KR20020003917A - 꼬리 단백질과 인간 인터루킨-16의 융합 단백질, 이 융합단백질을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 벡터로 형질전환된 대장균 및 이 대장균을이용한 인간 인터루킨-16의 생산 방법 - Google Patents
꼬리 단백질과 인간 인터루킨-16의 융합 단백질, 이 융합단백질을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 벡터로 형질전환된 대장균 및 이 대장균을이용한 인간 인터루킨-16의 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 꼬리 단백질과 인간 인터루킨-16의 융합 단백질, 이 단백질을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터, 이 벡터로 형질전환된 대장균 및 이 대장균을 이용한 인간 인터루킨-16의 생산 방법에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 융합 단백질은 티오레독신(thioredoxin) 영역, 히스티딘이 풍부한 영역 및 엔테로카이네이즈(enterokinase)에 의해 절단되는 영역을 포함하는 꼬리 단백질의 C-말단에 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16이 융합된 것을 특징으로 하며, 이 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하고 균체를 파쇄한 후 원심분리하여 상등액을 얻고; 이 상등액으로 1차 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하여 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16의 융합 단백질을 포함하는 용출액을 얻고; 이 용출액을 엔테로카이네이즈와 반응시켜 상기 융합 단백질을 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16으로 절단한 다음; 이 반응액으로 2차 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하여 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16을 포함하고 수지와 결합하지 않는 분획을 얻고; 이 분획으로부터 인간 인터루킨-16을 정제함으로써, C-말단 분비형 인간 인터루킨-16을 고효율로 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 인간 인터루킨-16의 생산에 유용한, 꼬리 단백질과 인간 인터루킨-16의 융합 단백질, 이 단백질을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터, 이 벡터로 형질전환된 대장균 및 이 대장균을 이용한 인간 인터루킨-16의 생산 방법에 관한 것이다.
인터루킨-16(Interleukin-16; IL-16)은 콘카나발린(concanavalin) A에 의해 활성화된 혈액 림프구 배양액에서 처음으로 발견되어 분리된 단백질로, CD4 분자를 가진 T-세포, 대식세포 또는 호산구 등의 림프구를 염증 부위로 유인하는 림프구 주화성 인자(Lymphocyte chemoattractant factor; LCF)로 알려져 왔다(Cruikshank & Center,J. Immunology 128, 2569 (1982)). 구체적인 유인 기작으로는, 염증 반응 부위에서 활성화된 혈소판, 비만 세포, 호염구 세포 등이 세로토닌, 히스타민 같은 단백질을 분비하면, 그 주변에 위치한 CD8-세포에서 이미 합성되었던 인터루킨-16의 분비가 유도되며, 이렇게 분비된 인터루킨-16은 CD4 분자를 가진 T-세포, 활성화된 약간의 대식세포 및 호산구에 작용하여 이들을 염증 부위로 유인하여 면역 반응이 일어나게 한다.
또한, 인터루킨-16은 주화성 인자로서의 특징 외에도 CD4 분자를 갖는 T-세포의 성장 인자로서의 특징도 가지는 것으로 알려져 있다(Cruikshank et al.,J. Immunology 155, 2902 (1987)). 구체적인 기작으로는, 인터루킨-16이 휴지기 상태(G0)의 CD4 양성 세포를 G1기로 전이시키면서 이 세포 표면의 MHC II와 IL-2 수용체의 합성을 촉진함으로써 분열을 시작하게 하는 것이다.
한편, 아토피성 천식(atopic asthma), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 유육종증(sarcoidosis)과 같은 질병에서는, 특히 환자의 기도(airways), 점막하조직(sub mucosa)등에서 매우 과민하게 발생하는 염증 반응의 초기 단계에, 인터루킨-16이 CD4 양성 T-세포 또는 호산구의 축적을 일으켜 이후의 반응을 지속시키므로, 상처를 치유하는 정상적인 염증 반응과는 달리 질병의 증후로 나타난다. 따라서 이 반응에서 인터루킨-16을 억제하고자 하는 연구가 진행되고 있다.
최근 인간을 포함한 영장류의 인터루킨-16이 선천성 면역결핍 환자의 혈액내 CD8 양성 세포가 결여된 총 림프구에서 선천성 면역결핍 바이러스의 증식을 억제한다고 보고된 바 있다. 이 과정에서 인터루킨-16의 작용 기전에 대하여는 알려지지 않았지만 CD4 분자와의 결합 특성이 바이러스의 증식억제와 관련이 있을 것으로 생각되고 있다.
최근 밝혀진 인터루킨-16 유전자 cDNA는 2,376 bp로 이루어져 있고, 약 2.6 kb의 오픈리딩프레임(open reading frame; ORF)을 포함하며, 67 kDa 분자량을 가지는 프로 인터루킨-16 단백질(Pro-IL-16)을 발현하는 것으로 알려져 있다(Baier et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 5273 (1997)). 이 프로 인터루킨-16 단백질은 단백질 분해 효소의 하나인 케스페이즈-3(caspase-3)에 의해 절단되어 17 kDa의 분자량을 갖는 인터루킨-16 단백질로 된 후 세포 밖으로 분비되는데, 구체적인 분비 기작은 아직 알려져 있지 않다(Zhang et al.,J. Biol. Chem. 273, 1144 (1998)). 분비된 17 kDa의 인터루킨-16 단백질 네 분자는 비공유 결합하여 활성화된 인터루킨-16을 형성하여 CD4 분자를 가지는 림프 세포들에 작용하게 된다.
대장균을 이용하여 인간 인터루킨-16을 생산하기 위해, 인터루킨-16 유전자를 발현 벡터 pQE30에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고 이 벡터로 형질전환된 대장균을 파쇄한 후 폴리믹신-B(polymyxin-B) 칼럼과 젤 여과 칼럼을 사용하여 정제하는 방법이 시도되었다(Idziorek et al.,Clin. Exp. Immunology,112, 84 (1998)). 그러나 이 방법은 복잡한 정제 과정을 거치는 단점이 있었다.
인간 인터루킨-16을 생산하기 위한 다른 방법으로, 인터루킨-16 유전자를 히스티딘 영역과 트롬빈에 의해 절단되는 영역을 포함하는 꼬리(tag) 단백질 유전자를 포함하는 발현 벡터 pET15b에 삽입하여 꼬리 단백질과 인터루킨-16의 융합 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 융합 단백질을 생산한 후 Ni-칼럼 크로마토그래피를 수행하여 인터루킨-16을 얻는 방법이 시도되었다(Krautwald,J. Immunology,160, 5874 (1998)). 그러한 이 방법에 의해 얻어진 인터루킨-16에는 N-말단에 꼬리 단백질에서 유래하는 약 20 개의 아미노산 잔기들이 부착되는 단점이 있었다.
이에 본 발명자들은 대장균을 이용하여 생물학적으로 활성인 인간 인터루킨-16을 대량 생산하는 방법을 개발하고자 예의 연구하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대장균을 이용한 인간 인터루킨-16의 생산에 유용한 꼬리 단백질과 인터루킨-16의 융합 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 대장균을 이용한 인간 인터루킨-16의 생산 방법을 제공하는 데 있다.
도 1은 C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA 유전자의 클로닝 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 한 태양에 따른 발현 벡터 pET32-b(+)/IL-16의 제작 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 대장균에서 발현된 융합 단백질의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 4는 엔테로카이네이즈 처리 전과 후의 융합 단백질을 나타내는 SDS-PAGE 결과이다.
도 5는 엔테로카이네이즈에 의해 완전 절단된 융합 단백질의 2차 HIS-BIND 칼럼 크로마토크래피 결과를 보여주는 SDS-PAGE이다.
도 6은 인터루킨-16에 의해 유도되는 세포 주화성 활성도를 나타낸 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 티오레독신(thioredoxin) 영역, 히스티딘이 풍부한 영역 및 엔테로카이네이즈(enterokinase)에 의해 절단되는 영역을 포함하는 꼬리 단백질의 C-말단에 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16이 융합된 단백질을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 대장균을 배양하고 균체를 파쇄한 후 원심분리하여 상등액을 얻고; 이 상등액으로 1차 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하여 상기 융합 단백질을 포함하는 용출액을 얻고; 이 용출액을 엔테로카이네이즈와 반응시켜 상기 융합 단백질을 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16으로 절단한 다음; 이 반응액으로 2차 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하여 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16을 포함하는, 수지와 결합하지 않는 분획을 얻고; 이 분획으로부터 인간 인터루킨-16을 정제하는 단계를 포함하는, C-말단 분비형 인간 인터루킨-16의 생산 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 융합 단백질은 티오레독신 영역, 히스티딘이 풍부한 영역 및 엔테로카이네이즈(enterokinase)에 의해 절단되는 영역을 포함하는 꼬리(tag) 단백질의 C-말단에, C-말단 분비형 인간 인터루킨-16 단백질이 부착된 구조를 가진다. 본 발명의 융합 단백질에서 꼬리 단백질내의 티오레독신 영역은 이와 융합된 단백질들이 대장균에서 합성될 경우 더욱 쉽게 용해되어 후속하는 단백질 분리 공정을 더욱 용이하게 하며, 히스티딘이 풍부한 영역은 HIS-BIND 수지와 결합하여 분리를 용이하게 하고, 엔테로카이네이즈에 의한 절단되는 영역은 대장균에서 생산된 융합 단백질로부터 엔테로카이네이즈 처리에 의해 N-말단에 추가의 아미노산이 부착되지않은 활성형 인터루킨-16이 생산되도록 한다. 상기 티오레독신 영역은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 가지며, 상기 히스티딘이 풍부한 영역(His.Tag)은 약 6 개의 연속된 히스티딘 잔기가 포함된 영역이다. 또한 상기 엔테로카이네이즈 절단 영역은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 영역으로 꼬리 단백질의 C-말단에 위치하는 것이 바람직하다. 이러한 꼬리 단백질의 예로는, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. C-말단 분비형 인간 인터루킨-16 단백질은 서열번호: 4의 아미노산 서열을 가지며, 예를 들어, 크루익스핵크 등에 의해(Cruikshank et al. PNAS, 91, 5109 (1994))에 공지되어 있다. 이러한 융합 단백질의 대표적인 예로는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 그러나 상기 단백질의 아미노산 서열에서 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자(이하 "융합 유전자"라 함)는 유전자 코드(genetic code)에 따라 융합 단백질의 아미노산 서열로부터 유추된 염기서열을 포함한다. 이러한 유전자의 대표적인 예로는 서열번호: 6의 염기서열을 갖는 것을 들 수 있다.
상기 융합 유전자는 꼬리 단백질을 코딩하는 유전자와 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16 유전자를 차례로 연결하여 얻을 수 있다. 상기 꼬리 단백질을 코딩하는 유전자는 공지의 DNA 합성 방법에 따라 합성할 수 있다. 또한 상기 C-말단 분비형 인터루킨-16 유전자는 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 예를 들어, 인터루킨-16 유전자는 진뱅크(GenBank)에 등록번호 제M90391호로 공지된 염기서열 정보를 토대로 제작한 서열번호: 7 및 8의 프라이머와 함께 사람 혈액내 림프구의 총 RNA를 주형으로 사용하여 역전사 효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하여 C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 상기 C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA와 꼬리 단백질을 코딩하는 유전자의 융합 유전자를 적절한 벡터에 삽입하거나, 꼬리 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 공지의 벡터에 C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA를 삽입하여 얻을 수 있다. 이러한 벡터의 예로는, C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA를, 꼬리 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 융합단백질 발현 벡터 pET-32b(+)(Novagen)에 삽입하여 얻은, 꼬리 단백질 유전자와 C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA의 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pET32-b(+)/IL-16을 들 수 있다.
이렇게 제조된 벡터를 적절한 대장균 세포에 도입시켜, 형질전환된 대장균을 얻는다. 특히, 숙주로는 티오레독신 환원 효소 기능을 잃은 변이체인 대장균 AD494(DE3)pLysS(Novagen)이 바람직한데, 그 이유는 대장균 세포질 내에서 합성되는 융합 단백질이 S-S 이중 결합을 형성하여 올바른 3차 구조를 갖는 활성화된 단백질이 되게 해주며, 세포질 내에서 비용해 형태보다는 용해 형태를 형성하게 하여, 융합 단백질의 분리를 더욱 쉽게 해주기 때문이다. 본 발명자들은 상기 재조합 벡터 pET32-b(+)/IL-16을 대장균 AD494(DE3)/pLysS에 도입하여 얻은 형질전환체를 대장균 AD494/pET32b(+)/IL-16으로 명명하였으며, 이를 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000년 5월 9일자 기탁번호 제 KCTC 0779BP 호로 기탁하였다.
얻어진 재조합 대장균으로부터 융합 단백질을 발현하기 위해, 형질전환체를 적절한 배지에 접종하고 진탕배양한 다음 신선한 배지에 접종하고 진탕배양하여 600 ㎚ 파장에서 흡광도가 0.6 내지 0.8인 때에 여기에 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside; IPTG)를 첨가하고 더 배양하여 융합 단백질의 발현을 유도한다. 이때 발현되는 융합 단백질은 대장균의 전체 단백질의 50% 이상에 이르며 가용성이어서 분리가 용이하다.
융합 단백질의 발현이 유도된 대장균으로부터 인간 인터루킨-16을 얻기 위해, 상기 대장균 배양액을 원심분리하여 세포를 회수하고 초음파 분쇄법으로 파쇄한 후 이를 원심분리하여 침전물과 상등액으로 분리한다. 이어서 상등액으로 1차 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행한다. 즉, HIS-BIND 크로마토그래피 키트(Novagen)를 사용하여, 수지를 주사기에 충전하고 멸균된 증류수, 전하 완충액, 결합 완충액으로 활성화한 다음, 여기에 상기 상등액을 로딩하고, 결합 완충액과 세척 완충액으로 세척한 후, 용출 완충액으로 용출한다. 용출된 분획을 적당한 완충액, 예를 들어, 20 mM Tris-Cl(pH 7.4) 및 150 mM NaCl을 포함하는 완충액에서투석한 다음, 엔테로카이네이즈를 처리하여 융합 단백질을 꼬리 단백질과 인간 인터루킨-16으로 절단한다. 이어서 다시 2차 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하여 수지와 결합하지 않은 부분을 수확한 후 인산화 완충 용액에 투석하여 최종산물로서 인간 인터루킨-16을 얻는다.
얻어진 인간 인터루킨-16은 세포 이동성 시험에서 Jurkat 세포주의 이동을 유인하므로, 생물학적 활성을 갖는 인간 인터루킨-16임을 알 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
참조예 1: 단백질 정량
단백질 정량은 라우리(Lowry) 방법을 변형하여 다음과 같이 수행하였다. 단백질 용액을 200 ㎕의 증류수에 희석한 후, 여기에 용액 C(용액 A(2% Na2CO3, 0.1N NaOH), 용액 B1(1% CuSO4·5H2O) 및 용액 B2(2% NaK tartrate·4H2O)를 100:1:1의 비율로 혼합하여 제조됨) 1 ㎖를 가하고 10 분 동안 방치한 다음, 2N 폴린-시오칼또 시약(Folin-Ciocalteu's reagent; Sigma) 50 ㎕를 첨가하고 상온에서 30 분 이상 방치하였다. 흡광도 측정기(Spectrophotometer: Shimadzu)를 이용하여 550 ㎚ 파장에서 반응물의 흡광도를 측정하였다. 농도 표준 물질로서 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하였다.
참조예 2: SDS-PAGE
SDS-PAGE는 램리의 방법(Laemmli, U. K.,Nature,227, 680-685 (1970))에 따라 수행하였다. 즉, 분리젤의 조성은 12% 아크릴아미드(아크릴아미드:N,N'-메틸렌-비스-아크릴아미드=29.2:0.8), 0.375 M Tris-Cl (pH8.8) 및 0.1% 소디움 도데실 설페이트(SDS)이었고, 스택킹 젤(stacking gel)의 조성은 5% 아크릴아미드, 0.125 M Tris-Cl(pH 6.8), 0.1% SDS이었다. 단백질 시료를 5X 램리 완충액(Laemli buffer; 60 mM Tris-Cl; pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 5% β-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)에 희석한 후 5 분 동안 중탕한 다음 젤에 로딩하여 전기영동하였다. 이어서, 젤을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R250(Sigma)로 염색하였다.
실시예 1: C-말단 분비형 인터루킨-16의 발현 벡터의 제조
(단계 1) C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA의 클로닝
실제 활성을 가지는 C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA 유전자를 클로닝하기 위해, 사람 혈액내 림프구로부터 분리한 총 RNA를 주형(template)으로 사용하고 서열번호: 7 및 8의 프라이머 25mer 및 20mer를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건으로는 94 ℃에서 1 분 동안 변성시키고 50 ℃에서 1 분 동안 결합(annealing)시킨 다음 72 ℃에서 1 분 동안 연장(extension)시키는 반응 주기를 45 회 반복하였다. PCR 산물을 1 % 아가로스 젤에서 전기영동하여 확인하였으며, 아가로스 젤 DNA 추출 키트(Agarose Gel DNA extraction Kit, Quiagen)를 사용하여 증폭된 393 bp의 인터루킨-16 cDNA를 분리 및 정제하였다. 정제된 인터루킨-16cDNA를HindIII로 절단하여 얻은 단편을,HindIII로 절단한 수소결합되지않은 티미딘(thymidine) 한 분자가 5'- 및 3'-말단에 부착된 벡터 pCRIII와 T4 DNA 리가제로 연결하여 재조합 벡터를 얻었으며, 이 벡터를 pCRIII/IL-16으로 명명하였다. 벡터 pCRIII/IL-16을 대장균 DH5α(Life Technologies, Inc.)에 형질전환시켰으며, 얻어진 형질전환체를 대장균 DH5α/pCRIII/IL-16으로 명명하였다.
도 1은 C-말단 분비형 인터루킨-16 cDNA 유전자의 클로닝 과정을 나타내는 모식도이다.
벡터 pCRIII/IL-16에 클로닝된 IL-16 cDNA의 염기서열을 생거(Sanger)의 디데옥시 시퀀싱(dideoxy sequencing)법에 따라 확인하였다.
(단계 2) 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인터루킨-16의 융합 단백질의 발현 벡터의 제조
꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인터루킨-16의 융합 단백질의 발현 벡터를 제조하기 위해, 단계 1에서 얻은 벡터 pCRIII/IL-16을HindIII로 절단하여 인터루킨-16 cDNA 단편을 얻고, 이 단편을HindIII로 절단된 융합단백질 발현 벡터 pET-32b(+)(Novagen)와 T4 리가제로 연결하여 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인터루킨-16의 융합 단백질을 코딩하는 서열번호: 6의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 얻었으며, 이 벡터를 pET32-b(+)/IL-16으로 명명하였다. 벡터 pET32-b(+)/IL-16을 대장균 DH5α(Life Technologies, Inc.)에 형질전환하였으며, 형질전환 여부를 미니-프렙(mini-prep.) 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed., 1989)에 따라 확인하였다.
도 2는 발현 벡터 pET32-b(+)/IL-16의 제작 과정을 나타내는 모식도이다.
얻어진 발현 벡터 pET32-b(+)/IL-16을 CaCl2를 처리한 대장균AD494(DE3)/ pLysS(Novagen)에 형질전환시켰다. 얻어진 형질전환체를 대장균 AD494/pET32b(+)/ IL-16으로 명명하였으며, 이를 생명공학연구소 부설 유전자 은행에 2000년 5월 9일자 기탁번호 제 KCTC 0779BP 호로 기탁하였다.
실시예 2: 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인터루킨-16의 융합 단백질의 발현
실시예 1의 단계 2에서 얻은 대장균 AD494/pET32b(+)/IL-16을 50 ㎍/㎖ 앰피실린(ampicilin) 및 30 ㎍/㎖ 클로람페니콜(chloramphenicol)이 포함된 LB 배지(1% NaCl, 0.5% 효모 추출물 및 1% 트립톤)(LAC 배지) 3 ㎖에 접종한 후 37 ℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 이 배양액 1 ㎖를 100 ㎖의 LAC 배지에 접종한 후 600 ㎚ 파장에서 흡광도(optical density; OD)가 0.6 내지 0.8 정도가 될 때까지 배양한 다음 여기에 IPTG를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하고 3 시간 동안 배양하여 융합 단백질의 발현을 유도하였으며, 이렇게 얻어진 대장균 배양액을 후속하는 단백질 분석 과정에 사용하였다.
도 3은 대장균에서 발현된 융합 단백질의 구조를 나타내는 모식도이다.
실시예 3: 대장균의 전체 세포 단백질과 용해성 및 비용해성 분획의 분석
(단계 1) 대장균 전체 세포 단백질과 용해성 및 비용해성 분획 시료의 제조
대장균의 전체 세포 단백질 시료를 얻기 위해, 실시예 2에서 얻은 대장균 배양액을 7,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 균체를 수확한 후 1/10 부피의 SDS-PAGE 로딩 완충액(12 mM Tris-Cl pH 6.8, 5% 글리세롤, 0.4% SDS, 1% β-머캅토에탄올 및 0.02% 브로모페놀 블루)에 재현탁시켰다.
대장균의 용해성 및 비용해성 분획 시료를 얻기 위해, 상기와 동일한 방법으로 균체를 수확한 후 1/10 부피의 TE 완충액(50 mM Tris-Cl pH 8.0, 2 mM EDTA)에 재현탁하고, 여기에 트리톤(Triton) X-100을 최종 농도가 0.1%가 되게 가한 다음 상온에서 20 분 동안 방치하였다. 여기에 DNase I을 최종농도 1 ㎍/㎖가 되도록 가하고 다시 상온에서 반응시켜 염색체 DNA를 제거하고, 이 반응액을 14,000 rpm으로 15 분 동안 원심분리한 다음 상등액과 침전물을 따로 회수하였다. 상등액을 SDS-PAGE 로딩 완충액에 희석시켜 대장균의 용해성 분획 시료로 사용하였으며, 침전물을 SDS-PAGE 로딩 완충액에 재현탁하여 대장균의 비용해성 분획 시료로 사용하였다.
(단계 2) 단백질 정량 및 SDS-PAGE
단계 1에서 얻어진 시료들을 이용하여 참조예 1의 방법에 따라 단백질을 정량하였으며, 참조예 2의 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행한 후 단백질의 양상을 비교하였다.
그 결과 발현된 전체 단백질 중 50 % 이상이 융합 단백질이었으며, 이 융합 단백질들은 용해성 분획에서 분리되었다. 융합 단백질의 양은 대장균 시료 100 ㎖ 당 1 ㎎이었다.
실시예 4: 대장균에서 발현된 융합 단백질로부터 인간 인터루킨-16 단백질의 제조
(단계 1) 대장균 추출액의 제조
실시예 2에서 얻은 대장균 배양액 100 ㎖를 7,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 세포 침전물을 결합 완충액(binding buffer; 5 mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-Cl pH 7.9; Novagen) 1 ㎖에 재현탁하고, 최종적으로 14,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 상등액을 대장균 추출액으로서 얻었다.
(단계 2) 1차 HIS-BIND 크로마토그래피
단계 1에서 얻은 대장균 추출액으로 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하여 융합 단백질을 분리하였다. 즉, HIS-BIND 크로마토그래피 키트(Novagen)를 사용하여, HIS-BIND 수지 2 ㎖를 끝을 유리 솜으로 막은 5 ㎖ 용량의 주사기에 충전(packing)한 후, 여기에 3 배 부피의 멸균된 증류수를 가하여 수지를 세척하고, 이어서 5 배 부피의 전하 완충액(charge buffer; 50 mM NiSO4)을 가하여 수지를 활성화시킨 다음, 마지막으로 3 배 부피의 상기 결합 완충액을 가하여 수지를 세척하여 HIS-BIND 칼럼을 준비하였다. 이어서, 칼럼위에 단계 1에서 얻은 대장균 추출액을 로딩한 후, 10 배 부피의 결합 완충액과 6 배 부피의 세척 완충액(wash buffer; 60 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl 및 20 mM Tris-Cl pH 7.9)을 차례로 가하여 세척하였다. 이어서 6 배 부피의 용출 완충액(elution buffer; 1 M imidazole, 0.5 M NaCl 및 20 mM Tris-Cl pH 7.9)을 가하여 융합 단백질을 용출시켜 1 ㎖씩의 분획을 얻었다. 얻어진 분획 중의 단백질을 참조예 1의 방법에 따라 정량하여 단백질 농도가 높은 분획을 확인하였다.
(단계 3) 엔테로카이네이즈를 사용한 융합 단백질의 절단
단계 2에서 얻은 고농도 단백질 분획을 20 mM Tris-Cl(pH, 7.4) 및 50 mM NaCl를 포함하는 완충액에서 투석한 다음, 투석된 용액에 CaCl2를 2 mM의 농도가 되게 첨가하고 엔테로카이네이즈(enterokinase, Novagen)를 단백질 50 ㎍ 당 10 단위, 0.5 단위 또는 0.001 단위의 비로 각각 가한 후 상온에서 16 시간 이상 반응시킨 다음 PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride)를 0.57 mM이 되게 가하여 반응을 종결시켰다. 얻어진 반응액을 사용하여 참조예 2의 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다.
도 4는 엔테로카이네이즈 처리 전과 후의 융합 단백질을 나타내는 SDS-PAGE 결과이다. 도 4에서, 제M열은 분자량 표지이고, 제1열은 엔테로카이네이즈 처리 전의 융합 단백질이며, 제2열은 0.001 단위/단백질 50 ㎍의 엔테로카이네이즈에 의해 부분적으로 절단된 융합 단백질이고, 제3열은 0.5 단위/단백질 50 ㎍의 엔테로카이네이즈에 의해 완전히 절단된 융합 단백질이며, 제4열은 10 단위/단백질 50 ㎍의 엔테로카이네이즈에 의해 과절단된 융합 단백질이다. 도 4에서 보듯이, 부분 절단된 융합 단백질은 꼬리 단백질이 인터루킨-16에 결합되어 있으며, 완전 절단된 융합 단백질은 꼬리 단백질과 인터루킨-16으로 완전 분리되었고, 과절단된 융합 단백질은 꼬리 단백질과 인터루킨-16 모두 과절단되었다.
(단계 4) 2차 HIS-BIND 크로마토그래피
단계 3에서 얻어진, 엔테로카이네이즈에 의해 완전 절단된 인터루킨-16을 포함하는 반응액을 단계 2에서와 동일한 방법으로 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하고 수지에 결합하지 않은 부분과 결합한 부분을 나누어 수확하였다. 이 부분들을 각각 PBS에 12 시간 이상 투석하여 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질을 참조예 1의 방법에 따라 정량하였으며, 참조예 2의 방법에 따라 SDS-PAGE를 수행하였다.
도 5는 엔테로카이네이즈에 의해 완전 절단된 융합 단백질의 2차 HIS-BIND 칼럼 크로마토크래피 결과를 보여주는 SDS-PAGE이다. 도 5에서 제M열은 분자량 표지이며, 제1열은 엔테로카이네이즈 처리 전 융합 단백질이고, 제2열은 2차 HIS-BIND 칼럼 크로마토그래피에서 칼럼에 결합하지 않은 부분으로부터 정제된 인터루킨-16이고, 제3열은 2차 HIS-BIND 칼럼 크로마토그래피에서 칼럼에 결합한 부분으로부터 정제된 꼬리 단백질이다. 도 5에서 보듯이, 엔테로카이네이즈에 의해 완전 절단되어 분리된 인터루킨-16은 HIS-BIND 칼럼에 결합하지 않은 부분으로부터 정제하여 약 80 %의 수율로 얻을 수 있으며, 꼬리 단백질은 HIS-BIND 칼럼에 결합한 부분으로부터 정제하여 얻을 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: 인간 인터루킨-16에 의한 림프구 이동성 시험
실시예 4의 단계 4에서 얻은 인간 인터루킨-16 및 꼬리 단백질을 각각 RPMI 배지로 10 ㎍/㎖의 농도로 희석한 후 이 희석액 20 ㎕ 및 100 ㎕를 각각 24 웰-플레이트에 넣었다. 1.5x106/㎖의 세포주 jurkat(KCTC H154) 500 ㎕를 8 ㎛ 직경의 니트로셀룰로즈 막으로 제조된 눈크(Nunc)사의 조직 삽입물(tissue insert)위에 가한 후 이 조직 삽입물을 인터루킨-16 또는 꼬리 단백질 시료가 들어있는 웰에 넣고, 5% CO2, 37℃의 조건으로 3 시간 동안 반응시킨 다음 막을 통과하여 이동한 세포수를 계산하였다. 이때 대조구로는 RPMI 배지를 사용하였다.
도 6은 인터루킨-16에 의해 유도되는 세포 주화성 활성도를 나타낸 것이다. 도 6에서 보듯이, 본 발명의 인터루킨-16은 생체 세포에 대해 활성도를 가지고 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 대장균을 이용하여 발현시킴으로써, 인터루킨-16을 간단한 공정에 의해 고효율로 대량 생산할 수 있으며, 이렇게 생산된 인터루킨-16은 생물학적 활성을 가지므로, 인체내 면역 반응 활성화, 항 HIV 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (10)
- 티오레독신(thioredoxin) 영역, 히스티딘이 풍부한 영역 및 엔테로카이네이즈 (enterokinase)에 의해 절단되는 영역을 포함하는 꼬리(tag) 단백질의 C-말단에 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16이 융합된 단백질.
- 제 1 항에 있어서,꼬리 단백질이 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
- 제 1 항에 있어서,서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질.
- 제 1 항의 융합 단백질을 코딩하는 유전자.
- 제 4 항에 있어서,서열번호: 6의 염기서열을 갖는 유전자.
- 제 4 항의 유전자를 포함하는 발현 벡터.
- 제 6 항에 있어서,벡터 pET32-b(+)/IL-16.
- 제 6 항의 발현 벡터로 형질전환된 대장균.
- 제 8 항에 있어서,대장균 AD494/pET32b(+)/IL-16(기탁번호 제 KCTC 0779BP 호).
- 제 8 항 또는 제 9 항의 대장균을 배양하고 균체를 파쇄한 후 원심분리하여 상등액을 얻고; 이 상등액으로 1차 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하여 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16의 융합 단백질을 포함하는 용출액을 얻고; 이 용출액을 엔테로카이네이즈와 반응시켜 상기 융합 단백질을 꼬리 단백질과 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16으로 절단한 다음; 이 반응액으로 2차 HIS-BIND 크로마토그래피를 수행하여 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16을 포함하고 수지와 결합하지 않는 분획을 얻고; 이 분획으로부터 인간 인터루킨-16을 정제하는 단계를 포함하는, 인간 인터루킨-16의 생산 방법.
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| KR1020000035381A KR20020003917A (ko) | 2000-06-26 | 2000-06-26 | 꼬리 단백질과 인간 인터루킨-16의 융합 단백질, 이 융합단백질을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 벡터로 형질전환된 대장균 및 이 대장균을이용한 인간 인터루킨-16의 생산 방법 |
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| KR (1) | KR20020003917A (ko) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100980457B1 (ko) * | 2008-06-27 | 2010-09-07 | 한국생명공학연구원 | 대장균에서 활성형 인간 인터루킨-6의 생산 및 정제방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO1992013955A1 (en) * | 1991-02-06 | 1992-08-20 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
| WO1996038570A1 (en) * | 1995-06-02 | 1996-12-05 | Genetics Institute, Inc. | Novel fusion protein recovery and purification methods |
| KR20000059787A (ko) * | 1999-03-09 | 2000-10-05 | 복성해 | 융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 |
-
2000
- 2000-06-26 KR KR1020000035381A patent/KR20020003917A/ko not_active Ceased
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