KR20020034078A - 신규한 세포 조절 인자 ｔｔｏ 20 - Google Patents

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KR20020034078A
KR20020034078A KR1020017013963A KR20017013963A KR20020034078A KR 20020034078 A KR20020034078 A KR 20020034078A KR 1020017013963 A KR1020017013963 A KR 1020017013963A KR 20017013963 A KR20017013963 A KR 20017013963A KR 20020034078 A KR20020034078 A KR 20020034078A
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콜러클라우스-페터
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로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트
아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 세포 조절 인자 TTO 20, 이를 암호화하는 DNA, 이의 제조 방법 및 용도, TTO 20에 결합하는 항체, 및 염증 질환, 특히 류마티스성 관절염을 검출하기 위한 진단 키트에서 TTO 20을 암호화하는 DNA 및 TTO 20에 결합하는 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 세포 조절 인자 ＴＴＯ 20 {Novel cellular regulation factor TTO 20}
본 발명은 세포 조절 인자 TTO 20 및 이의 DNA, 이의 제조 방법 및 TTO 20 활성에 대한 조절 인자(modulator)를 발견하고자 하는 스크리닝 목적을 위한 용도에 관한 것이다.
서론
인터류킨-1(IL-1)의 수 많은 생물학적 효과는 결합 조직으로부터의 수 많은 유형의 세포의 대사작용에서 IL-1의 작용을 포함한다. 이러한 유형의 세포의 한 가지 예는 관절 연골세포이다. IL-1은 연골세포에 의한 프로테오글리칸(PG)의 합성을 억제하며 세포외 간질의 분자들을 분해시킬 수 있는 프로스타글란딘 E2및 메탈로프로테이나제의 생산을 촉진시킨다.
실험적 결과들, 및 염증-변형된 관절부에서 IL-1, PG 단편들 및 단백질가수분해 효소들의 발견에 근거하여, IL-1이 골관절증 및 류마티스성 관절염에서의 연골 분해에 어느정도 역할을 한다는 것을 결론지을 수 있다[Beuton HP & Tyler JA, 1988, Biochem. Biophys. Res. Comm. 154, 421-428; Aydelotte MB et al. Comm.Tiss. Res. 28, 143-159, Wood DD et al., Arthritis Rheum. 26, 975-983; Lohmander LS et al., Trans. Orthop. Res. Soc. 17, 273]. 간질 메탈로프로테이나제는 상기 효소들과 상호작용하는 활성 화합물을 사용한 치료를 위한 출발점의 잠정적인 후보이지만, 지금까지는 연골 분해를 초래하는 복잡한 과정에서 초기 단계와 관련된 어떠한 실질적인 분자적 출발점도 확인된 바 없다. 이러한 이유로 인해, 다양한 접근법이 골관절증 및 류마티스성 관절염의 의학적 치료를 위한 이러한유형의 분자적 출발점을 수득하기 위해서 시도되어져 왔다.
상기 접근법은 문헌[유럽 특허원 EP 제0 705 842 A2호]에 기술되어져 있다. 연구 과제는 사람의 골연골증성 연골의 관절 연골세포에서 RNA 수준에서 IL-1β-유도된 연골 분해를 의학적으로 치료하기 위한 잠정적인 분자적 출발점을 수득하는 것이 가능한 것인지에 맞추어졌다.
이러한 목적을 위해서, 병에 걸린 연골에서 상이하게 발현되는 유전자를 확인한다. IL-1β 자극된 사람 연골세포 및 자극되지 않은 사람 연골세포로부터의 전체 RNA를 역전사 및 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 mRNA 차동 디스플레이(DDRT-PCR)시킨다. 이러한 방법은 두 개의 세포 집단에서 상이하게 발현되는 유전자를 확인하고 분리하는데 사용할 수 있다[Liang P & Gardee AB 1992, Science 257, 967-971; Liang P et al., AB 1993, Nucl. Acids Res. 21, 3269-3275; Bauer D et al. 1993, Nucl. Acids Res. 21, 4272-4280]. 이러한 기술의 주요 요소는 한 세트의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한다는 것인데, 이중 하나는 mRNA의 폴리아데닐화된 꼬리에 결합하는 한편, 다른 하나는 mRNA의 다양한 다른 부위에 결합하는 랜덤 데카머(decamer)이다. 특정 세트의 프라이머에 의해 정의되는 상기 mRNA 아집단을 역전사 후에 증폭시키고 DNA 서열분석 겔 상에서 분리시킨다. 연구된 각각의 세포주 중 하나의 특성인 밴드 패턴이 나타난다. 따라서, 예를 들면, 100개의 상이한 프라이머 조합은 10000개의 상이한 PCR 생성물을 제공하게 되며, 이는 전체 세포주내에서 발현되는 유전자의 대략 반 이상을 나타낸다. 두 개의 상이한 세포주의 밴드 패턴 비교는 상이하게 발현된 유전자에 상응하는 밴드를 암시한다. 이러한 정보에 기초하여, 이제 겔로부터 상이하게 발현된 유전자 생성물의 밴드를 추출하고, 재증폭시키고 서브클로닝하여 서열 분석하는 것이 가능해진다.
그러나, 이러한 방법은 수 많은 문제점을 갖고 있다:
1. DDRT-PCR의 높은 민감도의 결과로서, 약한 인위적인 밴드들이 형성될 수 있다.
2. 복잡한 유전자 발현 패턴의 분석이 어렵다.
3. 극소량의 RNA 만이 출발 물질로서 유용하다.
이러한 문제점들은 수득된 결과에서 불명확함을 야기시킨다.
문헌[유럽 특허원 EP 제0 705 842 A2호]에서, 상기 기술된 방식으로 확인된 수 많은 짧은 DNA 서열이 기술되어져 있다. 서열 분석 결과, 이들 중 일부는 이미 공지된 유전자의 서열과 완전히 동일하거나 매우 높은 동일성을 갖는 것으로 나타난다: 즉, 사람 오스테오폰틴과 100% 동일성을 갖는 cDNA 단편, 사람 칼넥신과 97.2%의 동일성을 갖는 다른 cDNA 단편, 및 사람 TNF-자극된 유전자 6(TSG-6)과99.5%의 동일성을 갖는 추가의 단편이 확인되었다. 그러나, 확인된 대부분의 단편들은 이들을 특성화하는 서열의 관점에서 어떠한 공지된 유전자에도 배치시킬 수 없었다. 이러한 그룹의 cDNA 단편들은 또한 400bp-길이의 클론 TTO 20/2(2)를 포함하며, 이중 DNA 서열 152bp는 해독되었다.
본 발명의 내용에서, 클론 TTO 20/2를 보다 면밀히 연구하였다. 소위 안티센스 실험은 상응하는 유전자 또는 유전자 생성물의 기능적인 중요성을 조사하는 한 가지 방법이다.
연골 분화에 대한 모델 세포로서 간주되는 사람 연골육종 세포에서 안티센스 RNA의 발현은 TTO 20/2의 역할에 대한 암시를 제공한다. 안티센스 접근법은 TTO 20에 대한 안티센스 mRNA를 발현하는 벡터를 사용하여 배양된 세포를 형질전환시키는데 기초하지만, 동시에, 또한 표지 단백질의 활성은 안티센스 RNA가 형성되는지를 나타낸다. 이러한 유형의 벡터는 비시스트론성 또는 디시스트론성 벡터로서 불린다. 본 발명의 작제물을 위한 출발 벡터는 pED4이며, 이의 작제는 문헌[Kaufmann et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19, 4485-4490]에 기술되어져 있다.
안티센스 기술에서, 기능성 단백질의 형성은 단백질을 암호화하는 mRNA(센스 RNA)에 결합하는 상보적인 RNA(안티센스 RNA)의 발현을 통해 제한되거나 방해된다. 특히, 본 발명의 실시예에서 입증되는 바와 같이, 안티센스 RNA는 표적 단백질의 형성을 방해하기 위해서 암호화 mRNA의 아영역 및 3' 또는 5' 비해독 영역에 대해서 사용될 수 있다. 따라서, 벡터의 도움으로, 어떠한 정의된 개방 판독 프레임도갖지 않는 EST 단편을 사용하여 관련된 유전자에 의해 최종적으로 암호화되는 단백질의 작용에 영향을 줄 수 있으며, 즉 "안티센스-발현된" EST는 암호화 센스 mRNA의 판독을 차단하거나 감소시킬 수 있다. 이러한 방식으로 차단되는 표적 단백질을 합성하는 것이 세포에서 중요한 역할을 수행하는 경우, 이는 세포 분열, 세포 성장, 조절되고 발현되는 단백질의 합성 등에 직접적인 또는 간접적인 효과를 갖는다. 안티센스 발현이 예를 들면, 시그날 연쇄증폭반응에서 역할을 수행하는 인자의 형성을 방해하는 경우, 시그날 연쇄증폭반응은 교란된다.
상기 인자가 전사 인자인 경우, 수 많은 유전자의 발현이 교란된다. 이는 예를 들면, 분비된 단백질, 특히 프로테아제의 변형된 발현에 기인할 수 있는 형태학적으로 가시적인 변화로부터 인식될 수 있다.
이러한 방식으로 확인된 유전자 또는 이의 생성물을 약제학적 활성 물질의 탐색을 위한 치료학적 표적으로서 사용할 수 있다. 마찬가지로, 이러한 방식으로 형질전환된 세포를 안티센스 RNA의 작용을 차단하기 위해 시도되는 스크리닝 시스템에서 사용할 수 있다.
DNA 칩 기술은 상기 변화의 직접적인 분석을 가능하게 하며, 즉 형질전환된 세포의 전사체 프로필을 형질전환되지 않거나 가짜-형질전환된 세포와 비교한다. 이후 상기 비교는 어떠한 EST가 임상학적 상황의 관점에서 결정적인 역할을 수행하며 결과적으로 스크리닝 표적으로서 적합한지를 결정하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 벡터의 사용은 신규한 표적의 발견 및 신규한 약제의 프로필화에 또한 적합하다. 이러한 벡터는 특히, 표적 입증을 위한 HTS 시스템의 합성에 적합하다. 적절하게는, EST 클론을 이를 위한 96-웰 미세적정 플레이트 같은 HTS 형태에서 배양시키며, 삽입 DNA는 예를 들면, 기술된 pED4 유도체 중 하나에서 3' 측면에서 PST 절단 부위 및 5' 측면에서 EcoRI 절단 부위를 생성시키는 적합한 PCR 프라이머를 사용하는 PCR을 사용하여 증폭시킨다. 제2 단계에서, 이러한 방식으로 생성된 PCR 단편들을 PstI 및 EcoRI을 사용하여 절단시키고 디시스트론성 EGFP 벡터를 상기 벡터에 결합시킨다. 이때, 스크리닝 형태는 유지된다. 결합된 벡터는 CaPO4, Fugene 6(제조원: Boehringer, Mannheim), 리포펙타민(제조원: Life Technologies, Eggenstein) 또는 다른 적합한 형질감염 제제를 갖는 시판중인 피펫팅 로봇을 사용하여 이미 준비된 진핵세포내로 피펫팅하고 상기 세포를 통상적인 방법에 따라서 형질전환시킨다. 이때도 또한, 스크리닝 형태는 유지된다. 세포를 통상적인 방법에 따라서 CO2의 존재하에서 배양하고, 24 내지 72시간 후 형광스캐너내에서 자동화된 조건하에서 형광 방출에 대해서 시험한다. 이후, 형질전환된 형광성 세포를 가진 웰을 PstI-EcoRI 삽입물을 갖지 않은 벡터로 형질감염시킨 형질전환된 대조군 세포와 비교하여, 세포 성장 및 세포 형태의 변화 등에 대해서 평가한다. 이러한 유형의 변화가 일어나는 경우, 이는 발현된 안티센스 RNA의 중요한 작용을 암시하는 것이다. 클론된 DNA의 분리 및 후속적인 서열 분석으로 뉴클레오타이드 서열에 대한 증거가 제공되며, 결과적으로 관련된 유전자 또는 암호화된 단백질에 대한 증거가 제공된다. 이러한 방식으로, 유전자 활성에 대한 첫 번째 기능적인 증거가 확인될 수 있으며, 이의 기능은 그 자체로는 EST를 사용하여 유도될 수 없는 것이다.
따라서, 본 발명은 표 1에 따른 아미노산 서열을 포함하는 TTO 20 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은, (a) 표 1의 DNA 서열, 특히 뉴클레오타이드 1 내지 1305번; (b) (a)의 DNA와 80% 이상의 동일성을 갖는 DNA, 또는 (c) 유전자 암호에 있어서, (a) 및 (b)로부터의 DNA에 대해 축퇴성인 DNA를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 언급된 상기 단백질을 암호화하는 DNA이다.
본 발명은 마찬가지로 TTO 20 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 기술된 DNA의 발현을 위한 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터를 사용하여 형질감염시키거나 형질전환시킨 숙주 세포이다.
본 발명은 또한, (a) TTO 20 단백질을 발현시킬 수 있는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계 및 (b) 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 TTO 20 단백질을 분리하는 단계를 포함하여 TTO 20 단백질을 제조하는 방법, 및 기술된 상기 방법으로 수득할 수 있는 TTO 20 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 기술된 바와 같이 DNA로부터 유도되는 생물학적 샘플내 RNA와 하이브리드화되는 핵산 프로브를 사용하여, TTO 20 단백질을 발현하는 세포주, 세포 또는 조직을 확인하는 방법이다.
본 발명은 또한, 하이브리드화 및/또는 PCR 방법을 사용하여 표 1의 DNA 및 단백질 서열을 완성하기 위한 표 1에 따른 TTO 20 단백질을 암호화하는 DNA의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 TTO 20 단백질의 3차원 구조를 결정하고 이의 억제제 또는 활성화제를 디자인하기 위한 TTO 20 단백질의 용도이다. 본 발명은 마찬가지로 TTO 20 활성의 조절 인자를 발견하기 위한 TTO 20의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명의 목적은 상기 기술된 바와 같은 항체를 포함하는 염증 질환 특히, 류마티스성 관절염을 진단하기 위한 진단 키트, 및 상기 기술된 바와 같은 DNA를 포함하는 염증성 질환, 특히 류마티스성 관절염을 진단하기 위한 진단 키트에 관한 것이다.
실시예 1 : TTO 20/2 서열을 사용한 cDNA의 동정
TTO 20/2로 명명된 152bp의 부분적인 서열은 문헌[유럽 특허원 EP 제0 705 842 A2호]에 기술되어져 있다. 완전한 클론된 서열에 대한 정보를 수득하기 위해서, TTO 20/2의 전체 DNA를 SP6 프라이머로 서열분석한다. 서열분석 반응은 문헌[Sanger, F. et al. 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467]에 기술된 바와 같은 쇄 종결 DNA 서열분석 방법에 따라서 수행한다. 서열분석으로부터, 272bp의 클론된 삽입체의 전체 길이가 수득된다. 이러한 서열을 사용하여, 상동성 조사를 유전자은행(NCBI) 및 EMBL 데이터베이스에서 수행한다. 이를 위해서, BLAST 및 FASTA 알고리듬을 사용하며, 이는 제조원(Genetics Computer Group, Madison, USA)의 GCG DNA 분석 팩키지의 일부이다.
상동성 조사 결과, 공개된 데이터베이스내 유전자은행 승인 번호 M 51303(서열 ID: g11924769) 및 승인 번호 H 05077(서열 ID: g868629)인 두 개의 EST 클론과상당한 유사성을 나타낸다. 클론 ID 283071 또는 43508을 갖는 상응하는 클론을 제조원(Genome Systems, St. Louis, USA)으로부터 구입하고, 완전히 서열분석하였다. 클론 ID 283071을 갖는 클론은 약 2580bp의 가장 큰 삽입체를 가지며, ID 43508을 갖는 클론은 삽입체 크기 2200bp를 갖는 현저하게 보다 더 작지만, 클론 283071과 100% 서열 상동성을 갖는다. 클론 283071의 완전한 서열은 표 1에 나타내며 뉴클레오타이드 706번에서 시작된다.
실시예 2 : 개방 판독 프레임의 확인
GCG 분석 팩키지의 해독 프로그램(Translate program)을 사용하여, 클론 283071의 서열분석된 DNA를 개방 판독 프레임(ORF)의 출현에 대해서 조사하였다. 따라서, 200개 아미노산을 암호화하는 개방 판독 프레임이 서열의 5' 말단에서 확인되었다. 종결 코돈 TAA 이후에, 약 1950bp 길이의 비해독 영역이 확인되며, 이후 폴리아데닐화 시그날 및 폴리 A 꼬리로 종결된다. 상기 서열은 표 1에 제시된 서열의 뉴클레오타이드 706번 내지 뉴클레오타이드 3262번에 상응한다.
상동성 조사는 개방 판독 프레임을 클로닝하는 5' DNA 서열 및 단백질 서열을 사용하여 공지된 데이터베이스에서 수행한다. 이는 개방 판독 프레임이 184개 아미노산을 암호화하는 서열과 완전히 일치하며, KIAA0282(유전자은행 승인 번호: g87458)로 명명된 cDNA 상에 위치한다는 것을 나타낸다. KIAA0282에 대한 상동성은 아미노산 서열 LQTSEG 이후에 갑작스럽게 종결되며 552bp에서 뉴클레오타이드 수준에서 제한된다. 클론 283071에서 판독 프레임은 15개 아미노산에 대해서 계속되며 이후 TAA 종결 코돈으로 종결된다.
그러나, KIAA0282 ORF에서 판독 프레임은 123개 아미노산에 대해서 계속된다. KIAA0282 서열의 약 2000bp의 상기 영역 및 완전한 3' 비해독 영역은 클론 283071의 서열과 상이하다. 예를 들어, 도 1을 참조한다.
실시예 3 : KIAA0282의 5' 영역에 대한 TTO 20의 3' 영역의 결합에 대한 입증
KIAA0282의 ORF의 5' 암호화 영역이 TTO 20의 3' 영역에 결합한다는 것을 확인하기 위해서, 추가로 공지된 이용할 수 있는 EST 클론을 서열분석한다. 상기 언급된 클론 43508 이외에, 이들은 또한 클론 47831 및 클론 36563을 포함하며, 이들은 제조원(Genome Systems)으로부터 수득할 수 있다. 상기 서열들은 TTO 20에 대해서 결정된 서열의 정확함을 명백히 입증해 준다.
독립적인 방법을 사용하여 KIAA의 5' 영역 및 TTO 20의 3' 영역 사이에서의 결합을 명백하게 하기 위해서, 다음 PCR 전략을 선택한다. 두 개의 정방향 프라이머를 KIAA0282의 5' 영역으로부터 유도한다. 프라이머 1: 5'-CAACTCC TGTAT CACC-3'(서열 1), 프라이머 2: 5'-AGTGCGATGTCTTCTACTG-3'(서열 2). 역방향 프라이머 3 및 4는 클론 283071의 3' 영역으로부터 유도한다. 프라이머 3: 5'-TCTAAAGGCAG GAGAGGAAC-3'(서열 3). 프라이머 4: 5'-TTCATGTGTCTTGCTTACTC-3'(서열 4). 연결 영역에서, 크기 2097bp의 단편을 프라이머 1 및 4를 사용하여 증폭시켜야 하며, 크기 1211bp의 단편은 프라이머 2 및 3을 사용하여 증폭시켜야 한다. 이러한 DNA들을 폴리머라제 연쇄 반응을 위한 원형으로서 사용한다: Multiple Tissue cDNAPanel Human 1(주문 번호: K1420-1, 제조원: Clontech, Heidelberg, Germany)로부터의 뇌 cDNA 및 Human Fetal cDNA Panel(주문 번호: K1425-1, 제조원: Clontech, Heildelberg, Germany)로부터의 태아 뇌 cDNA. 분취액 0.5 내지 1㎕를 프라이머쌍 1 및 4와 함께 PCR 반응내로 도입한다. PCR 반응을 효소 제조원으로부터 권장된 완충액을 사용하여 하기와 같이 수행한다: 폴리머라제 혼합물: AmpliTag DNA 폴리머라제(제조원: Perkin-Elmer, Weiterstadt, Germany) 19부 및 pfu 폴리머라제(제조원: Stratagen, La Jolla, USA) 1부. 프라이머 농도: 10pM, DNA 사이클러(제조원: Perkin Elmer, Model 480). 1회 주기의 PCR 조건: 94℃ 2분, 94℃ 30초, 59℃ 30초, 72℃ 30초, 72℃ 7분, 반응 용적: 50㎕. 25 내지 30회 주기 반복 후, 반응물을 4℃로 냉각시키고 반응 혼합물을 1.2% 농도의 아가로오스 겔에서 분석한다. 뇌 cDNA 및 태아 뇌 cDNA 둘 모두로부터 크기 약 2100bp인 상응하는 PCR 단편을 증폭시키는 것이 가능하다. 이러한 샘플 분취액 0.5 내지 1㎕를 동일한 조건을 사용하지만, 프라이머 2 및 3을 사용하여 추가의 '네스티드(nested)" PCR 반응시켜, 크기 1200bp의 PCR 단편을 수득한다. 이는 명백하게 상응하는 KIAA0282의 5' 영역 및 TTO 20의 3' 영역을 갖는 cDNA의 존재를 나타낸다.
추가의 확인을 위해서, 크기 2100bp의 DNA 단편을 아가로오스 겔로부터 절단하여 DNA를 전기영동적으로 용출시킨다[Ausubel et al.]. 용출된 DNA를 멸균수 10㎕에 넣고 제조원(Invitrogen BV, Groningen, Holland)의 권장에 따라서 벡터 pCR2.1에 클로닝시킨다. PCR 단편의 클로닝은 제조원에 의해 특성화된 방법을 사용하여 동일한 제조원의 TA 클로닝 키트를 사용하여 수행한다.
클로닝된 DNA 단편의 서열분석은 염료 종결 인자 및 모델 377 서열분석기(제조원: Perkin Elmer, Langen, Germany)를 사용하여 문헌[Sanger et al.]에 따라서 쇄 종결 방법으로 수행한다. 서열분석은 PCR 분석에 의해 수득한 결과를 정확히 입증한다. 따라서, 표 1에 제시된 서열(뉴클레오타이드 685번 내지 3262번)은 KIAA0282에 의해 특성화된 DNA 서열에 의해 5' 측면에서 신장될 수 있다. 완전한 서열은 표 1에 나타낸다(뉴클레오타이드 1번 내지 3262번).
실시예 4 : 기능의 증거
다양한 조직으로부터의 상기 EST의 기원은 염증 과정에서 발현된 상기 유전자의 관련성을 나타낸다. RNA 분석[참조: EP-A 제0 705 842호]은 인터류킨 1β-자극된 연골세포에서 상기 유전자의 발현이 4배 이상 유도됨을 입증한다. 생물정보학적 분석에 기초하여, KIAA0282에 대한 cDNA의 발견자들은 아연 핑거(zinc finger) 단백질과 암호화된 단백질의 상동성을 제시하고 있다. 아연 핑거 단백질은 전사 인자로서 작용할 수 있으며, 즉 세포 과정의 조절에서 필수적인 역할을 수행한다. TTO 20의 가능한 기능에 대한 즉각적인 정보를 수득하기 위해서, 서열의 아영역(표 1의 뉴클레오타이드 705번 내지 뉴클레오타이드 3198번)으로 설정된 안티센스 발현을 선택한다. 이러한 영역은 cDNA의 암호화 부분 및 비암호화 3' 영역을 모두 포함한다.
4.1 안티센스 발현 벡터의 작제
선택된 출발 벡터는 디시스트론성 벡터 pED4이다(도 2)[Kaufman et al., Nucleic Acids Research 19, 448-4490 (1991)]. 이의 작제 방법은 문헌[Kaufman et al.]에 상세히 기술되어져 있으며 이의 전구체 플라스미드 pMT2는 ATCC로부터 수탁 번호 ATCC 67122로 수득할 수 있는 이러한 벡터에 있어서, 안티센스 RNA는 제1 시스트론을 통해서 발현시킬 수 있는 것으로 이미 설명되어져 있다. 상기 벡터는 하기 구조 성분을 함유한다: 진핵 세포에서의 복제 오리진, SV40 발현 인핸서, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 mRNA의 리더 서열, 스플라이스 부위를 갖는 하이브리드 인트론, 뇌심근염 (encephalomyocarditis) 바이러스 리더 서열, 선택 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제, SV40 폴리아데닐화 시그날, 아데노바이러스 V1 RNA 유전자, 재조합 이. 콜라이에서의 벡터 복제를 위한 복제 오리진 및 선택 마커. 제1 단계에서, 선택 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)을 위한 유전자로 교체시켜야 한다. 따라서, 제2 시스트론을 통한 GFP의 발현은 일시적인 발현 실험에서 안티센스 작제물의 발현에 대한 가시적인 측정수단으로서 제공된다.
pED4로부터 분리된 플라스미드 DNA는 제한 엔도뉴클레아제 ClaI 및 XhoI을 사용하여 절단시킨다. GFP 유전자를 분리하게 위해서, 시판중인 벡터 pEGFP(제조원: Clontech, Heidelberg, Germany)의 DNA를 제한효소 SalI 및 NotI을 사용하여 절단시킨다. DNA 단편을 겔 전기영동으로 분리시킨다. ClaI의 단일 절단 부위가 VA 유전자내 암호화 디하이드로폴레이트 리덕타제 서열 이후 약 350bp에 존재하며,제3 단편이 폴리A 부분 및 VA 유전자 절편의 복원을 위해서 필요하다. PCR을 사용하여, 5' 말단에서 Not 절단 부위를 가지며 3' 말단에서 Cla 절단 부위를 가지며, 폴리A 부분 및 VA 유전자의 여전히 손실된 서열을 갖는 벡터 pED4로부터 DNA 단편을 증폭시킨다.
다음 프라이머를 사용한다:
정방향 프라이머 Not L:
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATCAGGAAGATGCTTTCAAGTTC-3'(서열 5)
역방향 프라이머 Cla R:
5'-ACAGGCTCTCCTTTTGCAC-3'(서열 6).
PCR 생성물을 NotI 및 ClaI으로 절단하고, 겔 전기영동으로 뉴클레오타이드로부터 절단하고 분리한다. 세 개의 단편들을 등몰비로 함께 피펫팅하여 완충액, ATP 및 T4 리가제와 혼합하여 결합시킨다. 결합 혼합물을 이. 콜라이 DH5α세포내로 형질전환시키고 암피실린 선별 플레이트상에 플레이팅한다. 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리한 후, DNA를 BamHI 제한 절단을 사용하여 단편 크기를 확인한다. 최초 벡터 pED4는 세 개의 BamHI 절단 부위를 가지며, 이는 약 2950bp, 2190bp 및 220bp의 크기의 세 개의 DNA 단편을 제공한다. 유전자 교체의 결과로서, 신규한 벡터 T782는 네 개의 BamHI 절단 부위를 가지며 이는 상기 플라스미드 DNA의 BamHI 절단을 초래하여, 약 2950bp, 1315bp, 1075bp 및 220bp의 네 개의 DNA 단편을 생성시킨다. 신규하게 통합된 표지 유전자의 정확한 서열은 서열분석으로확인된다. 벡터 T782의 플라스미드 지도는 도 3에서 나타낸다.
TTO 20의 RNA의 안티센스 발현을 위해서, TTO 20 서열을 PCR 및 적합한 프라이머를 사용하여 증폭시키고 EcoRI 절단 부위를 통해서 GFP 벡터 T782에 클로닝시킨다.
다음 프라이머를 사용한다:
정방향 프라이머:
5'-GGAATTCGATCAGATCTCTCACTGCAC-3'(서열 7)
역방향 프라이머:
5'-GGAATTCACTTCTGTGCAGTAACAGAG-3'(서열 8)
약 2500bp 크기의 수득되는 단편을 제한효소 EcoRI을 사용하여 완전히 절단시키고, 겔 전기영동으로 절단하여 분리시킨다. 분리된 단편을 마찬가지로 EcoRI으로 절단시킨 GFP 벡터내로 클로닝시킨다. 클로닝된 단편이 안티센스 방향으로 클로닝되었다는 것을 입증하기 위해서, 다양한 재조합 클론들을 이. 콜라이 DH5α를 형질전환시킨 후 제한효소 PstI을 사용하여 절단시키고, 단편들을 겔 전기영동으로 분석한다. 단일 PstI 절단 부위가 상기 벡터를 사용하는 경우 EcoRI 클로닝 부위에서 이용가능하다는 사실로 인해, 벡터내에 DNA 단편이 정확한 방향인 경우 크기 약 310bp의 PstI 단편이 부가적으로 형성되는 반면, Pst 단편의 패턴에서 크기 약 810bp의 단편이 상실된다. 비시스트론성 안티센스 벡터 T814의 플라스미드 지도는 도 4에 나타낸다.
4.2 안티센스 벡터를 사용한 사람 연골육종 세포의 형질감염
따라서, 연골육종 세포가 특히 관심의 대상이 되며, 이는 연골육종 세포가 관절 질환에 대한 모델로서 제공될 수 있기 때문이다. 착생 성장하는 세포를 둘베코 MOD 이글 배지(글루코오스 4.5g/ℓ를 함유하는 DMEM)와 부가제(10% 소 태아 혈청, 200mM L-글루타민, 5mM 나트륨 피루베이트, 20mM Hepes 완충액, pH 7.2, 하이드로코르티존 0.02㎍/㎖, 인슐린 0.1㎍/㎖, 아스코르브산 0.025㎎/㎖ 및 겐타마이신 0.05㎍/㎖)를 함유하는 배양 플라스크(75㎠)에서 성장시킨다. 3 내지 4일 마다, 세포를 트립신 처리하여 배양 플라스크로부터 분리시켜 신선한 배양 배지 10㎖ 중에 넣어, 원심분리시켜 트립신을 제거하고 1:5 내지 1:10으로 희석시켜 다시 접종한다. 트립신 처리를 위해서는, 트립신/EDTA를 0.25% 트립신과 1mM EDTA의 농도로 사용한다. 이러한 용액 1㎖를 37℃에서 2 내지 5분 동안 세포상에 잔류시킨다. 연골육종 세포의 스톡 배양물은 10% DMSO 및 90% 배양 배지 중에서 -80℃에서 저장한다.
연골육종 세포에 DNA를 형질감염시키기 위해서, 다양한 방법, 특히 칼슘 포스페이트 방법, DEAE-덱스트란 방법, 리포좀-매개된 형질감염 방법, 활성화된 덴드리머(dendrimer)의 사용, 및 전기천공법을 시험한다. 최적의 형질감염율은 사용된 형질감염제가 Fugene 6(제조원: Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)인 경우 달성되었다.
2 x 105내지 4 x 105개 세포를 6웰 세포 배양 플레이트(제조원: Beckton &Dickinson, Heidelberg, Germany) 각각 1웰내로 접종한다. 세포는 영양 용액 약 2㎖ 중에 존재한다. 퀴아필터 플라스미드 미디키트(Qiafilter Plasmid Midikit, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하고 정제시킨 DNA 각각 0.5 내지 2㎍를 형질감염에 사용한다. 이를 위해서, 세포를 우선 항온배양기내에서 5% CO2, 37℃에서 18 내지 24시간 동안 배양시킨다. 세포를 50 내지 80% 컨플루언스까지 성장시켜야 한다. 최적의 형질감염율은 4 x 105세포/웰을 접종한 경우 달성되며, DNA 2㎍ 및 Fugene 6㎕/혈청 비함유 배지 100㎕를 사용한다. 형질감염은 제조업자의 지침에 따라서 수행한다.
4.3 연골육종 세포에서 안티센스 발현
형질전환된 연골육종 세포를 우선 녹색 형광 단백질 GFP의 발현에 기인하는 녹색 형광의 출현에 대해서 형질감염 후 16 내지 48시간 동안 시험한다. 16시간 이후에, 녹색 형광 세포는 형광 여기 후 검출될 수 있으며, 형광 여기는 20시간 후에 현저하게 증가된다. 형성된 안티센스 RNA를 검출하기 위해서, 각각의 경우 6웰 플레이트 중 두 개의 웰로부터의 세포를 사용한다. RNA를 분리하기 위해서, 알엔이지 미니프렙 키트(RNeasy Miniprep Kit, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 제조업자의 지침에 따라서 사용한다. RNA 샘플을 RNase-비함유 물 30㎕에 넣고 -20℃에서 저장한다. RNA를 디곡시게닌-표지된 DNA 샘플을 사용하여 노던 블롯[Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecularbiology, Vol. 1-3,John Wiley and Sons, New York, 1997]을 사용하여 분석한다. DNA를 표지하는 것은 DIG 프로브 합성 키트(DIG Probe Synthesis Kit, 제조원: Boehringer, Mannheim, Germany)를 사용하여 PCR 반응으로 달성한다. 사용된 원형은 뉴클레오타이드로부터 나온 크기 약 2.5kb인 TTO 20 부분을 함유하는 이전에 정제된 PCR 단편이다. 이러한 프로브를 사용한 하이브리드화에서, 형질감염된 연골육종 세포에서 안티센스 RNA의 발현은 시간-의존적인 방식으로 명백히 가시화된다.
비-형질전환된 연골육종 세포와 비교하여, 형질전환된 세포의 세포 형태는 현저하게 변화되지는 않는다. 그러나, TTO 20 안티센스 대신에 세포골격-조절 단백질인, 코필린(cofilin)의 안티센스 RNA를 함유하는 상응하는 벡터를 사용하여 수행된 대조군 형질감염과 비교하여, GFP 형광의 동등하지 않은 분포가 가시화된다다. 반점성 형광 분포는 대조군과 비교하여 세포의 세포골격이 변형된다는 의혹을 가능하게 한다. 이는 TTO 20으로부터 형성된 단백질의 억제에 대한 발현된 안티센스 RNA의 직접적인 작용을 나타낸다.
도 1은 클론 283071, 43508, KIAA0282, TTO 20/2 및 g 868629의 도식을 나타낸다.
도 2는 플라스미드 pED4의 도식을 나타내며, 하기 약어를 사용한다: SV40 = SV40 인핸서 및 복제 오리진; MLP = 아데노바이러스 "주요 후기" 프로모터; TPL = 리더 서열 "아데노바이러스 주요 후기" mRNA; IVS = 스플라이스 부위를 갖는 인트론 하이브리드; EM C-L = 뇌심근염 리더 서열; DHFR = 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제; polyA = SV40 폴리아데닐화 시그날; VA1 = 아데노바이러스 VA I RNA 유전자.
도 3은 플라스미드 T782의 도식을 나타내며, 약어는 도 2를 참조한다.
도 4는 플라스미드 T814의 도식을 나타내며, 약어는 도 2를 참조한다.

Claims (13)

  1. 표 1의 아미노산 서열(서열 10)을 포함하는 TTO 20 단백질.
  2. (a) 표 1의 DNA 서열(서열 9), 특히 뉴클레오타이드 1번 내지 1305번; (b) (a)의 DNA와 80% 이상 동일한 DNA; 또는 (c) 유전자 암호에 있어서, (a) 및 (b)로부터의 DNA에 대해 축퇴성인 DNA를 포함하는 그룹으로부터 선택되는, 제1항에 따른 단백질을 암호화하는 DNA.
  3. 제1항에 따른 단백질에 결합하는 항체.
  4. 제2항에 따른 DNA의 발현을 위한 발현 벡터.
  5. 제4항에 따른 발현 벡터로 형질감염시키거나 형질전환시킨 숙주 세포.
  6. (a) TTO 20 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 TTO 20 단백질을 분리하는 단계를 포함하여, 제1항에 따른 TTO 20 단백질을 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 제6항에 따른 방법으로 수득할 수 있는 TTO 20 단백질.
  8. 제2항에 따른 DNA로부터 유도된 생물학적 샘플 중 RNA와 하이브리드화하는 핵산 프로브를 사용하여, 제1항에 따른 TTO 20 단백질을 발현하는 세포주, 세포 또는 조직을 확인하는 방법.
  9. 하이브리드화 및/또는 PCR 방법을 사용하여 표 1의 DNA 및 단백질 서열을 완성하기 위한 제2항 (a)에 따른 DNA의 용도.
  10. TTO 20 단백질의 3차원 구조를 결정하고 이의 억제제 또는 활성화제를 디자인하기 위한 제1항에 따른 TTO 20 단백질의 용도.
  11. TTO 20의 활성에 영향을 미치는 물질을 찾아내기 위한 제1항에 따른 TTO 20 단백질의 용도.
  12. 제3항에 따른 항체를 포함하는, 염증 질환, 특히 류마티스성 관절염을 진단하기 위한 진단 키트.
  13. 제2항에 따른 DNA를 포함하는, 염증 질환, 특히 류마티스성 관절염을 진단하기 위한 진단 키트.
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