KR102716144B1 - 신경퇴행을 검출하기 위한 분석 - Google Patents

신경퇴행을 검출하기 위한 분석 Download PDF

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Abstract

샘플에서 단일- 또는 다중-인산화된 p217+ 타우 단백질의 양을 측정하는 방법이 제공된다. 타우병증을 검출 또는 진단하는 방법, 타우병증의 치료의 유효성을 결정하는 방법 및 대상이 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합한지 여부를 결정하는 방법이 또한 제공된다. 또한, 상기 방법에서 사용하기 위한 항체 및 항체를 포함하는 키트가 기재된다.

Description

신경퇴행을 검출하기 위한 분석
본 발명은 신경퇴행을 검출하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생물학적 샘플에서 단일- 또는 다중-인산화된 p217+ 타우(tau) 단백질 종의 양을 측정하는 방법 및 이의 용도뿐만 아니라 본 방법에 사용하기 위한 항체 및 키트에 관한 것이다.
임상적으로 알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)은 기억, 인지, 사고, 판단, 및 감정적 안정성의 점진적인 상실로 인하여 점차적으로 극심한 정신 황폐(mental deterioration) 및 궁극적으로 사망에 이르게 하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌 장애이다. AD는 노인의 진행성 정신 부전(치매)의 매우 흔한 원인으로, 미국에서 네 번째로 흔한 의학적 사망 원인을 나타내는 것으로 여겨진다. AD는 전세계적으로 인종 집단에서 관찰되었으며, 현재와 미래의 공중 보건상의 주요 문제를 제시한다.
AD에 걸린 개체의 뇌에는 노인성(또는 아밀로이드) 플라크, 아밀로이드 혈관병증(혈관 내 아밀로이드 침착) 및 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle)으로 명명되는 특징적인 병변이 나타난다. 다수의 이들 병변, 특히 쌍 나선형 필라멘트의 신경섬유매듭 및 아밀로이드 플라크가 AD에 걸린 환자에서 기억 및 인지 기능에 중요한 인간 뇌의 여러 영역에서 일반적으로 발견된다.
신경섬유매듭은 과인산화된 타우 단백질의 응집체로 주로 구성된다. 타우의 주요 생리학적 기능은 미세소관 중합 및 안정화이다. 미세소관에 대한 타우의 결합은 타우의 미세소관 결합 영역 내의 양전하와 미세소관 격자 상의 음전하 사이의 이온 상호작용에 의해 일어난다(문헌[Butner and Kirschner, J Cell Biol. 115(3):717-30, 1991]). 타우 단백질은 85개의 가능한 인산화 부위를 함유하며, 이들 부위 중 다수에서의 인산화는 타우의 주요 기능을 방해한다. AD에서 응집된 타우는 과인산화되어 있는 반면에, 축삭 미세소관 격자에 결합된 타우는 저인산화 상태에 있어, 타우의 생리학적으로 활성인 풀(pool)과 구별되는 특유의 에피토프를 제공한다(문헌[Iqbal et al., Curr Alzheimer Res. 7(8): 656-664, 2010]).
AD 뇌에서 타우병증의 진행은 구별되는 확산 패턴을 따른다. 타우병증 전파 및 확산 가설이 기재된 바 있으며, 이는 인간 뇌에서 타우병증 진행의 브라카 스테이지(Braak stage) 및 전임상 타우 모델에서 타우 응집체 주사 후의 타우병증 확산을 기반으로 한다(문헌[Frost et al., J Biol Chem. 284:12845-52, 2009]; 문헌[Clavaguera et al., Nat Cell Biol. 11:909-13, 2009]). 타우병증은 하나의 뇌 영역으로부터 그 다음 뇌 영역으로 프리온과 유사한 방식으로 확산될 수 있는 것으로 여겨진다. 이러한 확산 과정은 근처 뉴런에 의해 흡수될 수 있는 타우 시드(seed)의 외재화를 수반하여 추가의 타우병증을 유도할 것이다.
신경섬유매듭 내의 타우 단백질의 단편은 뇌척수액(CSF)으로 이동하며, 여기서 이들은 요추 천자에 의해 수확되고 민감한 분석에 의해 측정될 수 있다. 따라서, 신경 질환의 존재를 CSF에서 타우 단백질-유래 단편을 인식하는 분석을 사용하여 검출할 수 있다. 이러한 타우 분석에는 신경퇴행성 장애에 특징적인 타우 종을 인식하는 능력이 필요하다. 다중-인산화된 타우는 AD-관련 타우 단백질의 대표적인 예이다. 따라서, CSF에서 다중-인산화된 타우 단백질을 검출하는 분석은 AD의 존재를 검출하는 데 가장 효과적일 수 있다.
인산화가 타우를 측정할 때 고려해야 하는 유일한 번역후 변형(posttranslational modification)은 아니다. 최근의 연구는 CSF에서 타우 단백질이 주로 전장 단백질보다는 단편으로 존재함을 입증하였다(문헌[Meredith et al. PLoS One. 8(10):e76523, 2013]). 또한, 타우 단편화 패턴은, 병리학적 조건에서 단백질 분해가 빈번하게 비정상적이기 때문에 질환의 영향을 받을 수 있다. 결과적으로, 신경퇴행에 대한 타우-기반 분석은 인산화 상태(예를 들어, 인산화 부위)뿐만 아니라, 측정되는 타우 단편(예를 들어, 타우 단편의 길이, 극성)에 대한 정보를 제공할 필요가 있다. 그러나, 이러한 아이디어의 해석은, 특히 건강한 대상으로부터의 샘플에서 인산화된 타우의 낮은 내인성 수준에 의해 제한된다.
요약하면, 생물학적 유체에서 다중-인산화된 타우를 검출하기 위한 민감하고 정밀하며 정확한 방법이 여전히 필요하다. 이러한 방법은 AD 및 다른 타우병증과 같은 신경퇴행성 질환의 질환 진행을 효과적으로 검출, 진단, 병기 결정 및 추적하는 데 유용할 것이다. 본 방법은 또한 총, 유리 및 치료적 항체-결합 다중-인산화된 타우의 수준을 측정하기 위한 약력학적 마커로서 유용할 것이다. 다중-인산화된 타우 단편을 검출하고 측정하는 능력은, 전염성 타우 종이 하나 이상의 타우 단편일 수 있기 때문에, 분야에서 더욱 중요하다.
본 발명은 신경퇴행성 질환과 관련된 CSF 내의 타우의 형태들을 검출할 필요성을 충족시킨다. 본 발명은 단일- 또는 다중-인산화된 타우의 검출뿐만 아니라 타우 단편의 검출을 가능하게 한다.
본 발명의 실시 형태에 따른 고감도 효소 결합 면역분석(ELISA)은 (212) R(pT)PSLPTPPTR (서열 번호 25), (217) RTPSLP(pT)PPTR (서열 번호 26) 또는 (212&217) R(pT)PSLP(pT)PPTR (서열 번호 27)의 서열을 갖는 인산화된 잔기 T212 및/또는 T217을 포함하는 인산화된 타우 에피토프("p217+ 타우 에피토프" 또는 "pT3 에피토프")를 포함하는 p217+ 타우를 측정하기 위해 개발되고 정량화되었다.
본 발명의 실시 형태에 따른 분석은 CSF, 간질액(ISF), 뇌 균질물(homogenate), 혈청, 혈장 및 이의 변성 또는 풍부 버전을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 유체 매트릭스에서 p217+ 타우 종을 측정할 수 있다. 본 발명의 실시 형태에 따른 분석은 포획 항체로서 타우의 pT3 에피토프에 대해 유도된 제1 단일클론 항체를 사용하고, 검출 항체로서 타우의 제2 에피토프에 대해 유도된 제2 단일클론 항체를 사용한다. 이 분석은 매우 고감도이며, 정밀하고, 정확하며, 실험실간 전송이 가능하고, 선형으로 희석되며, 많은 샘플 유형에 적용할 수 있다. 미정제 생물학적 유체에서 p217+ 타우 종을 측정하는 것 외에도, 분석을 사용하여 변성 여부에 관계 없이 또는 면역침전 후에 샘플을 측정할 수 있으며, 2개의 상보적 기술은 내인성 또는 치료용으로 투여되는 항체에 결합된 p217+ 타우 또는 유리 p217+ 타우의 양을 정량화할 수 있다. 상기 분석을 분획화된 CSF를 측정하기 위한 역상 고성능 액체 크로마토그래피(rpHPLC)와 함께 사용하여, p217+ 타우의 단편 프로파일을 분석할 수 있다.
일반적인 일 측면에서, 본 발명은 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (i) 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계 및 (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126, 예컨대 아미노산 잔기 116-127을 포함하는 에피토프, 또는 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 함유하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체에 접촉시켜, 각각 p217+ 타우 펩티드의 양 또는 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다.
구체적인 일 측면에서, 본 발명은 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드 또는 짧은 p217 타우 펩티드 단편의 상대적인 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (i) 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, (iii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (iv) p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 기초하여 긴 p217+ 타우 펩티드 또는 짧은 p217+ 타우 펩티드의 상대적인 양을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 샘플 내의 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양은 샘플 내의 p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 기초하며, 예를 들어, p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 계산된다. 다른 실시 형태에서, 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양 대 p217+ 타우 펩티드의 양 사이의 비, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양 대 p217+ 타우 펩티드의 양 사이의 비, 또는 긴 p217+ 타우 펩티드의 양 대 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양 사이의 비는 샘플 내의 p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 기초하여 결정된다. 본 발명의 실시 형태에 따르면, 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양 및/또는 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 측정량에 기초한 정보, 예를 들어, 짧은 p217+ 타우 펩티드의 계산된 양 및 전술된 비 중 하나 이상은 하나 이상의 진단 목적을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 특정한 일 측면에서, 본 발명은 샘플에서 총 타우 펩티드에 대한 p217+ 타우 펩티드의 비를 결정하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (i) 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, 및 샘플을 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 에피토프, 바람직하게는 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체와 접촉시켜, 샘플 내의 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하고, 포획된 총 타우 펩티드를 제1 검출 항체와 접촉시켜, 총 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하고, 포획된 총 타우 펩티드를 제2 검출 항체와 접촉시켜, 총 긴 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계 및 (iii) 총 타우 펩티드의 양에 대한 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 또는 총 긴 타우 펩티드의 양에 대한 긴 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 일 실시 형태에서, 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양은 p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 계산되며, 총 짧은 타우 펩티드의 양은 총 타우 펩티드의 양에서 총 긴 타우 펩티드의 양을 빼서 계산되고, 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비가 결정된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계 및 (iii) p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어진 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나에 기초하여, 대상이 타우병증을 앓고 있는지 또는 타우병증이 발병할 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 대상에게 타우병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, 및 샘플을 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 에피토프, 바람직하게는 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체와 접촉시켜, 샘플 내의 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 포획된 총 타우 펩티드를 제1 검출 항체와 접촉시켜, 총 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 포획된 총 타우 펩티드를 제2 검출 항체와 접촉시켜, 총 긴 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계 및 (iii) (a) 총 타우 펩티드의 양에 대한 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, (b) 총 긴 타우 펩티드의 양에 대한 긴 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 및 (c) 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 중 적어도 하나에 기초하여 대상이 타우병증을 앓고 있는지 또는 타우병증이 발병할 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양은 p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어지고, 총 짧은 타우 펩티드의 양은 총 타우 펩티드의 양에서 총 짧은 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어지며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 대상에게 타우병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 치료 중인 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계 및 (iii) p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어진 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나에 기초하여, 대상에서 치료의 유효성을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 대상에게 타우병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 치료 중인 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, 및 샘플을 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 에피토프, 바람직하게는 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체와 접촉시켜, 샘플 내의 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 포획된 총 타우 펩티드를 제1 검출 항체와 접촉시켜, 총 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 포획 총 타우 펩티드를 제2 검출 항체와 접촉시켜, 총 긴 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계, 및 (iii) (a) 총 타우 펩티드의 양에 대한 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, (b) 총 긴 타우 펩티드의 양에 대한 긴 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 및 (c) 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 중 적어도 하나에 기초하여 대상에서 치료의 유효성을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양은 p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어지고, 총 짧은 타우 펩티드의 양은 총 타우 펩티드의 양에서 총 짧은 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어지며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 대상에게 타우병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계 및 (iii) p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어진 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나에 기초하여, 대상이 항-p217+ 타우 항체에 적합한지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 대상에게 타우병증을 치료 또는 예방하기 위한 항-p217+ 타우 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, 및 샘플을 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 에피토프, 바람직하게는 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체와 접촉시켜, 샘플에서 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 포획된 총 타우 펩티드를 제1 검출 항체와 접촉시켜 총 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, 및 포획된 총 타우 펩티드를 제2 검출 항체와 접촉시켜, 총 긴 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계 및 (iii) (a) 총 타우 펩티드의 양에 대한 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, (b) 총 긴 타우 펩티드의 양에 대한 긴 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 및 (c) 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 중 적어도 하나에 기초하여, 대상이 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합한지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양은 p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어지고, 총 짧은 타우 펩티드의 양은 총 타우 펩티드의 양에서 총 짧은 타우 펩티드의 양을 빼서 얻어지며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 대상에게 타우병증을 치료 또는 예방하기 위한 항-p217+ 타우 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 특정 측면에서, 본 발명은 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 (i) 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계,(ii) 생물학적 샘플을 항-p217+ 타우 항체가 없는, 바람직하게는 IgG가 없는 p217+ 타우를 함유하는 제1 샘플, 및 항-p217+ 타우 항체에 결합된 p217+ 타우 펩티드를 함유하는 제2 샘플로 분리하는 단계, (iii) 제2 샘플로부터 항-p217+ 타우 항체가 없는 p217+ 타우를 함유하는 제3 샘플을, 바람직하게는 rpHPLC를 통해 얻는 단계, (iv) 제1 샘플 및 제3 샘플 각각을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (v) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계 및 (vi) 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양 중 적어도 하나에 기초하여, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 예를 들어, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료는 제1 샘플에서의 긴 p217+ 타우 펩티드의 양 대 제3 샘플에서의 그 양의 비, 제1 샘플에서의 p217+ 타우 펩티드의 양 대 제3 샘플에서의 그 양의 비, 또는 제1 샘플에서의 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양(p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 계산될 수 있음) 대 제3 샘플에서의 그 양의 비에 기초하여 모니터링될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 대상에게 타우병증을 치료 또는 예방하기 위한 항-p217+ 타우 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 (i) 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계, (ii) 총 p217+ 타우를 함유하는 생물학적 샘플로부터 반변성(semi-denatured) 샘플을 얻는 단계 - 상기 반변성 샘플은 샘플 내의 항체를 변성시키기 위해 가열됨 - 및 항-p217+ 타우 항체가 없는 p217+ 타우를 함유하는 생물학적 샘플로부터 비변성 샘플을 얻는 단계, (iii) 반변성 샘플과 비변성 샘플을 각각 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (v) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 중 적어도 하나를 수행하는 단계 및 (vi) 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양 중 적어도 하나에 기초하여, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함하며, 여기서 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다. 예를 들어, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료는 반변성 샘플에서의 긴 p217+ 타우 펩티드의 양 대 비변성 샘플에서의 그 양의 비, 반변성 샘플에서의 p217+ 타우 펩티드의 양 대 비변성 샘플에서의 그 양의 비, 또는 반변성 샘플에서의 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양(p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 계산될 수 있음) 대 비변성 샘플에서의 그 양의 비에 기초하여 모니터링될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 방법은 대상에게 타우병증을 치료 또는 예방하기 위한 항-p217+ 타우 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 측면에 따르면, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병(Pick's disease), 진행성 피질하 신경교증, 섬유매듭 단독 치매(tangle only dementia), 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 은친화성 과립성 치매(argyrophilic grain dementia), 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르텐-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob disease), 다계통 위축증, C형 니만-픽병(Niemann-Pick disease type C), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌(non-Guamanian) 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), FTDP-17 또는 진행성 핵상 마비이다.
가장 바람직하게는, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함)이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 정량화 방법의 하한은 약 40 fg/ml의 p217+ 타우 펩티드이며, 본 발명의 검출 방법의 하한은 약 2 fg/ml의 p217+ 타우 펩티드이다.
특정 측면에 따르면, 샘플은 이를 필요로 하는 대상으로부터의 생물학적 샘플, 예컨대 혈액, 뇌 균질물 또는 뇌척수액(CSF) 샘플이다. 바람직하게는, 생물학적 샘플은 타우병증의 진단, 타우병증 치료의 유효성의 모니터링, 또는 항-p217+ 타우 항체 요법에 대한 적합성에 대한 결정을 필요로 하는 대상으로부터의 CSF 샘플이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 유용한 포획 항체는 p217+ 타우 에피토프, 바람직하게는 서열 번호 25, 26 또는 27의 아미노산 서열을 함유하는 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 유용한 포획 항체는 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 포획 항체는 서열 번호 28 또는 30의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 29 또는 31의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 유용한 검출 항체는 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프, 바람직하게는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프, 예컨대 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 대해 유도된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 유용한 검출 항체는 각각 서열 번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 검출 항체는 서열 번호 8의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 pT82 항체이다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 유용한 검출 항체는 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 함유하는 에피토프, 바람직하게는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 대해 유도된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 유용한 검출 항체는 각각 서열 번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 검출 항체는 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 hT43 항체이다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명에 유용한 인산화-비의존성 포획 항체는 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 에피토프, 바람직하게는 타우 단백질의 아미노산 211 내지 221을 포함하는 에피토프, 또는 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프, 더욱 바람직하게는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 대해 유도된다. 일 실시 형태에서, 본 발명에 유용한 인산화-비의존성 포획 항체는 hT7 항체이다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 샘플은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(rpHPLC)를 사용하여 생물학적 샘플을 분획화한 후에 얻어진다.
다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 (a) 각각 서열 번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 (b) 각각 서열 번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 특정 측면에 따르면, 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 바람직하게는, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hT43 항체이다.
다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 (a) p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체 및 (b) 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 타우 단백질 에피토프에 대해 유도된 검출 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 선택적으로, 키트는 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 타우 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체를 추가로 포함한다. 키트는, 예를 들어, 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 등을 측정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 키트는 다양한 진단 또는 모니터링 목적을 위한 것일 수 있으며, 예를 들어, 대상이 타우병증을 앓고 있는지 또는 타우병증이 발병할 위험이 있는지 여부를 결정하거나, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료와 같은 타우병증에 대한 치료의 효능을 모니터링하거나, 대상이 항-p217+ 타우 항체에 적합한지 여부를 결정하는 등을 위한 것일 수 있다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 키트는 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 갖는 포획 항체를 포함한다. 바람직하게는, 포획 항체는 서열 번호 28의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 29의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 키트는 각각 서열 번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 검출 항체를 포함한다. 바람직하게는, 검출 항체는 서열 번호 8의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 pT82 항체이다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 키트는 각각 서열 번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 검출 항체를 포함한다. 바람직하게는, 검출 항체는 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 hT43 항체이다.
본 발명의 다른 태양, 특징 및 이점은 본 발명 및 그의 바람직한 실시 형태의 상세한 설명을 포함한 하기의 개시내용 및 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
전술한 발명의 내용뿐만 아니라 하기의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1은 보정 펩티드를 사용하여 생성한 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석에 대한 대표적인 표준 곡선을 나타내며, 각각의 지점에 중복 측정의 평균 +/- SD를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2e는 (a, c 및 e) 교정된 희석 pg/ml에서 또는 (b 및 d) 1:4 측정의 교정된 희석 %로서 도시된 측정을 갖는 CSF 샘플에서의 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석의 희석 직선성을 나타내며, 이때 파선은 1:4 측정의 +/- 20%를 나타낸다.
도 3은 (a) pT3xhT43 및 (b) pT3xpT82 분석의 시험내 및 시험간 정밀도를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 신호/잡음(S/N)으로서 그래프로 나타낸 데이터를 갖는 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석의 시험 장소 사이의 정밀도를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 (a) pT3xhT43 및 (b) pT3xpT82 분석에 대한 가용성 p217+ 타우-표적화된 항체에 의한 pT3-기반 분석 신호의 경쟁을 나타낸다.
도 6은 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석의 인산화 의존성을 나타낸다.
도 7은 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석을 사용하여 측정된 AD CSF의 p217+ 타우 단편 프로파일을 나타내며, 이때 데이터는 신호 마이너스 잡음으로서 그래프로 나타내었다.
도 8a 및 도 8b는 (a) pT3xhT43 및 (b) hT7xpT82 분석을 사용하여 AD CSF 샘플에서 p217+ 타우 신호의 온도 및 동결-해동 안정성을 나타낸다.
도 9는 -70℃에서 저장한 후 CSF 샘플에서 p217+ 타우 신호의 장기간 안정성을 나타낸다. 신호의 변화가 검출되지 않았다.
도 10a 내지 도 10f는 (a 내지 c) pT3xhT43 및 (d 내지 f) pT3xpT82 분석에 의해 측정된, p217+ 타우와 고전적인 AD 바이오마커 Aβ42, t타우(총 타우) 및 p타우181 사이의 상관 관계를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 (a) pT3xhT43 및 (b) pT3xpT82 분석에 의해 측정된, 뇌 생검 IHC 분석과 p217+ 타우 사이의 상관 관계를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12d는 AD 및 HV 환자로부터의 미정제 CSF의 (a) pT3xhT43, (b) pT3xpT82, (c) hT7xpT82 및 (d) pT3xpT82 대 hT7xpT82 비의 분석 결과를 나타낸다.
도 13은 HV 대상에서 AD를 구별하는 데 있어서 pT3xhT43 ("343"), pT3xpT82 ("382") 및 hT7xpT82 ("782") 분석의 예측력을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14f는 (a, c, e) AD 및 (b, d, f) HV 대상으로부터의 CSF의 rp-HPLC 분획에 대해 수행된 (a, b) pT3xhT43 ("343"), (c, d) pT3xpT82 ("382") 및 (e, f) hT7xpT82 ("782") 분석으로부터의 신호를 나타낸다.
도 15a 내지 도 15o는 CDR 0 및 CDR 0.5 대상으로부터의 CSF의 rp-HPLC 분획에 대해 수행된 (a 내지 e) pT3xhT43, (f 내지 j) pT3xpT82 및 (k 내지 o) hT7xpT82 분석으로부터의 신호를 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 (a) 미정제 CSF에 대한 pT3xpT82 대 hT7xpT82 분석의 비(p타우 짧은) 또는 pT3xhT43 대 hT7xpT82 분석의 비(p타우 긴) 및 (b) MMSE 점수와 비교하여, CSF의 rp-HPLC 분획의 pT3xpT82 대 hT7xpT82 분석의 비를 나타내며; 이들은 모두 CDR 0 및 CDR1 대상의 맹검 코호트 유래이다.
도 17a 내지 도 17t는 미정제 CSF에 대한 (a) pT3xhT43, (b) pT3xpT82 및 (c) hT7xpT82 분석, (d) 미정제 CSF에 대한 두 pT3 분석의 상관 관계, (e) 미정제 CSF에 대한 pT3xpT82 대 hT7xpT82의 상관 관계, (f) 미정제 CSF에 대한 pT3xhT43 대 이노테스트 tTau의 상관 관계, (g) 미정제 CSF에 대한 pT3xhT43 대 이노테스트 pTau181의 상관 관계, (h) 미정제 CSF에 대한 pT3xhT43 대 이노테스트 AB42의 상관 관계, (i) 미정제 CSF에 대한 pT3xhT43 대 이노테스트 AB42/40 비의 상관 관계; (j, m, q) 모든 rp-HPLC 분획뿐만 아니라 (k, n, r) 모든 분획의 합, (o, s) 초기 피크 분획(짧은 타우 단편)의 합 또는 (l, p, t) 후기 피크 분획(큰 타우 단편)의 합에서의 (j 내지 l) pT3xhT43 신호, (m 내지 p) pT3xpT82 신호 또는 (q 내지 t) hT7xpT82 신호의 결과를 나타내며; 이들은 모두 HV, MCI 및 AD 대상의 코호트 유래이다.
도 18a 내지 도 18p는 (a) pT3xpT82 (p217+ 짧은) 대 pT3xhT43 (p217+ 긴), (b) pT3xpT82 대 hT7xpT82 (tTau 짧은), (c) pT3xpT82 대 NFL 및 (d) pT3xhT43 또는 (e) pT3xpT82 대 아밀로이드 상태뿐만 아니라 (f 내지 i, n 내지 p) pT3xhT43 또는 (j 내지 m) pT3xpT82와 (f 내지 m) 다양한 인지 점수 또는 (n 내지 p) 78주에 걸친 이러한 점수의 변화와의 상관 관계의 결과를 나타내며; 이들은 모두 경증-중증도 AD 대상에 대한 얀센 연구 ELN115727301/302로부터의 235명의 대상(이들 중 90명을 78주 동안 추적 조사함)의 코호트 유래이다. 대상은 인지에 기초하여 초기에 등록되었으나(AD로 분류됨), 생화학적 평가(AB40 및 AB42)에서 27명의 대상이 아밀로이드 음성으로 확인되었으며, 이에 따라 AD가 아닌 원인으로부터의 치매를 나타내는 것으로 보인다. 이러한 대상은 상기 도면에서 별도의 코호트로 분석되며, 아밀로이드 음성은 0으로 지정되는 반면, 아밀로이드 양성 대상은 1로 지정된다.
도 19는 IgG, pT3 mAb, 인간화 pT3 mAb 또는 모의 대조군으로 스파이킹된 후 항체-결합된 p217+ 타우를 수집하기 위해 면역침전을 수행한 AD CSF 샘플의 rp-HPLC 분획에 대해 수행된 pT3xhT43 분석으로부터의 신호를 나타낸다.
도 20a 및 도 20b는 (a) 항체-무함유 및 (b) 항체-결합된 p217+ 타우를 정량화하기 위한 면역포획/rpHPLC 방법의 항체 용량 의존성을 나타내며, 이때 데이터는 rpHPLC 분획 12 내지 16에서의 신호의 합으로서 그래프로 나타내었다.
도 21a 내지 도 21c는 (a, c) 열-매개 변성을 사용하거나 (b)사용하지 않은 항체 대 p217+ 타우 손상의 차등적인 동역학을 나타낸다. (a) 인간화 PT3 mAb/CSF 혼합; (b) 미처리 CSF; (c) 인간화 PT3 mAb.
도 22a 내지 도 22c는 (a) 열-매개 변성 및 (b) 항체-무함유 대 항체-결합된 p217+ 타우를 정량화하기 위한 면역포획/rpHPLC 방법을 나타내며; (c)는 이 방법들의 비교를 나타낸다.
도 23은 사이노몰거스 마카크 CSF에서 p217+ 타우의 pT3-기반 분석 인식의 결여를 나타낸다.
도 24a 내지 도 24c는 (a) pT3xhT43, (b) pT3xpT82 및 (c) hT7xpT82 분석을 사용하여 결정된, 마모셋 CSF에서의 p217+ 타우의 측정을 나타낸다.
도 25a 내지 도 25d는 4명의 AD 및 4명의 HV 대상으로부터의 미정제 혈청에서 (a, b) hT7xpT82 (tTau) 또는 (c, d) pT3xpT82 (p217+ tau 짧은)의 측정을 나타낸다. 측정은 (a, c) 1:4 또는 (b, d) 1:16 희석에서 수행하였는데, 희석 직선성 및 감도가 결여됨에 유의한다.
도 26a 및 도 26b는 도 25a 내지 도 25d에서 평가된 동일한 4명의 AD 및 4명의 HV 대상으로부터의, NaOAc 및 열 변성으로 사전처리한 혈청에서 (a) hT7xpT82 (tTau) 또는 (b) pT3xpT82 (p217+ tau 짧은)의 측정을 나타낸다.
도 27은 도 25a 내지 도 25d 및 도 26a 및 도 26b에서 평가된 동일한 4명의 AD 및 4명의 HV 대상으로부터의 혈청의 pT3-면역침전(IP)에서의 pT3xpT82 (p217+ 타우 짧은)의 측정을 나타낸다.
다양한 간행물, 논문 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 재료, 디바이스, 물품 등에 대한 논의는 본 발명의 맥락을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술의 일부를 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 사용되는 소정의 용어는 본 명세서에 개시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 마치 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수형(부정 관사 및 정관사)은, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치 값은 전형적으로 인용된 값의 ± 10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10% (w/v)의 농도 범위는 0.9% (w/v) 내지 11% (w/v)를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위범위, 그 범위 내의 모든 개별 수치 값, 예를 들어 그러한 범위 내의 정수 및 값의 분율을 명시적으로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 넓은 의미로 사용되며, 다중클론 항체, 뮤린(murine), 인간, 인간-적응화, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 비롯한 단일클론 항체 및 항체 단편을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다.
일반적으로, 항체는 특정 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 잘 알려져 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 분류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 동종형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다. 따라서, 본 발명의 항체는 5개의 주요 부류 또는 상응하는 하위-부류 중 임의의 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개의 2개의 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나로 정해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 함유할 수 있다. 특정 실시 형태에 따르면, 본 발명의 항체는 마우스 항체 또는 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다.
중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 더하여, 항체는 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 함유한다. 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 "항원-결합 부위"가 개재된 "프레임워크(framework)" 영역으로 이루어진다. 항원-결합 부위는 하기와 같이 다양한 용어 및 넘버링 체계를 사용하여 정의된다:
(i) 카바트(Kabat): "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 서열 가변성을 기반으로 한다(문헌[Wu and Kabat, J Exp Med. 132:211-50, 1970]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 가변 영역 내에 3개의 CDR을 갖는다(예를 들어, 중쇄 가변 영역(VH) 내의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 경쇄 가변 영역(VL) 내의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3);
(ii) 초티아(Chothia): 용어 "초가변 영역", "HVR"은 초티아 및 레스크(Lesk)에 의해 정의되는 바와 같이 구조 면에서 초가변성인 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다(문헌[Chothia and Lesk, J Mol Biol. 196:901-17, 1987]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH(H1, H2, H3) 및 VL(L1, L2, L3) 내에 3개의 초가변 영역을 갖는다. 넘버링 체계뿐만 아니라 CDR 및 HVR의 주석이 아히난단(Abhinandan) 및 마틴(Martin)에 의해 개정되었다(문헌[Abhinandan and Martin, Mol Immunol. 45:3832-9, 2008]);
(iii) IMGT: 항원-결합 부위를 형성하는 영역의 다른 정의는 면역글로불린 및 T-세포 수용체로부터의 V 도메인의 비교를 기반으로 레프락(Lefranc)에 의해(문헌[Lefranc et al., Dev Comp Immunol. 27:55-77, 2003]) 제안되어 있다. 인터내셔널 이뮤노진틱스(International ImMunoGeneTics, IMGT) 데이터베이스(http:_//www_imgt_org)는 이들 영역의 표준화된 넘버링 및 정의를 제공한다. CDR, HVR 및 IMGT 기술 사이의 관련성이 문헌[Lefranc et al., 2003, Id.]에 기재되어 있다;
(iv) 항원-결합 부위는 또한 "특이성 결정 잔기 사용"(SDRU)(문헌[Almagro, Mol Recognit. 17:132-43, 2004])을 기반으로 기술될 수 있으며, 여기서 SDR은 항원 접촉에 직접 관여하는 면역글로불린의 아미노산 잔기를 지칭한다.
"프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 항원-결합 부위 서열인 것으로 정의된 것들 외에 항체의 가변 영역 내에 남아 있는 서열이다. 항원-결합 부위의 정확한 정의는 상기와 같이 다양한 기술에 의해 결정될 수 있으므로, 정확한 프레임워크 서열은 항원-결합 부위의 정의에 따라 달라진다. 프레임워크 영역(FR)은 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분이다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR(각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함하며, 이들은 일반적으로 3개의 초가변 루프에 의해 연결된 베타-시트 구성을 채택한다. 각 사슬 내의 초가변 루프는 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되며, 이때 다른 사슬로부터의 초가변 루프는 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 항체의 구조 분석은 상보성 결정 영역에 의해 형성된 결합 부위의 서열과 형상 사이의 관계를 밝혀내었다(문헌[Chothia et al., J. Mol . Biol. 227: 799-817, 1992]; 문헌[Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215:175-182, 1990]). 높은 서열 가변성에도 불구하고, 6개의 루프 중 5개가 "표준 구조"라고 불리는 주쇄 입체구조의 작은 레퍼토리(repertoire)만을 채택한다. 이들 입체구조는 무엇보다 먼저 루프의 길이에 의해 결정되고, 둘째로, 팩킹(packing), 수소 결합 또는 통상적이지 않은 주쇄 입체구조를 추정하는 능력을 통해 입체구조를 결정하는, 루프 내의 그리고 프레임워크 영역 내의 소정의 위치에서의 주요 잔기의 존재에 의해 결정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항체 단편, 예컨대 다이아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화된 다이아바디(ds 다이아바디), 단일쇄 항체 분자(scFv), 단일 도메인 항체(sdab), scFv 이량체(2가 다이아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부분으로부터 형성된 다중특이성 항체, 낙타화(camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모(parent) 항체 또는 모 항체 단편이 결합하는 것과 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시 형태에 따르면, 항원-결합 단편은 경쇄 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 불변 영역의 Fd 세그먼트를 포함한다. 다른 특정 실시 형태에 따르면, 항원-결합 단편은 Fab 및 F(ab')를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 면역글로불린, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 에피토프는 연속 아미노산 또는 단백질의 3차 접힘에 의해 병치된 불연속 아미노산 모두로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출 시 유지되는 반면, 3차 접힘에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리 시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간 입체구조로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 입체구조를 결정하는 방법은, 예를 들어 X-선 결정구조해석 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "타우" 또는 "타우 단백질"은 다수의 아이소형(isoform)을 갖는 풍부한 중추 및 말초 신경계 단백질을 지칭한다. 인간 중추 신경계(CNS)에는, 선택적 스플라이싱으로 인해 크기가 352 내지 441 아미노산 길이의 범위인 6개의 주요 타우 아이소형이 존재한다(문헌[Hanger et al., Trends Mol Med. 15:112-9, 2009]). 아이소형은 0 내지 2개의 N-말단 삽입체 및 3개 또는 4개의 직렬로 배열된 미세소관-결합 반복체의 조절된 포함에 의해 서로 상이하며, 0N3R, 1N3R, 2N3R, 0N4R, 1N4R 및 2N4R이라고 지칭된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대조군 타우"는 인산화 및 다른 번역후 변형이 없는 서열 번호 1의 타우 아이소형을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "타우"는 돌연변이, 예를 들어, 전장 야생형 타우의 점 돌연변이, 단편, 삽입, 결실, 및 스플라이스 변이체를 포함하는 단백질을 포함한다. 용어 "타우"는 또한, 타우 아미노산 서열의 번역후 변형을 포함한다. 번역후 변형은 인산화를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 타우 단백질 또는 이의 단편 내의 아미노산의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "p217+ 타우 펩티드," "p217+ 타우" 또는 "p217+ 타우 단백질"은 타우 단백질의 잔기 217(pT217) 및 잔기 212(pT212) 중 하나 또는 둘 모두에서 인산화되는 인간 타우 단백질 또는 타우 단편을 의미하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1의 넘버링에 따른다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "p217+ 타우 에피토프"는 인산화된 T217 및 인산화된 T212 중 적어도 하나를 함유하는 타우 에피토프를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1의 넘버링에 따른다. p217+ 타우 에피토프의 예는, 예를 들어 pT3 에피토프를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3 에피토프"는 인간 타우의 T217 및 T212 중 적어도 하나의 잔기가 인산화된 인간 타우 단백질의 아미노산 210 내지 220을 함유하는 에피토프를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1의 넘버링에 따른다. pT3 에피토프의 예는, 예를 들어 서열 번호 25, 26 및 27을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "긴 p217+ 타우 펩티드", "긴 p217+ 타우", "p217+ 타우 펩티드의 긴 형태" 또는 "긴 p217+ 타우 펩티드 단편"은 각각, p217+ 타우 에피토프 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프를 포함하는 p217+ 타우 펩티드를 지칭하는 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시 형태에 따른 "긴 p217+ 타우 펩티드"는 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, "긴 p217+ 타우 펩티드 단편"의 아미노-말단은 타우 단백질의 아미노산 잔기 1, 2, 4, 5, 6, 또는 7일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "짧은 p217+ 타우 펩티드", "짧은 p217+ 타우", "p217+ 타우 펩티드의 짧은 형태" 또는 "짧은 p217+ 타우 펩티드 단편"은 각각, p217+ 타우 에피토프, 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프를 포함하지만, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프를 함유하지 않은 p217+ 타우 펩티드를 지칭하는 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시 형태에 따른 "짧은 p217+ 타우 펩티드"는 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, "짧은 p217+ 타우 펩티드"의 아미노-말단은 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프와 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프 사이의 임의의 아미노산 잔기일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "긴 타우 펩티드", "긴 타우", "타우 펩티드의 긴 형태" 또는 "긴 타우 펩티드 단편"은 각각, 인산화-비의존성 포획 항체에 의해 인식되는 타우 에피토프 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프를 포함하는 타우 펩티드를 지칭하는 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시 형태에 따른 "긴 타우 펩티드 단편"은 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, "긴 타우 펩티드 단편"의 아미노-말단은 타우 단백질의 아미노산 잔기 1, 2, 4, 5, 6 또는 7일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "짧은 타우 펩티드", "짧은 타우", "타우 펩티드의 짧은 형태" 또는 "짧은 타우 펩티드 단편"은 각각, 인산화-비의존성 포획 항체에 의해 인식되는 타우 에피토프 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프를 포함하지만, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프를 함유하지 않는 타우 펩티드를 지칭하는 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시 형태에 따른 "짧은 타우 펩티드 단편"은 상이한 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, "짧은 타우 펩티드"의 아미노-말단은 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프와 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프 사이의 임의의 아미노산 잔기일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포획 항체"는 관심 항원에 결합하고 고체 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 항체를 지칭한다. 고체 지지체의 예에는 마이크로입자 또는 비드, 예를 들어, 자기 비드가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 포획 항체의 예는 p217+ 타우 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 실시 형태에 따르면, 포획 항체는 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 서열 번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 단일클론 항체일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 포획 항체는 pT3이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3"은 p217+ 타우 펩티드에 결합하고 서열 번호 28의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 29의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다. 일 실시 형태에서, pT3 단일클론 항체는 마우스-하이브리도마에 의해 발현된다. 다른 실시 형태에서, 포획 항체는 서열 번호 30의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 31의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 인간화 항체이다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 포획 항체는 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250, 바람직하게는 인간 타우 단백질의 아미노산 211 내지 221 또는 아미노산 159 내지 163 사이의 에피토프에 인산화-비의존성 방식으로 결합하는 단일클론 항체일 수 있으며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1의 넘버링에 따른다. 특정 실시 형태에서, 포획 항체는 hT7이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hT7"은 인간 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프에 결합하는 공개적으로 입수가능한 단일클론 항체를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1의 넘버링에 따른다. hT7 단일클론 항체는, 예를 들어 써모피셔(ThermoFisher)(예를 들어, 카탈로그 번호: MN1000)로부터 시판된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "검출 항체"는 관심 항원에 결합하고 검출가능한 표지를 가지거나, 2차 검출 시스템에 연결된 항체를 지칭한다. 검출가능한 표지의 예에는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생체 발광 물질 및 방사성 물질이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 검출 항체의 예에는 타우 단백질, 바람직하게는 인간 타우 단백질의 아미노산 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않으며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1의 넘버링에 따른다. 아미노산 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단일클론 항체가 포획된 p217+ 타우 펩티드에 대한 검출 항체로서 사용될 때, 긴 타우 단편이 검출된다. 아미노산 116 내지 127을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단일클론 항체가 포획된 p217+ 타우 펩티드에 대한 검출 항체로서 사용될 때, 짧고 긴 타우 단편 모두가 검출된다.
특정 실시 형태에서, 검출 항체는 hT43이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hT43"은 인간 타우 단백질의 아미노산 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1의 넘버링에 따르고, 항체는 서열 번호 8의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는다. 다른 특정 실시 형태에서, 검출 항체는 pT82이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT82"는 인간 타우 단백질의 아미노산 119 내지 126, 바람직하게는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 지칭하며, 여기서 위치의 넘버링은 서열 번호 1의 넘버링에 따르고, 항체는 서열 번호 18의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열 번호 19의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3-기반 분석"은 pT3 항체가 포획 항체로서 사용되는 본 발명의 실시 형태에 따른 분석을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3xhT43"은, pT3 항체가 포획 항체로서 사용되고 hT43 항체가 검출 항체로서 사용되는, 본 발명의 실시 형태에 따른 분석을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "pT3xpT82"는 pT3 항체가 포획 항체로서 사용되고, pT82 항체가 검출 항체로서 사용되는 본 발명의 실시 형태에 따른 분석을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hT7-기반 분석"은 hT7 항체가 포획 항체로서 사용되는 본 발명의 실시 형태에 따른 분석을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hT7xpT82"는 hT7 항체가 포획 항체로서 사용되고, pT82 항체가 검출 항체로서 사용되는 본 발명의 실시 형태에 따른 분석을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상"은 동물, 바람직하게는 포유류를 지칭한다. 특정 실시 형태에 따르면, 대상은 비영장류(예를 들어, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 쥐, 토끼, 기니 피그, 마모셋 또는 마우스) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이, 침팬지 또는 인간)를 포함하는 포유류이다. 특정 실시 형태에서, 대상은 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "타우병증"은 뇌 안에서 타우의 병리학적 응집을 수반하는 임의의 신경퇴행성 질환을 포함한다. 가족성 및 산발성 AD에 더하여, 다른 예시적인 타우병증은 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 섬유매듭 단독 치매, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르텐-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 및 만성 외상성 뇌병증, 예컨대 권투선수 치매(복싱병)이다(문헌[Morris et al., Neuron, 70:410-26, 2011]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "결정", "측정", "평가" 및 "분석"은 상호교환적으로 사용되며, 정량적 및 정성적 결정 모두를 포함한다. 이들 용어는 모든 형태의 측정을 지칭하며, 특성, 형질 또는 특징부가 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 평가는 상대적이거나 절대적일 수 있다. "존재를 평가하는 것"은 그것이 존재하거나 부재하는지 여부를 결정하는 것뿐만 아니라 존재하는 것의 양을 결정하는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "진단"은 질환 또는 장애를 검출하거나, 또는 타우병증과 같은 질환 또는 장애의 병기 또는 정도를 결정하는 것을 의미한다. 보통, 질환 또는 장애의 진단은 질환을 나타내는 하나 이상의 인자 및/또는 증상의 평가를 기반으로 한다. 질환 또는 상태의 존재 또는 부재를 나타내는 인자, 예를 들어, p217+ 타우의 존재, 부재 또는 양을 기반으로 진단을 내릴 수 있다. 특정 질환의 진단을 나타내는 것으로 간주되는 각 인자 또는 증상은 특정 질환과 배타적으로 관련될 필요는 없으며, 즉, 진단 인자 또는 증상으로부터 추론될 수 있는 감별 진단이 존재할 수 있다. 마찬가지로, 특정 질환을 나타내는 인자 또는 증상이 특정 질환을 갖지 않는 개체에서 존재하는 경우가 존재할 수 있다. 용어 "진단"은 또한 약물 요법, 예를 들어 항-p217+ 타우 항체 요법의 치료 효과를 결정하는 단계, 또는 약물 요법, 예를 들어 항-p217+ 타우 항체 요법에 대한 반응 패턴을 예측하는 단계를 포함한다. 진단 방법은 독립적으로 또는 특정 질환 또는 장애, 예를 들어 알츠하이머병에 대해 의료 분야에서 알려진 다른 진단 및/또는 병기 결정 방법과 조합하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증가하다" 및 "감소하다"는 대조군 또는 기준 수준과 비교하여 샘플 내의 특정 바이오마커의 양의 차이를 지칭한다. 예를 들어, 특정 펩티드의 양은 기준 수준과 비교하여 질환에 걸린 환자의 샘플에서 상승된 양 또는 감소된 양으로 존재할 수 있다. 일 실시 형태에서, "수준의 증가" 또는 "수준의 감소"는 대조군과 비교하여 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준 사이의 차이가 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 또는 그 이상일 수 있다. 일 실시 형태에서, "수준의 증가" 또는 "수준의 감소"는 대조군과 비교하여 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준 사이의 통계학적으로 유의한 차이일 수 있다. 예를 들어, 측정된 바이오마커의 수준이 임의의 대조군 또는 기준군의 평균의 약 1.0 표준 편차, 약 1.5 표준 편차, 약 2.0 표준 편차, 또는 약 2.5 표준 편차를 벗어나면, 차이는 통계학적으로 유의할 수 있다. 기준 또는 대조는, 예를 들어 건강한 개체로부터의 샘플, 또는 치료제의 투입 전 시점이나 치료 계획 중 초기 시점과 같은, 초기 시점에서 동일한 개체로부터 취해진 샘플일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 생물학적 성분(예컨대, 핵산, 펩티드 또는 단백질)이, 그러한 성분이 자연 발생하는 유기체의 다른 생물학적 성분, 즉 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 따로 생성되거나, 또는 따로 정제되었음을 의미한다. 따라서, "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. "단리된" 핵산, 펩티드 및 단백질은 조성물의 일부일 수 있고, 그러한 조성물이 핵산, 펩티드 또는 단백질의 천연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산, 펩티드 및 단백질뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "타우 단백질에 결합하는 단리된 항체" 또는 "단리된 항-타우 항체"는 타우 단백질과 특이적으로 결합하며, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예를 들어, 단리된 항-타우 검출 항체에는 타우 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, 단리된 항-타우 검출 항체는 다른 관련 항원, 예를 들어 다른 종(예컨대, 타우 종 상동체)으로부터의 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 본 발명의 항-타우 항체가 약 1x10-6 M 이하, 예를 들어 약 1x10-7 M 이하, 약 1x10-8 M 이하, 약 1x10-9 M 이하, 약 1x10-10 M 이하, 약 1x10-11 M 이하, 약 1x10-12 M 이하 또는 약 1x10-13 M 이하의 해리 상수(KD)로 사전결정된 표적에 결합하는 능력을 지칭한다. KD는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)에서 구하며, 몰 농도(M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 본 발명을 고려하여 당업계의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항-타우 항체의 KD 값은 표면 플라즈몬 공명을 사용함으로써, 예컨대 바이오센서 시스템, 예를 들어 비아코어(Biacore)® 시스템, 프로테온(ProteOn) 기기(바이오래드(BioRad)), KinExA 기기(사피디엔(Sapidyne)), ELISA 또는 당업자에게 알려진 경쟁적 결합 분석을 사용함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로, 항-타우 항체는, 예를 들어 프로테온 기기(바이오래드)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정될 때 비특이적 표적에 대한 이의 KD보다 적어도 10배 더 작은 KD로 사전결정된 표적(즉, 타우)에 결합한다. 그러나, 타우에 특이적으로 결합하는 항-타우 항체는 다른 관련 표적, 예를 들어 마우스, 쥐, 마모셋, 개 또는 돼지와 같은 다른 종으로부터의 동일한 사전결정된 표적(상동체)에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 동의어로서 "핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산"으로 지칭되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하며, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는, 제한 없이, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 더 전형적으로는 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 혼성(hybrid) 분자를 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA와 DNA 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는, 예를 들어 트리틸화(tritylated) 염기 및 통상적이지 않은 염기, 예컨대 이노신을 포함한다. DNA 및 RNA에 대해 다양한 변형이 이루어 질 수 있으므로, "폴리뉴클레오티드"는 천연에서 전형적으로 발견되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 화학적으로, 효소적으로, 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라, 바이러스 및 세포에 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태도 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는, 종종 올리고뉴클레오티드로 지칭되는 비교적 짧은 핵산 쇄를 또한 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 레플리콘이며, 그 안에는 세그먼트의 복제 또는 발현을 일으키도록 다른 핵산 세그먼트가 작동가능하게 삽입될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포를 지칭한다. "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예를 들어 일차 세포, 배양 중인 세포, 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 일 실시 형태에서, "숙주 세포"는 본 발명의 핵산 분자로 형질감염된 세포이다. 다른 실시 형태에서, "숙주 세포"는 그러한 형질감염된 세포의 자손 또는 잠재적 자손이다. 세포의 자손은, 예를 들어, 후속 세대에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 숙주 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 통합으로 인해 모세포와 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 이 용어는 RNA로의 유전자의 전사를 포함한다. 이 용어는 또한, 하나 이상의 폴리펩티드로의 RNA의 번역을 포함하고, 모든 자연 발생 전사후 및 번역후 변형을 추가로 포함한다. 타우에 결합하는 발현된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 숙주 세포의 세포질 내에 있거나, 세포 배양물의 성장 배지와 같은 세포외 환경 내에 있거나, 또는 세포막에 고정될 수 있다.
항-타우 항체
일반적인 일 측면에서, 본 발명은 포획 항체에 의해 고정된 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 그러한 항-타우 항체는 타우 상의 인산화된 에피토프에 결합하거나 타우 상의 비-인산화된 에피토프에 결합하는 특성을 가질 수 있다. 항-타우 검출 항체는 생물학적 샘플에서 타우를 검출하기 위한 연구 또는 진단 시약으로서 유용할 수 있다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126, 바람직하게는 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
특정 측면에 따르면, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 각각 서열 번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 (b) 각각 서열 번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
특정 측면에 따르면, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 8과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 가장 바람직하게는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 가장 바람직하게는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게는, 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 pT82 항체이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명은 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
특정 측면에 따르면, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 각각 서열 번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 (b) 각각 서열 번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
특정 측면에 따르면, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 18과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 가장 바람직하게는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 그리고 가장 바람직하게는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게는, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하는 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 hT43 항체이다.
본 발명의 항체는 다양한 기법에 의해, 예를 들어 하이브리도마 방법(문헌[Kohler and Milstein, Nature. 256:495-7, 1975])에 의해 생성될 수 있다. 수용자 항체(전형적으로 다른 포유동물 종, 예컨대 인간)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 회합된 공여자 항체(전형적으로 뮤린)로부터 유래된 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 키메라 mAb는 US4816567호에 개시된 방법으로 제조될 수 있다. 비-인간 공여자 면역글로불린(전형적으로 뮤린)으로부터 유래된 CDR을 갖고 분자의 나머지 면역글로불린-유래 부분이 하나 이상의 인간 면역글로불린으로부터 유래된 CDR-이식 mAB는 US5225539호에 개시된 것과 같은 당업자에게 알려져 있는 기법에 의해 제조될 수 있다. 임의의 비-인간 서열이 결여된 완전 인간 mAb는 문헌[Lonberg et al., Nature. 368:856-9, 1994]; 문헌[Fishwild et al., Nat Biotechnol. 14:845-51, 1996]; 문헌[Mendez et al., Nat Genet. 15:146-56, 1997])에 언급된 기술에 의해 인간 면역글로불린 트랜스제닉 마우스로부터 제조될 수 있다. 인간 mAb는 또한 파지 디스플레이 라이브러리로부터 제조되고 최적화될 수 있다(문헌[Knappik et al., J Mol Biol. 296:57-86, 2000]; 문헌[Krebs et al., J Immunol Methods. 254:67-84, 2001]; 문헌[Shi et al., J Mol Biol. 397:385-96, 2010]).
타우에 결합하는 검출 항체 및 이의 항원-결합 단편의 기능적 활성은 당업계에 알려진 방법에 의해 특성화될 수 있다. 타우에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 특성화하기 위한 방법은 비아코어, ELISA, 및 FACS 분석, 면역조직화학 분석 등을 포함하는 친화성 및 특이성 분석을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
몇몇 잘 알려져 있는 방법이 본 발명의 항체의 결합 에피토프를 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 개별 성분 모두의 구조가 알려져 있는 경우에, 컴퓨터 모의실험(in silico) 단백질-단백질 도킹(docking)이 양립가능한 상호작용 부위를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 항원과 항체 복합체를 사용하여 수소-중수소(H/D) 교환을 수행하여, 항체에 의해 결합되는 항원 상의 영역을 맵핑할 수 있다. 항원의 세그먼트 및 점 돌연변이생성을 사용하여, 항체 결합에 중요한 아미노산의 위치를 찾을 수 있다. 항체-항원 복합체의 공결정(co-crystal) 구조를 사용하여, 에피토프 및 파라토프에 기여하는 잔기를 확인한다.
다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 단백질의 코딩 서열을 변화(예를 들어, 대체, 결실, 삽입 등)시킬 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 본 발명의 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 서열을 변경할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예시적인 단리된 폴리뉴클레오티드는, 각각 서열 번호 2, 3 및 4에 나타낸 면역글로불린 중쇄 CDR HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 폴리펩티드, 또는 각각 서열 번호 5, 6 및 7에 나타낸 면역글로불린 경쇄 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 예시적인 단리된 폴리뉴클레오티드는, 각각 서열 번호 12, 13 및 14에 나타낸 면역글로불린 중쇄 CDR HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 폴리펩티드, 또는 각각 서열 번호 15, 16 및 17에 나타낸 면역글로불린 경쇄 CDR LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 예시적인 단리된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다. 주어진 발현 시스템에서의 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 항체를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 본 발명의 단리된 핵산은 잘 알려진 재조합 기법 또는 합성 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 단일클론 항체를 암호화하는 DNA는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마가 생성되는 경우, 그러한 세포는 그러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 코딩 서열과 번역 산물이 연결되어 있는 디스플레이 기법, 예컨대 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리가 사용될 수 있다.
다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 플라스미드, 코스미드, 파지 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은, 본 발명을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 재조합 발현 벡터, 예컨대 플라스미드이다. 벡터는 발현 벡터의 통상적인 기능을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 요소, 종결자, 인핸서, 선택 마커 및 복제 기점을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 세포에 핵산을 전달할 수 있는 다수의 발현 벡터가 당업계에 알려져 있으며, 세포에서의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성을 위해 본 발명에 사용될 수 있다. 통상적인 클로닝 기법 또는 인공 유전자 합성이 본 발명의 실시 형태에 따른 재조합 발현 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다.
다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 숙주 세포가 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 재조합 발현에 사용될 수 있다. 그러한 숙주 세포는 진핵 세포, 세균 세포, 식물 세포 또는 고세균(archeal) 세포일 수 있다. 예시적인 진핵 세포는 포유류, 곤충, 조류 또는 다른 동물 기원의 것일 수 있다. 포유류 진핵 세포는 불멸화 세포주, 예컨대 하이브리도마 또는 골수종 세포주, 예컨대 SP2/0(미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC(American Type Culture Collection), CRL-1581), NS0(영국 윌트셔주 솔즈베리 소재의 ECACC(European Collection of Cell Cultures), ECACC 번호 85110503), FO(ATCC CRL-1646) 및 Ag653(ATCC CRL-1580) 뮤린 세포주를 포함한다. 예시적인 인간 골수종 세포주는 U266(ATCC CRL-TIB-196)이다. 다른 유용한 세포주는, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 CHO-K1 SV(론자 바이올로직스(Lonza Biologics)), CHO-K1(ATCC CRL-61, 인비트로젠(Invitrogen)) 또는 DG44로부터 유래된 것들을 포함한다.
다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에서 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 (예를 들어, 상층액으로부터의) 세포 또는 세포 배양물로부터 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다. 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포로부터 수집되고, 당업계에 알려진 통상적인 기법에 따라 정제될 수 있다.
진단 방법
본 발명은, 예를 들어, p217+ 타우 종을 선택적으로 고정하는 pT3과 같은 포획 항체를, 포획된 p217+ 타우 종의 검출을 가능하게 하는 리포터 요소로 표지된 항-타우 검출 항체와 조합하여 사용함으로써, AD에서 풍부한 p217+ 타우 종을 측정하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 예를 들어, 대상에서 AD 또는 다른 타우병증을 진단하기 위해, 치료의 유효성을 모니터링하기 위해, 항-p217+ 타우 치료에 적합한 대상을 확인하기 위해 등의 다양한 진단 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 관심 샘플에서 p217+ 타우 펩티드는 서열 번호 25, 26 또는 27의 아미노산 서열을 갖는 에피토프와 같은 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체로 포획된다. 포획된 p217+ 타우 펩티드는 모두 p217+ 타우 에피토프를 함유하지만, 상이한 길이를 가질 수 있어, 상이한 에피토프에 결합하는 검출 항체에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체는 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 여전히 함유하는 포획된 p217+ 타우 펩티드 또는 이의 단편("긴 p217+ 타우 펩티드")만을 검출할 수 있는 반면에, 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체는 긴 p217+ 타우 펩티드뿐만 아니라 짧은 p217+ 타우 펩티드도 검출할 수 있다. 포획된 p217+ 타우 펩티드는 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉하여, 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드 또는 p217+ 타우 펩티드(긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드)의 양을 검출하고 측정할 수 있다. 샘플 내의 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양은 p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 계산된다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 포획하고 측정하는 것에 더하여, 샘플에서 총 타우 펩티드를 인산화-비의존성 포획 항체, 예를 들어 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 에피토프, 바람직하게는 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 항체로 포획한다. 포획된 총 타우 펩티드는 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉하여, 샘플에서 총 긴 타우 펩티드 또는 총 타우 펩티드(긴 그리고 짧은 타우 펩티드)의 양을 검출하고 측정할 수 있다. 샘플 내의 짧은 총 타우 펩티드의 양은 총 타우 펩티드의 양에서 긴 총 타우 펩티드의 양을 빼서 계산된다.
본 발명의 실시 형태들에 따르면, 샘플에서 p217+ 타우 펩티드와 관련된 값, 예컨대 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 선택적으로, 총 타우 펩티드의 양 및 총 긴 타우 단편의 양뿐만 아니라, 측정량에 기초한 정보, 예컨대 계산된 짧은 p217+ 타우 펩티드 및 짧은 총 타우 펩티드, 또는 p217+ 타우 펩티드와 관련된 비, 예컨대 긴 타우 펩티드 단편의 양에 대한 짧은 타우 펩티드 단편의 양의 비, 짧은 타우 단편의 총량에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, 긴 타우 단편의 총량에 대한 긴 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 등이 하나 이상의 진단 목적을 위해 사용될 수 있다.
진단은 대상으로부터의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드와 관련된 값을 상응하는 기준선 값과 비교하여 수행된다. 기준선 값은 건강한 개체의 집단에서의 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준선 값은 또한 동일한 대상에서 결정된 이전 수준을 나타낼 수 있다. 일 실시 형태에서, 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 p217+ 타우 펩티드와 관련된 값, 예컨대 긴 또는 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 또는 p217+ 타우 펩티드와 관련된 비, 예컨대, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비가 상응하는 기준선 값보다 유의하게 더 높은 경우, 대상은 타우병증을 앓고 있는 것으로 결정된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유의하게 더 높은"은 0.05 이하의 p-값을 갖는, 단지 우연에 의한 것이 아니라 통계학적으로 유의하게 더 높은 값을 지칭한다. "유의하게 더 높은"은 0.05, 0.04, 0.03, 0.01, 0.005, 0.001 미만 등의 p-값에서, 건강한 지원자에서 발견되는 것보다 적어도 약 1%, 2%, 5% 또는 10% 더 높은 것일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 (i) 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 인산화된 p217+ 타우를 포함하는 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하고/하거나 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (iii) p217+ 타우 펩티드의 양 또는 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상이 타우병증을 앓고 있는지 또는 타우병증이 발병할 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 진단은 대상으로부터의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양 또는 농도를 상응하는 기준선 값과 비교하여 수행될 수 있다. 진단은 또한 대상으로부터의 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 상응하는 기준선 값과 비교하여 수행될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 (i) 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하거나, 또는 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 타우 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드 또는 포획된 총 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (iii) 생물학적 샘플에서 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상이 타우병증을 앓고 있는지 또는 타우병증이 발병할 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 진단은 대상으로부터의 샘플에서, pT3 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 타우 단백질의 영역, 즉 타우의 아미노산 211 내지 221을 포함하는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 상응하는 기준선 값과 비교하여 수행될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 (i) 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하고/하거나 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (iii) p217+ 타우 펩티드의 양 또는 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상에서 치료의 유효성을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 (i) 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하거나, 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 타우 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드 또는 포획된 총 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (iii) 생물학적 샘플에서 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상에서 치료의 유효성을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 대상에서의 치료의 유효성은 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후에 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 모니터링함으로써 결정된다. 기준선과 대비하여 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 의미한다. 병리학적 타우가 뇌에서 제거됨에 따라 생물학적 체액에서 값이 또한 일시적으로 증가할 수도 있다.
특정 측면에 따르면, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 섬유매듭 단독 치매, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르텐-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), FTDP-17 또는 진행성 핵상 마비이다.
가장 바람직하게는, 타우병증은 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함)이다.
일 실시 형태에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하고/하거나 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (iii) p217+ 타우 펩티드의 양 또는 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상이 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합한지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 측면에 따르면, 생물학적 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 또는 생물학적 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비가 상응하는 기준선 값보다 유의하게 더 높은 경우, 대상은 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합한 것으로 결정된다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하거나, 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 타우 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 총 타우 펩티드를 포획하는 단계, (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드 또는 포획된 총 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 샘플에서 긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및 (iii) 생물학적 샘플에서 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상이 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합한지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에 따르면, 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비가 상응하는 기준선 값보다 유의하게 더 높은 경우, 대상은 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합한 것으로 결정된다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플에서 항체와 복합체를 이루는 p217+ 타우뿐만 아니라 샘플에서 항체와 결합되지 않은 유리 p217+ 타우를 측정하는 것에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 총 항체는 친화성 기술, 이어서 카오트로프(chaotrope), 열 불활성화(heat-inactivation), 또는 다른 단백질 파괴 기술을 포함하는 변성 조건을 사용하여 포획된다. p217+ 타우는 rpHPLC를 사용하여 항체로부터 분리되고, 본 발명의 방법을 사용하여 측정되어, 항체-결합된 p217+ 타우를 정량화할 수 있다.
일반적인 측면에 따르면, 본 발명은 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 방법에 관한 것으로, 본 방법은 (i) 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계, (ii) 생물학적 샘플을 항체-결합된 p217+ 타우를 함유하는 IgG 풍부 샘플, 및 항체-무함유 p217+ 타우를 함유하는 IgG 고갈 샘플로 분리하는 단계, (iii) p217+ 타우를 rpHPLC에 의해 IgG로부터 정제하여 항체-무함유 p217+ 타우 샘플을 얻는 단계, (iv) IgG 풍부 샘플과 항체-무함유 p217+ 타우 샘플을 각각 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (v) 각각의 샘플에서 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 펩티드의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜 각각의 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하거나, 또는 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜 각각의 샘플에서 긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, (vi) 항체-무함유 p217+ 타우의 양에 대한 항체-결합된 p217+ 타우의 양의 비를 계산하는 단계 및 (vii) 계산된 비에 기초하여 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함한다.
다른 일반적인 측면에 따르면, 본 발명은 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 (i) 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계, (ii) 총 p217+ 타우를 함유하는 생물학적 샘플로부터 반변성 샘플을 얻는 단계 및 항체-무함유 p217+ 타우를 함유하는 생물학적 샘플로부터 비변성 샘플을 얻는 단계 - 상기 반변성 샘플은 샘플 내의 항체를 변성시키기 위해 가열됨 -, (iii) 반변성 샘플과 비변성 샘플을 각각 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계, (iv) 각각의 샘플에서 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 펩티드의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜 각각의 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하거나, 또는 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜 각각의 샘플에서 긴 그리고 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계, (v) 총 p217+ 타우의 양에서 항체-무함유 p217+ 타우의 양을 빼서 샘플에서 항체-결합된 p217+ 타우의 양을 계산하는 단계, (vi) 항체-무함유 p217+ 타우에 대한 항체-결합된 p217+ 타우의 비를 계산하는 단계 및 (vii) 계산된 비에 기초하여 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함한다.
특정 측면에 따르면, 대상에서의 치료의 유효성은 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후에 항체-결합된 p217+ 타우 펩티드 및 항체-무함유 p217+ 타우 펩티드의 양을 모니터링하여 결정된다. 기준선에 비해 항체-무함유 p217+ 타우 값의 감소, 또는 기준선에 비해 항체-결합된 p217+ 타우 값의 증가, 및 그에 따른 기준선에 비해 항체-무함유 p217+ 타우에 대한 항체-결합된 p217+ 타우의 비의 증가는 치료에 대한 양성 반응을 나타낸다. 병리학적 타우가 뇌에서 제거됨에 따라 생물학적 체액에서 항체-무함유 p217+ 타우의 값이 또한 일시적으로 증가할 수 있다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법의 포획 항체는 비드, 예컨대 자기 비드에 접합된다. 다른 특정 측면에 따르면, 검출 항체는 비오틴화된다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법에서 측정된 p217+ 타우 펩티드의 양은 ELISA 및 단일 분자 어레이 플랫폼(single molecule array platform)을 포함하는 당업계에 알려진 임의의 적합한 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법은 퀀테릭스 시모아(Quanterix Simoa) 또는 MSD-plex와 같은 고감도 어레이 플랫폼을 사용하여 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정한다. 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법의 정량화의 하한은 약 40 fg/ml이고, 본 방법의 검출 하한은 약 2 fg/ml이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 샘플은 혈액, 뇌 균질물 또는 뇌척수액(CSF) 샘플과 같은 생물학적 샘플이다. 바람직하게는, 샘플은 CSF 샘플이다. 특정 측면에 따르면, 샘플은 미정제 CSF 샘플이다. 다른 특정 측면에 따르면, 샘플은 전장 타우 단백질과 차등 크기의 타우 단편들을 분리하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(rpHPLC)를 사용하여, CSF와 같은 생물학적 샘플을 분획화한 후에 얻어진다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법의 포획 항체는 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 포획 항체는 서열 번호 28의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 29의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 pT3 항체이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법의 검출 항체는 각각 서열 번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 검출 항체는 서열 번호 8의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 pT82 항체이다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 방법의 검출 항체는 각각 서열 번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 검출 항체는 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 hT43 항체이다.
키트
다른 일반적인 측면에서, 본 발명은 (a) p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체, 선택적으로 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250 사이의 타우 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체 및 (b) 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 타우 단백질 에피토프에 대해 유도된 적어도 하나의 검출 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 및/또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 측정하는 데 사용된다.
검출 항체는 임의의 검출가능한 표지(예를 들어, 형광 분자, 비오틴 등)를 함유할 수 있으며, 이는 직접 검출가능하거나 2차 반응(예를 들어, 스트렙타비딘과의 반응)을 통해 검출가능하다. 대안적으로, 검출가능한 표지를 함유하는 2차 시약이 사용될 수 있으며, 2차 시약은 1차 항체에 대한 결합 특이성을 갖는다. 생물학적 샘플에서 p217+ 타우를 측정하기에 적합한 진단 키트에서, 키트의 항체는 미세역가 접시(microtiter dish)의 웰 또는 비드와 같은 고체상(solid phase)에 사전결합되어 공급될 수 있다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 키트의 포획 항체는 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 포획 항체는 서열 번호 28의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 29의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 pT3 항체이다.
특정 측면에 따르면, 본 발명의 키트의 검출 항체는 각각 서열 번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 검출 항체는 서열 번호 8의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 pT82 항체이다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 키트의 검출 항체는 각각 서열 번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 바람직하게는, 검출 항체는 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 hT43 항체이다.
다른 특정 측면에 따르면, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 사용하여, 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 및/또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 측정하는 데 사용된다.
본 출원 전체에 걸쳐 인용된 (서적 참고문헌, 발행 특허, 공개된 특허 출원, 및 공계류 중인 특허 출원을 포함한) 모든 인용된 참고문헌의 내용은 본 명세서에 명시적으로 참조로 포함된다.
실시 형태
본 발명은 또한 하기의 비제한적인 실시 형태를 제공한다.
실시 형태 1은 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계 및
(ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126, 예컨대 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프, 또는 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 함유하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 각각 p217+ 타우 펩티드의 양 또는 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 2는 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드 또는 짧은 p217 타우 펩티드 단편의 상대적인 양을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
(i) 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계,
(ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계,
(iii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계 및
(iv) p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 기초하여, 긴 p217+ 타우 펩티드 또는 짧은 p217+ 타우 펩티드의 상대적인 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 3은 포획 항체가 비드에 접합되고, 검출 항체가 비오틴화되는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 2의 방법이다.
실시 형태 4는 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양이 고감도 플랫폼을 사용하여 측정되는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 3 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 5는 상기 방법의 정량화의 하한이 약 40 fg/ml의 p217+ 타우 펩티드이고, 상기 방법의 검출 하한이 약 2 fg/ml의 p217+ 타우 펩티드인, 실시 형태 1 내지 실시 형태 4 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 6은 상기 샘플이 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플이고, 상기 방법이 생물학적 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상이 타우병증을 앓고 있는지 또는 타우병증이 발병할 위험이 있는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 7은 생물학적 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비가 상응하는 기준선 값, 예컨대 건강한 지원자의 상응하는 평균 값보다 유의하게 더 높은 경우, 대상은 타우병증을 앓고 있거나 타우병증이 발병할 위험이 있는 것으로 결정되는, 실시 형태 6의 방법이다.
실시 형태 8은 상기 샘플이 타우병증 치료 중인 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플이고, 상기 방법이 생물학적 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상에서 치료의 유효성을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 9는 생물학적 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양이 치료 과정에 걸쳐 감소하는 경우, 치료가 효과적인 것으로 결정되는, 실시 형태 8의 방법이다.
실시 형태 10은 상기 타우병증이 알츠하이머병(가족성 알츠하이머병 및 산발성 알츠하이머병을 포함함), 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병, 진행성 피질하 신경교증, 섬유매듭 단독 치매, 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 은친화성 과립성 치매, 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군, 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병, 할러포르텐-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, C형 니만-픽병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시 형태 6 내지 실시 형태 9 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 11은 상기 타우병증이 알츠하이머병인, 실시 형태 10의 방법이다.
실시 형태 12는 상기 샘플이 인간 대상으로부터의 생물학적 샘플, 바람직하게는 CSF 샘플이고, 상기 방법이 생물학적 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비에 기초하여, 대상이 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합한지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 13은 생물학적 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비, 또는 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비가 상응하는 기준선 값, 예컨대 건강한 지원자의 상응하는 평균 값보다 유의하게 더 높은 경우, 대상은 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합한 것으로 결정되는, 실시 형태 12의 방법이다.
실시 형태 14는 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은
i. 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계,
ii. 생물학적 샘플을 항체-결합된 p217+ 타우를 함유하는 IgG 풍부 샘플 및 항체-무함유 p217+ 타우를 함유하는 IgG 고갈 샘플로 분리하는 단계,
iii. IgG 풍부 샘플과 IgG 고갈 샘플 각각을 타우 단백질의 인산화된 T212 및/또는 인산화된 T217을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계,
iv. 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 생물학적 샘플에서 항체-결합된 p217+ 타우의 양 및 항체-무함유 p217+ 타우의 양을 측정하는 단계,
v. 항체-무함유 p217+ 타우에 대한 항체-결합된 p217+ 타우의 비를 계산하는 단계 및
vi. 상기 계산된 비에 기초하여 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 15는 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은
i. 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계,
ii. 총 p217+ 타우를 함유하는 생물학적 샘플로부터 반변성 샘플을 얻는 단계 및 항체-무함유 p217+ 타우를 함유하는 생물학적 샘플로부터 비변성 샘플을 얻는 단계 - 상기 반변성 샘플은 샘플 내의 항체를 변성시키기 위해 가열됨 -,
iii. 반변성 샘플 및 비변성 샘플 각각을 타우 단백질의 인산화된 T212 및/또는 인산화된 T217을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계,
iv. 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 검출 항체와 접촉시켜, 생물학적 샘플에서 총 p217+ 타우의 양 및 항체-무함유 p217+ 타우의 양을 측정하는 단계,
v. 총 p217+ 타우의 양에서 항체-무함유 p217+ 타우의 양을 빼서 샘플에서 항체-결합된 p217+ 타우의 양을 계산하는 단계,
vi. 항체-무함유 p217+ 타우에 대한 항체-결합된 p217+ 타우의 비를 계산하는 단계 및
vii. 상기 계산된 비에 기초하여 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 16은 포획 항체가 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 바람직하게는, 포획 항체가 서열 번호 28의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 29의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 17은 검출 항체가 각각 서열 번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 바람직하게는, 검출 항체가 서열 번호 8의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 16 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 18은 검출 항체가 각각 서열 번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 바람직하게는, 검출 항체가 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 16 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 19는 상기 샘플이 혈액, 뇌 균질물 또는 뇌척수액(CSF) 샘플인, 실시 형태 1 내지 실시 형태 18 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 20은, 상기 샘플이 역상 고성능 액체 크로마토그래피(rpHPLC)를 사용하여 생물학적 샘플을 분획화한 후에 얻어지는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 19 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 21은 타우 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 127을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하며,
a. 각각 서열 번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및
b. 각각 서열 번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
실시 형태 22는 바람직하게는, 서열 번호 8의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 실시 형태 21의 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
실시 형태 23은 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에서 타우 단백질에 결합하며,
a. 각각 서열 번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및
b. 각각 서열 번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편 단편이다.
실시 형태 24는 바람직하게는, 서열 번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 실시 형태 23의 단리된 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
실시 형태 25는 실시 형태 21 내지 실시 형태 24 중 어느 하나의 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 단리된 핵산이다.
실시 형태 26은 실시 형태 25의 핵산을 포함하는 벡터이다.
실시 형태 27은 실시 형태 25의 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
실시 형태 28은 실시 형태 21 내지 실시 형태 24 중 어느 하나의 검출 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 조건 하에서 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계, 및 세포 또는 세포 배양물로부터 항체 또는 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법이다.
실시 형태 29는
a. 타우 단백질의 인산화된 T212 및/또는 인산화된 T217을 포함하는 단일- 또는 다중-인산화된 타우 단백질 에피토프에 대해 유도된 포획 항체 및
b. 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 타우 단백질 에피토프에 대해 유도된 검출 항체를 포함하는 키트로서,
상기 키트는 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 데 사용되는 키트이다.
실시 형태 30은 포획 항체가 각각 서열 번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열 번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 바람직하게는, 포획 항체가 서열 번호 28의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 29의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 갖는, 실시 형태 29의 키트이다.
실시 형태 31은 검출 항체가 실시 형태 20 내지 실시 형태 23 중 어느 하나의 단리된 검출 항체인, 실시 형태 29 또는 실시 형태 30의 키트이다.
실시예
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 특성을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 결정됨이 이해되어야 한다.
실시예 1. p217+ 타우를 검출하기 위한 고감도 분석
분석-특이적 시약은 다음과 같다: 시모아 홈브루(Simoa Homebrew) 키트(퀀테릭스, 카탈로그 번호 101351), 헬퍼 비드(Helper bead)(퀀테릭스, 카탈로그 번호 101732), pT3 마우스 단일클론 항체(mAb), hT43 mAb, pT82 mAb 및 hT7 mAb. pT3은 p217+ 타우를 인식하는 얀센(Janssen)에서 개발된 모 항체이며, 이의 인간화 버전은 본 명세서에서 인간화 pT3 mAb로 지칭된다.
샘플을 50 mM 트리스, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2% 소 혈청 알부민, 0.1% 트윈(Tween) 20, 0.05% 프로클린(ProClin) 300, pH7.8로 희석하였다.
뉴 잉글랜드 펩티드(New England Peptide)에 의해 제조된 3개의 맞춤형 펩티드를 사용하여 분석을 보정하였다(보정 펩티드).
펩티드 pT3xhT43은 PEG4 링커에 의해 연결된 hT43, PT51 및 pT3 에피토프를 함유하며, 분자량이 6893 g/mol이다. 펩티드 pT3xhT43의 아미노산 서열은 PRQEFEVMEDHAGTYGLGDR(dPEG4)GKTKIATPRGAAPPGQKG(dPEG4)GSRSR(pT)PSLP(pT)PPTREPKKV-아미드(서열 번호 22)이다.
펩티드 pT3xpT82는 PEG4 링커에 의해 연결된 pT82 및 pT3 에피토프를 함유하며, 분자량이 4551 g/mol이다. 펩티드 pT3xpT82의 아미노산 서열은 Ac-SLEDEAAGHVTQARMVSK(dPEG4)GSRSR(pT)PSLP(pT)PPTREPKKV-아미드(서열 번호 23)이다.
펩티드 hT7xpT82는 PEG4 링커에 의해 연결된 pT82 및 hT7 에피토프를 함유하며, 분자량이 3619 g/mol이다. 펩티드 hT7xpT82의 아미노산 서열은 Ac-SLEDEAAGHVTQARMVSK(dPEG4)PRGAAPPGQKGQANA-아미드(서열번호 24)이다.
시약 준비
포획 비드를 퀀테릭스 매뉴얼에 제공된 프로토콜에 따라 0.3 mg/ml 포획 Ab로 코팅하였다. 코팅된 포획 비드를 비드 희석제 완충액에서 200,000개의 비드/ml로 희석하고, 200,000개의 비드/ml의 헬퍼 비드를 첨가하여 비드의 총 농도가 400,000개의 비드/ml가 되도록 하였다.
검출 항체를 퀀테릭스 메뉴얼에 제공된 프로토콜에 따라 60x로 비오틴화하고, 홈브루 검출기/샘플 희석제에서 1.8 ug/ml로 희석하였다.
보정 펩티드를 0.1% 인산/물에서 5 mg/ml로 재구성하고, 20 ul로 분취하여 냉동시켰다. 사용할 준비가 되었을 때, 보정 펩티드 분취물을 해동시키고, 1:1000으로 희석하고(예를 들어, 1.5 ul를 1498.5 ul 내로), 희석물을 1:1000으로 희석하여, 펩티드의 최종 농도가 5000 pg/ml가 되도록 하였다. 30 pg/ml에서 시작하여, 3x 점프(jump)를 갖는 표준 곡선을 만들었다.
CSF 샘플을 샘플 희석제에서 적어도 1:4로 희석하였다. 건강한 지원자(HV) 샘플을 1:5 또는 1:10으로 희석하고, AD 샘플을 적어도 1:20으로 희석하였다.
시모아 분석
맞춤형 시모아 분석을 개발하였는데, 이는 포획 Ab, 샘플 및 검출 Ab를 사용한 35분, 그리고 세정한 다음, 스트렙타비딘 β-갈락토시다아제(SBG)를 사용한 5분으로 구성된 2단계 프로토콜을 포함한다. 각각의 반응은 25 ul 비드 용액, 100 ul 샘플 또는 보정제, 20 ul 검출 용액, 100 ul SBG로 이루어진다. 항체에는 명칭이 주어지며, 한번에 최대 5개의 포획 항체와 5개의 검출 항체를 로딩할 수 있다. 이 반응은 기기에 의해 시모아 큐벳에서 수행되고, 마지막으로 세정되어, β-갈락토시다아제 기질(RGP)을 갖는 측정 디스크로 로딩된 다음, 기기로 측정이 수행되었다.
실시예 2. rpHPLC에서의 천연 타우 단편의 분리
시약은 다음과 같다: 트라이플루오르아세트산(HPLC 등급), 물(HPLC 등급), 아세토니트릴(HPLC 등급), 인산(분석 등급) 및 HPLC 2액 기울기 시스템(binary gradient system), 면역분석 완충제(100 mM 트리스 HCl, 100 mM NaCl, 0.05% 트윈 및 BSA, pH7.8).
프로토콜은 다음과 같다: 500 ul의 동결된 CSF를 얼음 상에서 30분 동안 해동시켰다. 해동된 CSF를 100 mM 염화나트륨을 함유하는 1.5 ml의 100 mM 인산나트륨 pH 2.5에 첨가하고 혼합하였다. 생성된 혼합물 1.8 ml를 수중 0.1% 트라이플루오르아세트산에서 평형화된 C18 또는 유사한 역상 크로마토그래피 컬럼 상에 적용하였다. 이어서, HPLC 컬럼은 증가하는 아세토니트릴의 기울기로 개발되었다. 분획을 용리에 걸쳐 수집하였다. 분획을 구아니딘 HCl에서 10 mM로 조정한 다음, 진공 농축기에서 건조시켰다. 건조된 분획을 면역분석 완충액에 재현탁시키고, 본 발명의 항-타우 포획 및 검출 항체 쌍을 기반으로 분획 중의 타우 펩티드를 측정하였다.
실시예 3. 유리 또는 항체에 의해 결합된 p217+ 타우의 정량화
추가의 상류 샘플 조작에 의해, 고감도 pT3-기반 분석을 사용하여 환자 안에서 생성되거나 외인성으로 투여되는 항체, 예를 들어 인간화 pT3 mAb에 의한 p217+ 타우의 결합을 측정할 수 있다. 이러한 기술은 인간화 pT3 mAb와 같은 치료적 항-p217+ 타우 항체를 연구하기 위한 약력학적 분석으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 방법을 사용하여 항체-무함유 대 항체-결합된 p217+ 타우를 측정할 수 있다.
분석 1: 면역포획/고갈 후 rpHPLC를 사용한 생물학적 유체에서의 유리 p217+ 타우 대 결합된 p217+ 타우의 정량화
생물학적 유체(예를 들어, CSF)를 실온에서 흔들면서, 단백질 A/G-코팅된 자기 비드(15 μl 비드 슬러리/0.5 mL CSF)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하여, 샘플에서 면역글로불린을 포획하였다. 비드를 자석에 의해 침전시키고, 상청액을 제2 튜브로 옮겼다(샘플="IgG 고갈 상청액"). 비드를 1 ml의 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 4회 세정하였다. 이어서, (a) 세정된 비드 및 (b) IgG 고갈 상청액을 함유하는 튜브에 0.5 ml의 6M GuHCl을 첨가하고, 튜브를 실온에서 흔들면서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 비드를 자석에 의해 침전시키고, 생성된 상청액을 제3 튜브로 옮겼다(샘플="IgG 농축 상청액"). 마지막으로, 실시예 2에서와 같이 수행된 rpHPLC에 의해 분리하기 전에, 0.1 M 인산(pH 2)을 두 용액에 첨가하였다(1.0 mL 인산을 변성된 IgG 고갈 상청액에 첨가하고, 1.5 mL 인산을 IgG 농축 상청액에 첨가하여, 샘플을 최대 2.0 mL의 최종 부피로 만듬). 얻어진 rpHPLC 분획을 실시예 2에 기재된 바와 같이 재구성하고, 실시예 1의 시모아 p217+ 타우 분석을 사용하여 측정하였다. IgG 고갈 상청액으로부터의 신호는 유리 p217+ 타우(즉, 항체에 의해 결합되지 않는 것)를 나타내는 반면, IgG 농축 상청액으로부터의 신호는 결합된 p217+ 타우(즉, 인간화 pT3 mAb와 같은 항체에 의해 결합된 것)를 나타낸다. 유리 및 결합된 측정에 대한 대조군 또는 정규화군으로서, 면역포획/고갈 과정을 거치지 않은 동일한 모 생물학적 유체(예를 들어, CSF)의 rpHPLC 분리 및 시모아 p217+ 측정을 총 p217+ 타우 신호를 평가하기 위해 동시에 분석하였다.
분석 2: 항체의 열 변성을 사용한 생물학적 유체에서의 유리 p217+ 타우 대 결합된 p217+ 타우의 정량화
관심 생물학적 유체의 분취물(예를 들어, CSF)을 95℃에서 4분 동안 가열한 다음, 4분 동안 습식 얼음 상에서 냉각시켰다(샘플="반변성 유체"). 동시에, 동일한 유체의 제2 분취물을 8분 동안 습식 얼음 상에서 냉각시켰다(샘플="비변성 유체"). 이어서, 두 샘플을 모두 실시예 1의 시모아 p217+ 타우 분석을 사용하여 측정하였다. 반변성 유체 신호는 총 p217+ 타우를 나타내는 반면, 비변성 유체는 유리 p217+ 타우를 나타낸다. 전자에서 후자를 빼서 결합된 타우의 측정을 얻는다. 정확한 가열 시간 및 온도를 결정하여, p217+ 타우 신호 자체에는 어떠한 영향도 주지 않으면서, 시모아 p217+ 타우 분석을 더 이상 방해할 수 없도록 유체에서 임의의 항체를 비가역적으로 개질하였다. 이러한 분석은 항체가 p217+ 타우에 결합되었는지 여부를 직접 측정하는 것이 아니라, 오히려 분석-경쟁 항체가 존재함을 보여준다. 그러나, 이 분석으로 더 많은 노력이 필요한 분석 1의 결과와 유사한 결과를 얻었다.
실시예 4. 생물학적 샘플
분석 개발 및 기술 검증을 위해 사용되는 샘플
실시예 1 내지 실시예 3의 분석은 높은 타우 수준을 갖는 인간 대상으로부터 풀링된 CSF를 사용하여 개발하였다. 1상 실험의 건강한 지원자의 시험에 필요한 분석 감도를 보장하기 위해 낮은 타우 수준을 갖는 인간 대상에서 풀링된 CSF를 사용하여 일부 실험을 또한 수행하였다. 네우 엔세팜 게엠베하(Neu Encepharm GmbH)(동물 시험 CRO)로부터 얻은 사이노몰거스 마카크(Cynomolgus Macaque)(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) 및 비단 마모셋(칼리트릭스 자쿠스(Callithrix jacchus))로부터의 CSF를 또한 실시예 1 내지 실시예 3의 분석을 사용하여 측정하였다. 추가로, 인지적으로 정상인 인간 대상과 비단 마모셋으로부터의 급속 냉동한 뇌 샘플을 균질화하고, 실시예 1 및 실시예 3의 분석을 사용하여 측정하였다. 일부 실험은 임상적으로 정의된 HV 및 AD 대상으로부터의 개별 혈청을 사용하여 수행하였다.
예비 임상 적격성 평가를 위해 사용되는 샘플
코호트 1 ("분석간 상관 코호트"): 뇌실액(VF) 및 요추액(LF) CSF 샘플을 정상 뇌압 수두증(NPH)에 걸린 대상(n=11)에서 얻었다(쿠오피오 대학(University of Kuopio), 빌레 레노넨(Ville Lenoinen) 교수). 이러한 샘플을 살그렌스카 대학(University of Sahlgrenska)(카즈 블렌노우(Kaj Blennow) 교수)에서 수행된 이노테스트 분석(Innotest assay)에 의해 결정된 CSF Aβ42, 총 타우(t타우) 및 p타우181 측정, 그리고 뇌 생검 아밀로이드 및 면역조직화학(IHC) 측정에 의해 분리하였다. rpHPLC 및 시모아 p217+ 타우 측정을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스(Janssen Neuroscience Biomarkers)에서 수행하였다.
코호트 2 ("온전한(clear) HV 대 온전한 AD 코호트"): 생화학적으로 정의된 알츠하이머 질환(AD) 대 건강한 지원자(HV) 대상(군당 n=20)으로부터의 LF CSF 샘플을 살그렌스카 대학(카즈 블렌노우 교수)에서 얻었다. 이노테스트 분석에 의한 CSF Aβ42, t타우 및 p타우181 측정을 살그렌스카 대학에서 수행하였다. 미리 결정된 AD 대 HV 컷오프 측정으로의 분리를 기반으로 샘플의 대형 패널로부터 샘플을 선택하였다(AD = CSF Aβ42 < 400 pg/ml 및 CSF tTau > 600 pg/ml, HV = CSF Aβ42 > 400 pg/ml 및 CSF tTau < 600 pg/ml). rpHPLC 및 시모아 p217+ 타우 측정을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하였다.
코호트 3 ("HV 대 ARAD 대 초기 AD 코호트"): 임상적으로 정의된 정상(임상 치매 등급 0; CDR 0) 대 경증 기억 감퇴(CDR 0.5) 대상(군당 n=20)으로부터의 LF CSF 샘플을 얀센 연구 ALZ1005/1002로부터 수득하였다. 이노테스트 분석에 의한 CSF Aβ42, t타우 및 p타우181 측정을 살그렌스카 대학에서 수행하였다. CDR 및 CSF Aβ42 점수에 기초하여, 대상을 (a) HV = CDR 0 및 Aβ42 > 600 pg/ml, (b) AD 위험군(ARAD) = CDR 0 및 Aβ42 < 600 pg/ml, (c) 잠재적으로 AD가 아닌 치매 = CDR 0.5 및 Aβ42 > 600 pg/ml 및 (d) 초기 AD = CDR 0.5 및 Aβ42 < 600 pg/ml로 분류하였다. rpHPLC 및 시모아 p217+ 타우 측정을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하였다.
코호트 4 ("CDR 0 대 CDR1 코호트"): 임상적으로 정의된 정상(임상 치매 등급 0; CDR 0) 대 경도 기억 감퇴(CDR 1) 대상(군당 n=5)으로부터의 LF CSF 샘플을 워싱턴 대학(Washington University)으로부터 얻었다. 이노테스트 분석에 의한 CSF Aβ42, t타우 및 p타우181뿐만 아니라 CDR & MMSE 측정을 워싱턴 대학에서 얻었다. 선적 전에, 얀센이 샘플 식별 또는 특성화에 대해 보지 못하도록 샘플을 암호화하였다. rpHPLC 및 시모아 t타우 & p217+ 타우 측정을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하고, 분석을 위해 워싱턴 대학으로 보냈다.
코호트 5 ("HV 대 MCI 대 AD 코호트"): 임상적으로 그리고 생화학적으로 (이노테스트 AB42 > 600 pg/ml) 정의된 HV(n=7)로부터의 LF CSF 샘플을 샌디에고 소재의 프리시젼 메디슨(Precision Medicine)으로부터 얻었다. 임상적으로 그리고 생화학적으로(이노테스트 AB42 < 600 pg/ml) 정의된 MCI(n=28) 및 AD(n=12)로부터의 LF CSF 샘플을 앤트워프 대학교(University of Antwerp)로부터 얻었다. rpHPLC 및 시모아 p217+ 타우 측정을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하였다.
코호트 6 ("질환 중증도 및 진행 코호트"): 임상적으로 정의된 AD(임상 치매 등급 1+) 대상(n=235)으로부터의 LF CSF 샘플을 얀센 연구 ELN115727301/302로부터 얻었다. 이러한 샘플은 실험의 모든 대상으로부터의 기준선(투여전) 샘플이었다. 또한, 위약 대상(n=90)에 대한 78주차 추적 조사로부터의 CSF 샘플이 질병 진행의 바이오마커를 평가하기 위해 포함되었다. 인지 평가(ADAS-COG, MMSE, NTB, CDR.SOB), ApoE 유전자형, 성별 및 나이를 실험에서 얻었다. 이노테스트 AB42, 이노테스트 AB40, 시모아 NFL, pT3xpT82, pT3xhT43 및 hT7xpT82 분석을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하였다. 대상은 0.09의 AB42/40 비 컷오프를 기준으로 아밀로이드 양성 또는 음성으로 확인되었다(예를 들어, 비가 < 0.09인 대상 = 아밀로이드 양성 = AD인 반면, 비가 > 0.09인 대상 = 아밀로이드 음성 = AD가 아닌 원인으로부터의 치매). 235명의 대상 중 27명이 아밀로이드 음성인 것으로 결정되었으며, 두 군 모두를 개별적으로 분석하였다.
항-p217+ 제제로 치료한 후 표적 관여의 평가에 사용되는 샘플
위약 또는 JNJ63733657(단일 IV 주사)로 치료된 HV 대상(n=40)으로부터의 LF CSF를 얀센 실험 JNJ63733657EDI1001로부터 얻었다. pT3xpT82 분석을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하였다. pT3xhT43 분석을 메사추세츠 주 렉싱턴 소재의 퀀테릭스 코포레이션에서 수행하였다.
실시예 5. 시모아 플랫폼을 사용한 포획 및 검출 항체 쌍의 스크리닝
문헌(예를 들어, 문헌[Meredith et al. PLoS One. 8(10):e76523, 2013]; 문헌[Barthelemy et al., J Alzheimers Dis. 51(4):1033-43, 2016]; 문헌[Russell et al., J Alzheimers Dis. 55(1):303-313, 2017]; 문헌[Hanger et al. J Biol Chem. 282(32):23645-54, 2007]) 및 얀센 뉴로사이언스 디스커버리(Janssen Neuroscience Discovery)로부터의 이전 보고서들은 아미노산 200 내지 220, 특히 아미노산 212, 214, 217에서의 인산화의 일부 조합을 함유하는 타우 단편이 AD에서 풍부하다는 것을 보여주었다. 따라서, 이러한 특정 타우 종("p217+ 타우")을 측정하기 위한 분석을 개발하는 것은 AD 진단 및/또는 병기 결정을 위한 개선된 바이오마커뿐만 아니라 이러한 타우 모이어티를 표적화하는 새로운 약물에 대한 잠재적인 예측적 및/또는 약력학적 분석을 제공할 수 있다. 그러나, 타우는 건강한 지원자에서 낮은 수준(< 200 pg/ml)으로 존재할 수 있으며, p217+ 타우는 총 타우의 소수 성분이어서, p217+ 타우 분석은 최적의 항체 쌍 및 고감도를 필요로 한다.
이러한 목적을 달성하기 위해, 일부 고-친화성 상업용 항-타우 mAb뿐만 아니라 얀센에서 발견한 항-타우 mAb의 세트를 pT3과 쌍을 이룰 때 샌드위치 ELISA(sELISA) 형식으로 신호를 생성하는 이들의 능력에 대해 평가하였다. AD 대상으로부터의 CSF의 풀의 연속 희석을 사용하여, 항체 쌍을 시모아 HD-1 분석기 플랫폼(퀀테릭스 코포레이션) 상에서 스크리닝하여 필요한 감도를 제공하였다. 분석 성능은 샘플 희석제에서 희석된 샘플의 비드 당 평균 효소(AEB)/분석 희석제 단독의 AEB인 신호/잡음(Signal/Noise)을 기초로 하였다. pT3과 쌍을 이루는 최적의 검출 항체는 감도순으로 hT43, pT82, 퀀테릭스 타우 2.0 검출기 시약 및 BT2였다(표 1). hT43 및 퀀테릭스 타우 2.0 검출기 시약은 타우의 N-말단 영역을 인식하는 반면, pT82 및 BT2는 타우의 중간 영역에 더 가까운 서열을 인식한다. 최상의 N-말단(hT43) 및 중간 영역(pT82) mAb를 추가의 최적화를 위해 선택하였다. 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스 및 퀀테릭스 코포레이션에서 스크리닝을 동시에 수행하여 유사한 결과를 얻었다.
[표 1]
Figure 112020104520020-pct00002
실시예 6. pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석의 최적화
시모아 플랫폼에서의 분석을 최적화하는 일반적인 퀀테릭스 실험에 기초하여 일련의 최적화 실험을 수행하였다. 10% 마우스 혈청 또는 500 ㎍/ml 마우스 IgG를 검출기 희석제에 첨가하였으나, 분석 감도는 개선되지 않았다. 검출기 mAb 농도(0.15, 0.3, 0.6, 1.2 및 1.8 ㎍/ml), SβG 농도(100, 200 또는 300 pM) 및 포획 mAb 비드 농도(300K/웰, 150K + 200K 헬퍼 비드)의 적정을 평가하였다. 프로토콜 인큐베이션 시간(65분 대 35분) 및 샘플 부피(100 대 150 μl)를 또한 평가하였다. 두 분석 모두에 대한 이상적인 시약 농도는 각각 150K 포획 비드 + 200K 헬퍼 비드, 1.8 ㎍/ml 검출기 및 200 pM SBG였다. 샘플 부피 및 인큐베이션 시간은 분석에 최소한의 영향을 미치므로, 더 낮은 조건인 100 ul 샘플 및 35분 인큐베이션을 선택하였다.
실시예 7. pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석의 기술적 검증
보정 재료를 사용한 선형 범위
실시예 1에 기재된 보정 펩티드를 제조하였다. 보정 펩티드는 PEG4 링커에 의해 분리된 pT3 및 pT82, 또는 pT3 및 hT43의 코어 에피토프를 함유하였으며, 이들을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 대표적인 표준 곡선이 도 1에 도시되어 있다. 보정 펩티드를 분석 완충액에서 1:3 점프로 30 pg/ml에서 0.041 pg/ml로 적정하고, pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석으로 측정하였다. 4-파라미터 곡선 맞춤 데이터 감소 방법(4-parameter curve fit data reduction method)(4PL, 1/y2 가중)을 사용하여 보정 곡선을 생성하였다. 검출 하한(LLOD)은, 10% 변동 계수(CV)를 포함하여, 제로 보정기의 평균 + 2.5 표준 편차(SD)와 동일한 AEB를 산출하는 계산된 보정 수준으로 정의되었다. 이러한 기준으로, 대표적인 데이터로 약 0.002 pg/ml의 LLOD를 얻었다. 분석의 선형 범위, 정량화의 하한(LLOQ) 및 정량화의 상한(ULOQ)은 예상된 CV < 20% 및 80-120% 회수율을 달성하는 최저 및 최고 표준 곡선 지점으로 정의되었다. 이러한 기준을 사용하여, pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석 둘 모두에 대한 선형 범위는 0.041 내지 30 pg/ml였다(도 1, 표 2).
[표 2]
CSF를 사용한 희석 직선성
희석 직선성을 평가하고 CSF 샘플을 시험하기 위한 이상적인 희석을 결정하기 위해, AD 대상으로부터의 4개의 CSF 샘플의 패널(고 타우, 낮은 AB42)을 분석 완충액에서 1:2에서 1:4096 희석으로 적정하고, p217+ 타우 분석에서 측정하였다. 1:512를 초과하여 희석된 샘플은 전형적으로 LLOQ 미만으로 측정되었다. 1:4에서 1:512까지의 샘플 측정은 선형 희석이므로, CSF 샘플을 측정하는 것에 대해 범위로 한정되었다. 인지적으로 정상인 대상을 확인하기 위해, 낮은 타우 및 높은 AB42를 갖는 대상으로부터의 CSF의 풀을 유사하게 측정하였다. 희석 직선성이 1:4 에서 1:256까지의 희석에 대해 다시 관찰되었으며, 이 범위를 초과한 측정은 LLOQ 아래로 떨어졌다(도 2).
정밀도
측정의 정밀도를 평가하기 위해, pT3xhT43에 대한 표준 곡선을 생성하고, 별도의 3일에 걸쳐 측정하였다(도 3 및 표 3). 보정 펩티드를 30 내지 0.041 pg/ml의 연속 1:3 점프로 희석하고, pT3xhT43 분석에서 이중으로 측정하였다. 동일한 장소에서 그리고 동일한 기술자에 의해 연속 3일에 걸쳐 절차를 반복하였다. 곡선 중간에 있는 4개의 지점(CSF 샘플이 측정되는 곳)을 분석한 결과, 실행 내의 정밀도(시험 내 CV%)는 항상 <10%이고, 평균 2.46-5.18% CV이며, 시험간 정밀도는 평균 6.46% CV였다. 이들은 연구 전용(RUO) 분석에 대해 허용되는 한계인 20% CV 내에 잘 속하며, 시모아 HD-1 분석기에서의 모든 ELISA 단계의 자동화 특성에 부분적으로 기인한다.
[표 3]
Figure 112020104520020-pct00004
실험실간 이전성
시험 장소 사이의 p217+ 타우 분석의 정밀도를 평가하기 위해, 동일한 AD CSF 풀을 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스 및 퀀테릭스 코포레이션에서 동일한 시약의 로트(lot)를 사용한 적정으로 측정하였다. 도 4는 두 시험 장소에서 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석에 대한 측정이 매우 유사하다는 것을 보여준다.
정확도
분석의 정확도를 평가하기 위해, HV CSF의 2개의 상이한 풀을 공지의 농도의 보정 펩티드(0, 2 또는 20 pg/ml)로 스파이킹하고(spiked), 권장되는 1:4 희석으로 희석한 다음, pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석에서 측정하였다. 이는 샘플 매트릭스의 구성요소들에 의해 나타나는 잠재적인 간섭의 하나의 척도이다. 내인성 신호의 수준을 2 및 20 pg/ml의 스파이크 측정에서 뺀 다음, 보정 재료의 관찰된 농도를 예상 농도와 비교하여 % 회수율을 계산하였다. 측정된 농도를 예상 농도와 비교하여 스파이크 회수율을 계산하여, 114%의 평균 회수율을 얻었다(표 4). 이는 RUO 분석에 대해 허용되는 한계인 80-120% 회수율 안에 잘 속하며, 이는 ≥ 1:4 희석에서 시험될 때 CSF에서의 유의한 간섭이 없음을 나타낸다.
[표 4]
CSF에서 p217+ 유도된 항체에 의한 신호 경쟁
CSF에서의 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석 신호의 정확성을 확인하고, p217+ 타우-유도 항체의 임상 연구에서 약력학적 분석으로서의 이의 잠재적 유용성을 평가하기 위해, AD CSF의 풀을 pT3 mAb 또는 인간화 pT3 mAb의 적정으로 스파이킹하고, 실온에서 2시간의 인큐베이션 후에 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석에서 측정하였다(도 5). 가용성 pT3 및 인간화 pT3 항체의 투여는 pT3-기반 분석에서 신호를 용량 의존적으로 감소시켰다. 유사한 농도에서의 msIgG(음성 대조군)를 스파이킹하는 것은 측정에 어떠한 영향도 주지 않았다. 인간화 pT3 mAb 대 pT3의 낮은 경쟁 능력은 p217+ 타우에 대한 pT3의 더 높은 친화성에 기인할 수 있다.
인산화 의존성
pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석으로 얻어진 CSF 내의 신호를 확인하는 것은 실제로 인산화 에피토프를 기반으로 하며, AD CSF를 알칼리 포스파타제로 처리하여 모든 잔기를 탈인산화하였다. 이어서, 샘플을 pT3 분석에서 그리고 hT7xpT82 또는 hT7xBT2인 2개의 hT7-기반 분석에서 분석하였다. hT7은 인산화에 의존하지 않는 것으로 알려져 있어, 음성 대조군으로 사용하였다.
AD 환자로부터의 풀링된 CSF를 아연 및 염화마그네슘-함유 완충액에서 37℃에서 4시간 동안 증가하는 양의 알칼리 포스파타제(AP)로 처리하였다. pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석을 사용하여 pT3-유도된 에피토프에 대한 효과를 측정하였다. pT3xhT43 및 pT3xpT82 신호는 알칼리 포스파타제 처리에 의해 용량 의존적으로 감소되었다. 그러나, 비-인산화 의존성 분석 hT7xpT82 또는 hT7xBT2는 신호 감소를 보이지 않았으며, 이들은 실제로, pT7 결합이 인산화에 의해 감소되기 때문에 예상대로 증가를 나타내었다(도 6).
p217 + 타우 단편 프로파일
미정제 CSF를 측정하는 것으로부터 유도된 p217 + 타우 신호의 특성을 조사하기 위해, AD CSF의 샘플을 문헌[Meredith et al. PLoS One. 8(10):e76523, 2013]에 기재된 것과 유사한 방법을 통해 rpHPLC에 의해 분획화하였다. pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석을 사용하여 분획을 수집하고 측정하였다(도 7). 이러한 크로마토그래피 포맷에서, 더 작은 타우 분획은 더 빨리 용리되는 반면(더 작은 분획 번호), 더 큰 분획은 더 나중에 용리된다(더 큰 분획 번호). 전장 타우는 분획 19에서 용리된다. 타우 단편 프로파일은 이전의 보고에 따라, 분석 중 어느 하나에 의해 검출된 전장 타우가 거의 존재하지 않음을 나타내었다(문헌[Meredith et al. PLoS One. 8(10):e76523, 2013], 문헌[Barthelemy et al., J Alzheimers Dis. 51(4):1033-43, 2016]). pT3xpT82 분석은 전장 타우보다 작은 2개의 주요 피크(타우 종)를 검출한 반면(분획 12 및 14), pT3xhT43 분석은 이들 주요 피크 중 단지 하나(분획 14)만을 검출하였다. 이는 CSF 내의 p217+ 타우가 적어도 2개의 단편으로 존재함을 나타내었는데, 상기 단편은 적어도 hT43에서 pT3의 영역(타우 aa 7-220)을 암호화하는 더 큰 단편 및 적어도 pT82에서 pT3의 영역(타우의 aa 116-220)을 암호화하지만 hT43 에피토프에 도달하지는 않는 더 작은 단편이다. 즉, 임의의 주어진 시간에 타우 분자의 서브세트에서만 절단되는 단백질 분해 절단 부위가 aa 20 내지 aa 116 사이에 있을 가능성이 있다. 타우의 유사한 영역을 인식하지만 인산화-특이적이지 않은 다른 타우 분석을 사용한 측정이 유사한 결과를 산출하므로, 프로파일은 p217+ 특이적이지 않다(데이터는 도시되지 않음).
분석물 안정성
내인성 p217+ 타우 에피토프의 안정성을 다양한 온도에서 평가하였다. AD CSF의 풀을 분취하고, 각각의 분취물을 4℃, 22℃ 또는 37℃에서 1시간, 2시간 또는 4시간 동안 보관하였다. 또한, 분취물의 서브세트를 2회 또는 3회 동결-해동(-80℃ 내지 22℃)하였다. 이어서, 모든 샘플을 1:20으로 희석하고, pT3xhT43 및 hT7xpT82 분석을 사용하여 분석하였다(도 8). 시험한 임의의 조건에서 신호의 유의한 변화가 관찰되지 않았는데, 이는 이러한 분석에 의해 인식되는 4개의 에피토프가 모두 표준 저장/시험 절차를 가능하게 하기에 충분히 안정적이라는 것을 나타낸다. 마지막으로, CSF를 4명의 공여자로부터 전향적으로 수집한 후, 분취하고, -70℃에서 냉동하여, 샘플을 pT3xpT82 분석으로 측정하기 위해 3개월 마다 제거하였다. 3개월, 6개월 또는 9개월의 시점에서 신호의 유의한 변화가 관찰되지 않았다(도 9).
실시예 8. pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석의 임상적 검증
AD의 진단 및 병기 결정에서의 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석의 유용성을 평가하기 위해, p217+ 타우 측정을 위해 3개의 코호트의 CSF 샘플을 얻었다. 측정을 인지 점수 및 다른 고전적인 AD 바이오마커와의 상관 관계에 대해 분석하였다.
코호트 1: "분석간 상관 코호트 "
뇌에서 과도한 간질액을 생성하고 높은 AD 발병률을 보이는 것을 특징으로 하는 신경퇴행 장애 정상 뇌압 수두증(NPH)에 걸린 10명의 대상으로부터 CSF 샘플, VF 및 LF, 및 뇌 생검(뇌실)을 얻었다. p217+ 타우 측정을 미정제 CSF에 대해 수행하고 전통적인 AD 바이오마커와의 상관 관계에 대해 분석하였다.
VF 내의 Aβ42(도 10a, 도 10d), t타우(도 10b, 도 10e), p타우181(도 10c, 10f)의 수준을 이노테스트 ELISA(고전 측정)에 의해 결정하였다. 동일한 샘플을 pT3xhT43(도 10a, 도 10b, 도 10c) 및 pT3xpT82(도 10d, 도 10e, 도 10f) 분석으로 측정하고, 상관 관계를 평가하였다. pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석은 모두 CSF Aβ42(각각 r2 = 0.609, p = 0.0077 및 r2 = 0.590, p = 0.0095)와 음의 상관 관계를 나타내고, CSF t타우(각각 r2 = 0.525, p = 0.0177 및 r2 = 0.435, p= 0.0381)와 양의 상관 관계를 나타내지만, 이들은 CSF p타우181과 유의한 상관 관계가 없었다(도 10).
동일한 10명의 NPH 대상으로부터의 뇌 생검을 IHC에 의해 분석하고, 병리학자는 아밀로이드 양성/음성 및 타우 양성/음성으로 점수를 매겼다. 둘 모두에 대해 양성인 경우, 샘플은 "생검+"로 지정되었는데, 이는 AD에 대한 고전적인 진단이었다. 둘 모두에 대해 음성인 경우, 샘플은 "생검-"로 지정되었는데, 이는 비AD에 대한 고전적인 진단이었다. "생검+ (아밀로이드)"로 지정된 샘플은 아밀로이드에 대해 양성이었으나 타우에 대해 음성이었다. 뇌실 천자(VF = 검정색 점) 또는 요추 천자(LF = 빨간색 점)로부터 얻은 CSF를 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석으로 측정하였고, 상관 관계를 평가하였다(도 11). pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석은 모두 양성 샘플(아밀로이드+/타우+)에서 뇌 생검 음성(아밀로이드-/타우-)을 분리할 수 있었다(각각 P = 0.04 및 0.02). 아밀로이드에 대해 양성이지만 타우에 대해서는 양성이 아닌 샘플을 종종 생검+ 샘플과 생검- 샘플 사이에서 측정하였다. 뇌 내의 아밀로이드 플라크는 타우 매듭보다 먼저 일어나는 것으로 여겨지며, 따라서 아밀로이드+/타우- 샘플은 초기 AD 또는 다른 질환을 나타낼 수 있다.
코호트 2: " HV 대 AD 코호트 "
생화학적으로 정의된 AD 대 HV 대상(군당 n=20)으로부터의 CSF 샘플(LF)을 살그렌스카 대학으로부터 얻었다. Aβ42 및 t타우의 수준을 이노테스트 ELISA(고전적인 측정)에 의해 결정하여, 군을 세분하였다(AD = CSF Aβ42 < 400 pg/ml 및 CSF tTau > 600 pg/ml, HV = CSF Aβ42 > 400 pg/ml 및 CSF tTau < 600 pg/ml). 미정제 CSF 및 rpHPLC-분획화된 CSF의 서브세트에 대한 pT3xhT43, pT3xpT82 및 hT7xpT82 분석을 사용하여 측정을 수행하였다. 결과를 전통적인 AD 바이오마커와의 상관 관계에 대해 분석하였다(도 12). 도 12의 패널 A 및 B에서의 데이터는 pT3 에피토프가 초기 AD로 빠르게 진행될 위험이 높은 환자의 지표임을 입증하였다. pT3 에피토프는 총 타우가 높고 Aβ42가 낮은 것으로 나타나는 환자에서 고도로 상승하였다. 반대로, pT3 에피토프는 총 타우가 낮고 Aβ42가 높은 대상에서 낮은 수준으로 존재하였다. 도 11c는 증가된 pT3 에피토프-함유 타우가, hT7xpT82 총 타우 분석에 의해 입증된 바와 같이, 상승된 수준의 총 타우에 의해 적어도 부분적으로 유도되나, 전체적으로는 아니었음을 확인하였다(도 12 d). 이는 타우의 양 및 p217+ 에피토프에서 인산화되는 정도 모두가 AD에서 상승함을 나타낸다.
도 11로부터의 데이터를 사용하여, HV 샘플로부터 AD를 구별하기 위한 pT3xhT43, pT3xpT82 및 hT7xpT82 분석의 능력에 대한 ROC 곡선을 생성하였다. 3개의 분석은 모두 우수한 특이성 및 감도를 보여주었다. 그러나, 2개의 pT3-기반 분석(pT3xhT43, pT3xpT82, 이는 p217+ 타우를 검출함)은 hT7-기반 분석에 비해 진단 능력이 개선되었다(도 13).
도 12에서 측정된 동일한 CSF 샘플의 서브세트(군당 n=11)를 rpHPLC로 분획한 후, pT3xhT43, pT3xpT82 및 hT7xpT82 분석으로 측정하였다(후자는 인산화-비의존성적인 방식으로 동일한 타우 단편을 측정하는 것이다)(도 14). 관찰된 타우 단편의 프로파일은 실시예 7 및 도 7에서 보이는 것과 유사하였다. 즉, 두 pT82-기반 분석(pT3xpT82 및 hT7xpT82)에서는 2개의 주요 종이 관찰된 반면, pT3xhT43 분석에서는 피크 중 단지 하나만이 관찰되었다. 두 주요 종은 HV 군보다 AD 군에서 더 높은 농도로 존재하였다. 또한, pT3-기반 분석(p217+ 타우)은 미정제 CSF 분석에서 검출된 바와 같이, hT7-기반 분석(총 타우)보다 군간에 더 큰 차이를 보였다. 더 큰 p217+ 타우 종(분획 13-14)은 가장 큰 AD 대 HV 차이를 제공하였다(도 14).
도 14의 모든 주요 타우 단편(분획 11 내지 14)의 합을 계산한 다음, AD와 HV 하위군 간에 비교하였다. AD에서 pT3-에피토프-함유 타우(pT3xhT43 또는 pT3xpT82)의 % 증가는 비-pT3-에피토프 함유 타우(hT7xpT82)를 사용하여 보이는 것보다 2배 이상 컸다(표 5).
[표 5]
Figure 112020104520020-pct00006
표 5에서 행해진 바와 같은 합에 대해 각각의 도 14의 분획에서의 신호의 분석을 독립적으로 수행하여 어느 분획이 최대 AD 대 HV 신호를 산출하였는지 확인하였다. 가장 유익한 단편 풀은 단편 풀 13 및 14에 대한 pT3 항체를 이용해서 검출되었다(표 6).
[표 6]
코호트 3: " HV 대 ARAD 대 초기 AD 코호트 "
임상적으로 정의된 정상(CDR 0) 대 경증 기억 감퇴(CDR 0.5) 대상(군당 n=20)으로부터의 CSF 샘플(LF)을 얀센 연구 ALZ1005/200으로부터 얻었다. Aβ42, t타우 및 p타우181의 수준을 이노테스트 ELISA에 의해 결정하였다. CDR 및 CSF Aβ42 점수에 기초하여, 대상을 (a) HV = CDR 0 및 Aβ42 > 600 pg/ml, (b) ARAD = CDR 0 및 Aβ42 < 600 pg/ml, (c) 잠재적으로 AD가 아닌 치매 = CDR 0.5 및 Aβ42 > 600 pg/ml 및 (d) 초기 AD = CDR 0.5 및 Aβ42 < 600 pg/ml로 분류하였다.
CSF 샘플을 또한 rpHPLC에 의해 분획화하고, pT3-기반(pT3xhT43, 도 15a 내지 도 15e 및 pT3xpT82, 도 15f 내지 도 15j) 및 총 타우(hT7xpT82, 도 15k 내지 도 15o) 분석으로 측정하였다. 모든 pT3-기반 및 hT7-기반 분석은 CDR 0 대 CDR 0.5(도 15a, 도 15f 및 도 15k)에서 그리고 Aβ42 < 600 pg/ml 대 > 600 pg/ml를 갖는 샘플(도 15b, 도 15g 및 도 15l)에서 상승된 신호를 나타내었다. CDR x Aβ42 수준에 의한 분석(breakdown)이 도 15c, 도 15d, 도 15h, 도 15i, 도 15m 및 도 15n에 나타나 있으며, 모든 분획에 걸쳐 합산된 신호가 도 15e, 도 15j 및 도 15o에 예시되어 있다. 신호 수준은 초기 단계 AD 대 HV 또는 ARAD에서 상승된 p217+ 타우 신호와 일치하며, Aβ42 < 600 pg/ml + CDR 0.5 하위군에서 가장 높았다. 하위군 사이의 분리는 hT7-기반 분석에 비해 pT3-기반 분석에서 우수하였으며, 이는 pT3 에피토프의 과인산화가 질환에서 특히 풍부하다(단순히 총 타우 상승을 넘어)는 것을 나타낸다.
코호트 4(" CDR 0 대 CDR1 코호트 ")
임상적으로 정의된 정상(임상 치매 등급 0; CDR 0) 대 경도 기억 감퇴(CDR 1) 대상(군당 n=5)으로부터의 LF CSF 샘플을 워싱턴 대학으로부터 얻었다. 이노테스트 분석에 의한 CSF Aβ42, t타우 및 p타우181뿐만 아니라 CDR & MMSE 측정을 워싱턴 대학에서 얻었다. 선적 전에, 얀센이 샘플 식별 또는 특성화에 대해 보지 못하도록 샘플을 암호화하였다. rpHPLC 및 시모아 t타우 & p217+ 타우 측정을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하고, 분석을 위해 워싱턴 대학으로 보냈다.
CSF 샘플을 pT3-기반 분석(pT3xhT43 및 pT3xpT82) 및 t타우(hT7xpT82) 모두를 사용하여, 미정제 또는 rpHPLC 분획 후 측정하였다. 이 데이터는 짧은 타우 종의 상대적 영향을 평가하기 위해 2개의 pT3 분석(표 7) 사이의 비로 표현되거나, 또는 이러한 인산화 사건의 상대적 영향을 평가하기 위해 pT3 분석과 t타우 사이의 비(도 16a 및 도 16b)로 표현되었다. 두 경우 모두에서, 결과는 10명의 대상 중 9명에 대한 CDR 상태를 정확하게 예측하였다. 1명의 이상치 대상은 또한 이노테스트에 의해 비정상적으로 낮은 타우를 갖는 것으로 확인되었으므로, 비-타우증병으로 인한 치매를 나타낼 수 있다. 흥미롭게도, p217+ 타우/t타우 비와 MMSE 사이의 상관 관계가 관찰되었으며, 이는 pT3-분석에 의해 검출된 신호가 인지로 추적될 수 있음을 시사한다.
[표 7]
Figure 112020104520020-pct00008
코호트 5(" HV 대 MCI 대 AD 코호트 ")
임상적으로 그리고 생화학적으로 (이노테스트 AB42 > 600 pg/ml) 정의된 HV(n=7)로부터의 LF CSF 샘플을 캘리포니아주 샌디에고 소재의 프리시젼 메디슨으로부터 얻었다. 임상적으로 그리고 생화학적으로(이노테스트 AB42 < 600 pg/ml) 정의된 MCI(n=28) 및 AD(n=12)로부터의 LF CSF 샘플을 앤트워프 대학교로부터 얻었다. rpHPLC 및 시모아 p217+ 타우 측정을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하였다.
CSF 샘플을 pT3-기반 분석(pT3xhT43 및 pT3xpT82) 및 t타우(hT7xpT82) 모두를 사용하여, 미정제 또는 rpHPLC 분획 후 측정하였다. 모든 pT3-기반 분석 및 hT7-기반 분석은 HV 대 MCI 대 AD 군에서 상승된 신호 및 점진적으로 증가하는 신호를 보였으며(도 17a 내지 도 17c), 서로 잘 상관되었다(도 9의 코호트 1에 보이는 바와 같음)(도 17d 및 도 17e). pT3 분석은 또한 이노테스트 t타우 및 p타우181(도 17f 및 도 17g)과 어느 정도 상관 관계가 있지만, 이노테스트 AB42 또는 AB42/40 비와 상관 관계가 없다(도 17h 및 도 17i). 진단용 병기 결정에 대한 유사한 결과가 미정제 CSF 측정(도 17a 내지 도 17c) 또는 rpHPLC 분획화된 재료(도 17j 내지 도 17t)에서 관찰되었다. 코호트 3에서 보이는 바와 같이, HV 대 MCI 대 AD의 분리는 t타우 분석보다 pT3-기반 분석을 사용하여 더 두드러졌으며(통계적으로 더 큰 유의함), 이는 이러한 pT3-분석 측정의 병리학적 관련성을 강조하였다.
코호트 6("질환 중증도 및 진행 코호트")
임상적으로 정의된 AD(임상 치매 등급 1+) 대상(n=235)으로부터의 CSF 샘플(LF)을 얀센 연구 ELN115727301/302로부터 얻었다. 이러한 샘플은 실험의 모든 대상으로부터의 기준선(투여전) 샘플이었다. 또한, 위약 대상(n=90)에 대한 78주차 추적 조사로부터의 CSF 샘플이 질병 진행의 바이오마커를 평가하기 위해 포함되었다. 실험에서 인지 평가(ADAS-COG, MMSE, NTB 및 CDR.SOB), ApoE 유전자형, 성별 및 나이를 얻었다. 이노테스트 AB42, 이노테스트 AB40, 시모아 신경섬유 경쇄(NFL), pT3xpT82, pT3xhT43 및 hT7xpT82 분석을 라호이아 소재의 얀센 뉴로사이언스 바이오마커스에서 수행하였다. 대상은 0.09의 AB42/40 비 컷오프를 기준으로 아밀로이드 양성 또는 음성으로 확인되었다(예를 들어, 비가 < 0.09인 대상 = 아밀로이드 양성 = AD인 반면, 비가 > 0.09인 대상 = 아밀로이드 음성 = AD가 아닌 원인으로부터의 치매). 235명의 대상 중 27명이 아밀로이드 음성인 것으로 확인되어 각각의 군을 개별적으로 분석하였다.
미정제 CSF 측정으로부터의 신호는 두 pT3 분석 사이에서 그리고 t타우 분석과 양호한 상관 관계를 다시 보여주었지만(도 18a 및 도 18b), 일반적인 신경퇴행의 의심되는 마커인 NFL과는 그렇지 않았으며(도 18c), 이는 pT3-분석이 신경퇴행의 특정 형태 또는 병기를 인식할 수 있음을 시사한다.
pT3-기반 분석은 다시 아밀로이드 음성 대상에 비해 아밀로이드 양성에서 더 높은 신호를 나타내었다(도 18d 내지 도 18e).
pT3-기반 분석은 여러 인지 점수(ADAS-COG, MMSE, NTB, CDR.SOB, 도 18f 내지 도 18m)와 중간 정도의 상관 관계를 나타내어, 코호트 4에서의 발견을 보강하였다(도 16c). 흥미롭게도, 기준선 pT3-기반 분석 신호는 18개월의 추적 조사에 걸친 인지 점수의 변화와 중간 정도의 상관 관계를 보였는데, 이는 인지 감소를 예측하는 능력을 시사한다(도 18n 및 도 18p).
pT3-기반 신호 대 t타우 신호의 비(p217_ 타우/t타우)는 유사한 결과를 산출하였으며, 데이터는 도시되지 않는다.
아밀로이드 양성 및 음성 군 모두에서 인지와 인지 변화와의 상관 관계가 관찰되었지만, 후자의 군은 작은 샘플 세트였다. 확인된 경우, 이는 p217+ 대 인지 관련성이 AD-특이적이지 않을 수 있음을 시사한다.
실시예 9. 유리 p217+ 타우 대 항체에 의해 결합된 p217+ 타우의 정량화
실시예 3에 기재된 분석을 다음과 같이 수행하였다.
분석 1: 면역포획/고갈 후 rpHPLC를 통한 생물학적 유체에서의 유리 p217+ 타우 대 결합된 p217+ 타우의 정량화
항체를 CSF 샘플로 스파이킹함으로써 분석을 시험하였다. 풀링된 AD CSF를 10 ug의 pT3 mAb, 인간화 pT3 mAb, msIgG 또는 유사한 부피의 PBS(모의)로 스파이킹하고, 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 면역포획하였다. 샘플뿐만 아니라 면역포획되지 않은 모 CSF를 rpHPLC 상에 분획화하고, pT3xhT43 분석을 사용하여 각각의 분획을 측정하여, 총 및 결합된 p217+ 타우의 양을 평가하였다. 모 샘플(총 p217+ 타우) 및 pT3 mAb 또는 인간화 pT3 mAb 면역포획(결합된 p217+ 타우)에서 실시예 7 및 도 7에서 볼 수 있는 것과 유사한, 하나의 주요 피크에서 실질적인 신호가 관찰되었지만, 모의 또는 IgG 면역포획에서는 관찰되지 않았다(도 19).
풀링된 AD CSF를 인간화 pT3 mAb의 적정으로 스파이킹하고, 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 면역포획, rpHPLC 및 pT3xhT43 분석을 통해 결합된 p217+ 타우를 평가하였다(도 20a). IgG 고갈 상청액을 또한 분획화하고, 유리 p217+ 타우를 평가하였다(도 20b). 인간화 pT3 mAb를 사용한 스파이킹은 용량 의존적으로 측정된 결합된 p217+ 타우의 양을 증가시키고, 유리 p217+ 타우의 양을 감소시켰다.
종합하면, 결과는 표적 관여의 직접적인 측정인 이 방법이 p217+ 타우 에피토프에 표적화된 항체에 특이적이며(도 19), 표적화된-항체 용량 의존적임을 보여준다(도 20).
분석 2: 항체의 선택적 변성을 통한 생물학적 유체에서의 유리 p217+ 타우 대 결합된 p217+ 타우의 정량화
생물학적 샘플(예를 들어, CSF)을 4분 동안 거의 비등(near boiling)으로 가열한 후, 얼음 상에서 냉각시켜, pT3xhT43 및/또는 pT3xpT82 분석을 사용하여 후속 측정을 행하였다. 이러한 공정의 정확한 시간은 샘플에서 항체를 비가역적으로 손상시켜 분석을 방해할 수 없지만(도 21), p217+ 타우 신호 자체에 영향을 주지 않는 것으로 결정되었다(도 21). 이것은 타우 단백질 내의 3차 구조가 특히 부족하기 때문에 고온에서 특히 안정적인 것으로 여겨진다. 이러한 샘플을 총 p217+ 타우로 명명한 반면, 열 처리를 거치지 않은 샘플의 유사한 측정(parallel measurement)을 유리 p217+ 타우로 명명하였다. 총 농도에서 유리 농도를 빼서 결합된 p217+ 타우 측정을 얻었다.
분석에 대한 열의 영향을 다음과 같이 확인하였다.
CSF/ 인간화 pT3 mAb 혼합물에 대한 열의 영향: 풀링된 AD CSF의 분취량을 1 ㎍/ml로 인간화 pT3 mAb를 사용하여 스파이킹하고, 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여, 95℃에서 0 내지 20분 동안 가열하고, 4℃로 냉각한 다음, 1:10 희석에서 pT3xpT82 분석을 사용하여 측정하였다(도 21a). p217+ 타우 신호는 약 2분의 열 처리 동안 낮았다가, 이어서 스파이킹되지 않은 CSF에서 보이는 수준으로 돌아왔고, 약 10분의 열 처리 동안 안정적인 후, 하락하였다.
무경험() CSF의 열의 영향: 풀링된 AD CSF의 분취량을 95℃에서 0 내지 20분 동안 가열한 다음, 4℃로 냉각한 후, 1:10 희석에서 pT3xpT82 분석을 사용하여 측정하였다(도 21b). p217+ 타우 신호는 하락 전에 약 10분의 열 처리 동안 안정적이었다.
pT3xpT82 분석을 방해하는 인간화 pT3 mAb의 능력에 대한 열의 영향: PBS 중 10 ㎍/ml의 인간화 pT3 mAb의 분취물을 95℃에서 0 내지 20분 동안 가열한 다음, 4℃로 냉각하였다. 이어서, 이러한 샘플을 풀링된 AD CSF(인간화 pT3 mAb의 1 ㎍/ml 최종 농도로)와 혼합하고, 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 1:10 희석에서 pT3xpT82 분석을 사용하여 측정하였다(도 21c). p217+ 타우 신호는 약 2분의 JNJ 열처리 동안 낮았다가, 이어서 스파이킹되지 않은 CSF에서 보이는 수준(도 21b 참조)으로 돌아갔다가, 적어도 20분의 열처리 동안 안정적이었다.
풀링된 AD CSF의 유사 분취물을 인간화 pT3 mAb로 적정하고, 22℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 열 변성 과정(4분의 열을 사용함)(도 22a) 또는 면역포획/rpHPLC(도 22b) 중 어느 하나를 수행한 후, pT3xpT82 분석을 사용하여 측정하였다. 두 방법은 모두 결합된 p217+ 타우 신호에서의 pT3 mAb 용량 의존적 증가를 그리고 유리 p217+ 타우 신호에서의 감소를 보여주었고, 총 p217+ 타우 신호에서는 변화가 없음을 보여주었다. 추가로, 열-매개 변성 방법은 더 많은 노력이 필요한 면역포획/rpHPLC 분석법 1을 사용하여 얻은 것과 유사한 인간화 pT3 mAb 용량 의존성, 및 상대적인 유리 대 결합 대 총 p217+ 측정을 산출하였다(도 22c). 따라서, 표준 샘플 분석에는 가열 방법이 권장된다.
실시예 10. 전임상 동물 모델에서 p217+ 타우 신호
전임상 연구를 지원하기 위해, 다양한 일반적인 실험실 동물로부터의 무경험 샘플을 pT3-기반 분석을 사용하여 평가하고/하거나 서열-정렬하여 교차 반응성을 예측하였다.
사이노몰거스 마카크
2개의 사이노몰거스 마카크로부터의 CSF를 pT3-기반 및 hT7-기반 분석을 사용하여 다양한 희석에서 측정하였다(도 23). 비교 가능성을 위해, 동일한 검출 항체는 2개의 포획 항체 각각과 쌍을 이루었다. 일부 경우에, 2개의 개별 CSF를 개별적으로 시험하고(사이노 1 또는 사이노 2), 다른 경우에는, CSF 샘플을 풀링하여 부피를 절약하였다. 검출 항체와 관계 없이, 포획 항체로서 hT7을 사용한 모든 분석에서 실직적인 신호(AEB)가 관찰되었지만, 포획 항체로서 pT3을 사용한 임의의 분석에서는 어떠한 신호도 검출되지 않았다. 추가로, pT3을 사용한 플레이트 기반 분석은, 사이노몰구스 마카크 뇌의 균질물에서도, AD 인간 뇌에서의 큰 신호에도 불구하고, pT3 기반 신호가 거의 없거나 전혀 없다는 것을 보여주었다(데이터는 도시되지 않음). 이는 높은 수준의 타우에도 불구하고, pT3 에피토프는 이러한 종에서 보존되지 않음을 시사한다. 실제로, 공개된 단백질 서열의 분석은 pT3 코어 에피토프에서 인간과 사이노몰거스 마카크 사이에 하나의 아미노산이 상이하며, 타우를 갖는 인간화 pT3 mAb의 결정 구조에 기초한 구조적 모델링은 이러한 변화가 pT3의 결합을 무효화할 수 있음을 시사한다(데이터는 도시되지 않음).
비단 마모셋
비단 마모셋으로부터의 CSF를 pT3-기반 및 hT7-기반 분석을 사용하여 시험하였다(도 24). 3개의 비단 마모셋으로부터의 CSF를 pT3xhT43, pT3xpT82 및 hT7xpT82 분석을 사용하여 다양한 희석에서 측정하였다. 비교 가능성을 위해, 풀링된 사이노몰거스 마카크 CSF(음성 대조군) 및 풀링된 AD 인간 CSF(양성 대조군)를 동시에 시험하였다. pT3xpT82(도 24b) 및 hT7xpT82(도 20c) 분석을 사용하여, 마모셋 CSF에서 실질적인 신호(AEB)가 관찰되지만, pT3xhT43 분석은 그렇지 않았다(도 24a).
이는 hT43 에피토프가 이러한 종에는 결여되어 있음을 시사하며, 실제로 단백질 서열 정렬은 hT43 에피토프에서 인간과 비단 마모셋 사이에 하나의 아미노산이 상이한 반면, pT3, hT7 및 pT82 에피토프는 보존된다는 것을 나타낸다. 동일한 분석을 사용한 마모셋 뇌 균질물의 측정은 pT3xpT82 및 hT7xpT82 분석에서는 실질적인 신호가 있었지만, pT3xhT43 분석에서는 거의 신호가 없었던 것으로 확인되었다(데이터는 도시되지 않음). 따라서, pT3xpT82 분석을 사용하여, 마모셋 내의 p217+ 타우 신호를 분석하였다.
마우스, 쥐, 개, 돼지
마우스, 쥐, 개 또는 돼지(NCBI 수탁 번호: 각각 NP_001033698.1, NP_058908.2, NP_001104271.1 및 AGJ26517.1)에서의 예측된 타우 단백질 서열과 인간 서열의 정렬은 pT3이 이러한 종에서 100% 보존됨을 시사한다. 그러나, 마우스, 쥐, 개 및 돼지의 hT43 및 pT82 서열은 인간의 것과 동일하지 않으므로, 이들 유래의 샘플은 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석을 사용하여 평가될 필요가 있을 것이다.
종합하면, 본 명세서에 제시된 데이터는 CSF 측정을 위해 시모아 플랫폼 상에서 개발된 pT3xhT43 및 pT3xpT82 분석이 펨토그램 감도를 갖는 고감도이며, 정밀하고, 정확하며, 희석 선형이고, 분석물 안정적이라는 것을 나타낸다. 이 분석은 고전적인 AD 바이오마커 및 치매 점수와 매우 상관되는 것으로 보이며, AD 대상을 식별하고 병기 결정하는 데 있어서의 그러한 측정보다 우수할 수 있다.
분석은 CSF에서 총 p217+ 타우의 수준을 측정하거나, 또는 rpHPLC-분획화된 CSF에서 p217+의 단편 프로파일을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 또한 분석을 검사전 조작과 병용하여 내인성 또는 외인성으로 투여된 항체에 의해 결합된 p217+ 타우의 수준 대 항체가 없는 p217+ 타우의 수준을 측정할 수 있다. 따라서, 분석은 높은 수준의 p217+ 타우 표적을 갖는 대상을 식별함으로써, 항-p217+ 타우 항체 요법에 적합할 대상을 식별하기 위한 예측 바이오마커로서 사용될 수 있다. 총, 유리 및 치료적 항체-결합된 p217+ 타우의 수준을 측정함으로써, 분석은 또한 약력학적 마커로서 사용될 수 있다.
실시예 11. 혈액에서 p217+ 타우 신호
CSF에서의 타우의 측정이 신경퇴행 장애의 진단 및 병기 결정에서 큰 유용성을 보여주었지만, CSF의 수집에는 한계가 있었다(예컨대, 환자 부담, 임상 현장 경험, 수집량 및 빈도 제약). 이와 같이, 혈액 제품(예를 들어, 혈청, 혈장)에 사용하기 위한 타우 측정을 적용하는 데 큰 관심이 존재한다. 그러나, 최근 문헌은 미정제 혈청 또는 혈장에서의 타우 측정이 이상적인 진단 성능을 나타내지 않으며, 감도 및 매트릭스 간섭 장애에 의해 어려울 수 있음을 나타내었다. 그러나, pT3-기반 분석은 이의 고감도 및 특이성으로 인해 새로운 기회를 제시할 수 있다.
임상적으로 정의된 AD & HV 대상(각각 n=4)으로부터의 혈청을 다양한 희석에서 미정제 샘플("미정제", 도 25a 내지 도 25d) 또는 문헌[D'Abramo et al. 2016]에서와 같이 대부분의 매트릭스 간섭을 제거하기 위해 산(NaOAc pH5) 처리되고 변성된 샘플("비등", 도 26a 및 도 26b) 중 어느 하나에서, 그리고 pT3 비드를 사용한 면역침전(IP) 후 용리액의 열 변성 후("pT3 IP", 도 27) pT3xpT82 및 hT7xpT82 분석으로 측정하였다.
미정제 혈청에서의 측정은 대부분의 샘플이 정량화 한계(LOQ) 미만으로 나타났으며, 이때 약간의 이상치 샘플은 훨씬 더 높은 수준을 보고하였다. 그러나, 신호는 중간 정도의 희석을 견디지 못하여, 간섭 인공물(interference artifact)인 것으로 간주되었다. 시험된 가장 높은 희석을 평가하여(도 25b 및 도 25d), 간섭의 영향을 가장 적게 받은 결과, pT3xpT82 분석이 AD 샘플에서 약간 더 많은 신호를 검출할 수 있지만, 모두 LOQ 미만이어서 정확하고/하거나 정밀하지 않을 수 있음을 시사하였다.
(단백질-단백질 상호작용을 해리시키기 위한) 산 처리 및 (대부분의 비-타우 단백질을 변성시키기 위한) 열 처리 후 혈청에서의 측정은 모든 pT3xpT82 및 hT7xpT82 신호를 LOQ에 가깝거나 그 미만으로 감소시켰다(도 26a 및 도 26b). 다시 말해, pT3xpT82 분석은 AD 샘플에서 약간 더 많은 신호를 검출할 수 있지만, 모두 LOQ에 가까워 정확하고/하거나 정밀하지 않을 수 있다.
대부분의 간섭 물질을 제거하고 p217+ 타우를 농축하기 위한, pT3-IP 및 변성 후의 혈청에서의 측정은 HV 샘플에서보다 AD 샘플에서 훨씬 더 높은 수준을 나타내었다(도 27). p217+ 수준은 미정제 또는 비등 측정에서보다 약 4배 더 높았으며, HV 샘플은 이제 LOQ에 있고, AD 샘플은 이제 모두 선형 범위에 있었다.
이러한 결과는 본 명세서에 기재된 pT3-기반 분석이 특히 IP와 같은 풍부 전략과 쌍을 이룰 때 병리학적 타우의 혈액-기반 측정으로서 유용성을 가질 수 있음을 나타내었다.
본 발명이 상세히 그리고 그의 구체적인 실시 형태를 참조하여 설명되어 있지만, 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고서 거기서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
참고문헌
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Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 Sequence of PT82 mAb <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 Sequence of PT82 mAb <400> 3 Gln Ile Arg Leu Gln Ser Asp Asn Tyr Ala Thr Arg Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 sequence of PT82 mAb <400> 4 Gly Ile Thr Tyr 1 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 Sequence of PT82 mAb <400> 5 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT 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Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ile Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Tyr Met Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT82 mAb epitope, aa119-126 of SEQ ID NO:1 <400> 10 Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT82 mAb epitope, aa117 to 127 of SEQ ID NO:1 <400> 11 Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 of HT43 mAb <400> 12 Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 of HT43 mAb <400> 13 Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 of HT43 mAb <400> 14 Ser Trp Asp Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 of HT43 mAb <400> 15 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Phe Glu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 of HT43 mAb <400> 16 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 of HT43 mAb <400> 17 Phe Gln Gly Ser Leu Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 18 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of HT43 mAb <400> 18 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Thr Thr Ile Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Ser Trp Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of HT43 mAb <400> 19 Asp Val Leu Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HT43 mAb epitope, aa7 to 20 of SEQ ID NO:1 <400> 20 Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hT7 mAb epitope, aa 159-163 of SEQ ID NO: 1 <400> 21 Pro Pro Gly Gln Lys 1 5 <210> 22 <211> 58 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> calibrant peptide pT3xhT43 <220> <221> dPEG4 linker <222> (20)..(21) <220> <221> dPEG4 linker <222> (38)..(39) <220> <221> phosphorylated threonine <222> (44)..(44) <220> <221> phosphorylated threonine <222> (49)..(49) <220> <221> C-terminal amide <222> (58)..(58) <400> 22 Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Gly Asp Arg Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala 20 25 30 Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro 35 40 45 Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val 50 55 <210> 23 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> calibrant peptide pT3xpT82 <220> <221> N-terminal acetyl group <222> (1)..(1) <220> <221> dPEG4 linker <222> (18)..(19) <220> <221> phosphorylated threonine <222> (24)..(24) <220> <221> phosphorylated threonine <222> (29)..(29) <220> <221> C-terminal amide <222> (38)..(38) <400> 23 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 1 5 10 15 Ser Lys Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 20 25 30 Arg Glu Pro Lys Lys Val 35 <210> 24 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> calibrant peptide hT7xpT82 <220> <221> N-terminal acetyl group <222> (1)..(1) <220> <221> dPEG4 linker <222> (20)..(21) <220> <221> C-terminal amide <222> (34)..(34) <400> 24 Ala Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met 1 5 10 15 Val Ser Lys Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala 20 25 30 Asn Ala <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p217+ tau epitope <220> <221> phosphorylated threonine <222> (2)..(2) <400> 25 Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p217+ tau epitope <220> <221> phosphorylated threonine <222> (7)..(7) <400> 26 Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p217+ tau epitope <220> <221> phosphorylated threonine <222> (2)..(2) <220> <221> phosphorylated threonine <222> (7)..(7) <400> 27 Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 mouse mAb VH <400> 28 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Asn Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Lys Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asn Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Val Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 mouse mAb VL <400> 29 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Asp Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 humanized mAb VH <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Lys Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Val Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 humanized mAb VL <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 mouse mAb HCDR1, Kabat numbering <400> 32 Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 mouse mAb HCDR2, Kabat numbering <400> 33 Ser Ile Ser Lys Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asn Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 mouse mAb HCDR3, Kabat numbering <400> 34 Gly Trp Gly Asp Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 mouse mAb LCDR1, Kabat numbering <400> 35 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Arg Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 mouse mAb LCDR2, Kabat numbering <400> 36 Arg Ala Asn Arg Leu Leu Asp 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT3 mouse mAb LCDR3, Kabat numbering <400> 37 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr 1 5

Claims (31)

  1. 샘플에서 p217+ 타우(tau) 펩티드를 측정하는 방법으로서,
    (i) 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계로서,
    포획 항체가 각각 서열번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단계; 및
    (ii) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체 및 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 함유하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체 중 적어도 하나와 접촉시켜, 각각 p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양 중 적어도 하나를 측정하는 단계로서,
    a. 제1 검출 항체가 각각 서열번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고,
    b. 제2 검출 항체가 각각 서열번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단계;를 포함하며,
    아미노산의 넘버링은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 하는,
    방법.
  2. 제1항에 있어서, 포획된 p217+ 타우 펩티드를 제1 검출 항체 및 제2 검출 항체와 접촉시켜, 각각 p217+ 타우 펩티드의 양 및 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 긴 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제2항에 있어서, p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비 또는 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양에 대한 긴 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 측정하는 방법으로서,
    (i) 샘플을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하고, 샘플을 타우 단백질의 아미노산 150 내지 250의 에피토프에 대해 유도된 인산화-비의존성 포획 항체와 접촉시켜 샘플 내의 총 타우 펩티드를 포획하는 단계로서, 포획 항체가 각각 서열번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단계; 및
    (ii) 하기 a 및 b 중 적어도 하나를 수행하는 단계;를 포함하며:
    a. 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하고, 포획된 총 타우 펩티드를 제1 검출 항체와 접촉시켜 총 타우 펩티드의 양을 측정하며, 총 타우 펩티드의 양에 대한 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 결정하는 단계로서, 제1 검출 항체가 각각 서열번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단계; 및
    b. 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하고, 포획된 총 타우 펩티드를 제2 검출 항체와 접촉시켜 총 긴 타우 펩티드의 양을 측정하며, 총 긴 타우 펩티드의 양에 대한 긴 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 결정하는 단계로서, 제2 검출 항체가 각각 서열번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 단계;
    아미노산의 넘버링은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 기준으로 하는,
    방법.
  7. 제6항에 있어서, p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 결정하고, 총 타우 펩티드의 양에서 총 긴 타우 펩티드의 양을 빼서 총 짧은 타우 펩티드의 양을 결정하며, 총 짧은 타우 펩티드의 양에 대한 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양의 비를 결정하는 단계;를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 대상으로부터의 생물학적 샘플이며, 이는 대상으로부터의 혈액, 뇌 균질물(homogenate) 또는 뇌척수액(CSF)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 생물학적 샘플은 CSF인, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 생물학적 샘플은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(rpHPLC)를 사용하여 분획화된 것인, 방법.
  12. 제8항에 있어서, 대상으로부터 유래된 생물학적 샘플 내의 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나를 상응하는 기준선 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서, 대상으로부터 유래된 생물학적 샘플 내의 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 대상으로부터 유래된 생물학적 샘플 내의 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나를 상응하는 기준선 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 상기 생물학적 샘플을 항-p217+ 타우 항체가 없는 p217+ 타우 펩티드를 함유하는 제1 샘플 및 항-p217+ 타우 항체에 결합된 p217+ 타우 펩티드를 함유하는 제2 샘플로 분리하는 단계;
    (ii) 제2 샘플을 분리하여 항-p217+ 타우 항체가 없는 p217+ 타우 펩티드를 함유하는 제3 샘플을 얻는 단계;
    (iii) 제1 샘플 및 제3 샘플 각각을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 제1 및 제3 샘플 각각에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계;
    (iv) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, 제1 및 제3 샘플 각각에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 제1 및 제3 샘플 각각에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계; 중 적어도 하나를 수행하는 단계; 및
    (v) 제1 및 제3 샘플 각각에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나에 기초하여, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계;를 포함하는,
    방법.
  16. 제15항에 있어서, 제1 및 제3 샘플 각각에서 p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 제1 및 제3 샘플 각각에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나에 기초하여, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 제2 샘플이 rpHPLC에 의해 분리되는, 방법.
  19. 제12항에 있어서, 대상에서 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 방법이
    (i) 총 p217+ 타우 펩티드를 함유하는 상기 생물학적 샘플로부터 반변성(semi-denatured) 샘플을 얻고, 여기서 상기 반변성 샘플은 샘플 내의 항체를 변성시키기 위해 가열되며, 항-p217+ 타우 항체가 없는 p217+ 타우 펩티드를 함유하는 생물학적 샘플로부터 비변성 샘플을 얻는, 단계,
    (ii) 반변성 샘플과 비변성 샘플 각각을 p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드를 포획하는 단계,
    (iii) (a) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 119 내지 126을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제1 검출 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 포획된 p217+ 타우 펩티드를 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20을 포함하는 에피토프에 대해 유도된 제2 검출 항체와 접촉시켜, 각각의 샘플에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 측정하는 단계; 중 적어도 하나를 수행하는 단계, 및
    (iv) 각각의 샘플에서, p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나에 기초하여, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계;를 포함하는,
    방법.
  20. 제19항에 있어서, 제1 및 제3 샘플 각각에서 p217+ 타우 펩티드의 양에서 긴 p217+ 타우 펩티드의 양을 빼서 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 각각의 샘플에서 p217+ 타우 펩티드의 양, 긴 p217+ 타우 펩티드의 양, 짧은 p217+ 타우 펩티드의 양, 및 이들의 비 중 적어도 하나에 기초하여, 항-p217+ 타우 항체를 사용한 치료를 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 항체는 비드(bead)에 접합되고, 검출 항체는 비오틴화되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 정량화의 하한은 40 fg/ml의 p217+ 타우 펩티드이고, 상기 방법의 검출 하한은 2 fg/ml의 p217+ 타우 펩티드인, 방법.
  24. 제12항에 있어서, 대상이 타우병증을 앓고 있거나 또는 타우병증이 발병할 위험에 처해 있으며, 상기 타우병증은 가족성 알츠하이머병(familial Alzheimer's disease), 산발성 알츠하이머병, 17번 염색체와 연관된 파킨슨증을 동반하는 전측두엽 치매(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저핵 변성, 픽병(Pick's disease), 진행성 피질하 신경교증, 섬유매듭 단독 치매(tangle only dementia), 석회화를 동반하는 미만성 신경섬유매듭, 은친화성 과립성 치매(argyrophilic grain dementia), 근위축성 측삭 경화증 파킨슨증-치매 복합군, 다운 증후군(Down syndrome), 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병(Gerstmann-Strㅴussler-Scheinker disease), 할러포르텐-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeld-Jakob disease), 다계통 위축증, C형 니만-픽병(Niemann-Pick disease type C), 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유매듭을 동반하는 비-괌(non-Guamanian) 운동 신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증 및 권투선수 치매(복싱병)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 타우병증은 알츠하이머병인, 방법.
  26. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 항체는 서열번호 28의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호29의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 검출 항체는 서열번호 8의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 검출 항체는 서열번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 방법.
  29. 하기를 포함하는 키트:
    a. p217+ 타우 에피토프에 대해 유도된 포획 항체로서, 각각 서열번호 32, 33 및 34의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 35, 36 및 37의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는, 포획 항체; 및
    b. 타우 단백질의 아미노산 잔기 7 내지 20 또는 116 내지 127을 포함하는 타우 단백질 에피토프에 대해 유도되며,
    (i) 각각 서열번호 2, 3 및 4의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 5, 6 및 7의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제1 검출 항체; 또는
    (ii) 각각 서열번호 12, 13 및 14의 폴리펩티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 각각 서열번호 15, 16 및 17의 폴리펩티드 서열을 갖는 면역글로불린 경쇄 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 제2 검출 항체;를 포함하는, 적어도 하나의 검출 항체.
  30. 제29항에 있어서, 포획 항체는 서열번호 28의 폴리펩티드 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 29의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 타우 단백질의 아미노산 159 내지 163을 포함하는 타우 에피토프에 대해 인산화-비의존성 포획 항체가 유도되는, 키트.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    a. 제1 검출 항체는 서열번호 8의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    b. 제2 검출 항체는 서열번호 18의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 19의 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는,
    키트.
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