KR100242594B1 - 마커기 및 합텐이 선택적으로 혼입된 올리고머 담체 분자 - Google Patents

마커기 및 합텐이 선택적으로 혼입된 올리고머 담체 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 컨쥬게이트, 이것을 제조하는 방법 및 이러한 컨쥬게이트의 면역학적 검출방법에서 항원으로서 또는 DNA 진단을 위한 용도에 관한 것이다.

Description

마커기 및 합텐이 선택적으로 혼입된 올리고머 담체 분자 {OLIOGOMER CARRIER MOLECULES IN WHICH MARKER GROUPS AND HAPTENS ARE SELECTIVELY INCORPORATED}
체액, 특히 사람 혈청내의 면역글로불린의 검출은 미생물, 특히 HIV, 간염 바이러스 등의 바이러스에 의한 감염을 진단하는데 사용된다. 조사된 샘플중의 특이적 면역글로불린의 존재는 특이적 면역글로불린과 반응하는 하나 또는 여러개의 항원과의 반응에 의해 검출되는 것이 일반적이다. 샘플 액체중에서 특이적 면역글로불린을 측정하는 방법은 감도가 높고, 확실하고, 간단하고, 신속해야 한다.
또 다른 면역학적 방법은 분석물과 면역학적으로 유사한 합텐 및 분석물을 예를 들면 항체와 같은 수용체상의 결합 부위에 대해 경합시키는 방식으로, 분석물을 정성적 및 정량적으로 검출하는 경합적 면역검정법이다. 이러한 경우에, 분석물 유사체는 고체상에 결합할 수 있는 형태 또는 표지화 형태로 사용되는 것이 일반적이다.
최근 몇 년 동안에, 비-방사성 마커기를 기초로 하는 검출 시스템이 점차 개발되었고, 상기 시스템에서 조사된 샘플중의 예를 들면 특이적 항체와 같은 분석물의 존재는 광학적(예를 들어, 발광 또는 형광), NMR-활성, 또는 금속-침전 검출 시스템에 의해 측정될 수 있다.
EP-A-O 307 149는 하나는 고체상에 고정되고 다른 하나는 마커기를 함유하는 두 개의 재조합 폴리펩티드를 항원으로 사용하고, 상기 두 재조합 항원을 다른 유기체내에서 발현시켜 시험의 특이성을 증가시키는, 항체에 대한 면역학적 시험방법을 기술하고 있다.
EP-A-0 366 673은 샘플중의 항체를 정제되고 표지화된 항원 및 고체상-결합 형태로 존재하는 동일한 정제된 항원과의 반응에 의해 검출하는 방법을 기술하고 있다. 사람 IgG가 항원의 예로서 개시되어 있다.
EP-A-0 386 713은 다양한 HIV 항원이 샘플의 분액 및 표지화된 HIV 항원과 각각 접촉하게 되는 두 고체 지지체에 고정되는, 두 고체 지지체를 이용하여 HIV에 대한 항체를 검출하는 방법을 기술하고 있으며, 상기 방법에서 항체의 존재는 하나 이상의 시험에서의 양성 반응에 의해 검출된다. 재조합적으로 제조된 폴리펩티드가 HIV 항원으로서 개시되어 있다.
EP-A-0 507 586은 특이적 면역글로불린에 대한 면역학적 시험의 수행방법을 기술하고 있으며, 상기 방법에서 샘플은 면역글로불린과 결합할 수 있는 두 항원과 접촉하게 되고, 상기 두 항원중 제 1 항원은 고체 지지체에 결합하는데 적당한 기를 함유하고, 제 2 항원은 마커기를 함유한다. 마커기는 예를 들면, 효소, 색원체 또는 금속 입자와 같은 직접 마커기이거나, 항원에 부착된 마커기가 신호-발생기를 차례로 함유하는 마커기에 대한 수용체와 반응할 수 있는 간접 마커기일 수 있다. 플루오레세인 유도체가 상기 간접 마커기의 예로서 언급되며, 그것의 수용체는 효소와 차례로 결합되는 항체이다. B형 간염 표면 항원과 같은 폴리펩티드가 항원으로서 기술되어 있다. 플루오레세인을 결합시키는데 사용되는 SH 기는 유도체화에 의해 상기 항원으로 도입된다.
EP-A-0 507 587은 샘플이 검출하려는 항체에 대한 표지화 항원 및 고체상에 결합할 수 있는 검출하려는 항체에 대한 제 2 항원과 함께 인큐베이션되는, IgM 항체를 검출하는데 특히 적당한 방법을 기술하고 있다.
EP-A-0 199 804 및 EP-A-0 580 979는 발광 금속 킬레이트기 및 특히 루테늄 및 오스뮴 킬레이트기로 표지화된 항원을 사용하는 면역학적 검출방법을 기술하고 있다. 면역글로불린은 활성화 금속 착물과의 반응에 의해 통계적으로 표지화된 항원으로 사용된다.
EP-A-0 178 450은 항체와 같은 면역학적 활성 물질이 결합될 수 있는 금속 킬레이트, 특히 루테늄 착물을 기술하고 있다.
결합은 면역학적 반응성 물질과 금속 킬레이트의 통계적 반응에 의해 달성된다.
EP-A-0 255 534는 금속 킬레이트-결합된 항원 또는 항체를 사용하는 발광 면역검정법을 기술하고 있다. 결합은 예를 들어 금속 킬레이트 활성 에스테르 유도체와 항체의 통계적 반응에 의해 달성된다.
WO 90/05301은, (i) 첨가된 분석물, (ii) 분석물의 결합 파트너 또는 (iii) (i) 또는 (ii)에 결합할 수 있는 반응성 성분에 결합되는 발광 금속 킬레이트를 사용하는 전기화학발광에 의한 분석물의 검출방법 및 정량적 측정방법을 기술하고 있다. 발광은 금속 킬레이트를 활성화된 임의적 자기 마이크로입자에 결합시킨 후에 측정된다.
종래에 공지된 항체의 면역학적 검출방법에서는, 재조합 DNA 방법에 의해 일반적으로 제조되는 폴리펩티드 항원이 사용되는 것이 일반적이다. 그러나, 이러한 폴리펩티드 항원를 사용하면 문제가 발생할 수 있다. 따라서 재조합 폴리펩티드는 종종 융합 폴리펩티드의 형태로만 제조될 수 있고, 이러한 경우에 융합 부분은 시험에서 거짓 양성 결과를 유도할 수 있다. 부가하여, 재조합 발현에 의해 제조된 폴리펩티드는 종종 샘플 용액내에서 안정성이 매우 낮고, 응집하려는 경향이 있다. 또 다른 단점은 이러한 폴리펩티드로 마커기를 선택적으로 및 재현가능하게 도입시킬 수 없는 경우가 종종 있다는 것이다.
더욱이, 재조합 폴리펩티드 항원의 제조는 고비용이 소요되며, 다양한 많은 재조합 폴리펩티드의 면역학적 반응성에서의 광범위한 변이가 발생할 수 있다.
심지어 감도 및 정확성에 대해 매우 높은 요구를 갖는 경합적 면역검정법에서는, 에스트라디올 또는 테스토스테론과 같은 매우 낮은 농도로만 존재하는 분석물을 특히 전기화학발광을 기초로 하는 검출 시스템으로 검출하는 경우에, 공지 항원을 사용하여 요구되는 검출 하한을 달성하는 것은 종종 매우 어려운 일이다.
본 발명은 신규한 컨쥬게이트, 이것을 제조하는 방법 및 이러한 컨쥬게이트의 면역학적 검출방법에서 항원으로서 또는 DNA 진단을 위한 용도에 관한 것이다.
도 1은 금속 킬레이트-리신 유도체를 도시한다.
도 2는 비오틴-리신 유도체를 도시한다.
도 3은 본 발명에 따른 컨쥬게이트를 도시한다.
도 4는 대조 컨쥬게이트를 도시한다.
따라서, 본 발명의 목적은 종래의 공지 항원의 단점이 적어도 부분적으로 제거된 면역학적 시험을 위한 항원을 간단하고 효율적인 방식으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 데에 있다. 부가하여, 본 발명의 방법은 항원으로 마커기를 선택적 및 재현가능하게 도입시킬 수 있어야 한다.
상기한 문제는 반응성 측기(side group)에 결합된 1 내지 10개의 합텐 분자 및 1 내지 10개의 마커기 또는 고체상 결합기를 함유하고, 아미노산, 누클레오티드 및 펩티드 핵산으로부터 선택된 100개 이하의 단량체 단위를 갖는 중합체 담체를 포함하는 컨쥬게이트에 의해 해결된다.
면역학적 검출방법에서 1 내지 10개의 합텐 분자 및 한정된 수의 마커기 또는 고체상 결합기를 함유하는 본 발명에 따른 컨쥬게이트를 항원으로 사용하는 경우에, 놀랍게도 공지된 모노머 및 멀티머 항원에 비해 현저히 더 높은 감도 및 정확성과 동시에 감소된 검출 하한을 달성할 수 있다. 더욱이 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 고체상 합성법, 예를 들면 펩티드 고체상 합성법에 의해 간단한 방식으로 제조될 수 있다. 상기 단량체 단위에 관하여, 예를 들어 합텐 분자 또는 마커기 또는 고체상 결합기에 의해 유도체화된 아미노산 유도체가 예정된 위치에 혼입될 수 있다. 부가하여, 고체상 합성의 완결후에 유리 작용기를 갖는 단량체가 위치한 담체 사슬의 위치에 추가의 합텐 또는 마커기 또는 고체상 결합기를 선택적으로 혼입할 수 있다. 이는 합텐 분자 및 마커기 또는 고체상 결합기를 컨쥬게이트에 특정적이고 재현가능하게 혼입시킬 수 있게 한다. 컨쥬게이트상의 각각의 기 사이의 거리가 정확하게 특정되고, 필요에 따라 변경될 수 있다. 신호 강도가 마커기의 수에 비례하여 증가하도록, 컨쥬게이트상의 마커기의 거리를 선택하여 신호 켄칭(quenching)을 낮게 유지할 수 있다. 또한, 마커기의 특정 공간 배향은 예를 들면 나선형 담체의 경우에 신호 강도의 개선에 기여한다. 따라서, 마커기 사이의 거리는 단일가닥 또는 이중가닥 핵산과 같은 나선형 담체의 경우에 3 내지 6 및/또는 13 내지 16개의 단량체 단위인 것이 바람직하다.
컨쥬게이트의 골격을 형성하는 중합체 담체 분자의 길이는 100개 이하의 단량체 단위, 바람직하게는 3 내지 80개의 단량체 단위, 특히 바람직하게는 5 내지 60개의 단량체 단위이다.
단량체 단위는 아미노산, 누클레오티드 및 펩티드 핵산으로부터 선택된다. 중합체 담체는 아미노산으로 이루어진 펩티드 사슬, 바람직하게는 선형 펩티드 사슬을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 담체는 올리고누클레오티드일 수도 있고, 그것의 반응성 측기에 합텐 분자 및 마커기 또는 고체상 결합기가 결합된다.
부가하여, 중합체 담체는 펩티드 핵산으로 이루질 수 있다. 펩티드 핵산은 화학식 (CH2)k-CHR′-N[CO-(CH2)i-L]-CH2-(CH2)m-NH-CO-의 같거나 다른 단량체 단위로 구성된 폴리아미드 골격을 포함하며, 상기 식에서 L은 수소, 페닐, 천연 누클레오염기 및 비천연 누클레오염기로 이루어진 군으로부터 선택되고, R′은 수소 및 천연 또는 비천연 아미노산, 바람직하게는 α 아미노산의 측쇄로 이루어진 군으로부터 선택되고, k 및 m은 각각 0 또는 1이고, i는 독립적으로 0 내지 5 이다. 합텐 분자 및 마커기 또는 고체상 결합기는 펩티드 핵산의 누클레오염기 및/또는 아미노산 측쇄에 결합될 수 있다. 펩티드 핵산 및 이것들의 제조방법은 WO92/20703에 기술되어 있다. 개시 내용을 본원에 참고로서 포함한다.
펩티드 핵산의 경우에도, 담체는 단일 또는 이중가닥으로 존재할 수 있다. 하나 이상의 PNA 가닥, 예를 들면 하나의 PNA 가닥과 하나의 핵산 가닥, 예를 들면 DNA 가닥을 갖는 이중 가닥 담체가 특히 바람직하다.
컨쥬게이트는 1 내지 10개의 합텐 분자, 바람직하게는 1 내지 6개의 합텐 분자, 특히 바람직하게는 1 또는 2개의 합텐 분자를 함유한다. 합텐은 분자량이 100 내지 2000 Da인 면역학적 반응성 분자인 것이 바람직하다. 이러한 합텐은 예를 들어, 항생제, 마취제, 암페타민, 바르비투르산염, 세포증식 억제제(예를 들어, 젠타마이신, 토브라마이신, 반코마이신 등), 파라세타몰, 살리실산염, 페니토인, 퀴닌 및 퀴닌 유도체, 테오필린 등과 같은 약리학적 활성 물질, 스테롤, 담즙산, 성호르몬(예를 들면, 에스트라디올, 에스트리올, 테스토스테론, 프로게스테론, 프레그네놀론 및 이것들의 유도체), 코르티코이드(예를 들면, 코르티졸, 코르티코스테론, 코르티존 및 이것들의 유도체), 카르데놀리드 및 카르데놀리드-글리코시드(예를 들면, 디곡신, 디곡시제닌, 스트로판틴, 부파디에놀리드 등), 스테로이드-사포제닌, 스테로이드 알칼로이드, 펩티드 호르몬, 크레아티닌, 갑상선 호르몬 (예를 들면, T3, T4)과 같은 호르몬 및 대사산물, 신경전달물질(예들 들면, 세로토닌, 콜린, γ-아미노부티르산), 비타민 및 프로스타글란딘, 루코트리엔, 루코엔디인 및 트롬복산과 같은 매개물질로부터 선택될 수 있다.
다른 한편으로, 합텐은 바람직하게는 30개 이하의 아미노산 길이를 갖는 면역학적 반응성 펩티드 에피토프로부터도 선택될 수 있다. 이러한 펩티드 에피토프는 예를 들어 박테리아, 바이러스 및 원생동물과 같은 병원성 유기체 또는 자기면역 항원으로부터 유도될 수 있다. 면역학적 반응성 펩티드 에피토프는 예를 들어 HIV I, HIV II 또는 C형 간염 바이러스 (HCV)의 아미노산 서열과 같은 바이러스 항원으로부터 유도될 수 있다.
부가하여, 합텐은 샘플중에서 검출하려는 핵산 서열에 상보적이고, 바람직하게는 50개 이하의 누클레오티드 길이를 갖는 핵산으로부터 선택될 수도 있다. 최종적으로, 합텐은 50개 이하의 단량체 단위 길이를 갖는 펩티드 핵산으로부터 선택될 수도 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 1 내지 10개, 바람직하게는 2 내지 8개의 마커기 또는 고체상 결합기를 함유한다. 마커기의 바람직한 예는 발광 금속 킬레이트 및 형광 표지이다. 고체상 결합기의 바람직한 예는 스트렙트아비딘 또는 아비딘과 특이적으로 반응할 수 있는 비오틴 및 데스티오비오틴 및 이미노비오틴과 같은 비오틴 유사체이다.
합텐 분자 및 마커기 또는 고체상 결합기는 반응성 아미노 및/또는 티올 측기, 특히 바람직하게는 반응성 1차 아미노 측기를 통해 담체 사슬에 결합되는 것이 바람직하다. 이러한 측기는 적당한 단량체, 예를 들어 리신, 오르니틴, 히드록시리신 또는 시스테인과 같은 아미노산을 담체 사슬에 혼입시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 소정 구체예에서는, 합텐 및 마커기 또는 고체상 결합기와 담체 사슬 사이에 스페이서를 혼입시키는 것이 바람직할 수 있다. 스페이서는 가요성이고, 사슬 길이가 3 내지 30개의 원자인 것이 바람직하다. 스페이서는 옥시알킬렌 및/또는 히드록시 측기와 같은 친수성기를 함유하는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 마커기는 발광 금속 킬레이트, 즉 검출가능한 발광 반응을 생성할 수 있는 금속 킬레이트이다. 상기 발광 반응은 예를 들어 형광 또는 전자화학발광 측정에 의해 검출될 수 있다. 상기 금속 킬레이트의 금속은 예를 들어 전이 금속 또는 희토류 금속이다. 금속은 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 백금, 인듐, 팔라듐, 몰리브덴, 테크네튬, 구리, 크롬 또는 텅스텐인 것이 바람직하다. 루테늄, 이리듐, 레늄, 크롬 및 오스뮴이 특히 바람직하고, 루테늄이 가장 바람직하다.
금속과 함께 금속 킬레이트를 형성하는 리간드는 여러자리 리간드, 즉 수개의 배위 자리를 갖는 리간드인 것이 일반적이다. 여러자리 리간드는 예를 들어 방향족 및 지방족 리간드를 포함한다. 적당한 방향족 여러자리 리간드는 방향족 헤테로고리 리간드를 포함한다. 바람직한 방향족 헤테로고리 리간드는 예를 들어 비피리딜, 비피라질, 테르피리딜 및 페난트롤릴과 같은 질소-함유 폴리헤테로고리이다. 상기 리간드는 예를 들어 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 카르복실레이트, 카르복시알데히드, 카르복사미드, 시아노, 아미노, 히드록시, 이미노, 히드록시카르보닐, 아미노카르보닐, 아미딘, 구아니디늄, 우레이드, 황-함유기, 인-함유기 및 N-히드록시숙신이미드의 카르복실레이트 에스테르와 같은 치환체를 함유할 수 있다. 바람직한 리간드는 C2-C3알킬렌옥시, C2-C3알킬렌티오 및 C2-C3알킬렌 아미노기, 특히 에틸렌-옥시기를 함유한다. 킬레이트는 또한 하나 또는 여러 개의 한자리 리간드를 함유할 수도 있다. 한자리 리간드의 예는 일산화탄소, 시안화물, 이소시안화물, 할로겐화물 및 지방족, 방향족 및 헤테로고리 포스핀, 아민, 스틸벤 및 아르신을 포함한다.
발광 금속 킬레이트는 비피리딜 또는 페난트롤릴 리간드를 갖는 금속 킬레이트로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다. EP-A-0 178 450, EP-A-0 255 534, EP-A-0 580 979 및 WO90/05301에 적당한 금속 킬레이트 및 이것의 제조 방법의 예가 기술되어 있다. 그 개시내용을 본원에 참고로 포함한다. 루테늄-(비피리딜)3킬레이트가 가장 바람직한 금속 킬레이트이다. 상기 킬레이트는 예를 들어 Igen Inc. Company(미합중국의 매릴랜드 록빌에 소재)로부터 활성 에스테르 유도체의 형태로 상업적으로 구입할 수 있다.
전자화학발광 반응에 의해 검출가능한 발광 금속 착물을 마커기로서 사용하는 경우에, 예를 들어 아미노기 또는 카르복실레이트기와 같은 하나 이상의 양성 및/또는 음성 전하 담체를 담체 사슬 및/또는 금속 착물과 담체 사슬 사이의 스페이서로 혼입시키는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 담체 사슬은 예를 들어 합성 동안에 글루탐산 또는 아스파라긴산의 혼입에 의해 생성될 수 하나 또는 여러 개의 음전하를 함유하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 다른 마커기 또는 고체상 결합기, 예를 들어 형광기 또는 비오틴의 경우에도, 전하 담체를 담체 사슬 및/또는 스페이서로 혼입시키는 것이 유리할 수 있다.
바람직한 마커기의 또 다른 예는 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 레소루핀, 시아닌 및 이것들의 유도체와 같은 형광 표지이다. 형광 마커기를 사용하는 경우에는, 에너지 전달에 의한 형광 켄칭을 방지하기 위하여 공간적 배향 및 이격에 관해 형광 마커기를 고정시킨 나선형 구조의 담체 골격을 사용하는 것이 유리한 것으로 증명되었다. 적당한 나선 구조를 형성시키는 단량체의 예는 프롤린 또는 프롤린 측기를 갖는 펩티드 핵산 유도체이다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트는, (a) 합성 동안에 합텐 분자 및/또는 마커기 또는 고체상 결합기와 공유결합된 단량체 유도체를 담체상의 예정된 위치에 도입시키고/도입시키거나, (b) 합성 후에 활성화된 합텐 분자 및/또는 마커기 또는 고체상 결합기를 담체의 반응성 측기에 결합시키는, 단량체 단위로 구성된 중합체 담체, 바람직하게는 펩티드 담체를 고체상 합성시키는 방법에 의해 제조된다.
본 발명에 따른 방법중 변형 (a)에서는, 바람직하게는 리신 또는 오르니틴과 같은 염기성 아미노산의 1차 아미노 측기를 통하거나 시스테인과 같은 아미노산의 티올 측기를 통하여 합텐 분자 및/또는 마커기 또는 고체상 결합기에 공유결합된 단량체 유도체가 고체상 합성 동안에 도입된다. 상응하는 단량체 유도체는 예를 들어 활성화된 합텐 분자 또는 활성화된 마커기 또는 고체상 결합기, 예를 들어 활성 에스테르 유도체를 유리 1차 아미노기에 결합시키거나, 말레이미드 유도체를 임의로 부분적으로 보호된 단량체 유도체, 예를 들면 아미노산 유도체의 유리 티올기에 결합시켜 합성한다. 바람직한 금속 킬레이트-결합된 리신 유도체가 도 1에 도시되어 있다. 도 2는 비오틴화 리신 유도체를 도시한다.
본원에서 사용되는 "활성 에스테르"란 용어는 펩티드의 다른 반응성기와의 간섭 부반응이 일어날 수 없는 조건하에서 펩티드의 유리 아미노기와 반응할 수 있는 활성화된 에스테르기를 포함한다. N-히드록시-숙신이미드 에스테르가 활성 에스테르 유도체로 사용되는 것이 바람직하다. N-히드록시숙신이미드 에스테르 뿐만 아니라 유사한 p-니트로페닐, 펜타플루오로페닐, 이미다졸릴 또는 N-히드록시벤조트리아졸릴 에스테르도 사용될 수 있다.
Theisen 등 (Tetrahedron Letters 33 (1992), 5033-5036)은, 한 예로서 포스포르아미디트 유도체로 전환되는 형광 염료인 5-카르복시플루오레세인을 사용하는, 올리고누클레오티드 담체로의 혼입에 적당한 합텐, 마커기 및 고체상 결합기의 유도체를 합성하는 방법을 기술하고 있다. 상기 포스포르아미디트 유도체는 올리고누클레오티드의 5′말단 및/또는 3′말단 또는 올리고누클레오티드 서열내로 혼입될 수 있다.
본 발명에 따른 방법중 변형 (b)에 따르면, 도입되는 기가 바람직하게는 담체의 아미노 및/또는 티올 측기, 특히 바람직하게는 1차 아미노 측기에, 고체상 합성에 사용되는 단량체 유도체의 보호기를 절단한 후에 결합된다.
합텐 및 마커기 또는 고체상 결합기는 변형 (a)에 따라, 즉 고체상 합성 동안에 각 경우에 도입시키려는 기에 결합된 단량체 유도체를 사용하여 도입시키는 것이 바람직하다. 상기 변형에 따르면, 예를 들어 발광 금속 킬레이트, 비오틴 또는 펩티드 합텐이 문제 없이 도입될 수 있다. 그러나, 민감한 형광 염료 또는 표지 또는 스테로이드와 같은 다른 합텐의 경우에는, 상기 물질이 고체상 합성 조건하에서 분해될 수 있기 때문에 상기 방법이 부적당하다. 이러한 경우에, 컨쥬게이트는 변형 (b)의 방법에 따라서, 즉 완성된 담체 분자에 대한 후속 결합에 의하여 합성된다. 물론, 변형 (a) 및 변형 (b)의 방법을 조합하여 이용할 수도 있다.
변형 (b)에 따라서, 즉 합성의 완결 후에, 두 개의 다른 기, 예를 들어 합텐 및 마커기 또는 합텐 및 고체상 결합기를 도입할 수도 있다. 이와 관련하여, 변형 (b)에 따른 방법은 예를 들어 도입시키려는 제 1 기가 아미노 측기에 결합되고, 도입시키려는 제 2 기가 담체 분자의 티올 측기에 결합되는 방식으로 수행될 수 있다. 다른 한편으로, 도입시키려는 두 기는 각각 담체의 예정된 1차 아미노 측기에 선택적으로 결합될 수 있는데, 이때는 아미노 측기에 대한 제 1 보호기를 갖는 단량체 유도체가 합텐 분자가 결합될 담체의 위치에 사용되고, 아미노 측기에 대한 제 2 보호기를 갖는 단량체 유도체가 마커기 또는 고체상 결합기가 결합될 담체의 위치에 사용되며, 제 1 및 제 2 보호기는 두 반응 단계에서 보호기의 선택적 분해 및 그 후의 선택적인 결합을 가능하게 하는 방식으로 선택된다. 상기 목적을 위하여, 제 1 및 제 2 보호기는 Boc과 같은 산-불안정성 보호기 또는 페닐아세틸과 같은 산-안정성 보호기로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 목적하는 단량체 서열을 갖는 담체 분자는 고체상 합성된다. 펩티드 담체는 시판 펩티드 합성기(예를 들면, Applied Biosystems로부터의 A 431 또는 A 433 기기)를 사용하여 제조하는 것이 바람직하다. 합성은 아미노산 유도체를 사용하여 바람직하게는 펩티드의 카르복실 말단에서 출발하여 공지된 방법에 따라 수행한다. 결합에 필요한 아미노 말단기가 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 잔기로 유도된 아미노산 유도체를 사용하는 것이 바람직하다. 사용된 아미노산의 반응성 측기는 펩티드 합성의 완결 후에 용이하게 절단될 수 있는 보호기를 함유한다. 상기 보호기의 바람직한 예는 트리페닐메틸(Trt), t-부틸 에테르(tBu), t-부틸 에스테르(OtBu), 삼차-부톡시카르보닐(Boc), 2,2,5,7,8-펜타-메틸크로만-6-술포닐(Pmc) 또는 페닐아세틸과 같은 보호기이다.
합텐 또는 표지를 도입시키려는 펩티드의 위치에 위치한 리신 잔기 또는 일차 아미노 측기를 갖는 다른 아미노산 유도체의 아미노 측쇄는 변형 (a)에 따라 도입시키려는 기와 공유결합시킨다.
20개의 천연 아미노산 외에, 펩티드는 또한 β-알라닌, γ-아미노-부티르산, ε-아미노-카프로산, 노르루신 또는 오르니틴과 같은 합성 아미노산도 함유할 수 있다. 상기 합성 아미노산은 천연 아미노산과 유사하게 보호된 형태로 합성에 사용된다.
본 발명에 따른 방법중 변형 (b)에 따르면, 합텐 또는 표지가 합성을 완결시킨 후에 보호기의 분해 후의 펩티드를 펩티드의 유리 일차 아미노기와 반응하고 각각의 경우에 목적하는 활성화 기와 반응시켜 도입된다. 유리 일차 아미노기 당 활성 에스테르 1.5 내지 4 당량이 사용되는 것이 바람직하다. 후속하여, 반응 생성물은 바람직하게는 HPLC에 의해 정제된다. 변형 (b)에 따른 두 개의 다른 활성화 기의 도입은 전술한 바와 같은 두 개의 선택적으로 절단가능한 보호기를 사용하여 달성된다.
컨쥬게이트의 펩티드 골격은 비-면역학적 반응성 아미노산 서열, 즉 면역학적 검출방법에서 항원으로서의 컨쥬게이트의 의도된 사용에서 시험 과정과 간섭하지 않는 아미노산 서열을 가진다.
다른 한편, 담체 분자의 골격은 누클레오티드 또는 펩티드 핵산으로 구성될 수도 있다. 올리고누클레오티드 담체 분자의 합성은 시판 DNA 합성기에서 수행될 수 있다. 합텐 분자 및 마커기 또는 고체상 결합기는 바람직하게 포스포르아미디트 유도체로서 도입되고/도입되거나(Theisen 등, 상기 참조; Applied Biosystems, User Bulletin 67, FAM Amidite, May 1992), 그들은 후속하여 유리 반응성 측쇄에 결합된다. 펩티드 핵산을 기초로 하는 담체 분자는 예를 들어 WO92/20703에 기술된 방법에 따라서, 고체상 펩티드 합성법과 유사하게 합성된다. 합텐 분자 또는 마커기 또는 고체상 결합기는 펩티드 및 올리고누클레오티드 담체에 대해 설명된 방법에 따라서 도입될 수 있다.
본 발명은 또한 합텐 분자가 면역학적 반응성 분자라면 면역학적 방법에서 항원으로서, 합텐이 핵산이라면 DNA 진단을 위한 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
하나 초과의 합텐 분자를 함유하는 컨쥬게이트가 면역학적 검출방법에서 폴리합텐으로 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예는 샘플 액체내에서 특이적 항체를 측정하는 면역학적 방법에서 컨쥬게이트의 사용에 관한 것이다. 박테리아, 바이러스 또는 원생동물과 같은 미생물에 의한 감염을 나타내는 그러한 항체가 측정되는 것이 바람직하다. 바이러스에 대한 항체, 예를 들어 HIV 또는 간염 바이러스에 대한 항체가 측정되는 것이 특히 바람직하다. 샘플 액체는 혈청인 것이 바람직하고, 사람 혈청인 것이 특히 바람직하다. 부가하여, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 브리지 시험 방식으로 면역학적 방법에서 사용되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 (a) 샘플 액체를 측정하려는 항체에 대한 본 발명에 따른 하나 이상의 컨쥬게이트와 인큐베이션시키고, (b) 항체를 펩티드와의 결합을 통해 검출하는 것을 특징으로 하는, 샘플 액체중의 특이적 항체의 면역학적 측정방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 면역학적 측정방법은 실제로 모든 공지된 시험 방식, 예를 들면 단일 반응상을 사용하는 균일 면역검정법 또는 하나 초과의 반응상을 사용하는 불균일 면역검정법에 따라 수행될 수 있다. 항체의 존재가 고체상의 존재하에서 검출되는 불균일 시험 방식이 사용되는 것이 바람직하다. 상기 시험 방식의 한 가지 구체예는 소위 이중 항원 브리지 시험 디자인이다. 이 경우에, 샘플 액체는 측정하려는 항체에 대한 두 개의 항원과 반응성 고체상의 존재하에서 인큐베이션되며, 상기 두 항원중 제 1 항원은 마커기를 함유하고, 제 2 항원은 고체상에 결합되어 있거나 고체상에 결합할 수 있는 형태로 존재한다. 제 1 및/또는 제 2 항원은 본 발명에 따른 컨쥬게이트이다. 샘플 액체중의 측정하려는 항체는 임의적으로 고체상을 인큐베이션 액체로부터 분리시킨 후에 고체상 및/또는 액체상에서 표지를 측정하여 검출된다. 제 1 항원은 발광 금속 킬레이트 또는 형광기로 표지화된 컨쥬게이트인 것이 바람직하다. 제 2 항원은 비오틴으로 표지화되는 것이 바람직하고, 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상에 결합할 수 있다.
시험 과정은 샘플 액체를 제 1 표지화 항원 및 제 2 항원과 고체상에서 혼합하여, 제 1 항원, 항체 및 고체상-결합된 제 2 항원의 표지화되고 고정된 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 항체를 검출하는 다른 시험 방식과 비교하여, 브리지 시험 방식은 감도를 개선(즉, IgG, IgM, IgA 및 IgE와 같은 모든 면역글로불린류가 검출됨)시킬 뿐만 아니라, 특이성을 개선(즉, 비특이적 반응성이 감소됨)시킨다.
본 발명의 바람직한 제 2 구체예는 경합적 면역검정법에서 컨쥬게이트의 사용에 관한 것이다. 경합적 면역검정법은 일반적으로 저분자량의 분석물을 검출하는데 사용되고, 원칙적으로 "표지화 항체" 방식 및 "표지화 유사체" 방식의 두 시험 방식으로 수행될 수 있다. "표지화 항체" 방식에 있어서는, 측정하려는 분석물을 함유하는 샘플 액체가 분석물과 면역학적으로 경합하는 고체상에 결합할 수 있는 합텐 및 합텐과 분석물에 대한 항체와 같은 표지화된 수용체와 함께 인큐베이션된다. 상기의 시험 방식에 있어서, 고체상에 결합된 표지는 분석물의 농도에 반비례한다. "표지화 유사체" 방식에 있어서는, 측정하려는 분석물을 함유하는 샘플 액체가 분석물과 면역학적으로 경합하는 표지화 합텐 및 고체상에 결합할 수 있는 분석물과 합텐에 대한 수용체와 함께 인큐베이션된다. 그 후에 고체상-결합된 표지화 합텐의 양은 측정하려는 유리 분석물의 농도에 반비례한다.
따라서 본 발명은, (a) 샘플 액체를 반응성 고체상의 존재하에서 마커기를 함유하는 본 발명에 따른 컨쥬게이트 및 고체상에 결합되거나 고체상에 결합될 수 있고 분석물 및 컨쥬게이트의 합텐 성분과 특이적 면역 반응을 할 수 있는 수용체와 함께 인큐베이션시키고, (b) 고체상을 임의적으로 인큐베이션 액체로부터 분리시키고, (c) 샘플 액체중의 분석물의 존재 및/또는 분석물의 양을 고체상 및/또는 인큐베이션 액체에서 컨쥬게이트의 마커 성분을 측정하여 결정하는 것을 특징으로 하는, "표지화 유사체" 방식의 경합적 면역검정법의 원리를 기초로 하는 샘플 액체중의 분석물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 비오틴화 항체 또는 비오틴화 항체 단편이 고정가능한 수용체로서 사용되는 것이 바람직하고, 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상이 반응성 고체상으로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 주제는, (a) 샘플 액체를 반응성 고체상의 존재하에서 고체상 결합기를 함유하는 본 발명에 따른 컨쥬게이트 및 마커기를 함유하고 분석물 및 컨쥬게이트의 합텐 성분과 특이적 면역 반응을 할 수 있는 수용체와 함께 인큐베이션시키고, (b) 고체상을 임의적으로 인큐베이션 액체로부터 분리시키고, (c) 샘플 액체중의 분석물의 존재 및/또는 양을 고체상 및/또는 인큐베이션 액체에서 수용체의 마커 성분을 측정하여 결정하는 것을 특징으로 하는, "표지화 항체" 방식의 경합적 면역검정법의 원리를 기초로 하여 샘플 액체중의 분석물을 검출하는 방법이다. 비오틴화된 컨쥬게이트 및 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상을 사용하는 것이 바람직하다. 항체 또는 항체 단편이 표지화된 수용체로서 사용되는 것이 바람직하다.
발광 금속 킬레이트기는 발광 종이 전극의 표면에서 전기화학적으로 발생되는 전기화학발광에 의해 검출되는 것이 바람직하다. 발광은 정성적 및/또는 정량적으로 검출될 수 있다. EP-A-0 580 979, WO90/05301, WO90/11511 및 WO92/14138에 발광 검정법을 수행하는 예가 기술되어 있다. 상기 문헌에 개시된 발광 검정을 위한 방법 및 장치를 본원에 참고로 포함한다. 전기화학발광 검정법에서 고체상은 마이크로입자로 구성되는 것이 바람직하고, 고체상에서 제 2 항원과 상호작용하는 피복이 제공된 자기 마이크로입자로 구성되는 것이 특히 바람직하다. 마이크로입자는 스트렙트아비딘으로 피복되는 것이 바람직하다.
전기화학발광은 아민과 같은 금속 착물에 대한 환원제의 존재하에서 측정되는 것이 바람직하다. 지방족 아민이 바람직하고, 특히 알킬기가 각각 하나 내지 세 개의 탄소 원자를 가지는 일차, 이차 및 삼차 알킬아민이 바람직하다. 트리프로필아민이 특히 바람직하다. 그러나, 아민은 아닐린 또는 헤테로고리 아민과 같은 방향족 아민일 수도 있다.
또한, 에톡시화 페놀과 같은 비-이온성 계면활성제가 선택적으로 증폭제로서 존재할 수 있다. 이러한 물질은 예를 들어 트리톤 X100(Triton X100) 또는 트리톤 N-401(Triton N-401)이란 상품명으로 상업적으로 구입할 수 있다.
다른 한편, 발광 금속 킬레이트기는 또한 금속 킬레이트가 적당한 파장을 갖는 광에 의한 조사에 의해 여기되고, 이로부터 발생하는 형광 방사가 측정되는, 형광방법에 의해서도 검출될 수 있다. EP-A-0 178 450 및 EP-A-0 255 534에는 형광 검정법을 수행한 예가 기술되어 있고, 개시내용을 본원에 참고로 포함한다.
발광 금속 킬레이트와 같이 또한 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 바람직한 마커기인 형광기의 검출은 전술한 바와 같이 공지된 방식으로 여기 및 형광의 측정에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 주제는 본 발명에 따른 하나 이상의 표지화 또는 고체상-결합가능한 컨쥬게이트를 함유하는 면역학적 시약이다. 이중 항원 브리지 시험의 원리를 기초로 하는 특이적 항체의 면역학적 측정용 시약은 (a) 본 발명에 따른 표지화 컨쥬게이트 및/또는 (b) 고체상에 결합되거나 고체상에 결합할 수 있는 형태로 존재하는 본 발명에 따른 또 다른 컨쥬게이트를 함유한다.
경합적 면역검정법의 원리를 기초로 하여 분석물, 바람직하게는 저분자량의 분석물을 측정하기 위한 시약은 수용체와의 결합에 관해 측정하려는 분석물과 면역학적으로 경합하는 표지화된 컨쥬게이트("표지화 유사체" 방식) 또는 고체상 결합가능한 컨쥬게이트("표지화 항체" 방식)를 함유한다. 경합적 면역검정법용 시약은 본 발명에 따른 컨쥬게이트로부터 공간적으로 분리되고, 측정하려는 분석물 및 본 발명에 따른 컨쥬게이트와 면역학적으로 반응할 수 있는 표지화 수용체("표지화 항체" 방식) 또는 고체상 결합가능한 수용체("표지화 유사체" 방식)를 함유한다.
본 발명을 하기 실시예 및 도면에 의해 더 상세히 설명한다.
실시예 1
금속 킬레이트-리신 유도체의 제조
EP-A-0 580 979에 따른 루테늄 착물 Ru(비피리딘)2(비피리딘-CO-N-히드록시숙신이미드 에스테르) 6mmol을 50ml의 디메틸포름아미드중에 용해시키고, α-Fmoc 리신 용액을 적가하였다. 용매를 제거한 후에, 잔류물을 소량의 아세톤중에 용해시키고, 300ml의 클로로포름과 혼합시킨 다음, 신속히 가열하여 비등시켰다. 용매를 분리시킨 후에, 도 1에 도시된 화합물을 고체로서 수득하였다.
실시예 2
금속 킬레이트-표지화되고 비오틴화된 펩티드의 제조
금속 킬레이트-표지화되고 비오틴화된 펩티드는 예를 들어 Applied Biosystems A431 또는 A433과 같은 배치 펩티드 합성기에서 플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 고체상 펩티드 합성법에 의해 제조하였다. 이를 위하여, 표 1에 나타낸 아미노산 유도체의 4.0 당량을 각 경우에 사용하였다:
A Fmoc-Ala-OH
C Fmoc-Cys(Trt)-OH
D Fmoc-Asp(OtBu)-OH
E Fmoc-Glu(OtBu)-OH
F Fmoc-Phe-OH
G Fmoc-Gly-OH
H Fmoc-His(Trt)-OH
I Fmoc-Ile-OH
K Fmoc-Lys(Boc)-OH
L Fmoc-Leu-OH
M Fmoc-Met-OH
N Fmoc-Asn(Trt)-OH
P Fmoc-Pro-OH
Q Fmoc-Gln(Trt)-OH
R Fmoc-Arg(Pmc)-OH
S Fmoc-Ser(tBu)-OH
T Fmoc-Thr(tBu)-OH
U Fmoc-β알라닌-OH
V Fmoc-Val-OH
W Fmoc-Trp-OH
Y Fmoc-Tyr(tBu)-OH
Z Fmoc-ε-아미노카프로산-OH
Nle Fmoc-ε-노르루신-OH
Abu Fmoc-γ-아미노부티르산-OH
금속 킬레이트 및 비오틴기를 펩티드 서열로 도입시키는 것은 금속 킬레이트-결합되거나 비오틴-결합된 아미노산 유도체를, 예를 들어 금속 킬레이트 활성 에스테르로 ε-유도체화된 리신 잔기를 통해(도 1) 또는 비오틴-유도체화된 리신 잔기를 통해(도 2) 서열내에서 또는 상응하는 α-유도체화된 아미노산 잔기를 사용하여 N-말단적으로, 직접 혼입시켜 수행하였다.
아미노산 또는 아미노산 유도체를 N-메틸피롤리돈중에 용해시켰다. 펩티드를 400 내지 500 mg의 4-(2′,4′-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시 수지(Tetrahedron Letters 28 (1987), 2107)상에서 0.4 내지 0.7mmol/g의 로우딩(JACS 95 (1973), 1328)으로 합성시켰다. 결합 반응은 Fmoc-아미노산 유도체에 대하여 4당량의 디시클로헥실카르보디이미드 및 4 당량의 N-히드록시벤조트리아졸과 함께 반응 매질로서 디메틸포름아미드중에서 20분간 수행하였다. Fmoc기는 디메틸포름아미드중의 20% 피페리딘을 사용하여 각 합성 단계 후 20분내에 절단되었다.
지지체로부터 펩티드의 유리 및 산-불안정성 보호기의 절단은 20ml의 트리플루오로 아세트산, 0.5ml의 에탄디티올, 1ml의 티오아니졸, 1.5g의 페놀 및 1ml의 물과 함께 실온에서 40분 동안 달성되었다. 후속하여 반응 용액을 300ml의 냉각된 디이소프로필 에테르와 함께 혼합시키고, 0oC에서 40분간 유지시켜 펩티드를 완전하게 침전시켰다. 침전물을 여과시키고, 디이소프로필 에테르로 재세척시키고, 소량의 50% 아세트산중에 용해시키고, 동결건조시켰다. 수득한 미정제 물질을 적당한 구배(용리액 A: 물, 0.1%의 트리플루오로아세트산, 용리액 B: 아세토니트릴, 0.1%의 트리플루오아세트산)를 사용하여 델타-PAK RP C18 물질(컬럼 50 x 300mm, 100Å, 15μ)상에서 정제 HPLC에 의해 약 120분 동안 정제시켰다. 용리된 물질은 이온 스프레이 질량 분광법에 의해 확인하였다.
산-안정성 페닐아세틸 보호기는 유기 용매 성분을 갖는 수용액중에서 고정화되거나 가용성인 페니실린 G-아미다아제를 사용하여 효소적으로 실온에서 제거하였다.
실시예 3
합텐과의 결합
금속 킬레이트-표지화되거나 비오틴화된 펩티드를 디메틸포름아미드중에 용해시키고, 결합할 수 있는 펩티드상의 위치(예를 들어 리신의 아미노 측기)에 대하여 약간 과량(약 30%)의 활성화된 합텐(예를 들면, N-히드록시숙신이미드 에스테르)을 첨가하였다. 그것을 실온에서 1시간 동안 교반시키고, 용매를 고진공하에서 제거하고, 펩티드를 정제 HPLC에 의해 정제시켰다.
하기 구조를 갖는 컨쥬게이트를 도 1에 도시된 금속 킬레이트-리신 유도체를 마커기로 사용하고, 에스트라디올(E2)을 합텐으로 사용하여 제조하였다:
I: AcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)UEUK(E2)-NH2
II: AcK(BPRu)UEUEUK(E2)UEUEUK(BPRu)U-NH2
컨쥬게이트 I은 도 3에 도시되어 있다. 펩티드 사슬의 아미노 말단은 아세틸(Ac)에 의해 보호되어 있다. 카르복실 말단은 산 아미드기로서 존재한다.
금속 킬레이트 및 합텐 분자는 각 경우에 리신의 ε-아미노 측기를 통해 펩티드 사슬에 결합된다.
컨쥬게이트 I의 서열을 갖는 컨쥬게이트는 테스토스테론을 합텐 분자로서 사용하여 유사한 방식으로 합성한다.
제조된 컨쥬게이트의 구조는1H-NMR(500MHz)에 의해 조사하고 확인하였다.
실시예 4
혈청내의 에스트라디올의 측정
"표지화 유사체" 방식을 기초로 한 경합적 2단계 검정법을 수행하여 사람 혈청내의 에스트라디올을 측정하였다. 이를 위하여, 90㎕의 용액 1(각각 50 mmol/l의 4-모르폴린 에탄 술폰산 (MES), pH 6.8, 0.1%의 소 혈청 알부민, 0.1%의 테시트(Thesit), 0.01%의 메틸이소티아졸론, 0.1%의 옥시피리온, 30ng/ml의 분리 시약 디히드로테스토스테론내의 0.69 nmol/l의 본 발명에 따른 컨쥬게이트 I (도 3) 또는 1.68 nmol/l의 대조 컨쥬게이트 (도 4))을 폴리스티렌 용기내에서 50㎕의 샘플(혈청 샘플 또는 에스트라디올 표준)과 함께 37oC로 10분 동안 인큐베이션시켰다. 후속하여, 90㎕의 용액 2 (50mmol/l MES 완충액, pH 6.0중의 0.7㎍/ml 또는 1.4㎍/ml의 비오틴과 다중클론성 항-에스트라디올 토끼 Fab′의 컨쥬게이트) 및 50㎕의 비드 현탁액(720㎍/ml의 스트렙트아비딘-피복된 자기 입자, Dynal Company에서 제조됨)을 연속적으로 첨가하였다.
37oC에서 10분간 더 인큐베이션시킨 후에, 150㎕의 혼합물을 측정 셀로 이동시켰다. 거기서 비드 입자 및 그것에 부착된 루테늄 표지가 자기적으로 전극 표면에 농축되고, 전기화학적으로 발생하는 화학발광 신호가 28oC에서 검출되었다.
표 2에 나타낸 상기 실험의 결과는 본 발명에 따른 컨쥬게이트가 대조 컨쥬게이트와 비교하여 감도 및 검출 하한 면에서 현저하게 개선된 시험 성능을 가진다는 것을 보여준다.
항원 컨쥬게이트 I (본 발명) 컨쥬게이트 (대조)
항원 농도(nmol/l) 0.69 1.68
루테늄 착물 농도(nmol/l) 1.68 1.68
농도 항혈청(㎍/ml) 0.7 1.4
계수 표준 F 80412 87709
계수 표준 B 653420 1223219
계수 표준 A 861140 1445270
비 B/A 0.759 0.847
비 F/A 0.093 0.061
비 F/E 0.546 0.442
검출 하한(pg/ml) (3% CV) 15.9 25.1

Claims (46)

  1. 반응성 측기(side group)에 결합된 1 내지 10개의 합텐 분자 및 1 내지 10개의 마커기 또는 고체상 결합기를 함유하고 100개 이하의 단량체 단위를 갖는 중합체 담체를 포함하는 컨쥬게이트로서, 단량체 단위가 누클레오티드, 누클레오티드 유사체 및 펩티드 핵산으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  2. 반응성 측기에 결합된 1 내지 10개의 합텐 분자 및 1 내지 10개의 마커기 또는 고체상 결합기를 함유하고 100개 이하의 단량체 단위를 갖는 중합체 담체를 포함하는 컨쥬게이트로서, 단량체 단위가 아미노산으로부터 선택되고, 마커기가 발광 금속 킬레이트로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  3. 제 1항에 있어서, 중합체 담체가 3 내지 80개의 단량체 단위의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  4. 제 1항에 있어서, 중합체 담체가 누클레오티드 및/또는 누클레오티드 유사체로 구성된 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  5. 제 1항에 있어서, 중합체 담체가 펩티드 핵산으로 구성된 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 중합체 담체가 이중 가닥으로 존재하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  7. 제 6항에 있어서, 이중 가닥이 펩티드 핵산을 포함하는 사슬을 하나 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 합텐 분자 및 마커기 또는 고체상 결합기가 반응성 아미노 및/또는 티올 측기를 통해 중합체 담체에 결합되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  9. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 발광 금속 킬레이트 또는 형광기로부터 선택되는 마커기를 함유하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  10. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 비오틴 또는 비오틴 유사체로부터 선택되는 고체상 결합기를 함유하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  11. 제 9항에 있어서, 마커기가 발광 금속 킬레이트이고, 중합체 담체가 하나 이상의 양성 및/또는 음성 전하 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  12. 제 9항에 있어서, 마커기가 형광기이고, 중합체 담체가 나선형 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  13. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 합텐이 약리학적 활성 물질, 호르몬, 대사산물, 비타민, 매개물질 및 신경전달물질로부터 선택되는, 100 내지 2000 Da의 분자량을 갖는 면역학적 반응성 분자인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  14. (a) 합성 동안에 합텐 분자 및/또는 마커기 또는 고체상 결합기와 공유 결합된 단량체 유도체를 담체상의 예정된 위치에 도입하는 단계; 및/또는
    (b) 합성 후에 활성화된 합텐 분자 및/또는 마커기 또는 고체상 결합기를 담체의 반응성 측기에 결합시키는 단계를 포함하여, 단량체 단위로 구성된 중합체 담체를 고체상 합성하는,
    반응성 측기에 결합된 1 내지 10개의 합텐 분자 및 1 내지 10개의 마커기 또는 고체상 결합기를 함유하고, 누클레오티드, 누클레오티드 유사체, 펩티드 핵산 및 아미노산으로부터 선택되는 100개 이하의 단량체 단위를 갖는 중합체 담체를 포함하는 컨쥬게이트의 제조방법.
  15. 제 14항에 있어서, 펩티드 담체가 아미노산 유도체로부터 합성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 단계 (a)에서 합텐 분자 및/또는 마커기 또는 고체상 결합기가 각각의 경우에 단량체 유도체의 1차 아미노기 또는 티올기에 결합되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 단계 (b)에서 담체의 아미노 및/또는 티올 측기와의 결합 반응이 고체상 합성에 사용된 단량체 유도체의 보호기를 절단한 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 단계 (b)에서 합성 후에, 합텐 분자 및 마커기 또는 고체상 결합기가 담체의 1차 아미노 측기에 결합되는데, 아미노 측기에 대한 제 1 보호기를 갖는 단량체 유도체가 합텐 분자가 결합될 담체의 위치에 사용되고, 아미노 측기에 대한 제 2 보호기를 갖는 단량체 유도체가 마커기 또는 고체상 결합기가 결합될 담체의 위치에 사용되며, 제 1 및 제 2 보호기는 그 보호기들을 선택적으로 절단할 수 있는 방식으로 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  19. 제 18항에 있어서, 제 1 및 제 2 보호기가 산-불안정성 또는 산-안정성 보호기로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제 1항에 따르는 컨쥬게이트를 포함하는 면역학적 방법 또는 핵산 진단용 시약.
  21. 제 20항에 있어서, 1개 초과의 합텐 분자를 함유하는 컨쥬게이트를 폴리합텐으로서 포함하고, 면역학적 검출방법용임을 특징으로 하는 시약.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 경합적 면역검정법용임을 특징으로 하는 시약.
  23. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 특이적 항체를 검출하기 위한 면역검정법용임을 특징으로 하는 시약.
  24. "표지화 유사체" 방식의 경합적 면역검정법의 원리를 기초로 하여 샘플 액체내의 분석물을 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플 액체를 반응성 고체상의 존재하에 제 1항에 따르는 마커기를 함유하는 컨쥬게이트, 및 고체상에 결합되거나 고체상에 결합될 수 있고 분석물 및 컨쥬게이트의 합텐 성분과 특이적 면역 반응을 할 수 있는 수용체와 함께 인큐베이션하는 단계;
    (b) 고체상을 인큐베이션 액체로부터 선택적으로 분리하는 단계; 및
    (c) 샘플 액체내의 분석물의 존재 및/또는 양을 고체상 및/또는 인큐베이션 액체중에서 컨쥬게이트의 마커 성분을 측정하여 결정하는 단계를 포함하는 검출방법.
  25. 제 24항에 있어서, 비오틴화 항체 또는 비오틴화 항체 단편을 수용체로서 사용하고, 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  26. "표지화 항체" 방식의 경합적 면역검정법의 원리를 기초로 하여 샘플 액체내의 분석물을 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플 액체를 반응성 고체상의 존재하에 제 1항에 따르는 고체상 결합기를 함유하는 컨쥬게이트, 및 마커기를 함유하고 분석물 및 컨쥬게이트의 합텐 성분과 특이적 면역 반응을 할 수 있는 수용체와 함께 인큐베이션하는 단계;
    (b) 고체상을 인큐베이션 액체로부터 선택적으로 분리하는 단계; 및
    (c) 샘플 액체내의 분석물의 존재 및/또는 양을 고체상 및/또는 인큐베이션 액체중에서 수용체의 마커 성분을 측정함으로써 결정하는 단계를 포함하는 검출방법.
  27. 제 26항에 있어서, 비오틴화 컨쥬게이트 및 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  28. 샘플 액체내의 특이적 항체를 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플 액체를 측정하려는 항체에 대한 하나 이상의 제 1항에 따르는 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
    (b) 항체를 컨쥬게이트와의 결합을 통해 검출하는 단계를 포함하는 검출방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    (a) 샘플 액체를 반응성 고체상 및 측정하려는 항체에 대한 두 항원(여기서, 제 1항원은 마커기를 함유하고, 제 2항원은 고체상에 결합되거나 고체상에 결합될 수 있는 형태로 존재함)의 존재하에 인큐베이션하는 단계;
    (b) 고체상을 인큐베이션 액체로부터 선택적으로 분리하는 단계; 및
    (c) 항체의 존재 및/또는 양을 고체상 및/또는 액체상중에서 표지를 측정함으로써 검출하는 단계를 포함하고, 제 1항에 따르는 컨쥬게이트가 제 1 항원 및/또는 제 2 항원으로 사용되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  30. 제 29항에 있어서, 발광 금속 킬레이트 또는 형광기로 표지화된 컨쥬게이트가 제 1항원으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 비오틴화 컨쥬게이트 또는 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상이 제 2 항원으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  32. 제 2항에 있어서, 중합체 담체가 3 내지 80개의 단량체 단위의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  33. 제 2항에 있어서, 합텐 분자 및 마커기 또는 고체상 결합기가 반응성 아미노 및/또는 티올 측기를 통해 중합체 담체에 결합되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  34. 제 2항에 있어서, 비오틴 또는 비오틴 유사체로부터 선택되는 고체상 결합기를 함유하는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  35. 제 2항에 있어서, 합텐이 약리학적 활성 물질, 호르몬, 대사산물, 비타민, 매개물질 및 신경전달물질로부터 선택되는, 100 내지 2000 Da의 분자량을 갖는 면역학적 반응성 분자인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  36. 제 2항에 따르는 컨쥬게이트를 포함하는 면역학적 방법 또는 핵산 진단용 시약.
  37. 제 36항에 있어서, 1개 초과의 합텐 분자를 함유하는 컨쥬게이트를 폴리합텐으로서 포함하고, 면역학적 검출방법용임을 특징으로 하는 시약.
  38. 제 36항 또는 제 37항에 있어서, 경합적 면역검정법용임을 특징으로 하는 시약.
  39. 제 36항 또는 제 37항에 있어서, 특이적 항체를 검출하기 위한 면역검정법용임을 특징으로 하는 시약.
  40. "표지화 유사체" 방식의 경합적 면역검정법의 원리를 기초로 하여 샘플 액체내의 분석물을 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플 액체를 반응성 고체상의 존재하에 제 2항에 따르는 마커기를 함유하는 컨쥬게이트, 및 고체상에 결합되거나 고체상에 결합될 수 있고 분석물 및 컨쥬게이트의 합텐 성분과 특이적 면역 반응을 할 수 있는 수용체와 함께 인큐베이션하는 단계;
    (b) 고체상을 인큐베이션 액체로부터 선택적으로 분리하는 단계; 및
    (c) 샘플 액체내의 분석물의 존재 및/또는 양을 고체상 및/또는 인큐베이션 액체중에서 컨쥬게이트의 마커 성분을 측정하여 결정하는 단계를 포함하는 검출방법.
  41. 제 40항에 있어서, 비오틴화 항체 또는 비오틴화 항체 단편을 수용체로서 사용하고, 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  42. "표지화 항체" 방식의 경합적 면역검정법의 원리를 기초로 하여 샘플 액체내의 분석물을 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플 액체를 반응성 고체상의 존재하에 제 2항에 따르는 고체상 결합기를 함유하는 컨쥬게이트, 및 마커기를 함유하고 분석물 및 컨쥬게이트의 합텐 성분과 특이적 면역 반응을 할 수 있는 수용체와 함께 인큐베이션하는 단계;
    (b) 고체상을 인큐베이션 액체로부터 선택적으로 분리하는 단계; 및
    (c) 샘플 액체내의 분석물의 존재 및/또는 양을 고체상 및/또는 인큐베이션 액체중에서 수용체의 마커 성분을 측정함으로써 결정하는 단계를 포함하는 검출방법.
  43. 제 42항에 있어서, 비오틴화 컨쥬게이트 및 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상을 사용하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  44. 샘플 액체내의 특이적 항체를 검출하는 방법으로서,
    (a) 샘플 액체를 측정하려는 항체에 대한 하나 이상의 제 2항에 따르는 컨쥬게이트와 함께 인큐베이션하는 단계; 및
    (b) 항체를 컨쥬게이트와의 결합을 통해 검출하는 단계를 포함하는 검출방법.
  45. 제 44항에 있어서,
    (a) 샘플 액체를 반응성 고체상 및 측정하려는 항체에 대한 두 항원(여기서, 제 1항원은 마커기를 함유하고, 제 2항원은 고체상에 결합되거나 고체상에 결합될 수 있는 형태로 존재함)의 존재하에 인큐베이션하는 단계;
    (b) 고체상을 인큐베이션 액체로부터 선택적으로 분리하는 단계; 및
    (c) 항체의 존재 및/또는 양을 고체상 및/또는 액체상중에서 표지를 측정함으로써 검출하는 단계를 포함하고, 제 2항에 따르는 컨쥬게이트가 제 1 항원 및/또는 제 2 항원으로 사용되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  46. 제 45항에 있어서, 비오틴화 컨쥬게이트 또는 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 피복된 고체상이 제 2 항원으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 검출방법.
KR1019970700495A 1994-07-25 1995-07-24 마커기 및 합텐이 선택적으로 혼입된 올리고머 담체 분자 Expired - Fee Related KR100242594B1 (ko)

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DE4426276 1994-07-25
DEP4426276.0 1994-07-25
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DEP4429345.8 1994-11-04
DE4439345A DE4439345A1 (de) 1994-07-25 1994-11-04 Oligomere Trägermoleküle mit definiert eingebauten Markierungsgruppen und Haptenen
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ300927B6 (cs) 1997-04-09 2009-09-16 Bio-Rad Pasteur Syntetický peptid monomerního typu, prostredek, který ho obsahuje, zpusob imunologické in vitro kvantifikace a diagnostický kit pro použití v biologických testech pro identifikaci infekcí zpusobených viry HIV
DE19745001A1 (de) * 1997-10-11 1999-05-06 Evotec Biosystems Ag Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren
US6214628B1 (en) * 1998-01-14 2001-04-10 Joseph R. Lakowicz Method of conducting an assay of a sample containing an analyte of interest
US6080839A (en) * 1998-06-25 2000-06-27 Wallac Oy Labeling reactants and their use
WO2000031130A1 (en) * 1998-11-20 2000-06-02 Bio Merieux Synthetic polypeptides corresponding to the hepatitis c virus (hcv) and applications
DE19954934A1 (de) * 1999-11-16 2001-05-17 Otto S Wolfbeis Verfahren zur Solubilisierung von optischen Markern
AU6115300A (en) * 1999-07-19 2001-02-05 California Institute Of Technology Detection of biomolecules by sensitizer-linked substrates
EP1245956A1 (en) * 2001-03-29 2002-10-02 Roche Diagnostics GmbH Conjugates of defined stoichiometry
US7897404B2 (en) * 2000-09-29 2011-03-01 Roche Diagnostics Operations, Inc. Conjugates of defined stoichiometry
DE10106654A1 (de) * 2001-02-12 2002-09-05 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung eines Analyten
KR100454868B1 (ko) * 2001-08-01 2004-11-05 주식회사 아이센스 신규의 전기화학발광 면역분석 표지물질인 루테늄착화합물 및 그의 제조방법
JP2007523170A (ja) * 2004-02-19 2007-08-16 アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド ネコ免疫不全ウイルスの検出のための方法および装置
US7658930B2 (en) * 2005-02-02 2010-02-09 Peng Cui Kit for detecting the antibody of HCV and its preparing method
KR101463065B1 (ko) * 2008-02-14 2014-11-19 재단법인서울대학교산학협력재단 발광 바이오틴-전이금속 복합체 결합물 및 이를 이용한 신호 증폭방법
KR20230010332A (ko) 2021-07-12 2023-01-19 주식회사 스마트름뱅이 모듈형 살균장치 및 모듈형 살균장치가 마련되는 기능성 자동차 시트구조

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5310687A (en) * 1984-10-31 1994-05-10 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5229490A (en) * 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
EP0366673B1 (en) * 1987-06-09 1992-09-16 Cambridge Life Sciences Plc Immunoassay method
DE3877294T2 (de) * 1987-09-04 1993-05-06 Int Murex Tech Corp Festphasenimmunoassay fuer einen antikoerper und hierbei verwendete biologische produkte.
CA2064953A1 (en) * 1991-04-03 1992-10-04 John Joseph Rejman Immunoassay for immunoglobulins
EP0507587A3 (en) * 1991-04-03 1993-03-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay for immunoglubulins
US5580563A (en) * 1992-05-01 1996-12-03 Tam; James P. Multiple antigen peptide system having adjuvant properties, vaccines prepared therefrom and methods of use thereof
DE4240980A1 (de) * 1992-08-07 1994-02-10 Boehringer Mannheim Gmbh HCV Peptidantigene und Verfahren zur Bestimmung von HCV

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