KR19980702702A

KR19980702702A - 신규의 증식 인자 및 이를 암호하는 유전자 서열

Info

Publication number: KR19980702702A
Application number: KR1019970706109A
Authority: KR
Inventors: 헤이워드 니콜라스킴; 군터웨버; 신그리몬드; 매그너스노르덴스트욜드; 라센 카타리나
Original assignee: 스튜어트 마틴 슈트; 암레드오퍼레이숀즈피티와이.리미티드
Priority date: 1995-03-02
Filing date: 1996-02-22
Publication date: 1998-08-05
Anticipated expiration: 2016-02-22
Also published as: HU223438B1; NO974035D0; CN1224464A; FI973571A0; ATE252600T1; NO320839B1; EP0815221B1; HUP9800377A1; NZ337634A; FI120153B; US20070135344A1; HK1002963A1; WO1996027007A1; DE69630442D1; JP2001037493A; NZ301611A; EP0815221A1; NO974035L; FI973571L; BR9607628A

Abstract

본 발명은 개괄적으로 혈관 내피 증식 인자와 유사한 성질을 지닌 분자 분리물 및 이를 암호하는 유전자 서열에 관한 것이다. 이 분자는 증진되거나 감소된 혈관구조 및/또는 혈관 투과성을 요하는 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 일정 범위의 치료법 및 진단법의 개발에 유용할 것이다. 또한, 본 발명의 분자는 주신경원 및 중추 신경원의 유용한 작동인자이며 대교세포의 증식을 유도할 수 있다.

Description

신규의 증식 인자 및 이를 암호하는 유전자 서열

본원에서 인용한 공개 문헌들의 구체적인 저서목록은 본원 마지막 부분에 기재하고 있다. 본원에서 사용된 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 상기 문헌들에 따라 나타낸다.

본원을 통해 사용된 포함이라는 별다른 표시가 없는 한, 기술된 인자 또는 그 전체를 포함하지만 임의의 다른 인자 또는 그 전체 또는 인자들이나 전체들의 군은 포함하지 않는 것이다.

혈관작용 투과성 인자라고도 알려진 혈관 내피 증식 인자(이후, VEGF라고 약칭함)는 내피 조직을 특이적으로 활성화시키는 분비형의 공유 결합된 동종이량체 당단백질이다(Senger et al., 1993). 황체 형성(Yan et al., 1993) 및 태반 발생(Sharkey et al., 1993), 혈관 투과성 조절(Senger et al., 1993), 염증성 혈관형성(Sunderkotter et al., 1994) 및 자가이식(Dissen et al., 1994)을 비롯한 일반적인 혈관형성 및 종양 촉진성 혈관형성(Folkman Shing, 1992), 류마티스양 관절염(Koch et al., 1994) 및 당뇨병 관련성 망막증(Folkman Shing, 1992)과 같은 인체 질환에 대한 VEGF의 관련성과 같이 VEGF는 일정 기능에 관여한다.

따라서, VEGF는 이 VEGF 를 주성분으로 한 치료제, 예방제 및 진단제에 대한 연구 또는 그 활성에 대한 연구의 표적이 되는 매우 중요한 분자이다. 또한, VEGF에 대한 대체물로서 사용하거나 VEGF와 함께 병용하기 위한 동족체 또는 다른 관련 분자에 대한 동정이 요구되었다.

본 발명 이전까지 본 발명자들은 복합 내분비선 신생물 제 I 형 감수성 유전자(MEN1)에 대해 연구를 지속해왔다. 놀랍게도, 본 발명자들은 MEN1 유전자의 가능성에서 제외된 유전자 서열이 VEGF와 일면 유사성을 지닌 새로운 증식 인자라는 것을 발견하였다. 더우기, 본 발명의 증식 인자는 주 신경원 및 중추 신경원의 작동 분자이다.

도 1은 VEGF₁₆₅의 뉴클레오티드 서열[서열 번호 1] 및 이에 상응하는 아미노산 서열[서열 번호 2].

도 2는 SOM 175의 뉴클레오티드 서열[서열 번호 3] 및 이에 상응하는 아미노산 서열[서열 번호 4].

도 3은 SOM175 단백질 서열을 이용한 BLAST 연구 결과.

도 4는 VEGF cDNA 및 SOM175 cDNA의 BESTFIT 배열.

도 5는 복수 정렬된 VEGF₁₆₅와 SOM175 및 이것의 뉴클레오티드 준위에서의 결찰 변형체.

도 6은 복수 정렬된 VEGF₁₆₅와 SOM175 및 이것의 아미노산 준위에서의 결찰 변형체.

도 7은 SOM 175 및 이것의 결찰 변형체의 모식도.

도 8a는 엑손/인트론 지도를 도시한 인체 SOM175의 게놈 모식도.

도 8b는 엑손/인트론 경계를 도시한 인체 SOM175의 게놈 모식도.

도 9는 mVRF cDNA 클론으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 추정되는 펩티드 서열. 뉴클레오티드의 번호는 개시 코돈의 A에서 부터 번호를 부쳐 좌측에 표시하였다. 아미노산은 추정상의 시그널 펩티드를 제거한 후 예상되는 성숙 단백질의 제 1 잔기에서 부터 번호를 부쳐 우측에 표시하였다. 교호적으로 결찰되는 영역은 이중으로 밑줄이 그어져 있고 각 mRNA로부터 산출되는 펩티드 서열도 표시하였다. 가능성이 있는 폴리아데닐화 시그널은 볼드체활자로 나타내었다. 또한 mVRF₁₆₇및 mVRF₁₈₆의 개시 코돈 및 종지 코돈에 밑줄을 그었고 3' UTR내의 다형성 AC 반복 서열은 점각 박스로 표시하였다. 인트론/엑손 경계의 위치는 화살촉 모양으로 표시되어 있다.

도 10은 인간 및 쥐의 VRF 단백질 이소형태의 BESTFIT 정렬도. A: mVRF₁₆₇및 hVRF₁₆₇. B: 각각 167 아미노산 이소형태로부터 벗어난 서열의 지점에서부터 mVRF₁₈₆및 hVRF₁₈₆서열. 아미노산 동일성은 수직 단선으로 표시하였고, 보존되는 아미노산은 점으로 표시하였다. 화살표는 인간 및 쥐 VRF의 예상되는 펩타이드 절단 부위를 표시한 것이다.

도 11은 mVRF₁₆₇및 mVEGF₁₈₈(Breier et al, 1992) 펩티드 서열의 BESTFIT 정렬도. mVEGF의 시그널 펩티드 절단 부위는 화살표로 표시하였다. 동일한 아미노산은 수직 단선으로, 보존적 치환은 점으로 표시하였다. 아미노산 번호는 도 9에 설명한 바와 같다.

도 12는 VRF(쥐 및 인간 동족체의 인트론/엑손 구조는 거의 동일하므로 일반적인 VRF 유전자를 도시함) 및 다른 인간 VEGF/PIGF/PDGF 유전자 군간의 유전자 구조를 비교한 것이다. 단백질 암호 영역 및 비해독 영역은 각각 빗금친 구역과 빈 구역으로 표시하였다. VRF내에 평행선이 그어진 영역은 VRF₁₈₆이소형태의 교호적 결찰로 형성된 또다른 3' UTR 서열을 나타낸다. 각 유전자의 가능한 교호 결찰 생성물도 도시하고 있다.

도 13은 mVRF cDNA 클론과 하이브리드한 여러 성숙쥐의 조직(표시됨)에서 추출한 총 RNA의 노던 블롯의 자동방사선사진이다. 모든 샘플중에서 1.3kb의 주요 전사체가 검측되었다.

도 14는 쥐에 존재하는 mVRF 및 mRNA의 발현 패턴을 나타내는 필름 자동 방사진사진(A-C) 및 암시야 현미경사진(D-E)이다. E14 쥐배아(A)에 있어서, 발생하는 심장(Ha) 및 대뇌피질(Cx)상에서 양성의 시그널이 나타났다. 또한, 그 구역내 다른 조직들에 대해서도 낮은 배경 시그널이 나타났다. E17 배아(B) 및 심장(Ha)은 강한 하이브리드화 시그널로 인해 뚜렷하게 관찰되었다. 이와 동등한 강한 시그널이 흉곽 주위 및 후면에 있는 갈색 지방 조직(Fa)에서도 나타났다. 척수(SC) 및 혀(T)에서는 중간정도의 하이브리드 시그널이 나타났다. E14 배아에 비해 배경 시그널의 강도는 감소하였다. 어린 성숙 쥐(C-D)에 있어서, 심장(Ha)과 흉곽 주위의 지방 조직(Fa)상에서 양성의 시그널이 나타나는 반면, 예컨대, 허파(Lu)는 표지되지 않았다. 심장에 대한 하이브리드화 시그널은 유두 근육(D)을 비롯하여 좌심실 전체상에 균일하게 분포한다. 과량의 비방사능성 프로브와 하이브리드된 E17 심장에서 양성의 시그널은 나타나지 않았다(E). 크기 바아 = 0.5mm(A), 1.2mm(B), 1mm(C), 0.3mm(D), 0.1mm(E).

도 15는 쥐 지방 조직(A-B) 및 척수(C-D)내에서의 mVRF mRNA 형질발현을 나타내는 암시야(A 및 C) 및 명시야(B 및 D) 현미경사진. 수단 블랙 염색된 구역(B)에서 강한 표지화로 표시되는 바와 같이, 강한 하이브리드 시그널이 지방(A)상에서 나타났다. 또한, 골격근(A-B중의 M)에서는 약한 시그널이 나타났다. 성숙한 척수(C)에서 mVRF 프로브는 회백질상에 있어서의 신경원 염색 패턴을 나타냈다. 톨로우딘 대비염색은 mVRF mRNA가 주로 양성으로 나타나는 중심관 주위 및 배면각의 심부내에 존재하는 개재뉴런(도시되지 않음), 복측각내의 운동뉴런(D)을 나타내고 있다. 크기 바아 = 0.1mm(A), 0.1mm(B), 0.25mm(C), 0.015mm(D).

도 16은 생존율%, 신경돌기 과성장율% 및 평균 신경돌기 길이(㎛)로 측정되는 바와 같은, 배아발생 8일(E8)째의 병아리 감각뉴런에 대한 VEGF의 효과.

도 17은 병아리 신경교에 대한 VEGF 및 SOM175의 효과. CNS 신경교, 말초 신경교 및 CNS 희돌기교세포도 시험하였다.

도 18은 쥐의 대교세포에 대한 각종 SOM 175 단백질의 효과. ■³H(cpm)

1. FGF-2(10ng/ml) 양성 대조군

2. SOM_△X6^*1 ng/ml

3. SOM_△X6 10 ng/ml

4. SOM_△X6 100 ng/ml

5. SOM_△X6 1000 ng/ml

6. SOM_△X6 1000 ng/ml, 헤파린 무첨가

7. SOMX6^**1 ng/ml

8. SOMX6 10 ng/ml

9. SOMX6 100 ng/ml

10. SOMX6 1000 ng/ml

11. SOMX6 1000 ng/ml, 헤파린 무첨가

^*이것은 엑손 6이 없는 SOM175를 나타낸다;

^**이것은 SOM 175를 나타낸다.

도 19는 쥐의 희돌기교세포에 대한 각종 SOM175 단백질의 효과.■³H(cpm)

1. FGF-2(10ng/ml) 양성 대조군

2. SOM_△X6^*1 ng/ml

3. SOM_△X6 10 ng/ml

4. SOM_△X6 100 ng/ml

5. SOM_△X6 1000 ng/ml

6. SOM_△X6 1000 ng/ml, 헤파린 무첨가

7. SOMX6^**1 ng/ml

8. SOMX6 10 ng/ml

9. SOMX6 100 ng/ml

10. SOMX6 1000 ng/ml

11. SOMX6 1000 ng/ml, 헤파린 무첨가

^*이것은 엑손 6이 없는 SOM175를 나타낸다;

^**이것은 SOM 175를 나타낸다.

도 20은 쥐의 전뇌 뉴런에 대한 각종 SOM175 단백질의 효과.■생존율%

1. FGF-2(10ng/ml) 양성 대조군

2. SOM_△X6^*1 ng/ml

3. SOM_△X6 10 ng/ml

4. SOM_△X6 100 ng/ml

5. SOM_△X6 1000 ng/ml

6. SOM_△X6 1000 ng/ml, 헤파린 무첨가

7. SOMX6^**1 ng/ml

8. SOMX6 10 ng/ml

9. SOMX6 100 ng/ml

10. SOMX6 1000 ng/ml

11. SOMX6 1000 ng/ml, 헤파린 무첨가

^*이것은 엑손 6이 없는 SOM175를 나타낸다;

^**이것은 SOM 175를 나타낸다.

서열 번호 요약

서열 번호
1	VEGF₁₆₅의 뉴클레오티드 서열
2	VEGF₁₆₅의 아미노산 서열
3	SOM175의 뉴클레오티드 서열(VEGF-유사 분자)
4	SOM175의 아미노산 서열
5	엑손 6이 없는 SOM175의 뉴클레오티드 서열
6	엑손 6이 없는 SOM175의 아미노산 서열
7	엑손 6 및 엑손 7이 없는 SOM175의 뉴클레오티드 서열
8	엑손 6 및 엑손 7이 없는 SOM175의 아미노산 서열
9	엑손 4가 없는 SOM175 뉴클레오티드 서열
10	엑손 4가 없는 SOM175의 아미노산 서열
11	올리고뉴클레오티드
12	올리고뉴클레오티드

13	올리고뉴클레오티드
14	올리고뉴클레오티드

따라서, 본 발명의 제 1 양태는 아미노산 서열이 (i) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 약 15% 이상 유사하고; (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열과 5% 이상 유사하지 않은 생물학적으로 분리된 단백 분자를 포함한다.

본 발명의 제 2 양태는 (i) 서열번호 2의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상은 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고; (ii) VEGF와 공통된 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 분리된 단백 분자를 제공한다.

본 발명의 제 3 양태는 (i) 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고; (ii) (a) 혈관 내피 세포의 증식 유도성; (b) flt-1/flk-1 수용체류와의 상호반응성; 및 (c) 세포 이동, 세포 생존 및/또는 알칼리 포스포타제 세포내 농도의 증가를 유도하는 특성중 한가지 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 분리된 단백 분자에 관한 것이다.

생물학적으로 분리된이란 용어의 의미는 분자가 생물원으로부터 1단계 이상의 정제 단계를 거친 것임을 의미하는 것이다. 이 분자는 또한 생물학적으로 순수한 것으로, 조성물내에 존재하는 다른 화합물에 대해 중량, 활성 또는 다른 편리한 수단으로 측정시 상기 조성물내 분자의 함량이 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 40% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 65% 이상, 더 더욱 바람직하게는 약 80 내지 90% 이상인 것을 의미한다. 가장 바람직한 것은 분자가 서열상 순수한 것이다.

본 발명의 제 4 양태로서, 상기 분자를 재조합 형태로 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 양태에 따라, (i) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 약 15% 이상 유사하고; (ii) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 5% 이상 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하는 재조합 분자를 제공한다.

이와 관련된 본 발명의 양태는 (i) 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고; (ii) VEGF와 공통된 특성을 한가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자에 관한 것이다.

또다른 본 발명의 관련 양태는 (i) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고; (ii) (a) 혈관 내피 세포의 증식 유도성; (b) flt-1/flk-1 수용체류와의 상호반응성; 및 (c) 세포 이동, 세포 생존 및/또는 알칼리 포스파타제 세포내 농도의 증가를 유도하는 특성중 한가지 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열 번호 1의 아미노산 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상 유사하지 않은 단백 분자를 암호하는 게놈 클론 또는 부분 게놈 클론에 관한 것이다.

서열 번호 2에 기술된 아미노산 서열은 인체 VEGF에 상응하는 것이다(이하, VEGF₁₆₅라고 약칭함). 따라서, 본 발명의 분자는 VEGF의 아미노산 서열과 유사하나 동일하지는 않은 아미노산 서열을 포함하는 VEGF-유사체 또는 VEGF 동족체이다. 본 발명은 인체 VEGF-유사 분자를 사용하여 설명하고 있지만, 가축류(예, 양, 돼지, 말 및 소), 애완 동물(예, 개 및 고양이) 및 실험실용 시험 동물(예, 쥐, 래트, 래빗 및 기니피그)과 같은 포유류, 뿐만 아니라 조류(예, 가금류), 어류 및 파충류와 같은 비포유류 유래의 동종 분자 및 암호 서열도 본 발명에 포함된다. 가장 바람직한 양태는 VEGF-유사 분자가 인체 유래의 것으로서, 염색체 11q13에 위치한 유전자에 의해 암호되는 것이다. 따라서, 본 발명은 상기 VEGF-유사 분자를 암호하는 게놈 서열 또는 그 일부까지도 포함한다.

유사성율은 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 또는 그 일부와의 유사성이 약 30% 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 40% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 50% 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 약 60 내지 70%, 가장 바람직하게는 약 80 내지 95% 이상인 것이다.

특히 바람직한 양태에서 본 발명의 VEGF-유사 분자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나, 그 일부, 단편, 유도체 또는 유사체도 포함한다. 특히 바람직한 유사성율은 약 19 내지 20% 및 29 내지 30%이다. 또한 본원에서 사용된 유도체란 결찰 변형체를 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명은 SOM175의 결찰 변형체도 포함한다. 본 발명에 포함되는 결찰 변형체의 예로는 서열 번호 6, 서열 번호 8 및/또는 서열 번호 10중 어느 하나 이상의 서열과 실질적으로 같은 아미노산 서열을 지닌 변형체 또는 이의 변이체 또는 유도체 또는 또다른 결찰 변형체를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.

제 5 양태는 (i) 서열 번호 4와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 이 아미노산 서열이 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 5% 이상 유사하지 않다면 서열 번호 4의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 15% 이상의 유사성을 가지며; (ii) VEGF와 공통된 생물학적 특성을 한가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자를 제공한다.

제 6 양태는 (i) 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 이 아미노산 서열이 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 5% 이상 유사하지 않다면, 서열 번호 6의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 15% 이상의 유사성을 지닌 아미노산 서열을 가지며; (ii) VEGF와 공통된 생물학적 특성을 한가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자를 제공한다.

제 7 양태는 (i) 서열 번호 8과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 이 아미노산 서열이 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 5% 이상 유사하지 않다면, 서열 번호 8의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 15% 이상의 유사성을 지닌 아미노산 서열을 가지며; (ii) VEGF와 공통된 생물학적 특성을 한가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자를 제공한다.

제 8 양태는 (i) 서열 번호 10과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 이 아미노산 서열이 서열 번호 2의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 5% 이상 유사하지 않다면, 서열 번호 10의 아미노산 서열 전체 또는 일부와 약 15% 이상의 유사성을 지닌 아미노산 서열을 가지며; (ii) VEGF와 공통된 생물학적 특성을 한가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자를 제공한다.

VEGF의 특성으로는 (a) 혈관 내피 세포의 증식 유도성; (b) flt-1/flk-1 수용체류와의 상호반응성; 및 (c) 세포 이동, 세포 생존 및/또는 알칼리 포스파타제 세포내 농도의 증가를 유도하는 특성중 한가지 이상의 특성을 포함한다.

본 발명에 따르면, 바람직한 유사성율은 약 40% 이상이고, 보다 바람직하게는 약 50% 이상이며, 보다 더 바람직하게는 약 65% 이상이다.

본 발명의 제 9 양태는 서열 번호 4의 아미노산 서열 일부 또는 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10에 기재된 것과 같은 결찰 변형체 또는 이의 화학적 등가체에 상응하는 펩티드 단편을 포함한다. 본 발명의 생물학적으로 분리된 분자 또는 재조합 분자는 자연적으로 글리코실화되거나 또는 이것이 분리 또는 합성된 세포 종류에 따라 변화된 글리코실화 패턴을 포함할 수 있다. 예컨대, 원핵 세포중에서 재조합 수단에 의해 생성된다면, 이 분자는 글리코실화되지 않을 것이다. 상기 분자는 완전한 길이의 자연발생된 형태이거나, 절두형 또는 유도체화된 형태일 수 있다.

본 발명의 제 10 양태는 본원에 기술된 VEGF-유사 분자를 암호하는 핵산 분자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 서열 번호 3과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 이 핵산 서열이 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열과 15% 이상 유사하나 30% 이상 유사하지 않은 경우에는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 역전사한 보체에 대해 낮은 스트린젠시 조건하에 하이브리드할 수 있거나 상기 핵산 서열 전체 또는 일부와 15% 이상의 유사성을 갖는 핵산 분자를 제공한다. 또한, 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열은 본원에서 SOM175라고 명명하였다. 비유사성율은 약 35%인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 약 39%, 가장 바람직하게는 약 40 내지 50% 이상인 것이다.

스트린젠시율은 본원에 참고 인용되는 문헌[Sambrook et al(1989), p. 9.47-9.51]에 개시된 높은 스트린젠시로 사려되는 세척 단계를 이용하여 용이하게 조성할 수 있다. 본원에 정의된 낮은 스트린젠시는 4-6X SSC/0.1-0.5% w/v SDS를 사용하여 37-45℃에서 2 내지 3시간동안 수행하는 것이다. 하이브리드화와 관련된 핵산 원료 및 농도에 따라 다른 스트린젠시 조건을 사용할 수 있으며, 예컨대, 본원에서 1-4X SSC/0.25-0/0.5% w/v SDS를 사용하여 45℃ 이상에서 2 내지 3시간동안 수행하는 것인 중간 스트린젠시 조건 또는 본원에서 0.1-1X SSC/0.1% w/v SDS를 사용하여 60℃에서 1 내지 3시간동안 수행하는 것인 높은 스트린젠시가 있다.

또한, 본 발명은 서열 번호 3과 15% 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 전술한 바와 같은 VEGF-유사 분자를 암호하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 상동성율은 약 40% 이상, 보다 바람직하게는 약 60 내지 70%이다.

본 발명은 또한, 인체 VEGF에 대응하는 쥐의 동족체에 관한 것이다(이하 mVRF라고 명명함). mVRF는 인체 VEGF와 비교하여 전체 암호 영역상의 아미노산 잔기에 대해 92%의 보존성 및 약 85%의 동질성을 갖고 있다. mVRF는 도 9와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 암호한다.

본 발명의 VEGF-유사 분자는 단독물로서 또는 VEGF와 같은 다른 분자와의 복합물로서 소정의 치료제 및/또는 진단제 개발에 유용할 것이다. 따라서, 본 발명은 VEGF-유사 분자 또는 그 일부분, 단편, 유도체, 동족체 또는 유사체 및 1종 이상의 약학적 허용성 담체 및/또는 희석제를 함유하는 약학 조성물도 포함한다. 더우기, 본 발명은 서열 번호 3의 핵산 서열, 또는 이것과 약 15% 이상의 유사성, 보다 바람직하게는 약 40%, 보다 더 바람직하게는 약 60 내지 70%의 유사성을 갖고 있으나 30% 이상, 보다 바람직하게는 약 39%의 비유사성을 갖는 핵산 서열을 함유하는 벡터 및 이를 함유하는 숙주 세포도 포함한다. 또한, 본 발명은 서열 번호 3을 근거로 하는 안티센스 분자 및 리보자임 뿐만 아니라 VEGF-유사 분자에 대한 중화 항체도 포함한다. 이러한 분자들은 예컨대, 종양에 의한 혈관신생 또는 혈관형성을 유도하는 VEGF-유사 유전자 발현시의 효과를 경감시키는데 유용하다.

본 발명의 제 10 양태는 (i) 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상은 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고; (ii) 혈관 내피 증식 인자(VEGF)와 공통된 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 단백 분자를 포유류에게 유효량 투여하는 것으로 구성되어, 포유류내에서 대교세포 증식을 유도하는 방법을 제공하며, 이 때 투여는 대교세포의 증식을 유도하기에 충분한 시간과 조건하에서 수행한다.

재조합 단백 분자는 서열 번호 3 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제 11 양태는 (i) 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상은 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고; (ii) 혈관 내피 증식 인자(VEGF)와 공통된 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 단백 분자를 포유류에게 유효량 투여하는 것으로 구성되어, 포유류내의 신경 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 방법을 제공하며, 이 때 투여는 대교세포의 증식을 유도하기에 충분한 시간과 조건하에서 수행한다.

재조합 단백 분자는 서열 번호 3 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 진단제로서 사용할 수 있는, VEGF-유사 분자를 암호하는 유전자에 대한 핵산 프로브 또는 VEGF-유사 분자에 대한 항체를 포함한다.

더우기, 본 발명은 도면 및/또는 실시예를 통해 보다 상세히 설명되며, 이것에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1

인간 cDNA 클론

최초 SOM175 cDNA는 코스미드 D11S750을 이용하여 인간 태아 뇌 라이브러리(λzapII, 스트라타진)을 스크리닝하므로써 분리하였다[참조: Larsson 등 (1992)]. 상기 플라즈미드는 생체 내에서 절단하였으며, 단일 1.1 kb cDNA를 수득하였다. 또한, 3개의 독립적인 SOM175 cDNA 클론은 인간 태아 비장 라이브러리(스트라타진, 유니-잽)으로부터 상기 SOM175 삽입물을 프로브로 사용하여 분리하였다. 3개의 독립적인 클론, 즉 SOM175-4A, SOM175-5A 및 SOM175-6A를 수득하였다. SOM175-5A는 엑손 4가 없는 교대로 결찰된 클론이었다(SOM175-e4). 이들 라이브러리 스크린은 상기 라이브러리 제조업자(스트라타진)에 의해 추천된 하이브리드화 조건 및 SOM175의 무작위 프라임된 삽입물을 이용하여 수행하였다.

또한, 두 개의 부분적인 인체 SOM175 cDNA는 λGT11 인간 흑색종 세포주 A2058 라이브러리(클론테크)로부터 분리하였다. cDNA 라이브러리 스크린은 문헌[참조: Church 와 Gilbert, (1984)]에 기재된 하이브리드화 조건을 이용하여 수행하였다. 각각의 경우에서, 프로브는 SOM175로부터 유도된 PCR 생성물(18f-700r)의 무작위 프라이밍에 의해 생성하였다.

생쥐 cDNA 클론

또한, 인체 SOM175를 사용하여 생후 1개월 이내의 생쥐 전뇌(全腦) cDNA 라이브러리(유니잽, 스트라타진)를 스크린하였다. 4개의 비키메라성 클론, 즉 M175-A, M175-B, M175-C 및 M175-D를 수득하였다. 모든 클론은 부분 cDNA 였으며, M175-C는 몇몇 인트론을 함유하였다. 이들 cDNA 중 3개의 cDNA는 엑손 6이 없었다.

M1이라 칭한 다른 클론은 서열이 완전히 결정되었으며, 전장 개방 해독틀 + 5'utr 의 부분 및 전체적인 3'utr을 함유하는 것으로 확인되었다.

실시예 2

DNA 서열 분석

cDNA 클론(SOM175)의 전체적인 서열을 해독하였으며, 상기 서열은 그의 상응하는 아미노산 서열과 함께 도 2에 제시하였다. 상기 서열은 MAP 프로그램(GCG, 위스콘신 대학)을 이용하여 개방 해독틀에 대해 스크린하였다. 672 bp인 단일 개방 해독틀이 관찰되었다(참조: 도 2). 약간의 5' 미해독 서열(2 bp)이 존재하는 것으로 생각된다. 3' 미해독 부분은 완전한 것으로 생각되는데, 그 이유는 3' 미해독 부분이 폴리아데닐화 신호 및 폴리-A-꼬리를 포함하기 때문이다.

데이터베이스 상동성 검색은 BLAST 알고리듬(미국, NCBI에서 운용함)을 이용하여 수행하였다. 본 분석은 VEGF의 몇몇 포유류형에 대한 상동성을 확인시켜 준다(참조: 도 3). SOM175 및 인체 VEGF₁₆₅사이의 상동성의 양은 BESTFIT 프로그램(GCG, 위스콘신 대학; 참조: 도 4 및 도 5)을 이용하여 수행하였다. BESTFIT 분석을 이용하여 뉴클레오티드 상동성은 69.7%로 산정하였으며, 단백질 상동성은 33.3% 이상 동일 및 52.5% 보존으로 산정하였다. 뉴클레오티드 서열에 대한 BLAST 분석으로 인간의 발현된 서열 태그 EST06302에 거의 완전히 부합되는 것을 확인하였다[참조: Adams 등, (1993)].

이들 자료는 SOM175가 VEGF와 구조적 유사성을 보유하는 증식 인자를 암호화함을 나타내고 있다. 양 유전자 모두 개시 및 종결 코돈을 유사한 위치에서 나타내며, 상동 관계의 불연속 차단물을 공유하고 있다. 모두 8개의 시스테인 뿐만 아니라 이량체화에 연루되는 것으로 생각되는 기타 VEGF 잔기의 수는 보존된다. 이들 잔기는 시스테인-47, 프롤린-70, 시스테인-72, 발린-74, 아르기닌-77, 시스테인-78, 글리신-80, 시스테인-81, 시스테인-82, 시스테인-89, 프롤린-91, 시스테인-122 및 시스테인-124이고, 이들은 도 6에 나타냈다. VEGF와 SOM175 유전자 생성물 사이에 구조적 보전이 이루어지는 경우, 이들은 기능적 유사성도 공유할 가능성이 있다. SOM175는 VEGF와 몇몇 특성을 공유하나, 자신의 독특한 특성을 보유한 VEGF-유사 분자를 암호화하는 것으로 제안되었다. VEGF₁₆₅의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 도 1에 제시하였다.

실시예 3

VEGF₁₆₅류와 SOM175 류(단백질) 사이의 유사성(%) 및 발산성(%)은 미국, 위스콘신에 소재하는 멕알리안 소프트웨어 DNASTAR를 사용하는 클러스탈법을 이용하여 분석하였다. 분석 결과는 하기 표 2a 및 2b에 나타냈다. SOM175의 교대로 결찰된 형태는 모든 엑손 6이 결실된 경우, SOM175-e6; 모든 엑손 67이 결실된 경우, SOM175-e67; 모든 엑손 4가 결실된 경우, SOM175-e4로 약식 표기하였다. SOM175의 결찰된 형태는 도 7에 도시하였다. 인트론/엑손 경계를 나타내는 SOM175의 게놈 지도는 도 8a 및 8b에 나타냈다.

실시예 4

SOM175의 기능을 결정하기 위한 생분석

본 분석을 수행하여 SOM175가 내피 세포 기능, 혈관 생성 및 상처 치료에 대해 VEGF와 유사한 활성을 보유하는지 여부를 평가하였다. 기타 분석은 수용체 결합 분포 연구를 근거로 수행하였다.

내피 세포 기능 분석

내피 세포 증식. 내피 세포 성장은 문헌[참조: Ferrara Henzel (1989) 및 Gospidarowicz 등(1989)]에 기재된 바와 같이 분석하였다.

혈관 투과성 분석. 기니아 피그 내에서 마일즈 테스트를 이용하는 본 분석은 문헌[참조: Miles Miles (1952)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

세포 접착 분석. 내피 세포에 다형체의 접착에 대한 SOM175의 영향을 분석하였다.

화학주성. 이는 표준 보이덴 챔버 화학주성 분석법을 이용하여 수행하였다.

플라스미노겐 활성제 분석. 내피 세포는 플라스미노겐 활성제 및 SOM175 첨가시 플라스미노겐 활성제 억제제 생성에 대해 테스트하였다[참조: Pepper 등 (1991)].

내피 세포 이동 분석. 이동하고, 관을 형성하기 위해 내피 세포를 자극할 수 있는 SOM175의 능력은 문헌[참조: Montesano 등 (1986)]에 기재된 바와 같이 분석하였다.

혈관 생성 분석

병아리 융모요막에서 혈관 생성 반응의 SOM175 유도는 문헌[참조: Leung 등 (1989)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

SOM175의 가능한 향신경성 작용은 하기 분석을 이용하여 평가하였다:

신경돌기 과성장 분석 및 유전자 유도(PC12 세포)

PC12 세포(크롬친화성세포종 세포주)는 교감신경 뉴우론의 특성을 발현시키므로써 NGF 및 기타 향신경성 인자에 반응하는데, 상기 반응에는 초기 및 후기 유전자의 유도 및 신경돌기의 신장이 포함된다. 이들 세포는 SOM175에 노출시켰으며, 그들의 반응은 모니터하였다[참조: Drinkwater 등 (1991); Drinkwater 등 (1993)].

말초 신경계(PNS) 유래의 배양된 뉴우론

하기 PNS 뉴우론의 초기 배양물은 SOM175에 노출시켰으며, 임의의 반응에 대해 모니터하였다:

- 신경릉(神經綾) 및 후근 신경절로부터 취한 감각 뉴우론

- 교감신경 쇄 신경절로부터 취한 교감신경 뉴우론

- 결절성 신경절로부터 취한 판 유래의 감각 뉴우론

- 척수로부터 취한 운동 뉴우론

상기 분석은 문헌[참조: Suter 등 (1992) 및 Marinou 등 (1992)]에 기재되어 있다.

시험관 내에서 반응이 관찰되는 경우, 흡수 및 역 전달과 같은 특성에 대한 생체내 분석은 문헌[참조: Hendry 등 (1992)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.

신경 재생(PNS)

SOM175의 향신경성 효과가 관찰되는 경우, 축삭절단된 감각 뉴우론, 교감신경 뉴우론 및 운동 뉴우론의 재생에서 그의 가능한 역할은 문헌[참조: Otto 등 (1989); Yip 등 (1984) 및 Hendry 등 (1976)]에 기재된 방법을 이용하여 분석하였다.

CNS 뉴우론에 대한 SOM175의 작용

중추 신경계 뉴우론의 생존을 촉진시킬 수 있는 SOM175의 능력은 문헌[참조: Hagg 등 (1992); Williams 등 (1986); Hefti (1986) 및 Kromer (1987)]에 기재된 바와 같이 분석하였다.

상처 치료

상처 치료에 조력할 수 있는 SOM175의 능력은 문헌[참조: Schilling 등 (1995) 및 Hunt 등 (1967)]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있는 대부분의 임상적으로 관련된 모델에서 테스트하였다.

조혈 시스템

조혈 시스템의 특정 세포군에 대한 여러 가지 시험관내 및 생체내 분석을 이용하였으며, 그 개요를 설명하면 다음과 같다:

간상 세포

설치류

여러 가지 신규의 시험관내 설치류 간상 세포 분석법이 FACS-정제된 세포를 이용하여 개발되어 왔다:

(a) 간상 세포의 재증식

이들은 치명적으로 방사선 조사된 생쥐의 골수를 재생시킬 수 있는 세포들이며, 표현형은 Lin^-, Rh^hi, Ly-6A/E⁺, c-kit⁺이었다. 테스트 물질은 이들 세포 상에서 단독 또는 다수의 인자와 동시 항온처리한 후,³H 티미딘 혼입에 의해 세포 증식을 측정하였다.

(b) 후기 간상 세포

비교적으로, 이들은 골수 재생 능력이 거의 없었으나, D13 CFU-S를 생성할 수 있는 세포들이었다. 이들 세포들의 표현형은 Lin^-, Rh^hi, Ly-6A/E⁺, c-kit⁺이었다. 테스트 물질은 일정 기간 동안 이들 세포와 함께 배양하였으며, 치명적으로 방사선 조사된 수용체에 주사하였으며, D13 비장 콜로니의 수를 계수하였다.

(c) 선조 세포-풍부한 세포

이들은 시험관 내에서 단일 증식 인자에 반응하는 세포들이며, 이들의 표현형은 Lin^-, Rh^hi, Ly-6A/E⁺, c-kit⁺이었다. 본 분석은 SOM175가 조혈 선조 세포에 직접 작용할 수 있는지 여부를 확인시켜줄 것이다. 테스트 물질은 한천 배양물 내에서 이들 세포와 함께 항온처리하였으며, 7 내지 14일후 콜로니의 수를 계수하였다.

동맥경화증

평활근 세포는 동맥경화증의 발생 및 진전에 결정적인 역할을 수행하는데, 이 역할 수행에는 수축 상태로부터 합성 상태로의 표현형의 변화를 필요로 한다. 마크로파지, 내피 세포, T 임파구 및 혈소판 모두는 평활근 세포의 성장 및 표현형 조절에 영향을 미침으로써 동맥경화성 플라크의 진전에 일익을 담당한다. 다세포성 환경 내에서 평활근 세포의 증식 속도 및 표현형 조절을 측정하는 임의의 시험관내 분석법을 이용하여 평활근 세포에 대한 SOM175의 효과를 평가하였다. 상기 시스템은 상이한 세포 형태가 마주하는 커버슬립 상에 시딩되는 변형된 로즈 챔버를 이용하였다.

뼈에 대한 SOM175의 효과

골아세포의 증식을 조절할 수 있는 SOM175의 능력은 문헌[참조: Lowe 등 (1991)]에 기재된 바와 같이 분석하였다. 뼈 재흡착에 대한 임의의 효과는 문헌[참조: Lowe 등 (1991)]에 기재된 바와 같이 분석하였다. 세포내 분자 내에서 골아세포 이동 및 변화에 대한 효과(예를 들어, cAMP 축적, 알칼리 포스파타아제 농도)는 문헌[참조: Midy 등 (1994)]에 기재된 바와 같이 분석하였다.

골격근 세포에 대한 효과

근아세포의 증식 및 근관의 발육에 대한 SOM175의 효과는 문헌[참조: Ewton 등 (1980) 및 Gospodarowicz 등 (1976)]에 기재된 바와 같이 결정할 수 있다.

실시예 5

설치류 VEGF DNA 클로닝

cDNA의 분리

설치류 VRF(mVRF) 클론은 λZap 신생 전뇌 cDNA 라이브러리(스트라타진)로부터 선택하였다. 고밀도 필터(5 x 10⁴pfu/평판)로부터 취한 초기 파지는 이미 기술한 바와 같이 hVRF cDNA(pSOM175)로부터 PCR에 의해 생성된 682 bp³²P-표지된 프로브를 이용하여 하이브리드화하므로써 동정하였다. 하이드리드화 및 나일론 막(하이본드-N)의 강한 세척은 문헌[참조: Church Gilbert (1984)]에 기재된 조건 및 65℃에서 수행하였다. 양성 플라크를 취하고, 정제하고, 생체 내에서 절단하여 p블루스크립트 SK- 내에 cDNA 클론을 함유하는 박테리아 콜로니를 생성하였다.

게놈 클론의 분리

게놈 클론은 λFix II 벡터(스트라타진) 내에서 클론된 생쥐 균주 SV/129 라이브러리로부터 분리하였다. 고밀도 필터(5 x 10⁴pfu/필터)는 mVRF cDNA 의 뉴클레오티드 233-798 부위의 PCR 증폭에 의해 생성된 563 bp³²P-표지된 프로브를 이용하여 스크린하였다(참조: 도 9). 양성 클론은 모으고, 400 내지 800 pfu를 함유하는 필터를 이용하여 재스크린하였다. 큰 규모의 파지 제제는 퀴아젠 λ 키트 또는 ZnCl₂정제를 이용하여 제조하였다[참조: Santos, (1991)]

뉴클레오티드 서열 결정 및 분석

cDNA는 제조업자의 사양에 따라 어플라이드 바이오시스템 인코오포레이티드(ABI) 염료 종결자 서열결정 키트를 사용하고, 여러 가지 벡터계 및 내부 프라이머를 이용하여 양 스트랜드로부터 서열결정하였다. 서열은 ABI 모델 373A 자동화 DNA 서열결정기로 분석하였다. 펩티드 상동체 배열은 프로그램 BESTFIT(GCG, 위스콘신)을 이용하여 수행하였다.

인트론/엑손 경계의 확인

엔손 경계 및 인접 부위의 확인은 생쥐 게놈 DNA 또는 mVRF 게놈 λ클론을 주형으로 사용하는 PCR을 이용하여 수행하였다. 인트론을 확인하기 위해 PCR에 사용한 프라이머는 hVRF 서열로부터 유도하였으며, 인간-생쥐 서열 불합치 어닐링 온도 5 내지 10℃ 이하를 고려하기 위해, 예상된 T_m을 사용하였다. 모든 PCR 생성물은 아가로오즈 겔 전기영동 QIA퀵 스핀 칼럼(퀴아젠)을 이용하여 정제된 겔에 의해 크기를 결정하였으며, 인트론/엑손 경계는 이들 생성물로부터 직접 서열결정하였다. 또한, 몇몇 결찰된 접합부는 MVRF*의 서브클론된 게놈 단편으로부터 서열결정하였다. 인트론/엑손 경계는 cDNA와 게놈 DNA 서열을 비교하므로써 확인하였다.

노던 분석

전체적인 세포성 RNA는 문헌[참조: Chomczynski 및 Sacchi (1987)]의 방법을 이용하여 새로운 정상적인 성체 생쥐 조직(뇌, 신장, 간, 근육) 패널로부터 제조하였다. 전체적인 RNA 20 ㎍을 전기영동하고, 나일론 막(하이본드-N, 아메르샴)으로 이전하고, 표준 조건[참조: Church 및 Gilbert (1984)] 하에서 하이브리드화하였다. 필터는 65℃에서 0.1 x SSC(20xSSC 는 3 M NaCl/0.3 M 시트르산 삼나트륨이다), 0.1% SDS 로 세척하고, 강화 스크린을 이용하여 -70℃에서 1 내지 3일 동안 X-선 필름에 노출시켰다.

mVRF cDNA의 특정화

설치류 VRF 상동체는 hVRF cDNA 를 이용하여 설치류 cDNA 라이브러리를 스크리닝하므로써 분리하였다. 크기가 0.8 내지 1.5 kb인 5개의 클론을 회수하고, 서열결정하였다. 상기 cDNA 서열을 편집하여 전체적인 개방 해독틀(결찰 형태에 따라 621 bp 또는 564 bp; 하기 참조) 및 3' UTR(379 bp) 뿐만 아니라 163 bp의 5' UTR을 포함하는 전장 1041 bp의 cDNA 서열을 수득하였다(참조: 도 9).

예상된 개시 코돈은 hVRF 내의 개시 코돈의 위치와 부합되었다. 틀에서 한 개의 다른 ATG 는 -47에 위치하였으며, 두 개의 종결 코돈은 상류(각각 -9 위치 및 -33 위치)에서 관찰되었고, 틀내에 추정적인 개시 코돈을 보유하였다.

hVRF의 예상된 N-말단 신호 펩티드는 81%의 동일성으로 mVRF 내에 존재하는 것으로 생각된다(17/21 아미노산). mVRF 내에서의 펩티드 절단은 잔기 21 이후에 발생하는 것으로 생각된다(참조: 도 10). 이들 자료는 성숙한 mVRF가 분비되고, 생각건대 증식 인자로서 작용할 수 있음을 암시하는 것이다.

hVRF에 있어서, 두 개의 개방 해독틀(ORF)은 라이브러리 스크리닝에 의해 분리된 cDNA에서 검출하였다. 5개중 4개의 클론은 교대로 결찰되었으며, hVRF의 엑손 6에 상동성인 101 bp의 단편이 없는 것으로 확인되었다(참조: 도 10).

mVRF₁₈₆을 암호화하는 메시지는 엑손 7의 말단을 향해 위치 +622에서 종결되는 암호화 서열을 갖는 621 bp ORF를 함유한다(참조: 도 9). mVRF₁₆₇을 암호화하는 더 작은 메시지는 실질적으로 +622 TAG의 하류에서 종결되는데, 그 이유는 101 bp 엑손 6으로부터의 결찰로 인한 틀 전이 및 엑손 8의 개시 위치 근처인 +666 위치에 종결 코돈(TGA)의 도입 때문이다(참조: 도 9).

mVRF₁₆₈단백질은 VEGF의 아미노부 및 중심부와 강한 상동성을 갖는 한편,카르복시 단부는 알라닌이 풍부한 완전히 발산성이었다. mVRF₁₆₇은 이들 유사성을 보유하고, 또한 C-말단에 대해 mVEGF에 대한 상동성을 유지하였다(참조: 도 11). hVRF₁₆₇에 대한 mVRF₁₆₇의 전체적인 상동성은 각각 85% 동일성 및 92% 유사성이었다(참조: 도 10). 유사하게, mVRF₁₆₇및 mVEGF 간의 상동성[참조: Breier 등 (1992)]은 각각 49% 동일성 및 71% 보존적 아미노산 치환이었다(참조: 도 11).

그러나, 표준 척추동물 폴리아데닐화 신호(AATAAA)[참조: Brinstiel 등 (1986)]는 mVRF cDNA 내에 존재하지 않지만, 매우 부합하는 서열 GATAAA가 생쥐 및인간 VRF cDNA 둘 다 내에서 유사한 위치에 존재하였다(참조: 도 9). hVRF와는 대조적으로, mVRF는 3'UTR의 3' 최단부(뉴클레오티드 위치 998 내지 1011; 참조: 도 9)에 AC 디뉴클레오티드 반복부를 함유하는 것으로 확인되었다. 이 반복부의 다형태는 디뉴클레오티드의 수가 7 에서 11 사이에서 변함에 따라 몇몇 mVRF cDNA 사이에서 관찰되었다.

mVRF의 게놈 특정화

인트론/엑손 경계(참조: 표 3)는 상응하는 hVRF의 인트론 I, III, IV 및 VI(참조: 표 3과 도 12)는 hVRF 개재서열 보다 더 작았다. 완전한 게놈 서열은 mVRF의 5' UTR로부터 가장 큰 개재 부분(2.2kb)인 인트론 IV 까지 mVRF의 증폭된 인트론 및 클론된 게놈부를 서열결정하므로써 편집하였다. mVRF와 hVRF 사이의 게놈 구조에는 한 가지 중요한 차이점이 존재하는데, 이는 mVRF의 엑손 7/인트론 VI 경계는 cDNA 서열에 대해 추가로 10 bp 하류에 위치하므로써, mVRF의 엑손 7은 hVRF 내의 상응하는 엑손 보다 10 bp 더 길다는 점이었다.

엑손 67은 인간 상동체 내에서 발생하는 것으로 확인된 바와 같이 mVRF 내에서 엑손 6과 hVRF 간의 강한 서열 상동성(참조: 도 10)은 이 서열이 유지된 인트론 서열이 아니라 오히려 VRF₁₈₆등형의 작용부를 암호화함을 암시하는 것이다.

일반적인 인트론/엑손 구조는 VEGF 유전자류(VEGF, PIGF, hVRF)의 여러 가지 구성원 사이에서 보존되었다. 따라서, mVRF 유전자의 전체적인 게놈 조직화는 이들 유전자와 매우 유사하였다(참조: 도 12).

이전의 비교 지도화 연구 결과, 염색체 11q13 상에 인간 다중 내분비 종양의 타입 1 병소 주위의 부위는 생쥐 염색체 19의 인접 단편과 동일 염색분체 상에 존재하는 것으로 확인되었다[참조: Rochelle 등 91992)]. 본 발명자들은 1 kb의 인간 MEN1 병소 내에서 hVRF 유전자를 지도화하였기 때문에(상기 참조), 설치류 VRF 유전자는 염색체 19의 중심절 근처에서 지도화되었다.

mVRF의 발현 연구

성체 생쥐 조직(근육, 심장, 폐 및 간)으로부터 취한 RNA의 노던 분석은 발현이 편재하는 것으로 생각되며, 주로 크기가 약 1.3 kb인 주 밴드로서 발생하는 것으로 생각된다(참조: 도 14). 이는 2.0 및 5.5 kb의 두 개의 주 밴드가 모든 조사된 조직 내에서 확인된, hVRF에 대해 관찰된 패턴과는 다소 상이하였다. 아마도 1.3 kb의 설치류 메시지는 더 짧은 인간 전사체에 상응하며, 이의 크기 변환은 각각의 5'UTRs의 길이 차이에 기인하는 것으로 생각되었다.

실시예 6

출생전 및 출생후 생쥐에서 설치류 VEFG의 발현

동물

임신한 생쥐(n=4) 및 어린 성체 생쥐(n=2)(스웨덴, ALAB의 C57 양육 생쥐)를 이산화 탄소로 죽이고, 관련 조직을 적출하고, 꺽쇠 상에서 냉동하였다. 조직은 추가 사용할 때까지 -70℃로 보관하였다. 본 연구에는 두 개의 임신기간을 사용하였다; 태아일 8(E8), 14 및 E17.

동일계내 하이브리드화 조직 분석

동일계내 하이브리드화는 문헌[참조: Dagerlind 등 (1992)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략히 설명하면, 횡 단편(14 ㎛)을 저온 유지 장치(독일 마이크롬) 내에서 절단하고, 프로브-온 슬라이드(미국 피셔 사이언티픽) 상에서 해동하고, 사용할 때까지 흑색의 밀봉된 상자에서 저장하였다. mVRF를 암호화화는 mRNA에 상보적인 합성 42량체 올리고뉴클레오티드의 서열은 ACCACCACCTCCCTGGGCTGGCATGT GGCACGTGCATAAACG[서열 번호: 11](뉴클레오티드 120-161에 상보적임) 및 AGTTGTTT GACCACATTGCCCATGAGTTCCATGCTCAGAGGC[서열 번호: 12](뉴클레오티드 162-203에 상보적임)이었다. 2개의 교대로 결찰된 형태를 검출하기 위해, 올리도뉴클레오티드 GATCCTGGGGCTGGAGTGGGATGGATGATGTCAGCTGG[서열 번호: 13](뉴클레오티드 xxx-xxx에 상보적임) 및 GCGGGCAGAGGATCCTGGGGCTGTCTGGCCTCACAGCACT[서열 번호: 14]를 사용하였다. 프로브는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(미국 IBI)로 특이 활성 7-10 x 10⁸cpm/㎍ 까지 3'-말단에 표지하였으며, 42℃에서 16-18 시간 동안의 예비처리없이 상기 단편에 하이브리드화하였다. 하이브리드화 혼합물은 50% v/v 포름아미드, 4xSSC(1xSSC = 0.15 M NaCl 및 0.015 M 나트륨 시트레이트), 1 x 덴하르트 용액(각각 0.02% 폴리비닐피롤리돈, BSA 및 피콜), 1% v/v 사르코실(N-라우로일사르코신; 시그마), 0.02 M 인산염 완충용액(pH 7.0), 10% w/v 덱스트란 설페이트(스웨덴 파마시아), 250 ㎍/㎖ 효모 tRNA(시그마), 500 ㎍/㎖ 전단 처리 및 열 변성된 연어 정자 DNA(시그마) 및 200 mM 디티오트레이톨(DTT; 스웨덴 LKB)을 포함하였다. 대조용 단편에서, 양 프로브의 특이성은 상기 하이브리드화 혼합물에 20배 초과량의 미표지된 프로브를 첨가하므로써 조사하였다. 또한, 인접 단편은 상이한 발현 패턴을 제공하는, 본 연구와는 무관한 프로브와 하이브리드화하였다. 하이브리드화후, 상기 단편은 1 x SSC 로 55℃에서 수회 세척하고, 에탄올 내에서 탈수하고, NTB2 핵 트랙 에멀젼(미국 코닥)내에 침지하였다. 3 내지 5주후, 상기 단편은 D-19 현상액(미국 코닥) 내에서 현상하고, 커버 슬립으로 덮었다. 몇몇 경우, 단편을 에멀젼 침지하기 전에 자동방사능 필름(영국 베타-맥스 오토라디오그래피 필름 아메르샴 리미티드)에 노출시켰다.

4개의 상이한 프로브는 조사한 모든 조직에서 동일한 하이브리드화 패턴을 제공하였다. 생쥐 VRF 발현은 이미 E8 배에서 관찰되었으며, 양성 신호는 신경관에 가장 상응할 것 같은 구조에 대해 기록하였다.

E14 생쥐 배의 시상봉합부에서, 가장 강한 하이브리드화 신호는 심장과 신경계, 특히 대뇌 피질에 존재하였다(참조: 도 14A). 후기 임신 기간 E17에서, 높은 mVRF mRNA 신호는 심장, 등의 갈색 지방 조직 및 목 주위에 국한되었다(참조: 도 14B). 명백히 양성인 하이브리드화 신호는 척수의 회백질 및 혀 내에 존재하였다(참조: 도 14B). 대뇌 피질의 발현은 14일에 비해 명백히 감소하였다. 예를 들어, 근육 내에서 E14 배 내에서 나타난 약한 바탕 발현은 본 임신기간에서 감소하였다. 강한 mVRF mRNA 하이브리드화 신호는 단지 어린 성체 생쥐의 심장 및 갈색 지방 내에서만 존재하였다(참조: 도 14C). 심장에 대한 신호는 유두 근육을 포함하는 전체적인 심실벽에 분포하였다(참조: 도 14D). 과량의 냉 프로브와 하이브리드화하는 심장 조직 단편에서, 바탕 신호에 대해 표지화하는 기록된 바탕 신호는 없었다(참조: 도 14E).

심장을 제외하고, mVRF mRNA 신호는 갈색 지방과 형태학적으로 유사한 흉곽 외부의 어떤 조직에 존재하였다. 이는 동일한 부분에서 강한 염색을 나타내는 수단 블랙 대응염색으로 확인하였다(참조: 도 15A 및 도 15B). 성체 생쥐 척수의 횡 단편에서, mVRF 프로브는 회백질 부분에 대해 신경 염색 패턴을 제공하였다(참조: 도 15C). 톨루이딘을 이용하는 대응염색(참조: 도 15D)은 복부 혼(참조: 도 15C 및 15D), 배 혼의 저부 및 중심 도관 주변의 운동 뉴우론이 mVRF mRNA에 대해 큰 양으로 양성인 것으로 나타났다.

실시예 7

병아리 감각 뉴우론에 대한 VEGF 및 SOM175 단백질의 효과

E8 병아리 김각 뉴우론에 대한 VEGF 및 SOM175의 효과는 문헌[참조: Nurcombe 등 (1992)]에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다. 뉴우론 분석은 1개의 분석 웰 당 2000 개의 세포를 이용하여 48 시간째에 판독하였다. 결과는³H-티미딘 계수를 이용하여 수득하였다. 뉴우론의 생존율(%), 신경돌기 외성장 및 평균 신경돌기 길이(㎛)는 양성 대조용으로 NGF를 이용하고, VEGF, 헤파린 존재 하에서의 VEGF 및 헤파린 및 5 μM의 5'-플루오로우라실(5FU) 존재 하에서 VEGF의 농도를 변화시키면서 측정하였다. 5FU는 신경교질 세포를 사멸시켰다.

상기 측정 결과는 도 16에 나타냈다. 상기 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, VEGF는 뉴우론 생존을 촉진하는데 효과적이었으나, 상기 효과에는 신경교질 세포의 존재를 필요로 하였다. 도 17은 3개 타입의 병아리 신경교에 대한 VEGF 및 SOM175의 효과를 측정한 결과를 나타낸다. 테스트한 신경교는 CNS 신경교, 말초 신경교 및 CNS 희돌기교세포(稀突起膠細胞)였다. 헤파린은 모든 배양물에서 10 ㎍/㎖ 이었으며, 분석은 24시간째에 판독하였다. 결과는 1개의 웰당 2000개의 세포를 이용하는³H-티미딘 계수로 측정하였다.

상기 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 병아리 중추 뉴우론 및 말초 뉴우론에 있어서, 대교세포는 헤파린 존재 하에서 SOM175에 의해 현저히 자극되어 증식하지만, 병아리 희돌기교세포는 분열 속도 증가가 무시할 수 있을 정도로 나타났다.

실시예 8

생쥐 초기 뉴우론 및 중추 뉴우론에 대한 SOM175 단백질의 효과

실시예 7의 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, VEGF 등형은 대교세포의 작용을 통해 병아리 초기 뉴우론 및 중심 뉴우론에 대한 효과를 보유하였다. 유사한 실험을 생쥐 세포에서 반복 수행하였다.

배양 조건

문헌[참조: Methods in Neurosciences(Vol. 2): Cell Culture Ed. P.M. Conn, Academic Press, San Diego (1990)]의 대교세포에 대해서는 pp33-46, 희돌기교세포에 대해서는 pp56-74 및 중추 뉴우론에 대해서는 pp87-102에 기재된 바와 같이 모든 시험관내 실험에서 뉴우론 세포 및 신경교 세포를 제조하고, 배양하였다.

세포는 폴리-L-오르니틴(0.1 ㎎/㎖)으로 피복한 24-웰 배양 클러스터(Nunc) 상에서 2,000 세포/웰의 밀도로 평판배양하였다. 배양 개시후 48 시간이 경과한 후, 널리 알려진 기법[참조: Maruta 등 (1993)]을 이용하여 역상 광 하에서 상기 웰 내의 뉴우론을 계수하였다. 신경교질 세포는 하기 하는 바와 같이 세포 분열 속도를 모니터하기 위해 [³H]티미딘 흡수를 이용하여 평가하였다. 헤파린(10 ㎍/㎖, 저분자량 분획, 시그마 케미칼 코오포레이숀)은 특별히 언급되는 경우를 제외하고, 배양중 항상 존재하였다. 뉴우론 배양물은 5 mM 5-플루오로-2-데옥시우리딘(시그마)으로 보충하여 바탕 신경교질 성장을 억제하였다.

신경교질 세포 증식에 대한³H-티미딘 혼입 분석

상기 세포는 표준 배지 내의 저장 농도 0.1 mCi/㎖로부터³H-티미딘(특이 활성 103 μCi/㎍)을 이용하여 14 시간 동안 펄스처리하고, 최종 배양 부피를 20 ㎕/웰로 하였다. 상기 웰의 내용물을 수거하고, 니트로셀룰로오즈 페이퍼(타이터텍, 플로우) 상에 흡수하였다. 잔류하는 흡착 세포는 트립신/베르센(오스트레일리아, 빅토리아 CSL 리미티드)과 함께 5분 동안 배양하여 제거하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 니트로셀룰로오즈 디스크는 표준 타이터텍 회수기(플로우)내에서 처음에는 증류수, 그 다음에는 메탄올을 이용하여 세척하였다. 상기 니틀로셀룰로오즈 디스크를 건조하고, 섬광 유체(5% v/v 트리톤-X를 함유함)를 첨가하고, 상기 디스크는 섬광 계수기 상에서 계수하였다.

가장 큰 활성은 헤파린과 함께 전달되는 경우 그들의 증식에 현저한 자극이 존재하는 생쥐 대교세포 배양물 상에서 엑손 6이 없는 SOM175(SOMΔX6)의 제조물을 이용하여 확인하였다(참조: 도 16). 희돌기교세포의 증식에 대한 자극은 거의 없었으며(참조: 도 17), 분리된 전뇌 뉴우론의 생존 반응의 식별할 수 있는 가능성은 매우 희박했다(참조: 도 18). 모두 세 개의 그래프에서 각각의 점에 대한 표준 오차는 8% 미만이었다.

뉴우론의 생존 가능성은 신경교질 세포 증식을 촉진하므로써 유지할 수 있다. 또한, SOMΔX6은 대교세포 증식의 양호한 인듀서이며, 중추 신경계 내피 세포 상에서 대교세포 무수신경섬유의 형성과 함께 발현될 수 있다.

당업자는 본원에 기술된 본 발명이 본 명세서에 상세히 기술된 것과는 다르게 변형 실시될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명은 이러한 모든 변형 실시를 포함하는 것으로 이해하여야 할 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 언급 또는 제시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 개별적으로 또는 총괄하여 포함하며, 상기 단계 또는 특징중 임의의 두 개 이상의 모든 조합을 포함한다.

설치류 VRF 유전자의 결찰 접합

5' UTR^*	엑손 1	223bp	CCCAGgtacgtgcgt	인트론 I	495bp
ttccccacagGCCCC	엑손 2	43bp	GAAAGgtaataatag	인트론 II	288bp
ctgcccacagTGGTG	엑손 3	197bp	TGCAGgtaccagggc	인트론 III	196bp
ctgagcacagATCCT	엑손 4	74bp	TGCAGgtgccagccc	인트론 IV	182bp
ctcttttcagACCTA	엑손 5	36bp	GACAGattcttggtg	인트론 V	191bp
ctcctcctagGGTTG	엑손 6	101bp		인트론 없음
CCCACTCCAGCCCCA	엑손 7	135bp	TGTAGgtaaggagtc	인트론 VI	~2200bp
cactccccagGTGCC	엑손 8	394bp	AGAGATGGAGACACT
대문자 및 소문자는 각각 엑손 및 인트론의 서열을 나타낸다.^*는 엑손 1의 5' 말단이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.

관계 서적 목록

Adams MD, Soares MB, Kerlavage AR, Fields C, Venter JC,(1993) Nature Genet, 4, 373-380.

Birnstiel ML, Busslinger M 및 Strub K (1985) Cell 41,349-359.

Breier G, Albrecht U, Sterrer S 및 Risau W (1992) Development 114.521-532.

Chomczynski P 및 Sacchi N (1987) Analyt. Biochem. 162, 156-159.

Church G 및 Gilbert W (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 18, 1991-1995.

Dagerlind A, Friberg K, Bean AJ 및 Hokfelt T (1992) Histochemistry 98, 39-49.

Dissen GA, Lara HE, Fabrenbach WH, Costa ME, Ojeda SR, (1994) Endocrinology 134, 1146-1154.

Drinkwater CC, Barker PA, Suter U 및 Shooter EM (1993) J. Biol.Chem., 268, 23202-23207

Drinkwater CC, Suter U, Angst C 및 Shooter EM (1991) Proc. Roy. Soc. Lond. (시리즈 B), 246,307-313.

Ewton DZ Florini JR (1980) Endocrinology, 106: 577-583.

Ferrara N Henzel WJ (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 161, 851-185.

Folkman J Shing Y (1992) J. Biol. Chem. 267, 10931-10934.

Gospodarowicz D, Abraham JA Schilling J (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 7311-7315.

Gospodarowicz D, Weseman J, Morgan JS Lindstrom J (1976) J.Cell Biol., 70: 395-405.

Hagg T, Quon D, Higaki J Varon S (1992) Neuron, 8, 145-158.

Hefti S (1986) J.Neurosci, 6, 2155-2162.

Hendry IA Campbell J (1976) J. Neurocytol., 5, 351-360.

Hendry IA, Murphy M, Hilton DJ, Nicola NA Bartlett PF (1992) J. Neurosci. 12, 3427-3434.

Hunt 등, (1967) Am. J. Surgery, 114: 302-307.

Koch AE, Harlow LA, Haines GK, Amento EP, Unemoti EN, Wong WL, Pope RM, Ferrara N, (1994) J. Immunol. 152, 4149-4156.

Kromer AF (1987) Science, 235, 214-216.

Larsson C, Weber G, Kvanta E, Lewis C, Janson M, Jones C, Glaser T, Evans G, Nordenskjold M, (1992) Hum. Genet. 89, 187-193.

OZUS Leung DW, Cachianes G, Kuang W-J, Goeddel DV Ferrara N (1989) Science 246: 1306-1309.

Lowe C, Cornish J, Callon K, Martin TJ Reid IR (1991) J. Bone Mineral Res., 6, 1277-1283.

Martinou JC, Martinou I Kato AC (1992) Neuron, 8, 737-744.

Lowe C, Cornish J, Martin TJ Reid IR (1991) Calcif. Tissue Int., 49, 394-397.

Maruta 등 (1993) Growth Factors 8: 119-134.

Midy V Plouet J (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun., 199: 380-386.

Miles AA Miles EM (1952) J. Physiol. (Lond) 118:228-257.

Montesano R, Vassalli JD, Baird A, Guillemin R Orci, L (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 83, 7297-7301.

Nurcombe 등 (1992) Development 116: 1175-1183.

Otto D., Frotscher M Unsicker K (1989) J. Neurosci. Res., 22, 83-91.

Pepper MS, Ferrara N, Orci L, Montesano R. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 902-906.

Rochell JM, Watson ML, Oakey RJ 및 Seldin MF (1992) Genomics 14, 26-31.

Roth S Weston J (1967) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 58: 974-980.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 제 2 판 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Santos MA (1991) Nucleic Acids Res. 19, 5442.

Schilling 등,(1959) Surgery, 46: 702-710.

Senger DR, Van De Water L, Brown LF, Nagy JA, Yeo KT, Yeo TK, Berse B, Jackman RW, Dvorak AM, Dvorak HF (1993) Cancer Netastasis Rev. 12, 303-324.

Sharkey AM, Chamock-Jones DS, Boocock CA, Brown KD, Smith SK, (1993) J. Reprod. Fertil. 99, 609-615.

Sunderkotter C, Steinbrink K, Goebeler M, Bhardway R, Sorg E, (1993) J. Leukocyt. Biol. 55, 410-422.

Suter U, Angst C, Tien C-L, Drinkwater CC, Lindsay RM 및 Shooter EM (1992) J. Neurosci., 12, 306-318.

Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D, Fiddes JC, Abraham J (1991) J. Biol. Chem. 266, 11947-11954.

Williams LR, Varon S, Peterson GM, Wictorin K, Fischer W, Bjorklund A Gage FH (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9231-9235.

Yan Z, Weich HA, Bernart W, Breckwoldt M, Neulen J, (1993) J. Clin. Endocrinol. Metab. 77, 1723-1725.

Yip NK, Rich KM, Lampe PA Johnson EM Jr (1984) J. Neurosci., 4, 2986-2992.

서열표

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 :

(미국 이외의 국가) 암레드 오퍼레이숀즈 피티와이.리미티드

(미국에 한해서) 헤이워드, 엔. 및 웨버 지.

(ii) 발명의 명칭 : 신규의 증식 인자 및 이를 암호하는 유전자 서열

(iii) 서열의 수 : 14

(iv) 서신 주소:

(A) 수신인 : 데비스 콜리즌 케이브

(B) 스트리트 : 1 리틀 콜린스 스트리트

(C) 도시 : 멜보른

(D) 주 : 빅토리아

(E) 국가 : 오스트레일리아

(F) ZIP : 3000

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체 유형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 겸용식

(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PantentIn Release #1.0, 버전 #1.25

(vi) 선행 출원 자료 :

(A) 출원 번호 :PCT INTERNATIONAL

(B) 출원 일자 : 1996년 2월 22일

(vii) 종래 출원 데이터:

(A) 출원 번호 : 오스트레일리아 PN1457

(B) 출원 일자 : 1995년 3월 2일

(A) 출원 번호 : 오스트레일리아 PN6647

(B) 출원 일자 : 1995년 11월 20일

(A) 출원 번호 : 오스트레일리아 PN7274

(B) 출원 일자 : 1995년 12월 22일

(viii) 대리인 정보 :

(A) 성명 : 허그스 닥터, 이 존 엘

(C) 참조번호 : EJH/EK

(ix) 통신 정보 :

(A) 전화 : +61 3 9254 2777

(B) 팩스 : +61 3 9254 2770

(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 649 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : DNA

(ix) 특징:

(A) 명칭/검색표: CDS

(B) 위치: 17...589

(xi) 서열 : 서열 번호 1:

(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 191 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 : 서열 번호 2:

(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 1094 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : DNA

(ix) 특징:

(A) 명칭/검색표: CDS

(B) 위치: 3..624

(xi) 서열 : 서열 번호 3:

(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 207 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 : 서열 번호 4:

(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 993 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : DNA

(ix) 특징:

(A) 명칭/검색표: CDS

(B) 위치: 3..566

(xi) 서열 : 서열 번호 5:

(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 188 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 : 서열 번호 6:

(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 858 염기쌍

(B) 서열형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : DNA

(ix) 특징:

(A) 명칭/검색표: CDS

(B) 위치: 3..431

(xi) 서열 : 서열 번호 7:

(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 143 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 : 서열 번호 8:

(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 910 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : DNA

(ix) 특징:

(A) 명칭/검색표: CDS

(B) 위치: 3..305

(xi) 서열 : 서열 번호 9:

(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 101 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 단백질

(xi) 서열 : 서열 번호 10:

(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 42 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 : 서열 번호 11:

(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 42 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 : 서열 번호 12:

(2) 서열 번호 13 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 38 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 : 서열 번호 13:

(2) 서열 번호 14 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 40 염기쌍

(B) 서열형 : 핵산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 분자 형태 : 올리고뉴클레오티드

(xi) 서열 : 서열 번호 14:

Claims

(i) 서열 번호 2의 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상은 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고;

(ii) 혈관 내피 증식 인자(VEGF)와 공통된 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 분리된 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 분자가

(i) 혈관 내피 세포의 유도성;

(ii) flt-1/flk-1 수용체류와의 상호 반응성; 및/또는

(iii) 세포 이동, 세포 생존 및 또는 알카리 포스파타제의 세포내 농도 증가를 유도할 수 있는 특성 중 1가지 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 단백 분자.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 분자가 대교 세포의 증식을 유도할 수 있는 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 상기 분자가 인체에서 유래한 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 상기 분자가 인체에서 유래한 것이 아닌 단백 분자.
제 5 항에 있어서, 상기 분자가 가축류, 애완 동물, 실험실용 시험 동물, 조류, 어류 또는 파충류 유래인 단백 분자.
제 5 항에 있어서, 상기 분자가 염색체 11q13에 위치한 유전자에 의해 암호화되는 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 2에 대한 유사성율이 약 30% 이상인 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 2에 대한 유사성율이 약 40% 이상인 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 2에 대한 유사성율이 약 60-70% 이상인 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 4와 동일한 아미노산 서열 또는 그 일부, 단편, 유도체 또는 이의 유사체를 포함하는 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 그 일부, 단편, 유도체 또는 이의 유사체를 포함하는 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 8과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 그 일부, 단편, 유도체 또는 이의 유사체를 포함하는 단백 분자.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 10과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 그 일부, 단편, 유도체 또는 이의 유사체를 포함하는 단백 분자.
(i) 서열 번호 4와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 그 서열과 약 15% 이상 유사성을 갖지만 서열 번호 2의 아미노산 서열과는 약 5% 이상은 유사하지 않는 서열;

(ii) VEGF와 공통된 생물학적 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
(i) 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 그 서열과 약 15% 이상 유사성을 갖지만 서열 번호 2의 아미노산 서열과는 약 5% 이상은 유사하지 않는 서열;

(ii) VEGF와 공통된 생물학적 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
(i) 서열 번호 8과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 그 서열과 약 15% 이상 유사성을 갖지만 서열 번호 2의 아미노산 서열과는 약 5% 이상은 유사하지 않는 서열;

(ii) VEGF와 공통된 생물학적 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
(i) 서열 번호 10과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 그 서열과 약 15% 이상 유사성을 갖지만 서열 번호 2의 아미노산 서열과는 약 5% 이상은 유사하지 않는 서열;

(ii) VEGF와 공통된 생물학적 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
제 15 항 내지 18 항중 어느 한 항에 있어서,

(i) 혈관 내피 세포의 유도성;

(ii) flt-1/flk-1 수용체류와의 상호 반응성; 및/또는

(iii) 세포 이동, 세포 생존 및 또는 알카리 포스파타제의 세포내 농도 증가를 유도할 수 있는 특성 중 1가지 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 분자.
제 15 항 내지 제 18 항중 어느 한 항에 있어서, 대교 세포의 증식을 유도할 수 있는 재조합 분자.
제 20 항에 있어서, 분자가 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 재조합 분자.
서열 번호 4의 아미노산 서열의 일부 또는 이의 유도체 또는 화학적 등가체에 해당하는 펩티드 단편.
제 22 항에 있어서, 서열 번호 6의 서열 또는 이의 화학적 등가체를 갖는 펩티드 단편.
제 22 항에 있어서, 서열 번호 8의 서열 또는 이의 화학적 등가체를 갖는 펩티드 단편.
제 22 항에 있어서, 서열 번호 10의 서열 또는 이의 화학적 등가체를 갖는 펩티드 단편.
(i) 서열 번호 2의 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상은 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고;

(ii) 혈관 내피 증식 인자(VEGF)와 공통된 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열 또는 단백 분자를 암호화하는 서열에 상보적 서열을 포함하는 핵산 분자.
제 26 항에 있어서, 단백 분자가

(i) 혈관 내피 세포의 유도성;

(ii) flt-1/flk-1 수용체류와의 상호 반응성; 및/또는

(iii) 세포 이동, 세포 생존 및 또는 알카리 포스파타제의 세포내 농도 증가를 유도할 수 있는 특성 중 1가지 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 27 항에 있어서, 단백 분자가 대교 세포의 증식을 유도할 수 있는 핵산 분자.
제 28 항에 있어서, 상기 분자가 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, 상기 분자가 인체에서 유래한 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, 서열 번호 2에 대한 유사성율이 약 30% 이상인 핵산 분자.
제 26 항에 있어서, 서열 번호 3과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 상기 핵산과 15% 이상 유사하거나 또는 이 핵산 서열이 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열과 15% 이상 유사하나 30% 이상 유사하지 않은 경우에는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 역전사한 보체에 대해 낮은 스트린젠시 조건하에 하이브리드할 수 있는 핵산 분자.
제 26 항에 있어서, 인체 VEGF의 쥐 동족체를 암호화하고 도 9와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 11 항중 어느 한 항에서 정의한 단백 분자를 포함하는 약학적 조성물 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제.
(i) 서열 번호 2의 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상은 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고;

(ii) 혈관 내피 증식 인자(VEGF)와 공통된 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 트징으로 하는 재조합 분자를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 재조합 분자를 합성하고 이 분자를 분리하는데 효과적인 조건에서 성장한 적절한 숙주에 의해 재조합 분자를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 포함하는 방법.
제 35 항에 있어서, 핵산 분자가 서열 번호 3과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이 핵산 서열과 15% 이상 유사하거나 또는 이 핵산 서열이 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열과 15% 이상 유사하나 30% 이상 유사하지 않은 경우에는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열을 역전사한 보체에 대해 낮은 스트린젠시 조건하에 하이브리드할 수 있는 방법.
포유 동물의 대교 세포의 증식을 유도하는 방법으로, 상기 방법이

(i) 서열 번호 2의 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상은 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고;

(ii) 혈관 내피 증식 인자(VEGF)와 공통된 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 단백 분자를 포유류에게 대교 세포 증식을 유도하기에 충분한 시간과 조건에서 유효량 투여하는 것으로 구성되는 방법.
제 37 항에 있어서, 재조합 단백 분자가 서열 번호 3과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 방법.
제 37 항에 있어서, 재조합 단백 분자가 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 방법.
포유류내의 신경 세포 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 방법으로서, 상기 방법은

(i) 서열 번호 2의 서열과 약 15% 이상 유사하나 약 5% 이상은 유사하지 않은 아미노산 서열을 포함하고;

(ii) 혈관 내피 증식 인자(VEGF)와 공통된 특성을 1가지 이상 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 단백 분자를 포유류에게 대교 세포 증식을 유도하기에 충분한 시간과 조건에서 유효량 투여하는 것으로 구성되는 방법.
제 40 항에 있어서, 재조합 단백 분자가 서열 번호 3과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 방법.
제 40 항에 있어서, 재조합 단백 분자가 서열 번호 6과 실질적으로 동일한 아미노산 서열 또는 이의 유도체를 포함하는 방법.