KR20040108672A - 올리고뉴클레오티드 및 그 유사체의 정제방법 - Google Patents

올리고뉴클레오티드 및 그 유사체의 정제방법 Download PDF

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KR20040108672A
KR20040108672A KR10-2004-7014747A KR20047014747A KR20040108672A KR 20040108672 A KR20040108672 A KR 20040108672A KR 20047014747 A KR20047014747 A KR 20047014747A KR 20040108672 A KR20040108672 A KR 20040108672A
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조한센잭티.
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아베시아 바이오테크놀러지, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 불순물로부터 올리고뉴클레오티드를 분리하는 방법 개시한다. 본 발명의 방법에서, 표적 올리고뉴클레오티드 및 불순물을 포함하는 혼합물에서의 표적 올리고뉴클레오티드를, 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 이용하여 불순물로부터 분리한다. 표적 올리고뉴클레오티드를 적정 가능한 음이온 교환 조성물에 결합시키고, 시간에 따라 pH를 증가시키는 용리액을 표적 올리고뉴클레오티드가 결합된 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 통해 통과시킨다. 바람직하게는, 용리액이 실질적으로 그 염 농도를 증가시키지 않는다. 표적 올리고뉴클레오티드를 용리시키고, 그럼으로써 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 낮은 pH 또는 더 높은 pH에서 용리되는 불순물로부터 분리한다.

Description

올리고뉴클레오티드 및 그 유사체의 정제방법{Purification methods for oligonucleotides and their analogs}
지난 수년간, 올리고뉴클레오티드 및 그 유사체의 대규모 합성(예를 들어, kg 단위)은 현저한 발전이 이루어졌다. 이러한 발전 중 많은 부분은 단일 합성에서 μmol 내지 mol의 양으로 생산할 수 있는 자동화된 고체상 DNA 합성기(synthesizer)로 인한 것이다. 일반적으로, 합성 올리고뉴클레오티드의 합성은 가장 일반적으로 고체상 지지체에 부착된 초기 올리고뉴클레오티드 체인에 특정 올리고뉴클레오티드(5' 히드록시 말단이 보호기(예: 디메톡시트리틸기(DMT))로 보호된 올리고뉴클레오티드)를 단계적으로 부가하는 일련의 시스템 반응을 거쳐 수행된다.
그러나, 합성 올리고뉴클레오티드 생산의 기술적 발전에도 불구하고, 모노머를 초기 올리고뉴클레오티드 체인에 단계적으로 부가하는 동안 결합 반응중 약 1-2%가 실패한다. 그 결과, 생성되는 생성물은 일반적으로 길이가 다른 올리고뉴클레오티드의 이종 혼합물이며, 바람직하지 않은 오염물(예: 실패 서열)의 양은 바람직한 생성물의 길이 및 전체적인 합성 수율에 비례한다. 그 결과, 이것은 올리고뉴클레오티드의 정제를 위한 제조 기술을 개발하는데 관심을 불러 일으켰다.
실패 서열로부터 충분한 길이의 표적 올리고뉴클레오티드를 분리하거나 정제하기 위한 여러 기술이 개발되었으며, 그러한 기술로는 박층 크로마토그래피(TLC), 겔 전기영동(예: 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)), 및 액체 크로마토그래피 기술(예: 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)) 등이 있다. 합성 올리고뉴클레오티드의 대규모의 분리를 위해서, 지금까지 이용된 두 가지 주요 크로마토그래피 기술은 음이온 교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피이다. 그러나, 이러한 종래의 두 가지 크로마토그래피 분리 방법은 모두 시간이 너무 소요될 뿐만 아니라 비용이 소요된다.
합성된 뉴클레오티드를 역상 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 경우, 5'-O-트리틸기와 같은 소수성 5' 보호기는 결합 및 산화 단계동안 올리고뉴클레오티드의 5'-히드록실기를 보호하는데 사용된다. 그런 다음, 소수성 5'-보호기는 트리틸이 결합된 충분한 길이의 표적 올리고뉴클레오티드를 소수성 5'-보호기를 갖지 않는 더 짧은 실패 서열(즉, 트리틸기가 없는 서열)로부터 분리하는데 사용될 수 있다. 분리 후에, 트리틸기는 산을 이용하여 표적 올리고뉴클레오티드로부터 분리할수 있다. 이것은 효과적인 접근법인 반면에, 시간 소모적이며 힘이 들며, 정제된 생성물을 분리하기 위해 이후에 가수분해 및 추출단계를 필요로 한다.
음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 합성된 올리고뉴클레오티드를 분리하는 경우에, 고정된 양전하를 갖는 음이온 교환 조성물이 표적 올리고뉴클레오티드 및 실패 서열(둘 모두 다가 음이온)을 결합시키는데 사용된다. 표적 올리고뉴클레오티드 및 실패 서열을 음이온 교환 조성물에 결합시키는 강도는 직접적으로 그들의 길이에 비례한다. 따라서, 결합된 표적 올리고뉴클레오티드 및 실패 서열을 용리시키는데, 올리고뉴클레오티드와 음이온 교환 조성물과의 상호 작용을 약화시키기 위해 음이온 염 경사를 전형적으로 이용한다. 결합의 강도는 올리고뉴클레오티드의 길이에 비례하기 때문에, 가장 짧은 올리고뉴클레오티드가 가장 먼저 용리되고, 더 긴 올리고뉴클레오티드가 더 높은 염 농도에서 용리된다. 올리고뉴클레오티드의 음이온 분리에서의 염 경사의 사용은 많은 이유로 인해 단점이 있다. 첫째, 원하는 용리된 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 다운스트림 적용에서 사용하기 전에 탈염되어야 한다. 따라서, 이것은 이후의 탈염 단계를 필수적으로 필요로 하며, 이로 인해 분리에 필요한 시간, 노동, 및 비용이 증가된다. 둘째, 용리 용액에서 염을 고농도로 사용하는 것으로 인해 음이온 교환 분리를 위해 사용되는 기계의 스테인레스 스틸 부분(예: HPLC 펌프, 피팅(fittings). 밸브, 컬럼, 튜빙(tubing))의 부식이 증가될 수 있다.
따라서, 현재의 방법과 관련된 단점 및 문제를 극복하고 완화한 향상된 올리고뉴클레오티드 분리 방법의 필요성이 있다.
합성 올리고뉴클레오티드는 다양한 적용을 위해 중요한 생분자로서 나타났다. 그러한 적용에는 합성 올리고뉴클레오티드를 혼성화 프로브, 링커, DNA 시퀀싱을 위한 프라이머, 증폭 반응(예: PCR(polymerase chain reacrion), 역전사), 안티센스에서의 잠재적 치료제, 그리고 관련 기술 연구 및 유전자와 바이러스 질환의 진단 도구에 사용하는 것을 포함한다. 또한, 합성 올리고뉴클레오티드 유사체는 CMV의 치료에 대해 FDA 인증을 받았으며, 현재 여러 올리고뉴클레오티드 유사체가 임상 시험 중이다.
본 발명은 불순물로부터 올리고뉴클레오티드를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서, 표적 올리고뉴클레오티드 및 불순물을 포함하는 혼합물에서의 표적 올리고뉴클레오티드는 적정 가능한 음이온 조성물을 이용하여 불순물로부터 분리한다. 표적 올리고뉴클레오티드를 적정 가능한 음이온 교환 조성물에 결합시키고, 시간에 따라 pH를 증가시키는 용리 용액을 상기 표적 올리고뉴클레오티드가 결합된 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 통해 통과시킨다. 바람직하게는, 용리 용액은 실질적으로 염 농도를 증가시키지 않는다. 그런 다음, 표적 올리고뉴클레오티드를 용리시키고, 그럼으로써 그것을 표적 올리고뉴클레오티드와 다른 pH에서 용리되는 불순물로부터 분리한다. 선택적으로, 표적 올리고뉴클레오티드를 용리하기 전에 하나 이상의 세척 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 방법은 일차 아민, 이차 아민, 또는 삼차 아민을 포함한 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 포함한 다양한 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 이용하여 수행될 수 있다. 적절한 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 폴리이미자돌, 폴리히스티딘, 폴리라이신, 또는 폴리에틸렌이민을 포함한 음이온 교환 조성물을 포함한다. 한 구현예에서, 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 예를 들어, 합성 폴리머 지지체(예: 실리카겔, 폴리사카라이드, 폴리스티렌, 특히 스티렌-디비닐벤젠 코폴리머, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 또는 예를 들어 Sepharose 상표로 입수 가능한 아가로오스와 같은 아가로오스)와 같은 지지체에 접합된다. 바람직하게는, 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 선태적으로 링커 그룹을 경유하여 지지체에 공유결합 된다. 지지체는 작용기 부여(functionalized) 지지체일 수 있다. 그러한 작용기 부여 지지체의 예는 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 히드록시 또는 아미노-작용기 부여 지지체, 특히 히드록시 또는 아미노-작용기 부여 폴리스티렌을 포함한다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥 핵산을 포함한 다양한 올리고뉴클레오티드를 분리하는데 이용될 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)과 같은 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 택일적으로는, 본 발명의 방법은 합성 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트, 포스포라미데이트, 및 키메라를 분리하는데 이용될 수 있다.
한 구현예에서, 분리되는 표적 올리고뉴클레오티드는 5'-O-보호된다(예를 들어, 5'-O-디메톡시트리틸과 같은 5'-O-트리틸 보호기로 보호된다). 선택적으로, 용리하기 전에 표적 올리고뉴클레오티드는 적정 가능한 음이온 교환 조성물에 결합되어 있는 상태로 둔 채 표적 올리고뉴클레오티드로부터 5'-O-보호기를 절단한다. 5'-O-트리틸 보호기의 분리는 표적 올리고뉴클레오티드를 용리하기 전에 충분한 양의 산성 용액(예: 수성 아세트산을 포함하는 용액(예: 20%-80% v/v 아세트산))을 표적 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 통해 통과시킴으로써 이루어진다.
용리 용액이 pH를 증가시킬 수만 있다면, 다양한 용리 용액을 이용하여 표적 올리고뉴클레오티드를 용리할 수 있다. 표적 올리고뉴클레오티드를 불순물로부터분리하는 것은 실질적으로 시간에 따라 염농도를 증가시키는 것 없이 이루어질 수 있다. 적절한 용리 용액은 표적 올리고뉴클레오티드를 적정 가능한 음이온 교환 조성물에 결합시키기에 적절한 pH에서 시작하고, 적정 가능한 음이온 교환 조성물이 표적 올리고뉴클레오티드에 결합할 수 없도록 시간에 따라 pH를 증가시키는 것이다.
본 발명의 방법은 표적 올리고뉴클레오티드를 다양한 불순물로부터 분리시키는데 사용될 수 있다. 그러한 불순물로는 표적 올리고뉴클레오티드와 다른 분자 구조를 갖는 임의의 조성물을 포함한다. 한 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드로부터 분리되는 불순물은 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 짧은 길이를 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드(예: 하나 이상의 실패 서열)이다. 이 구현예에서, 불순물(즉, 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 짧은 길이를 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드)은 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 낮은 pH에서 용리된다. 또 다른 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드로부터 분리되는 불순물은 하나 이상의 염, 특히 금속염을 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 표적 올리고뉴클레오티드의 농도를 증가시키는데 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드는 표적 올리고뉴클레오티드가 원래 함유되어 있었던 부피보다 적은 부피의 용액으로 표적 올리고뉴클레오티드를 용리시킴으로써 농축시킨다.
본 발명의 방법은 올리고뉴클레오티드를 분리하거나 정제하는데 전형적으로 필요로 하는 더 많이 힘이 들고 시간이 소요되는 종래의 분리 단계들을 피한다는점에 있어서 유리하다. 올리고뉴클레오티드를 분리하는데 필요한 단계의 수를 감소시킨다는 점에 있어서, 본 발명은 대규모의 올리고뉴클레오티드 정제를 위해 신속하고, 간편하고, 보다 효율적이며, 보다 저렴한 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
이하, 본 발명의 바람직한 구현예를 설명한다.
본 발명은 불순물로부터 올리고뉴클레오티드를 분리하거나 정제하는 방법에 관한 것이다. 여기에서 사용된 용어 "분리" 및 "정제"는 서로 바꿔서 사용될 수 있으며, 특정 분자 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 서로 다른 분자 구조를 갖는 불순물로부터 물리적으로 격리하는 방법을 말한다. 그러한 격리는 부분적이거나 완전할 수 있다.
여기에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 선택적으로 변형된 포스포디에스테를 결합에 의해 공유결합된 뉴클레오티드의 올리고머 또는 폴리머를 포함한다. 뉴클레오티드는 유기 염기에 연결된 펜토오스에 연결된 선태적으로 변형된 포스페이트기를 포함하는 공통된 구조를 갖는다. 펜토오스가 리보오스라면, 그 핵산은 RNA이고 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다. 펜토오스가 2'-데옥시리보오스라면, 그 핵산은 DNA이고 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 약 2 보다 더 큰 pH를 갖는 수용액에서, 매우 친수성이 있는 핵산의 당-포스페이트 폴리머 백본은 각각의 포스포디에스테르로 인해 하나의 음전하와 모든 종결 포스포모노에스테르로 인해 하나 이상의 음전하를 제공한다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 대략적으로 그 길이에 비례하는 순 음전하를 갖는 폴리음이온이다. 매우 다양한 염기가 펜토오스에 부착될 수 있으며, 자연적으로 생성되는 DNA 및 RNA에서 우위를 나타내는 5개는 아데닌("A"), 티민("T", 주로 DNA에서), 우라실("U", 주로 RNA에서), 구아닌("G"), 및 시토신("C")이다.
여기에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 바꿔서 사용할 수 있으며, 수 개(예: 2-20 개)로부터 많은(예: 20 내지 수백이상 예을 들어 250 이하) 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 멀티머 또는 올리고머르 말한다. 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 및 단일 가닥 핵산, 예를 들어 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드 및 합성 올리고뉴클레오티드 모두를 포함한다.
여기에서 사용된 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드는 생명체에서 발견되는 핵산, 예를 들어 게놈 DNA, 상보적 DNA(cDNA), 염색체 DNA, 플라스미드 DNA, mRNA, tRNA, 및 rRNA를 포함하지만 이에 한정되지 않는 핵산이다. 그러한 자연적으로 생성되는 핵산은 또한 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 또는 변형을 함유하는 자연적으로 생성되는 핵산과 같은 변형된 핵산(예: 다형성 또는 대립형질 변이)을 포함한다. 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드는 여기에 기재된 방법 및/또는 다른 공지의 방법을 이용하여 생명체로부터 분리된 핵산을 포함한다.
합성 올리고뉴클레오티드는 생명체로부터 분리된 것이라기 보다는 인공적 수단에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드는 잘 알려진 방법 및/또는 상업적으로 사용 가능한 방법(예: 자동화된 핵산 합성기 또는 다른 화학적 합성법)을 이용하여 고체상에 제조된 올리고뉴클레오티드를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 합성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다. 여기에 사용된 변형된 뉴클레오티드는 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 다르도록 구조적으로 변경된 뉴클레오티드이다. 그러한 변형 뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티, 변형된 포스페이트 모이어티, 및/또는 변형된 핵염기를 함유하는 뉴클레오티드를 포함한다.
당 모이어티의 변형은 리보오스 고리를 헥소오스, 시클로펜틸, 또는 시클로헥실 고리로 치환하는 것을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 택일적으로, 자연적으로 생성되는 핵산의 D-리보오스 고리는 L-리보오스 고리로 치환되거나, 자연적으로 생성되는 핵산의 β-아노머는 α-아노머로 치환될 수 있다.
변형된 핵산은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트, 포스포라미데이트 등, 또는 그들의 조합을 포함한다. 그러한 변형된 포스페이트 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 유일한 포스페이트 디에스테르 연결을 포함하는 해당 올리고뉴클레오티드와 비교할 때 향상된 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 변형된 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드는 생명체에 존재할 수 있는 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 향상된 내성을 가질 수 있다(예: 안티센스 적용에 사용 시).
변형된 핵염기는 7-데아자구아닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 5-프로피닐시토신, 5-프로피닐우라실, 7-데아자아데닌, 7-데아자-8-아자아데닌, 7-데아자-6-옥소퓨린, 6-옥소퓨린, 3-데아자아데노신, 2-옥소-5-메틸피리미딘, 2-옥소-4-메틸티오-5-메틸피리미딘, 2-티오카보닐-4-옥소-5-메틸피리미딘, 4-옥소-5-메틸피리미딘, 2-아미노-퓨린, 5-플루오로우라실, 2,6-디아미노퓨린, 8-아미노퓨린, 4-트리아졸로-5-메틸티민, 및 4-트리아졸-5-메틸우라실을 포함한다.
하나 이상의 변형된 당 모이어티, 포스페이트 모이어티, 및/또는 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 생성시키는 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다. 키메릭 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 연결 모두를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 또한 포함된다.
변형된 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드에 통합시키는 동안 또는 그 후에, 예를 들어 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트를 증폭반응(예: 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용)동안 핵산 폴리머에 통합시킴으로써 생성시킬 수 있다. 이미 기재한 것 이외에, 그러한 변형 뉴클레오티드는 디데옥시뉴클레오티드, 비오티닐화 뉴클레오티드, 아민-변형 뉴클레오티드, 알킬화 뉴클레오티드, 형광발색단-라벨 뉴클레오티드, 라디오라벨 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트, 포스포라미다이트, 포스파이트, 고리 원자-변형 유도체 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다중 변형 뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드들의 임의의 조합을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 또한 본 발명에 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 백본, 예를 들어 단백질-핵산(PNAs) 또는 PNA 하이브리드를 갖는 올리고뉴클레오티드 폴리머를 포괄한다. 그러한 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 폴리머를 생산하는 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법은 합성 올리고뉴클레오티드를 불순물로부터 분리하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 분리되어야 할 합성 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 약 2 내지 약 100 개의 뉴클레오티드, 약 2 내지 약 75 개의 뉴클레오티드, 또는 약 4 내지 약 50 개의 뉴클레오티드의 바람직한 길이를 갖는다. 현재 치료제로서 관심이 있는 많은 합성 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 약 40 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 분리되어야 할 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 약 40 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
올리고뉴클레오티드를 획득하기 위한 수많은 전략이 존재한다. 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드는 생명체, 동물 또는 인간의 임상 시험 샘플(예: 진단 및/또는 예방 목적을 위해 수집한 시험 샘플)로부터의 조직, 및/또는 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 생물학적 물질로부터 획득할 수 있다. 그러한 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드를 획득하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 세포는 용해될 수 있으며, 그 결과물인 용해물은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 기술을 이용하여 처리하여 핵산(예: DNA 및/또는 RNA) 수용액을 획득할 수 있다(예를 들어, Ausebel, F., et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York (1998);Maniatia, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)).
택일적으로, 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드 또는 합성 올리고뉴클레오티드는 생물학적 방법, 화학적 방법, 또는 생물학적 방법 및 화학적 방법의 조합을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 재조합 핵산 방법, 인공 재조합(예: 중합효소 연쇄반응(PCR)), 또는 다양한 클로닝 전략(예: 벡터 및/또는 제한 효소를 이용하는 것)을 이용하여 생물학적으로 생성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 예를 들어 자동화된 핵산 신씨사이저 또는 다른 공지의 화학적 합성방법을 이용하여 화학적으로 생성될 수 있다. 오늘날에는 자동화된 신씨사이저를 이용하여 방대한 양의 올리고뉴클레오티드가 생산된다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체에 부착된 성장하는 올리고뉴클레오티드 체인의 최종 뉴클레오티드 잔기의 탈보호된 5'-위치와 함께 5'-보호된 뉴클레오티드(각각의 포스페이트기에서 활성화)를 한 단계씩 정해진 순서대로 반응시킴으로써 3'에서 5'으로 합성된다. 가장 보편적으로 사용되는 5'-위치에 대한 보호기는 매우 소수성이며, 예를 들어 5'-O-트리틸 보호기(예: 5'-O-디메톡시트리틸)가 있다.
올리고뉴클레오티드는 본 발명의 방법에 이용되기 전 및/또는 후에 다양한 분자 생물학 및/또는 분리 기술로 처리될 수 있다. 그러한 분리 기술의 예는 친화도 분리(예: 핵산 혼성화), 전기영동 분리(예: 크기 분획화 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드 겔), 및/또는 크로마토그래피 분리(예: HPLC, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피)(예를 들어, Ausebel, F., et al., Current Protocolsin Molecular Biology, Wiley, New York(1998); Maniatis, F., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1982)). 본 발명의 방법은 다른 분리 방법과 함께 조합하여 이용될 수 있다(예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피).
본 발명의 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 혼합물에 존재한다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물은 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액을 포함한다. 그러한 혼합물은 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 샘플을 포함한다(예: 살아 있거나 죽은 자연적으로 생성되는 또는 인공적으로 증식된 단세포 또는 다세포 생명체). 택일적으로, 그 혼합물은 합성 올리고뉴클레오티드를 함유하는 샘플을 포함할 수 있다.
한 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물은 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 짧은 길이를 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다. 바람직한 구현예에서, 혼합물은 올리고뉴클레오티드의 합성 혼합물이며, 예를 들어 자동화된 신씨사이저를 이용하여 획득된 합성 혼합물이다. 이 구현예에서, 그 혼합물은 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것 이외에 절단된 실패 서열을 더 포함한다. 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있는 다른 혼합물은 완충용액, 예를 들어 Tris계 용액, MOPS계 용액, HEPES계 용액, 아세테이트계 용액, 및 포스페이트계 용액과 같은 완충용액을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 화학적 또는 생물학적 적용에 전형적으로 사용되는 용액을 포함하는 혼합물 또한 포함될 수 있다. 그러한 혼합물은 표적 올리고뉴클레오티드를 합성할 때 얻어지는 샘플(예: PCR 산물을 포함하는 샘플, 자동화된 신씨사이저로부터 획득된 샘플), 표적 올리고뉴클레오티드를 시퀀싱할 때 획득되는 샘플, 또는 올리고뉴클레오티드를 분리할 때 획득되는 샘플(예: 크로마토그래피 분리로부터 획득되는 샘플)을 포함한다. 한 종류 이상의 올리고뉴클레오티드의 조합(예: 자연적으로 생성되는 올리고뉴클레오티드 및 합성 올리고뉴클레오티드 모두를 포함하는 혼합물)을 함유하는 혼합물이 또한 포함된다.
본 발명의 방법은 표적 올리고뉴클레오티드를 불순물로부터 분리한다. 여기에서 정의되는 불순물은 표적 올리고뉴클레오티드와 다른 분자 구조를 갖는 조성물이다. 표적 올리고뉴클레오티드로부터 불순물을 분리하는 것은 부분적 또는 실질적으로 완전할 수 있다. 소정의 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드로부터 분리되는 불순물은 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 길이를 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드로부터 분리되어야 할 불순물은 표적 올리고뉴클레오티드를 합성하는 동안 생성된 하나 이상의 실패 서열을 포함한다. 그러한 실패 서열은 합성 올리고뉴클레오티드의 생산에서, 모노머를 초기의 올리고뉴클레오티드 체인에 부가하는 각각의 단계동안 결합 반응의 약 1-2%가 실패할 수 있다(즉, 모노머 부가가 일어나지 않는다). 그 결과, 생성물은 일반적으로 원치 않는 불순물 또는 오염물(예: 실패 서열)이 원하는 생성물의 길이 및 총 합성량에 비례하는, 다양한 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드의 이종 혼합물이다. 대부분의 다운스트림 적용에서, 표적 올리고뉴클레오티드를 그러한 실패 서열로부터 분리하는 것이 필수적이다.
또 다른 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드로부터 분리되어야 할 불순물은 염(즉, 이온 염), 특히 금속염을 포함한다. 염은 예를 들어, 음이온 교환 크로마토토그래피를 이용하여 얻어진 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 샘플에서 종종 발견되는 통상적인 불순물이다. 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 샘플에서 염의 존재는 표적 올리고뉴클레오티드를 사용하기 전에 염을 제거하기 위해 전형적으로 하나 이상의 그 이후의 분리 또는 탈염 단계를 필수적으로 요구한다. 여기에 기재한 바와 같이, 본 발명의 방법은 올리고뉴클레오티드를 용리해 내기 위해 염 경사를 요구하지 않고 따라서 이후의 탈염 단계를 필요로 하지 않는다는 점에 있어서 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 염 불순물 농도의 실질적인 감소를 이루기 위해 적용될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드로부터 분리할 수 있는 염에는 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, NaHCO3, Na2CO3, NaOH, NH4Cl, NaOC(O)CH3, 및 NaClO4등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법을 이용하여 분리될 수 있는 그 이외의 염들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다.
염이 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 혼합물에 존재할 때, 그 염은 두 가지 메커니즘에 의해 표적 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 수 있다. 그 염이 표적 올리고뉴클레오티드 또는 음이온 교환 조성물과 결합하지 않을 경우, 그것은 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 통해 간단하게 통과할 것이며, 따라서 결합되어 이후에 더 높은 pH에서 용리되는 표적 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 것이다.택일적으로는, 그 염이 표적 올리고뉴클레오티드 또는 음이온 교환 조성물과 결합할 경우, 표적 올리고뉴클레오티드를 용리하기 전에 표적 올리고뉴클레오티드가 결합된 음이온 교환 조성물을 적절한 세척 용액으로 세척함으로써 그 염이 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 용리하기 전에 표적 올리고뉴클레오티드가 결합된 음이온 교환 조성물을 하나 이상의 세척 단계에 노출시킨다. 본 발명의 방법에 적절한 세척 용액은 적절한 pH를 가져서 적정 가능한 음이온 교환 조성물로부터 표적 올리고뉴클레오티드를 분리시키지 않고 불순물을 제거할 수 있는 것이다. 그러한 세척 용액에는 물 및 완충용액(예: Tris계 용액, MOPS계 용액, HEPES계 용액, 아세테이트계 용액, 포스페이트계 용액)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있는 음이온 교환 조성물을 세척하기 위해 사용될 수 있는 다른 적절한 용액은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 방법은 핵산을 정제하기 위하여 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 이용한다. 여기에 기재된 바와 같이, 음이온 교환 조성물은 양전하, 및 음전하의 치환 가능한 이온(반대이온(counterions))을 함유하는 조성물이다. 따라서, 음이온 교환 조성물은 음전하를 갖는 분자를 결합할 수 있어 음전하를 갖는 반대이온을 치환시킬 수 있다. 본 발명의 음이온 교환 조성물은 바람직하게는 고체 조성물이다.
본 발명에 사용된 음이온 교환 조성물은 적정 가능하다. 여기에 사용된 "적정 가능한 음이온 조성물"은 pH의 증가 시 양전하를 소실할 수 있는 음이온 교환 조성물이다. 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 pH가 약 7.0에서 약 12.0으로 증가할 때 양전하를 잃는다. 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 일급 아민, 이급 아민, 또는 삼급 아민을 포함하는 조성물을 포함한다. 적절한 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 폴리이미다졸, 폴리히스티딘, 폴리라이신, 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌이민, 변형 폴리에틸렌이민, 및 폴리(에틸렌-이민/옥시에틸렌)을 포함하는 음이온 교환 조성물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 pH가 약 8에서 약 11로 증가 시 양전하를 소실하는 폴리에틸렌이민이다.
특정 이론에 얽매이기를 바라는 것은 아니지만, 본 발명에 사용되는 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 프로톤화되는 원자(예: 질소 원자)를 가지며, 그리하여 중성 및 낮은 pH에서 양으로 하전된다. 예를 들어, 폴리에틸렌이민은 약 5-8의 pH(또는 더 낮은 pH)에서 양으로 하전된 질소원자를 갖는다. 용리액의 pH가 서서히 증가하면, 폴리에틸렌이민의 질소 원자는 탈프로톤화 하기 시작한다. 따라서, 예를 들어 표적 올리고뉴클레오티드를 실패 서열로부터 분리할 때, 폴리에틸렌이민을 이용하면 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 짧은(그리하여 더 적은 음전하를 갖는) 실패 서열이 더 길고 더 많은 음으로 하전된 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 낮은 pH에서 폴리에틸렌이민으로부터 방출되도록 한다. pH가 증가함에 따라, 폴리에틸렌이민의 더욱 더 많은 질소원자들이 탈프로톤화되고, 그로 인해 더 긴 실패 서열 및 표적 올리고뉴클레오티드가 방출된다. 최종적으로, 더 높은 pH에서 폴리에틸렌이민의 모든 질소 원자가 탈프로톤화되고, 따라서 음을 하전된 올리고뉴클레오티드를 보유할 수 없다.
그러므로, 적정 가능한 음이온 교환 조성물(예: 폴리에틸렌이민)을 사용하면 결합된 올리고뉴클레오티드를 용리시키기 위해 염 경사를 이용할 필요가 없으며, 보다 신속하고 효율적이며 경제적인 올리고뉴클레오티드 분리방법을 제공한다.
일 구현예에서, 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 지지체에 접합시킨다. 음이온 교환 조성물을 지지체에 접합시키는 것은 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법(예: 공유결합, 선택적으로 디비닐 술폰 링커 또는 에피클로로히드린 링커와 같은 링커 그룹에 의해)에 의해 수행할 수 있다. 바람직하게는, 적정 가능한 음이온 교환 조성물의 고정된 양전하 및 음전하의 치환가능한 이온(반대이온)이 올리고뉴클레오티드에 접근 가능하도록(즉, 표면에 노출되도록), 접합을 수행한다. 적절한 지지체로는 고형 또는 반고형 지지체가 있으며, 예를 들어 실리카(예: 실리카 겔), 폴리사카라이드, 합성 올레핀(폴리스티렌(예: 스티렌-디비닐벤젠 코폴리머), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴(예: 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트)과 같은 합성 폴리머 지지체, 예를 들어 상표명이 Sepharose로서 상업적으로 입수 가능한 아가로오스와 같은 아가로오스가 있다. 당해 기술분야에 공지되어 있는 다른 적절한 지지체가 또한 본 발명에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 폴리에틸렌이민-유도 실리카 겔 또는 폴리에틸렌이민-유도 스티렌-디비닐 벤젠 코폴리머이다. 또 다른 구현예에서, 적정 가능한 음이온 조성물은 지지체에 접합되지 않는다. 오히려, 고체의 적정 가능한 음이온 교환 조성물 그 자체가 올리고뉴클레오티드가 결합하고 방출될 수 있는 지지체로서 작용한다.
본 발명의 소정의 구현예에서, Millipore로부터 Matrex Silica라는 상표명,예를 들어 Matrex Silica PEI-300 및 Matrex Silica PEI-100으로 상업적으로 입수 가능한 적정 가능한 음이온 교환 조성물인 폴리에틸렌이민-유도 실리카를 사용함으로써 좋은 결과가 얻어졌다.
본 발명의 방법에서 사용되는 적정 가능한 음이온 교환 조성물의 농도 및 양은 수 많은 인자, 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물의 양 및 특성, 그 혼합물 중의 올리고뉴클레오티드의 농도 및 특성, 그리고 그 혼합물 중의 불순물의 농도 및 특성에 의존한다. 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 적절치 않은 실험을 수행할 필요 없이 표적 올리고뉴클레오티드를 결합시키기에 적절한 적정 가능한 음이온 교환 조성물의 적절한 양을 결정할 수 있다.
유사하게, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 적절치 않은 실험을 수행해야 할 필요 없이 분리를 수행하기 위해 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, 표적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 상대적으로 순수한 혼합물 또는 표적 올리고뉴클레오티드와 구조적으로 완전히 다른 불순물을 포함하는 혼합물에 있어서, 분리는 상대적으로 신속하게, 예를 들어 유속의 증가를 이용하여 진행할 수 있다. 또는, 매우 이종인 혼합물 또는 표적 올리고뉴클레오티드와 유사한 불순물을 함유하는 혼합물의 경우에는, 분리 속도의 감소(예: 유속의 감소) 및/또는 부가적인 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 이용함으로써 해상도를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
적절한 분리를 수행하기 위해 변경할 수 있는 또 다른 중요한 변수는 용리액의 pH의 변화 속도이다. 다시, 분리 특성에 따라, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 적절한 pH 용리 프로파일(예: 연속적인 pH 경사, 단계적 pH 경사, pH의 빠른 속도의 변화, pH의 느린 속도의 변화)을 결정할 수 있을 것이다.
pH를 증가시키는 다양한 용리액이 본 발명의 방법에 사용될 수 있으며, 원하는 pH를 이루기 위해 적절히 완충화된 용액, 예를 들어 트리스계 용액, MOPS계 용액, HEPES계 용액, 아세테이트계 용액, 포스페이트계 용액을 포함한다. 음이온 교환 분리에 전형적으로 사용되고 당해 기술분야에 알려져 있는 다른 용액을 또한 포함한다. 그 용리액은 또한 하나 이상의 이온 염, 예를 들어 NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, NaHCO3, Na2CO3, NaOH, NH4Cl, NaOH 등을 함유할 수 있으나, 여기에 기재한 바와 같이 용리액은 염 경사를 이용하지 않는다. 본 발명의 방법에 사용되는 용리액의 부피는 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 포화시키는데 충분해야 한다.
바람직한 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드가 결합된 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 통해 통과하는 용리액은 pH를 시간에 따라 증가시키지만 동일한 시간동안 실질적으로 염농도를 증가시키지 않는다. 여기에서 정의된 바와 같이, 염 농도의 "실질적인 증가"의 결여는 일어나는 염 농도의 임의의 증가가 적정 가능한 음이온 교환 조성물로부터 표적 올리고뉴클레오티드의 용리에 현저하게 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 사용되는 용리액은 실질적으로 일정한 염 농도를 갖는다. 여기에서 사용된 "실질적으로 일정한" 염 농도는 염 농도의 임의의 변화(증가 또는 감소)가 적정 가능한 음이온 교환 조성물로부터 표적 올리고뉴클레오티드의 용리에 현저하게 영향을 주지 않을 정도로 작다는 것을 의미한다. 택일적으로는, 용리액의 염 농도가 시간의 경과에 따라 감소할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 용리액은 실질적으로 금속염이 없다. 여기에서 사용된 "실질적으로 금속염이 없다"는 것은 그 용액이 실질적인 양의 금속염을 함유하지 않는다는 것을 의미한다(즉, 금속염이 없거나, 올리고뉴클레오티드를 이용하는 다운스트림 적용에 영향을 주지 않을 정도로 거의 없다). 본 발명의 중요한 일 측면은 올리고뉴클레오티드의 전형적인 음이온 교환 분리와는 달리, 본 발명의 방법은 용리를 위해 pH 경사를 이용하는 것이지 염 경사를 이용하지는 않는다는 것이다.
본 발명에 사용되는 용리액은 pH를 연속적인 방식으로 증가시키는 용액뿐만 아니라 pH를 단계적인 방식으로 증가시키는 용액을 포함한다. 일 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드를 용리하기 위해 사용되는 용액은 pH를 시간의 경과에 따라 선형적으로 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드를 용리하는데 사용되는 용액은 pH를 약 8로부터 11로 증가시킨다. 바람직하게는, 이 구현예에서, 이용되는 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 폴리에틸렌이민을 포함한다. 용리액은 또한 pH를 적절하게 변화시키기 위한 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 용리액은 NaHCO3, Na2CO3, NaOH, NH4OH, 및/또는 NH4HCO3중 하나 이상을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 용리액은 금속염을 함유하지 않으며, 바람직하게는 NH4HCO3및 특히 NH4OH와 같이 건조 시 휘발가능한 염을 포함한다. 용리 속도가 일반적으로 중요하지 않다고 하더라도, 표적 올리고뉴클레오티드를 용리하는데 사용되는 용액은 일반적으로 약 350 내지 550 cm/시간의 유속으로, 보다 통상적으로는 약 420 내지 450 cm/시간의 속도로 투여한다.
염을 포함하는 용리액은 염-경사 용리에서 이용되는 염 농도보다 실질적으로 더 낮은 염 농도를 갖는다는 것을 인지할 것이다. 종종, pH 경사 용리액에서의 염 농도는 약 0.01 내지 약 0.07 M , 예를 들어 0.05 M과 같이 0.1 M보다 작다. 많은 구현예에서, pH 경사가 있는 pH의 전체적인 증가는 약 100% 이상으로 용리액의 염 농도를 증가시키지 않는다. 소정의 특정 구현예에서, 염 농도는 실질적으로 일정하게 유지되거나 감소하기까지 한다. 용리액의 염 농도는 통상적으로 0.2 M을 넘지 않으며, 바람직하게는 0.1 M을 넘지 않는다. 이것은 염 농도가 전형적으로 약 0.5 M 이상이고, 통상적으로 2 M 또는 그 이상으로 예를 들어 3 내지 4 M까지 증가하는 염 경사를 이용하는 경우와 대조를 이룬다.
본 발명의 방법은 5'-O-보호된 올리고뉴클레오티드의 분리에 이용될 수 있다. 소정의 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드는 적정 가능한 음이온 교환 조성물에 여전히 결합된 상태로 둔 채, 5'-O-보호기를 표적 올리고뉴클레오티드로부터 절단시킬 수 있다. 적절한 5'-O-보호기는 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어 치환 또는 비치환된 트리틸기(예: 4,4'-디메톡시트리틸(DMT))가 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 5'-O-트리틸 보호된 올리고뉴클레오티드(예: 5'-O-디메톡시트리틸 보호된 올리고뉴클레오티드)의 분리를 위해 사용된다. 결합된 올리고뉴클레오티드로부터 보호기의 절단(즉, 적정 가능한 음이온 교환 조성물로부터 용리하기 전)은 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 통해 적절한 시약을 통과시킴으로써 이루어질 수 있다. 트리틸 보호기를 표적 올리고뉴클레오티드로부터 절단하기 위해 적절한 시약은 충분한 양의 산성 용액이다. 많은 구현예에서, 트리틸 보호기(예: 5'-O-DMT)는 아세트산 수용액, 예를 들어 20%-80% v/v 아세트산 수용액을 이용하여 표적 올리고뉴클레오티드로부터 절단할 수 있다.
본 발명의 방법은 올리고뉴클레오티드를 분리하거나 정제하기 위해 전형적으로 요구되는 노력과 시간이 많이 소요되는 종래의 분리 단계를 피한다는 점에 있어서 장점이 있다. 음이온 교환 분리에서 염 경사를 사용할 필요성을 제거하여, 본 발명의 방법은 올리고뉴클레오티드를 분리하기 위해 전형적으로 요구되는 단계의 수를 줄인다. 따라서, 본 발명은 신속하고, 간단하고, 보다 효율적이며, 비용이 적게 소요되는 올리고뉴클레오티드의 대규모 정제방법을 제공한다. 또한, 용리액에서 높은 염농도를 사용하지 않아서, 본 발명의 방법은 크로마토그래프 및 다른 음이온 교환 기계(예: HPLC 펌프, 피팅, 밸브, 컬럼, 튜빙)의 스테인레스 스틸 및/또는 이동 부분의 손상을 줄인다.
본 발명을 다음의 비제한적 실시예에 의해 더욱 설명할 것이다. 여기에 인용된 모든 문헌은 전체가 참고로 여기에 통합된다.
실시예 1
고체상 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드의 정제
다음 기구 및 시약은 편의를 위해 적절한 정보와 함께 나열될 것이다. 달리 나타내지 않았다면, 모든 기구 및 시약은 제조자의 지시사항에 나타난 바에 따라사용하였다. 또한, 달리 나타내지 않았다면, 다른 유사한 기구 및 시약은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 것으로 치환될 수 있다.
시약
폴리에틸렌이민-유도 실리카겔(Matrex Ion Exchange Silica PEI-300-15; 상품번호 S674 (Millipore, Bedford, MA);
완충용액 A; 50 mM NaHCO3용액; pH 8.2;
완충용액 B; 50 mM NaHCO3/Na2CO3용액; pH는 0.1 M NaOH로 11.1로 조정;
완충용액 C; 0.1 NaOH 용액;
완충용액 D; 0.1 M Tris, 2 M NaCl 용액; pH 7.5
올리고뉴클레오티드 TCT-TCG-TGT-TTT-CTA-TTT-TCG-UTT(SEQ ID NO. 1)을 고체 지지체 및 포스포라미다이트 화학을 이용하여 합성하였다. 5'-O-트리틸 보호기를 메틸렌 클로라이드 중의 3% 디클로로아세트산을 이용하여 올리고뉴클레오티드 합성의 마지막에 제거하였다. 그런 다음, 올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 방출시키고 보호기를 진한 수산화암모늄 용액으로 제거하였다. 그런 다음, 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 용액을 1.0 M 인산 용액을 부가함으로써 pH 7.5로 조정하였다(총 올리고뉴클레오티드는 121,950 OD였다).
올리고뉴클레오티드의 분리
PEI-유도 실리카 겔(100 mL) 슬러리를 완충용액 D 중에서 제조하고 유리 컬럼에 8 mL/분의 속도로 충진하였다. 그런 다음, 그 결과 워쉬(wash)가 pH 8.2에도달할 때까지 그 컬럼을 완충용액 C, 완충용액 D, 및 완충용액 A로 세척하였다. 컬럼을 4 컬럼 부피의 완충용액 A로 35 mL/분의 유속으로 세척함으로써 평형화 하였다.
표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 샘플을 35 ml/분의 일정한 유속으로 컬럼에 로딩하였다. 샘플을 로딩한 후, 컬럼을 4 컬럼 부피의 완충용액 A로 세척하였다. 표적 올리고뉴클레오티드를 완충용액 A 및 완충용액 B(20 컬럼 부피의 0 내지 80% 완충용액 B를 435 cm/시간의 유속으로)로 획득되는 pH 경사(pH 8.2 내지 11.1)를 이용하여 분리하였다. 분획을 수집하고 분석 음이온 교환 HPLC를 이용하여 원하는 올리고뉴클레오티드에 대하여 어세이 하였다. 90% 보다 높은 순도를 갖는 분획을 모았다. 올리고뉴클레오티드 생성물의 농축 및 탈염을 UF 멤브레인 여과를 이용하거나 PEI-유도 실리카 겔에 결합시킴으로써 수행하였다. 그런 다음, 올리고뉴클레오티드 생성물을 동결건조 하였다.
컬럼의 재생
표적 올리고뉴클레오티드를 분리한 후, 컬럼을 완충용액 C(1 컬럼 부피), 완충용액 D(2 컬럼 부피), 및 최종적으로 완충용액 A(워시가 8.5 미만의 pH에 도달할 때까지)로 세척함으로써 재생하였다. 그러면, 컬럼은 추가의 분리를 하기에 적절하다.
실시예2
고체상 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드의 탈염 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제
시약
폴리에틸렌이민-유도 실리카겔(Matrex Ion Exchange Silica PEI-300-15; 상품번호 S674 (Millipore, Bedford, MA);
완충용액 A; 0.25 M NH4HHCO3용액; pH 7.5;
완충용액 B; 0.1 M NH4OH;
완충용액 C; MILLI-Q Water;
완충용액 D; 0.1 M NH4OH, 2 M NaCl 용액; pH 7.5
PEI-유도 실리카 겔 슬러리(100 mL)를 완충용액 D 중에서 제조하고, 유리 컬럼에 8 mL/분의 유속으로 충진하였다. 그 후 컬럼을 2 컬럼 부피의 완충용액 D로 세척하였다. 그런 다음, 그 컬럼을 pH가 8 미만이 될 때까지 완충용액 A로 재평형화 하였다.
올리고뉴클레오티드 TCT-TCG-TGT-TTT-CTA-TTT-TCG-UTT(SEQ ID NO. 1)을 실시예 1에서와 같이 합성하였다. 합성 후, 표적 올리고뉴클레오티드를 표준 방법을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 부산물로부터 분리하여, 정제된 올리고뉴클레오티드 및 약 1.5-2.0 M 염화나트륨을 함유하는 pH 12의 용액을 생성시켰다. 그런 다음, 이 용액의 pH를 1.0 M 아세트산으로 7.5로 조정하였다. 그런 다음, 그 샘플을 컬럼에 8 mL/분의 유속으로 로딩하였다(100 OD/mL 레진).
로딩된 컬럼을 우선 5 컬럼 부피의 완충용액 A로 세척한 다음, 전도도가 0.01 milisiemons/cm 미만이 될 때까지 완충용액 C로 세척하였다. 그런 다음, 올리고뉴클레오티드를 완충용액 B를 이용하여 컬럼으로부터 용리하였다. 용리 후, 컬럼을 2 컬럼 부피의 완충용액 A로 세척함으로써 재생하였다.
실시예 3
66%의 전장 생성물(FLP)을 함유하는 18-mer의 충분히 포스포로티오에이트화 데옥시리보뉴클레오티드(5'-디메톡시트리틸)를 완충용액 A가 6.0의 pH를 갖는 것을 제외하고 실시예 1의 방법을 이용하여 정제하였다. 그 정제된 용리된 뉴클레오티드를 분석 시, >94%의 FLP를 갖는 생성물 순도를 나타내었다. 적정 가능한 음이온 교환 지지체로서 PEI-유도 폴리스티렌 비드를 이용할 때, 또한 필적할 만한 결과를 획득하였다.
본 발명은 그 바람직한 구현예를 참조로 하여 구체적으로 나타내고 설명하였지만, 첨부된 청구항이 포괄하는 본 발명이 범위에서 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항의 다양한 변경을 가할 수 있다는 것을 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Avecia Biotechnology, Inc. et al <120> Purification Methods for Oligonucleotides and their Analogs <130> SMC 60475-WO <160> 1 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide purified in Examples 1 and 2 <400> 1 tcgtcgtgtt ttctattttc gutt 24

Claims (25)

  1. a) 표적 올리고뉴클레오티드를 적정 가능한 음이온 교환 조성물과 결합시키는 단계;
    b) 상기 표적 올리고뉴클레오티드가 결합된 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 통해 시간의 경과에 따라 pH를 증가시키는 용액을 통과시키는 단계; 및
    c) 상기 불순물과 다른 pH에서 용리되는 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 용리시키는 단계를 포함하는,
    적정 가능한 음이온 교환 조성물을 이용하여 표적 올리고뉴클레오티드 및 불순물을 포함한 혼합물에서 불순물로부터 표적 올리고뉴클레오티드를 분리하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 일차 아민, 이차 아민, 또는 삼차 아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 폴리에틸렌이민, 폴리이미다졸, 폴리히스티딘, 또는 폴리라이신을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 용액은실질적으로 금속염이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 용액은 시간의 경과에 따라 그 염의 농도를 실질적으로 증가시키지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 지지체에 접합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 지지체는 합성 폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 합성 폴리머는 실리카 겔, 폴리사카라이드, 스티렌-디비닐 벤젠 코폴리머, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴, 및 아가로오스로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 적정 가능한 음이온 교환 조성물은 폴리에틸렌이민-유도 실리카겔 또는 폴리에틸렌이민-유도 스티렌-디비닐 벤젠 코폴리머인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드는 합성 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 합성 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸 포스포네이트, 및 포스포라미데이트로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 상기 적정 가능한 음이온 교환 조성물과의 결합은 pH 5 - 8에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 용액은 pH를 시간의 경과에 따라 선형 방식으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 용액은 pH를 약 8에서 약 11로 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 용액은 하나 이상의 NH4HCO3및/또는 NH4OH를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 약 40 개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불순물은 상기 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 짧은 길이을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드이며, 상기 불순물은 상기 표적 올리고뉴클레오티드보다 더 낮은 pH에서 용리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 불순물은 하나 이상의 실패 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불순물은 금속염인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드는 5'-O-보호된 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드는 5'-O-트리틸, 바람직하게는 5'-O-디메톡시-트리틸 보호된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 용리시키기 전에, 상기 적정 가능한 음이온 교환 조성물을 통해 충분한 양의 산성 용액을 통과시켜 상기 표적 올리고뉴클레오티드로부터 상기 5'-O-트리틸 보호기를 절단시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 산성 용액은 수성 아세트산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 b) 단계에서의 용액은 상기 표적 올리고뉴클레오티드 및 불순물을 포함하는 혼합물의 부피보다 더 적은 부피를 가짐으로써 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 농도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드를 용리하기 전에 하나 이상의 세척 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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