KR20020008190A - 마이크로어레이에 기준한 삭감식 혼성화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이크로어레이를 사용하는 핵산 분자들의 집단 내의 과다 분자 (redundancy)의 확인 및 제거를 위한 고도로 능률적이고 작업처리가 빠른 방법에 관한 것이다. 본 방법은 각각의 연속하는 라운드에서 미지의 유전자를 향하여 보다 편향되는 라이브러리를 사용하는 반복적인 삭감식 프로토콜을 포함한다. 라이브러리로부터 반복적인 기존에 특성화된 핵산들을 제거하면 관심있는 기원으로부터 낮은 풍부도 (low-abundance) mRNA의 확인을 허용하고 신규 유전자 발견 속도를 증진시킨다. 본 발명은 클로닝 라이브러리로부터의 오염 핵산의 제거에 또한 유용하다.

Description

마이크로어레이에 기준한 삭감식 혼성화 {Microarray-Based Subtractive Hybridization}
살아있는 세포의 정상적인 기능을 명령하는 기전의 설명에는 모든 완전한 게놈에서 암호화된 정보의 상세한 이해가 요구된다. 상이한 유기체들의 게놈 내에 포함된 유전자를 맵핑하고 시퀀싱하기 위해 대개 메신저 RNA (mRNA) 서열이 사용된다. 서열 정보는 관심있는 특정 세포 또는 유기체의 유전자 구성(makeup)을 평가하기 위해 사용된다. 그러나, mRNA는 상이한 세포 유형들 내에서 및 발달 단계의 상이한 시점 동안 상이한 수준으로 생산된다. mRNA 유형들의 분포, 그의 발달 단계적 및 세포형 특이적 조절 발현 및 그의 단백질로의 번역은 특정 세포 유형의 독특한 (unique) 특징을 형성한다.
메신저 RNA와 같은 핵산 분자들의 집단은 대개 클로닝된 핵산 라이브러리를 사용하여 연구된다. 라이브러리는 게놈 라이브러리를 포함할 수 있으며, 이는 전체 게놈의 랜덤하게 절단된 DNA 단편을 적당한 클로닝 벡터 내로 배치함으로써 제작할 수 있다. 포유동물 게놈의 DNA로부터 제조된 라이브러리에 있어서, 가장 랜덤한 게놈 클론은 비-코딩 DNA, 고도 반복적 DNA, 또는 둘 모두를 포함한다.
제2 유형의 라이브러리는 상보적 DNA (cDNA) 분자로부터 제조된다. 이들 라이브러리는 관심있는 기원 (sources)으로부터 단리된 mRNA로부터 역전사된 DNA로부터 제작된다. 따라서, cDNA 라이브러리는 유전자를 코딩하는 DNA를 주로 포함한다.
mRNA의 상이한 종들이 소정의 세포 내에서 동등하게 나타나는 것은 아니다. 대신, mRNA 분자는 3가지 빈도 등급: 즉, (1) 초우세 (합하여 전체 mRNA 질량의 10 내지 20%를 나타내는 대략 10 내지 15개의 mRNA로 이루어짐) (2) 중간 (합하여 전체 mRNA 질량의 40 내지 45%를 나타내는 대략 1 내지 2,000개의 mRNA로 이루어짐), 및 (3) 복합 (complex) (합하여 전체 mRNA 질량의 40 내지 45%를 나타내는 대략 15 내지 20,000개의 mRNA로 이루어짐)으로 구분된다 [Davidson 및 Britten, SCIENCE204: 1052-1059 (1979)].
세포 내에 초우세 및 중간 복합도의 RNA 분자가 존재하면 저 풍부도 (low-abundance) mRNA 종들의 확인 및 시퀀싱에 심각한 장애가 될 수 있다. 시퀀싱에 적당한 핵산 라이브러리의 생성에서, 초우세 mRNA는 보다 낮은 풍부도의 mRNA의 단리 및 분석을 방해한다. cDNA 라이브러리로부터 단리된 대다수의 클론들은 초우세 및 중간 우세의 mRNA로부터 유래될 것이므로, 많은 시간과 노력이 기존에 공지된 (previously known) 우세한 mRNA 종들을 재시퀀싱하는 데에 소모되며, 낮은 풍부도 mRNA 종을 단리하고 시퀀싱하기 위해서는 매우 많은 mRNA 종들을 시퀀싱하여야 한다. 따라서, 라이브러리로부터의 유전자 발견 속도는 제시된 세포 내에 존재하는mRNA의 과잉 특성에 의해 제한될 수 있다. 고도로 풍부한 mRNA의 존재도 또한 관련 조직 유형의 상이한 세포들에서 관찰되는 활성 유전자에서의 차이, 다양한 발달 단계의 세포, 자극의 효과, 및 정상 기능 세포와 비정상 세포 사이 (예, 종양 조직에 비교한 정상 조직으로부터의 세포)의 차별적인 유전자 발현의 비교를 곤란하게 한다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로 핵산 분자들의 집단 내에서 과다 분자 (redundancy)의 확인 및 제거를 위한 고도로 능률적이고 작업처리가 빠른 방법의 발견에 기초한 것이다.
본 방법은 핵산 단편들의 랜덤 (random) 샘플을 제공하고, 상기 핵산 단편들의 랜덤 샘플을 마이크로어레이 상에 고정시키며, 기존에 어레이되거나 또는 시퀀싱된 단편에 대응하는 1종 이상의 라벨링된 프로브를 혼성화시키는 것을 포함한다. 상기 라벨링된 프로브에 혼성화하는 단편들을 검출하고, 상기 라벨링된 프로브에 혼성화하지 않거나 또는 약하게 혼성화하는 적어도 하나의 단편을 확인하고 원하는 경우 시퀀싱한다.
핵산 단편은 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 임의로 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 핵산 단편은 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 구성원이다. 라이브러리는 표준화되거나 또는 비표준화될 수 있다. 다른 실시태양에서, 핵산 단편은 PCR 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 핵산 단편은 예를 들어, PCR에 의해 증폭된다.
이어서, 핵산 단편을 고체 표면, 예를 들면, 마이크로어레이에 고정시킨다. 고체 표면은 바람직하게는 유리이다. 기존에 어레이되거나 또는 시퀀싱된 단편들에 대응하는 라벨링된 프로브 (즉, 삭감 프로브)를 상기 고정된 핵산 단편에 혼성화시킨다. 핵산 라벨은 형광, 발광 또는 방사성 라벨이거나, 또는 비오틴화되거나, 합텐화되거나, 또는 라벨링된 프로브의 용이한 검출을 허용하는 다른 화학적 태그일 수 있다. 일반적으로, 하이브리드를 형성하지 않은 프로브는 제거한다. 라벨링된 프로브에 혼성화하지 않거나 또는 약하게 혼성화하는 핵산 단편을 단리한 다음 앞서의 프로브 세트와 함께 모아서(pool) 새로운 보다 큰 프로브 세트를 생성시킨다. 보통, 새로 단리된 단편들을 시퀀싱하여 그 서열을 서열 데이타베이스에서의 서열과 비교한다.
본 발명의 방법은 핵산 분자들의 집단으로부터 풍부하지 않은 핵산 단편들을 확인하고 단리하는 삭감식 프로토콜을 포함한다. 필요하다면, 각각의 연속적인 반복작업에 의해 기존에 특성화되지 않은 유전자가 보다 많아진 단편 세트를 생성하기 위해 상기 프로토콜을 반복한다. 따라서, 각각의 삭감 라운드에서, 새로 단리된 단편들에 대응하는 프로브를 라벨링하여 앞서의 삭감 프로브에 첨가하며, 이 새로운 삭감 프로브를 랜덤하게 집어진 핵산 단편들을 함유하는 다음 마이크로어레이에 혼성화시킨다. 바람직하게는 새로 확인된 서열을 앞서의 삭감 프로브에 첨가하는 것을 포함하여 이 절차를 수회 반복한다. 따라서, 본 방법은 관심있는 기원으로부터 풍부하지 않은 또는 최소로 겹치는 핵산 단편들의 확인 및 단리를 허용하고, 신규 유전자의 발견 속도를 증진시킨다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의방법을 이용하여 단리된 풍부하지 않은 클론을 확인하고, 선택하고, 새로운 마이크로어레이에 고정시켜 유니진 (unigene) 세트를 생산한다.
본원에 기술한 방법에 대해 수많은 용도를 계획할 수 있다. 예를 들면, 본 방법은 관심있는 서열에 대한 농축 (enrichment)이 요구되는 어떠한 용도에도 사용할 수 있다. 별법으로, 본 방법은 핵산 분자들의 집단으로부터 원치않는 핵산 단편들을 제거하기 위해 사용할 수 있다. 비제한적인 용도 세트로는 다음의 용도를 포함한다.
I. 발현된 mRNA/cDNA 서열의 발견 속도를 증진시키고, 핵산 분자들의 집단 내에 소량으로 존재하는 메시지 (message)를 확인하기 위한 핵산 분자들의 세트의 제작을 용이하게 하기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법. 본 방법은 발현된 cDNA의 발견을 증가시키고 독특한 cDNA의 세트의 제작을 용이하게 한다.
II. 게놈 서열의 발견 속도를 증진시키고, 전체 게놈 또는 관심있는 하위구역에 대응하는 DNA 단편들의 단리를 용이하게 하기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법. 이 용도에서, 본 방법은 게놈 클론의 발견을 증가시키고, 풍부하지 않은 또는 최소로 겹치는(minimally tiled) 게놈 클론들의 세트의 제작을 용이하게 한다. 또한, 관심있는 구역에 맵핑하는 클론의 발견을 증가시키고, 게놈 내의 관심있는 구역에서 게놈 클론의 세트 제작을 촉진시키며, 게놈 지도에서 간극의 충전을 촉진시킨다. 이는 예를 들면, 질병 유전자 맵핑과 질병 유전자 확인을 용이하게 하는데 유용할 수 있다.
III. 다른 집단에 비교하여 한 집단에 독특한 DNA 서열의 농축 및(또는) 단리를 위한 마이크로어레이에 기준한 방법. 본 발명은 또한 상이한 균주 (예, 병원성 및 비병원성)와 상이한 종으로부터의 핵산 분자들을 포함하여, 다른 유기체에 대해 한 유기체에 독특하거나 또는 신규한 서열의 확인을 허용한다. 서열은 예를 들면, mRNA/cDNA, 게놈, 염색체외, 플라스미드 또는 바이러스 핵산일 수 있다.
IV. 관련 DNA 서열들의 발견을 증가시키기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법. 역으로, 본 방법은 밀접하게 관련된 또는 관련이 먼 유기체들 사이의 관련 서열의 확인을 허용한다. 서열은 예를 들면, mRNA/cDNA, 게놈, 염색체외, 플라스미드 및 바이러스 핵산일 수 있다.
V. 핵산 분자들의 집단으로부터 원치않는 서열의 제거 속도를 증진시키기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법. 다른 실시태양에서, 본 발명은 오염 DNA 서열 및 기존에 확인된 것과 밀접하게 관련된 서열을 포함한 원치않는 DNA 서열의 제거를 제공한다.
VI. 핵산들의 2가지 상이한 집단에서 하나 이상의 DNA 서열의 카피수에서의 변화를 확인하기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법.
달리 규정하지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 학술적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 지닌다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용할 수 있지만, 적당한 방법 및 재료를 이하에 기술한다. 본원에 언급한 모든 문헌, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문은 그 전문을 참고로 포함시킨다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서에서 조절할 것이다. 또한,재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하는 것을 의도하지 않는다.
본 발명의 다른 특징과 잇점은 하기 발명의 상세한 설명과 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
본 발명은 핵산에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 풍부하지 않은 (non-redundant) mRNAs 및 신규 게놈 서열의 확인 및 단리를 위한 방법에 관한 것이다.
도 1은 유전자 발견 전략의 개요를 예시한 흐름도이다.
도 2는 신규 유전자의 확인에 사용된 마이크로어레이의 예시도이다.
도 3은 마우스 칼바리아 (calvaria) 유니진 칩 (chip)의 제작을 예시한 흐름도이다.
도 4는 라이브러리로부터 오염 미토콘드리아 유전자의 제거를 예시한 선 그래프도이다.
편의상 본원에 사용된 몇몇 용어와 구절의 의도된 의미를 이하에 제시한다.
"공지 유전자" 또는 "공지 서열"은 그 서열을 공공 또는 사설 서열 데이타베이스에서 찾을 수 있는 것이다.
"신규 유전자" 또는 "신규 서열"은 그 서열이 공적으로 이용가능하지 않은, 즉, 어떠한 공공 또는 사설 서열 데이타에서도 찾을 수 없는 핵산 분자이다.
"이종 (heterogeneous)"은 핵산 분자들의 세트가 서열이 상이한 적어도 2개의 핵산 분자들을 포함하는 상기 핵산 분자들의 세트를 의미한다. 이종 핵산은 예를 들면, 세포, 조직 및(또는) 유기체로부터 단리된 RNA 집단을 포함한다.
본원에서 정의하는 "약하게" 혼성화하는 것이란 어레이비전 (ArrayVision)소프트웨어의 데이타 분석 시스템을 사용하여 확인했을 때 신호 대 잡음비 (S/N)가 0.5 미만인 혼성화 시그널을 나타낸다. S/N은 스폿(spot) 시그널의 배경을 공제한 강도를 배경 강도의 표준 편차로 나눈 측정치이다.
"풍부하지 않은 핵산"은 핵산 분자들의 집단, 예를 들면, 핵산 분자들의 이종 집단 내에서 기존에 확인되지 않는 핵산이다. 몇몇 실시태양에서, 풍부하지 않은 핵산은 핵산 분자들의 집단 내에 낮은 카피수로 존재하는 서열이다.
"독특한 유전자 세트"는 유전자의 세트의 각 구성원이 세포의 집단 내에 낮은 카피수로 나타난 서열에 대응하는, 상기 유전자의 세트이다. 예를 들면, 독특한 유전자 세트는 세포 당 몇개의 카피들로 존재하는 서열에 해당한다. 별법으로 독특한 유전자 세트는 풍부도가 감소된 유전자 세트로 부를 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 독특한 유전자 세트는 세포 당 100, 50, 25, 15, 10, 5, 2개의 카피 또는 심지어 1개의 카피로 존재하는 구성원을 포함한다. 따라서, 특정 세포 유형 또는 집단으로부터의 독특한 유전자 세트는 몇몇 실시태양에서 그 세포 유형에서 발현된 각 유전자의 한 카피를 함유할 것이다.
"복합 프로브"는 많은 상이한 DNA 또는 RNA 분자들을 함유하는 것이다. 본원에서 사용된 복합 프로브는 공지 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유한다.
본 발명은 복합 프로브 풀 (pool)과 마이크로어레이 기술을 사용한 삭감식 혼성화를 포함하는 반복 선별을 이용하여 핵산 분자들의 집단에서 과다 분자의 확인 및 제거를 위한 고도로 능률적이고 작업처리가 빠른 방법을 제공한다. 클로닝 라이브러리로부터 선택된 랜덤하게 선택된 핵산 단편들을 마이크로어레이하여, 혼성화 조건 하에서 공지 서열 (예, 젠뱅크(Genbank), pubEST와 같은 공공 데이타베이스로부터 얻은 서열)로부터 생성된 복합 라벨링된 프로브에 노출시킨다. 이러한 제1 프로브 풀에 약하게 혼성화하거나 또는 혼성화하지 않는 클론만을 시퀀싱하고; 이러한 제1 프로브 풀에 혼성화하는 클론을 시퀀싱하지 않는다. 이 단계에서 얻은 서열을 기존에 확인된 핵산 분자들의 공공 데이타베이스 (예, BLAST, pubEST, 젠뱅크 NR)에서 비교한다. 이들 서열을 최초의 프로브 풀에 첨가하여 제2의 삭감 프로브 풀을 생성시킨다. 이러한 삭감 프로브 풀을 라이브러리로부터 랜덤하게 선택된 클론의 제2 군에 혼성화시킨다. 프로브는 최초의 공지된 서열의 핵산에 상보적인 핵산 뿐만 아니라, 혼성화의 제1 라운드에서 확인된 핵산에도 혼성화한다. 연속적인 혼성화 라운드 이후 프로브 풀을 확장시키는 절차는, 본질적으로 모든 랜덤하게 선택된 클론이 라벨링된 프로브에 혼성화하여, 즉 기존에 특성화되지 않은 모든 클론이 시퀀싱될 때까지 반복한다. 따라서, 본 발명의 방법은 당업계에 공지된 다른 방법의 효율을 감소시키는 문제인 공지 클론을 재시퀀싱하는 필요를 제거한다.
제1 단계는 핵산 분자들의 이종 집단의 단리를 포함한다. 핵산 분자들은 전장 RNA 또는 DNA 분자의 단편일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 핵산 분자들의 이종 집단은 핵산 분자들의 집단으로부터 랜덤하게 선택된 핵산 단편을 포함할 수 있다. 이들 단편은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 이들은 임의로 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 핵산 분자는 미지 서열의 핵산 라이브러리로부터의 cDNA를 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 라이브러리는 게놈 라이브러리이다. 다른 실시태양에서, 상기 라이브러리는 cDNA 라이브러리이다. 두 실시태양에서, 상기 라이브러리는 표준화 라이브러리 또는 비표준화 라이브러리일 수 있다. 별법으로, 핵산 단편들의 집단은 라이브러리의 일부가 아닐 수 있다 (예, PCR 단편).
몇몇 실시태양에서, PCR 또는 다른 증폭법을 이용하여 핵산을 증폭시킨다. 이어서, DNA를 표면, 바람직하게는 유리 상의 마이크로어레이에 고정시킨다. 몇몇 실시태양에서, 어레이된 DNA는 유리 상에 합성된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 실시태양에서, PCR 단편은 마이크로어레이 스폿터(spotter)를 사용하여 어레이시킨다.
이어서 고정된 DNA 분자를, 혼성화를 허용하는 조건 하에 공지 또는 규정된 서열의 핵산 분자를 함유하는 라벨링된 프로브 풀에 접촉시킨다. 핵산에 대한 표준 라벨링 프로토콜은 예를 들면 문헌[Sambrook 등; Kambara 등, BIOTECHNOLOGY6: 816-821 (1988); Smith 등, NUC. ACIDS RES.13: 2399-2412 (1985)]에 기술되어 있다. 핵산 라벨은 형광, 발광 또는 방사성 라벨이거나, 또는 비오틴화되거나, 합텐화되거나 또는 라벨링된 프로브의 용이한 검출을 허용하는 다른 화학적 태그일 수 있다. 본원에 기재한 방법에서는 형광 라벨이 다수 샘플들의 동시적인 작업처리가 빠른 분석을 위한 자동화 기구와 함께 일상적으로 사용되므로 유리하다. 메츠커 (Metzker) 및 깁스 (Gibbs)는 최근에 스펙트럼 특징이 개선된 Cy 플루오로포어에 기초한 형광 태그된 뉴클레오티드의 패밀리를 개시하였다 (예를 들면, 본원에 참고로 인용하는 미국 특허 제5,728,529호 참조). 별도의 플루오로포어 세트로는 로다민에 기초한 플루오로포어, TARAM, ROX, JOE 및 FAM; BigDye(등록상표) 플루오로포어 (어플라이드 바이오시스템즈, 인크. (Applied Biosystems, Inc.)), 댄실기, 플루오레신 및 치환 플루오레신 유도체, 아크리딘 유도체, 쿠마린 유도체, 프탈로시아닌, 테트라메틸로다민, 텍사스 레드(Texas Red) (등록상표), 9-(카르복시에틸)-3-히드록시-6-옥소-6H-잔텐, DABCYL (등록상표) 및 BODIPY (등록상표) 플루오로포어 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes; Eugene, OR))이 있다.
혼성화 단계에 이어, 마이크로어레이, 예를 들면, DNA 마이크로어레이 내의 각 위치에서 라벨의 양을 검출한다 (문헌[Brown 및 Botstein, NAT. GENET.21: 33-37 (1999)] 참조). 마이크로어레이는 지지체 재료 상에 공간적으로 분리된 체제로 위치하는 이중쇄 또는 단일쇄 DNA 분자들의 정렬된 (ordered) 어레이이다. 대개 니트로셀룰로스의 큰 시트인 필터 "마크로어레이"와 대조적으로, 마이크로어레이는 10,000개 이하의 DNA 분자들이 대개 1 내지 4 ㎠의 구역 내에 맞추어질 수 있도록 DNA를 보다 치밀하게 채워진 체제로 위치시킨다. 필터 어레이의 니트로셀룰로스에 기재된 재료와는 대조적으로, 마이크로어레이에서는 대개 고체 지지체로서 코팅된 유리를 사용한다. DNA 샘플들의 정렬된 어레이를 가짐으로써, 각 샘플의 위치를 트랙킹하여 어레이 상의 DNA가 생성된 원래의 샘플에 연관시킬 수 있다. 마이크로어레이를 제조하는 방법 및 장치는 설명되어 있다 (예를 들면, 둘 모두 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제5,445,934호와 제5,800,992호 참조).
마이크로어레이를 생성하는 공정은 cDNA 라이브러리를 함유하는 박테리아 콜로니들의 세트를 처리하여, 임의의 하나의 박테리아 콜로니에 보유된 벡터의 인서트로부터 유래된 정제 DNA의 증폭된 단편을 얻는 일련의 단계를 포함한다. 상기 일련의 단계는 수동으로 또는 로봇식 워크스테이션, 예를 들면, PCR 기기 및 액체취급 로봇을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 방법에서, 상기 단계는 96 웰, 384 웰 또는 1536 웰로 이루어진 다수웰 평판을 사용하여 수행한다. 그러나, 다른 구성도 가능하다. 마이크로어레이는 몰레큘라 다이나믹스 (Molecular Dynamics)에 의해 개발된 기구와 같은 로봇식 스폿터를 사용하여 또는 스탠포드 대학 (Stanford University; 동일장소)의 패트릭 브라운 (Patrick Brown)의 실험실에서 제작한다. 마이크로어레이 공정의 다른 특징은 데이타 분석을 어레이비젼과 같은 데이타 분석 소프트웨어를 사용하여 자동으로 수행한다는 점이다. 클론 트랙킹, 마이크로어레이 제작으로부터 결과에 이르기까지의 전체 공정을 완전히 일체화시켜, 시퀀싱을 위해 처리해야 하는 박테리아 콜로니들을 쉽게 확인할 수 있다.
각종 실시태양에서, 본 발명에 따른 마이크로어레이는 100; 1,000; 10,000 또는 심지어 100,000 또는 그 이상의 DNA 샘플을 포함한다.
마이크로어레이 상의 DNA 샘플을 라벨링된, 예를 들면, 형광 라벨링된 RNA 또는 DNA 프로브와 혼성화시켜, 상기 프로브 샘플이 마이크로어레이 상의 DNA 샘플과 유사하거나 동일한 분자를 함유하는지 여부를 확인한다. 바람직한 실시태양에서, 복합 프로브를 마이크로어레이에 혼성화시킬 수 있다. 복합 프로브는 많은 상이한 DNA 또는 RNA 분자들을 함유하는 것이다.
프로브 분자를 마이크로어레이 상의 DNA 분자에, 상기 프로브 분자와 마이크로어레이 상의 DNA 분자와 동일하거나 또는 거의 동일한 DNA 분자(들) 사이의 하이브리드 형성을 허용하는 조건 하에 혼성화시킨다. DNA-프로브 하이브리드 분자의 존재를 예를 들면, 형광 검출 기구에 의해 검출한다. 특정 DNA 부위에서 혼성화시그널이 약하거나 또는 존재하지 않으면, 프로브 내에 대응하는 DNA 또는 RNA 분자가 부재한다. 각종 실시태양에서, 1, 2, 3 또는 4 또는 그 이상의 프로브 분자를 동시에 사용한다.
몇몇 실시태양에서, 마이크로어레이 제작, 혼성화 및 분석의 반복적인 라운드로 상기 공정을 성취한다. 본 방법은 제시된 크기의 독특한 유전자 세트를 얻기 위한 시퀀싱의 양을 감소시킨다. 각종 실시태양에서, 반복적인, 예를 들면, 2중 cDNA를 제거하기 위해, 박테리아 또는 미토콘드리아 DNA를 갖는 샘플 또는 어떠한 cDNA 인서트도 갖지 않는 샘플을 사용할 수 있다.
필터 어레이 방법에 비해 마이크로어레이에 기준한 삭감법의 잇점은 많다. 예를 들면, 본 방법은 시퀀싱에 앞서 박테리아 내에서 클론을 증식시킬 필요를 없앤다. 예를 들면, 필터법은 일반적으로 클로닝된 cDNA가 함유된 박테리아 콜로니를 어레이한다. 이 콜로니는 수일에 걸쳐 배양하고, 용해시켜 DNA를 방출시키고, 상기 DNA를 필터 상에 고정시켜야 한다. 콜로니의 필터 어레이에의 혼성화는 박테리아 파편과 콜로니로부터 방출된 소량의 DNA 때문에 저해될 수 있다.
본 방법의 두번째 잇점은 박테리아 콜로니를 사용하는 필터 어레이를 이용할 때보다 마이크로어레이를 이용하여 반복작업을 보다 신속하게 수행할 수 있다는 점이다. 박테리아 내에서 클론을 증식시키고 분석하는 것은 수일까지 요구될 수 있다. 대조적으로, 후속 마이크로어레이를 프로빙하는 것은 어레이의 분석이 완료된 후 24시간 이내에 시작할 수 있다.
마이크로어레이의 다른 잇점은 형광 라벨링된 프로브를 사용할 수 있는 능력이다. 이는 혼성화 검출을 위한 비방사성 방법을 제공한다. 대조적으로, 필터 혼성화에서는 일반적으로 방사성 인 또는 황으로 라벨링된 프로브를 사용한다. 마이크로어레이는 다수 프로브들과 동시에 혼성화할 수 있다. 대조적으로, 필터 어레이는 단지 한번에 하나의 프로브와 혼성화할 수 있다.
마이크로어레이의 또다른 잇점은 그 반복재현성과 혼성화 시그널의 감도에 있다. 전형적으로, 필터 어레이에 비해 마이크로어레이 상에서 혼성화 시그널이 더 높고 감도가 더 크다. 이는 프로브의 복합성이 보다 높도록 허용하며, 또한 마이크로어레이 상의 포지티브 혼성화 시그널을 얻는다. 또한, 필터 어레이는 종종 프로브와 필터 상의 DNA 사이의 생산적인 혼성화와 관련되지 않은 가짜 배경 시그널을 나타낸다.
또한 다른 방법들에 비해 마이크로어레이에 기준한 삭감법에 의해 독특한 유전자 세트를 제작하는 잇점이 많다. 예를 들면, cDNA 표준화 또는 삭감 절차에서 사용되는 것과 같이 용액 중 선택적인 혼성화를 이용하는 방법에서는 대개 몇몇 낮은 풍부도 클론이 손실된다. 대조적으로, 반복적인 마이크로어레이에 기준한 삭감법을 사용하면, 라이브러리 내의 모든 클론을 확인할 수 있다. 낮은 풍부도 cDNA 클론은 다수의 반복적 혼성화 라운드 이후에 발견될 것이다. cDNA의 독특한 세트의 제조를 위한 마이크로어레이에 기준한 방법의 다른 잇점은 생성된 cDNA 클론이 전체 길이에 가깝게 되기 더 쉽다는 점이다. 대조적으로, 삭감 및 표준화를 위한 다른 방법에서는 종종 짧고 불완전한 cDNA를 농축시킨다.
어레이의 특정 위치에서 약한 시그널 또는 시그널이 전혀 없는 것은 일반적으로 프로브 풀 내에 나타난 서열들에 혼성화하지 않거나 또는 약하게 혼성화하는 DNA의 존재에 대응한다. 약한 시그널 또는 시그널이 전혀 없는 클론을 시퀀싱한다. 시퀀싱은 당업계에 잘 알려져 있는 DNA 시퀀싱 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들면, 문헌[Maxam 및 Gilbert, PROC NATL ACAD SCI USA74: 560-564 (1997); Sanger 등, PROC NATL ACAD SCI USA74: 5463-5467 (1977)] 및 본원에 참고로 인용한 미국 특허 제5,821,058호 참조).
겔 또는 모세관에서 단편들의 자동화 분석은 서열 정보를 수집하고 처리하는데 수반되는 노력을 상당히 감소시켰다 (예를 들면, 문헌[Prober 등, SCIENCE238: 336-341 (1987); Smith 등, NATURE321: 674-679 (1986); Luckey 등, NUCLEIC ACIDS RES18: 4417-4421 (1990); Dovichi, ELECTROPHORESIS18: 2393-2399 (1997)] 참조). 이 단계에서 단리되고 시퀀싱된 핵산 단편을 최초의 프로브 풀에 첨가한다. 종종, 이들 단편을 마이크로어레이 내의 풍부하지 않은 핵산 분자들의 존재를 측정하기 위해 먼저 시퀀싱한다. 이어서 그 서열을 기존에 확인된 핵산 분자의 공공 데이타베이스와 비교한다 (예를 들면, 공공적으로 이용가능한 데이타베이스 내의 서열들을 비교함으로써).
제2 삭감 프로브 풀을 라이브러리로부터 랜덤하게 선택된 클론의 다른 군으로부터 생성된 제2 마이크로어레이를 포함하는 다음 혼성화 라운드에서 사용한다. 새로 확인된 핵산 단편들을 삭감 프로브 풀에 첨가함으로써, 라이브러리로부터 랜덤하게 선택된 클론의 후속 마이크로어레이는 보다 많은 수의 라벨링된 프로브에 노출된다. 따라서, 본 발명의 방법은 공지 클론의 재시퀀싱을 제거한다.
연속적인 반복작업에서 라벨링된 프로브 수가 증가할수록, 라벨링된 "공지" 클론의 수는 증가할 것이며, 라벨링되지 않는 클론은 더 적어질 것이다. 궁극적으로, 충분히 반복작업함으로써, 모든 클론이 시퀀싱될 것이므로, 제시된 라이브러리로부터 랜덤하게 선택된 클론의 마이크로어레이 내의 모든 클론이 라벨링될 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 낮은 풍부도 mRNA를 농축시킨 클로닝 라이브러리가 생성된다. 이 방법을 확대하면, 저풍부도 서열은 낮은 풍부도 RNA에 대응하는 핵산을 함유하는 칩의 제작에서 사용된다. 이들 칩은 후속적인 실험 (예, 차등 디스플레이 실험)에서 사용할 수 있다. 신규 유전자의 발견을 위한 전략의 개요를 도 1에 예시한다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 오염 핵산을 클로닝 라이브러리로부터 제거한다.
다른 측면에서, 본 발명은 핵산 분자들의 샘플에서 과다 분자를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은 핵산 분자들의 이종 샘플을 제공하고, 상기 핵산 분자들의 샘플을 마이크로어레이에 고정시키는 것을 포함한다. 이어서, 기존에 어레이되거나 또는 시퀀싱된 핵산 분자들에 대응하는 1종 이상의 라벨링된 프로브를 고정된 샘플 중의 핵산 분자들에 혼성화시킨다. 바람직하게는, 상기 프로브는 핵산 분자들의 샘플 내에 존재하는 것으로 알려진 서열들을 포함한다. 본 방법은 또한 상기 라벨링된 프로브에 혼성화하는 적어도 하나의 고정된 분자를 확인하고, 고정된 핵산(들)을 특이적으로 인식하거나 샘플에 혼성화하는 제2 핵산 분자를 제공하는 것을 포함한다. 원하는 경우, 제2 핵산 분자를 라벨링하여 프로브 분자로서 사용할 수 있고, 상기 샘플을 새로 첨가된 프로브 분자를 포함하는 프로브 분자(들)과 재혼성화시킬 수 있다. 원하는 경우 상기 공정을 반복하여 핵산 분자들의 집단 내에서 이미 확인된 핵산 분자들을 점진적으로 제거할 수 있다.
본 발명에는 핵산 분자들의 이종 샘플을 제공하고, 상기 핵산 분자들의 샘플을 마이크로어레이 상에 고정시키고, 1종 이상의 라벨링된 프로브를 상기 샘플에 혼성화시킴으로써 핵산들의 집단에서 다수의 풍부하지 않은 서열들을 확인하는 방법이 또한 포함된다. 상기 라벨링된 프로브는 샘플 내의 하나 이상의 기존에 확인된 핵산 분자들에 대응한다. 상기 라벨링된 프로브에 약하게 혼성화하거나 또는 혼성화하지 않는 고정된 샘플 내의 적어도 하나의 고정된 핵산 분자를 확인한다. 원하는 경우, 상기 공정을 다수의 풍부하지 않은 서열들이 확인될 때까지 반복한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따라 확인된 서열 뿐만 아니라 상기 다수의 서열들을 포함하는 마이크로어레이를 포함한다.
본 발명은 당업자가 관심있는 서열들을 농축시키거나 또는 관심없는 서열들을 제거하기 원하는 모든 목적에 적합할 수 있다. 용도의 예는 다음의 용도를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
I.발현된 mRNA/cDNA 서열의 발견 속도를 증진시키고, 독특한 또는 낮은 풍부도의 트랜스크립트 (transcripts)에 대응하는 서열들의 세트의 제작을 용이하게 하기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법.
한 측면에서, 본 발명은 신규 유전자 발견을 증가시키고 발현된 cDNA로부터의 세트의 제작을 촉진시킨다. 이는
(a) 핵산 단편들의 랜덤 샘플을 (PCR 또는 핵산 단리 절차에 의해) 증폭시켜 제공하고;
(b) 상기 랜덤 핵산을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷 (format)으로 고정시키고;
(c) DNA원으로부터의 라벨링된 프로브를 상기 고정되고 마이크로어레이된 DNA 단편들에 혼성화시키고;
(d) 상기 라벨링된 프로브에 혼성화하는 DNA 단편을 검출하고, 혼성화하지 않거나 약하게 혼성화하는 적어도 하나의 단편을 확인하고 (즉, 삭감);
(e) DNA 시퀀싱, 혼성화 또는 다른 분석법에 의해 상기 DNA 단편의 정체를 결정하고;
(f) 추가의 서열을 확인하고 독특한 유전자 세트를 증가시키기 위해서, 상기 프로브 세트 내의 기존에 확인된 서열들을 사용하여 상기 단계 (b) 또는 (c) 내지 (e)를 반복함으로써 성취할 수 있다.
II.게놈 서열의 발견 속도를 증진시키고, 전체 게놈 또는 관심있는 하위구역에 대응하는 DNA 단편의 단리를 용이하게 하기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법.
게놈 서열의 경우, "최소로 겹치는" 클론, 즉, 겹치는 서열의 양이 가능한 한 적은 클론들의 세트를 제작하는 것이 원해질 수 있다. 따라서, 본 발명은 게놈 클론의 발견을 증가시키고, 풍부하지 않은 또는 최소로 겹치는 게놈 클론의 세트의 제작을 촉진시키며, 관심있는 유전자에 맵핑하는 클론의 발견을 증가시킨다. 본방법은 또한 게놈 내의 관심있는 구역 내의 게놈 클론의 세트의 제작을 촉진시킨다. 게놈 내의 관심있는 구역에 클론을 용이하게 맵핑시킬 수 있는 능력으로 인해 당업자는 또한 게놈 지도 내의 간극을 쉽게 채울 수 있고, 질병 유전자 맵핑과 질병 유전자 확인을 용이하게 할 수 있다.
본 방법은
(a) 게놈 핵산 단편들의 랜덤 샘플을 (PCR 또는 핵산 단리 절차에 의해) 증폭시켜 제공하고;
(b) 상기 랜덤 핵산을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
(c) DNA원으로부터의 라벨링된 프로브 (모아진 (pooled) 또는 단일)를 상기 고정되고 마이크로어레이된 DNA 단편들에 혼성화시키고 (상기 프로브는 cDNA/mRNA 또는 게놈 서열일 수 있다);
(d) 상기 라벨링된 프로브에 혼성화하는 DNA 단편을 검출하고;
(e) DNA 시퀀싱, 혼성화 또는 다른 분석법에 의해 상기 DNA 단편의 정체를 결정하고;
(f) 추가의 서열을 확인하고 독특한 유전자 세트를 증가시키기 위해서, 상기 프로브 세트 내의 기존에 확인된 서열들을 사용하여 상기 단계 (b) 또는 (c) 내지 (e)를 반복하는 것을 포함한다.
특히, 기존에 확인된 서열들의 단부 구역을 플랭킹 클론을 "워킹하고 (walk)" 확인하기 위해 프로브로서 사용할 수 있다.
III.다른 집단에 비교한 한 집단에 독특한 DNA 서열 (mRNA/cDNA, 게놈, 염색체외, 플라스미드 및 다른 모든)의 농축 및(또는) 단리를 위한 마이크로어레이에 기준한 방법.
본 발명의 다른 용도는 다른 것에 대해 한 유기체에 독특하거나 또는 신규한 서열 (발현된 cDNA 또는 게놈)의 확인을 위한 것이다. 이는 다른 균주에 비해 한 균주 (즉, 비병원성에 비해 병원성에)에 독특한 핵산의 확인 뿐만 아니라, 밀접하게 관련된 종들 및 보다 관련이 먼 종들로부터의 독특한 유전자 세트들의 비교를 포함한다.
하나 이상의 기원 유기체로부터의 핵산 분자들이 본 용도에서 사용되기 때문에 본 방법은 구체적인 단계가 다소 상이하며,
(a) 핵산 단편들의 랜덤 샘플을 (PCR 또는 핵산 단리 절차에 의해) 증폭시켜 제공하고;
(b) 상기 랜덤 핵산을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
(c) 제1 기원 및 제2 기원으로부터의 라벨링된 프로브를 상기 고정되고 마이크로어레이된 DNA 단편들에 혼성화시키고 (상기 프로브는 cDNA/mRNA 또는 게놈 서열일 수 있다);
(d) 상기 제1 기원으로부터의 라벨링된 프로브에 혼성화하지만 제2 기원으로부터의 프로브에는 혼성화하지 않거나 또는 그 역의 DNA 단편을 검출하고;
(e) DNA 시퀀싱, 혼성화 또는 다른 분석법에 의해 상기 DNA 단편의 정체를 결정하는 것을 포함한다.
IV.관련 (또는 보존적) DNA 서열 (mRNA/cDNA, 게놈, 염색체외, 플라스미드또는 다른 모든)의 발견을 증가시키기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법.
상기 방법의 역으로 상이한 박테리아 균주들 및 관련이 먼 유기체들을 포함한, 다양한 종들에서 관련 서열들 (차이 보다는)의 발견을 허용한다. 본 방법은
(a) 핵산 단편들의 랜덤 샘플을 (PCR 또는 핵산 단리 절차에 의해) 증폭시켜 제공하고;
(b) 상기 랜덤 핵산을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
(c) 라벨링된 프로브 (단일 또는 모아진)를 상기 고정되고 마이크로어레이된 DNA 단편들에 특히 감소된 혼성화 엄격도에서 혼성화시키고 (상기 프로브는 cDNA/mRNA 또는 게놈 서열일 수 있다);
(d) 상기 라벨링된 프로브에 (종종 보다 약한 시그널로) 혼성화하는 DNA 단편을 검출하고;
(e) DNA 시퀀싱, 혼성화 또는 다른 분석법에 의해 상기 DNA 단편의 정체를 결정하고;
(f) 얻어진 DNA 서열을 다른 이용가능한 DNA 서열에 비교하여 상동성을 보이지만 다른 공지 서열들과 동일하지는 않는 서열을 검출하는 것을 포함한다.
V.원치않는 서열의 제거 속도를 증진시키기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법.
본 발명은 또한 어레이된 DNA의 임의의 집단으로부터 원치않는 DNA 서열 (cDNA 또는 게놈)의 제거를 제공한다. 이는 오염 DNA 서열 뿐만 아니라 관심없는 모든 DNA, 예를 들면, 이미 확인된 것과 밀접하게 관련된 서열을 포함할 수 있다.본 방법은
(a) 핵산 단편들의 랜덤 샘플을 (PCR 또는 핵산 단리 절차에 의해) 증폭시켜 제공하고;
(b) 상기 랜덤 핵산을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
(c) 제거를 위해 표적화된 서열인 라벨링된 프로브를 상기 고정되고 마이크로어레이된 DNA 단편들에 혼성화시키고;
(d) 상기 라벨링된 프로브에 혼성화하는 DNA 단편을 검출하고, 혼성화하지 않거나 또는 약하게 혼성화하는 적어도 하나의 단편을 확인하고 (즉, 삭감);
(e) DNA 시퀀싱, 혼성화 또는 다른 분석법에 의해 상기 DNA 단편의 정체를 결정하고;
(f) 단편들의 집단으로부터 원치않는 서열들을 제거하기 위해서, 필요한 것으로 생각되면 프로브 세트 내의 기존에 확인된 서열들을 사용하여 상기 단계 (a), (b) 또는 (c) 내지 (e)를 반복하는 것을 포함한다.
VI.핵산의 상이한 기원들 사이에서 DNA 서열 (게놈, 염색체외, 플라스미드 및 다른 모든)의 카피수 (과소 또는 과다로 나타난)에서의 변화를 확인하기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법.
본 발명은 또한 핵산의 상이한 기원들 사이에서 DNA 서열 (게놈, 염색체외, 플라스미드 및 다른 모든)의 카피수 (과소 또는 과다로 나타난)에서의 변화를 확인하기 위한 마이크로어레이에 기준한 방법을 제공한다. 본 방법은
(a) 제시된 기원으로부터의 핵산 단편들의 랜덤 샘플을 (PCR 또는 핵산 단리절차에 의해) 증폭시켜 제공하고;
(b) 상기 랜덤 핵산을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
(c) 다른 기원으로부터의 라벨링된 프로브 (단일 또는 모아진; 임의의 유형의 핵산 - mRNA/cDNA, 게놈, 염색체외, 플라스미드 및 다른 모든 - 일반적으로 어레이된 핵산의 유형에 대응함)를 상기 고정되고 마이크로어레이된 DNA 단편들에 혼성화시키고;
(d) 상기 라벨링된 프로브에 혼성화하지 않는, 또는 유의하게 보다 적게 혼성화하는 또는 유의하게 보다 많이 혼성화하는 DNA 단편들을 검출하고 (시그널 강도에서의 이러한 변동은 풍부도에서의 변화를 반영할 것이다);
(e) DNA 시퀀싱, 혼성화 또는 다른 분석법에 의해 상기 DNA 단편(들)의 정체를 결정하는 것을 포함한다.
<실시예 1>
cDNA 마이크로어레이 제작
1.1 cDNA 증폭
cDNA 라이브러리를 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 생성하였다. cDNA 인서트를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 박테리아 클론으로부터 단리하였다. PCR 혼합물 25 ㎕를, 10×PCT 완충액 1000 ㎕, 2.5mM dNTPs 800 ㎕, T3 프라이머 (5 pmoles/㎕) 400 ㎕, T7 프라이머 (5 pmoles/㎕) 400 ㎕ 및 재조합 Taq 폴리머라제 10 ㎕를 함유하는 PCR 매스터 혼합물로부터 384 웰 마이크로티터 플레이트의 각웰에 첨가하였다. PCR 평판을 약 1 ㎕를 전달하는 384 핀 툴을 사용하여 철야 배양판으로부터 접종하였다. 평판을 MicrosealA로 밀봉하여 MJ 리서치 테트라드 (MJ Research tetrad) PCR 기기의 알파 유닛에 넣었다. 반응액을 95℃에서 4분간 예열시킨 후 35회의 증폭 사이클: 95℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2.5분으로 반응시켰다.
cDNA 인서트의 증폭은 각 PCR 반응액 2 ㎕를 500 ng/㎕ 에티듐 브로마이드를 함유하는 1% 아가로스 겔 상에 로딩시킨 아가로스 겔 전기영동으로 입증하였다. 분자량 표준품 (1 Kb 래더(ladder), 프로메가 (Promega)) 500 ng을 크기 측정과 증폭의 정량을 위해 각 겔에 첨가하였다. 샘플을 1×TAE (트리스 아세테이트, EDTA) 중에서 150 ㎃에서 30분 동안 전기영동시켰다.
증폭된 cDNA 인서트를 384 웰 유리 섬유 필터판에서 혼입되지 않은 뉴클레오티드와 프라이머로부터 다음과 같이 정제하였다: 5M 구아니디늄 이소티오시아네이트 (시그마 (Sigma)) 70 ㎕을 96 핀 사이클론 (Cyclone) 액체 핸들러를 이용하여 각 평판에 첨가하였다; PCR 반응액 25 ㎕를 PCR 마이크로티터 플레이트로부터 유리 섬유 필터판에 옮기고 실온에서 2분간 인큐베이션시켰다. 필터판을 진공 배분장치 상에 놓고 건조시켰다. 필터판을 80% 이소프로판올 70 ㎕로 2회 세척하고 진공 배분장치 상에서 2분 동안 건조시켰다. 정제된 PCR 생성물을, 물 50 ㎕을 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리함으로써 유리 섬유판으로부터 384 웰 수집판으로 용출시켰다. 정제된 PCR 생성물을 스피드-백 (speed-vac)에서 하이(on high)로 45분 내지 1시간 동안 동결건조시켰다. 정제된생성물을 50% DMSO/물 30 ㎕에 재현탁시켰다.
1.2 샘플의 고정
최대 4,608개의 상이한 PCR 단편들을 아메르샴 (Amersham)/몰레큘라 다이나믹스의 Generation III (Gen III) 마이크로어레이 스폿터를 사용하여 유리 슬라이드 상에 2조로 스폿팅하였다. 12개의 384 웰 U 바닥 마이크로티터 플레이트를 Gen III 스폿터의 호텔(hotel)에 넣었다. 36개 이하의 유리 슬라이드를 스폿터 상에 놓고, 스폿팅실의 스폿팅 습도를 55%로 유지하면서 DNA를 스폿팅하였다. 기원 평판 액세스 (access) 당 6개의 슬라이드를 스폿팅하였다. 다음 PCR 템플레이트 세트를 액세스하기 이전에, 12 펜(pen) 카셋트를 다음과 같이 세척하였다: 0.2M KOH 중에서 1초, 95% 에탄올 중에서 1초 및 증류수 중에서 2초. 스폿팅한 후, 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 공기 건조시켰다. PCR 단편들을 스트라타링커 (Stratalinker) (스트라타젠 (Stratagene))에서 5000 줄(joules)에서 UV 가교결합시킴으로써 유리에 가교결합시켰다.
<실시예 2>
프로브 합성
서열이 입증된 클론에 대한 cDNA 인서트를 96 웰 PCR 평판에서, PCR 반응액의 부피가 50 ㎕인 것을 제외하고는 384 웰 평판에 대해 앞서 설명한 바와 같이 증폭시켰다. 증폭은 앞서 설명한 바와 같이 아가로스 겔 전기영동으로 입증하였다. PCR 단편들을 96 웰 탄소 섬유 필터판과 DNA 결합 수지를 사용하여 다음과 같이 정제하였다: 위자드 (Wizard) PCR 정제 수지 (프로메가) 100 ㎕를 12 채널 피펫을 이용하여 96 웰 필터판의 각 웰에 첨가하였다; PCR 반응액 50 ㎕를 수지에 첨가하고 실온에서 1분 동안 인큐베이션시켰다; 이어서 평판을 진공 배분장치 상에 1분 동안 건조될 때까지 놓았다. 각 평판을 80% 이소프로판올 200 ㎕로 가볍게 세척한 후 용액을 진공 배분장치에 의해 제거하고, 필터판을 진공에서 잘 건조시켰다. 정제된 PCR 생성물을 멸균 증류수 50 ㎕을 첨가한 후 3000 rpm에서 5분 동안 96 웰 마이크로티터 플레이트 내로 원심분리함으로써 용출시켰다. 정제된 PCR 반응액을 모으고 모아진 PCR 반응물 100 ㎍을 키아겔(Qiagen) PCR 정제 칼럼 상에서 정제하였다. 재정제시킨 PCR 풀을 앞서 설명한 바와 같이 겔 전기영동으로 입증하였다. 모아진 PCR의 농도를 분광학적으로 결정하여, 멸균 증류수를 사용하여 농도를 100 ng/㎕로 조정하였다.
정제된 PCR 단편 풀을 시험관내 전사 반응에서 RNA 합성을 위한 템플레이트로 사용하였다. 정제된 PCR 반응물 (500 ng)을 1×전사 완충액, 0.5mM의 각각의 rNTP, 37mM DTT, 및 10 유닛의 T7 또는 T3 RNA 폴리머라제를 함유하는 반응액 20 ㎕에 첨가하였다. 반응액을 37℃에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 1 유닛의 RQ1 DNase를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 DNA 템플레이트를 제거하였다. RNA 이지(Easy) 칼럼 (키아겐) 상에서 정제함으로써 혼입되지 않은 뉴클레오티드를 제거하였다.
시험관내 합성된 RNA 템플레이트로부터 제1쇄 라벨링 반응으로 다음과 같이 형광 프로브를 합성하였다: RNA 템플레이트 100 ng을 랜덤 헥사머 0.5 ㎍과 함께 10 ㎕의 최종 부피로 10분 동안 70℃에서 인큐베이션시켰다. 반응물을 얼음 상에서 5분 동안 냉각시킨 후, 1× 역전사 완충액 (20mM 트리스 pH 8.4, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2), 10mM DTT, 100μM dGTP, dTTP, dATP, 50μM dCTP, 50μM Cye3 dCTP 또는 cye5 dCTP, 및 200 유닛의 슈퍼스크립트 (Superscript) II 역전사효소 (깁코 (Gibco) BRL, #18089-011)을 함유하는 반응 혼합물을 첨가하였다. 반응물을 42℃에서 90분 동안 인큐베이션시켰다. 5M NaOH 1 ㎕을 첨가하고 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켜 RNA 템플레이트를 가수분해시켰다. 2M MOPS (유리산) 10 ㎕을 첨가하여 NaOH를 중화시켰다. GFX 칼럼 (파마시아 (Pharmacia)) 상에서 정제하여 혼입되지 않은 뉴클레오티드 및 프라이머를 제거하였다. 프로브를 동결건조시키고, 50% 포름아미드, 5×SSC, 0.2% SDS, 1× 덴하르트액 (Denhardt's), 100 ㎍/㎖ 연어 정액 DNA 및 1 ㎍ 올리고-dA(80)을 함유하는 혼성화 완충액 30 ㎕에 재현탁시켰다.
<실시예 3>
신규 유전자의 확인
신규 유전자를 확인하기 위한 절차를 도 2에 예시하였다.
3.1 혼성화
프로브를 100℃에서 10분 동안 변성시키고 마이크로어레이 슬라이드에 첨가하였다. 슬라이드를 유리 커버 슬립 (코닝 (Corning))으로 덮고 18 내지 24시간 동안 42℃에서 가습실에서 인큐베이션하였다. 혼성화된 슬라이드를 실온에서 10분 동안 0.1% SDS를 함유하는 2×SSC로 2회 세척한 후, 42℃에서 10분 동안 0.1% SDS를 함유하는 0.1×SSC로 2회 세척하였다. 슬라이드를 증류수에 수회 담그고 여과시킨 고압 공기 하에 건조시켰다. 형광 프로브의 혼성화는 슬라이드를 Generation III (Gen III) 공초점 스캐너 (아메르샴/몰레큘라 다이나믹스)에서 스캐닝함으로써 검출하였다.
3.2 데이타 획득
슬라이드 화상을 어레이비젼 화상 분석 소프트웨어 (이미징 리서치 (Imaging Research))를 사용하여 스폿 발견 분석, 국소화 배경 결정, 스폿 내의 시그널 강도의 분포, 및 신호 대 잡음비에 대해 분석하였다. 데이타를 탭-범위한정 (tab-delimited) 파일로서 오라클 (Oracle) 데이타베이스에 송출하였다. 표준화 및 통계학적 품질 평가는 데이타 분석 툴의 웹 (Web)-기준 세트를 사용하여 수행하였고, 데이타를 획스트-아리아드 제노믹스 센터 (Hoechst-Ariad Genomics Center)에서 개발된 웹 브라우저 툴을 사용하여 분석하였다. 데이타를 신호 대 잡음비를 기준으로 소팅하고(sorted), 배경보다는 높지만 역치 신호 대 잡음비보다는 낮은 시그널을 갖는 DNA를 EST 시퀀싱에 의해 더욱 특성화하였다.
3.3 시퀀싱 및 공지 라이브러리에의 비교
단계 3.1에서 혼성화하지 않은 클론들을 당업계에 잘 알려져 있는 기술을 이용하여 EST (발현 서열 태그) 시퀀싱을 위해 표적화하였다 [Adams 등, SCIENCE252: 1651-1656 (1991)]. 서열들을 공공 dbEST, 마우스 EST 및 Lifeseq (인사이트 (Incyte)) 데이타베이스에 대해 탐색하였다. 기존의 공지된 서열로서 새로 특성화되거나 확인된 모든 클론을 프로브 (삭감) 풀에 첨가하여, 후속적인 혼성화동안 동일한 유전자의 중복 확인을 방지하였다.
3.4 반복적인 삭감식 혼성화
랜덤하게 집어진 클론들을 함유하는 다음 마이크로어레이를, 기존의 모든 클론들을 포함하고 또한 EST 시퀀싱으로부터 확인된 임의의 새로운 클론들을 함유하는 새로운 프로브에 혼성화시켰다. 이 방법으로부터 확인된 클론을, 다른 기원 (예, 공공 데이타베이스)으로부터 기존에 확인된 클론들 뿐만 아니라 기존에 설명되지 않은 신규 클론들을 함유하는 독특한 유전자 세트를 제작하기 위해 사용하였다 [Ermolaeva 등, NAT. GENET.20: 19-23 (1998)].
<실시예 4>
낮은 풍부도 mRNA의 선별
cDNA 라이브러리로부터 랜덤하게 집어진 1500개의 상이한 cDNA를 함유하는 마이크로어레이를 제작하는 데에 반복 기준의 삭감식 프로토콜을 사용하였다. 제1 마이크로어레이를 64 하우스키핑(housekeeping) 및 리보좀 유전자를 코딩하는 삭감 프로브와 혼성화시켰다. 하이브리드를 형성하지 않은 클론들을 EST 시퀀싱에 의해 분석하였다. 앞서의 삭감 프로브에 존재하지 않는 임의의 클론들을 존재하는 삭감 프로브에 첨가하여, 랜덤하게 집어진 cDNA 클론들을 함유하는 다음 마이크로어레이에 혼성화시켰다. 이 절차를 17회 반복하여 총 26,112개의 cDNA를 마이크로어레이시켰다. 혼성화 데이타를 기준으로, 단지 7,700개의 클론만을 EST 시퀀싱을 위해 선택하였다. 클러스터링시킨 후, 4,400개의 상이한 cDNA 클론들을 확인하였다. 이러한 클론들의 군은 낮은 풍부도의 트랜스크립트에 대해 고도로 농축되었다. 부가적으로, 과잉의 높은 풍부도의 메신저 RNA를 제거함으로써, 마이크로어레이에 기준한 삭감법은 EST 시퀀싱 노력을 70% 감소시켰다.
<실시예 5>
독특한 또는 낮은 풍부도의 메시지를 확인하기 위한 칩의 제작, 차등 디스플레이에서의 사용
마우스 칼바리아 내에 낮은 카피수를 존재하는 메신저 RNA를 확인하기 위한 칩을 도 3에 개략한 절차에 따라 제작하였다. 표준화 마우스 칼바리아 라이브러리로부터 27,648개의 클론의 어레이들을 생성하였다. 27,648개의 클론을 모두 PCR 증폭시켜 18개 마이크로어레이로 배열하였다. 삭감식 혼성화 (상기 개략한 바와 같은)의 결과로서, 18 라운드의 혼성화 이후 7,790개의 cDNA를 시퀀싱하였다. 이들 서열을 공지 서열들을 함유하는 데이타베이스에 비교하여, 4,608개의 클론들을 증폭과 마이크로어레이 상으로의 배치를 위해 선택하였다. 이어서 이 칩을 차등 유전자 발현 실험에서 BMP2 (뼈 형태형성 단백질 2)에 의해 조절되는 유전자를 확인하기 위해 사용하였다.
<실시예 6>
라이브러리 오염의 제거
본 발명에 의해 기술한 바와 같은 삭감식 혼성화 프로토콜을 클로닝 라이브러리로부터 고도로 풍부한 유전자의 오염을 제거하는데에서 증명하였다. 도 4에 도시한 바와 같이, 최초의 라이브러리는 35%의 미토콘드리아 유전자로 오염되었다. 9 라운드의 삭감식 혼성화 이후, 이 양은 2 내지 3%로 감소되었다. 이는 핵산들의 출발 집단으로부터 고도로 풍부한 서열을 제거하는데 있어서 본 발명의 유용성을증명한다.
동등물
본 발명의 구체적인 실시태양의 상기한 상세한 설명으로부터, 유전자 단리의 독특한 방법이 설명되는 것은 명백할 것이다. 특정 실시태양을 본원에서 상세히 개시하였지만, 이는 단지 예시의 목적을 위한 예로써 행해진 것이며, 이하의 청구의 범위에 관하여 제한하는 것을 의도하지 않는다. 특히, 청구의 범위에 규정된 바와 같은 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명에 대해 각종 치환, 변화 및 변경을 할 수 있음이 예상된다. 예를 들면, 핵산의 특정한 기원, 특정 라벨, 또는 특정 프로브 풀의 선택은 본원에 기술한 실시태양의 지식에서 당업계의 통상의 숙련자에게 일상적인 문제인 것으로 믿어진다.

Claims (26)

  1. (a) 핵산 분자들의 이종 샘플을 제공하고;
    (b) 상기 핵산 분자들의 샘플을 제1 마이크로어레이 상에 고정시키고;
    (c) 상기 샘플에, 상기 핵산 분자들의 샘플 내에 존재하는 것으로 알려지거나 또는 존재가 의심되는 서열에 대응하는 1종 이상의 라벨링된 프로브를 혼성화시키고;
    (d) 상기 라벨링된 프로브에 약하게 혼성화하거나 또는 혼성화하지 않는 적어도 하나의 고정된 분자를 확인하고;
    (e) 상기 단계 (d)의 핵산 분자를 특이적으로 인식하는 프로브를 제공하고;
    (f) 임의로, 단계 (e)의 프로브를 포함하는 라벨링된 프로브를 사용하여 단계 (b) 내지 (d) 또는 단계 (b) 내지 (e)를 반복하여 상기 핵산 분자들의 샘플에서 과다 분자 (redundancy)를 감소시키는 것을 포함하는, 핵산 분자들의 샘플에서 과다 분자를 감소시키기 위한 방법.
  2. (a) 핵산 분자들의 이종 샘플을 제공하고;
    (b) 상기 핵산 분자들의 이종 샘플을 마이크로어레이 상에 고정시키고;
    (c) 기존에 어레이되거나 또는 시퀀싱된 핵산 분자들에 대응하는 1종 이상의 라벨링된 프로브를 혼성화시키고;
    (d) 상기 라벨링된 프로브에 약하게 혼성화하거나 또는 혼성화하지 않는 상기 샘플 내의 적어도 하나의 고정된 핵산 분자를 확인하고;
    (e) 상기 단계 (d)에서 확인된 핵산 분자를 시퀀싱하여 상기 집단 내에 낮은 카피수로 존재하는 서열을 확인하는 것을 포함하는, 핵산 분자들의 집단에서 풍부하지 않은 (non-redundant) 서열을 확인하기 위한 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자들의 샘플이 DNA를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 DNA가 cDNA인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 DNA가 게놈 DNA인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 DNA가 라이브러리로부터의 클론인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 DNA가 라이브러리로부터의 클론인 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자들의 샘플이 RNA를 포함하는 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 샘플 내의 핵산 분자가 증폭되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증폭이 PCR 증폭인 방법.
  11. 제2항에 있어서, 상기 라벨이 형광 라벨, 발광 라벨 및 방사성 라벨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  12. (a) 핵산 분자들의 이종 샘플을 제공하고;
    (b) 상기 핵산 분자들의 샘플을 마이크로어레이 상에 고정시키고;
    (c) 상기 샘플에 1종 이상의 라벨링된 프로브를 혼성화시키고;
    (d) 상기 라벨링된 프로브에 약하게 혼성화하거나 또는 혼성화하지 않는 상기 샘플 내의 적어도 하나의 고정된 핵산 분자를 확인하고;
    (e) 단계 (a) 내지 (d) 또는 단계 (b) 내지 (d)를 반복하여 상기 집단 내에서 다수의 풍부하지 않은 핵산 분자들을 확인하는 것을 포함하는, 핵산들의 집단에서 다수의 풍부하지 않은 서열을 확인하기 위한 방법.
  13. 제12항에 따른 방법으로 확인된 다수의 서열.
  14. 제13항에 따른 다수의 서열을 포함하는 마이크로어레이.
  15. (a) 핵산 분자들의 이종 샘플을 증폭시키고;
    (b) 상기 핵산들의 샘플을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷 (format)으로 고정시키고;
    (c) DNA원으로부터의 라벨링된 프로브를 상기 고정된 핵산 분자에 혼성화시키고;
    (d) 상기 라벨링된 프로브에 약하게 혼성화하거나 또는 혼성화하지 않는 상기 샘플 내의 적어도 하나의 고정된 핵산 분자를 확인하고;
    (e) 상기 단계 (d)에서 확인된 분자의 서열을 결정하며;
    (f) 상기 단계 (b) 또는 (c) 내지 (e)를 반복하여 핵산 서열들의 이종 샘플 내에서 다중의 풍부하지 않은 서열을 확인하는 것을 포함하는, 핵산 서열들의 랜덤 샘플에서 다중의 풍부하지 않은 서열을 확인하기 위한 방법.
  16. (a) 전체 게놈 또는 관심있는 하위구역으로부터의 게놈 핵산 분자들의 이종 샘플을 증폭시키고;
    (b) 상기 증폭된 핵산 분자들을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
    (c) DNA원으로부터의 라벨링된 프로브를 상기 고정되고 마이크로어레이된 핵산 분자에 혼성화시키고;
    (d) 상기 라벨링된 프로브에 혼성화하는 DNA 핵산 분자를 검출하고;
    (e) 상기 단계 (d)에서 확인된 분자의 서열을 결정하며;
    (f) 상기 단계 (b) 또는 (c) 내지 (e)를 반복하여 전체 게놈 또는 관심있는 하위구역에 대응하는 다중 핵산 분자를 확인하는 것을 포함하는, 전체 게놈 또는 관심있는 하위구역에 대응하는 다중 핵산 분자를 확인하기 위한 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 라벨링된 프로브가 모아진 (pooled) 라벨링된 프로브 또는 단일 라벨링된 프로브인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 라벨링된 프로브가 cDNA/mRNA 또는 게놈 서열인 방법.
  19. (a) 핵산 분자들의 이종 샘플을 증폭시켜 제공하고;
    (b) 상기 핵산 분자들을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
    (c) 핵산 분자들의 제1 집단으로부터의 라벨링된 프로브 및 핵산 분자들의 제2 집단으로부터의 라벨링된 프로브를 상기 고정된 핵산 분자에 혼성화시키고;
    (d) 상기 제1 기원 또는 상기 제2 기원으로부터의 라벨링된 프로브에 혼성화하는 핵산 분자를 검출하며;
    (e) 상기 단계 (d)에서 검출된 DNA 분자의 서열을 결정하여 상기 제1 집단 및 제2 집단 내에 상이한 양으로 존재하는 핵산을 확인하는 것을 포함하는, 핵산 분자들의 제1 집단 및 제2 집단 내에 상이한 양으로 존재하는 핵산 서열을 확인하기 위한 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 핵산 분자들의 이종 샘플이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭되는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 라벨링된 프로브가 cDNA/mRNA 또는 게놈 서열인 방법.
  22. (a) 핵산 분자들의 이종 샘플을 증폭시키고;
    (b) 상기 핵산들의 증폭된 샘플을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
    (c) 라벨링된 프로브를 상기 고정된 분자에 혼성화시키고;
    (d) 상기 라벨링된 프로브에 약하게 혼성화하는 고정된 분자를 검출하고;
    (e) 상기 단계 (d)의 고정된 분자의 서열을 결정하고;
    (f) 상기 고정된 샘플의 서열을 서열 데이타베이스 내의 하나 이상의 서열에 비교하며;
    (g) 상기 분자가 상기 하나 이상의 데이타베이스 서열과 동일한지 여부를 결정하는 것을 포함하는 (여기서, 상기 데이타베이스 내의 서열과 상동성을 보이지만 동일하지는 않은 상기 단계 (e)의 고정된 분자는 공지 핵산 서열과 관련된 핵산 서열임), 공지 핵산 서열과 관련된 핵산 서열을 발견하기 위한 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 라벨링된 프로브가 cDNA/mRNA 또는 게놈 서열인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 라벨링된 프로브가 모아진 라벨링된 프로브 또는 단일 라벨링된 프로브인 방법.
  25. (a) 핵산 분자들의 이종 샘플을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
    (b) 라벨링된 프로브를 상기 고정된 핵산 분자에 혼성화시키며 (여기서, 상기 라벨링된 프로브는 상기 샘플로부터 제거하기 원하는 서열을 포함한다);
    (c) 상기 프로브에 약하게 혼성화하거나 또는 혼성화하지 않는 적어도 하나의 분자를 확인하고;
    (d) 상기 단계 (c)의 분자의 서열을 결정하며;
    (e) 상기 단계 (a) 또는 (b) 내지 (d)를 반복하여 분자들의 집단으로부터 원치않는 서열을 제거하는 것을 포함하는, 핵산 분자들의 샘플로부터 원치않는 서열을 제거하기 위한 방법.
  26. (a) 이종 핵산 분자들의 샘플을 고체 표면 상에 마이크로어레이 포맷으로 고정시키고;
    (b) 제1 및 제2 집단으로부터의 라벨링된 프로브를 상기 고정된 핵산 분자에 혼성화시키고;
    (c) 상기 제2 집단으로부터의 라벨링된 프로브에 비해 상기 제1 집단으로부터의 라벨링된 프로브에 혼성화하지 않거나, 또는 유의하게 보다 적게 혼성화하거나, 또는 유의하게 보다 많이 혼성화하는 핵산 분자를 검출하며;
    (d) 상기 단계 (c)에서 확인된 분자의 서열을 결정하여 핵산들의 상이한 기원들 사이에서 DNA 서열의 카피수의 차이를 확인하는 것을 포함하는, 제1 핵산 집단 및 제2 핵산 집단 사이의 DNA 서열의 카피수의 변화를 확인하기 위한 방법.
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