ES2270421T3 - Anticuerpos monoclonales especificos para phf-tau, hibridomas que secretan los mismos, reconocimiento de antigeno por estos anticuerpos y sus aplicaciones. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales especificos para phf-tau, hibridomas que secretan los mismos, reconocimiento de antigeno por estos anticuerpos y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE MAS PARTICULARMENTE A UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE FORMA UN COMPLEJO INMUNOLOGICO CON UN EPITOPO FOSFORILADO DE UN ANTIGENO QUE PERTENECE AL TAU ANORMALMENTE FOSFORILADO (PHF-TAU) QUE RESIDE EN LAS POSICIONES QUE SE EXTIENDEN EN LA REGION (143-254), Y CON EL ANTICUERPO MONOCLONAL CARACTERIZANDOSE POR EL HECHO DE QUE ES CAPAZ DE DETECTAR ESPECIFICAMENTE LA PROTEINA DEL TAU ANORMALMENTE FOSFORILADO (PHF-TAU) EN EL FLUIDO CEREBROESPINAL (CSF).
Description
Anticuerpos monoclonales específicos para
PHF-tau, hibridomas que secretan los mismos,
reconocimiento de antígeno por estos anticuerpos y sus
aplicaciones.
La invención se refiere a nuevos anticuerpos
monoclonales específicos para PHF-tau, a los
hibridomas que secretan estos anticuerpos monoclonales, y al patrón
de reconocimiento de antígeno de estos anticuerpos monoclonales y
sus aplicaciones. La invención se refiere también a un proceso para
diagnosticar enfermedades cerebrales que implican anticuerpos
monoclonales de la invención, más particularmente en muestras de
fluido cerebroespinal (CSF). La invención se refiere también a una
región de la molécula tau modificable in vivo por el proceso
de fosforilación, que se ha encontrado está asociado con la
enfermedad de Alzheimer o con otros tipos de demencia y que es
reconocida específicamente por los anticuerpos monoclonales de la
invención.
La enfermedad de Alzheimer (AD) es la forma más
común de demencia que comienza en la edad adulta. En la actualidad,
no se dispone de ningún ensayo bioquímico fiable para diagnóstico
ante mortem de la AD. La enfermedad se diagnostica por tanto
clínicamente sobre la base de la exclusión de otras formas de
demencia. El diagnóstico puede confirmarse neuropatológicamente por
la demostración de grandes cantidades de placas neuríticas (seniles)
y ovillos neurofibrilares (NFT) en regiones particulares del cerebro
(McKhann et al, 1984).
Los ovillos neurofibrilares consisten en
filamentos helicoidales apareados (PHFs). La evidencia
inmunocitoquímica sugiere que la proteína tau asociada a los
microtúbulos es un componente proteínico principal de PHF y NFT
(Brion et al., 1985b; Delacourte y Defossez, 1986;
Grundke-Iqbal et al., 1986; Kosik et
al., 1986; Wood et al., 1986). Una prueba definitiva de
que el dominio de fijación de tubulina de tau está fuertemente
asociado con el núcleo de los PHFs se obtuvo por secuenciación de
aminoácidos (Kondo et al., 1988). Sin embargo, se ha sugerido
que los péptidos de tau pueden representar solamente una pequeña
porción del componente principal de PHF (Wischik et al.,
1988).
La proteína tau existe en isoformas diferentes,
de las cuales 4 a 6 se encuentran en el cerebro adulto pero
únicamente la isoforma 1 se detecta en el cerebro fetal. La
diversidad de las isoformas se genera a partir de un gen simple en
el cromosoma humano 17 por corte y empalme alternativos de mRNA
(Andreadis et al., 1992). La característica más llamativa de
la proteína tau, tal como se deduce de la clonación molecular, es un
tramo de 31 ó 32 aminoácidos, que ocurre en la parte
carboxi-terminal de la molécula, y que puede
repetirse tres o cuatro veces. Una diversidad adicional es generada
por inserciones de 29 ó 58 aminoácidos de longitud en la parte
NH_{2}-terminal de las moléculas tau (Goedert
et al., 1989). Para simplificar, toda la numeración en esta
solicitud de patente se refiere a la variante de tau htau 40 que
contiene todos los exones (441 aminoácidos de longitud) de acuerdo
con Goedert et al. (1989).
En circunstancias normales, tau promueve el
ensamblaje y la estabilidad de los microtúbulos en el compartimiento
axonal de las neuronas. El dominio de fijación de microtúbulos en
tau está localizado en la región de repetición de tau
(255-381) (Lewis et al, 1990) y está modulado
por regiones adyacentes: la cola carboxiterminal
(382-414) y la región rica en prolina
(143-254) (Drubin & Kirschner, 1991). La
estabilidad y el empaquetamiento de los microtúbulos está mediada
por una cremallera corta hidrófoba en la cola carboxiterminal de tau
(Lewis et al, 1989). Tanto el ensamblaje como la estabilidad
están regulados por corte y empalme alternativos de mRNA y
fosforilación.
En circunstancias normales, el cerebro adulto
contiene 2 a 3 moles de fosfato por mol de tau (Selden y Pollard,
1983; Ksiezak-Reding et al, 1992) presentes
entre otros en la serina 404 (Poulter et al, 1993), si bien
otros resultados demuestran que la fosforilación de sitios
diferentes en tau normal sigue diferentes perfiles de desarrollo
(Lee et al, 1991; Bramblett et al, 1993; Goedert et
al, 1993a). Variantes anormales de tau de 60, 64 y 68 kDa han
sido detectadas exclusivamente en áreas cerebrales que exhiben
cambios neurofibrilares y placas seniles (Delacourte et al,
1990). El comportamiento anormal de tau en la electroforesis es
debido a fosforilación, dado que el tratamiento con fosfatasa
alcalina de estas moléculas tau cambia su masa molecular a la de tau
normal (Goedert et al., 1992; Flament et al., 1990b,
Greenberg & Davies, 1990). Actualmente han sido detectados
sitios de fosforilación anormales en PHF-tau en las
posiciones 46, 231, 235, 263 y 396 (Iqbal et al., 1989; Lee
et al., 1991; Hasegawa et al., 1992). En cuatro de
estos sitios, el residuo fosforilado va seguido por un residuo
prolina, lo que indica que una quinasa dirigida por prolina está
indicada en algunas de las fosforilaciones anormales de tau. Además
de estos sitios, están presentes 10 sitios más en htau 40, dos de
los cuales están también fosforilados anormalmente, como se indica
por su reactividad con anticuerpos (Mab tau2: Watanabe et
al., 1992; Mab AT8: Biernat et al., 1992, Goedert et
al.,
1993).
1993).
La fosforilación anormal de tau en la enfermedad
de Alzheimer es debida a un desplazamiento en el equilibrio
fosfatasa/quinasa. In vitro, varias quinasas pueden fosforilar tau:
las quinasas cdc2 (Vulliet et al, 1992; Ledesma et
al, 1992), las quinasas MAP (Drewes et al, 1992, Rodert e
Ingram, 1991), las quinasas glucógeno-sintasa
(Mandelkow et al, 1992) y TPKI y TPKII (Ishiguro et
al, 1992). Las fosfatasas están menos estudiadas en la
enfermedad de Alzheimer y hasta ahora solamente una fosfatasa era
capaz de desfosforilar in vitro los sitios fosforilados
anormalmente, a saber la proteína fosfatasa 2A_{1} (Goedert et
al, 1992).
Hasta ahora, la detección de
PHF-tau en extractos de cerebro, sea por anticuerpos
(Mab Alz50: Ghanbari et al., 1990; Mab Ab423: Harrington
et al., 1991), o por el cambio en peso molecular (Flament
et al., 1990, Delacourte et al., 1993), o incluso por
ensayo funcional (Bramblett et al., 1992) ha sido muy útil
para discriminar demencias con propiedades citoesqueléticas
alteradas de ancianos normales o pacientes con otros tipos de
demencia. Sin embargo, la detección de PHF-tau en
CSF seguía siendo imposible, incluso utilizando anticuerpos
dirigidos a uno de los sitios fosforilados anormalmente tales como
la serina 202 (Goedert et al., 1993). Esto puede adscribirse
a una o más de las razones siguientes: 1) la baja concentración de
PHF-tau en CSF, 2) el uso irregular de sitios de
fosforilación entre todos los sitios de fosforilación potenciales,
3) diferencias en la sensibilidad a las fosfatasas de estos sitios,
y, 4) una constante de afinidad demasiado baja de los anticuerpos
utilizados.
La finalidad de la presente invención es por
consiguiente proporcionar anticuerpos monoclonales que permiten la
detección fiable y sensible de tau fosforilada anormalmente presente
en fluido cerebroespinal.
La invención está orientada también a
proporcionar los hibridomas que secretan los anticuerpos
monoclonales citados anteriormente.
La invención está orientada adicionalmente a
proporcionar los epítopes de la proteína tau fosforilada
anormalmente presentes en homogeneizados de cerebro o en fluidos
corporales tales como fluido cerebroespinal, que son reconocidos por
dichos anticuerpos monoclonales.
Por último, la invención está orientada a
proporcionar un proceso para la detección o diagnóstico in
vitro de enfermedades cerebrales que implican proteínas tau
fosforiladas anormalmente.
La invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal secretado por el hibridoma depositado en la ECACC el 7
de julio de 1993 bajo el No. 93070774; y a dicho hibridoma
depositado.
La invención se refiere adicionalmente a un
proceso para el diagnóstico, in vitro, de un paciente que se
sospecha padece la enfermedad de Alzheimer, que comprende:
- (a) detectar el nivel de
PHF-tau en una muestra de CSF obtenida de dicho
paciente por fijación inmunológica de anticuerpos monoclonales
capaces de reconocer específicamente en un péptido tau fosforilado
una secuencia de aminoácidos
Pro-Lys-Thr-Pro-Pro
(SEQ ID NO 3), estando dicha Thr (181) fosforilada o anticuerpos
monoclonales secretados por el hibridoma depositado de la
reivindicación 2,
- (b) comparar el nivel obtenido en (a) con el
nivel de PHF-tau presente en muestras de CSF
obtenidas de controles, por lo cual una concentración incrementada
de tau fosforilada anormalmente en dicho paciente apunta al
diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención se refiere más
particularmente a un anticuerpo monoclonal que forma un complejo
inmunológico con un epítope fosforilado de un antígeno que
pertenece a tau fosforilada anormalmente (PHF-tau)
que reside en la región que abarca las posiciones
143-254 con la secuencia de aminoácidos
siguiente:
y caracterizándose dicho anticuerpo
monoclonal por el hecho de que el mismo es capaz de detectar
específicamente la proteína tau fosforilada anormalmente
(PHF-tau) en fluido cerebroespinal
(CSF).
Los anticuerpos monoclonales de la invención se
seleccionaron de una gama de anticuerpos monoclonales obtenidos por
inmunización directa con PHF-tau, extraída de tejido
cerebral humano derivado de pacientes de Alzheimer. Más
particularmente, los anticuerpos monoclonales de la invención se
caracterizan por el hecho de que los mismos se fijan
específicamente a tau fosforilada anormalmente que existe
naturalmente. El análisis ulterior de sus epítopes demostró que los
anticuerpos monoclonales de la invención están dirigidos a epítopes
fosforilados confinados a una región particular de la molécula tau,
a saber la región entre 143 y 254 que incluye varios sitios de
fosforilación potenciales tales como T153 y S235 utilizados por las
quinasas dirigidas a SP y TP. Los anticuerpos monoclonales de la
invención se caracterizan adicionalmente por el hecho de que
reconocen epítopes que son diferentes del epítope del anticuerpo
monoclonal AT8 como se define el Goedert et al. (1993) y
después de comparación con los anticuerpos AT8 permiten la detección
de PHF-tau en el CSF. Aquéllos reconocen
preferentemente PHF-tau en secciones de cerebro,
inmunotransferencias o en ELISA y son sorprendentemente capaces de
detectar PHF-tau en CSF, solos o en combinación con
otros anticuerpos específicos de PHF-tau.
En conclusión, los anticuerpos monoclonales de
la invención se caracterizan porque se fijan específicamente a tau
fosforilada anormalmente que existe naturalmente, cuyo estado de
fosforilación está confinado a una región particular de las
moléculas tau como se ha especificado arriba, o se fijan a tau
recombinante no fosforilada después de tratamiento con quinasas
dirigidas por prolina, que pueden provocar la fosforilación de,
entre otros, sitios Ser-Pro o
Thr-Pro en la sesión especificada. Las quinasas
dirigidas por prolina tales como quinasas MAP (Sturgill et
al., 1991), quinasas cdc2 (Labbé et al., 1991) y las
quinasas glucógeno-sintasa (Vandenheede et
al., 1980) pueden purificarse a partir de diversos tejidos o
pueden estar presentes en extractos cerebrales. La fosforilación de
tau por estas quinasas se anula o disminuye notablemente cuando una
o más de las serinas-treoninas siguientes están
mutadas a un aminoácido tal como Ala: T153, T175, T181, S199, S202,
T205, T212, T217, T231, o S235. Por consiguiente, el epítope de
estos anticuerpos puede caracterizarse por dicha tau mutante, o por
tau no fosforilada tal como tau recombinante expresada en
procariotas y sus homólogos fosforilados, o por péptidos sintéticos
que tienen la misma secuencia de aminoácidos como partes de la
región arriba especificada de la proteína tau 40 humana, siendo
dichos péptidos susceptibles de ser fosforilados por dichas quinasas
o siendo incapaces de ser fosforilados después de la síntesis de
los péptidos. Los epítopes a que se hace referencia en la presente
invención se definen por tanto como la región rica en prolina de tau
entre las posiciones 143 y 254 y que pueden estar fosforilados
anormalmente en la treonina 153 (T153), T175, T181, S199, S202,
T205, T212, T217, T231 y S235 o una combinación de estos sitios
incluida el epítope de estos anticuerpos, a los que se hace
referencia ulteriormente como "epítopes
PHF-tau".
La expresión "detección específica de proteína
tau fosforilada anormalmente" corresponde al hecho de que los
anticuerpos monoclonales de la invención detectan tau fosforilada
anormalmente en CSF sin reacción cruzada con tau normal presente en
CSF.
La expresión "formación de un complejo
inmunológico con" significa que el anticuerpo monoclonal de la
invención se fija al antígeno citado anteriormente en condiciones
como las mencionadas en una de las técnicas siguientes:
Muestras de tejido cerebral, de v.g. pacientes
de Alzheimer obtenidas por cirugía o autopsia, se fijan por
inmersión en formalina al 4% o fijador de Bouin y se incrustan en
parafina para su seccionamiento. Los anticuerpos monoclonales de la
invención se aplican en asociación con una técnica para visualizar
los complejos inmunológicos formados tales como la técnica del
complejo avidina-peroxidasa biotinilada (Hsu et
al., 1981) utilizando tetrahidrocloruro de
3,3'-diaminobencidina para desarrollo del color. Las
secciones se someten a contratinción con el tinte hematoxilina de
Harris.
Muestras de tejido cerebral obtenidas v.g. de
pacientes de Alzheimer por cirugía o autopsia se fijan en fijador
de Bouin o en formalina tamponada al 10% antes de seccionamiento sin
incrustación (Vibrátomo). El anticuerpo monoclonal de la invención
se utiliza para inmunotinción por el método indirecto de
inmuno-oro después de lo cual se fijan las
secciones, se incrustan y se seccionan para microscopía electrónica,
todo ello de acuerdo con protocolos estándar conocidos por los
expertos en la técnica (Brion et al., 1985a).
Para la inmunotransferencia, se preparan
fracciones enriquecidas en PHF-tau como ha sido
descrito (Greenberg y Davies, 1990). Típicamente, tejido
postmortem, constituido en su mayoría por materia gris de la
corteza frontal y temporal, se obtuvo de pacientes de Alzheimer
confirmados histológicamente. Esta muestra cerebral de materia gris
de Alzheimer (5-10 g) se homogeneizó con 10
volúmenes de tampón H frío (Tris 10 mM/EGTA 1 mM/NaCl 0,8 M/sacarosa
al 10%, pH 7,4) en un homogeneizador Potter S de Teflón/vidrio
(Braun, Alemania). Después de centrifugación del homogeneizado en
un rotor 60Ti MSE a 27.000 x g durante 20 min a 4ºC, se retiró el
pelet y se ajustó el sobrenadante a 1% (peso/volumen) de
N-laurosilsarcosina y 1% (volumen/volumen) de
2-mercaptoetanol y se incubó mientras se mantenía
la rotación en un mezclador (Swelab, Suecia) durante 2,5 horas a
37ºC. La mezcla sobrenadante se centrifugó a 108.000 x g durante 35
min a 20ºC. El pelet que contenía PHF-tau se lavó
cuidadosamente con PBS y se suspendió finalmente en 1 ml del mismo
tampón.
La electroforesis en
SDS-poliacrilamida se realiza en condiciones
reductoras sobre geles al 12% (Laemmli, 1970). Después de la
electroforesis, las proteínas se fijan y se tiñen con azul brillante
Coomassie, o se transfiere (Towbin et al., 1979) a hojas de
nitrocelulosa (Hybond-C, Amersham) o filtros
Immobilon (Millipore).
Después de la transferencia, los filtros se
preimpregnan en PBS que contiene 0,05% (vol/vol) de Twin 20
(Twin-PBS) y se incuban luego durante 1 h en
Twin-PBS que contiene 5% (peso/vol) de leche
desnatada y desecada y 10% (vol/vol) de suero de ternero recién
nacido (tampón de bloqueo). A continuación, los filtros se tratan
durante una noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal de acuerdo con
la invención diluido adecuadamente en tampón de bloqueo.
Los filtros se lavan luego 3 veces en
Twin-PBS y se tratan durante 1,5 h a la temperatura
ambiente con IgG anti-ratón de conejo marcado con
peroxidasa de rábano picante (Dakopatts, Dinamarca) diluida 1/3000
en tampón de bloqueo. Después de tres lavados en
Twin-PBS, se aplica complejo
estreptavidina-peroxidasa de rábano picante
biotinilada (Amersham), diluido 1/250 en tampón de bloqueo, durante
1,5 h a la temperatura ambiente. Después de ello, se lavan los
filtros tres veces en Twin-PBS y una sola vez en
PBS. Los filtros se incuban después en PBS que contiene 0,05%
(peso/vol) de diaminobencidina y 0,03% (vol/vol) de peróxido de
hidrógeno hasta que se desarrolla la tinción de fondo.
Debe aclararse que la formación de un complejo
inmunológico entre los anticuerpos monoclonales y el antígeno no
está limitada a las condiciones precisas arriba descritas, sino que
todas las técnicas que respeten las propiedades inmunoquímicas de
la fijación de anticuerpo y antígeno producirán una formación
similar de un complejo inmunológico.
La presente invención se refiere más
particularmente a un anticuerpo monoclonal como se define arriba,
caracterizado por el hecho de que forma un complejo
inmunológico:
- o bien con un epítope fosforilado localizado
dentro de la secuencia arriba definida (SEQ ID NO 1),
- o con cualquier otro péptido fosforilado capaz
de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo monoclonal,
que es capaz en sí mismo de formar un complejo con un epítope
fosforilado localizado en la región de la proteína tau humana como
se muestra en SEQ ID NO 1.
AT180 y AT270 son producidos por hibridomas
depositados en la ECACC (European Collection of Animal Cell
Cultures, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health
and Laboratory Service (PHLS), Centre for Applied Microbiology and
Research, Porton Down, GB-Salisbury, Wiltshire SP4
OJG), el 22 de diciembre de 1992, bajo el No. 92122204 o el 7 de
julio de 1993 bajo el No. 93070774.
Los anticuerpos monoclonales arriba mencionados
se obtienen por un proceso que implica obtención y aislamiento de
hibridomas que secretan estos anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales preferidos de la
invención permiten la detección de al menos 1, 5, 10 ó 20 pg/ml de
tau fosforilada como se determina en un ELISA utilizando estos
anticuerpos monoclonales en la fase de recubrimiento e incubándolos
con CSF impurificado con diferentes cantidades de tau fosforilada y
no fosforilada sin amplificación. La tau fosforilada se prepara por
incubación de tau recombinante no fosforilada con un extracto de
cerebro de rata capaz de fosforilación de los aminoácidos Ser y Thr
en las posiciones correspondientes a los sitios de fosforilación
anormal de tau (Goedert et al., 1993), como se encuentran en
extractos tau de tejido cerebral derivado de pacientes que han
fallecido a consecuencia de la enfermedad de Alzheimer.
Un proceso para obtención de los hibridomas de
la invención implica:
- partiendo de células de bazo de un animal,
v.g. ratón o rata, inmunizado previamente in vivo o de
células de bazo de dichos animales inmunizados previamente in
vitro con un antígeno que es preferiblemente tau fosforilada
anormalmente (PHF-tau), o un péptido tau humano
fosforilado o tau fosforilada anormalmente purificada por
inmunoafinidad, como se describe más adelante, reconocida por los
anticuerpos monoclonales de la invención;
- fusionar dichas células inmunizadas con
células de mieloma en condiciones de formación de hibridoma; y
- seleccionar aquellos hibridomas que secretan
los anticuerpos monoclonales que son capaces de reconocer
específicamente un epítope fosforilado de tau fosforilada
anormalmente (PHF-tau) en fluido cerebroespinal
(CSF).
El péptido tau humano fosforilado hace
referencia a un péptido que comprende en su secuencia de aminoácidos
una secuencia fosforilada comprendida en la región que abarca los
aminoácidos 143 a 254 de tau humana, caracterizándose dicho péptido
por el hecho de que puede formar un complejo inmunológico con los
anticuerpos de la invención.
El antígeno de la invención está contenido
ventajosamente en el cerebro, en el fluido cerebroespinal o en el
suero de un paciente que sufre enfermedad de Alzheimer, síndrome de
Down, enfermedad de Pick, panencefalitis esclerosante subaguda
(SSPE) u otras enfermedades neurológicas en las cuales está
implicada la proteína tau fosforilada anormalmente; este antígeno
provoca una reacción inmunológica con el anticuerpo monoclonal de la
invención.
Más particularmente, la presente invención se
refiere también a anticuerpos monoclonales como se han definido
arriba, obtenidos por un proceso tal como se define arriba,
caracterizado porque implica:
- partir de las células de bazo de un ratón
inmunizado previamente con tau fosforilada anormalmente
(PHF-tau) extraída y purificada de una muestra de
cerebro humano de un paciente que sufre la enfermedad de Alzheimer
(como se describe en la sección de ejemplos), o un péptido de tau
humana fosforilado, o tau fosforilada anormalmente purificada por
inmunoafinidad, capaz de reaccionar con los anticuerpos monoclonales
de la invención,
- fusionar dichas células inmunizadas con
células de mieloma en condiciones de formación de hibridoma,
- seleccionar aquellos hibridomas que secretan
anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente
PHF-tau y que son capaces de detectar
específicamente PHF-tau en CSF (como se ilustra en
detalle en la sección de ejemplos).
Un proceso para producir los anticuerpos
monoclonales de la invención implica:
- cultivar los hibridomas seleccionados que se
han indicado arriba en un medio de cultivo apropiado; y
- recuperar los anticuerpos monoclonales
secretados por dicho hibridoma seleccionado; o alternativamente
- implantar el hibridoma seleccionado en el
peritoneo de un ratón y, cuando se ha producido ascitis en el
animal;
- recuperar los anticuerpos monoclonales
formados entonces a partir de dicha ascitis.
Los anticuerpos monoclonales de la invención
pueden prepararse por técnicas convencionales in vitro tales
como el cultivo de células inmovilizadas utilizando v.g. fibras
huecas o microcápsulas o tales como el cultivo de células en
suspensión homogénea utilizando v.g. reactores con emulsor de aire
comprimido o biorreactores agitados.
La invención se refiere también a un péptido
capaz de formar un complejo inmunológico con cualquiera de los
anticuerpos monoclonales de la invención, encontrándose dicho
péptido en la forma fosforilada, y,
- comprendiendo o estando constituida la
secuencia de dicho péptido por partes fosforiladas de la secuencia
como se muestra en SEQ ID NO 1, o,
- comprendiendo o estando constituida la
secuencia de dicho péptido por la secuencia de cualquier péptido
que es capaz de formar un complejo inmunológico con uno cualquiera
de los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención.
Dichos péptidos fosforilados tienen
preferiblemente una longitud de 6 a 100 aminoácidos. Los péptidos de
acuerdo con esta realización de la invención pueden prepararse por
síntesis química clásica. La síntesis puede realizarse en solución
homogénea o en fase sólida de acuerdo con cualquiera de los métodos
bien conocidos en la técnica.
Los péptidos fosforilados se preparan de acuerdo
con cualquier método conocido en la técnica, (p.ej. de Bont et
al., 1990a; de Bont et al., 1990b; Perich, 1991; Orvos
et al., 1989).
La presente invención se refiere a un péptido
fosforilado como se define arriba constituido por o que comprende
en su secuencia de aminoácidos la secuencia siguiente:
Val-Arg-Thr-Pro-Pro
(aminoácidos 229-233; numeración de tau 40 humana,
SEQ ID NO 2), estando dicha Thr (231) fosforilada y
caracterizándose dicho péptido porque es capaz de formar un complejo
inmunológico con el anticuerpo monoclonal AT180 producido por el
hibridoma depositado en la ECACC en 22 de diciembre de 1992 bajo No.
92122204.
De acuerdo con una realización preferida, la
presente invención se refiere a un péptido fosforilado como se
define arriba constituido por o que comprende en su secuencia de
aminoácidos la secuencia siguiente:
Pro-Lys-Thr-Pro-Pro
(aminoácidos 179-183; numeración de tau 40 humana;
SEQ ID NO 3), estando dicha Thr(181) fosforilada y
caracterizándose dicho péptido porque es capaz de formar un complejo
inmunológico con el anticuerpo monoclonal AT270 producido por el
hibridoma depositado en la ECACC en 7 de julio de 1993 bajo No.
93070774.
La presente invención se refiere también a un
péptido fosforilado como se define arriba, que es capaz de generar
un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 después de inmunización.
Los péptidos utilizados para inmunización se
encuentran preferentemente en la forma en que los mismos están
unidos a una molécula portadora a fin de alcanzar una respuesta
inmunógena satisfactoria. Tales moléculas portadoras son bien
conocidas en la técnica y se acoplan al péptido por grupos
enlazadores, que forman parte también de la técnica.
La invención se refiere también a un proceso
para la detección o diagnóstico post-mortem
in vitro de una enfermedad cerebral/neurológica que implica
PHF-tau, tal como la enfermedad de Alzheimer, que
comprende al menos los pasos siguientes:
- poner en contacto un anticuerpo monoclonal de
la invención con una preparación de NFT o un homogeneizado de
cerebro extraído con detergente aislado de un paciente que había
sufrido la enfermedad de Alzheimer o cualquier otra enfermedad que
implique proteína tau fosforilada anormalmente
(PHF-tau) en condiciones adecuadas para producir un
complejo antígeno-anticuerpo;
- detectar la fijación inmunológica de dicho
anticuerpo a dicho homogeneizado de cerebro, y separar si es
posible dicho complejo y recuperar el antígeno buscado en forma
purificada.
La recuperación del antígeno buscado puede
hacerse lavando primeramente el complejo
antígeno-anticuerpo inmovilizado formado
entonces;
- tratar este complejo con una solución (v.g.
tiocianato de potasio 3 M, cloruro de magnesio 2,5 M, citrato-ácido
cítrico 0,2 M, pH 3,5 o ácido acético 0,1 M) capaz de producir la
disociación del complejo antígeno-anticuerpo;
y
y
- recuperar el antígeno en forma purificada.
La invención se refiere también a un proceso
para la detección o diagnóstico in vitro de una enfermedad
cerebral/neurológica que implica la proteína tau fosforilada
anormalmente, tal como en la enfermedad de Alzheimer, que
incluye:
- poner una muestra de CSF, más preferiblemente
CSF no concentrado, o una muestra de suero de un paciente que se
sospecha padece una enfermedad cerebral que implica
PHF-tau, más particularmente enfermedad de
Alzheimer, o proteínas o polipéptidos como resultado de un
procedimiento de extracción a partir de tejidos cerebrales, fluido
cerebroespinal o suero conocido por los expertos en la técnica
(Iqbal et al., 1984; Greenberg & Davies, 1990) en
contacto en condiciones in vitro con un anticuerpo monoclonal
de la invención, siendo dichas condiciones adecuadas para producir
un complejo antígeno-anticuerpo; y
- detectar la fijación inmunológica de dicho
anticuerpo a dicha muestra de extracto cerebral, fluido cerebro
espinal o suero, o proteínas o polipéptidos.
Ventajosamente, los anticuerpos monoclonales de
la invención se encuentran en un estado inmovilizado sobre un
soporte adecuado, tal como una resina. Alternativamente, el presente
proceso puede ponerse en práctica utilizando cualquier otro formato
de inmunoensayo conocido por las personas expertas en la
técnica.
El proceso para la detección del antígeno puede
llevarse a cabo luego por ejemplo como sigue:
- reunir dicho complejo
antígeno-anticuerpo formado por el antígeno y los
anticuerpos de la invención con:
- un segundo anticuerpo
- *
- que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o un epítope de cualquier péptido tau fosforilado que lleva un epítope, siendo dichos epítopes diferentes del de la invención, o
- *
- que puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, estando dicho anticuerpo policlonal preferentemente purificado por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;
- un marcador para marcación específica o
acoplamiento con dicho segundo anticuerpo, siendo dicho marcador
cualquier marcador posible conocido por las personas expertas en la
técnica;
- soluciones tampón apropiadas para realizar la
reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la
invención y una muestra del ensayo por una parte, y el segundo
anticuerpo fijado y el marcador por otra parte.
La detección del anticuerpo monoclonal fijado
inmunológicamente puede realizarse por tecnología convencional
conocida en la técnica. Ventajosamente, el segundo anticuerpo lleva
en sí mismo un marcador o un grupo para acoplamiento directo o
indirecto con un marcador.
Los anticuerpos monoclonales de la invención
permiten también el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (AD)
y de cualquier enfermedad que implique la formación de tau
fosforilada anormalmente en la región 143 a 254 sobre la base de
CSF (es decir, detectar formas modificadas de tau en CSF). El
problema asociado con ello es que este antígeno está presente en
una cantidad muy baja en CSF, por lo que el ensayo de detección
tiene que ser muy sensible. Este problema de sensibilidad puede
resolverse adicionalmente por (i) utilización de una combinación de
los anticuerpos monoclonales de la invención, o (ii) una combinación
de un anticuerpo monoclonal de la invención con cualesquiera otros
anticuerpos monoclonales de tau fosforilados normal y/o anormalmente
conocidos en la técnica, y/o (iii) por utilización de un anticuerpo
monoclonal o una combinación de anticuerpos monoclonales de la
invención en combinación con una técnica de amplificación tal como
la técnica de amplificación por deposición de informadores
catalizada (CARD, Bobrow et al., 1989), que permite un ELISA
específico de PHF-tau con mayor sensibilidad.
Los resultados obtenidos con los anticuerpos
monoclonales de la invención indican que se encuentran niveles
elevados de PHF-tau en AD, pero pueden existir
también en otras enfermedades neurológicas en las cuales ocurre una
fosforilación anormal de tau en la región de tau comprendida por los
aminoácidos 143 a 254.
De acuerdo con otra realización, la presente
invención se refiere a un kit para el diagnóstico in vitro de
una de las enfermedades siguiente: enfermedad de Alzheimer,
síndrome de Down, enfermedad de Pick y otros trastornos neurológicos
en los cuales están implicados la proteína tau fosforilada
anormalmente o filamentos helicoidales apareados, caracterizado
porque el kit comprende:
- al menos un anticuerpo monoclonal de la
invención depositado sobre una microplaca;
- una preparación que contiene la muestra (CSF,
suero o las proteínas extraídas del mismo) que debe someterse a
diagnóstico in vitro,
- un segundo anticuerpo
- *
- que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o un epítope de cualquier péptido de tau fosforilado que lleva un epítope, siendo dichos epítopes diferentes del de la invención, o
- *
- que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, estando dicho anticuerpo policlonal purificado preferiblemente por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;
- un marcador para marcación específica o
acoplamiento con dicho segundo anticuerpo;
- soluciones tampón apropiadas para realización
de la reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la
invención y una muestra de ensayo por una parte, y el segundo
anticuerpo fijado y el marcador por otra parte,
- posiblemente un péptido que lleva un epítope
de PHF-tau comprendido en la región que abarca los
aminoácidos 143 a 254 para propósitos estándar, o para propósitos
de competición con respecto al antígeno que se busca.
Una realización preferida de la presente
invención para la detección o diagnóstico in vitro de una
enfermedad cerebral/neurológica que implica proteína tau
fosforilada anormalmente, tal como la enfermedad de Alzheimer, se
refiere a un método o un kit como se ha definido arriba, que
comprende una mezcla (combinación) de anticuerpos monoclonales
utilizados en la invención, o una combinación de al menos un
anticuerpo monoclonal utilizado en la invención con otros
anticuerpos capaces de reconocer específicamente una región de
PHF-tau que reside en la región que abarca las
posiciones 143-254 de tau 40 humana (SEQ ID NO 1),
seleccionándose preferiblemente dichos anticuerpos monoclonales
de:
- *
- (1) el anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC en 22 de diciembre de 1992 bajo No. 92122204;
- *
- (2) el anticuerpo monoclonal AT270 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 7 de julio de 1993 bajo No. 93070774;
- *
- (3) el anticuerpo monoclonal AT8 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 8 de octubre de 1991 bajo No. 91100806;
y seleccionándose preferiblemente dicha mezcla
de la lista siguiente:
- *
- una mezcla de anticuerpos monoclonales que comprende los anticuerpos monoclonales (1) y (2),
- *
- una mezcla de los anticuerpos monoclonales que comprende los anticuerpos monoclonales (2) y (3),
- *
- una mezcla de los anticuerpos monoclonales que comprende los anticuerpos monoclonales (1), (2) y (3);
caracterizándose adicionalmente dicho método o
kit por contener o utilizar:
- una preparación que contiene la muestra a
diagnosticar in vitro;
- un segundo anticuerpo
- *
- que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o un epítope de cualquier péptido tau fosforilado que lleva un epítope, siendo dichos epítopes diferentes del de la invención, o
- *
- que puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, estando dicho anticuerpo policlonal purificado preferiblemente por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;
- un marcador para marcación específica o
acoplamiento con dicho segundo anticuerpo;
- soluciones tampón apropiadas para
realización de la reacción inmunológica entre el anticuerpo
monoclonal de la invención y una muestra de ensayo por una parte, y
el segundo anticuerpo fijado y el marcador por otra parte,
- posiblemente un péptido que lleva un epítope
de PHF-tau para propósitos estándar, o para
propósitos de competición con respecto al antígeno que se busca.
De acuerdo con otra realización preferida
adicional, la presente invención se refiere a un método o kit para
detección o diagnóstico in vitro de una enfermedad
cerebral/neurológica que implica proteína tau fosforilada
anormalmente, tal como la enfermedad de Alzheimer, que implica un
formato de detección ELISA en sándwich es que comprende anticuerpos
de recubrimiento y detección, estando constituidos dichos
anticuerpos de recubrimiento por al menos un anticuerpo monoclonal
utilizado en la invención, y estando constituidos dichos anticuerpos
de detección por al menos un anticuerpo monoclonal capaz de
detectar tau humana normal y/o fosforilada anormalmente, cuyo
epítope es diferente de cualquiera de los epítopes de los
anticuerpos monoclonales de la invención. Dicho formato ELISA en
sándwich preferido se ilustra extensamente en la sección de ejemplos
de la presente inven-
ción.
ción.
Tabla
1
Detección de PHF-tau y tau
normal utilizando los anticuerpos monoclonales específicos de
PHF-tau AT180 y AT270. Microplacas recubiertas con
cantidades saturantes de un anticuerpo monoclonal que reconoce
específicamente PHF-tau se incubaron con CSF
impurificado con cantidades diferentes de tau no fosforilada o
fosforilada, preparada la última por incubación de tau recombinante
no fosforilada con un extracto de cerebro de rata capaz de
fosforilar los aminoácidos Ser y Thr en posiciones correspondientes
a los sitios de fosforilación anormal de tau (Goedert et
al., 1993). El antígeno fijado se detectó como se describe en la
sección de ejemplos.
Tabla
2
Muestras de CSF de paciente de AD, pacientes de
control y pacientes que padecían diversos trastornos neurológicos
distintos de AD se ensayaron en ELISA utilizando combinaciones
diferentes de anticuerpos de captura como se describe (Ejemplo
III). Todos los análisis se expresan como unidades mOD excepto para
la determinación de tau total que se realizó utilizando la htau
Innotest (Innogenetics, Bélgica) y que se expresan en pg/ml de
CSF.
Las diferentes condiciones experimentales
utilizadas para cada disposición permiten únicamente comparación
entre pistas.
Tabla
3
Muestras de CSF de pacientes de control,
pacientes de AD y pacientes que sufrían diversos trastornos
neurológicos distintos de AD (OND) se ensayaron utilizando la htau
Innotest (Innogenetics, Bélgica). De los grupos de pacientes AD y
pacientes OND se seleccionaron aquéllos que tenían valores de tau
total altos para ensayo ulterior utilizando el ELISA específico de
PHF-tau en el cual se utilizaron AT8, AT180 y AT270
como anticuerpos de captura y AT120 y HT7 como anticuerpos de
detección como se describe (Ejemplo IV). Los resultados se expresan
en pg/ml de tau en CSF para tau total (htau Innotest) y como
unidades mOD para el ELISA específico de
PHF-tau.
\newpage
Figura
1
Detección de PHF-tau y tau
normal utilizando el anticuerpo monoclonal AT180. Microplacas
recubiertas con cantidades saturantes del anticuerpo monoclonal
AT180 que reconoce específicamente PHF-tau se
incubaron con CSF impurificado con diferentes cantidades de tau no
fosforilada o fosforilada, preparada la última por incubación de tau
recombinante no fosforilada con un extracto de cerebro de rata
capaz de fosforilar los aminoácidos Ser y Thr en las posiciones
correspondientes a los sitios de fosforilación anormal de tau
(Goedert et al., 1993). El antígeno fijado se detectó como se
describe en la sección de ejemplos.
Figura
2
Detección de PHF-tau y tau
normal utilizando el anticuerpo monoclonal AT270. Microplacas
recubiertas con cantidades saturantes del anticuerpo monoclonal
AT270 que reconoce específicamente PHF-tau se
incubaron con CSF impurificado con diferentes cantidades de tau no
fosforilada o fosforilada, preparada la última por incubación de tau
no fosforilada recombinante con un extracto de cerebro de rata
capaz de fosforilar los aminoácidos Ser y Thr en las posiciones
correspondientes a los sitios de fosforilación anormal de tau
(Goedert et al., 1993). El antígeno fijado se detectó como se
describe en la sección de ejemplos.
Figura
3
Fosforilación de tau de tipo salvaje y mutada
recombinante (expresada por el clon humano tau24; Goedert y Jakes,
1990) con la actividad de proteína-quinasa de
cerebro de rata. Inmunotransferencias con antisuero 134
anti-tau y anticuerpos monoclonales AT8 y AT180.
Pistas 1, tau 24; 2, tau 24 más extracto de cerebro; 3, tau 24 T231
A; 4, tau 24 T231 A más extracto de cerebro; 5, tau 24 S235 A; 6,
tau 24 S235 A más extracto de cerebro.
Figura
4
Fosforilación de tau de tipo salvaje y
recombinante mutada (expresada por el clon de tau 24 humana) con la
actividad de proteína-quinasa de cerebro de rata.
Inmunotransferencias con antisuero 134 anti-tau y
anticuerpos monoclonales AT8 y AT270. Pistas 1, tau 24; 2, tau24 más
extracto de cerebro; 3, tau 24 T175 A; 4, tau 24 T175 A más extracto
de cerebro; 5, tau 24 T181 A; 6, tau 24 T181 A más extracto de
cerebro.
Se purificó parcialmente PHF-tau
por una modificación del método de Greenberg y Davis (1990). El
tejido postmortem, constituido en su mayoría por materia
gris de la corteza frontal y temporal, se obtuvo de pacientes de
Alzheimer confirmados histológicamente. Esta muestra de cerebro de
materia gris de Alzheimer (5-10 g) se homogeneizó
con 10 volúmenes de tampón H frío (Tris 10 mM/EGTA 1 mM/NaCl 0,8
M/10% sacarosa, pH 7,4) en un homogeneizador Potter S de
Teflón/vidrio (Braun, Alemania). Después de centrifugación del
homogeneizado en un rotor 60 Ti MSE a 27.000 x g durante 20 min a
4ºC, se retiró el pelet y se ajustó el sobrenadante a 1%
(peso/volumen) de N-laurosilsarcosina y 1% (vol/vol)
de 2-mercaptoetanol y se incubó mientras se mantenía
en rotación en un mezclador (Swelab, Suecia) durante 2,5 horas a
37ºC. La mezcla sobrenadante se centrifugó a 108.000 x g durante 35
min a 20ºC. El pelet que contenía PHF-tau se lavó
cuidadosamente con PBS y se suspendió finalmente en 1 ml del mismo
tampón.
La preparación de antígeno se evaluó por
electroforesis en gel de 10% dodecilsulfato de
sodio-poliacrilamida, seguida por transferencia
Western utilizando antisuero de tau normal
anti-humana policlonal de conejo (Mercken et
al., 1992a).
Se cebaron subcutáneamente ratones Balb/c con
100 \mug de preparación de PHF-tau en adyuvante de
Freund completo y se reforzaron intraperitonealmente 3 veces después
de ello a intervalos de 3 semanas con 100 \mug del mismo antígeno
en adyuvante de Freund incompleto. Los días 3 y 2 antes de la
fusión, los ratones se reforzaron con 100 \mug de
PHF-tau en solución salina.
Se fusionaron células de bazo de ratón con
células de mieloma SP2/0, utilizando un procedimiento de Köhler y
Milstein (1975) modificado con PEG4000.
Las células del experimento de fusión se
suspendieron a una densidad de 4,5 x 10^{4} células de
bazo/pocillo en placas de 96 pocillos sembradas previamente con
células macrófagos peritoneales de ratón como capa de alimentación.
Estos pocillos se escrutaron después de 12 días de crecimiento
continuo respecto a producción de anticuerpo
anti-PHF-tau por medio de un ELISA
sándwich como se detalla más adelante.
El crecimiento de hibridoma se realizó en medio
de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 20% de
suero de ternero fetal, piruvato de sodio (1 mM),
L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml),
estreptomicina (100 mg/ml), y aminoácidos no esenciales. Todos los
productos se adquirieron de Gibco (Paisley, U.K.). Las células se
incubaron en un incubador de aire con CO_{2} humidificado.
El ELISA de escrutinio utilizado para la
detección de los anticuerpos monoclonales
anti-PHF-tau era un sistema ELISA
sándwich con anticuerpos de anti-tau humana
policlonales de conejo purificados por afinidad (Mercken et
al., 1992a) en la fase de recubrimiento. A este fin, se utilizó
tau normal humana purificada, preparada como se describe en Mercken
et al. (1992a) para la preparación de una columna de
inmuno-afinidad utilizando inmovilización covalente
sobre Sepharosa activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia, LKB
Suecia). La fracción anti-tau fijada por afinidad se
eluyó de esta columna con una solución tamponada de ácido cítrico
0,1 M a pH 2,5. Después de la neutralización, las fracciones que
contenían anti-tau se agruparon y se aplicaron en
forma de capa durante una noche (1 \mug/ml) a 4ºC sobre placas de
microtitulación de alta fijación (Nunc, Gibco, Paisley, UK) en
tampón de recubrimiento (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, NaN_{3} 10 mM, pH
8,5). Después de aplicación de sobrecapa durante 30 min con 125
\mul de caseína saturada al 10% en PBS para reducir la fijación
inespecífica, las placas se incubaron con 100 \mul de una
preparación de PHF-tau diluida adecuadamente y se
incubaron durante 60 min a 37ºC. Las placas se lavaron tres veces
con PBS-0,05% de Twin 20 (vol/vol); se añadieron 100
\mul de sobrenadante de hibridoma y se continuó la incubación
durante 1 h a 37ºC. Después del lavado, los anticuerpos monoclonales
fijados se detectaron con suero anti-ratón de conejo
conjugado con peroxidasa (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca). Todos
los reactivos se diluyeron en PBS con 10% de caseína. Después del
lavado final, se añadieron como sustrato de peroxidasa 100 \mul de
3,5,3',5'-tetrametilbencidina 0,42 mM, 0,003% de
H_{2}O_{2} vol/vol en ácido cítrico 100 mM, hidrogenofosfato
disódico 100 mM, pH 4,3. La reacción se paró con 50 \mul de una
solución 2 M de H_{2}SO_{4}. La absorbancia se leyó en un
Multiscan Titertek (Flow Laboratories, Eflab, Oy, Finlandia) a 450
nM.
A partir de dicho experimento de fusión,
utilizando el procedimiento de escrutinio que se describe en la
sección 3 anterior, se recuperaron 28 cultivos positivos (es decir
cultivos que secretaban anticuerpos monoclonales
anti-PHF-tau) de un total de 1440
cultivos. Estos cultivos positivos se designaron arbitrariamente AT1
a AT28 (algunos de estos cultivos de hibridoma, a saber, AT1 a AT14
han sido descritos por Mercken et al., 1992b). Como en esta
ronda de escrutinio inicial, se encontró que los cultivos positivos
estaban compuestos en la mayoría de los casos de clones mixtos como
se observaba por inspección visual de los pocillos (usualmente
entre 1 y 4 clones por pocillo). Todos los cultivos de hibridoma se
subclonaron ulteriormente por dilución limitante, un método bien
conocido por los expertos en la técnica, dando finalmente como
resultado clones de hibridoma puros que secretaban anticuerpos con
un idiotipo homogéneo. Algunos de estos clones de hibridoma puros
se ensayaron ulteriormente con respecto a sus patrones de
reactividad sobre tau normal y PHF-tau en ELISA
como se describe en el Ejemplo II y la localización de sus epítopes
por medio de análisis por transferencia Western utilizando mutantes
de tau como se describe en el Ejemplo II.
El último procedimiento se llevó a cabo como
sigue: Se aplicaron tau humana normal purificada y
PHF-tau a geles de
SDS-poliacrilamida al 10% y se corrieron en
condiciones desnaturalizantes de acuerdo con Laemmli (1970).
Después de la SDS-PAGE, la
transferencia a nitrocelulosa (Hybond-C, Amersham,
Bruselas, Bélgica) se llevó a cabo en NaHCO_{3} 10 mM,
Na_{2}CO_{3} 3 mM, pH 9,9 durante 120 min a 55 V con
enfriamiento. Después de la transferencia, se equilibró la
nitrocelulosa a solución salina tamponada con fosfato (PBS), y los
sitios de fijación de proteína se bloquearon con tampón de
transferencia (PBS complementado con 5% p/v de leche desnatada
desecada y 10% v/v de suero de ternero recién nacido). Las proteínas
transferidas se incubaron durante una noche a 4ºC con el anticuerpo
del hibridoma respectivo. Después de 3 lavados con
PBS-0,05% Tween 20 (v/v), se utilizaron
inmunoglobulinas anti-ratón de conejo marcadas con
peroxidasa de rábano picante (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca) a una
dilución de 1/3000 y se incubaron durante 90 min a la temperatura
ambiente. Todos los antisueros se diluyeron en tampón de
transferencia. Las transferencias se lavaron luego tres veces en
PBS/Tween y se revelaron con solución sustrato (PBS, 0,05% p/v de
3,3'-diaminobencidina, 0,03% v/v de H_{2}O_{2})
después de lo cual se paró la reacción en H_{2}O.
Como resultado de estos análisis, se encontró
que 8 hibridomas de un total de 28 (que incluían AT180 y AT270)
eran realmente específicos de PHF-tau. Estos
anticuerpos monoclonales específicos de PHF-tau se
ensayaron finalmente respecto a su capacidad de detección de
PHF-tau en fluido cerebroespinal utilizando un ELISA
(como se ilustra en el Ejemplo IV). Como se ilustra en los ejemplos
ulteriores, pudieron encontrarse dos anticuerpos monoclonales, a
los que se hace referencia como AT270 y AT180, que permitían la
detección específica de al menos 10 pg/ml de tau fosforilada como
se determina en CSF impurificado con cantidades diferentes de tau
fosforilada y no fosforilada sin aplicar técnicas de amplificación
(la tau fosforilada se preparó por incubación de tau no fosforilada
recombinante con un extracto de cerebro de rata capaz de fosforilar
los aminoácidos Ser y Thr en posiciones correspondientes a los
sitios de fosforilación anormales de tau como se describe en Goedert
et al., 1993). Además, el anticuerpo monoclonal AT270 era
capaz de detectar PHF-tau en CSF no concentrado
(véase más adelante). Un ensayo basado en el uso de AT180 permitió
detectar PHF-tau en CSF concentrado 5 veces,
mientras que AT8 no era capaz de detectar PHF-tau en
CSF concentrado 10 veces. Basándose en estos criterios, se
seleccionaron los hibridomas AT180 y AT270 para caracterización
ulterior de sus epítopes y se depositaron en la ECACC bajo los
números 92122104 y 93070774.
La clase y subclase de anticuerpos se determinó
por Inno-LIA (Innogenetics, Gante, Bélgica). Los
anticuerpos AT180 y AT270 parecían ser de los subtipos IgG1,
kappa.
La preparación de tau normal purificada por
afinidad se describe en Mercken et al. (1992b) y para
PHF-tau es esencialmente como se describe en
Greenberg y Davies (1990); Mercken et al. (1992a). La pureza
de los patrones de tau normal y PHF-tau se
determinó por SDS-PAGE. Las muestras se analizaron
también en el analizador de aminoácidos 420 A/H (Applied Biosystems
B.V., Maarssen, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Tanto tau normal como PHF-tau exhibían
las composiciones de aminoácidos esperadas. La concentración exacta
de proteínas tanto de tau normal purificada por afinidad como de
PHF-tau se determinó utilizando un péptido estándar
interno.
Los anticuerpos monoclonales de
PHF-tau derivados de los hibridomas AT180 o AT270 y
purificados de medio acondicionado exento de suero por
cromatografía en columna Protein G, se aplicaron como recubrimiento
durante una noche a 4ºC sobre placas de microtitulación de alta
fijación (Nunc, Gibco, Paisley, UK) en tampón de recubrimiento a 3
\mug/ml (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, NaN_{3} 10 mM, pH 8,5). Después
de aplicación de sobrecapa durante 30 min con 150 \mul de caseína
saturada al 10% en PBS para reducir la fijación inespecífica, se
incubaron las placas con 100 \mul de patrones de tau o
PHF-tau adecuadamente diluidos y se incubaron
durante 60 min a 37ºC. Las placas se lavaron 5 veces con
PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v), se añadieron 100 \mul
de dos anticuerpos biotinilados (AT120 y HT7, Vandermeeren et
al., 1993; Mercken, tesis Ph. D.) a una concentración final de
0,2 \mug/ml, y se incubaron durante 1 hora a la temperatura
ambiente. Después del lavado, se añadió estreptavidina conjugada con
peroxidasa de rábano picante (Jackson, Innogenetics, Bélgica) a una
dilución de 1/10000 durante 30 min a la temperatura ambiente.
Después de un lavado final con PBS/Tween 20, se añadieron 100 \mul
de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina 0,42 mM, 0,003%
(vol/vol) de H_{2}O_{2} en ácido cítrico 100 mM,
Na_{2}HPO_{4} 100 mM, pH 4,3 como sustrato de peroxidasa
durante 30 min a la temperatura ambiente. La reacción se paró con 50
\mul de una solución 2M de H_{2}SO_{4}. La absorbancia se leyó
en un Multiscan Titertek (Flow Laboratories, Eflab Oy, Finlandia) a
450 nm.
Se muestra la especificidad de AT180 y AT270
para PHF-tau (Tabla 1, Figuras 1 y 2), a partir de
la cual puede verse que incluso a 1 \mug de tau normal no está
presente reactividad alguna.
Un clon de cDNA de longitud total (tau 24
humana; htau24) correspondiente a una isoforma de 4 repeticiones de
tau y con un sitio NdeI en el contexto del codón iniciador (Goedert
y Jakes, 1990) se subclonó en el sitio EcoRI de M13mp18. Se utilizó
mutagénesis orientada para cambiar los codones representativos de
los aminoácidos siguientes a una Ala: T153, T175, T181, T199, T205,
T212, T217, T231, S235, al que se hace referencia ulteriormente
como T153A, etc., mutantes. Se evaluaron también constructos que
contenían combinaciones de estos sitios. Después de escisión con
NdeI y EcoRI los fragmentos resultantes se subclonaron aguas abajo
del promotor de RNA-polimerasa T7 en el plásmido de
expresión pRK172 (Mc Leod et al., 1987) y los plásmidos
recombinantes se transformaron en células E. coli
BL21(DE3) (Studier et al., 1990). Los cultivos
bacterianos se dejaron crecer, se indujeron y las proteínas tau se
purificaron como ha sido descrito (Goedert y Jakes, 1990).
La actividad de la
proteína-quinasa cerebral se preparó por
homogeneización de cerebro de rata adulta (1 g, 2,5 ml) en ácido
okadaico 10 mM, PMSF 1 mM, 20 \mug/ml de leupeptina, 20 \mug/ml
de aprotinina y 20 \mug/ml de pepstatina y se centrifugó a 40.000
rpm durante 1 h a 4ºC. El sobrenadante se utilizó directamente para
fosforilación (Goedert et al., 1993). Las incubaciones (0,05
ml) se llevaron a cabo a 37ºC y comprendían HEPES 40 mM, pH 7,2,
ATP 2 mM, MgCl_{2} 2 mM, proteína tau (1 \muM), extracto de
cerebro de rata (1 \mul), EGTA 5 mM, DTT 2 mM, ácido okadaico 1
\muM, PMSF 1 mM, 20 \mug/ml de aprotinina y 20 \mug/ml de
pepstatina. Las reacciones se iniciaron por adición del extracto de
cerebro, se incubaron durante 24 h y se utilizaron partes alícuotas
para la SDS-PAGE. Los controles se incubaron en las
mismas condiciones, excepto que se omitió el extracto de
cerebro.
El clon de htau 24 normal o mutantes htau24 se
fosforilaron por un extracto de cerebro de rata que contenía
proteína-quinasa (Goedert et al., 1993), se
corrieron en SDS-PAGE y se sometieron a
inmunotransferencia utilizando AT180, AT270 o un antisuero de tau,
134, que es independiente de la fosforilación (Goedert et
al., 1989). AT270 y AT180 no tenían las proteínas tau de tipo
salvaje o mutantes antes de la fosforilación del extracto de
cerebro. En cambio, después de una incubación de 24 h con extracto
de cerebro, AT270 reconocía la tau de tipo salvaje, pero no tau
T181A (Fig. 3). Esto establece que la tinción por AT270 requiere
como mínimo que T181 esté fosforilada. El anticuerpo monoclonal
AT180 reconocía igualmente la tau de tipo salvaje fosforilada pera
fallaba en el reconocimiento del mutante T231A fosforilado, lo que
indicaba que el epítope AT180 requiere fosforilación de T231 para
reconocimiento (Fig. 4). La tinción bastante débil en el mutante
S235A es debida al hecho de que algunos factores en el extracto de
cerebro son limitantes en este tipo de ensayo y por consiguiente el
sitio S235 no se convertía siempre por completo a su estado
fosforilado, como se confirmó por utilización de
proteína-quinasas recombinantes activadas como
agentes de fosforilación (datos no presentados). Cuando se trató tau
recombinante con la quinasa MAP recombinante activada sola o la
quinasa GSK3 sola, no pudo producirse el epítope AT180, mientras que
el mismo experimento realizado con una mezcla de quinasa MAP y
quinasa GSK3 permitía la fosforilación e inmunorreactividad
correctas con AT180.
Se ha demostrado previamente que un ensayo para
detectar tau fosforilada anormalmente basado en el uso exclusivo
del anticuerpo AT8 como detector no es capaz de detectar el epítope
de AT8 en CSF sin concentrar ni en CSF concentrado (Vandermeeren
et al., 1993). Los experimentos de continuación con AT180 y
AT270 demuestran que el epítope de AT270 presente en tau
fosforilada anormalmente puede detectarse en la mayoría de las
muestras no concentradas de CSF de Alzheimer, mientras que el
epítope AT180 detecta sólo tau fosforilada anormalmente en aquellas
muestras de CSF que contienen niveles altos de tau total y por
consiguiente no detecta PHF-tau en todas las
muestras de CSF de Alzheimer. Los autores de la invención utilizaron
subsiguientemente AT270 solo o en diferentes combinaciones con
otros anticuerpos (AT8, AT180). Se utilizaron combinaciones de
anticuerpos como anticuerpos de recubrimiento fijados en fase
sólida para examinar respecto a la presencia de
PHF-tau en CSF de pacientes que padecían diferentes
trastornos neurológicos en los cuales se ha descrito tau fosforilada
anormalmente, tal como la enfermedad de Pick, la enfermedad de
Creutzfeld-Jacob, y la enfermedad de Parkinson
(véase la Tabla 2).
Un ensayo específico de PHF-tau
preferido puede ser como sigue: aplicación como recubrimiento de los
3 anticuerpos monoclonales, AT8, AT180, y AT270 a una concentración
final de 5 \mug/ml en Tris 10 mM de pH 8,6, NaCl 10 mM, NaAz 10 mM
durante una noche a 4ºC sobre placas de microtitulación de alta
fijación (Nunc, GIBCO, Paisley, U.K.). Después de aplicación de
sobrecapa durante 1 h con 150 \mul de caseína saturada al 10% en
solución salina tamponada con fosfato (PBS) para reducir la fijación
inespecífica, se incubaron las placas con 100 \mul de un estándar
de tau recombinante fosforilada diluido adecuadamente, o con
muestras de CSF sin concentrar, complementadas con 5% de Tween 20,
durante una noche a la temperatura ambiente. Las placas se lavaron 5
veces con PBS/0,05% de Tween 20 (vol/vol), se añadieron 100 \mul
de dos anticuerpos biotinilados (AT120 y HT7; Vandermeeren et
al., 1993; Mercken, Tesis Ph. D.) a una concentración final de
0,2 \mug/ml y se incubaron durante 1 h a la temperatura ambiente.
Después del lavado, se añadió estreptavidina conjugada con
peroxidasa de rábano picante (Jackson, Innogenetics, Bélgica) a una
dilución de 1/10000 durante 30 min a la temperatura ambiente.
Después de un lavado final con PBS/Tween 20, se añadieron 100 \mul
de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina 0,42 mM, 0,003%
(vol/vol) de H_{2}O_{2} en ácido cítrico 100 mM,
Na_{2}HPO_{4} 100 mM, pH 4,3 como sustrato de peroxidasa durante
30 min a la temperatura ambiente. La reacción se paró con 50 \mul
de una solución 2M de H_{2}SO_{4}. La absorbancia se leyó en un
Multiscan Titertek (Flow Laboratories, Eflab Oy, Finlandia) a 450
nm.
Se recogieron muestras de CSF
ante-mortem de pacientes en el departamento
de Neurología del Hospital Universitario de Amberes. Todas las
muestras se obtuvieron por punción lumbar realizada para propósitos
de diagnóstico de rutina. Las muestras de CSF se congelaron y
mantuvieron a -70ºC hasta su utilización. Se tomaron muestras de
pacientes de Alzheimer, de pacientes sin complicación neurológica
alguna y de pacientes con diversos trastornos neurológicos. Dichas
muestras se ensayaron respecto a la concentración de tau total
utilizando la htau Innotest (Innogenetics, Bélgica) y las muestras
que tenían valores de tau total altos se retuvieron para análisis
ulterior respecto a la presencia de PHF-tau con el
ensayo de PHF-tau preferido que se especifica en el
Ejemplo III.
Utilizando este ensayo y las muestras de CSF
descritas, se obtuvieron los resultados resumidos en la Tabla 3. A
partir de esto, es evidente que los niveles medios de
PHF-tau se mantienen bastante bajos para los
controles y los pacientes OND (controles: 381 mOD; OND,
degenerativa: 423 mOD; OND, inflamatoria: 392 mOD; OND, vascular:
340 mOD), mientras que el valor medio para los pacientes de
Alzheimer es 814 unidades mOD. Adicionalmente, como se puede ver en
la Tabla 3, valores de tau total altos en el grupo OND no siempre se
reflejan por un aumento paralelo en PHF-tau,
mientras que en los pacientes AD los niveles de tau total altos dan
siempre lugar a concentraciones elevadas de
PHF-tau. La evidencia acumulada del grupo de
control, los grupos OND y los pacientes AD apunta por tanto
fuertemente a la especificidad de diagnóstico del ensayo
PHF-tau para AD y síndromes afines a AD (tales como
la demencia por infartos múltiples, la demencia mixta de la
enfermedad de Parkinson y una demencia no especificada).
\vskip1.000000\baselineskip
- Pacientes de Alzheimer
\vskip1.000000\baselineskip
- Pacientes de Control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- Otros Trastornos Neurológicos. Tipos Degenerativos
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
{}\hskip0,5cm Otras enfermedades
neurodegenerativas. Tipos inflamatorios
\newpage
{}\hskip0,5cm Otras enfermedades neurológicas.
Tipos vasculares
\vskip1.000000\baselineskip
- Otros trastornos neurológicos, no definidos
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Innogenetics sa.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Industriepaark-Zwijnaarde 7, box 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Gante
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Bélgica
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): B-9052
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 00 32 9 241 07 11
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 00 32 9 241 07 99
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos monoclonales específicos para PHF-tau, hibridomas que secretan los mismos, reconocimiento de antígeno por estos anticuerpos y sus aplicaciones
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 112 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Arg Thr Pro Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Thr Pro Pro}
Claims (15)
1. Un anticuerpo monoclonal secretado por el
hibridoma depositado en la ECACC el 7 de julio de 1993 bajo el No.
93070774.
2. Un hibridoma conforme al depositado en la
ECACC el 7 de julio de 1993 bajo el No. 93070774.
3. Un proceso para producir anticuerpos
monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1, que implica:
- -
- cultivar los hibridomas seleccionados de acuerdo con la reivindicación 2 en un medio de cultivo apropiado, y
- -
-
recuperar los anticuerpos monoclonales excretados por dichos
hibridomas seleccionados; o
\hbox{alternativamente}
- -
- implantar los hibridomas seleccionados de la reivindicación 2 en el peritoneo de un ratón y, cuando ha sido producida ascitis por el animal, recuperar los anticuerpos monoclonales formados luego a partir de dicha ascitis.
4. Proceso para la detección o diagnóstico
post-mortem de una enfermedad
cerebral/neurológica que implica la proteína
PHF-tau, tal como la enfermedad de Alzheimer, que
comprende al menos los pasos siguientes:
- -
- poner en contacto un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 con una preparación de ovillos neurofibrilares (NFT) o un homogeneizado de cerebro extraído con detergente, aislado de un paciente que tenía la enfermedad de Alzheimer o cualquier otra enfermedad que implique PHF-tau en condiciones adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo; y
- -
- detectar la fijación inmunológica de dicho anticuerpo a dicho homogeneizado de cerebro, y
- -
- separar posiblemente el antígeno de dicho complejo y recuperar el antígeno buscado en una forma purificada.
5. Proceso para la detección o diagnóstico
in vitro de una enfermedad cerebral que implica proteína tau
fosforilada anormalmente, tal como la enfermedad de Alzheimer, que
incluye:
- -
- poner una muestra de CSF, preferiblemente CSF no concentrado, o de suero procedente de un paciente que se sospecha padece un trastorno neurológico que implica PHF-tau, más particularmente enfermedad de Alzheimer, o proteínas o polipéptidos extraídos de la misma, en contacto en condiciones in vitro con un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, siendo dichas condiciones adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo; y
- -
- detectar la fijación inmunológica de dicho anticuerpo a dicha muestra de fluido cerebro-espinal, o suero, o extracto de la misma.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
5, en el cual dichos anticuerpos monoclonales están inmovilizados
sobre un soporte adecuado tal como resina.
7. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, que comprende adicionalmente:
- -
- reunir dicho complejo antígeno-anticuerpo formado por el antígeno y los anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 1, con:
- -
- un segundo anticuerpo,
- \bullet
- que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o
- \bullet
- que puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, estando dicho anticuerpo policlonal preferiblemente purificado por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;
- -
- un marcador sea para marcación específica o acoplamiento con dicho segundo anticuerpo;
- -
- soluciones tampón apropiadas para llevar a cabo la reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la invención y una muestra de ensayo por una parte, y el segundo anticuerpo fijado y el marcador por otra parte.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
7, en el cual dicha muestra se pone en contacto con una combinación
de anticuerpos monoclonales constituida por anticuerpos monoclonales
de acuerdo con la reivindicación 1 y uno o más anticuerpos
monoclonales seleccionados del grupo constituido por:
- -
- el anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 22 de diciembre de 1992 bajo el No. 92122204;
- -
- el anticuerpo monoclonal AT8 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 8 de octubre de 1991 bajo el No. 91100806.
9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
8, en el cual se utiliza al menos una de las combinaciones
siguientes de anticuerpos monoclonales:
- -
- una mezcla que comprende al menos un anticuerpo mono-clonal de acuerdo con la reivindicación 1 y un anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 22 de diciembre de 1992 bajo el No. 92122204;
- -
- una mezcla que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 y al menos otro anticuerpo monoclonal que reconoce tau o PHF-tau.
10. Un proceso de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado adicionalmente porque implica
un formato de detección en sándwich que comprende aplicar en forma
de recubrimiento y detectar anticuerpos, estando constituidos
dichos anticuerpos de recubrimiento por al menos un anticuerpo de
acuerdo con la reivindicación 1, y estando constituidos dichos
anticuerpos de detección por al menos un anticuerpo monoclonal capaz
de detectar tau humana normal y/o fosforilada anormalmente cuyo
epítope es diferente del epítope de cualquiera de los anticuerpos
monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1.
11. Un kit para el diagnóstico in vitro
de una o más de las enfermedades siguientes: enfermedad de
Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Pick y otros trastornos
neurológicos en los cuales está implicada proteína tau fosforilada
anormalmente o filamentos helicoidales apareados,
caracterizado porque el kit comprende:
- -
- al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 depositado sobre una microplaca;
- -
- una preparación para contener la muestra (CSF, suero, o proteínas extraídas de los mismos) para diagnóstico in vitro,
- -
- un segundo anticuerpo
- \bullet
- que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o un epítope de cualquier péptido de tau fosforilado que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dichos epítopes diferentes del epítope de la invención, o
- \bullet
- que puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, y estando dicho anticuerpo policlonal preferiblemente purificado por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;
- -
- un marcador, sea para marcación específica o acoplamiento con dicho segundo anticuerpo;
- -
- soluciones tampón apropiadas para realización de la reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la invención y una muestra de ensayo por una parte, y el segundo anticuerpo fijado y el marcador por otra parte,
- -
- posiblemente un péptido que lleva un epítope de PHF-tau comprendido en la región definida por SEQ ID No. 1 para propósitos estándar, o para propósitos de competición con respecto al antígeno que se busca.
12. Un kit de acuerdo con la reivindicación
11, para la detección o diagnóstico in vitro de una
enfermedad cerebral/neurológica que implica proteína tau
fosforilada anormalmente, tal como enfermedad de Alzheimer, que
comprende al menos una de las combinaciones de anticuerpos
monoclonales siguientes:
- -
- una mezcla que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 y un anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 22 de diciembre de 1992 bajo No. 92122204;
- -
- una mezcla que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 y al menos otro anticuerpo monoclonal que reconoce tau o PHF-tau.
13. Un kit de acuerdo con la reivindicación
12, caracterizado adicionalmente porque implica un formato de
detección en sándwich que comprende anticuerpos de recubrimiento y
de detección, estando constituidos dichos anticuerpos de
recubrimiento por al menos un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, y estando constituidos dichos anticuerpos de
detección por al menos un anticuerpo monoclonal capaz de detectar
tau humana normal y/o fosforilada anormalmente, cuyo epítope es
diferente del epítope de cualquiera de los anticuerpos monoclonales
de acuerdo con la reivindicación 1.
14. Un proceso para el diagnóstico in
vitro, de un paciente que se sospecha padece la enfermedad de
Alzheimer, que comprende:
- -
- (a) detectar el nivel de PHF-tau en una muestra de CSF obtenida de dicho paciente por fijación inmunológica de anticuerpos monoclonales, capaz de reconocer específicamente en un péptido tau fosforilado una secuencia de aminoácidos Pro-Lys-Thr-Pro-Pro (SEQ ID No. 3), estando dicha Thr(181) fosforilada o anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1;
- -
- (b) comparar el nivel obtenido en (a) con el nivel de PHF-tau presente en muestras de CSF obtenidas de controles, por lo cual una concentración incrementada de tau fosforilada anormalmente en dicho paciente apunta al diagnóstico de enfermedad de Alzheimer.
15. Un proceso de acuerdo con la
reivindicación 14, en el cual dichos anticuerpos monoclonales se
combinan ulteriormente con:
- -
- anticuerpos monoclonales AT180 producidos por el hibridoma depositado en la ECACC el 22 de diciembre de 1992 bajo el No. 92.122.204; y/o
- -
- anticuerpos monoclonales AT8 producidos por el hibridoma depositado en la ECACC el 8 de octubre de 1991 bajo el No. 91100806.
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