KR20000011069A - 리간드 개발 및 다변수 단백질 화학의 최적화를 위한미량이식판 열 이동 분석 및 그 장치 - Google Patents
리간드 개발 및 다변수 단백질 화학의 최적화를 위한미량이식판 열 이동 분석 및 그 장치Info
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Abstract
본 발명은 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자에 대해 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 표적 분자를 각각의 다수 용기에서 다수의 상이한 분자중 하나의 분자와 접촉시키는 단계, 다수의 용기들을 동시에 가열하는 단계, 각각의 용기에서 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하고 그로부터 중점 온도(Tm)을 결정하는 단계, 각각의 열 변성 곡선의 Tm을 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에서 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계, 및 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 다수의 상이한 분자의 친화도를 평가하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 다수의 샘플을 동시에 가열하는 온도 조정 수단 및 샘플이 가열되는 동안 샘플로부터 분광 방출을 수용하는 수용 수단을 구비하는 분석 장치를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에서 수용 수단은 형광 방출, 자외광 및 가시광을 수용하도록 구성될 수 있다. 수용 수단은 다양한 방법으로, 예를 들면, 한 번에 하나씩, 하나 이상의 샘플로부터 동시에, 또는 샘플 전부로부터 동시에, 샘플로부터 분광 방출을 수용하도록 구성될 수 있다. 온도 조정 수단은 예정된 프로필에 따라 온도를 변화시키는 온도 제어기를 구비할 수 있다.
Description
최근에, 약학 분야의 연구자들은 신약 발견을 위해 새로운 주도 화합물의 공급원으로서 조합 라이브러리에 관심을 가지고 있다. 조합 라이브러리는 화학 합성법이나 생물학적 합성법으로, 또는 다수의 화학적 "구성단위(building blocks)"를 시약으로 배합함으로써 생성된 화학적 화합물의 집합체이다. 예를 들면, 조합 폴리펩티드 라이브러리는 주어진 화합물의 길이(즉, 폴리펩티드 화합물에서 아미노산의 수)에 대해 모든 가능한 방식으로 한 세트의 아미노산을 조합함으로써 형성된다. 수많은 화학적 화합물은 이론적으로 화학적 구성단위의 그러한 조합적 혼합을 통해 합성될 수 있다. 실제로, 어떤 연구자는 100개의 호환성 화학적 구성단위를 조직적이고 조합적으로 혼합하면, 1억개의 4량체 화합물 또는 100억개의 5량체 화합물이 산출된다는 것을 관찰하였다(Gordon,E.M. 등, J. Med. Chem. 37:1233-1251(1994)).
조합 라이브러리의 합성 속도는 화합물의 합성 및 평가를 자동화함으로써 가속된다. 예를 들면, 디렉티드디버시티(등록상표 DirectedDiversity)는 지정된 물리적 성질, 화학적 성질 및/또는 생물활성을 가진 화학적 실체를 생성시키기 위한 컴퓨터에 기초한 반복 공정이다. 디렉티드디버시티 시스템은 본원에 전적으로 참고로 인용한 미국 특허 제5,463,564호에 개시되어 있다.
일단 라이브러리가 구성되면, 일종의 생물학적 또는 약리학적 활성을 가진 화합물을 동정하기 위해 검색되어야 한다. 화합물의 라이브러리를 검색하기 위해서는, 라이브러리내 각 화합물이 효소와 같은 당해 표적 분자와 평형을 이루어야 한다. 주도 화합물에 대한 조합 라이브러리를 검색하기 위해 다양한 방법을 사용하여 왔다. 예를 들면, 암호화된 라이브러리에서 화학적 조합 라이브러리의 각 화합물은 올리고뉴클레오티드 "표지"가 그 화합물에 연결되도록 할 수 있다. 각 화합물에 대한 핵산 표지 서열에 관해 세심하게 계속 기록한다. 표적 효소에 영향을 미치는 화합물은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 그 핵산 표지를 증폭시킴으로써 선별한다. 표지의 서열로부터, 그 화합물을 동정할 수 있다(Brenner,S.등, Proc. Natl. Acad. USA 89:5381-5383(1992)). 그러나, 이 연구는 매우 시간 소모적인데, 그 이유는 이 연구가 수차례의 올리고뉴클레오티드 표지 증폭 및 그에 이은 증폭 생성물의 전기영동을 필요로 하기 때문이다.
사상 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리는 비오티닐화된 항체, 수용체 또는 기타 결합 단백질에의 결합에 대해 검색할 수 있다. 결합된 파지를 사용하여 박테리아 세포를 감염시킨 다음, 나타난 결정인자(즉, 펩티드 리간드)를 동정한다(Scott, J.K. 등, Science 249:386-390(1990)). 이 연구는 여러 가지의 결점을 안고 있다. 그것은 시간 소모적인 일이다. 파지 또는 박테리아에 대해 독성이 있는 펩티드는 연구될 수 없다. 더욱이, 연구자는 펩티드 화합물의 조사에 한정된다.
국제특허출원 WO94/05394호(1994)(Hudson 등)에는 4×4 내지 400×400의 배열로 고체상 평판상의 생체고분자(biopolymer)의 조합 라이브러리를 합성 및 검색하기 위한 방법 및 장치가 개시되어 있다. 이 라이브러리는 형광 표지되거나, 방사성 표지되거나 또는 효소 결합된 표지 분자 또는 수용체를 사용하여 검색할 수 있다. 이 방법의 결점은 표적 분자를 라이브러리 검색에 사용하기 전에 표지하여야 한다는 점이다.
현재 이용 가능한 조합 라이브러리 검색 기술에 의해 나타나는 문제점은 이 기술이 수용체 단백질에 대한 상이한 리간드의 상대적인 결합 친화도에 대해 아무런 정보를 제공하지 못한다는 점이다. 이것은 조합 라이브러리의 생성 방법이 펩티드의 파지 라이브러리 디스플레이(Scott, J.K. 등, Science 249:386-390(1990)), 무작위 합성 펩티드 배열(Lam, K.S. 등, Nature 354:82-84(1991)), 암호화된 화학 라이브러리(Brenner, S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383(1992)), 허드슨의 방법(국제특허출원 WO94/05394) 또는 가장 최근에는 조합적 유기 합성법(Gordon, E. 등, J. Med. Chem. 37:1385-1399(1994))을 포함하는 경우에 그러하다.
표적 효소에 대한 리간드 친화성의 고처리량 검색으로부터 정량적 결합 데이터를 얻기 위해서, 연구자들은 효소 활성의 분석에 의존하여 왔다. 리간드 결합의 효과는 역학적 분석법을 사용하여 모니터할 수 있기 때문에, 효소는 스스로 고처리량 검색에 이용된다. 실험의 목표점은 보통 분광광도의 변화이다. 역학적 분석법을 사용하여 다수의 연구자들은 주도 화합물을 발견하기 위한 2 단계의 방법을 사용한다. 먼저, 화합물의 대형 라이브러리를 표적 효소에 대해 검색하여 라이브러리 화합물중 어느 것이 활성이 있는 지를 측정한다. 이러한 분석은 통상 1개 내지 3개의 복사판으로 단일의 농도(10-4M 내지 10-6M)에서 수행한다. 둘째, 통상 첫 번째 검색으로부터 수득한 유망한 화합물(즉, 설정치보다 더 큰 활성을 나타내는 화합물)을 재시험하여 50% 억제 농도(IC50), 억제제 회합 상수(Ki) 또는 해리 상수(Kd)를 측정한다. 그러나, 이러한 2 단계 방법은 매우 노동 집약적이고, 시간 소모적이며 착오가 발생하기 쉽다. 각각의 재시험 샘플은 본래의 분석판으로부터 회복되거나 계량하여 재용해되어야 한다. 각 샘플에 대해 농도 곡선을 만들어야 하고, 각 분석에 대해 별도의 분석판 세트를 만들어야 한다.
조합 라이브러리의 고처리량 검색을 위한 생화학적 방법과 관련된 기타 문제들이 있다. 통상, 주어진 분석을 1종 이상의 수용체에 적용할 수는 없다. 즉, 하나의 새로운 수용체를 시험에 이용할 수 있게 되는 경우, 새로운 분석법이 개발되어야 한다. 다수의 수용체의 경우, 간단히 이용할 수 있는 신뢰성 있는 분석법이 없다. 분석법이 존재하더라도, 그 자체를 자동화할 수는 없다. 또한, Ki가 역학 분석에서 측정하여야 할 종말점인 경우, 먼저 사용할 억제제의 농도에서 추정하고, 분석을 실시한 다음, 6개 이상의 상이한 억제제 농도를 사용한 추가의 분석을 실시하여야 한다. Ki를 너무 낮게 추정하면, 억제제는 시험한 최적 농도 이하에서는 그 억제 효과를 나타내지 못한다.
전술한 역학 검색 방법에 대한 결점 외에도, 효소의 활성 부위의 외부에 결합하는 리간드를 동정하고 평가하기 위해 역학적 방법을 사용하기는 어려운 일이다. 활성 부위의 외부에 결합하는 리간드는 분광광도 측정 기질의 결합을 방해하지 않기 때문에, 모니터되는 분광 광도의 변화는 없다. 역학적 검색 방법의 훨씬 더 심각한 결점은 비효소 수용체는 전혀 분석할 수 없다는 점이다.
열에 의한 단백질의 폴딩해체(unfolding), 즉 열 "이동" 분석법을 사용하여 주어진 리간드가 표적 수용체 단백질에 결합하는지 여부를 측정하였다. 물리적인 열 이동 분석법에서는, 단백질의 생물리학적 매개변수의 변화를 온도 증가의 함수로서 모니터한다. 예를 들면, 열량 측정 연구에서는, 측정된 물리학적 매개변수는 단백질이 온도에 의해 유도되는 폴딩해체 전이를 일으킴에 따른 열용량의 변화이다. 차등 스캐닝 열량계측법을 사용하여 스트렙트아비딘에 대한 아조벤젠 리간드의 패널의 친화도를 측정하였다(Weber, P 등, J. Am. Chem. Soc. 16:2717-2724(1994)). 적정 열량계측법을 사용하여 표적 단백질에 대한 리간드로 결합상수를 측정하였다(Brandts, J. 등, American Laboratory 22:30-41(1990)). 그러나, 열량계측법은 연구자가 열량계에 접근해야 할 필요가 있다. 또한, 열량계측 기술은 자체적으로 조합 라이브러리의 고처리량 검색을 실시할 수 없으며, 하루에 3회의 열 스캐닝은 통상적인 일이다.
열량 계측 기술과 마찬가지로, 분광학적 기술을 사용하여 온도에 의해 유도된 단백질의 폴딩해체를 모니터하였다(Bouvier, M. 등, Science 265:398-402 (1994); Chavan, A.J. 등, Biochemistry 33:7193-7202 (1994); Morton, A. 등, Biochemistry 1995:8564-8575 (1995)). 전술한 열량 계측 및 분광학적 열 이동 연구는 모두 공통의 한계를 지니고 있다. 각각의 연구에서, 단 하나의 결합 반응을 가열하고, 한 번에 분석하였다. 단일의 샘플 가열 및 분석 방식은 통상적으로 실시되는 것으로서, 조합 라이브러리의 고처리량 검색에 대한 열 이동 기술의 적용을 방해하였다. 따라서, 조합 라이브러리의 검색에 사용될 수 있고, 주도 화합물의 동정 및 평가에 사용될 수 있으며, 모든 수용체 단백질에 적용 가능한 열 이동 기술이 요구되고 있다.
열 이동 분석법을 사용하여, 리간드가 DNA에 결합하는지 여부를 측정하여 왔다. 열량 계측, 흡광도, 원편광 이색성 및 형광강도 기술을 사용하여 왔다(Pilch, D.S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:9332-9336 (1994); Lee, M. 등, J. Med. Chem. 36:863-870 (1993); Butour, J.-L. 등, Eur. J. Biochem. 202:975-980 (1991); Barcelo, F. 등, Chem. Biol. Interactions 74:315-324 (1990)). 그러나, 통상적으로 사용되는 바와 같이, 이들 기술은 고친화도로 결합하는 주도 화합물에 대한 핵산 수용체의 고처리량 검색을 방해하였다. 따라서, 당해 DNA 서열에 결합하는 주도 화합물의 친화도를 동정하고 평가하는 데에 사용될 수 있는 열 이동 기술이 요구되고 있다.
박테리아 세포를 사용하여 외래 단백질을 과다 발현시키는 경우, 재조합 단백질은 박테리아 세포 봉입체에 종종 격리된다. 유용한 재조합 단백질의 경우, 그것은 봉입체로부터 정제되어야 한다. 정제 과정중에, 재조합 단백질은 변성되고 다시 재생되어야 한다. 주어진 재조합 단백질의 적절한 리폴딩(refolding)을 촉진하고 최적화하는 재생 조건을 예측하기란 불가능하다. 통상, 충분한 세트의 조건이 발견되기 전에 다수의 재생 조건이 시도되어야 한다. 타시바나(Tachibana) 등에 의한 연구에서, 암탉의 라이소자임으로부터 부위 지향성 돌연변이 유발법에 의해 4개의 이황화물 결합을 각각 한 번에 제거하였다(Tachibana 등, Biochemistry 33:15008-15016 (1994)). 돌연변이 유전자는 박테리아 세포에서 발현되고, 재조합 단백질은 봉입체로부터 분리되었다. 분리된 단백질은 각각 상이한 온도 및 글리세롤 농도하에서 재생되었다. 단백질 리폴딩의 효능은 박테리아 용균 활성을 재생 온도의 함수로서 측정하는 박테리아 용균 분석법에서 평가하였다. 각각의 단백질의 열 안정성은 물리적인 열 이동 분석법을 사용하여 연구하였다. 그러나, 이 연구에서는 단 하나의 샘플 반응을 가열하고 한 번에 분석하였다. 단일의 샘플 가열 및 분석 방식은 다수의 단백질 리폴딩 조건의 고처리량 검색에 열 이동 기술을 적용하는 것을 방해한다. 따라서, 다양한 단백질 리폴딩 조건의 효능을 평가하는 데에 사용될 수 있는 열 이동 기술이 요구되고 있다.
과거 40년 이상에 걸쳐, 단백질 및 핵산의 X-선 결정학 및 그 산물인 원자 모델은 생물학적 현상의 구조적, 분자적 및 화학적 측면의 이해에 크게 기여하여 왔다. 그러나, 결정학적 분석은 여전히 난해한데, 그 이유는 X-선 품질의 단백질 결정을 얻는 직접적인 방법이 없기 때문이다. 통상의 방법은 결정화 촉진에 대한 최고의 가능성을 가진 결정화 조건을 신속히 동정하는 데에는 사용할 수 없다(Garavito, R.M. 등, J. Bioenergtics and Biomembranes 28:13-27 (1996)). 공장 설계 실험 및 연속적인 자동화된 그리드 연구를 사용(Cox, M.J. & Weber, P.C., J. Appl. Cryst. 20:366-373 (1987); Cox, M.J. & Weber, P.C., J. Crystal Growth 90:318-324 (1988))하더라도 X-선 품질의 단백질 결정의 결정화를 촉진하는 생화학적 조건의 신속한 고처리량 검색을 용이하게 하지는 못한다. 더욱이, 상이한 단백질은 그 폴딩에 대한 경험과 마찬가지로 단백질 결정화에 대한 상이한 조건을 필요로 할 것으로 예상된다(McPherson, A., Preparation and Analysis of Protein Crystals, 뉴욕 소재의 와일리 인터사이언스(1982)). 결정화 조건의 통상의 결정 방법은 성가시고 느리고 노동 집약적이다. 따라서, 단백질 결정화 조건의 효능을 평가하는 데에 사용될 수 있는 신속한 고처리량 기술이 요구되고 있다.
열 이동 분석에서 표적 단백질을 안정화하는 생화학적 조건 또는 조합 분자의 신속한 고처리량 검색은 다수 샘플의 동시 가열에 의해 용이해진다. 그러나, 지금까지의 열 이동 분석법은 그 방법을 실시하지는 못했다. 대신에, 열 이동 분석을 실시하는 통상의 방법은 단 하나의 샘플을 한 번에 가열하고 분석하여 왔다. 즉, 연구자들은 통상적으로 1) 가열 장치내에서 목적 온도로 샘플을 가열하고; 2) 광 흡수도 또는 2차, 3차 또는 4차의 단백질 구조의 변화와 같은 물리적 변화를 분석하고; 3) 샘플을 다음의 목적하는 최고 온도로 가열하고; 4) 물리적 변화를 분석하며; 5) 샘플이 최고의 목적 온도에서 분석될 때까지 이 과정을 반복하였다.
상기 통상의 방법은 2가지 이상의 이유로 결점을 가진다. 첫째, 이 방법은 노동 집약적이다. 둘째, 이 방법은 열 이동 검색 분석법을 실시하여, 표적 수용체에 대한 조합 분자의 신속한 고처리량 검색 및 표적 단백질을 안정화하는 생화학적 조건을 배제하는 속도를 제한한다. 따라서, 가역적으로 폴딩하는 단백질을 비롯한 모든 수용체에 적합한 신속한 고처리량 열 이동 분석을 실시할 수 있는 장치가 요구되고 있다.
본 출원은 미국 가명세서 출원 제60/017,860호(그 전체를 본원에 참고로 인용함)에 기초하여 우선권을 주장하는 출원이다.
연방정부의 지원을 받은 연구 및 개발하에 이루어진 발명에 관한 권리에 대한 언급
본 발명의 개발중에 실시된 작업의 일부에서는 미국 정부의 기금을 이용하였다. 미국 정부가 본 발명에 관한 특정의 권리를 가진다.
본 발명은 일반적으로는 화합물 및 조합 라이브러리의 검색에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 분석, 특히 열 이동 분석을 실시하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
도 1은 인간의 α-트롬빈의 활성 부위에 결합하는 리간드에 대한 미량이식판 열 이동 분석 결과(실험 신호로서 혼탁도와 함께)를 도시한 것이다.
도 2는 산성의 섬유아세포 성장 인자(aFGF)에 결합하는 리간드에 대한 미량이식판 열 이동 분석 결과(실험 신호로서 혼탁도와 함께)를 도시한 것이다.
도 3은 인간의 α-트롬빈의 활성 부위에 결합하는 리간드에 대한 미량이식판 열 이동 분석 결과(실험 신호로서 형광 방출도와 함께)를 도시한 것이다. 데이터 점들을 통해 그려진 라인은 데이터의 비선형 최소 평방 곡선이 도면 아래에 제시된 식을 사용하여 얻은 데이터와 일치함을 나타낸다. y(T) 대 T의 식에 대한 5개의 적합성 매개변수가 있다: (1) yf, 천연 단백질에 대한 전이전 형광강도; (2) yu, 폴딩해체된 단백질에 대한 전이후 형광강도; (3) Tm, 폴딩해체 전이에 대한 중점의 온도; (4) ΔHu, 반트 호프 폴딩해체 엔탈피 변화; 및 (5) ΔCpu, 단백질 폴딩해체시의 열용량의 변화. 비선형 최소 평방 곡선 최적화는 칼레이다그래프(KaleidaGraphTM) 3.0 소프트웨어(펜실베니아주 리딩 소재의 시너지 소프트웨어)를 사용하여 수행하였는데, 여기서, 상기 소프트웨어는 면적을 구한 잔기의 합계의 최소화를 위한 마르쿠아르트(Marquardt) 방법을 이용하면서 5개의 적합도 매개변수가 나타나게 한다.
도 4는 인간의 FGF 수용체 1 (D(II) FGFR1)의 D(II) 도메인에 결합하는 리간드의 미량이식판 열 이동 분석 결과(실험 신호로서 형광 방출도와 함께)를 도시한 것이다. 데이터 점들을 통해 그려진 라인은 도 3에 대해 기술한 바와 같이 비선형 최소 평방 곡선이 도면의 하단에 제시된 식을 사용하여 얻은 데이터와 일치함을 나타낸다.
도 5는 리간드의 부재하에 인자 D에 대한 소규모 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 6은 리간드의 부재하에 인자 Xa에 대한 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 7은 인간 α-트롬빈의 촉매 부위에 결합하는 리간드의 소형 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 8은 인간 FGF 수용체 1의 D(II) 도메인에 결합하는 아프로설레이트의 소형 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 9는 glu-gly-arg 클로로메틸케톤의 존재하에 유로키나제에 대한 소형 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 10은 분석 부피가 2㎕인 인간 α-트롬빈의 소형 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다. 3개 실험에 대한 열 변성 곡선이 도시되어 있다.
도 11은 분석 부피가 5㎕인 인간 α-트롬빈의 소형 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다. 5개 실험에 대한 열 변성 곡선이 도시되어 있다.
도 12는 4개의 별도 실험에서 4개의 상이한 화합물의 존재하에 인간 α-트롬빈의 단일 온도 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 13은 인간 α-트롬빈의 본래의 트립토판 형광강도의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다. 이 분석에서, 무샘플 웰 형광강도는 샘플 형광강도로부터 공제되지 않았다.
도 14는 인간 α-트롬빈의 본래의 트립토판 형광강도의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다. 이 분석에서, 무샘플 웰 형광강도는 샘플 형광강도로부터 공제되었다.
도 15는 인간 α-트롬빈에 대한 결합 부위의 3개의 상이한 종에 대한 단일 리간드 결합 상호작용의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 16은 인간 α-트롬빈에 대한 다중 리간드 결합 상호작용의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 17A 내지 17D는 pH 및 다양한 염화나트륨 농도가 인간 α-트롬빈의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다. 도 17A에서, 형광단은 1,8-ANS이다. 도 17B에서, 형광단은 2,6-ANS이다. 도 17C에서, 형광단은 2,6-TNS이다. 도 17D에서, 형광단은 비스-ANS이다.
도 18은 염화칼슘, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디티오트레이톨 및 글리세롤이 인간 α-트롬빈의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 19는 pH 및 염화나트륨 농도가 인간 D(II) FGF 수용체 1의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 20은 다양한 생화학적 조건이 인간 D(II) FGF 수용체 1의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 21은 다양한 생화학적 조건이 인간 D(II) FGF 수용체 1의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 22는 다양한 생화학적 조건이 인간 D(II) FGF 수용체 1의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 23은 다양한 생화학적 조건이 인간 D(II) FGF 수용체 1의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 24는 다양한 생화학적 조건이 인간 D(II) FGF 수용체 1의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 25는 다양한 생화학적 조건이 인간 유로키나아제의 안정성에 미치는 영향의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 26은 단백질 폴딩의 자유에너지와 리간드 결합의 자유 에너지를 연관시키기 위한 열역학적 모델의 개략도이다.
도 27은 단백질 폴딩을 최적화하는 생화학적 조건을 검색하는 방법의 개략도이다.
도 28은 다양한 형광단을 사용한 인간 α-트롬빈 안정성의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다.
도 29는 본 발명의 분석 장치의 일 양태의 개략도이다.
도 30은 본 발명의 분석 장치의 또 다른 양태의 개략도이다.
도 31은 본 발명의 분석 장치의 또 하나의 양태의 개략도이다.
도 32A-32E는 본 발명의 분석 장치의 열 전기단의 일 양태의 개략도이다. 도 32A는 열 전기단의 측면도이다. 도 32B는 열 전기단의 평면도이다. 도 32C-32E는 열 전기단에 부착될 수 있는 삽입체의 3개의 형태를 도시한 것이다. 일 양태에서, 삽입체는 미량이식판을 수용한다. 그러한 양태에서, 분석 샘플은 미량이식판의 웰내에 포함된다.
도 33은 본 발명의 분석 장치의 또 다른 양태의 개략 평면도이다.
도 34는 하우징이 장착된 도 33에 도시한 분석 장치 양태의 개략 평면도이다.
도 35는 도 33 및 도 34에 도시한 분석 장치 양태의 개략 측면도이다.
도 36A 및 36B는 온도 프로필과, 본 발명의 자동화된 분석 장치를 사용하여 온도 프로필을 실시하는 방법을 예시한 도면이다.
도 37은 본 발명에 사용하기에 적합한 컴퓨터 시스템을 예시한 도면이다.
도 38은 본 발명의 실시를 위한 일 양태를 예시하는 흐름도이다.
도 39는 본 발명의 실시를 위한 또 다른 양태를 예시하는 흐름도이다.
도 40은 형광 스캐너 및 CCD 카메라를 사용하여 실시한 인간 α-트롬빈 변성의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 비교한 도면이다.
도 41A 및 41B는 CCD 카메라를 사용하여 실시한 인간 α-트롬빈 변성의 미량이식판 열 이동 분석 사진을 나타낸 도면이다. 도 41A: 바닥이 V자형인 웰 미량이식판. 도 41B: 딤플 미량이식판.
도 42는 형광 스캐너 및 CCD 카메라를 사용하여 실시한 인간 α-트롬빈 변성의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 비교한 것이다.
바람직한 양태에 관한 상세한 설명
다음의 설명에서는, 생화학 및 약리학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 다양한 용어 및 방법을 참조하였다. 그러한 공지된 용어 및 방법을 제시하고 있는 공개문헌 및 기타 자료를 본원에 전적으로 참고로 인용하였다.
본 발명의 방법에 관한 개관
본 발명은 다수의 상이한 분자가 열 변화로 인해 폴딩해체될 수 있는 표적 분자에 결합하는 능력의 순서로 상기 다수의 상이한 분자를 평가하는 방법을 제공한다. 이 방법의 일 양태에서, 표적 분자는 각각의 다수 용기에서 다수의 상이한 분자중의 하나의 분자와 접촉한다. 용기들은 일정 온도 범위에 걸쳐 시간 간격을 두고 동시에 가열한다. 각각의 가열 간격후에, 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정한다. 상기 방법의 또 다른 양태에서는, 용기를 연속적인 방식으로 가열한다. 열 변성 곡선은 각각의 용기들에서 표적 분자에 대한 온도의 함수로서 플로팅한다. 각각의 열 변성 곡선의 온도 중점 Tm을 확인한 다음, 용기내 임의의 분자의 부재하에 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 것이 바람직하다. 한편, 전체적인 열 변성 곡선은 컴퓨터 분석 수단을 사용하여 다른 전체적인 열 변성 곡선과 비교할 수 있다.
"조합 라이브러리"란 용어는 주어진 화합물 길이에 대해 모든 가능한 방법으로 구조에 있어 관련되거나 또는 관련되지 않을 수 있는 한 세트의 화학적 또는 생화학적 구성단위를 조합함으로써 형성된 다수의 분자 또는 화합물을 말한다. 한편, 이 용어는 특정 세트의 화학적 구성단위를 선택적으로 조합함으로써 형성된 다수의 화학적 또는 생화학적 화합물을 의미할 수 있다. 조합 라이브러리는 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 친숙한 방법에 따라 구성할 수 있다. 참조 문헌의 예를 들면 다음과 같다: Rapoport 등, Immunology Today 16:43-49 (1995); Sepetov, N.F. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 92:5426-5430 (1995); Gallop, M.A. 등, J. Med. Chem. 9:1233-1251 (1994); Gordon, E.M. 등, J. Med. Chem. 37:1385-1401 (1994); Stankova, M. 등, Peptide Res. 7:292-298 (1994); Erb, E. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 91:11422-11426 (1994); DeWitt, S.H. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국, 90:6909-6913 (1993); Barbas, C.F. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 89:4457-4461 (1992); Brenner, S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 89:5381-5383 (1992); Lam, K.S. 등, Nature 354:82-84 (1991); Devlin, J.J등, Science 245:404-406 (199)); Cwirla, S.E. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 87:6378-6382 (1990); Scott, J.K. 등, Science 249:386-390 (1990). "조합 라이브러리"란 용어는 미국 특허 제5,463,564호에 제시된 바와 같이 디렉티드디버시티 라이브러리를 의미하는 것이 바람직하다. 조합 라이브러리를 구성하는 방법과는 상관 없이, 라이브러리내 각각의 분자 또는 화합물은 장차의 참고용으로 목록에 수록한다.
"화합물 라이브러리"란 용어는 화학적 또는 생화학적 구성단위를 조합하는 조합 라이브러리 방법을 사용하여서는 형성되지 않는 다수의 분자 또는 화합물을 말한다. 대신에, 화합물 라이브러리는 장차의 리간드-수용체 결합 분석에 사용하기 위해 축적하고 보관하는 다수의 분자 또는 화합물이다. 화합물 라이브러리내 각각의 분자 또는 화합물은 장차의 참고용으로 목록에 수록한다.
"다수의 분자", "다수의 화합물" 또는 "다수의 용기"란 용어는 2개 이상의 분자, 화합물 또는 용기를 말한다.
"다변수"란 용어는 하나 이상의 실험 변수를 말한다.
"검색(screening)"이란 용어는 변성될 수 있는 표적 분자에 다수의 분자 또는 화합물이 결합하는 능력에 대해 상기 다수의 분자 또는 화합물을 시험하는 것을 의미한다.
"평가(ranking)"란 용어는 어떠한 분자나 화합물의 부재하에서의 표적 분자의 열 변성 곡선과 비교하여, 분자 또는 화합물이 표적 분자의 열 변성 곡선을 이동시키는 능력에 따라, 표적 분자에 대한 다수의 분자 또는 화합물의 친화도의 순서를 결정하는 것을 말한다.
"평가"란 단백질 안정화, 단백질 폴딩, 단백질 결정화 또는 단백질의 보관 수명을 최적화하는 데에 있어서의 다수의 생화학적 조건의 효능의 순서를 결정하는 것을 의미하기도 한다. 단백질 안정화의 최적화, 단백질 폴딩의 최적화, 단백질 결정화의 최적화 및 단백질의 보관 수명의 최적화와 관련하여, "평가"란 기준 세트의 조건하에서의 표적 분자의 열 변성 곡선과 비교하여, 1종 이상의 생화학적 조건의 조합이 표적 분자의 열 변성 곡선을 이동시키는 효능의 순서를 결정하는 것을 의미한다.
"기준 세트의 조건"이란 표적 분자에 대한 열 변성 곡선이 수득되는 한 세트의 생화학적 조건을 의미한다. 기준 조건과 상이한 조건하에서 수득된 열 변성 곡선은 서로 비교되며, 기준 조건하에 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교된다.
상기에 논급한 바와 같이, 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따른 분자, 화합물 또는 생화학적 조건을 평가하는 것이 바람직하다. 한편, 분자, 화합물 또는 생화학적 조건은 이들이 전체 열 변성 곡선에서의 변화에 따라 표적 분자를 안정화하는 능력에 대해 평가할 수 있다.
"주도 분자(lead molecule)"이란 조합 라이브러리에서 유래하고 표적 분자에 대해 비교적 높은 친화도를 나타내는 분자 또는 화합물을 말한다. "주도 화합물" 및 "주도 분자"란 용어는 동의어이다. "비교적 높은 친화도"란 Kd범위가 10-4M 내지 10-15M인 친화도를 의미한다.
"표적 분자"란 용어는 펩티드, 단백질, 핵산 및 기타 수용체를 포함한다. 그 용어는 효소가 아닌 단백질과 효소를 둘다 포함한다. 그 용어는 단량체 단백질 및 다량체 단백질을 포함한다. 다량체 단백질은 호모머 또는 헤테로머일 수 있다. 상기 용어는 올리고뉴클레오티드와 같은 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 핵산은 1본쇄, 2본쇄 또는 3본쇄일 수 있다. 상기 용어는 합성 올리고뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자의 일부 또는 염색체 DNA의 일부인 핵산을 포함한다. 표적 분자는 또한 폴딩, 코일화 또는 트위스팅을 통해 2차, 3차 또는 4차 구조를 획득할 수 있는 펩티드, 단백질 및 기타 수용체의 일부를 포함한다. 표적 분자는 보조인자, 조효소, 보결분자단, 지질, 올리고당 또는 포스페이트기(이들에 국한되지 않음)와 같은 치환체로 치환될 수 있다. "변성될 수 있는"이란 말은 폴딩해체, 코일화 해체 또는 트위스팅 해체를 통해 2차, 3차 또는 4차 구조를 상실하는 것을 말한다. "표적 분자"와 "수용체"는 동의어이다.
표적 분자의 예로는 다음 문헌들에 개시된 것들을 들 수 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다: Faisst, S. 등, Nucleic Acids Research 20:3-26 (1992); Pimentel, E., Handbook of Growth Factors, I-III권, CRC Press (1994); Gilman, A.G. 등, The Phamacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press (1990); Lewin, B., Genes V, Oxford University Press (1994); Roitt, I., Essential Immunology, Blackwell Scientific Publ. (1994); Shimizu, Y., Lymphocyte Adhesion Molecules, RG Landes (1993); Hyams, J.S. 등, Microtubules, Wiley-Liss (1995); Montreuil, J. 등, Glycoproteins, Elsevier (1995); Woolley, P., Lipases: Their Structure Biochemistry and Applications, Cambridge University Press (1994); Kurjan, J., Signal Transduction: Prokaryotic and Simple Eukaryotic Systems, Academic Press (1993); Kreis, T. 등, Guide Book to the Extra Cellular Matrix and Adhesion Proteins, Oxford University Press (1993); Schlesinger, M.J., Lipid Modifications of Proteins, CRC Press (1992); Conn, P.M., Receptors: Model Systems and Specific Receptors, Oxford University Press (1993); Lauffenberger, D.A. 등, Receptors: Models For Binding Trafficking and Signaling, Oxford University Press (1993); Webb, E.C., Enzyme Nomenclature, Academic Press (1992); Parker, M.G., Nuclear Hormone Receptors; Molecular Mechanisms, Cellular Functions Clinical Abnormalities, Academic Press Ltd. (1991); Woodgett, J.R., Protein Kinases, Oxford University Press (1995); Balch, W.E. 등, Methods in Enzymology, 257, Pt. C: Small GTPases and Their Regulators: Proteins Involved in Transport, Academic Press (1995); The Chaperonins, Academic Press (1996); Pelech, L., Protein Kinase Circuitry in Cell Cycle Control, RG Landes (1996); Atkinson, Regulatory Proteins of the Complement System, Franklin Press (1992); Cooke, D.T. 등, Transport and Receptor Proteins of Plant Membranes: Molecular Structure and Function, Plenum Press (1992); Schumaker, V.N., Advances in Protein Chemistry: Lipoproteins, Apolipoproeins and Lipases, Academic Press (1994); Brann, M., Molecular Biology of G-Protein-Coupled Receptors: Applications of Molecular Genetics to Pharmacology, Birkhauser (1992); Konig, W., Peptide and Protein Hormones: Structure, Regulations, Activity-A Reference Manual, VCH Publ. (1992); Tuboi, S. 등, Post-Translational Modification of Proteins, CRC Press (1992); Heilmeyer, L.M., Cellullar Regulation by Protein Phosphorylation, Springer-Verlag (1991); Takada, Y., Integrin: The Biological Problem, CRC Press (1994); Ludlow, J.W., Tumor Suppressors: Involvement in Human Disease, Viral Protein Interactions, and Growth Regulations, RG Landes (1994); Schlesinger, M.J., Lipid Modification of Proteins, CRC Press (1992); Nitsch, R.M., Alzheimer's Disease: Amyloid Precursor Proteins, Signal Transduction, and Neuronal Transplantation, New York Academy of Sciences (1993); Cochrane, C.G. 등, Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation, 3권: Signal Transduction in Inflammatory Cells, PartA, Academic Press (1992); Gupta, S. 등, Mechanisms of Lymphocyte Activation and Immune Regulation IV: Cellular Communications, Plenum Press (1992); Authi, K.S. 등, Mechanisms of Platelet Activation and Control, Plenum Press (1994); Grunicke, H., Signal Transduction Mechanisms in Cancer, RG Landes (1995); Latchman, D.S., Eukaryotic Transcription Factors, Academic Press (1995).
"표적 분자"란 용어는 보다 구체적으로 혈액 응고 캐스케이드에 관여하는 단백질, 섬유아세포 성장 인자 및 섬유아세포 성장 인자 수용체, 유로키나아제 및 인자 D를 말한다.
"분자"란 용어는 표적 분자에 대한 결합 친화도를 시험하는 화합물을 의미한다. 이 용어는 핵산 및 펩티드(이에 국한되지 않음)와 같은 임의의 구조의 화합물을 포함한다. 보다 구체적으로, "분자"란 용어는 하나의 화합물 또는 조합 라이브러리 형태의 화합물들을 포함한다. "분자" 및 "리간드"는 동의어이다.
"열 변화" 및 "물리적 변화"란 용어는 광이나 열 형태의 에너지의 방출, 광이나 열 형태의 에너지의 흡수, 혼탁도의 변화 및 광의 극성의 변화를 포함한다. 구체적으로, 그 용어는 형광 방출, 형광 에너지 전이, 자외광 또는 가시광의 흡수, 광의 편광성의 변화, 형광 방출의 편광성의 변화, 혼탁도의 변화 및 효소 활성의 변화를 말한다. 형광 방출은 단백질에 고유한 것이거나, 또는 형광 수용체 분자(하기함)로 인한 것일 수 있다. 핵산의 경우, 형광은 삽입물질인 에시듐 브로마이드로 인한 것일 수 있다. 한편, 핵산은 형광단(하기함)으로 표지할 수 있다.
"표적 분자와 접촉시킨다"는 것은 광범위하게는 결합에 대해 검색하고자 하는 분자와 함께 용액중에 표적 분자를 배치하는 것을 의미한다. 그보다 좁은 의미로 접촉은 결합에 대해 검색하고자 하는 분자 및 표적 분자의 용액을 회전, 와동, 진탕 또는 진동시키는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 접촉은 결합에 대해 시험하고자 하는 분자와 표적 분자를 혼합하는 것을 의미한다. 혼합은 예를 들면, 페펫의 끝을 통한 반복적 흡수 및 방출에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 접촉은 결합에 대해 시험하고자 하는 분자와 표적 분자 사이의 결합의 평형을 의미한다. 접촉은 검색하고자 하는 분자 및 표적 분자를 용기에 넣기 전에 또는 용기내(하기함)에서 일어날 수 있다.
표적 분자는 결합에 대해 검색하고자 하는 분자와 접촉시키기 전에 핵산과 접촉시킬 수 있다. 표적 분자는 결합에 대해 검색하고자 하는 분자와 접촉시키기 전에 펩티드와 복합체를 형성할 수 있다. 표적 분자는 결합에 대해 검색하고자 하는 분자와 접촉시키기 전에 인산화 또는 탈인산화할 수 있다.
탄수화물부는 표적 분자를 결합에 대해 검색하고자 하는 분자와 접촉시키기 전에 표적 분자에 첨가할 수 있다. 한편, 탄수화물부는 표적 분자를 결합에 대해 검색하고자 하는 분자와 접촉시키기 전에 표적 분자로부터 제거될 수도 있다.
"용기"란 용어는 결합에 대해 시험하고자 하는 분자와 수용체를 넣을 수 있는 임의의 통 또는 소실을 의미한다. "용기"란 용어는 반응 튜브(예; 시험관, 미세튜브, 바이얼 등)를 포함한다. 바람직하게는, "용기"란 다중웰 미량이식판 또는 미량역가 평판의 웰을 의미한다. "샘플"이란 용어는 용기의 내용물을 말한다.
"열 변성 곡선"은 온도의 함수로서 단백질 또는 핵산의 변성과 관련된 물리적 변화의 플롯이다. 문헌[Davidson 등, Nature Structure Biology 2:859 (1995); Clegg, R.M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 90:2994-2998 (1993)] 참조.
"중점 온도 Tm"은 열 변성 곡선의 중점의 온도이다. Tm은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 널리 공지된 방법을 사용하여 쉽게 측정할 수 있다. 문헌[Weber, P.C. 등, J. Am. Chem. Soc. 116:2717-2724 (1994); Clegg, R.M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 90:2994-2998 (1993)] 참조.
"형광 프로브 분자"란 용어는 형광단을 의미하는데, 이것은 폴딩해체된, 즉 변성된 수용체에 결합할 수 있고, 지정된 파장의 광에 의한 여기후 형광 에너지를 방출하는 형광 분자 또는 화합물이다. 형광 프로브 분자라는 용어는 모든 형광단을 포함한다. 보다 구체적으로 단백질에 대한 형광 프로브 분자는 다음과 같은 형광단을 포함한다: 티오이노신, N-에테노아데노신, 포르미신, 댄실 유도체, 플루오레세인 유도체, 6-프로피오닐-2-(디메틸아미노)-나프탈렌(PRODAN), 2-아닐리노나프탈렌, N-아릴아미노-나프탈렌 설포네이트 유도체(예; 1-아닐리노나프탈렌-8-설포네이트(1,8-ANS), 2-아닐리노나프탈렌-6-설포네이트(2,6-ANS), 2-아미노나프탈렌-6-설포네이트, N,N-디메틸-2-아미노나프탈렌-6-설포네이트, N-페닐-2-아미노나프탈렌, N-시클로헥실-2-아미노나프탈렌-6-설포네이트, N-페닐-2-아미노나프탈렌-6-설포네이트, N-페닐-N-메틸-2-아미노나프탈렌-6-설포네이트, N-(o-톨루일)-2-아미노나프탈렌-6-설포네이트, N-(m-톨루일)-2-아미노나프탈렌-6-설포네이트, N-(p-톨루일)-2-아미노나프탈렌-6-설포네이트, 2-(p-톨루이디닐)-나프탈렌-6-설폰산(2,6-TNS)), 4-(디시아노비닐) 줄로리딘(DCVJ), 6-도데카노일-2-디메틸아미노나프탈렌(LAURDAN), 6-헥사데카노일-2-(((2-(트리메틸암모늄)에틸)메틸)아미노)나프탈렌 클로라이드(PATMAN), 나일 레드, N-페닐-1-나프틸아민, 1,1-디시아노-2-[6-(디메틸아미노)나프탈렌-2-일]프로펜(DDNP), 4,4'-디아닐리노-1,1-비나프틸-5,5-디설폰산(비스-ANS) 및 다폭실(DapoxylTM) 유도체(오레곤주 유진 소재의 몰리큘라 프로브즈). 단백질에 대한 상기 용어는 1,8-ANS 또는 2,6-TNS를 의미하는 것이 바람직하다.
2본쇄 올리고뉴클레오티드를 형광 공명 에너지 전이 분석에 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 한 가닥은 공여체 형광단을 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 다른 하나의 가닥은 수용체 형광단을 포함한다. 핵산이 공여체 또는 수용체의 형광단을 "포함하는" 경우, 형광단은 올리고뉴클레오티드 서열내로 직접 혼입될 수 있다. 한편, 형광단은 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 또는 3'-말단에 부착될 수 있다.
공여체 형광단은 광에 의해 여기될 때 형광 에너지를 방출하는 형광단이다. 공여체 형광단에 의해 방출된 에너지는 수용체 형광단에 의해 흡수된다. "공여체 형광단"이란 용어는 카르복시플루오레세인, 요오도아세트아미도플루오레세인 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(이들에 국한되지 않음)와 같은 모든 형광단을 포함한다. "수용체 형광단"이란 용어는 요오도아세트아미도에오신 및 테트라메틸로다민(이들에 국한되지 않음)과 같은 모든 형광단을 포함한다.
"캐리어"라는 용어는 2개 이상의 용기를 자체적으로 지지할 수 있는 임의의 형상을 가진 단 또는 다른 물체를 포함한다. 캐리어는 유리, 플라스틱 또는 금속(이들에 국한되지 않음)과 같은 임의의 재료로 이루어질 수 있다. 캐리어로는 다중웰 미량이식판이 바람직하다. 미량이식판 및 미량역가 평판은 동의어이다. 캐리어는 가열 부재로부터 제거될 수 있다. 본 발명에서는 다수의 캐리어를 사용한다. 각각의 캐리어는 다수의 용기를 지지한다.
"생화학적 조건"이란 용어는 물리적, 화학적 또는 생화학적 반응의 모든 구성 요소를 포함한다. 구체적으로, 이 용어는 온도, 압력, 단백질 농도, pH, 이온 강도, 염 농도, 시간, 전류, 전위차, 보조인자의 농도, 조효소, 산화제, 환원제, 세정제, 금속 이온, 리간드 또는 글리세롤의 조건을 의미한다.
"변성된 단백질"이란 용어는 2차, 3차 또는 4차 구조가 제거되도록 처리된 단백질을 의미한다. "천연 단백질"이란 용어는 단백질에 완전한 화학적 및 생물학적 기능을 제공하는 2차, 3차 또는 4차 구조를 보유하는 단백질을 의미한다. 천연 단백질은 가열하지 않고, 요소와 같은 변성제 또는 화학물질로 처리하지 않은 단백질이다.
"변성된 핵산"이란 용어는 폴딩되거나 코일화되거나 또는 트위스트된 구조를 제거하도록 처리된 핵산을 의미한다. 3본쇄의 핵산 복합체의 변성은 제3의 가닥이 두 개의 상보 가닥으로부터 제거될 때 완료된다. 2본쇄의 변성은 두 개의 상보 가닥 사이의 염기쌍 형성이 방해되고, 불규칙적 형태를 띠는 1본쇄의 DNA 분자를 산출할 때 완료된다. 1본쇄 RNA의 변성은 분자내 수소 결합이 방해되고, RNA가 불규칙적이고 비수소결합된 형태를 띨 때 완료된다.
용어 "폴딩", "리폴딩" 및 "재생"은 생체분자의 완전한 화학적 및 생물학적 기능을 제공하는, 단백질 또는 핵산의 정확한 2차, 3차 또는 4차 구조를 획득하는 과정을 의미한다.
"효능"이란 용어는 폴딩해체되거나 변성된 단백질의 리폴딩 또는 재생을 촉진함에 있어서의 특정 세트의 생화학적 조건의 유효성을 의미한다.
"분광학적 측정" 및 "분광광도 측정"이란 용어는 광 흡수도의 변화를 측정하는 것을 말한다. 혼탁도 측정, 가시광 흡수도의 측정 및 자외광 흡수도의 측정이 분광학적 측정의 예이다.
"편광계 측정"이란 광 및 형광 방출의 편광성의 변화를 측정하는 것을 의미한다. 원편광 이색성 및 광학적 회전이 편광계로 측정될 수 있는 광의 편광성의 예이다. 원편광 이색성 및 광학적 회전의 측정은 분광편광계를 사용하여 실시한다. "비편광계" 측정은 분광편광계를 사용하여 수득되지 않는 것이다.
"집합체"란 용어는 표적 분자 또는 수용체에의 결합에 대해 시험하고자 하는 1종 이상의 분자의 푸울 또는 그룹을 의미한다.
"숙주"는 숙주 박테리아 세포에 이종성인 단백질을 발현시킬 목적으로 재조합 DNA로 형질전환시킨 박테리아 세포이다.
열 이동 분석은 단백질 또는 핵산과 같은 수용체의 열 변성 곡선의 리간드-의존성 변화에 기초하고 있다. 일정 온도 범위에 걸쳐 가열할 때, 수용체는 폴딩 해체된다. 온도의 함수로서 변성도를 플로팅함으로써, 수용체에 대한 열 변성 곡선을 수득한다. 열 변성 곡선에서 유용한 기준점은 중점 온도(Tm)인데, 이 온도는 수용체의 절반이 변성되는 온도이다.
리간드 결합은 수용체를 안정화시킨다(Schellman, J., Biopolymers 14:999-1018 (1975)). 상호작용의 자유 에너지와 결합의 정도는 리간드 농도의 함수로서 평행한 과정을 따른다(Schellman, J., Biophysical Chemistry 45:273-279 (1993); Barcelo, F. 등, Chem. Biol. Interactions 74:315-324 (1990)). 리간드에 의한 안정화의 결과로서, 보다 많은 에너지(열)가 수용체의 폴딩해체에 필요하다. 따라서, 리간드 결합은 열 변성 곡선을 이동시킨다. 이 성질은 리간드가 수용체에 결합하는지 여부를 측정하는 데에 이용할 수 있고, 열 변성 곡선에서 및 따라서 Tm에서의 변화 또는 "이동"은 리간드가 수용체에 결합한다는 것을 암시하고 있다.
열 이동 분석에 대한 열역학적 기초는 문헌[Schellman, J.A. (Biopolymers 15:999-1000 (1976) 및 Brandts 등(Biochemistry 29:6927-6940 (1990)]에 기재되어 있다. 문헌[Brandts 등(Biochemistry 29:6927-6940 (1990)]에 의한 차등 스캐닝 열량계측 연구는 하나의 폴딩해체 전이가 있는 1:1 화학량론의 견고한 결합 시스템의 경우, 하기 수학식 1에서 얻은 Tm에서 결합 친화도를 평가할 수 있다는 것을 보여 주었다.
상기 수학식 1에서,
Tm= 리간드의 존재하에서의 단백질 폴딩해체 전이에 대한 중점 온도;
T0= 리간드의 부재하에서의 단백질 폴딩해체 전이에 대한 중점 온도;
ΔCpu= 리간드의 부재하에서의 단백질 폴딩해체시의 열용량의 변화;
R = 기체 상수이다.
매개변수 ΔHu및 ΔCpu는 보통 차등 스캐닝 열량계측 실험으로부터 관찰되며, 각각의 수용체에 특이적이다. 수학식 1로부터 결합상수를 계산하기 위해서는, 차등 스캐닝 열량계를 사용하여 당해 수용체에 대한 ΔHu및 ΔCpu를 측정하여야 한다. 이들 매개변수를 당해 수용체 또는 문헌상에서 그와 밀접한 관련이 있는 수용체에 대해 지정할 수 있다. 이러한 경우에, 수학식 1은 Tm에서 KL을 정확히 측정할 수 있다.
수학식 2를 사용하여 임의의 온도에서의 리간드 회합 상수, 즉 T에서의 KL을 계산하는 것도 가능하다. 수학식 2를 사용하기 위해서는, T에서의 결합 엔탈피, 즉 ΔHL및 리간드 결합시의 열용량의 변화, 즉 ΔCpL에 관한 열량계측 데이터를 알고 있어야 한다(Brandts 등, Biochemistry 29:6927-6940 (1990)).
상기 수학식 2에서,
Tm= 리간드의 존재하에서의 단백질 폴딩해체 전이에 대한 중점 온도;
ΔCpL= 리간드의 결합시 열용량의 변화; 및
R = 기체 상수이다.
수학식 2의 제2 지수항은 보통 무시해도 좋을 만큼 작아서 단지 제1 지수항인 하기 수학식 3을 사용하여 T에서 KL의 대략적인 수치를 얻을 수 있다.
그러나, 수용체에 대한 다수의 상이한 리간드의 친화도를 평가하기 위해 수학식 1 내지 3에 따라 결합 상수를 계산할 필요는 없다. 대신에, 본 발명은 열 변성 곡선이 리간드에 의해 이동되는 정도에 따라 리간드의 친화도를 평가하는 방법을 제공한다. 따라서, ΔHu, ΔCpu및 ΔHL의 정확한 수치가 없을 때에도 Tm에서의 KL산정치를 얻을 수 있다.
본 발명은 조합 라이브러리 또는 화합물 라이브러리를 검색하는데에 특히 유용하다. 고처리량 검색을 달성하기 위해서는, 샘플을 다중용기 캐리어 또는 단상에 수용하는 것이 가장 양호하다. 다중용기 캐리어는 다수의 샘플의 동시 가열을 용이하게 한다. 일 양태로, 다중웰 미량이식판, 예를 들면, 96개 또는 384개의 상이한 샘플을 수용할 수 있는 96웰 또는 384웰 미량이식판을 캐리어로서 사용한다.
일 양태로, 하나의 샘플은 다중웰 미량이식판의 각 웰에 포함된다. 대조군 웰은 수용체를 함유하나, 결합에 대해 시험하고자 하는 분자는 함유하지 않는다. 다른 샘플은 각각 결합에 대해 검색하고자 하는 1종 이상의 분자를 함유한다. 대조군 웰내 수용체에 대한 열 변성 곡선은 다른 실험 모두에 대한 곡선과 비교되는 곡선이다.
검색 속도는 샘플이 결합에 대해 검색하고자 하는 분자를 1종 이상 함유할 때 가속된다. 예를 들면, 검색 속도는 샘플이 20개 분자의 푸울을 함유할 때, 20배 증가한다. 그 후, 결합 분자를 함유하는 샘플을 결합에 대해 검색하고자 하는 분자의 보다 작은 집합체를 함유하는 샘플로 분할하여야 한다. 이렇게 분할된 집합체는 표적 분자에의 결합에 대해 분석되어야 한다. 이러한 단계를 본래의 열 이동의 원인인 단일 분자가 수득될 때까지 반복하여야 한다.
수용체 변성은 광학 분광광도 측정법으로 측정할 수 있다. 용액중의 단백질이 가열에 반응하여 변성될 때, 수용체 분자는 응집하여 용액이 혼탁하게 된다. 변성시에 열에 의해 유도된 응집은 예외 없는 법칙이다. 응집은 일반적으로 열량계측 실험을 복잡하게 만든다. 그러나, 응집은 분광광도 측정 기술을 사용할 때는 장점이 되는데, 그 이유는 혼탁도의 변화가 지정된 파장의 가시광 또는 자외광의 흡광도의 변화를 모니터함으로써 측정될 수 있기 때문이다.
핵산의 변성은 광학 분광광도 측정법을 사용하여 모니터할 수 있다. 규칙적인 구조의 상실로 인한 폴리뉴클레오티드 용액에 의한 흡광도의 증가인 흡광증가 효과의 변화는 온도 증가의 함수로서 모니터한다. 흡광증가 효과의 변화는 통상 광학 분광광도 측정법을 사용하여 분석된다.
그러나, 또 다른 양태에서는, 형광 분광광도 측정법을 사용하여 열 변성을 모니터한다. 형광법은 흡수법보다 더 감도가 높다.
형광 분광광도 측정 실험에서 고유의 단백질 형광 및 형광 프로브 분자를 사용하는 것에 대해서는 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 널리 공지되어 있다. 문헌[Bashford, C.L. 등, Spectrophotometry and Spectrofluorometry: A Practical Approach, 91-114면, IRL Press Ltd. (1987); Bell, J.E., Spectroscopy in Biochemistry, I권, 155-194면, CRC Press (1981); Brand, L. 등, Ann. Rev. Biochem. 41:843 (1972)] 참조.
연구하고자 하는 표적 분자 또는 수용체가 핵산인 경우, 형광 분광광도 측정은 에시듐 브로마이드 치환 분석법을 사용하여 실시할 수 있다(Lee, M. 등, J. Med. Chem. 36:863-870 (1993)). 이 방법에서, 리간드 결합은 에시듐 브로마이드를 치환하여 에시듐 브로마이드로부터의 형광 방출의 감소를 초래한다. 또 다른 방법은 형광 공명 방출 전이를 사용하는 것이다. 이 방법에서는, 올리고뉴클레오티드의 하나의 가닥상의 공여체 형광단으로부터 다른 하나의 가닥상의 수용체 형광단으로의 형광 에너지의 전이를, 수용체 형광단의 방출을 측정함으로서 모니터한다. 변성은 형광 에너지의 전이를 방해한다.
형광 공명 방출 전이 방법은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 널리 공지되어 있다. 문헌[Ozaki, H. 등, Nucleic Acids Res.20:5205-5214 (1992); Clegg, R.M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 90:2994-2998 (1993); Clegg, R.M. 등, Biochemistry 31:4846-4856 (1993)] 참조.
샘플 캐리어를 가열시키는 부재는 샘플을 신속히 재생가능한 방식으로 가열할 수 있는 부재이면 모두 가능하다. 본 발명에서는, 다수의 샘플을 동시에 가열한다. 다수의 샘플을 단일의 가열 부재상에서 가열할 수 있다. 한편, 다수의 샘플을 하나의 가열 부재상에서 주어진 온도로 가열한 다음, 또 다른 온도로 가열하기 위한 또 다른 가열 부재로 이동시킬 수 있다. 가열은 규칙적 또는 불규칙적 간격으로 수행할 수 있다. 완만한 변성 곡선을 생성시키기 위해서는, 샘플을 1℃ 또는 2℃의 간격으로 동등하게 가열하여야 한다. 샘플을 가열할 수 있는 온도 범위는 25℃ 내지 110℃이다. 각각의 가열 단계후에 분광학적 판독을 실시한다. 샘플을 연속적인 방식으로 분광 장치에 의해 가열하고 판독할 수 있다. 한편, 각각의 가열 단계후, 샘플은 분광 판독을 실시하기 전에 더 낮은 온도로 냉각시킬 수 있다. 샘플을 계속 가열하고, 가열하면서 분광학적 판독을 실시하는 것이 바람직하다.
분광학적 판독은 캐리어내 모든 샘플에 대해 동시에 실시할 수 있다. 한편, 2개 이상의 그룹의 샘플에 대해 한 번에 판독을 실시할 수도 있다. 마지막으로, 판독은 하나의 샘플에 대해 한 번에 실시할 수 있다.
일 양태에서, 열 변성은 도 29에 도시한 것과 같은 분석 장치를 사용하여 형광 분광강도에 의해 모니터한다. 그 기계는 스캐너와 제어 소프트웨어 시스템으로 구성되어 있다. 상기 시스템은 가용성 및 세포-회합성 형광 방출을 정량분석할 수 있다. 형광 방출은 광차단 검출실내 광증폭관에 의해 검출된다. 소프트웨어는 개인용 컴퓨터상에서 실행되고 스캐너의 작용은 그 소프트웨어를 통해 제어된다. 정밀 X-Y 메카니즘은 민감성 섬유-광학 프로브로 미량이식판을 스캐닝하여 각 웰내 형광을 정량분석한다. 미량이식판 및 샘플은 샘플의 각열의 스캐닝중에 정지상으로 유지되고, 그 후 섬유-광학 프로브를 다음 열로 이동시킨다. 한편, 미량이식판 및 샘플을 섬유-광학 프로브 아래의 새로운 샘플열로 배치하기 위해 이동시킬 수 있다. 스캐닝 시스템은 1분내에 96개 샘플을 스캐닝할 수 있다. 스캐너는 다수의 여기 필터 및 다수의 방출 필터를 지탱하여 가장 통상적인 형광단을 측정할 수 있다. 따라서, 형광 방출 판독은 한 번에 하나의 샘플, 또는 동시에 샘플의 부분세트에 대해 실시할 수 있다. 분석 장치의 또 다른 양태는 도 33에 도시되어 있다. 본 발명의 분석 장치는 이하에서 더 상세히 기술된다.
본 발명은 또한 다수의 용기를 내부에 가진 캐리어를 포함하는 제품에 관한 것이다. 그 제품을 사용하여 당해 수용체에 결합하는 주도 화합물에 대해 조합 라이브러리를 검색할 수 있다. 조합 라이브러리는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 검색할 수 있다.
제품에서, 각각의 용기는 당해 수용체의 균일한 양을 함유한다. 또한, 이들 용기는 각각 수용체의 농도보다 2배 이상 높은 농도로 조합 라이브러리에서 유래한 상이한 화합물을 함유한다. 제품은 다중웰 미량이식판 또는 다수의 다중웰 미량이식판이 바람직하다. 수용체가 단백질이면, 각각의 용기는 에시듐 브로마이드를 추가로 함유할 수 있다. 한편, 핵산은 형광단으로 표지할 수 있다.
사용하기 전에, 제품은 당해 수용체의 완전성을 유지할 필요가 있는 임의의 방법으로 보관할 수 있다. 예를 들면, 제품은 -90℃와 실온 사이의 온도에서 보관할 수 있다. 수용체 및 화합물은 동결건조된 형태, 액체 형태, 분말 형태로 보관하거나, 또는 글리세롤에 보관할 수 있다. 제품은 광 또는 암실에서 보관할 수 있다.
샘플 캐리어를 가열하는 열 전도성 부재는 샘플을 신속히 그리고 재생가능하게 가열할 수 있으면 어떤 부재도 가능하다. 다수의 샘플을 단일의 가열 부재상에 가열할 수 있다. 한편, 다수의 샘플을 하나의 가열 부재상에서 주어진 온도로 가열한 다음, 또 다른 온도로 가열하기 위한 또 다른 가열 부재로 이동시킬 수 있다. 가열은 규칙적 또는 불규칙적 간격으로 수행할 수 있다. 완만한 변성 곡선을 생성시키기 위해서는, 샘플을 1℃ 또는 2℃의 간격으로 동등하게 가열하여야 한다. 샘플을 가열할 수 있는 온도 범위는 25℃ 내지 110℃이다.
본 발명에서는, 다수의 샘플을 동시에 가열한다. 샘플이 계단식으로 분리된 온도 간격으로 가열되는 경우, 분광학적 판독은 각각의 가열 단계후에 실시한다. 한편, 각각의 가열 단계후에, 샘플은 분광학적 판독을 실시하기 전에 더 낮은 온도로 가열할 수 있다. 한편, 샘플은 연속적인 방식으로 가열하고 분광학적 가열중에 판독을 실시한다.
분광학적 판독은 캐리어상의 모든 샘플에 대해 동시에 실시할 수 있다. 한편, 2개 이상의 그룹의 샘플에 대해 한 번에 분광학적 판독을 실시할 수도 있다.
본 발명은 또한 주도 화합물의 개량된 생성 방법을 제공한다. 화합물 또는 화합물의 조합 라이브러리를 열 이동 분석법을 사용하여 검색한 후, 표적 수용체에 결합하는 화합물은 화학적으로 변형시켜 화합물의 제2 라이브러리를 생성시킨다. 이러한 제2 라이브러리는 열 이동 분석법을 사용하여 검색한다. 새로운 라이브러리를 발생시키고 검색하는 이러한 방법은 Kd범위가 10-4M 내지 10-15M인 친화도를 가진 표적 분자에 결합하는 화합물이 수득될 때까지 계속한다.
형광 방출 조영 시스템을 사용하여 표적 분자 또는 수용체의 열 변성을 모니터할 수 있다. 형광 방출 조영 시스템은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 알파이미저 겔 도큐멘테이션 앤드 어낼리시스 시스템(AlphaImagerTMGel Documentation and Analysis System)(캘리포니아 산 레안드로 알파 이노테크)은 768×494 픽셀 해상도를 가진 고성능 전하 커플링된 장치를 이용한다. 전하 커플링된 장치 카메라는 컴퓨터와 접촉되어 있고, 상은 상 분석 소프트웨어(상표명)로 분석한다. 케미이미저(ChemiImagerTM)(알파 이노테크)는 알파이미저의 모든 기능을 실행하는 냉각된 전하 커플링된 장치이고, 또한 화학 발광성 샘플 및 기타 저강도의 샘플상을 포착한다. 케미이미저 전하 커플링된 장치는 펜티엄 프로세서(1.2 Gb 하드 드라이브, 16 Mb RAM), 알파이즈(AlphaEaseTM) 분석 소프트웨어, 광 기밀식 캐비넷 및 UV 및 백색광 광선투과기를 구비한다. 예를 들면, MRC-1024 UV/가시광 레이저 공초점 조영 시스템(Visible Laser Confocal Imaging System)(캘리포니아 리치먼드 소재의 바이오래드)은 광범위한 조명 파장(350 ㎚ 내지 700 ㎚)에 대해 1종 이상의 형광단의 동시 조영을 가능하게 한다. 겔 독 1000 형광성 겔 문서처리 시스템(Gel Doc 1000 Fluorescent Gel Documentation System)(캘리포니아 리치먼드 소재의 바이오래드)은 20㎝×20㎝만큼 큰 샘플 면적 또는 5㎝×4㎝만큼 작은 샘플 면적을 명확히 디스플레이할 수 있다. 두 개 이상의 96웰 미량이식판을 20㎝×20㎝의 면적내로 맞출 수 있다. 겔 독 1000 시스템은 또한 시간에 기초한 실험의 실행을 용이하게 한다.
형광 열 조영 시스템을 사용하여 미량이식판 열 이동 분석에서 수용체 폴딩해체를 모니터할 수 있다. 이 양태에서는, 다수의 샘플을 25℃ 내지 110℃에서 동시에 가열한다. 형광 방출 판독은 다수의 샘플 각각에 대해 동시에 실시한다. 예를 들면, 96웰 또는 384웰 미량이식판의 각 웰중의 형광 방출은 각 샘플에 대해 연속적으로 그리고 동시에 모니터할 수 있다. 한편, 형광 방출 판독은 다수의 샘플 각각에 대해 연속적으로 동시에 실시할 수 있다. 보다 낮은 온도에서, 모든 샘플은 저레벨의 형광 방출을 나타낸다. 온도가 증가됨에 따라 각 샘플의 형광강도가 증가한다. 고친화도를 가진 표적 분자에 결합하는 리간드를 함유하는 웰은 열 변성 곡선을 보다 높은 온도로 이동시킨다. 결과적으로, 고친화도를 가진 표적 분자에 결합하는 리간드를 함유하는 웰은 고친화도의 리간드를 함유하지 않는 웰보다 임의의 리간드의 부재하에 표적 분자의 Tm이상의 주어진 온도에서 더 적은 형광강도를 나타낸다. 샘플이 증분 단계에서 가열되는 경우, 다수 샘플 모두의 형광강도는 각 가열 단계에서 동시에 조영된다. 샘플이 연속적으로 가열되는 경우, 다수 샘플 모두의 형광 방출은 가열중에 동시에 조영된다.
열 이동 분석은 100㎕ 부피로 실시할 수 있다. 그러나, 다음과 같은 이유로 열 이동 분석을 10㎕ 부피로 실시하는 것이 바람직하다. 첫째, 소규모 분석에는 약 10배 더 적은 단백질이 필요하다. 따라서, 그 분석(즉, 약 1 μM 내지 약 μM의 표적 분자 농도와 5 ㎕ 내지 10 ㎕의 작업 부피)에는 ~5 pmole 내지 40 pmole(25 kDa 단백질의 경우, 0.1㎍ 내지 1.0㎍)만이 필요하다(즉, 약 1 μM 내지 약 μM의 표적 분자 농도와 5 ㎕ 내지 10 ㎕의 작업 부피). 따라서, 단백질 1㎎을 사용하여 소규모의 형식으로 1,000개 내지 10,000개의 분석을 수행할 수 있다. 이것은 표적 분자가 극소량으로 이용가능한 경우에 특히 유리하다.
둘째, 소규모 분석에는 약 10배 더 적은 리간드가 필요하다. 이 장점은 라이브러리 화합물이 극소량으로 합성되는 중요한 조합 라이브러리를 검색할 경우에 연구자에게 매우 중요하다. 인간 α-트롬빈의 경우, 이상적인 리간드 농도는 약 50 μM인데, 이 농도는 리간드 250 pmole 또는 소규모 형식의 분석당 100 ng(MW 500 Da로 추정)에 해당한다.
셋째, 소규모 분석은 훨씬 더 적은 면적에도 적용할 수 있기 때문에 보다 적은 작업 부피는 보다 대규모의 분석열을 가능하게 한다. 예를 들면, 384웰(16×24열) 또는 864웰(24×36열) 평판은 96웰 평판(약 8.5㎝×12.5㎝)와 대략 동일한 치수를 가진다. 384웰 평판 및 864웰 평판은 사용자가 96웰 평판을 사용하여 실시할 수 있는 것의 4배 내지 9배만큼 많은 분석을 실시할 수 있게 한다. 한편, 1536웰 평판(32×48열; 매트릭스 테크놀로지스 코포레이션)을 사용할 수 있다. 1536웰 평판은 96웰 평판에 의해 제공되는 처리량의 16배를 가능하게 한다.
따라서, 1536웰 평판 형태를 사용하여, 분석 속도를 96웰 형식을 사용하여 실시할 수 있는 속도에 비해 약 16배 증가시킬 수 있다. 8×12 분석열 배열(96웰 평판에서)은 96개 분석/시간 또는 약 2300개 분석/24 시간의 실행을 가능하게 한다. 32×48열 분석 배열은 약 1536개 분석/시간의 실행을 가능하게 하는데, 즉 32×48 분석열 형태를 사용하여 약 37,000개 분석/시간을 실시할 수 있다.
분석 부피는 1㎕ 내지 100㎕일 수 있다. 분석 부피는 1㎕ 내지 50㎕인 것이 바람직하다. 분석 부피가 1㎕ 내지 25㎕인 것이 보다 더 바람직하다. 분석 부피가 1㎕ 내지 10㎕인 것이 더 바람직하다. 분석 부피가 1㎕ 내지 5㎕인 것이 보다 더 바람직하다. 분석 부피가 1㎕ 또는 2㎕인 것이 가장 바람직하다.
분석은 V자형-바닥의 폴리카르보네이트 평판 또는 폴리카르보네이트 딤플 평판에서 실시하는 것이 바람직하다. 딤플 평판은 총 부피 15㎕를 차치하는 다수의 둥근 바닥 웰을 포함하는 평판이다.
Tm의 이동을 확인하기 위하여 치료용 표적의 Tm부근의 온도 범위에서 분광학적 판독을 실시하여 리간드/표적 복합체에 대한 완전한 열 폴딩해체 곡선을 수득하는 또 다른 방법은 표적 분자의 Tm근처의 단일 온도에서 분석을 실시하는 것이다. 이 양태에서, 대조군 샘플(표적 분자를 함유하지만, 후보 리간드가 없는 샘플)에 비해 보다 적은 형광을 방출하는 샘플은 후보 리간드가 표적 분자에 결합하는 것을 나타낸다.
상기 양태에서, 가열에서 기인한 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화의 크기는 1종 이상의 별개의 또는 고정된 온도 범위에서 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출함으로써 측정한다. 열 변성과 관련된 물리적 변화, 예를 들면, 형광 방출을 측정한다. 모든 리간드의 부재하에 표적 분자에 대해 별개의 또는 고정된 온도에서 물리적 변화의 크기를 기록한다. 다수의 상이한 분자, 예를 들면, 조합 라이브러리 각각의 존재하에서의 물리적 변화의 크기를 측정한다. 다수의 분자 각각의 존재하에서의 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화의 크기를 다수의 상이한 분자 모두의 부재하에 별개의 또는 고정된 온도에서 표적 분자에 대해 수득된 물리적 변화의 크기와 비교한다. 다수의 상이한 분자의 친화도를 물리적 변화의 크기의 변화에 따라 평가한다.
물리적 변화가 측정되는 별개의 또는 고정된 온도는 열 안정성의 변화를 구별하는 데에 유용한 임의의 온도일 수 있다. 별개의 또는 고정된 온도는 표적 분자에의 결합에 대해 시험하고자 하는 다수의 상이한 분자의 부재하에 표적 분자에 대한 열 변성 곡선의 중점 온도 Tm이 바람직하다.
단일 온도 형태는 일련의 비교적 고친화도 리간드의 분석에 관심이 있는 경우에 특히 유용한데, 이 때, 상기 리간드는 임상 시험에서의 후보로 바람직한 화합물이다. 그러나, 결합 친화도에 대해 덜 엄격한 요건이 바람직한 경우에는, 리간드 농도를 500 μM로 증가시켜 Kd가 2.5 μM 또는 그 이상의 친화도를 가진 리간드를 동정할 수 있다.
단일 온도 양태는 다수의 장점을 제공한다. 첫째, 분석 속도는 10배의 크기로 증가한다. 따라서, 96웰 평판(8×12열) 분석이 약 96개 분석/시간을 가능하게 하기 때문에, 단일 온도 변화 양태는 약 1000개 분석/시간을 가능하게 한다. 1536웰 평판(32×48열)을 사용하는 경우, 샘플의 분할이 8×12열 시스템에서와 동일한 속도로 32×48열 시스템에서 수행될 수 있는 한, 약 15,000개의 분석이 시간당 수행될 수 있다.
미량이식판 열 이동 분석의 경우 열 폴딩해체 전이를 검출하기 위한 또 다른 방법은 표적 단백질의 본래의 트립토판(Trp) 형광강도에 의해 이루어진다. 사이토플루오르(CytoFluor) II와 같은 대부분의 형광 방출 평판 판독기는 그 광원으로서 텅스텐-할로겐 램프를 사용한다. 이들 램프는 280 ㎚에서 최대로 흡수되는 단백질의 본래의 Trp 잔기를 여기시키도록 280 ㎚ 근처에서 충분한 광을 발산하지 않는다. 그러나, 바이오루민(Biolumin) 960(몰레큘라 다이나믹스)는 크세논-아크등을 사용한다. 크세논-아크등은 280 ㎚에서의 여기 및 350 ㎚에서의 측정을 가능하게 한다.
본 발명의 방법 및 분석 장치는 리간드-단백질 상호작용의 분석에 국한되지 않는다. 이 방법 및 분석 장치는 단백질 안정화와 관련된 임의의 다변수 시스템을 신속히 분석하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법 및 장치를 사용하여 표적 분자에의 1종 이상의 화합물 또는 리간드의 결합을 동시에 분석할 수 있다. 이 방법을 사용하여 다수-리간드 결합의 첨가 효과를 평가할 수 있다. 양성 및 음성 협동성을 측정할 수 있다. 이 방법을 수행하기 위해서는, 리간드의 부재하에, 단일 리간드의 존재하에, 2개 이상의 리간드의 존재하에 단백질과 같은 표적 분자에 대해 열 이동 분석을 실시한다. 단백질만에 대해 그리고 단백질과 리간드(들)의 각각의 조합에 대해 열 변성 곡선을 만든다. 중점 온도 Tm을 각 곡선에 대해 측정한다. 각각의 Tm을 다른 곡선에 대한 다른 각각의 Tm과 비교한다. 한편, 각각의 전체 열 변성 곡선을 다른 열 변성 곡선의 각각과 비교한다. 이들 방법중 어느 하나에서, 1종 이상의 리간드가 결합 상호작용 또는 단백질 안정성에 미치는 부가적인 역할을 측정할 수 있다.
유사한 방식으로, 단백질 안정성에 대한 1종 이상의 생화학적 조건의 추가적인 역할을 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명을 사용하여 단백질 안정성 및 단백질의 보관 수명을 최적화하는 생화학적 조건을 신속히 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법 및 분석 장치를 사용하여 폴딩해체된, 즉 변성된 단백질의 리폴딩 또는 재생에 대한 다양한 생화학적 조건의 효능을 평가할 수 있다. 이 양태는 효과적인 리폴딩 또는 재생 조건을 검색하는 신뢰할 만한 방법에 대한 당해 분야의 요구에 부응한다.
예를 들면, 박테리아 세포에서의 재조합 DNA의 발현은 통상 재조합 단백질의 박테리아 봉입체내로의 격리를 야기한다(Marston, F.A.O., Biochem. J. 240:1-12 (1986)). 박테리아 발현 시스템 대신에 다른 발현 시스템을 사용할 수 있지만, 박테리아 세포에서의 발현은 고레벨의 재조합 단백질 생산에 대한 선택 방법을 남긴다(Rudolph, R., Protein Engineering: Principles and Practices, 283-298면, 존 와일리 앤드 선즈 (1995)). 다수의 경우에, 재조합 단백질의 회수에는 단백질이 봉입체로부터 분리될 것을 요한다. 봉입체로부터의 단백질 정제 공정에는 재조합 단백질의 변성이 필요하다. 결국, 재조합 단백질은 그 천연의 완전 기능 형태의 단백질을 생성시키기에 적합한 조건하에서 재생되거나 리폴딩되어야 한다.
이들 각각의 경우에 있어서, 변성된 단백질은 추가의 연구 또는 사용에 유용하도록 재생되거나 리폴딩되어야 한다. 불운하게도, 주어진 단백질 또는 그 단백질의 단편이 재생되어야 하는 정확한 조건을 예측하기란 용이하지 않다. 각각의 단백질은 상이하다. 어느 세트의 조건이 최적이란 것을 알 수 있기 전에 재생 조건의 다수의 상이한 조합을 항상 시험해야 하는 것이다. 따라서, 다양한 재생 조건의 효능을 평가하기 위한 신뢰성 있고 신속한 방법을 찾는 것이 바람직하다.
재조합 DNA 기술은 박테리아 단백질 발현 장치의 탐색을 통해 비교적 다량으로 광범위한 다양성의 당해 이종성 폴리펩티드의 생합성을 가능하게 하였다. 그러나, 높은 치료수치를 가진 정확히 폴딩된 인간의 특이 단백질의 저렴하고 풍부한 공급은 폴딩되지 않거나 부분적으로 폴딩되지 않은 표적 단백질이 불용성의 단백질 봉입체로 압도적으로 우세하게 응집하기 때문에 실패하여 왔다. 최근의 연구에 대해서는 문헌[Rudolph, R., & Lilie, H., FASEB J. 10:49-56 (1995); Sadana, A., Biotechnology & Bioengineering 48:481-489 (1995); Jaenicke, R., Phil. Trans. Royal Soc. London Ser. B-Biol. Sci. 348:97-105 (1995)] 참조. 이.콜리에서의 자가 응집 반응이 우세한 이유는 부분적으로 폴딩해체된 상태에서 다양한 정도로 확인되는 비교적 고농도의 이종성 단백질(세포 중량의 30%의 고농도)에 집중되었다. 따라서, 이.콜리 균주의 과다발현의 증가된 단백질 농도에서, 폴딩해체된 단백질의 노출된 소수성 잔기는 이들이 완전히 폴딩된 천연 상태로 진행하기 위해 적합한 배향(분자내 전이 상태)으로 채워지는 자가 붕괴된 폴리펩티드 모양을 시험하고자 하는 경우보다 유사하게 노출된 기를 가진 기타 분자와 접촉(분자간 반응)하는 경향이 더 크다(도 26 참조). 이러한 상관관계로부터, 불용성 단백질 봉입체는 바람직한 단백질 폴딩 과정을 방해하는 역학적으로 포착된 부반응 생성물로서 나타난다.
봉입체의 분리, 봉입체로부터 재조합 단백질의 정제 및 단백질의 리폴딩 또는 재생 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook, J.등, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 17.37-17.41면, 콜드 스프링 하버 래보러토리 프레스 (1989); Rudolph, R. 등, FASEB J. 10:49-56 (1995)] 참조.
이.콜리에서 정확히 폴딩된 단백질을 다량으로 생산하는데 있어서의 또 다른 장애 요인은 이.콜리 시토졸의 환원성 산화환원 전위가 생체내 이황화물 결합의 형성을 방해한다는 것이다. 이황화물 결합의 형성은 단백질 폴딩과 자주 연관되는 다수의 세포외 단백질의 생합성에 있어서 중요한 동시해독 및 해독후 현상이다. 또한, 시스-트란스 프롤린 이성화 반응은 특정 단백질의 정확한 폴딩에 대한 속도 결정 단계로 입증되었다(Lin, L.-N., & Brandts, J.F., Biochemistry 22:564-573 (1983)). 결과적으로, 부분적으로 폴딩된 중간체는 단백질 집합체로 응집 및 침전될 만큼 생체내에서 충분한 양으로 축적된다.
세포들은 분자 샤페로닌으로 지칭되는 숙주 단백질의 1 종류를 이용하는데, 이 샤페로닌은 봉입체 형성, 즉 응집 및 부적절한 이황화물 결합 형성과 관련하여 전술한 다수의 비생산적인 부반응을 외관상 방해함으로써 생체내 단백질 폴딩을 보조한다. 그러나, 이.콜리 샤페로닌 구조는 단백질 GroEL 및 GroES에 부분적으로 포함되는 것으로서, 대량의 과다발현에 의해 매몰되는 것 같다. 당해 단백질과 분자 샤페로닌의 동시발현에 의한 그러한 샤페로닌 결함을 수정하기 위한 다수의 시도에도 불구하고(Rudolph, R. & Lilie, H. The FASEB J. 10:49-56 (1995)), 단 하나의 경우에 양성의 결과가 보고되었다(Goloubinoff, P 등, Nature 342:884-889 (1989)).
GroEL 및 GroES가 어떻게 생체내 단백질 폴딩을 보조하는 지를 설명하기 위한 두가지의 가설이 제안되었다. 첫 번째 가설인 안핀센 케이지(Anfinsen cage) 가설에서는, 분자 샤페로닌의 기능은 단백질의 그 천연 상태로의 폴딩이 세포에서의 프로-응집 조건에 의한 간섭 없이 진행할 수 있는 경우인 보호된 환경을 제공하는 것이다(Martin 등, Nature 352:36-42 (1991); Ellis, R.J., Current Biology 4:633-635 (1994)). 두 번째 가설인 "반복적인 어닐링" 가설에서는 샤페로닌의 기능이 ATP 가수분해 에너지를 일부 사용하여 착오폴딩된 단백질(즉, 역학적으로 포착된 중간체)을 부분적으로 폴딩해체시키는 것인데, 이 때, ATP 가수분해 에너지는 기질 폴리펩티드의 형태 에너지로 전달되어 폴리펩티드를 보다 고에너지 상태로 만들어 그것이 용액내로 해리된 후에 정확히 다시 리폴딩시킬 수 있었다(Todd, M.J. 등, Science 265:659-666 (1994); Jackson 등, Biochemistry 32:2554-2563 (1993); Weissman, J.S. 등, Cell 78:693-702 (1994); Weissman, J.S. & Kim, P.S. Science 253:1386-1393 (1991)).
상기에서 논의한 생체내 결과는 여러 가지 면에서 이.콜리에서 발현된 재조합 이종성 단백질의 생체외 리폴딩에 관한 보다 최근의 실험과 일치한다. 즉, 단백질의 1차 아미노산 서열이 그 천연의 폴딩된 형태를 측정하기에 충분한 정보를 포함할 수 있는 반면에(Anfinsen, C.B., Science 181:223-230 (1973)), 폴딩 반응이 일어나는 생화학적 조건은 폴딩해체된 형태, 응집된 형태 및 정확히 폴딩된 형태들 사이의 구분에 강하게 영향을 끼칠 수 있다.
예를 들면, pH가 하기 수학식 4의 4번째 항에 계산된 긴 범위의 정전기적 상호작용에 미치는 그 영향에 의해 폴딩 반응에 영향을 끼치는 것으로 이해할 수 있다.
상기 수학식에서,
ΔGconf= 형태 자유 에너지(질서/무질서 관계);
Δgi,int= 짧은 범위의 상호작용(H-결합, 반데르 발스 상호작용, 염 브릿지, 보조인자 결합 등);
Δgi,s= 용매와의 짧은 범위의 상호작용(소수성 효과, 이온의 수화 등); 및
ΔWel= 긴 범위의 정전기적 상호작용.
ΔGbind= 리간드 결합 자유 에너지.
단백질 용액의 pH가 단백질에 대한 pI 이하로 감소함에 따라, 폴리펩티드상의 작용기는 작용기들 사이의 정전기적 반발력이 결국 자유 에너지식(수학식 4)에서 다른 항을 상쇄하는 값까지 점차로 양성자화되고, 단백질은 더 이상 천연의 형태를 취할 수 없다.
단백질 폴딩에 대한 또 다른 중요한 생화학적 매개변수는 지방족 및 방향족 측쇄( 및 아마도 주쇄를 상당한 정도로)를 반발하여 그 노출된 표면적을 최소화하는 용매인 물이다. 폴딩 반응에 대한 용매의 영향은 자유 에너지식(수학식 4)의 세 번째 항에 계산된다. 특정 염이 수용액에서의 단백질 측쇄 사이의 소수성 상호작용을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 그 효과는 호프마이스터(Hofmeister) 시리즈에 따른 이온의 성질에 따라 좌우된다: 양이온: Mg2+> Li+> Na+> K+> NH4 +. 음이온: SO4 2-> HPO4 2-> 아세테이트 > 시트레이트 > 타르트레이트 > Cl-> NO3 -> ClO3 -> I-> ClO4 -> SCN-. 0.4M의 SO4 2-및 HPO4 2-와 같은 호프마이스터 음이온을 안정화시키면, 정확히 폴딩된 단백질의 수득률이 증가되는 것으로 확인되었다(Creighton, T.E. Proteins: Structure and Molecular Properties, Freeman, 뉴욕 (1984)). 단백질의 천연 형태에 대한 이러한 양호한 결과는 단백질의 우선적인 수화를 초래하는 양이온과 음이온의 "염석" 효과 때문이었다(Creighton, T.E. Proteins: Structure and Molecular Properties, Freeman, 뉴욕 (1984)).
글리세롤은 단백질의 천연 형태를 선호하는 물의 용매화 성질을 변화시킨다. 이것이 일어나는 메카니즘은 호프마이스터 시리즈의 염들의 염 효과와 다르지 않게, 공용매 배타 및 단백질의 우선적 수화이다(Timasheff & Arakawa, Protein Structure, A Practical Approach, T.E. Creighton 편집, IRL PRess, 영국 옥스포드 (1989), 331-354면).
환경이 단백질 폴딩에 영향을 미치는 방법의 또 다른 예는 공지의 리간드 및 보조인자가 폴딩된 단백질의 수득률에 미치는 효과이다. 리간드 결합은 폴딩 반응의 자유 에너지에 결합 자유 에너지를 결합시킴으로써, 폴딩해체된 상태로부터 천연-리간드 복합체로 평형을 이동시키는 효과이다. 소의 카르보닉 안하이드라제 II의 리폴딩에서의 금속 이온의 역할은 공지되어 있다(Bergenhem & Carlsson, Biochim. Biophys. Acta 998;277-285 (1989)). 단백질 폴딩에 영향을 미치는 것으로 알려진 기타 생화학적 매개변수는 단백질 농도, 온도, 글루타치온 산화환원 완충액(GSH, GSSG), 세정제의 존재 및 기타 첨가제, 예를 들면 글리세롤, 아르기닌-HCl, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 유기 용매의 존재 등이다.
리폴딩 조건하에서의 항온처리중에, 재조합 단백질은 고체상 지지체에 고정화시킬 수 있다. 이 구조는 폴딩해체된 단백질이 보호된 환경, 즉 천연 상태로의 폴딩이 경쟁성 응집 반응으로부터 방해받지 않고 진행될 수 있는 환경에서 일시적으로 고정화되는 경우에 GroEL 및 GroES의 기능에 대한 "안핀센 케이지" 가설과 유사하다. 고체 지지체상의 단백질 폴딩은 이제 두가지의 최근의 보고 문헌에서 확인할 수 있다. 폴리-히스티딘 표지된 TIMP-2 단백질은 투석에 의해 리폴딩될 수 있는 반면에, 금속 킬레이트 칼럼에 여전히 결합할 수 있다(Negro, A.등, FEBS Lett. 360:52-56 (1995)). α-글루코시다제의 아미노 또는 카르복실 말단에 부착된 다가이온 융합 펩티드는 폴딩을 허용하는 반면에, 약 5 ㎎/㎖의 헤파린-세파로스 수지에 결합하였다(Rudolph & Lilie, FASEB J. 10:49-56 (1995)). α-글루코시다제의 고정화 및 리폴딩을 위한 다가이온 아르기닌 표지 방법은 문헌[Stempfer, G. 등, Nature Biotechnology 14:329-334 (1996)]에 개시되어 있다.
본 발명에서는, 열 이동 분석법을 사용하여 다양한 리폴딩 또는 재생 조건의 효능을 평가한다. 당해 단백질의 다수의 분취물 각각은 다양한 상이한 생화학적 폴딩 조건하에 항온처리된 것으로서, 다용기 캐리어내 용기에 넣는다. 농도를 알고 있는 천연의 완전 기능 단백질의 분취물은 대조군 용기에 넣는다. 샘플은 임의의 다용기 캐리어에 넣을 수 있다. 각 샘플을 다중웰 미량이식판의 하나의 웰에 넣는 것이 바람직할 수 있다.
단백질 폴딩 반응의 결과에 영향을 미칠 수 있는 다수의 생화학적 변수를 고려할 때, 단백질 폴딩의 최적화는 신약 탐구에서의 단백질 결정화 및 정량적 구조 활성 관계(QSAR)과 다르지 않게 다변수 최적화의 문제이다. 다변수 최적화 문제는 양호한 반응에 영향을 미치기 위해 가능한 한 많은 데이터를 수집하는 다수의 병행 실험을 필요로 한다. 이 점에서, 단백질 결정화 및 QSAR 분석은 생화학적 또는 화학적 조성물에서의 증분 변화의 행렬을 이용하는 질량 검색 프로토콜로부터 큰 장점을 얻었다.
본 발명을 사용하여 리폴딩 또는 재생 조건의 효능을 평가할 수 있다. 그러한 조건으로는 글리세롤의 농도, 단백질의 농도, 이황화물 결합 형성을 촉매하는 작용제의 사용, 온도, pH, 이온강도, 용매의 종류, 환원된 글루타치온(GSH) 및 산화된 글루타치온(GSSG)과 같은 티올, 요소, 염화구아니듐, 알킬-요소와 같은 카오트로프, 탄산 아미드와 같은 유기 용매, L-아르기닌 HCl, 트리스 완충액, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 세정제, 이온성 세정제, 쯔비터이온성 세정제, 혼합 마이셀 및 시클로덱스트린과의 배합물 상태의 세정제의 사용이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다. 본 발명은 변성제가 투석, 칼럼 크로마토그래피 기술 또는 흡입 여과를 사용하여 단백질로부터 제거되는 지 여부와 관계없이 사용할 수 있다.
분광학적 열 이동 분석법을 사용하여, 최적 단백질 리폴딩을 가능하게 하는 조건을 신속하게 측정할 수 있다. 이 양태에서는, 재생된 단백질 샘플 및 대조군 단백질 샘플(즉, 그 완전 기능적 형태의 천연 단백질 샘플)을 일정 온도 범위에 걸쳐서 가열한다. 별개의 온도 간격에서, 분광학적 판독을 실시한다. 한편, 분광학적 판독은 연속적인 예정된 온도 프로필중에 실시할 수 있다. 열 변성 곡선이 각 샘플에 대해 만들어진다. 천연의 완전 기능성 단백질의 열 변성 곡선에 대한 Tm을 측정한다. 리폴딩 조건의 상대적인 효능은 그 Tm에서 천연의 완전 기능성 단백질의 공지량의 물리적 변화의 크기와 비교하여, 천연의 완전 기능성 단백질의 Tm에서 폴딩해체와 관련된 물리적 변화의 크기에 따라 평가한다. 폴딩해체의 정도(열 변성 곡선의 종좌표, 즉 y-축상에 반영됨)를 측정하는데 사용된 물리적 변화의 크기는 정확히 폴딩된 단백질의 양에 해당한다.
본 발명은 단백질 폴딩을 용이하게 하고 최적화하는 생화학적 조건을 검색하는 방법을 제공한다. 주어진 단백질에 대한 조건을 검색하기 위해서는, 먼저 당해 단백질에 대한 열 폴딩해체 프로필을 측정할 필요가 있다. 이것은 미량이식판 열 이동 분석법을 사용하여 변성 곡선을 산출함으로써 수행한다. 다양한 조건을 최적화할 수 있는데, 그 예로는 최적 pH, 이온강도 의존성, 호프마이스터 시리즈의 염 농도, 글리세롤 농도, 슈크로스 농도, 아르기닌 농도, 디티오트레이톨 농도, 금속 이온 농도 등을 들 수 있다.
미량이식판 열 이동 분석법을 사용하여, 단백질 안정성에 부가적인 영향을 가지는 1종 이상의 생화학적 조건을 결정할 수 있다. 단백질 안정성을 증가시키는 한가지 세트의 생화학적 조건이 열 이동 분석법을 사용하여 동정되면, 동일한 세트의 조건을 재조합 단백질과의 단백질 폴딩 실험에 사용할 수 있다. 도 27 참조. 열 이동 분석에서 단백질 안정성을 촉진시키는 조건이 재조합 단백질의 폴딩을 촉진하는 조건과 상관 관계가 있으며, 단백질 안정성의 추가의 증가를 초래하는 안정화 조건의 조합이 동정될 때까지 추가의 열 이동 분석을 실시함으로써 더 최적화할 수 있다. 그 다음, 재조합 단백질은 그러한 조건하에서 폴딩된다. 이 과정은 최적의 폴딩 조건이 동정될 때까지 반복한다. 단백질 안정성은 단백질 폴딩의 향상된 수득률과 상관 관계가 있는 것으로 예상된다. 정확히 폴딩된 단백질의 수득률은 적합한 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 정확히 폴딩된 단백질의 수득률은 친화도 칼럼, 예를 들면, 단백질의 리간드가 부착되는 칼럼에 리폴딩된 단백질을 통과시키고, 샘플에 존재하는 단백질량을 정량 분석함으로써 계산할 수 있다. 이러한 방식으로, 폴딩 조건은 정확한 폴딩에 대한 그 추가적 역할에 대해 평가할 수 있다. 단백질 폴딩 반응에 대한 전이 상태는 변성된 형태보다 더 단백질의 천연 형태와 유사하다. 이것은 다수의 단백질의 경우에 입증되었다(Fersht, A.R., Curr. Op. Struct. Biol. 7:3-9 (1997)).
본 발명의 방법 및 장치는 단백질 폴딩을 선호하는 생화학적 조건의 조합을 검색하는 신속한 고처리량 방법을 제공한다. 이 방법은 단백질 폴딩에 대한 통상의 방법들이 필요로 하는 성가시고 시간 소모적인 단계를 요하지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 방법을 사용하면, 재조합 단백질 리폴딩의 통상의 방법과 관련된 응집 문제를 피하기 위해 큰 부피와 낮은 단백질 농도(~10 ㎍/㎖)로 단백질을 희석할 필요가 없다. 단백질 응집을 억제하면, 단백질 폴딩 평형(단백질의 폴딩해체된 형태와 폴딩된 형태 사이)을 정확한 천연 형태로 이동시키는 생화학적 매개변수를 검색할 수 있다.
단백질 안정화, 단백질 폴딩, 리간드 선별 및 약제 설계와 마찬가지로, 단백질 안정화를 촉진하는 조건의 선별은 본 발명의 방법 및 장치를 사용하여 해결되는 또 다른 다변수 최적화 문제이다.
본 발명의 방법 및 장치는 또한 단백질 결정화를 촉진하는 조건을 결정하는 데에 유용하다. 용액으로부터 분자를 결정화하는 것은 가역적 평형 과정이며, 역학적 및 열역학적 매개변수는 당해 용매 시스템 및 용질의 화학적 및 물리적 성질의 함수이다.(McPherson, A., Preparation and Analysis of Protein Crystals, 와일리 인터사이언스 (1982); Weber, P.C., Adv. Protein Chem. 41:1-36 (1991)). 초포화 조건하에서, 시스템은 용질이 폴딩해체된 상태와 천연 상태 대신에 가용성 상과 고체상 사이에서 분배되는 평형에 대해 작동된다. 결정상내 분자들은 단백질 폴딩에 중요한 점착력, 즉 반 데르 발스 상호작용, 정전기적 상호작용, 수소 결합 및 공유 결합이 동일한 다수의 유형에 에너지학적으로 우세한 정리되고 주기적인 3차원 배열로 충전된다(Moore, W. J., Physical Chemistry, 제4판, 프렌티스 홀 (1972), 865-898 면).
따라서, 다수의 방식으로, 단백질 결정화는 전체 분자가 각각의 아미노산 잔기 대신에 점착 에너지를 최대화하도록 충전된 단백질 폴딩의 보다 고레벨의 변형으로 볼 수 있다. 더욱이, 단백질 결정화 및 단백질 폴딩 둘다의 경우, 용매의 조성은 가용성(폴딩해체된) 형태와 결정형(천연) 형태 사이에 분배 정도에 매우 중요한 역할을 할 수 있다. 단백질 거대분자에 존재하는 점착성 상호작용, 및 단백질 폴딩과 단백질 결정화 둘다에 대한 그러한 상호작용의 조절에 있어서의 용매의 역할은 복잡하여 현재까지도 완전히 이해되지 않고 있다. 이 점에서, 단백질 안정성 및 단백질 폴딩을 촉진하는 생화학적 조건은 또한 단백질 결정화를 촉진하기도 한다.
예를 들면, D(II) FGF 수용체 1의 안정성을 증가시키는 것으로 확인된 생화학적 조건(도 19 내지 도 24)은 x-선 회절 품질의 단백질 결정의 결정화를 촉진하는 조건과 상관 관계가 있다. D(II) FGFR1 단백질의 결정을 수득하는데 이용된 조건(Lewankowski, Myslik, Bone, R. Springer, B.A. 및 Pantoliano, M.W., 미공개 결과(1997))은 표 1에 제시되어 있다. 단백질 결정은 호프마이스터 염 Li2SO4(65% 내지 72%)의 존재하에 pH 7.4 내지 9.2 범위에서 수득되었다. 이들 결정화 조건은 도 23에서 최적 pH 약 8.0과 상관 관계가 있었다. Na2SO4, (NH4)2SO4및 Mg2SO4와 같은 호프마이스터 시리즈의 기타 염 역시 침전제로서 필요한 Li2SO4의 양을 낮추는 첨가제로서 유용한 것으로 확인되었다. 명백히, 성공적인 D(II) FGFR1 결정화에 대한 상기 조건은 미량이식판 열 이동 분석법을 사용하여 확인된 안정화 조건과 밀접한 상관 관계가 있었다.
인간의 α-트롬빈 안정화를 촉진하는 것으로 확인된 조건은 또한 인간의 α-트롬빈 단백질 결정화를 촉진한다. 도 17A-D 및 도 18은 인간의 α-트롬빈 안정성을 촉진하는 조건의 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다. 표 2는 x-선 회절 품질의 인간 α-트롬빈 결정의 결정화를 촉진하는 조건에 관한 요건이 요약되어 있는데, 이 조건은 3명의 상이한 연구자에 의해 확인된 것이다(Bode, W. 등, Protein Sci. 1:426-471 (1992); Vijayalakshmi, J. 등, Protein Sci. 3:2254-22271 (1994); 및 Zdanov, A. 등, Proteins: Struct. Funct. Genet. 17:252-265 (1993)).
표 2에 요약된 조건은 인간의 α-트롬빈 안정화를 촉진하는 것으로 미량이식판 열 이동 분석에서 확인된 조건과 밀접한 상관 관계가 있다. 결정은 최적 pH 약 7.0 부근에서 형성되었다. 또한, 0.1M 내지 0.5M의 NaCl(조건의 50%) 또는 0.1M 내지 0.2M의 NaHPO4의 존재하에서 명백한 선호가 있었다. 이것은 최근에 발견된 Na+결합 부위(Dang 등, Nature Biotechnology 15:146-149 (1997)) 및 도 17A-D 및 도 18에 도시된 미량이식판 열 이동 분석 결과와 일치하는 것이다. 양호한 결과를 산출한 표 2에 기술한 인간의 α-트롬빈 샘플은 모두 리간드와 복합체를 이루어 이 단백질의 천연의 구조를 안정화하는데, 이 단백질은 그 구조를 초월하여 생화학적 조건으로부터 수득된 것이다.
| D(II)FGFR1 결정화 조건 | |||
| 완충제 | 침전제 | 첨가제 | 단백질 농도 |
| 50mM Hepes pH7.4 | 72% Li2SO4 | 10㎎/㎖(10mM Hepes pH7.5) | |
| 50mM Hepes pH7.4 | 72% Li2SO4 | 3.4mM ZnSO4 | 10㎎/㎖(10mM Hepes pH7.5) |
| 50mM Hepes pH7.4 | 68% Li2SO4 | 1% PEG 8000 | 10㎎/㎖(10mM Hepes pH7.5) |
| 50mM Hepes pH7.4 | 66% Li2SO4 | 3.4mM Na2SO4 | 10㎎/㎖(10mM Hepes pH7.5) |
| 50mM Hepes pH7.4 | 66% Li2SO4 | 5.3mM (NH4)2SO4 | 10㎎/㎖(10mM Hepes pH7.5) |
| 50mM Hepes pH7.4 | 66% Li2SO4 | 2.1mM MgSO4 | 10㎎/㎖(10mM Hepes pH7.5) |
| 10mM Tris HCl pH8.0 | 65% Li2SO4 | 10㎎/㎖(10mM Hepes pH7.5) | |
| 20mM 글리신 pH5.2 | 68% Li2SO4 | 10㎎/㎖(10mM Hepes pH7.5) |
단백질 결정화는 역사적으로 단백질 및 핵산 구조의 x-선 회절 측정용 속도 결정 단계였던 느리고 지루한 과정이다. 본 발명의 방법 및 장치는 주어진 단백질의 안정성을 촉진하는 조건의 신속한 고처리량 규명 및 따라서 X-선 품질의 단백질 결정의 형성을 촉진한다.
단백질이 보다 더 안정할 경우, 결정 격자내로 충전을 억제하는 보다 더 적은 열역학적 운동을 가진다. 운동이 보다 적게 일어나면, 단백질은 결정 격자내에 보다 잘 들어맞는다. 통상의 결정화 방법을 사용하여, 결정화 실험은 한 번에 수주동안 실온에서 설정된다. 시간이 초과하면 단백질의 폴딩해체가 일어난다. 본 발명의 방법을 사용하면, 단백질을 안정화하는 조건은 일정 온도 범위에 걸쳐 시험된다. 열적 폴딩해체 곡선을 보다 고온으로 이동시키는 조건은 결정화 과정이 일어나는 동안 일어나는 폴딩해체도를 낮춘다.
| 인간 α-트롬빈 복합체 | 결정화 조건 | |||||
| 완충제 | 염 | 침전제 | 첨가제 | 단백질 농도 | 설명 | |
| Vijayalakshmi 등의 조건 | ||||||
| MDL-28050 | 75mM NaHPO4pH7.3 | 0.375M NaCl | 1mM NaN3 | 3㎎/㎖ | 단백질(2.2Å) | |
| 100mM NaHPO4pH7.3 | 24% PEG 4000 | 1mM NaN3 | 양호 | |||
| 히루겐/히루로그 1 | 50mM NaHPO4pH7.3 | 0.375M NaCl | 0.5mM NaN3 | 3-3.7㎎/㎖ | 단백질(2.3Å) | |
| 0.1M NaHPO4pH7.3 | 28% PEG 8000 | 1mM NaN3 | 양호 | |||
| FPAM + 히루겐 | 0.1M NaHPO4pH7.3 | 5㎎/㎖ | 단백질(2.5Å) | |||
| 0.1M NaHPO4pH7.3 | 28% PEG 8000 | 양호 | ||||
| 히루로그 3 | 75mM NaHPO4pH7.3 | 0.38M NaCl | 1mM NaN3 | 5㎎/㎖ | 단백질(2.3Å) | |
| 0.1M NaHPO4pH7.3 | 24% PEG 8000 | 1mM NaN3 | 양호 | |||
| Bode 등의 조건 | ||||||
| NAPAP | 0.1M KHPO4pH8.0 | 10㎎/㎖ | 단백질(2.3Å) | |||
| 0.1M KHPO4pH8.0 | 1.9M NH4SO4 | |||||
| PPACK | 2mM MOPS pH7 | 0.1M NaCl | 0.5% NaN3 | 10㎎/㎖ | 단백질(1.9Å) | |
| 0.2M PO4pH6-7 | 0.5M NaCl | 20% PEG 6000 | 양호 | |||
| Zdanov 등의 조건 | ||||||
| 히루토닌-2 | 50mM NaHPO4pH5.5 | 0.1M NaCl | 10㎎/㎖ | 단백질(2.1Å) | ||
| 0.1M Na 시트레이트 pH5.5 | 0.1M NaCl | 24% PEG 4000 | 양호 |
분석 장치의 개관
본 발명의 분석 장치는 지정된 온도 범위에서 다수의 샘플의 온도를 동시에 조정하고 샘플로부터 분광 방출을 수용하는 자동화된 온도 조정 및 분광 방출 수용 시스템을 지향한다. 본 발명의 분석 장치는 단백질 안정성의 미량이식판 열 이동 분석의 실시에 특히 유용하다. 본 발명의 분석 장치는 본 발명의 방법 모두의 실시에 사용할 수 있다.
본 발명의 분석 장치는 별도의 가열 장치 및 분광 방출 수용 장치를 대체한다. 기타 장치와 대조적으로, 본 발명의 분석 장치는 다수의 샘플의 온도를 동시에 조정하고 예정된 온도 프로필에 따라 온도를 조정하는 중에 샘플로부터 분광 방출을 수용하도록 구성할 수 있다.
열 변성후에, 가역성 폴딩 단백질은 부분적으로 또는 완전히 리폴딩한다. 리폴딩은 열 이동 분석에서 의미있는 측정을 방해한다. 그러나, 본 발명의 분석 장치를 사용하여, 열 이동 분석에서 가역성 폴딩 단백질을 분석할 수 있다. 그것은 본 발명의 분석 장치에서 단백질이 가열되는 동안 분광학적 측정을 실시하기 때문이다. 그리고 단백질 리폴딩은 일어나지 않는다.
그러한 구조에서, 본 발명의 분석 장치는 샘플열이 배치되는 이동성 열 전도성 블록위로 위치하는 센서를 구비한다. 서보 구동 전기자와 같은 상대 이동 수단을 사용하여 센서를 이동시킴으로써 센서가 샘플열의 각 샘플위로 순차적으로 위치하게 한다. 센서는 샘플로부터 분광 방출을 수용한다.
본 발명의 분석 장치는 단일의 열 전도성 블록을 포함하는 구조를 가질 수 있다. 한편, 분석 장치는 이동식 단상에 다수의 열 전도성 블록을 구비하도록 구성할 수 있다. 단은 예를 들면, 서보 구동 선형 슬라이드 장치에 의해 병진 운동할 수 있는 병진 운동식 단일 수 있다. 선형 슬라이드 장치의 예로는 모델 SA A5M400(캘리포니아 토란스 소재의 IAI 어메리카)이 있다. 이 양태에서, 센서는 주어진 열 전도성 블록상에 각각의 샘플로부터 분광 방출을 수용한다. 그 다음, 단은 병진 운동하여 또 다른 열 전도성 블록 및 그 수반 샘플을 센서 아래에 위치시킴으로써, 그 가열 블록상에서 각각의 샘플로부터 분광 방출을 수용하도록 한다. 단은 모든 열 전도성 블록상에서 샘플로부터 분광 방출이 수용될 때가지 병진 운동한다.
한편, 단은 서보 구동축과 같은 것에 의해 회전될 수 있는 회전식 단일 수 있다. 이 양태에서, 센서는 주어진 열 전도성 블록상에서 각각의 샘플로부터 분광 방출을 수용한다. 그 다음, 단은 병진 운동하여 또 다른 열 전도성 블록 및 그 수반 샘플을 센서 아래에 위치시킴으로써, 그 가열 블록상에서 각각의 샘플로부터 분광 방출을 수용하도록 한다. 단은 모든 열 전도성 블록상에서 샘플로부터 분광 방출이 수용될 때가지 병진 운동한다.
시스템 설명
도 29는 본 발명의 분석 장치(2900)의 일 양태의 개략도이다. 분석 장치(2900)는 다수의 샘플(2910)에 대한 다수의 웰(2920)을 포함하는 열 전도성 블록(2912)를 구비한다. 열 전도성 블록(2912)은 알루미늄, 스테인리스 스틸, 황동, 테플론 및 세라믹과 같은 비교적 높은 열 전도도를 갖는 재료로 이루어진다.
따라서, 열 전도성 블록(2912)는 균일한 온도로 가열되고 냉각될 수 있으나, 온도를 유지하기 위해 과도한 가열 또는 냉각을 필요로 할 만큼 충분한 열 전도성을 갖지는 않는다.
분석 장치(2900)는 또한 샘플에 대해 일반적으로 2916으로 나타낸 여기 파장의 광을 방출하는 광원(2906)을 구비한다. 광원(2906)은 여기광(2916)으로 샘플(2910)을 여기시킨다. 임의의 적합한 광원을 사용할 수 있다. 예를 들면, 텅스텐-할로겐 램프를 사용할 수 있다. 한편, 바이오루민 960(몰레큘라 다이나믹스)과 같은 크세논-아크 램프를 사용할 수 있다.
한편, 고압 수은(Hg) 램프를 사용할 수 있다. 고압 수은 램프는 크세논(Xe) 램프보다 고강도의 강을 방출한다. 고압 수은 램프로부터 광의 강도는 특이 라인에 집중되고, Hg 라인이 특정 형광단의 여기에 적합한 파장에 있는 경우에만 유용하다.
일부 형광판 판독기는 전자기 스펙트럼의 가시영역에서 여기용 레이저를 이용한다. 예를 들면, 플루오르이미저(캘리포니아 팔로 알토 소재의 몰리큘라 다이나믹스)는 그러한 장치이다. 이 기술은 480㎚ 부근에서 에너지를 흡수하고 590㎚ 부근에서 에너지를 방출하는 형광성 염료를 사용할 경우에 유용하다. 그러한 염료는 표준 아르곤, 아르곤/크립톤 레이저의 488㎚ 조명으로 여기될 수 있다. 예를 들면, 1,1-디시아노-2-[6-(디메틸아미노)나프탈렌-2-일]프로펜(DDNP)이 그러한 염료이다. 레이저의 사용할 때에 있어서의 장점은 레이저가 매우 고강도의 광을 특징으로 하여 신호 대 노이즈 비의 향상을 초래한다는 것이다.
여기광(2916)은 샘플(2910)로부터 분광 방출(2918)을 일으킨다. 분광 방출(2918)은 전자기 스펙트럼에서의 임의의 파장의 전자기 복사일 수 있다. 분광 방출(2918)은 형광, 자외광 또는 가시광이 바람직하다. 분광 방출(2918)은 형광 방출이 가장 바람직하다. 분광 방출(2918)은 광증폭관(2904)에 의해 수용된다. 광증폭관(2904)은 전선부(2902)에 의해 컴퓨터(2914)에 연통되고 작동적으로 연결된다. 컴퓨터(2914)는 온도의 함수로서 분광 방출을 분석하는 데이터 분석 수단으로서 기능한다.
상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명의 분석 장치의 분광 수용 수단 또는 센서는 광증폭관을 구비할 수 있다. 한편, 분광 수용 수단 또는 센서는 전하가 커플링된 장치 또는 전하가 커플링된 카메라를 구비할 수 있다. 또 다른 대안적 양태에서, 분광 수용 수단 또는 센서는 다이오드열을 구비할 수 있다.
본 발명의 분석 장치의 또 다른 양태는 도 30에 도시되어 있다. 도 30에 도시된 양태에서, 전하가 커플링된 장치(CCD) 카메라(3000)를 사용하여 샘플(2910)으로부터 분광 방출(2918)을 검출한다. CCD 카메라(3000)은 형광 방출을 조영하기에 적합한 임의의 CCD 카메라일 수 있다. 예를 들면, 적합한 CCD 카메라는 알파-이노테크(캘리포니아 산 레안드로), 스트라타진(캘리포니아 라 졸라) 및 바이오래드(캘리포니아 리치몬드)에서 입수가능하다. 미량이식판 열 이동 분석에서 형광 방출을 측정하는 경우, 형광판 판독기를 대체하는 것으로 전하가 커플링된 장치(CCD)가 있다. 예를 들면, 고해상도 CCD 카메라는 먼 거리의 별에서 발생한 것이거나, 결정에 의해 회절된 것이거나 또는 형광단에 의해 방출된 것이거나 간에 매우 소량의 전자기 에너지를 검출할 수 있다. CCD는 반전도성 실리콘으로 이루어진다. 광자가 그 위에 충돌하면 자유 전자가 방출된다. 전자 조영 장치로서, CCD 카메라가 형광 방출 조영에 특히 적합한데, 그 이유는 이 카메라가 매우 희미한 물체를 검출하고, 광범위하게 감도높은 검출을 제공하며, 전자기 노이즈의 저레벨을 제공하며, 광범위한 역학적 범위에 걸쳐 신호를 검출할 수 있기 때문이다. 즉, 전하가 커플링된 장치는 밝은 물체 및 희미한 물체를 모두 동시에 검출할 수 있기 때문이다. 또한, 출력은 선형성이어서 수집된 전자의 양이 수용된 광자의 수와 정비례한다. 이것은 상의 휘도가 물체의 실제 휘도, 즉 사진 유제와 같은 것에 의해 제공되지 않는 성질의 척도라는 것을 의미한다.
형광 조영 카메라, 즉 CCD 카메라를 사용하는 경우에, 여기광(2916)은 다수의 샘플(2910)위로 배치된 적합한 램프일 수 있다. 한편, 여기광(2916)은 다수의 샘플(2910) 아래에 위치한 적합한 램프일 수 있다. 또 다른 양태에서, 여기광(2916)은 다수의 광섬유 케이블에 의해 각 샘플(2910)에 전달될 수 있다. 각각의 광섬유 케이블은 전도성 블록(2912)에서 다수의 터널중 하나를 통해 배치된다. 따라서, 각각의 샘플(2910)은 광섬유 케이블을 통해 여기광(2916)을 수용한다.
도 30에 도시한 바와 같이, 광원(2906)은 여기광(2916)으로 샘플(2910)을 여기시킨다. 여기광(2916)은 샘플(2910)로부터 분광 방출(2918)을 야기한다. 분광 방출(2918)은 방출 필터(3002)를 통해 여과된다. 방출 필터(3002)는 CCD 카메라(3000)에 의해 수용되거나 모니터되지 않는 분광 방출(2918)의 파장을 여과한다. CCD 카메라(3000)는 모든 샘플(2910)으로부터 여과된 분광 방출(2918)을 동시에 수용한다. 이해의 간단성 및 용이성을 위해, 샘플(2910)의 한 개의 열을 이룬 분광 방출만을 도 30에 도시하였다. CCD 카메라(3000)는 전선부(2902)에 의해 컴퓨터(2914)에 연통되고 작동적으로 연결되어 있다.
이제 도 31과 관련하여, 분석 장치(2900)의 일 양태를 보다 상세히 제시한다. 도 31에 도시된 바와 같이, 다수의 장치 부품들이 바닥판(3100)에 부착되어 있다. 열 전도성 블록 관련 이동 수단(3128)은 열 전도성 블록(2912)을 방향(3150 및 3152)으로 이동시키는 데에 사용된다. 열 전도성 블록 관련 이동 수단(3128)은 서보 제어기(3144)에 연통되고 작동적으로 연결되어 있다. 서보 제어기(3144)에 의한 열 전도성 블록 관련 이동 수단(3128)의 활성화에 의해 열 전도성 불록(2912)은 방향(3150 및 3152)으로 이동한다. 서보 제어기(3144)는 컴퓨터 제어기(3142)에 의해 제어된다. 한편, 컴퓨터(2914)를 사용하여 서보 제어기(3144)를 제어할 수 있다.
센서는 센서 전기자(3120)에 제거가능하게 부착되어 있다. 센서의 예로는 광섬유 프로브(3122)가 있다. 광섬유 프로브(3122)는 수용 여기광(2916)을 샘플(2910)로 투과할 수 있는 광섬유 케이블 및 샘플(2910)에서 방출된 분광 방출(2918)을 수용할 수 있는 광섬유 케이블을 구비한다. 전자기 복사선은 여기광 입력 광섬유 케이블(3108)에 의해 여기 광원(2906)으로부터 광섬유 프로브(3122)로 투과된다. 본 발명의 일 양태에서는, 광증폭관(2904)를 구비하는 분광 수용 수단을 사용하여 샘플(2910)로부터 분광 방출을 검출한다. 이 양태에서, 전자기 복사는 광섬유 케이블(3110)에 의해 광섬유 프로브(3122)로부터 광증폭관(2904)으로 투과된다. 본 발명의 또 다른 양태에서는, CCD 카메라(3002)를 사용하여 샘플(2910)로부터 분광 방출을 검출한다. 이 양태에서, 광섬유 케이블(3110)은 불필요하다.
온도 센서(3124)는 센서 전기자(3120)에 제거가능하게 부착된다. 온도 센서(3124)는 온도 제어기(3162)에 연통되고 작동적으로 연결되어 있다. 온도 센서(3124)는 열 전도성 블록(2912)의 온도를 모니터하고 온도 정보를 다시 온도 제어기(3162)로 공급한다. 온도 제어기(3162)는 열전기 연결부(3164)에 의해 열 전도성 블록(2912)에 연결되어 있다. 온도 제어기(3162)의 작용하에, 열 전도성 블록(2912)의 온도는 증가되거나, 감소하거나 또는 일정하게 유지된다. 구체적으로, 열 전도성 블록(2912)의 온도는 예정된 온도 프로필에 따라 온도 제어기(3162)에 의해 변화될 수 있다. 온도 컴퓨터 제어기(3162)는 도 37과 관련하여 후술하는 것과 같은 컴퓨터 시스템을 사용하여 작동시키는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 "온도 프로필"이란 용어는 시간에 따른 온도의 변화를 의미한다. "온도 프로필"이란 용어에는 온도의 연속적인 상방 또는 하방 변화, 선형 및 비선형 변화가 포함된다. 그 용어는 또한 온도의 증가 또는 감소가, 온도가 일정하게 유지되는 기간에 의해 방해되는 동안 온도의 분량적 증가 또는 감소를 특징으로 하는 프로토콜을 비롯한 임의의 단계적 온도 변화 프로토콜을 포함한다. 본 발명의 장치에서, 온도 프로필은 온도 컴퓨터 제어기(3162)를 프로그램함으로써 미리 결정할 수 있다. 예를 들면, 온도 프로필은 조작자에 의해 온도 제어기(3162)의 기억 장치 또는 온도 제어기(3162)로의 입력장치에 저장할 수 있다.
센서 전기자 관련 이동 수단(3130)을 사용하여 방향(3154 및 3156)으로 센서 전기자(3120)를 이동시킨다. 센서 전기자 서보 제어기(3118)는 여기광 필터 하우징(3160)에 고정 연결되어 있다. 센서 전기자 서보 제어기(3118)의 활성화는 방향(3154 및 3156)으로 광섬유 프로브(3122)를 이동시킨다. 어떻게 서보 제어기를 구성하여 열 전도성 블록(2912) 및 센서 전기자(3120)를 이동시키는 지는 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 쉽게 이해될 것이다. 본 발명이 열 전도성 블록(2912) 및 센서 전기자(3120)의 이동을 위해 서보 제어기를 사용하는 것에 국한되지 않으며, 모터와 같은 당해 분야에 공지된 기타 적합한 수단을 사용할 수도 있다.
서보 제어기(3118 및 3144)는 둘다 컴퓨터 제어기(3142)에 연통되고 작동적으로 연결되어 있다. 컴퓨터 제어기(3142)는 방향(3154 및 3156)으로 센서 전기자(3120)의 이동을 제어한다. 또한 컴퓨터 제어기(3142)는 방향(3150 및 3152)으로 열 전도성 블록 관련 이동 수단(3128)의 이동을 제어한다.
본 발명의 분석 장치에서, 여기 광원(2906)을 사용하여 샘플(2910)을 여기시킨다. 여기 광원(2906)은 여기광 필터(3104)에 연통되고 작동적으로 연결되어 있는데, 이 때, 필터는 여기광 필터 하우징(3160)내에 포함되어 있다. 여기광 필터(3104)는 광섬유 프로브(3122)에 의해 샘플(2910)로 전달시키고자 하는 파장(들)을 제외하고는, 여기 광원(2906)으로부터 광의 모든 파장을 여과한다. 여기광 필터 서보 제어기(3106)는 여기광 필터(3104)의 구경을 제어한다. 여기 광원(2906) 및 여기광 필터 서보 제어기(3106)는 여기광 컴퓨터 제어기(3102)에 연통되고 작동적으로 연결되어 있다. 컴퓨터 제어기(3102)는 여기광 필터 서보 제어기(3106)의 제어에 의해 샘플(2910)로 투과되는 여기광 파장을 제어한다. 여기광(2916)은 여기광 입력 광섬유 케이블(3108)을 통해 광섬유 프로브(3122)로 투과되어 샘플(2912)로 투과된다.
샘플(2910)로부터 유래한 분광 방출(2918)은 광섬유 프로브(3122)에 의해 수용되고, 출력 광섬유 케이블(3110)에 의해 분광 방출 필터(3114)로 투과된다. 분광 방출 필터(3114)는 분광 방출 필터 하우징(3166)내에 포함되어 있다. 분광 방출 필터 하우징(3166)은 광증폭관 하우징(3168)상에 배치되어 있다. 광증폭관 하우징(3168)은 광증폭관(2904)를 포함한다. 분광 방출 서보 제어기(3112)는 분광 방출 필터(3114)의 구경을 제어함으로써, 광증폭관(2904)으로 투과되는 분광 방출(2918)의 파장을 제어한다. 분광 방출 서보 제어기(3112)는 컴퓨터 제어기(3170)에 의해 제어된다.
샘플(2910)에서 유래한 분광 방출(2918)은 광증폭관(2904)로부터 투과된다. 전기 출력(3140)은 광증폭관(2904)을 전선부(2902)에 연결한다. 전선부(2902)는 전기 출력(3140)을 컴퓨터(2914)에 연결시킨다. 적합한 소프트웨어에 의해 구동되는 컴퓨터(2914)는 샘플(2910)로부터 분광 방출 신호를 처리한다. 소프트웨어의 예는 샘플(2910)으로부터 수득된 형광 데이터를 자동적으로 분석하는 그래프 인터페이스이다. 그러한 소프트웨어는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 사이토플루오르(CytoFluorTM) II 형광 다중웰 평판 판독기(매사츄세츠주 프라밍햄 소재의 퍼셉티브 바이오시스템스)는 사이토캘크(CytocalcTM) 데이터 분석 시스템을 이용한다. 기타 적합한 소프트웨어로는 마이크로소프트 엑셀 또는 임의의 필적하는 소프트웨어를 들 수 있다.
도 32A 내지 32C는 본 발명의 분석 장치에 대한 열전기단 또는 열 전도성 블록의 일 양태를 예시한 것이다. 도 32A는 열 전도성 블록(2912) 및 열 전도성 와이어(3206)의 측면도이다. 도 32B는 열 전도성 블록(2912) 및 열 전도성 와이어(3206)의 평면도이다. 열 전도성 와이어(3206)는 열 전도성 블록(2912)의 온도를 조정하는 온도 조정 부재이다. 당해 분야에 널리 공지된 수단에 의해, 온도 제어기(3162)는 열 전도성 와이어(3206)의 온도의 증가 또는 감소를 일으켜 열 전도성 블록(2912)의 온도를 변화시킨다. 예를 들면, 온도 제어기로는 전기 에너지를 열 에너지로 전환시키는 저항 장치가 있다. 한편, 가열 부재는 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제5,255,976호에 개시된 것과 같은 순환수 시스템을 사용할 수 있다. 또 하나의 대안적 양태에서, 온도 조정 부재는 열 전도성 블록(2912)이 배치된 열 전도성 표면일 수 있다. 구체적으로, 열 전도성 와이어(3206)의 온도는 예정된 온도 프로필에 따라 온도 제어기(3162)에 의해 변화될 수 있다. 온도 제어기(3162)는 도 37과 관련하여 후술하는 것과 같은 컴퓨터 시스템을 사용하여 작동시키는 것이 바람직하다. 한편, 컴퓨터(2914)를 사용하여 온도 제어기(3162)를 작동시킬 수 있다. 온도 제어기(3162) 및 열 전도성 블록(2912)에 대한 예시적인 특성 세트는 다음과 같다:
해상도 0.1℃
정확도 +0.5℃
안정성 0.1℃
반복성 0.1℃
온도 제어기(3162)는 도 36A 및 36B와 관련하여 하기에 논의되는 온도 프로필에 따라 온도를 변화시킨다.
열 전도성 블록(2912)의 온도는 열 전도성 블록을 가로질러 균일한 온도가 유지되도록 제어될 수 있다. 한편, 열 전도성 블록(2921)의 온도는 온도 구배가 열 전도성 블록의 한쪽 단부에서 다른 쪽 단부로 형성되도록 제어될 수 있다. 그러한 기술은 본원에 그 내용 전체를 참고로 인용한 미국 특허 제5,255,976호 및 제5,525,300호에 개시되어 있다.
열 전도성 블록(2912)은 분석할 샘플(2910)에 대한 다수의 웰(2920)을 가지도록 구성하는 것이 바람직하다. 일 양태에서, 각각의 웰(2920)은 다수의 샘플(2910)중 하나를 함유하는 용기를 수용하도록 구성된다. 한편, 열 전도성 블록(2912)은 다수의 샘플(2910)을 함유하는 용기를 수용하도록 구성된다. 다수의 샘플(2910)을 함유하는 용기의 예가 미량역가 평판이다.
또 하나의 양태에서는, 열 전도성 블록(2912)이 하나 이상의 샘플(2910)을 함유하는 용기를 수용하도록 구성되는 열 전도성 어댑터를 수용하도록 구성된다. 열 전도성 어댑터는 열 전도성 블록(2912)에 배치되고, 샘플(2910)을 함유하는 용기는 열 전도성 어댑터에 들어맞는다. 도 32C-E는 열 전도성 어댑터의 3개의 예시적 형태를 도시한 것이다. 어댑터(3200)는 바닥이 둥근 웰을 가지도록 구성되어 있다. 어댑터(3202)는 바닥이 사각형인 웰을 가지도록 구성되어 있다. 어탭터(3204)는 V자형의 웰을 가지도록 구성되어 있다. 예를 들면, 어댑터(3200)는 바닥이 둥근 다수의 용기를 수용할 수 있는데, 그 용기는 각각 하나의 샘플을 함유하는 것이다. 유사하게, 어댑터(3202)는 바닥이 사각형인 다수의 용기를 수용할 수 있으며, 어댑터(3204)는 바닥이 V자형인 용기를 포함할 수 있다. 어댑터(3200, 3202 및 3204)는 또한 바닥이 둥근 다수의 용기에 대한 캐리어를 수용할 수 있다. 캐리어의 예는 다수의 웰을 가진 미량역가 평판인데, 각 웰은 하나의 샘플을 함유하는 것이다. 열 전도성 블록(2912)이 가열되는 경우, 열 전도성 어댑터(3200, 3202 또는 3204)도 역시 가열된다. 따라서, 어댑터(3200, 3202 또는 3204)내에 들어맞는 용기에 포함된 샘플들 역시 가열된다. 어댑터(3200, 3202 및 3204)는 표준 미량역가 평판 기하구조를 수용할 수 있다.
본 발명의 분석 장치의 또 다른 양태는 도 33에 도시한다. 이 양태에서는, 다수의 열 전도성 블록(2912)이 회전식 단 또는 카루젤(carousel)(3306)상에 장착된다. 한편, 단은 병진 운동식 단일 수 있다. 단 또는 카루젤(3306)은 열 전도성 블록(2912)를 구성하고 있는 재료와 같은 열 전도성 재료로 구성될 수 있다. 6개의 열 전도성 블록이 도 33에 도시되어 있지만, 이 숫자는 예시적인 것이며, 열 전도성 블록의 개수는 임의대로 사용할 수 있음을 이해하여야 한다. 도 33에 도시된 바와 같이, 축(3308)은 바닥판(3100)에 회전가능하게 연결되어 있다. 회전식 단(3306)은 축(3308) 둘레로 회전하도록 축 방향으로 장착되어 있다. 축(3308)의 회전은 서보 제어기(3312)에 의해 제어된다. 서보 제어기(3312)는 당해 분야에 널리 공지된 방법으로 컴퓨터 제어기(3314)에 의해 제어된다. 컴퓨터 제어기(3314)는 서보 제어기(3312)가 축(3308)을 회전시키도록 하여 회전식 단(3306)을 회전시킨다. 이러한 방법으로, 열 전도성 블록(291)은 광섬유 프로브(3122)하에 순차적으로 배치된다.
다수의 열 전도성 블록(2912)의 각각은 온도 제어기(3162)에 의해 독립적으로 제어될 수 있다. 따라서, 제1 열 전도성 블록(2912)의 온도는 제2 열 전도성 블록(2912)의 온도보다 더 높거나 낮을 수 있다. 유사하게, 제3 열 전도성 블록(2912)의 온도는 제1 또는 제2 열 전도성 블록(2912)의 온도보다 더 높거나 낮을 수 있다.
도 31에 대해 상기한 것과 유사한 방법으로, 관련 이동 수단(3130)을 사용하여 방향(3150 및 3152)로 센서 전기자(3120)을 이동시켜 광섬유 프로브(3122)가 샘플(2910)에서 유래한 분광 방출을 검출할 수 있도록 이동될 수 있게 한다. 제2 센서 전기자 관련 이동 수단(3316)을 사용하여 센서 전기자(3120)를 방향(3154 및 3156)으로 이동시킨다.
열 전도성 블록(2912)의 온도는 온도 제어기(3162)에 의해 제어된다. 온도 제어기(3162)는 열 전도성 블록(2912)로의 연결부(3164)에 의해 회전식 단(3306)에 연결되어 있다. 온도 제어기(3162)의 작용하에, 열 전도성 블록(2912)의 온도는 증가되거나 감소될 수 있다. 한편, 온도 제어기(3162)는 회전식 단(3306)의 온도를 조정하도록 구성될 수 있다. 그러한 형태에서, 회전식 단(3306)이 가열될 경우, 열 전도성 블록(2912) 역시 가열된다. 한편, 열 전도성 블록(2912)의 각각의 온도는 상기한 바와 같은 순환수 시스템에 의해 제어될 수 있다.
도 31에 예시한 것과 유사한 방법으로, 여기 광원(2906)을 사용하여 샘플(2910)을 여기시킨다. 여기 광원(2906)은 여기광 필터(3104)에 연통되고 작동적으로 연결되어 있는데, 이 필터는 여기광 필터 하우징(3160)내에 포함되어 있다. 여기광 필터(3104)는 광섬유 프로브(3122)에 의해 샘플(2910)로 전달시키고자 하는 파장(들)을 제외하고는, 여기 광원(2906)으로부터 광의 모든 파장을 여과한다. 여기광 필터 서보 제어기(3106)는 여기광 필터(3104)의 구경을 제어한다. 여기 광원(2906) 및 여기광 필터 서보 제어기(3106)는 여기광 컴퓨터 제어기(3102)에 연통되고 작동적으로 연결되어 있다. 컴퓨터 제어기(3102)는 여기광 필터 서보 제어기(3106)의 제어에 의해 샘플(2910)로 투과되는 여기광 파장을 제어한다. 여기광(2916)은 여기광 입력 광섬유 케이블(3108)을 통해 광섬유 프로브(3122)로 투과되어 샘플(2912)로 투과된다.
샘플(2910)로부터 유래한 분광 방출(2918)은 광섬유 프로브(3122)에 의해 수용되고, 광섬유 케이블(3110)에 의해 분광 방출 필터(3114)로 투과된다. 분광 방출 서보 제어기(3112)는 분광 방출 필터(3114)의 구경을 제어하며, 따라서, 광증폭관(2904)으로 투과되는 분광 방출의 파장을 제어한다. 도 31에 대해 설명한 것과 유사한 방법으로, 분광 방출 서보 제어기(3112)는 컴퓨터 제어기(3170)에 의해 제어된다.
본 발명의 분석 장치는 샘플(2910)으로부터 분광 방출을 한 번에 하나의 샘플 또는 부분 세트의 샘플(2910)로부터 동시에 검출할 수 있다. 본원에 사용된 "부분 세트의 샘플"이란 용어는 2개 이상의 샘플(2910)을 의미한다. 광증폭관(2904)을 포함하는 본 발명의 분석 장치의 일 양태에서 부분 세트의 샘플로부터 동시에 분광 방출을 검출하기 위해서는, 다수의 여기광 필터(3104), 여기광 입력 광섬유 케이블(3108), 방출광 출력 광섬유 케이블(3110) 및 방출광 필터(3114)를 사용하여야 한다.
분광 방출 신호는 광증폭관(2904)로부터 컴퓨터(2914)로 투과된다. 광증폭관(2904)은 전선부(2902)에 의해 컴퓨터(2914)에 연통되고 작용적으로 연결되어 있다. 전선부(2902)는 전기 출력(3140)을 통해 광증폭관(2904)에 연결되어 있다. 컴퓨터(2914)는 온도의 함수로서 분광 방출을 분석하는 데이터 분석 수단으로서 기능한다.
도 34는 장치를 덮는 하우징(3400)을 가진 도 33에 도시한 분석 장치의 평면도를 예시한 것이다. 도어(3402)는 샘플(2910)을 나타내도록 열린다. 도어(3402)는 열린 채로 흔들리는 힌지 도어일 수 있다. 한편, 도어(3402)는 열린 채로 미끄러지는 슬라이딩 도어일 수 있다. 도 33 및 34에 도시한 분석 장치의 측면도는 도 35에 예시되어 있다. 커버(3400)는 바닥판(3100)의 상부에 배치된다. 커버(3400)은 임의의 적합한 재료로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 커버(3400)은 플렉시글래스, 유리섬유 또는 금속으로 이루어질 수 있다.
도 36A 및 36B는 온도 프로필 및 본 발명의 분석 장치를 사용하여 온도 프로필을 실시하는 방법을 예시한 것이다. 도 36A는 시간의 함수로서 열 전도성 블록(2912)의 온도를 나타내는 온도 프로필(3600)을 예시한 것이다. 열 전도성 블록(2912) 및 샘플(2910)은 온도 프로필(3600)에 따라 연속적인 방식으로 가열된다. 한편, 회전식 단(3306)은 열 전도성 블록(2912)을 따라 가열될 수 있다. 온도 프로필(3600)은 선형이고 온도 범위가 약 25℃ 내지 약 110℃인 것이 바람직하다.
한편, 온도 프로필(3600)은 온도의 계단식 증가를 특징으로 할 수 있는데, 즉 열 전도성 블록(2912) 및 샘플(2910)은 예정된 온도로 가열되고, 예정된 시간 동안 그 온도로 유지된 다음, 보다 높은 예정된 온도로 가열된다. 예를 들면, 온도는 분당 0.5℃ 내지 20℃가 증가할 수 있다. 온도 범위가 약 25℃ 내지 약 110℃인 것으로 개시되지만, 주어진 표적 분자, 예를 들면 단백질이 열 변성 곡선을 산출하도록 가열되는 온도 범위는 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 쉽게 측정될 수 있음을 이해하여야 한다. 온도 프로필(3600)이 수행되는 시간 길이는 얼마나 많은 샘플을 분석하는냐 여부 및 분광 방출(2918)을 수용하는 센서가 얼마나 빨리 샘플(2910)로부터 분광 방출(2918)을 검출할 수 있는가의 여부에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 6개의 열 전도성 블록(2912)의 각각이 총 96개 샘플(2910)을 가지며(총 576개의 샘플), 단일의 광섬유 프로브를 가진 형광 판독기를 사용하여 샘플을 검색하며, 온도 프로필이 38℃ 내지 76℃인 실험은 도 33에 도시된 장치를 사용하여 실시하는 데 약 38분이 걸린다.
온도 프로필(3600)에 따라 가열하는 동안, 제1 열 전도성 블록(2912)의 각 샘플(2910)에서 유래한 분광 방출(2918)은 광섬유 프로브(3122)를 통해 수용된다. 도 36B에 예시한 바와 같이, 제1 열 전도성 블록(2912)중의 모든 샘플(2910)로부터의 방출이 수용된 후, 단(3306)은 회전하여 광섬유 프로브(3122) 아래의 다음 열 전도성 블록(2912)을 이동시키고, 샘플(2910)에서 유래한 분광 방출(2918)은 광섬유 프로브(3122)에 의해 수용된다. 이 과정을 모든 열 전도성 블록(2912)내 모든 샘플로부터 분광 방출의 수용이 완료될 때까지 계속한다. 각각의 열 전도성 블록(2912)상의 샘플(2910)에서 유래한 분광 방출은 한 번에 하나씩, 부분 세트의 샘플로부터 동시에, 하나의 샘플열로부터 한 번에 동시에, 또는 모든 샘플을 한 번에 수용할 수 있다.
바람직한 양태의 컴퓨터 프로그램의 실행
본 발명은 하드웨어, 소프트웨어 또는 그 조합을 사용하여 실행할 수 있고, 컴퓨터 시스템 또는 다른 처리 시스템에서 실행할 수도 있다. 본 발명의 하나의 양태의 실행에 대한 흐름도(3800)는 도 38에 도시되어 있다. 흐름도(3800)는 출발 단계(3802)로 시작된다. 단계(3804)에서, 온도 프로필(3600)을 개시한다. 예를 들면, 온도 제어기(3162)는 열 전도성 블록(2912)의 온도가 증가하게 한다. 단계(3806)에서, 광섬유 프로브(3122) 또는 CCD 카메라(3000)와 같은 센서가 샘플(2910), 샘플열(2910) 또는 모든 샘플(2910) 위로 이동된다. 단계(3808)에서, 여기광은 여기광원(2906)을 사용하여 샘플(2910)로 투과된다. 단계(3810)에서, 분광 방출은 샘플(2910)로부터 센서에 의해 수용된다. 결정 단계(3812)에서, 분광 방출(2918)이 하나의 열 전도성 블록(2912)에서 모든 샘플, 샘플열로부터 수용되었는지 여부를 결정한다. 분광 방출(2918)이 샘플 또는 샘플열의 모두로부터 수용되지 않았다면, 센서는 단계(3814)에서 다음 샘플 또는 샘플열 위로 이동된다. 처리는 단계(3808)에서 계속되어 여기광(2916)을 투과한다. 그후, 처리는 단계(3810)으로 계속되어 샘플(2910)으로부터 분광 방출(2918)을 수용한다.
분광 방출(2918)이 샘플 또는 샘플열의 모두로부터 수용되었다면, 처리는 결정 단계(3816)으로 계속된다. 결정 단계(3816)에서, 분광 방출(2918)이 모든 열 전도성 블록에서 샘플로부터 수용되었는지 여부를 측정한다. 그렇지 않다면, 회전식 단(3306)을 단계(3818)에서 회전시켜 다음 열 전도성 블록(2912) 및 샘플(2910)을 센서 아래에 포함되도록 위치시킨다. 분광 방출(2918)이 모든 열 전도성 블록(2912)에서 모든 샘플로부터 수용될 때까지 단계(3806) 내지 단계(3818)이 따른다. 그 후, 단계(3820)로 처리를 계속하며, 이 때, 온도 프로필(3600)이 완료되며, 처리는 단계(3822)에서 종결된다.
본 발명의 또 하나의 양태의 실행에 대한 흐름도(3900)은 도 39에 도시되어 있다. 이 양태에서는, CCD 카메라(3000)와 같은 열 전도성 블록(2912)상의 모든 샘플(2910)로부터 분광 방출(2918)을 동시에 수용하는 센서를 열 전도성 블록(2912)위로 배치한다. 흐름도(3900)는 출발 단계(3902)로 개시된다. 단계(3904)에서, 온도 프로필(3600)을 개시한다. 예를 들면, 온도 제어기(3162)는 열 전도성 블록(2912)의 온도가 증가하게 한다. 단계(3906)에서, 여기광은 여기 광원(2906)을 사용하여 샘플(2910)로 투과된다. 단계(3908)에서, 분광 방출은 샘플(2910)로부터 CCD 카메라(3000)에 의해 수용된다. 결정 단계(3910)에서, 분광 방출(2918)이 모든 열 전도성 블록(2912)으로부터 수용되었는지 여부를 결정한다. 분광 방출(2918)이 수용되지 않았다면, 회전식 단(3306)을 단계(3912)에서 회전시켜 다음 열 전도성 블록(2912) 및 샘플(2910)을 CCD 카메라(3000) 아래에 포함되도록 위치시킨다. 분광 방출(2918)이 모든 열 전도성 블록(2912)에서 샘플(2910)로부터 수용될 때까지 단계(3906) 내지 단계(3912)가 따른다. 그 후, 단계(3914)로 처리를 계속한다. 단계(3914)에서 온도 프로필(3600)이 완료되며, 처리는 단계(3916)에서 종결된다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 하드웨어, 소프트웨어 또는 그 조합을 사용하여 실행할 수 있고, 컴퓨터 시스템 또는 기타 처리 시스템에서 실행할 수 있다. 컴퓨터 시스템(3702)의 예는 도 37에 도시되어 있다. 컴퓨터 제어기(3102, 3142, 3162, 3170 또는 3314)는 컴퓨터 시스템(3702)과 같은 하나 이상의 컴퓨터 시스템을 사용하여 실행할 수 있다.
이 설명을 읽고 난 후에, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에거는 기타 컴퓨터 시스템 및/또는 컴퓨터 구조를 사용하여 본 발명을 실행하는 방법은 자명할 것이다. 컴퓨터 시스템(3702)은 처리기(3704)와 같은 하나 이상의 처리기를 포함한다. 처리기(3704)는 연결 버스(3706)에 연결되어 있다.
컴퓨터 시스템(3702)은 또한 주기억 장치(3708), 바람직하게는 랜덤 액세스 메모리(RAM)을 구비하고, 제2 기억장치(3710)를 구비하기도 한다. 제2 기억장치(3710)는 예를 들면, 하드 디스크 드라이브(3712) 및/또는 제거용이한 저장 드라이브(3714)(플로피 디스크 드라이브, 자기 테이프 드라이브, 광학 디스크 드라이브 등)을 포함할 수 있다. 제거용이한 저장 드라이브(3714)는 널리 공지된 방법으로 제거용이한 저장 유니트(3716)로부터 판독 및/또는 작성한다. 제거용이한 저장 유니트(3716)은 플포피 디스크, 자기 테이프, 광학 디스크 등을 나타내는데, 이것은 제거용이한 저장 드라이브(3714)에 의해 판독 및 작성된다. 이해할 수 있는 바와 같이, 제거용이한 저장 유니트(3716)는 컴퓨터 소프트웨어 및/또는 데이터가 내장된 컴퓨터용 저장 매체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 제2 기억장치(3710)은 컴퓨터 프로그램 또는 기타 지시가 컴퓨터 시스템(3702)으로 로딩되도록 하는 기타 유사한 수단을 구비할 수 있다. 그러한 수단의 예로는 제거용이한 저장 유니트(3718) 및 인터페이스(3720)이 있다. 그 예로는 프로그램 카트리지 및 카트리지 인터페이스(예; 비디오 게임 장치에서 확인되는 것), 제거용이한 메모리 칩(예; EPROM 또는 PROM) 및 관련 소켓, 및 소프트웨어 및 데이터가 제거용이한 저장 유니트(3718)로부터 컴퓨터 시스템(3702)으로 전달되게 하는 기타 제거용이한 저장 유니트(3718) 및 인터페이스(3720)가 있다.
컴퓨터 시스템(3702)은 또한 통신 인터페이스(3722)을 구비할 수도 있다. 통신 인터페이스(3722)는 소프트웨어 및 데이터가 컴퓨터 시스템(3702)과 외부 장치 사이에 전달되도록 한다. 통신 인터페이스(3722)의 예로는 모뎀, 네트워크 인터페이스(예; 에테르넷 카드), 통신 포트, PCMCIA 슬롯 및 카드 등이 있을 수 있다. 통신 인터페이스(3722)를 통해 전달되는 소프트웨어 및 데이터는 통신 인터페이스(3722)에 의해 수용될 수 있는 전기 신호, 전자기 신호, 광학 신호 또는 기타 신호일 수 있는 신호들(3724)의 형태이다. 이들 신호(3724)는 채널(3726)을 통해 통신 인터페이스로 제공딘다. 이 채널(3726)은 신호(3724)를 수송하고 와이어 또는 케이블, 광섬유, 전화선, 셀룰라 폰 링크, RF 링크 및 기타 통신 채널을 사용하여 실행할 수 있다. 본 발명의 분석 장치에서, 채널(3726)의 일례는 분광 방출(2918)을 컴퓨터(2914)로 수송하는 전선부(2902)이다.
본 명세서에서, "컴퓨터 프로그램 매체" 및 "컴퓨터용 매체"란 용어는 제거용이한 저장 장치(3716 및 3718), 하드 디스크 드라이브(3712)에 설치된 하드 디스크 및 신호(3724)와 같은 매체를 일반적으로 언급하기 위해 사용한다. 이들 컴퓨터 프로그램 제품은 소프트웨어를 컴퓨터 시스템(3702)으로 제공하는 수단이다.
컴퓨터 프로그램(컴퓨터 제어 로직으로도 지칭됨)은 주기억 장치(3708) 및/또는 제2 기억장치(3710)에 저장된다. 컴퓨터 프로그램은 또한 통신 인터페이스(3722)를 통해 수용될 수 있다. 그러한 컴퓨터 프로그램은 실행될 경우 컴퓨터 시스템(3702)이 본원에서 논의된 본 발명의 특징을 실행하게 할 수 있다. 구체적으로, 컴퓨터 프로그램은 실행될 경우 처리기(3704)를 본 발명의 특징을 실행할 수 있게 한다. 따라서, 그러한 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 시스템(3702)의 제어기를 나타낸다.
본 발명이 소프트웨어를 사용하여 실행되는 일 양태에서, 소프트웨어는 제거용이한 저장 드라이브(3714), 하드 드라이브(3712) 또는 통신 인터페이스(3722)를 사용하여 컴퓨터 프로그램 제품에 저장하고 컴퓨터 시스템(3702)으로 로딩할 수 있다. 제어 로직(소프트웨어)은 처리기(3704)에 의해 실행될 경우, 처리기(3704)가 본원에 기술한 발명의 기능을 실행하게 한다.
또 하나의 양태에서, 본 발명은 응용 주문형 집적회로(ASIC)와 같은 하드웨어 부품을 사용하여 하드웨어에서 주로 실행된다. 본원에 기술한 기능을 실행하기 위한 하드웨어 상태의 기계의 실행은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 사항이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 사용하여 실행한다.
본 발명의 분석 장치는 본 발명의 방법을 실행하기에 특히 적합하다. 본 발명의 방법 및 장치를 사용하여 미량이식판 열 이동 분석을 수행하기 위해서는, 샘플을 열 전도성 블록에 배치하고, 예정된 온도 프로필에 따라 가열하고, 광의 여기 파장으로 자극하고, 샘플이 예정된 온도 프로필에 따라 가열되는 동안 샘플로부터의 분광 방출을 검출한다.
본 발명의 분석 장치가 본 발명의 방법과 사용하는 것에, 또는 생물학적 중합체, 단백질 또는 핵산에 대한 분석을 수행하는 것에 국한되지 않음은 이해할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 분석 장치는 샘플을 예정된 온도로 항온처리하는 데에 사용할 수 있다. 한편, 본 발명의 분석 장치를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응, 임의의 목적의 열 순환 단계, 약제와 같은 화합물의 열 안정성의 분석을 실시하거나, 화합물을 안정화하는 조건을 결정하거나, 또는 화합물의 결정화를 촉진하는 조건을 결정할 수 있다.
지금까지 본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 단지 예시 목적으로만 제시되고, 특별한 언급이 없으면 그에 국한되지 않는 하기의 구체적인 실시예를 참조하면 보다 용이하게 본 발명을 이해할 수 있다.
본 발명은 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자를 안정화하기 위한 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하기 위한 다변수 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 분자를 각각의 다수 용기에 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상과 접촉시키는 단계, 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, 각 용기에서 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, 각각의 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 기준 세트의 생화학적 조건하에서 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 각각의 열 변성 곡선에 따라 다수의 상이한 분자 또는 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명은 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자의 보관 수명을 최적화하기 위한 다변수 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 분자를 각각의 다수 용기에 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상과 접촉시키는 단계, 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, 각 용기에서 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, 각각의 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 기준 세트의 생화학적 조건하에서 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 각각의 열 변성 곡선에 따라 다수의 상이한 분자 또는 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자에 대한 다수의 상이한 분자의 2종 이상의 조합의 친화도를 평가하기 위한 다변수 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 분자를 각각의 다수 용기에 다수의 상이한 분자중 2개 이상의 조합물과 접촉시키는 단계, 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, 각 용기에서 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, 각각의 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 2개 이상의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에서의 표적 분자에 대한 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 다수의 상이한 분자중 2개 이상의 조합물에 대한 친화도를 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명은 변성된 단백질의 리폴딩을 촉진하는 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하기 위한 다변수 방법을 제공한다. 이 방법은 다수의 조건중 1종 이상에 따라 미리 리폴딩된 단백질 샘플중 하나를 각각의 다수 용기에 배치하는 단계, 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, 각 용기에서 가열로부터 초래되는 단백질의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, 각각의 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 기준 세트의 생화학적 조건하에서 천연 단백질에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 각각의 열 변성 곡선의 물리적 변화의 크기의 변화에 따라 다수의 상이한 리폴딩 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명은 변성된 단백질 샘플의 리폴딩을 촉진하는 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하기 위한 다변수 방법도 제공한다. 이 방법은 단백질 안정성을 촉진하는 다수의 상이한 조건중 1종 이상의 조합을 결정하는 단계, 단백질 안정화를 촉진하는 것으로 동정된 생화학적 조건의 1종 이상의 조합하에 변성된 단백질을 폴딩시키는 단계, 폴딩된 단백질의 수득률을 평가하는 단계, 폴딩된 단백질의 수득률에 따라 상기 다수의 상이한 리폴딩 조건의 효능을 평가하는 단계, 및 최적의 단백질 폴딩을 촉진하는 생화학적 조건의 조합이 동정될 때까지 상기 단계들을 반복하는 단계를 포함한다.
미량이식판 열 이동 분석법을 사용하여 단백질 안정화에 부가적인 효과를 갖는 1종 이상의 생화학적 조건을 결정할 수 있다. 단백질 안정화의 증가를 촉진하는 한 세트의 생화학적 조건이 열 이동 분석을 사용하여 동정되면, 동일한 세트의 조건을 재조합 단백질과의 단백질 폴딩 실험에 사용할 수 있다. 열 이동 분석에서의 단백질 안정화를 촉진하는 조건이 재조합 단백질의 폴딩을 촉진하는 조건과 상호 관련되어 있다면, 단백질 안정성을 더욱 증가시키는 안정화 조건의 조합이 동정될 때까지 추가의 열 이동 분석을 실시함으로써 조건을 추가로 최적화할 수 있다. 재조합 단백질은 그러한 조건하에 폴딩된다. 이 과정을 최적의 폴딩 조건이 동정될 때까지 반복한다.
본 발명은 또한 열 변화로 인해 변성될 수 있는 단백질의 결정화를 촉진하는 다수의 상이한 생화학적 조건중의 1종 이상의 효능을 평가하기 위한 다변수 방법을 제공한다. 이 방법은 단백질을 각각의 다수 용기에서 다수의 상이한 생화학적 조건중의 1종 이상과 접촉시키는 단계, 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, 각 용기에서 가열로부터 초래되는 단백질의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 용기에 대해 온도의 함수로서 단백질에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, 각각의 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 기준 세트의 생화학적 조건을 사용하여 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 다수의 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자에 대한 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하기 위한 다변수 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 분자를 각각의 다수 용기에서 다수의 상이한 분자중 하나의 분자와 접촉시키는 단계, 그 용기들을 동시에 가열하는 단계, 각 용기에서 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 용기에서 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, 각각의 변성 곡선을 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에서 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 각 분자의 친화도를 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자에 결합하는 분자에 대한 다수의 상이한 분자의 푸울 또는 집합체의 분석 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 분자를 각각의 다수 용기에서 다수의 상이한 분자중 2개 이상의 집합체와 접촉시키는 단계, 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, 각 용기에서 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, 각각의 열 변성 곡선을 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에서 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 상이한 분자의 집합체의 친화도를 평가하는 단계, 표적 분자에 대한 친화도를 가진 분자를 함유하는 상이한 분자들의 집합체를 선별하는 단계, 선별된 집합체를 각각의 다수 용기에서 분자들의 보다 적은 집합체로 분할하는 단계, 및 다수의 분자에서 본래의 열 이동을 담당하는 단일의 분자가 동정될 때까지 상기 단계들을 반복하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 다수의 화합물을 합성하는 단계 및 각 화합물이 수용체 분자에 결합하는 능력을 시험하는 단계를 포함하는 주도 화합물의 개량된 생성 방법을 제공한다. 이 개량 방법은 수용체 분자를 미량이식판내 각각의 다수 웰에서 다수의 상이한 화합물중 하나의 화합물과 접촉시키는 단계, 그 웰들을 동시에 가열하는 단계, 각 웰에서 가열로부터 초래되는 수용체 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, 각 웰에서 온도의 함수로서 수용체 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, 각각의 열 변성 곡선을 다수의 상이한 화합물중 임의의 화합물의 부재하에서 수용체 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 각 화합물의 친화도를 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 가열로 인해 변성될 수 있는 표적 분자를 내부에 각각 함유하는 다수의 용기를 가진 캐리어 및 그 내부에 다수의 용기중 하나의 상이한 용기에 각각 존재하는 다수의 상이한 분자로부터 선택되며 조합 라이브러리에 존재하는 1종 이상의 분자를 포함하는 제품을 제공한다.
단백질 안정성, 리간드 결합, 단백질 폴딩 및 단백질 결정화의 최적화는 다변수의 현상이다. 다변수의 최적화 문제는 변수들이 양호한 반응에 영향을 미치는 지를 측정하기 위하여 가능한 한 많은 데이터를 수집하기 위한 다수의 병행 실험을 필요로 한다. 예를 들면, 다변수의 최적화 문제는 변수들이 단백질의 안정화에 영향을 미치는 지를 측정하기 위하여 가능한 한 많은 데이터를 수집하기 위한 다수의 병행 실험을 필요로 한다. 이러한 관점에서, 단백질의 결정화 및 정량적 구조 활성 관계의 분석은 생화학적 또는 화학적 조성물에 증가성 변화의 매트릭스 배열을 이용하는 질량 검색 프로토콜로부터 크게 도움을 받았다. 따라서, 정량적 구조 활성 환계가 주어진 치료용 수용체에 대한 결합 친화도에 미치는 그 효과에 대해 리간드상의 화학 작용기의 변화를 관련시키고자 하는 것과 동일한 방식으로, 본 발명의 방법 및 장치는 상이한 생화학적 조건을 실험적으로 측정된 단백질 안정성, 리간드 특이성, 폴딩된 단백질의 수득률 및 결정화된 단백질의 수득률과 관련시키는 정량적 모델의 구성을 용이하게 한다.
본 발명은 단백질 안정화, 리간드 결합, 단백질 폴딩 및 단백질 결정화와 같은 다변수 현상을 최적화하는 데에 이용되는 종래의 기술을 능가하는 다수의 장점을 제공한다. 이들 장점중 가장 최고의 것은 본 발명이 고처리량의 검색을 용이하게 한다는 것이다. 또한, 본 발명은 조합 라이브러리의 검색에 이용되는 종래의 기술을 능가하는 다수의 장점을 제공한다. 이들 장점중 최고의 것은 본 발명이 주도 화합물에 대한 조합 라이브러리의 고처리량 검색을 용이하게 한다는 것이다. 다수의 현재의 라이브러리 검색 기술은 리간드가 수용체에 결합하는지 여부를 간단히 나타낸다. 이 경우, 정량적인 정보는 제공되지 않는다. 일련의 리간드의 상대적 결합 친화도에 대한 정보는 제공되지 않는다. 대조적으로, 본 발명은 표적 수용체에 대한 그 상대적 친화도에 대해 일련의 화합물의 평가를 용이하게 한다. 입수된 이러한 정보를 사용하여 한 세트의 화합물에 대해 구조-활성 관계를 발생시킬 수 있다. 중점 폴딩해체 온도(Tm)의 리간드-의존성 변화를 사용하여 상대적인 결합 친화도를 평가하는 용이성, 재현성 및 속도로 인해 본 발명은 신약 발견 과정에서 강력한 수단이 된다.
통상적으로, 종래의 역학적 검색 방법은 Ki를 결정하기 위해 억제제의 6가지 상이한 농도에서 6개 이상의 추가의 웰 분석을 필요로 한다. 본 발명을 이용하여, 처리량은 효소계 분석에 비해 6배까지 증가되는데, 그 이유는 하나의 완전한 결합 실험이 다중웰 미량이식판의 각 웰에서 실시될 수 있기 때문이다. 역학적 검색법은 또한 통상 약 1 nM의 단백질 농도에서 발생하는 희석과 신호 검출 사이에서의 통상의 절충에 의해 제한되기도 한다. 이러한 관점에서, 열량계측 방법은 차등 스캐닝 열량계측이든 등온 적정 열량계측이든 이들은 통상 시간당 1회로 단독의 결합 실험으로 제한되기 때문에 훨씬 더 불량한 단점을 가진다. 대조적으로, 본 발명은 단일 웰에서 ~10-4M으로부터 10-15M까지의 측정가능한 결합 친화도의 광범위한 동적 범위를 제공한다.
본 발명은 방사성 표지된 화합물을 필요로 하지 않는다. 또한 수용체가 형광 표지나 발색 표지로 표지될 필요도 없다.
본 발명의 매우 중요한 장점은 표적 약제인 임의의 수용체에 보편적으로 적용될 수 있다는 것이다. 따라서, 새로운 수용체가 시험에 이용될 때마다 새로운 분석법을 발명해야 할 필요는 없는 것이다. 당해 수용체가 효소인 경우에, 연구자는 통상의 역학적 방법을 사용할 수 있는 것보다 더 신속하고 용이하게 일련의 화합물의 친화도의 평가 순위를 결정할 수 있다. 또한, 연구자는 효소에의 리간드 결합을 검출할 수 있는데, 결합이 활성 부위, 알로스테릭 보조인자 결합 부위 또는 수용체 서브유니트 경계중 어디에서 일어나든지 상관없이 검출할 수 있다. 본 발명은 단백질 및 핵산과 같은 비효소 수용체에 동등하게 적용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로는, 다수의 샘플을 동시 가열하기 위한 가열 수단 및 샘플이 가열되는 동안 샘플로부터 분광 방출을 수용하기 위한 수용 수단을 구비한 분석 장치가 제공된다. 본 발명의 또 하나의 양태로는 설정한 온도 프로필에 따라 다수 샘플의 온도를 동시에 조정하는 온도 조정 수단 및 샘플의 온도가 온도 프로필에 다라 조정되는 동안 샘플로부터 분광 방출을 수용하기 위한 수용 수단을 구비한 분석 장치가 제공된다.
또 하나의 양태로, 본 발명은 또한 다수의 열 전도성 블록이 배치된 이동단을 구비한 분석 장치를 제공한다. 열 전도성 블록 및 그 샘플의 온도는 온도 조정 수단에 의해 조정된다. 다수의 열 전도성 블록의 각각은 다수의 샘플을 수용하기에 적합하다. 광원은 샘플에 대한 여기 파장의 광을 방출하는 것이 제공된다. 샘플의 온도가 조정되는 동안, 센서는 광의 여기 파장에 반응하여 샘플로부터 분광 방출을 검출한다. 이동단은 열 전도성 블록 사이를 이동하여 각각의 다수의 열 전도성 블록에서 샘플로부터 분광 방출을 순차적으로 검출한다.
본 발명의 분석 장치는 단백질 안정성에 영향을 미치는 분자 및 생화학적 조건을 신속히 검색할 기회를 제공한다. 샘플은 일정 온도 범위에 걸쳐 동시에 가열된다. 가열중에 분광 방출이 수용된다. 본 발명의 분석 장치는 또한 본 발명의 방법을 편리하고 효과적으로 수행할 기회를 제공한다. 본 발명의 분석 장치는 표적 단백질을 안정화하는 분자 및 생화학적 조건의 열 이동 분석을 수행하기에 특히 적합하다.
본 발명의 장치는 가열 수단 및 분광 방출 수용 수단을 둘다 포함하기 때문에, 본 발명은 하나의 장치에서 샘플을 가열하고 다른 장치로 샘플을 옮겨 분광 방출 판독을 실시할 필요성을 배제한다. 결과적으로, 본 발명의 장치는 온도의 증분 및 중간의 냉각 단계보다는 설정된 온도 프로필에 따라 온도 변화를 용이하게 한다. 따라서, 주어진 샘플에 대해 보다 많은 데이터점들을 모을 수 있고, 보다 정확한 정보를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 분석 장치는 가열 수단 및 분광 방출 수단을 둘다 포함하기 때문에 샘플이 가열되는 동안 샘플로부터 분광 측정을 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 분석 장치를 사용하여, 비가역적 단백질 폴딩해체 및 가역적 단백질 폴딩을 둘다 연구할 수 있다.
본 발명의 추가적인 특징 및 장점은 첨부 도면을 참조하여 하기에서 상세히 기술하고자 한다.
첨부 도면을 참조하여 본 발명을 기술하고자 한다. 도면에서, 유사한 도면부호는 동일하거나 기능적으로 유사한 부재를 나타낸다. 또한, 도면부호의 맨왼쪽 숫자는 도면부호가 처음 나타나는 도면을 지정하는 것이다.
실시예 1
인간 α-트롬빈의 활성 부위에 결합하는 리간드의 평가
컴퓨터 제어 공정 디렉티드디버시티(미국 특허 제5,463,564호 참조)를 사용하여, 3-디멘셔널 파마슈티컬스 인코포레이티드의 과학자들은 인간 α-트롬빈의 활성 부위로 지향되는 화합물의 조합 라이브러리를 생성시켰다. 약 400개의 화합물을 합성하고, 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Arg-p-니트로아닐리드(펜실베니아주 킹 오브 프러시아 소재의 바켐)이 기질로서 사용된 통상의 분광 광도 측정 역학 분석에 의해 분석하였다. 상기 화합물중 다섯 개는 결합 친화도 크기의 거의 4차수의 범위를 갖는 Ki를 특징으로 하는 것으로서, 이들을 사용하여 열 이동 분석의 검출 범위 및 한계를 시험하였다. 이들 다섯 개의 독점적 화합물은 표 3a 및 표 3b에 역학 분석(마지막 칼럼)에 의해 측정되는, 각각의 화합물에 대한 Ki와 함께 제시한다. 이들 화합물에 대한 Ki는 3dp-4026에 대한 7.7nM로부터 3dp-3811에 대한 20.0μM까지의 범위를 가졌다.
엔자임 리서치 랩에서 수득한 인간 α-트롬빈 모액(1.56㎎/㎖)을 먼저 50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl(다른 언급이 없으면, 분석 완충액)로 0.5㎎/㎖(11μM)로 희석하고, 얼음에 보관하였다. 5개의 리간드(질량 분광분석 및 NMR에 의해 특성 분석된 재결정화된 고체)를 정확히 계량하여 1.5㎎ 내지 2.0㎎으로 만들고, 100% DMSO 1.0㎖에 용해시켜 농도가 1.8mM 내지 3.8mM이 되도록 하였다. 그 다음, 바닥이 V자형인 96개 웰의 코스타 미량이식판을 설치하여 11μM 인간 α-트롬빈 용액 100㎕를 웰 A1 내지 A6내로 피펫팅하였다. 그 다음, 3dp-3811 2㎕를 웰 A2내로, 3dp-3959 2㎕를 웰 A3내로, 3dp-4077 2㎕를 웰 A4내로, 3dp-4076 2㎕를 웰 A5내로, 3dp-4026 2㎕를 웰 A6내로, 그리고 100% DMSO 2㎕를 웰 A1내로 첨가하였다. 내용물을 100㎕ 피펫 팁을 사용하여 반복된 흡수 및 방출에 의해 혼합하였다. 최종적으로, 광유 한 방울(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)을 웰의 상부에 첨가하여 고온에서의 샘플의 증발을 감소시켰다. 그 다음, 미량이식판을 25℃로 설정된 로보사이클러 그래디언트 96 온도 사이클러(캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진)의 가열 블록 4에서 1분 동안 위치시켰다. 평판을 스펙트라맥스 250 분광 광도계(30℃)내로 위치시키고, 350㎚에서의 흡광도를 각 샘플에 대해 측정하였다. 이 판독치는 보다 고온에서의 다른 모든 판독치를 비교한 블랭크 또는 기준으로 작용하였다. 분석은 가열 블록 1을 38℃로 설정하고, 온도 사이클러가 가열 블록 1을 이동시키도록 프로그램하고, 미량이식판을 거기에서 3분 동안 유지함으로써 개시하였다. 38℃에서 평형화 이후에, 평판을 30초 동안 25℃ 블록(블록 4)으로 이동시키고, 분광 광도계에 삽입시키고, 흡광도를 350㎚에서 판독하였다. 그 다음, 미량이식판을 온도 사이클러내로 다시 넣고, 가열 블록 2로 이동시켰는데, 이 블록은 40℃에서 사전 평형화한 것이었다. 40℃에서 3분후, 평판을 25℃(블록 4)로 30초 동안 복귀시키고, 350㎚에서의 흡광도 측정을 위해 분광 광도계로 복귀시켰다. 이 과정을 온도가 2℃씩 증가시켜 76℃로 될 때까지 18회 반복하였다. 블랭크 흡광도(25℃에서의 A350)를 공제한 후, 흡광치에 반영된 혼탁도를 온도의 함수로서 플로팅하였다. 이 실험에 대한 열 변성 곡선을 도 1에 도시하였다.
2% DMSO중 11μM의 인간 α-트롬빈만을 함유한 대조군(웰 A1)은 A350의 큰 증가로 반영되는 ~50℃에서 시작하는 열 변성 전이를 진행하는 것으로 확인되었다. 이 전이의 중점은 ~55℃로 관찰되었다. 이 결과는 소의 프로트롬빈 1에 대한 차등 스캐닝 열량계측과 일치하였는데, Tm= 58℃에서 변성 전이를 나타냈다(Lentz, B.R. 등, Biochemistry 33:5460-5468 (1994)). 사험한 억제제 화합물 모두에 대한 열 변성 곡선은 보다 고온에 대한 전이에서 이동을 나타냈다. 3dp-4026은 Tm= ~9℃에서 최대의 이동을 나타냈다. 이 결과는 시험한 화합물 중에서 3dp-4026은 기질로서 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Arg-p-니트로아닐리드를 사용한 역학적 측정에 의해 판된되는 바와같이 최대의 결합 친화도를 나타냈다는 사실과 일치하는 것이다. 실제로, 도 1에 나타낸 Tm에서의 이동의 평가 등급은 통상의 효소법에 의해 측정된 결합 친화도의 등급과 유사하였다. 이러한 결과는 대조군과 비교한 일련의 화합물에 대한 Tm에서의 이동을 간단히 관찰함으로써, 당해 단백질에 대한 결합 친화도의 등급 증가에 있어 일련의 화합물을 쉽고 정확히 평가할 수 있다.
미량이식판 열 이동 분석을 1 단계 더 실시하고, Tm에서의 각 리간드의 결합 친화도를 평가할 수 있었다. 이것은 T0, Tm, ΔHu및 ΔCpu를 수학식 1에 치환함으로써 수행되었다. 열량계를 이용할 수 없어서 ΔHu및 ΔCpu를 측정할 수 없는 경우에, 치료 표적에 대해 ΔHu및 ΔCpu의 근거있는 추정을 할 수 있다. 인간 α-트롬빈의 경우에, 밀접하게 관련된 단백질인 소의 프로트롬빈 1에 대해 측정된 값인 ΔHu= 200.0 kcal/mol을 사용할 수 있었다(Lentz, B.R. 등, Biochemistry 33:5460-5468 (1994)). 이 크기의 유사한 단백질은 유사한 값을 산출하는 것으로 알려졌기 때문에, ΔCpu= 2.0 kcal/mol-。K 값을 사용하여 Tm에서의 KL을 계산하였다. 5개 시험의 리간드의 결합 친화도는 분광 광도 측정 기질로 측정한 Ki'와 매우 유사하였다(표 3a 및 표 3b).
| 단백질/리간드 | [리간드](μM) | Tm(。K) | ΔTm(。K) | Tm에서의 Kd a(nM) | 310。K에서의 Kd b(nM) | Ki(310。K)c(nM) |
| 트롬빈(TH) | 무 | 327.15 | 0.0 |
| 단백질/리간드 | [리간드](μM) | Tm(。K) | ΔTm(。K) | Tm에서의 Kd a(nM) | 310。K에서의 Kd b(nM) | Ki(310。K)c(nM) |
| TH/3dp-3811 | 37 | 328.15 | 1.0 | 14400 | 5880 | 2000 |
| TH/3dp-3959 | 76 | 332.15 | 5.0 | 660 | 224 | 250 |
| TH/3dp-4077 | 48 | 333.15 | 6.0 | 160 | 51.7 | 46 |
| TH/3dp-4076 | 60 | 334.15 | 7.0 | 76.3 | 23.6 | 26 |
| TH/3dp-4026 | 67 | 336.15 | 9.0 | 12.3 | 3.5 | 7.7 |
| 각주- a. 프로트롬빈 1에 대해 관찰된 바와 같이(Lentz, B.R. 등, Biochemistry 33:5460-5468 (1994)), ΔHT0 u= 200.0 kcal/mole, 추정된 ΔCpu= 2.0 kcal/mole-。K; 및 Kd=1/Ka를 사용하여 수학식 1에서 Tm에서의 Kd를 계산하였다.b. T = 310。K에서의 Kd에 대한 산정치는 수학식 3을 사용하여 얻었는데, 이 때, ΔHT L은 -10.0 kcal/mole로 산정되었다.c. K는 310。K에서 분광 광도 측정 기질인 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Arg-p-니트로아닐리드의 효소적 가수분해의 [억제제] 의존도를 조사하는 고전적인 효소 방법에 의해 측정하였다(50mM Hepes, pH7.5, 0.2M NaCl, 0.05% β-옥틸글루코시드). |
실시예 2
인간 α-트롬빈의 헤파린 결합 부위에 결합하는 리간드의 평가
인간 α-트롬빈의 헤파린 결합 부위에 결합하는 리간드에 대한 분석은 인간 α-트롬빈의 활성 부위에 결합하는 리간드에 대한 분석보다 실행하기가 더 어렵다. 헤파린 결합 부위에서, 기질은 가수분해되지 않으며, 그래서 분광 광도 측정 신호는 장치 검출에 대해 증폭될 수 있다. 헤파린 활성은 보통 생물학적 응고 시간 분석에서 평가된다. 한편, 인간 α-트롬빈에 대한 헤파린 결합 친화도는 낮은 MW의 헤파린의 농도가 2 로그 이상으로 변화되는 15개 내지 20개의 단일점 분석을 지루하게 수행하고 인간 α-트롬빈의 활성 부위에 결합된 형광 프로브인 p-아미노벤즈아미딘의 켄칭을 모니터함으로써 측정할 수 있다(Olson, S.T. 등, J. Biol. Chem. 266:6342-6352 (1991)). 따라서, 인간 α-트롬빈에의 헤파린의 결합은 비효소 수용체/리간드 결합 현상의 대부분과 마주치는 항원 투여의 종류를 나타내는 것인데, 이는 호르몬/수용체 상호작용, 리프레서/DNA 상호작용, 신경전달물질/수용체 상호작dyd 등에 대해 공통적으로 관찰된다. 여러 가지의 헤파린 유사 설페이트화된 올리고당 및 설페이트화된 나프탈렌 화합물을 미량이식판 열 이동 분석에 의해 분석하였다. 열 이동 분석법을 사용하면, 웰당 하나의 화합물을 사용하여 결합 친화도가 증가하는 순서로 화합물을 신속하게 평가할 수 있는데, Kd는 3개 자리수의 크기에 걸쳐 변화된다(표 4). 실시예 1에서의 실험과 같이, 열 이동 분석 결과는 낮은 MW의 헤파린의 광범위한 농도에서 일련의 지루한(15회 내지 20회의 단일 측정) 형광 켄치 분석을 필요로 하는 또 다른 방법을 통해 수득된 결과와 거의 일치한다(Olson, S.T. 등, J. Biol. Chem. 266:6342-6352 (1991)). 이러한 결과는 대조군과 비교하여 일련의 화합물에 대해 Tm에서의 이동을 간단히 관찰함으로써, 당해 단백질의 결합 친화도가 증가하는 순서로 일련의 화합물을 용이하게 정확히 평가할 수 있다.
문헌 조사에서는 기타 리간드에 대해 다른 방법으로 측정한 결합 결과를 찾을 수 없었는데, 이는 이러한 실험들이 어렵다는 것을 입증해 주는 것이라 할 수 있다. 그러나, 문헌에는 펜토산 폴리설페이트(PSO4)(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마), 덱스트란 SO4(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마) 및 수라민 (캘리포니아주 라졸라 소재의 칼바이오켐)이 항응고성을 갖는 것으로 관찰되었음이 나타나 있다. 실제로, 펜토산 폴리설페이트 및 수라민은 항-혈관형성 활성에 대한 임상 실험에서 이미 시험되었으나, 독성 효과로 인해 경시되었고, 그 다수가 응고 이상으로 기재되어 있다(Pluda, J.M. 등, J. Natl. Cancer Inst. 85:1585-1592 (1993); Stein, C.A. Cancer Res. 53:2239-2249 1993)). 열 이동 분석에 의해 측정된 T에서의 펜토산 PSO4및 수라민의 친화도는 헤파린 5000의 친화도보다 각각 7배 및 5700배 더 높은 것으로 확인되었다(표 4). 이러한 결과는 이들 리간드가 인간 α-트롬빈 활성에 대한 단백질 보조인자인 항-트롬빈 III(AT III)에의 인간 α-트롬빈의 헤파린 매개의 결합을 방해함으로써 응고 속도를 변화시킬 수 있다는 것을 시사하였다.
표 4의 결과는 화합물 라이브러리의 검색에 대한 미량이식판 열 이동 분석의 또 다른 장점을 나타냈다: 이 방법은 리간드가 활성 부위, 알로스테릭 보조인자 결합 부위, 또는 단백질 서브유니트 계면중 어디에 있든지 상관없이 리간드의 결합을 검출한다는 점에서 맹목적이고 편견이 없는 방법이다. 효소의 활성 부위 외부의 부위에 고친화도로 결합하는 리간드를 검출하는 능력은 주도 분자의 발견을 크게 촉진시킬 것이다.
| 단백질/리간드 | [리간드](μM) | Tm(。K) | ΔTm(。K) | Tm에서의 Kd a(nM) | 298。K에서의 Kd b(nM), 관찰치 | Ki(310。K) (nM), 문헌상 수치 |
| 트롬빈(TH) | 무 | 329.15 | 0.0 | |||
| TH/헤파린 SO4 | 61 | 329.65 | 0.5 | 38,300 | 7,570 | - |
| TH/헤파린 3000 | 50 | 330.15 | 1.0 | 19,700 | 3,810 | - |
| TH/헤파린 5000 | 44 | 330.15 | 1.0 | 17,200 | 3,490 | 5,400c |
| TH/펜토산 PSO4 | 40 | 332.15 | 3.0 | 2,425 | 427 | - |
| TH/덱스트란 SO4 | 48 | 336.15 | 7.0 | 68.8 | 10.1 | - |
| TH/수라민 | 102 | 340.15 | 11.0 | 3.02 | 0.37 | - |
| 각주- a. 프로트롬빈 1에 대해 관찰된 바와 같이(Lentz, B.R. 등, Biochemistry 33:5460-5468 (1994)), ΔHT0 u= 200.0 kcal/mole, 산정된 ΔCpu= 2.0 kcal/mole-。K; 및 Kd=1/Ka를 사용하여 수학식 1에서 Tm에서의 Kd를 계산하였다. 엔자임 리서치 랩(인디애나주 사우스 벤드)에서 입수한 트롬빈인 인간 α-트롬빈(인자 IIa)를 50mM Hepes, pH 7.5, 0.1M NaCl(3배 희석)을 사용하여 0.5 ㎎/㎖(11μM)로 희석하였다. 모든 리간드는 동일한 완충액에 용해시켰다.b. T = 298。K에서의 Kd에 대한 산정치는 수학식 3을 사용하여 얻었는데, 이 때, ΔHT L은 -10.0 kcal/mole로 산정되었다.c. Olson, S.T. 등, J. Biol. Chem. 266:6342-6352 (1991). |
실시예 3
aFGF 리간드의 평가
미량이식판 열 이동 분석에서 시험한 제2 치료 수용체는 산성의 섬유아세포 성장 인자(aFGF:acidic Fibroblast Growth Factor)였는데, 이 성장 인자는 혈관형성에서 중요한 역할을 하는 성장 인자이다(Folkman, J. 등, J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992)). 이 단백질에 대한 합성 유전자는 R&D 시스템스(미네소타주 미네아폴리스)로부터 구입하고, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)에 대해 기술한 것과 유사한 방법을 사용하여 이.콜리에서 클로닝하고 발현시켰다(Thompson, L.D. 등, Biochemistry 33:3831-3840 (1994); Pantoliano, M.W. 등, Biochemistry 33:10229-10248 (1994); Springer, B.A. 등, J. Biol. Chem. 269:26879-26884 (1994)). 재조합 aFGF는 문헌에 기재된 대로 헤파린-세파로즈 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다(Thompson, L.D. 등, Biochemistry 33:3831-3840 (1994)). aFGF는 헤파린/헤파란에 결합하는 것으로도 알려져 있는데, 이것은 유사분열 유발 활성에 대한 보조인자이다. 펜토산 PSO4및 수라민과 같은 헤파린-유사 분자는 성장 인자의 생물학적 활성을 억제한다. 이들 화합물의 미량이식판 열 분석은 인간 α-트롬빈에 대해 전술한 것과 유사한 방법으로 구성되었다. 각각의 리간드인 수라민, 헤파린 5000 및 펜토산 PSO4에 대해 온도의 함수로서 혼탁도의 변화를 도 2에 도시하였다. 그 결과는 표 5에 요약한다. 친화도 상수는 상당히 광범위한 결합 친화도를 나타냈는데, 펜토산 PSO4가 최고의 친화도를 나타냈다. 펜토산 PSO4, 헤파린 5000 및 수라민의 리간드 결합 친화도의 순서는 등온 적정 열량계측법을 사용하여 측정한 bFGF에 대해 확인된 것과 유사하였다(Pantoliano, M.W. 등, Biochemistry 33:10229-10248 (1994)). 이들 화합물에 대해 다른 방법으로 측정한 결합 친화도의 부족은 물리적, 온도-의존성 변화를 모니터하지 못하는 분석을 사용하여 상기의 측정을 실시하는 난점을 입증하는 증거라 할 수 있다.
표 5의 결과는 표 3a, 표 3b 및 표 4의 결과와 일치한다. 대조군과 비교하여 일련의 화합물에 대해 Tm의 이동을 간단히 관찰함으로써, 당해 단백질에 대한 결합 친화도가 증가하는 순서로 일련의 화합물을 용이하게 정확히 평가할 수 있다.
| 단백질/리간드 | [리간드](μM) | Tm(。K) | ΔTm(。K) | Tm에서의 Kd a(nM) | 298。K에서의 Kd b(nM), 관찰치 | Ki(298。K) (nM), 문헌상 수치 |
| aFGF | 무 | 317.15 | 0.0 | |||
| aFGF/EEEEE | 50 | 317.15 | 0.0 | >50,000 | - | |
| aFGF/더마탄 SO4 | 50 | 318.15 | 1.0 | 37,000 | 12,700 | - |
| aFGF/EEEEEEEE | 50 | 322.15 | 5.0 | 10,076 | 3,040 | - |
| aFGF/β-CD 14 SO4 | 47 | 329.15 | 12.0 | 1055 | 213 | 1,500 |
| aFGF/수라민 | 200 | 330.15 | 13.0 | 3220 | 622 | |
| aFGF/헤파린 5000 | 50 | 331.15 | 14.0 | 576 | 106 | 470 |
| aFGF/헤파란 SO4 | 61 | 333.15 | 16.0 | 357 | 60 | - |
| aFGF/펜토산 PSO4 | 100 | 336.15 | 19.0 | 208 | 31 | 88 |
| 각주- a. 산정된 ΔHT0 u= 60.0 kcal/mole, 산정된 ΔCpu= 0.95 kcal/mole-。K; 및 Kd=1/Ka를 사용하여 수학식 1에서 Tm에서의 Kd를 계산하였다. β-CD 14 SO4를 제외하고는, 모든 리간드를 시그마에서 구입하고 추가 정제없이 사용하였다. β-CD 14 SO4는 어메리칸 메이즈 프로덕츠 컴파니(인디애나주 해몬드)에서 구입하였다. aFGF는 50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl에서 0.25㎎/㎖로 희석하였다. 모든 리간드는 동일한 완충액에 용해시켰다..b. T = 298。K에서의 Kd에 대한 산정치는 수학식 3을 사용하여 얻었는데, 이 때, ΔHT L은 -10.0 kcal/mole로 산정되었다.c. 이들 리간드에 대한 공개된 결합 친화도 데이터는 문헌에서 발견되지 않았으나, bFGF에 대한 이들 리간드의 결합 친화도는 등온 적정 열량계측법에 의해 측정하여 나타냈다(Thompson, L.D. 등, Biochemistry 33:10229-10248 (1994)). |
실시예 4
bFGF 리간드의 평가
미량이식판 열 이동 분석법을 사용하여 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 헤파린 결합 부위에 결합하는 리간드를 평가하였다. bFGF에 대한 유전자는 R&D 시스템스로부터 구입하고, 전술한 바와 같이, 이.콜리에서 클로닝하고 발현시켰다(Thompson, L.D. 등, Biochemistry 33:3831-3840 (1994); Pantoliano, M.W. 등, Biochemistry 33:10229-10248 (1994); Springer, B.A. 등, J. Biol. Chem. 269:26879-26884 (1994)). 펜토산 PSO4및 수라민이 각각 결합 친화도 55nM 및 3.5μM로 bFGF에 결합되는 것을 확인하였다. PSO4에 대한 이러한 결과는 등온 적정 열량계측법에 의해 측정되는 bFGF에 대한 PSO4결합에 대해 관찰된 88nM의 친화도와 매우 잘 비교되는 것이다.
실시예 5
형광 방출법을 사용한 인간 α-트롬빈 리간드의 평가
형광 측정법은 흡광도 측정법보다 더 감도가 높기 때문에, 형광 열 이동 분석법을 사용하여 인간 α-트롬빈에 결합하는 리간드를 평가하였다. 다수의 형광단의 형광 방출 스펙트럼은 그 주위 환경의 극성에 민감하고, 그러므로, 단백질에 대한 상 전이(즉, 천연상으로부터 폴딩해체된 상으로)의 효과적인 프로브이다. 이러한 환경 의존적인 형광단의 가장 잘 연구된 예가 8-아닐리노나프탈렌-1-설포네이트(1,8-ANS)인데, 이에 대한 방출 스펙트럼은 용매 극성이 감소함에 따라 보다 더 짧은 파장으로 이동하는 것으로 관찰되었다. 이러한 청색 이동은 통상 형광단의 형광 양자 수득률의 증가를 수반한다. ANS의 경우에, 양자 수득률은 물에서 0.002이고 ANS가 혈청 알부민에 결합되는 경우에 0.4로 증가한다.
ANS를 형광 프로브 분자로 사용하여 단백질 변성을 모니터하였다. 형광 분석에서, 인간 α-트롬빈의 최종 농도는 0.5μM인데, 이것은 혼탁도 분석에 사용된 농도보다 20배 더 희석된 것이다. 인간 α-트롬빈의 이러한 농도는 역학적 검색 분석에 사용되는 범위에 있다.
ANS는 360㎚의 파장의 광으로 여기시켰다. 형광 방출은 사이토플루오르 II 형광 미량이식판 판독기(매사츄세츠주 프라밍햄 소재의 퍼셉티브 바이오시스템스)를사용하여 460㎚에서 측정하였다. 온도는 혼탁도 분석에 대해 상기한 바와 같이 높은 쪽으로 기울었다(실시예 1 참조). 온도의 함수로서 형광강도의 플롯은 도 3에 인간 α-트롬빈 단독에 대해 그리고 3dp-4026/인간 α-트롬빈 복합체에 대해 나타냈다. 인간 α-트롬빈에 대한 변성 전이는 57℃에서 명백히 관찰되었는데, 이 온도는 혼탁도 실험에서 관찰된 것보다 단지 약간 더 높은 온도이다. 그럼에도 불구하고 형광 분석 결과는 차등 스캐닝 열량계측 실험으로부터 프로트롬빈 1에 대해 관찰된 58℃의 Tm과 거의 일치한다. 중요한 것은, 3dp-4026(67μM에서)이 변성 전이를 ~66℃로 이동시켜 9℃의 Tm의 이동을 제공하는 것으로 확인되었는데, 이 Tm의 이동은 검출 신호로서 혼탁도를 사용하여 확인한 것과 동일한 것이다(표 3a 및 표 3b).
도 3 및 표 4의 결과는 여러 가지 중요한 점을 예시하고 있다. 첫째, 감도의 20배 이상의 증가는 흡광도를 형광 방출 검출 시스템으로 전환함으로써 수득할 수 있다. 이것은 공급이 제한되는 수용체 단백질의 경우 중요할 수 있다.
둘째로, 형광 분석에서, 변성 전이 신호는 혼탁도 분석에서의 신호보다 훨씬 더 명백하다. 혼탁도 분석에서는, 단백질의 보다 고 농도가 변성된 단백질의 침전을 초래하였다. 침전된 단백질은 노이즈 신호의 원인이 되었다.
셋째로, 미량이식판 열 이동 분석으로부터 Tm이동의 측정은 하나의 검출 시스템으로부터 다른 시스템으로 재생 가능하다.
실시예 6
FGFR1의 D(II) 도메인에 대한 리간드의 평가
미량이식판 열 이동 분석법을 이용하여 헤파린 5000 및 펜토산 PSO4가 섬유아세포 성장 인자 수용체 1(FGFR1)의 D(II) 도메인내 공지의 헤파린 결합 부위에 결합하는 지를 시험하였다. D(II) FGFR1은 bFGF에 대한 결합의 자유 에너지의 대부분의 원인이 되는 124개 잔기의 도메인이다. D(II) FGFR1은 이.콜리에서 클로닝되고 발현되었다. 재조합 D(II) FGFR1은 헥사-히스티딘 표지가 N-말단에 포함되어 Ni2+킬레이트 칼럼상에서의 친화도 크로마토그래피(Janknecht, R. 등, Natl. Acad. Sci. 미국 88:8972-8976 (1991))에 의한 회수를 촉진하는 것을 제외하고는, 공지된 바(Wetmore, D.R. 등, Proc. Soc. Mtg., 캘리포니아주 산 디에고 (1994))와 거의 동일하게 봉입체로부터 재생시켰다. D(II) FGFR1은 헤파린-세파로즈 칼럼상에서 추가로 정제하였다(Kan, M. 등, Science 259:1918-1921 (1993); Pantoliano, M.W. 등, Biochemistry 33:10229-10248 (1994)). 순도는 SDS-PAGE에 의해 판단할 때, 95%를 초과하였다. D(II) FGFR1 단백질은 12 ㎎/㎖(~1mM)로 농축시키고, 4℃에서 보관하였다.
D(II) FGFR1 단백질은 ANS 용액에 용해시켜 농도를 1.0 ㎎/㎖(70μM)로 만들었다. D(II) FGFR1의 변성형에 결합된 ANS에 대한 양자 수득률은 인간 α-트롬빈에 결합된 ANS에 대한 양자 수득률보다 더 낮았다. ANS 형광은 매우 환경 의존적이기 때문에(Lakowicz, I.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, 뉴욕 플레넘 프레스 (1983)), 상이한 단백질의 변성에 대해 관찰된 양자 수득률은 달라진다. 그러나, D(II) FGFR1의 경우, 분석의 혼탁도 버전에 대한 신호는 거의 검출할 수 없었다. D(II) FGFR1에 대해 감소된 감도에도 불구하고, ANS는 미량이식판 분석에 대해 이 시스템을 구제한다. 변성된 인자 Xa에 결합된 ANS에 대한 형광 양자 수득률이 인간 α-트롬빈에 대한 것과 거의 동일한 것을 제외하고는, 유사한 결과가 인자 Xa에 대해 수득되었다. 변성된 bFGF에 결합된 ANS에 대한 형광 양자 수득률이 인간 α-트롬빈에의 ANS 결합에 대한 양자 수득률만큼 높다는 것이 확인되었다.
미량이식판 열 이동 분석에 의해 측정되는 D(II) FGFR1 결합 실험의 결과는 도 4 및 표 6a 및 표 6b 도시되어 있다. 전술한 기타 수용체 단백질 전부에 대해 이미 입증되었듯이, 미량이식판 열 이동 분석은 D(II) FGFR1에 대한 리간드 결합 친화도의 평가를 용이하게 하였다.
| 단백질/리간드 | [리간드](μM) | Tm(。K) | ΔTm(。K) | Tm에서의 Kd a(μM) | 298。K에서의 Kd b(μM), 관찰치 | Ki(298。K)c(μM), 문헌상 수치 |
| D(II) FGFR1 | 무 | 312.8 | 0.0 |
| 단백질/리간드 | [리간드](μM) | Tm(。K) | ΔTm(。K) | Tm에서의 Kd a(μM) | 298。K에서의 Kd b(μM), 관찰치 | Ki(298。K)c(μM), 문헌상 수치 |
| D(II) FGFR1/헤파린 5000 | 150 | 317.9 | 5.1 | 30.0 | 13.6 | 85.3 |
| D(II) FGFR1/펜토산 PSO4 | 156 | 319.4 | 6.6 | 19.1 | 4.9 | 10.9 |
| 각주- a. 산정된 ΔHT0 u= 60.0 kcal/mole, 산정된 ΔCpu= 0.95 kcal/mole-。K; 및 Kd=1/Ka를 사용하여 수학식 1에서 Tm에서의 Kd를 계산하였다. D(II) FGFR1는 136μM ANS가 존재하는 50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl에서 1.0㎎/㎖로 희석하였다. 모든 리간드는 동일한 완충액에 용해시키고, 단백질 용액내로 50배 희석시켰다.b. T = 298。K에서의 Kd에 대한 산정치는 수학식 3을 사용하여 얻었는데, 이 때, ΔHT L은 등온 적정 열량계측법(Pantoliano, M.W. 등, Biochemistry 33:10229-10248 (1994))으로 측정하여 펜토산 PSO4및 헤파린 5000에 대해 각각 -12.1 kcal/mole 및 -7.48 kcal/mole로 산정되었다.c. 등온 적정 열량계측법(Pantoliano, M.W. 등, Biochemistry 33:10229-10248 (1994))으로 측정한, D(II)-D(III) FGFR1에 결합하는 이들 리간드에 대한 공개된 결합 친화도 데이터. |
실시예 7
인자 D의 미량이식판 열 이동 분석
미량이식판 열 이동 분석의 교차 표적 유용성을 추가로 입증하기 위해, 또 다른 효소인 인자 D를 그것이 열 폴딩해체 전이를 진행하는 능력에 대해 시험하였다. 인자 D는 침입성 병원체에 대한 숙주 방어의 주요 효과기 시스템인 보체 시스템의 대안적 경로의 활성화에 관여하는 필수 세린 프로테아제이다. 인자 D는 판코니 증후군 환자의 뇨에서 정제하고(Narayana 등, J. Mol. Biol. 235:695-708 (1994)), 분석 완충액(50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl)에 4μM로 희석시켰다. 분석 부피는 10㎕이고, 1,8-ANS의 농도는 100μM이었다. 실험은 바닥이 둥근 15㎕ 들이의 딤플 평판(8×12웰 열)을 사용하여 수행하였다. 단백질은 로보사이클러 온도 사이클러를 사용하여 42℃ 내지 62℃에서 2℃씩 증가시키면서 가열하였다. 각각의 가열 단계후, 그리고 사이토플루오르 II 형광판 판독기를 사용한 형광 스캐닝전에 샘플을 25℃로 냉각시켰다(실시예 1 참조). 비선형의 최소 평방 곡선 최적화 및 기타 데이터 분석을 도 3에 제시한 대로 실시하였다. 인자 D에 대한 미량이식판 열 이동 분석 결과는 도 5에 도시하였는데, 이것은 단백질의 리간드 비결합형에 대해 324K(51℃) 근처에서 일어나는 열 폴딩해체 전이를 나타낸다. 인자 D에 대해서는 상당한 친화도를 가진 가역성 리간드가 알려지지 않았다. 도 5의 결과는 미량이식판 열 이동 분석을 사용하여 인자 D 리간드에 대한 화합물의 라이브러리를 검색할 수 있음을 나타내는 것이다. 도 5의 결과는 또한 미량이식판 열 이동 분석이 일반적으로 임의의 표적 분자에 적용가능함을 나타낸다.
실시예 8
인자 Xa의 미량이식판 열 이동 분석
혈액 응고 경로의 핵심 효소인 인간의 인자 Xa를 미량이식판 열 이동 분석의 교차 표적 유용성의 또 다른 시험으로서 선택하였다. 인자 Xa는 엔자임 리서치 랩(인디애나주 사우스 벤드)에서 구입하고 분석 완충액(50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl)에서 1.4μM로 희석시켰다. 분석 부피는 100㎕이고, 1,8-ANS의 농도는 100μM이었다. 단백질은 로보사이클러 온도 사이클러를 사용하여 50℃ 내지 80℃에서 2℃씩 증가시키면서 가열하였다. 각각의 가열 단계후, 그리고 사이토플루오르 II 형광판 판독기를 사용한 형광 스캐닝전에 샘플을 25℃로 냉각시켰다(실시예 1 참조). 인자 Xa의 미량이식판 열 이동 분석 결과는 도 6에 도시하였다. 열 폴딩해체 전이는 338K(65℃)에서 관찰되었다. 데이터 분석은 도 3에 기재한 대로 기재하였다. 도 6의 결과는 단백질 안정성의 미량이식판 열 이동 분석이 일반적으로 임의의 표적 분자에 적용가능함을 나타낸다.
실시예 9
인간 α-트롬빈에 결합하는 리간드의 미량이식판 열 이동 분석의 소규모화
미량이식판 열 이동 분석의 소규모화 형태는 분석에 필요한 중요한 치료 단백질 및 리간드의 양을 최소화하기 위해 개발되었다. 분석 부피를 감소시키기 위한 첫 번째 시도에서는, 형광 신호에 악영향을 끼치지 않으면서 분석 부피를 100㎕로부터 50㎕로 감소시켰다. 분석 부피를 10배 더, 즉 5㎕로 감소시켰을 때, 인간 α-트롬빈에 대해 양호한 결과가 수득되었다. 도 7에 도시한 바와 같이, 인간의 α-트롬빈 폴딩해체 전이는 그 통상의 Tm에서 용이하게 관찰될 수 있다. 보다 중요한 것은, 활성 부위 억제제는 폴딩해체 전이의 Tm를 8.3。K만큼 이동시켜 Tm에서 15nM의 Kd의 산정치를 얻을 수 있는 것으로 관찰된 것이다.
Tm에서의 Ka는 다음 수학식 1의 관계식을 사용하여 계산하였다:
수학식 1
상기 수학식 1에서,
Tm= 332.2。K(리간드의 부재하에서의 폴딩해체 전이의 중점 온도);
T0= 323.9。K;
ΔCpu= 2.0 kcal/mol(인간 α-트롬빈의 폴딩해체시의 열용량의 산정된 변화;
25℃ 또는 37℃ 근처 온도에서의 Kd는 결합 엔탈피 ΔHb가 이 리간드에 대해 음의 값이면 보다 높은 친화도를 갖는 값이다. 분광 광도 측정 분석을 사용하여 약 8nM의 외관상 Ki가 37℃(310。K)에서 관찰되었다.
도 7에 도시한 측정값은 사이토플루오르 II 형광판 판독기(매사츄세츠주 프라밍햄 소재의 퍼셉티브 바이오시스템스)를 사용하여 수득하였다. 이 실험에서는 광의 여기 파장이 360㎚이고 방출은 460㎚에서 측정하였다. 이 소규모된 분석에 이용되는 미량이식판은 8×12열(코스타 평판 뚜껑)로 15㎕의 딤플을 포함하는 통상의 폴리카르보네이트 V자형 바닥의 96웰 평판(스트라타진 또는 코스타) 또는 폴리카르보네이트 평판이었다. 반응에서, 인간 α-트롬빈의 농도는 분석 완충액(50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl)중의 μM로 표시하였다. 분석 부피는 5㎕이고, 1,8-ANS의 농도는 100μM이었다. 단백질은 로보사이클러 온도 사이클러를 사용하여 44℃ 내지 64℃에서 2℃씩 증가시키면서 가열하였다. 각각의 가열 단계후, 그리고 사이토플루오르 II 형광판 판독기를 사용한 형광 스캐닝전에 샘플을 30초 동안 25℃로 냉각시켰다(실시예 1 참조). 비선형 최소 평방 곡선 최적화 및 기타 데이터 분석은 도 3에 기재한 대로 실시하였다.
실시예 10
D(II) FGFR1에 결합하는 리간드의 미량이식판 열 이동 분석의 소규모화
재조합 D(II) FGFR1을 봉입체로부터 정제하고 헤파린 세파로즈상에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. D(II) FGFR1(15 ㎎/㎖; 1.1mM)의 모액을 분석 완충액(50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl)에 50μM로 희석시켰다. 분석 부피는 10㎕이고, 1,8-ANS의 농도는 250μM이었다. 리간드의 부재하에서의 폴딩해체 전이는 도 8에 도시된 바와 같이, 약 312 K(39℃)인 것으로 확인되었다. 헤파린 유사 아프로설페이트(300μM)의 존재하에, 폴딩해체 전이는 약 320 K까지 약 8 K씩 증가되는 것으로 관찰되었다. 이 온도 중점 Tm을 사용하여, 아프로설페이트의 D(II) FGFR1에의 결합 친화도를 Tm에서 약 18μM인 것으로 산정하는 것이 가능하다(표 6a 및 표 6b). 이러한 결과는 미량이식판 열 이동 분석이 비효소 표적 분자에의 리간드 결합 친화도를 평가할 수 있는 능력을 입증한다.
실시예 11
유로키나제의 미량이식판 열 이동 분석의 소규모화
분석된 또 다른 표적 분자는 인간의 유로키나제형의 플라스미노겐 활성화인자(u-PA)였다. U-PA는 효소에 의해 플라스미노겐을 활성 프로테아제 플라스민으로 전환시킨다. U-PA는 조직 리모델링, 세포 이동 및 상 전이에 관여한다. u-PA에 대한 유전자는 ATCC(매릴랜드 록빌)에서 입수하였고, 이.콜리에서 활성 효소를 적절히 발현시키도록 변형시켰다. u-PA를 클로닝하고 이.콜리에서 대량발현시키고, 문헌[Winkler 등, Biochemistry 25:4041-4045 (1986)]에 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 정제하였다. u-PA 정제의 마지막 단계는 활성 부위 억제제 glu-gly-arg-클로로메틸케톤(CMK)의 존재하에 실시하였으며, 그러므로, 이 실험에 이용된 u-PA는 CMK-u-PA 복합체였다. 실험은 5㎕ 부피의 소규모형으로 실시하였다. 1㎕의 농축된 CMK-u-PA(13g/L, 371.4μM)를 96-웰 폴리카르보네이트 V자형 바닥의 미량이식판의 다중웰내의 4㎕의 62.5mM MOPS, pH7, 125mM NaCl 및 250μM 1,8-ANS에 첨가하였다. 미량이식판을 증분 가열한 다음, 각각의 온도 증가후 형광 판독에 의해 트롬빈, aFGF, D(II)FGFR1, 인자 D 및 인자 Xa에 대해 전술한 대로 열 변성 곡선을 생성시켰다. 이 실험에 대한 데이터의 분석 및 비선형 최소 평방 최적화에 의해 상기 조건하에서의 CMK-u-PA에 대한 Tm이 81℃임을 알 수 있는데, 이것은 트롬빈, aFGF, D(II)FGFR1, 인자 D 및 인자 Xa에 대해 나타난 것(각각, 55℃, 44℃, 40℃, 51℃, 55℃ 및 65℃)보다 상당히 더 높은 것이다. 이 실험은 비교적 열안정성인 단백질 또는 리간드의 고친화도 결합에 의해 안정화된 단백질에 대한 Tm을 측정하는 데에 있어서의 본 발명의 유용성을 입증하는 것이며, 추가로 그러한 실험을 소규모형식으로 실시할 수 있는 능력을 입증하는 것이다.
실시예 12
인간의 α-트롬빈의 미량이식판 열 이동 분석의 추가 소규모화
모트롬빈 용액을 50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl 및 100μM 1,8-ANS중에서 1μM로 희석시켰다. 전자 다채널 피펫을 사용하여 2㎕ 또는 5㎕의 희석된 트롬빈 용액을 96-웰 폴리카르보네이트 미량이식판의 웰내로 분배하였다. 평판을 미량이식판을 가로지르는 온도 구배를 형성할 수 있는 열 블록에서 3분 동안 가열하고, 30초 동안 25℃로 냉각시키고, 사이토플루오르 II 형광판 판독기에서 판독하였다. 데이터는 비선형 최소 평방 최적화에 의해 분석하고 도 10 및 도 11에 도시한 바와 같이 플로팅하였다. 각 곡선은 복제 실험을 나타낸다. Tm측정치에 대한 표준편차는 5㎕ 또는 2㎕ 부피(각각 ±1.73 K 및 ±0.90)을 이용하는 실험에 매우 양호한데, 이것은 본 발명이 매우 낮은 부피에서 작동할 수 있는 능력을 입증하는 것이다. 사실, 본 발명에 이용할 수 있는 부피는 작은 부피를 정확히 분배할 수 있는 기술에 의해서만 제한되는 것 같다.
분석 부피는 도 11에 인간의 α-트롬빈(1.0μM)에 대해 도시한 바와 같이, 2㎕로 감소되었다. 96웰 열에서 2㎕의 재생성 피펫팅은 매트릭스 테크놀로지스 코포레이션(매사츄세츠주 로웰)에서 입수가능한 다채널 피펫과 같은 특수 피펫팅 수단의 이용을 필요로 하는데, 이 때, 상기 피펫은 부피 0.5㎕ 내지 12.5㎕에 대해 ±2.0% 또는 0.15㎕의 정확도 및 ±2.5% 또는 0.15㎕의 정확도를 가진다.
실시예 13
미량이식판 열 이동 분석의 단일 온도 방식
단일 온도 분석의 결과는 도 12에 도시하였다. 화합물 3DP-3811, 3DP-3959, 3DP-4076 및 3DP-4660은 인간 α-트롬빈의 활성 부위에 결합한다. 인간 α-트롬빈에 대한 이들 4개의 화합물의 Ki(효소법으로 측정함)는 각각 20,000nM, 250nM, 25nM 및 8nM이다. 이들 4개의 화합물 각각은 96웰 평판내 별개의 5㎕의 분석 부피로 인간의 α-트롬빈과 평형화하였다. 최종 리간드 농도는 50μM이었다.
보다 높은 친화도를 가진 인간의 α-트롬빈에 결합하는 리간드의 경우, 55℃에서 대조 반응(인간의 α-트롬빈 단독)과 비교하여 저레벨의 형광 방출을 관찰하였다. 약하게 결합하는 리간드 3DP-3811을 함유하는 샘플에 대한 결과는 대조군 샘플에 대해 수득된 결과와 거의 상이하지 않았다. 3P-4076에 대한 형광 방출의 감소는 예상한 만큼 높게 인간 α-트롬빈에 대해 고친화도(25nM의 Ki)를 제공하지는 못했다. 이 결과는 상기 화합물의 염화물염의 보다 낮은 용해도에 부분적으로 기인할 수 있다.
도 12의 데이터는 250nM의 결합 친화도(Kd)를 가지고 리간드 농도가 50μM인 경우에 더 양호한 리간드를 신속히 동정하는 미량이식판 열 이동 분석의 단일 온도 양태의 유용성을 입증하는 것이다.
실시예 14
내재성 단백질의 트립토판 형광 방출의 미량이식판 열 이동 분석
인간 α-트롬빈의 내재성 Trp 형광강도를 미량이식판 열 이동 분석법으로 분석하였다. 100㎕의 샘플은 2μM의 인간 α-트롬빈을 함유하였다. 샘플을 280㎚에서 크세논-아크 램프의 광에 노출시켰다. 바이오루민 960(몰리큘라 다이나믹스)을 사용하여 350㎚에서 방출을 검출하였다. 44℃와 66℃ 사이의 온도 순환은 전술한 실시예에서 기재한 바와 같이 실시하였다. 분석 결과는 도 13 및 14에 나타냈다. 형광 방출의 소량의 증가가 온도의 증가와 함께 350㎚에서 관찰되었다. 그러나, 형광 방출의 이러한 증가는 단백질을 함유하지 않은 블랭크 웰내 형광 레벨 이상으로는 거의 검출할 수 없었다(도 13). 평균 블랭크를 공제하면 신호 대 노이즈비가 향상되었지만, 관찰된 폴딩해체 전이는 1,8-ANS를 이용하는 분석에서 통상 관찰된 것과 상이하였다. 1,8-ANS를 사용하여 관찰된 전이와 대조적으로, 도 14의 전이는 보다 광범위하게 나타나고, 334.4±5.1。K의 중점 Tm을 가지는데, 이것은 1,8-ANS를 사용하여 실시한 분석에서 인간 α-트롬빈에 대해 관찰된 Tm보다 약 5℃ 더 높은 값이다.
실시예 15
다중 리간드 결합 상호작용의 분석
상기에서 입증된 바와 같이, 열 이동 분석은 표적 단백질상의 단일 부위에 결합하는 리간드의 검색에 사용할 수 있다. 미량이식판 열 이동 분석이 기초하고 있는 중요한 물리적 원리, 즉 리간드 결합 및 단백질 폴딩해체의 자유 에너지의 근사한 첨가성을 고려하면, 표적 단백질과의 다중 리간드 상호작용을 분석하기 위해 미량이식판 열 이동 분석을 이용할 수 있다. 동일한 단백질에 결합하는 상이한 리간의 결합의 자유 에너지가 거의 첨가성이면, 리간드가 협동적(양성)인 방식으로 또는 비협동적(음성)인 방식으로 결합하는 지 여부에 따라, 다중 리간드 결합 시스템을 분석할 수 있다.
인간 α-트롬빈에 결합하는 다중 리간드는 미량이식판 열 이동 분석에서 분석하였다. 인간 α-트롬빈은 다음과 같은 4개 이상의 상이한 리간드 결합 부위를 가진다: (1) 촉매 결합 부위; (2) 피브린 결합 부위(엑소부위 I); (3) 헤파린 결합 부위(엑소부위 II); 및 (4) 촉매 부위에서 ~15Å 떨어진 Na+결합 부위. 첫째, 3개의 각 리간드의 독립적인 결합을 분석하였다: 3DP-4660, 히루겐(히루딘 53-64) (바켐) 및 헤파린 5000(칼바이오켐). 이들 리간드는 각각 촉매 부위, 피브린 결합 부위 및 헤파린 결합 부위에 결합한다.
모트롬빈 용액을 50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl, 1mM CaCl2및 100μM 1,8-ANS에서 1μM로 희석하였다. 각각의 트롬빈 리간드는 단독으로 그리고 다양한 조합으로 1μM 트롬빈 용액에 포함시켜, 헤파린 5000이 200μM인 것을 제외하고는, 최종 농도가 각각 50μM이 되게 하였다. 트롬빈 또는 트롬빈/리간드(들) 용액 100㎕를 바닥이 V자형인 96-웰의 폴리카르보네이트 미량이식판의 웰내로 분배하였다. 평판은 미량이식판을 가로지르는 온도 구배를 형성할 수 있는 열 블록에서 3분 동안 가열한 다음, 30초 동안 25℃에서 냉각시키고, 이어서 형광판 판독기에서 판독을 실시하였다. 데이터는 비선형의 최소 평방 최적화에 의해 분석하였다.
이들 각각의 결합 반응의 결과는 도 15 및 16에 도시하였다. 결합 친화도의 등급 순서는 각 T에서 결합하는 리간드에 대해 3DP-4660>히루겐>헤파린 5000이었고, 이는 각각 KO값 15 nM, 185 nM 및 3434nM에 해당하였다(수학식 4 참조).
그 결과는 결합의 자유 에너지가 완전히 첨가적이면, 예상보다 약간 더 작은 열 폴딩해체 이동을 나타낸다. 예를 들면, 히루겐 단독으로는 5.8℃의 ΔTm을 나타내고, 3DP-4660 단독으로는 7.7℃의 ΔTm을 나타낸다. 그러나, 히루겐과 3DP-4660은 함께 12.2℃의 ΔTm을 나타낸다. 이 결과는 하나 또는 두 개의 리간드의 결합 친화도가 두 개의 리간드가 결합할 때 감소된다는 것이며, 피브린 부위와 촉매 결합 부위 사이의 결합에 음성 협동성의 일 예이다. 그러한 음성 협동 효과는 인간α-트롬빈에 관한 문헌과 일치하는데, 문헌에서는 다양한 발색성 기질의 가수분해의 역학이 엑소부위 I에 결합하는 리간드에 의존하는 것으로 확인되었다. 실제로, 히루겐이 존재하는 경우에 D-페닐알라닐피페콜릴 아르기닐-p-니트로아닐리드의 가수분해에 대한 Km의 60% 감소율이 관찰되었다(Dennis 등, Eur. J. Biochem. 188:61-66 (1990)). 더욱이, 촉매 부위와 엑소부위 I 사이에는 협동성에 관한 구조적인 증거도 있다. PPACK(인간 α-트롬빈 촉매 부위 억제제) 및 히루겐에 결합된 인간 α-트롬빈의 동형성 구조를 비교한 결과, 엑소부위 I에서 히루겐 결합의 결과로서 활성 부위에서 일어나는 형태적 변화가 나타났다(Vijayalakshmi 등, Protein Science 3:2254-2271 (1994)). 따라서, 미량이식판 열 이동 분석에서, 촉매 중심과 엑소부위 I 사이에 관찰된 외관상의 협동성은 문헌의 기능적 및 구조적 데이터와 일치하는 것이다.
유사하게, 3개 리간드 모두의 결합을 분석하였을 때, 12.9℃의 ΔTm이 관찰되었다(도 16). 결합의 자유 에너지가 완전히 첨가적인 경우, 17.7℃의 ΔTm을 관찰할 것으로 예상되었다. 관찰된 결과는 추가의 음성 협동성이 3개 단백질 결합 부위 모두에의 리간드 결합을 통해 일어난다는 것을 의미한다. 이 결과는 문헌과 일치하는 것이다. 헤파린 및 피브린 단량체와의 3종 복합체에서, 인간 α-트롬빈은 트리-펩티드 발색성 기질 및 프로트롬빈에 대한 활성을 감소시키고(Hogg & Jackson, J. Biol. Chem. 265:248-255 (1990)), 항-트롬빈과의 반응성을 현저히 감소시켰다(Hogg & Jackson, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 86:3619-3623 (1989)). 또한, 최근의 관찰은 3종 복합체 역시 혈장에서 형성되고 헤파린 항응고 활성을 현저히 상쇄시킨다는 것을 나타내고 있다(Hotchkiss등, Blood 84:498-503 (1994)). 이들 다중 리간드 결합 결과의 요약은 표 7a 및 표 7b에 제시한다.
도 15, 도 16, 표 7a 및 표 7b의 결과는 미량이식판 열 이동 분석을 사용하여 다변수 분석을 수행하는 다음과 같은 장점을 예시하고 있다. 먼저, 동일한 미량이식판 열 이동 분석을 사용하여 표적 단백질내 다수의 결합 부위의 다중 리간드의 결합을 동시에 검출할 수 있다. 둘째, 미량이식판 열 이동 분석을 사용하여 치료 표적내 2개 이상의 부위에의 동일한 리간드 결합을 검출할 수 있다. 셋째, 미량이식판 열 이동 분석은 리간드 결합에서 협동성의 검출을 가능하게 한다. 리간드 결합 협동성에 대한 정보를 모으고 매우 신속히 분석할 수 있다. 따라서, 다른 기술을 사용하여 실시하면 몇 개월씩 걸리는 다중 리간드 결합 실험은 미량이식판 열 이동 분석을 사용하면 단지 몇시간내에 실시할 수 있다.
| 단백질/리간드 | [리간드](μM) | Tm(。K) | ΔTm(。K) | Tm에서의 Kd a(μM) | 298。K에서의 Kd b(nM) |
| 트롬빈(TH) | 무 | 323.75 | 0.0 | ||
| TH/헤파린 5000 | 200 | 327.95 | 4.2 | 3434 | 470 |
| TH/히루딘 53-65 | 50 | 329.52 | 5.8 | 185 | 23 |
| TH/3dp-4660 | 50 | 331.40 | 7.7 | 29 | 3 |
| 단백질/리간드 | [리간드](μM) | Tm(。K) | ΔTm(。K) | Tm에서의 Kd a(μM) | 298。K에서의 Kd b(nM) |
| TH/헤파린 5000 | 200 | 327.95 | |||
| TH/Hep./Hir. | 50 | 330.57 | 2.6 | 4254 | 478 |
| TH/헤파린 5000 | 200 | 327.95 | |||
| TH/Hep.3dp 4660 | 50 | 333.20 | 5.3 | 350 | 32 |
| TH/히루딘 53-65 | 50 | 329.52 | |||
| TH/Hir./Hep. | 200 | 330.57 | 1.1 | 75422 | 8467 |
| TH/히루딘 53-65 | 50 | 329.52 | |||
| TH/Hir.3dp 4660 | 50 | 335.97 | 6.5 | 117 | 9 |
| TH/3dp-4660 | 50 | 331.40 | |||
| TH/3dp-4660/Hep. | 200 | 333.20 | 1.8 | 38205 | 351 |
| TH/3dp-4660 | 50 | 331.40 | |||
| TH/3dp-4660/Hir. | 50 | 335.97 | 4.6 | 731 | 54 |
| 각주- a. 렌츠 등(1994)에 의해 프리트롬빈 1에 대해 관찰된 바와 같이, ΔHT0 u= 200.0 kcal/mole 및 산정된 ΔCpu= 2.0 kcal/mole-。K; 및 Kd=1/Ka를 사용하여 수학식 1에서 Tm에서의 Kd를 계산하였다.b. T = 298。K에서의 Kd에 대한 산정치는 수학식 3을 사용하여 얻었는데, 이 때, ΔHT L은 -10.0 kcal/mole로 산정되었다. |
실시예 16
인간 α-트롬빈 안정성을 증가시키는 생화학적 조건의 검색
4개의 상이한 형광단을 사용한 미량이식판 열 이동 분석을 사용하여 다중 pH값, 염화나트륨 농도 및 산화-환원 화합물이 인간 α-트롬빈의 안정성에 미치는 효과를 동시에 검색하였다. 트롬빈 용액은 50mM Hepes, pH7.5, 0.1M 또는 0.5M의 NaCl, 10mM EDTA, 10mM CaCl2, 10mM 디티오트레이톨, 101mM CaCl2및 100μM 1,8-ANS, 10%(v/v) 글리세롤 또는 0.1%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 6000에서 1μM로 희석하였다. 반응 부피는 100㎕이었다.
다변수 실험의 결과는 도 17A-D 및 도 18에 도시하였다. 도 17A-D는 인간 α-트롬빈에 대한 단일의 96웰 평판에서 수집한 안정성 데이터를 요약한 것이다. 도 17A에서, 형광단은 1,8-ANS이다. 도 17B에서, 형광단은 2,6-ANS이다. 도 17C에서, 형광단은 2,6-TNS이다. 도 17D에서, 형광단은 비스-ANS이다. 도 17A-D에서의 결과는 약 7.0의 최적 pH 및 NaCl 농도의 증가에 따른 안정성의 증가를 나타낸다. NaCl 농도가 0M 내지 0.5M로 증가되었을 때, 약 12℃의 ΔTm이 관찰되었다. 도 18은 10% 글리세롤의 안정화 효과 및 디티오트레이톨의 탈안정화 효과를 나타낸다. 도 17A-D 및 도 18로부터, 형광단 1,8-ANS 및 2,6-TNS가 미량이식판 열 이동 분석에서 가장 효과적임이 명백하다.
NaCl의 안정화 효과는 트롬빈의 촉매 중심에서 약 15Å 떨어진 약한 Na+결합 부위(5mM 트리스 완충액 pH8.0, 0.1% PEG, 25℃에서 30±3mM의 Kd)에 관한 최근의 보고가 있기 때문에 특히 흥미롭다(Dang 등, Nature Biotechnology 15:146-149 (1997)). 수학식 1을 사용하여, NaCl결합을 50mM Hepes pH8.0 완충액(0M 및 0.10M NaCl)에서 Tm(53℃) 근처에서 ~6mM로 산정하는 것이 가능하다.
0.10M보다 더 높은 NaCl 농도에서 일어나는 추가의 안정화는 인간 α-트롬빈의 전체 구조에 대해 계산된 추가의 Na+및/또는 Cl-로부터 얻을 수 있다. 한편, 이러한 추가의 안정화원은 통상 0.5M 내지 2M NaCl에서 관찰되고 염에 의해 유도된 단백질의 우선적인 수화에서 기인하는 특이성이 더 적은 염석 효과로부터 생길 수 있다(Timasheff & Arakawa, Protein Structure, A Practical Approach, T.E. Creighton 편집, IRL Press, 영국 옥스포드 (1989), 331-354면).
단백질에 대한 글리세롤의 안정화 효과는 글리세롤의 우선적인 배제(즉, 단백질의 우선적인 수화)와 단백질 표면상의 극성 영역에의 특이적 결합 사이의 균형 때문이었다(Timasheff & Arakawa, Protein Structure, A Practical Approach, T.E. Creighton 편집, IRL Press, 영국 옥스포드 (1989), 331-354면).
실시예 17
D(II) FGF 수용체 1 안정성을 증가시키는 생화학적 조건의 검색
미량이식판 열 이동 분석을 사용하여 D(II) FGF 수용체 1 안정성에 대한 다수의 생화학적 조건의 영향을 동시에 검색하였다. 분석은 96-웰 폴리카르보네이트 미량이식판의 웰에서 각각의 생화학적 조건의 4㎕와 D(II) FGFR1(50mM Hepes pH7.5에서 농축된 모액 500μM로부터) 1㎕를 혼합하여 수행하였다. 혼합후 최종 단백질 농도는 100μM이었고, 최종 1,8-ANS 농도는 200μM이었다. 생화학적 조건은 다음과 같이 시험하였다: 시험한 pH는 5(Na 아세테이트), 6(MES), 7(MOPS), 8(HEPES) 및 9(CHES)였고, 최종 완충액 농도는 50mM이었다.
시험한 염 농도는 0.1M 또는 0.5M NaCl이었다. 첨가제는 50mM MOPS, pH7, 0.1M NaCl에서 시험하였고, 최종 농도는 1mM(EDTA, 디티오트레이톨), 10mM(CaCl2, MgCl2, MgSO4, NiSO4), 50mM(아르기닌), 100mM((NH4)2SO4, LiSO4, Na2SO4, ZnSO4), 5% w/v(폴리에틸렌 글리콜 6000) 및 10%v/v 글리세롤이었다.
열 변성 프로필은 미량이식판의 증분 가열 및 각각의 온도 증가후의 형광 판독에 의해 트롬빈, aFGF, 인자 D 및 인자 Xa에 대해 전술한 대로 생성시켰다. 데이터는 전술한 바와 같이 비선형 최소 평방 최적화에 의해 분석하였다.
이러한 다변수 실험의 결과는 도 19 내지 도 24에 도시하였다. 도 19에 도시한 바와 같이, 안정성은 NaCl 농도의 증가와 함께 증가하였다. NaCl 농도가 0.1M로부터 0.5M로 증가함에 따라 약 5℃의 ΔTm이 관찰되었다. 도 20에 도시한 바와 같이, MgSO4및 아르기닌이 단백질을 안정화시켰다. 도 21에 도시한 바와 같이, 10% 글리세롤이 단백질을 안정화시켰다. 또한, LiSO4, Na2SO4, (NH4)2SO4, LiSO4, Na2SO4, 및 MgSO4와 같은 호프마이스터 계열의 염은 모두 안정화 효과를 가졌다(도 21). 도 22에 도시한 바와 같이, 디티오트레이톨이 단백질을 안정화시켰다. 이러한 결과는 인간 α-트롬빈의 것과 매우 상이한 것이 아니다. 도 23에 도시한 바와 같이, 최적 pH는 약 8.0으로 관찰되었다. EDTA, CaCl2, MgCl2, MgSO4, 아르기닌, (NH4)2SO4, Li2SO4, Na2SO4, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 6000 및 디티오트레이톨의 상대적인 안정화 효과는 도 24에 도시하였다.
실시예 18
유로키나제 안정성을 증가시키는 생화학적 조건의 검색
미량이식판 열 이동 분석을 사용하여 다수의 생화학적 조건이 인간 유로키나제 안정성에 미치는 효과를 동시에 검색하였다. 이 실험은 96-웰 폴리카르보네이트 미량이식판의 웰에서 각각의 생화학적 조건의 4㎕와 유로키나제(20mM Tris pH8에서 농축된 모액 371.5M로부터) 1㎕를 혼합하여 수행하였다. 혼합후 최종 단백질 농도는 74μM이었고, 최종 1,8-ANS 농도는 200μM이었다. 생화학적 조건은 다음과 같이 시험하였다: 시험한 pH는 5(아세테이트), 6(MES), 7(MOPS), 8(HEPES) 및 9(CHES)였고, 최종 완충액 농도는 50mM이었다. 시험한 염 농도는 0.1M 또는 0.5M NaCl이었다. 글리세롤은 50mM MOPS, pH7, 0.1M NaCl중의 10%v/v에서 시험하였다.
열 변성 프로필은 미량이식판의 증분 가열 및 각각의 온도 증가후의 형광 판독에 의해 트롬빈, aFGF, 인자 D, D(II) FGFR1 및 인자 Xa에 대해 전술한 대로 생성시켰다. 데이터는 전술한 바와 같이 비선형 최소 평방 최적화에 의해 분석하였다.
이러한 다변수 실험의 결과는 도 25에 도시하였다. 최적 pH는 약 7.0으로 관찰되었다. 단백질 안정성은 NaCl 농도의 증가와 함께 증가하였다. 10% 글리세롤 역시 단백질을 안정화시켰다. 이러한 결과는 문헌[Timasheff & Arakawa, Protein Structure, A Practical Approach, T.E. Creighton 편집, IRL Press, 영국 옥스포드 (1989), 331-354면]에 보고된 결과와 일치하는 것이다.
도 17 내지 도 25의 결과는 미량이식판 열 이동 분석을 사용하여, 단백질 안정성을 최적화하는 다변수 생화학적 조건을 동시에 검색하는 방법의 장점을 예시하고 있다. 본 발명의 방법 및 장치를 사용하여, 단백질의 안정성에 영향을 미치는 조건에 대해 다양한 열의 생화학적 조건을 신속히 검색할 수 있다. 따라서, 본 발명을 사용하여 단백질 보관 수명을 최적화하는 생화학적 조건을 신속히 동정할 수 있다.
실시예 19
단백질 폴딩을 촉진하는 생화학적 조건의 검색
정확히 폴딩된 His6-D(II)-FGFR1의 수득률을 증가시키는 생화학적 조건을 동정하기 위한 공장 실험을 실시하였다. His6-D(II)-FGFR1은 재조합 D(II)-FGF 수용체 1 단백질인데, 여기에는 폴리히스티딘 표지가 N-말단에 부착된다. 그 결과는 표 8에 요약한다. 최종 구아니디늄 염산염 농도가 0.38M인 경우, 13.5±0.2%의 리폴딩된 단백질 수득률은 pH8.0 및 0.5M NaCl에서 수득되었다. 이 수득률은 글리세롤이 7%(v/v)에서 존재하면, 15.5±0.3%까지 증가될 수 있었다. 약 18%로의 His6-D(II)-FGFR1 리폴딩 수득률의 추가적인 증가는 pH가 8.9로 증가되었을 경우에 관찰되었다. 사실, pH를 8.0 내지 8.9로 증가시키면, 모든 실험에서 수득률이 향상되었다. 이러한 결과는 8 내지 9의 pH와 7%의 글리세롤이 D(II)-FGFR1 폴딩을 촉진하는 두가지의 중요한 조건임을 입증하는 것이다. 이들 조건은 각각 pH8.0 및 0.5M NaCl의 출발 조건에 대해 폴딩된 단백질 수득률을 약 15% 내지 20%까지 증가시켰다.
중요하게도, pH 및 글리세롤의 효과는 거의 첨가성인 것 같다. pH 8.9 및 7% 글리세롤에서 리폴딩된 단백질의 증가된 수득률은 pH8.0 및 0.5M NaCl에서 수득된 수득률(13.5±0.2%)보다 더 높은 17.8%, 32%로 확인되었다. 리폴딩 결정인자의 근사 첨가성은 중요성을 가지는데, 왜냐하면, 폴딩의 전체 자유 에너지를 포함하는 각각의 작은 자유 에너지 성분이 증분식으로 배합하여 폴딩된 단백질의 수득률을 최적화할 수 있음이 시사되기 때문이다.
| 500mM NaCl | 50mM NaCl | 7% 글리세롤/500mM NaCl | |
| pH8.0 | 13.3%b | 9.3% | 15.1% |
| pH8.0 | 13.6% | 9.4% | 15.8% |
| pH8.9 | 16.1% | 13.5% | 17.8% |
| pH8.9 | 10.3% | 17.8% | |
| a. 최종 Gdn-HCl 농도가 0.38M이 되도록 각각의 리폴딩 완충액(1:15.6 희석)에서 Ni2+NTA/6M Gdn-HCl의 3.2㎖의 현탁액을 50㎖로 희석시킴으로써 리폴딩을 개시하였다.b. 수들률은 헤파린 세파로즈 칼럼으로부터 용출된 분획에 대해 측정된 A280값에 기초한 것이다. 고정화된 단백질 농도는 바이오-래드 단백질 분석에 의해 측정하여 1.2㎎/㎖였다. 칼럼 크기는 21㎖였고, D(II) FGFR1 25㎎이 그 수지에 결합하였다. |
최종 Gdn-HCl 농도 0.09M에서의 리폴딩 실험의 제2 라운드의 결과는 Gdn-HCl이 His6-D(II)FGFR1의 폴딩에 영향을 미치는 보다 중요한 인자임을 나타내고 있다(표 9). pH8.0 및 0.5M NaCl에서, Gdn-HCl 농도를 0.09M로 감소시키면, pH8.0, 0.5M NaCl 및 0.38M Gdn-HCl에서 수득된 수득률과 비교하여 리폴딩된 단백질 수득률이 2배가 되었다. 0.38M의 Gdn-HCl에서 수득한 결과에 따라, 0.09M Gdn-HCl내 리폴딩된 His6-D(II)FGFR1의 수득률 역시 글리세롤의 존재하에 증가되었다. 이러한 결과는 글리세롤(5% 내지 10%) 및 보다 낮은 Gdn-HCl 농도에서 리폴딩된 His6-D(II)FGFR1의 수득률의 향상이 첨가성임을 암시한다. 또한, 표 9의 결과는 호프마이스터 염인 Na2SO4가 5% 내지 10% 글리세롤과 마찬가지로 리폴딩된 단백질의 수득률을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
| 500mM NaCl | 50mM NaCl | 5% 글리세롤 50mM NaCl | 10% 글리세롤 50mM NaCl | 100mM Na2SO4 | 300mM Na2SO4 | |
| pH8.0 | 25.6%b | 29.7% | 36.5% | 35.6% | 32.2% | 33.4% |
| a. 최종 Gdn-HCl 농도가 0.09M이 되도록 각각의 리폴딩 완충액(1:6.7 희석)에서 Ni2+NTA/6M Gdn-HCl의 7.5㎖의 현탁액을 50㎖로 희석시킴으로써 리폴딩을 개시하였다.b. 수들률은 헤파린 세파로즈 칼럼으로부터 용출된 분획에 대해 측정된 A280값에 기초한 것이다. 고정화된 단백질 농도는 바이오-래드 단백질 분석에 의해 측정하여 1.6㎎/㎖였다. 칼럼 크기는 20㎖였고, D(II) FGFR1 32㎎이 그 수지에 결합하였다. |
리폴딩된 Ni2+NTA 결합된 His6-D(II)FGFR1의 수득률을 증가시키는 생화학적 조건(표 8 및 표 9) 및 His6-D(II)FGFR1의 전체 단백질 안정성을 증가시키는 생화학적 조건(도 19 내지 도 24)를 비교하면, 단백질 폴딩과 단백질 안정성 결과 사이에 밀접한 상관 관계가 있음이 명백하다. 글리세롤, 호프마이스터 계열의 염 및 pH8.5 내지 8.9는 His6-D(II)FGFR1의 단백질 폴딩 수득률 및 전체 단백질 안정성을 향상시킨다.
이러한 결과는 도 26의 단백질 폴딩 모델과 일치하는 것이다. Ni2+NTA에 고정화되고, U와 N 사이에 단순한 두 상태의 평형이 존재하는 경우에 폴딩해체된 His6-D(II)FGFR1의 응집이 억제되면, U와 N 사이의 평형의 상대적인 위치에 영향을 끼치는 인자는 U로부터 시작하든지(리폴딩 실험에서), N으로부터 시작하든지(미량이식판 열 이동 분석 단백질 안정성 검색에서) 상관 없이 동일하여야 한다. 열역학적 특성은 경로와 무관하기 때문에, 이 반응의 초기 및 최종 상태만이 중요하다. 유사한 생화학적 조건이 단백질 안정성 및 폴딩된 단백질 수득률을 촉진하기 때문에, 도 26에 도시된 단백질 폴딩에 대한 간단한 모델이 이 단백질에는 정확하다. 따라서, 미량이식판 열 이동 분석은 단백질 폴딩을 최적화하는 생화학적 조건을 검색하는 신속하고 일반적인 방법으로서 기능할 수 있다.
실시예 20
도 28은 4개의 형광 프로브 분자, 즉 비스-ANS, 2,6-TNS, 1,8-TNS 및 2,6-ANS의 각각을 사용하여 미량이식판 열 이동 분석 결과를 도시한 것이다. 트롬빈 용액은 50mM Hepes, pH7.5 및 0.1M NaCl에서 1μM로 희석하였다.
실시예 21
형광 스캐너 및 전하 커플링된 장치 카메라에 대한 분석 결과의 비교
겔 문서처리 및 분석 시스템(캘리포니아주 산 레안드로 소재의 알파 이노테크 코포레이션)을 사용하여 미량이식판 열 이동 분석을 실시하였다. 이 시스템은 CCD 카메라를 사용하여 염색된 겔로부터의 형광 방출, 도트 블롯 분석 및 96웰 평판을 검출한다. 여기 광원은 CCD 카메라 아래에 직접 위치한 장파장의 UV 광선투과 상자였다. 분석할 96웰 평판은 CCD 카메라(21×26㎝)의 초점 관찰 영역내에 광선투과 상자상에 배치하였다.
정제된 인간 α-트롬빈(위스콘신주 매디슨 소재의 엔자임 리서치 랩)의 34μM 모액(1:17)을 희석하여 인간 α-트롬빈의 2μM 용액을 50mM Hepes, pH7.5, 0.1M NaCl에서 제조하였다. 인간의 α-트롬빈 용액은 또한 100μM의 1,8-ANS를 함유하였다. 인간의 α-트롬빈-1,8-ANS 용액 100㎕를 바닥이 V자형인 폴리카르보네이트 미량이식판(코스타)의 단일열(A열)의 12개 웰 각각으로 분할하였다. 구배 블록(스트라타진의 로보사이클러)을 사용하여 미량이식판의 열을 가로질러 12개의 샘플을 44℃로부터 66℃로 가열하였다. 즉, 웰당 2℃의 온도 구배를 형성하였다. 따라서, 웰 A1은 66℃였고, 웰 A12는 44℃였다. 동일한 완충액에 100μM 1,8-ANS를 함유한 대조군 용액(단백질 없음)을 웰 B1 내지 B12의 각각에 넣었다. 증발을 방지하기 위해 광유를 각 웰에 한 방울 적가한 후, 평판을 구배 블록상에서 3분 동안 가열하였다. 각 웰의 내용물을 실온에 이르게 하고, 바닥이 평평한 미량이식판으로 옮겼다. 이 실험에서는 여기 파장을 ~360㎚ 및 방출 파장을 ~460㎚까지 감소시키기 위해 필터를 이용하지 않았는데, 상기 파장들은 1,8 ANS 형광단에 대해 최적 파장들이다. 그 다음, 바닥이 평평한 평판을 UV 광선투과 상자 근처에 위치시키고, CCD 카메라를 사용하여 방출된 광량을 측정하였다. 두가지 상이한 검출 방법에 의해 수득된 결과를 비교하기 위해 통상의 형광판 판독기(사이토플루오르 II)를 사용하여 평판을 판독하였다. 두가지 검출 방법에 대한 결과는 도 40에 플로팅하였다. 도 40의 결과는 CCD 카메라가 미량이식판 열 이동 분석에서 단백질의 폴딩해체를 모니터하는 데 형광 방출 검출기로서 유용하다는 것을 나타낸다.
실시예 22
전하 커플링된 장치 카메라를 사용한 미량이식판 열 이동 분석
방출 필터를 사용하여 1,8-ANS(~460㎚)에 대한 방출 영역의 외부에서 모든 표유광을 차단하였다. 또한, 미량이식판 열 이동 분석의 5㎕의 소규모형을 이용하여 이 형태에서의 CCD 카메라 검출 방법을 시험하였다. 폴리카르보네이트 V자형 바닥 평판 및 딤플 평판을 시험하였다. 실험은 분석 부피가 V자형 바닥 평판 또는 딤플 96웰 평판에서 5㎕인 것을 제외하고는, 실시예 21에 설명한 바와 거의 동일하였다. 온도 범위는 V자형 바닥 평판의 경우 44℃ 내지 66℃(우에서 좌로)이고, 딤플 평판의 경우 46℃ 내지 70℃(우에서 좌로)였다. CCD 상의 사진은 도 41에 제시하였다. V자형 바닥의 웰 미량이식판 상은 도 41A에 제시하였다. 딤플 평판 상은 도 41B에 제시하였다. 도 41A의 평판으로부터 수득한 결과는 도 42에 도시하였다. 도 42의 결과는 CCD 카메라를 사용하여 얻은 데이터가 형광 검출에 광증폭관(PMT)을 이용하는 형광판 판독기를 사용하여 수득한 데이터와 매우 잘 비교됨을 나타내고 있다.
상기에서 언급한 모든 공개 문헌 및 특허들은 전적으로 본원에 참고로 인용하였다. 상기에서는 본 발명을 명확성 및 이해의 목적으로 상세히 설명하였지만, 본 명세서의 개시 사항으로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명의 진정한 범위 및 첨부하는 특허청구범위에서 벗어나지 않고 다양한 변형예를 만들 수 있다.
Claims (182)
- 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자를 안정화하기 위한 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법으로서, (a) 각각의 다수 용기에서 표적 분자를 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상과 접촉시키는 단계, (b) 단계(a)의 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, (c) 각각의 용기에서 상기 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, (d) 각각의 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 기준 세트의 생화학적 조건하에서 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 (f) 각각의 열 변성 곡선에 따라 다수의 상이한 분자 또는 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 상기 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 표적 분자에 대해 수득되거나 또는 기준 세트의 조건하에서 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 다수의 상이한 분자 또는 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 단백질을 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 표적 분자가 핵산인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 단계(c)가 상기 핵산의 흡광증가 효과의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 표적 분자가 형광 표지된 2본쇄 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 하나의 가닥이 공여체 형광단을 포함하고, 다른 하나의 가닥이 수용체 형광단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 각각의 다수 용기에서 각각의 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 공여체 형광단을 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기에서 수용체 형광단으로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 한 번에 하나의 용기씩 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 단계(c2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계(a)의 다수 용기가 미량이식판에 다수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건 또는 다수의 상이한 분자중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자에 대해 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법으로서, (a) 각각의 다수 용기에서 표적 분자를 상기 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물과 접촉시키는 단계, (b) 단계(a)의 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, (c) 각각의 용기에서 상기 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, (d) 각각의 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 열 변성 곡선을 (i) 상기 표적 분자에 대해 수득된 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 상기 2종 이상의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 (f) 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 상기 조합물의 친화도를 평가하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 상기 2종 이상의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 상기 2종 이상의 분자의 효능을 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 표적 분자를 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자의 존재하에 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 분자가 핵산인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 단계(c)가 상기 핵산의 흡광증가 효과의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 분자가 형광 표지된 2본쇄 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 하나의 가닥이 공여체 형광단을 포함하고, 다른 하나의 가닥이 수용체 형광단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 각각의 다수 용기에서 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 공여체 형광단을 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기에서 수용체 형광단으로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제20항 또는 제25항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 한 번에 하나의 용기씩 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제20항 또는 제25항에 있어서, 상기 단계(c2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제20항 또는 제25항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 단계(a)의 다수 용기가 미량이식판에 다수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 다수의 상이한 분자가 조합 라이브러리를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 다수의 화합물이 디렉티드디버시티(등록상표) 라이브러리인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 조합물의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 변성된 단백질 샘플의 리폴딩을 촉진하는 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법으로서, (a) 1종 이상의 상기 다수의 조건에 따라 이미 리폴딩된 단백질 샘플중 하나를 각각의 다수 용기에 배치하는 단계, (b) 단계(a)의 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, (c) 각각의 용기에서 가열로부터 초래되는 단백질의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, (d) 각 용기에 대해 온도의 함수로서 상기 단백질에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 기준 세트의 생화학적 조건하에서 천연 단백질에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 (f) 각각의 열 변성 곡선의 물리적 변화의 크기의 변화에 따라 다수의 상이한 리폴딩 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 상기 단백질에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 리폴딩 조건의 효능을 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 단백질을 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 한 번에 하나의 용기씩 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 단계(c2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 단계(a)의 다수 용기가 미량이식판에 다수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 변성된 단백질 샘플의 리폴딩을 촉진하는 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법으로서, (a) 단백질 안정성을 촉진하는 다수의 상이한 조건중 1종 이상의 조합을 결정하는 단계, (b) 단계(a)의 생화학적 조건중 1종 이상의 조합하에 단백질 안정화를 촉진하는 상기 변성된 단백질을 폴딩시키는 단계, (c) 폴딩된 단백질의 수득율을 평가하는 단계, (d) 폴딩된 단백질의 수득률에 따라 상기 다수의 상이한 리폴딩 조건의 효능을 평가하는 단계, 및 (e) 최적의 단백질 폴딩을 촉진하는 생화학적 조건의 조합이 동정될 때까지 상기 단계(a) 내지 (d)를 반복하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법
- 제32항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 상기 천연 단백질에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 리폴딩 조건의 효능을 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 단백질을 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 한 번에 하나의 용기씩 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 단계(c2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제43항에 있어서, 상기 단계(a)의 다수 용기가 미량이식판에 다수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 숙주에 대해 이종성인 단백질을 발현시키고, 이 숙주의 봉입체내의 상기 단백질을 수득하고, 재생 조건하에 상기 단백질을 재생시킴으로써 상기 봉입체로부터 기능성 단백질을 회수하는 단계들을 포함하는, 재조합 DNA에 의한 단백질의 생산 방법에 있어서, 제32항 또는 제40항의 방법에 의해 다수의 상이한 세트의 재생 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함하는 재조합 DNA에 의한 단백질의 생산 방법.
- 열 변화로 인해 변성될 수 있는 단백질의 결정화를 촉진하는 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법으로서, (a) 각각의 다수 용기에서 상기 단백질을 상기 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상과 접촉시키는 단계, (b) 단계(a)의 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, (c) 각각의 용기에서 상기 가열로부터 초래되는 상기 단백질의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, (d) 각각의 용기에 대해 온도의 함수로서 상기 단백질에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 열 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 상기 생화학적 조건중 임의의 조건의 부재하에 상기 단백질에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 (f) 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 다수의 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 기준 세트의 생화학적 조건하에 상기 단백질에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 표적 분자를 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자의 존재하에 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 한 번에 하나의 용기씩 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 단계(d2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 단계(c2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자에 대해 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법으로서, (a) 각각의 다수 용기에서 표적 분자를 상기 다수의 상이한 분자중 하나의 분자와 접촉시키는 단계, (b) 단계(a)의 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, (c) 각각의 용기에서 상기 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, (d) 각각의 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 열 변성 곡선을 상기 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 (f) 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 다수의 상이한 분자의 친화도를 평가하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 상기 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 분자의 효능을 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 표적 분자를 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자의 존재하에 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 분자가 핵산인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 단계(c)가 상기 핵산의 흡광증가 효과의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 표적 분자가 형광 표지된 2본쇄 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 하나의 가닥이 공여체 형광단을 포함하고, 다른 하나의 가닥이 수용체 형광단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 각각의 다수 용기에서 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 공여체 형광단을 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기에서 수용체 형광단으로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제60항 또는 제67항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 한 번에 하나의 용기씩 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제60항 또는 제67항에 있어서, 상기 단계(c2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제60항 또는 제67항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 단계(a)의 다수 용기가 미량이식판에 다수의 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 다수의 상이한 분자가 조합 라이브러리를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 제72항에 있어서, 상기 다수의 화합물이 디렉티드디버시티(등록상표) 라이브러리인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 각각의 친화도를 평가하는 다변수 방법.
- 다수의 화합물을 합성하고, 이 화합물이 수용체 분자에 결합하는 능력을 시험하는 단계를 포함하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법에 있어서, (a) 미량이식판의 각각의 다수 웰에서 상기 수용체 분자를 상기 다수의 화합물중 하나의 분자와 접촉시키는 단계, (b) 단계(a)의 다수의 웰을 동시에 가열하는 단계, (c) 각각의 웰에서 상기 가열로부터 초래되는 상기 수용체 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, (d) 각각의 웰에 대해 온도의 함수로서 상기 수용체 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 열 변성 곡선을 상기 다수의 상이한 화합물중 임의의 화합물의 부재하에 상기 수용체 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 (f) 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 화합물의 친화도를 평가하는 단계를 포함하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 상기 다수의 상이한 화합물중 임의의 화합물의 부재하에 상기 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 분자의 효능을 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질인 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제77항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 표적 분자를 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자의 존재하에 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 표적 분자가 핵산인 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제80항에 있어서, 상기 단계(c)가 상기 핵산의 흡광증가 효과의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 표적 분자가 형광 표지된 2본쇄 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 하나의 가닥이 공여체 형광단을 포함하고, 다른 하나의 가닥이 수용체 형광단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제83항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 각각의 다수 용기에서 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 공여체 형광단을 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기에서 수용체 형광단으로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제79항 또는 제83항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 한 번에 하나씩 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제79항 또는 제83항에 있어서, 상기 단계(c2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제79항 또는 제83항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 다수 용기로부터 1종 이상의 화합물을 그 최대 결합 친화도에 의해 선별하는 단계 및 상기 수용체 분자에 대해 고친화도를 갖는 화합물의 제2 라이브러리를 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 다수의 분자가 조합 라이브러리를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 제89항에 있어서, 상기 조합 라이브러리가 디렉티드디버시티(등록상표) 라이브러리인 것을 특징으로 하는, 주도 화합물을 생성시키는 조합 방법.
- 다수의 용기를 내부에 가지고 있는 캐리어를 포함하고, 이 때, 각각의 용기는 (a) 열로 인해 변성될 수 있는 표적 분자 및 (b) 상기 캐리어내 다수의 용기중 상이한 하나의 용기에 각각 존재하며 조합 라이브러리에 존재하는 다수의 상이한 분자들중에서 선택되는 하나의 분자를 포함하는 제품.
- 제91항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질인 것을 특징으로 하는 제품.
- 제92항에 있어서, 각각의 상기 다수 용기에 형광 프로브 분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제품.
- 제91항에 있어서, 상기 표적 분자가 핵산인 것을 특징으로 하는 제품.
- 제94항에 있어서, 상기 핵산이 형광 표지된 2본쇄 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 제품.
- 제95항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 하나의 가닥이 공여체 형광단을 포함하고, 다른 하나의 가닥이 수용체 형광단을 포함하는 것을 특징으로 하는 제품.
- 제91항에 있어서, 상기 다수 용기가 미량이식판에 다수 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는 제품.
- 제91항에 있어서, 상기 조합 라이브러리가 디렉티드디버시티(등록상표) 라이브러리인 것을 특징으로 하는 제품.
- 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자에 대해 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법으로서, (a) 표적 분자를 각각의 다수 용기에서 상기 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 분자의 집합체와 접촉시키는 단계, (b) 단계(a)의 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, (c) 각각의 용기에서 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, (d) 각각의 용기에 대해 온도의 함수로서 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 변성 곡선을 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에서 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, (f) 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 상이한 분자의 집합체의 친화도를 평가하는 단계, (g) 표적 분자에 대한 친화도를 가진 분자를 함유하는 상이한 분자들의 집합체를 선별하는 단계, (h) 상기 집합체를 각각의 다수 용기에서 분자들의 보다 적은 집합체로 분할하는 단계, 및 (i) 다수의 분자에서 본래의 열 이동을 담당하는 단일의 분자가 동정될 때까지 상기 단계(b) 내지 (h)를 반복하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제98항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 상기 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 상기 표적 분자에 대해 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 상기 상이한 분자의 집합체의 친화도를 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제99항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제99항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제99항에 있어서, 상기 단계(a)가 상기 표적 분자를 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자의 존재하에 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(c)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제103항에 있어서, 상기 단계(c2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제99항에 있어서, 상기 단계(c2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제107항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(c1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(c2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제99항에 있어서, 단계(a)의 상기 다수 용기가 미량이식판에 다수 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제99항에 있어서, 상기 다수의 상이한 분자가 조합 라이브러리를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제108항에 있어서, 상기 다수의 화합물이 디렉티드디버시티(등록상표) 라이브러리인 것을 특징으로 하는 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제99항에 있어서, 상기 단계(c)가 상기 다수 용기 전부에서의 물리적 변화를 동시에 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자중 2종 이상의 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 열 변화로 인해 변성될 수 있는 표적 분자에 대해 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법으로서, (a) 1종 이상의 별개의 온도 범위에 걸쳐 온도의 함수로서 상기 표적 분자에 대한 열 변성 곡선을 산출함으로써 가열로부터 초래되는 상기 표적 분자의 열 변성과 관련된 물리적 변화의 크기를 결정하고, 상기 가열로부터 초래되는 상기 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하며, 상기 온도 범위내의 상기 별개의 각각의 온도에서 상기 물리적 변화의 크기를 기록하는 단계, (b) 표적 분자를 각각의 다수 용기에서 상기 다수의 상이한 분자중 하나의 분자와 접촉시키는 단계, (c) 단계(b)의 다수의 용기를 상기 온도 범위내의 1종 이상의 별개의 온도로 동시에 가열하는 단계, (d) 각각의 용기에서 가열로부터 초래되는 표적 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하고, 그로부터 상기 1종 이상의 별개의 온도에서의 물리적 변화의 크기를 결정하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 물리적 변화의 크기를 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 상기 별개의 온도에서 표적 분자에 대해 수득된 상기 물리적 변화의 크기와 비교하는 단계, 및 (f) 각각의 상기 용기의 물리적 변화의 크기의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 분자의 친화도를 평가하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 별개의 온도가 상기 다수의 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 상기 표적 분자에 대한 열 변성 곡선의 중점 온도(Tm)인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 단계(d)가 각각의 상기 다수의 용기의 내용물에 의한 광의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 단계(b)가 상기 표적 분자를 상기 각각의 다수 용기에 존재하는 형광 프로브 분자의 존재하에 상기 다수의 상이한 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 단계(d)는 각각의 상기 다수 용기에서 상기 형광 프로브 분자를 광으로 여기시키는 단계(d1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(d2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제114항에 있어서, 상기 단계(d)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(d1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(d2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제114항에 있어서, 상기 표적 분자가 핵산인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 단계(c)가 상기 핵산의 흡광증가 효과의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 표적 분자가 형광 표지된 2본쇄 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제119항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 하나의 가닥이 공여체 형광단을 포함하고, 다른 하나의 가닥이 수용체 형광단을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제115항 또는 제116항에 있어서, 상기 단계(d2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 한 번에 하나씩 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제115항 또는 제116항에 있어서, 상기 단계(d2)가 상기 다수 용기의 부분세트로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제115항 또는 제116항에 있어서, 상기 단계(d2)가 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 동시에 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 단계(c)가 각각의 상기 다수 용기에서 상기 단백질내 트립토판 잔기를 광으로 여기시키는 단계(d1) 및 각각의 상기 다수 용기로부터 형광 방출을 측정하는 단계(d2)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 단계(b)의 상기 다수 용기가 미량이식판에 다수 웰을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 다수의 상이한 분자가 조합 라이브러리를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 제126항에 있어서, 상기 조합 라이브러리가 디렉티드디버시티(등록상표) 라이브러리인 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 각 분자의 친화도를 평가하는 방법.
- 열 변화로 인해 변성될 수 있는 단백질의 보관 수명을 최적화하기 위한 다수의 상이한 분자 또는 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법으로서, (a) 상기 단백질을 각각의 다수 용기에서 상기 다수의 상이한 분자 또는 상이한 생화학적 조건중 1종 이상과 접촉시키는 단계, (b) 단계(a)의 다수의 용기를 동시에 가열하는 단계, (c) 각각의 용기에서 가열로부터 초래되는 상기 단백질 분자의 열 변성과 관련한 물리적 변화를 측정하는 단계, (d) 각각의 용기에 대해 온도의 함수로서 상기 단백질에 대한 열 변성 곡선을 산출하는 단계, (e) 단계(d)의 각각의 변성 곡선을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선 및 (ii) 상기 상이한 분자 또는 상기 상이한 생화학적 조건중 임의의 분자 또는 조건의 부재하에서 상기 단백질에 대해 수득된 열 변성 곡선과 비교하는 단계, 및 (f) 각각의 열 변성 곡선의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 분자 또는 상기 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계를 포함하는, 다수의 상이한 분자 또는 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 제128항에 있어서, 상기 단계(d)가 열 변성 곡선으로부터 중점 온도(Tm)를 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 단계(e)가 단계(d)의 각각의 변성 곡선의 Tm을 (i) 각각의 기타 열 변성 곡선의 Tm및 (ii) 상기 상이한 분자중 임의의 분자의 부재하에 수득되거나 기준 세트의 조건하에 수득된 열 변성 곡선의 Tm과 비교하는 단계(e1)를 포함하며, 상기 단계(f)가 각각의 열 변성 곡선의 Tm의 변화에 따라 상기 다수의 상이한 분자 또는 상기 상이한 생화학적 조건의 효능을 평가하는 단계(f1)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다수의 상이한 분자 또는 다수의 상이한 생화학적 조건중 1종 이상의 효능을 평가하는 다변수 방법.
- 예정된 온도 프로필에 따라 다수의 샘플의 온도를 동시에 조정하는 온도 조정 수단 및 온도 프로필에 따라 샘플의 온도가 조정되는 동안 샘플로부터 분광 방출을 수용하는 수용 수단을 구비한 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 형광 방출을 수용하는 것을 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 자외광을 수용하는 것을 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 가시광을 수용하는 것을 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 온도 조정 수단이 다수 샘플중 하나를 포함하는 용기를 수용하는 구조를 각각 가지는 다수의 웰이 내부에 형성된 열 전도성 블록 및 이 열 전도성 블록의 온도를 조정하는 온도 조정 부재를 구비하는 것을 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 온도 조정 수단이 열 전도성 블록, 그 블록상에 배치되고 다수의 샘플을 함유하는 용기를 수용하도록 구성된 어댑터 및 상기 열 전도성 블록의 온도를 조정하는 온도 조정 부재를 구비하는 것을 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 이동식 단(platform) 및 상기 열 전도성 블록의 온도를 조정하는 온도 조정 부재를 추가로 구비하며, 여기서 상기 온도 조정 수단은 다수 샘플중 하나를 포함하는 용기를 수용하는 구조를 각각 가지는 다수의 웰이 내부에 형성된 열 전도성 블록을 포함하고, 상기 이동식 단은 상기 열 전도성 블록을 수용하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 이동식 단 및 상기 열 전도성 블록의 온도를 조정하는 온도 조정 부재를 추가로 구비하며, 여기서 상기 온도 조정 수단은 다수 샘플을 함유하는 용기를 수용하기에 적합한 열 전도성 블록을 포함하고, 상기 이동식 단은 상기 열 전도성 블록을 수용하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제127항에 있어서, 상기 이동식 단이 병진 운동식 단인 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제137항에 있어서, 상기 이동식 단이 회전식 단인 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 한 번에 하나의 샘플씩 다수의 샘플로부터 분광 방출을 수용하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 다수의 샘플중 하나 이상의 샘플로부터 분광 방출을 동시에 수용하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 다수의 샘플 전부로부터 분광 방출을 동시에 수용하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제135항에 있어서, 상기 온도 조정 수단이 예정된 온도 프로필에 따라 상기 열 전도성 블록의 온도를 변화시키는 온도 제어기를 추가로 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제136항에 있어서, 상기 온도 조정 수단이 예정된 온도 프로필에 따라 상기 열 전도성 블록의 온도를 변화시키는 온도 제어기를 추가로 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제137항에 있어서, 상기 수용 수단이 샘플에 대해 여기 파장의 광을 방출하는 광원 및 여기 파장의 광에 반응하여 샘플로부터 분광 방출을 검출하는 센서를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 광증폭관을 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제131항에 있어서, 상기 수용 수단이 형광 스캐너를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제131항에 있어서, 상기 수용 수단이 형광 스캐너를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제140항에 있어서, 상기 수용 수단이 형광 스캐너를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제141항에 있어서, 상기 수용 수단이 형광 스캐너를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 전하가 커플링된 장치를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제142항에 있어서, 상기 수용 수단이 형광 조영 카메라를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제141항에 있어서, 상기 수용 수단이 CCD 형광 조영 카메라를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 수용 수단이 다이오드 열을 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 이동식 단, 이 단에 배치되고 각각 다수의 샘플을 수용하기에 적합한 다수의 열 전도성 블록, 샘플에 대해 여기 파장의 광을 방출하는 광원, 상기 열 전도성 블록의 온도를 조정하여 샘플의 온도를 조정하는 온도 조정 수단, 및 여기 파장의 광에 반응하여 샘플로부터 분광 방출을 검출하는 센서를 구비하며, 이 때, 상기 이동식 단은 열 전도성 블록 사이에서 이동하여 각각의 상기 다수의 열 전도성 블록에서 샘플로부터 분광 방출을 순차적으로 검출하는 것인 분석 장치.
- 제142항에 있어서, 상기 이동식 단이 병진 운동식 단인 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제145항에 있어서, 상기 이동식 단이 회전식 단인 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제145항에 있어서, 각각의 상기 다수의 열 전도성 블록이 각각 다수의 샘플중 하나를 함유하는 용기를 수용하도록 구성되어 있는 다수의 웰을 내부에 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제145항에 있어서, 각각의 상기 다수의 열 전도성 블록이 다수의 샘플을 함유하는 용기를 수용하기에 적합한 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제145항에 있어서, 상기 온도 조정 수단이 예정된 온도 프로필에 따라 상기 열 전도성 블록의 온도를 변화시키는 온도 제어기를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제145항에 있어서, 상기 센서가 광증폭관을 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제145항에 있어서, 상기 센서가 형광 스캐너를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제162항에 있어서, 상기 형광 스캐너가 한 번에 하나씩 다수의 샘플을 검색하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제162항에 있어서, 상기 형광 스캐너가 다수의 샘플중 2개 이상의 부분세트를 동시에 검색하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제162항에 있어서, 상기 수용 수단이 다수의 샘플 전부로부터 분광 방출을 동시에 수용하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제155항에 있어서, 상기 수용 수단이 형광 조영 카메라를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제155항에 있어서, 상기 센서가 전하 커플링된 장치를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제157항에 있어서, 상기 센서가 전하 커플링된 카메라를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제155항에 있어서, 상기 센서가 다이오드 열을 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제166항에 있어서, 상기 형광 조영 카메라가 상기 열 전도성 블록중 하나에서 다수의 샘플 전부를 동시에 검색하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제166항에 있어서, 상기 형광 조영 카메라가 상기 열 전도성 블록의 전부에서 다수의 샘플 전부를 동시에 검색하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제168항에 있어서, 상기 전하 커플링된 장치 카메라가 상기 열 전도성 블록중 하나에서 다수의 샘플 전부를 동시에 검색하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제168항에 있어서, 상기 전하 커플링된 장치 카메라가 상기 열 전도성 블록의 전부에서 다수의 샘플 전부를 동시에 검색하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제155항에 있어서, 다수의 샘플중 하나 이상의 샘플이 생물학적 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제155항에 있어서, 다수의 샘플중 하나 이상의 샘플이 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제155항에 있어서, 다수의 샘플중 하나 이상의 샘플이 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제130항에 있어서, 상기 온도 조정 수단의 작동을 제어하는 컴퓨터 제어기를 추가로 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제143항에 있어서, 상기 온도 제어기가 처리기를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제144항에 있어서, 상기 온도 제어기가 처리기를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제160항에 있어서, 상기 온도 제어기가 처리기를 구비하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 제155항에 있어서, 상기 온도 조정 수단이 각각의 상기 열 전도성 블록의 온도를 독립적으로 조정하는 것을 특징으로 하는 분석 장치.
- 다수의 샘플을 동시에 가열하는 가열 수단 및 샘플이 가열되는 동안 샘플로부터 분광 방출을 수용하는 수용 수단을 구비하는 분석 장치.
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