KR100481925B1

KR100481925B1 - 가시오갈피로부터 분리된 아세틸렌 계열 화합물들 및 그를함유하는 아폽토시스 유도제 조성물

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Publication number: KR100481925B1
Application number: KR10-2002-0000241A
Authority: KR
Inventors: 오현철; 배현옥; 장선일; 채규윤; 윤용갑; 정헌택; 이호섭; 권태오
Original assignee: 정헌택; 권태오; 윤용갑
Priority date: 2002-01-03
Filing date: 2002-01-03
Publication date: 2005-04-11
Anticipated expiration: 2022-01-03
Also published as: KR20030059643A

Abstract

본 발명은 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 화합물에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 파낙시돌(panaxydol) 및 8-메톡시-파낙시돌로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 함유하는 아폽토시스 유도제 조성물에 관한 것이다.

Description

가시오갈피로부터 분리된 아세틸렌 계열 화합물들 및 그를 함유하는 아폽토시스 유도제 조성물{Acetylenes from the Root of Acanthopanax senticosus and apoptosis-inducing composition containing the same}

본 발명은 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 화합물에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올(heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn- 3,10-diol), 파낙시돌(panaxydol) 및 8-메톡시-파낙시돌(8-methoxy-panaxydol)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 함유하는 아폽토시스 유도제 조성물에 관한 것이다.

현재 상당한 의학기술, 생명공학 및 유전공학의 발전으로 암치료의 길이 열렸음에도 불구하고, 암은 아직 완치될 수 없는 질환으로 인식되고 있다.

이러한 암치료 방법으로 화학요법, 방사선요법, 절개술 등의 많은 방법이 개발되었지만, 방사선 요법이나 절개술 등은 주로 암의 초기진단이 이루어졌을 때 효과가 있다. 그러나, 말기암으로의 진행상태가 보이면 화학요법으로 암을 치료하여야 하지만, 완치률은 상당히 낮다.

따라서, 임상분야에서는 기존의 항암제보다 항암 효능이 더욱 뛰어난 새로운 항암제를 요구하고 있으나, 이러한 항암제를 개발하기 위해서는 항암제의 새로운 표적에 대한 개발이 요구된다.

최근, 이러한 항암제의 표적으로 아폽토시스에 관여하는 여러 유전자 및 단백질에 대한 연구가 진행되었다. 이러한 연구의 시발은, 지난 수년동안 화학요법에 이용되었던 항암제들이 암세포의 유전자를 손상시켜 아폽토시스(apoptosis), 즉 계획된 세포사멸(programmed cell death)을 유발시킨다는 발견에서부터 시작되었다.

비록, 아폽토시스를 통해 종양세포들을 죽일 수 있다는 기전에는 논쟁의 여지가 있을지라도, 아폽토시스를 유발할 수 있는 물질을 찾는 것은 새로운 항암제의 동정방법으로 인식되고 있다.

아폽토시스는, 모든 세포에서 나타나는 세포 사멸의 한 형태로, 아폽토시스를 통해 세포사멸이 이루어지면, 뚜렷한 형태적, 생화학적 특징이 나타난다. 이러한 아폽토시스 세포사멸은 일반적으로 수명이 다한 일반세포들에서 여러 유전자들의 작용에 의해 일어나며, 미분화 조세포(stem cell)로부터 새로운 세포가 생성되는 것만큼 중요하다. 아폽토시스를 통해 세포사멸이 이루어지는 세포는 염증반응 등에 의해 인접한 세포에 어떠한 영향도 미치지지 않고, 계획된 사멸을 수행하여 자신만이 파괴된다. 이러한 아폽토시스의 생리적인 과정은 심각한 세포 손상과 팽배(swelling) 및 파손(lysis)이 일어난 후, 염증반응을 유발하여 주위 세포들마저도 파괴하는 세포괴사(necrotic cell death)와는 구별된다.

아폽토시스는, 생명체의 발달동안 잠깐 존재해야되는 세포들이 사라질 때, 바이러스, 박테리아 등에 감염된 세포(virus-infected cells) 및 자연적인 돌연변이에 의해 종양(tumor)으로 변형된 세포들을 효과적으로 사멸시키는 계획된 세포사멸이다.

따라서, 아폽토시스를 유도할 수 있는 물질의 개발은 염증반응을 통한 일반세포의 사멸을 유도하지도 않으면서, 효과적으로 종양세포만을 사멸시킬 수 있는 특징을 가질 수 있다.

이에 본 발명자들 또한 아폽토시스를 유발할 수 있는 새로운 물질을 찾고자 많은 연구를 수행한 결과, 가시오갈피로부터 분리한 아세틸렌 계열의 화합물들, 즉 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 파낙시돌(panaxydol) 및 8-메톡시-파낙시돌이 아폽토시스와 관련된 세포 내 여러 기전들의 발생을 유도할 수 있음을 발견하고 본 발명은 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 가시오가피로부터 분리한 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 가시오가피로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도제 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가시오갈피로부터 분리한 아세틸렌 계열의 신규한 화합물로서, 하기 화학식 3로 표시되는 8-메톡시-파낙시돌을 제공한다.

[화학식 3]

또한, 본 발명에 따른 아폽토시스 유도제 조성물은 하기 화학식 1로 나타내어지는 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 화학식 2로 나타내어지는 파낙시돌 및 화학식 3으로 나타내어지는 8-메톡시-파낙시돌로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상의 화합물을 함유함을 특징으로 한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명에 따른 아폽토시스 유도제 조성물에서 유효성분인 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 파낙시돌 및/또는 8-메톡시-파낙시돌의 유효량은 투여방법, 제제형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어 질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 상기 화합물들 각각 또는 그의 조합이 0.001∼100㎎/㎏체중의 농도로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기 범위를 벗어난 양일 수도 있다.

헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 파낙시돌 및/또는 8-메톡시-파낙시돌을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상적인 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 주사제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 투여경로를 통해 아폽토시스를 유도하기 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한 투여경로는 당업자에게 이미 주지되어 있으며, 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제, 담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

가시오갈피(Acanthopanax senticosus)는 인삼과 비슷한 기능을 가진 것으로 알려져 있고, 일본, 중국 및 우리나라의 남부지방, 중부지방 및 북부지방의 심산지역 해발 100∼1,800m 지역 산지곡간에 자생하는 나무로서, 종래부터 한방과 민간에서 수피, 근피 및 열매를 강장제, 강심제, 음위제, 요통제 및 진정제 등의 약제로 이용하여왔다. 이외에도 가시오갈피의 각종 부위로부터 얻은 추출물은 전통적으로 마비증세, 관절염, 류마티즘, 고혈압등의 치료 목적으로 사용되고 있다.

본원 발명에서는, 가시오갈피 뿌리 부분의 n-헥산 용해성 추출물을 암세포에 처리하면, 아폽토시스가 유도됨을 규명하였다. 이러한 결과로부터, 본 발명자들은 가시오갈피 뿌리 부분의 n-헥산 용해성 추출물을 구성하는 성분 중에서, 아폽토시스를 유도할 수 있는 유효성분을 찾아내고자 연구를 더 수행한 결과, 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 파낙시돌 및 8-메톡시-파낙시돌의 3종의 아세틸렌 화합물들을 분리하였으며, 이 성분들을 암세포에 처리하면 아폽토시스가 현저하게 유발됨을 확인하였다.

한편, 본원 발명에 따르면, 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 파낙시돌 및 8-메톡시-파낙시돌으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 본원 발명에 따른 아폽토시스 유도제는 아폽토시스가 수행되지 않아 발생하는 질환들, 바람직하게는 백혈병, 유방암, 간암, 자궁경부암, 난소암, 폐암, 상피세포암, 피부암, 위암, 유방암 등의 각종 암, 더욱 바람직하게는 백혈병 치료를 위해 투여될 수 있다.

즉, 암은 대부분 아폽토시스에 의한 세포사멸 및 세포내 신호전달 기전에 의한 세포증식 사이의 불균형에 의하여 발생하며, 일반적으로 암조직에서는 세포 증식에 관련된 신호전달 기전은 활성화되는 반면, 아폽토시스에 관련된 세포 내 신호전달은 억제된다는 것이 당업계에 통상적으로 알려져 있다. 따라서, 아폽토시스 유도제는 암세포에서 아폽토시스를 활성화시켜, 암세포에서 계획된 세포사멸을 유도시키며, 이를 통해 암을 치료할 수 있다.

이러한 관점에서, 본 발명에 따른 아폽토시스 유도제 조성물은 암세포, 바람직하게는 백혈병 세포에서 아폽토시스를 활성화시킴으로써, 암치료, 바람직하게는 백혈병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 아폽토시스 유도제 조성물을 암치료에 적용할 경우, 그 자체를 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 다른 암치료제 또는 암치료제 조성물, 약제 및 다른 여러 치료방법과 병행하여 사용함으로써, 그 효과를 극대화시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예와 도면에 의해서 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되는 것은 아니다. 비록 하기의 실시예에서는, 본 발명에 따른 화합물의 아폽토시스 유도효과에 대해서, 백혈병 세포주인 HL-60 세포에 적용한 결과만을 보여주었지만, 본 발명의 화합물이 적용되는 범위는 상기 HL-60 세포 또는 백혈병 세포에만 적용되는 것이 아니라, 각종 암세포에서도 아폽토시스를 유발함으로써 그 해당 암질환을 치료할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하게 인식될 수 있을 것이다.

또한, 하기의 실시예에서는 화합물 3에 대한 결과만을 보여주었지만, 화합물 1 내지 3 모두는 0.1∼1㎍/㎖ 범위에서 농도 의존적으로 인간백혈병세포주(human leukemia cells, HL-60)의 아폽프토시스를 유도함을 확인하였다.

하기의 실시예 중 실험예들은 각각의 실험들을 적어도 3번 이상 실행하여 얻어진 결과들이며, Student's t-test를 이용한 통계분석을 이용하였다. 유의성의 한계는 p값이 <0.05를 기준으로 정하였다.

[참고실시예 1] 식물

본원 발명에서 사용한 가시오갈피는 2000년 8월 전북 장수에서 채집되었으며, 표본은 원광대 생명자원대학 권태오 교수에 의해 동정되었고, 원광대학교 의약자원 연구센터의 표본 보관실에 KTO-124의 보관번호로 보관하였다.

[실시예 1] 추출 및 분리

상기 가시오갈피의 뿌리부분을 공기 건조시킨 후, 건조물을 분쇄하여 가루화시켰다. 600g의 건조된 뿌리의 가루를 메탄올로 24시간 동안 추출하였다. 메탄올 추출물을 농축한 후 물에 현탁하였다. 그런 다음, 순차적으로 n-헥산, 에틸아세테이트, 부탄올로 추출하여 각각의 분획들을 얻었다. 생리활성을 갖는 n-헥산 용해성 분획이 7.0g 얻졌으며, 이를 실리카겔 플래쉬 컬럼크로마토그래피(silica gel flash column chromatography; Merch Kieselgel 60; 0.063∼0.2㎜의 입자크기, 직경 2.5㎝, 높이 40㎝)에 적용하였다. 컬럼은, CH₂Cl₂로 희석시킨 50%, 40% 및 30%의 n-헥산 희석용액 각각 150㎖, 100% CH₂Cl₂150㎖으로 차례대로 용출한 후, 메탄올에 용해된 2%, 5%, 7% 및 15%의 CH₂Cl₂용액 150㎖로 다시 용출하여 8개의 분획을 얻어내었다(분획 1∼8). 이중, 분획 번호 2∼4의 분획은 100g/㎖의 농도(각각 38%, 47% 및 51%의 농도)에서 아폽토시스를 유도하는 활성이 관찰되었다(70% 이상의 아폽토시스를 유도함). 분획 번호 2의 분획(2.25g)은 C₁₈ 플래쉬 컬럼크로마토그래피(C₁₈ flash column chromatography; 직경 3㎝, 높이 20㎝)에 적용시킨 후, 증류수로 희석시킨 80%의 메탄올로 용출한 다음(각각 50㎖의 4개의 분획이 얻어짐), 100% 메탄올로 다시 용출하였다(각각 50㎖의 4개의 분획이 얻어짐). 그런 다음, 80% 메탄올로 용출된 분획(50㎖과 100㎖ 사이에서 얻어진 분획들, 178㎎)은 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(3㎝의 직경, 50㎝의 높이)에 적용한 후, 75㎖의 n-헥산/CH₂Cl₂(4:1); 100㎖의 CH₂Cl₂/아세톤(3:2); 100㎖의 CH₂Cl₂/아세톤 (1:4); 및, 50㎖의 아세톤/MeOH (95:5)의 농도 구배로 용출한 후, 25㎖씩 분획을 수집하였다.

용출하여 얻어진 25㎖ 및 75㎖ 사이의 분획에서 화합물 1[27.7㎎; 0.005w/w%; [α]²³ _D: -10.0^o(c 0.22, CHCl₃)]이 순수한 형태로 얻어졌다.

또한, 분획 번호 3 및 4의 분획을 합친 후(907.5㎎), 이를 C₁₈ 플래쉬 컬럼크로마토그래피(직경 3㎝, 높이 20㎝)에 적용한 다음, H₂O로 용해시킨 40%, 50%, 70% 및 80%의 메탄올 용액 각 100㎖로 용출하고, 그런 다음 400㎖의 100% 메탄올로 다시 용출하여, 8개의 분획을 얻어내었다. 이중, 용출된 400㎖과 500㎖ 사이의 분획은 H₂O에 용해된 60% 내지 90%의 CH₃CN의 농도구배를 사용하는 준대량 역상 HPLC(semi-preparative reversed-phase HPLC)에 60분간 적용하여 화합물 2[t_r 23.0 min; 23.3㎎; calculated 0.004w/w%; [α]²³ _D: -21.1^o (c 0.19, CHCl₃)] 및 화합물 3[t_r 24.7 min; 6.8㎎; calculated 0.001w/w%)을 얻어내었다.

당업계의 통상적으로 화합물 1 내지 3에 대하여 NMR 등의 다양한 스펙트럼 분석을 수행하였고, 그 결과 화합물 1 내지 3은 각각 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 파낙시돌 및 8-메톡시-파낙시돌임이 확인되었다.

본 발명에서 측정한 화합물 1 및 2의 스펙트럼 분석결과는 다음과 같다.

헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올(화합물 1):

¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): 6.32 (dd, J = 15.6, 6.0 Hz, H-9), 5.93 (ddd, J = 17.4, 10.1, 6.0 Hz, H-2), 5.76 (d, J = 15.6 Hz, H-8), 5.47 (br d, J = 17.4 Hz, H-1), 5.25 (d, J = 10.1 Hz, H-1), 4.97 (d, J = 6.0 Hz, H-3), 4.18 (dt, J = 6.0, 2.0 Hz, H-10), 1.61-1.42 and 1.39-1.24 (m, H-11 ~ H-16), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, H-17);

¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz): 149.9 (C-9), 135.9 (C-2), 117.2 (C-1), 108.0 (C-8), 80.4 (C-4), 77.5 (C-7), 73.6 (C-5), 72.0 (C-10), 70.7 (C-6), 63.6 (C-3), 36.9 (C-11), 31.7 (C-15), 29.4 (C-14), 29.2 (C-13), 25.2 (C-12), 22.6 (C-16), 14.1 (C-17).

파낙시돌(화합물 2):

¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): 1H NMR (CDCl₃, 500 MHz): 5.94 (ddd, J = 17.0, 10.1, 5.1 Hz, H-2), 5.46 (br d, J = 17.0 Hz, H-1), 5.25 ( br d, J = 10.1 Hz, H-1), 4.92 (br d, J = 5.1 Hz, H-3), 3.14 (m, H-9), 2.96 (m, H-10), 2.70 (dd, J = 7.1, 5.5 Hz, H-8), 2.39 (dd, J = 7.1, 5.5 Hz, H-8), 1.61-1.42 and 1.39-1.24 (m, H-11 ~ H-16), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, H-17);

¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz): 136.1 (C-2), 117.3 (C-1), 76.9 (C-7), 74.9 (C-4), 70.8 (C-5), 66.4 (C-6), 63.6 (C-3), 57.0 (C-10), 54.4 (C-9), 31.8 (C-15), 29.5 (C-13), 29.2 (C-14), 27.6 (C-11), 26.5 (C-12), 22.7 (C-16), 19.5 (C-8), 14.1 (C-17).

화합물 1 과 2의 화학적 구조는 문헌에서 보고된 [α]_D, NMR, 및 MS 자료의 비교 분석에 의하여 동정되었다(Shim SC, Chang S-K, Hur CW, Kim CK. A polyacetylenic compound from Panax ginseng roots. Phytochemistry 1987; 26: 2849-50; Poplawski J, Wrobel JT, Glinka T. Panaxydol, a new polyacetylenic epoxide from Panax ginseng roots. Phytochemistry 1980; 19: 1539-41). 화합물 3의 양성자 및 탄소 NMR 자료는 화합물 2의 자료와 매우 유사하였다. 그러나, 화합물 2에서 관찰되었던 메틸렌 그룹에 해당하는 신호는 없는 반면 화합물 2에서 보이지 않았던 옥시메틴 (oxymethine) 그룹과 메톡시 그룹이 새로이 관찰되었다.

또한, 화합물 3의 분자식은 NMR및 FABMS 자료 분석을 근거로 C₁₈H₂₆O₃로 규명되었다. 이상의 자료를 바탕으로 화합물 3의 구조는 8-메톡시-파낙시돌임을 확인하였다. 전체적인 화합물 3의 평면 구조는 이차원 NMR 자료 (COSY 및 HMBC) 분석을 통하여 확인하였다.

한편, 본 발명에서 신규히 밝혀낸 화합물 3의 스펙트럼 분석결과는 다음과 같다.

8-메톡시-파낙시돌(화합물 3):

[α]²³ _D: + 14.3^o (c 0.07, CHCl₃);

UV(MeOH):_max(log ) = 241(3.52), 254(3.46), 269(3.47), 285(3.43)㎚;

IR(film):_max = 3443, 2928, 2235, 2135cm^-1;

¹H NMR (CDCl₃, 500 MHz): 5.96 (ddd, J = 17.0, 10.1, 5.1 Hz, H-2), 5.50 (br d, J = 17.0 Hz, H-1), 5.29 (d, J = 10.1 Hz, H-1), 4.96 (br d, J = 5.1 Hz, H-3), 3.89 (d, J = 7.8 Hz, H-8), 3.45 (s, 8-OCH₃), 3.13 (dd, J = 4.2, 7.4 Hz, H-9), 3.04 (m, H-10), 1.61-1.42 and 1.39-1.24 (m, H-11 ~ H-16), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, H-17);

¹³C NMR (CDCl₃, 125 MHz): 135.8 (C-2), 117.6 (C-1), 77.9 (C-4), 76.8 (C-7, observed in the HMBC data), 71.0 (C-6), 70.3 (C-5), 69.7 (C-8), 63.6 (C-3), 57.9 (C-10), 57.1 (C-9), 56.9 (OCH₃), 31.8 (C-15), 29.4 (C-13), 29.2 (C-14), 27.8 (C-11), 26.5 (C-12), 22.7 (C-16), 14.2 (C-17);

LRFABMS (positive, m-nitrobenzyl alcohol): m/z = 313 [M + Na]⁺

[실시예 2] DAPI/PI를 이용한 핵 염색

1×10⁶cells/㎖ 농도의 HL-60세포를, 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 RPMI 1640 배지에 10 nmol/ℓ의 화합물 3을 함유시키거나 함유시키지 않은 상태에서, 6웰 접시(6-well dishes)에서 12시간 배양하였다. 그런 다음, 1㎖의 세포 부유액을 1,000rpm에서 3분동안 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 그런 다음, 세포침전물에 4%의 중성 완충된 100㎕의 포르말린을 첨가하여 고정하였다. 고정된 50㎕의 세포부유액을 슬라이드에 옮기고, 실온에서 건조하였다. 고정된 세포를 PBS로 세척한 다음, 건조시키고, DNA-특이적 플루오로크롬(fluorochrom) DAPI(4,6-Diamidino-2-phenylindole)/PI(propidium iodide)으로 1분간 염색하였다. 부착된 세포는 PBS로 세척한 다음, 건조시키고, 90% 글리세롤(glycerol)로 마운트(mount)시켰다. 슬라이드는 형광현미경을 이용해 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 화합물 3이 처리된 HL-60 세포에서는 아폽토시스를 통한 세포사멸의 특징적인 형태인 핵염색질의 응축, 핵절편화 및 아폽토시스 바디 등이 관찰됨을 알 수 있다.

[실시예 3] DNA 절편화 분석

1×10⁶cells/㎖의 HL-60 세포를 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0㎍/㎖의 화합물 3으로 12시간 처리하였다. 그런 다음, 상기 세포를 1,000rpm에서 3분간 윈심분리하고, 세포를 침전시킨 후, 세포 침전물을 PBS로 세척하였다. 세포침전물을 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.5 mg/ml proteinase K(Sigma Chemical Co., St. louis. MO. U.S.A))으로 실온에서 30분간 처리하였다. 그런 다음, 25㎎/㎖의 RNaes A를 첨가한 후, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그런 다음, 단백질 침전용액(40% 암모니움 설페이트 용액)을 첨가한 다음, 1,300rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하여 모든 단백질을 침전시켰다. 그런 다음, 상청액을 표면으로 하여, 페놀/클로로포름(1:1, v/v)으로 추출하고, 수상(aqueous phaes)을 클로로포름/이소아밀알콜(24:1, v/v)으로 한번 더 추출하였다. 그런 다음, 2배의 부피의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 원심분리를 통해 회수한 DNA 펠렛을 70% 에탄올로 세척한 후, 공기 중에서 건조시킨 다음, 10mM 트리스-HCl(pH8.0) 및 1mM EDTA로 구성된 TE 완충액으로 용해시켰다. DNA를 정량한 후, 10㎍의 DNA를 5V/㎝에서 1.5%의 아가로즈 겔로 전기영동시켰다. 그런 다음, EtBr(ethidium bromide)로 DNA를 염색한 후, 자외선 조사(照射)로 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 화합물 3으로 처리된 세포의 경우, 약 180∼200bp 위치에서, 다수의 올리고뉴클레오조말(oligonucleosomal) DNA 절편화(ladder) 확인되었고, 이를 통해서 이들 세포에서 아폽토시스가 일어났음을 확인하였다. 즉, 아폽토시스의 전형적인 생화학적 특징으로서, 이들 세포에서는 뉴클레오좀내 영역이 내인성 DNase들에 의해서 DNA 단편들로 분해되었음을 알 수 있다.

[실시예 4] 흐름세포 분석(Flow Cytometric Analysis)

지수성장을 하는 세포들을 1×10⁶cells/㎖의 밀도가 되도록 RPMI 1640 배지로 현탁하고, 0, 0.01, 0.1, 0.5 또는 1.0㎍/㎖의 화합물 3을 처리한 후, 37℃에서 12시간동안 배양하였다.

상기 화합물 3로 처리된 1×10⁶ cells/웰의 HL-60세포를 80% 냉장 에탄올로 30분간 고정시킨 다음, PBS로 세척하고, 1㎎/㎖ RNase A를 함유하고 있는 0.5% 트립톤 X-100 용액 0.25㎖로 37℃에서 30분간 처리하였다. 그런 다음, 50㎎/㎖ 농도의 PI 용액 0.25㎖을 첨가하고, 암실에서 30분간 방치하였다. 그런 다음, FACS Vantage(Becton Dickinson, San jose, CA, U.S.A) 흐름세포 분석기에 통과시켜, 표본으로부터 세포수를 측정함으로써, 서브-G1기의 DNA량을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 화합물 3은 농도가 증가에 따라 세포주기상 서브-G1기의 아폽토시스 피크도 증가함을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 화합물 3이 HL-60 세포의 아폽토시스를 농도에 의존적으로 유발시킨다는 것을 나타낸다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 가시오갈피의 뿌리로부터 분리한 아세틸렌 계열의 화합물들, 즉 헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올, 파낙시돌(panaxydol) 및 8-메톡시-파낙시돌은 아폽토시스와 관련된 세포 내 여러 기전들의 발생을 유도할 수 있으므로, 본 발명에 따른 조성물은 각종 암, 바람직하게는 백혈병의 치료에 이용될 수 있다.

참고문헌

1.Story M, Kodym R. Signal transduction during apoptosis: implications for cancer therapy. Frontiers in Bioscience 1998; 3: 365-75

2.McConkey DJ. Biochemical determinants of apoptosis and necrosis. Toxicology Letters 1998; 99: 157-68

3.Fadeel B, Orrenius S, Zhivotovsky B. Apoptosis in human disease: a new skin for the old ceremony? Biochemical and Biophysical Research Communications 1999; 266: 699-717

4.Perry LM, Metzger J. Medicinal plants of East and Southeast Asia. Cambridge: MIT Press. 1980. P. 41-2

5.Chang S-Y, Yook C-S, Nohara T. Lupane-triterpene glycosides from leaves of Acanthopanax koreanum. Phytochemistry 1999; 50: 1369-74

6.Shim SC, Chang S-K, Hur CW, Kim CK. A polyacetylenic compound from Panax ginseng roots. Phytochemistry 1987; 26: 2849-50

7.Poplawski J, Wrobel JT, Glinka T. Panaxydol, a new polyacetylenic epoxide from Panax ginseng roots. Phytochemistry 1980; 19: 1539-41

8.Kobayashi M, Mahmud T, Umezome T, Wang W, Murakami N, Kitagawa I. The absolute stereostructures of the polyacetylenic constituents of ginseng radix rubra. Tetrahedron 1997; 53: 15691-700

9.Loo DT, Rillema JR. Measurement of cell death. Methods in Cell Biology 1998; 57: 251-64

10.Oh G-S, Hong, K-W, Oh H, Pae H-O, Seo W-G, Kim I-K, et al. 4-Acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol isolated from the fruiting bodies of Isaria japonica Yasuda induces apoptosis of human leukemia cells (HL-60). Biological & Pharmaceutical Bulletin 2001; 24: 785-9

11.Bernart MW, Cardellina JH II, Balaschak MS, Alexander MR, Shoemaker RH, Boyd MR. Cytotoxic falcarinol oxylipins from Dendropanax arboreus. Journal of Natural Products 1996; 59: 748-53

도 1은 본 발명의 화합물의 처리에 의해 백혈병 세포주인 HL-60 세포에서 아폽토시스가 유도됨을 보여주는 도면이다(도 1에서, *의 표시는 아폽토시스가 나타난 세포에서 전형적으로 보여지는 쭈그러진 핵(shrunken nuclei)을 나타낸다.).

도 2는 본 발명의 화합물의 처리에 의해 백혈병 세포주인 HL-60 세포에서 DNA 절편화가 일어남을 보여주는 도면이다(도 2에서, Marker는 φx174 RF DNA/Hae III 크기 마커를 사용한 것으로, 위에서부터 1,353 bp, 1,078bp, 872 bp, 603 bp의 크기를 나타낸다).

도 3은 본 발명의 화합물의 처리에 의해서 백혈병 세포주인 HL-60 세포가 아폽토시스의 전형적인 특징인 서브-G1기의 세포주기로 전이되는 것이 증가됨을 보여주는 도면이다.

Claims

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헵타데카-1,8-디엔-4,6-디인-3,10-디올 및 파낙시돌(panaxydol)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도용 항암제 조성물.
삭제
제 2항에 있어서, 상기 항암제 조성물은 백혈병 세포에서 아폽토시스를 유도함을 특징으로 하는 조성물.