JPS647342B2 - - Google Patents
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- JPS647342B2 JPS647342B2 JP56021366A JP2136681A JPS647342B2 JP S647342 B2 JPS647342 B2 JP S647342B2 JP 56021366 A JP56021366 A JP 56021366A JP 2136681 A JP2136681 A JP 2136681A JP S647342 B2 JPS647342 B2 JP S647342B2
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- antibody
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
- B01L3/5085—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates
- B01L3/50851—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates specially adapted for heating or cooling samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、エンザイムイムノアツセイのサンド
イツチ法の改良方法に関するものである。 エンザイムイムノアツセイのサンドイツチ法
は、特公昭52−47011号公報、特開昭52−32114号
公報、特開昭52−57316号公報、特開昭52−47011
号公報、「医学のあゆみ」第102巻第２号第57〜65
頁などに示されているように、物質の微量測定法
として近年開発された優れた方法である。主とし
て、α−フエトプロテイン、HBs抗原、ホルモ
ン類などの抗原性物質の測定に用いられている。 このエンザイムイムノアツセイのサンドイツチ
法で物質を測定するにあたつて、一検体ごと別々
に測定することももちろんできるが、ほとんどの
場合には、同じ物質の検出を目的とする多数の検
体を一度にまとめて測定を行なう。まとめて測定
を行なう場合、測定しようとする物質に特異的に
結合する物質の固相化物と多数の検体とを室温に
おいて順次接触させ、続いて室温ないし45℃で反
応させた後、それに続く工程を経て測定を行なつ
ている。しかし、この場合、測定値に大きなバラ
ツキが生じる。これは上記のように、測定しよう
とする物質に特異的に結合する物質の固相化物と
多数の検体を順次接触させるので、最初に接触さ
せた検体と最後に接触させた検体とでは時間のず
れがかなり生じる。このような時間のずれは、上
記に続く工程においても発生するが、上記工程の
それが最も大きい。この時間のずれが原因で測定
値にバラツキが発生するものと考えられる。した
がつて一度に測定を行なう検体数が多いほどバラ
ツキは大きくなる。 次に示す本発明方法は、上記欠点を改良するも
のであり、本発明の冷却手段により、測定値のバ
ラツキを小さくすることができる。 ａ 測定物質（検体）とその物質に特異的に結合
する物質の固相化物とを反応させ、 ｂ 固相と液相に分離し、 ｃ 固相と測定物質に特異的に結合する物質の酵
素ラベル化物とを反応させ、 ｄ 固相と液相に分離し、 ｅ 固相または液相とｃの工程の酵素に対する基
質とを反応させ、 ｆ 反応液の吸光度を測定する エンザイムイムノアツセイにより複数の検体を同
時に測定するにあたり、ａの工程において、ま
ず、０℃〜15℃の冷却下に検体と測定物質に特異
的に結合する物質の固相化物とを順次接触させ、
ついでこれらを同時に室温ないし45℃でインキユ
ベーシヨンする。 上記工程に続き、前記のｂ〜ｆの工程を常法に
より行ない検体中の物質の測定を行なう。 上記ａの工程の反応は、別に用意した試験管な
どの反応容器中で固相化物と検体とを反応させる
か、またはマイクロタイタープレート、カツプ
（いずれも内壁に測定物質に特異的に結合する物
質がコートないし結合している）のように反応容
器を兼ねた固相化物に検体を加えて反応させる。
この反応において、０℃〜15℃、室温ないし45℃
に温度コントロールするためには、冷却手段とし
て冷却プレートなどの電気的冷却装置、氷、冷水
など、また加熱手段としてホツトプレート、恒温
槽、孵卵器などの電気的装置、温水などを用いて
反応温度をコントロールすることができる。 ｂの工程は、反応液を除き、固相を水、緩衝液
などで洗浄することにより行なうことができる。 ｃの工程は、固相と測定物質に特異的に結合す
る物質の酵素ラベル化物とを、室温ないし45℃で
反応させることにより行なうことができる。この
工程においても、固相に酵素ラベル化物を順次加
える際、０℃〜15℃で加え、続いて室温ないし45
℃で反応を行なうことが測定値のバラツキをおさ
える上で望ましい。 ｄの工程は、反応液と固相とを分離する。次の
ｅの工程で、固相を用いる場合には、分離した固
相を緩衝液、水などで洗浄する。 ｅの工程は、ｄの工程で得た固相または液相
に、用いた酵素に対する基質溶液を順次加えて酵
素反応を行ない、一定時間後に、酵素反応停止液
を加えることにより行なうことができる。上記酵
素反応の温度は用いた酵素の至適温度に調整す
る。この工程においても、固相または液相に基質
溶液を加える際、および反応液に反応停止液を加
える際は０℃〜15℃で行なうことが測定値のバラ
ツキをおさえる上で望ましい。 ｆの工程は、基質分解液の定量に適した波長を
用い、吸光度計により測定することにより行なう
ことができる。 以上の測定系で、測定しようとする既知量の物
質を用いて吸光度を予め測定し、その量と吸光度
との間の検量線を求める。次いで未知量の検体に
ついて、同測定系で吸光度を測定すれば、上記検
量線より、検体中の測定しようとする物質の量を
求めることができる。 本発明では、測定値のバラツキを小さくするた
めに、前記のように、ａの工程、望ましくはそれ
に加えてｃの工程およびｅの工程において０℃〜
15℃の冷却下に反応物を加える。また、ｂおよび
ｄの工程において、固相と液相の分離を検体ごと
に順次行なう場合には、これらの工程も０℃〜15
℃の冷却下に行なうのが望ましい。 本発明において、冷却または加熱する際には、
反応容器の外壁が密着するような金属ホルダーを
用いれば、温度コントロールが容易である。例え
ば、アルミニウム、銅、鉄などの熱良伝導体の板
に反応容器が密着して入るような穴を所定の数あ
け、あるいはそのような形状のものを鋳造し、こ
の穴に反応容器を差し込み、前記した冷却または
加熱手段により温度コントロールを行なう。ま
た、上記形状の他、円筒状の突起部を有し、その
円筒の中に反応容器が入るような形状のもの、あ
るいは反応容器の外壁を金属箔または金属板で被
うような形状のものがあげられる。これらは反応
容器の脱着ができる形態のもの、あるいは反応容
器と一体化したもののいずれでもよい。このよう
な器具を用いれば、冷却、加熱を短時間で行なう
ことができ、測定時間を短縮することができる。
また、検体間の温度差が少なくなり、測定値のバ
ラツキをさらに小さくすることができる。 本発明に用いる、測定物質に特異的に結合する
物質の固相化物は、測定物質に特異的に結合する
物質を不溶性の担体に結合することにより得るこ
とができる。このような担体の材質としては、ポ
リスチレン、セルローズ、アガロース、ガラス、
架橋デキストラン、金属などがあげられる。また
その形状としては、チユーブ、マイクロタイター
プレート、カツプ、粉末、球、デイスク、板、薄
片などの形があげられる。例えば抗体の固相化に
ポリスチレン製のマイクロタイタープレートを担
体として用いる場合、抗体を緩衝液などで適当に
希釈してプレートに加え、静置することにより、
プレートの内壁に抗体は結合し、抗体の固相化物
を得ることができる。 測定物質に特異的に結合する物質の酵素ラベル
化物の製造に用いられる酵素としては、エンザイ
ムイムノアツセイに通常用いられるものを使用す
ることができる。例えば、アルカリフオスフアタ
ーゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダー
ゼなどがあげられる。また、酵素ラベル化法とし
ては、グルタルアルデヒド法、中根法、マレイミ
ド法、混合酸無水物法、カルボジイミド法などを
用いることができる。例えば、抗体に酵素を加
え、これにグルタルアルデヒドを0.2〜0.8％濃度
になるように加えて室温で反応させて抗体の酵素
ラベル化物を得ることができる。 基質としては、酵素ラベル化物の製造に用いた
酵素の基質を用いる。酵素がアルカリフオスフア
ターゼの場合、基質はＰ−ニトロフエニルフオス
フエート、β−グリセロールフオスフエート、フ
エニルフオスフエート、β−ナスチルフオスフエ
ート、フエノールフタレンフオスフエートなどが
用いられる。 酵素反応の停止液としては、それぞれの酵素に
ついて知られているものを用いることができる。
アルカリフオスフアターゼの場合、1N−水酸化
ナトリウムが適当である。 以上、本発明方法について説明したが、本発明
方法により測定できる物質は、その物質に特異的
に結合する結合パートナーを有する物質である。
このような物質として、抗原−抗体、ハプテン−
抗体の関係にある両物質があげられる。例えば、
α−フエトプロテイン、CEA、BFP（NEA）、ア
ルドラーゼなどの癌関連抗原、HB抗原（HBs、
HBc、HBe）、HA抗原、非Ａ非Ｂなどの肝炎関
連抗原、インシユリン、HCGなどのホルモン類、
免疫グロブリン、アルブミン、α−マクログロブ
リンおよびこれらの抗体などがあげられる。 次に実施例を示し、本発明を更に詳しく説明す
る。 実施例 １ α−フエトプロテインの測定 (a) 固相化抗ヒトα−フエトプロテイン抗体 ポリスチレン製のカツプ（内径6.5mm、深さ
10mm）に、精製抗ヒトα−フエトプロテイン抗
体（ウサギ）を10μｇ／ml含有する0.05Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.0）150μを加え、４℃
で一夜静置した。液をカツプより除去し、精製
水で洗浄して抗ヒトα−フエトプロテイン抗体
結合カツプを得た。 (b) アルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトα−フ
エトプロテイン抗体 アルカリフオスフアターゼ溶液１ml（蛋白量
３mg、比活性1000単位／mg）に精製抗ヒトα−
フエトプロテイン抗体３mgを含む0.05Mトリス
−塩酸緩衝液0.5mlを加えた。これに25％グル
タールアルデヒド水溶液を加え、グルタールア
ルデヒド濃度0.2％に調整した。室温で３時間
静置した。次いで、0.05Mトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）で一夜透析し、アルカリフオスフアタ
ーゼ標識抗ヒトα−フエトプロテイン抗体を得
た。 (c) エンザイムイムノアツセイ Γ測定系Ａ 96個（横８×縦12）の穴のあいたアルミニウ
ム板（アルミホルダー）の各穴に上記(a)のカツ
プを挿入した。 (1) このアルミホルダーを氷の上におき、冷却
下にNo.１〜48のカツプにα−フエトプロテイ
ン陽性ヒト血清100μ（α−フエトプロテ
イン濃度120nｇ／ml、検体温度19℃）、No.49
〜56のカツプにα−フエトプロテイン標準検
体（検量線作成用）100μ、No.57〜No.96の
カツプに上記のα−フエトプロテイン陽性ヒ
ト血清100μをマイクロピペツトで番号順
に入れた。 (2) アルミホルダーを37℃の温湯につけ、60分
間反応させた。 (3) アルミホルダーを温湯よりとり出し、カツ
プ内液を順次アスピレーターで吸引除去した
後、精製水で洗浄（精製水を加えた後吸収除
去）を３回行なつた。 (4) アルミホルダーを氷上におき、前記(b)のア
ルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトα−フエ
トプロテイン抗体を50％ウサギ血清で400倍
に希釈した液100μ（４℃）を各カツプに
順次加えた。 (5) アルミホルダーを37℃の温湯につけ、60分
間反応させた。 (6) 前記(3)と同様にしてカツプ内液の除去、洗
浄を行なつた。 (7) アルミホルダーを氷上におき、Ｐ−ニトロ
フエニルフオスフエート水溶液（４mg／ml）
100μ（４℃）を各カツプに順次加えた。 (8) アルミホルダーを37℃の温湯につけ、60分
間反応させた。 (9) アルミホルダーを温湯よりとり出して氷上
におき、２分間冷却した後、1N−水酸化ナ
トリウム100μ（４℃）を各カツプに順次
加えた。 (10) カツプ内液を精製水で11倍に希釈し、分光
光度計で405ｍμにおける吸光度を測定した。 No.49〜56のカツプのOD405ｍμより検量線
を作成し、No.１〜48、No.57〜96のα−フエト
プロテイン濃度を求めた。 Γ測定系Ｂ 測定系Ａの(3)および(6)において、温湯よりと
り出したアルミホルダーを氷上に２分間おいて
冷却した後、各操作を行なつた。 Γ測定系Ｃ 測定系Ａの(4)、(7)および(9)において、アルミ
ホルダーを氷で冷却しないで、室温下（19℃）
で各操作を行なつた。 Γ測定系Ｄ 測定系Ａの(1)、(4)、(7)および(9)において、ア
ルミホルダーを氷で冷却しないで、室温下（19
℃）で各操作を行なつた。 測定系Ａ〜Ｄによるα−フエトプロテインの
測定結果を表１に示す。
イツチ法の改良方法に関するものである。 エンザイムイムノアツセイのサンドイツチ法
は、特公昭52−47011号公報、特開昭52−32114号
公報、特開昭52−57316号公報、特開昭52−47011
号公報、「医学のあゆみ」第102巻第２号第57〜65
頁などに示されているように、物質の微量測定法
として近年開発された優れた方法である。主とし
て、α−フエトプロテイン、HBs抗原、ホルモ
ン類などの抗原性物質の測定に用いられている。 このエンザイムイムノアツセイのサンドイツチ
法で物質を測定するにあたつて、一検体ごと別々
に測定することももちろんできるが、ほとんどの
場合には、同じ物質の検出を目的とする多数の検
体を一度にまとめて測定を行なう。まとめて測定
を行なう場合、測定しようとする物質に特異的に
結合する物質の固相化物と多数の検体とを室温に
おいて順次接触させ、続いて室温ないし45℃で反
応させた後、それに続く工程を経て測定を行なつ
ている。しかし、この場合、測定値に大きなバラ
ツキが生じる。これは上記のように、測定しよう
とする物質に特異的に結合する物質の固相化物と
多数の検体を順次接触させるので、最初に接触さ
せた検体と最後に接触させた検体とでは時間のず
れがかなり生じる。このような時間のずれは、上
記に続く工程においても発生するが、上記工程の
それが最も大きい。この時間のずれが原因で測定
値にバラツキが発生するものと考えられる。した
がつて一度に測定を行なう検体数が多いほどバラ
ツキは大きくなる。 次に示す本発明方法は、上記欠点を改良するも
のであり、本発明の冷却手段により、測定値のバ
ラツキを小さくすることができる。 ａ 測定物質（検体）とその物質に特異的に結合
する物質の固相化物とを反応させ、 ｂ 固相と液相に分離し、 ｃ 固相と測定物質に特異的に結合する物質の酵
素ラベル化物とを反応させ、 ｄ 固相と液相に分離し、 ｅ 固相または液相とｃの工程の酵素に対する基
質とを反応させ、 ｆ 反応液の吸光度を測定する エンザイムイムノアツセイにより複数の検体を同
時に測定するにあたり、ａの工程において、ま
ず、０℃〜15℃の冷却下に検体と測定物質に特異
的に結合する物質の固相化物とを順次接触させ、
ついでこれらを同時に室温ないし45℃でインキユ
ベーシヨンする。 上記工程に続き、前記のｂ〜ｆの工程を常法に
より行ない検体中の物質の測定を行なう。 上記ａの工程の反応は、別に用意した試験管な
どの反応容器中で固相化物と検体とを反応させる
か、またはマイクロタイタープレート、カツプ
（いずれも内壁に測定物質に特異的に結合する物
質がコートないし結合している）のように反応容
器を兼ねた固相化物に検体を加えて反応させる。
この反応において、０℃〜15℃、室温ないし45℃
に温度コントロールするためには、冷却手段とし
て冷却プレートなどの電気的冷却装置、氷、冷水
など、また加熱手段としてホツトプレート、恒温
槽、孵卵器などの電気的装置、温水などを用いて
反応温度をコントロールすることができる。 ｂの工程は、反応液を除き、固相を水、緩衝液
などで洗浄することにより行なうことができる。 ｃの工程は、固相と測定物質に特異的に結合す
る物質の酵素ラベル化物とを、室温ないし45℃で
反応させることにより行なうことができる。この
工程においても、固相に酵素ラベル化物を順次加
える際、０℃〜15℃で加え、続いて室温ないし45
℃で反応を行なうことが測定値のバラツキをおさ
える上で望ましい。 ｄの工程は、反応液と固相とを分離する。次の
ｅの工程で、固相を用いる場合には、分離した固
相を緩衝液、水などで洗浄する。 ｅの工程は、ｄの工程で得た固相または液相
に、用いた酵素に対する基質溶液を順次加えて酵
素反応を行ない、一定時間後に、酵素反応停止液
を加えることにより行なうことができる。上記酵
素反応の温度は用いた酵素の至適温度に調整す
る。この工程においても、固相または液相に基質
溶液を加える際、および反応液に反応停止液を加
える際は０℃〜15℃で行なうことが測定値のバラ
ツキをおさえる上で望ましい。 ｆの工程は、基質分解液の定量に適した波長を
用い、吸光度計により測定することにより行なう
ことができる。 以上の測定系で、測定しようとする既知量の物
質を用いて吸光度を予め測定し、その量と吸光度
との間の検量線を求める。次いで未知量の検体に
ついて、同測定系で吸光度を測定すれば、上記検
量線より、検体中の測定しようとする物質の量を
求めることができる。 本発明では、測定値のバラツキを小さくするた
めに、前記のように、ａの工程、望ましくはそれ
に加えてｃの工程およびｅの工程において０℃〜
15℃の冷却下に反応物を加える。また、ｂおよび
ｄの工程において、固相と液相の分離を検体ごと
に順次行なう場合には、これらの工程も０℃〜15
℃の冷却下に行なうのが望ましい。 本発明において、冷却または加熱する際には、
反応容器の外壁が密着するような金属ホルダーを
用いれば、温度コントロールが容易である。例え
ば、アルミニウム、銅、鉄などの熱良伝導体の板
に反応容器が密着して入るような穴を所定の数あ
け、あるいはそのような形状のものを鋳造し、こ
の穴に反応容器を差し込み、前記した冷却または
加熱手段により温度コントロールを行なう。ま
た、上記形状の他、円筒状の突起部を有し、その
円筒の中に反応容器が入るような形状のもの、あ
るいは反応容器の外壁を金属箔または金属板で被
うような形状のものがあげられる。これらは反応
容器の脱着ができる形態のもの、あるいは反応容
器と一体化したもののいずれでもよい。このよう
な器具を用いれば、冷却、加熱を短時間で行なう
ことができ、測定時間を短縮することができる。
また、検体間の温度差が少なくなり、測定値のバ
ラツキをさらに小さくすることができる。 本発明に用いる、測定物質に特異的に結合する
物質の固相化物は、測定物質に特異的に結合する
物質を不溶性の担体に結合することにより得るこ
とができる。このような担体の材質としては、ポ
リスチレン、セルローズ、アガロース、ガラス、
架橋デキストラン、金属などがあげられる。また
その形状としては、チユーブ、マイクロタイター
プレート、カツプ、粉末、球、デイスク、板、薄
片などの形があげられる。例えば抗体の固相化に
ポリスチレン製のマイクロタイタープレートを担
体として用いる場合、抗体を緩衝液などで適当に
希釈してプレートに加え、静置することにより、
プレートの内壁に抗体は結合し、抗体の固相化物
を得ることができる。 測定物質に特異的に結合する物質の酵素ラベル
化物の製造に用いられる酵素としては、エンザイ
ムイムノアツセイに通常用いられるものを使用す
ることができる。例えば、アルカリフオスフアタ
ーゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダー
ゼなどがあげられる。また、酵素ラベル化法とし
ては、グルタルアルデヒド法、中根法、マレイミ
ド法、混合酸無水物法、カルボジイミド法などを
用いることができる。例えば、抗体に酵素を加
え、これにグルタルアルデヒドを0.2〜0.8％濃度
になるように加えて室温で反応させて抗体の酵素
ラベル化物を得ることができる。 基質としては、酵素ラベル化物の製造に用いた
酵素の基質を用いる。酵素がアルカリフオスフア
ターゼの場合、基質はＰ−ニトロフエニルフオス
フエート、β−グリセロールフオスフエート、フ
エニルフオスフエート、β−ナスチルフオスフエ
ート、フエノールフタレンフオスフエートなどが
用いられる。 酵素反応の停止液としては、それぞれの酵素に
ついて知られているものを用いることができる。
アルカリフオスフアターゼの場合、1N−水酸化
ナトリウムが適当である。 以上、本発明方法について説明したが、本発明
方法により測定できる物質は、その物質に特異的
に結合する結合パートナーを有する物質である。
このような物質として、抗原−抗体、ハプテン−
抗体の関係にある両物質があげられる。例えば、
α−フエトプロテイン、CEA、BFP（NEA）、ア
ルドラーゼなどの癌関連抗原、HB抗原（HBs、
HBc、HBe）、HA抗原、非Ａ非Ｂなどの肝炎関
連抗原、インシユリン、HCGなどのホルモン類、
免疫グロブリン、アルブミン、α−マクログロブ
リンおよびこれらの抗体などがあげられる。 次に実施例を示し、本発明を更に詳しく説明す
る。 実施例 １ α−フエトプロテインの測定 (a) 固相化抗ヒトα−フエトプロテイン抗体 ポリスチレン製のカツプ（内径6.5mm、深さ
10mm）に、精製抗ヒトα−フエトプロテイン抗
体（ウサギ）を10μｇ／ml含有する0.05Mトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.0）150μを加え、４℃
で一夜静置した。液をカツプより除去し、精製
水で洗浄して抗ヒトα−フエトプロテイン抗体
結合カツプを得た。 (b) アルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトα−フ
エトプロテイン抗体 アルカリフオスフアターゼ溶液１ml（蛋白量
３mg、比活性1000単位／mg）に精製抗ヒトα−
フエトプロテイン抗体３mgを含む0.05Mトリス
−塩酸緩衝液0.5mlを加えた。これに25％グル
タールアルデヒド水溶液を加え、グルタールア
ルデヒド濃度0.2％に調整した。室温で３時間
静置した。次いで、0.05Mトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）で一夜透析し、アルカリフオスフアタ
ーゼ標識抗ヒトα−フエトプロテイン抗体を得
た。 (c) エンザイムイムノアツセイ Γ測定系Ａ 96個（横８×縦12）の穴のあいたアルミニウ
ム板（アルミホルダー）の各穴に上記(a)のカツ
プを挿入した。 (1) このアルミホルダーを氷の上におき、冷却
下にNo.１〜48のカツプにα−フエトプロテイ
ン陽性ヒト血清100μ（α−フエトプロテ
イン濃度120nｇ／ml、検体温度19℃）、No.49
〜56のカツプにα−フエトプロテイン標準検
体（検量線作成用）100μ、No.57〜No.96の
カツプに上記のα−フエトプロテイン陽性ヒ
ト血清100μをマイクロピペツトで番号順
に入れた。 (2) アルミホルダーを37℃の温湯につけ、60分
間反応させた。 (3) アルミホルダーを温湯よりとり出し、カツ
プ内液を順次アスピレーターで吸引除去した
後、精製水で洗浄（精製水を加えた後吸収除
去）を３回行なつた。 (4) アルミホルダーを氷上におき、前記(b)のア
ルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトα−フエ
トプロテイン抗体を50％ウサギ血清で400倍
に希釈した液100μ（４℃）を各カツプに
順次加えた。 (5) アルミホルダーを37℃の温湯につけ、60分
間反応させた。 (6) 前記(3)と同様にしてカツプ内液の除去、洗
浄を行なつた。 (7) アルミホルダーを氷上におき、Ｐ−ニトロ
フエニルフオスフエート水溶液（４mg／ml）
100μ（４℃）を各カツプに順次加えた。 (8) アルミホルダーを37℃の温湯につけ、60分
間反応させた。 (9) アルミホルダーを温湯よりとり出して氷上
におき、２分間冷却した後、1N−水酸化ナ
トリウム100μ（４℃）を各カツプに順次
加えた。 (10) カツプ内液を精製水で11倍に希釈し、分光
光度計で405ｍμにおける吸光度を測定した。 No.49〜56のカツプのOD405ｍμより検量線
を作成し、No.１〜48、No.57〜96のα−フエト
プロテイン濃度を求めた。 Γ測定系Ｂ 測定系Ａの(3)および(6)において、温湯よりと
り出したアルミホルダーを氷上に２分間おいて
冷却した後、各操作を行なつた。 Γ測定系Ｃ 測定系Ａの(4)、(7)および(9)において、アルミ
ホルダーを氷で冷却しないで、室温下（19℃）
で各操作を行なつた。 Γ測定系Ｄ 測定系Ａの(1)、(4)、(7)および(9)において、ア
ルミホルダーを氷で冷却しないで、室温下（19
℃）で各操作を行なつた。 測定系Ａ〜Ｄによるα−フエトプロテインの
測定結果を表１に示す。
【表】
表に示すように、冷却操作を全く行なわない
Ｄ（対照）の測定系においては、測定値のバラ
ツキが非常に大きい。すなわち、全検体につい
ての変動系数は17.5％と非常に大きい。また、
No.１〜16の平均値が142.6nｇ／ml、No.81〜96の
平均値が96.8nｇ／mlとなつている。つまり、
測定操作における順番により測定値が大きく異
なる。これに対し、冷却操作を行なつたＡ、
Ｂ、Ｃの測定系においては、測定値のバラツキ
は非常に小さい。 実施例 ２ α−フエトプロテインの測定 実施例１の測定系Ａにより、α−フエトプロテ
イン陽性ヒト血清（α−フエトプロテイン濃度
120nｇ／ml、検体温度４℃）の測定を行なつた。
対象として、実施例１の測定系Ｄにより測定を行
なつた。結果を表２に示す。
Ｄ（対照）の測定系においては、測定値のバラ
ツキが非常に大きい。すなわち、全検体につい
ての変動系数は17.5％と非常に大きい。また、
No.１〜16の平均値が142.6nｇ／ml、No.81〜96の
平均値が96.8nｇ／mlとなつている。つまり、
測定操作における順番により測定値が大きく異
なる。これに対し、冷却操作を行なつたＡ、
Ｂ、Ｃの測定系においては、測定値のバラツキ
は非常に小さい。 実施例 ２ α−フエトプロテインの測定 実施例１の測定系Ａにより、α−フエトプロテ
イン陽性ヒト血清（α−フエトプロテイン濃度
120nｇ／ml、検体温度４℃）の測定を行なつた。
対象として、実施例１の測定系Ｄにより測定を行
なつた。結果を表２に示す。
【表】
上記表に示すように、あらかじめ４℃に冷却し
た検体の測定を行なう際も、本発明の冷却操作を
加えた方が測定値のバラツキは小さい。 実施例 ３ α−フエトプロテインの測定 α−フエトプロテイン陽性ヒト血清（α−フエ
トプロテイン濃度130nｇ／ml、検体温度28℃）
の測定を実施例１の測定系Ａに準じて行なつた。
検体のアツセイにはNo.１〜96のカツプを用いた。
標準検体のアツセイはNo.48とNo.49のアツセイの間
に、別に用意したカツプで行なつた。室温は28℃
である。実施例１の測定系Ａの(1)、(4)、(7)および
(9)における氷での冷却のかわりに、３℃、７℃、
10℃、15℃の冷水で冷却した。対照は、この(1)、
(4)、(7)および(9)において、室温（28℃）および20
℃の冷水での冷却下に操作を行なつた。結果を表
３に示す。
た検体の測定を行なう際も、本発明の冷却操作を
加えた方が測定値のバラツキは小さい。 実施例 ３ α−フエトプロテインの測定 α−フエトプロテイン陽性ヒト血清（α−フエ
トプロテイン濃度130nｇ／ml、検体温度28℃）
の測定を実施例１の測定系Ａに準じて行なつた。
検体のアツセイにはNo.１〜96のカツプを用いた。
標準検体のアツセイはNo.48とNo.49のアツセイの間
に、別に用意したカツプで行なつた。室温は28℃
である。実施例１の測定系Ａの(1)、(4)、(7)および
(9)における氷での冷却のかわりに、３℃、７℃、
10℃、15℃の冷水で冷却した。対照は、この(1)、
(4)、(7)および(9)において、室温（28℃）および20
℃の冷水での冷却下に操作を行なつた。結果を表
３に示す。
【表】
表に示すように冷却温度が低いほど測定値のバ
ラツキは小さい。 実施例 ４ ヒト筋肉型アルドラーゼの測定 (a) 固相化抗ヒト筋肉型アルドラーゼ抗体 精製抗ヒト筋肉型アルドラーゼ抗体（ニワト
リ）を用い、実施例１の(a)と同様にして、抗ヒ
ト筋肉型アルドラーゼ抗体結合カツプを得た。 (b) アルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトα−フ
エトプロテイン抗体 精製抗ヒト筋肉型アルドラーゼ抗体（ニワト
リ）を用い、実施例１の(b)と同様にして、アル
カリフオスフアターゼ標識抗ヒトα−フエトプ
ロテイン抗体を得た。 (c) エンザイムイムノアツセイ 実施例１で用いたアルミホルダーに、上記(a)
で得たカツプ54個を挿入した。このアルミホル
ダーを氷の上におき、冷却下にNo.１〜24のカツ
プにヒト筋肉型アルドラーゼ陽性ヒト血清
100μ（ヒト筋肉型アルドラーゼ濃度250n
ｇ／ml、検体温度19℃）、No.25〜32のカツプに
ヒト筋肉型アルドラーゼ標準検体（検量線作成
用）100μ、No.33〜56のカツプに上記のヒト
筋肉型アルドラーゼ陽性ヒト血清100μを番
号順に入れた。アルミホルダーを37℃の温湯に
つけ、60分間反応させた。アルミホルダーを温
湯よりとり出し、カツプ内液を順次アスピレー
ターで吸引除去した後、精製水で洗浄（精製水
を加えた後吸引除去）を３回行なつた。室温
（19℃）下に、前記(b)のアルカリフオスフアタ
ーゼ標識抗ヒト筋肉型アルドラーゼ抗体を50％
ウサギ血清で400倍に希釈した液100μ（４
℃）を各カツプに順次加えた。アルミホルダー
を37℃の温湯につけ、60分間反応させた。アル
ミホルダーを温湯よりとり出し、カツプ内液を
吸引除去した後、前記と同様に、精製水で３回
洗浄した。室温下に、Ｐ−ニトロフエニルフオ
スフエート水溶液（４mg／ml）100μ（４℃）
を各カツプに順次加えた。アルミホルダーを37
℃の温湯につけ、60分間反応させた。アルミホ
ルダーを温湯よりとり出し、室温下に1N−水
酸化ナトリウム100μ（４℃）を各カツプに
順次加えた。カツプ内液を精製水で11倍に希釈
し、分光光度計で405ｍμにおける吸光度を測
定した。検量線を作成し、各検体のヒト筋肉型
アルドラーゼの濃度を求めた。次の表に測定結
果を示す。
ラツキは小さい。 実施例 ４ ヒト筋肉型アルドラーゼの測定 (a) 固相化抗ヒト筋肉型アルドラーゼ抗体 精製抗ヒト筋肉型アルドラーゼ抗体（ニワト
リ）を用い、実施例１の(a)と同様にして、抗ヒ
ト筋肉型アルドラーゼ抗体結合カツプを得た。 (b) アルカリフオスフアターゼ標識抗ヒトα−フ
エトプロテイン抗体 精製抗ヒト筋肉型アルドラーゼ抗体（ニワト
リ）を用い、実施例１の(b)と同様にして、アル
カリフオスフアターゼ標識抗ヒトα−フエトプ
ロテイン抗体を得た。 (c) エンザイムイムノアツセイ 実施例１で用いたアルミホルダーに、上記(a)
で得たカツプ54個を挿入した。このアルミホル
ダーを氷の上におき、冷却下にNo.１〜24のカツ
プにヒト筋肉型アルドラーゼ陽性ヒト血清
100μ（ヒト筋肉型アルドラーゼ濃度250n
ｇ／ml、検体温度19℃）、No.25〜32のカツプに
ヒト筋肉型アルドラーゼ標準検体（検量線作成
用）100μ、No.33〜56のカツプに上記のヒト
筋肉型アルドラーゼ陽性ヒト血清100μを番
号順に入れた。アルミホルダーを37℃の温湯に
つけ、60分間反応させた。アルミホルダーを温
湯よりとり出し、カツプ内液を順次アスピレー
ターで吸引除去した後、精製水で洗浄（精製水
を加えた後吸引除去）を３回行なつた。室温
（19℃）下に、前記(b)のアルカリフオスフアタ
ーゼ標識抗ヒト筋肉型アルドラーゼ抗体を50％
ウサギ血清で400倍に希釈した液100μ（４
℃）を各カツプに順次加えた。アルミホルダー
を37℃の温湯につけ、60分間反応させた。アル
ミホルダーを温湯よりとり出し、カツプ内液を
吸引除去した後、前記と同様に、精製水で３回
洗浄した。室温下に、Ｐ−ニトロフエニルフオ
スフエート水溶液（４mg／ml）100μ（４℃）
を各カツプに順次加えた。アルミホルダーを37
℃の温湯につけ、60分間反応させた。アルミホ
ルダーを温湯よりとり出し、室温下に1N−水
酸化ナトリウム100μ（４℃）を各カツプに
順次加えた。カツプ内液を精製水で11倍に希釈
し、分光光度計で405ｍμにおける吸光度を測
定した。検量線を作成し、各検体のヒト筋肉型
アルドラーゼの濃度を求めた。次の表に測定結
果を示す。
【表】
実施例 ５
HBs抗原の測定
(a) 固相化抗HBs抗体
精製抗HBs抗体（ウサギ）を用い、実施例
１の(a)と同様にして、抗HBs抗体結合カツプ
を得た。 (b) アルカリフオスフアターゼ標識抗HBs抗体 精製抗HBs抗体（ウサギ）を用い、実施例
１の(b)と同様にして、アルカリフオスフアター
ゼ標識抗HBs抗体を得た。 (c) エンザイムイムノアツセイ 実施例１で用いたアルミホルダーに、上記(a)
で得たカツプ18個を挿入した。このアルミホル
ダーを氷の上におき、冷却下にNo.１〜６のカツ
プにHBs抗原陽性ヒト血清（HBs抗原濃度
210nｇ／ml、検体温度19℃）、No.７〜12のカツ
プにHBs抗原標準検体（検量線作成用）100μ
、No.13〜18のカツプに上記HBs抗原陽性ヒ
ト血清100μを番号順に入れた。アルミホル
ダーを37℃の温湯につけ60分間反応させた。ア
ルミホルダーを温湯よりとり出し、カツプ内容
を順次アスピレーターで吸収除去した後、精製
水で洗浄（精製水を加えた後吸引除去）を３回
行なつた。室温（19℃）下に、前記(b)のアルカ
リフオスフアターゼ標識抗HBs抗体を50％ウ
サギ血清で400倍に希釈した液100μ（４℃）
を各カツプに順次加えた。以後、実施例４と同
様にして、検体中のHBs抗原を測定した。全
検体（No.１〜６、13〜18）の平均値は211.1n
ｇ／ml、変動係数（c.v.）は4.2％であつた。
１の(a)と同様にして、抗HBs抗体結合カツプ
を得た。 (b) アルカリフオスフアターゼ標識抗HBs抗体 精製抗HBs抗体（ウサギ）を用い、実施例
１の(b)と同様にして、アルカリフオスフアター
ゼ標識抗HBs抗体を得た。 (c) エンザイムイムノアツセイ 実施例１で用いたアルミホルダーに、上記(a)
で得たカツプ18個を挿入した。このアルミホル
ダーを氷の上におき、冷却下にNo.１〜６のカツ
プにHBs抗原陽性ヒト血清（HBs抗原濃度
210nｇ／ml、検体温度19℃）、No.７〜12のカツ
プにHBs抗原標準検体（検量線作成用）100μ
、No.13〜18のカツプに上記HBs抗原陽性ヒ
ト血清100μを番号順に入れた。アルミホル
ダーを37℃の温湯につけ60分間反応させた。ア
ルミホルダーを温湯よりとり出し、カツプ内容
を順次アスピレーターで吸収除去した後、精製
水で洗浄（精製水を加えた後吸引除去）を３回
行なつた。室温（19℃）下に、前記(b)のアルカ
リフオスフアターゼ標識抗HBs抗体を50％ウ
サギ血清で400倍に希釈した液100μ（４℃）
を各カツプに順次加えた。以後、実施例４と同
様にして、検体中のHBs抗原を測定した。全
検体（No.１〜６、13〜18）の平均値は211.1n
ｇ／ml、変動係数（c.v.）は4.2％であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ａ 測定物質（検体）とその物質に特異的に
結合する物質の固相化物とを反応させ、 ｂ 固相と液相に分離し、 ｃ 固相と測定物質に特異的に結合する物質の酵
素ラベル化物とを反応させ、 ｄ 固相と液相に分離し、 ｅ 固相または液相とｃの工程の酵素に対する基
質とを反応させ、 ｆ 反応液の吸光度を測定する エンザイムイムノアツセイにより複数の検体を同
時に測定するにあたり、ａの工程において、ま
ず、０℃〜15℃の冷却下に検体と測定物質に特異
的に結合する物質の固相化物とを順次接触させ、
ついでこれらを同時に室温ないし45℃でインキユ
ベーシヨンすることを特徴とする、物質の測定方
法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56021366A JPS57136163A (en) | 1981-02-18 | 1981-02-18 | Method for assaying material by enzyme immunoassay |
| DE8282101136T DE3266735D1 (en) | 1981-02-18 | 1982-02-16 | An enzyme immuno-assay for simultaneously measuring a plurality of samples and test vessel for carrying out this method |
| EP82101136A EP0058428B1 (en) | 1981-02-18 | 1982-02-16 | An enzyme immuno-assay for simultaneously measuring a plurality of samples and test vessel for carrying out this method |
| CA000396435A CA1192839A (en) | 1981-02-18 | 1982-02-17 | Method for measuring substances by enzyme immunoassay |
| US06/609,530 US4743544A (en) | 1981-02-18 | 1984-05-14 | Method for measuring substances by enzyme immunoassay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56021366A JPS57136163A (en) | 1981-02-18 | 1981-02-18 | Method for assaying material by enzyme immunoassay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57136163A JPS57136163A (en) | 1982-08-23 |
| JPS647342B2 true JPS647342B2 (ja) | 1989-02-08 |
Family
ID=12053091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56021366A Granted JPS57136163A (en) | 1981-02-18 | 1981-02-18 | Method for assaying material by enzyme immunoassay |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4743544A (ja) |
| JP (1) | JPS57136163A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02266417A (ja) * | 1989-04-06 | 1990-10-31 | Nec Corp | マウス |
| JPH03208118A (ja) * | 1990-01-10 | 1991-09-11 | Fujitsu Ltd | マウスの誤動作防止回路 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4575485A (en) * | 1983-08-29 | 1986-03-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Ultrasonic enhanced immuno-reactions |
| DE3640318A1 (de) * | 1986-11-26 | 1988-06-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und testtraeger zur bestimmung eines analyten |
| US6319475B1 (en) * | 1995-02-24 | 2001-11-20 | Keiichi Katoh | Sample container |
| JP3985872B2 (ja) * | 1995-07-31 | 2007-10-03 | プレシジョン・システム・サイエンス株式会社 | 容器 |
| US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
| US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
| US20040214315A1 (en) * | 1998-10-29 | 2004-10-28 | Analytik Jena Ag | Ultrathin-walled multi-well plate for heat block thermocycling |
| CN1555294A (zh) * | 2001-09-20 | 2004-12-15 | 3-άҩƷ��˾ | 导热微量滴定板 |
| US9180461B2 (en) | 2012-10-22 | 2015-11-10 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Condensation-reducing incubation cover |
| US20140112829A1 (en) * | 2012-10-22 | 2014-04-24 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Tube strip handling and heating apparatus |
| USD735881S1 (en) | 2012-10-22 | 2015-08-04 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Tube strip holder for automated processing systems |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US31006A (en) * | 1861-01-01 | Feeding mechanism for spoke-machines | ||
| US30562A (en) * | 1860-11-06 | Washing-machine | ||
| USRE31006E (en) | 1968-09-24 | 1982-08-03 | Akzona Incorporated | Process for the demonstration and determination of reaction components having specific binding affinity for each other |
| US4154795A (en) * | 1976-07-23 | 1979-05-15 | Dynatech Holdings Limited | Microtest plates |
| NL7804144A (nl) * | 1978-04-18 | 1979-10-22 | Akzo Nv | Inrichting voor clorimetrische bepalingen. |
| US4246339A (en) * | 1978-11-01 | 1981-01-20 | Millipore Corporation | Test device |
| USRE30562E (en) | 1979-02-22 | 1981-03-31 | Immunological testing devices | |
| US4234680A (en) * | 1979-08-03 | 1980-11-18 | Calbiochem-Behring Corp. | Method for terminating a peroxidase catalyzed reaction |
| US4341866A (en) * | 1980-06-02 | 1982-07-27 | Syva Company | Antienzyme termination in enzyme immunoassays |
-
1981
- 1981-02-18 JP JP56021366A patent/JPS57136163A/ja active Granted
-
1984
- 1984-05-14 US US06/609,530 patent/US4743544A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02266417A (ja) * | 1989-04-06 | 1990-10-31 | Nec Corp | マウス |
| JPH03208118A (ja) * | 1990-01-10 | 1991-09-11 | Fujitsu Ltd | マウスの誤動作防止回路 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4743544A (en) | 1988-05-10 |
| JPS57136163A (en) | 1982-08-23 |
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