KR20030032905A

KR20030032905A - 내츄럴 킬러세포의 증식방법

Info

Publication number: KR20030032905A
Application number: KR1020027006659A
Authority: KR
Inventors: 오노다다오; 사이죠카오루
Original assignee: 리가가쿠 겐큐쇼
Priority date: 1999-11-26
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2003-04-26
Also published as: CA2393322A1; WO2001038494A1; JP3619853B2; EP1233058B1; CN1399675A; HK1048498A1; CN1237170C; JP2001149069A; TWI224137B; ATE348876T1; DE60032508D1; EP1233058A4; EP1233058A1

Abstract

말초혈 단핵구세포와 인간 빌름스종양 세포주 HFWT를 혼합 배양하는 공정을 포함하는 인간 내츄럴 킬러세포의 증식방법. 예를 들면, 인간개체로부터 분리한 말초혈 단핵구세포를 사용하여 상기 인간개체 자신의 내츄럴 킬러세포를 증식시키는 것이 가능하여, 높은 세포상해활성을 유지한 상태의 내츄럴 킬러세포를 효율적으로 증식할 수 있다.

Description

내츄럴 킬러세포의 증식방법{Method of proliferating natural killer cells}

기술분야

본 발명은, 인간의 면역계 세포의 제조방법에 관한 것이다.

배경기술

동물 체내에 있는 내츄럴 킬러세포(이하, 본 명세서에 있어서 「NK세포」라고 약칭하는 경우가 있다.)는, 면역반응의 일익을 담당하는 림프구계 세포이다. 이 세포에는 여러 기능이 있지만, 특히 종양세포를 죽이는 강한 활성이 있기 때문에, 체내에서는 종양화한, 또는 종양화하고 있는 이상 세포를 제거하는 면역 감시기구의 중요멤버라고 생각되고 있다. 따라서, 이 세포를 종양치료에 유효하게 이용하고자 하는 연구는 옛부터 행해지고 있었다.

예를 들면, 림포카인(lymphokine)의 일종인 인터류킨-2(이하, 본 명세서에 있어서 인터류킨을 「IL」이라고 약칭하는 경우가 있다)를 대량으로 배양액에 첨가하여, 말초혈 단핵구세포(peripheral blood mononuclear cell)(이하, PBMC)를 배양하면, 인간의 경우에는 1주일 전후에서 소위 림포카인 활성화 킬러 림프구(이하, 본 명세서에 있어서 「LAK세포」라고 약칭하는 경우가 있다)가 증식하게 되는데,이 중에는 NK세포가 많이 포함되어 있는 것은 잘 알려져 있다. LAK세포는, Rosenberg 등의 연구(Rosenberg, S.A., et al., N. Engl. J. Med. 313, pp.1485-1492, 1985) 이래, 종양의 양자면역요법에 널리 사용되고 있다. 또한, LAK세포는 감염증에도 유효한 것으로 알려져 있어, 항생물질로는 치료하기 어려운 감염증 대책으로서 주목받고 있다. 그러나, LAK세포를 대량으로 증식시키기 위해서 2주일 이상 장기간 배양하면, NK세포의 세포상해활성이 크게 저하되는 경우가 많기 때문에, LAK세포 배양에 의한 NK세포의 취득은 상책이 아니다.

NK세포의 표면상에는 NK활성 저해수용체(이하, 본 명세서에 있어서 「NKIR」이라고 부르는 경우가 있다)가 있어, 이것에 결합하는 분자가 있으면 NK세포의 세포상해활성은 저해된다(Gumperz, J. E. and Parham, P., Nature, 378, pp.245-248, 1995). 일반적으로, 정상세포의 표면에는 주요조직 적합성 항원 클래스I(이하, 본 명세서에 있어서 「MHC-I」이라고 부르는 경우가 있다) 분자가 발현되고 있어 자기와 비자기의 식별에 중요한 역할을 하고 있는데, MHC-Ⅰ분자군 중에는 NKIR에 결합하는 것이 있기 때문에, 통상, NK세포의 세포상해활성을 측정할 때에는 인간 만성백혈병 세포주 K562를 표적으로 하여 활성을 측정한다. 이것은, K562세포가 MHC-Ⅰ분자를 거의 발현하고 있지 않기 때문이다. 또한, K562세포를 죽일 때에는, NK세포는 더욱 활성화되어 증식하는 것이 알려져 있다.

최근, Strominger의 그룹은, 세포표면에 거의 MHC-I을 발현하고 있지 않은 인간 B세포주 721.221에 방사선을 조사하여 분열능을 상실시킨 상태로 하고, 이것을 PBMC와 함께 5~6일간 혼합 배양하여, 거기에서 NK세포를 정제하고 더욱 배양을계속해서 NK세포를 대량으로 얻는 방법을 개발했다. 이 방법으로 멜라노마(melanoma)환자로부터 얻어진 NK세포는, MHC-I을 발현하고 있지 않은 환자의 자기 멜라노마세포를 죽일 수 있는 것이 나타나 있다(Porgador, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94, pp.13140-13145, 1997). 단, 이 방법은 NK세포를 증식시키는 데에는 간편하지만, NK세포의 표적세포로서 사용한 721.221세포주는, K562세포와 마찬가지로 실제상으로는 약간이긴 하지만 MHC-I의 발현이 있기 때문에(Hay, R., American Type Culture Collection, personal communication), K562세포에 비하여 특히 효율 좋게 NK세포를 증식시키는 것은 아니다.

한편, 인간 NK세포의 세포상해활성 측정으로서는, K562세포를 표적세포로 하여 이것에 미리 방사성의 Cr-51을 무기염으로서 넣어두고, K562세포가 죽었을 때에 세포밖으로 유리되는 Cr-51의 양을 방사선 측정기로 측정하는 방법이 표준적으로 사용되고 있다. 이 방법은, 표적세포에 대해서 죽이는 쪽의 세포(즉 이펙터세포(effector cells))를 대량으로 가하더라도, Cr-51이 죽는 쪽의 K562세포로부터만 유리되기 때문에, 고감도이며 특이성이 높은 방법이다. 그러나, 방사성 물질을 다루기 때문에 위험하다고 하는 피할 수 없는 결점이 있다.

이에 대해서, 본 발명자 등은, 세포상해성 T림프구(이하, 본 명세서에 있어서 「CTL」이라고 부르는 경우가 있다)의 활성측정법으로서, 부착성 세포를 표적세포로 하여 사용하는 크리스탈 바이올렛 염색법(crystal violet staining method)(이하, 본 명세서에 있어서 「CV법」이라고 부르는 경우가 있다)을 제안하고 있다(Liu, S. Q., et al., Nature Medicine 1, pp.267-271, 1995). 이 방법은, 표적세포를 이펙터세포와 혼합 배양한 후, 세포를 서로 분리하여, 생잔 표적세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 비색법(colorimetry)으로 정량하기 때문에, 방사성 물질을 필요로 하지 않아 지극히 안전하다.

그러나, K562세포가 부유성 세포이기 때문에, 마찬가지로 부유성 세포인 이펙터세포와 일단 혼합한 후에는, 표적세포만을 분리하는 것은 매우 곤란하여, 인간 NK세포의 활성측정에는 CV법은 적용할 수 없다고 하는 문제가 있다. K562세포와 마찬가지로 인간 NK세포에 고감수성이고, 또한 부착성 표적세포를 이용할 수 있으면 CV법을 적용할 수 있지만, 그러한 보고는 지금까지 없다.

발명의 개시

본 발명의 과제는, 종래부터 알려져 있는 방법보다도 효율이 좋은 NK세포 증식법을 제공하는 것에 있다. 보다 구체적으로는, 종래의 방법에 비해 2배 이상의 효율로 PBMC로부터 NK세포를 선택적으로 증식시킬 수 있고, 또한 높은 세포상해활성을 유지한 상태의 NK세포를 얻기 위한 방법을 제공하는 것이 본 발명의 과제이다. 또한, 상기의 특징을 갖는 방법에 의해 생산된 인간 NK세포 및 종래의 방법보다도 안전성이 높은 인간 NK세포의 세포상해활성 측정법을 제공하는 것도 본 발명의 과제이다.

본 발명자 등은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 노력한 결과, NK세포의 표적세포가 되는 세포군 중에서, MHC-Ⅰ분자의 발현유도제인 인터페론 감마(이하, 본 명세서에 있어서 「IFNg」라고 부르는 경우가 있다)를 세포배양중에 첨가하더라도 MHC-Ⅰ분자를 증가 발현하지 않는 세포주를 다수의 인간배양 세포주군으로부터 스크리닝하여, 그러한 세포주 중 특정의 세포주를 사용한 경우에는, K562세포주에 비하여 매우 높은 NK세포 증식효과를 달성할 수 있는 것을 발견했다. 본 발명은 이 사실을 토대로 완성된 것이다.

즉, 본 발명은, 말초혈 단핵구세포와 인간 빌름스종양 세포주(human Wilms tumor cell line) HFWT를 혼합 배양하는 공정을 포함하는, 인간 내츄럴 킬러세포의 증식방법을 제공하는 것이다. 이 발명의 바람직한 태양에 의하면, 인간개체, 바람직하게는 종양환자로부터 분리한 말초혈 단핵구세포를 사용하여, 상기 개체 자신의 내츄럴 킬러세포를 증식시키는 상기 방법; 미리 증식능을 상실시킨 인간 빌름스종양 세포주 HFWT를 사용하는 상기 방법; 및 인터류킨-2의 존재하에서 배양을 행하는 상기 방법이 제공된다.

예를 들면, 종양환자의 말초혈로부터 분리한 말초혈 단핵구세포를 본 발명의 방법에 따라 인간 빌름스종양 세포주 HFWT와 함께 배양함으로써, 환자 본인의 NK세포를 높은 세포상해활성을 유지한 채로 대량으로 증식시킬 수 있다. 또한, 이들 방법에 의해 제조된 인간 내츄럴 킬러세포 및 종양환자로부터 분리한 말초혈 단핵구세포를 사용하여 상기 방법에 의해 증식시킨 상기 종양환자 자신의 내츄럴 킬러세포를 포함하는, 상기 종양환자를 위한 종양치료제가 본 발명에 의해 제공된다.

다른 관점에서는, 인간 내츄럴 킬러세포의 세포상해활성의 측정방법으로서, 인간 빌름스종양 세포주 HFWT와 인간 내츄럴 킬러세포를 혼합 배양하고, 배양 후에 생존한 표적세포를 염색하는 공정을 포함하는 방법이 제공되며, 이 방법의 바람직한 태양에 의하면, 염색에 크리스탈 바이올렛을 사용하는 상기 방법이 제공된다. 이들 방법에 의하면, 방사성 물질을 사용하지 않고, 인간 NK세포의 세포상해활성을 정확하고 간편하게 측정할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은, 본 발명의 방법에 의해 정상인 1(40세, 여)의 PBMC를 사용하여 NK세포의 선택적 배양을 행한 결과를 나타낸 도이다.

도 2는, 본 발명의 방법에 의해 정상인 2(27세, 남)의 PBMC를 사용하여 NK세포의 선택적 배양을 행한 결과를 나타낸 도이다.

도 3은, 예 1의 실험 3에서 얻은 배양 림프구군을 사용하여, 세포상해시험을 행한 결과를 나타낸 도이다.

도 4는, NK세포의 선택적 배양에 있어서의 인터류킨 첨가의 효과를 나타낸 도이다. 도중, ILs는 배양에 4종류의 인터류킨을 사용한 경우의 결과를 나타내고, IL-2는 인터류킨-2 만을 첨가한 경우의 결과를 나타낸다.

도 5는, NK세포의 선택적 배양에 있어서의 인터류킨 첨가의 효과로서, 정상인 2 및 3으로부터 얻은 NK세포를 포함하는 림프구군의 세포상해활성을 나타낸 도이다.

도 6은, 종양환자의 PBMC를 사용하여 본 발명의 방법에 의해 선택적으로 NK세포를 증식 배양한 결과를 나타낸 도이다.

도 7은, 종양환자의 PBMC를 사용하여, K562세포 또는 HFWT세포를 표적으로하여 증식 배양한 경우에 대해 세포상해시험을 행한 결과를 나타낸 도이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 방법은, 인간 NK세포를 증식시킬 때, 인간의 빌름스종양 세포주 HFWT를 표적세포로 하여 인간 PBMC와 혼합 배양하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 방법에 의하면, PBMC 중 NK세포를 선택적으로 증식시키는 것이 가능하다. 인간의 빌름스종양 세포주 HFWT는 리가가쿠겐큐쇼(일본국 사이타마현 와코시 히로사와 2-1)의 세포개발은행(일본국 쯔쿠바시 다카노다이 3-1-1)에 세포번호 RCBO665로서 보존되어 있어, 신청에 의해 입수하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양방법은 특별히 한정되지 않지만, 통상은, 아래의 방법에 따라 배양을 행할 수 있다. 통상의 동물세포배양용 배지에 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 증식인자를 첨가하여, 인간 말초혈로부터 분리한 PBMC를 가하고, 이 배양물을 HFWT세포에 첨가하여 배양한다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않아, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 혈액형이 AB형인 것이 바람직하고, PBMC를 채취한 본인 유래의 것이 더욱 바람직하다. 농도는 1~30용량% 정도이면 좋다. 또한, 무혈청상태에서 림프구의 증식을 지지할 수 있는 배지를 사용하는 것도 가능하다.

증식인자로서는 인터류킨-2(IL-2)가 가장 바람직하지만, PBMC로부터 림프구를 증식시키는 사이토카인의 조합이나, 림프구증식을 자극하는 렉틴류, 또는 PBMC를 채취한 대상자와는 다른 인간개체로부터 채취한 PBMC로 증식능력을 상실시키는처리를 행한 것을 증식인자 대신에 사용하더라도 좋다. 증식능을 상실시키는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 방사선조사나 마이토마이신C 처리 등, 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다. 첨가하는 IL-2의 농도는 10~2,000 국제단위/ml가 바람직하다.

PBMC와 HFWT세포와의 비는 특별히 한정되지 않지만, 10:1 정도로 하는 것이 바람직하다. 표적인 HFWT세포는 부착성 세포이기 때문에, 일반적으로는, 이들이 부착하고 있는 상태 그대로, 증식능을 상실시키는 처리를 행하여 사용하는 것이 바람직하다. 단, 상기 세포를 물리적으로 부착상태로부터 벗겨내는 등, 부유상태로 하여 사용하는 것도 가능하다. 또한, NK세포가 활성화하여 활발히 증식하고 있는 상태에서는, 표적세포인 HFWT세포는 NK세포에 의해 빨리 죽어버리기 때문에, 이러한 상태로 표적세포를 사용할 때에는, 반드시 그 증식능을 미리 상실시켜 둘 필요는 없다. PBMC의 배양기간은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 5일간 이상이다. NK세포는 높은 활성을 유지한 상태 그대로 증식하지만, 저절로 NK세포가 증식능을 상실할 때까지는 배양을 계속 할 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 인간 내츄럴 킬러세포의 세포상해활성의 측정방법은, 인간 빌름스종양 세포주 HFWT와 인간 내츄럴 킬러세포를 혼합 배양하여, 배양 후에 생존한 표적세포를 염색하는 것을 특징으로 하고 있다. 이 방법은, 일반적으로는 공지의 방법(Liu, S. Q., et al., Nature Medicine, 1, pp.267-271, 1995)에 준하여, 이펙터세포를 NK세포로 하고, 표적세포를 HFWT세포로 하여 행할 수 있다. 염색에는 크리스탈 바이올렛을 사용하는 것이 바람직하다. HFWT세포가 부착성 배양세포이기 때문에, 본 발명의 방법에 의하면, 방사성 물질을 사용하지 않고, 정확하고 간편하게 인간 NK세포의 활성을 측정할 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 아래의 실시예에서 사용한 세포주는, 리가가쿠겐큐쇼 세포개발은행에 보존되어 있는 인간종양 세포주 209주를 스크리닝하고, 이 중 만성 골수성 백혈병 세포주 K562(세포번호 RCB0027), 빌름스종양 세포주 HFWT(세포번호 RCBO665), 멜라노마세포주 HMV-Ⅱ(세포번호 RCB0777)가 MHC-Ⅰ분자를 거의 발현하고 있지 않은 것(단 두 후자는 K562세포와 동일한 정도의 약간의 MHC-I의 발현이 확인되고 있다), 이들 세포에서는 배양내에서 24시간 IFNg 첨가처리를 하더라도 MHC-I 발현이 증강되는 것은 전혀 없는 것을, 당업자에게 주지의 플로우 사이토메트리법(flow Cytometry technique)으로 확인한 후 사용했다.

K562세포에는 다수의 변이체(variant)가 존재하는 것이 알려져 있고, 원주(Lozzio, C. B. and Lozzio, B. B., Blood, 45, pp.321-334, 1975)는 IFNg처리에 의해 MHC-I의 발현이 유도되는 것으로 되어 있다. 그러나, 본 실시예에서 사용하고 있는 K562세포주는 원주로부터 변이되고 있어, IFNg처리에 의해서도 MHC-I의 발현이 지극히 낮은 상태인 채로 변화하는 일은 없다. 또한, Higashino세포는, 병리진단에서 gliosarcoma로 진단받은 뇌종양 조직으로부터, 리가가쿠겐큐쇼 세포개발은행에서 계대 배양된 것으로, 이것은 통상의 배양하에서 상시 강하게 MHC-I 및MHC-Ⅱ를 발현하고 있는 세포이다. 이 세포는, MHC-I을 거의 발현하고 있지 않은 세포주와의 비교대조로서 사용했다.

예 1: 정상인의 NK세포의 선택적 배양

HFWT세포를 표적세포로 한 경우, 정상인의 PBMC로부터 NK세포가 선택적으로 증식되는지의 여부를 검토했다.

<방법>

1. 표적세포의 배양

1×10⁵개의 표적세포를 24웰 플레이트의 각 웰에 파종했다. 표적세포로서는 Higashino, HFWT, K562, HMV-Ⅱ를 사용하고, 배지로서는, 10% 소태아혈청 첨가 Ham F12배지를 사용했다. 이들 세포를 하룻밤 배양한 후, 50 Gy의 X선을 조사하여, PBS(-)로 3회 세척후, 표적세포로서 사용했다.

2. PBMC의 조제

정상인의 말초혈 30 ml로부터 PBMC를 당업자에게 주지의 방법(Kawai, K., et al., Cancer Immunol. Immunother. 35, pp.225-229, 1992)에 따라 분리했다. 또한, 이 때에 채취되는 혈장은 PBS(-)로 2배로 희석되어 있는데, 그것을 아래의 배양에서 사용했다. 사용농도는 2배 희석상태에서 용량비 10%(즉, 혈장으로서는 5%)이다.

3. PBMC의 배양

1웰당 2 ml의 혈장첨가 RHAM α배지(Kawai, K., et al., Cancer Immunol.Immunother. 35, pp.225-229, 1992)에 현탁한 1×10⁶개의 PBMC를 표적세포상에 파종했다. 또한, 배지중에 IL-1(종농도 167 국제단위/ml, 이하 마찬가지로 종농도를 나타낸다), IL-2(67 국제단위/ml), IL-4(67 국제단위/ml), IL-6(134 국제단위/ml)을 첨가했다. 이것을 37℃의 탄산가스 인큐베이터에서 배양했다.

4. 플로우 사이토메트리

당업자에게 주지의 방법으로, 배양된 부유세포군을 각각 세포표면항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날항체로 형광염색하여, FACS(Becton Dickinson사제)로 해석했다. 여기에서 사용한 모노클로날항체 중, 항CD3 항체는 T세포를 식별하기 위해 사용, 항CD56 항체는 NK세포를 식별하기 위해 사용했다.

5. 세포수의 계측

세포수는 타타이식 혈구계산판(Tatai hemocytometer)을 사용하여 계측했다.

6. 세포상해활성의 측정

기보의 방법(Liu, S. Q., et al., Nature Medicine 1, pp.267-271, 1995)에 따라, CV법에 의해 배양 림프구의 세포상해활성을 측정했다. 본 실시예에서는, 살아있는 표적세포에 림프구를 첨가하기 직전의 표적세포의 염색후 흡광도를 100%로 했다. 이 때문에, 24시간 인큐베이션 후에는, 대조가 되는 표적세포만의 웰(이펙터세포와 표적세포의 비(이하, E/T비)가 0인 웰)에서는 표적세포가 증식하고 있기 때문에 세포상해활성이 100%를 초과하고 있는데, 이것은 본 실험에 있어서 표적세포 자체는 건강한 것임을 나타내고 있다.

<결과>

정상인 1(40세, 여)의 PBMC를 사용하여 얻은 결과를 표 1의 실험 1, 실험 2 및 도 1에 나타내고, 정상인 2(27세, 남)로부터 얻은 결과를 표 1의 실험 3 및 도 2에 나타낸다.

표 1

표적세포표면항원이 다른 세포의 비율(%)CD3+CD56- CD3-CD56+

실험 1 (13일간 배양)없음 58.2 5.4Higashino 96.0 0.2HFWT 19.8 54.6K562 47.8 17.6

실험 2 (14일간 배양)없음 60.9 13.0Higashino 84.8 5.4HFWT 7.3 75.9HMV-Ⅱ 55.0 18.9

실험 3 (13일간 배양)없음 74.4 7.2Higashino 95.1 1.7HFWT 12.4 64.6

본 실시예에서 사용한 4종의 IL의 조합은, MHC-Ⅰ분자와 항원 펩티드를 동시에 인식하여 죽이는 성질이 있는 CTL을 유도배양하기에 적합한 것이다(Liu, S. Q., et al., Cancer Immunol Immunotherapy, 39, pp.279-285, 1994). 정상인의 PBMC는 통상 8~25%의 NK세포를 포함하는데, 표 1에 나타낸 바와 같이, CD3+CD56-로 나타내어지는 T세포는 Higashino세포를 표적세포로 한 경우에는 96%에 달하지만, CD3-CD56+로 나타내어지는 NK세포는, 정상인 1의 PBMC를 사용한 실험 1에서는 거의 없어지고, 실험 2에서도 5.4%로 되어 있다. 한편, MHC-Ⅰ분자가 거의 표면에 없는HFWT세포를 표적세포로 한 경우는, 반대로 T세포의 비율이 큰폭으로 저하되고, NK세포의 비율이 54.6%로까지 상승했다. 이 비율은, 마찬가지로 MHC-Ⅰ분자가 거의 표면에 없는 K562세포를 표적세포로 한 경우의 결과(17.6%)와 비교하더라도 명백하게 높다. 실험 2에서도 이들의 경향은 변하지 않아, NK세포의 비율은 HFWT세포를 표적세포로 한 경우에는 75.9%에 달하고, 마찬가지로 MHC-Ⅰ분자가 거의 표면에 없는 HMV-Ⅱ세포를 표적세포로 한 경우(18.9%)와 비교하더라도 명백하게 높다.

정상인 2의 말초혈로부터 PBMC를 조제한 직후에서는, CD3+CD56-의 T세포는 55.4%, CD3-CD56+의 NK세포는 13.2%였다. 표 1의 실험 3에 나타낸 바와 같이, 배양 13일후에는, Higashino세포를 표적으로 한 경우는 95.1%를 T세포가 차지해, NK세포는 거의 없어지고, 반대로 HFWT세포를 표적으로 한 경우는 NK세포가 64.6%로까지 증가했다. 또한, 도 1에 나타내는 바와 같이, 정상인 1의 PBMC 유래의 세포증식은, Higashino세포와 HFWT세포를 표적으로 한 쪽이, HMV-Ⅱ세포를 표적으로 한 경우나 표적세포가 없는 경우에 비해 명백하게 높다. 정상인 2의 경우(도 2)는, Higashino세포를 표적으로 한 경우 보다도 HFMT세포를 표적으로 한 경우 쪽이 더욱 효율좋게 PBMC 유래세포가 증식했다.

더욱이, 실험 3에서 얻은 배양 림프구군을 사용하여, 세포상해시험을 행한 결과를 도 3에 나타낸다. Higashino세포를 표적으로 하여 얻은 배양 림프구군은, 4종의 IL을 조합하여 배양했기 때문에 CTL이 된 것이 예상되었지만, 실제, 이 림프구군은 세포상해활성 측정시에 표적세포로 한 살아있는 Higashino세포를 매우 잘 죽였다. E/T비가 0일때(즉 표적세포만일 때), 24시간에 표적세포가 147%로 증식하는 조건하에서도, E/T비가 2일 때의 생잔 표적세포는 47.6%가 되었다. E/T비가 8일때의 생잔 표적세포는 겨우 7.5%가 되었다. 이 때의 생잔 표적세포의 비율은, E/T비가 낮으면 높아져, 명료한 용량 의존관계가 인정되었다. 그러나, 세포상해활성 측정시의 표적세포가 살아있는 HFWT세포인 경우에는, Higashino세포를 표적으로 하여 얻은 림프구군은 HFWT세포를 전혀 죽이지 않아, 여기에서 얻은 배양 림프구군이 전형적 CTL인 것이 확인되었다.

한편, HFWT세포를 표적으로 하여 얻은 배양 림프구군은, 살아있는 HFWT세포를 매우 잘 죽였다. E/T비가 2일 때의 생잔 표적세포는 18.5%가 되었다. E/T비가 8일 때의 생잔 표적세포는 -9.2%까지 저하되었다(마이너스값이 된 것은 측정오차 때문이다). 이 때의 생잔세포의 비율은, E/T비가 낮으면 높아져, 용량 의존관계가 인정되었다. 따라서, 세포상해활성 측정시에 살아있는 HFWT세포를 표적세포로 함으로써, NK세포의 세포상해활성을 정확하게 측정할 수 있다.

또한, 이 배양 림프구군에는 12.4%의 T세포가 포함되어 있어, 살아있는 HFWT세포와 비교하면 정도는 명백하게 낮아지지만, 살아있는 Higashino세포도 죽이고 있는 것으로 보아, 이 중에는 NK세포 뿐만 아니라 약간의 CTL도 포함되어 있다고 추정된다. E/T비가 2일 때의 생잔 표적세포는 60.5%, E/T비가 8일 때의 생잔 표적세포는 21.8%가 되었다. 따라서, 이들 실험으로부터 명백하듯이, HFWT세포를 표적으로 하면, 높은 세포상해활성을 유지한 NK세포를 PBMC로부터 선택적으로, 또한 효율좋게 증식시키는 것이 가능하다.

예 2: NK세포의 선택적 배양에 필요한 인터류킨

예 1에서는 증식능을 상실시킨 HFWT세포를 표적세포로 하여, 정상인의 PBMC로부터 NK세포를 선택적으로 증식 배양할 수 있는 것을 나타냈지만, 배양에 4종류의 IL을 사용했다. 이 예에서는, 림프구에 있어서 최저한 필요(minimum essential)라고 불리는 IL-2만을 첨가한 배지를 사용하고, HFWT세포를 표적세포로 하여 NK세포의 선택적 배양을 행했다. 방법은 배지에 첨가하는 IL의 종류를 변경한 것 이외에는 모두 예 1과 동일하다. 단, IL-2만을 첨가하는 경우의 농도는 500 국제단위/ml로 했다. 또한, 플로우 사이토메트리법으로 배양된 세포군을 조사할 때, NK세포를 식별하기 위해서, 항CD56 항체 이외에 항CD16 항체도 사용했다.

도 4에 나타내는 바와 같이 정상인 1, 정상인 2, 정상인 3(56세, 남) 유래의 PBMC 모두를, HFWT세포를 표적세포로 하여 배양한 경우에, 4종의 IL 첨가에서도 IL-2만의 첨가에서도, 거의 동일하게 증식했다. 도 4(C)에 나타내는 바와 같이, 정상인 3 유래 PBMC에서는, 표적세포를 사용하지 않고, 또한 IL-2만을 첨가한 배양에서는 세포증식은 크게 늦어졌다.

정상인 1의 PBMC에서는, 당초 8.0% 밖에 없었던 CD3-CD56+로 나타내어지는 NK세포의 비율은, 배양 14일후에 표적세포를 추가하여 재자극했더니, IL로서 IL-2만을 첨가한 배양에서도, 배양 17일후에는 77.3%에 달했다. 이와 같은 재자극을 하지 않은 정상인 2의 PBMC의 경우에서는, 배양 13일후에는, IL-2만을 첨가한 배양에서도, CD3-CD56+로 나타내어지는 NK세포의 비율은 90.7%, 또한 CD16+로 나타내어지는 NK세포의 비율은 79.1%, CD16+CD56+로 나타내어지는 NK세포의 비율은 78.2%가되었다. 정상인 3에서도 이와 같은 경향은 변하지 않고, 배양 13일후에는, IL-2만을 첨가한 배양에서도, CD3-CD56+로 나타내어지는 NK세포의 비율은 74.9%, 또한 CD16+로 나타내어지는 NK세포의 비율은 76.5%, CD16+CD56+로 나타내어지는 NK세포의 비율은 75.7%가 되었다.

이들 정상인 2 및 3으로부터 얻은 대부분의 NK세포로 된 림프구군의 세포상해활성을 본 결과를 도 5에 나타낸다. 이 때의 살아있는 표적세포는 HFWT이다. 정상인 2의 경우도 정상인 3의 경우도, 충분히 활성이 강한 NK세포를 얻을 수 있어, HFWT세포를 표적으로 하여 PBMC로부터 NK세포를 선택적으로 배양할 때에 첨가하는 IL은 IL-2만으로 좋고, 높은 세포상해활성을 유지한 채, 선택적으로 효율좋게 증식시키는 것이 가능하다.

예 3: 종양환자 PBMC로부터의 선택적인 NK세포의 증식 배양

예 1 및 예 2에서는 정상인의 PBMC를 사용했지만, 이 예에서는 종양환자의 PBMC를 사용하여 NK세포의 선택적 증식 배양이 가능한지의 여부를 검토했다. 시험은 예 1에 따라 행하고, 단, PBMC 배양시의 표적세포로서는 HFWT세포 또는 K562세포를 사용하고, IL로서는 IL-2만을 첨가하고, 농도는 500 국제단위/ml로 했다. 또한, 플로우 사이토메트리법으로 배양된 세포군을 조사할 때, NK세포를 식별하기 위해서 항CD56 항체 이외에 항CD16 항체도 추가하여 사용했다. 환자(51세, 남)는 gliosarcoma로 진단받은 뇌종양환자로, 예 1 및 예 2에서 사용하고 있는 Higashino세포를 채취한 본인이다.

도 6에 결과를 나타낸다. PBMC 유래의 림프구의 증식은, 표적세포로서는 K562세포 보다도 HFWT세포 쪽이 좋았다. 1 ×10⁶개에서 출발하여, 누적증식 림프구수의 최고값이, K562세포를 표적으로 한 경우에서는 3.05 ×10⁷개인 것에 비해, HFWT세포를 표적으로 한 경우에서는 15.6×10⁷개에 달했다. 또한, PBMC 유래 세포군의 구성을 표 2에 나타냈다.

표 2

표적세포 표면항원이 다른 세포의 비율(%)CD3+CD56- CD3-CD56+ CD16+CD56+

(13일 배양)HFWT 0.4 83.8 54.7K562 1.9 81.5 51.7

K562세포를 표적으로 하여 증식 배양한 경우 및 HFWT세포를 표적으로 하여 증식 배양한 경우 모두, CD3-CD56+로 나타내어지는 NK세포의 비율은 82% 전후, CD16+CD56+로 나타내어지는 NK세포의 비율은 53% 전후로 거의 동일했다. 얻어진 림프구군의 세포상해활성은, 살아있는 HFWT세포를 표적으로 하여 측정한 결과, K562세포와 HFWT세포 어느것을 표적세포로 하여 증식 배양한 림프구군이더라도, 매우 강력했다(도 7).

산업상이용가능성

본 발명에 의해, 종래의 방법 보다도 한층 효율적인 인간 NK세포의 증식 배양이 가능하게 되어, 대량의 NK세포를 용이하게 얻을 수 있다. 종양환자 PBMC를 재료로 하여 본 발명에 의해 얻어진 NK세포는, 그 환자 본인의 체내로 거절반응 등의 문제없이 되돌리는 것이 가능하기 때문에, 종양 치료나 감염증 치료에 적용할 수 있다.

Claims

말초혈 단핵구세포와 인간 빌름스종양 세포주 HFWT를 혼합 배양하는 공정을 포함하는, 인간 내츄럴 킬러세포의 증식방법.
제1항에 있어서, 인간개체로부터 분리한 말초혈 단핵구세포를 사용하여, 상기 인간개체 자신의 내츄럴 킬러세포를 증식시키는 방법.
제2항에 있어서, 인간개체가 종양환자인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미리 증식능을 상실시킨 인간 빌름스종양 세포주 HFWT를 사용하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인터류킨-2의 존재하에서 배양을 행하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조할 수 있는 인간 내츄럴 킬러세포.
종양환자로부터 분리한 말초혈 단핵구세포를 사용하여 제1항의 방법에 의해증식시킨 상기 종양환자 자신의 내츄럴 킬러세포를 포함하는, 상기 종양환자를 위한 종양치료제.
인간 내츄럴 킬러세포의 세포상해활성 측정방법으로서, 인간 빌름스종양 세포주 HFWT와 인간 내츄럴 킬러세포를 혼합 배양하고, 배양후에 생존한 표적세포를 염색하는 공정을 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 염색에 크리스탈 바이올렛을 사용하는 방법.