KR102881188B1 - N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염, 이의 제조 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 신규한 석시네이트 염 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물, 이의 제제, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방의 용도에 관한 것이다.

Description

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염, 이의 제조 및 용도

본 발명은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민(N-(3-(4-(3-(diisobutylamino)propyl)piperazin-1-yl)propyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine)의 신규한 석시네이트 염 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물, 이의 제제, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방의 용도에 관한 것이다.

화학식 I의 구조를 갖는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민(N-(3-(4-(3-(diisobutylamino)propyl)piperazin-1-yl)propyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine)은

[화학식 I]

신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하고 이전에 WO 2006/051489에 개시된 1,4-비스(3-아미노프로필)피페라진(1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine) 유도체의 패밀리에 속하는 약제학적 활성분자(pharmaceutically active molecule, PAM)이다.

이 화합물의 자유 염기 형태는 산화적 분해로 인해 장기적인 안정성 문제를 나타낸다. 따라서, 본 출원인은 이러한 안정성 문제를 극복하는 염의 형태를 찾고 WO2014/102339에 기술된 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민(N-(3-(4-(3-(diisobutylamino)propyl)piperazin-1-yl)propyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine)의 황산염(sulphate salts)을 발견하였다. 황산염은 산화 분해가 없으며 결정성이 우수한 결정상(good crystallinity)을 갖는 안정한 분말로 얻어지며; 일반적으로 사용되는 기준(즉, 25℃/60% 상대 습도(relative humidity, RH)에서 2중량% 미만의 수분 흡수)에 따라 흡습성이 없다. 특히, 본 출원인은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 디-설페이트(di-sulphate)가 최소 5년 동안 일반 저장 조건(15 내지 25℃)에서 안정적이며 100 mg/mL보다 큰 수용해도를 갖는다는 것을 발견하였다. 따라서, N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 황산염은 적합한 API(Active Pharmaceutical Ingredients)이다.

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 디-설페이트 API는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases) 치료를 위해 개발되고 있으며 건강한 지원자를 대상으로 임상 1상(phase 1 clinical trials)을 성공적으로 마쳤다. 이 디-설페이트 API는 건강한 지원자에게 액상 제제(물에 녹인 용액)로 경구 투여되었다. 이러한 수용액은 방부제가 필요없이 준비하기 쉽고 매우 안정적(유리 바이알에서 5 ℃에서 최대 18개월, 25 ℃/60% RH에서 최대 18개월, 40 ℃/75% RH에서 최대 6개월)이다. 동일한 제형은 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy, PSP)를 앓고 있는 환자를 대상으로 진행 중인 2A상 임상 시험에서 사용된다.

본 출원인은 염 형태로 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 PAM의 고형제(예를 들어, 캡슐)를 개발하고자 했으며, 유리 염기(free base)는 불안정성 문제 및 낮은 용해도로 인하여 제외하였다. 실제로 고형제는 액제에 비해 다음과 같은 많은 이점을 제공한다: 안정성(stability), 포장(packaging), 공급(supply), 보관(storage), 취급(handling) 및 운반(logistics)이 더 쉽고 더욱 비용-효율적이다. 액제와 달리 고형제(규제 준수)의 개발은 API가 고유하고 명확한 다형성 형태(polymorphic form)가 되도록 한다. 분자의 다형성 형태 또는 다형체(polymorphs)는 결정화도, 녹는점, 용해도 및 안정성과 같은 다양하고 독특한 물리화학적 특성을 갖는 분자의 서로 다른 고체 상태를 의미한다. API 및 이의 고형제의 특징은 API의 다형성 형태에 따라 다르다; 다형체는 약물의 생체이용률에 큰 영향을 미칠 수 있는 다양한 안정성, 용해도, 용해 속도를 나타낼 수 있다. 따라서, 약물 승인 및 규제 당국(drug approval and regulatory authorities)은 약물의 고형제가 API의 독특하고 안정적인 다형체일 것을 요구한다; 예를 들어, 원료 의약품(Drug Subsance)이 다형성 형태로 존재하는 경우 약식 신약 신청 제출에 대한 화학, 제조 및 관리(CMC) 요구 사항과 관련하여 미국 식품의약국 산업 지침을 참조한다(도켓 n° FDA-2004-D-0182). 따라서 적절한 염의 올바른 다형성 형태를 선택하는 것은 API 개발에 매우 중요하며, 합성을 위해 재현성이 높은 화학 공정을 구현하는 것도 마찬가지로 중요하다. 이 경우 API 합성 공정의 마지막 단계는 선택한 다형성 형태를 직접 얻기 위해 최적화해야 하는 염 형성이다. 즉, 원팟 염 형성(직접 결정화 최종 단계)과 호환되는 염/다형성 형태를 선택하는 데 있어 이 공정이 더 효율적이고 비용 효율적일 것이다.

본 출원인은 먼저 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 디-설페이트 염을 조사하고 포괄적인 다형체 스크리닝을 수행하여 많은 다형성 형태를 확인하였다. 도 1에서 보여지는 XRPD 회절도가 "형태 A"로 명명되는 다형성 형태는 고형제를 제조하는데 가장 적합하고 안정적인 형태로 확인되었다. 그 다음, 본 출원인은 형태 A의 재현 가능한 화학 공정 합성(reproducible chemical process synthesis of Form A), 예를 들어, 유리 염기 출발 물질로부터의 본 발명의 다형성 형태하에서 원팟 이황산염 형성/직접 결정화에 적합한 조건(용매, 반용매, 농도, 기간, 온도, 핵생성 조건, 여과, 건조 조건)을 개발하고자 하였다. 광범위한 연구에도 불구하고, 본 출원인은 이러한 결과를 달성할 수 없었고 유리 염기로부터 2개의 별개의 단계에서 원하는 형태 A 다형성 형태를 얻을 수 있었다: 1) "형태 B"로 명명된 다형성 형태 하에서의 디-설페이트 염 형성, 이어서 2) 형태 B를 표적이 되는 형태 A로 전환.

본 출원인은 표적이 되는 형태 A가 50 ℃에서 건조 시 다형성 형태 B로 다시 전환되기 때문에 건조 조건에 민감하다는 것을 추가로 확인하였다. 이러한 민감도는 산업적인 규모에서의 공정을 추가적으로 제한할 것이며, 본 출원인은 이 형태가 더욱 효율적인 원-팟 염 형성/결정화 최종 단계에 적합하기 때문에 대신 형태 B를 조사하였다.

도 2에 개시된 XRPD 회절도(Diffractogram)인 형태 B는 다형 스크리닝 연구로부터 확인된 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 디-설페이트의 가장 두드러진 다형성 형태이다.

그러나, 여러가지 다양한 용매 또는 습도가 높은 조건에서 결정형태로 전환될 위험이 있으며, 알코올성 용매에서는 염 불균형(트리스-설페이트 염 형성)이 발생하기 쉽다. 또한, 형태 B는 50 ℃에서 장기간 건조하면 부분적으로 결정성을 잃는다. 따라서 본 출원인은 형태 B를 고형제를 개발하기 위한 적합한 다형성 형태로 간주하지 않았다.

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 디-설페이트는, 안정하고 결정형이며 비흡습성 분말 API임에도 불구하고 결정 형태 안정성 및 합성 공정 효율과 관련하여 복잡한 다형성(polymorphism) 환경을 나타낸다. 원-팟 염 형성/직접 결정화 최종 단계를 포함하는 견고하고 비용-효율적인 합성 공정은 특정 안정된 다형성 형태(polymorphic form)의 획득을 보장하지 않는다. 본 출원인은 기존의 50 ℃에 건조시 불안정하여 다형성 선별 기준(polymorphism screening criteria)을 통과한 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 다형체에 있어서, 디-설페이트 염이 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 PAM의 고형제를 얻기에 적합하지 않다는 결론에 도달하였다.

WO 2014/102339는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 다른 염을 설명한다. WO 2006/051489에 원래 보고된 옥살레이트 염(oxalate salt)은 옥살레이트 이온(oxalate ions)이 유발할 수 있는 신독성(nephrotoxicity)으로 인해 적합하지 않았다. 직접적으로 하이드로클로라이드 염(hydrochloride sal)은 매우 흡습성이 있는 것으로 밝혀진 반면, 아세테이트 염(acetate salts)은 고체 형태로 얻어지지 않았다. 타르트레이트 및 푸마레이트 염(Tartrate and fumarate salts)은 무정형 고체(amorphous solids)로 얻어졌다. 말레이트 염(malate salt)은 각각의 입체이성질체가 활성 입체이성질체로서 동일하게 특성화되어야 하기 때문에 임상 개발을 상당히 복잡하게 만드는 키랄성(chirality)이 있어서 폐기되었다.

따라서, 특히 고형제에 적합하며 강력한 화학 공정을 통해 얻을 수 있는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 새로운 염의 안정한 다형성 형태에 대한 당업계의 요구가 여전히 존재한다.

본 발명은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민(N-(3-(4-(3-(diisobutylamino)propyl)piperazin-1-yl)propyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine)의 석시네이트 염(SUCCINATE SALTS)이 안정한 분말을 제공한다는 예상치 못한 발견에 기초하며, 다형체(polymorphs)는 높은 결정화도를 가지며, 매우 안정하고, 비흡습성이며, 원팟 염 형성/유리 염기로부터 직접 결정화에서 양호한 수율로 얻을 수 있다. 석시네이트 염은 상기 제시된 까다로운 기준을 만족하며 캡슐과 같은 고형제의 API로 사용하기에 특히 적합하다.

따라서 본 발명은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물에 관한 것이다.

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 및 이의 용매화물은 결정성이 높은 결정상과 일정한 형태를 갖는 분말로 얻어진다. 또한, 본 발명의 석시네이트 염은 이를 함유하는 약제학적 조성물의 제조에 특히 적합하다. 석시네이트 염은 약제학적으로 허용되며 본 출원인이 아는 한 어떤 종류의 고유한 독성과도 관련이 없다.

더욱이, 황산염(sulphate salts)과 같은 다른 염들과 비교했을 때, 석시네이트 염은 더 단순한 다형성 형태를 가지며, 다형성 형태(Polymorphic forms)는 더 높은 결정도를 가지며, 합성 동안 더 안정하다(즉, 결정 형태의 변화 없음). 공정, 특히 규칙적인 50 ℃ 건조에 적용되며 공정에 사용되는 용매에 불균형(즉, 화학양론적 변화)이 발생하지 않았다.

석시네이트 염의 사용은 결과적으로 관련 비용을 줄이면서 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 PAM을 함유하는 약제학적 조성물의 생산을 강화하고 용이하게 할 것이다.

본 발명의 화합물은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염(SUCCINATE SALTS) 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물(Solvates)이다. 특히, 본 발명의 석시네이트 염 및 이의 용매화물은 화학식 II의 구조를 갖고

[화학식 II]

상기 x는 1 내지 4, 바람직하게는 x는 1.4 내지 3.1, 더욱 바람직하게는 x는 1.4 내지 1.6, 더욱 더 바람직하게는 x는 약 1.5, 가장 바람직하게는 x는 1.5이다.

즉, N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 1분자에 대하여 1 내지 4 당량, 바람직하게는 1.4 내지 3.1 당량, 보다 바람직하게는 1.4 내지 1.6 당량, 더욱 더 바람직하게는 약 1.5 당량, 가장 바람직하게는 1.5 당량을 포함한다.

바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명의 석시네이트 염은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 세스퀴-석시네이트 염(sesqui-succinate salt)이다.

일 양태에 있어서, 본 발명의 바람직한 석시네이트 염은 x가 2.9 내지 3.1이고, 바람직하게는 x가 약 3이고, 더욱 바람직하게는 x가 3인 화학식 II의 화합물이다.

또 다른 바람직한 일 양태에 있어서, 본 발명의 석시네이트 염은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 트리스-석시네이트 염이다.

특정 일 양태에 있어서, 화학식 II의 석시네이트 염은 약제학적으로 허용되는 용매화물, 바람직하게는 수화물(hydrate)의 형태이다. 용매화물 화학양론(solvate stoichiometry)은 화학식 II의 석시네이트 염 1 분자에 대해 0.4 내지 2, 바람직하게는 0.4 내지 1.2, 보다 바람직하게는 0.5 내지 1.1, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 또는 약 1.1, 가장 바람직하게는 0.5 또는 1.1 분자의 용매화물이다.

일 양태에 있어서, 본 발명의 화합물은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 반-수화물(hemi-hydrate)이다.

또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명의 화합물은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 단일(mono)-수화물이다.

본 출원인은 1) 염 불균형화(disproportionation)와 같은 화학적 분해 및 2) 다형성 변화에 특히 안정한 본 발명의 화합물의 여러 다형성 형태(Polymorphic forms)를 확인하였다. 이러한 다형체(polymorphs)는 결정화도가 높고 (high degree of crystallinity), 정기적인 보관 및 스트레스 조건에서 안정적이며 흡습성(hygroscopic)이 없다. 본 출원인은 자유 염기로부터의 원팟 염 형성/결정화 최종 단계를 사용하여 이들 다형성 형태(다형성)의 특정 제조를 위한 실험 조건을 발견하였다. 따라서 본 발명의 화합물은 고형제(solid formulations)에 사용하기 위한 API로서 유용하다.

일 양태에 있어서, 본 발명의 특히 바람직한 화합물 중 하나는 CuKα 광원으로 조사했을 때 2θ=3.8° ±0.2°, 10.3° ±0.2°, 12.4° ±0.2°, 16.2° ±0.2°, 17.9° ±0.2°, 19.8° ±0.2°, 20.4° ±0.2°, 23.8° ±0.2° and 26.7° ±0.2°의 회절각에서 피크를 포함하는 X-선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정 형태 하에서 x가 1.5인 화학식 II의 화합물이다. 이 특정 결정형은 응용 프로그램 전체에서 "형태 1"로 지칭되며 PIXcel 검출기(128개 채널)가 있는 PANalytical X'pert pro에 기록된 XRPD 회절도는 도 3에 나타내었다.

본 발명에 있어서 또 다른 바람직한 화합물은 CuKα 광원으로 조사했을 때 회절각 2θ=5.3° ±0.2°, 15.0° ±0.2°, 15.3° ±0.2°, 16.8° ±0.2°, 17.9° ±0.2°, 20.5° ±0.2°, 21.2° ±0.2°, 23.9° ±0.2°, 24.3° ±0.2° and 26.6° ±0.2°에서의 피크를 포함하는 X-선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정형에서 x가 3인 화학식 II의 화합물이다. 이 특정 결정형은 응용 프로그램 전체에서 "형태 2"로 지칭되며 PIXcel 검출기(128개 채널)가 있는 PANalytical X'pert pro에 기록된 XRPD 회절도는 도 4에 나타내었다.

본 발명에 있어서 또 다른 바람직한 화합물은 CuKα 광원을 조사했을 때 2θ=3.8°±0.2°, 4.4°±0.2°, 9.2°±0.2°, 10.6°±0.2°, 13.8°±0.2°, 17.7°±0.2°, 19.9°±0.2°, 21.6°±0.2° 및 23.6° ±0.2°의 회절각에서의 피크를 포함하는 X선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정형에서 x가 1.5이고, y가 0.5인 화학식 II의 화합물이다. PIXcel 검출기(128개 채널)가 있는 PANalytical X'pert pro에 기록된 XRPD 회절도는 도 5에 나타내었다.

본 발명에 있어서 또 다른 바람직한 화합물은 CuKα 광원으로 조사했을 때 2θ=4.2±0.2°, 4.4°±0.2°, 9.6°±0.2°, 10.6°±0.2°, 15.0°±0.2°, 16.3°±0.2°, 17.4°±0.2°, 19.7°±0.2°, 22.8 ° ±0.2°, 29.1 및 29.7° ±0.2°에서의 피크를 포함하는 X-선 분말 회절(XRPD) 패턴을 갖는 결정형에서 x가 1.5이고, y가 1.1인 화학식 II의 화합물이다. PIXcel 검출기(128개 채널)가 있는 PANalytical X'pert pro에 기록된 XRPD 회절도는 도 6에 나타내었다.

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴석시네이트 염의 결정형은 화학 합성 공정을 통해 얻을 수 있다. 이러한 공정은 본 발명의 또 다른 목적이다.

본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 결정형의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다:

- 단계 1: N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민을 유기 용매에 용해하고;

- 단계 2: 반응 매질(reaction medium)을 온도 B로 가열하고, 상기 온도 B는 30 내지 50 ℃를 포함하는 온도로 정의되며;

- 단계 3: 실질적인 등몰량(substantially equimolar)의 숙신산 첨가하고;

- 단계 4: 반응 매질을 온도 B에서 0.25 내지 4시간 동안 교반하며;

- 단계 5: 10시간 내지 30 시간 주기로 온도 A 및 온도 B 사이에서 반응 매질을 온도 순환시키되, 상기 온도 A는 0 내지 10 ℃를 포함하는 온도로 정의되고;

- 단계 6: 반응 매질을 온도 A로 냉각하며;

- 단계 7: 온도 A에서 반응 매질 여과하고;

- 단계 8: 온도 A에서 필터 케이크(filter cake)를 상기 유기 용매로 세척하며;

- 단계 9: 30 내지 50 ℃의 온도에서 필터 케이크를 건조한다.

단계 1에서는, N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 용액을 제공한다. 용액 제조에 유용한 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 출발 물질은 95% 이상의 순도에서 용매화된 형태를 포함하는 유리 염기의 임의의 물리적 형태일 수 있다. 일 양태에 있어서, 유기 용매는 아세톤, 97.5% 아세톤/2.5% 물(% v/v), 메틸 에틸 케톤, 아세토니트릴, 털트(tert)-부틸메틸 에테르로 구성된 그룹에서 선택된다. 특히 바람직한 일 양태에 있어서, 사용되는 유기 용매는 결정형 1을 제조하는데 특히 적합한 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone)이다. 사용된 유기 용매의 부피는 유리 염기의 용해를 달성하고 성공적인 염 형성 및 결정화를 가능하게 하는데 중요하다. 바람직한 일 양태에 있어서, 첨가된 유기 용매의 양은 20 내지 40 mL/g 유리 염기, 바람직하게는 25 내지 35 mL/g 유리 염기, 더욱 바람직하게는 약 30 mL/g 유리 염기이다.

바람직한 일 양태에 있어서, 가열 단계 2는 35 내지 45 ℃, 더 바람직하게는 40 내지 45 ℃, 더욱 더 바람직하게는 약 40 ℃, 가장 바람직하게는 40 ℃에 포함된 온도 B에서 수행된다.

온도 B에서의 선택적인 여과 단계는 단계 2와 뒤이은 숙신산 첨가 단계 3 사이에 실현될 수 있다. 숙신산은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 유리 염기에 대해 실질적으로 등몰량으로 첨가된다. 즉, 숙신산의 유리 염기에 대하여 0.95 당량(eq.) 내지 1.05 당량(eq.)이 첨가된다. 바람직한 일 양태에 있어서, 1.0 당량의 숙신산이 사용된다.

단계 3에서, 숙신산 첨가는 분말 형태의 숙신산을 사용하여 분획을 이루거나 염기를 용해시키기 위해 사용된 유기 용매에 진한 숙신산의 현탁액 또는 용액을 천천히 첨가함으로써 이루어진다.

단계 4에서, 반응 매질이 온도 B에서 0.5 내지 4시간 동안 교반되는 동안 염 형성이 시작된다. 바람직한 일 양태에 있어서, 배지는 20분 내지 40분 사이, 바람직하게는 약 30분 동안 교반된다. 다른 바람직한 일 양태에 있어서, 배지는 2 내지 4시간, 바람직하게는 약 3시간 동안 교반된다.

후속 온도 순환 단계 5는 세스퀴-석시네이트 염이 특정 결정형으로 결정화되도록 한다. 온도 순환은 10 내지 30시간 동안 2 내지 4시간 주기로 온도 A와 온도 B 사이에서 수행되며, 상기 온도 A는 0 내지 10 ℃를 포함하는 온도로 정의된다. 특히 바람직한 일 양태에 있어서, 온도 순환은 약 20시간 동안 약 시간을 주기로 약 5 ℃ 및 약 40 ℃ 사이에서 수행되며 따라서 특히 메틸에틸 케톤(methylethyl ketone)이 유기 용매로 사용되는 경우 세스퀴-석시네이트가 결정형 1하에서 결정화 되도록 한다.

이 포인트에서, 결정염은 일반적으로 침전되고 반응 매질은 동일한 온도에서 여과하여 원하는 물질을 회수하기 전(단계 7)에 0 내지 10 ℃, 바람직하게는 약 5 ℃(단계 6)를 포함하는 온도로 냉각된다. 반응에서 사용된 것과 동일한 유기 용매로 1회 세척된 필터 케이크에서 원하는 결정염이 회수된다 (단계 8). 바람직한 일 양태에 있어서, 물질 g당 약 5 mL의 유기 용매 부피가 필터 케이크 세척에 사용된다.

이어서, 여과 및 세척된 물질을 바람직하게는 감압 하에 30 내지 50 ℃, 바람직하게는 약 40 ℃의 온도에 건조시킨다(단계 9).

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 형태 1을 수득할 수 있는 본 발명의 특히, 바람직한 방법은:

- 단계 1: N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민을 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone )에 용해하고;

- 단계 2: 반응 매질(reaction medium)을 45 ℃로 가열하고;

- 단계 3: 동일한 몰 양의 숙신산(succinic acid)를 첨가하고;

- 단계 4: 반응 매질을 45 ℃에서 3~4시간 동안 교반하며;

- 단계 5: 20시간 동안 3시간 주기로 5 ℃ 및 40 ℃사이에서 반응 매질을 순환시키며;

- 단계 6: 반응 매질을 5 ℃로 냉각하며;

- 단계7: 5 ℃에서 반응 매질을 여과하고;

- 단계 8: 5 ℃에서 필터 케이크(filter cake)를 상기 유기 용매로 세척하며;

- 단계 9: 40 ℃의 온도에서 필터 케이크를 건조한다.

본 발명에 따른 방법은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 직접적인 원-팟 염 형성/결정화를 가능하게 한다.

1) 에탄올을 유기용매로 사용하고 2) 3단계에서 숙신산의 화학양론을 약 2 당량으로 변경하여 적응시켰을 때, 본 발명에 따른 방법은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 트리스 석시네이트 염의 직접적인 원-팟 염 형성/결정화를 가능하게 한다.

본 출원인은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염(SUCCINATE SALTS) 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물이 특히 병적 타우 단백질(Tau protein) 인산화를 억제함으로써 타우 단백질의 대사를 바로 잡는데 유용하다는 것을 보여주었다. 타우 단백질(일명 Microtubule Associated Protein Tau - MAPT)은 튜불린(tubulin)과 상호작용하여 미세소관(microtubules)을 안정화하고 미세소관으로의 튜불린 조립을 촉진하며, 미세소관 안정성은 이소형(isoforms) 및 인산화(phosphorylation)에 의해 제어된다. 타우 병리학은 과인산화(hyperphosphorylation)와 같은 미세소관-관련 타우 단백질의 비정상적인 변형으로 이어지는 메커니즘, 소위 신경원 섬유 엉킴(neurofibrillary tangles, NFT)을 형성하기 위한 퇴행성 뉴런 내부의 원섬유 물질(fibrillar material inside degenerating neurons)로의 응집 및 축적을 포함한다. 본 발명의 화합물은 뉴런의 신경돌기 네트워크(neurite network of neurons)를 보존하고 신경돌기 성장(neurite outgrowth)을 촉진하는데 효율적이다. 신경돌기는 뉴런의 세포체에서 나온 돌기이며, 신경돌기의 보존과 성장은 뉴런 간 연결에 해롭다. 또한, 본 발명의 화합물은 프로그래눌린(PGRN) 신경영양 인자의 수준을 증가시키면서 신경염증(neuroinflammation) 및 미세교(microglial) 활성화를 감소시킬 수 있다. 신경염증은 신경세포 손실에 기여하는 신경독성 전염증성 사이토카인을 방출하는 활성화된 미세교 세포에 의해 유발될 수 있는 타우병증 및 파킨슨병을 포함하되, 이에 국한되지 않는 만성 진행성 신경퇴행성 조작(신경퇴행성 질환)의 2차 반응이다. PGRN은 대뇌피질의 생존력을 유지하는 성숙한 뉴런과 미세아교세포에서 주로 발현되는 분비된 당단백질이다(Brain J. Neurol. 140, 3081-3104 (2017)). 뇌에서의 PGRN 발현은 발달 초기에는 낮고 나이가 들면서 증가한다(Trends Neurosci. 37, 388-398 (2014), J. Reprod. Dev. 57, 113-119 (2011)). 그러나 손상에 대한 반응으로 활성화된 미세아교세포는 PGRN 발현을 상향 조절한다(Acta Neuropathol. (Berl.) 119, 123-133 (2010), Neuroscience 250, 8-19 (2013)). 타우 병리(Tau pathology)와 관련하여 PGRN 결핍은 인간 타우-발현 마우스에서 타우 침착 및 인산화를 가속화한다(J. Neuropathol. Exp. Neurol. 74, 158-165 (2015)). PGRN은 활성화된 미세아교세포에서 방출되는 엘라스타제를 포함한 여러 프로테아제에 의해 과립으로 가공될 수 있다(Neurology 90, 118-125 (2018)). 인간 및 설치류 데이터는 PGRN 감소가 증가된 타우 병리와 관련이 있음을 보여주었다. PGRN haploinsufficiency는 P301L-Tau 트랜스제닉 마우스에서 Tau 인산화를 증가시키며, 이는 PGRN 단백질의 감소가 타우의 과인산화 및 신경내 축적에 기여할 수 있다는 개념을 강력하게 뒷받침한다(J. Neuropathol. Exp. Neurol. 74, 158-165 (2015)). 또한, 뇌의 염증 자극도 타우 인산화 악화와 관련이 있는 것으로 보고되었다(J. Neuroinflammation 7, 56 (2010)). PGRN은 신경염증에서 항염증 인자로 작용할 수 있기 때문에(Neuroscience 250, 8-19 (2013)), PGRN 수치 감소로 인한 염증 상태에서 타우 인산화가 가속화될 것이라는 가설이 있다. PGRN은 파킨슨병에서 역할이 잘 조사된 신경영양 인자이다. Van Kampenet al. PD의 예방 또는 치료를 위한 치료법으로서 PGRN 유전자 전달의 가능한 사용을 조사하기 위해 PD의 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 모델을 사용하였다(PLOS one 2014, 9, 5, e97032). PGRN 유전자의 바이러스 벡터 전달은 흑질선조체 뉴런(nigrostriatal neurons)에서 PGRN 발현을 높이는 효과적인 수단이었다. 마우스의 SNC에서 PGRN 발현이 증가했을 때, 흑색선조체 뉴런은 선조체 도파민 함량 및 회전율의 보존과 함께 MPTP 독성으로부터 보호되었다. 또한, PGRN 유전자 치료에 의한 흑질선조체 뉴런의 보호는 운동 기능의 완전한 보존뿐만 아니라 MPTP 유발 염증 및 세포사멸의 마커 감소를 동반하였다. 더욱이, 프로그래눌린의 혈중 수치는 인간의 파킨슨병 중증도와 진행을 반영할 수 있다(Neuroscience Letters volume 725, 23 April 2020, 134873). 프로그래눌린 혈장 수치는 대조군에 비해 파킨슨병 환자에서 유의하게 낮았으며 운동 증상, 질병 중증도 및 기간과 음의 상관관계가 있는 것으로 밝혀져 PD에서 PGRN의 신경 보호 효과를 시사한다. 이러한 모든 발견은 PGRN 수치를 높이는 것이 타우병증 및 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 신경병증을 개선하는 효과적인 치료법이 될 수 있음을 뒷받침한다. 특히, 본 발명의 석시네이트 염(SUCCINATE SALTS)은 미토콘드리아 독소 MPP+ 또는 로테논(rotenone)으로 손상된 도파민성 뉴런에서 신경 보호 및 α-시누클레인의 응집을 상당히 감소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다; 두 가지 잘 알려진 PD의 체외 모델.

타우병증은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis) 및 괌의 파킨슨병-치매 복합성(Parkinsonism-dementia complex of Guam), 은친화 과립성 질환(Argyrophilic grain disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 피질기저핵 변성(Corticobasal degeneration), 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 석회화를 동반한 확산성 신경원섬유엉킴(Diffuse neurofibrillary tangles with calcification), 가족성 영국 치매(Familial British Dementia), 가족성 덴마크 치매(Familial Danish Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia, FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(Frontotemporal dementia-granulin subtype, FTD-GRN), 게르스트만-슈트라이슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism), 할러보르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 내포체 근염(Inclusion body myositis), 다발성 시스템 위축(Multiple system atrophy), 스타이너트 근긴장성 이영양증(Steinert Myotonic dystrophy), II형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type II), 뇌철분축적을 가진 신경퇴화(Neurodegeneration with brain iron accumulation), C형 니만-피크병(Niemann-Pick disease of type C), 신경섬유 엉킴이 있는 비과만 운동뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles), 파제트병(Paget's disease), 픽병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism), 진행성 피질하 신경교증(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), SLC9A6-관련 정신 지체(SLC9A6-related mental retardation), 아급성 경화 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 엉킴형 치매(Tangle-only dementia), 다발성 경색 치매(multi-infarct dementia), 허혈성 뇌졸중(Ischemic stroke), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy, CTE), 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury, TBI), 뇌졸중 및 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증(Stroke and White matter Tauopathy with globular glial inclusions) 을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 석시네이트 염(succinate salts) 및 이의 용매화물 (Solvates)의 결정화도, 안정성, 용해도 등의 물리화학적 특성은 고형 및 액상 약물 제형과 관련하여 특히 유용하다.

따라서, 상기 기재한 바와 같이 타우 단백질의 대사를 바로잡고 PGRN신경 영양 인자의 수준을 높이고 신경 염증을 줄이기 위해, 본 발명의 석시네이트염(SUCCINATE SALTS) 및 이의 용매화물(Solvates)은 특히 타우병증 및 파킨슨병을 포함하는 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약으로서 유용하다.

따라서 본 발명의 석시네이트 염은 신경퇴행성 질환 및 타우 단백질 인산화의 기능 장애가 관찰되는 모든 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약으로서 유용하며, 타우병증(tauopathies)을 포함하되, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 양태에 있어서, 본 발명은 타우병증을 포함하되 이에 국한되지 않는 신경 퇴행성 질환 및 타우 단백질 인산화 기능 장애가 관찰되는 질환 중에서 선택된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 석시네이트 염에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 또한 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis) 및 괌의 파킨슨병-치매 복합성(Parkinsonism-dementia complex of Guam), 은친화 과립성 질환(Argyrophilic grain disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 피질기저핵 변성(Corticobasal degeneration), 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 석회화를 동반한 확산성 신경원섬유엉킴(Diffuse neurofibrillary tangles with calcification), 가족성 영국 치매(Familial British Dementia), 가족성 덴마크 치매(Familial Danish Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia, FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(Frontotemporal dementia-granulin subtype, FTD-GRN), 게르스트만-슈트라이슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker isease), 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism), 할러보르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 내포체 근염(Inclusion body myositis), 다발성 시스템 위축(Multiple system atrophy), 스타이너트 근긴장성 이영양증(Steinert Myotonic dystrophy), II형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type II), 뇌철분축적을 가진 신경퇴화(Neurodegeneration with brain iron accumulation), C형 니만-피크병(Niemann-Pick disease of type C), 신경섬유 엉킴이 있는 비과만 운동뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles), 파제트병(Paget's disease), 픽병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism), 진행성 피질하 신경교증(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), SLC9A6-관련 정신 지체(SLC9A6-related mental retardation), 아급성 경화 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 엉킴형 치매(Tangle-only dementia), 다발성 경색 치매(multi-infarct dementia), 허혈성 뇌졸중(Ischemic stroke), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy, CTE), 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury, TBI), 뇌졸중 및 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증(White matter Tauopathy with globular glial inclusions)로부터 선택된 질병을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민(N-(3-(4-(3-(diisobutylamino)propyl)piperazin-1-yl)propyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine)의 석시네이트 염 또는 이의 제약상 허용되는 용매화물에 관한 것이다. 바람직하게는, 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 은친화 과립성 질환(Argyrophilic grain disease), 피질기저핵 변성(Corticobasal degeneration), 석회화를 동반한 확산성 신경원섬유엉킴(Diffuse neurofibrillary tangles with calcification), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia, FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(Frontotemporal dementia-granulin subtype, FTD-GRN), 피크병 (Pick's disease), 진행성 피질하 신경교증(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), 엉킴형 치매(Tangle-only dementia) 및 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증(White matter Tauopathy with globular glial inclusions)로부터 선택된 것이다. 더욱 바람직하게는, 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia, FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(Frontotemporal dementia-granulin subtype, FTD-GRN), 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), 엉킴형 치매(Tangle-only dementia) 및 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증(White matter Tauopathy with globular glial inclusions)으로부터 선택된 것이다. 가장 바람직하게는, 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP)로부터 선택된 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 또한 타우병증으로부터 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 특히 상기 인용된 것뿐만 아니라, 이를 필요로 하는 환자에게 약제학적 유효량의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 본 발명에 기술된 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 일 양태에서, 질병은 알츠하이머병 및 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy, PSP)로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명에 기재된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물의 용도, 타우병증으로부터 선택되는 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서, 특히 상기 인용된 것뿐만 아니라 이의 실시예를 제공한다. 특정 일 양태에 있어서, 질병은 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 진핵성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy, PSP)로부터 선택된다.

다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 또한 환자에게서 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases) 및 타우 단백질 인산화의 기능 장애가 관찰되는 질병으로부터 선택되는 질병의 발병을 지연시키는데 사용하기 위한 본 발명의 석시네이트 염에 관한 것이며, 타우병증(tauopathies)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특정 일 양태에 있어서, 본 발명은 또한 환자에게서 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis) 및 괌의 파킨슨병-치매 복합성(Parkinsonism-dementia complex of Guam), 은친화 과립성 질환(Argyrophilic grain disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 피질기저핵 변성(Corticobasal degeneration), 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 석회화를 동반한 확산성 신경원섬유엉킴(Diffuse neurofibrillary tangles with calcification), 가족성 영국 치매(Familial British Dementia), 가족성 덴마크 치매(Familial Danish Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia, FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(Frontotemporal dementia-granulin subtype, FTD-GRN), 게르스트만-슈트라이슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism), 할러보르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 내포체 근염(Inclusion body myositis), 다발성 시스템 위축(Multiple system atrophy), 스타이너트 근긴장성 이영양증(Steinert Myotonic dystrophy), II형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type II), 뇌철분축적을 가진 신경퇴화(Neurodegeneration with brain iron accumulation), C형 니만-피크병(Niemann-Pick disease of type C), 신경섬유 엉킴이 있는 비과만 운동뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles), 파제트병(Paget's disease), 픽병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism), 진행성 피질하 신경교증(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), SLC9A6-관련 정신 지체(SLC9A6-related mental retardation), 아급성 경화 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 엉킴형 치매(Tangle-only dementia), 다발성 경색 치매(multi-infarct dementia), 허혈성 뇌졸중(Ischemic stroke), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy, CTE), 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury, TBI), 뇌졸중 및 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증(Stroke and White matter Tauopathy with globular glial inclusions)로부터 선택되는 질병의 개시를 지연시키는데 사용하기 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 제약상 허용되는 용매화물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 은친화 과립성 질환(Argyrophilic grain disease), 피질기저핵 변성(Corticobasal degeneration), 석회화를 동반한 확산성 신경원섬유엉킴(Diffuse neurofibrillary tangles with calcification), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia, FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(Frontotemporal dementia-granulin subtype, FTD-GRN), 픽병(Pick's disease), 진행성 피질하 신경교증(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), 엉킴형 치매(Tangle-only dementia), 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증(Stroke and White matter Tauopathy with globular glial inclusions)으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 질병은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia, FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(Frontotemporal dementia-granulin subtype, FTD-GRN), 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), 엉킴형 치매(Tangle-only dementia) 및 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증(Stroke and White matter Tauopathy with globular glial inclusions)으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 질병은 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP)로부터 선택된다.

다시 말해서, 본 발명은 타우병증, 특히 상기 인용된 질병 및 이의 구현예로부터 선택되는 질병의 발병을 환자에서 지연시키는 방법을 제공하고, 특히 상기 인용된 것 및 이의 실시양태는 이를 필요로 하는 환자에게 약제학적으로 유효한 양의 본 발명의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 일 양태에 있어서, 질병은 알츠하이머병 및 진핵성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy, PSP)로부터 선택된다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 또한 환자에서 타우병증, 특히 상기 인용된 질환 및 그의 실시양태로부터 선택된 질환의 개시를 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 파킨슨병(Parkinson's disease)의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물에 관한 것이다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 또한 파킨슨병의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하며, 상기 기술된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물의 약학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 또한 파킨슨병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 기재된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물의 용도를 제공한다.

특정 일 양태에 있어서, 본 발명은 또한 환자에게 파킨슨병의 발병을 지연시키는데 사용하기 위한 본 발명에 정의된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물에 관한 것이다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 약제학적 유효량의 본 발명의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서의 파킨슨병의 개시를 지연시키는 방법을 제공한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 또한 환자에게 파킨슨병의 발병을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 기재된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가적인 특징에 따르면, 환자에게 병적인 타우 단백질 인산화(Tau protein phosphorylation)를 억제하는 방법을 제공하며, 바람직하게는 온혈 동물, 더욱 바람직하게는 본 발명의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시테이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물의 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 이러한 치료를 필요로 하는 인간에게 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 환자, 바람직하게는 온혈 동물에서 신경영양 인자 프로그래눌린(progranulin, PGRN)의 수준을 증가시키면서 병리학적 타우 단백질 인산화를 억제하는 방법을 제공하고, 보다 바람직하게는 이러한 치료를 필요로 하는 인간에게 유효량의 본 발명의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 기재된 바와 같은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 및/또는 보조제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 양태에 있어서, 본 발명은 또한 활성 성분으로서 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물 이외에 추가 치료제 및/또는 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물을 포함한다.

일 양태에 있어서, 본 발명의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 (SUCCINATE SALTS), 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 용매화물은 병용 요법의 일부로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범위 내에는 활성 성분으로서 본 발명의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물 이외에 추가의 치료제 및/또는 활성 성분을 함유하는 조성물 및 약제의 공동-투여를 포함하는 실시예가 포함된다. 종종 "병용 요법"이라고 하는 이러한 다중 약물 요법은 모든 신경퇴행성 질환, 특히 타우병증 또는 파킨슨병의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 이러한 치료제 조합의 사용은 치료가 필요한 환자 또는 이러한 환자가 될 위험이 있는 환자 내에서 상기 언급한 신경퇴행성 질환의 치료와 관련하여 특히 적절하게 사용될 수 있다.

치료 효능 요건의 요구사항 외에도 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염(SUCCINATE SALTS) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물(Solvates)에 추가하여 활성제의 사용을 필요로 할 수 있는 것을 더 할 수 있으며, 보조 요법을 나타내는 활성 성분을 포함하는 약물 조합의 사용을 강요 또는 적극 권장할 수 있는 추가적인 근거가 있을 수 있으며, 즉, 이들은 본 발명의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 용매화물에 의해 수행되는 기능을 보완하고 보충할 수 있다. 보조 치료의 목적으로 사용되는 적합한 보충 치료제는 병리학적 단백질 타우 인산화 및/또는 신경염증에 의해 매개되거나 관련된 질병 또는 상태를 직접 치료 및/또는 예방하는 대신에, 기본 또는 근본적인 병리학적 단백질 타우 인산화 및/또는 신경염증 조절 질병 또는 상태를 간접적으로 동반한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따르면, N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염, 이의 약제학적으로 허용 가능한 용매화물은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 진행성 핵상 마비(Progressive Supranuclear Palsy, PSP) 및 파킨슨병(Parkinson's disease)과 같은 신경퇴행성 질환 치료에 사용되는 다른 약물과 병용 요법으로 사용될 수 있다. 특히, 화학식 II의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물은, 도네페질(CAS n° 120014-06-4) 및 이들의 염 및 용매화물, 갈란타민(CAS n° 357-70-0)과 이들의 염 및 용매화물, 리바스티그민(CAS n° 123441-03-2) 및 이들의 염 및 용매화물, 타크린(CAS n° 321-64-2) 및 이들의 염 및 용매화물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아닌 아세틸콜린에스테라제 억제제와 병용하여, 또는 메만틴(CAS n° 19982-08-2) 및 이의 염 및 용매화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 NMDA 글루타메이트 수용체 길항제와 병용하여, 또는 후퍼진(huperzine) A(CAS n°102518-79-6 ) 및 이들의 염과 용매화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 이중 아세틸콜린에스테라제 억제제 및 NMDA 글루타메이트 수용체 길항제와 병용하여, 또는 리라글루티드(CAS n° 204656-20-2) 및 이들의 염 및 용매화물, 엑세나타이드(CAS n° 141732-76-5) 및 이들의 염 및 용매화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 글루카콘 유사 펩티드 1(GLP-1) 작용제와 병용하여, 또는 아시트레틴(CAS n° 55079-83-9) 및 이들의 염 및 용매화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 레티노이드와 병용하여, 또는 닐바디핀(CAS n° 75530-68-6)과 그 염 및 용매화물, 니트렌디핀(CAS n° 39562-70-4)과 그 염 및 용매화물, 니모디핀(CAS n°66085-59-4)과 그의 염 및 용매화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 칼슘 채널 차단제(CCB)와 병용하여, 또는 발사르탄(CAS n° 137862-53-4) 및 이들의 염 및 용매화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 안지오텐신 수용체 차단제와 병용하여, 또는 미노사이클린(CAS n° 10118-90-8)과 이들의 염 및 용매화물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 테트라사이클린 항쟁제와 병용하여, 또는 아두카누맙(aducanumab), 바피네우주맙(bapineuzumab), 솔라네주맙(solanezumab), 간테네루맙(gantenerumab), 크레네주맙(crenezumab), BAN2401, GSK933776, AAB-003, SAR228810, BIIB037/BART, ABBV-8E12, BIIB092 및 UCB0107으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단일 클론 항체와 병용하여, 또는 글리코시다제 (O-GlcNAcase) 억제제와 병용하여, 또는 선택적으로 카르보도파(carbodopa)와 조합된 레보도파(levodopa)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 도파민 전구약물과 병용하여, 또는 프라미펙솔, 로티고틴, 로피니롤, 아만타딘을 포함하나, 이에 한정되지 않는 도파민 수용체 작용제와 병용하여, 또는 벤즈트로핀(benztropine), 트리헥시페니딜(trihexyphenidyl)과 같은 항콜린제(anticholinerfics)과 병용하여, 또는 사피나미드(safinamide), 셀레길린(selegiline), 라사길린(rasagiline)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 MAO-B 억제제와 병용하여, 또는 엔타카폰(entacapone), 오피카폰(opicapone) 및 톨카폰(tolcapone)을 포함하는 COMT 억제제와 병용하여 보조 요법으로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 치료 방법 및 약제학적 조성물은 단일 요법에서 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물을 사용할 수 있다. 그러나, 상기 방법 및 조성물은 또한 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 하나 이상의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물이 하나 이상의 다른 치료제와 병용 투여되는 다중 요법에 사용될 수 있다.

전술한 일 양태에 있어서, N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물 및 기타 치료 활성제의 조합은 투여 형태 측면에서 개별적으로 또는 서로 함께, 관리 시간 측면에서 연속적으로 또는 동시에 투여할 수 있다. 따라서, 하나의 성분 제제의 투여는 다른 성분 제제의 투여 이전, 동시 또는 이후 일 수 있다.

일반적으로, 약제학적 용도로서, N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 염 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 용매화물은 적어도 하나의 본 발명의 석시네이트 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 및/또는 보조제, 및 임의의 하나 이상의 추가 치료제 및/또는 활성 성분으로 제형화 될 수 있다.

비제한적인 일 예에 있어서, 약제학적 조성물은 경구 투여, 비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내 주입), 국소 투여, 흡입 투여, 피부 패치, 임플란트, 좌약 등에 의해 적합하게 투여될 수 있는 제형일 수 있다. 이러한 적합한 투여 형태(투여 방식에 따라 고체, 반고체 또는 액체일 수 있음) 및 이의 제조에 사용하기 위한 방법 및 담체, 희석제 및 부형제는 당업자에게 명백할 것이며; Remington's Pharmaceutical Sciences의 최신판을 참조하면 된다. 약제학적 조성물은 고체 형태로 제형화되고 사용 전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 본 발명의 석시네이트 염 또는 이의 용매화물의 바람직한 약제학적 조성물은 경구 투여에 적합한 고체 투여 형태이다.

일부 바람직한 일 양태에 있어서, 비-제한적인 일예로 정제(tablets), 알약(pills), 파우더(powders), 로젠지(lozenges), 향낭(sachets), 카세(cachets), 엘릭시르(elixirs), 현탁액(suspensions), 유제(emulsions), 용액(solutions), 시럽(syrups), 에어로졸(aerosols), 연고(ointments), 크림(cremes), 로션(lotions), 연질 및 경질 젤라틴 캡슐(soft and hard gelatin capsules), 좌약(suppositories), 점적제(drops), 볼루스로서 투여 및/또는 연속 투여를 위한 멸균 주사액 및 멸균 포장 분말(sterile injectable solutions and sterile packaged powders)(이는 일반적으로 사용 전에 재구성됨)을 포함하며, 이는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 한천, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 트라가칸트, 젤라틴, 규산칼슘, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 셀룰로오스, (멸균)수, 메틸셀룰로오스, 메틸 및 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산마그네슘, 식용유, 식물성 오일 및 미네랄 오일 또는 이들의 적합한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 석시네이트 염 및 이의 용매화물의 특히 바람직한 투여 형태는 연질 및 경질 캡슐, 특히 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 바람직하게는 경질 젤라틴 캡슐이며, 특히 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 바람직하게는 경질 젤라틴 캡슐이며, 적어도 하나의 미세결정성셀룰로오스 부형제(microcrystalline cellulose excipient), 특히 Avicel® PH101와 함께 제형화 된다. 약제학적 조성물은 약제학적 제형에 임의로 통상적으로 사용되는 다른 물질인 예를 들어, 윤활제(lubricating agents), 습윤제(wetting agents), 유화제 및 현탁제(emulsifying and suspending agents), 분산제(dispersing agents), 붕해제(disintegrating agents), 안정제(stabilizing agents), 등장제(isotonic agents), 증량제(bulking agents), 충전제(fillers), 보존제(preserving agents), 감미제(sweetening agents), 향미제(flavouring agents), 향료(perfuming agents), 착색제(colouring agents), 파라벤(parabens), 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀(phenol), 소르브산(sorbic acid) 등과 같은 항균제(antibacterial agents) 및/또는 항진균제, 분배제(dispensing agents), 유동 조절제(flow regulators), 이형제(release agents)를 함유할 수 있다. 조성물은 또한 그 안에 함유된 활성 화합물(들)의 신속, 지속 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 단위 투여 형태이고, 예를 들어, 박스(box), 블리스터(blister), 바이알(vial), 병(bottle), 봉지(sachet), 앰플(ample) 또는 임의의 다른 적합한 단일-용량 또는 다중-용량 홀더 또는 용기(적절하게 라벨이 붙어 있을 수 있음)에 포장될 수 있으며; 선택적으로 제품 정보 및/또는 사용 지침이 포함된 하나 이상의 전단지와 함께 포장될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 적어도 하나의 화합물의 이러한 단위 투여량은 0.05 내지 1000 mg, 일반적으로 1 내지 500 mg, 예를 들어, 약 10, 25, 50, 100, 200, 300 또는 400 mg 포함될 수 있다.

일반적으로, 예방 또는 치료할 상태 및 투여 경로에 따라, 본 발명의 활성 화합물은 일반적으로 킬로그램 당 0.01 내지 100 mg, 더 자주는 0.1 내지 50 mg, 예를 들어, 환자 체중 1 kg당 약 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 또는 25mg/일로 투여될 수 있으며, 이는 1일 1회 투여, 1회 이상의 1일 투여로 나누어 투여되거나 기본적으로 지속적으로 투여되거나, 예를 들어, 점적 주입법(drip infusion)으로 투입될 수 있다.

화학식 II의 화합물에 대한 모든 언급은 용매화물, 특히 이의 수화물, 다중 다성분 복합체 및 액정에 대한 언급을 포함한다.

본 출원을 통해 공개된 화합물은 ChemDraw®Ultra 버전 11.0(CambridgeSoft, Cambridge, MA, USA)을 사용하여 명명되었다.

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 유리 염기는 WO 2006/051489에 개시된 바와 같이 얻을 수 있다. 석시네이트 염 및 이의 용매화물은 침전, 결정화, 재결정화, 동결건조, 상 전이 또는 이온 교환 수지를 수반하는 기술과 같은 당업계에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다.

정의

아래의 정의와 설명은 명세서, 도면 및 청구항을 포함하여 전체 출원에서 사용된 용어에 대한 것이다.

본 발명의 화합물을 설명할 때, 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 다음 정의에 따라 해석되어야 한다.

본 명세서에서 본 발명의 화합물에 대한 언급이 달리 명시되지 않는 한, 화학식 II의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 용매화물을 의미한다. 화학식 II의 화합물에 대한 모든 언급은 약학적으로 허용되는 용매화물 및 이의 모든 결정 형태를 포함한다.

용어 "투여" 또는 그 변형(예를 들어, "투여")은 상태, 증상 또는 질병을 치료 또는 예방하고자 하는 환자에게 활성제 또는 활성 성분 (예를 들어, N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민)을 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 구성의 일부로 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서 용어 “알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease)”은 산발성 및 가족성 유형을 포함하되 이에 국한되지 않는 모든 유형의 알츠하이머병을 지칭한다.

본 발명에 있어서 용어 “억제(inhibiting)”는 부분적인 억제 또는 감소와 완전한 억제를 의미한다.

용어 “인간”은 성별과 모든 발달 단계(예를 들어, 신생아, 유아, 미성년자, 청소년, 어른)에 있는 대상을 모두 의미한다.

용어 “환자”는 의료 서비스를 받거나, 받고 있거나, 의료 절차의 대상이 되거나, 받을 예정인 온혈 동물, 더 바람직하게는 사람을 의미한다.

“약제학적으로 허용되는”이란 의약품 조성물의 성분이 서로 호환되고 환자에게 해롭지 않다는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서 용어 “예방(prevent)”, “방지(preventing)”, 및 “예방(prevention)”은 상태 또는 질병 및/또는 그에 수반되는 증상의 발병을 지연 또는 예방하고, 환자가 상태 또는 질병에 걸리지 않도록 하거나, 환자의 상태 또는 질병에 걸릴 위험을 줄이는 방법을 의미한다.

본 발명에 있어서 용어 “세스퀴”는 1.5 등가물을 의미하며, 화합물의 세스퀴 석시네이트 염은 석신산이 유리 염기 형태의 화합물과 비교하여 3:2의 비율로 존재하는 석시네이트 부가염을 의미한다.

본 발명에 있어서 용어 “용매화물(solvate)”은 에탄올과 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 용매 분자의 화학량론적 또는 화학량론적 이하(sub-stoichiometric) 양을 포함하는 화합물을 설명하기 위해 사용된다. "수화물"이라는 용어는 상기 용매가 물일 때 사용된다. 약제학적으로 허용되는 용매 분자는 본 발명의 화합물과 공결정화(co-crystallized)될 수 있고, 및/또는 그 고체의 결정상 및/또는 비정질 상에 존재할 수 있고, 및/또는 이에 흡착될 수 있다.

본 발명에 있어서 화합물은 본 명세서상에 정의된 화학식 II의 화합물, 모든 다형성 및 이의 결정 습성, 이의 전구체 및 화학식 II의 동위원소 표지 화합물을 포함한다.

본 발명에 있어서 용어 "타우병증(tauopathy)"은 타우 단백질의 비정상적인 대사, 특히 타우 단백질의 비정상적인 인산화 및/또는 과인산화 및/또는 세포, 조직 또는 체액, 바람직하게는 뇌 조직 및/또는 뇌척수액에서 타우 또는 타우 이소형 또는 타우 폴리펩티드 및/또는 병리학적인 형태의 타우의 높은 수준(예를 들어, 정상 대조 수준보다 높음)의 존재를 특징으로 하는 장애를 지칭한다. 보다 구체적으로, 타우병증은 비정상적으로 변형된 타우 단백질의 세포 내 응집체(예를 들어, 신경섬유 엉킴 (neurofibrillary tangles, NFT)), 픽 바디, 성상세포 술 및/또는 근육 내포체, 바람직하게는 적어도 신경섬유 엉킴(NFT)이 관찰되는 장애를 말한다.

본 발명에 있어서 용어 “치료적인 유효량(therapeutically effective amount)(또는 더욱 간단하게는 “유효량”)”은 투여 대상/대상 환자에게 원하는 치료 또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 활성제 또는 활성 성분(예를 들어, N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민)의 양을 의미한다.

본 발명에 있어서 용어 “치료(treat)”, “치료(treating)” 및 “치료(treatment)”는 상태나 질병 및/또는 그에 수반되는 증상을 완화(alleviating), 약화(attenuating) 또는 후퇴하게 되는(arrogating)하는 것을 의미한다.

본 발명은 다음의 실시예를 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다. 이러한 실시예는 본 발명의 특정 실시예를 대표하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.

도 1은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민(N-(3-(4-(3-(diisobutylamino)propyl)piperazin-1-yl)propyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine) 디-설페이트 염의 결정 형태인 형태 A의 XRPD 2θ회절도를 보여준다.
도 2는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 디-설페이트 염의 결정 형태인 형태 B의 XRPD 2θ회절도를 보여준다.
도 3은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴 석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 XRPD 2θ회절도를 보여준다.
도 4는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 트리스-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 2의 XRPD 2θ회절도를 보여준다.
도 5는 결정 형태인 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 반-수화물(hemi-hydrate)(물 0.5 당량)의 XRPD 2θ회절도를 보여준다.
도 6은 결정 형태인 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 단일-수화물(mono-hydrate)(물 1.1 당량)의 XRPD 2θ회절도를 보여준다.
도 7은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 HPLC 크로마토그램을 보여준다.
도 8은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 TG/DT 써모그램(thermogram)을 보여준다.
도 9는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1(첫번째 가열 사이클)의 DSC 써모그램을 보여준다.
도 10은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 GVS 등온선 플롯을 보여준다.
도 11은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 GVS 동역학 플롯을 보여준다.
도 12는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 GVS 후 XRPD 2θ회절도를 보여준다.
도 13은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 FT-IR 스텍트럼을 보여준다.
도 14는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 ¹H-NMR 스펙트럼(DMSO-d₆, 500.12 MHz)을 보여준다.
도 15는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 ¹³C 퀸트-NMR 스펙트럼(DMSO-d₆, 500.12 MHz)을 보여준다.
도 16은 7일 안정성 테스트에서 얻은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1의 XRPD 2θ회절도를 보여준다.
도 17은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 1 배치의 XRPD 2θ 회절도를 오버레이(overlay)한 것을 보여준다.
도 18은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 트리스-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 2의 TG/DT 써모그램을 보여준다.
도 19는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 트리스-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 2의 DSC 써모그램을 보여준다.
도 20은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 트리스-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 2의 ¹H-NMR 스펙트럼을 보여준다(MeOH-d₄, 500.12 MHz)
도 21은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 트리스-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 2의 DVS 등온선 플롯을 보여준다.
도 22는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 트리스-석시네이트 염의 결정 형태인 형태 2의 DVS 동역학 플롯을 보여준다.
도 23은 경질 젤라틴 캡슐로 제조되어 RT에서 보관된 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 형태 1과 Avicel^® PH101의 혼합물의 XRPD(4 - 35° 2θ)회절도를 보여준다.
도 24는 경질 젤라틴 캡슐로 제조되어 40 ℃ / 75% RH에서 보관된 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 형태 1과 Avicel^® PH101의 혼합물의 XRPD(4 - 35° 2θ)회절도를 보여준다.
도 25는 Aβ1-42 손상 후 72시간 동안 미세아교세포로 배양한 피질 신경세포에서 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 형태 1이 생존(A), 뉴라이트 네트워크(B) 및 타우 인산화(AT100)에 미치는 영향(C)을 보여준다. 결과는 대조군(CTR) 조건의 평균 ± SEM (n = 4-6)으로 백분율로 표시된다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA)에 이어 피셔 테스트(Fisher's test)가 뒤따른다. *; ** 또는 ***는 p< 0.05를 나타낸다; p<0.01 또는 p<0.001 vs Aβ_1-42 또는 ### vs CTR, p<0.05는 중요한 것으로 간주된다.
도 26은 Aβ1-42 손상 후 72시간 동안 미세아교세포로 배양한 피질 신경세포에서 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 형태 1이 미세아교세포 활성화(A) 및 PGRN 방출(B)에 미치는 영향을 보여준다. 결과는 대조군(CTR) 조건의 평균± SEM (n = 4-6)으로 백분율로 표시된다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA)에 이어 피셔 테스트(Fisher's test)가 뒤따른다. *; ** 또는 ***는 p< 0.05를 나타낸다; p<0.01 또는 p<0.001 vs Aβ_1-42 또는 ### vs CTR, p<0.05는 중요한 것으로 간주된다.
도 27은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 형태 1의 사전 또는 동시 배양이 MPP+ 손상 후 48시간 동안 원발성 중뇌 뉴런 TH(+)의 생존(A), 뉴라이트 네트워크(B) 및 α-시누클레인 응집(C)에 미치는 영향을 보여준다. 결과는 대조군(CTR) 조건의 평균 ± SEM (n = 4-6)으로 백분율로 표시된다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA)에 이어 피셔 테스트(Fisher's test)가 뒤따른다. #### p<0.0001 대비 컨트롤; *<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 또는 ****p<0.0001 대비 MPP⁺.
도 28은 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 형태 1의 사전 또는 동시 배양이 로테논(rotenone) 손상 후 24시간 동안 원발성 중뇌 뉴런 TH(+)의 생존(A), 뉴라이트 네트워크(B) 및 α-시누클레인 응집(C)에 미치는 영향을 보여준다. 결과는 대조군(CTR) 조건의 평균 ± SEM (n = 4-6)으로 백분율로 표시된다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA)에 이어 피셔 테스트(Fisher's test)가 뒤따른다. #### p<0.0001 대비 대조군; *<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 또는 ****p<0.0001 대비 로테논.

화학 실시예

다음 약어가 본 명세서상 전체에 걸쳐 사용된다: ℃: 섭씨 온도(Celsius degrees), a_w: 수분 활성도(water activity), DMSO: 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxyde), DSC: 시차 주사 열량계(differential scanning calorimetry), GVS: 중량 증기 수착(gravimetric vapour sorption), δ: ppm으로 표현되는 NMR 화학적 이동, eq: 당량(s), EDTA: 에틸렌디아민 테트라-아세트산(ethylenediamine tetra-acetic acid), eq.: 당량(equivalent(s)), g: 그램, h: 시간, HDPE: 고밀도 폴리에틸렌(high density polyethylene), HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography), Hz: 헤르츠(Hertz), FT-IR: 푸리에 변환 적외선(Fourier-transform infrared), L: 리터, M: mol/L, mM: mmol/L, μM: μmol/L, Me: 메틸(methyl), MEK: 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone), mg: 밀리그램 , MHz: 메가헤르츠(megahertz), min: 분, mL: 밀리리터, mm: 밀리미터, mol: 몰, mmol: 밀리몰, μmol: 마이크로몰, MPP+: 1 -메틸-4-페닐피리딘-1-아이엄(1-methyl-4-phenylpyridin-1-ium), nm: 나노미터, NMR: 핵 자기 공명, PBS: 인산염 완충 식염수, PLM: 편광 현미경(polarized light microscopy), PGRN: 프로그래눌린(progranulin), ppm: 백만분율(party per million), RH: 상대적 습도(relative humidity), RPM: 분당 라운드(round(s) per minute), rt: 체류 시간(retention time), RT: 실온(ca 15-25 °C), s: 초, TFA: 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), TG/DTA: 열중량/시차 열 분석(thermogravimetric/differential thermal analysis), UV: 자외선, v: 부피, VH-XRPD: 가변 습도 X선 분말 회절(Variable Humidity X-Ray Powder Diffraction), WB : 웨스턴 블롯, XRPD: X선 분말 회절(X-ray powder diffraction).

보고된 모든 온도는 섭씨(°C)로 표시된다. 달리 명시되지 않는 한 모든 반응은 실온(RT)에서 수행되었다.

본 발명에 사용된 실험 설정 또는 정제 절차는 구체적으로 상세하게 기술되지 않은 경우 당업자에게 알려져 있는 것으로 간주되며 다음과 같은 표준 참조 설명서에 기술되어 있다: i) Gordon, A. J.; Ford, R. A. “The Chemist's Companion - A Handbook of Practical Data, Techniques, and References”, Wiley: New York, 1972; ii) Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, Pearson Prentice Hall: London, 1989; iii) P. Heinrich Stahl and Camille G. Wernuth 'Handbook of Pharmaceutical Salts', Wiley VCH.

HPLC 분석.

방법 A:

기기(Instrument): Dionex Ultimate 3000

컬럼(Column): Supelco Ascentis Express C18 15 x 4.6mm 2.7μm

컬럼 온도(Column Temperature): 50°C

자동시료주입기 온도(Autosampler Temperature): 실온

UV 파장(UV wavelength): 275nm

주입량(Injection Volume): 20μL

유속(Flow Rate): 1mL/분

이동상 A(Mobile Phase A): 물 중 0.1% TFA

이동상 B(Mobile Phase B): 아세토니트릴 중 0.1% TFA

농도구배 프로그램(Gradient program):

방법 B:

여러가지로, Zorbax Extend C18 150 x 4.6mm 3.5μm 컬럼을 사용하여 위와 동일한 매개변수로 HPLC 분석을 수행하였다.

NMR 분석

NMR 실험은 양성자와 탄소에 대해 500.12MHz에서 작동하는 DCH 저온탐침이 장착된 Bruker AVIIIHD 분광계(spectrometer)로 수행하였다. 실험은 중수소화된 DMSO에서 수행하였고 각 샘플은 ca. 10　mM 농도로 준비하였다. 추가 분석은 선택적으로 D₂O 및/또는 methanol-d₄에서 수행하였다. 화학적 이동은 백만분율, (ppm, δ 단위)로 표시된다. 결합 상수는 Hz로 표시된다. NMR 스펙트럼에서 관찰되는 다중도에 대한 약어는 다음과 같다: s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), m (multiplet), br (broad).

UV 분석(캡슐 혼합 균일성 전용)

경로 길이가 10mm인 석영 큐벳(quartz cuvette)을 사용하여 샘플을 측정하였다. 초기에는 UV 스캔으로 물에서 제조된 농도 ca. 20　μg/mL를 갖는 염 용액의 190 nm 내지 400 nm 범위에 걸쳐 UV 스캔을 수행하였다. 베이스라인 보정을 위해 동일한 용매를 사용하였다. 고정된 280 nm 파장은 주로 염 제제의 혼합 균일성을 확인하는데 사용하였다.

X선 분말 회절(XRPD)

XRPD 분석은 PIXcel 검출기(128개 채널)가 장착된 PANalytical X'pert pro에서 수행하였으며 샘플을 3에서 35° 2θ 사이에서 스캔하였다. 물질을 부드럽게 분쇄하여 응집물(agglomerates)을 방출하고 Mylar 폴리머 필름(Mylar polymer film)이 있는 다중 웰 플레이트에 로드하여 샘플을 지지하였다. 그런 다음 다중-웰 플레이트(multi-well plate)를 회절계에 넣고 40kV/40mA 발생기 설정을 사용하여 투과 모드(단계 크기 0.0130° 2θ, 단계 시간 18.87초)에서 실행되는 Cu Kα 방사선(α₁ λ = 1.54060 Å; α₂ = 1.54443 Å; β = 1.39225 Å; α₁ : α₂ ratio = 0.5)을 사용하여 분석하였다. HighScore Plus 4.7 데스크톱 애플리케이션(PANalytical, 2017)을 사용하여 데이터를 시각화하고 이미지를 생성하였다.

열중량/시차 열 분석(Thermogravimetric/Differential Thermal Analysis, TG/DTA)

약 5 mg의 재료를 개방형 알루미늄 팬에 칭량하고 동시 열중량/시차 열 분석기(TG/DTA)에 넣고 실온에서 유지하였다. 그런 다음 샘플을 10°C/분의 속도로 20°C에서 300°C로 가열했으며, 이 시간 동안 샘플 무게의 변화를 모든 차등 열 이벤트(DTA; differential thermal events)와 함께 기록하였다. 질소는 300 cm³/min의 유량으로 퍼지 가스로 사용되었다.

시차주사열량계(Differential Scanning Calorimetry, DSC)

약 5 mg의 재료를 알루미늄 DSC 팬에 칭량하고 구멍 뚫린 알루미늄 뚜껑으로 밀폐하지 않고 밀봉하였다. 그런 다음 샘플 팬을 Seiko DSC6200(냉각기가 장착됨)에 넣고 20 ℃로 냉각하였다. 안정적인 열 흐름 응답이 얻어지면 샘플과 기준을 10 ℃/분의 속도로 최대 180 ℃까지 가열하고 그 결과 열 흐름 응답을 모니터링하였다. 질소는 50 cm³/min의 유속으로 퍼지 가스로 사용되었다.

적외선 분광법(Infrared Spectroscopy, IR)

적외선 분광법은 Bruker ALPHA P 분광계(spectrometer)로 수행되었다. 분광계 플레이트 중앙에 충분한 재료를 놓고 다음 매개변수를 사용하여 스펙트럼을 얻었다:

해상도(Resolution): 4cm^-1

백그라운드 스캔 시간(Background Scan Time): 16 스캔

샘플 스캔 시간(Sample Scan Time): 16 스캔

데이터 수집(Data Collection): 4000~400cm^-1

결과 스펙트럼(Result Spectrum): 투과율

소프트웨어(Software): OPUS 버전 6

중량 증기 수착(Gravimetric Vapour Sorption, GVS)

약 10-20 mg의 샘플을 메시 증기 수착 저울 팬(mesh vapour sorption balance pan)에 넣고 Hiden Analytical의 IGASorp 수분 수착 분석기 저울에 넣었다. 샘플은 25 ℃에서 안정적인 중량이 달성될 때까지(98% 단계 완료, 최소 단계 길이 30분, 최대 단계 길이 60분) 각 단계에서 샘플을 유지하면서 40~90% 상대 습도(RH)에서 10% 증가분(increments)으로 램핑 프로파일에 적용되었다. 흡착 주기(sorption cycle) 완료 후, 샘플을 동일한 절차를 사용하여 0% RH로 건조하고 마지막으로 40% RH의 시작점으로 되돌렸다. 2사이클을 수행하였다. 흡착/탈착 주기 동안의 중량 변화를 플롯(plot)하여 샘플의 흡습 특성을 결정할 수 있도록 하였다.

동적 증기 수착(Dynamic Vapour Sorption, DVS)

대략 10-20 mg의 샘플을 메시 증기 수착 저울 팬에 놓고 표면 측정 시스템에 의해 고유 동적 증기 흡착 저울에 넣었다. 샘플은 25 ℃에서 안정적인 중량(dm/dt 0.004%, 최소 단계 길이 30분, 최대 단계 길이 500분)에 도달할 때까지 각 단계에서 샘플을 유지하면서 40~90% 상대 습도(RH)에서 10% 증분으로 램핑 프로파일에 적용되었다. 흡착 주기 완료 후 샘플을 동일한 절차를 사용하여 0% RH로 건조시킨 다음 두 번째 흡착 주기를 다시 40% RH로 건조하였다. 2사이클을 수행하였다. 흡착/탈착 주기 동안의 중량 변화를 플롯하여 샘플의 흡습 특성을 결정할 수 있도록 하였다. XRPD 분석은 남아있는 모든 고체에 대하여 수행하였다.

가변 습도 X선 분말 회절(Variable Humidity X-Ray Powder Diffraction, VH-XRPD)

VH-XRPD 분석은 습도 챔버가 장착된 Philips X'Pert Pro 다목적 회절계(VH-XRPD analysis was carried out on a Philips X'Pert Pro )에서 수행하였다. 샘플은 40 kV / 40 mA 생성기 설정을 사용하여 Bragg-Brentano 형상(스텝 크기 0.008 °2θ)에서 실행되는 Cu K 방사선(A: α1 λ = 1.54060 Å; α2 = 1.54443 Å; β = 1.39225 Å; α1 : α2 ratio = 0.5)을 사용하여 4 및 35.99 °2θ 사이에서 스캔하였다. 측정은 50%, 60%, 70%, 80% 및 90%에서 수행하였다. 샘플은 1시간 30분 동안 90%에서 유지하였다. 측정은 30분 간격으로 수행하였다.

달리 명시되지 않는 한 용매 및 시약은 상업적 공급업체로부터 받은 그대로를 구입하여 사용하였다.

실시예 1. 형태 1의 합성 및 특성화: N -(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1 H -벤조[ d ]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염의 결정형

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민(N-(3-(4-(3-(diisobutylamino)propyl)piperazin-1-yl)propyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine)을 20 mL 신틸레이션 바이알(scintillation vial)에서 칭량하였다. 10 mL의 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone)(순도 99%)을 바이알에 첨가하고 온도 조절 블록, 교반기 플레이트 및 자침을 사용하여 40 ℃에서 교반하였다. 투명한 용액이 관찰되지 않았으므로 40 ℃에서 용해를 돕기 위해 5mL의 MEK를 추가로 첨가하였다. 투명한 용액이 얻어졌다; 40 ℃의 맑은 용액을 PTFE 필터(0.45 미크론)와 주사기를 사용하여 연마 여과(polish-filtered)하였다. 여과된 용액을 깨끗한 20mL 신틸레이션 바이알에 다시 넣고 40 ℃로 재가열하였다. 142.5 mg의 숙신산(1몰 당량)을 바이알에 첨가하였다. 처음에 투명한 용액이 관찰되었다. 40 ℃에서 30분 동안 교반한 후, 물질의 결정화(crystallization of material)를 관찰하였다. 실험은 20시간 동안 3시간 주기로 40 ℃와 5 ℃ 사이에서 온도 순환되었다. 5 ℃에서, 슬러리(slurry)를 부흐너 플라스크(Buchner flask )를 사용하여 여과하고 진공 하에 등급 1 Whatman 여과지(공극 크기 = 11㎛)를 사용하는 깔때기를 사용하였다. 습윤 케이크를 2.5mL의 냉각된(5 ℃) MEK로 세척하고 감압 하에 40 ℃에서 2시간 동안 건조시켰다. 건조된 단리된 고체를 XRPD, TG/DTA 및 HPLC로 분석하였다. 여과된 모액을 HPLC로 농축 분석하였다.

78.5%의 분리 수율이 달성되었으며, 모액 농도(mother liquor)를 기준으로 결정된 HPLC 수율은 93.5%이다 (표 1 참조).

형태 1 석시네이트 염 제조로부터의 결과

용매 시스템	자유 염기 인풋 (mg)	수율 (%)		고체 순도 % 영역	mL's (mg/mL)로의 손실	워시 (mg/mL)에 대한 손실
		이론적인	분리된
메틸에틸케톤	514	93.5	78.5	99.2	11.1	5.5

HPLC(방법A)는 99.2%의 순도를 나타내었다; rt=10.65분(도 7).

XRPD 2θ 회절도는 물질이 결정임을 보여주었고(도 3) CuKα 광원으로 조사했을때 2θ=3.8°±0.2°(100%), 10.3°±0.2°(11.3%), 12.4°±0.2°(6.8%), 16.2°±0.2°(23.5%), 17.9°±0.2°(11.9%), 19.8°±0.2°(10.2%), 20.4°±0.2°(13.0%), 23.8°±0.2°(23.3%) 및 26.7° ±0.2°(9.8%)의 회절각에서 피크를 포함하였다. TG 트레이스는 표면 수분으로 인한 가열 시작부터 ca. 160 °C까지 0.4%의 중량 손실을 나타내었다. DT 트레이스는 용융 현상으로 인한 ca. 130 °C (132°C에서 피크)의 시작과 함께 흡열 현상를 보여주었다. 광범위한 흡열 현상은 용융 후 시작 ca. 209 ℃ (약 228 ℃의 피크)에서 관찰되었다. 이는 분해와 관련이 있다 (도 8).

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 또 다른 배치로서, 세스퀴-석시네이트 염이 제조되었고 HPLC, XRPD, DSC, GVS, FT-IR, NMR 및 VH-XRPD에 의해 추가로 특성화되었다. HPLC(방법 A)는 98.4%의 순도를 나타내었다.

XRPD 2θ회절도는 이전에 기술된 배치의 회절도와 동일하였다 (도 3과 관련하여 도 12 상단 그래프 참조).

첫 번째 가열 사이클의 DSC는 131 ℃에서 피크를 갖는 ca. 128 ℃의 시작과 함께 날카로운 흡열 현상을 보여주었다. 그 다음에는 142 ℃에서 피크를 갖는 작은 발열 이벤트와 147 ℃에서 피크를 갖는 더 작은 발열 이벤트가 이어진다 (도 9); 첫 번째 냉각 및 두 번째 가열 주기에서 DSC 분석은 온도 기록도에서 중요한 이벤트를 보여주지 않았다.

GVS 분석으로, 재료는 70% RH에서 ca. +0.1 중량. %를 흡수한 다음 90% RH까지 ca. +18.9 중량. %(약 7.1 당량의 물)을 급격하게 증가시키는 것으로 나타났다. 이 단계에 있어서, 채널 하이드레이트(channel hydrate)가 형성될 가능성이 있다. 이 단계에서, 채널 하이드레이트가 형성될 가능성이 있다. 이것은 70% RH까지 쉽게 손실될 수 있으며 점차적으로 0 % RH까지 떨어진다(도 10). GVS 동역학 플롯(GVS kinetic plot)은 70 ~ 90% RH 사이에서 급격한 중량 증가를 보여주는 도 11에서 찾을 수 있다. Post-GVS XRPD 분석은 재료가 GVS 습도 조건에 노출된 후에도 동일한 결정 형으로 남아 있음을 발견하였다 (오류! 참조 제공원(Source)을 찾을 수 없다: 위: 재료의 XRPD; 아래: GVS 이후 재료의 XRPD).

FT-IR 스펙트럼은 도 13에 나와있다.

DMSO-d6에서 ¹H 및 정량적 ¹³C NMR 스펙트럼은 각각 도 14 및 도 15에 나와있다.

¹H NMR 스펙트럼(500.12MHz - DMSO-d₆): δ(ppm): 7.13 (2H dd J1 = 6 Hz, J2 = 3 Hz), 6.87 (2H dd J1 = 6 Hz, J2 = 3 Hz), 6.71 (1H br s), 3.30 (2H t J = 7 Hz), 2.42 (6H m, 2.33 4H dt J1 = 16 Hz, J2=7 Hz), 2.04 (4H d J = 7 Hz), 1.74 (2H quintet J = 7 Hz), 1.67 (2H septet J = 7 Hz), 1.52 (2H quintet J = 7Hz), 0.85 (12H d J = 7 Hz) ppm.

정량적 ¹³C NMR spectrum (121.16 MHz - DMSO-d₆): δ (ppm): 174.3, 156.0, 119.5, 111.9, 63.9 56.1, 55.6, 53.0 (d), 29.8, 26.8, 26.6, 24.2, 21.3. 정량적 ¹³C NMR은 화학양론 및 세스퀴-석시네이트 염의 성공적인 형성을 확인하였다.

VH-XRPD 최대 90% RH의 세스퀴-석시네이트 형태 1은 최대 1시간 30분 동안 90% RH에 노출된 후에도 결정도 또는 형태의 변화 없이 동일한 결정형을 유지하는 것으로 밝혀졌다.

7-일 안정성 테스트

7일 안정성 테스트를 다음과 같이 수행하였다: 15mg의 소금을 x3 2mL 바이알에 칭량하였다. 그런 다음 바이알을 40 ℃/75% RH, 80 ℃ 및 주변광(ambient light)에 두었다; 1주 후, 고체를 XRPD 및 HPLC 순도로 분석하였다 (방법 A).

7일 안정성 테스트(40 ℃/75% RH, 80 ℃ 및 주변광에서) 후 회수된 고체의 XRPD 분석은 이러한 조건에 노출된 후 결정도 또는 형태에 변화가 없음을 보여주었다 (도 16).

7일 안정성 시험에서 회수된 고체의 HPLC 분석(방법 A)은 각 안정성 조건에서 순도의 변화가 없음을 보여주었다. 값은 표 2에 나타내었다.

세스퀴-석시네이트 형태 1 내지 7일 안정성 테스트의 HPLC 순도 값

Condition	Purity (%)
40 ℃/ 75 % RH	98.5
80 ℃	98.3
Ambient Light	98.4

용해도 실험

완충되지 않은 물에서의 용해도 평가(solubility assessment)는 > 500 mg/mL의 값으로 물질이 매우 잘 용해되는 것으로 나타났다. pH 측정을 하여 5.28의 값을 제공하였다.

대략 20 mg의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민, 세스퀴-석시네이트 염 형태 1을 3 x 2mL 바이알에 칭량하였다. 적절한 버퍼 100μL를 첨가하여 슬러리를 형성하였다. 결과는 표 3에 나타내었다.

세스퀴-석시네이트 형태 1 용해도 값

pH Buffer	Solubility (mg/mL)
1.2 HCl	> 213
4.5 citrate	> 176
6.8 phosphate	> 182

합성 스케일업

동일한 실험 조건으로 20 g 및 79 g의 유리 염기로부터 본 발명의 세스퀴-석시네이트 염 형태 1의 2가지 추가적인 배치 합성(synthesis of two further batches)을 하였다. HPLC(방법 A)로 확인한 상기 배치의 순도는 각각 69% 및 73%의 수율로 99% 이상이었다. 모든 배치(514mg, 20g 및 79g 스케일)의 XRPD 2θ 회절도의 오버레이가 도 17에 제시되어 있다.

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민, 세스퀴-석시네이트 염 형태 1은 양호한 수율로 원팟 염 형성/결정화와 함께 멀티그램 규모로 재현 가능하게 얻어졌다. 세스퀴-석시네이트 염 형태 1은 매우 안정하고(순도 및 다형 형태), 결정성이 높으며, 용해도가 높으며, 최대 90% 상대 습도까지 흡습성이 없고, 스트레드 조건 하에서 안정하다. 따라서, 본 제품은 적합한 API이며 특히 고형제로 이용가능하다(interst for).

실시예 2: 형태 2의 합성 및 특성화: N -(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1 H -벤조[ d ]이미다졸-2-아민 트리스-석시네이트 염의 결정형

10 mg의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민을 1.5 mL 바이알에 넣고 최소량의 에탄올을 첨가하여 유리 염기를 완전히 용해시켰다. 2당량. 0.5M 스톡 용액(10mL 에탄올에 용해된 596.41mg 석시네이트 애씨드)을 사용하여 석시네이트 애씨드 100 ml를 첨가하였다. 바이알을 6일 동안 교반하면서 주위 온도와 40 ℃ 사이에서 온도 순환(4시간 주기)하였다. 침전이 관찰되었고 고체를 원심분리 여과로 분리한 다음 진공 하에 40 ℃에서 ca. 24 시간 동안 건조시켰다. 고체를 HPLC, XRPD, TG/DT, DSC, DVS, FT-IR, NMR 및 VH-XRPD로 분석하였다.

HPLC(방법 A)는 99.9%의 순도를 나타냈다.

XRPD 2θ 회절도는 재료가 결정임을 보여주고(도 4 참조) CuKα 광원으로 조사했을 때 2θ=5.3° ±0.2° (100%), 15.0° ±0.2° (26.7%), 15.3° ±0.2° (57.4%), 16.8° ±0.2° (25.3%), 17.9° ±0.2° (92.3%), 20.5° ±0.2° (30.1%), 21.2° ±0.2° (25.5%), 23.9° ±0.2° (24.2%), 24.3° ±0.2° (65.3%) and 26.6° ±0.2° (31.5%) 의 회절각에서 피크를 포함했다.

TG/DT 분석의 TG 트레이스(도 18 참조)은 최대 150 ℃까지 질량 손실이 없음을 보여 물질에 잔류 용매가 포함되지 않았음을 나타낸다. 염 해리와 관련된 질량 손실은 150°℃ 이상의 온도에서 관찰되었다. DT 추적은 ca. 155.1 ℃ (피크 159.1 ℃)의 개시와 함께 염 형태의 결합 해리/용해와 관련된 흡열 현상 보여주었다.

DSC 서모그램(도 19 참조)은 트리스-석시네이트 형태 2가 ca. 155.8°C의 개시(피크 157.7 ℃)와 함께 용융되는 것을 보여주었다.

MeOH-d₄ 로부터 취한 1H NMR은 숙신산 3당량을 함유하는 염으로 확인되었다(도 20 참조).

¹H NMR 스펙트럼 (500.12 MHz - MeOH-d₄): δ (ppm): 7.28 (2H dd J1 = 6 Hz, J2 = 3 Hz), 7.10 (2H dd J1 = 6 Hz, J2 = 3 Hz), 3.48 (2H t J = 7 Hz), 2.78 (6H br s), 2.67 (7H m), 2.56 (12H s), 2.41 (4H d J = 7 Hz), 1.95 (2H quintet J = 7 Hz), 1.87 (2H septet J = 7 Hz), 1.79 (2H sextet J = 7.4 Hz), 1.33 (5H br m), 0.97 (12H d J = 6.7 Hz) ppm.

DVS 분석에 의해, 재료는 70% RH에서 ca. +0.1 wt. % 를 흡수한 다음 90% RH까지 ca. +9.92 wt. % (약 4.3 equiv. 물)의 급격한 증가가 뒤따르는 것으로 밝혀졌다. 이것은 70% RH까지 쉽게 손실되고 점차적으로 0% RH까지 떨어진다 (도 21).

DVS 등온선 플롯(DVS isotherm plot)은 DVS 동역학 플롯(도 22)에 의해 확인된 바와 같이 DVS 사이클 전반에 걸쳐 구조의 변화가 없음을 나타내는 유형 I 등온선과 상관관계가 있었으며 여기서 질량의 유의한 변화는 기록되지 않았다. DVS 후 XRPD 분석은 물질이 트리스-석시네이트 염 형태 2로 남아 있음을 보여주었다.

7일 안정성은 형태 2가 50 ℃, 80 ℃ 및 주변 광 조건 하에서 안정함을 보여주었다. 다양한 버퍼의 용해도는 표 4에 기재하였다.

트리스-석시네이트 형태 2 용해도 값

pH Buffer	Solubility (mg/mL)
1.2 HCl	> 123.2
4.5 citrate	> 92.4
6.8 phosphate	> 95.7

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민, 트리스-석시네이트 염 형태 2를 원팟 염 형성/결정화로 양호한 수율로 얻었다. 트리스-석시네이트 염 형태 2는 매우 안정하고(순도 및 다형 형태), 고도의 결정이며, 고도로 용해되며, 최대 90% 상대 습도까지 흡습성이 없고, 스트레스 조건 하에서 안정하다. 따라서 이 제품은 적합한 API이며 특히 고형제로 활용 가능하다.

실시예 3: N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 형태 1을 함유하는 캡슐의 제조 및 안정성

제제 블렌드의 제조(Preparation of Formulation Blends)

220 mL 부피의 원통형 드럼 쉘 (cylindrical Drum shell)에 Avicel® PH101의 7.5 g 무게를 측정한 다음 15 g의 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 형태 1 및 마지막으로 7.5g의 Avicel PH101을 측정하였다. 이러한 방식으로 형태 1 및 Avicel^® PH101 부형제를 추가하면 두 화합물의 혼합이 개선되었다. 최종적인 블렌드는 50:50 w/w 형태 : Avicel^® PH101이다. 제형은 60초마다 반대 방향으로 5분 간격으로 55 내지 65rpm의 고정 속도로 드럼을 회전시켜 TorPac ProMixer 분말 혼합기/블렌더를 사용하여 혼합하였다. 5분 후 하위 샘플을 채취하고 물에 20μg/mL의 형태 1에 해당하는 용액을 준비하였다. 이것은 블렌드에서 형태 1 함량을 결정하고 동일한 염 및 농도의 표준에 대한 UV로 분석되었습니다. 균질한 블렌드가 얻어질 때까지 혼합을 수행하였다. 부형제(excipient)는 수용성이 아니므로 시료 용액을 분석 전에 0.45 μm PTFE 주사기 필터를 통해 여과하였다. 선택된 막이 분석 물질의 회수에 악영향을 미치지 않는다는 것을 확인하기 위해 표준을 사용하였다. 균일한 혼합물이 얻어지면 100개의 경질 젤라틴 크기 1 백색/백색 캡슐을 채웠다. 채워진 캡슐의 균일성은 각 배치에서 10개의 채워진 캡슐을 칭량하여 평가하였다. 빈 껍질의 변화는 중요하지 않은 것으로 간주되었다.

제형 블렌드의 안정성 샘플 준비(Stability Sample Preparation of Formulation Blends)

채워진 캡슐을 병당 10개씩 HDPE 스크류 탑 병에 분배하고 보관하였다. 각 조건에서 4개의 병을 보관하였다: 상온 및 40 ℃/75%RH. 10개의 캡슐은 초기 시점을 위한 것이며 중량 균일성을 결정하는 데 사용하였다. 각 시점에서, 5개의 캡슐을 절단하여 열고 내용물을 20 mL 신틸레이션 바이알에 넣었다. 그런 다음 분말을 주걱으로 혼합하고 HPLC(방법 B) 및 XRPD에 의한 분석에 필요한 대로 샘플링하였다.

혼합 균일성(Blend uniformity)

혼합 균일성은 3개의 동시 하위 시료 농도가 5% 내에서 일치할 때 확립되었다. 세스퀴-석시네이트 염 형태 1은 균질한 분말을 얻기 위해 30분 동안의 혼합이 요구된다.

세스퀴-석시네이트 형태 1 혼합물 균질성 값

시점(분)	세스퀴-석시네이트 염 형태 1 혼합
	% 회복률	절대차
5	74.6	N/A
10	81.5	-7
15	101.4	-20
20	99.2	2
25	97.7	1
30	98.9	-1

대조적으로, 디-설페이트 염 형태 B 혼합물은 혼합시 작은 응집체가 형성된 것으로 나타났기 때문에 최대 60분이 필요했다. 이황산염 형태 B로 과도한 전단력을 가하는 것은 응집을 분해하고 혼합 공정을 가속화(즉, 30분으로 감소)하는 데 필요하지만 결정도에 악영향을 미칠 가능성도 있다.

캡슐 균일성: 채워진 캡슐의 무게(Capsule uniformity: weight of filled capsules)

혼합물의 자유 유동성 특성으로 인해 분말 제형은 캡슐에 쉽게 채워졌고 적절한 캡슐 균질성을 달성하였다.

세스퀴-석시네이트 염 형태 1 혼합물로 채워진 캡슐의 중량

복제품 (Replicate)	세스퀴-석시네이트 염 형태 1 혼합물 (mg)
1	267.63
2	269.95
3	266.81
4	273.64
5	263.59
6	271.26
7	260.86
8	271.63
9	264.88
10	262.92
평균	267.32
Std Dev	4.25
%RSD	1.59

HPLC 안정성 분석

RT 또는 40 ℃/75% RH에서 4주동안 캡슐을 보관하는 동안 상기 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민(N-(3-(4-(3-(diisobutylamino)propyl)piperazin-1-yl)propyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-amine) 세스퀴-석시네이트 염 1 은 안정적인 보관 전반에 걸쳐서 순도(purity)의 변화를 나타내지 않았다.

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 1 블렌드로 채워진 캡슐의 HPLC 순도

상태		실온 (RT)				40°C/75%RH
순도	초기값	T=1 주	T=2 주	T=4 주		T=1 주	T=2 주	T=4 주
	99.3	99.4	99.4	99.3	99.3		99.4	99.3

XRPD 안정성 분석

RT 또는 40 ℃/75 % RH에서 캡슐을 4주간 보관하는 동안 상기 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 1은 안정적인 저장 전반에 걸쳐서 결정형(crystalline form)의 변화를 나타내지 않았다.

N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-석시네이트 염 1은 미세 결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose excipient)와 효율적으로 혼합되었고, 캡슐에서 쉽게 분배되며, RT에서 4주간 안정성을 보이고 40 ℃/75 % RH에서 순도 및 결정성 형태의 API가 변하지 않는 분말의 자유로운 흐름을 제공하였다.

생물학적 실시예

Aβ _1-42 로 손상된 피질 뉴런에 대한 영향

피질 뉴런의 배양

미세아교세포 (microglia)에 배양된 래트 대뇌 피질 뉴런을 Callizot et al. in J Neurosci Res.2013, 91: 706-71에 의해 기술된 바와 같이 미세교 세포(microglial cells)를 포함하도록 수정(modification)하여 배양하였다. 임신 15일째 되는 암컷 쥐 (Rats Wistar; Janvier Labs France)를 CO₂로 마취시킨 후, 자궁 경부 탈구(cervical dislocation)으로 사망시켰다. 그 다음, 태아(fetuses)를 꺼내어 즉시 2% 페니실린 (10,000 U/mL) 및 스트렙토마이신 용액(penicillin and streptomycin, PS) 및 1% 소 혈청 알부민 (BSA)과 함께 빙냉(ice-cold) L15 LEIBOVITZ 배지에 즉시 넣었다. 0.05% 트립신 및 0.02% EDTA가 최종 농도인 트립신-EDTA 용액에서 피질을 37 ℃에서 20 분 동안 처리하였다. DNase I 등급 II (최종 농도 0.5 mg/ml) 및 10% 태아 CALF 혈청 (FCS)을 함유하는4.5 g/리터의 포도당과 함께 Dulbecco의 변형 Eagle 's 배지 (DMEM)를 첨가하여 해리를 중단시켰다. 세포는 10 mL 피펫의 팁으로 세번 파이펫팅하여 기계적으로 풀어주었다. 그 다음, 세포를 4 ℃ 515 x g에서 10 분 동안 원심 분리하였다. 상층액은 버리고, 펠렛을 B27 보충제 2% 용액, 2 mmol/리터의 L- 글루타민, 2% PS 용액, 10 ng/ml의 뇌-유래 신경 요소 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), 2% 열-불활성된 홀스 세럼, 2% 열-불활성된 FCS, 1g/L의 글르코스, 1 mM의 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 및 100 uM비-필수적인 아미노산(amino acid)를 포함하는 신경기저 배지 (Neurobasal medium)으로 구성된 한정 배양 배지(defined culture medium)에 부유시켜주었다. 생존 가능한 세포는 트리 팬 블루 배제 시험(trypan blue exclusion test)을 사용하여 뉴바우어 사이토미터(Neubauer cytometer)에서 계수되었다.

폴리 -L- 리신으로 사전 코팅 된 (면역 염색을 위한) 96- 웰 플레이트에서 웰당 45,000의 밀도로 세포를 시딩하고, 공기 (95%)-CO₂ (5%)인 인큐베이터에서 37 ℃로 배양하였다. 배양 배지는 2 일마다 변경하였다.

테스트 화합물 및 인간 Aβ _1-42 노출

피질 뉴런(Cortical neurons)은 배양 11일 이후 Aβ 용액으로 중독(intoxicated)시켰다(하기 내용 참조). Aβ_1-42의 준비는 Callizot et al., 2013.Briefly에 기술된 절차에 따라 수행하였으며, Aβ_1-42 펩타이드는 초기 농도 40 uM로 상기 언급된 한정 배지에 용해되었다. 이 용액은 37 ℃ 암실에서 3일동안 부드럽게 교반하고 사용 농도(0.5μM의 Aβ 올리고머(AβO)를 포함하는 5μM의 Aβ_1-42 제제를 WB로 측정)로 대조군 배지에 적절하게 희석한 후에 즉시 사용하였다. 대조군 배지는 한정 배지로 구성하였다(상기 기재된 바와 동일함). 테스트할 화합물을 물에 용해시키고 배양 배지에서 혼합하였다. 이 화합물은 Aβ_1-42 제제와 미세아교세포와 72시간 동안 배양된 1차 피질 뉴런과 함께 공동-투여되었다.

면역염색

0.1%의 사포닌으로 투과시킨 후, 세포를 1% 소태아 혈청을 함유하는 PBS로 15분 동안 블록시켰다. 그 다음, 세포를 다음과 함께 2시간 동안 배양하였다:

a) MAP-2 뉴런의 경우: 1% 소태아 혈청 및 0.1% 사포닌을 포함하는 PBS에서 1/1000 희석한 닭 다클론 항체(Ab) 항 미세소관-관련-단백질 2(MAP-2). 이 항체는 뉴런과 신경돌기에 특이적으로 결합하며, 신경세포 생존 및 신경돌기 네트워크를 연구할 수 있게 한다.

b) AT100 Tau 인산화의 경우: 1% 소태아 혈청 및 0.1% 사포닌을 포함하는 PBS에서 1/400 희석하고, Thr212 및 Ser214(AT100)의 부위가 인산화 된, 마우스 단일클론 Ab 안티-타우(mouse monoclonal Ab anti-tau).

c) OX-41 미세아교세포의 경우: % 소태아 혈청 및 0.1% 사포닌을 포함하는 PBS에서 1/400 희석한, 토끼 다클론성 Ab 항-SIRP 알파/CD172a(OX-41).

이들 항체는 1시간 동안 실온에서 1% 소태아, 0.1 % 사포닌을 포함하는 PBS에서 1/400으로 희석하여 Alexa Fluor 350 당나귀 안티 치킨 IgG(Alexa Fluor 350 donkey anti-chicken IgG), Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG(Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG) 및 Alexa Fluor 568 염소 안티 토끼 IgG(Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG)으로 밝혔다.

각 조건에 대하여, ImageXpress(Molecular Devices)를 사용하여 20x 배율로 웰당 30장의 사진을 자동으로 촬영하였다. 모든 이미지는 동일한 수집 매개변수를 사용하여 생성되었다. 분석은 Custom Module Editor(Molecular Devices)를 사용하여 자동으로 수행하였다.

다음 판독값을 조사하였다:

- 뉴런 생존(neuron survival): 총 뉴런 수(MAP-2 염색)

- 신경돌기 네트워크(neurite network)(μm 단위의 MAP-2 염색)

- 뉴런 내부의 인산화 타우(phosphor Tau): AT100 및 MAP-2의 공동로컬리제이션(colocalization) 영역(μm² 중첩)

- 미세아교세포 활성화: 미세교세포의 전체 면적(μm² 단위 OX41 염색)

세포외 프로그래눌린 정량

배양 배지에서 PGRN의 수준은 제조업체의 권장 사항에 따라 ELISA(Progranulin (rat) ELISA lit, Adipogen, Coger)에 의해 결정되었다. 요약하자면, 100 μL의 상청액을 37 ℃, 1시간 동안 웰 스트립에 직접 첨가하였다. 그 다음, 37 ℃에서 1시간 동안 100 μL의 검출 항체를 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 HRP가 표지된 스트렙타비딘 (Streptavidin) 100 μL을 첨가하였다. 마지막으로 실온에서 10분 동안 TMB 기질 용액 100 μL를 첨가하였다.

광학 밀도(OD)는 Glomax 장치(Promega)를 사용하여 450 nm파장에서 분광광도법으로 평가하였다. 과산화효소의 활성은 PGRN의 농도에 비례한다.

통계 분석

결과는 제어 백분율로 표시된다. 모든 값은 조건당 4-6개의 웰의 평균 +/- SEM(평균의 표준 오차)을 나타낸다. 그래프 및 통계 분석은 그래프패드 프리즘 소프트웨어 버전 7.04(GraphPad Prism software version 7.04)를 사용하여 다양한 조건(ANOVA followed by Dunnett's or Fisher's t test)에서 수행되었다. *p<0.05는 유의한 것으로 간주되었다.

결과

뉴런 생존(Neuronal survival): Aβ_1-42에 의한 중독은 대조군과 비교하여 피질 뉴런의 생존을 상당히 감소시켰다 (도 25A). 가장 높은 용량(10 nM 내지 100 nM)에서 세스퀴-석시네이트 형태 1은 신경보호적이었다.

신경돌기 네트워크(Neurite network): 신경돌기 네트워크의 총 길이는 Aβ_1-42 손상 후 상당히 감소하였다(도 25B). 신경돌기 네트워크는 가장 높은 용량의 세스퀴-석시네이트 형태 1(10nM 내지 100nM)이 존재하는 경우 상당히 더 길었다.

AT100: Aβ_1-42 적용하에, MAP-2 피질 뉴런에서 AT100의 상당한 증가가 관찰되었다(도 25C). 세스퀴-석시네이트 형태 1은 1 nM 이상의 용량에서 Tau의 과인산화를 상당히 감소시켰다.

미세교세포(microglial cells)의 활성화: 예측한대로, Aβ_1-42 중독(intoxcication)은 대조군과 비교하여 미세교세포의 활성화를 유발하였다 (도 26A). 조사된 용량에서, 세스퀴-석시네이트 염 형태 1은 미세교세포의 활성화를 감소시킬 수 있었다.

세포외 PGRN: , Aβ_1-42 존재하에, 상층액의 PGRN 수준은 대조군과 비교할 때 현저히 낮았다. 세스퀴-석시네이트 염 형태 1은 10 nM의 농도에서 세포외 PGRN의 수준을 상당히 증가시켰다 (도 26B).

이러한 결과에 따라, 세스퀴-석시네이트 염 형태 1은 a) 신경보호적일 수 있고, b) 신경돌기 네트워크를 보존할 수 있고, b) 타우(Tau)의 과인산화를 감소시킬 수 있고, d) 미세아교세포(microglial) 활성화 및 이에 따른 신경염증을 완화시킬 수 있고, e) 배양된 세포의 상청액에서 프로그래눌린 신경영양 인자(progranulin neurotrophic factor)의 방출을 촉진한다. 따라서, 본 발명의 석시네이트 염은 신경퇴행성 신경병증, 특히 타우병증 및 파킨슨병의 치료에 유용하다.

MPP+ 또는 로테논으로 손상된 중뇌 뉴런에 미치는 영향

중뇌 뉴런의 배양

래트 도파민성 뉴런(Rat dopaminergic neurons) 은 Visanji et al. in FASEB J. 2008, 22(7): 2488-2497 및 Callizot et al.,in PlosOne 2019: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0215277에 의해 기술된 바와 같이 배양되었다. 간단히 말하자면, 임신 15일의 임신한 암컷 쥐(Wistar)를 CO₂챔버로 깊은 마취를 하고 자궁경부 탈구(cervical dislocation )로 사망시켰다. 15일 된 쥐 배아 (Janvier, France)에서 얻은 중뇌를 현미경으로 상세하게 분석하였다. 배아 중뇌를 제거하여 2%의 페니실린-스트렙토마이신(PS) 및 1%의 BSA를 함유하는 Leibovitz(L15)의 얼음처럼 차가운 배지에 넣었다. 도파민 신경세포가 풍부한 발달 중인 뇌 영역인 중뇌굴곡(mesencephalic flexure)의 중간 부분(ventaral portion)을 세포를 준비하는데 사용하였다.

중뇌는 37 ℃에서 20분 동안 트립신을 처리하여 해리되었다 (0.05% 트립신 및 0.02% EDTA의 최종 농도 용액). DNAase I 등급 II(0.5 mg/mL) 및 10% FCS를 포함하는 DMEM을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 그 다음 세포를 10ml 파이펫으로 세번 파이펫팅하여 기계적으로 풀어주었다. 그 다음 세포를 L15 배지의 BSA(3.5%) 층에서 +4 ℃에서 10분 동안 180 x g에서 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세포 펠릿(cell pellets)을 B27(2%), L-글루타민(2mM) 및 2% PS 용액과 10ng/mL의 BDNF 및 1 ng/mL의 신경아교세포 유래 신경영양인자(Glial-Derived Neurotrophic Factor, GDNF)로 보충된 신경기저(Neurobasal)로 이루어진 제한 배양 배지에 재-부유시켰다. 살아있는 세포는 트리판 블루 배제 테스트를 사용하여 뉴바우어(Neubauer) 세포계산기에서 계수하였다. 세포를 96개의 웰-플레이트(폴리-L-라이신으로 미리 코팅됨)에 40,000 세포/웰의 밀도로 접종하고 37 ℃, 5% CO₂/95% 대기 분위기의 습한 인큐베이터에서 유지하였다. 배지의 절반은 2일마다 새로운 배지로 갈아주었다.

96웰 플레이트의 경우 60웰만을 사용하였다. 첫번째 및 마지막 라인과 컬럼의 웰은 사용하지 않았으며(엣지 효과를 방지하기 위해) 멸균수로 채웠다.

테스트 화합물 및 미토콘드리아 스트레스

비히클: 배양 배지(0.1% PBS)

전처리: 4일째, 세스퀴-석시네이트 염 형태 1을 배양 배지에 용해시키고 48시간 동안 배양물에 첨가하였다.

MMP+ 손상: 세스퀴-석시네이트 염 형태 1의 인큐베이션 후 6일 및 48시간 후 또는 그의 인큐베이션 직후에, MPP+를 최종 농도 4μM로 첨가하고, 여전히 화합물의 존재 하에 대조군 배지에서 48시간 동안 희석하였다.

로테논(Rotenone) 손상: 세스퀴-석시네이트 염 형태 1의 인큐베이션 후 6일 및 48시간 후 또는 그의 인큐베이션 직후에, 로테논을 최종 농도 10 nM로 첨가하고, 여전히 화합물의 존재 하에 대조군 배지에서 24시간 동안 희석하였다.

면역염색

손상 이후(24시간 또는 48시간), 세포 배양 상청액을 제거하고, 실온에서 20분 동안 PBS, pH = 7.3 중 4% 파라포름알데히드 용액으로 세포를 고정시켰다. 세포를 PBS에서 2회 세척하였다. 0.1% 사포닌과 1% FCS가 함유된 PBS 용액으로 실온에서 15분 동안 세포막 투과 및 비특이적 결합 부위 차단을 수행하였다. 그런 다음 세포를 다음과 함께 배양하였다:

a) 티로신 하이드록실라제(TH)의 경우: 실온에서 2시간 동안 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS에 1/10000으로 희석하여 마우스에서 생성된 단클론 항-TH항체.

b) 알파 시누클레인(α-syn)의 경우: 1% FCS, 0.1% 사포닌을 포함하는 PBS에 1/200 희석하여 실온에서 2시간 동안 생성된 토끼 유래 다클론 항-α-syn 항체. 1차 항체는 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG 및 Alexa Fluor 568 염소 항-토끼 IgG이며, 둘 다 실온에서 1시간 동안 1% FCS, 0.1% 사포닌을 함유하는 PBS에서 1/400 희석되었다. 핵은 Hoechst 염료(1/1000)로 표지되었다.

각 조건에 대해 ImageXpress® Molecular Devices)를 사용하여 동일한 획득 매개변수(acquisition parameters)를 사용하여 10배 배율로 20장의 사진(전체 웰 영역을 나타냄)을 자동으로 촬영하였다. 이미지에서 분석은 MetaXpress® Molecular Devices)에 의해 자동으로 수행되었다.

다음과 같이 판독 값이 조사되었다:

- 뉴런 생존율: 총 TH 뉴런 수(TH 염색)

- 신경돌기 네트워크: TH 양성 뉴런의 신경돌기 네트워크 총 길이(단위: μm)

- α-syn 응집(μm² 단위로 TH와 α-syn 염색 사이의 중첩 영역)

통계 분석

결과는 제어 백분율로 표시된다. 모든 값은 조건당 4-6개 웰의 평균 +/- SEM(평균의 표준 오차)을 나타낸다. GraphPad Prism 소프트웨어 버전 7.04를 사용하여 다양한 조건(ANOVA에 이어 Fisher의 LSD 테스트) 및 그래프에 대한 통계 분석을 수행하였다. p<0.05는 유의한 것으로 간주되었다.

결과

MPP+로 손상된 TH(+) 뉴런에 대한 세스퀴-석시네이트 형태 1의 효과

신경 생존: MPP+ 중독은 대조군과 비교하여 도파민성(TH 양성) 뉴런의 생존을 상당히 감소시켰다. 세스퀴-석시네이트 형태 1은 50nM 용량에서 신경보호적이었다(도 27A).

신경돌기 네트워크: 신경돌기 네트워크의 전체 길이는 MPP+ 손상 후 유의하게 감소하였다. 신경돌기 네트워크의 무결성은 50nM 용량의 세스퀴-석시네이트 형태 1로 상당히 개선되었다(도 27B).

α-syn 응집: MPP+ 적용 시 도파민성 뉴런에서 α-syn 응집의 유의한 증가가 관찰되었다. 이 응집은 모든 시험된 농도에서 세스퀴-석시네이트 형태 1의 예비-인큐베이션 후에 상당히 감소되었다. 50 또는 100nM 세스퀴-석시네이트 형태 1과의 동시 배양은 α-syn 응집을 상당히 감소시켰다(도 27C).

로테논으로 손상된 TH(+) 뉴런에 대한 세스퀴-석시네이트 형태 1의 효과

신경 생존 : 로테논 중독은 대조군과 비교하여 도파민 신경 세포의 상당한 손실을 유발하였다. 세스퀴-석시네이트 형태 1은 사전 배양되었을 때 10 및 50 nM의 용량에서 신경보호를 잘 하였다. 그러나, 로테논을 직접 투여했을 때 모든 농도에서 뉴런 생존을 유의하게 증가시켰다(도 28A).

신경돌기 네트워크 : 신경돌기 네트워크의 무결성은 로테논 손상 후 크게 감소하였다. 세스퀴-석시네이트 형태 1을 사용한 전처리 및 공동처리 둘 모두는 10 내지 100nM의 모든 투여량에서 신경돌기 네트워크를 상당히 개선시켰다(도 28B).

α-syn 응집 : 로테논은 도파민성 뉴런에서 α-syn의 응집을 상당히 증가시켰다. 이 병리학적 응집은 세스퀴-석시네이트 형태 1이 사전 배양되거나 로테논(10에서 100nM)으로 직접 적용될 때 상당히 감소되었다. 특히, α-syn의 응집은 100 nM 세스퀴-석시네이트 형태 1이 공동 투여되었을 때 방지되었다(도 28C).

Claims (17)

1. N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민의 숙신산염(succinate salt) 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물.
2. 제1항에 있어서, 화학식 II의 구조를 갖는, 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물:
   [화학식 II]
   
   상기 식에서 x는 1 내지 4이다.
3. 제2항에 있어서, x는 1.4 내지 3.1인 것을 특징으로 하는, 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물.
4. 제2항에 있어서, x는 1.4 내지 1.6인 것을 특징으로 하는, 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물.
5. 제2항에 있어서, x는 1.5인 것을 특징으로 하는, 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물.
6. 제2항에 있어서, CuKa 광원을 조사하였을 때 2θ = 3.8°±0.2°, 10.3°±0.2°, 12.4°±0.2°, 16.2°±0.2°, 17.9°±0.2°, 19.8°±0.2°, 20.4°±0.2°, 23.8°±0.2° 및 26.7°±0.2°의 회절각에서의 피크를 포함하는 X-선 분말 회절(X-ray powder diffraction, XRPD) 패턴을 갖는 결정 형태 하에서, x는 1.5인 것을 특징으로 하는, 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물.
7. 제2항에 있어서, x는 2.9 내지 3.1인 것을 특징으로 하는, 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물; 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 포함하는, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 및 괌의 파킨슨병-치매 복합증(Parkinsonism-dementia complex of Guam), 은친화 과립성 질환(Argyrophilic grain disease), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy), 피질기저핵 변성(Corticobasal degeneration), 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 석회화를 동반한 확산성 신경원섬유엉킴(Diffuse neurofibrillary tangles with calcification), 가족성 영국 치매(Familial British Dementia), 가족성 덴마크 치매(Familial Danish Dementia), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia, FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17), 전두측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration, FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(Frontotemporal dementia-granulin subtype, FTD-GRN), 게르스트만-슈트라이슬러-샤인커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 과들루프 파킨슨증(Guadeloupean parkinsonism), 할러보르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 내포체 근염(Inclusion body myositis), 다발성 시스템 위축(Multiple system atrophy), 스타이너트 근긴장성 이영양증(Steinert Myotonic dystrophy), II형 근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophy type II), 뇌철분축적을 가진 신경퇴화(Neurodegeneration with brain iron accumulation), C형 니만-피크병(Niemann-Pick disease of type C), 신경섬유 엉킴이 있는 비과만 운동뉴런 질환(Non-Guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles), 파제트병(Paget's disease), 픽병(Pick's disease), 뇌염후 파킨슨증(Postencephalitic parkinsonism), 진행성 피질하 신경교증(Progressive subcortical gliosis), 진행성 핵상(성)마비(Progressive supranuclear palsy, PSP), SLC9A6-관련 정신 지체(SLC9A6-related mental retardation), 아급성 경화 범뇌염(Subacute sclerosing panencephalitis), 엉킴형 치매(Tangle-only dementia), 다발성 경색 치매(multi-infarct dementia), 허혈성 뇌졸중(Ischemic stroke), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy, CTE), 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury, TBI), 뇌졸중, 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증(White matter Tauopathy with globular glial inclusions) 및 파킨슨병으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
9. 다음 단계를 포함하는 N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민 세스퀴-숙신산염(sesqui-succinate salt)의 제조방법:
   - 단계 1: N-(3-(4-(3-(다이이소부틸아미노)프로필)피페라진-1-일)프로필)-1H-벤조[d]이미다졸-2-아민을 유기 용매에 용해하고;
   - 단계 2: 반응 매질(reaction medium)을 온도 B로 가열하되, 상기 온도 B는 30 내지 50℃을 포함하는 온도로 정의되며;
   - 단계 3: 동일한 몰 양(equimolar amount)의 숙신산을 첨가하고;
   - 단계 4: 반응 매질을 온도 B에서 0.25 내지 4시간 동안 교반하며;
   - 단계 5: 10 내지 30시간 동안 2 내지 4시간 주기로 온도 A 및 온도 B 사이에서 반응 매질을 온도 순환시키되, 상기 온도 A는 0 내지 10℃를 포함하는 온도로 정의되고;
   - 단계 6: 반응 매질을 온도 A로 냉각하며;
   - 단계 7: 반응 매질을 온도 A에서 여과하고;
   - 단계 8: 필터 케이크(filter cake)를 온도 A에서 상기 유기 용매로 세척하며;
   - 단계 9: 필터 케이크를 30 내지 50℃의 온도에서 건조한다.
10. 삭제
11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물을 포함하는, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 및 괌의 파킨슨병-치매 복합증, 은친화 과립성 질환, 만성 외상성 뇌병증, 피질기저핵 변성, 권투선수 치매, 석회화를 동반한 확산성 신경원섬유엉킴, 가족성 영국 치매, 가족성 덴마크 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(FTDP-17), 전두측두엽 변성증(FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(FTD-GRN), 게르스트만-슈트라이슬러-샤인커병, 과들루프 파킨슨증, 할러보르덴-스파츠병, 내포체 근염, 다발성 시스템 위축, 스타이너트 근긴장성 이영양증, II형 근긴장성 이영양증, 뇌철분축적을 가진 신경퇴화, C형 니만-피크병, 신경섬유 엉킴이 있는 비과만 운동뉴런 질환, 파제트병, 픽병, 뇌염후 파킨슨증, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상(성)마비(PSP), SLC9A6-관련 정신 지체, 아급성 경화 범뇌염, 엉킴형 치매, 다발성 경색 치매, 허혈성 뇌졸중, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 외상성 뇌손상(TBI), 뇌졸중, 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증 및 파킨슨병으로부터 선택되는 질환의 치료 또는 예방용 약제.
12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 숙신산염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 용매화물을 포함하는, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 및 괌의 파킨슨병-치매 복합증, 은친화 과립성 질환, 만성 외상성 뇌병증, 피질기저핵 변성, 권투선수 치매, 석회화를 동반한 확산성 신경원섬유엉킴, 가족성 영국 치매, 가족성 덴마크 치매, 전두측두엽 치매(FTD), 17번 염색체와 관련된 파킨슨병을 동반하는 전두측두엽 치매(FTDP-17), 전두측두엽 변성증(FTLD), 전두측두엽 치매-그래뉼린 아형(FTD-GRN), 게르스트만-슈트라이슬러-샤인커병, 과들루프 파킨슨증, 할러보르덴-스파츠병, 내포체 근염, 다발성 시스템 위축, 스타이너트 근긴장성 이영양증, II형 근긴장성 이영양증, 뇌철분축적을 가진 신경퇴화, C형 니만-피크병, 신경섬유 엉킴이 있는 비과만 운동뉴런 질환, 파제트병, 픽병, 뇌염후 파킨슨증, 진행성 피질하 신경교증, 진행성 핵상(성)마비(PSP), SLC9A6-관련 정신 지체, 아급성 경화 범뇌염, 엉킴형 치매, 다발성 경색 치매, 허혈성 뇌졸중, 만성 외상성 뇌병증(CTE), 외상성 뇌손상(TBI), 뇌졸중, 구상 신경교 내포물을 동반한 백질 타우병증 및 파킨슨병으로부터 선택되는 질환의 발병(onset)을 환자에서 지연시키기 위한 약제.
13. 삭제
14. 삭제
15. 제11항에 있어서, 질환은 파킨스병인, 약제.
16. 삭제
17. 제12항에 있어서, 질환은 파킨스병인, 약제.