JPS646201B2 - - Google Patents
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- JPS646201B2 JPS646201B2 JP55114688A JP11468880A JPS646201B2 JP S646201 B2 JPS646201 B2 JP S646201B2 JP 55114688 A JP55114688 A JP 55114688A JP 11468880 A JP11468880 A JP 11468880A JP S646201 B2 JPS646201 B2 JP S646201B2
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- mucopolysaccharides
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
- B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
- B01J20/287—Non-polar phases; Reversed phases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
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- Sustainable Development (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
本発明はムコ多糖類の分離方法に係り、詳しく
はハイドロホービツク・クロマトグラフイを用い
るムコ多糖類の分離方法に関する。 ハイドロホービツク・クロマトグラフイは、ハ
イドロホービツク・インターラクシヨン（疎水性
相互作用）・クロマトグラフイとも称され、溶質
の疎水性部位とクロマト担体が有する疎水性リガ
ンドとの間の相互作用の程度により溶質を相互分
離する方法である。 生体構成物質は、そのほとんどが水を媒体とす
るが、中でも蛋白質のように分子表面に強い疎水
性部位（アミノ酸残基）を有するものはその疎水
性の程度に応じてハイドロホービツク・クロマト
グラフイにより分離、分画することが理論的に可
能である。事実、この点に着目した、ハイドロホ
ービツク・クロマトグラフイによる蛋白質の分離
分画例が報告されており、イオン交換クロマトグ
ラフイやアフイニテイ・クロマトグラフイとの併
用により蛋白質の高度な分離・精製が行われてい
る。 一方、糖類の分離・精製の方法としては、これ
まで異なる溶媒への分配、イオン交換性、特定物
質に対する吸着性もしくは親和性、分子量等の差
違を利用する方法が採用されて来たが、ハイドロ
ホービツク・クロマトグラフイの利用はまつたく
顧みられず、従来行われていない。その理由の１
つとして、糖類は構造的に親水性基を多数含むが
疎水性基は極めて少ないために疎水性が極めて乏
しく、そのために疎水性相互作用を基本原理とす
るハイドロホービツク・クロマトグラフイの適用
は有効ではないと考えられて来たことがあげられ
る。また、ハイドロホービツク・クロマトグラフ
イは、蛋白質を対象とする場合ですら吸着、溶離
の条件設定が離しいという事情があつたため、と
ても糖類への適用までは想到され得なかつたもの
と考えられる。即ち、例えばイオン交換クロマト
グラフイの場合には蛋白質の等電点が条件設定の
参考になるし、アフイニテイークロマトグラフイ
の場合には基質や補酵素のKm値、阻害物質等と
の親和度などが参考になるのに対して、ハイドロ
ホービツク・クロマトグラフイの場合には、蛋白
質の疎水性部位とクロマト担体の疎水性リガンド
との相互作用の実体について知見が少ないため、
吸着、分離の条件設定は実験的な試行に頼らざる
を得ないという背景が存在したのである。 以上のような技術水準のもとで、本発明者らが
ムコ多糖類の構造と生理活性の関連性について研
究を進めて来た過程で、意外にも糖類、とりわけ
ムコ多糖類の分離、精製にハイドロホービツク・
クロマトグラフイが有効であることを見い出し、
本発明を完成するに到つた。更に驚くべきことに
は、本発明の分離方法によれば、ムコ多糖類が生
理活性の程度を異にする複数の画分に分離、分画
されるという事実も判明した。 即ち、ムコ多糖類は、動物組織や、体液に広く
分布し、アミノ糖及びウロン酸などを構成糖とす
る複合多糖であり、構成糖の種類およびＮ―アセ
チル基、Ｏ―硫酸基、、Ｎ―硫酸基等の含有度合
により、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫
酸、コンドロイチン硫酸Ａ〜Ｈ等と多様に存在す
る。ムコ多糖類は、生体内の結合組織に対する特
異機能を有することが知られており、血液や血管
壁の凝血因子との相互作用、脂血清澄作用、細胞
増殖抑制など細胞機能への関与、血小板機能に対
する作用等多くの生理活性が知られている。これ
らムコ多糖類は、蛋白質のように分子表面は疎水
性相互作用域を有しない故にハイドロホービツ
ク・クロマトグラフイーの効果的適用が期待出来
ないと一般的に考えられていたのに反し、本発明
者らの検討から得た知見によれば、従来の通常の
手段により精製したムコ多糖、例えばヘパリンを
ハイドロホービツク・クロマトグラフイーにより
分画を行うと、ヘパリンは、疎水性の異なる複数
の画分に分離され、更に驚くべき事実として、そ
れらのヘパリンの各画分の生理活性としての抗凝
血活性が疎水性の強度に応じた活性の強弱を有す
ると云う新規事実が判明した。この事実は、ヘパ
リンなどのムコ多糖類から生理活性の強い画分を
精製できることを意味し、医薬領域への大きな貢
献が期待される。このようにムコ多糖類を生理活
性の強弱に応じた複数の画分に分離することは、
前述した従来の糖類の分離方法によつては不可能
なことであつて、本発明の方法によつて始めて達
成されたことである。 このように、本発明の目的は、糖類とりわけム
コ多糖類の分離方法を提供することにあり、更に
は、ムコ多糖類を生理活性の程度を異にする複数
の画分に分離する方法を提供することである。 本発明のムコ多糖類の分離方法は、ムコ多糖類
をハイドロホービツク・クロマトグラフイを用い
て分離することを特徴とする方法である。 本発明に用いるハイドロホービツク・クロマト
グラフイー用担体及び疎水性リガンドについて述
べるならば、本発明で適用される糖質が高分子の
多糖であり、構成単糖がヘキソサミン及びウロン
酸などから成り、それら構成糖のアミノ基又は水
酸基はアセチル基または硫酸基と結合しており、
ウロン酸を構成糖とする場合には、カルボキシル
基を有する酸性多糖類である故に、ハイドロホー
ビツク・クロマトグラフイーの担体マトリツクス
構造は、イオン交換性を有しない巨大網状構造を
有することが好ましく、更にこれら担体の骨格構
成物質が過度の疎水性を保有しないことが望まし
い。これらの点から通常架橋されたアガロース、
ポリビニルアルコール樹脂等が用いられるが、本
発明の主旨を越えない範囲で他の基材を使用出来
る。ハイドロホービツク・クロマトグラフイーの
原理が、溶質の疎水性部位と担体の疎水性リガン
ドとの相互作用を利用するものであるから、担体
には溶質の性質に見合つた適度の疎水性基が導入
されねばならない。このために疎水基の種類、密
度の選択が要求される。溶質がムコ多糖の如き、
疎水性に乏しい物質である場合、クロマト担体中
の疎水性リガンドは、スペーサーを介してより相
互作用が容易な状態にあることが好ましい。リガ
ンドのタイプとしては、アルキル基；水酸基、カ
ルボキシル基もしくはアミノ基で置換されたアル
キル基；フエニル基などのアリール基；又はベン
ジル基などのアラルキル基が好適である。これら
の疎水性リガンドは、クロマト担体中の水酸基を
用いて、BrCNを用いる反応や、グリシジルアル
キルエーテルとの反応により担体に導入すること
が出来る（S.HJERTE′N et al：B.B.A.412
（1975）51〜61、J.Chrom atography101（1974）
281〜288、S.SHALTIEL et al：Pro.Nat.Acad.
Sci.USA70（1973）778〜781参照）。疎水性相互
作用の強さを決める因子として、上記リガンドの
炭素鎖の鎖長及び置換基の種類およびリガンドの
担体中における密度（置換度）が重要であり溶質
の分離に大きな影響を与える。 これら担体の市販品は、オクチルアガロース、
ベンジルアガロース〔ピアス・ケミカル社、米
国〕アルキル基アガロース類、ω―アミノアルキ
ルアガロース類〔マイルス・ラボラトリーズ社、
米国〕、エンゾルブーＡ（フエノキシアセチルセル
ロース）〔レギス・ケミカル社、米国〕フエニ
ル・セフアロースCL―4B、オクチル・セフアロ
ースCL―4B〔フアルマシア・フアインケミカル
社、スエーデン国〕等の商品名で入手出来る。 吸着・溶出の条件については、原理的に疎水性
相互作用を強くするような条件では、溶質が担体
リガンドに結合し、弱くしてやれば溶出して来る
と云うことは自明であるが、疎水性相互作用の強
度に影響を及ぼす因子として、イオン強度、温度
PHあるいは多価水酸基化合物や、界面活性剤など
がある。イオン強度が高いと親水性基（解離性
基）はより非解離型をとることとなり、従つて疎
水性相互作用は強くなり、逆にイオン強度が低く
なるにつれて弱くなる。温度の影響については、
低温時には相互作用は弱く、高温になるに従つて
強くなる。更に、溶質と担体リガンド間の疎水性
相互作用を弱める溶媒としては、担体リガンドと
溶質間の疎水性相互作用に競合的な溶媒や物質が
用いられる。通常、メタノール、エタノール、プ
ロパノール、ブタノール、エチレングリコールの
如きアルコール類や界面活性剤の如き親水性部分
及び疎水性部分を分子内に有する化合物や、尿
素、グアニジン、テトラエチルアンモニウム塩、
硫化アンモニウム等の疎水性相互作用を弱めるも
のとして知られているものが使用される。 これらの諸因子を選択・調節することにより溶
質とクロマト担体の疎水性リガンドとの疎水性相
互作用を制御し、溶質の疎水性の程度に応じた吸
着、脱着を行う。通常、疎水性相互作用が最も強
い状態にして糖類を担体に保持させておき、次に
疎水性相互作用をより弱い状態にして疎水性の程
度のより低いものを溶出させる。これを繰り返す
と、疎水性の程度の弱い画分から順次溶出され、
最後に最も疎水性の強い画分が分離溶出されるこ
とになる。 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ フエニル―セフアロースCL―4B（カラム）を
用いる段階的（ステツプワイズ）溶出法による
ヘパリンの分離 市販のブタ腸粘膜へパリン（シグマ・ケミカル
社）161USPU／mg（USPU：米国薬局方の方法
による抗凝血活性の単位）をLaurent等の方法
（T.C.Laurentほか、Biochem.J.175（1978）691
―701）に従いSephadex Ｇ―100を用いるゲル
過法により分子サイズ分布をより均質に調整し
た。この調整へパリン179USPU／mgを出発へパ
リンとし、フエニル・セフアロースCL―4B（フ
アルマシアフアイン・ケミカルズ社）カラムを用
いて次の〜の操作のハイドロホービツク・ク
ロマトグラフイーによる吸着・溶出を行い各溶出
画分中のへパリンを常法に従いナトリウム塩とし
て粉末状で単離した。各画分から単離されたへパ
リンの分析値、収量を表に示す。 フエニル―セフアロースCL―4Bカラム4.5×
210cmを3.8M（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH3.3）
で調整する。 調整へパリン10ｇを2lの溶媒3.8M
（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH3.3）に溶解準備す
る。 調整へパリン溶液をフエニル―セフアロース
CL―4Bカラムに負何し、ヘパリンを担体に吸
着せしめる。 22.5の洗浄液3.8M（NH4）2SO4・0.01MHCl
（PH3.3）を用い500ml／hrの流速で洗滌溶出を
行う。 15の3.4M（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH3.35）
を用いて同様に溶出を行う。 13.8の3.0M（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH
3.4）を用いて同様に溶出行う。 ５の2.0M（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH3.5）
を用いて同様に溶出を行う。 これらクロマト条件は18〜22℃の調温室内にて
行つた。
はハイドロホービツク・クロマトグラフイを用い
るムコ多糖類の分離方法に関する。 ハイドロホービツク・クロマトグラフイは、ハ
イドロホービツク・インターラクシヨン（疎水性
相互作用）・クロマトグラフイとも称され、溶質
の疎水性部位とクロマト担体が有する疎水性リガ
ンドとの間の相互作用の程度により溶質を相互分
離する方法である。 生体構成物質は、そのほとんどが水を媒体とす
るが、中でも蛋白質のように分子表面に強い疎水
性部位（アミノ酸残基）を有するものはその疎水
性の程度に応じてハイドロホービツク・クロマト
グラフイにより分離、分画することが理論的に可
能である。事実、この点に着目した、ハイドロホ
ービツク・クロマトグラフイによる蛋白質の分離
分画例が報告されており、イオン交換クロマトグ
ラフイやアフイニテイ・クロマトグラフイとの併
用により蛋白質の高度な分離・精製が行われてい
る。 一方、糖類の分離・精製の方法としては、これ
まで異なる溶媒への分配、イオン交換性、特定物
質に対する吸着性もしくは親和性、分子量等の差
違を利用する方法が採用されて来たが、ハイドロ
ホービツク・クロマトグラフイの利用はまつたく
顧みられず、従来行われていない。その理由の１
つとして、糖類は構造的に親水性基を多数含むが
疎水性基は極めて少ないために疎水性が極めて乏
しく、そのために疎水性相互作用を基本原理とす
るハイドロホービツク・クロマトグラフイの適用
は有効ではないと考えられて来たことがあげられ
る。また、ハイドロホービツク・クロマトグラフ
イは、蛋白質を対象とする場合ですら吸着、溶離
の条件設定が離しいという事情があつたため、と
ても糖類への適用までは想到され得なかつたもの
と考えられる。即ち、例えばイオン交換クロマト
グラフイの場合には蛋白質の等電点が条件設定の
参考になるし、アフイニテイークロマトグラフイ
の場合には基質や補酵素のKm値、阻害物質等と
の親和度などが参考になるのに対して、ハイドロ
ホービツク・クロマトグラフイの場合には、蛋白
質の疎水性部位とクロマト担体の疎水性リガンド
との相互作用の実体について知見が少ないため、
吸着、分離の条件設定は実験的な試行に頼らざる
を得ないという背景が存在したのである。 以上のような技術水準のもとで、本発明者らが
ムコ多糖類の構造と生理活性の関連性について研
究を進めて来た過程で、意外にも糖類、とりわけ
ムコ多糖類の分離、精製にハイドロホービツク・
クロマトグラフイが有効であることを見い出し、
本発明を完成するに到つた。更に驚くべきことに
は、本発明の分離方法によれば、ムコ多糖類が生
理活性の程度を異にする複数の画分に分離、分画
されるという事実も判明した。 即ち、ムコ多糖類は、動物組織や、体液に広く
分布し、アミノ糖及びウロン酸などを構成糖とす
る複合多糖であり、構成糖の種類およびＮ―アセ
チル基、Ｏ―硫酸基、、Ｎ―硫酸基等の含有度合
により、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫
酸、コンドロイチン硫酸Ａ〜Ｈ等と多様に存在す
る。ムコ多糖類は、生体内の結合組織に対する特
異機能を有することが知られており、血液や血管
壁の凝血因子との相互作用、脂血清澄作用、細胞
増殖抑制など細胞機能への関与、血小板機能に対
する作用等多くの生理活性が知られている。これ
らムコ多糖類は、蛋白質のように分子表面は疎水
性相互作用域を有しない故にハイドロホービツ
ク・クロマトグラフイーの効果的適用が期待出来
ないと一般的に考えられていたのに反し、本発明
者らの検討から得た知見によれば、従来の通常の
手段により精製したムコ多糖、例えばヘパリンを
ハイドロホービツク・クロマトグラフイーにより
分画を行うと、ヘパリンは、疎水性の異なる複数
の画分に分離され、更に驚くべき事実として、そ
れらのヘパリンの各画分の生理活性としての抗凝
血活性が疎水性の強度に応じた活性の強弱を有す
ると云う新規事実が判明した。この事実は、ヘパ
リンなどのムコ多糖類から生理活性の強い画分を
精製できることを意味し、医薬領域への大きな貢
献が期待される。このようにムコ多糖類を生理活
性の強弱に応じた複数の画分に分離することは、
前述した従来の糖類の分離方法によつては不可能
なことであつて、本発明の方法によつて始めて達
成されたことである。 このように、本発明の目的は、糖類とりわけム
コ多糖類の分離方法を提供することにあり、更に
は、ムコ多糖類を生理活性の程度を異にする複数
の画分に分離する方法を提供することである。 本発明のムコ多糖類の分離方法は、ムコ多糖類
をハイドロホービツク・クロマトグラフイを用い
て分離することを特徴とする方法である。 本発明に用いるハイドロホービツク・クロマト
グラフイー用担体及び疎水性リガンドについて述
べるならば、本発明で適用される糖質が高分子の
多糖であり、構成単糖がヘキソサミン及びウロン
酸などから成り、それら構成糖のアミノ基又は水
酸基はアセチル基または硫酸基と結合しており、
ウロン酸を構成糖とする場合には、カルボキシル
基を有する酸性多糖類である故に、ハイドロホー
ビツク・クロマトグラフイーの担体マトリツクス
構造は、イオン交換性を有しない巨大網状構造を
有することが好ましく、更にこれら担体の骨格構
成物質が過度の疎水性を保有しないことが望まし
い。これらの点から通常架橋されたアガロース、
ポリビニルアルコール樹脂等が用いられるが、本
発明の主旨を越えない範囲で他の基材を使用出来
る。ハイドロホービツク・クロマトグラフイーの
原理が、溶質の疎水性部位と担体の疎水性リガン
ドとの相互作用を利用するものであるから、担体
には溶質の性質に見合つた適度の疎水性基が導入
されねばならない。このために疎水基の種類、密
度の選択が要求される。溶質がムコ多糖の如き、
疎水性に乏しい物質である場合、クロマト担体中
の疎水性リガンドは、スペーサーを介してより相
互作用が容易な状態にあることが好ましい。リガ
ンドのタイプとしては、アルキル基；水酸基、カ
ルボキシル基もしくはアミノ基で置換されたアル
キル基；フエニル基などのアリール基；又はベン
ジル基などのアラルキル基が好適である。これら
の疎水性リガンドは、クロマト担体中の水酸基を
用いて、BrCNを用いる反応や、グリシジルアル
キルエーテルとの反応により担体に導入すること
が出来る（S.HJERTE′N et al：B.B.A.412
（1975）51〜61、J.Chrom atography101（1974）
281〜288、S.SHALTIEL et al：Pro.Nat.Acad.
Sci.USA70（1973）778〜781参照）。疎水性相互
作用の強さを決める因子として、上記リガンドの
炭素鎖の鎖長及び置換基の種類およびリガンドの
担体中における密度（置換度）が重要であり溶質
の分離に大きな影響を与える。 これら担体の市販品は、オクチルアガロース、
ベンジルアガロース〔ピアス・ケミカル社、米
国〕アルキル基アガロース類、ω―アミノアルキ
ルアガロース類〔マイルス・ラボラトリーズ社、
米国〕、エンゾルブーＡ（フエノキシアセチルセル
ロース）〔レギス・ケミカル社、米国〕フエニ
ル・セフアロースCL―4B、オクチル・セフアロ
ースCL―4B〔フアルマシア・フアインケミカル
社、スエーデン国〕等の商品名で入手出来る。 吸着・溶出の条件については、原理的に疎水性
相互作用を強くするような条件では、溶質が担体
リガンドに結合し、弱くしてやれば溶出して来る
と云うことは自明であるが、疎水性相互作用の強
度に影響を及ぼす因子として、イオン強度、温度
PHあるいは多価水酸基化合物や、界面活性剤など
がある。イオン強度が高いと親水性基（解離性
基）はより非解離型をとることとなり、従つて疎
水性相互作用は強くなり、逆にイオン強度が低く
なるにつれて弱くなる。温度の影響については、
低温時には相互作用は弱く、高温になるに従つて
強くなる。更に、溶質と担体リガンド間の疎水性
相互作用を弱める溶媒としては、担体リガンドと
溶質間の疎水性相互作用に競合的な溶媒や物質が
用いられる。通常、メタノール、エタノール、プ
ロパノール、ブタノール、エチレングリコールの
如きアルコール類や界面活性剤の如き親水性部分
及び疎水性部分を分子内に有する化合物や、尿
素、グアニジン、テトラエチルアンモニウム塩、
硫化アンモニウム等の疎水性相互作用を弱めるも
のとして知られているものが使用される。 これらの諸因子を選択・調節することにより溶
質とクロマト担体の疎水性リガンドとの疎水性相
互作用を制御し、溶質の疎水性の程度に応じた吸
着、脱着を行う。通常、疎水性相互作用が最も強
い状態にして糖類を担体に保持させておき、次に
疎水性相互作用をより弱い状態にして疎水性の程
度のより低いものを溶出させる。これを繰り返す
と、疎水性の程度の弱い画分から順次溶出され、
最後に最も疎水性の強い画分が分離溶出されるこ
とになる。 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ フエニル―セフアロースCL―4B（カラム）を
用いる段階的（ステツプワイズ）溶出法による
ヘパリンの分離 市販のブタ腸粘膜へパリン（シグマ・ケミカル
社）161USPU／mg（USPU：米国薬局方の方法
による抗凝血活性の単位）をLaurent等の方法
（T.C.Laurentほか、Biochem.J.175（1978）691
―701）に従いSephadex Ｇ―100を用いるゲル
過法により分子サイズ分布をより均質に調整し
た。この調整へパリン179USPU／mgを出発へパ
リンとし、フエニル・セフアロースCL―4B（フ
アルマシアフアイン・ケミカルズ社）カラムを用
いて次の〜の操作のハイドロホービツク・ク
ロマトグラフイーによる吸着・溶出を行い各溶出
画分中のへパリンを常法に従いナトリウム塩とし
て粉末状で単離した。各画分から単離されたへパ
リンの分析値、収量を表に示す。 フエニル―セフアロースCL―4Bカラム4.5×
210cmを3.8M（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH3.3）
で調整する。 調整へパリン10ｇを2lの溶媒3.8M
（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH3.3）に溶解準備す
る。 調整へパリン溶液をフエニル―セフアロース
CL―4Bカラムに負何し、ヘパリンを担体に吸
着せしめる。 22.5の洗浄液3.8M（NH4）2SO4・0.01MHCl
（PH3.3）を用い500ml／hrの流速で洗滌溶出を
行う。 15の3.4M（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH3.35）
を用いて同様に溶出を行う。 13.8の3.0M（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH
3.4）を用いて同様に溶出行う。 ５の2.0M（NH4）2SO4・0.01MHCl（PH3.5）
を用いて同様に溶出を行う。 これらクロマト条件は18〜22℃の調温室内にて
行つた。
【表】
＊アンチトロンビンに対する親和性画分比は、
DamusとRosenbergらの方法（Methods
Enzymol.45B，653―669（1976）に従い精製した
ウシアンチトロンビンをCuatrecasasの方法
（J.Biol，Chem.245（1970）3059―3065）に従い
BrCN活性化Sepharose4Bに結合せしめ、カラム
に充填し、Laurentらの方法に従い、ハイドロホ
ービツククロマト画分をAT―Sepharoseカラ
ムによりアフイニテイークロマトグラフイーを実
施し、非親和性部（NA）、低親和性部（LA）及
び高親和性部（HA）に分画しウロン酸の相対量
比を百分率で示した。 実施例 ２ オクチル・セフアロースCL―4B（カラム）を
用いる漸減（グレージエント）溶出法によるヘパ
リンの分離。 オクチル・セフアロースCL―4B（フアルマシ
ア・フアイン・ケミカルズ社、スウエーデン）を
4.0M（NH4）2SO4／0.1MHCl（PH2.9）（Soln―１）
にて調整し、0.7×40cmのカラムに充填した。 市販ブタ腸粘膜へパリン（シグマ・ケミカル
社、161USPU／mg）60mg／15ml（4.0M
（NH4）2SO4／0.1MHCl，PH2.9）をオクチル・セ
フアロースCL―4Bカラムに負荷し、引続いて
Soln―１ 350mlで溶出を行つた。次に、4.0Mか
ら2.0Mまで濃度を直線的に低めながら
（NH4）2SO4溶液で溶出を行い、得られたクロマ
トグラムを図面に示す。図中各試験管のヘパリン
濃度は試験管より20μ採取しカルバゾール反応
により呈色した530nmに於ける吸光度で表わし
た。 試験管番号３〜73を画分１、同74〜140を画分
２としプールし、各画分中のヘパリンを常法に従
いNa塩として粉末状に単離した。収率、収量、
抗凝血活性を表に示す。
DamusとRosenbergらの方法（Methods
Enzymol.45B，653―669（1976）に従い精製した
ウシアンチトロンビンをCuatrecasasの方法
（J.Biol，Chem.245（1970）3059―3065）に従い
BrCN活性化Sepharose4Bに結合せしめ、カラム
に充填し、Laurentらの方法に従い、ハイドロホ
ービツククロマト画分をAT―Sepharoseカラ
ムによりアフイニテイークロマトグラフイーを実
施し、非親和性部（NA）、低親和性部（LA）及
び高親和性部（HA）に分画しウロン酸の相対量
比を百分率で示した。 実施例 ２ オクチル・セフアロースCL―4B（カラム）を
用いる漸減（グレージエント）溶出法によるヘパ
リンの分離。 オクチル・セフアロースCL―4B（フアルマシ
ア・フアイン・ケミカルズ社、スウエーデン）を
4.0M（NH4）2SO4／0.1MHCl（PH2.9）（Soln―１）
にて調整し、0.7×40cmのカラムに充填した。 市販ブタ腸粘膜へパリン（シグマ・ケミカル
社、161USPU／mg）60mg／15ml（4.0M
（NH4）2SO4／0.1MHCl，PH2.9）をオクチル・セ
フアロースCL―4Bカラムに負荷し、引続いて
Soln―１ 350mlで溶出を行つた。次に、4.0Mか
ら2.0Mまで濃度を直線的に低めながら
（NH4）2SO4溶液で溶出を行い、得られたクロマ
トグラムを図面に示す。図中各試験管のヘパリン
濃度は試験管より20μ採取しカルバゾール反応
により呈色した530nmに於ける吸光度で表わし
た。 試験管番号３〜73を画分１、同74〜140を画分
２としプールし、各画分中のヘパリンを常法に従
いNa塩として粉末状に単離した。収率、収量、
抗凝血活性を表に示す。
【表】
実施例 ３
ペンジル・アガロースを用いるステツプワイズ
溶出法による市販へパリンの分画。 市販ブタ腸粘膜へパリン（シグマ・ケミカル社
161USPU／mg）について、ベンジル・アガロー
ス（ピアス・ケミカル社、米国）カラムを用いて
次の〜の操作によりハイドロホービツク・ク
ロマトグラフイーを行つた。各溶出画分のへパリ
ンは常法に従い、ナトリウム塩として粉末状に単
離した。各画分から単離したへパリンの収量、抗
凝血活性を表―に示す。 ベンジル・アガロースカラム（4.5×215cm）
を、3.8M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.3）で予
備調整した。以下、〜の操作は室温（18―
22℃）で行なつた。 ヘパリン10ｇを２の3.8M（NH4）2SO4／
0.01MHCl（PH3.3）に溶解してヘパリン溶液と
する。 ヘパリン溶液をベンジル・アガロースカラム
に負荷し、ヘパリンを担体に吸着させる。 35の3.8M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.3）
をカラムに流し、溶出を行なう（流出速度500
ml／hr）。 28の3.4M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.35）
をカラムに流す。 28の3.0M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.4）
をカラムに流す。 10.5の2.5M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH
3.45）をカラムに流す。 14の2.0M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.5）
をカラムに流す。
溶出法による市販へパリンの分画。 市販ブタ腸粘膜へパリン（シグマ・ケミカル社
161USPU／mg）について、ベンジル・アガロー
ス（ピアス・ケミカル社、米国）カラムを用いて
次の〜の操作によりハイドロホービツク・ク
ロマトグラフイーを行つた。各溶出画分のへパリ
ンは常法に従い、ナトリウム塩として粉末状に単
離した。各画分から単離したへパリンの収量、抗
凝血活性を表―に示す。 ベンジル・アガロースカラム（4.5×215cm）
を、3.8M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.3）で予
備調整した。以下、〜の操作は室温（18―
22℃）で行なつた。 ヘパリン10ｇを２の3.8M（NH4）2SO4／
0.01MHCl（PH3.3）に溶解してヘパリン溶液と
する。 ヘパリン溶液をベンジル・アガロースカラム
に負荷し、ヘパリンを担体に吸着させる。 35の3.8M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.3）
をカラムに流し、溶出を行なう（流出速度500
ml／hr）。 28の3.4M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.35）
をカラムに流す。 28の3.0M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.4）
をカラムに流す。 10.5の2.5M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH
3.45）をカラムに流す。 14の2.0M（NH4）2SO4／0.01MHCl（PH3.5）
をカラムに流す。
【表】
実施例２，３で明らかなごとく、本実施例で用
いたヘパリンは抗凝血活性の大きく異なる２成分
から成り、疎水性の強さに対応して分画される。 実施例 ４ 疎水性リガンドの相異によるヘパリンの分画対
比。 市販ブタ腸粘膜ヘパリン（シグマ・ケミカル社
161USPU／mg）5.01mgを各々オクチル―セフア
ロースCL―4B、フエニルセフアロースCL―4B
（フアルマシア・フアインケミカルズ社、スウエ
ーデン）、ベンジル・アガロース（ピアス・ケミ
カル社、米国）の各0.6×６cmのカラムを用いて
ステツプワイズ・ハイドロホービツク・クロマト
グラフイを行いリガンドの相異による分画の影響
を対比した。吸着・溶出は実施例３に準じて実施
し各硫安濃度に於ける画分中のヘパリンの相対量
比で対比した。その結果を表に示す。
いたヘパリンは抗凝血活性の大きく異なる２成分
から成り、疎水性の強さに対応して分画される。 実施例 ４ 疎水性リガンドの相異によるヘパリンの分画対
比。 市販ブタ腸粘膜ヘパリン（シグマ・ケミカル社
161USPU／mg）5.01mgを各々オクチル―セフア
ロースCL―4B、フエニルセフアロースCL―4B
（フアルマシア・フアインケミカルズ社、スウエ
ーデン）、ベンジル・アガロース（ピアス・ケミ
カル社、米国）の各0.6×６cmのカラムを用いて
ステツプワイズ・ハイドロホービツク・クロマト
グラフイを行いリガンドの相異による分画の影響
を対比した。吸着・溶出は実施例３に準じて実施
し各硫安濃度に於ける画分中のヘパリンの相対量
比で対比した。その結果を表に示す。
【表】
実施例４で明らかなごとく担体のハイドロホー
ビツクリガンドの差異に伴いヘパリンの分画量比
に変動がみられ、オクチル基、フエニル基、ベン
ジル基と担体リガンドのハイドロホービシテイー
が増すにしたがいヘパリンの結合力も強くなるこ
とが判る。 実施例 ５ オクチル・セフアロースCL―4B、およびフエ
ニル・セフアロースCL―4Bを用いる各種ムコ多
糖類の分画比較。0.6×６cmのオクチル・セフア
ロースCL―4Bカラム及びフエニルセフアロース
CL―4Bカラムを準備し、負荷する各種ムコ多糖
類を溶解した硫安濃度の溶液であらかじめ平衡化
しておいた。それぞれのカラムに、各種ムコ多糖
類を負荷吸収せしめ、次いで各種濃度の硫安溶液
を用いて順次段階的に溶離する。得られた画分中
のムコ多糖類を、セチルピリジニウムクロリドで
沈澱とし、NaClによりナトリウム塩に変換した
後、アルコール沈澱せしめ、粉末状に乾燥して秤
量した。これら各画分中に回収されたムコ多糖類
の重量について相互の比（百分率）をとり、表―
に示す。 表―で明らかなごとく、各種ムコ多糖類を疎
水性の異なる担体にてクロマトグラフイーを行う
とき、ムコ多糖類はそれぞれ、疎水性リガンドに
対するハイドロホービシテイー・インタラクシヨ
ンの相異に応じて分画される。
ビツクリガンドの差異に伴いヘパリンの分画量比
に変動がみられ、オクチル基、フエニル基、ベン
ジル基と担体リガンドのハイドロホービシテイー
が増すにしたがいヘパリンの結合力も強くなるこ
とが判る。 実施例 ５ オクチル・セフアロースCL―4B、およびフエ
ニル・セフアロースCL―4Bを用いる各種ムコ多
糖類の分画比較。0.6×６cmのオクチル・セフア
ロースCL―4Bカラム及びフエニルセフアロース
CL―4Bカラムを準備し、負荷する各種ムコ多糖
類を溶解した硫安濃度の溶液であらかじめ平衡化
しておいた。それぞれのカラムに、各種ムコ多糖
類を負荷吸収せしめ、次いで各種濃度の硫安溶液
を用いて順次段階的に溶離する。得られた画分中
のムコ多糖類を、セチルピリジニウムクロリドで
沈澱とし、NaClによりナトリウム塩に変換した
後、アルコール沈澱せしめ、粉末状に乾燥して秤
量した。これら各画分中に回収されたムコ多糖類
の重量について相互の比（百分率）をとり、表―
に示す。 表―で明らかなごとく、各種ムコ多糖類を疎
水性の異なる担体にてクロマトグラフイーを行う
とき、ムコ多糖類はそれぞれ、疎水性リガンドに
対するハイドロホービシテイー・インタラクシヨ
ンの相異に応じて分画される。
図面は、「実施例２」において、ヘパリンをオ
クチル・セフアロースCL―4Bカラムを用い、溶
離液の硫安濃度を漸減させながらハイドロホービ
ツククロマトグラフイを行つたときの溶出曲線を
表す。
クチル・セフアロースCL―4Bカラムを用い、溶
離液の硫安濃度を漸減させながらハイドロホービ
ツククロマトグラフイを行つたときの溶出曲線を
表す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ムコ多糖類をハイドロホービツク・クロマト
グラフイを用いて分離することを特徴とするムコ
多糖類の分離方法。 ２ ムコ多糖類が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コ
ンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒヤルロン
酸、又はコンドロイチン―ポリ硫酸である特許請
求の範囲第１項に記載の分離方法。 ３ ハイドロホービツク・クロマトグラフイに用
いるクロマト担体の疎水性リガンドが、アルキル
基；水酸基、カルボキシル基もしくはアミノ基で
置換されたアルキル基；アリール基；又はアラル
キル基である特許請求の範囲第１項に記載の分離
方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55114688A JPS5740503A (en) | 1980-08-22 | 1980-08-22 | Separation of saccharides |
| EP81106515A EP0046581B1 (en) | 1980-08-22 | 1981-08-21 | Process for separation of mucopolysaccharides |
| DE8181106515T DE3173365D1 (en) | 1980-08-22 | 1981-08-21 | Process for separation of mucopolysaccharides |
| DK371881A DK371881A (da) | 1980-08-22 | 1981-08-21 | Fremgangsmaade til adsjillelse af carbohydrater |
| US06/461,059 US4421650A (en) | 1980-08-22 | 1983-01-26 | Process for separation of carbohydrates |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55114688A JPS5740503A (en) | 1980-08-22 | 1980-08-22 | Separation of saccharides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5740503A JPS5740503A (en) | 1982-03-06 |
| JPS646201B2 true JPS646201B2 (ja) | 1989-02-02 |
Family
ID=14644145
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55114688A Granted JPS5740503A (en) | 1980-08-22 | 1980-08-22 | Separation of saccharides |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4421650A (ja) |
| EP (1) | EP0046581B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5740503A (ja) |
| DE (1) | DE3173365D1 (ja) |
| DK (1) | DK371881A (ja) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58183701A (ja) * | 1982-04-21 | 1983-10-27 | Soda Koryo Kk | 乳化安定剤 |
| SE8202544L (sv) * | 1982-04-23 | 1983-10-24 | Larsson Per Olof | Lektinhaltigt separationsmedel |
| US5059654A (en) * | 1983-02-14 | 1991-10-22 | Cuno Inc. | Affinity matrices of modified polysaccharide supports |
| GB2184732B (en) * | 1985-12-26 | 1990-07-11 | Showa Denko Kk | Active support substance and adsorbent for chromatography |
| JPS6420445A (en) * | 1987-07-15 | 1989-01-24 | Sumitomo Chemical Co | Chromatograph packing agent and analysis of enantiomer using said agent |
| CA1336077C (en) * | 1987-11-10 | 1995-06-27 | Ruben G. Carbonell | Chromatography apparatus and method and material for making the same |
| EP0401248A4 (en) * | 1988-02-11 | 1992-04-15 | Cuno, Incorporated | Affinity matrices of modified polysaccharide supports |
| US4867884A (en) * | 1988-02-24 | 1989-09-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Separation of cyclodextrins by affinity chromatography |
| US5045190A (en) * | 1988-11-08 | 1991-09-03 | Carbonell Ruben G | Chromatography apparatus |
| US5135650A (en) * | 1988-12-22 | 1992-08-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Chromatography stationary phase material for high performance liquid chromatography |
| EP0386926A3 (en) * | 1989-03-02 | 1991-12-18 | Supelco, Inc. | Silica gel supports suitable for chromatographic separations |
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| US7005510B1 (en) * | 1993-06-23 | 2006-02-28 | Beckman Instruments, Inc. | Recombinant DNase B derived from Streptococcus pyogenes |
| US5811403A (en) * | 1996-09-30 | 1998-09-22 | Vanderbilt University | Polysaccharide toxin from Group B β-hemolytic Streptococcus (GBS) having improved purity |
| ATE498409T1 (de) | 1998-08-06 | 2011-03-15 | Mountain View Pharmaceuticals | Peg-uricase konjugate und verwendung davon |
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| MX2007012548A (es) | 2005-04-11 | 2008-03-11 | Savient Pharmaceuticals Inc | Formas variantes de urato oxidasa y uso de las mismas. |
| EP1883425A1 (en) * | 2005-05-23 | 2008-02-06 | Universite De Geneve | Injectable superparamagnetic nanoparticles for treatment by hyperthermia and use for forming an hyperthermic implant |
| JP5033177B2 (ja) | 2006-04-12 | 2012-09-26 | サビエント ファーマセウティカルズ インク． | 陽イオン界面活性剤によるタンパク質の精製 |
| EP2409995A3 (en) | 2007-02-28 | 2012-08-15 | Lipoxen Technologies Limited | Reduction of endotoxin in polysialic acids |
| WO2009132330A2 (en) * | 2008-04-25 | 2009-10-29 | Biotrove, Inc. | Separation cartridges and methods for fabrication and use thereof |
| JP5501589B2 (ja) * | 2008-08-28 | 2014-05-21 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製法 |
| US9377454B2 (en) | 2009-06-25 | 2016-06-28 | Crealta Pharmaceuticals Llc | Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during pegylated uricase therapy |
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| CN103804523B (zh) * | 2013-11-24 | 2016-08-17 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 制备高纯度伊诺肝素方法 |
| SG11201805170XA (en) | 2015-12-18 | 2018-07-30 | Tega Therapeutics Inc | Cellular glycosaminoglycan compositions and methods of making and using |
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| US10518205B2 (en) | 2016-02-26 | 2019-12-31 | Lg Electronics Inc. | Air cleaner |
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| CN109762079B (zh) * | 2019-01-15 | 2021-04-27 | 湖北亿诺瑞生物制药有限公司 | 一种从肝素副产物中分离提纯舒洛地特原料药的方法 |
| WO2020160322A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-08-06 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Tolerization reduces intolerance to pegloticase and prolongs the urate lowering effect (triple) |
| WO2020160325A1 (en) | 2019-01-30 | 2020-08-06 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Reducing immunogenicity to pegloticase |
| US12269875B2 (en) | 2023-08-03 | 2025-04-08 | Jeff R. Peterson | Gout flare prevention methods using IL-1BETA blockers |
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-
1980
- 1980-08-22 JP JP55114688A patent/JPS5740503A/ja active Granted
-
1981
- 1981-08-21 DK DK371881A patent/DK371881A/da not_active Application Discontinuation
- 1981-08-21 EP EP81106515A patent/EP0046581B1/en not_active Expired
- 1981-08-21 DE DE8181106515T patent/DE3173365D1/de not_active Expired
-
1983
- 1983-01-26 US US06/461,059 patent/US4421650A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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| EP0046581A3 (en) | 1982-03-17 |
| JPS5740503A (en) | 1982-03-06 |
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| DK371881A (da) | 1982-02-23 |
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| US4421650A (en) | 1983-12-20 |
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