KR100242597B1

KR100242597B1 - 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키는 투과제 펩티드

Info

Publication number: KR100242597B1
Application number: KR1019930703212A
Authority: KR
Inventors: 드블유. 코자리히 죤; 에프. 무쏘 게리; 말프로이-카민 버어나드
Original assignee: 마이클 랜딘; 알케르메스 인코포레이티드
Priority date: 1991-04-23
Filing date: 1992-04-23
Publication date: 2000-02-01
Anticipated expiration: 2012-04-23
Also published as: DE69229549T2; DK0585412T3; ATE181926T1; JPH06506942A; GR3030814T3; US5686416A; EP0585412A1; WO1992018529A1; CA2107556C; AU660465B2; ES2133326T3; EP0885900A3; AU1799992A; US5268164A; EP0585412B1; CA2107556A1; DE69229549D1; EP0885900A2; US5506206A

Abstract

본 발명은 치료제 또는 진단제와 같은 분자들에 대한 혈액/뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 수용체 중재 투과제(RMP)로 불리는 펩티드에 관한 것이다. 투과제 A-7 또는 구조적 유사체들은, 그것의 바람직한 목적지가 뇌의 간질액 부분인 분자들과 함께 숙주에 함께 정맥내투여될 수 있다. 또는 달리, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체들은 관심의 분자(들)과 차례로 투여될 수 있으며, 이들 분자들은 또한 혈관내 이외의 경로로 투여될 수도 있다. 투과제 A-7 또는 구조적 유사체들은 상기 분자들이 혈액-뇌 장벽을 통과하여 간질액에 도달하는 것을 가능하게 한다.

Description

[발명의 명칭]

혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키는 투과제 펩티드

[배경]

신경계 및 이것과 관련된 장애에 대한 이해가 심화됨에 따라, 보다 광범위한 치료제 및 진단제가 이용가능해 질 것이다. 이들 작용제가 확인되면, 이들을 중추 신경계내의 환부 조직의 부위에 전달시킬 필요가 있을 것이다. 유감스럽게도, 혈액-뇌 장벽의 존재로 인해 많은 유형의 분자가 혈액으로부터 중추 신경계의 세포에 자유롭게 전달되는 것이 제한된다.

혈액-뇌 장벽에 대한 생리학적 기초는 내피 세포로 구성된 뇌 모세관이다 [참조: Goldstein, et al., Scientific American, 255: 74-83 (1986) ; Pardridge, W. M., Endocrin. Rev., 7 : 314-330 (1986)]. 이들 내피 세포는 신체의 다른 조직에서 발견되는 내피 세포와 상이하다. 구체적으로, 이들 내피 세포는 상호간에 복잡하고 치밀한 경계를 형성한다. 실제 혈액-뇌 장벽은, 혈액으로부터 뇌로 많은 분자가 수동 이동되지 않도록 세포 자체가 연속 벽을 형성하는 이러한 저항성이 높은 치밀한 세포간 경계에 의해 형성된다. 또한, 이들 세포는 포음 소포를 거의 갖지 않는다는 점에서 상이하며, 이들 소포는 그 밖의 조직에서 모세관 벽을 가로지르는 약간의 비선택적 수송을 허용한다. 또한, 비제한적 수송을 허용하도록 세포를 관통하는 연속갭 또는 채널이 존재하지 않는다.

혈액-뇌 장벽의 한 가지 기능은 혈액화학의 변동으로부터 뇌를 보호하는 데에 있다. 그러나, 뇌를 혈류로부터 단리시키는 것은 불완전하다. 영양분과 폐기물의 교환이 존재하게 된다. 모세관 내피 세포내에 특이적 수송 시스템이 존재함으로써, 뇌가, 제어된 방식으로 정상적 성장 및 기능에 필요한 모든 화합물을 수용하는 것이 보장된다. 혈액-뇌 장벽에 의해 나타나는 장애로는, 뇌를 보호하는 과정 도중에, 잠재적으로 유용한 많은 치료제 및 진단제를 배제시킨다는 점이 있다.

치료제 또는 진단제를 전달시키기 위하여 혈액-뇌 장벽을 물리적으로 돌파하거나 또는 우회하는 여러 가지 기법들이 존재한다. 이들 기법으로는 척수초내 주사(intrathecal injection), 외과적 이식 및 삼투압 기법이 있다.

척수초내 주사는 뇌를 둘러싼 막을 천공(puncturing)시킴으로써 상기 제제가 뇌실과 척수액에 직접 투여될 수 있게 한다. 제제가 척수액에 직접 계속 전달되는 것은 외과적으로 이식된 주입 펌프의 사용에 의해 수득될 수 있다. 이러한 척수액 전달 기법은 뇌암, 뇌감염, 뇌염증 및 뇌의 통증의 치료를 위해 사용되지만, 이들은 뇌에 깊숙히 침투하지 못한다.

임상의들은 척수초내 주사가 종종 비효율적이며, 위험할 수 있기 때문에 회피하는 편이다. 척수초내 주사된 물질은 뇌에서 불균일하고, 느리며, 불완전하게 분배된다. 척수액의 부피가 작기 때문에, 주사가 반복됨에 따라 대뇌내 압력이 증가할 수 있다. 또한, 부적합한 니들(needle) 또는 카테테르 정위에 의해, 발작, 출혈, 뇌염 및 그 밖의 다양한 심각한 부작용이 유발될 수 있다.

삼투압 방법은 뇌의 종양에 화학치료제 및 영상화 항체를 전달하기 위해, 오레곤 주립 대학의 에드워드 뉴웰트(Edward Neuwelt) 박사에 의해 사용되었다 [참조: Neuwelt, E.A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 ＆ 2, Plenum Press, N. Y. (1989)]. 이 기법은 고장성 만니톨 용액의 거환약을 동맥주사하는 것을 포함한다. 만니톨에 의해 나타난 삼투압 차이에 의해 내피 세포는 수축에 대한 장벽을 형성함으로써, 단기간 동안 이들 사이의 갭을 개방시키게 된다. 이 기간 동안, 약물은 동맥 시스템내에 투여되어, 뇌내로 직접 운반된다. 삼투압 방법은 치료제가 장벽을 통과하면 뇌 전체에 효율적으로 분배될 수 있음을 입증한다.

그러나, 많은 위험이 내포되어 있기 때문에, 삼투압 치료를 수행한 후에는 철저한 보호 유닛내에서 24 내지 48시간 동안 있어야 한다. 만니톨은 눈에 영구적인 손상(실명을 포함함)을 유발시킬 수 있다. 장벽이 너무 장기간 투과성인 경우, 뇌수종이 유발된다. 또한, 뇌의 세포는, 일반적으로는 뇌에 도달하지 못하는 혈액 중의 신경독성 물질이 장벽을 가로지를 수 있는 경우에 손상될 수 있다. 결국, 치료 과정 도중 및 치료 과정 후에 환자에게서 심각한 발작이 발생한다.

[발명의 요약]

본 발명은 동물에서 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 아미노산 또는 아미노산 유사체의 코아 서열을 갖는 펩티드인 혈액-뇌 장벽의 투과제이다. 코아 펩티드에 있어서, 서열은 N-말단으로부터 C-말단으로, 아르기닌-프롤린-히드록시프롤린-글리신-티에닐알라닌-세린-프롤린-4-Me-티로신-ψ(CH₂NH)아르기닌이며, 여기에서, ψ(CH₂NH)는 4-Me-티로신과 아르기닌 아미노산 사이의 환원 펩티드 결합을 나타낸다. 브래디키닌(bradykinin)의 유사체인 이 펩티드는 본원에서는 편의상 투과제 A-7로서 언급한다. 또한, 이 서열의 구조적 유사체가 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 성질을 갖는다면 본 발명의 조성물이다.

또한, 투과제 A-7 또는 이것의 구조적 유사체 및 약제학적 허용 담체를 포함하는 약제 조성물은 본 발명에 포함된다. 또한, 이러한 약제 조성물은 투과제 A-7 또는 이것의 구조적 유사체가 혈액-뇌 장벽을 보다 투과성으로 만드는 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다.

최종적으로, 본 발명은 숙주의 혈액-뇌 장벽에 대한 숙주의 혈류에 함유된 분자의 투과성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유효량의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체를 숙주에 투여하는 것을 포함한다. 투여된 투과제 A-7 또는 구조적 유사체에 의해 혈액-뇌 장벽에 대해 보다 투과적이 되는 분자는, 본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체와 동시 투여될 수 있다. 따라서, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 뇌에 전달시키려는 분자는 혈류중에 존재하는 내인성 분자 또는 투과제 A-7 또는 구조적 유사체와 차례로 또는 동시에 동시 투여되는 외인성 분자 중의 하나일 수 있다.

본 발명의 잇점은, 치료, 예방 또는 진단적으로 가치가 있는 분자를 동시 투여하면서 투과체 A-7 또는 구조적 유사체를 투여함으로써 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 실제적인 수단을 제공한다는 데에 있다. 예를 들어, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 정맥 주사는 척수초내 주사 또는 혈액-뇌 장벽의 삼투적 파괴 보다 훨씬 덜 침입적이다. 투과제 A-7 또는 구조적 유사체는 우선적으로 저분자량 물질에 대해 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시킨다.

본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체는 통상적인 투여 경로 중의 하나에 의해 투여될 수 있다. 즉, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체는 예를 들어, 혈관내, 피하 또는 근육내 주사, 경구, 경피 또는 비강내 투여, 및 흡입 또는 지연 방출 경로에 의해 투여될 수 있다. 이러한 투여 경로에 의해 본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체를 숙주의 혈류에 전달하기 위한 다양한 이용가능한 선택이 제공된다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 투과제 A-7의 특정량(10㎍)을 다수의 마우스에게 투여한 후 슈크로오스의 뇌 흡수를 시간 경과에 따라 나타낸 그래프이다.

제2도는 투과제 A-7과 이것의 2가지 쌍성 이성질체의 다양한 양을 투여한 후 슈크로오스의 뇌흡수를 나타낸 그래프이다.

제3(a)도는 브래디키닌 또는 투과제 유사체를 투여한 후 주사된 용량의 %로서 나타낸, 슈크로오스의 뇌 흡수를 나타낸 그래프이다.

제3(b)도는 브래디키닌 또는 투과제 유사체를 투여한 후 최대 흡수 %로서 나타낸, 슈크로오스의 뇌 흡수를 나타낸 그래프이다.

제3(c)도는 투과제 A-7 유사체인 A-9의 다양한 양을 투여한 후 주사된 용량의 %로서 나타낸, 슈크로오스의 뇌 흡수를 나타낸 그래프이다.

제3(d)도는 투과제 A-7 유사체인 A-14를 투여한 후 주사된 용량의 %로서 나타낸, 슈크로오스의 뇌 흡수를 나타낸 그래프이다.

제4(a)도는 뇌 종양을 이식시킨 래트의 수명(일)에 대한, 비처리; 시스플라틴으로의 처리; 브래디키닌, 캅토프릴 및 시스플라틴으로의 처리; 및 투과제 A-7 및 시스플라틴으로의 처리의 효과를 나타내는 그래프이다.

제4(b)도는 뇌 종양을 이식시킨 래트의 수명(일)에 대한, 비처리; 시스플라틴으로의 처리; 및 투과제 A-7과 시스플라틴으로의 처리의 효과를 나타내는 그래프이다.

제5도는 식염 또는 3가지 상이한 양 중의 한 가지 양의 투과제 A-7을 래트에 정맥 주사한 지 2분 후에 정맥 주사된 영상화제 DISIDA의 뇌흡수를 나타내는 그래프이다.

제6도는 영상화제 DISIDA의 뇌 흡수에 대한 정맥 투여된 투과제 A-7의 효과를 예시하는 막대그래프이다.

제7도는 마우스 꼬리 튕기기 검정에서 로페라미드(loperamide)의 항통각 활성에 대한 동시 투여된 투과제 A-7의 효과를 예시하는 막대그래프이다.

제8도는 래트의 아포모르핀(apomorphine) 유도된 운동 활성에 대한, 투과제 A-7과 동시 투여된 도파민 수용체 길항제(돔페리돈:domeperidone)의 효과를 나타내는 그래프이다.

제9도는 래트의 음주 거동에 대한, 투과제 A-7과 동시 투여된 안지오텐신 II 유사체의 효과를 나타내는 그래프이다.

제10도는 래트의 음주 거동에 대한, 투과제 A-7과 동시 투여된 안지오텐신 II 유사체 및 억제제의 효과를 나타내는 그래프이다.

제11도는 투과제 A-7의 투여 후에 다양한 시점에서⁸⁶Rb의 뇌 흡수에 대한 정맥 투여된 투과제 A-7의 효과를 예시하는 막대그래프이다.

제12도는 경합 비방사성 펩티드의 부재시 및 50nM 투과제 A-7 또는 100nM 투과제 A-7의 9D 쌍성 이성체의 존재시에, [³H]-브래디키닌의 특이적 결합에 대한 스캐처드(Scatchard) 분석을 나타내는 그래프이다.

제13도는 래트 뇌 내피 세포의 세포내 칼슘 수준에 대한, 투과제 A-7의 다양한 농도의 효과를 나타내는 그래프이다.

제14도는 투과제 A-7 및 투과제 A-7의 9D 쌍성 이성체에 노출된 래트 뇌 내피 세포로부터의 형광률의 변화를 기록한 도면이다.

제15도는 실험적으로 유도된 크립토코커스 수막염(뇌막염)에 대한 암포테리신 B의 효력에 대한, 투과제 A-7의 효과를 나타내는 그래프이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 개체, 예를 들어 사람에게서 혈액-뇌 장벽에 대한 관심있는 분자의 투과성을 증가시키기 위한 조성물에 관한 것이다. 혈액-뇌 장벽에 대한 관심있는 분자의 투과성을 증가시킴으로써, 분자는 보다 신속하게 혈류를 이탈하여 뇌의 간질액으로 들어가게 된다. 관심있는 분자에 대한 혈액-뇌 장벽 투과성이 증가됨으로써, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체가 없는 경우 보다 높은 상대 농도로 이 분자가 뇌에 접근할 수 있게 된다.

본 발명의 조성물은 투과제 A-7 또는 구조적 유사체로서 언급된다. 이 용어는 혈액-뇌 장벽에 대한 관심있는 분자의 투과성을 증가시키는 이들 물질의 속성을 특징화하기 위해 선택되었다. 이들 조성물의 투여 결과로써 나타나는 혈액-뇌 장벽의 증가된 투과성은, 혈액-뇌 장벽을 형성하는 뇌 내피 세포의 표면에 위치한 수용체, 아마도 브래디키닌 B₂수용체에 의해 중재되는 것으로 믿어진다. 이들 수용체와 본 발명의 조성물 사이의 상호 작용은, 세포 사이의 결합 또는 수송 특성을 명백하게 변경시킴으로써, 혈액-뇌 장벽에 대한 분자, 예를 들어 관심있는 분자의 투과성을 증가시킨다. 이들 분자는 수용체에서 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 이러한 상호작용의 결과로써 보다 자유롭게 혈액-뇌 장벽을 통과한다.

브래디키닌으로서 알려져 있는 물질도 또한 혈액-뇌 장벽에 대한 분자의 투과성을 증가시킬 수 있다. 이러한 투과성 증가는 아마도 본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체에 대한 것과 동일한 메카니즘에 의해 일어난다. 즉, 브래디키닌은 아마도 혈액-뇌 장벽 투과성의 변경을 유도하기 위해 투과제 A-7 또는 구조적 유사체와 동일한 또는 유사한 B2 수용체에서 상호작용함으로써 특정 분자들이 보다 쉽게 혈류를 이탈하여 뇌의 간질액 안으로 들어갈 수 있게 한다. 이러한 이유로, 본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체와 브래디키닌은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 약리학적 아고니스트(agonist)로 간주될 수 있다.

본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체는, 브래디키닌과 같이, 아미노산의 코아 서열을 갖는 펩티드 또는 펩티드 의사체이다. 이러한 아미노산의 코아 서열은, 혈액-뇌 장벽과 결합된 분자, 예를 들어 수용체 분자와 상호작용하여, 혈액-뇌 장벽에 대한 혈류 중에 존재하거나 혈류에 주사된 관심있는 분자의 투과성을 증가시킬 수 있을 정도의 수용액내에서의 구조를 갖는다. 다양한 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 아미노산 또는 의사 대체물의 특정 서열은, 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위하여 혈액-뇌 장벽과 결합된 분자들과 상호작용할 수 있는 적절한 구조를 상기 투과제 A-7 또는 구조적 유사체에 제공한다. 1차 서열이 부적절한 경우, 물질은 적절한 구조로 전환되지 못할 것이기 때문에, 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키지 못할 것이다.

투과제 A-7 또는 구조적 유사체가 분자들과 상호작용하여 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키도록 허용하는 적절한 구조는, 본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체 서열을 구성하는 아미노산의 구조에 제한을 가한다. 아미노산의 특정 서열 및 이들 아미노산의 의사체만이 투과제 A-7 또는 그것의 구조적 유사체들의 패밀리(famlily)의 일원이 되는 기준을 만족시킬 것이다; 즉, 이들이 적절한 구조를 허용함으로써 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 특이적이고 바람직한 구체예는, N-말단에서 C-말단으로, 선형 아미노산 서열이 아르기닌-프롤린-히드록시프롤린-글리신-티에닐알라닌-세린-프롤린-4-Me-티로신ψ(CH₂NH)-아르기닌인 투과제 A-7이다. 이 펩티드는 본원에서 투과제 A-7으로 언급한다. 투과제 A-7의 합성 방법은 하기 실시예에 제공되어 있다. 그러나, 다른 공지된 제조 방법이 투과제 A-7 또는 구조적 유사체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드의 투과제 A-7은 하기 측면에서 종래의 아미노산의 펩티드 서열과 상이하다: 제3아미노산이 히드록시프롤린이고; 제5아미노산이 페닐알라닌과 유사하지만, 티에닐기가 페닐기로 치환된 티에닐알라닌이고; 제8아미노산이 4 위치에서 메틸기로 치환된 티로신이고; 제8아미노산과 제9아미노산 사이의 펩티드 결합이 환원된 등입체성 펩티드 결합, 즉, ψ(CH₂NH)로 치환되어 있다. 또한, 본 구체예의 펩티드 및 펩티드 의사 유사체는 이들이 수용액에서 적절한 구조를 허용하여 관심있는 분자에 대한 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위해 사용된다면 본 발명의 일부이다. 이러한 조성물은 이 구체예의 “구조적 유사체”로 언급된다.

본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체들은 하기의 선형 아미노산 서열을 갖는 브래디키닌과 비교될 수 있다: 아르기닌-프롤린-프롤린-글리신-페닐알라닌-세린-프롤린-페닐알라닌-아르기닌[참조: Lehninger, A.L., Biochemistry, p. 75 (1975)]. 바람직한 투과제 A-7은 다음 측면에서 브래디키닌과 상이하다: 제3아미노산에서, 프롤린이 히드록시프롤린으로 치환되고; 제5아미노산에서, 페닐알라닌이 티에닐알라닌으로 치환되고; 제8아미노산에서, 페닐알라닌이 4-Me-티로신으로 치환되고; 제8아미노산과 제9아미노산 사이에서, 통상적인 펩티드 결합이 환원 펩티드 결합으로 치환된다. 이러한 차이로 인해, 브래디키닌과 비교하는 경우, 바람직한 투과제 A-7은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 데에 보다 효과적이 된다. 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키기 위해서는 훨씬 적은 양의 투과제 A-7이 필요하고, 브래디키닌의 동일한 투여량과 비교할 때, 투과제 A-7의 주어진 투여량에서 더 많은 관심의 분자가 혈액-뇌 장벽을 가로지른다.

본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 특징은, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체가 혈액-뇌 장벽에 대한 하나 이상의 관심있는 분자의 투과성을 증가시킬 수 있도록 적절한 구조를 허용하는데 중요하다. 예를 들어, 하기 변형이 투과제 A-7에 대해 이루어질 수 있지만, 여전히 적절한 구조가 형성된다: N-말단 아르기닌이 구아니디노 또는 구아니디노 유도체 측쇄를 함유하는 아미노산 유사체에 의해 치환되고; 제2아미노산(프롤린)이 히드록시프롤린, 데히드로프롤린, N-메틸알라닌 또는 또 다른 프롤린 유사체로 치환되고; 제3아미노산(히드록시프롤린)이 프롤린, 데히드로프롤린, 또 다른 프롤린 유사체, 알라닌, 사르코신 또는 N-메틸알라닌으로 치환되고; 제5아미노산(티에닐알라닌)이 또 다른 방향족 아미노산 또는 소수성 지방족 아미노산으로 치환되고; 제6아미노산(세린)이 글리신, 트레오닌, 알라닌, 알로트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 또는 이들의 유도체로 치환되고; 제7아미노산(프롤린)이 히드록시프롤린, 데히드로프롤린, N-메틸알라닌 또는 또 다른 프롤린 유사체로 치환되고; 제8아미노산(4-Me-티로신)이 또 다른 O-알킬티로신 또는 소수성 지방족 아미노산으로 치환되고; C-말단 아르기닌이 구아니디노 측쇄를 함유하는 아미노산 유사체로 치환되고; 제8아미노산(4-Me-티로신)과 C-말단 아미노산(아르기닌) 사이의 펩티드의사 등입체성 결합인 ψ(CH₂NH)가 ψ(CSNH), ψ(NHCO) 또는 ψ(CH₂S)로 치환된다.

투과제 A-7의 구조적 유사체를 얻기 위한 이러한 일반적인 개요 내에서, 변화는 다음과 같이 제한되는 것이 바람직하다: N-말단 또는 C-말단 아르기닌에 대해, β-시클로아르기닌, 호모아르기닌, γ-히드록시아르기닌, 카나바닌, N^ω-아미디노시트룰린, 2-아미노-4-구아니디노부탄산, 시트룰린, 호모시트룰린 또는 라이신 또는 오르니틴의 시아노구아니디노 유도체; 제2 또는 제7아미노산(프롤린)에 대해, 히드록시프롤린 또는 데히드로프롤린; 제3아미노산(히드록시프롤린)에 대해, 프롤린 또는 데히드로 프롤린; 제5아미노산(티에닐알라닌)에 대해, 데히드로페닐알라닌, 페닐알라닌 또는 또 다른 방향족 유사체 또는 로이신, 이소로이신, 발린, 시클로헥실알라닌 또는 또 다른 지방족 아미노산; 제6아미노산(세린)에 대해, 글리신 또는 트레오닌; 및 제8아미노산(4-Me-티로신)에 대해, O-알킬 티로신 또는 로이신, 이소로이신, 발린, 시클로헥실알라닌 또는 또 다른 지방족 아미노산.

상기와 같은 특정 아미노산 지정에 의해, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 적절한 구조가 이루어져서 투과제 A-7 또는 구조적 유사체가 혈액-뇌 장벽에 대한 관심있는 분자의 투과성을 증가시킬 수 있다. 이러한 아미노산 위치 및 지정은 투과제 A-7 또는 구조적 유사체가 적절한 구조를 취하여서 바람직한 상호작용이 일어날 수 있도록 하는데 중요한 것으로 여겨진다.

본 발명에 포함되는 또 다른 변형예는, 하나 이상의 아미노산 또는 유사체를 N-말단 아르기닌에 임의로 첨가하거나, 이 아르기닌의 1차-아미노기를 마스킹(예컨대, 아세틸화)하는 것이다. 이들 추가 아미노산은 전형적인 펩티드 결합에 의해 서로 결합되고, N-말단 아르기닌에 결합됨으로써, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체 펩티드의 N-말단에 아미노산이 추가된다. 이들 추가 아미노산은 아르기닌 또는 라이신이거나, 2개의 추가 아미노산이 있는 경우, N-말단 아미노산은 메티오닌일 수 있다. 하나의 아미노산이 첨가되고 이것이 아르기닌인 경우, 이것은 아세틸 또는 기타 마스킹제(예를 들어, 프로필, 벤질, 아다만틸아세틸 등)로 치환될 수 있다. 이들 추가의 아미노산은 D- 또는 L-이성질체 형태 중의 하나일 수 있다. 바람직한 추가의 N-말단 아미노산기는 아르기닌-, 아세틸 아르기닌-, 라이신-, 아르기닌-아르기닌-, 라이신-라이신-, 메티오닌-아르기닌- 또는 메틸오닌-라이신이며, 여기에서, 이들 추가 아미노산은 D 또는 L 형태 중의 어느 하나를 갖는다.

본 발명의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체들의 코아 서열을 구성하는 아미노산은, 바람직하게는 L-이성질체로서 형성되어야 한다. D-이성질체는 코아 서열의 몇몇 위치(예를 들어, 위치 8)에서 치환될 수 있으며, 생성되는 펩티드는 혈액-뇌 장벽 투과 활성을 여전히 가질 것이다. 그러나, D-이성질체가 서열의 코아를 구성하는 아미노산 중 위치 9에서 치환되면, 생성되는 투과제 A-7 또는 구조적 유사체가 숙주 동물에게 투여되는 경우에 혈액-뇌 장벽의 투과성의 증가율이 심각하게 감쇠된다.

또한, 본 발명은 혈액-뇌 장벽에 대한 관심있는 분자의 투과성을 증가시키기 위해 숙주 동물에 투여하기에 적당한 약제 조성물에 관한 것이다. 이들 약제 조성물은 당업자에게 공지되어 있는 약제학적 허용 담체 중에 하나 이상의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체를 함유한다. 약제 조성물은 종종 주사에 의해 숙주 동물의 혈관에 투여될 것이다. 특히, 약제 조성물은, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체가 폐에 고농도로 존재하는 것으로 알려져 있는 안지오텐신 전환 효소(ACE)에 의해 유의할 만하게 분해되지 않기 때문에, 정맥 투여될 수 있다. 대조적으로, 브래디키닌은 ACE에 의해 현저하게 분해되기 때문에, 종종 동맥내 투여된다.

투여하려는 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 양, 즉, 약제 조성물의 단위체로서 포장될 양은 투과제 A-7 또는 선택된 구조적 유사체의 효능, 숙주 전체의 집단에 비교한 숙주의 크기 및 기타 개별적인 변이, 및 혈액-뇌 장벽을 통과시키려는 분자(들)에 좌우된다. 약제 조성물 중의 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 실제량 및 농도는 당업자에 의해 쉽게 확정될 수 있다.

또한, 본 발명의 약제 조성물은 혈액-뇌 장벽을 가로질러 통과하는 하나 이상의 관심있는 분자를 함유할 수 있다. 이러한 조성물에는, 관심있는 분자(들)과 혈액-뇌 장벽에 대한 투과를 촉진시키는 투과제 A-7 또는 구조적 유사체 둘 모두가 편리한 패키지로 포함될 수 있다. 이것에 의해 물질이 동시 투여됨으로써, 이들 물질의 투여 효율이 최대화된다.

몇몇 경우에는 이러한 패키징이 불리할 것이다. 많은 경우, 관심있는 분자(들) 및 투과제 A-7 또는 구조적 유사체는, 다른 부분이 투여되기 전에 다수의 부분 중의 한 부분이 혈액 중에 최적 농도로 존재시키기 위해 순차적으로 투여될 것이다. 이러한 경우, 부분들은 개별적으로 패키지될 것이다.

또한, 본 발명은 숙주의 혈액-뇌 장벽에 대한 숙주의 혈류에 존재하는 분자의 투과성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 숙주는 중추신경계(즉, 뇌)를 갖는 임의의 동물일 수 있다. 숙주의 예로는, 포유동물, 예를 들어 사람, 가축(예를 들어 개, 고양이, 소 또는 말) 및 실험용 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼)이 있다.

혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키는데 효율적인, 숙주에 투여되는 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 양은 숙주에 대한 독성 수준 보다 낮다. 따라서, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 비독성 용량은 투과 활성을 희생시킴이 없이 투여될 수 있다.

숙주 혈류 중의 분자는 숙주에 대해 외인성일 수 있다. 예를 들어, 이러한 분자는 신경학적 장애에 대한 치료 효과 또는 예방 효과를 갖는 신경약제학적 제제일 수 있다. 신경학적 장애의 예로는 암(예를 들어, 뇌종양), 후천성 면역결핍증(AIDS), 중추신경계의 감염, 간질, 파킨슨씨 병, 다발성 경화증, 신경축퇴성 질환, 외상(trauma), 우울증, 알쯔하이머병, 편두통, 동통, 또는 발작장애가 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 신경약제학적 제제의 부류로는 항미생물제, 구충제, 아드레날린성제제 및 카테콜아민성제제를 포함하는 자율 신경계에 작용하는 제제, 항경련제, 누클레오시드 유사체, 항종양제, 항외상제, 자극성 아미노산 및 신경학적 장애를 치료 또는 방지하기 위해 사용되는 제제들의 기타 부류가 있다. 항생 물질의 예로는 암포테리신 B, 겐타마이신 황산염, 피리메타민, 클린다마이신 및 페니실린이 있다. 아드레날린성 제제(차단제를 포함함)의 예로는 아테놀올(atenoll)이 있다. 카테콜 아민성 제제의 예로는 도파민, 디아세틸도파민 및 돔페리돈이 있다. 항종양제의 예로는 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 에토포시드, 카르보플라틴 및 시스플라틴이 있다. 사용될 수 있는 항경련제의 예로는 발프로에이트가 있다. 사용될 수 있는 항외상제의 예로는 칼파인(calpain) 억제제, 채널 차단제, 글루탐산염 킬레이터 및 산소 라디칼 제거제가 있다. 누클레오시드 유사체로는 아지도 티미딘(AZT), 디데옥시이노신(ddI) 및 디데옥시시티딘(ddC)이 사용될 수 있다.

또한, 숙주의 혈류 중의 분자는 진단용 영상화제 또는 대조제(contrast agent)일 수 있다. 진단제의 예로는, 예를 들어^99mTc 글루코헵토네이트와 같은 방사능으로 표지된 물질, 또는 예를 들어 가돌리늄 도핑된 킬레이트화제(예를 들어, Gd-DTPA)와 같은 자기 공명 영상화(MRI) 과정에 사용되는 물질이 있다.

외인성 분자들의 숙주 혈류에의 투여 경로는 피하 주사, 혈관내(정맥내를 포함함) 주사, 또는 근육내 주사에 의한 비경구 투여 경로, 또는 소화관, 호흡계 또는 피부와 같은 신체 조직을 통한 흡수에 의한 비경구 투여 경로가 있다. 분자의 투여 형태(예를 들어, 캡슐, 정제, 용액, 에멀션)는 최소한 부분적으로 그것이 투여되는 경로에 좌우된다.

외인성 분자 및 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 숙주의 혈류로의 투여는 동시에 또는 순차적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 치료 약물은 정제 형태로 경구 투여될 수 있는 반면, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 정맥 투여는 나중에(예를 들어, 30분 후) 이루어진다. 이는 투과제 A-7 또는 구조적 유사체가 혈액-뇌 장벽에 대한 약물의 투과성을 증가시키기 위해 제공되기 전에 약물이 위장관으로부터 흡수되어, 혈류에 의해 흡수되기 위한 시간을 허용하기 위한 것이다. 다른 한편, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체는 약물의 혈관내 주사 전, 주사 후 또는 주사와 동시에 투여될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 “동시 투여(co-administration)”는, 투과제 A-7 또는 구조적 유사체와 외인성 분자가, 혈액-뇌 장벽에 대한 외인성 분자의 투과성을 증가시키고, 외인성 분자가 혈액으로부터 뇌의 간질액으로 최대량 통과되는 것을 허용하는 동시 효과를 이루기 위해 혈액 중에 현저한 농도로 있게 되는 시간에 투여됨을 의미한다.

또한, 숙주의 혈류를 경유하여 뇌에 전달될 분자는 숙주에 대해 내인성일 수도 있다. 즉, 숙주에 의해 자연적으로 합성되고 생성되는 생물학적 생성물일 수 있다. 그러한 생물학적 생성물의 예로는 글루코오스 같은 당류, 엔케팔린 및 갑상선 자극 호르몬 방출 인자와 같은 작은 펩티드가 있다.

투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 유효량은 혈액-뇌 장벽에 대한 관심있는 분자의 투과성을 상당히 증가시킬 정도의 양이다. 달리 표현하면, 충분량의 관심있는 분자가 혈액으로부터 뇌의 간질액으로 통과하는 것을 가능하게 하여 뇌에서 치료 효과 또는 예방 효과를 나타내거나 진단 과정이 수행될 수 있도록 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시킬 것이다. 유효량은 개체마다 다르게 결정될 것이며, 최소한 부분적으로 개체의 크기, 특정 질병, 치료하고자 하는 증상의 심각도, 얻고자 하는 결과, 특정 투과제 A-7 또는 구조적 유사체 및 숙주 간의 다른 변이 등을 고려하여 결정될 것이다. 따라서, 유효량은 이러한 인자들을 이용하고, 일상적인 실험을 이용하는 당업자에 의해 결정될 수 있다.

투과제 A-7 또는 구조적 유사체에 대해 반응하는 혈액-뇌 장벽의 투과성의 증가는, 혈액으로부터 뇌로 이동하는 분자의 양과 관련이 있을 뿐만 아니라 관심있는 분자(들)의 유형에도 관련이 있다. 투과제 A-7 또는 구조적 유사체의 효과는, 우선적으로 작은 분자량 물질이 혈액-뇌 장벽을 통과하는 것을 증가시킨다.

본 발명은 하기 특정 실시예에 의해 추가로 예시된다.

[실시예 1]

[BOC-4-MeTyr ψ(CH₂N[Z]) Arg(Tos)-O-수지]

[N-BOC-O-메틸-L-티로신 N-메톡시-N-메틸아미드]

얼음 위에 있는 THF 무수물 350㎖에 3.635g(37.2m㏖)의 N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드를 첨가하였다. 이 혼합물을 10분 동안 교반하여 대부분의 N,O-디메틸히드록실아민 하이드로클로라이드를 용해시켰다. 그런 다음, 플라스크에 하기 성분들을 차례로 첨가하였다: 10g(33.8m㏖)의 N-BOC-O-메틸-L-티로신, 6.997g(33.8m㏖)의 디시클로헥실카르보디이미드, 1.96g(16.04m㏖)의 4-디메틸아미노피리딘, 및 6.209㎖(35.64m㏖)의 N,N-디이소프로필에틸아민. 모든 시약을 첨가하면, 반응 플라스크를 저온실(4℃)에 넣고, 12시간 동안 교반하였다. 플라스크의 내용물을 와트만 퀄리테이티브(Whatman Qualitative) #1 필터지를 사용하여 중력 여과시켰다. 여과물을 회전 증발기에 의해 농축하여 점성 오일로 만든 후 200㎖의 염화메틸렌에 재용해시켰다. 이 미정제 반응 혼합물을 4℃에 1시간 동안 방치한 후, 상기와 같이 여과하여 모든 잔류하는 디시클로헥실우레아를 제거하였다. 여과물을 회전 증발기를 사용하여 재농축하였고, 50㎖의 염화메틸렌에 재용해시켜 칼럼 크로마토그래피를 위해 준비하였다. 칼럼 크로마토그래피는 흡착제로서 실리카(230 내지 400메쉬, 60A) 및 용리제로서 50/50의 에틸아세테이트/헥산을 사용하여 수행하였다. 이 규모의 반응을 위해 사용한 칼럼은 길이가 70㎝이고 직경이 10㎝인 것이다. 생성물은 용리액 약 400㎖가 칼럼을 통과한 후 용리되었다. 분획들을, 실리카겔 60 F-254 유리 배면 플레이트를 사용하여 TLC에 의해 모두 조사하였다. 원하는 생성물(Rf값 : 0.46)을 풀링시키고, 진공 농축시켰다. 농축에 의해 무색 투명한 오일이 수득되었고, 이것을 고진공하에 수 시간 동안 방치시킨 결과, 생성물은 반고체 물질로 남게 되었고, 시간이 경과함에 따라 완전 고체가 되었다.

백색의 고체 5.73g (50.2%)이 남았다. mp. 58 내지 62℃;

[N(t-BOC)-O-메톡시-L-티로시날:]

무수 에틸 에테르 150㎖에 1.04g(27.37 m㏖)의 리튬 알루미늄 하이드라이드를 첨가하고, 현탁액을 30분 동안 부드럽게 환류시켰다. 4℃로 냉각시킨 다음, 환류 콘덴서를 100㎖의 무수 에틸에테르 중에 용해되어 있는 7.4g(21.9m㏖)의 N-(t-BOC)-O-메틸-L-티로신 N-메톡시-N-메틸아미드를 함유하고 있는 압력 평형화 적하 깔대기로 대체시켰다. 깔대기의 내용물을 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가 2시간 동안 반응시켰다. 반응 종료시에, KHSO₄의 저온 용액(230㎖의 H₂O 중의 5.433g)을 반응 용기에 첨가하였다. 층들을 분리한 후, 수성층을 각회 150㎖ 에테르로 3회 추출하였다. 에테르층을 결합시키고, 다음과 같이 조작하였다. 200㎖의 3N HCl로 3회 세척하였다. 200㎖의 포화 중탄산 나트륨으로 3회 세척하였다. 200㎖씩의 식염으로 3회 세척하였다. 황산 마그네슘상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 농축시켰다. 3.78g(61.6%)의 백색 고체를 얻었다. mp: 69 내지 72℃:

[N-BOC-4MeTyrψ(CH₂NH) Arg(Tos)-OH]

100㎖의 메탄올:아세트산(99:1)을 함유하는 플라스크에 4.92g(15m㏖)의 N^g-토실-아르기닌을 첨가한 후, 1.15g(18m㏖)의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다. 시약을 5분 동안 교반시킨 후, 4.46g의 N-BOC-4-Me-티로시날을 첨가하였다. 30분 후, 추가의 1.15g(18m㏖)의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 반응 용기에 첨가하였다. 1.15g씩의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 3회에 걸쳐 30분 간격으로 첨가한 후 반응물을 밤새 교반시켰다. 용매를 증발시킴으로써 반응을 조작하였다. 잔류물을 헵탄에 용해시킨 후 건조시킨 다음, 에테르에 용해시키고, 건조시켰다. 물 200㎖를 플라스크에 첨가하고, 여과에 의해 고체를 수집하였다. TLC 분석 결과, Rf값이 0.35인 균일한 생성물이 나타났다 (CHCl₃:MeOH, 4:1). NMR은 예상했던 생성물과 일치하였다.

[N-BOC-4MeTyrψ(CH₂N [Z]) Arg (Tos)-OH]

슈도디펩티드 2.14g(3.61m㏖)에 100㎖의 1:1 디옥산/물 중의 1.65g(19.6 m㏖)의 NaHCO₃를 첨가하였다. 벤질 클로로포르메이트(0.6㎖, 4m㏖)을 첨가하고, 반응물을 밤새 교반시켰다. 용매를 진공하에 제거하여서 검같은(gummy) 잔류물을 얻었다. 잔류물을 100㎖의 물에 현탁시키고, HCl을 사용하여 pH 2로 산성화시키고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 결합된 에틸 아세테이트 분획을 황산 마그네슘상에서 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜서, 2.35g(90%)의 원하는 물질을 미정제 비결정질 백색 고체로서 수득하였다. 염화 메틸렌/헥산으로부터 재결정하여 2.18g(83%)의 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. TLC 분석 결과 Rf값이 0.64인 균질한 생성물이 나타났다(CHCl₃: MeOH, 4:1).

[폴리스티렌 수지에 대한 보호된 슈도디펩티드의 부착]

보호된 슈도디펩티드를 디시클로헥실카보디이미드와 4-디메틸아미노피리딘을 사용하여 히드록시메틸수지(폴리스티렌-1%디비닐벤젠, 0.7mequiv./g)에 부착시켰다. 1.87g의 히드록시메틸 수지(1.31m㏖)에, 2.28g(3.28m㏖)의 보호된 슈도디펩티드, 410㎎(3.33m㏖)의 4-디메틸아미노피리딘 및 50㎖의 폴리프로필렌 튜브 중의 25㎖의 무수 디메틸포름아미드를 첨가하였다. 이것에, 680㎎(3.3m㏖)의 디시클로헥실카르보디이미드를 첨가하고, 용기를 실온에서 밤새 진탕시켰다. 수지를 여과에 의해 수집하고, 염화메틸렌 및 메탄올로 연속 3회 세척하고, 밤새 진공 건조시켜서, 2.6g의 수지를 수득하였다. 이것을 중량으로 치환시켜 계산하면 0.54m㏖/g이다.

[실시예 2]

[투과제 A-7의 합성 및 정제]

투과제 A-7을, 잔류하는 아미노산을 순서대로(C에서 N 양태로) 수지 결합된, 보호된 슈도디펩티드상에 어셈블링시킴으로써 고체상 펩티드 합성에 의해 제조하였다. 펩티드를 각각의 커플링 사이클에 대해 하기의 프로그램을 사용하는 벡크만 990 펩티드 합성기에서 합성시켰다: 1- CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 2- 40% TFA/CH₂Cl₂로 탈보호(10분씩 2회); 3- CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 4- 이소프로판올로 세척(1분씩 2회); 5- CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 6- 5% DIEA/CH₂Cl₂로 중성화(2분씩 3회); 7- CH₂Cl₂로 세척(1분씩 5회); 8-커플링(3 당량의 BOC-아미노산, 3 당량의 BOP), 60분 1회; 9- CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 10- 이소프로판올로 세척(1분씩 2회); 11- CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 12- 닌히드린에 의한 커플링 시험. 양성 닌히드린 시험에 의해 판단하여 리커플링이 필요한 경우, 단계 6에서 출발하여 마지막 단계까지 진행시키는 부분적인 사이클을 수행하였다. 완전 보호된 펩티드의 어셈블리 후, N-말단 BOC기를 사이클 중의 단계 1 내지 5를 사용하여 제거하고, 수지를 건조시켰다.

미정제 펩티드를, 보호된 펩티드-수지를 10% 아니솔을 함유하는 무수 HF로 1시간 동안 0℃에서 처리함으로써 단리시켰다. HF를 진공 제거하고, 미정제 수지/펩티드를 에테르로 3회 세척하였다. 펩티드를 10% 아세트산으로 추출하고, 동결건조시켜서, 미정제 펩티드를 수득하였다.

펩티드를, C₁₈역상 지지체상에서 0.1% TFA/아세토니트릴 구배(30분에 걸쳐서 10 내지 40%) 사용하는 HPLC에 의해 부분 정제시켰다. 주요 피크로부터 분획을 결합시켜서, 정제된 투과제 A-7을 수득하였고, 이것은 TLC, 전기영동 및 HPLC에 의해 균질한 것으로 나타났다. FAB/MS 분석 결과 예상 분자량인 1098 이었다. 6N HCl 가수분해(110℃에서 24시간) 후 아미노산 분석 결과, 조성은 하기와 같았다: Ser(1) 0.89, Pro(2) 2.00, Gly(1) 0.97, Arg(1) 1.03, Thi(1) 0.73, 4Me-Tyr-ψ(CH₂NH)-Arg(1)이 또 다른 방법에 의해 검출되었지만, 가수분해에서 부분적으로 파괴되었다.

[실시예 3]

[투과제 A-7의 또 다른 합성 및 정제]

투과제 A-7은 BOC-Arg(Tos)-수지 지지체로 출발하여 나머지 아미노산을 순차적으로 어셈블링(C-에서 N-방식으로)시킴으로써 고체상 펩티드 합성에 의해 또한 제조될 수 있다. 하기 프로그램 사이클을 사용하여 환원된 디펩티드를 지지체상에서 제조하였다: 1) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 2) 40% TFA/CH₂Cl₂로 탈보호(1분씩 1회, 그 후, 30분 1회); 3) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 4) 메탄올로 세척(1분씩 2회); 5) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 6) DMF로 세척 (1분씩 2회); 7) DMF/1% HOAc로 세척(1분, 1회); 8) BOC-4-Me-티로시날로 커플링. (주: 3당량의 BOC-4-Me-티로시날과 3당량의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 최소량의 DMF에 미리 용해시켰다. 커플링을 개시시키기 위해, 아미노산/보로하이드라이드 용액을, DMF/1% HOAc에 현탁시켜 놓은 세척된 펩티드 수지에 첨가하였다.) 커플링을 닌히드린 시험에 의해 모니터하였고, 전형적으로 30분내에 완결되는 것으로 나타났다. 환원성 아민화후, 펩티드 수지를 DMF로 세척한 후 메탄올로 세척하였다. 그 후, 환원된 디펩티드의 2차 아민을 벤질옥시카르보닐기(Z-)를 사용함으로써 추가 합성을 위해 보호하였다. 이 기를, 수지를 각각의 단계마다 1 내지 4시간 동안 5% DIEA/CH₂Cl₂중의 2 × 5당량의 Z-OSu로 처리함으로써 도입시켰다.

나머지 아미노산들을 하기 자동 프로토콜을 사용하여 단계적으로 첨가하였다: 1) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 2) 40% TFA/CH₂Cl₂로 탈보호(1분 1회후, 30분 1회); 3) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 4) 메탄올로 세척(1분씩 2회); 5) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 6) 5% DIEA/CH₂Cl₂로 중성화; 7) CH₂Cl₂로 세척(1분 1회); 8) 5% DIEA/CH₂Cl₂로 중성화; 9) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 10) 30분 내지 2시간 동안 3당량의 BOC-아미노산, 3당량의 BOP 시약, 3당량의 DIEA로 커플링; 11) MeOH로 세척(1분씩 2회); 12) 닌히드린에 의한 커플링 시험. 양성 닌히드린 시험에 의해 판단하여 리커플링이 필요한 경우, 단계 8에서 시작하여 마지막 단계까지 지속되는 부분적인 사이클을 수행하였다. 따라서, 하기 서열의 아미노산이 첨가되었다: BOC-Pro, BOC-Ser(Bz), BOC-Thi, BOC-Gly,BOC-Hyp(Bz), BOC-Pro, BOC-Arg(Tos). 완전 보호된 펩티드의 어셈블리 후, N-말단 BOC 기를, 사이클 중의 단계 1 내지 5를 사용하여 제거시키고, 수지를 건조시켰다.

미정제 펩티드를, 보호된 펩티드-수지를 10% 아니솔을 함유하는 무수 HF로 1시간 동안 0℃에서 처리함으로써 수지로부터 단리시켰다. HF를 진공하에 제거하고, 미정제 수지/펩티드를 에테르로 3회 세척하였다. 펩티드를 10% 아세트산으로 추출하고, 동결건조시켜서, 미정제 펩티드를 수득하였다.

펩티드를, C₁₈역상 지지체상에서 0.1% TFA/아세토니트릴 구배(180분동안 0~25%)를 사용하여 HPLC에 의해 정제하였다. 주요 피크로부터의 분획을 결합시켜서, 정제된 투과제 A-7을 수득하였고, 이것은 TLC, 전기영동 및 HPLC에 의해 균질한 것으로 나타났다. FAB/MS 분석 결과, 예상 분자량인 1098 및 투과제 A-7의 서열이 적절한 것으로 확인되는 단편화 패턴이 수득되었다.

[실시예 4]

[투과제 A-9의 합성 및 정제]

투과제 A-7 아미노산 서열의 위치 2와 7에 프롤린 잔기 대신 데히드로프롤린을 갖는([데히드로 Pro2,7]-A-7), 투과제 A-7의 유사체인 투과제 A-9를 BOC-Arg(Tos)-수지 지지체로 출발하여 나머지 아미노산을 순차적으로 어셈블링(C- 에서 N-방향으로)함으로써 고체상 펩티드 합성법에 의해 제조하였다. 환원된 디펩티드는 하기의 프로그램 사이클을 사용하여 지지체상에서 제조하였다: 1) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 2) 40% TFA/CH₂Cl₂로 탈보호(1분 1회, 그 후, 30분 1회); 3) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 4) 메탄올로 세척(1분씩 2회); 5) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 6) DMF로 세척(1분씩 2회); 7) DMF/1% HOAC로 세척(1분 1회); 8) BOC-4-Me-티로시날로 커플링. (3당량의 BOC-4-Me-티로시날과 3당량의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 최소량의 DMF에 미리 용해시켰다. 커플링을 개시시키기 위해, 아미노산/보로하이드라이드 용액을 DMF/1% HOAC에 현탁시켜 놓은 세척된 펩티드에 첨가하였다.) 커플링을 닌히드린 시험에 의해 모니터하였고, 전형적으로 1시간내에 완결되는 것으로 나타났다. 환원성 아민화 후, 펩티드 수지를 DMF로 세척한 후, 메탄올로 세척하였다. 그런 다음, 환원된 디펩티드의 2차 아민을 벤질옥시카르보닐기(Z-)를 사용하여 추가의 합성을 위해 보호하였다. 이 기를, 수지를 각각의 단계마다 1 내지 4시간 동안 5% DIEA/CH₂Cl₂중의 2 × 5당량의 Z-Cl로 처리함으로써 도입시켰다.

나머지 아미노산들을 하기 자동 프로토콜을 사용하여 단계적으로 첨가하였다: 1) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 2) 40% TFA/CH₂Cl₂로 탈보호(1분 1회, 그 후, 30분 1회); 3) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 4) 메탄올로 세척(1분씩 2회); 5) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 6) 5% DIEA/CH₂Cl₂로 중성화; 7) CH₂Cl₂로 세척(1분 1회); 8) 5% DIEA/CH₂Cl₂로 중성화; 9) CH₂Cl₂로 세척(1분 3회); 10) 30분 내지 2시간 동안, 3당량의 BOC-아미노산, 3당량의 BOP 시약, 3당량의 DIEA로 커플링; 11) MeOH로 세척(1분씩 2회); 12) 닌히드린에 의한 커플링 시험. 양성 닌히드린 시험에 의해 판단하여 리커플링이 필요한 경우, 단계 8에서 시작하여 마지막 단계까지 지속되는 부분적인 사이클을 수행하였다. 따라서, 하기 서열의 아미노산이 첨가되었다. BOC-데히드로 프롤린, BOC-Ser(Bz), BOC-Thi, BOC-Gly, BOC-Hyp(Bz), BOC-데히드로프롤린, BOC-Arg(Tos). 완전 보호된 펩티드의 어셈블리 후, N-말단 BOC 기를, 사이클 중의 단계 1 내지 5를 사용하여 제거하고, 수지를 건조시켰다.

미정제 펩티드를, 보호된 펩티드-수지를 10% 아니솔을 함유하는 무수 HF로 1시간 동안 0℃에서 처리함으로써, 수지로부터 단리하였다. HF를 진공하에 제거하고, 미정제 수지/펩티드를 에테르로 3회 세척하였다. 펩티드를 10% 아세트산으로 추출하고, 동결건조시켜서 미정제 펩티드를 수득하였다.

펩티드를 C₁₈역상 지지체상에서 0.1% TFA/아세토니트릴 구배(180분동안 0 내지 25%)를 사용하여 HPLC에 의해 정제하였다. 주요 피크로부터의 분획을 결합시켜서, 정제된 투과제 A-9를 수득하였고, 이것은 TLC, 전기영동 및 HPLC에 의해 균질한 것으로 나타났다. 아미노산 분석 결과는 하기와 같았다: Ser(1) 0.97, 데히드로Pro(2) 1.69, Gly(1) 0.95, Arg(1) 0.95, Hyp(1) 0.92, Thi(1) 0.75.

[실시예 5]

[투과제 A-14의 합성 및 정제]

D-아르기닌이 펩티드 결합에 의하여 N-말단에 부착되어 있는 투과제 A-7인 투과제 A-14, 즉, [D-Arg⁰]-A-7을 BOC-Arg(Tos)-수지 지지체로 출발하여 나머지 아미노산을 순차적으로 어셈블링(C- 에서 N-방향으로)함으로써 고체상 펩티드 합성에 의해 제조하였다. 환원된 디펩티드를 하기 프로그램 사이클을 사용하여 지지체상에서 제조하였다: 1) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 2) 40% TFA/CH₂Cl₂로 탈보호(1분 1회, 그 후, 30분 1회); 3) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 4) 메탄올 세척(1분씩 2회); 5) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 6) DMF로 세척(1분씩 2회); 7) DMF/1% HOAC로 세척(1분 1회); 8) BOC-4-Me-티로시날로 커플링. (주 : 3당량의 BOC-4-Me-티로시날과 3당량의 나트륨 시아노보로하이드라이드를 최소량의 DMF에 미리 용해시켰다. 커플링을 개시시키기 위해, 아미노산/보로하이드라이드 용액을 DMF/1% HOAC에 현탁시켜 놓은 세척된 펩티드에 첨가하였다.) 커플링을 닌히드린 시험에 의해 모니터하였고, 전형적으로 30분내에 완결되는 것으로 나타났다. 환원성 아민화후, 펩티드 수지를 DMF로 세척한 후, 메탄올로 세척하였다. 그런 다음, 환원된 디펩티드의 2차 아민을 벤질옥시카르보닐기(Z-)를 사용하여 추가 합성을 위해 보호하였다. 이 기를, 수지를 각각의 단계마다 30분 동안 5% DIEA/CH₂Cl₂중의 10% 벤질클로로포름산염으로 처리함으로써 도입시켰다. 그런 다음, 수지를 CH₂Cl₂(1분씩 3회), 에탄올(1분 1회), 및 CH₂Cl₂(1분씩 3회) 순차적으로 세척하였다.

나머지 아미노산들을 하기 자동 프로토콜을 사용하여 단계적으로 첨가하였다: 1) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회) ; 2) 40% TFA/CH₂Cl₂로 탈보호(1분 1회, 그 후 30분 1회); 3) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 4) 메탄올로 세척(1분씩 2회); 5) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 6) 5% DIEA/CH₂Cl₂로 중성화; 7) CH₂Cl₂로 세척(1분 1회); 8) 5% DIEA/CH₂Cl₂로 중성화; 9) CH₂Cl₂로 세척(1분씩 3회); 10) 30분 내지 2시간 동안, 4당량의 BOC-아미노산, 4당량의 DCC, 4당량의 HOBt로 커플링; 11) MeOH로 세척(1분씩 2회). 아르기닌을, 새로운 시약으로 단계 10을 반복함으로써 2중 커플링시켰다. 따라서, 하기 서열의 아미노산이 첨가되었다: BOC-프롤린, BOC-Ser(Bz), BOC-Thi, BOC-Gly, BOC-Hyp(Bz), BOC-Pro, BOC-Arg(Tos), BOC-D-Arg(Tos). 완전 보호된 펩티드의 어셈블리 후, N-말단 BOC 기를, 사이클 중의 단계 1 내지 5를 사용함으로써 제거하고, 수지를 건조시켰다.

미정제 펩티드를, 보호된 펩티드-수지를 10% 아니솔을 함유하는 무수 HF로 1시간 동안 0℃에서 처리함으로써, 수지로부터 분리하였다. HF를 진공하에 제거하고, 미정제 수지/펩티드를 에테르로 3회 세척하였다. 펩티드를 10% 아세트산으로 추출하고, 동결건조시켜서, 미정제 펩티드를 수득하였다.

펩티드를 C₁₈역상 지지체상에서 0.1% TFA/아세토니트릴 구배(5, 40 및 75% 아세토니트릴)를 사용하여 HPLC에 의해 정제하였다. 40% 용리 분획을 C₄지지체 상에서 60분에 걸쳐 10 내지 20%의 0.1% TFA/아세토니트릴 구배를 사용하여 추가로 정제시켰다. 주요 피크로부터의 분획을 결합시켜서, 정제된 투과제 A-14를 수득하였고, 이것은 HPLC에 의해 균질한 것으로 나타났다. FAB/MS 분석 결과, 예상 분자량 1155인 것으로 나타났다. 아미노산 분석 결과는 하기와 같았다; Hyp(1) 1.02, Ser(1) 0.98, Gly(1) 0.86, Arg(2) 2.07, Pro(2) 2.08.

[실시예 6]

[마우스에서의 혈액-뇌 장벽 개방의 시간 경과]

암컷 Balb/C 마우스(체중: 약 20g)을 사용하였다. 모든 용액을 멸균 인산염-완충 식염수 중에서 제조하였다. 100㎕ 중의 10㎍의 투과제 A-7를 시간 0에서 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다. 투과제 A-7을 주사한 즉시, 또는 10분, 20분, 30분 또는 60분 후,¹⁴C-수크로오스(3×10⁶dpm)를 꼬리 정맥에 정맥 주사하였다. 몇몇 실험에서, 수크로오스를 투과제 A-7을 주사한 후 즉시 투여하였고, 마우스를 2분 또는 5분 후에 안락사시켰다. 그 밖의 실험에서는, 마우스를,¹⁴C수크로오스를 투여한 지 10분 후에 안락사시켰다. 혈액을 헤파린처리한 튜브에 수집하여, 원심분리시킴으로써 생성되는 펠릿으로부터 혈장을 분리하였다. 혈장의 분취액 100㎕의 방사능을, 15㎖의 아쿠아졸-2(Dupont)를 첨가한 후, 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정하였다. 뇌를 분리하여, 2.5㎖의 물과 2.5㎖의 1% 나트륨 도데실술페이트(SDS) 중에 균질화시켰다. 균질액 1㎖을 분취하여, 15㎖의 아쿠아졸-2에 첨가하고 카운트하였다. 뇌의 수크로오스 흡수를 계산하고, 주사 용량×100의 백분율로서 그래프로 표현하였다. 제1도에 도시된 바와 같이, 가로축의 값은 투과제 A-7을 주사와 안락사 사이의 시간 간격을 나타내며, 10분째 및 20분째에서의¹⁴C-수크로오스의 흡수는 투과제 A-7의 존재시에 현저하게 높았다. 혈액-뇌 장벽은 투과제 A-7을 주사한 후 20분 이상 동안 수크로오스에 대해 투과성인 상태로 남아 있었지만, 40분 후에는 불투과성이었다. 각각의 데이터 지점은 8마리의 마우스로부터 얻은 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.

[실시예 7]

[투과제 A-7 및 이것의 2개의 쌍성 이성체(8D 및 9D)에 대한 마우스에서의 혈액-뇌 장벽 개방의 시간 경과]

체중이 20g인 암컷 Balb/C 마우스를 사용하였다. 모든 용액을 멸균 인산염-완충 식염수 중에 제조하였다. 실시예 6에서 설명한 것과 유사한 실험에서의 수크로오스 흡수 측정법을 사용하여, 투과제 A-7을 이것의 2개의 쌍성 이성체, 8D-A-7과 9D-A-7과 비교하였다. 8D-A-7의 경우, D-4-Me-티로신이 고체상 펩티드 합성으로부터 제조되는 펩티드의 8번째 위치의 아미노산에 대한 출발 물질이었다. 9D-A-7 쌍성 이성체의 경우, 고체상 수지를 합성 전에 보호된 D-아르기닌으로 에스테르화시켰다. 식염수 또는 다양한 용량의 쌍성 이성체들을¹⁴C-수크로오스와의 혼합물로서 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였고, 10분 후, 마우스들을 안락사시켰다. 각각의 동물로부터의 혈액을 개개의 헤파린처리된 튜브안에 수집하고 원심분리하여, 혈장을 생성되는 펠릿으로부터 분리하였다. 혈장의 분액 20㎕의 방사능을 15㎖의 아쿠아졸을 첨가한 후 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 카운트하였다. 뇌를 분리하여, 5㎖의 0.5% 나트륨 도데실 설페이트 용액 중에서 균질화시켰다. 이 균질액 1㎖의 방사능을 카운트하였다.

몇몇 실험에서는, 뇌조직내로의 투과제 A-7에 의해 유도된 관심있는 방사성표지된 화합물의 실제 흡수를 측정하기 위해, 혈액 중의 방사성표지된 화합물이 뇌에서 발견되는 전체 방사능에 기여하는 정도를 평가하였다. 대조 뇌의 모든 방사능은 혈액 중에 존재하는 방사능에 의해 반영되는 것으로 가정하였다. 따라서, 대조 뇌에 해당하는 방사능의 양을 대조혈액 1㎕에 해당하는 방사능으로 나눔으로써, 대조뇌에 해당하는 혈액의 1㎕에 대한 특정값을 얻었다. 그 후, 대조 표준 및 투과제 A-7 처리된 뇌가 동일 부피의 혈액을 함유하는 것으로 가정하였다. 그런 다음, 대조 뇌 당 혈액의 양을 투과제 A-7으로 처리한 마우스의 1㎕ 혈액 당 방사능과 곱하고, 이로써 투과제 A-7으로 처리한 마우스에 대한 뇌 당 혈액 중의 방사능을 대략 계산하였다. 마지막으로, 처리된 뇌에 함유된 혈액의 방사능을 처리된 뇌 중의 방사능으로부터 감하여, 투과제 A-7 처리된 뇌 조직만의 방사성표지된 물질의 양을 수득하였다. 수크로오스의 뇌 흡수를 계산하여, 주사된 용량의 백분율로서 나타내었다.

이들 쌍성 이성체의 존재시의¹⁴C-수크로오스의 흡수를 제2도에 도시하였다. 이 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 9D 쌍성 이성체가 아닌 8D 쌍성 이성체가, 뇌내로의¹⁴C-수크로오스 흡수를 개선시키는데 투과제 A-7과 비교하여 거의 같은 정도로 활성이었다.

[실시예 8]

[브래디키닌, 투과제 A-7 및 그 밖의 혈액-뇌 장벽 투과제의 용량 반응 관계. 수크로오스 흡수 실험]

이들 실험에 대한 방법은 전술한 시간 경과 실험(실시예 6)과 유사하며, 단, 모든 마우스를,¹⁴C-수크로오스와 브래디키닌, 투과제 A-7 또는 그밖의 혈액-뇌 장벽 투과제의 혼합물을 마우스의 꼬리 정맥에 1회 주사한 지 10분 후에 안락사시켰다.

제3(a)도는 주사한 지 10분 후, 다양한 용량의 브래디키닌, 투과제 A-7 또는 또 다른 혈액-뇌 장벽 투과제인 A-4([Thi5, Phe8 ψ(CH₂-NH)Arg9]-브래디키닌)의 주사 용량의 100 × %로서 나타낸¹⁴C-수크로오스 흡수량을 도시한다. 제3(b)도는 브래디키닌, 투과제 A-7 또는 투과제 A-4의 용량 범위에 걸쳐 % 최대 반응(¹⁴C 수크로오스 흡수율)을 도시한다. 투과제 A-4 및, 특히 A-7은 브래디키닌과 캅토프릴(captopril)의 배합물(BK+Cap) 보다 강력하였다. 데이터 지점 당 마우스의 수는 12 내지 16 이었다.

투과제 A-7의 2개의 추가의 구조적 유사체를 마우스에게 행한 유사한¹⁴C-수크로오스 흡수 실험에서 또한 조사하였다. 투과제 A-9([데히드로 Pro2,7]-A-7) 및 A-14([D-Arg 0]-A-7)를 사용하여 수득한 결과를 각각 제3(c)도와 제3(d)도에 도시하였다. 2개의 유사체도 A-7에 비교할 만한 방식으로 뇌로의¹⁴C-수크로오스의 흡수를 개선시켰다. 이들 실험에서는 시간 지점 당 8마리의 마우스를 사용하였다.

[실시예 9]

[투과제 A-7과 동시 투여되는 경우, 다수의 저분자량 물질의 뇌 내로의 흡수]

이들 실험의 방법은 상기 세 가지 실시예의 방법과 유사하다. 특이하게 방사성 표지된 상이한 분자량 및 구조를 갖는 분자들을, 식염수와 함께 또는 식염수 중의 1 또는 10㎍의 투과제 A-7과 함께 꼬리 정맥을 통하여 마우스에 정맥 주사하였다. 동시 투여후 10분 후에 마우스들을 안락사시켜서, 뇌에 존재하는 방사능을 전술한 바와 같이¹⁴C 수크로오스에 대해 측정하였다. 이들 실험의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

데이터는 각각의 군에서 7 내지 15 마리의 마우스에 대한 평균±표준편차로서 표시한다.

* 투과제 A-7 용량은 1㎍ 이었다.

추가의 실험을 마우스에서 상이한 분자량의 화합물과 100㎍/㎏의 투과제 A-7을 사용하여 수행하였다. 이 실험은 실시예 7에서 투과제 A-7의 8D 및 9D 쌍성 이성체에 대해 설명한 것과 유사한 분석 방법을 통합 사용하였다(혈액 중의 방사능에 대한 보정함). 이들 추가의 실험 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

작은 분자량의 물질이 투과제 A-7과 동시 투여되는 경우에 혈액-뇌 장벽을 우선적으로 가로지르는 것으로 나타난다.

[실시예 10]

[브래디키닌 또는 투과제 A-7과 동시 투여되는 경우, 뇌 종양 이식편을 갖는 래트의 수명에 대한 항종양제인 시스플라틴의 효과]

수컷 피셔(Fisher) 344 래트(체중: 200 내지 250g)를 케타민 HCL(100㎎/㎏) 및 아세프로마진(10㎎/㎏)으로 마취시켰다. 래트를 접촉주성 장치에 넣었다. 각각의 동물의 머리털을 깍고, 중심선을 절개하여 두개골을 노출시켰다. 작은 구멍을 우측 지각 운동 피질 위에 뚫고 100㎕의 세포 현탁액(250,000 9L 신경교 세포)을 5분에 걸쳐 각각의 동물의 오른쪽 꼬리 피각에 주사하고 두피를 봉합하였다. 동물들을, 건강을 잃어가는 신호에 대해 매일 관찰하였다. 건강이 매우 불량한 신호가 관찰되었을 때(눈의 충혈 또는 우측 반사의 소실), 동물들을 안락사시켜서 종양의 존재에 대하여 뇌를 조사하였다.

5일에서 14일째에 동물의 군에 꼬리 정맥을 통해 하기 정맥내 처리를 수행하였다: 미처리; 시스플라틴 200㎍/래트; 50㎍의 투과제 A-7 처리후 5분 후 시스플라틴 처리; 또는 복강내로 캅토프릴 처리 후 15분 후 1㎎의 브래디키닌 처리(BK+Cap) 후, 5분 후 시스플라틴 처리. 결과를 하기 표 3에 평균 수명으로서 나타내었다.

[표 3]

제4(a)도는 실험에서의 모든 동물의 수명을 예시한다. 투과제 A-7 + 시스플라틴 처리를 받은 군에서 2마리의 동물이 연장된 수명을 나타냈고, 그중 한 동물을 38일째에 안락사시키고, 나머지 한 동물을 62일째에 안락사시켰다. 2마리의 동물은 종양이 성장한 증거를 가졌다.

시스플라틴과 투과제 A-7으로 수행한 추가의 실험 결과를 제4(b)도 및 하기 표 4에 나타내었다.

[표 4]

* 한 마리는 23일째에 치사하였고; 한 마리는 60일째에 치사하였다(안락사).

이 실험에서, 투과제 A-7과 시스플라틴을 조합하여 처리하였을 때, 시스플라틴만으로 처리하여 관찰했을 때와 비교하여 평균 수명의 증가는 관찰되지 않았다. 그러나, 조합 처리군에서 연장된 시간 동안 생존한 2마리의 동물이 있었다.

[실시예 11]

[래트에서의 머리 영역(뇌)으로의 99mTc-DISIDA (N-[2,6-디이소프로필아세트아닐리드]이미노디아세트산)의 흡수]

암컷의 스프라그-도울리종의 래트(체중:250-300g)를 펜토바르비탈(60㎎/㎏) 및 케타민(100㎎/㎏)으로 마취시켰다. 대퇴골 정맥을 외과 수술로 노출시켜서 우측 대퇴골 정맥을 식염수로 또는 일정 범위 용량의 투과제 A-7로 주사하였다. 2분 후, 환으로 된^99mTc-DISIDA를 좌측 정맥에 주사하였다. 그런 다음, 래트를 즉시 감마 카메라상에 놓고, 처음 5분 동안에는 1분 간격으로, 그 다음 DISIDA 주 사후 1시간이 될 때까지는 5분 간격으로 방사능을 카운트하였다. 주요 기관이 뇌인 머리 부분을 확인하였고, 이 부분에 존재하는 방사능의 양을 대조표준과 투과제 A-7의 시험 용량 각각에 대해 제5도에 도시하였다. 각 용량에 대한 데이타는 한 마리의 래트에서 방사능을 측정한 결과이다. 매우 초기에는, 투과제 A-7이 대조동물에 비교하여 상기 머리 부분으로의^99mTc-DISIDA의 흡수를 증가시켰다. 이 실험은 2개의 유사한 실험을 대표한다.

다른 세트의 실험에서는 투과제 A-7을 마취된 래트의 정맥에 1회 정맥내 주사하였고, 2분 후에^99mTc-DISIDA를 대뇌골 정맥에 주사하였다. 대조 동물에는 투과제 A-7을 주사하지 않았다(식염수의 위조(sham) 주사).^99mTc-DISIDA 주사후 2, 10, 30 또는 60분 간격으로 래트를 안락사시켜서, 래트의 뇌를 분리하여, 감마 카운터에서 카운트하였다.^99mTc-DISIDA의 뇌흡수를 계산하였고, 기관 당 주사 용량의 %로서 표현하였다. 주사 후 선택된 시간에서의 미처리된 래트와 투과제 A-7로 처리된 래트의 전체 뇌안으로의 99mTc-DISIDA의 생체 분포를 하기 표 5 및 제6도에 나타내었다.

[표 5]

데이터는 군 당 3마리 동물에 대한 평균±표준편차로서 표현된다.

이들 결과는 방사성 표지된 제제의 주사 후 초기 시간대에 대조 래트와 비교하여, 투과제 A-7 처리된 래트의 뇌에서 더 많은 99mTc-DISIDA가 발견되었음을 증명한다.

[실시예 12]

[로페라미드의 항통각 효과에 대한 투과제 A-7의 효과. 꼬리 튕기기 검정]

체중이 약 20g인 암컷의 Balb/C 마우스를 사용하였다. 꼬리 튕기기 검정은 꼬리 튕기기(Tail Flick) 장치 모델 TF6(Emdie Instruments, Maidens, VA)을 사용하여 수행하였다. 가열원의 세기를 매일 조정하여, 실험한 적이 없는 미처리 마우스에서 2.0초와 3.2초 사이의 반응 시간을 수득하였다. 가열원에 대한 최대 노출 시간은 7.5초였다. 각각의 마우스이 꼬리 철회 반응 시간을 꼬리 정맥을 통해 실험 물질을 정맥 주사하기 직전에 10초 간격으로 4회 측정하였다. 마지막 3회의 값을 평균하여 바셀린값(VO)으로 취하였다. 4회 측정으로 이루어지는 또 한 세트의 실험을, 아편제 수용체 아고니스트인 로페라미드를 다른 제제없이 및 다른 제제와 함께 꼬리에 정맥 주사한 후 즉시, 5분, 10분, 15분, 30분, 및 60분 간격으로 수행하였다. 각각의 시간 지점에 대한 마지막 3회 측정치(V)를 평균하였다. 몇몇 실험에서는 아편제 수용체 길항제인 날로르핀(nalorphine)(10㎎/㎏; 식염수 중의 100㎕)을 투과제 A-7(0.1㎍) 및 로페라미드(25㎍)를 투여하기 15분 전에 복강내 투여하였다. 결과를 식 100×(V-VO)/(7.5-VO)에 따른 최대 항통각 반응의 %로서 나타냈다.

제7도는 % 최대 항통각 반응에서의 증가에 의해 증명되는 로페라미드에 대한 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 투과제 A-7의 능력을 도시한다. 각각의 지점은 로페라미드, 투과제 A-7, 및 투과제 A-7과 로페라미드를 날로르핀 처리 없이 또는 처리하여 주사한지 30분 후에, 4마리의 마우스를 사용하는 2회 실험으로부터의 풀링된 데이타를 나타낸다. 완전한 항통각 반응은 투과제 A-7을 로페라미드와 동시 주사되었을 때 얻어졌다. 효과는 날로르핀으로의 전처리에 의해 완전 길항되었다.

[실시예 13]

[투과제 A-7과 동시 투여되는 경우, 래트의 이동 활성에 대한 도파민성 길항제의 효과]

돔페리돈은 혈액-뇌 장벽 외부의 후지(postrema) 영역에서의 작용에 의해 항구토제로서 임상적으로 사용되는 도파민 수용체 길항제이다. 문헌에 기재되어 있는 보고에 의해, 돔페리돈은 혈액-뇌 장벽을 가로지르지는 않지만, 뇌실내에 직접 주사한 경우에 도파민 수용체에 대한 도파민성 화합물, 예를 들어 아포모르핀의 결합을 효과적으로 차단하는 것으로 증명되었다. 적절한 시험은 돔페리돈이 투과제 A-7과 동시 투여되었을 때 이동 활성의 도파민 수용체 길항제 유도된 증가를 길항할 수 있는 가에 대한 것이지만, 투과제 A-7 없이 투여된 경우에는 비효과적이다.

스프라그-도울리 종의 래트(체중:125-150g)를 2일간 활성 우리(activity cages)에 적응시켰다. 활성 우리는 각각의 우리의 마루를 가로질러 2개의 광전지 비임이 지나가고 있는 표준 크기의 래트 우리이다. 2개의 비임 중의 하나를 통과하는 래트의 모든 움직임을 컴퓨터로 기록하였다. 이동 활성은 2시간에 걸쳐 10분 간격으로 차례로 비임이 차단되는 회수로서 측정하였다.

래트에게 혈액-뇌 장벽을 쉽게 가로지르는 도파민 아고니스트인 아포모르핀을 피하 주사(0.75㎎/㎏)하기 1시간 전에, 10㎍의 투과제 A-7과 300㎍의 돔페리돈을 동시 주사하거나 또는 돔페리돈만을 주사하였다. 래트의 이동 활성을, 아포모르핀을 주사한 지 2시간이 될 때까지 10분 간격으로 활성 우리에서 측정하였다.

각각의 처리군에서의 3마리 래트를 이용한 이 실험의 결과를 제8도에 도시하였다. 투과제 A-7과 돔페리돈의 조합은 아포모르핀과 관련된 이동 활성의 증가를 길항시켰다. 돔페리돈만으로는 아포모르핀에 의해 유도된 이동 활성에 대해 거의 영향을 미치지 못하였다.

[실시예 14]

[투과제 A-7과 동시 투여되는 경우, 래트의 음용 방식에 대한 안지오텐신 II의 효과]

상기 생리적 농축액 중의 안지오텐신 II는 물로 배를 채운 래트의 음용 거동을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 이 방식은 뇌실 기관과 관련되지 않은 뇌영역 내에서 안지오텐신 II 수용체의 자극의 결과로서 일어나는 것으로 제시되었다. 높은 용량으로 투여될 때 음용 거동을 유발할 수 있는 안지오텐신 II 유사체를 사용하여 투과제 A-7의 동시 투여의 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.

래트에게 측면의 꼬리 정맥을 통하여 10㎍의 투과제 A-7과 0.1, 0.3, 3, 10 또는 30㎍의 β-Asp¹-안지오텐신 II를 함께 주사하거나 β-Asp¹-안지오텐신 II를 단독 주사하였다. 1시간 간격으로 각각의 래트가 소비한 물의 부피를 측정하였다.

각각의 시험군에서 3마리씩의 래트를 사용한 이 시험의 결과를 제9도에 도시하였다. 투과제 A-7과 안지오텐신 II 유사체의 동시 투여는 유사체만의 투여와 비교할 때, 용량 반응 곡선이 좌측으로 이동하는 것을 유발하거나, 또는 유사체의 용량을 더 낮게 사용하는 것을 가능하게 하였다.

또 다른 실험에서, 래트에게 꼬리 정맥 주사를 통하여 식염수, 1㎍의 β-Asp¹-안지오텐신 II, 1㎍의 β-Asp¹-안지오텐신 II와 8㎍의 사랄라신(saralasin), 또는 1㎍의 β-Asp¹-안지오텐신 II와 10㎍의 투과제 A-7과 8㎍의 사랄라신을 투여하였다. 사랄라신은 이것이 공지된 안지오텐신 II 수용체 길항제이기 때문에 투여하였다. 다시 한번, 각각의 래트가 1시간 간격으로 소비한 물의 양을 측정하였다.

각각의 군에서 3마리의 래트를 사용한 이 실험의 결과를 제10도에 도시하였다. 투과제 A-7과 β-Asp¹-안지오텐신 II의 동시 투여는, 안지오텐신 II 유사체만을 투여하거나 사랄라신과 함께 투여했을 때와 비교하여 물 소비량을 상당히 증가시켰다. 사랄라신이 투과제 A-7 및 안지오텐신 II 유사체와 동시 투여될 때 물 소비는 정상적인 범위에서 유지되었고, 이것은 안지오텐신 II 수용체 길항제의 첨가에 의해 안지오텐신 II 유사체 유도된 음용 방식이 억제되었음을 나타낸다.

[실시예 15]

[래트의 뇌내로의⁸⁶Rb의 흡수에 대한 투과제 A-7의 효과]

수컷의 스프라그-도울리종 래트(체중:200-300g)에게, 측면의 꼬리 정맥을 통하여 75㎍/㎏의 투과제 A-7 또는 식염수를 투여하였다. 5마리의 래트를 1군으로 하였다. 이 주사 후 즉시, 5분, 10분, 20분, 40분 또는 60분 후에 각각의 래트의 대측성 꼬리 정맥에⁸⁶Rb(5000cpm)를 투여하였다.⁸⁶Rb를 투여한지 4분 후에 래트를 안락사시켜서 뇌를 분리하였다. 각각의 뇌를 절개하여 연막관(뇌의)을 유리시키고 남아있는 뇌 조직의 방사능을 감마 카운터에서 카운트하였다.⁸⁶Rb의 뇌 흡수를 뇌 당 1분 당 카운트로서 표시하였다. 이 결과는 제11도에 도시되어 있으며, 이것은⁸⁶Rb의 주사후 매우 초기에 대조 래트에서 발견되는 양과 비교하여 투과제 A-7 처리된 래트의 뇌에서⁸⁶Rb의 더 많은 양이 발견됨을 증명한다.

[실시예 16]

[브래디키닌 결합의 치환에 대한 투과제 A-7 및 9D-A-7 쌍성 이성체의 효과]

이 실험에 사용한 내피 세포는 개개의 래트 뇌의 미소관으로부터 분리하여 배양하였다. 결합 실험을 위해, 계대 9 내지 12까지의 세포를 젤라틴 처리한 24-웰 조직 배양 접시 위에 시이딩(1:5 스플릿으로)하였다. 결합 실험은 시이딩한지 제7일째에 수행하였다. 24-웰 플라이트상의 컨플루언트 내피 세포 배양물을 인큐베이터로부터 취하여 각각의 웰을 둘베코의 인산염 완충 식염수(DPBS, 0.2g/L KCl, 0.2g/L KH₂PO₄, 8g/L NaCl, 1.15g/L Na₂HPO₄, 0.13g/L CaCl₂및 0.1g/L MgCl₂-6H₂O, pH 7.4)로 세척한 후, 0.4㎖의 결합 완충액(DPBS와 1%(w/v) 우혈청 알부민(BSA), 5mM 1,0-페난트롤린, 및 1%(v/v) 에탄올)으로 덮은 다음, 15분 동안 4℃ 저온실에서 냉각시켰다. 후속되는 모든 조작은 별도 표시가 없는 한 저온실에서 수행하였다.

결합 인큐베이션을 개시시키기 위해, 세포층으로부터 완충액을 제거하고, 4℃에서 [3H-pro2,3]-브래디키닌([3H]-브래디키닌)을 함유하고 있고 개별적인 실험에 대해 표시된 농도에서 비-방사성 펩티드와 경합하는, 0.4㎖의 새로운 결합 완충액으로 대체시켰다. 각각의 실험 조건에 대해 3중 웰을 사용하였다. 세포수의 추후 측정을 위해, 표시된 특정 세포를 방사성 리간드없이 결합 완충액으로서 덮어서 다른 샘플과 마찬가지로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 액체를 웰로부터 붓고, 배양 접시를 0.1% BSA가 첨가된 DPBS로 이루어진 세척 완충액으로 신속하게 3회 세척한다. 세척 후, 배양 접시를 저온실에서 꺼내어 실온에서 추가로 처리하였다.

지시된 경우, 세포수에 대해 측정할 웰을 즉시 Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 DPBS로 세척하고, 웰 당 0.2㎖의 트립신-EDTA(Ca²⁺와 Mg²⁺가 없는 DPBS에 0.25%의 트립신, 1mM EDTA)로 배양물 표면으로부터 세포를 분리시켰다. 분리된 세포를 수집하여 10㎖의 이소톤(Isoton) 희석제에 희석시키고, 세포수를 코울터(Coulter) 카운터로 카운트하였다. 모든 다른 샘플을 0.2㎖의 1%(w/v) 나트륨 도세실 술페이트의 일정액을 2회 계속 사용하여 각각의 웰에 세포들을 용해시킴으로써 수집하였다. 2개의 분액을 하나의 신틸레이션 바이알에 모으고, 10㎖의 하이드로플루오로 신틸레이션액을 첨가한 후, 샘플을 신틸레이션 카운터에서 트리튬에 대해 카운트하였다. 카운팅 바탕값을 평가하기 위한 블랭크 샘플에는 10㎖의 신틸레이션 액 중에 0.4㎖의 1% 나트륨 도데실 술페이트를 넣었다. 세포에 첨가한 각각의 [³H]-브래디키닌 희석액의 분액을 다른 샘플과 함께 카운트하였다. 이들 값을 사용하여 나중에 각각의 인큐베이션 조건하에서 방사성 리간드의 최종 농도를 계산하였다. 데이터를, 제조업자에 의해 제공된 [³H]-브래디키닌의 비활성(107 Ci/mmole 또는 238 dpm/fmole)을 사용하여 브래디키닌의 몰량으로 전환시켰다. 에러 막대는 복제 샘플의 표준 편차를 나타낸다. 결합 데이터는 입수가능한 맥리간드(MacLigand) 프로그램, 버젼 1.01을 사용하여 컴퓨터로 분석하였다.

[래트 뇌 내피 세포에 대한 브래디키닌 결합]

래트 뇌의 미소관 내피 세포에 대한 [³H]-브래디키닌의 전체 결합율은 인큐베이션 용액 중의 방사성 리간드의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 비특이적 결합에 대해 보정된 [³H]-브래디키닌 결합 데이터의 스캐쳐드 도표를 제12도에 도시하였다(흰색 원형). 곡선의 도표에 의해 나타나는 바와 같이, 데이터는 [³H]-브래디키닌 결합 부위의 2개의 친화성 부류를 갖는 모델에 잘 들어맞는다.

[³H]-브래디키닌 결합에 대한 투과제 A-7 및 9D-A-7 쌍성 이성체의 효과]

경합하는 비-방사성 펩티드의 부재시에 뇌의 내피 세포에 대한 [³H]-브래디키닌의 특이한 결합(대조표준, 흰색 원형)을, 50nM의 투과제 A-7의 존재시(흰색 삼각형) 또는 100nM의 9D-A-7 쌍성 이성체의 존재시(검은색 원형) 관찰된 [³H]-브래디키닌의 특이한 결합과 비교한다. 굵은 선은 경합하는 리간드의 부재시에 얻어진 데이터로부터 맥리간드에 의해 맞추어진(fitted) 곡선을 나타낸다. 제12도에서 알 수 있는 바와 같이, 투과제 A-7은 [³H]-브래디키닌 결합 부위의 하위 세트로부터의 [³H]-브래디키닌을 대체하였다. 대조적으로, 비활성 이성질체인 9D-A-7은 방사성 리간드 결합에 유의할만한 효과를 나타내지 않았다.

[실시예 17]

[래트 뇌 미소관의 내피 세포에서 세포간 유리 칼슘의 방출에 대한 투과제 A-7의 효과]

세포간 유리 칼슘 측정을 위해서 계대 10 내지 12의 래트 뇌의 내피 세포를 사용하였다. 래트 뇌의 내피 세포를 DPBS 중의 0.02% 이나트륨 EDTA와 분리시켜서, 피브로넥틴-피복된 유리 커버슬립 위의 성장 배지에 시이딩하고(1:5 또는 1:10 스플릿), 조직 배양 인큐베이션에 2.5 내지 3시간 동안 방치하여 거기에 부착되어 확산되도록 하였다. 그런 다음, 인큐베이션로부터 커버슬립을 제거하여 각각을 라이보비치(Lebovitz's)(L15) 배지에 침지시켰다. 세포를 다음 실험에 사용할 때까지 실온에서 37℃에서 보관하였다.

실험을 위해, 커버슬립상의 래트 뇌 미소관의 내피 세포를 1% 알부민, 0.02% 플루론산 및 5㎛ 농도의 푸라 2의 아세톡시메틸 에스테르 형태(fura-2AM)가 첨가된 행크 용액(137mM NaCl, 5.4mM KCl, 0.44mM KH₂PO₄, 0.42mM Na₂HPO₄, 4.17mM NaHCO₃, 5.55mM 덱스트로오스, 10mM HEPES, 1mM CaCl₂, 1.4mM MgCl₂, 95% O₂-5% CO₂로 평형시킴, pH 7.4) 중에 35℃에서 인큐베이션함에 의해 칼슘 민감성 플루오로포어와 함께 20분 동안 로딩시켰다. 세포를 상기 방식으로 fura-2와 함께 로딩시킨 후, 커버슬립을 행크 용액에 담금으로써 커버슬립을 세척한 후, 세포를 칼슘 측정에 사용할 때까지 박막으로 싼 접시 중의 L15 배지 중에 35℃에서 보관하였다.

측정을, 주어진 커버슬립으로부터 취한 단지 하나의 세포에 대해 수행하였고, 커버슬립은 버렸다. 측정을, 에피 형광성에 대해 장비가 갖춰져 있는 역화합물 현미경의 스테이지상에서 수행하였다. 측정을 위해, 커버슬립을 현미경 스테이지상에 놓고 500㎕의 행크 용액으로 덮었다. 현미경의 40× 배율하에서, 세포를 선택하여 기록하고, 스테이지를 조정하여 광선이 원형질을 통과하도록 하였다. 형광값을 350±5㎚와 390±6㎚의 여기 필터, 420㎚ 색체 비임 스플리터 및 하마마쯔(Hamamatsu) 모델 R928 포토멀티플라이어 튜브를 사용하는 통로가 긴 485㎚ 필터를 사용하여 수집하여, 챠트 기록기상에 기록하였다. 이들 값을 기록기 궤도로부터 판독하여, 350㎚에서의 형광 대 390㎚에서의 형광비를 “비율”로서 계산하였다. 시험 펩티드를 적용하기 전에, 여러 개의 형광 측정치를 취하여 세포에 잔류하는 칼슘 수준을 반영하는 기초비 값을 측정하였다. DPBS에 녹아 있는 각각의 시험 펩티드를 커버슬립상의 행크 용액에 5㎕의 거환으로서 옮겨놓았다. 도면에 표시된 시험 펩티드의 농도는 커버슬립상의 최종 농도이며 완전히 확산된 것으로 가정한다.

투과제 A-7 용량 반응 곡선(제13도)에 대하여 잔류비 값의 범위가 0.56 내지 0.82인 5개의 상이한 세포로부터 얻은 데이타를 함께 평균을 계산하였다. 이것은 반응의 피크에서 비율의 변화(△ 비율)을 측정하거나, 또는 비율에서 잔류 비율을 감함으로써 계산하였다. 그 값을 개별적인 세포에 대해서 측정한 각 △ 비율을 그 세포에서 관찰한 최대 △ 비율값의 %로서 표시함으로써 정상화하였다. 각각의 투과제 A-7 농도에 대해 얻어진 정상화된 △ 비율을 평균화하여 그것들의 표준 편차를 계산하였다. 결합 연구에 대해 상술한 바와 같이 ANOVA를 또한 수행하였다.

제13도에 도시된 데이타는 투과제 A-7이 10^-10M 정도로 낮은 정도에서 래트 뇌의 미소관 내피 세포 중의 세포간 유리 칼슘의 증가를 유발시킨다는 것을 가리킨다. 이 기법에 의해 최대로 도달가능한 세포간 칼슘 방출의 반을 제공하는 투과제 A-7의 농도(ED50)는 대략 10^-9M이다. 또한, 투과제 A-7으로 유도된 세포간 칼슘 방출은 10^-8M 이상의 투과제 A-7 농도에서 포화되는 것으로 여겨진다.

[실시예 18]

[래트뇌의 내피 세포의 세포간 칼슘 방출에 대한 투과제 A-7 및 9D-A-7의 효과]

실시예 16의 결합 실험은 투과제 A-7이 뇌 내피 세포상의 적어도 한 부류의 브래디키닌 수용체에 결합하는 것을 암시한다. 투과제 A-7이 이들 배양물에서 브래디키닌 수용체 아고니스트로서 작용하는지의 여부를 설명하기 위해, 세포간 칼슘 고정화에 미치는 펩티드의 효과, 즉, 브래디키닌-자극 내피 세포에서 일어나는 것으로 알려진 신호 변환 사건을, 선행 실시예에서 설명한 바와 같이 정량 형광 현미경법을 사용하여 연구하였다. 제14도는 투과제 A-7 또는 9D-A-7으로 자극된 단일 래트 뇌 내피 세포에서의 fura-2 형광 비율 변화의 역학을 보여준다. 상기 세포를 먼저 1㎛의 9D-A-7으로 처리하였는데, 세포간 유리 칼슘의 변화는 나타나지 않았다. 그러나, 100nM의 투과제 A-7으로 2회 연속 자극하면, 각각의 자극이 세포간 유리 칼슘의 급격한 증가를 유발하였고, 이 값은 약 100초의 기간에 걸쳐 기초값 이상의 지속된 값으로 감소되었다.

[실시예 19]

[암포테리신 B를 사용한 분비액 저장조내의 크립토코쿠스 감염의 치료에서 투과제 A-7의 효과]

폴리엔 마크롤라이드인 암포테리신 B(AmB)는 사람의 진균성 수막염의 치료에 현재 사용되고 있는 것이다. 토끼에서 실험적으로 유도된 크립토코쿠스성 수막염의 치료는 사람에서의 수막염의 특징과 많은 점에서 유사하다. 그러나, 뇌척 수액(CSF) 안으로의 AmB의 투과는 아주 낮으며, 생체 안에서 AmB의 CSF 농도는 시험관 내에서의 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)의 성장에 대한 활성과 별로 상관관계가 없다. 또한, AmB의 투여는 신독성 및 다른 심각한 부작용과 관련이 있다. AmB CSF 농도를 증가시킬 수 있는 치료 요법은 상기 진균성 감염의 치료에 유익할 수도 있다. 그러므로, 투과제 A-7과 AmB의 공동 투여가 토끼의 실험적으로 유도된 크립토코쿠스 수막염의 치료에 AmB 단독 투여보다 더 효과적인지의 여부를 평가하기 위하여 연구를 수행하였다.

1㎖당 100㎍의 클로르암페니콜을 함유하고 있는 크립토코쿠스 네오포르만스의 4일 배양물을 면봉에 흡수시킨 뒤 15nM의 인산염-완충 식염수에 현탁시키고, 대략 5×10⁷콜로니 형성 유니트(CFU)/㎖로 조정하였다. 뉴질랜드 화이트 토끼(2-3㎏)에 스트렙토코쿠스 네오포르만스를 접종하기 전 1일에 시작하여(제 0일) 2.5㎎의 코르티손 아세테이트를 근육내 투여(i.m.)함으로써 토끼를 면역 억제시키고, 연구가 종결될 때까지 매일 1회씩 근육내 투여하였다. 제1일에 토끼를 케타민(100-150㎎) 및 크실라진(15-25㎎)을 근육내 주사하여 진정시키고, 0.3㎖의 크립토코쿠스 네오포르만스 현탁액으로 분비액 저장조내에 접종시켰다. 제4일에 CSF를 모아서 클로르암페니콜을 함유하고 있는 아가 플레이트 위에 놓아 크립토코쿠스 네오포르만스 계수(CFU/㎖)를 하기 위한 기초 수준을 수립하고, 약물 처리를 개시하였다. CSF 샘플을 또한 회수하여 제7일, 11일 및 14일에 크립토코쿠스 네오포르만스를 계수하였다. 약물 처리는 10일 동안 계속하였다.

토끼에게 하기의 정맥내 치료 요법 중 하나를 택하여 투여하였다: 1) 식염수-대조표준; 2) 1㎎의 AmB/㎏/일; 3) 10ng의 투과제 A-7/일+1㎎의 AmB/㎏/일; 4) 100ng의 투과제 A-7/㎏/일+1㎎의 AmB/㎏/일. 각각의 군은 대체로 3 내지 5 마리의 동물로 구성하였다. 모든 처리는 귀의 정맥을 통하여 투여하였고, 투과제 A-7은 언제나 AmB 투여 직전에 투여하였다. CSF 샘플은 항상 치료일에 약물 치료 전에 회수하였다.

실험적으로 유도된 크립토코쿠스 수막염에 걸린 토끼에서 CSF 크립토코쿠스 네오포르만스 계수에 미치는 AmB 및 투과제 A-7의 효과를 제15도에 나타낸다. 대조 크립토코쿠스 네오포르만스 계수는 연구기간 동안 비교적 일정하게 유지되었다. 매일 1㎎의 AmB/㎏으로 치료하는 것은 대조표준과 비교할 때 제11일과 제14일째의 크립토코쿠스 네오포르만스 계수를 상당히 저하시켰다. 100ng의 투과제 A-7/㎏/일과 1㎎의 AmB/㎏/일의 조합은 제7일째의 크립토코쿠스 네오포르만스 계수를 다른 어떤 처리군의 계수보다 상당히 낮게 저하시켰다. 1㎎의 AmB/㎏/일과 투과성 A-7(10ng과 100ng의 투과제 A-7/㎏/일)의 조합은 또한 제11일과 제14일째의 대조표준 또는 AmB 처리군에 비교하여 콜로니 계수를 감소시켰다. 실제로, 제11일째에 멸균 CSF 배양물은 10ng의 투과제 A-7/㎏/일+1㎎의 AmB/㎏/일의 조합물이 투여된 동물의 40%에서, 그리고 100ng의 투과제 A-7/㎏/일+1㎎의 AmB/㎏/일이 투여된 토끼의 60%에서 관찰되었다(데이타는 제시하지 않음). 다른 어떤 처리군에서도 멸균 CSF 배양물은 주지되지 않았다.

이들 결과는 투과제 A-7이 토끼에서 실험적으로 유도된 크립토코쿠스성 수막염의 치료에 AmB의 효율을 증가시킨다는 것을 암시하며, 이것은 치료후 7일 후(제11일째) 및 10일 후(제14일째)의 낮은 콜로니 계수에 의해 증명된다. 나아가, 3일 동안(제7일) 100ng의 투과제 A-7/㎏과 1㎎의 AmB/㎏으로 매일 처리된 동물에서 약간 더 낮은 크립토코쿠스 네오포르만스 계수는, 상기 조합이 표준 AmB 치료 요법에 비교하여 크립토코쿠스 네오포르만스 성장을 보다 신속하게 억제할 수 있음을 나타낸다.

Claims

아미노산 서열이 NH₂-아르기닌-프롤린-히드록시프롤린-글리신-티에닐알라닌-세린-프롤린-4-Me-티로신ψ(CH₂NH)아르기닌-COOH인 펩티드 또는 하기 변형 중 한 가지 이상을 갖는 이것의 구조적 유사체를 포함하는 혈액-뇌 장벽 투과제로서, C 말단 아미노산이 L형을 갖는 혈액-뇌 장벽투과제: a) N 말단 아르기닌이 구아니디노 또는 구아니디노 유도체 측쇄를 함유하는 아미노산 유사체로 치환되는 변형; b) 제2아미노산인 프롤린이 히드록시프롤린, 데히드로프롤린, N-메틸알라닌 또는 또 다른 프롤린 유사체로 치환되는 변형; c) 제3아미노산인 히드록시프롤린이 프롤린, 데히드로프롤린, 또 다른 프롤린 유사체, 알라닌, 사르코신 또는 N-메틸알라닌으로 치환되는 변형; d) 제5아미노산인 티에닐알라닌이 또 다른 방향족 아미노산 또는 소수성 지방족 아미노산으로 치환되는 변형; e) 제6아미노산인 세린이 글리신, 트레오닌, 알라닌, 알로트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 또는 이들의 유사체로 치환되는 변형; f) 제7아미노산인 프롤린이 히드록시프롤린, 데히드로프롤린, N-메틸알라닌 또는 또 다른 프롤린 유사체로 치환되는 변형; g) 제8아미노산인 4-Me-티로신이 또 다른 O-알킬 티로신 또는 소수성 지방족 아미노산으로 치환되는 변형; h) C 말단 아르기닌이 구아니디노 또는 구아니디노 유도체 측쇄를 함유하는 아미노산 유사체로 치환되는 변형; 및 i) 제8아미노산인 4-Me-티로신과 C 말단 아르기닌인 ψ(CH₂NH) 사이의 펩티도의사 등입체성 결합이 ψ(CSNH), ψ(NHCO) 또는 ψ(CH₂S)로 치환되는 변형.
제1항에 있어서, 변형이 하기 물질로부터 선택됨을 특징으로 하는 혈액-뇌 장벽 투과제: a) N 말단 또는 C 말단 아르기닌에 대해, β-시클로아르기닌, 호모아르기닌, γ-히드록시아르기닌, 카나바닌, N^ω-아미다노시트룰린, 2-아미노-4-구아니디노부탄산, 라이신 또는 오르니틴의 시아노구아니디노 유도체, 시트룰린 또는 호모시트룰린; b) 제2 또는 제7아미노산인 프롤린에 대해, 히드록시프롤린 또는 데히드로프롤린; c) 제3아미노산인 히드록시프롤린에 대해, 프롤린 또는 데히드로프롤린; d) 제5아미노산인 티에닐알라닌에 대해, 데히드로페닐알라닌, 페닐알라닌 또는 또 다른 방향족 유사체, 로이신, 이소로이신 또는 시클로헥실알라닌; e) 제6아미노산인 세린에 대해, 글리신 또는 트레오닌; f) 제8아미노산인 4-Me-티로신에 대해, O-알킬 티로신, 로이신, 이소로이신 또는 시클로헥실알라닌.
제1항에 있어서, 모든 광학 활성 아미노산이 L형을 가짐을 특징으로 하는 혈액-뇌 장벽 투과제.
제1항에 있어서, 제8아미노산이 D형을 가짐을 특징으로 하는 혈액-뇌 장벽 투과제.
제1항에 있어서, 아세틸화기, 추가 아미노산 또는 아세틸화된 추가 아미노산이 펩티드 결합을 통해 N 말단 아르기닌에 부착됨을 특징으로 하는 혈액-뇌 장벽 투과제.
혈액-뇌 장벽에 대한 분자의 투과성을 증가시키기 위한 동물 투여용 약제 조성물로서, a) 코아 아미노산 서열이 NH₂-아르기닌-프롤린-히드록시프롤린-글리신-티에닐알라닌-세린-프롤린-4-Me-티로신ψ(CH₂NH)아르기닌-COOH인 펩티드 또는 하기 변형 중 한 가지 이상을 갖는 이것의 구조적 유사체 (여기에서, C 말단 아미노산은 L형을 가짐): i) N 말단 아르기닌이 구아니디노 또는 구아니디노 유도체 측쇄를 함유하는 아미노산 유사체로 치환되는 변형, ii) 제2아미노산인 프롤린이 히드록시프롤린, 데히드로프롤린, N-메틸알라닌 또는 또 다른 프롤린 유사체로 치환되는 변형, iii) 제3아미노산인 히드록시프롤린이 프롤린, 데히드로프롤린, 또 다른 프롤린 유사체, 알라닌, 사르코신 또는 N-메틸알라닌으로 치환되는 변형, iv) 제5아미노산의 티에닐알라닌이 또 다른 방향족 아미노산 또는 소수성 지방족 아미노산으로 치환되는 번형, v) 제6아미노산인 세린이 글리신, 트레오닌, 알라닌, 알로트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 또는 이들의 유사체로 치환되는 변형, vi) 제7아미노산인 프롤린이 히드록시프롤린, 데히드로프롤린, N-메틸알라닌 또는 또 다른 프롤린 유사체로 치환되는 변형, vii) 제8아미노산인 4-Me-티로신이 또 다른 O-알킬 티로신 또는 소수성 지방족 아미노산으로 치환되는 변형, viii) C 말단 아르기닌이 구아니디노 또는 구아니디노 유도체 측쇄를 함유하는 아미노산 유사체로 치환되는 변형 및 ix) 제8아미노산인 4-Me-티로신과 C 말단 아르기닌인 ψ(CH₂NH) 사이의 펩티도의사 등입체성 결합이 ψ(CSNH), ψ(NHCO) 또는 ψ(CH₂S)로 치환되는 변형; 및 b) 약제학적 허용 염을 포함하는 약제 조성물.
제6항에 있어서, 동물이 사람임을 특징으로 하는 약제 조성물.
제6항에 있어서, 투여가 분자의 동시 혈관내 투여를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
제6항에 있어서, 분자가 진단 영상화제를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
제9항에 있어서, 진단 영상화제가 방사성 표지됨을 특징으로 하는 약제 조성물.
제6항에 있어서, 분자가 신경약제학적 제제를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
제11항에 있어서, 투여가 신경약제학적 제제의 동시 혈관내 투여를 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
아미노산 서열이 NH₂-아르기닌-프롤린-히드록시프롤린-글리신-티에닐알라닌-세린-프롤린-4-Me-티로신ψ(CH₂NH)아르기닌-COOH인 펩티드 또는 하기 변형 중 한 가지 이상을 갖는 이것의 구조적 유사체로서, C 말단 아미노산이 L형을 가지며, 유효량의 펩티드 또는 이것의 구조적 유사체를 혈관내 투여함으로써 숙주의 혈액-뇌 장벽에 대한 숙주의 혈관 중에 존재하는 분자의 투과성을 증가시키는 데에 사용되는 펩티드 또는 이것의 구조적 유사체: a) N 말단 아르기닌이 구아니디노 또는 구아니디노 유도체 측쇄를 함유하는 아미노산 유도체로 치환되는 변형; b) 제2아미노산인 프롤린이 히드록시프롤린, 데히드로프롤린, N-메틸알라닌 또는 또 다른 프롤린 유사체로 치환되는 변형; c) 제3아미노산인 히드록시프롤린이 프롤린, 데히드로프롤린, 또 다른 프롤린 유사체, 알라닌, 사르코신 또는 N-메틸알라닌으로 치환되는 변형; d) 제5아미노산인 티에닐알라닌이 또 다른 방향족 아미노산 또는 소수성 지방족 아미노산으로 치환되는 변형; e) 제6아미노산인 세린이 글리신, 트레오닌, 알라닌, 알로트레오닌, 아스파라긴, 글루타민 또는 이들의 유사체로 치환되는 변형; f) 제7아미노산인 프롤린이 히드록시프롤린, 데히드로프롤린, N-메틸알라닌 또는 또 다른 프롤린 유사체로 치환되는 변형; g) 제8아미노산인 4-Me-티로신이 또 다른 O-알킬 티로신 또는 소수성 지방족 아미노산으로 치환되는 변형; h) C 말단 아르기닌이 구아니디노 또는 구아니디노 유도체 측쇄를 함유하는 아미노산 유사체로 치환되는 변형; 및 i) 제8아미노산인 4-Me-티로신과 C 말단 아르기닌인 ψ(CH₂NH) 사이의 펩티도의사 등입체성 결합이 ψ(CSNH), ψ(NHCO) 또는 ψ(CH₂S)로 치환되는 변형.