KR102843473B1 - 락토바실러스 김치쿠스를 포함하는 질산염 환원용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus), 이의 배양물, 파쇄물 또는 추출물을 포함하는 질산염 환원용 조성물 및 이를 포함하는 프로바이오틱스, 신바이오틱스 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 김치로부터 분리되어 안전하고, 질산염 환원능, 철 이온 환원능이 우수하며 체내 유용한 산화질소를 효과적으로 공급할 수 있으므로, 다양한 건강기능식품, 의약품, 사료, 비료 분야에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

락토바실러스 김치쿠스를 포함하는 질산염 환원용 조성물{Composition for reducing nitrate containing Lactobacillus kimchicus}

본 발명은 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus), 이의 배양물, 파쇄물 또는 추출물을 포함하는 질산염 환원용 조성물 및 이를 포함하는 프로바이오틱스, 신바이오틱스 조성물에 관한 것이다.

유기질소 또는 무기질소 오염물질은 하·폐수 또는 농업용 비료 및 가축의 분뇨 등에서 기인하며 배출량이 지속적으로 증가하고 있고, 현재는 자연 생태계의 자기 정화능력을 초과하여 논, 밭, 지하수, 하천 및 호수로 다량 유입되어 다양한 환경 문제를 야기하고 있다. 국내의 경우, 대다수 농촌지역에서는, 농업비료 및 농약과 가축분뇨에 의한 질산염(NO₃ ^-) 오염이 가장 큰 비중을 차지하고 있다.

지하수 또는 지표수 내 질산염 이온의 경우, 그 자체로는 인체에 유해한 물질은 아니지만, 질산염이 체내에 흡수되어 혈액 속의 헤모글로빈과 결합하여 메트헤모글로빈증(methemoglobinemia, 청색증)을 유발하며 이는 주로 유아 및 아동들에게 주로 발생한다. 또한, 질산염을 과다 섭취할 경우, 단백질 식품에 존재하는 아민(amine)이나 아미드(amide)가 함유된 음식물 섭취하게 되면 위장관에서 질소 화합물과 반응하여 니트로사민(nitrosamine)이라는 발암물질이 생성될 수 있다고 보고되고 있다.

한편 질산염으로부터 환원되어 생성되는 산화질소(nitric oxide)는 체내 다양한 건강상 이점을 부여할 수 있는데 특히 혈압 상승을 억제하여 심혈관계 질환의 개선과 예방에 관여할 수 있다. 과량의 상태에서는 유해 미생물들의 사멸 유도 및 정상적인 균총의 회복에도 관여할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 구강에서 공급되는 산화질소는 구강 내 유해 미생물의 생육조절 및 정상 균총에 관여할 수 있고, 구강 및 위장 관계로 흡수되는 산화질소는 체내 혈압 상승 억제 및 심혈관계 질환의 개선에 효과를 나타낼 수 있다.

따라서, 체내에 유입될 수 있는 질산염을 제거하고, 체내에 유익한 효과를 낼 수 있는 산화 질소를 제공하기 위한 연구의 필요성이 있고 이러한 목적을 달성하기 위하여 다양한 프로바이오틱스를 이용하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.

그러나 아직까지 안전하면서 우수한 질산염 환원 활성 및 산화질소 제공 활성을 나타내는 새로운 프로바이오틱스가 널리 알려지지 않아, 이에 대한 연구의 필요성이 있다.

이에 본 발명자들은 김치 유래 유산균으로 안전성이 보장된 락토바실러스 김치쿠스에 대하여 연구하던 중 상기 균주가 우수한 질산염 환원 활성 및 산화 질소 공급 활성을 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus), 이의 배양물, 파쇄물 또는 추출물을 포함하는, 질산염 환원용 조성물, 프로바이오틱스, 신바이오틱스 조성물 및 체내 산화질소 공급용 건강기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus), 이의 배양물, 파쇄물 또는 추출물을 포함하는, 질산염 환원용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 락토바실러스 김치쿠스 또는 이의 배양물을 포함하는, 질산염 환원용 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 프로바이오틱스로 락토바실러스 김치쿠스 또는 이의 배양물; 및 프리바이오틱스로 과일 또는 채소류;를 포함하는 신바이오틱스 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 체내 산화질소 공급용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 김치로부터 분리되어 안전하고, 질산염 환원능, 철 이온 환원능이 우수하며 체내 유용한 산화질소를 효과적으로 공급할 수 있으므로, 다양한 건강기능식품, 의약품, 사료, 비료 분야에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1의 (A)는 락토바실러스 김치쿠스 (Lactobacillus kimchicus) (KCTC 12976), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) (ATCC 11454), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) (ATCC 393), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) (ATCC 8014), 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG) (ATCC 53103), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) (KCTC 3530)의 질산염 환원 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1의 (B)는 락토바실러스 김치쿠스의 질산염 환원 효과를 배양 시간에 따라 확인한 결과를 나타낸 도이다 (p<0.05, one way ANOVA 및 Tukey's HSD test).
도 2의 (A) 및 (B)는 락토바실러스 김치쿠스 (Lactobacillus kimchicus) (KCTC 12976), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) (ATCC 11454), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) (ATCC 393), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) (ATCC 8014), 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG) (ATCC 53103), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) (KCTC 3530)의 아질산염 소거 활성 (A) 및 배양 시간에 따른 아질산염 소거 활성 (B)을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (p<0.05, one way ANOVA 및 Tukey's HSD test).
도 3은 배추, 적상추, 무의 멸균처리 시료에서 락토바실러스 김치쿠스의 아질산염/NO 생성 효과를 나타낸 도이다. (**, p<0.01, Student's t-test)
도 4는 배추, 적상추, 무의 멸균처리 시료에서 배양 시간에 따른 락토바실러스 김치쿠스의 아질산염/NO 생성 효과를 나타낸 도이다. (p<0.05, one way ANOVA 및 Tukey's HSD test)
도 5는 배추, 적상추의 멸균처리 시료에서 락토바실러스 김치쿠스 (Lactobacillus kimchicus) (KCTC 12976), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) (ATCC 11454), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) (ATCC 393), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) (ATCC 8014), 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG) (ATCC 53103)의 아질산염/NO 생성 효과를 나타낸 도이다. (**, p<0.01, Student's t-test)
도 6은 배추, 적상추, 무의 비멸균처리 시료에서 락토바실러스 김치쿠스의 아질산염/NO 생성 효과를 나타낸 도이다. (**, p<0.01, Student's t-test)
도 7은 배추, 적상추, 무의 열풍 건조 또는 동결건조 시료에서 락토바실러스 김치쿠스의 아질산염/NO 생성 효과를 나타낸 도이다. (**, p<0.01, Student's t-test와 p<0.05, one way ANOVA 및 Tukey's HSD test)
도 8은 락토바실러스 김치쿠스 (Lactobacillus kimchicus) (KCTC 12976), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) (ATCC 11454), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) (ATCC 393), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) (ATCC 8014), 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG) (ATCC 53103), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) (KCTC 3530)의 철 (Fe3⁺) 환원 활성을 나타낸 도이다. (p<0.05, one way ANOVA 및 Tukey's HSD test)

본 발명은 락토바실러스 김치쿠스(Lactobacillus kimchicus), 이의 배양물, 파쇄물 또는 추출물을 포함하는, 질산염 환원용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 락토바실러스 김치쿠스, 이의 배양물, 파쇄물 또는 추출물은 질산염, 철 (Fe³⁺) 환원 활성이 우수하고, 이를 통해 체내 유용한 효과를 나타내는 산화 질소를 제공할 수 있으므로, 다양한 건강기능식품, 의약품, 사료, 비료 분야에 유용하게 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어, 락토바실러스 김치쿠스는 김치에서 분리된 김치 발효 유산균으로 베타-글루코시다아제를 생산하는 균주로 알려져 있다. 본 발명에서는 락토바실러스 김치쿠스 KCTC 12976 를 사용하였으나, 입수 경로에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 락토바실러스 김치쿠스는 다양한 형태로 조성물에 포함될 수 있고, 질산염 환원 및 이에 따른 아질산염 생성, 산화 질소 생성 효과를 달성할 수 있는 한, 당업자에게 잘 알려진 형태로 가공되어 포함될 수 있다. 예컨대 락토바실러스 김치쿠스는 생균 또는 사균, 바람직하게는 생균 형태로 포함될 수 있고, 이를 공지의 액체 또는 고체 배양 배지에서 배양한 배양물, 균주의 세포막을 용해시키거나 파쇄 또는 균질화 처리한 파쇄물 또는 용해물, 상기 균주를 무기 또는 유기용매로 추출한 추출물 등의 형태로 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 락토바실러스 김치쿠스는 질산염 환원능을 가질 수 있고, 질산염 환원능은 질산염 제거능과 상호 교환적으로 사용할 수 있다. 질산염 환원 또는 제거능이란 시료에 존재하는 질산염(nitrate)을 환원시켜 이를 제거하고 이들을 아질산염 (nitrite), 산화질소 (Nitric oxide, NO) 로 생성하는 것이다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 질산염을 아질산염으로 환원시킬 수 있고, 나아가 아질산염 소거능을 가질 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 특히 과일 또는 채소류 내 존재하는 질산염 환원용일 수 있다. 최근 다양한 과일 또는 채소에 질산염이 함유되어 있다는 보고가 있으며, 이에 천연 질산염 소재로 과일 및 채소가 이용될 수 있다. 질산염 제공원으로 바람직한 과일 또는 채소는 이에 제한되는 것은 아니나, 상추, 시금치, 호박, 파, 양배추, 무, 배추, 부추, 당근, 샐러리, 감자, 사탕무우, 레드비트, 오이, 가지, 토마토, 파프리카, 수박, 바나나, 사과, 배, 복숭아, 포도, 참외 및 딸기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 더욱 바람직하게는 적상추, 무, 배추일 수 있다.

또한 본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 질산염 환원능을 통해 시료 내 존재하는 질산염을 환원시켜 산화질소를 공급할 수 있고, 이러한 반응을 통해 체내에 유용한 산화질소를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 질산염뿐만 아니라 다른 유산균 균주에서는 거의 확인되지 않는 철에 대한 환원 활성도 우수하여, 철 (Fe³⁺) 환원용으로도 활용될 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 질산염 환원용 조성물은 질산염을 환원시키고, 이를 통해 아질산염, 산화질소를 공급하고자 하는 목적으로 다양한 형태로 활용될 수 있으며, 예컨대 산화질소 공급이 필요한 개체에 대한 약학적 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 건강기능식품 조성물, 식품 첨가제 조성물, 사료 조성물일 수 있고, 토양에 공급 시 비료 조성물로도 활용될 수 있다.

또한 본 발명은 락토바실러스 김치쿠스 또는 이의 배양물을 포함하는, 질산염 환원용 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.

프로바이오틱스란, 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 시료 내 존재하는 질산염을 체내에 유용한 산화질소로 환원시킬 수 있으므로 프로바이오틱스 제제로 유용하게 활용될 수 있다.

또한 본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 시료, 바람직하게는 과일 또는 채소에 존재하는 질산염을 효과적으로 산화 질소로 환원시킬 수 있으므로, 과일 또는 채소를 프리바이오틱스로 하고, 락토바실러스 김치쿠스, 이의 배양물을 프로바이오틱스로 하는 신바이오틱스 형태로 활용될 수 있다. 이 경우 과일 또는 채소는 천연 질산염 공급원으로 활용되며, 락토바실러스 김치쿠스에 의한 체내 산화 질소 공급 효과를 극대화시킬 수 있다. 따라서 상기 신바이오틱스 조성물은 체내 산화질소 공급용일 수 있으며, 산화질소 공급을 통해 구강 내 프로바이오틱스로 구강에 존재하는 유해 미생물의 생육 조절 및 정상 균총의 회복에 관여하거나, 구강 또는 소화관을 통해 흡수되는 산화 질소를 통해 체내 혈압 상승 억제 및 심혈관계 질환을 개선, 피부 유해균 억제, 장내 장관계 균총의 유지, 여성 생식기 내 유해균 억제 등과 같은 다양한 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 락토바실러스 김치쿠스는 질산염 환원 능력이 우수하여, 멸균 또는 비멸균된 과일 또는 채소류, 동결 또는 열풍 건조된 과일 또는 채소류에 존재하는 질산염을 모두 제한없이 환원시킬 수 있는 능력이 우수하다. 따라서, 신바이오틱스 조성물에 포함되는 프리바이오틱스로서의 과일 또는 채소류는 멸균 또는 비멸균 형태이거나, 동결 건조 또는 열풍 건조 형태일 수 있다.

또한 본 발명은 락토바실러스 김치쿠스, 이의 배양물, 파쇄물 또는 추출물을 포함하는 질산염 환원용 조성물, 질산염 환원용 프로바이오틱스 조성물 또는 신바이오틱스 조성물을 포함하는 체내 산화질소 공급용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

체내 산화질소 공급에 따른 다양한 건강에 유익한 효과는 앞서 설명한 바와 같다. 본 발명의 락토바실러스 김치쿠스가 건강기능 식품으로 사용되는 경우, 이들은 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 포함할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 총 중량에 대하여 15 중량부 이하, 10 중량부 이하, 1중량 내지 15중량부, 1중량 내지 10중량부, 1중량 내지 5중량부, 또는 0.1중량 내지 15중량부의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 식품 조성물은 예를 들어, 우유, 요플레 등의 식품 소재, 식음료, 기능성 식품으로 이용될 수 있다. 상기 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제는 조성물 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락토바실러스 김치쿠스의 질산염 환원 활성 확인

다양한 유산균들 중 질산염 환원능을 갖는 유산균을 도출하기 위하여, 락토바실러스 김치쿠스 (Lactobacillus kimchicus) (KCTC 12976), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) (ATCC 11454), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) (ATCC 393), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) (ATCC 8014), 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG)(ATCC 53103), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) (KCTC 3530)을 이용한 질산염 환원 활성을 아질산염과 산화질소 생산을 통해 확인하였다. 7.1, 7.4, 7.7log CFU/ml 유산균들을 2mM 질산염을 포함하는 5% MRS broth 에서 배양하고, 아질산염 형성을 72 시간 동안 배양하며 확인하고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이 때 배양액 중 생성된 아질산염과 산화질소는 sulfanilamide와 N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NED)에 의해 적색의 azo화합물로 전환되는 Griess 반응을 이용하여 분석하였다. 즉, 각 시간 별로 시료를 취하여 원심분리(8,000×g, 3 min)한 상등액 150 μL와 5% phosphoric acid (v/v)에 녹인 1% sulfanilamide (w/v) 용액 50 μL를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 이후, 0.1% NED (w/v) 50 μL와 혼합하여 10분간 실온의 암소에서 더 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험 결과는 3번의 반복실험을 통해 평균±표준편차로 나타내었다.

도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 6종의 유산균 중 락토바실러스 김치쿠스에서만 질산염 환원 효과가 확인되었으며, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, 7.1, 7.4, 7.7log CFU/ml 모든 실험군에서 락토바실러스 김치쿠스 배양 시간에 따라 아질산염/NO 생성이 증가하다가 48시간 이후부터 생산량이 포화에 도달하는 것을 확인하였다.

실시예 2. 락토바실러스 김치쿠스의 아질산염 소거 활성 확인

락토바실러스 김치쿠스가 질산염 환원 활성 외에도 아질산염에 대한 소거활성과 추가환원 능력이 있는지 확인하였다. 락토바실러스 김치쿠스 (Lactobacillus kimchicus) (KCTC 12976), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) (ATCC 11454), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei)(ATCC 393), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) (ATCC 8014), 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG)(ATCC 53103), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) (KCTC 3530)를 NaNO₂ 50μM을 함유하는 5% MRS에서 7.1, 7.4, 7.7log CFU/ml로 배양하고, 6종의 유산균에 의한 아질산염 농도 변화를 24시간 시점에서 균주 수(A) 및 7.7log CFU/ml 실험군에서 6 내지 72시간의 배양 시간(B)에 따라 확인하였다. 각 균주들의 아질산염 소거 활성을 균주 수 및 배양 시간에 따라 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 이 때 배양액 중 잔류하는 아질산염의 수준은 실시예 1에 기술한 Griess 반응을 이용하여 분석하였다. 모든 실험 결과는 3번의 반복실험을 통해 평균±표준편차로 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 김치쿠스는 다른 유산균 대비 현저히 우수한 아질산염 소거 활성을 나타냈으며, 균주 수 및 배양 시간 의존적으로 아질산염 소거 활성의 증가를 나타냄을 확인하였다.

상기와 같은 결과는 유산균 중에서도 특히 락토바실러스 김치쿠스가 질산염을 아질산염으로 환원하는 우수한 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 아질산염을 소거하는 활성이 탁월하여 산화질소를 포함한 환원형태의 질소물로 전환시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 3. 채소류에서의 락토바실러스 김치쿠스 환원 활성 확인

실시예 1 및 2에서 락토바실러스 김치쿠스가 질산염 환원능, 아질산염 소거능이 있는 것을 확인하였으므로, 천연 질산염 소재인 채소류들을 질산염 공급원으로 이용하여 락토바실러스 김치쿠스가 동일한 활성을 나타내는지 확인하여 균과 채소를 혼합한 신바이오틱스 (synbiotics) 로 활용가능한지 확인하였다.

채소류로 배추, 적상추, 무를 이용하여 발효시료를 제조하였다. 구체적으로 배추 및 무는 건조 전 중량대비 2배, 적상추는 건조 전 중량 대비 3배의 물과 혼합하여 믹서기로 분쇄하였다. 이후 오토클레이브 조건에서 멸균처리하거나 (실험군 1) 멸균처리하지 않은 시료(실험군 2)를 제조하였다. 또한 상기 채소류를 열풍건조하고 분말화한 시료 (실험군 3), 동결건조하고 분말화한 시료 (실험군 4) 를 제조하였다. 각 도에 나타낸 모든 실험 결과는 4회 이상의 반복측정을 통해 평균±표준편차로 나타내었다.

3.1 멸균처리 채소 시료 (실험군 1)에서의 아질산염 생성 확인

멸균 처리한 채소에 락토바실러스 김치쿠스 1배수 (1%), 또는 10배수 (10%) 균을 접종하고, 37 ℃ 에서 24시간 배양하여 배양액 중의 아질산염/NO 생산량을 분석하였다. 이때 멸균 채소 분쇄액와 균 MRS접종액은 95:5 (v/v)로 혼합하여 배양하였으며, 배양액을 원심분리(8,000×g, 3 min)한 상등액 중의 아질산염과 NO생성량을 실시예 1과 동일한 Griess 반응을 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

락토바실러스 김치쿠스를 접종하지 않은 대조군에서는 아질산염이 전혀 생성되지 않았으나, 도 3에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 김치쿠스를 접종한 배추와 적상추에서는 과량의 아질산염이 검출되었다. 배추에서는 접종 균수의 증가에 따라 더 많은 아질산염이 생성되었다. 적상추에서는 1% 접종만으로도 더욱 많은 아질산염이 생성되었으나, 균이 과량 접종되는 경우 생성된 아질산염이 배지 성분 등에 의해 오히려 소거되어 수율이 오히려 낮아지는 것을 확인하였다.

한편 멸균처리한 세포에 1배수 균 (1%)을 위의 방법으로 접종하고 배양 시간에 따른 아질산염/NO 생산 결과를 48시간까지 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 멸균 처리 채소 시료군에서 락토바실러스 김치쿠스에 의한 아질산염의 생성은 18 내지 24시간 내에 거의 포화상태에 도달하는 것을 확인하였다.

다른 4종의 유산균을 배추 및 적상추를 질산염 공급원으로 하여 배양하였을 때, 아질산염이 생성되는지 여부를 비교하기 위하여, 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) (ATCC 11454), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) (ATCC 393), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum)(ATCC 8014), 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG) (ATCC 53103) 1%를 시료에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하였으며, 배양액 중의 아질산염 생성량을 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 다른 4종의 균주들은 채소 발효를 통해 아질산염을 거의 생산하지 못하였고, 이는 실시예 1의 결과와 일치하는 결과이다. 이러한 결과를 통해 다양한 유산균들 중 락토바실러스 김치쿠스만이 질산염 환원 효과를 나타내고, 특히 채소류를 질산염 공급원으로 하여 환원 활성을 나타낼 수 있음을 다시 한번 확인하였다.

3.2 비멸균처리 채소 시료 (실험군 2)에서의 아질산염 생성 확인

멸균처리하지 않은 시료에서의 아질산염 생성능을 확인하기 위하여, 멸균처리 하지 않은 배추, 적상추, 무의 분쇄 액상 시료에 1% 락토바실러스 김치쿠스를 접종 또는 접종하지 않고 37 ℃ 에서 배양하면서 배양액 내에 생성된 아질산염/NO를 측정하여 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 김치쿠스를 접종하지 않은 실험군에서는 아질산염의 생성이 매우 낮은 수준으로 확인되었으나, 접종 군에서는 6시간만에 미접종군 대비 최대 40 배 높은 수준의 아질산염 생성이 확인되었다. 특히 3.1의 멸균처리 채소 시료 실험에서는 아질산염이 생성되지 않았던 무에서도 우수한 아질산염 생성을 확인하였다. 미접종군에서 생성된 아질산염은 채소류에 존재하는 다양한 미생물 군집에 의한 것으로 생각된다.

한편 배양 시간을 24시간까지 증가시킴에 따라 발효시간이 증가되어 아질산염 생성량이 점차적으로 감소하였는데, 이러한 결과는 비 멸균처리 채소 시료를 이용한 경우 발효시간을 단축해야 한다는 것을 의미한다.

3.3 열풍 건조 시료 (실험군 3) 또는 동결건조 시료 (실험군 4) 에서의 아질산염 생성 확인

열풍 건조 또는 동결 건조 배추, 적상추, 무 분말 시료를 2% (건중량 기준) 생리식염수에 분산시킨 후, 1% 락토바실러스 김치쿠스를 접종 또는 접종하지 않고 37℃ 에서 6시간 동안 배양하였다. 각 실험군에서 배양액 중에 생성된 아질산염의 생성량을 측정하였으며 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 김치쿠스 접종 군은 열풍 건조 및 동결 건조 모두에서 비접종 대조군 대비 현저히 우수한 아질산염 생산 효과를 나타내었다.

상기와 같은 결과는 락토바실러스 김치쿠스가 멸균, 비멸균, 동결건조, 열풍 건조된 다양한 종류의 채소 시료를 질산염 공급원으로 하여 질산염을 환원시켜 아질산염 및 NO를 생성할 수 있음을 보여주는 결과이다.

실시예 4. 락토바실러스 김치쿠스의 철 환원 활성 확인

질산염 환원 활성 외 락토바실러스 김치쿠스가 철 이온(Fe3+) 환원 활성도 갖는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 락토바실러스 김치쿠스 (Lactobacillus kimchicus) (KCTC 12976), 락토바실러스 락티스 (Lactobacillus lactis) (ATCC 11454), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei) (ATCC 393), 락토바실러스 플란타럼 (Lactobacillus plantarum) (ATCC 8014), 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus rhamnosus GG) (ATCC 53103), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) (KCTC 3530) 7.1, 7.4, 7.7log CFU/ml 유산균들을 100 μg/mL 황산제2철 (ferric sulfate)을 포함하는 5% MRS 에서 배양하였으며, 배양 24시간 후 철 이온 환원 활성을 확인하였다. 이때 각 균주들의 ferric ion에 대한 환원활성을 ferrozine을 이용하여 평가하였고, 각 시간 별로 배양액을 취하여 원심분리(8,000×g, 3 min)에 의해 상등액을 회수한 후, 상등액 150 μL와 1 mM ferrozine 50 μL를 혼합하여 상온의 암소에서 20분 동안 반응시키고 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 유산균주의 철 이온 환원능을 확인한 결과를 도 8에 나타내었다. 모든 실험 결과는 3회 이상의 반복실험을 통해 평균±표준편차로 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 같은 수의 균을 접종한 모든 실험군에서 락토바실러스 김치쿠스가 현저히 우수한 철 환원 활성을 나타내었고, 다른 5종의 균주에서는 철 이온 환원능이 거의 나타나지 않아, 락토바실러스 김치쿠스가 다른 유산균주들 대비 최대 1000 배 이상의 철 이온 환원능을 갖는 것을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 통해, 락토바실러스 김치쿠스가 질산염 환원 활성뿐만 아니라, 철이온 환원활성을 동시에 나타내어 우수한 환원력을 가지고 있는 균주임을 확인하였다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 질산염 환원능을 갖는 락토바실러스 김치쿠스 균주(여기서, 균주는 KCTC 12976으로 기탁된 것)를 포함하는, 질산염 환원용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 질산염 환원능을 갖는 락토바실러스 김치쿠스 균주(여기서, 균주는 KCTC 12976으로 기탁된 것)는 질산염을 아질산염으로 환원하는 것인, 질산염 환원용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 질산염 환원능을 갖는 락토바실러스 김치쿠스 균주(여기서, 균주는 KCTC 12976으로 기탁된 것)는 아질산염 소거능을 갖는 것인, 질산염 환원용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 과일 또는 채소류 내 존재하는 질산염 환원용인, 질산염 환원용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 과일 또는 채소류는 상추, 시금치, 호박, 파, 양배추, 무, 배추, 부추, 당근, 샐러리, 감자, 사탕무우, 레드비트, 오이, 가지, 토마토, 파프리카, 수박, 바나나, 사과, 배, 복숭아, 포도, 참외 및 딸기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 질산염 환원용 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 체내 산화질소 공급용인, 질산염 환원용 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 철 (Fe³⁺) 환원용인, 질산염 환원용 조성물.
   
8. 질산염 환원능을 갖는 락토바실러스 김치쿠스 균주(여기서, 균주는 KCTC 12976으로 기탁된 것)를 포함하는, 질산염 환원용 프로바이오틱스 조성물.
   
9. 프로바이오틱스로, 질산염 환원능을 갖는 락토바실러스 김치쿠스 균주(여기서, 균주는 KCTC 12976으로 기탁된 것) 또는 이의 배양물; 및
   프리바이오틱스로, 과일 또는 채소류;를 포함하는 체내 산화질소 공급용 신바이오틱스 조성물.
   
10. 삭제
11. 제9항에 있어서, 상기 과일 또는 채소류는 멸균 또는 비멸균된 것인, 조성물.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 과일 또는 채소류는 동결 건조 또는 열풍 건조된 것인, 조성물.
    
13. 제1항, 제8항 또는 제9항의 조성물을 포함하는, 체내 산화질소 공급용 건강기능식품 조성물.