RS55861B1 - Antagonisti toll-like receptora 3 - Google Patents

Antagonisti toll-like receptora 3

Info

Publication number
RS55861B1
RS55861B1 RS20170263A RSP20170263A RS55861B1 RS 55861 B1 RS55861 B1 RS 55861B1 RS 20170263 A RS20170263 A RS 20170263A RS P20170263 A RSP20170263 A RS P20170263A RS 55861 B1 RS55861 B1 RS 55861B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tlr3
antibody
mat
seq
antibodies
Prior art date
Application number
RS20170263A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Cunningham
Mateo Lani San
Robert T Sarisky
Raymond Sweet
Robert Rauchenberger
Mark Rutz
Yiqing Feng
Katharine Heeringa
Jinquan Luo
Fang Teng
Alexey Teplyakov
Sheng-Jiun Wu
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Publication of RS55861B1 publication Critical patent/RS55861B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela antagoniste Toll-like receptora 3 (TLR3) ili njihove fragmente, i postupke za njihovu pripremu i korišćenje.
Pozadina pronalaska
[0002] Toll-like receptori (TLRs) regulišu aktiviranje urođenog imunog odgovora i utiču na razvoj adaptivnog imuniteta pokretanjem kaskada za prenos signala kao odgovor na bakterijske, virusne, parazitske, i u nekim slučajevima i ligande domaćina (Lancaster et al., J. Phvsiol. 563:945-955, 2005). TLR lokalizovani u membrani plazme: TLR1, TLR2, TLR4 i TLR6 prepoznaju liganade uključujući proteinske ili lipidne komponente bakterija i gljivica. Pretežno intracelularni TLR-i, TLR3, TLR7 i TLR9 odgovaraju na dsRNK, ssRNK i nemetilovanu CpG DNK, respektivno. Disregulacija TLR signalizacije verovatno izaziva mnoštvo problema, pa se terapijske strategije i razvijaju u tom pravcu (Hoffman et al., Nat. Rev. Drug Discov. 4:879-880, 2005, Rezaei, Int. Immunopharmacol. 6:863-869, 2006; VVIckelgren, Science 312:184-187, 2006). Na primer, antagonisti TLR4 i TLR-a 7 i 9 su u kliničkom razvoju za teške sepse i lupus, respektivno (Kanzler et al., Nat. Med. 13:552-559, 2007).
[0003] TLR3 signalizaciju aktiviraju dsRNK, mRNK ili RNK oslobođene iz nekrotičnih ćelija tokom upale ili infekcije virusom. TLR3 aktivacija izaziva lučenje interferona i pro-inflamatornih citokina I izaziva aktivaciju i regrutaciju imunskih ćelija koje su zaštitne tokom određenih mikrobioloških infekcija. Na primer, dominantno-negativnl TLR3 alel se povezuje sa povećanom osetljivošću na Herpes Slmpleks encefalitis nakon primarne infekcije HSV-1 u detinjstvu (Zheng et al., Science 317:1522-1527 2007.). Kod miševa, nedostatak TLR3 se povezuje sa smanjenim preživljavanjem nakon izazova koksaki virusom (Richer et al., PLoS One 4:e4127 , 2009). Međutim, pokazano je da nekontrolisana ili deregulisana TLR3 signalizacija doprinosi obolevanju i smrtnosti u određenim virusnim modelima infekcije uključujući virus Zapadnog Nila, Flebovirus, vakciniju i influencu A (Wang et al., Nat. Med. 10:1366-1373, 2004; Gowen et al., J. Immunol. 177:6301-6307, 2006; Hutchens et al., J. Immunol. 180:483-491, 2008; Le Goffic et al., PloS Pathog. 2:E53, 2006).
[0004] Takođe je pokazano da TLR3 pokreće patogene mehanizme u spektru inflamatornih, imunski-posredovanih i autoimunskih bolesti uključujući, npr. septički šok (Cavassani et al., J. Exp. Med. 205:2609-2621, 2008), akutnu povredu pluća (Murray et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178:1227-1237, 2008), reumatoidni artritis (Kim et al., Immunol. Lett. 124:9-17, 2009; Brentano et al., Arth. Rheum. 52:2656-2665, 2005), astma (Sugiura et al., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40:654-662 , 2009; Morishima et al., Int. Arch. Allergv Immunol. 145:163-174, 2008; Stowell et al., Respir. Res. 10:43, 2009), inflamatorna bolest creva poput Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa (Zhou et al., J. Immunol. 178:4548-4556, 2007; Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 104:7512-7515, 2007), autolmuno oboljenje jetre (Lang et al., J. Clin. Invest. 116:2456-2463, 2006) i dijabetes tipa I (Oogusan et al. Diabetes 57:1236-1245, 2008; Lien and Zipris, Curr. Mol. Med. 9:52-68, 2009). Osim toga, pokazano je da organ-specifično povećanje TLR3 ekspresije korelira sa određenim brojem patoloških stanja koja pokreću disregulisani lokalni inflamatorni odgovori kao npr. u tkivu jetre kod primarne bilijarne ciroze (Takii et al., Lab Invest. 85:908-920, 2005), kod reumatoidnog artritisa zglobova (Ospelt et al., Arthritis Rheum. 58:3684-3692, 2008), i nazalne mukoze kod pacijenata sa alergijskim rinitisom (Fransson et al., Respir. Res. 6:100, 2005).
[0005] U nekrotičnim stanjima, oslobađanje intracelularnog sadržaja uključujući endogenu mRNK izaziva lučenje citokina, hemokina i drugih faktora koji izazivaju lokalnu upalu, olakšavaju čišćenje ostataka izumrlih ćelija i popravljaju oštećenje. Nekroza često održava upalni proces, dovodeći do hronične ili preterane upale (Bergsbaken et al., Nature Revievs 7: 99-109, 2009). Aktivacija TLR3 na mestu nekroze može da doprinese ovim aberantnim upalnim procesima i generiše dalje pro-inflamatorne povratne sprege preko oslobođenih TLR3 liganda. Tako, TLR3 antagonizam može biti koristan kod raznih poremećaja uključujući hronlčnu ili preteranu upalu i/ili nekrozu.
[0006] Negativna-modulacija TLR3 aktivacije takođe može da predstavlja novu strategiju lečenja za onkološke indikacije uključujući i karcinom bubrežnih ćelija i karcinom skvamoznih ćelija glave 1 vrata (Morikavva et al., Clin. Cancer Res. 13:5703-5709, 2007; Pries et al., Int. J. Mol. Med. 21: 209-215, 2008). Osim toga, TLR3<L423F>alel koji kodira protein sa smanjenom aktivnošću je povezan sa zaštitom od uznapredovale "suve" starosne makularne degeneracije (Yang et al., N. Engl. J. Med. 359: 1456-1463, 2008), što ukazuje da TLR3 antagonisti mogu biti korisni kod ove bolesti.
[0007] Patologije povezane sa Inflamatornim i drugim stanjima, kao što su one povezane sa tnfekcijama, imaju značajne zdravstvene i ekonomske posledice. Ipak, uprkos napretku u mnogim oblastima medicine, relativno mali broj opcija lečenja i terapija je dostupan za mnoga od ovih stanja.
[0008] Prema tome, za lečenje sa TLR3-udruženih stanja, postoji potreba da se potisne TLR3 aktivnost.
[0009] US 2006/115475 razmatra anti-TLR3 antitela. Opisana su monoklonska antitela koja prepoznaju ekstracelularni domen humanog TLR3 (Duffy et al. Cellular Imunologv 248 (2):103-114, 2007). Agonistička anti-TLR3 antitela su takođe opisana u US 2007/098716. Pokazano je da Anti-TLR3 monoklonsko antitelo protiv humanog TLR3 potiskuje poly(l): poly(C)-posredovanu produkciju IFN-B od strane TLR3 koje eksprimiraju humani fibroblasti (Matsumoto et al. Blochemical and Biophysical Research Communications 293(5): 1364-1369, 2002 and U5 2005/153910).
Kratak opis crteža
[0010]
SI. 1 prikazuje dejstvo anti-humanog TLR3 (huTLR3) mAt u NF-kB testu reporterskog gena.
SI. 2A i 2B prikazuju dejstvo {% inhibiclje) ili anti-huTLR3 mAts u BEAS-2B testu.
SI. 3A1 3B prikazuju dejstvo anti-huTLR3 mAt u NHBE testu.
SI. 4 prikazuje dejstvo anti-huTLR3 mAt u PBMC testu.
SI. 5A i 5B prikazuju dejstvo anti-huTLR3 mAt u HASM testu.
SI. 6A, 6B1 6C prikazuju vezivanje anti-huTLR3 mAt sa TLR3 mutantima.
SI. 7A prikazuje epltope za mAt 15EVQ (crno) i C1068 mAt (sivo) (gornja slika) i epitope za mAt 12QVQ/QSV (crno, donja slika) superponirane na strukturu humanog TLR3 ECD.
SI. 7B prikazuje lokalizovanu mapu perturbacije H/D izmene za TLR3 ECD protein u kompleksu sa mAt 15EVQ.
SI. 8A i 8B prikazuju delovanje pacov/mišjeg anti-mišjeg TLR3 mAt mAt 5429 (surogat) u testovima A) NF-kB i B) ISRE reporterskog gena.
SI. 9 prikazuje delovanje surogata mAt (mAt 5429, mAt c1811) u MEF CXCL10/IP-10 testu.
SI. 10 prikazuje specifičnost vezivanja surogata mAt sa TLR3. Gornji panel: kontrola za izotip; donji panel: mAt c1811. SI. 11 prikazuje delovanje surogata mAts na PenH nivo u AHR modelu.
SI. 12 prikazuje delovanje surogata mAts na ukupan broj neutrofila u BAL fluidu u AHR modelu.
SI. 13 prikazuje delovanje surogata mAts na CXCL10/IP-10 nivoe u BAL fluidu u AHR modelu.
SI. 14 prikazuje delovanje surogata mAt na histopatološke skorove u DSS modelu.
SI. 15 prikazuje delovanje surogata mAt na A) histopatološke skorove i B) priliv neutrofila u modelu transfera T-ćelija. SI. 16 prikazuje delovanje surogata mAt na kliničke skorove u CIA modelu.
SI. 17 prikazuje delovanje surogata mAt na kliničke AUC skorove u CIA modelu.
SI. 18 prikazuje delovanje surogata mAt na preživljavanje C57BL/6 miševa posle intranazalne administracije influenca A/PR/8/34.
SI. 19 prikazuje delovanje surogata mAt na kliničke skorove nakon administracije influenca A/PR/8/34.
SI. 20 prikazuje delovanje surogata mAt na telesnu težinu tokom 14 dana posle administracije influence A/PR/ 8/34. SI. 21 prikazuje delovanje surogata mAts na nivo glukoze u krvi kod (A) WT DIO i (B) TLR3KO DIO životinja nakon Izazova glukozom.
SI. 22 prikazuje delovanje surogata mAt na nivoe insulina kod WT DIO životinja.
SI. 23 prikazuje delovanje mAt 15EVO. na (A) NTHi i (B) nivoe CXCL10/IP-10 i CCL5/RANTES u NHBE ćelijama, indukovane rinovirusom.
SI. 24 prikazuje delovanje mAt 15EVQna (A) slCAM-1 nivo i (B) vijabilnost HUVEC ćelija.
Rezime pronalaska
[0011]Prvi aspekt pronalaska je izolovano antitelo iti njegov fragment reaktivan sa toll-like receptorom 3 (TLR3), koje sadrži varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca, pri čemu antitelo sadrži: a. aminokiselinske sekvence teškog lanca CDR 1,213 kako je prikazano u SEK ID BR: 82, 86 i 84; i b. aminokiselinske sekvence lakog lanca CDR 1, 2 i 3 kako je prikazano u SEK ID BR: 79, 80 i 87.
[0012] U jednoj realizaciji, antitelo vezuje najmanje jedan aminokiselinski ostatak TLR3 izabran iz grupe koju čine ostacci K467, R488 ili R489 iz sekvence SEK ID BR: 2.
[0013] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu antitelo vezuje najmanje jedan aminokiselinski ostatak TLR3 izabran iz grupe koju čine ostaci D116 ili K145 iz sekvence SEK ID BR: 2.
[0014] U Jednoj realizaciji antitelo ima najmanje jedno od sledećih svojstava: a. smanjuje biološku aktivnost humanog TLR3 uIn vitropoli (I: C) NF-kB testu reporterskog gena > 50% pri <1 ug/ml; b. inhibtra > 60* produkciju IL-6 ili CXCL10/IP-10 iz BEAS-2B ćelija stimulisanih sa <100 ng/ ml poly (l:C) pri < 10 pg/ml; c. inhibira > 50% produkciju IL-6 ili CXCL10/IP-10 iz BEAS-2B ćelija stimulisanih sa <100 ng/ ml poli (l:C) pri < 0.4 pg/ml; d. inhibira > 50% IL-6 iz NHBE ćelija stimulisanih sa 62.5 ng /ml poli (l:C) pri < 5 pg/ml;
e. produkciju IL-6 iz NHBE ćelija stimulisanih sa 62.5 ng/ml poly(l:C) inhibira>50% pri <1 pg/ml;
f. poli (l:C)-indukovanu produkciju IFN-y, IL-6 ili IL-12 od strane PBMC ćelija, inhibira > 20% pri<1 pg/ml;
g. inhibira cinomologus TLR3 biološku aktivnost uin vitroNF-kB testu reporterskog gena sa IC50 <10 pg/ml; ili h. inhibira cinomologus TLR3 biološku aktivnost uin vitrotestu ISRE reporterskog gena sa IC50 < 5 pg/ml.
[0015] Ovde je takođe otkriveno i izolovano antitelo koje reaguje sa TLR3 koje se takmiči sa monoklonskim antitelom za vezivanje sa TLR3, pri čemu monoklonsko antitelo sadrži aminokiselinske sekvence teškog lanca, regiona koji određuju komplementarnost (CDR) 1, 2 i 3 kao što je prikazano u SEK ID BR: 82, 86 i 84, i aminokiselinske sekvence lakog lanca CDR 1, 2 i 3, kao što je prikazano u SEK ID BR: 79, 80 i 87, ili u kojem monoklonsko antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona (VH) teškog lanca, kao što je prikazano u SEQ ID BR: 216 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona (VL) lakog lanca, kao što je prikazano u SEQ ID BR: 41.
[0016] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo reaktivno sa TLR3 koje sadrži varijabilne regione teških i lakih lanaca i pri čemu antitelo sadrži određene regione teških lanaca koji određuju komplementarnost (CDR) 1, 2 i 3 i aminokiselinske sekvence CDR 1, 2 i 3 lakih lanaca.
[0017] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo reaktivno sa TLR3 koje sadrži varijabilne regione teških i lakih lanaca, pri čemu antitelo sadrži aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona (VH) određenih teških lanaca i aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona određenih lakih lanaca (VL).
[0018] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo reaktivno sa TLR3 koje sadrži varijabilne regione teških i lakih lanaca, pri čemu antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu određenog teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu određenog lakog lanca.
[0019] Ovde je takođe otkriven teški lanac izolovanog antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u sekvencama: SEK ID BR: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 ili 216.
[0020] Ovde je takođe otkriven laki lanac izolovanog antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210 ili 211.
[0021] Ovde je takođe otkriven teški lanac izolovanog antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 ili 168.
[0022] Ovde je takođe otkriven laki lanac izolovanog antitela koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 Ili 167.
[0023] Ovde je takođe otkriven izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac antitela, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 ili 216.
[0024] Ovde je takođe otkriven izolovani polinukleotid koji kodira laki lanac antitela, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209, 210 ili 211.
[0025] Ovde je takođe otkriven izolovani polinukleotid koji kodira teški lanac antitela, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 ili 168.
[0026] Ovde je takođe otkriven izolovani polinukleotid koji kodira laki lanac antitela, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 ili 167.
[0027] Još jedan aspekt pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži izolovano antitelo prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovde je takođe otkriven vektor koji sadrži najmanje jedan polinukleotid koji je ovde opisan.
[0028] Ovde je takođe otkrivena ćelija domaćin koja sadrži vektor iz ovog pronalaska.
[0029] Ovde je takođe otkriven postupak izrade antitela reaktivan sa TLR3 prema zahtevu 1 koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina iz ovog otkrića i izolaciju antitela koje je produkovala ćelija domaćina.
[0030] Još jedan aspekt pronalaska je izolovano antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku za upotrebu u terapiji.
[0031] U jednoj realizaciji izolovano antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju inflamatornog stanja, koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine izolovanog antitela ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku, pacijentu kome je to potrebno tokom vremena dovoljnog za lečenje ili prevenciju inflamatornog stanja.
[0032] U jednoj realizaciji izolovano antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije sistemskog inflamatornog stanja, koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine izolovanog antitela ili farmaceutske kompozicije iz pronalaska, pacijentu kome je to potrebno tokom vremena dovoljnog za lečenje ili prevenciju sistemskog Inflamatornog stanja.
[0033] U jednoj realizaciji izolovano antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku je za upotrebu u postupku lečenja dijabetesa tipa II koji obuhvata davanje terapijski efikasne količine izolovanog antitela ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku pacijentu kome je to potrebno tokom vremena dovoljnog za lečenje dijabetesa tipa II.
[0034] U jednoj realizaciji izolovano antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku je za upotrebu u postupku za lečenje hiperglikemije koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine izolovanog antitela ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku pacijentu kome je to potrebno tokom vremena dovoljnog za lečenje hiperglikemije.
[0035] U jednoj realizaciji izolovano antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku je za upotrebu u postupku za lečenje hiperinsulinemije koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine izolovanog antitela ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku pacijentu kome je to potrebno tokom vremena dovoljnog za lečenje rezistencije na insulin.
[0036] U jednoj realizaciji izolovano antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju virusnih infekcija koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine izolovanog antitela ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku pacijentu kome je to potrebno tokom vremena dovoljnog za lečenje ili prevenciju virusne infekcije.
Petaljan opi s pr onalas ka
[0037] Termin "antagonist", kako se ovde koristi, označava molekul koji delimično ili potpuno inhibira, bilo kojim mehanizmom, delovanje drugog molekula kao što je receptor ili intracelularni medijator.
[0038] Kako se ovde koristi, "antitelo TRL3 antagonist" ili antitelo "reaktivno sa TLR3" opisuje antitelo koje može, direktno ili indirektno, suštinski da neutrališe, smanji ili inhibira biološku aktivnost TLR3 ili aktivaciju TLR3 receptora. Na primer, antitelo reaktivno sa TLR3 može da se veže direktno za TLR3 i neutrališe aktivnost TLR3, odnosno blokira TLR3 signalizaciju kako bi se smanjilo oslobađanje citokina i hemokina ili NF-kB aktivacija.
[0039] Termin "antitela" kako se ovde koristi u širem smislu podrazumeva i uključuje imunoglobuline ili molekule antitela uključujući poliklonska antitela, monoklonska antitela, uključujući murinska, humana, humana-adaptirana, humanizovana i himerna monoklonska antitela i fragmente antitela.
[0040] Uopšteno, antitela su proteini ili peptidni lanci koji ispoljavaju specifičnost vezivanja za određeni antigen. Intaktna antitela su hetero-tetramerni glikoproteini, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Svaki laki lanac je obično povezan sa teškim lancem pomoću jedne kovalentne disulfidne veze, dok broj disulfidnih veza između teških lanaca različitih imunoglobulinskih izotipova varira. Svaki teški i laki lanac takođe ima uredno razmaknute međulančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac na jednom kraju ima varijabilni domen (VH) praćen sa određenim brojem konstantnih domena. Svaki laki lanac na jednom kraju ima varijabilni domen (VL) i konstantni domen na svom drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca. Laki lanci antitela bilo koje vrste kičmenjaka mogu biti dodeljeni jednom od dva jasno različita tipa, naime kapa (k) i lambda (A), na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.
[0041] Imunoglobulini se mogu podeliti na pet glavnih klasa, odnosno IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, zavisno od aminokiselinske sekvence konstantnog domena teškog lanca. IgA i IgG su dalje podeljeni kao izotipovi lgA1, lgA2, lgG1, lgG2, lgG3 i lgG4.
[0042] Izraz "fragmenti antitela" označava deo intaktnog antitela, generalno antigen vezujući ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente, dijatela, jednolančane molekule antitela i multispecifična antitela formirana od najmanje dva intaktna antitela.
[0043] Imunoglobulinskl varijabilni regioni lakog ili teškog lanca se sastoje od "okvirnog" regiona prekinutog sa tri "antigen-vezujuća mesta". Antigen-vezujuća mesta se definišu pomoću različitih termina kao što sledi: (i) termin Regioni Koji Određuju Komplementarnost (CDR) je zasnovan na varijabilnosti sekvence (Wu i Kabat, J Exp. Med. 132:211-250, 1970). Generalno, antigen-vezujuće mesto ima šest CDR-a; tri u VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3), i tri u VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) Termin "hipervarijabilni region", "HVR", ili "HV se odnosi na regione varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u strukturi kako su definisali Chothia i Lesk (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Generalno, antigen-vezujuće mesto ima šest hipervarijabilnih regiona, tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). Čoti i Lesk strukturno očuvane HV nazivaju "kanonskim strukturama" (iii) "IMGT-CDR" kako je predložio Lefranc (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003) se odnosi na poređenja V domena iz imunoglobulina i receptora T-ćelija. International ImMunoGeneTics (IMGT) baza podataka (http:// www. imgt. orq) obezbeđuje standardizovanu numeraciju i definisanje ovih regiona. Korespondencija između CDR, HV i IMGT delineacija je opisao Lefranc sa saradnicima u Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003. (iv) Delineacija mesta vezivanja antigena takođe može da se izvrši prema Almagru: "Specificitv Determining Residue Usage" (SDRU), (Almagro, Mol. Recognit. 17:132-143, 2004), gde se Ostaci koji Određuju Specifičnost ("SDR"), odnosi na amino kiselinske ostatke imunoglobulina koji su direktno uključeni u kontakt sa antigenom. SDRU kako je definisao Almargo je precizna mera broja i distribucije SDR za različite tipove antigena kako je definisano analizama kristalnih struktura kompleksa antigen-antitelo.
[0044] Termin "kompozitne sekvence" kako se ovde koristi, označava vezujuće mesto antigena definisano tako da uključuje sve aminokiselinske ostatke označene pojedinačno prema Kabatu, Cotiju ili IMGT ili bilo koje druge pogodne delineacije regiona vezivanja antigena.
[0045] "Okvir" ili "okvirne sekvence" su preostale sekvence varijabilnog regiona osim onih koje su definisane kao mesta vezivanja antigena. Zato što mesto vezivanja antigena može biti definisano različitim terminima kako je gore opisano, tačna amino kiselinska sekvenca okvira zavisi od toga kako je definisano mesto vezivanja antigena.
[0046] Izraz "antigen" kako se ovde koristi označava bilo koji molekul koji ima sposobnost generisanja antitela direktno ili indirektno. Definicijom "antigen" je obuhvaćena nukleinska kiselina koja kodira protein.
[0047] Izraz "homolog" označava proteinske sekvence koje imaju između 40% i 100% identičnosti sa referentnom sekvencom. Homolozl humanog TLR3 uključuju polipeptide iz drugih vrsta koje Imaju između 40% i 100% identičnosti sekvence sa poznatom humanom sekvencom TLR3. Procenat identičnosti između dva peptidna lanca može biti određen poravnavanjem parova korišćenjem standardnih podešavanja na AlignX modulu Vektor NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carslbad, CA). Pod "TLR3" se podrazumeva humani TLR3 (huTLR3) i njegovi homolozi. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence pune dužine huTLR3 su prikazane u SEK ID BR: 1 i 2, respektivno. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence huTLR3 ekstracelularnog domena (ECD) su prikazane u SEK ID BR: 3 i 4, respektivno.
[0048] Izraz "suštinski identičan" kako se ovde koristi znači da su dve aminokiselinske sekvence antitela ili fragmenta antitela, koje sa porede, identične ili imaju "nebitne razlike". Nebitne razlike su supstitucije 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci antitela ili fragmenta antitela. Aminokiselinske sekvence suštinski identične sa ovde opisanim sekvencama su takođe deo ove prijave. U nekim realizacijama, identičnost sekvenci može biti oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više. Procenat identičnosti može da se odredi kako je gore opisano. Primeri peptidnih lanaca koji se porede su varijabilni regioni teškog ili lakog lanca.
[0049] Izraz "u kombinaciji sa" kako se ovde koristi znači da opisani agensi životinji mogu biti administrirani zajedno u smeši, istovremeno kao pojedinačni agensi ili sekvencijalno kao pojedinačni agensi u bilo kom redosledu.
[0050] Izraz "inflamatorno stanje" kako se ovde koristi označava lokalizovani odgovor na ćelijsku povredu koja je delimično posredovana aktivnošću citokina, hemokina, ili inflamatornih ćelija (npr, neutrofili, monociti, limfociti, makrofagi), koju u većini slučajeva karakterišu bol, crvenilo, otok i gubitak tkivne funkcije. Termin "inflamatorno stanje pluća" kako se ovde koristi, označava inflamatorno stanje koje pogađa ili je povezano sa plućima.
[0051] Izraz "monoklonsko antitelo" (MAt) kako se ovde koristi, označava antitelo (ili fragment antitela) dobijen iz populacije suštinski homogenih antitela. Monoklonska antitela su visoko specifična, obično usmerena protiv jedne antigenske determinante. Modifikator "monoklonsko" označava suštinski homogen karakter antitela i ne zahteva proizvodnju antitela nekom posebnom metodom. Na primer, murinska mAt mogu biti napravljena hibridoma metodom Kolera i saradnika, Nature 256:495-497, 1975. Himerna mAt koja sadrže varijabilne regione lakog lanca i teškog lanca dobijena od donorskog antitela (obično murinskog) u saradnji sa konstantnim regionima lakih i teških lanaca dobijenih iz akceptorskih antitela (obično druge vrste sisara poput humanih) mogu biti pripremljeni pomoću postupka opisanog u US Pat. 4,816,567. Humana adaptirana mAt koja imaju CDR-e izvedene od imunoglobulina ne-humanog donora (obično miša) i ostale delove imunoglobulina izvedene od molekula koji potiču od jednog ili više humanih imunoglobulina mogu biti pripremljena pomoću tehnika koje su poznate stručnjacima u tehnici, kako je opisano u U.S. Pat. No 5,225,539. Humane okvirne sekvence korisne za adaptaciju mogu biti izabrane iz relevantnih baza podataka od strane osoba verziranih u stanje tehnike. Opciono, humano-adaptirana mAt dalje mogu biti modifikovana ugrađivanjem izmenjenih ostataka okvirnih regiona da se sačuva afinitet vezivanja pomoću tehnika poput onih opisanih u Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:10029-10032, 1989 i Hodgson etal., B1o/Technology, 9:421, 1991.
[0052] Potpuno humana mAt bez ne-humanih sekvenci se mogu pripremiti od humanog imunoglobulina transgenskih miševa pomoću tehnika pomenutih u npr. Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Fishvvild et al., Nature Biotechnology 14:845-851, 1996; i Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156, 1997. Humana mAt takođe mogu biti pripremljena i optimizovana iz fagnih biblioteka pomoću tehnika navedenih u, npr. Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; i Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254: 67-84 2001.
[0053] Izraz "epitop" kako se ovde koristi označava deo antigena za koji se antitelo specifično vezuje. Epitopi se obično sastoje od hemijskl aktivnih (poput polarnih, nepolarnih ili hldrofobnlh) površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci polisaharida, i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop može biti linearne prirode ili može biti diskontinuiran, npr., konformacioni epitop, koji je formiran pomoću prostornog odnosa između ne-susednih aminokiselina antigena pre nego od serija linearnih aminokiselina. Konformacioni epitop sadrži epltope nastale savijanjem antigena, pri čemu aminokiseline iz različitih delova linearne sekvence antigena dolaze u neposrednu blizinu u trodimenzionalnom prostoru.
[0054] Izraz "specifično vezivanje", kako se ovde koristi, se odnosi na vezivanje antitela sa unapred određenim antigenom sa većim afinitetom nego sa drugim antigenima ili proteinima. Obično se antitelo vezuje sa konstantom disocijacije (Ko) od 10'<7>M ili manjom i vezuje se za unapred određeni antigen sa KDkoja je najmanje dvostruko manja od Koza vezivanje nespecifičnog antigena (npr. BSA, kazein Ili bilo koji drugi određeni polipeptid) osim unapred određenog antigena. Izrazi "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" se ovde koriste naizmenično sa terminom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen" ili "antigen specifično antitelo" npr. TLR3 specifično antitelo. Konstanta disocijacije se može meriti pomoću standardnih postupaka opisanih u nastavku.
[0055] Izraz TLR3 biološka aktivnost" ili "TLR3 aktivacija", kako se ovde koristi, se odnosi na bilo koju aktivnost koja se javlja kao posledica vezivanja liganda za TLR3. TLR3 ligandi obuhvataju dsRNK, poly(l:C) i endogenu mRNK, npr. engodenu mRNK iz nekrotičnih ćelija. Jedan primer TLR3 aktivacije dovodi do aktivacije NF-kB u odgovoru na TLR3 ligand. NF-kB aktivacija može biti testirana korišćenjem testa reporterskog gena posle indukcije receptora sa poly(l:C)
(Alexopoulou et al., Nature 413: 732-738, 2001; Hacker et al., EMBO J. 18: 6973-6982, 1999). Sledećt primer TLR3 aktivacije dovodi do aktivacije regulatornih faktora interferona (IRF-3, IRF-7) kao odgovor na TLR3 ligand. TLR3 posredovana IRF aktivacija može biti testirana pomoću reporterskog gena koji pokreće interferonom stimulisani elemenat odgovora (ISRE). Sledeća egzemplarna TLR3 aktivacija dovodi do sekreclje pro-inflamatornih citokina i hemokina, na primer TNF-a, IL-6, IL-8, IL-12, CXCL5/IP-101 RANTES. Oslobađanje citokina i hemoklna iz ćelija, tkiva ili u cirkulaciji se može merlti korišćenjem poznatih imunotestova, kao što je ELISA imunotest.
[0056] Konvencionalni aminokiselinski kodovi od jednog ili tri slova se ovde koriste kako sledi:
Kompozicije materije
[0057] Ovaj pronalazak obezbeđuje antagonistička antitela sposobna da inhibiraju TLR3 biološku aktivnost i upotrebu takvih antitela kako je definisano u patentnim zahtevima. Takvi TLR3 antagonisti mogu imati svojstva vezivanja TLR3 i inhibiranja aktivacije TLR3. Primeri mehanizama pomoću kojih TLR3 aktivacija može biti inhiblrana pomoću takvih antitela uključujuin vitro, in vlvoiliin situinhibictju vezivanja liganada za TLR3, inhibiciju dimerizacije receptora, inhibiciju lokalizacije TLR3 u endozomnom prostoru, inhibiciju aktivnosti nizvodnih slgnalnlh puteva kinaza, ili inhibiciju transkripcije TLR3 mRNK. Druga antagonistička antitela sposobna da inhibiraju aktivaciju TLR3 pomoću drugih mehanizama su takođe u okviru različitih aspekata i primena ovog pronalaska. Ovi antagonisti su korisni kao istraživački reagensi, dijagnostički reagensi i terapeutski agensi.
[0058] Raznovrsnost antitela se stvara pomoću višestrukih gena germinalne linije, koji kodiraju varijabilne regione i pomoću raznih somatskih događaja. Somatski događaji uključuju rekombinaciju varijabilnih (V) genskih segmenata sa genskim segmentima diverziteta (D) i spojnim eng. „joining" (J) genskim segmentima da se dobije kompletan VH region i rekombinaciju varijabilnih I spojnlh genskih segmenata da se napravi kompletan VL region. Antitela i kompozicije koje imaju identične ili slične CDR sekvence kao ovde opisane, verovatno neće biti nezavisno generisane. Sekvenca gena antitela posle sklapanja i somatske mutacije je jako raznovrstan, a procenjuje se da ovf razni geni kodiraju 1010 različitih molekula antitela (Immunoglobulinski Geni, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1995).
[0059] Pronalazak obezbeđuje nova mesta vezivanja antigena dobijena iz biblioteka humanih imunoglobulisklh gena. Struktura koja nosi antigen-vezujuće mesto je obično teški ili laki lanac antitela ili njihov deo, pri čemu se mesto vezivanja antigena locira tamo gde se mesto vezivanja antigena prirodno javlja kao što je opisano gore.
[0060] Pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment reaktivan sa TLR3 prema patentnom zahtevu 1, koje sadrže varijabilne regione teškog lanca 1 lakog lanca i pri tome antitelo sadrži regione teškog lanca koji određuju komplementarnost (CDR) aminokiselinske sekvence 1,213 (HCDR1, HCDR2 1 HCDR3), kako je prikazano u SEK ID BR: 82, 86 i 84 i regione lakog lanca koji određuju komplementarnost (CDR) aminokiselinske sekvence 1,213 (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) SEK ID BR: 79, 80 i 87, kako je prikazano u Tabeli 1a.
[0061] Ovde su takođe otkrivena druga antitela ili njihovi fragmenti reaktivni sa TLR3 koji sadrže varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu antitelo sadrži regione teškog lanca koji određuju komplementarnost (CDR), aminokiselinske sekvence 1, 2 i 3 (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i regione lakog lanca koji određuju komplementarnost (CDR), aminokiselinske sekvence 1, 2 i 3 (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) kao što je prikazano u Tabeli 1a.
[0062] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili njegov fragment reaktivan sa TLR3 koji sadrže varijabilne regione teškog lanca 1 lakog lanca, pri čemu antitelo sadrži HCDR2 aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEK ID BR: 192, pri čemu je, HCDR2 sekvence SEK ID BR: 194, definisan kako je prikazano u formuli (I):
u kojoj
Xaa6 može biti Arg ili Lys;
Xaa7 može biti Tyr, His ili Ser;
Xaa8 može biti Met, Arg ili Tyr; i
Xaa9 može biti Lys ili Arg.
[0063] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili njegov fragment reaktivan sa TLR3 koji sadrži varijabilne regione teškog lanca 1 lakog lanca i pri čemu antitelo sadrži HCDR2 aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEK ID BR: 194, pri čemu je HCDR2 sekvence SEK ID BR: 194 definisan kao što je prikazano u formuli (III):
u kojoj
Xaa,j može biti Lys, Thr ili lle;
Xaan može biti Asn ili Asp; i
Xaai7može biti Val ili Leu.
[0064]Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili fragment reaktivan sa TLR3, koji sadrži varijabilne regione teškog lanca I lakog lanca, pri čemu antitelo sadrži HCDR2 aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEK ID BR: 196, gde je HCDR2 sekvence SEK ID BR: 196 definisan kao što je prikazano u formuli (V):
u kojoj
Xaa24 može biti Phe ili Arg; i
Xaa2!može biti Ala ili Ser.
[0065] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili fragment reaktivan sa TLR3 koji sadrži varijabilni region i teškog lanca I lakog lanca i pri čemu antitelo sadrži LCDR3 aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEK ID BR: 191, gde je LCDR3 SEK ID BR: 191 definisan kao što je prikazano u formuli (II):
u kojoj
Xaa, može biti Ala, Gln, Gli ili Ser;
Xaa2može biti Gli, Glu ili Ser;
Xaa3može biti Asp ili Asn;
Xaa< može biti Glu ili Ser; 1
Xaa5može biti Phe, Ala ili Leu.
[0066] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili fragment reaktivan sa TLR3, koji sadrži varijabilni region i teškog lanca I lakog lanca i antitelo sadrži LCDR3 aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEK ID BR: 193, gde je LCDR3 SEK ID BR: 193 definisan kao što je prikazano u formuli (IV):
gde
Xaai0može biti Gln ili Ser;
Xaa,, može biti Thr, Glu ili Asp;
Xaau može biti Val ili Asn;
Xaan može biti Tir ili Phe; i
Xaa« može biti Ser, Asn Ili Gln.
[0067] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili fragment reaktivan sa TLR3, koji sadrži varijabilne regione i teškog lanca i lakog lanca i antitelo sadrži LCDR3 aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEK ID BR: 195, gde je LCDR3 SEK ID BR: 195 definisana kao što je prikazano u formuli (VI):
gde
Xaa„ može biti Tir, Gli ili Ala;
Xaa,9 može biti Gli, Glu ili Asn;
Xaa20može biti Ser III Thr;
Xaa2imože biti Val, lle ili Leu;
Xaau može biti Ser 111 Leu; i
Xaa2Jmože biti lle, Ser, Pro ili Tir.
[0068] Ovde su takođe otkrivena ostala izolovana antitela ili fragmenti reaktivni sa TLR3, koji imaju regione teškog lanca koji određuju komplementarnost (CDR), amfno kiselinske sekvence 1,2 1 3 (HCDR1, HCDR2 1 HCDR3) 1 regione lakog lanca koji određuju komplementarnost (CDR), amlno kiselinske sekvence 1,213 (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) kao što je prikazano u Tabeli 1a.
[0069] Ovde su takođe otkrivena antitela čije se aminokiselinske sekvence mesta vezivanja antigena nebitno razlikuju od onih prikazanih u Tabeli 1a (SEK ID BR: 49-121 i 191-196). Ovo obično uključuje Jednu 111 više amlnokiselinskih supstitucija sa amlnoklselinom koja ima slično naelektrisanje, hidrofobne ili stereohemijske karakteristike. Dodatne supstitucije u okvirnim regionima, za razliku od antigen-vezujućih mesta takođe mogu biti izvršene sve dok one ne utiču negativno na osobine antitela. Supstitucije mogu biti izvršene da se poboljšaju osobine antitela, na primer stabilnost ili afinitet. Jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest supstitucija može biti ivršeno na mestima vezivanja antigena.
[0070] Konzervativne modifikacije će proizvesti molekule koji imaju funkcionalne i hemijske karakteristike slične onima kakve ima molekul od kojeg su takve modifikacije napravljene. Suštinske modifikacije funkcionalnih i/ili hemijskih karakteristika molekula se mogu postići izborom supstitucija u aminokiselinskoj sekvenci koje se bitno razlikuju u svom uticaju na održavanje (1) primarne strukture molekula u zoni supstitucije, na primer, konformacija pločice ili zavojnice, (2) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu ili (3) veličine molekula. Na primer, "konzervativna aminokiselinska supstitucija" može uključiti supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka sa nenatlvnim ostatkom tako ima malo ili nimalo uticaja na polarnost ili naelektrisanje aminokiselinskog ostatka na tom položaju. Osim toga, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu takođe može biti supstituisan alaninom, kao što je prethodno opisano za "skenirajuću alaninsku mutagenezu<j>(MacLennan et al., Acta Phvsiol. Scand. Suppl. 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv. Biophvs 35:1-24, 1998). Željene supstitucije aminokiselina (konzervativne ili ne-konzervativne) mogu da odrede oni koji su verzirani u stanje tehnike u trenutku kada su takve supstitucije potrebne. Na primer, aminokiselinske supstitucije mogu da se koriste za identifikaciju važnih ostataka sekvence molekula, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta molekula koji su ovde opisani. Primeri aminokiselinskih supstitucija su prikazani u Tabeli 1b.
[0071] U nekim realizacijama, konzervativne aminokiselinske supstitucije takođe obuhvataju ne-prirodne aminokiselinske ostatke, koji su obično inkorporirani hemijskom sintezom peptida, pre nego sintezom u biološkim sistemima. Aminokiselinske supstitucije se mogu izvršiti na primer PCR mutagenezom (US Pat. No. 4,683,195). Biblioteke varijanti mogu da se dobiju korišćenjem dobro poznatih postupaka, na primer korišćenjem nasumičnih (NNK) ili ne-nasumičnih kodona, naprimer DVK kodona, koji kodiraju 11 aminokiselina (ACDEGKNRSYW), i skriningom biblioteka za varijante sa željenim osobinama, kao što je prikazano u Primeru 1. Tabela 1c prikazuje supstitucije napravljene na tri roditeljska antitela antagonista TLR3 unutar regiona LCDR3 i HCDR2 u cilju poboljšanja svojstava antitela.
[0072] U zavisnosti od delineacije antigen vezujućih mesta, ostaci antigen-vezujućih mesta antitela iz predmetnog pronalaska, i kasniji i ostaci okvirnih regiona mogu da variraju neznatno za svaki teški i laki lanac. Tabela 2a i 2b prikazuje ostatke mesta vezivanja antigena za primere antitela iz pronalaska sa delineacijom prema Kabatu, Čotiju i IMGT i njihove kompozitne sekvence.
[0073] Još jedan primer antitela iz pronalaska (mAt 14) je slično prikazan u Tabelama 2a i 2b
[0074] U drugim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili fragment reaktivan sa TLR3 prema zahtevu 1, koji sadrži varijabilne regione i teškog lanca i lakog lanca pri čemu antitelo sadrži aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona (VH) teškog lanca i varijabilnog regiona (VL) lakog lanca, kao što je prikazano u Tabeli 3a. F17, F18 i F19 predstavljaju varijante antitela koje sadrže konsenzus aminokiselinske sekvence za familije 17, 18 i 19, respektivno (vidi Primer 1).
[0075] U nekim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment reaktivan sa TLR3, koji sadrži varijabilne regione i teškog lanca i lakog lanca, pri čemu antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (VH) SEK ID BR: 216 i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca (VL) SEK ID BR:41, iz Tabele 3a.
[0076] U Tabeli 3a su takođe otkrivena i druga izolovana antitela ili fragmenti reaktivni sa TLR3 koji sadrže varijabilne regione teškog lanca 1 lakog lanca, pri čemu antitelo sadrži aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL).
[0077] lako realizacije ilustrovane u Primerima sadrže parove varijabilnih regiona, jedan iz teškog i jedan iz lakog lanca, iskusan stručnjak će prepoznati da alternativni primeri mogu sadržati pojedinačne varijabilne regione teškog ili lakog lanca. Pojedinačni varijabilni region se mogu koristiti za skrining varijabilnih domena koji mogu da formiraju dvo-domenski specifični antigen-vezujućl fragment koji može da se vezuje npr. sa TLR3. Skrining se može izvesti metodama fag displej skrininga pomoću npr. hijerarhijskog dualnog kombinatorijalnog pristupa opisanog u PCT Publ. No. V/092/01047. U ovom pristupu, individualna kolonija koja sadrži klon H ili L lanca se koristi za infekciju kompletne biblioteke klonova koji kodiraju drugu lanac (L ili H), a dobijem' dvo-lančani specifični antigen-vezujući domen se odabira u skladu sa fag displej tehnikama kako je opisano.
[0078] U drugim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili fragment reaktivan sa TLR3 prema zahtevu 1, koji sadrži varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca, koji imaju aminokiselinske sekvence sa najmanje 95% identičnosti sa varijabilnim regionom aminokiselinske sekvence kako je prikazano u Tabeli 3a.
[0079] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili fragment koji sadrži teški lanac sekvenci SEK ID BR: 2201 SEK ID BR: 156.
[0080] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 1 koje sadrže određene aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca kako je prikazano u Tabeli 3b.
[0081] Ovde su takođe otkriveni izolovani polinukleotidi koji kodiraju bilo koje od antitela iz pronalaska ili njihov komplement. Ovde su opisani određeni primeri polinukleotida, međutim, takođe su opisani 1 drugi polinukleotidi koji s obzirom na degeneraciju genetskog koda ili kodonske preference u datom sistemu ekspresije, kodiraju antitela antagoniste iz pronalaska su takođe u okviru obima ovog pronalaska.
[0082] Primeri antitela antagonista mogu biti antitela IgG, IgD, IgG, IgA ili IgM izotipova. Osim toga, takva antagonistička antitela mogu biti post-translatorno modifikovana procesima kao što su glikozilacija, izomerizacija, deglikozilacija ili veštačke kovalentne modifikacije, kao što je adicija polietilen glikol grupa (PEG) (pegilacija) i lipidacija. Takve modifikacije se mogu javitiin vivoili inWtro.Na primer, antitela iz ovog pronalaska mogu biti konjugovana sa polietilen glikolom (PEG) da poboljšaju svoje farmakokinetičke profile. Konjugaclja se može izvršiti tehnikama poznatim prosečnom stručnjaku. Pokazano je da konjugacija terapeutskih antitela sa PEG poboljšava farmakodinamiku, a da pri tome ne ometa funkciju. Pogledajte Deckert et al., Int. J. Cancer 87: 382-390, 2000; Knight et al, Platelets 15:409-418, 2004; Leong et al., Cvtokine 16:106-119, 2001; i Yang et al., Protein Eng. 16:761-770, 2003.
[0083] Farmakoklnetička svojstva antitela prema predmetnom pronalasku se takođe mogu poboljšati tehnikama Fc modifikacija koje su poznate stručnjacima. Na primer, teški lanci lgG4 izotipa sadrže Cys-Pro-Ser-Cys (CPSC) motiv u zglobnom regionu koji može da formira ili inter ili intra- disulfidne veze teškog lanca, odnosno, dva Cys ostatka u CPSC motivu mogu ostvariti disulfidnu vezu sa odgovarajućim Cys ostatcima u drugom teškom lancu (inter) ili dva Cys ostatka unutar datog CPSC motiva mogu ostvariti disulfidnu vezu međusobno (Intra). Veruje se da enzimi izomeraza in vivo mogu da pretvore inter- veze teškog lanca molekula lgG4 u intra- veze teškog lanca i obrnuto (Aalberse i Schuurman, lmmunology 105:9-19, 2002). Shodno tome, pošto parovi teški:laki lanac (H:L) u ovim lgG4 molekulima sa intra- vezama teškog lanca u zglobnom regiona nisu kovalentno vezani međusobno, oni mogu disocirati na H:L monomere koji se tada reasociraju sa H:L monomerima izvedenim iz drugih lgG4 molekula i formiraju bispeclfične, heterodimerne lgG4 molekule. U bispecifičnom IgG antitelu dva Fab-a molekula antitela se razlikuju po epitopima za koje se vežu. Supstitucijom Ser ostatka u zglobnom regionu CPSC motiva lgG4 sa Pro Results in "lgG1-sličnim ponašanjem", t.j. molekuli formiraju stabilne disulfidne veze između teških lanaca i stoga, nisu podložni H:L razmenl sa drugim lgG4 molekulima. U jednoj varijanti, antitela iz ovog pronalaska će sadržati lgG4 Fc domen sa S u P mutacijom u CPSC motivu. Položaj CPSC motiva se obično nalazi na ostatku 228 zrelog teškog lanca, ali se to može promenfti u zavisnosti od dužine CDR.
[0084] Osim toga, mogu biti uklonjena mesta koja utiču na vezivanje sa Fc receptorima osim za FcRn neonatalnog receptora u antitelima iz ovog pronalaska. Na primer, vezujući regioni Fc receptora uključeni u ADCC aktivnost mogu biti uklonjeni iz antitela iz ovog pronalaska. Na primer, mutacija Leu234/ Leu235 u zglobnom regionu lgG1 u L234A/L235A ili Phe235/Leu236 u zglobnom regionu lgG4 u P235A/L236A minimizira FcR vezivanje i smanjuje sposobnost imunoglobulina da posreduje citotoksičnost zavisnu od komplementa i ADCC. U jednom izvođenju, antitela iz ovog pronalaska će sadržati lgG4 Fc domen sa P235A/L236A mutacijama. Lokacija ovih ostataka Identlfikovanih iznad je tipična u zrelom teškom lancu, ali se može promeniti u zavisnosti od dužine CDR. Primeri antitela koja imaju P235A/L236A mutacije su antitela koja imaju teške lance kodirane sekvencama prikazanim u SEK ID BR: 218, 219 ili 220.
[0085] Potpuno humani, humani-adaptirani, humanizovani i afinitetno-zreli molekuli antitela 111 fragmenti antitela su u okviru ovog pronalaska isto kao i fuzioni proteini i hlmerni proteini. Afinitet antitela ka antigenu može biti poboljšan racionalnim dizajnom ili slučajnim sazrevanjem afiniteta korišćenjem dobro poznatih metoda poput nasumične ili usmerene mutageneze ili upotrebom biblioteka faga. Na primer, izmene na ostacima Vernier Zone, koji se uglavnom nalaze u okvirnom regionu, se mogu koristiti za moduliranje afiniteta antitela kako je opisano u US Pat. No. 6,639,055. Nedavno je Almagro sa saradnicima definisao "Rezidue koje određuju Afinitet" (eng. "Affinity Determining Residues", ADRs), koje se nalaze u CDR, i čiji inženjering može povećati afinitet (Cobaugh et al., J. Mol Biol 378:622-633, 2008).
[0086] Potpuno humani, humani-adaptirani, humanizovani, afinitetno-zreli molekuli antitela ili fragmenti antitela modifikovani da im se poboljša stabilnost, selektivnost, unakrsna reaktivnost, afinitet, imunogenost ili druga poželjna biološka ili biofizička svojstva su u okviru ovog pronalaska. Stabilnost antitela je pod uticajem brojnih faktora, uključujući (1) pakovanje jezgra pojedinačnih domena koje utiče na njihovu unutrašnju stabilnost, (2) interakcije spojeva protein/protein koje imaju uticaj na HC i LC sparivanje (3) ukopavanje polarnih i naelektrisanih ostataka, (4) mreža H-veza za polarne i naelektrisane ostatke; i (5) distribucija površinski naelektrisanih i polarnih ostataka između intra- i inter-molekularnih sila (Worn et al., J. Mol. Biol., 305:989-1010, 2001.). Ostaci koji su potencijalni destabilizatori strukture mogu biti identifikovani na osnovu kristalne strukture antitela ili molekulskog modelovanja u određenim slučajevima, a delovanje ostataka na stabilnost antitela se može ispitati generisanjem i procenom varijanti skrivanja mutacija u identifikovanim ostacima. Jedan od načina za povećanje stabilnosti antitela je da se poveća srednja tačka termalne tranzicije (Trn) merene pomoću diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). Generalno, vrši se korelacija Trn proteina sa njegovom stabilnošću i obrnuta korelacija sa njegovom sklonošću ka odvijanju i denaturaciji u rastvoru i procesima degradacije koji zavise od tendencije proteina da se odvija (Remmele et al., Biopharm, 13:36-46, 2000). Brojne studije su otkrile korelaciju između rangiranja fizičke stabilnosti formulacije merene kao termička stabilnost pomoću DSC i fizičke stabilnosti merene drugim metodama (Gupta et al., AAPS PharmSci 5E8, 2003; Zhang et al., J. Pharm Sci. 93:3076-3089, 2004; Maa et al., Int. J. Pharm, 140:155-168, 1996; Bedu-Addo et al., Pharm. Res., 21:1353-1361, 2004; Remmele et al., Pharm. Res, 15:200-208, 1997). Studije formulacije ukazuju na to da Fab TM ima uticaja na dugoročnu fizičku stabilnost odgovarajućeg mAt. Razlike u aminokiselinama bilo u okvirnom regionu ili u okviru CDR-a mogu imati značajan uticaj na termičku stabilnost Fab domena (Yasui, et al., FEBS Lett 353:143-146, 1994).
[0087] Antitela antagonisti iz ovog pronalaska se mogu vezati sa TLR3 sa K, manjom od ili jednakom oko 10'7,10 ', 10 ', 10'°, 1011 ili 10" M. Afinitet datog molekula ka TLR3, kao što je antitelo se može eksperimentalno odrediti, korišćenjem bilo kog pogodnog postupka. Takvi postupci mogu koristiti Biacore ili KinExA instrumente, ELISA testove ili testove kompetitivnog vezivanja koji su poznati prosečnom stručnjaku.
[0088] Antagonistička antitela koja se vezuju sa datlm TLR3 homologom sa željenim afinitetom mogu biti Izabrana iz biblioteke varijanti ili fragmenata raznim tehnikama uključujući sazrevanje afiniteta antitela. Antagonistička antitela mogu biti identifikovana na osnovu njihove inhibicije biološke aktivnosti TLR3, pomoću bilo kog pogodnog postupka. Takvi postupci mogu koristiti testove reporterskog gena ili merenje proizvodnje citokina korišćenjem poznatih metoda i kao što je opisano u ovoj prijavi.
[0089] Sledeća varijanta ovog pronalaska je vektor koji sadrži najmanje jedan polinukleotid iz ovog pronalaska. Takvi vektori mogu biti plazmidni vektori, virusni vektori, vektori za ekspresiju bakulovirusa, vektori na bazi transponzona ili bilo koji drugi vektor pogodan za uvođenje polinukleotida iz pronalaska u dati organizam ili genetičku osnovu pomoću bilo kog sredstva.
[0090] Ovde je takođe otkrivena ćelija domaćin koja sadrži polinukleotide kao što je polinukleotid koji kodira pollpeptid koji sadrži varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 159, 198, 200, 202, 164, 212, 213, 214, 215 ili 216 ili varijabilni region imunoglobulinskog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 , 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 122, 123, 197, 199, 201, 163, 209 ili 210.
[0091] Ovde je takođe otkrivena ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži imunoglobulinski teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 102, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 160, 204, 206, 208, 220, 166 ili 168, ili imunoglobulinski laki lanac koji ima sekvencu aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 155, 156, 157, 158, 203, 205, 207, 165 ili 167. Takve ćelije domaćini mogu biti eukariotske ćelije, bakterijske ćelije, biljne ćelije ili arhealne ćelije. Primeri eukariotskih ćelija mogu biti ćelije sisara, insekata, ptica ili drugog životinjskog porekla. Sisarske eukariotske ćelije obuhvataju besmrtne ćelijske linije kao što su hibridoma ili mijeloma ćelijske linije poput SP2/0 Američkog Tipa Kulturne Kolekcije (American Tipe Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisburi, VViltshire, UK, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) i Ag653 (ATCC CRL -1580) mišje ćelijske linije. Primer humanih mijeloma ćelijskih linija je U266 (ATTC CRL TIB-196). Druge korisne ćelijske linije obuhvataju ćelije iz jajnika kineskog hrčka (CHO) kao što su CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) ili DG44.
[0092] Ovde je takođe otkriven postupak dobijanja antitela reaktivnog sa TLR3, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema ovom otkriću i izolovanje antitela koje je proizvela ćelija domaćin. Postupci za dobijanje antitela i njihovo prečišćavanje su dobro poznati u tehnici.
[0093] Ovde je takođe otkrivena hibridoma ćelijska linija koja proizvodi antitelo prema ovom pronalasku.
[0094] Ovde je takođe opisano izolovano antitelo ili njegov fragment koji je reaktivan sa TLR3, pri čemu antitelo vezuje najmanje jedan TLR3 aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koju čine (a) ostaci K467, R488 ili R489 sa SEK ID BR:2; (b) ostatak K467 iz SEK ID BR: 2; (c) ostatak R489 SEK ID BR: 2; (d) ostaci K467 i R489 SEK ID BR: 2; i (e) ostaci K467, R488 i R489 od SEK ID BR: 2. Izolovano antitelo može dalje da veže najmanje jedan TLR3 aminokiselinski ostatak odabran od ostataka 1465, 1468, N517, D536, K538, H539, N541, E570 ili K619 iz SEK ID BR:2.
[0095] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili njegov fragment, pri čemu se antitelo vezuje najmanje za TLR3 aminokiselinski ostatak izabran iz grupe koju čine ostaci D116 ili K145 iz SEK ID BR: 2.
[0096] Nekoliko poznatih metodologija može biti korišćeno da se odredi vezujući epitop za antitela iz predmetnog pronalaska. Na primer, kada su poznate strukture obe pojedinačne komponente, može se izvršitiin Stlicoprotein-protein doking da se identifikuju kompatibilna mesta interakcije. Izmena vodonik-deuterijum (H/D) se može izvesti sa kompleksom antigen i antitelo da se mapira region na antigenu za koji se antitelo može vezati. Mutageneza usmerena na segment ili na mesto antigena se može koristiti za lociranje aminokiselina važnih za vezivanje antitela. Za velike proteine poput TLR3, mapiranje mutagenezom usmerenom na mesto je pojednostavljeno kada se vezujuće mesto prvo lokalizuje u određenom regionu na proteinu, npr. pomoću dokinga, mutageneze usmerene na segment ili H/D Izmene.
[0097] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo ili njegov fragment reaktivan sa TLR3 koji se takmiči sa monoklonskim antitelom za vezivanje sa TLR3, pri čemu monoklonsko antitelo sadrži aminokiselinske sekvence regiona teškog lanca koji određuju komplementarnost (CDRs) 1, 2 i 3, kao što je prikazano u SEK ID BR: 82, 86 i 84 i amino kiselinske sekvence lakog lanca CDR 1, 21 3, kao što je prikazano u SEK ID BR: 79, 801 87; ili aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona (VH) teškog lanca, kako je prikazano u SEK ID BR: 216 i aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona (VL) lakog lanca, kao što je prikazano u SEK ID BR: 41. Primeri monoklonskih antitela iz ovog pronalaska su izolovano antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 216, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR:41, i antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 214 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 211.
[0098] Kompeticija vezivanja za TLR3 može biti procenjenaIn vitro,korišćenjem dobro poznatih postupaka. Na primer, vezivanje MSD sulfo-Tag™ NHS-estar-obeleženih antitela za TLR3 u prisustvu neobeleženog antitela se može proceniti pomoću ELISA testa. Primer antitela prema pronalasku je mAt 15. Drugi primeri antitela iz ovog pronalaska su mAt 12 i mAtC1811 (vidi Tabelu 3a). Prethodno opisana anti-TLR3 antitela c1068 i njihovi derivati (opisana u PCT Publ. No. VVO06/ 060513A2), TLR3.7 (eBiosdences, cat. no 14-9039) i lmgenex IMG-315A (lmgenex IMG-315A; generisani protiv hunanih TLR3 aminokiselina. Aminokiseline 55-70, VLNLTHNOJ-RRLPAAN) ne konkurišu za vezivanje za TLR3 sa mAt 12 15 Ilid811 kao što je prikazano u Primeru 5.
[0099] Sledeći aspekt pronalaska je izolovano antitelo reaktivno sa TLR3 koje obuhvata sekvence navedene u zahtevima, pri čemu antitelo ima najmanje jedno od sledećih svojstava: a. smanjuje>50% biološku aktivnost humanog TLR3 uin vitropoly(l:C) NF-kB testu reporterskog gena pri <1pg/ml; b. inhibira > 60% produkciju IL-6 ili CXCL5/IP-10 iz BEAS-2B ćelija stimulisanih sa < 100 ng/ ml poly(l:C) pri <10 pg/ml; c. inhibira > 50% produkciju IL-6 ili CXCL5/IP-10 iz BEAS-2B ćelija stimulisanih sa <100 ng/ ml poly(l:C) pri < 0.4 pg/ml; d. inhibira > 50% produkciju IL-6 iz NHBE ćelija stimulisanih sa 62.5 ng/ml poly(l:C) pri <5 pg/ml;
e. inhibira > 50% produkciju IL-6 iz NHBE ćelija stimulisanih sa 62.5 ng/ml poly(l:C) pri <1pg/ml;
f. inhibira > 20% produkciju IFN-y, IL-6 ili IL-12 iz PBMC ćelija indukovanu sa poly(l:Q pri < 1 pg/ml.
g. Inhibira cinomologus TLR3 biološku aktivnost u inWrroNF-kB testu reporterskog gena sa IC50 < 10 pg/ml; ili h. inhibira cinomologus TLR3 biološku aktivnost uin vitroISRE testu reporterskog gena sa IC50 <5 pg/ml.
Metode lečenla
[0100] TLR3 antagonisti prema ovom pronalasku, na primer antitela TLR3 antagonisti se mogu koristiti za modulaciju imunog sistema. Bez želje da se vežemo za bilo koju teoriju, antagonisti iz pronalaska mogu da moduliraju imuni system za prevenciju ili smanjenje vezivanja liganada za TLR3, dimerizacijom TLR3, TLR3 internalizacijom ili migracijom TLR3. Izolovano antitelo ili njegov fragment prema ovom pronalasku može da se koristi za lečenje animalnog pacijenta koji pripada bilo kojoj klasifikaciji. Primeri takvih životinja uključuju sisare kao što su ljudi, glodari, psi, mačke i domaće životinje. Na primer, antitela iz ovog pronalaska su korisna za antagonizaciju TLR3 aktivnosti, u lečenju zapaljenja, inflamatornih i metaboličkih bolesti, a takođe su korisna za pripremu leka za takvo lečenje pri čemu se medikament za davanje priprema u dozama kako je ovde definisano.
[0101] Generalno, inflamatorna stanja, stanja povezana sa infekcijom ili imunski-posredovani inflamatorni poremećaji koji se mogu sprečiti ili lečiti administracijom antitela TLR3 antagonista iz ovog pronalaska, uključujući stanja posredovana citoklnima ili hemokinima i stanja koja u celini ili delimično proističu od aktivacije TLR3 ili signalizacije TLR3 puta. Primeri takvih inflamatornih stanja uključuju sa sepsom udružena stanja, inflamatorne bolesti creva, autoimune poremećaje, Inflamatorne poremećaje i stanja povezana sa Infekcijom. Takođe se smatra da se kanceri, kardiovaskularna 1 metabolička stanja, neurološka 1 fibrotična stanja mogu sprečiti ili lečiti davanjem antitela TLR3 antagonista iz ovog pronalaska. Zapaljenje može pogoditi tkivo ili može biti sistemsko. Primeri pogođenih tkiva su respiratorni trakt, pluća, gastrointestinalnl trakt, tanko crevo, debelo crevo, debelo crevo, rektum, kardiovaskularni sistem, srčano tkivo, krvni sudovi, zglobovi, kosti i sinovijalna tkiva, hrskavica, epitel, endotel, jetra ili adipozno tkivo. Primeri sistemskih inflamatornih stanja su citokinska oluja ili hipercitoklnemija, sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), graft protiv domaćina (eng. graft versus host disease, GVHD), akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), teški akutni respiratorni distres sindrom (SARS), katastrofalni antifosfolipldni sindrom, teške virusne Infekcije, Influenca, pneumonija, šok ili sepse.
[0102] Upala je zaštitni odgovor kojim se organizam brani od invazivnog agensa. Upala je kaskadni događaj koji uključuje mnoge ćelijske i humoralne medijatore. S jedne strane, suzbijanje inflamatornih odgovora može da ostavi domaćina imunokompromitovanim; međutim, ako se ne kontroliše zapaljenje može dovesti do ozbiljnih komplikacija, uključujući hronične inflamatorne bolesti (npr. astma, psorijaza, artritis, reumatoidni artritis, multlpla skleroza, inflamatorna bolest creva i slično), septlčki šok 1 otkazivanje više organa. Što Je najvažnije, ova različita bolesna stanja dele zajedničke inflamatorne medijatore, poput citokina, hemokina, inflamatornih ćelija i drugih posrednika koje luče ove ćelije.
[0103] Aktivacija TLR3 od strane njihovih liganda poly(l:C), dsRNK ili endogene mRNK dovodi do aktivacije signalnih puteva koja dovodi do sinteze 1 sekrecije proinflamatornih citokina, aktivacije i regrutacije inflamatornih ćelija, kao što su makrofagi, granulociti, neutrofili i eozinofili, do ćelijske smrti i razaranja tkiva. TLR3 indukuje sekreciju IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a, MIP-1, CXCL5/IP-10 i RANTES i drugih pro-inflamatornih citokina i hemokina umešanih u regrutovanje i aktivaciju imunih ćelija, doprinoseći tako destrukciji tkiva kod autoimunih 1 drugih upalnih obolenja. TLR3 ligand endogena iRNK se oslobađa iz nekrotičnih ćelija tokom inflamacije, i može da dovede do pozitivne povratne sprege za aktiviranje TLR3 i održavanje upale i dalje oštećenje tkiva. TLR3 antagonisti, kao što su antitela TLR3 antagonisti, mogu da normalizuju sekreciju citokina, smanje regrutaciju inflamatornih ćelija, i smanje oštećenje tkiva i umiranje ćelija. Stoga, TLR3 antagonisti imaju terapijski potencijal za lečenje inflamacije i spektra inflamatornih stanja.
[0104] Jedan primer inflamatornog stanja je sa sepsom udruženo stanje koje može obuhvatati sindrom sistemskog inflamatornog odgovora (SIRS), septični šok ili sindrom multiple organske disfunkcije (MODS). dsRNK oslobođena virusnom, bakterijskom, gljivičnom ili parazitskom infekcijom i od strane nekrotičnih ćelija može doprineti pojavi sepse. Bez želje da se vežemo za jednu određenu teoriju, veruje se da tretman sa antagonistima TLR3 može obezbediti terapeutski benefit produžavanjem preživljavanja kod pacijenata koji pate od inflamatornih stanja povezanih sa sepsom ili sprečavanjem da se lokalni inflamatorni događaj (npr. u plućima) proširi i postane sistemsko stanje, pojačavanjem urođene antimikrobne aktivnosti, demonstriranjem sinergijske aktivnosti u kombinaciji sa antimikrobnim lekovima, minimiziranjem lokalnog zapaljenskog stanja koje doprinosi patologiji, ili kombinacijom svega navedenog. Takva intervencija može biti dovoljna da omogući dodatni tretman (npr. tretman osnovne infekcije ili smanjenje nivoa citokina) neophodan da se osigura preživljavanje pacijenta. Sepsa može biti modelovana kod životinja kao što su miševi, adminstracijom D-galaktozamina i poly(l:C). U takvim modelima, D-galaktozamin je hepatotoksin koji funkcioniše kao sensitizer sepse a poly(l:C) je molekul izazivač sepse, koji imitira dsRNA i aktivira TLR3. Tretman antagonistima TLR3 može da poveća stope preživljavanja životinja u mišjem modelu sepse, tako da TLR3 antagonisti mogu biti korisni u lečenju sepse.
[0105] Gastrointestinalna inflamacija je inflamacija mukoznog sloja gastrointestinalnog trakta, i obuhvata akutna i hronična inflamatorna stanja. Akutnu inflamaciju generalno karaktertšu kratko vreme nastanka i infiltracija ili priliv neutrofila. Hroničnu inflamaciju generalno karakteriše relativno duži period nastanka i infiltracija ili priliv mononuklearnih ćelija. Mukozni sloj može biti sluznica creva (uključujući tanko crevo i debelo crevo), rektuma, želuca ili usne duplje. Primeri hroničnih gastrointestinalnih inflamatornih stanja su inflamatorna bolest creva (IBD), kolitis izazvan uticajem okoline (npr. gastrointestinalno zapaljenje (npr. kolitis) izazvan ili povezan sa (npr. kao nuspojavom) terapeutskim režimom, poput primene hemoterapije, radioterapije i slično), Infektivni kolitis, ishemljski kolitis, kolageni 111 limfocitnl kolitis, nekrotizirajući enterokolltis, kolitis u stanjima kao što su hronična granulomatozna bolest ili celijakija, alergije na hranu, gastritis, infektivni gastritis ili enterokolitis (npr. hronični aktivni gastritis uzrokovan bakterijom Helicobacter pylori) i drugi oblici gastrointestinalnih zapaljenja izazvanih infektivnim agensom.
[0106] Inflamatorna bolest creva (IBD) obuhvata grupu hroničnih inflamatornih poremećaja generalno nepoznate etiologije, npr. ulcerativni kolitis (UC) i Kronovu bolest (CD). Klinički i eksperimentalni dokazi ukazuju na to da je patogeneza IBD multi-faktorska I ona uključuje susceptibilnost gena i faktore okoline. Kod Inflamatorne bolesti creva, oštećenje tkiva nastaje usled neodgovarajućeg ili preteranog imunog odgovora na antigene crevne mikroflore. Postoji nekoliko životinjskih modela za inflamatorne bolesti creva. Neki od najčešće korišćenih modela su kolitis model indukovan smešom 2,4,6-trinitrobenesulfonska kiselina/etanol (TNBS) ili okazalon model, koji indukuje hroničnu upalu i ulceraciju u kolonu (Neurath et al., Intern. Rev. Immunol 19:51-62, 2000). Drugi model koristi dekstran sulfat natrijuma (eng. dextran sulfate sodium" DSS), koji indukuje akutni kolitis koji manifestuje krvavu dijareju, gubitak težine, skraćenje kolona i ulceracije sluzokože sa infiltracijom neutrofila. DSS-indukovani kolitis se histološki odlikuje infiltracijom upalnih ćelija u vezivnom tkivu, uz limfoidnu hiperplaziju, fokalnim oštećenjem kripte, i ulceracijama epitela (Hendrickson et al., Clinical Microbiology Revievvs 15:79-94, 2002). Drugi model podrazumeva adoptivni transfer naivnih CD45RB<hl>,<h>CD4 T ćelija u RAG ili SCID miševima. U ovom modelu, donatorske naivne T ćelije napadaju creva primaoca izazivajući hroničnu upalu creva 1 simptome slične ljudskim zapaljenskim bolestima creva (Read and Powrie, Curr. Protoc. Immunol. Chapter 15 unit 15.13, 2001). Administracija antagonista iz predmetnog pronalaska u bilo kojem od ovih modela se može koristiti za procenu potencijalne efikasnosti ovih antagonista za poboljšanje simptoma i pramenu toka bolesti povezanih sa inflamacijom u crevima, kao što je inflamatorna bolest creva. Dostupno je nekoliko opcija za lečenje IBD, na primer decenljama su korišćene terapije anti-TNF-a antitelima za lečenje Kronove bolesti (Van Assche et al., Eur. J. Pharmacol. Epub Oct. 2009). Međutim, značajan procenat pacijenata je otporan na postojeće tretmane (Hanauer et al., Lancet 359:1541-1549, 2002; Hanauer et al. Gastroenterologija 130:323-333, 2006), zbog čega su potrebne nove terapije koje ciljaju ove otporne populacije pacijenata.
[0107] Još jedan primer inflamatornog stanja je stanje upale pluća. Primeri stanja upale pluća uključuju plućna stanja uzrokovana infekcijom uključujući i ona udružena sa virusnim, bakterijskim, gljivičnim, parazitskim ili prionsklm infekcijama; alergenom-indukovana stanja disajnih organa; polutantom-indukovana stanja disajnih organa poput azbestoze, silikoze ili berllloze; plućna stanja indukovana aspiracijom gastričnog sadržaja, imuno-disregulacija, inflamatorna stanja sa genetskom predispozicijom, kao kao što su cistična fibroza, i fizičkom traumom indukovana pulmonalna stanja, povreda pluća u toku veštačke ventilacije. Ovi inflamatorna stanja takođe obuhvataju astmu, emfizem, bronhitis, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (HOBP), sarkoidozu, histiocitozu, limfangiomiomatozu, akutnu povredu pluća, akutni respiratorni distres sindrom, hroničnu bolest pluća, bronhopulmonalnu displaziju, pneumoniju stečenu u zajednici, nozokomijalnu pneumoniju, pneumoniju usled veštačke ventilacije, sepsu, virusnu pneumoniju, influencu, parainfluencu, rotavirusnu infekciju, humani metapneumovirus, respiratornu sincitialnu virusnu Infekciju i aspergillus ili druge gljivične infekcije. Primeri sa infekcijom povezane inflamatorne bolesti mogu uključivati virusne ili bakterijske pneumonije, uključujući tešku upalu pluća, cističnu fibrozu, bronhitis, egzacerbacije vazdušnih puteva i akutni respiratorni distres sindrom (ARDS). Takva sa infekcijom udružena stanja mogu obuhvatati višestruke infekcije kao što su primarne virusne Infekcije t sekundarne bakterijske infekcije .
[0108] Astma je inflamatorna bolest pluća koju karakteriše hiperosetljivost disajnih puteva ("AHR"), bronhokonstrikcija, šištanje, eozinofilna ili neutrofilna inflamacija, hipersekrecija mukusa, subepitelijalna fibroza i povišeni nivoi IgE. Pacijenti sa astmom doživljavaju "egzacerbacije", pogoršanje simptoma, najčešće zbog infekcija respiratornog trakta (npr. rinovirus, virus gripa, Hemofilus grip, itd). Asmatični napadi mogu biti izazvani faktorima okoline (npr. askaride, insekti, životinje (npr. mačke, psi, zečevi, miševi, pacovi, hrčci, zamorci i ptice), gljive, zagađivači vazduha (npr., duvanskl dim), nadražujući gasovi, dim, pare, aerosoli, hemikalije, polen, vežbe, ili hladan vazduh. Osim astme, nekoliko hroničnih inflamatornih bolesti koje pogađaju pluća karakteriše infiltracija neutrofila u disajne puteve, na primer hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), bakterijske pneumonije i cistična fibroza (Linden et al., Eur. Respir. J. 15:973-977, 2000; Rahman et al., Clin. Immunol. 115:268-276, 2005), a bolesti poput COPD, alergijskog rinitisa, i cistične fibroze karakteriše hiperosetljivost disajnih puteva (Fahy i 0'Byrne, Am. J. Crit. Care Med. 163: 822-823, 2001). Uobičajeno korišćeni životinjski modeli za astmu i upale disajnih puteva uključuju model izazova ovalbumlnom i modele senzibilizaclje metaholinom (Hessel et al., Eur. J. Pharmacol. 293:401-412, 1995). Inhibicija proizvodnje citokina i hemokina iz kultlvlsanih humanih bronhijalnih epitelnih ćelija, bronhijalnih fibroblasta ili glatkih mišićnih ćelija disajnih puteva se takođe mogu koristiti kaoin vitromodeli. Administracija antagonista iz predmetnog pronalaska u bilo kojem od ovih modela se može koristiti za procenu upotrebe tih antagonista za ublažavanje simptoma i promenu toka astme, zapaljenja disajnih puteva, COPD i slično.
[0109] Druga inflamatorna stanja 1 neuropatije, koje mogu biti sprečene ili tretirane izolovanim antitelom ili njegovim fragmentom iz pronalaska su ona Izazvana autoimunim bolestima. Ova stanja i neuropatije obuhvataju multiplu sklerozu, sistemski eritematozni lupus, neurodegenerativne poremećaje i poremećaje centralnog nervnog sistema (CNS), uključujući Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, Hantingtonovu bolest, bipolarni poremećaj 1 Amiotrofnu Lateralnu Sklerozu (ALS), bolesti jetre uklučujući primarnu bilijarnu cirozu, primarni sklerozantni holangltis, nealkoholna bolest masne jetre/steatohepatitls, fibrozu, hepatitis C virus (HCV) i hepatitis B virus (HBV), dijabetes i insulinsku rezistenciju, kardiovaskularne poremećaje uključujući aterosklerozu, cerebralnu hemoragiju, moždani udar i infarkt mlokarda, artritis, reumatoidni artritis, psorijatičkl artritis i juvenilni reumatoidni artritis (JRA), osteoporozu, osteoartritis, pankreatitis, fibrozu, encefalitis, psoriazu, artritis džinovskih ćelija, ankilozni spondilitis, autoimuni hepatitis, virus humane imunodeficijencije (HIV), inflamatorna stanja kože, transplant, kancer, alergije, endokrina obolenja, zarastanje rana, druge autoimune poremećaje, hiperosetljivost disajnih puteva i ćelijske, virusne ili prion-posredovane infekcije ili poremećaje.
[0110] Artritis, uključujući osteoartritis, reumatoidni artritis, artritični zglobovi kao rezultat povrede i slično, su uobičajena inflamatorna stanja koja bi imala koristi od terapijske upotrebe anti-inflamatornih proteina, kao što su antagonisti iz predmetnog pronalaska. Na primer, reumatoidni artritis (RA) je sistemska bolest koja utiče na celo telo i predstavlja jedan od najčešćih oblika artritisa. Pošto reumatoidni artritis dovodi do oštećenja tkiva, TLR3 Ugandi mogu biti prisutni na mestu inflamacije. Aktiviranje TLR3 signalizacije može održavati upalu 1 dalje oštećenje tkiva u upaljenom zglobu. Nekoliko životinjskih modela reumatoidnog artritisa je poznato u struci. Na primer, u kolagenom-indukovanom artritis (CIA) modelu, miševi razvijaju hronični inflamatorni artritis koji je veoma sličan humanom reumatoidnom artritisu. Administracija TLR3 antagonista prema prikazanom pronalasku u CIA murinskom modelu može biti upotrebljena za procenu korišćenja ovih antagonista za poboljšanje simptoma i promenu toka bolesti.
[0111] Dijabetes melitus, dijabetes, se odnosi na proces bolesti izveden iz višestrukih uzročnih faktora, a karakteriše ga hiperglikemija (LeRoith et al., (eds.), Diabetes Mellitus, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa. U.S.A. 1996), i sve tamo navedene reference. Nekontrolisana hiperglikemija je udružena sa povećanom i preranom smrtnosti zbog povećanog rizika za mikrovaskularne i makrovaskularne bolesti, uključujući nefropatiju, neuropatiu, retinopatiju, hlpertenzlju, cerebrovaskularne bolesti i koronarne srčane bolesti. Dakle, kontrola homeostaze glukoze je kritično važan pristup za lečenje dijabetesa.
[0112] Osnovni defekti dovode do klasifikacije dijabetesa u dve glavne grupe: dijabetes tipa I (insulin zavisni dijabetes melitus, IDDM), koji nastaje kada pacijentima nedostaju beta-ćelije koje proizvode insulin u svojim žlezdama pankreasa, i dijabetes tipa 2 (insulin nezavisni dijabetes melitus, NIDDM), koji se javlja kod pacijenata sa abnormalnim lučenjem insulina od strane beta-ćelija i/ili rezistencijom na dejstvo insulina.
[0113] Tip 2 dijabetesa se odlikuje insulinskom rezistencijom koju prati relativni, umesto apsolutnog, nedostatak insulina. Kod pojedinaca rezistentnih na insulin, telo luči abnormalno visoke količine insulina kako bi kompenzovalo ovaj poremećaj. Kada su prisutne količine insulina neadekvatne za kompenzaciju insulinske rezistencije i adekvatnu kontrolu glukoze, razvija se stanje poremećene tolerancije na glukozu. Kod značajnog broja pojedinaca, lučenje insulina dalje opada i raste nivo glukoze u plazmi, što dovodi do kliničkog stanja dijabetesa. Sa adipocitima udružena inflamacija je snažno uključena u razvoj insulinske rezistencije, dijabetesa tipa 2, dislipidemije i kardiovaskularne bolesti. Gojazno masno tkivo regrutuje i zadržava makrofage i može da proizvede prekomerne pro-inflamatorne citokine, uključujući TNF-a i IL-6, slobodne masne kiseline i adipokine, što može ometati insulinsku signalizaciju i indukovati insulinsku rezistenciju. Aktivacija TLR3 na makrofagima može doprineti pro-inflamatornom statusu adipoznog tkiva. Poznato je nekoliko animalnih modela insulinske rezistencije. Na primer, kod modela gojaznosti indukovane ishranom (DIO) životinje razvijaju hiperglikemiju i insulinsku rezistenciju praćenu gojenjem. Administracija TLR3 antagonsita iz ovog pronalaska u (DIO) modelu može biti upotrebljena za procenu upotrebe antagonista za ublažavanje komplikacija povezanih sa dijabetesom tipa 2 i promenu toka bolesti.
[0114] Primeri kancera mogu uključivati najmanje jednu malignu bolest u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali ne ograničavajući se na leukemiju, akutnu leukemiju, akutnu limfoblastičnu leukemiju (ALL), ALL B-ćelija ili T-ćelija, akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), hroničnu mijelocitnu leukemiju (CML), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), leukemija dlakastih ćelija, mijelodisplastični sindrom (MDS), limfom, Hodgkin-ovu bolest, maligni limfom, ne-Hodgkin-ov limfom, Burkitov limfom, multipli mijelom, Kapošijev sarkom, kolorektalni karcinom, karcinom pankreasa, karcinom renalnih ćelija, karcinom dojke, karcinom nazofarinksa, malignu histiocitozu, paraneoplastični sindrom/hiperkalcemija kod maligniteta, čvrste tumore, adenokarcinome, karcinome skvamoznih ćelija, sarkom, maligni melanom, a posebno metastatski melanom, hemangiom, metastatsku bolest, resorpciju kostiju zbog malignih bolesti i bol povezan sa karcinomom kostiju.
[0115] Primeri kardiovaskularnih bolesti mogu da uključe kardiovaskularne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacijentu, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sindrom srčanog šoka, infarkt miokarda, kongestivnu srčanu insuficijenciju, slog, ishemični moždani udar, krvarenje, arteriosklerozu, aterosklerozu, restenozu, dijabetesnu aterosklerozu, hipertenziju, arterijsku hipertenziju, renovaskularnu hipertenziju, sinkopu, šok, sifilis kardiovaskularnog sistema, srčanu insuficijenciju, plućno srce, primarnu plućnu hipertenziju, srčane aritmije, atrijalne ektopične otkucaje, atrijalni flater, atrijalne fibrilacije (permanentna ili paroksizmalna), post-perfuzioni sindrom, inflamatorni odgovor na kardiopulmonalni bajpas, haotičnu ili multifokalnu atrijalnu tahikardiju, regularnu tahikardiju sa uskim QRS, specifične aritmije, ventrikularnu fibrilaciju, aritmije His snopa, atrioventirkularni blok, blok grane snopa, ishemijsku bolest srca, bolest koronarnih arterija, anginu pektoris, infarkt miokarda, kardiomiopatiju, dilatativnu kongestivnu kardiomiopatiju, restriktivnu kardiomiopatiju, valvularno srčano oboljenje, endokarditis, perikardni izliv, srčane tumore, aneurizme aorte i perifernih arterija, aortnu disekciju, upalu aorte, okluziju abdominalne aorte i njene grane, periferne vaskularne poremećaje, okluzivne arterijske poremećaje, perifernu aterosklerotičnu bolest, thromboangitis obliterans, funkcionalne poremećaje perifernih arterija, Reinoov fenomen, akrocijanozu, eritromelalgiju, venske bolesti, vensku trombozu, proširene vene, arteriovenske fistule, limfedem, lipedem, nestabilnu anginu, reperfuzionu povredu, post perfuzioni sindrom i ishemijsku reperfuzionu povredu.
[0116] Primeri neuroloških oboljenja mogu obuhvatati neurološko oboljenje ćelije, tkiva, organa, životinje ili pacijenta, uključujući, ali ne ograničavajući se na neurodegenerativne bolesti, multiplu sklerozu, migrensku glavobolju, kompleks AIDS demencije, demijellnizirajuće bolesti kao što je multipla skleroza i akutni transverznt mijelitis; ekstrapiramidalne i cerebelarne poremećaje, kao što su lezije kortikospinalnog sistema; poremećaji bazalnih ganglija ili cerebelarni poremećaji; hiperkinetičke poremećaje kao što je Hantingtonova Horea i senilna horea; lekovima indukovani poremećaji kretanja, poput indukovanih tekovima koji blokiraju CNS dopaminske receptore; hipokinetičke poremećaje kretanja, kao što su Parkinsonova bolest, Progresivna supranuklearna paraliza; strukturne lezije cerebeluma; spinocerebelarne degeneracije, kao što su kičmene ataksije, Fridrajhova ataksija, cerebelarne kortikalne degeneracije, višesistemske degeneracije (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi- Drager, i Machado-Joseph); sistemski poremećaji (Refsum-ova bolest, abetalipoproteinemija, ataksija, teleangiektazija i multisistemski poremećaj mitohondrija); demijelinizacioni poremećaji kao što su multipla skleroza, akutni transverzni mijelitis; i poremećaji motornog neurona poput neurogene mišićne atrofije (degeneracija ćelija prednjeg roga, kao što je amiotrofična lateralna skleroza, infantilna mišićna atrofija i juvenilna spinalna mišićna atrofija); Alzhajmerova bolest; Daunov sindrom u srednjem dobu; Difuzna bolest Levijevih tela; Senilna demencija sa Levijevim telima; Vernike-Korsakov sindrom; hronični alkoholizam; Krojcfeld Jakobova bolest; subakutni sklerozni panencefalitis, Hallervorden-Spatzova bolest i Demencija pugilistika.
[0117] Primeri fibrotičnih stanja mogu uključivati fibrozu jetre (uključujući ali ne ograničavajući se na alkoholom indukovanu cirozu, virusno Indukovanu cirozu, autoimuno indukovani hepatitis); fibrozu pluća (uključujući ali ne ograničavajući se na sklerodermu, Idlopatsku plućnu fibrozu); fibrozu bubrega (uključujući ali ne ograničavajući se na sklerodermu, dijabetski nefritis, glomerularni nefritis, lupus nefritis); dermalnu fibrozu (uključujući ali ne ograničavajući se na sklerodermu, hipertrofičnl i keloidni ožlljak, opekotine); mijelofibrozu; neurofibromatozu; fibrom; Intestinalnu fibrozu; i fibrozne priraslice usled hirurške procedure. U takvom postupku, fibroza može biti organ specifična fibroza ili sistemska fibroza. Organ specifična fibroza može biti povezana sa najmanje jednim od sledećeg; plućna fibroza, fibroza jetre, fibroza bubrega, fibroza srca, vaskularna fibroza, fibroza kože, fibroza očiju, fibroza koštane srži ili druga fibroza. Fibroza pluća može biti povezana sa najmanje jednim od sledećeg: idiopatska pulmonarna fibroza, lekovima Indukovana plućna fibroza, astma, sarkoidoza ili hronična opstruktivna bolest pluća. Fibroza jetre može biti povezana sa najmanje jednim od sledećeg: ciroza, šistosomijaza ili holangitis. Ciroza može biti izabrana između alkoholne ciroze, post-hepatitis C ciroze, primarne bilijarne ciroze. Holangitis je sklerozirajući holangitis. Fibroza bubrega može biti povezana sa dijabetičkom nefropatijom ili lupus glomerulosklerozom. Vaskularna fibroza može biti povezana sa infarktom miokarda. Vaskularna fibroza može biti povezana sa postangioplastičnom arterijskom restenozom ili aterosklerozom. Fibroza kože može biti povezana sa ožiljcima od opekotina, hipetrofičnih ožiljaka, keloidom ili nefrogenom fibroznom dermopatijom. Očne fibroze mogu biti povezane sa retro-orbitalnom fibrozom, postkataraktnom hirurškom ili proliferativnom vitreoretinopatijom. Fibroza koštane srži može biti povezana sa idiopatskom mijelofibrozom ili lekovima indukovanom mijelofibrozom. Druge fibroze mogu biti izabrane između Pejronijeve bolesti, Dipitrenove kontrakture ili dermatomiozitisa. Sistemska fibroza može biti sistemska skleroza ili graft versus host bolest.
Administarcija/Fa rmaceutske kompozicije
[0118] "Terapeutski efikasna količina" pomenutog agensa efikasna u lečenju ili prevenciji stanja u kojem je poželjno potiskivanje TLR3 aktivnosti može biti određena standardnim tehnikama istraživanja. Na primer, doza agensa koja će biti efikasna u lečenju 111 prevenciji inflamatornih stanja kao što su astma, Kronova bolest, ulceroznl kolitis ili reumatoidni artritis se može odrediti admlnistriranjem agensa u relevantnim animanim modelima, kao što su modeli koji su ovde opisani.
[0119] Pored toga, opciono mogu biti korišćeniin vitrotestovi da pomognu u identifikovanju optimalnih opsega doze. Izbor određene efektivne doze mogu odrediti (npr. kliničkim ispitivanjima) oni koji su verzirani u stanje tehnike na osnovu razmatranja nekoliko faktora. Takvi faktori uključuju bolest koju treba lečiti ili sprečiti, simptome, pacijentovu telesnu masu, Imuni status pacijenta i druge faktore poznate prosečnom stručnjaku. Precizna doza koja će se koristiti u formulaciji takođe zavisi od načina davanja 1 ozbiljnosti bolesti, i treba da bude određena u skladu sa procenom lekara i stanja svakog pacijenta. Efektivne doze se mogu ekstrapolirati sa krivih doza-odgovor izvedenih iz sitema ispitivanjaIn vitroili u animalnim modelima.
[0120] U terapijskim primenama prema pronalasku, TLR3 antagonist se može administrirati sam ili u kombinaciji sa najmanje Jednim drugim molekulom. Takvi dodatni molekuli mogu biti drugi TLR3 antagonistički molekuli ili molekuli sa terapeutskim benefitom koji nije posredovan signalizacijom TLR3 receptora. Antibiotici, antivirali, palijativi i druga jedinjenja koja smanjuju nivoe ili aktivnost citokina su primeri takvih dodatnih molekula.
[0121] Način administracije za terapeutsku primenu agensa iz ovog pronalaska može biti bilo koji pogodan put kojim se domaćinu isporučuje agens. Farmaceutske kompozicije ovih agenasa su naročito korisne za parenteralnu administraciju, npr. intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, Intravensku, subkutanu ili intranazalnu.
[0122] Agens prema ovom pronalasku može biti pripremljen u obliku farmaceutskih kompozicija koje sadrže efikasnu količinu agensa kao aktivni sastojak u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Termin "nosač" se odnosi na dfluent, adjuvans, ekscipljens ili sredstvo sa kojim se aktivno jedinjenje daje. Takvi farmaceutski nosači mogu biti tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući ulja naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Na primer, mogu se koristiti 0.4% slani rastvor i 0.3% glicin. Ovi rastvori su sterilni 1 generalno bez partikulata. Mogu biti sterilisani konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije (npr. filtraclja). Ove kompozicije po potrebi mogu sadržati farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance za približavanje fiziološkim uslovima kao što su sredstva za podešavanje pH i puferi, stabilizatori, ugušćivači, lubrikanti i agensi za bojenje itd. Koncentracija agensa iz ovog pronalaska u takvoj farmaceutskoj formulaciji može široko varirati, odnosno, od manje od oko 0.5%, obično od ili najmanje oko 1% do čak 15 ili 20 % težinskih, a biće izabrana prvenstveno na bazi potrebne doze, zapremine tečnosti, viskoznosti, itd, u zavisnosti od konkretnog načina administracije koji je izabran.
[0123] Prema tome, farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska za intramuskularne injekcije može biti pripremljena da sadrži 1 ml sterilne puferovane vode, i između oko 1 ng do oko 100 mg, npr. oko 50 ng do oko 30 mg ili još poželjnije, oko 5 mg do oko 25 mg, antitela TLR3 antagonista iz ovog pronalaska. Slično tome, farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska za intravensku infuziju može biti pripremljena da sadrži oko 250 ml sterilnog Ringerovog rastvora, i oko 1 mg do oko 30 mg i poželjno 5 mg do oko 25 mg antagonista iz pronalaska. Stvarni postupci za pripremanje kompozicija koje se mogu primeniti parenteralno su dobro poznati i opisani su detaljnije u, npr. "Remington Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Companv, Easton, PA.
[0124] Antagonistička antitela iz ovog pronalaska mogu biti liofillzirana za skladištenje i rekonstltuisana u pogodnom nosaču pre upotrebe. Pokazano je da je ova tehnika efikasna sa konvencionalnim imunoglobullnima i proteinskim preparatima tako da se mogu upotreblti tehnike liofilizacije i rekonstitucije koje su poznate u struci.
[0125] Predmetni pronalazak će sada biti opisan pozivanjem na sledeće specifične, neograničavajuće primere.
Primer 1
Identifikacija 11zvođenje Anti- huTLR3 antagonista mAt
[0126] MorphoSvs Human Kombinatorial Antibodv Librarv (HuCAL®) Zlatna biblioteka fag-a (Morphosvs AG, Martinsried, Nemačka) je korišćena kao izvor fragmenata humanih antitela i bila selektovana protiv prečišćenog TLR3 antigena generisanog ekspresijom aminokiselina 1-703 humanog TLR3 (huTLR3) (SEK ID BR: 4) sa C-terminalnim poli-histidin tagom i prečišćen imobilisanom metal-aflnitetnom hromatografijom. Aminokiseline 1-703 odgovaraju predviđenom ekstracelularnom domenu (ECD) humanog TLR3. Fab fragmenti (Fab) koji se specifično vezuju sa huTRU ECD su izabrani prezentovanjem TLR3 proteina na različite načine tako da je raznovrstan set fragmenata antitela mogao biti identifikovan, sekvenciran i potvrđen kao jedinstven. Iz različitih strategija selekcije, identifikovana su 62 Kandidata (sekvence različitih V-regiona) za vezivanje sa huTLR3 ECD.
[0127] 62 Kandidata identifikovana za vezivanje sa huTLR3 ECD su skenirani za aktivnost neutralizacije u opsegu testova na bazi ćelije, relevantnih za identifikaciju anti-inflamatorne aktivnosti. Korišćenjem preliminarnih podataka o aktivnosti (videti Primer 2 dole), od 62 Kandidata, četiri Kandidata (Fab 16-19) koji definišu familije 16-19 su izabrani kao roditeljski za sazrevanje CDR teškog lanca CDR2 (HCDR2) i CDR3 lakog lanca (LCDR3). Jedan od roditeljskih Kandidata (Kandidat 19) je ispoljio mesto glikozilacije sa N-vezom u HCDR2; kod ovog Kandidata je izvršena mutacija Ser u Ala (S u A) da se izvrši delecija ovog mesta. Nakon sazrevanja CDR četiri roditeljska Kandidata, ukupno 15 Kandidata potomaka (Kandidati 1-15) je identifikovano za dalju karakterizaciju opisanu u Primeru 2 dole. Listing varijabilnih regiona lakog i teškog lanca prisutnih kod svakog od 19 Kandidata je prikazan u Tabeli 3 iznad. Kandidati su ovde označeni kao mAt 1-19 ili Fab 1-19, u zavisnosti da li su bili Fab fragmenti ili su klonirani kao antitela pune dužine lanaca (Primer 3). Zahvaljujući dizajnu ekspresionog vektora, zreli amino termlnusi varijabilnih regiona za sve Kandidate su QVE za teški lanac i Dl za laki lanac. Poželjne sekvence na ovim termlnusima su one u odgovarajućim genima germinalne linije sa visokim Identitetom sa sekvencama Kandidata. Za familije 17 i 18 sekvence germinalne linije su OVO. za VH ' SY za VL- Za familiju 19, sekvence su EVQ za VH i Dl za VL. Sekvenca SY je jedinstvena za lambda podgrupu 3, a postoje izveštaji o heterogenosti za S ili Y kao aminske terminalne ostatke. Dakle, QSV konsenzus terminalni kraj iz prominentne lambda podgrupe 1 je smatran pogodnijom zamenom za DIE za VL familija 17 i 18. Ove promene su uvedene kod Kandidata, 9, 10 i 12 iz familije 18. i Kandidate 14 i 15 iz familije 19. U ovom procesu, oba VH i VL regioni ovih antitela su kodonski optimizovani. Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakih lanaca N-terminatnih varijanti germinalne linije Kandidata 9, 10 i 11 su prikazane u SEK ID BR: 209-211, a aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca N-terminalnih varijanti germinalne linije Kandidata 9, 10, 12, 14, i 15 su prikazane u SEK ID BR: 212-216, respektivno. N-termlnalne varijante Kandidata se ovde nazivaju Kandidati/mAt/Fab 9QVQ/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQ ili 15EVQ. N-terminalne varijante germinalnih linija su eksprimirane kao mAt i nisu pokazale efekat vezivanja sa TLR3 ili sposobnost da inhibiraju biološku aktivnost TLR3 u poređenju sa svojim roditeljskim kopijama (podaci nisu prikazani).
Primer i
Određivanje Aktivnosti Antagonista TLR3in vitro
[0128] Gore opisani 15 CDR-zreli Kandidati su izabrani kao potencijalni humani terapeutici i određen im je opseg aktivnosti vezivanja i neutralizacije. Testovi aktivnosti i rezultati za četiri roditeljska Fab-a, Fab 16-19 i 15 CDR-zrelih Fab fragmenata, Fab 1-15 ili njihove ne-germinalne varijante V-regiona su opisani dalje u tekstu.
Inhlblclla NF- kB 1 ISRE Sienalne Kaskade
[0129] 293T ćelije su gajene u DMEM i GlutaMax medijumu (Invltrogen, Carlsbad, CA) sa dodatkom toplotno inaktivisanog FBS i transffektovane sa 30 ng pNF-KB ili ISRE reporterskih plazmida luciferaze svlca, 13.5 ng pcDNK3.1 vektora, 5 ng phRL-TK i 1.5 ng pCDNK koja kodira FL TLR3 (SEK ID BR: 2). PhRL-TK plazmid sadrži genRenillaluciferazu pokretanu od strane HSV-1 promotora timidin kinaze (Promega, Madion, Wl). TLR3 antitela su inkubirana 30-60 min pre dodavanja poly(l:C) (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Ploče su inkubirane 6h, ili 24h na 37 "C pre dodavanja reagensa Dual-Glo luciferaze, i očitane su na čitaču ploča Fluostar. Normalizovane vrednosti (odnosi luciferaza) su dobijene deljenjem RLU svica sa RLURenilla.Nakon stimulacije sa TLR3 agonistom poly(l:C) (1 pg/ml), NF-kB ili ISRE signalna kaskada koja je stimulisala produkciju luciferaze svica je posebno inhibirana inkubacijom ćelija sa antt-TLR3 antitelima (0.4, 2.0 i 10 pg/ml) pre stimulacije. Rezultati NF-kB testova su prikazani na SI. 1 i izraženi su kao % inhibldje Svitac/Renilla odnosa sa 5465 kao pozitivnom kontrolom (neutrališuće anti-humano TLR3 MAt) i anti-humanim tkivnim faktorom mAt (859) kao kontrolom za humani izotip lgG4. Inhlbicija > 50% je ostvarena sa koncentracijama mAt 0.4-10 pg/ml. c1068 i TLR3.7 su inhibirali oko 38% i 8% TLR3 biološke aktivnosti pri 10 pg/ml. Slični rezultati su dobljeni u ISRE testu reporterskog gena (podaci nisu prikazani).
Oslobađanje Citokina u BEAS- 2B ćelijama
[0130] BEAS-2B ćelije (SV-40 transformisana ćelijska linija normalnog humanog bronhijalnog epitela) su zasejane u posude obložene kolagenom tipa I i inkubirane sa ili bez anti-humanih TLR3 antitela pre dodavanja poly(l:C). Dvadeset četiri sata posle tretmana, supernatanti su sakupljeni i analizirani za nivoe citokina i hemokina pomoću prilagođenog multi-plex testa sa perlama za detekciju IL-6, IL-8, CCL-2/MCP-1, CCL5/RANTES i CXCL10/IP-10. Rezultati su prikazani na Slici. 2 kao % inhibicije pojedinačnog citokina/hemokina nakon tretmana sa mAt u koncentracijama od 0.4, 2.0 i 10 pg/ml. 5465 je pozitivna kontrola; 859 je kontrola za izotip.
Oslobađanje Citokina u NHBE ćelijama
[0131] Oslobađanje citokina je takođe testirano i u normalnim humanim bronhijalnim epitelijalnim (NHBE) ćelijama (Lonza, Walkersville, AAD). NHBE ćelije su ekspandirane i prebačene u posude obložene kolagenom i Inkubirane tokom 48 sati nakon čega je medijum uklonjen i dopunjen sa 0.2 ml svežeg medijuma. Ćelije su zatim inkubirane sa ili bez antihumanih TLR3 mAt 60 minuta, pre dodavanja poly(l:C). Supernatanti su sakupljeni nakon 24 časa i čuvani na -20" C ili odmah analizirani za nivoe IL-6. Rezultati su grafički prikazani na Slici 3 kao % Inhibicije sekrecije IL-6 nakon mAt tretmana korišćenjem doza između 0.001 i 50 pg/ml. 5465 je pozitivna kontrola, 859 je kontrola izotipa. Većina mAt je inhibirala najmanje 50 % produkciju IL-6, pri < 1 pg/ml, i postigla 75 % Inhibicije pri < 5 pg/ml.
Oslobađanje Citokina u PBMC ćelijama
[0132] Oslobađanje citokina je takođe testirano u ljudskim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC). Cela krv je uzimana od humanih donora u sabirne heparinske epruvete u koje je ispod polako postavljen sloj rastvora Ficoll-Pakue Plus. Epruvete su centrifugirane i PBMC, koje su formirale beli sloj odmah iznad Ficoll-a su izolovane i obložene. PBMC su zatim inkubirane sa ili bez anti-humaniih TLR3 mAt pre dodavanja 25 pg/ml poly(l:C). Posle 24 časa, supernatanti su sakupljeni 1 nivoi citokina su određeni korišćenjem Luminex tehnologije. Rezultati su grafički prikazani na Slici 4 kao kumulativni procenat inhibicije IFN-y, IL-12 1 IL-6 pomoću Jedne doze mAt (0.4 pg/ml) sa 5465 kao pozitivnom kontrolom; hlgG4 je kontrola izotipa.
Oslobađanje Citokina u HASM ćelijama
[0133] Ukratko, ćelije ljudskih glatkih mišića disajnih puteva eng. "human airway smooth muscle" (HASM) su inkubirane sa ili bez antl-humanih TLR3 mAt pre dodavanja sinergetske kombinacije 500 ng/ml poly(l:C) 1 10 ng/ml TNF-a. Posle 24 časa, supernatanti su sakupljeni i određeni su nivoi citokina pomoću Luminex tehnologije. Rezultati su grafički prikazani na Slici 5 kao nivoi hemokina CCL5/RANTES korišćenjem tri doze mAt (0.4, 2 i 10 ug/ml). 5465 je pozitivna kontrola; hlgG4 je kontrola izotipa.
[0134] Rezultati izin vitrotestova u humanim ćelijama potvrđuju da antitela iz pronalaska mogu da smanje oslobađanje citokina i hemokina kao rezultat vezivanja sa huTLR3.
Primer 3
Konstrukti Antitela Pune dužine
[0135] Teški lanci četiri roditeljska Fab-a (Kandidati br. 16-19) i 15 Fab potomaka (Kandidati br. 1-15) su klonirani u humanu lgG4 osnovu sa S229P Fc mutacijom. Kandidati 9Q.VQ_/QSV, 10QVQ/QSV, 12QVQ/QSV, 14EV0. ili 15EV0. su klonirani u humanu lgG4 osnovu sa F235A/L236Ai S229P Fc mutacijama.
[0136] Zrele sekvence pune dužine aminokiselina teškog lanca su prikazane u SEK ID BR: 90-102 i 218-220 kako sledi:
[0137] Za ekspresiju, ove sekvence teškog lanca mogu da sadrže N-terminalnu vodeću sekvencu kao što je MAWWWTLLFLMAAAQSIQA (SEK ID BR: 103). Primeri nukleotidnih sekvenci koje kodiraju teški lanac Kandidata 14EV0.1 15EV0. sa vodećom sekvencom i zrelom formom (bez vodeće sekvence) su prikazani u SEK ID BR: 104 1 105, respektivno. Isto tako, za ekspresiju, sekvence lakog lanca antitela prema pronalasku mogu da sadrže N-terminalnu vodeću sekvencu kao što je MGVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEK ID BR: 106). Primeri nukleotidnih sekvenci koje kodiraju laki lanac kodonski optimizovanog Kandidata 15 sa vodećom sekvencom i zrelom formom (bez vodeće sekvence) su prikazani u SEK ID BR: 107 i 108, respektivno.
Primer4
Karakterizaclia antl- TLR3 mAt vezivanja
[0138] EC50 vrednosti za vezivanje mAta sa ekstracelularnim domenom (ECD) humanog TLR3 su određene ELISA testom. Humani TLR3 ECD protein je razblažen do 2 pg/ml u PBS i alikvoti odi00 pl su podeljeni u sve velove ploče sa 96-velova (Corning Inc., Acton, MA). Posle inkubacije preko noći na 4° C, ploča je isprana 3 puta u puferu za Ispiranje koji se sastoji od 0.05% Tween-20 (Sigma-Aldrich) u PBS. Otvori su blokirani sa 200 ml rastvora za blokiranje koji se sastoji od 2% i-Block (Applied Biosvstems, Foster City, CA) i 0.05% Tween-20 u PBS. Nakon blokiranja tokom 2 časa na sobnoj temperaturi ploča je isprana 3 puta, nakon čega su dodata serijska razblaženja anti-TLR3 mAt Kandidata1do 19 u puferu za blokiranje. Anti-TLR3 mAt su inkubirana tokom 2 časa na sobnoj temperaturi i isprana 3 puta. Ovo je praćeno dodavanjem peroksidazom konjugovanog ovčijeg anti-humanog IgG (GE Healthcare, Piscataway, NJ) razblaženog 1: 4000 u puferu za blokiranje, inkubiranjem 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim ispiranjem 3 puta u puferu za ispiranje. Vezivanje je detektovano 10-15 minutnom inkubacijom u TMB-S (Fitzgerald Industries International, Inc., Concord, MA). Reakcija je zaustavljena sa 25 pl 2N H2SO<i apsorbancije su očitane na 450 nm sa subtrakcijom na 650 nm pomoću spektrofotometra SPECTRA Max (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). EC50 vrednosti su određene nelinearnom regresijom pomoću softvera GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego,
CA).
[0139] EC50 vrednosti za vezivanje za huTLR3 (Tabela 4) su određene inkubiranjem sa 100 pl četvorostrukih serijskih razblaženja mAt od 2.5 pg/ml do 0.6 pg/ml. Anti-humani tkivni faktor mAt 859 I hu lgG4Ksu uključeni kao negativne kontrole.
[0140] Afinitet vezivanja za huTLR3 ECD je takođe određen Biacore analizom. Podaci (nisu prikazani) pokazuju da su mAt 1-19 imala Kd za huTLR3 ECD manju od 10'" M.
Primer 5
Kom<p>etitivno Vezivanje E<p>itopa
[0141] Za odredjivanje kompetltivnih grupa ili "korpi epitopa" anti-TLR3 antitela, izvedeni su eksperimenti vezivanja epitopa.
[0142] Za kompetitivni ELISA test, 5 pl (20 pg/ml) prečišćenog humanog TLR3 ECD proteina dobijenog kao što je opisano u Primeru 1 je obloženo na MSD HighBind ploču (Meso Scale Discoverv, Gaithersburg, MD) po svakom velu tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Svakom velu je dodato 150 pl 5% MSD Blocker A pufera (Meso Scale Discoverv) i inkubirano tokom 2 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane tri puta sa 0.1 M HEPES pufera, pH 7.4, a zatim je dodavana smeša obeleženog anti-TLR3 mAt sa različitim kompetitorima. Obeležena antitela (10 nM) su inkubirana sa rastućim koncentracijama (1 nM do 2 pM) neobeleženog antl-TLR3 antitela, a zatim su dodata u određene velove u zapremini od po 25 pl smeše. Posle 2 sata inkubacije uz blago mućkanje na sobnoj temperaturi, ploče su isprane 3 puta sa 0.1 M HEPES pufera (pH 7.4). MSD Read Buffer T je razblažen destilovanom vodom (četvorostruko), razdeljen u zapremini od 150 pl/velu i analiziran na uređaju SECTOR Imager 6000. Antitela su obeležena sa MSD Sulfo-Tag™ NHS-estrom prema uputstvima proizvođača (Meso Scale Discoverv).
[0143] Procenjivana su sledeća anti-TLR3 antitela: mAt 1-19 dobijena iz "MorphoSvs Human Combinatorial Antibodv Librarv" (prikazane u Tabeli 3a); c1068 (opisano u VVO06/060513A2), c1811 (pacovsko anti-mišje TLR3 mAt dobijeno od hibridoma generisanih od pacova imunizovanih mišjim TLR3 proteinom), TLR3.7 (eBiosciences, San Diego, CA, cat. no. 14-9039) i IMG-315A (generisano protiv humanih TLR3 aminokiselina aminokiseline 55-70 (VLNLTHNOJ-RRLPAAN) od lmgenex, San Diego, CA). Za mAt 9,10, 12, 14 i 15, u ovoj studiji su korišćene varijante 9Q.VQ_/QSV, 10Q.VO_/QSV, 12QVQ/QSV, 14EVQili 15EVQ.
[0144] Na osnovu ogleda kompeticije, anti TLR3 antitela su podeljena u pet različitih korpi. Korpa A: mAt 1, 2, 13, 14EVQ_ 15EVCL16, 19; Korpa B: mAt 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9QVQ/QSV, 10QyO_/QSV, 11, 12Q.VQ/QSV, 17, 18; Korpa C: antitelo lmgenex IMG-315A; Korpa D antitela TLR3.7,C1068; i Korpa E: antitelo c1811.
Primer 6
Mapiranje epitopa
[0145] Reprezentativna antitela iz različitih korpi epitopa kao što je opisano u Primeru 5 su izabrana za dalje mapiranje epitopa. Mapiranje epitopa je izvedeno korišćenjem različitih pristupa, uključujući eksperimente zamene TLR3 segmenta, mutagenezu, H/D izmenu iIn silicoproteinski doking (The Epitope Mapping Protocols, Methods in Molecular Biologv, Volume 6, Glen E. Morris ed., 1996).
[0146] Zamena TLR3 segmenta. TLR3 humani-mišji himerni proteini su korišćeni za lociranje većine domena vezivanja antitela na TLR3. Humani ekstracelularni proteinski domen TLR3 je bio podeljen na tri segmenta (aa 1-209, aa 210-436, aa 437-708 prema numeraciji aminokiselina baziranoj na aminokiselinskoj sekvenci humanog TLR3, GenBank Acc. No. NP_003256). MT5420 himerni protein je generisan zamenom humanih TLR3 aminokiselina 210-436 i 437-708 odgovarajućim mišjim aminoklselinama (mišji TLR3, GenBank Acc. No. NP_569054, aminokiseline 211-437 i 438-709). MT6251 himera je generisana zamenom humane aminokiseline na pozicijama 437-708 mišjim TLR3 aminokisellnama (mišji TLR3, GenBank Acc. No. NP_569054, aminokiseline 438-709). Svi konstrukti su generisani u pCEP4 vektoru (Life Technologies, Carslbad, CA) korišćenjem standardnih postupaka kloniranja. Proteini su prolazno eksprimirani u HEK293 ćelijama kao V5-His6 C-terminalni fuzioni proteini, 1 prečišćeni kao što je opisano u Primeru 1. mAt c1068. mAt c1068 se vezivalo za humani TLR3 ECD sa visokim afinitetom, ali se nije dobro vezivalo za mišji TLR3. c1068 je izgubilo sposobnost da se vezuje za oba MT5420 i MT6251, pokazujući da je mesto vezivanja bilo locirano u okviru aminokiselina 437-708 VT humanog TLR3 proteina. mAtp 12QVQ/ Q5V. mAt 12Q.VO./QSV se vezivalo za obe himere, ukazujući da je mesto vezivanja za mAt 12QVQ/QSV bilo locirano u okviru aminokiselina 1-209 humanog TLR3 proteina koji ima sekvencu prikazanu u SEK ID BR: 2.
[0147]In silicoprotein-protein doking. Kristalna struktura mAt 15EVQ (vidi dole) i objavljena struktura humanog TLR3 (Bell et al., J. Endotoxin Res. 12:375-378, 2006) su bile energetski minimizirane u CHARm programu (Brooks et al., J. Computat. Chem. 4:187-217, 1983) za primenu kao polazni modeli za doking. Proteinski doking je izveden sa ZDOCKpro 1.0 softverskim paketom (Accelrvs, San Diego, CA), koji je ekvivalentan sa softverskim paketom ZDOCK 2.1 (Chen i Veng, Proteins 51:397-408, 2003) sa ugaonom mrežom od 6 stepeni. Poznatim Asn ostacima mesta glikozilacije sa N-vezom u humanom TLR3 (Asn 52, 70, 196, 252, 265, 275, 291, 398, 413, 507 i 636) (Sun et al., J. Biol. Chem. 281:11144-11151, 2006) je bilo blokirano učešće u kontaktima kompleksa antitelo-antigen energetskim ograničenjem u ZDOCK algoritmu. 2000 inicijalnih poza je klasterovano, doking poze su utačnjene i ponovo bodovane u RDOCK softverskom paketu (LI et al., Proteins 53:693-707, 2003). 200 poza sa najvišim ZDOCK skorovima i 200 najboljih početnih RDOCK poza je vizuelno ispitano.
[0148] Kristalizacija mAt 15EV0. je izvedena metodom difuzije pare na 20" C (Benvenuti and Mangani, Nature Protocols 2:1633-51, 2007). Početni skrining je podešen pomoću Hydra robota na pločama sa 96-velova. Eksperimenti su se sastojali od kapljica od 0.5 pl rastvora proteina pomešanih sa 0.5 pl rastvora iz rezervoara. Kapljice su ekvilibrisane sa 90 pl rastvora iz rezervoara. Fab rastvor u 20 mM Tris puferu, pH 7.4, koji sadrži 50 mM NaCl je koncentrovan do 14.3 mg/ml pomoću ćelije Amicon Ultra-5 kDa. Skrining je izveden sa VVizard I & II (Emerald B1oSystems, Bainbridge Island, WA) i sopstvenlm metodama skrininga.
[0149] Podaci rendgenske difrakcije su prikupljeni i obrađeni pomoću Rigaku MicroMax™-007HF mikrofokus rendgenskog generatora opremljenog sa Osmic™ VariMax™ konfokalnom optikom, Saturn 944 CCD detektorom, 1 X-Stream™ 2000 sistemom za hlađenje (Rigaku, Woodlands, TX). Intenziteti difrakcije su detektovani prilikom rotacije kristala za ugao od 270° sa vremenom ekspozicije od 120s za pola stepena slike. Podaci dobijeni rendgenskom difrakcijom su obrađeni u programu DTrek (Rigaku). Struktura je određena metodom molekularne zamene, pomoću programa Phaser ili CNX (Accelrvs, San Diego, CA). Atomske pozicije i temperaturni faktori su utačnjeni pomoću REFMAC korišćenjem svih podataka u opsegu rezolucije 15-2.2 A za mAt 15 i 50-1.9 A za mAt 12. Molekuli vode su dodati na (F0-Fc) pikove elektronske gustlne sa graničnim nivoom od 3o. Sva kristalografska izračunavanja su obavljena u CCP4 programskom paketu (Collaborative Computational Project, Number 4. 1994. CCP4 programski paket: programi za kristalografiju proteina: Acta Crvstallogr. D50:760-763). Korekcije modela su izvršene pomoću programa COOT (Emslev et al., Acta Crystallogr. D60:2126-2132, 2004).
[0150] Rešena kristalna struktura mAt 15EVQ je pokazala da je mesto spajanja antitela bilo karakterisano određenim brojem negativno naelektrisanih ostataka u teškom lancu (D52, D55, E99, D106 i D109). Prema tome, prepoznavanje između mAt 15EVQ 1 TLR3 je najverovatnije uključivalo pozitivno naelektrisane ostatke. Simulacije izvršene proteinskim dokingom su sugerisale da su dve velike površine na TLR3 koje sadrže više pozitivno naelektrisanih ostataka pokazale dobru komplementarnost sa antitelom. Ostaci na TLR3 na kontaktu TLR3 - antitelo anti-TLR3 simuliranih kompleksa su bili R64, K182, K416, K467, Y468, R488, R489 i K493.
[0151] Studije mutageneze. Pojedinačne i kombinovane tačkaste mutacije su uvedene u površinske ostatke TLR3 ECD u regione za koje je gore utvrđeno da sadrže epitope mAt 12 i mAt 15EVQ i ovi mutant proteini su testirani za vezivanje antitela.
[0152] Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiseline 1-703 (ECD), (SEK ID BR: 4; GenBank pristupni broj NP_003256) humanog TLR3, je klonirana korišćenjem standardnih protokola. Svi mutanti su generisani mutagenezom usmerenom na položaj pomoću Strategene QuickChange II XL kompleta (Stratagene, San Diego, CA) u skladu sa protokolom proizvođača, korišćenjem oligonukleotida prikazanih u Tabeli 5a. Mutacije su verifikovane DNK sekvencioniranjem. Proteini su eksprimirani pod kontrolom CMV promotora kao C-terminalne His-tag fuzije u HEK293 ćelijama i prečišćeni kao što je opisano u Primeru 1
[0153]Testovivezivanja. Aktivnost vezivanja mAt 12Q_VQ/QSV i mAt 15EVQsa humanim TLR3 i generisane varijante su procenjene pomoću ELISA testa. Da se ubrza proces, mutanti na predviđenom mestu vezivanja mAt 15EVO. su koeksprimirani u HEK ćelijama ko-transfekcijom TLR3 ECD mutanta koji sadrži C-terminalni His Tag sa mAt 12QVQ/QSV, nakon čega je usledilo prečišćavanje metalnom afinitetnom hromatografijom. Dobijeni uzorak je bio kompleks TLR3 mutanta sa antitelom mAt 12. Ovaj pristup je bio izvodljiv zato što su mesta vezivanja mAt 12QVQ/QSV i mAt, 15EVQ udaljena jedno od drugog; tako da tačkaste mutacije na jednom mestu verovatno nisu uticale na epitop na drugom mestu. Ovi kompleksi su korišćeni u ELISA testovima vezivanja. 5 pl po velu 20 pg/ml divljeg tipa TLR3 ECD ili mutant proteina u PBS je naneto na MSD HighBind ploču (Meso Scale Discoverv, Gaithersburg, MD). Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 60 minuta i blokirane tokom noći u MSD Blocker A puferu (Meso Scale Discoverv, Gaithersburg, MD) na 4' C. Ploče su sutradan isprane i mAt 15EVQ obeleženo sa MSDSulfo-Tag, je dodavano u koncentracijama od 500 pM do 1 pM tokom 1.5 sati. Nakon ispiranja obeleženo antitelo je detektovano pomoću MSD Read Buffer T i ploče su očitane pomoću SECTOR Imager 6000. Da bi se procenila aktivnost vezivanja mAt 12QVQ./QSV sa humanim TLR3 i varijante, izvedena je ko-ekspresija sa mAt 15EVO. i izvedeni su ELISA testovi vezivanja kao što je opisano za mAt 15EVQ, osim što je antitelo za detekciju, bilo obeleženo mAt 12QV0_/CiSV.
mAt 12QVQ/QSV: Mesto vezivanja za mAt 12QVQ/0_SV je locirano u okviru amino kiselina 1 -209 humanog TLR3 proteina kako je utvrđeno u studijama zamene segmenata. Procenjivani su sledeći TLR3 mutanti: D116R, N196A, N140A, V144A, K145E, K147E, K163E i OJ67A. Divlji tip TLR3 i V144A mutant su pokazali uporedivo vezivanje sa mAt 120_VQ/QSV (Slika 6A). Antitelo se nije vezalo za TLR3 D116R mutanta i imalo je značajno smanjen afinitet vezivanja sa K145E mutantom. Tako, ostaci D116 i K145 koji su blisko postavljeni na površini TLR3 su identifikovani kao ključna mesta epitopa za mAt 12QVO_/QSV (Slika 7A).
[0154] Dva kritična ostatka mAt 12QVQ/QSV vezujućeg epitopa su locirana u blizini površine mesta vezivanja dsRNA na N-terminalnom segmentu ektodomena TLR3 (Pirher, et al., Nature Struct. 6 Mol. Biol., 15:761-763, 2008). Kompletan epitop će sadržati i druge ostatke u susednim regionima, koji nisu bili otkriveni analizama mutacija. Ne želeći da se vežemo za bilo koju teoriju, smatra se da vezivanje mAt 12QVQ/QSV za svoj TLR3 epitop može direktno ili indirektno ometati vezivanje dsRNA na TLR3 ektodomen ometajući tako dimerizaciju receptora i aktivaciju nishodnih signalnlh puteva. mAt. 15EVO: Procenjivani su sledeći TLR3 mutanti: R64E, K182E, K416E, Y465A, K467E, R488E, R489E, N517A, D536A, D536K, 0.538A, H539A, H539E, N541A, E570R, K619A, K619E, dvostruki mutant K467E/Y468A, trostruki mutant T472S/R473T/N474S, i trostruki mutant R488E/R489E/K493E. Divlji tip TLR3, R64E, K182E, K416E mutanti i trostruki mutant T472S/R473T/N474S su pokazali uporedivo vezivanje sa mAt 15EVQ (Slika 6B i Tabela 5b). Antitelo se nije vezalo za TLR3 mutante K467E, R489E, K467E/Y468Ai R488E/R489E/K493E (Slika 6B i 6C). Preostale varijante su pokazale umereno vezivanje sa R488E koje je imalo najveći efekat. Svi ovi mutanti su bili vezani sa mAt 12QVQ/0.SV. Ovi rezultati su pokazali da su ostaci K467 i R489 od ključnog značaja za mAt 15EVO. epitop. Ostatak R488 je takođe doprineo epitopu. Ovi ostaci su blisko raspoređeni na istoj površini TLR3 (Slika 7A). Rezultati su takođe pokazali da su ostaci Y465, Y468, N517, D536, 0.538, H539, N541, E570 i K619, koji su svi na istoj površini kao K467, R488 i R489, doprineli epitopu. Ovaj zaključak je dodatno podržan studijama H/D izmena sa mAt 15EVQ_. Slika 7A prikazuje vezujuće mesto epitopa za mAt 12QVQ_/QSV i 15EV0. (crno) i C1068 mAt (sivo) preklopljena preko strukture humanog TLR3. Epitop za mAt 15EVO pokriva ostatke Y465, K467, Y468, R488, R489, N517, D536, 0.538, H539, N541, E570 i K619.
[0155] Studije H/D izmene. Za H/D izmenu, procedura korišćena za analizu perturbacije antitela je bila slična prethodno opisanoj (Hamuro et al., J. Biomol Techniques 14:171-182, 2003; Horn i saradnici, Biochemistry 45:8488-8498, 2006) sa nekim modifikacijama. Rekombinantni TLR3 ECD (eksprimiran iz S/9 ćelija sa C-terminalnim His-tagom i prečišćen) je inkubiran u deuterisanom vodenom rastvoru za unapred određena vremena što je dovelo do inkorporiranja deuterijuma u izmenjive atome vodonika. Deuterisani TLR3 ECD je uhvaćen na koloni koja je sadržala imobilisana mAt 15EVQ, a zatim ispran vodenim puferom. Povratno-izmenjeni TLR3 ECD protein je eluiran na koloni i lokalizacija fragmenata koji sadrže deuterijum je izvršena digestijom proteaza i masenom spektrometrijom. Kao referentna kontrola, TLR3 ECD uzorak je slično obrađen osim što je izložen deuterizovanoj vodi tek nakon hvatanja antitela na koloni, a zatim ispran i eluiran na isti način kao i eksperimentalni uzorak. Zaključeno je da su regioni vezani za antitela ona mesta koja su relativno zaštićena od izmene zbog čega sadrže veći udeo deuterijuma nego referentni TLR3 ECD uzorak. Oko 80% proteina može biti mapirano na specifičnim peptidima. Mape perturbacije H/D izmene TLR3 ECD sa mAt 15EVQ.su prikazane na slici 7B. Zbog jasnoće je prikazan samo segment TLR3 oko dela na koji utiče mAt 15EVQ_. Na ostatak proteina koji se prostire do amino i karboksilnog terminusa TLR3 ECD nije bilo značajnijeg uticaja.
[0156] Studije H/D izmene su identifikovale peptidne segmente«5YNKYLQU7,, 5hSNNNIANINDDML,26 i .^LEKLsi!iz SEK ID BR: 2 kao regione u kojima je izmena na TLR3 bila naročito promenjena vezivanjem sa mAt 15EV0.. Po svojoj prirodi, H/D izmena je metoda linearnog mapiranja i obično ne može da definiše koji ostaci u okviru peptidnog segmenta su najviše pogođeni vezivanjem antitela. Međutim, veliko poklapanje između H/D izmena i rezultata mutacija daje dodatno uverenje da je površina prikazana na Slici 7A mesto vezivanja mAt 15. Ovo mesto vezivanja je bilo u istom regionu linearne aminokiselinske sekvence koja je prethodno opisana za mAt c1068 (PCT Publ. no. WO06/060513A2), ali je utvrđeno da se nalazi na površini koja se ne poklapa kompletno (slika 7A) u saglasnosti sa ne postojanjem unakrsne kompeticije između ovih antitela.
[0157] Vezujući epitop mAt 15EVQ je bio prostorno proksimalan mestu vezivanja dsRNA na C-terminalnom segmentu TLR3 (Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 103:8792-8797, 2006; Ranjith-Kumar et al., J Biol Chem, 282:7668-7678, 2007; Liu et al., Science, 320:379-381, 2008). Ne želeći da se vežemo za bilo koju teoriju, veruje se da vezivanje mAt 15EVQza svoj TLR3 epitop izaziva sterne smetnje sa ligandom dsRNA molekulom i/ili dimer partnerom, sprečavajući vezivanje liganda i ligand-indukovanu dimerizaciju receptora.
Primer 7
Generlsanle varilantl sa poboljšanom termičkom stabilnošću
[0158] Inženjering na bazi strukture je sproveden za generisanje varijanti antitela sa povećanom termičkom stabilnosti, uz istovremene napore da se zadrži biološka aktivnost i minimizira imunogeničnost.
[0159] Za inženjering je izabrano mAt 15EVQ. Da se umanji imunogeničnost, sprovedene su samo mutacije germinalne linije za koje je na bazi strukturnih razmatranja predviđeno da su korisne. VL i VH sekvence mAt 15EVQ. (SEK ID BR: 41 i SEK ID BR: 216, respektivno) su poravnate sa genima humane germinalne linije pomoću BLAST pretraživanja. Najpribližnije sekvence germinalne linije koje su identifikovane su bile GenBank Acc. No. AAC09093 i X5931B za VH i VL, respektivno. Sledeće razlike su identifikovane između germinalnih VH, VL sekvenci i sekvenci VH i VL iz mAt 15EVQ: (VH) V34I, G35S, F50R, A61S i 0.67H; (VL) G30S, L31S, i A34N. Identifikovane razlike sekvenci su mapirane na kristalnoj strukturi mAt 15EVO. i ostaci za koje je predviđeno da menjaju pakovanje i interakcije na kontaktima su odabrani za inženjering. Na osnovu kristalne strukture antitela (videti Primer 6), identifikovani su ostaci koji potencijalno mogu da destabilizuju strukturu. (1) Mala zatvorena šupljina je identifikovana u jezgru VH u blizini V34. Ova šupljina je bila dovoljno velika da primi malo veći bočni lanac kao što je lle. (2) E99 iz VH CDR3 je ukopan na kontaktu VH/VL bez mreže H-veza. Negativno naelektrisana karboksilatna grupa E99 je u bila u generalno hidrofobnom okruženju sa pretežno Van der Valsovim (VDV) vezama sa okolnim ostacima. Ukopavanje naelektrisanih grupa je obično energetski nepovoljno tako da ima destabilišući efekat. (3) F50 iz VH je ostatak kontakta VH/VL. Njegov aromatični bočni lanac je glomazan i na taj način može imati negativan uticaj na sparivanje. Mreže pakovanja pomoću H-veza i vdw interakcija za Fv su izračunate i vizuelno pregledane u Pymol ( https:// www. pvmol. ory). Ukopane šupljine u VH i VL domenima su izračunate pomoću Caver softwera (Petrek et al., BMC Bioinformatics, 7:316, 2006). Svi grafički prikazi molekula su pripremljeni u Pymol-u. U ekspresionim vektorima koji kodiraju Fab fragmente ili lgG4 potpuno humanim antitelima generisanim kao što je opisano u Primeru 3 su napravljene mutacije pomoću standardnih tehnika kloniranja i kompleta Quick Change II XSL za usmerenu mutagenezu (Stratagene, San Diego, CA), Change-IT Multiple Mutation Site Directed Mutagenesis kompleta (USB Corporation, Cleveland, OH) ili Quick Change II kompleta za usmerenu mutagenezu (Stratagene, San Diego, CA). Reakcije su izvedene u skladu sa preporukama proizvođača. Dobijeni klonovi su sekvencirani za verifikaciju, i dobijene modifikovane varijante su nazvane mAt 15-1 - 15-9. Listing identifikacionih brojeva sekvenci: za CDR-e, varijabilne regione lakih i teških lanaca i teške i lake lance pune dužine mAt 15EVOJ njegove modifikovane varijante je prikazan u Tabeli 6. Tabela 7 prikazuje prajmere za generisanje svake varijante.
[0160] Vezivanje mAts 15-1 - 15-9 sa TLR3 je procenjeno pomoću ELI5A imunotesta. Humani TLR3 ECD (100 pl konc. 2 pg/ml TLR3-ECD) je zalepljeno za crnu Maxisorb ploču (eBioscience) preko noći na 4° C. Ploče su isprane i blokirane, a razblažena antitela su alikvotirana u velove po 50 pl po velu, u duplikatu. Ploča je inkublrana na sobnoj temperaturi tokom 2 sata uz blago mućkanje. Vezivanje je detektovano pomoću luminescence POD supstrata (Roche Applied Science, Mannheim, Nemačka, Cat. No. 11 582 950 001) i kozjeg anti-humanog Fc:HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat. No. 109-035-098), a ploča je očitana na čitaču ploča SpectraMax (Molecular Devices, Sunnvvale, CA).
[0161] DSC eksperimenti su izvedeni na MicroCal Auto VP kapilarnom DSC sistemu (MicroCal, LLC, Northampton, MA) u kojem su kontinuirano merene razlike temperatura između referentnih ćelija i ćelija uzoraka, i kalibrisane u jedinicama snage napajanja. Uzorci su zagrevani od 10" C do 95' C pri brzini zagrevanja od 60" C/sat. Vreme pre-skeniranja je bilo 15 minuta, a period filtriranja je iznosio 10 sekundi. U DSC eksperimentima je korišćena koncentracija oko 0.5 mg/ml. Analiza dobijenih termograma je izvedena korišćenjem MicroCal Origin 7 softvera (MicroCal, LLC).
[0162] Termička stabilnost (Trn) generisanih varijanti je merena pomoću DSC (Tabela 8). Vezivanje varijanti antitela za TLR3 je poređeno sa roditeljskim antitelom.
Primer 8
Generisanje surogata ant1- TLR3 antitela
[0163] Himerno antagonističko pacovsko/mišje anti-mišje TLR3 antitelo, ovde nazvano mAt 5429 je generisano za procenu efekata inhibicije TLR3 signalizacije u raznimin vivomodelima, pošto humantzovana antitela generlsana u Primeru 1 nisu imala dovoljnu specifičnost Ili aktivnost antagonista za mišji TLR3. Surogat himernog mAt 5429 kao i njegovo roditeljsko pacovsko anti-mišje TLR3C1811 antitelo je inhibiralo signalizaciju mišjeg TLR3In vitro1In vivo,i popravilo patogene mehanizme u nekoliko modela bolesti kod miša.
[0164] Podaci razmatrani dalje u tekstu ukazuju na ulogu TLR3 u indukciji i održavanju štetnih upala, i doprinose obrazloženju za terapijsku upotrebu TLR3 antagonista 1 antitela antagonista TLR3, na primer kod akutnih i hroničnih inflamatornih stanja uključujući hipercitoklnemiju, astmu i upalu disajnih puteva, inflamatorne bolesti creva i reumatoidni artritis, virusne Infekcije 1 dijabetes tipa II.
Generisanie surogata mAt 5429
[0165] CD pacovi su imunizovani sa rekombinantnim murinskim TLR3 ektodomenom (aminokiseline 1-703 sekvence SEK ID BR: 162, GenBank Acc. No. NP_569054.) generisanim pomoću rutinskih metoda. Limfoclti od dva pacova koji su demonstrirali titre antitela specifične za mišji TLR3 su fuzionisani u FO mijeloma ćelijama. Identifikovan je panel monoklonskih antitela reaktivnih prema murinskom TLR3 i testiran in vitro na aktivnost antagonista u murinskom reporter testu luciferaze i murinskom testu embrionskog fibroblasta. Hibridoma linija C1811Aje izabrana za dalji rad. Funkcionalni geni varijabilnih regiona su sekvencionirani iz mAt c1811 izlučenog iz hibridoma. Klonirani geni varijabilnih regiona teškog 1 lakog lanca, respektivno su zatim ubačeni u plazmidne ekspresione vektore koji su obezbedili kodirajuće sekvence za produkciju himernih Pacov/Balb C mulgG1/K mAt, označenog kao mAt 5429, korišćenjem rutinskih metoda. Antitela su eksprimirana kao što je opisano u Primeru 3. Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lako?lanca mAt 5429 su prikazane u SEK ID BR: 164 i SEK ID BR: 163, respektivno, a sekvence teškog i lakog lanca pune dužine su prikazane u SEK ID BR: 166 i SEK ID BR: 165, respektivno. Sekvence teškog i lakog lanca pune dužine mAt c1811 su prikazane u SEK ID BR: 168 i SEK ID BR: 167, respektivno.
K areKteri zacIja mA t5429
[0166] mAt 5429 je okarakterisano u paneluin vitrotestova za svoju sposobnost neutralizacije TLR3 signalizacije. Testovi aktivnosti i rezultati su opisani dalje u tekstu.
MurinsM test r eporterskog gena luciferaze
[0167] Mišja TLR3 cDNK (SEK ID BR: 161, GenBank Acc. No: NMJ26166) je umnožena pomoću PCR iz mišje slezine cDNK (BD Biosciences, Bedford, MA), i klonirana u pCEP4 vektor (Life Technologies, Carslbad, CA) korišćenjem standardnih postupaka. 200 pl HEK293T ćelija su zasejane u ploče sa 96 velova sa belim prozirnim dnom u koncentraciji od 4 x 10<*>ćelija/velu u kompletnom DMEM, i upotrebljene sutradan za transfekciju korišćenjem Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp., Carslbad, CA) sa 30 ng PNF-kB luciferaze svica (Stratagene, San Diego, CA) ili 30 nG pISRE luciferaze svica (BD Biosciences, Bedford, MA), 5 ng phRL-TK kontrole Renilla luciferaze (Promega Corp., Madison, VI) reporter plazmida, 1.5 NG pCEP4 koji kodira celu dužinu mišjeg TLR3 i 13.5 ng praznog pcDNK3.1 vektora (Life Technologies, Carslbad, CA) da se dobije ukupna DNK u količini od 50 ng/velu. 24 sata posle transfekcije, ćelije su inkubirane 30 minuta do 1 sat na 37' C sa antl-mišjim TLR3 antitelima u svežem DMEM bez seruma, pre dodavanja 0.1 ili 1 pg/ul poly(l:C). Ploče su analizirane posle 24 sata pomoću Dual-Glo Luciferase test sistema (Promega, Madison, VI). Relativne svetlosne jedinice su izmerene korišćenjem FLUOstar OPTIMA multi-detekcionog čitača sa OPTIMA softverom (BMG Labtech GmbH, Nemačka). Normalizovane vrednosti (odnosi luciferaza) su dobijene deljenjem Firefly relativnih svetlosnih jedinica (RLU) sa Renilla RLU. mAt 5429 kao i njegovo roditeljsko mAt c1811 i mAt 15 (Tabela 3a) je na dozno zavisan način smanjilo sa poly(l:C) - indukovanu NF-kB i ISRE aktivaciju (Slika 8A i 8B), pokazujući svoje sposobnosti da antagonizuju aktivnost TLR3. IC50 izmerene u ISRE testu su bile 0.5, 22 i 0.7 pg/ml za mAt 5249, mAt 15 i mAtd811, respektivno.
Test Mišjeg Embrlonsko<g>Flbroblasta ( MEF)
[0168] C57BL/6 MEF ćelije su nabavljene kod Artis Optimus (Opti-MEF™ C57BL/6 - 0001). Ćelije su zasejane u 96-velova (BD Falcon) sa 20,000 ćelija/velu u 200 pl MEF medijuma (DMEM sa glutamaksom, 10% toplotno inaktivisanim-FBS, 1x NEAA i 10 pg/ml gentamicina). Sve inkubacije su izvedene na 37' C/5% C02. 24 sata posle zasejavanja, mAt 5429 ili mAt, c1811 su dodati u velove. Ploče su inkubirane sa mAt 1 sat, nakon čega je u velove dodato po 1 pg/ml Poly (l:C). Supernatanti su sakupljeni nakon 24 sata inkubacije. Nivoi citokina su određeni korišćenjem kompleta sa perlicama (Invitrogen Corp., Carslbad, CA) za detekciju CXCL10/IP-10 prema protokolu proizvođača. Rezultati su grafički prikazani pomoću softvera GraphPad Prism. Oba antitela su na dozno-zavisan način smanjila CXCL10/IP-10 nivoe indukovane sa poly(l:C), pokazujući sposobnost ovih antitela da antagonizuju endogeni TLR3 I inhibiraju TLR3 signalizaciju (Slika 9).
TekućaCltometrija -PovršinskoBojenje
[0169] C57BL/6 i TLR3 nokaut (TLR3K0) (C57BL/6 background; ženke, 8-12 nedelja stare, Ace Animals, Inc.), po 10 u grupi, su dozirane intraperitonealno sa 1 ml 3% Tioglikolat medijuma (Sigma) i 96 sati kasnije su žrtvovane i peritoneum iz svakog miša je ispran sa 10 ml sterilnog PBS. Tioglikolatom izazvani peritonealni makrofagi su resuspendovani u PBS i ispitana je ćelijska vijabilnost pomoću Tripan plavog bojenja. Ćelije su oborene centrifugiranjem i resuspendovane u 250 pl FACS puferu (PBS -Ca<2*>-Mg<2>', 1% toplotno inaktivisani FBS, 0.09% natrijum azid) i držane na mokrom ledu. CD16/32 reagens (eBioscience) je korišćen sa 10 pg/10' ćelija tokom 10 minuta da se blokiraju Fc receptori na makrofagima. Distribuirano je po 10<6>ćelija u 100 pl/velu za površinsko bojenje. Alexa-Fluor 647 (Molecular Probes)-konjugovana mAt c1811 i mAt 1679 (pacovsko anti-mišje TLR3 antitelo koje nema specifičnost za TLR3,1 zato se koristi kao kontrola izotipa) su dodata u količini od 0.25 pg/10<6>ćelija i inkubirana 30 minuta na ledu u mraku. Ćelije su isprane i resuspendovane u 250 pl FACS pufera. Dodata je boja za vijabilnost, 7-AAD (BD Biosciences, Bedford, MA), u količini 5 pl/velu ne više od 30 minuta pre akvizicije uzoraka na FACS Calibur da se otkrije populacija mrtvih ćelija. Uzorci su sakupljeni pomoću FACS Calibur uređaja, korišćenjem Cell Quest Pro softvera. FCS Express je korišćen za analizu prikupljenih podataka formiranjem histograma.
[0170] Vezivanje mAt c1811 za tioglikolatom-lzazvane peritonealne makrofage iz C57BL/6 i TLR3KO miševa je procenjivano protočnom citometrijom da se odredi specifičnost vezivanja. U ovom testu nije korišćeno mAt 5429 pošto je očekivano da mišji Fc region ovog himernog antitela doprinosi nespecifičnom vezivanju. mAt,C1811 je pokazalo da se ne vezuje za TLR3K0 makrofage, a da se pojačano vezuje za površinu ćelija C57BL/6 peritonealnih makrofaga sugerišući specifičnost mAt za TLR3 (Slika 10). Pretpostavlja se da mAt 5429, koje ima iste vezujuće regione kao mAt c1811, ima istu specifičnost vezivanja kao mAt d811.
Primer 9
Antitela TLR3 antagonisti štite od TLR3- DOsredovane sistemske Inflamacije
Model
[0171] Sa poly(l:C) indukovan sistemski citokin/hemokin model je korišćen kao model TLR3-posredovane sistemske inflamacije. U ovom modelu, poly(l:C) (PIC) isporučen intrapeirtonealno indukuje sistemski cltokinski i hemokinski odgovor koji je delimično TLR3-posredovan.
[0172] Ženkama C57BL/6 miša (8-10 nedelja stare) ili ženkama TLR3KO miša (C57BL/6 background; 8-10 nedelja stare, Ace Animals, Inc.) je davano mAt 5429 od 10, 20 ili 50 mg/kg u 0.5 ml PBS, mAt c1811 od 2, 10 ili 20 mg/kg u 0.5 ml PBS ili 0.5 ml PBS samog (kontrola) subkutano. 24 sata posle doziranja antitela, miševima je dato 50 pg poly(l:C)
(Amersham Cat. No. 26-4732 Lot no. IH0156) u 0.1 ml PBS intraperitonealno. Retro-orbitalna krv je uzimana 1 i 4 sata nakon Izazova sa poly(l:C). Pripremljen je serum iz pune krvi i analizirane koncentracije citokina i hemokina pomoću uređaja Luminex.
Rezultati
[0173] Poly(l:C) isporučen intrapeirtonealno je indukovao sistemski citokinski i hemokinski odgovor koji je delimično TLR3-posredovan, što je dokazano značajnim smanjenjem produkcije panela hemokina i citokina u TLR3KO životinjama (Tabela 9A). TLR3-zavisni, indukovani sa poly(l:C) medijatori su bili IL-6, KC, CCL2/MCP-1 i TNF-a, 1h nakon Izazova sa poly(l:C), i IL-1a, CCL5/RANTES i TNF-a, 4 h nakon izazova sa poly(l:C). Oba antitela mAtC1811 i mAt 5429 su značajno smanjila nivoe ovih TLR3-zavisnih medijatora, pokazujući sposobnost antitela dain vivosmanje TLR3 signalizaciju (Tabela 9b). Vrednosti u tabeli 9 su prikazane kao srednje koncentracije citokina ili hemokina u pg/ml za šest životinja/grupi ±SEM. Ovi podaci ukazuju da TLR3 antagonizam može biti koristan u smanjenju povećanih nivoa TLR3-posredovanih citokina i hemokina u uslovima kao što su "dtokinska oluja" ili letalni šok.
Primer 10
TLR3 antagonisti antitela smanluiu hiperosetlHvost disajnih puteva
Model
[0174] Hiperresponzivnost disajnih puteva je indukovana sa Poly(l:C).
[0175] Ženke C57BL/6 miševa (12 nedelja stare) ili ženke TLR3KO miševa (C57BL/6 background; 12 nedelja stare, Ace animals, Inc.) su anestezirane izofluranom i intranazalno im je administrlrano nekoliko doza (10-100 pg) poly(l:C) u 50 pl sterilnog PBS. Miševi su primili tri administracije poly(l:C) (ili PBS) sa 24 sata perioda odmora Između svake administracije. 24 časa nakon poslednje poly(l:C) (ili PBS) administracije, plućna funkcija i hipersenzitivnost disajnih puteva na metaholin su merene pomoću pletizmografije celog tela (BUXCO sistem). Miševi su smešteni u komoru za telesnu pletizmografiju i ostavljeni najmanje 5 minuta da se aklimatizuju. Nakon očitavanja baznih vrednosti, miševi su izloženi rastućim dozama nebulizovanog metaholina (Sigma, St. Louis, MO). Nebulizovani metaholin je administriran tokom 2 minuta, a zatim je usledio period prikupljanja podataka od 5 minuta, nakon čega je usledio odmor od 10 minuta pre narednog izazova metaholina sa povećanjem doze. Povećan otpor protoku vazduha je izmeren kao "Enhanced Pause" (Penh) i predstavljen kao prosečna Penh vrednost tokom perioda snimanja od 5 minuta (8UXCO sistem). Nakon merenja plućne funkcije, na miševima je izvršena eutanazija, i pluća su im kanulirana. Bronhoalveolarne lavaže (BAL) su izvedene ubrizgavanjem 1 ml PBS u pluća i vađenjem efluenta. Tkiva pluća su uklonjena i zamrznuta. BAL fluidi su centrifugiranl (1200 rpm, 10 min.) i supernatanti bez ćelija su sakupljeni i čuvani na -80' C do analize. Ćelijski peleti su resuspendovani u 200 pl PBS za određivanje ukupnog i diferencijalnog broja ćelija. Multiplex test je Izveden prema protokolu proizvođača i Multiplex Immunoassav Kit-a (Millipore, Billercia, MA).
Rezultati
[0176] Prethodna zapažanja su pokazala da intranazalna administracija poly (l:C) indukuje TLR3-posredovano oštećenje funkcije pluća kod miša sa povećanom povećanim vrednostima (Penh) pletizmografije celog tela (Buxco) na početku f povećanu responzivnost za aerosol metaholina (indikator hiperresponzivnosti disajnih puteva) (PCT Publ. No WO06/060513A2). Ovo oštećenje funkcije pluća je bilo povezano sa grupisanjem neutrofila u plućima, i povećanjem nivoa proinflamatornih citokina/hemokina u plućima. U ovoj studiji, delovanje mAt 1811 1 mAt 5429 je procenjeno u poly (l:C) indukovanom oštećenju funkcije pluća, administracijom svakog antitela sa 50 mg/kg subkutano pre izazova sa poly(l:C).
[0177] TLR3 posredovano oštećenje funkcije pluća je značajno smanjeno tretmanom životinja sa antitelima TLR3 antagonistima pre izazova sa poly(l:C). TLR3-posredovano povećanje baznih Penh vrednosti i osetljivosti disajnih puteva na metaholin su sprečeni kod životinja tretiranih ant1-TLR3 antitelima (Slika 11). Zatim, TLR3 posredovano grupisanje neutrofila u plućima miša i generisanje hemokina u disajnim putevima su smanjeni kod životinja tretiranih anti-TLR3 antitelima. Brojevi neutrofila (Slika 12) i nivoi CXCL10/IP-10 (Slika 13) su mereni u sakupljenoj bronhoalveolarnoj lavaži (Bal fluid). Studije su ponovljene najmanje tri puta sa sličnim rezultatima. Podaci prikazani na Slikama 11, 12 i 13 su iz jedne reprezentativne studije. Svaki simbol predstavlja set podataka za jednog miša, a horizontalni stupci prikazuju srednje vrednosti za grupu. Studija je pokazala da su slstemski-administrirana antitela TLR3 antagonisti dospela u pluća, smanjila TLR3 posredovano oštećenje funkcije pluća, infiltraciju neutrofila u disajnim putevima, generisanje hemokina i zapaljenje respiratornog trakta u korišćenom modelu. Tako, TLR3 antagonisti mogu biti korisni u lečenju ili prevenciji respiratornih bolesti koje karakteriše hiperresponzivnost disajnih puteva, kao što je astma, alergijski rinitis, hronična opstruktivna bolest pluća (COPD) i clstlčna fibroza.
Primer 11
antitela TLR3 antagonisti Stlte od Inflamatorne bolesti creva
Model
[0178] Model DSS kolltisa je korišćen kao model inflamatorne bolesti creva.
[0179] Ženke C57BL/6 miševa (stare <8 nedelja) Ili ženke TLR3K0 miševa (C57BL/6 background; stare <8 nedelja, težine između 16.5g i 18g, Ace Animals, Inc.) su hranjene gama-ozračenom hranom počevši od dana -1. DSS (Dekstran sulfat) (MP Biomedicals, Aurora, OH, Cat. no: 160110, 35-50kDa, 18-20% Sumpor, Lot no. 8247J) je razblažen u autoklaviranoj zakišeljenoj pijaćoj vodi do konačne koncentracije od 5%. DSS-voda je adminlstrirana tokom 5 dana, posle čega je zamenjena običnom vodom. Miševi su pili vodu ad libitum tokom cele studije. Sve boce sa vodom su merene svakodnevno da se snimi potrošnja vode. Na dane 0, 2 1 4 miševi su intraperitonealno dozirani sa 5 mg/kg (0.1 mg u 0.1 ml PBS) mAt 5429, mišjeg anti-TNF-a antitela, ili PBS kao kontrolom. Miševi su praćeni svakodnevno tokom studije i mereni na dane 0 do 4 i sedmog dana. Miševi su podvrgnuti eutanaziji 2. i 7. dana studije. Trbušne šupljine su im otvorene i uzlazni delovi debelog creva odsečeni na mestu spajanja sa slepim crevom. Creva su sakupljena 1 fiksirana u 10% neutralnom puferisanom formalinu. Creva su zalivena u parafin, sekcirana i H&E obojena (Oualtek Molecular Labs, Santa Barbara, CA). Histopatološke procene kolona su izvršene šlepom tehnikom od strane veterinarskog patologa kao što je opisano u nastavku (PathoMetrix, San Jose, CA).
Histopatološka procena
[0180] Dva segmenta debelog creva, kolon i rektum su procenjeni i bodovani za sledeće promene: (i) nekroza pojedinačne ćelije; (ii) ulceracija epitela; (iii) odlubljivanje epitela; (iv) kriptalni apsces; (v) ćelijska proliferacija; (vi) proliferacija kriptalnih ćelija; (vil) formiranje granulaclonog tkiva u lamini proprija; (viii) granulaciono tkivo u submukozi; (1x) inflltrat submukoznih Inflamatornih ćelija, sa preovlađujućim neutrofilima; i (x) submukoznl edem.
[0181] Jedan, ukupni skor težine je dat na osnovu sledećih standarda:
0 - ne postoji
1 - blaga, fokalna ili povremeno nađena
2 - blaga, multifokalna
3 - umerena, često nađen ali u ograničenim područjima
4 - teška, često nađena u mnogim područjima ili ekstenzijama dostavljenih tkiva
5 - veoma teška, proširena na velika područja dostavljenih tkiva
Rezultati
[0182] Prethodni zapažanja su pokazala da su TLR3KO životinje pokazale značajno smanjenu histopatologiju u poređenju sa divljim tipom miševa u modelu inflamatornog oboljenja creva Izazvanog ingestljom DSS (PCT Publ. No. VVO06/60513A2), što ukazuje da TLR3 signalizacija Igra ulogu u patogenezi u ovom modelu. Zabeleženo je da komensalna bakterijska RNK ili sisarska RNK oslobođena iz nekrotičnih ćelija može delovati kao endogeni liganad za stimulaciju TLR3 signalizacije (Kariko et al., Immunity 23165-231175 2005; Kariko et al., J. Biol. Chem. 279:12542-12550 2004), i stoga TLR3 stimulacija endogenim ligandima u crevima može pojačati 1 održavati inflamaciju u modelu DSS kolitisa.
[0183] Težina bolesti je ublažena kod životinja izloženih DSS-u posle tretmana sa anti-TLR3 antitelima, prema proceni pomoću histopatoloških rezultata za pojedina jedinjenja (Slika 14). Slika 14 prikazuje srednje vrednosti, standardne devijacije 1 intervale pouzdanosti od 95% za skorove težine bolesti prikazane kao horizontalni stublći. Značajno smanjenje rezultata je zabeleženo kod životinja divljeg tipa koje su bile izložene DSS-tretmanu, a zatim tretirane sa anti-TLR3 antitelima (p<0.05) u poređenju sa netretiranim životinjama divljeg tipa. TLR3K0 životinje izložene DSS-u su zaštićene od DSS-indukovane promene. DSS-u izložene životinje koje su primile anti-mišje TNF-a mAt, nisu pokazale poboljšanje histopatologije u DSS modelu. Dakle, DSS model može biti koristan za procenu terapeutika koji mogu da ciljaju populaciju humanih pacijenata koji ne reaguju na anti-TNF-a terapije, a neutrališuća anti-TLR3 antitela mogu imati potencijal da budu korisna pacijentima sa inflamatornom bolesti creva koji ne reaguju na anti-TNF-a terapije.
Model
[0184] Model Transfera T Ćelija je korišćen kao model inflamatorne bolesti creva. U ovom modelu, zapaljenje creva je indukovano kod SCID miševa transferom populacije naivnih T-ćelija od imuno-kompetentnih miševa, koje napadaju antigen-prezentujuće ćelije sluzokože creva.
[0185] Naivne T-ćelije (CD4+T ćelije CD45RB<hi>|<h>) su intrapeirtonealno ubrizgane u SCID recipijente da indukuju hronični kolitis. Miševima je dat ili PBS (500 pl/mišu intraperitonealno; nosač kontrola), mAt 5429 (0.1 mg/mišu intraperitonealno), ili anti-TNF-a antitelo (0.05 mg/mišu intraperitonealno; pozitivna kontrola), 48 sati nakon transfera T-ćellja, a zatim dva puta nedeljno tokom 8 nedelja istraživanja. 8 nedelja nakon transfera T-ćelija (ili kada su miševi izgubili > 15% svoje prvobitne telesne težine) životinje su podvrgnute eutanaziji i uklonjeni su im koloni. Koloni su fiksirani, zatopljeni u parafin i H&E obojeni. Histopatologija (ćelija infiltracija, kriptalni abscesi, erozija epitela, gubitak peharastih ćelija, i zadebljanje crevnog zida) je ocenjena kvantitativno slepim postupkom.
Rezultati.
[0186] Kod životinja koje su primile transfer T-ćelija, težina bolesti je ublažena nakon tretmana sa anti-TLR3 antitelima, što je procenjeno na osnovu značajnog smanjenja histopatološkog zbira skorova u odnosu na kontrolne životinje (p <0.05) (Slika 15A). Za zbir skorova su procenjivani kriptalni apscesi, ulceracija, priliv neutrofila, gubitak peharastih ćelija, abnormalne kripte, upala lamine propria i transmuralna upala. Značajno smanjenje je prlmećeno kod kriptalnih abscesa, ulceracija i priliva neutrofila (za sve p<0.05) (Slika 15b). Anti-TNF-a antitelo je korišćeno kao pozitivna kontrola u dozama za koje je poznato da obezbeduju optimalnu korist.
[0187] Studije koje koriste dva dobro poznata modela inflamatornih bolesti creva, DSS i model transfera T-ćelija, su pokazale da su sistemski isporučena antitela TLR3 antagonisti dospela u sluznicu creva i smanjila upalu gastrointestinalnog trakta indukovanu preko dva različita patogena mehanizama. Tako, TLR3 antagonisti mogu biti korisni za lečenje inflamatornih bolesti creva, uključujući anti-TNF-a-refraktome slučajeve, i druge imuno-posredovane patologije u gastrointestinalnom traktu.
Primer12
Antitela TLR3antagonisti štite od kolanenom indukovanog artritisa
Model
[0188] Kolagenom indukovani artritis (CIA) model je korišćen kao model reumatoidnog artritisa.
[0189] Mužjaci B10RIII miševa (6-8 nedelja stari, Jackson Labs) su podeljeni u grupe od po 15 po grupi (artritis grupe) ili po 4 u grupi (kontrolni miševi). Artritis grupe su anestezirane sa izofluranom i date su im injekcije kolagena Tipa II (Elastin Products) i Freund kompletni adjuvans dopunjen sa M. tuberculosis (Difco) na dane 0 i 15. Na dan 12., miševi sa razvojem kolagen-artritisa tipa II su randomizovani prema telesnoj težini u grupe za tretman i dozirani subkutano (SC) u dane 12, 17, i 22 (d12, d17, d22) sa mAt 5429 (25 mg/kg), antitelom za negativnu kontrolu CVAM (rekombinantna mAt bez poznate specifičnosti kod miševa) (5 mg/kg) ili anti-TNF-a antitelom (5 mg/kg, pozitivna kontrola). Pored toga, kontrolne grupe miševa su tretirane sa nosačem (PBS) ili deksametazonom (0.5 mg/kg, Dex, referentno jedinjenje) subkutano (SC) svakodnevno (QD) u dane 12-25. Životinje su svakodnevno posmatrane od dana 12 do dana 26. Prednje i zadnje šape su procenjene pomoću kliničkog sistema bodovanja (prikazano ispod). Životinje su podvrgnute eutanaziji 26. dana ispitivanja i histopatologija je procenjena šlepom metodom (sistem bodovanja je opisan dole). Procena efikasnosti je zasnovana na telesnoj težini životinja i rezultatima kliničkog artritisa. Sve životinje su prežlvele do okončanja studije.
Klinički kriterijumi bodovanja prednjih i zadnjih ša<p>a
[0190]
0 - normalno
1 - pogođen zglob zadnje ili prednje šape ili minimalan difuzni eritem i oticanje
2 - pogođeni zglobovi zadnje ili prednje šape ili blag difuzni eritem i oticanje
3 - pogođeni zglobovi zadnje ili prednje šape ili umeren difuzni eritem i oticanje
4 - znatan difuzni eritem i oticanje, ili = pogođeni zglobovi 4 prsta)
5 - težak difuzni eritem i teško oticanje cele šape, ne može da savije prste)
Histopatološke metode bodovanja zglobova miša sa kolacen- artritisom Tipa II
[0191] Kada su bodovane šape Ili zglobovi miševa sa lezijama kolagen-artritisa tipa II, uzeta je u obzir ozbiljnost pramena, kao i broj pojedinačnih zglobova koji su pogođeni. Kada je pogođeno samo 1-3 zgloba šapa ili članaka od mogućeg broja metakarpalnih/metatarzalnih/prstiju ili tarzalnih/ tibiotarzalnih zglobova, arbitrarno dodeljivanje maksimalnog skora od 1, 2 ili 3 za parametre u nastavku je izvršeno u zavisnosti od težine pramena. Ako je bilo uključeno više od 2 zgloba, donji kriterijumi su primenjeni na najozbiljnije pogođene/većinu zglobova.
[0192] Klinički podaci bodovanja šapa su analizirani korišćenjem AUC za dane 1-15, i bili su izračunati % inhibicije za kontrole.
Upala.
[0193]
0 - normalno
1 - minimalna infiltracija inflamatornih ćelija u sinovijumu i periartikularnom tkivu pogođenih zglobova
2 - blaga infiltracija, šapa, ograničena na pogođene zglobove
3 - umerena infiltracija sa umerenim edemom, za šape, ograničena na pogođene zglobove
4 - znatna infiltracija koja pogađa većinu područja sa znatnim edemom
5 - teška difuzna infiltracija sa teškim edemom
Panus
[0194]
0 - normalan
1 - minimalna infiltracija panusa u sinovijumu i subhondralnoj kosti
2 - blaga infiltracija sa marginalnom zonom razaranja tvrdog tkiva u pogođenim zglobovima
3 - umerena infiltracija sa umerenim razaranjem tvrdog tkiva u pogođenim zglobovima
4 - znatna infiltracija sa znatnim razaranjem arhitekture zgloba, većina zglobova
5 - teška infiltracija u vezi sa potpunim ili skoro potpunim uništenjem zajedničke arhitekture, pogodjeni svi zglobovi
Oštećenje Hrskavice
[0195]
0 - normalna
1 - minimalan do blagi gubitak toluidin plavog bojenja bez očiglednog gubitka hondrocita ili razaranja kolagena u pogođenim zglobovima 2 - blagi gubitak toluidin plavog bojenja sa fokalnim blagim (površinskim) gubitkom hondrocita i/ili razaranjem kolagena u pogođenim zglobovima 3 - umereni gubitak toluidin plavog bojenja sa multifokalnim umerenim (dubine do srednje zone) gubitkom hondrocita i/i li razaranjem kolagena u pogođenim zglobovima 4 - znatan gubitak toluidin plavog bojenja sa multifokalnim umerenim (do duboke zone) gubitkom hondrocita i/ili razaranjem kolagena u većini zglobova 5 - težak difuzni gubitak toluidin plavog bojenja sa teškim multifokalnim (dubine do oznake plime) gubitkom hondrocita i/ili razaranjem kolagena u svim zglobovima
Resorpdja kostiju
[0196]
0 - normalna
1 - minimalna sa malim oblastima resorpclje, koje nisu očigledne pri malom uvećanju, retki osteoklasti u pogođenim zglobovima 2 - blaga sa više oblasti resorpcije, koje nisu očigledne pri malom uvećanju, brojniji osteoklasti u pogođenim zglobovima 3 - umerena sa očiglednom resorpcijom medularno trabekularne 1 kortikalne kosti bez defekata pune debljine u korteksu, manji gubitak medularne trabekule, uočljive lezije pri malom uvećanju, brojni osteoklasti u pogođenim zglobovima 4 - znatna sa nedostacima pune debljine u kortlkalnoj kosti, često sa narušavanjem profila preostale kortikalne površine, znatan gubitak medularne kosti, brojni osteoklasti, pogođeni svi zglobovi
5 - teška sa nedostacima pune debljine kortikalne kosti i uništavanjem zglobne arhitekture svih zglobova
Rezul tati
[0197] Deksametazon (Dex) i anti-mišje TNF-a antitelo su korišćeni kao pozitivna kontrola, PBS je korišćen kao kontrola nosača 1 CVAM je korišćen kao antitelo za negativnu kontrolu. Svi tretmani su započeti na 12. dan studije, tokom razvoja bolesti zglobova. Učestalost oboljenja za kontrolne životinje tretirane nosačem je bila 100% na 22. dan ispitivanja. Negativne kontrolne grupe tretirane sa nosačem ili CVAM antitelima su imale najviše kliničke skorove. Znatno manji klinički skorovi su uočeni za grupe tretirane sa Dex (p<0.05 za d18-d26), 5 mg/kg anti-TNF-a antitelom (p <0.05 za d18-26), ili 25 mg/kg mAt 5429 (p<0.05za d18-d23 1 d25-d26) (Slika 16). Klinički skorovi za artritis izraženi kao površina ispod krive (AUC) značajno su smanjeni lečenjem sa 25 mg/kg mAt 5429 (43% smanjenje), 5 mg/kg anti-TNF-a antitelom (52%) ili Dex (69%) u poređenju sa nosač kontrolom. Slika 17 prikazuje sredstva i standardne devijacije za AUC za svaku grupu.
[0198] Hlstopatološki efekti tretmana su takođe procenjeni. Resorpcija kosti šape je značajno smanjena lečenjem sa 25 mg/kg mAt 5429 (47% smanjenje) u poređenju sa nosač kontrolom. Pozitivna kontrola miševi tretirani sa 5 mg/kg anti-TNF-a antitela su imali značajna smanjenja upale šape (33%), oštećenja hrskavice (38%) i ukupnih skorova za šape (37%). Lečenje sa Dex je značajno smanjilo sve histopatološke parametre šapa (73% smanjenje ukupnih skorova).
[0199] Ovi podaci pokazuju da antitela TLR3 antagonisti poboljšavaju kliničke i histopatološke simptome bolesti u CIA modelu, 1 sugerišu korišćenje antagonista TLR3 za lečenje reumatoidnog artritisa.
Primer 14
Antitela TLR3 antagonisti štite od akutnih letalnih virusnih infekcija
Model
[0200] Model izazova virusom gripa tipa A je korišćen kao model akutne letalne virusne infekcije.
[0201] Na dane -1, 4, 8 i 12, ženke C57BL/6 miša (12 nedelja stare) ili ženke TLR3KO miševa (C57BL/6 background; 12 nedelja, ACE Anlmals, Inc., 15 miševa po grupi) su subkutano dozirani sa 20 mg/kg mAt 5429, 111 samo sa PBS. Na dan 0, miševi su anestezirani izofluranom i intranazalno im je administriran virus Influenca A/PR/8/34 (ATCC, Rockland, MD, Lot no. 218171), u 25 pl PBS (ekvivalentno 10<5>" CEID50). Životinjama su dva puta dnevno praćene promene telesne težine I preživljavanje u periodu od 14 dana. Sistem kliničkog bodovanja je korišćen za procenu nivoa progresije bolesti i suptilnih poboljšanja u odgovoru na Influenca virus A tretman.
Klinički rezultati
[0202]
0 - normalan, oprezan i reaktivan, bez vidljivih znakova bolesti
1 - nakostrešeno krzno, sa ili bez neznatno smanjenom ambulacijom
2 - nakostrešeno krzno, pogrbljen stav pri hodu, nerada ambulacija, otežano disanje
3 - nakostrešeno krzno, otežano disanje, ataksija, drhtavica
4 - nakostrešeno krzno, nemogućnost ambulacije na blago guranje, nesvesnost, hladan na dodir
5 - nađen mrtav
Rezultati
[0203] U studiji je ocenjivano preživljavanje, dnevni klinički skorovi 1 promene telesne težine. Oba, I influencom A zaraženi WT miš administriran sa mAt 5429 (20 mg/kg) i influencom A inficirani TLR3KO miš koji nije primio mAt 5429 su pokazali statistički značajno povećanje preživljavanja (p <0.001 i p <0.01, respektivno) u poređenju sa C57BL/6 miševima inokulisanlm influence virusom, što ukazuje da antagonizam ili nedostatak TLR3 može da spreči influencom-indukovanu smrtnost (slika 18). Klinički skorovi su značajno smanjeni u grupi koja je primala 20 mg/kg mAt 5429, kao i u TLR3K0 grupi (Slika 19). Telesna težina miševa je praćena tokom perioda od 14 dana nakon administracije influenca virusa. Kod C57BL/6 miševa doziranih sa influenca A virusom telesna težina se stalno smanjivala. Međutim, C57BL/6 miševi dozirani sa 20 mg/kg mAt 5429 i TLR3KO miševi su pokazali značajno veće telesne težine u odnosu na VvT C57BL/6 miševe kojima je ubrizgan Influenca virus (Slika 20). Ovi rezultati pokazuju da TLR3 antitela antagonisti smanjuju kliničke simptome i mortalitet u modelu akutne letalne Influenca virusne infekcije, i sugerišu da TLR3 antagonisti mogu pružiti zaštitu za ljude u akutnim infektivnim stanjima.
Primer 15
Antitela TLR3 antagonisti pobollsalu hlpergllkemllu 1 snlžavalu Insulin u<p>lazmi
Model
[0204] Model gojaznosti indukovane ishranom (DIO) je korišćen kao model hiperglikemije i insulinske rezistencije i gojaznosti.
[0205] C57BL/6 VVT životinje (oko 3 nedelje stare, Jackson Labs) 1 TLR3K0 životinje (C57BL/6 background; oko 3 nedelje stare, Ace Animals, Inc.) su držane na punomasnoj dijeti tokom 12 do 16 nedelja. TLR3KO i VVT C57BL/6 miševi su hranjeni sa normalnom hranom i sa punomasnom hranom (Purina TestDiet cat. no. 58126) koja se sastoji od masti sa 60.9% kcal i ugljenih hidrata sa 20.8% kcal. Miševi su držani na 12:12-h ciklusu svetlo-mrak, sa vodom I hranom ad libitum. Težina svakog miša u svakoj grupi je merena nedeljno. mAt 5429 im je davano Intraperitonealno dva puta nedeljno prve nedelje a zatim jednom nedeljno tokom ukupno 7 nedelja. Uzorci retro-orbitalnog krvnog seruma nakon gladovanja su korišćeni za merenje insulina u navedenim vremenskim tačkama. Testovi glukozne tolerancije su izvedeni i.p. davanjem glukoze 1.0 mg/g telesne težine posle gladovanja tokom noći u 7. nedelji. Pored toga, meren im je nivo insulina nakon gladovanja i nivo glukoze u plazmi.
[0206] HOMA-IR je određena Iz jednačine na bazi nivoa glukoze nakon gladovanja i nivoa insulina nakon gladovanja (12) korišćenjem sledeće jednačine: HOMA-IR - ((glukoza nakon gladovanja (mmol/L) x insulin nakon gladovanja (mU/l))/22.5 (Wallace et al., Diabetes Care 27:1487-1495, 2004). Glukoza u krvi (BG) je određena pomoću testa za glukoza-oksidazu. Nivoi insulina nakon gladovanja su određivani pomoću insulin pacov/miš ELISA kompleta (Crvstal Chem, cat. No. 90060).
Rezultati
[0207] Nakon 12-16 nedeljne ishrane sa visokim sadržajem masti, WT DIO životinje su bile hiperglikemične i hiperinsulinemične. Tolerancija glukoze je poboljšana kod VVT DIO životinja, ali ne 1 kod TLR3KO DIO životinja nakon tretmana sa mAt 5429. Značajno smanjeni nivoi glukoze u krvi posle glukoznog izazova, su uočeni kod životinja tretiranih sa mAt 5429 na 60, 90, 120 i 180 min, u odnosu na kontrolu (samo PBS) (Slika 21A). Smanjenje od oko 21% vrednosti AUC je uočeno kod VVT DIO životinja tretiranih sa mAt 5429, u poredjenju sa VVT DIO miševima koji nisu primili mAt. Nivoi Insulina nakon gladovanja kod VVT DIO životinja tretiranih mAt 5429, su takođe smanjeni (Slika 22). TLR3K0 DIO životinje nisu pokazale poboljšanje insulina nakon gladovanja posle tretmana sa mAt, 5429. Analiza homeostatičkim modelom procene (HOMA) je pokazala bolju osetljfvost na insulin kod VVT DIO životinja tretiranih sa mAt 5429, ali ne i kod TLR3KO DIO životinja. HOMA-IR vrednosti su bile 14.0±9.8, 8.7±4.9, 9.0±3.0 za WT DIO, 5 mg/kg težine za VVT DIO mAt 5429, i 20 mg/kg težine za VVT DIO mAt 5429 životinje, respektivno. Kod TLR3KO DIO životinja nije uočen nikakav efekat.
[0208] Studija je pokazala da antitela TLR3 antagonisti poboljšavaju otpornost na insulin i smanjuju glukozu nakon gladovanja u DIO modelu bez gubitka težine, sugerišući da TLR3 antagonisti mogu biti korisni za lečenje hiperglikemije, otpornosti na insulin, i dijabetesa tipa II.
Primer 16
AntitelaTLR3antagonisti štite od bakterijom I virusom Indukovanlh inflamatornih od<g>ovora
Reagensi
[0209] Atipični hemofilus influence (NTHi) sojevi 35, izolovani od COBP pacijenata sa bakterijskim egzacerbacijama, su dobijeni od Dr. TF Murphv (Buffalo VA Medical Center, Buffalo, NY). Humani rinovirus 16 je dobijen od Američke kolekcije uzoraka kultura (ATCC) sa TCID(50) = 2.8 x ICC/ml.
Testovi NTHi stimulacije
[0210] NHBE ćelije (Lonza, VVakersville, MD) su zasejane u Microtest ploče sa 96-velova (BD Biosciences, Bedford, MA) pri 1 x 10<s>/velu. NTHI gajene na agar pločama 16-20 h su resuspendovane u medijumu za kulturu -2 x 10<*>CFU/ml, tretirane sa 100 pg/ml gentamicina tokom 30 min i razdeljene po -2 x 107velu u ploče sa 96 velova koje sadrže NHBE. Posle 3 h, supernatanti su uklonjeni i zamenjeni svežim medijumom za kulturu sa ili bez antitela (konačne koncentracije 0.08 do 50 pg/ml). Nakon dodatnih 24h inkubacije, analizirano je prisustvo citokina i hemokina u ćelijskim supernatantima u triplikatu, sa Cvtokine 25-Plex AB kompletom sa perlicama, Human (uključujući IL-1B, IL-IRA, IL-2, IL-2R, IL-4 , IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL12p40p70, IL-13, IL-15, IL-17, TNF-a, IFN-a, IFN-y, GM-CSF MIP-1a, MIP-1B IP-10, MIG, eotaksin, RANTES i MCP-1) (Life Technologies, Carslbad CA) u Luminex 100IS multiplex fluorescentnom sistemu sa analizatorom i čitačem (Luminex Corporation, Austin, TX).
Testovi stimulacije Rinovirusa
[0211] NHBE ćelije su zasejane u Mikrotest ploče sa 96 velova za kulturu tkiva (BD Biosciences, Bedford, MA) sa 1 x 10<5>ćelija/velu. Sutradan su u NHBE ili BEAS-2B ćelije dodata antitela (konačne koncentracije 0.08 do 50 pg/ml) i inkubirana 1 h, a zatim je dodat rinovirus 10 pl/velu. Nakon dodatnih 24h inkubacije, analizirano je prisustvo citokina i hemokina u ćelijskim supernatantima pomoću luminex testova kao što je gore opisano.
BezuiižlL
[0212] mAt 15EVQ je inhibiralo NTHi indukovanu IP-10/CXCL10 i RANTES/CCL5 produkciju na dozno zavisan način, dok kontrolno antitelo, humani lgG4 (Slgma, St. Louis, MO), nije pokazalo inhibitorni efekat na NTHi stimulaciju (Slika 23A). mAt 15EVQ takođe inhibira produkciju CXCL10/IP 10 i CCL5/RANTES indukovanu rinovirusom (Slika 23B).
Primer 17
Antitela TLR3 antagonisti suzbllalu inflamatorne o dgovore u astroctlma
Metode
[0213] Normalni humani astrociti od 2 donora (Lonza, Walkersville, MD) su zasejani u ploče sa 24 vela sa 75,000 ćelija/velu i ostavljeni preko noći da se zalepe. Sledećeg dana, astrociti su tretirani 24 sata sa 200 ng/ml poly(l:C) i/ili 10 pg/ml mAt 18. Citokini su mereni pomoću Luminex-a.
Rezultati
[0214] Produkcija IL-6, IL-8, IL-12, IFN-a, IFN-y, CKSCL9/MIG, CCL3/MIP-1a, CC14, CCL5/RANTES i CXCL10/IP-10 indukovana sa Poly(l:C), je inhibirana pomoću mAt 18, kako je prikazano u Tabeli 10.
Primer 18
Antitela TLR3antagonisti potiskuju inflamatorne odgovore u endotelijalnim ćelijama
Metode
[0215] HUVEC ćelije (Lonza, V/alkersville, MD) su kultivisane u serumu koji sadrži medijum za kulturu koji preporučuje Lonza. Ćelije su resuspendovane u medijumu bez seruma (Lonza, Walkersville, MD), zasejane na ploče sa 96-velova sa 3x10<5>ćelija/ml i inkubirane 24 sata na 37 'C, 5% C02. Poly(l:C) (GE Healthcare, Piscataway, NJ) je dodat u rastućim koncentracijama (1.5 do 100 pg/mL) i inkubiran dodatnih 24 sata na 37 "C. Za testove inhibicije citokina, ćelijama je dodato mAt 15EVQ_sa različitim koncentracijama (0 - 50 ug/mL) i inkubirane su 30 min, nakon čega je dodato 20 pg/ml poly(l:C) tokom 24 časa. Ćelijski supernatanti su sakupljeni i nivoi citokina su mereni pomoću kompleta human citokin 30-plex i Luminex MAP tehnologije (Invitrogen Corp., Carslbad, CA). Za merenje slCAM-1 ekpesije HUVEC ćelije su tretirane sa 20 pg/ml poly(l:C) i različitim koncentracijama mAt 15EVQ (0.8 - 50 pg/ml). Ćelijski supernatanti su analizirani za slCAM-1 ekspresiju pomoću ELISA (R&D Svstems). Ćelijska vijabilnost je merena pomoću CellTiterGlo kompleta (Promega, Madison, Wl).
Rezultati
[0216] U odgovoru na poly(l:C) HUVEC ćelije su proizvele sledeće citokine: IL-1RA, IL-2, IL-2R, IL-6, IL-7, CKSCL8/IL-8,IL-12 (p40-p70), IL-15, 1L-17, TNF-a, IFN-a, IFN-y, GM-CSF, CCL3/MIP-1a, CC14/MIP-1B, CKCL1O/IP-10, CCL5/RANTES,
CCL2/MCP-1, VEGF, G-CSF, FGF-basic, i HGF (Tabela 11). mAt 15EVQ je na dozno-zavisan način smanjilo nivoe svih citokina indukovane sa poly(l:C) (Tabela 12). Sposobnost mAt 15EVQda smanji produkciju, CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, i CXCL10/IP-10, indukovanu sa poly(l:C), sugerisala je da inhibicija TLR3-posredovanih aktivnosti može štititi od infiltracije leukocitnih i T ćelija koja može dovesti do ateroskleroze. Takođe, inhibicija VEGF pomoću mAt 15EVQ je sugerisala potencijalnu korist od blokade TLR3 kod patologija posredovanih od VEGF, uključujući angiogenezu kod različitih kancera i očnih bolesti kao što je starosna makularna degeneracija.
[0217] TNF-a i IFN-y učestvuju u regrutaciji leukocita i povećavaju ekspresiju adhezionih molekula na aktiviranom endotelijumu (Doukas et al., Am. J. Pathol. 145:137-47, 1994; Pober et al., Am. J. Pathol. 133:426-33, 1988). CCL2/MCP-1, CCL5/RANTES, i CXCL10/IP-10 su uključeni u regrutovanje monocita i T ćelija i doprinose razvoju ateroskleroze (Lundgerg et al., Clin. Immunol. 2009.). Generacija VEGF od strane endotelijalnih ćelija je povezana sa abnormalnim rastom tkiva ili tumora tokom angiogeneze kod različitih kancera (Livengood et al., Cell Immunol 249:55-62, 2007).
[0218] Solubilni Intercelularni Adhezivni Molekul 1 (slCAM-1) se generiše proteolitičkim cepanjem i predstavlja marker za aktivaciju endotelijalnih ćelija. ICAM-1 igra ključnu ulogu u migraciji i aktivaciji leukocita i ushodno je regulisan na endotelnim ćelijama i epitelnim ćelijama tokom inflamacije gde posreduje u adhezlji leukocita putem integrinskih molekula LFA-1 1 Mac-1. Poly(l:C) je aktivirao endotelijalne ćelije za ushodnu regulaciju slCAM-1 ekspresije, a ushodna regulacija je smanjena tretmanom sa mAt 15EVQ. (Slika 24A).
[0219] Ovo ukazuje na to da antitela TLR3 antagonisti mogu da inhibiraju migraciju leukocita a time i oštećenja tkiva izazvana prilivom inflamatornih ćelija.
[0220] Za testove vijabilnosti, HUVEC ćelije su gajene, zasejane i stimulisane sa poly(l:C) kako je prethodno opisano. mAt 15EVQ je, na dozno zavisan način, obnovilo smanjenu vijabilnost HUVEC ćelija indukovanu sa poly(l:C) (Slika 24B).
[0221] Nishodna-modulacija aktivacije endotelijalnih ćelija može potisnuti prekomernu infiltraciju imunih ćelija i smanjiti oštećenja tkiva uzrokovana citokinima koji se uvećavaju tokom inflamatornih stanja. Zapaljenje i prekomerna ekspresija citokina i adhezivnih molekula na endotelijalnim ćelijama su glavni uzroci razvoja ateroskleroze i hipertenzije. Ovi podaci daju obrazloženje za istraživanje potencijalne koristi antagonista TLR3 za upotrebu kod bolesti krvnih sudova, uključujući vaskulitise, i one koje karakteriše disfunkcija endotela. Druga bolest na koju utiče inflamacija i prekomerno eksprimiranl citokini je Kapošijev sarkom (KS) koji je uobičajen kod imunosuprimiranih i osoba inficiranih HlV-om i uzrokovana je herpes virusom Kapošijevog sarkoma (KSHV). Produkcija VEGF i citokina doprinosi preživljavanju KS ćelija (Livengood et al., Immunol. 249: 55-62, 2007). TLR3 antagonisti mogu biti od koristi u smanjenju angiogenskih rizika povezanih sa KS i drugim tumorima i u sprečavanju gubitka ćelijske vijabilnosti i zaštite integriteta endotelne barijere da bi se sprečilo curenje krvnih sudova, potencijalno ozbiljno stanje povezano sa otkazivanjem organa i opasnim po život upalnim stanjima, kao što su sepse. TLR3 antagonisti takođe mogu biti korisni kod virusnih infekcija uključujući patologije endotelijalnih ćelija kao što su virusne hemoragične groznice izazvane od članova porodice Flaviviridae (npr. denga, žuta groznica), filoviridae (Ebola, Marburg), Buniaviridae (npr. Hantavirusa, Nairovirus, Phlebovlrus), i Arenaviridae (npr. Lujo, Lasa, Argentinska, Bolivijska, Venecuelanska hemoragijska groznica (Sihibamiya et al., Blood 113:714-722, 2009).
Primer 19
Unakrsna reaktivnost antitela TLR3 antagonista sa cvnomolaus 1 mišlim TLR3
[0222] Aktivnost protiv cynomolgus ili mišjeg TLR3 je procenjena pomoću ISRE testa reporterskog gena, kao što je
opisano u Primeru 2. Cvnomolgus (SEK ID BR: 217) 1 mišja TLR3 cDNK (SEK ID BR: 161) su amplifikovane iz cele krvi i
klonirane u vektor pCEP4 (Clontech), i eksprimirane kako je gore opisano. mAt 15EVQ Je imalo IC50 od 4.18 pg/ml i 1.74 pg/ml u cyno NF-kB i ISRE testovima, respektivno, u poređenju sa IC50 od 0.44 i 0.65 pg/ml u humanim TLR3 NF-kB I ISRE esejima, respektivno. Antitela, kontrole Izotipa nisu imala efekta u ovim testovima.

Claims (10)

1. Izolovano antitelo ili njegov fragment reaktivni sa toll-like receptorom 3 (TLR3), obuhvatajući varijabilne regione i teškog lanca i lakog lanca, pri čemu antitelo obuhvata: a. aminokiselinske sekvence teškog lanca CDR 1, 2 i 3 kao što je prikazano u SEK ID BR:s 82, 86 i 84; i b. aminokiselinske sekvence lakog lanca CDR 1, 2 i 3 kao što je prikazano u SEK ID BR:s 79, 80 i 87.
2. Izolovano antitelo ili fragment prema zahtevu 1, obuhvatajući varijabilni region teškog lanca SEK ID BR: 216 i varijabilni region lakog lanca SEK ID BR: 41.
3. Izolovano antitelo ili fragment prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, koje sadrži teški lanac SEK ID BR: 220 i laki lanac SEK ID BR: 156.
4. Izolovano antitelo ili fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, naznačeno time što antitelo ima najmanje jedno od sledećih svojstava: a. smanjuje biološku aktivnost humanog TLR3 uIn vitropoli(l:C) NF-kB testu reporterskog gena za > 50% pri <1 pg/ml; b. inhibira> 60% produkciju IL-6 ili CXCL10/IP-10 iz BEAS-2B ćelija stimulisanih sa <100ng /ml poli(l:C) pri <10<p>g/mL; c. inhibira> 50% produkciju IL-6 ili CXCL10/IP-10 iz BEAS-2B ćelija stimulisanih sa <100 ng /ml poli(l:C) pri <0.4<p>g/ml; d. inhibira>50% produkciju IL-6 iz NHBE ćelija stimulisanih sa 62.5 ng/ml poli(l:C) pri <5pg/ml; e. inhibira>50% produkciju IL-6 iz NHBE ćelija stimulisanih sa 62.5 ng/ml poli(l:C) pri <1 pg/ml; f. inhibira> 20% poli (I: C) indukovanu, produkciju IFN-y IL-6 ili IL-12 iz PBMC ćelija pri<1pg/ml; g. inhibira biološku aktivnost cvnomotogus TLR3 uIn vitroNF-kB testu reporterskog gena sa IC50 <10 pg/ml; ili h. inhibira cvnomologus biološku aktivnost TLR3 u inWtroISRE testu reporterskog gena sa IC50 <5 pg/ml.
5. Izolovano antitelo ili fragment prema bilo kojem od prethodnog a. antitelo je potpuno humano; b. antitelo ili fragment je humano-adaptirano; c. antitelo je konjugovano sa polietilen glikolom; ili d. njegov Fc domen obuhvata mutacije S229P, P235A ili L236A.
6. Izolovano antitelo ili fragment prema bilo kojem od prethodnih zahteva koje ima lgG4 izotip.
7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži izolovano antitelo ili fragment prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač.
8. Izolovano antitelo ili fragment prema bilo kojem od zahteva od 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u terapiji.
9. Izolovano antitelo ili fragment prema bilo kojem od zahteva od 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u postupku lečenja: a) inflamatornog stanja, pri čemu inflamatorno stanje opciono: i) pogađa tkivo izabrano iz grupe koja se sastoji od respiratornog trakta, pluća, gastrointestinalnog trakta, tankog creva, debelog creva, kolona, rektuma, kardiovaskularnog sistema, srčanog tkiva, krvnih sudova, zglobova, kosti i sinovijalnog tkiva, hrskavice, epitela, endotela, hepatičnog ili adipoznog tkiva; ii) je povezano sa povećanom infiltracijom neutrofila u tkivu posredovanom od TLR3; iii) je stanje upale pluća, opciono: I) astma ili hronična opstruktivna bolest pluća (COPD); II) izazvano Netipičnom Hemofilus Influencom; ili III) hiperesponzivnost disajnih puteva, opciono udružena sa astmom, alergijskim rinitisom, COPD ili cističnom fibrozom; iv) je inflamatorna bolest creva; v) je povezana sa gastrointestinalnom ulceracijom, opciono infektivnim kolitisom, ishemijskim kolitisom, kolagenoznim ili limfocitnim kolitisom ili nekrotizirajućim enterokolitisom; ili vi) je autoimuna bolest, opciono reumatoidna b) dijabetes tipa II; c) hiperglikemija; ili d) hiperinsulinemija; pri čemu se postupak sastoji od administriranja terapeutski efikasne količine izolovanog antitela ili fragmenta ili farmaceutske kompozicije pacijentu kome je to potrebno tokom vremena dovoljnog za lečenje ili prevenciju inflamatornog stanja, dijabetesa tipa II, hiperglikemije ili rezistentnosti na insulin.
10. Izolovano antitelo ili fragment prema bilo kojem od zahteva od 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije: a) sistemskog inflamatornog stanja, opciono citokinske oluje ili hipercitokinemije, sistemskog sindroma inflamatornog odgovora (SIRS), graft versus host bolesti (GVHD), akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS), teškog akutnog respiratornog distres sindroma (SARS), katastrofalnog antifosfolipidnog sindroma, teške virusne infekcije, influence, pneumonije, šoka ili sepse; ili b) virusnih infekcija, opciono influence A virusne infekcije; pri čemu se postupak sastoji od administriranja terapeutski efikasne količine izolovanog antitela ili fragmenta ili farmaceutske kompozicije pacijentu kome je to potrebno, tokom vremena dovoljnog za lečenje ili prevenciju sistemskog inflamatornog stanja ili virusne infekcije.
RS20170263A 2008-10-31 2009-10-30 Antagonisti toll-like receptora 3 RS55861B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10997408P 2008-10-31 2008-10-31
US16186009P 2009-03-20 2009-03-20
US16510009P 2009-03-31 2009-03-31
US17368609P 2009-04-29 2009-04-29
PCT/US2009/062813 WO2010051470A2 (en) 2008-10-31 2009-10-30 Toll-like receptor 3 antagonists
EP09824182.1A EP2350304B1 (en) 2008-10-31 2009-10-30 Toll-like receptor 3 antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55861B1 true RS55861B1 (sr) 2017-08-31

Family

ID=42129569

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170263A RS55861B1 (sr) 2008-10-31 2009-10-30 Antagonisti toll-like receptora 3

Country Status (32)

Country Link
US (8) US8409567B2 (sr)
EP (1) EP2350304B1 (sr)
JP (1) JP5751631B2 (sr)
KR (1) KR101683033B1 (sr)
CN (2) CN105601742A (sr)
AU (1) AU2009308763B2 (sr)
BR (1) BRPI0921696A2 (sr)
CA (1) CA2742014A1 (sr)
CL (1) CL2011000975A1 (sr)
CO (1) CO6362052A2 (sr)
CY (1) CY1118797T1 (sr)
DK (1) DK2350304T3 (sr)
EA (2) EA022832B1 (sr)
EC (1) ECSP11011072A (sr)
ES (1) ES2618567T3 (sr)
HR (1) HRP20170415T1 (sr)
HU (1) HUE031756T2 (sr)
IL (1) IL212545A (sr)
LT (1) LT2350304T (sr)
MX (1) MX2011004635A (sr)
MY (1) MY183144A (sr)
NI (1) NI201100085A (sr)
NZ (2) NZ592542A (sr)
PE (1) PE20110808A1 (sr)
PL (1) PL2350304T3 (sr)
PT (1) PT2350304T (sr)
RS (1) RS55861B1 (sr)
SI (1) SI2350304T1 (sr)
SM (2) SMT201700127T1 (sr)
SV (1) SV2011003891A (sr)
UA (1) UA109397C2 (sr)
WO (1) WO2010051470A2 (sr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130090457A1 (en) * 2008-10-31 2013-04-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
US8460659B2 (en) 2008-10-31 2013-06-11 Janssen Biotech, Inc. Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
PE20110808A1 (es) 2008-10-31 2011-10-31 Janssen Biotech Inc Anticuerpos contra el receptor 3 de tipo toll
EA021512B1 (ru) * 2009-04-29 2015-07-30 Янссен Байотек Инк. Антагонисты толл-подобного рецептора 3
ES2543095T3 (es) 2009-07-10 2015-08-14 Innate Pharma Agentes de unión a TLR3
WO2012095432A2 (en) 2011-01-12 2012-07-19 Innate Pharma Tlr3 binding agents
CA2855955A1 (en) * 2011-09-12 2013-03-21 Janssen Biotech, Inc. Toll-like receptor 3 antagonists
EP2855527B1 (en) 2012-05-31 2018-08-01 Innate Pharma Tlr3 binding agents
EP3560960A1 (en) * 2013-04-22 2019-10-30 The University of Tokyo Preventive or therapeutic agent for inflammatory disease
US8906951B1 (en) 2013-06-24 2014-12-09 Tigercat Pharma, Inc. Use of NK-1 receptor antagonists in pruritus
US9198898B2 (en) 2013-06-24 2015-12-01 Tigercat Pharma, Inc. Use of NK-1 receptor antagonists in pruritus
WO2015016282A1 (ja) * 2013-07-30 2015-02-05 国立大学法人東京大学 放射線誘導性消化管症候群の予防又は治療用医薬組成物
GB201522394D0 (en) * 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
TWI736575B (zh) 2016-01-22 2021-08-21 美商默沙東藥廠 抗凝固因子ｘｉ抗體
IL263272B2 (en) 2016-06-14 2025-07-01 Merck Sharp & Dohme Antibodies to coagulation factor xi
US10429214B2 (en) * 2017-03-07 2019-10-01 Newtonoid Technologies, L.L.C. Modular elongated wall-mounted sensor system and method
CN109136231B (zh) * 2018-09-14 2019-08-30 苏州大学 一种翘嘴鳜tlr3基因及其应用
EP4531910A2 (en) * 2022-05-31 2025-04-09 The University of Chicago Chemical screen of modulators for vaccine adjuvants

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO2003031573A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
JP2004016021A (ja) * 2002-06-12 2004-01-22 Japan Science & Technology Corp 抗体および阻害剤並びにそれを用いた形質転換方法および形質転換キット
BRPI0411514A (pt) * 2003-06-20 2006-08-01 Coley Pharm Gmbh antagonistas de receptor toll-like de molécula pequena
CA2483732A1 (en) 2004-09-29 2006-03-29 Ronan Le Goffic Toll-like receptor 3, its signalling associated molecule trif and their use thereof
UA97229C2 (ru) * 2004-11-30 2012-01-25 Центокор, Инк. Изолированное моноклональное антитело, которое специфически связывается с toll-подобным рецептором 3 (tlr3)
AR051836A1 (es) * 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
DK1945820T3 (da) * 2005-10-27 2013-11-11 Janssen Biotech Inc Toll-lignende receptor-3-modulatorer, fremgangsmåder og anvendelser
EP2134172A4 (en) * 2007-03-05 2011-06-01 Univ Utah State RESTRICTIVE AGONIST OF THE TOLL LIKE RECEPTOR 3
EP2155889A4 (en) * 2007-05-25 2010-06-16 Centocor Ortho Biotech Inc TOLL RECEPTOR 3 MODULATORS AND USES THEREOF
DK2334703T3 (en) * 2008-09-17 2015-10-05 Innate Pharma Configurations and methods for detection of tlr3
WO2010040054A2 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods for suppressing toll-like receptor activity
PE20110808A1 (es) * 2008-10-31 2011-10-31 Janssen Biotech Inc Anticuerpos contra el receptor 3 de tipo toll
US20100188778A1 (en) * 2009-01-29 2010-07-29 Castagna Joseph T Disk Drive Assembly Having Flexible Support for Flexible Printed Circuit Board
EA021512B1 (ru) 2009-04-29 2015-07-30 Янссен Байотек Инк. Антагонисты толл-подобного рецептора 3
ES2543095T3 (es) * 2009-07-10 2015-08-14 Innate Pharma Agentes de unión a TLR3

Also Published As

Publication number Publication date
CA2742014A1 (en) 2010-05-06
US20140093508A1 (en) 2014-04-03
EP2350304A4 (en) 2014-04-16
US20110008352A1 (en) 2011-01-13
IL212545A (en) 2014-07-31
ECSP11011072A (es) 2011-06-30
UA109397C2 (uk) 2015-08-25
NI201100085A (es) 2011-11-21
CO6362052A2 (es) 2012-01-20
US20140212426A1 (en) 2014-07-31
SV2011003891A (es) 2011-07-21
US20100166778A1 (en) 2010-07-01
CL2011000975A1 (es) 2012-02-03
MX2011004635A (es) 2011-07-19
US9255153B2 (en) 2016-02-09
EP2350304B1 (en) 2016-12-14
HRP20170415T1 (hr) 2017-05-05
US20170058041A1 (en) 2017-03-02
PT2350304T (pt) 2017-03-23
US9481731B2 (en) 2016-11-01
HK1166105A1 (zh) 2012-10-19
MY183144A (en) 2021-02-16
NZ603824A (en) 2013-11-29
US9522957B2 (en) 2016-12-20
US8409567B2 (en) 2013-04-02
JP5751631B2 (ja) 2015-07-22
CN102300997B (zh) 2016-01-20
KR20110081874A (ko) 2011-07-14
HUE031756T2 (en) 2017-07-28
US9238693B2 (en) 2016-01-19
WO2010051470A2 (en) 2010-05-06
LT2350304T (lt) 2017-02-10
BRPI0921696A2 (pt) 2015-08-18
CN102300997A (zh) 2011-12-28
SMT201700127T1 (it) 2017-03-08
PL2350304T3 (pl) 2017-06-30
AU2009308763B2 (en) 2017-03-09
US20180179294A1 (en) 2018-06-28
AU2009308763A1 (en) 2010-05-06
US8540986B2 (en) 2013-09-24
US20130244281A1 (en) 2013-09-19
IL212545A0 (en) 2011-06-30
CY1118797T1 (el) 2017-07-12
KR101683033B1 (ko) 2016-12-06
US20130280263A1 (en) 2013-10-24
SMT201700127B (it) 2017-03-08
SI2350304T1 (sl) 2017-04-26
EA201170636A1 (ru) 2012-03-30
NZ592542A (en) 2013-01-25
CN105601742A (zh) 2016-05-25
JP2012507564A (ja) 2012-03-29
EA201500316A1 (ru) 2016-01-29
EP2350304A2 (en) 2011-08-03
PE20110808A1 (es) 2011-10-31
ES2618567T3 (es) 2017-06-21
US9932404B2 (en) 2018-04-03
EA022832B1 (ru) 2016-03-31
DK2350304T3 (en) 2017-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS55861B1 (sr) Antagonisti toll-like receptora 3
US20130090457A1 (en) Toll-Like Receptor 3 Antagonists for the Treatment of Metabolic and Cardiovascular Diseases
EP2425008B1 (en) Toll-like receptor 3 antagonists
US8460659B2 (en) Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
EP2755685A1 (en) Toll-like receptor 3 antagonists for the treatment of metabolic and cardiovascular diseases
HK1225044A (en) Toll-like receptor 3 antagonists
HK1225044A1 (en) Toll-like receptor 3 antagonists
HK1166105B (en) Toll-like receptor 3 antagonists