KR20050109934A - 관능기의 단백질로의 공유 테더링 - Google Patents

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마크 맥두갈
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Abstract

목적하는 단백질에 임의로 융합된 돌연변이 하이드롤라제가 제공된다. 돌연변이 하이드롤라제는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정한, 상응 비돌연변이 (야생형) 하이드롤라제에 대한 기질과의 결합을 형성할 수 있다. 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제에 대한 기질뿐만 아니라 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제 및 기질의 이용 방법도 제공된다. 융합 단백질을 발현하는 세포와 기질과의 안정한 결합을 형성할 수 있는 융합 단백질도 제공된다.

Description

관능기의 단백질로의 공유 테더링 {COVALENT TETHERING OF FUNCTIONAL GROUPS TO PROTEINS}
본 출원은 미국 특허법 제119조(e) 하의 미국 특허 출원 제60/444,094(출원일 2003. 1. 31.), 미국 특허 출원 제60/474,659호(출원일 2003. 5. 30.)의 출원일의 이익을 가지며, 상기 출원들을 본원에 참고문헌으로 삽입한다.
본 발명은 생화학적 분석 및 시약 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 관능기에 공유적으로 결합된(테더링) 돌연변이 단백질 및 그 사용 방법에 관한 것이다.
분자의 특정 탐지는 세포 내에서 분자의 역할을 이해하는데 가장 중요한 요소이다. 표지, 예를 들어 목적하는 분자에 공유적으로 결합되는 것들은 복합 혼합물 중에서 분자의 탐지를 용이하게 한다. 표지는 시험관 내에서 화학적으로 합성되거나 또는 생체 내에서, 예를 들어, 재조합 기술에 의해 부착되어 첨가될 수 있는 것이다. 예를 들어, 형광 또는 기타 표지의 단백질로의 부착은 통상적으로 단백질 정제 후 시험관내에서 화학적 변형에 의해 달성되어 왔다(Hermanson, 1996). 표지의 생체내 부착의 경우, 젤리피시 에쿠로리아 빅토리아(Aequorea victoria) 유래의 녹색 형광 단백질(GFP)이 다양한 숙주 단백질과 유전공학적으로 융합되어서 인 시츄(in situ)에서 형광 키메라를 생성할 수 있다(Tsien, 1998; Chalfie et al., 1998). 그러나, GFP-기재의 지시약이 현재 다양한 분석, 예를 들어, pH 측정(Kneen et al., 1998; Llopis et al., 1998; Miesenboeck et al., 1998), Ca2+(Miyawaki et al., 1997; Rosomer et al., 1997) 및 막 전위(Siegel et al., 1997)에 사용되고 있지만, 내재적으로 표지된 단백질의 형광, 예를 들어, GFP는 단백질 구조의 성질, 예를 들어, 제한된 범위의 형광색 및 상대적으로 낮은 내재적 광도에 의해 제한된다(Cubitt et al., 1995; Ormoe et al., 1996).
인 시츄에서 GFP 표지화의 결핍을 해결하기 위해, 그리펜(Griffen, 1998) 등은 분자 성분들의 단단하게 결합된 쌍을 합성하였다: 작은 수용체 도메인은 6개 정도의 작은 천연 아미노산과, 다양한 분광분석 프로브 또는 가교 결합제에 결합될 수 있는 작은(<700 달톤), 합성 리간드로 이루어진다. 수용체 도메인은 α나선의 i, i+1, i+4 및 i+5 위치에서 4개의 시스테인을 포함하고, 리간드는 4',5'-비스(1,3,2-디티오아르솔란-2-일)플루오레세인(FLASH)였다. 그리펜 등은 리간드가 트랜스펙트되지 않은 포유동물 세포에서 비교적 적은 수의 결합 부위를 가지고, 막 투과성이며, 재조합 단백질 중의 테트라시스테인 도메인에 높은 친화도 및 특이성으로 결합될 때까지 비형광성이며, 나노몰 또는 낮은 해리 상수를 가진 형광 표지된("FLASH" 표지된) 세포를 생성하였다는 것을 개시하고 있다. 그러나, 세포 내에서 배경 결합과 관련하여, 스트로페코바(Stroffekova, 2001) 등은 FLASH-EDT2가 내인성 시스테인-농후 단백질에 비특이적으로 결합한다는 것을 개시하고 있다. 아울러, FLASH에 의한 단백질 표지화는 사용될 수 있는 형광발색단의 범위에 의해 제한된다.
수용체 매개된 표적화 방법은 표적화된 단백질이 적절히 폴딩될 수만 있다면, 실제적으로 모든 세포내 부위에 대해 형광발색단을 배치하기 위해서 유전자에 의해 코딩된 표적화 서열을 사용한다. 예를 들어, 파리나스(Farinas, 1999) 등은 세포내 특정 부위로 단일쇄 항체(sFv)를 표적화하기 위해 cDNA 트랜스펙션을 사용하였음을 개시하고 있다. 파리나스 등은 살아 있는 챠이니즈 햄스터 난소 세포에서 sFv에 대해 세포내 부위에서 헵텐(4-에톡시메틸렌-2-페닐-2-옥사졸린-5-온, phOx) 및 형광 프로브(예를 들어, BODIPY Fl, 테트라메틸로다민 및 플루오레세인)의 컨쥬게이트가 높은 친화도(약 5nM)로 결합되어, 표적화된 항체가 세포 투과성 헵텐-형광발색단 콘쥬게이트에 대해 높은 친화도의 수용체로 기능함을 나타낸다는 것을 개시하고 있다. 그럼에도 불구하고, 기능적 sFv 발현은 환원적 환경에서는 상대적으로 불충분할 수 있다.
따라서, 원하는 단백질을 표지하기 위해 개선된 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 하나 이상의 관능기를 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 단백질을 포함하는 융합 단백질(키메라)에 예를 들어, 공유결합 또는 기타 안정한 결합을 통해 테더링(결합)하는 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 본 발명의 단백질은 야생형(천연형) 하이드롤라제와 구조적으로 관련되어 있지만, 상응하는 야생형 하이드롤라제에 비해서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상응하는 야생형 하이드롤라제의 기질에 결합하지만, 상응하는 야생형 하이드롤라제에 비해서 촉매 활성이 결여되었거나 감소되었다(이 돌연변이체 단백질은 본원에서 돌연변이 하이드롤라제로 지칭된다). 상기에서 언급한 테더링은 예를 들어, 용액 중 또는 현탁액 중에서, 세포 중에서, 고형 지지체 상에서 또는 용액/표면 계면 사이에서, 반응성기를 포함하며, 하나 이상의 관능기를 포함하도록 개질된 하이드롤라제에 대한 기질을 사용하여 일어난다. 본원에서 사용된 "기질"은 반응성기 및 임의로 하나 이상의 관능기를 갖는 기질을 포함한다. 하나 이상의 관능기를 포함하는 기질은 일반적으로 본원에서 본 발명의 기질로 지칭된다. 본원에서 사용된 "관능기"는 탐지될만한, 또는 탐지될 수 있는 분자(예를 들어, 발색단, 형광발색단, 또는 발광단) 또는 제2 분자(예를 들어, 바이오틴, 헵텐 또는 가교결합기)에 결합되거나 또는 부착될 수 있거나, 또는 하나 이상의 아미노산을 포함하는, 예를 들어, 항체 또는 수용체를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드, 하나 이상의 뉴클레오티드, 지질 이중충을 포함하는 지질, 고형 지지체, 예를 들어, 침전 입자 등을 포함하는 분자이다. 관능기는 탐지될 수 있고, 다른 분자에 결합될 수 있는 것과 같은 하나 이상의 성질을 가질 수 있다. 본원에서 사용된 "반응성기"는 특정 야생형 또는 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제에 의해 특이적으로 인지되는 기질 중의 최소의 원자들이다. 기질 중의 반응성기와 야생형 하이드롤라제와의 상호작용은 생성물 및 야생형 하이드롤라제의 재생을 가져온다. 기질, 예를 들어, 본 발명의 기질은 또한 임의로 링커, 예를 들어, 절단성 링커를 포함할 수 있다.
본 발명에서 유용한 기질은 돌연변이 하이드롤라제에 의해 특이적으로 결합될 수 있고, 바람직하게는 돌연변이 하이드롤라제의 아미노산, 예를 들어, 반응성 잔기와의 결합으로 야생형 하이드롤라제의 상응하는 아미노산과 기질 사이에 형성된 결합보다 안정한 결합을 형성한다. 돌연변이 하이드롤라제가 상응하는 야생형 하이드롤라제에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 기질에 특이적으로 결합하지만, 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이의 반응에 의해 생성물이 형성되는 조건 하에서, 돌연변이 하이드롤라제와 기질 사이의 상호작용으로부터는 생성물이 생성되지 않거나, 또는 실질적으로 거의 생성물이 생성되지 않는다(예를 들어, 2-, 10-, 100-, 또는 1000-배 적은 양으로). 돌연변이 하이드롤라제에 의한 생성물 형성의 결여 또는 감소량은 돌연변이 하이드롤라제 중에 하나 이상의 치환이 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 기질과의 안정한 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 생성하기 때문이다. 바람직하게는, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합은, 상응하는 야생형 하이드롤라제에 의해 생성물 형성을 초래하는 조건 하에서 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합의 t1/2 보다 2배 이상, 보다 바람직하게는 4배 또는 심지어 10배 및 100배, 1000배 또는 10,000배 큰 반감기(즉, t1/2)를 갖는다. 바람직하게는, 돌연변이 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합은 30분 이상, 바람직하게는 4 시간 이상 및 최소한 10 시간 정도의 t1/2을 가지며, 세척, 단백질 변성 및(또는) 고온에 의한 분해에 내성이다(예를 들어, 결합은 SDS 중에서의 가열에 대해 안정함).
한 실시태양에서, 기질은 데할로게나제, 예를 들어, 지방족 또는 방향족 할로겐화된 기질 중의 탄소-할로겐 결합을 절단하는 할로알칸 데할로게나제 또는 데할로게나제의 기질로, 예를 들어, 로도코커스(Rhodococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 부르크홀데리아(Burkholderia), 아그로박테리움(Agrobacterium) 또는 크산토박터(Xantobacter) 데할로게나제의 기질 또는 세린 베타-락타마제의 기질이다. 한 실시태양에서, 본 발명의 기질은 하나 이상의 관능기를 기질 중의 반응성기로부터 물리적으로 분리시키는 링커를 임의로 포함한다. 예를 들어, 일부 돌연변이 하이드롤라제, 즉, 깊은 촉매 포켓을 갖는 것들의 경우, 본 발명의 기질의 하나 이상의 관능기가 하이드롤라제(야생형 또는 돌연변이)의 3-D 구조를 저해하지 않도록 본 발명의 기질은 충분한 길이 및 구조의 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 데할로게나제에 대한 본 발명의 기질의 한 예는 (CH2)2-3-X와 같은 반응성기(여기서, X는 할라이드) 및 테트라메틸로다민(TAMRA)과 같은 관능기, 예를 들어, TAMRA-C14H24O4-Cl를 포함한다.
한 실시태양에서, 링커는 바람직하게는 그 길이가 12 내지 30개 원자이다. 링커는 본 발명의 기질에 반드시 존재하는 것은 아니지만, 일부 실시태양에서, 반응성기가 돌연변이 하이드롤라제 중의 반응성 잔기와 상호작용하여 공유 결합을 형성할 수 있도록 반응성기와 관능기의 물리적 분리가 필요할 수 있다. 바람직하게는, 존재하는 경우, 링커는 링커를 갖지 않은 상응하는 기질과 야생형 또는 돌연변이 하이드롤라제와의 특이성 또는 반응성에 비해, 링커를 가진 기질과 야생형 또는 돌연변이 하이드롤라제의 특이성 또는 반응성을 실질적으로 변경, 예를 들어, 손상하지 않는다. 아울러, 링커의 존재는 바람직하게는, 하나 이상의 성질, 예를 들어, 관능기의 관능성을 실질적으로 변경, 예를 들어, 손상시키지 않는다.
따라서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
R-링커-A-X (I)
(여기서, R은 하나 이상의 관능기이고, 링커는 C, N, S 또는 O를 포함하는 다원자 직쇄 또는 분지쇄이며, A-X는 데할로게나제의 기질이고, X는 할로겐임)
한 실시태양에서, 알킬할라이드는 데할로게나제에 대한 기질을 형성하기 위해 하나 이상의 관능기를 공유적으로 부착시키는 기 또는 기들인 링커, L에 공유적으로 부착된다. 본원에서 기술된 것과 같이, 돌연변이 데할로게나제, DhaA.H272F는 5-(및 6-) 카르복시 플루오레세인(FAM), 예를 들어, FAM-C14H24O4-Cl, TAMRA, 예를 들어, TAMRA-C14H24O4-Cl, 및 바이오틴, 예를 들어, 바이오틴-C18-H32-O4-Cl를 포함하는 DhaA에 대한 기질에 결합하고, 이 결합의 FAM 또는 TAMRA 형광 또는 스트렙타비딘에 대한 바이오틴 결합에서 유의한 수준의 켄칭 효과는 없었다. 또한, 본원에서 기술된 것과 같이, 돌연변이 데할로게나제, 예를 들어, DhaA.D106C 및 DhaA.D106E과 아울러 DhaA.D106C:H272F 및 DhaA.D106E:H272F는 FAM-C14H2404-Cl 및(또는) TAMRA-Cl4H2404-Cl에 결합했다. 한 실시태양에서, 기질은 R-(CH2)2O(CH2)20(CH2)20(CH2)6C1(여기서, R은 관능기)이다. 이 같은 기질을 제조하기 위해서, 관능기는 NH(CH2)20(CH2)20(CH2)20(CH2)6C1와 같은 분자와 반응될 수 있다.
한 실시태양에서, 본 발명의 기질은 세포의 원형질막을 투과할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 것과 같이, 원핵세포(이. 콜라이(E.coli)) 및 진핵세포(CHO-K1) 세포의 원형질막은 TAMRA-Cl4H2404-Cl 및 바이오틴-Cl8H3204-Cl에 투과성이고, 돌연변이 하이드롤라제가 없는 경우 이들 기질은 재빨리, 그리고 효율적으로 로딩되고, 세포로부터 세정되어 배출된다. 돌연변이 하이드롤라제가 존재하는 경우, 최소한 일부 기질이 세포로부터 세정되어 배출되는 것이 방지된다. 따라서, 기질의 결합된 부분은 돌연변이 하이드롤라제 또는 그 융합체를 포획하기 위한 마커 또는 수단으로 작용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 하나 이상의 관능기를 포함하도록 기질이 개질된 하이드롤라제에 대한 기질을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 사용되기 위한 예시적인 관능기는 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아미노산, 단백질(예를 들어, 효소, 항체 또는 기타 면역원성 단백질), 방사선핵종, 핵산 분자, 약물, 지질, 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 자석 비드, 고형 지지체, 전자 불투명 분자, 발색단, MRI 조영제, 염료(예를 들어, 크산텐 염료, 칼슘 민감성 염료, 예를 들어, 1-[2-아미노-5-(2,7-디클로로-6-히드록시-3-옥시-9-크산테닐)-페녹시]-2-(2'-아미노-5'-메틸페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산(Fluo-3), 나트륨 민감성 염료, 예를 들어, 1,3-벤젠디카르복실산, 4,4'-[1,4,10,13-테트라옥사-7,16-디아자시클로옥타데칸-7,16-디일비스(5-메톡시-6,2-벤조푸란디일)]비스(PBFI), NO 민감성 염료, 예를 들어, 4-아미노-5-메틸아미노-2',7'-디플루오레세인), 또는 기타 형광발색단을 포함한다. 한 실시태양에서, 관능기는 면역원성 분자, 즉, 그 분자에 특이적인 항체에 의해 결합되는 분자이다. 한 실시태양에서, 관능기는 방사선핵종이 아니다.
또한, 본 발명은 상응하는 야생형 하이드롤라제에 비해, 돌연변이 하이드롤라제가 결합, 예를 들어, 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 안정한, 상응하는 하이드롤라제에 대한 기질, 예를 들어, 본 발명의 기질과 공유 결합을 형성할 수 있도록 하는, 하나 이상의 아미노산 치환(들)을 포함하는 돌연변이 하이드롤라제를 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제는 물 분자의 활성화와 관련되어 있는 야생형 하이드롤라제 중의 잔기, 예를 들어, 활성화된 물 분자가 야생형 하이드롤라제의 촉매 잔기와 하이드롤라제의 기질 중 사이에 형성된 결합을 절단하는, 촉매 트리아드(triad) 또는 보조 잔기 중의 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. 본원에서 사용된, "보조 잔기"는 다른 잔기의 활성을 변경하는, 예를 들어, 수 분자를 활성화시키는 잔기의 활성을 증가시키는 잔기이다. 본 발명의 범위 내에서 물을 활성화시키는 잔기는 산-염기 촉매에 관여하는 잔기, 예를 들어, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제는 야생형 하이드롤라제 중에서 하이드롤라제에 대한 기질의 친핵성 공격에 의해 에스테르 중간체를 형성하는 잔기에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
예를 들어, 야생형 데할로게나제 DhaA는 할로겐화된 탄화수소(HaloC3-HaloC10) 중의 탄소-할로겐 결합을 절단한다. DhaA의 촉매 중심은 친핵체, 산 및 히스티딘 잔기를 포함하는 전형적 촉매 트리아드이다. 트리아드 중의 아미노산은 DhaA의 촉매 포켓 속에 깊숙이 위치한다(약 10Å 길이 및 약 20Å2 횡단면). DhaA에 대한 할로겐화된 기질 중의 할로겐 원자, 예를 들어, Cl-알칸 기질의 염소 원자가 DhaA의 촉매 중심에 매우 근접하게 위치한다. DhaA는 기질에 결합하여, ES 복합체를 형성할 것이고, DhaA의 Asp106(번호는 DhaA의 단백질 서열 기준임)에 의해 기질의 친핵성 공격에 의해 에스테르 중간체가 형성된다(도 1). 이후, DhaA의 His272가 물을 활성화시키고, 활성화된 물은 중간체를 가수분해하여서, 촉매 중심으로부터 생성물을 방출한다. 본원에서 기술된 것과 같이, 컴퓨터 모델링 연구에 기초한 3-D 구조 및 야생형 DhaA(DhaA.WT)의 기본적 물리화학적 특성을 유지할 것인, 돌연변이 DhaA, 예를 들어, DhaA.H272F 돌연변이체는 야생형 효소의 하나 이상의 기질, 예를 들어, Cl-알칸을 가수분해할 수 없어, 야생형 효소에 의해 방출되는 상응하는 알콜을 방출할 수 없었다. 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 돌연변이 세린 베타-락타마제, 예를 들어, blaZ.E166D 돌연변이체, blaZ.N170Q 돌연변이체 및 blaZ.E166D:N170Q 돌연변이체는 야생형 세린 베타-락타마제의 하나 이상의 기질을 가수분해할 수 없었다.
따라서, 본 발명의 한 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 활성화된 물 분자가 야생형 데할로게나제 중의 촉매 잔기와 데할로게나제의 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는, 물 분자를 활성화시키는 것과 관련된, 야생형 데할로게나제 중의 잔기, 예를 들어, 촉매 트리아드 중의 잔기 또는 보조 잔기 중의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 데할로게나제이다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 치환은 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) 유래의 DhaA 중의 잔기 272번에 상응하는 잔기 중에 있다. "상응하는 잔기"는 참조 야생형 단백질에 비해 한 야생형 단백질에서 동일한 활성(기능)을 가지며, 임의로는 두 단백질의 일차 서열을 배열하였을 때 동일한 상대 위치에 존재하는 잔기이다. 예를 들어, 한 효소에서 촉매 트리아드의 일부를 형성하고, 물 분자를 활성화시키는 잔기는 그 효소에서 272번 잔기일 수 있고, 73번 잔기가 촉매 트리아드를 형성하고, 물 분자를 활성화시키는 다른 효소에서, 272번 잔기는 73번 잔기에 상응한다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명의 돌연변이 데할로게나제는 로도코커스 로도크로우스 유래의 DhaA 중의 272번 잔기에 상응하는 위치에서 페닐알라닌 잔기를 갖는다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 로도코커스 로도크로우스 유래의 DhaA 중의 106번 잔기에 상응하는 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 데할로게나제이다. 예를 들어, 본 발명의 돌연변이 데할로게나제는 로도코커스 로도크로우스 유래의 DhaA 중의 106번 잔기에 상응하는 위치에서 시스테인 또는 글루탐산 잔기를 갖는다. 추가 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 두개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 데할로게나제로, 한 아미노산 치환은 로도코커스 로도크로우스 유래의 DhaA 중의 106번 잔기에 상응하는 잔기에서의 치환이고, 다른 아미노산 치환은 272번 잔기에 상응하는 잔기에서의 치환이다. 또 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) PCl의 세린 베타-락타마제 중의 166번 잔기 또는 170번 잔기에 상응하는 잔기에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 세린 베타-락타마제이다.
돌연변이 하이드롤라제는 융합 단백질, 예를 들어, 돌연변이 하이드롤라제를 코딩하는 재조합 DNA로부터 발현된 융합 단백질 및, 화학적 합성으로 형성된 하나 이상의 목적하는 단백질 또는 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 돌연변이 하이드롤라제 및 목적하는 효소, 예를 들어, 루시퍼라제, RNasin 또는 RNase 및(또는) 채널 단백질, 수용체, 막 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질, 구조 단백질, 인단백질, 키나제, 신호 전달 단백질, 대사 단백질, 미토콘드리아 단백질, 수용체 결합 단백질, 형광 단백질, 효소 기질, 전사 인자, 전달 단백질 및(또는) 돌연변이 하이드롤라제, 예를 들어, 융합 단백질을 특정 위치로 지정하는 표적 서열, 예를 들어, 미리스틸화 서열, 미토콘드리아 위치지정 서열 또는 핵 위치지정 서열을 포함할 수 있다. 목적하는 단백질은 돌연변이 하이드롤라제의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 한 실시태양에서, 융합 단백질은 목적하는 단백질을 돌연변이 하이드롤라제의 N-말단에서, 다른 단백질, 예를 들어, 상이한 단백질을 C-말단에서 포함한다. 예를 들어, 목적하는 단백질은 형광 단백질 또는 항체일 수 있다. 임의로, 융합체에서 단백질은 커넥터(connector) 서열, 예를 들어, 바람직하게는 2개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 것(예를 들어, 13 내지 17개의 아미노산 잔기를 갖는 것)으로 분리된다. 본 발명의 융합 단백질 중의 커넥터 서열의 존재는 각각의 개별 단백질의 기능에 비해서 융합체 중의 단백질 중 어느 것의 기능도 실질적으로 변경하지 않는다. 따라서, 돌연변이 데할로게나제 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라제의 융합체의 경우, 커넥터 서열의 존재는 돌연변이 데할로게나제 및 이에 대한 기질 사이에 형성된 결합의 안정성, 또는 루시퍼라제의 활성을 실질적으로 변경하지 않는다. 융합체에서 단백질의 임의의 특정 조합의 경우, 다양한 커넥터 서열이 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 커넥터 서열은 효소에 의해 인지되는 서열, 예를 들어, 절단가능한 서열이다. 예를 들어, 커넥터 서열은 캐스파제(caspase)에 의해 인지되는 서열, 예를 들어, DEVD(서열 64)일 수 있거나, 또는 광절단가능한 서열이다.
한 실시태양에서, 융합 단백질은 돌연변이 하이드롤라제의 N-말단에서 목적하는 단백질, 그리고, 바람직하게는 C-말단에서 상이한 목적하는 단백질을 포함할 수 있다. 본원에서 기술된 것과 같이, 돌연변이 DhaA와 GST(N-말단에서), Flag 서열(C 말단에서) 및 레닐라 루시퍼라제(N-말단 또는 C-말단에서)의 융합체는 관능기를 포함하는 야생형 DhaAD에 대한 기질과 돌연변이 DhaA 사이에서의 결합 형성에 탐지될만한 영향을 갖지 않는다. 아울러, Flag 서열 및 DhaA.H272F의 융합체는 스트렙타비딘-바이오틴 C18H32O4-DhaA.H272F 브릿지를 통해 고형 지지체에 부착될 수 있었다(SFlag-ELISA 실험). 아울러, 레닐라 루시퍼라제(R.Luc)와 DhaA.H272F의 융합체는 관능기를 포함하는 야생형 DhaA에 대한 기질로 코팅된 Magnesil™ 입자에 부착될 수 있었다. 아울러, R.Luc을 포함하는 부착된 융합체는 효소적으로 활성이 있는 것으로 나타났다.
예시적인 목적하는 단백질은 면역원성 단백질, 형광 단백질, 선별가능한 마커 단백질, 막 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질, 구조 단백질, 효소(예를 들어, RNase), 효소 기질, 수용체 단백질, 전달 단백질, 전사 인자, 채널 단백질(예를 들어, 이온 채널 단백질), 인-단백질, 키나제, 신호 전달 단백질, 대사 단백질, 미토콘드리아 단백질, 수용체 결합된 단백질, 핵산 결합 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 분비 단백질, 수용체 리간드, 혈청 단백질, 또는 반응성 시스테인을 갖는 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 링커를 포함하는 하이드롤라제에 대한 기질, 하나 이상의 관능기 및 임의로 링커(링커는 하나 이상의 관능기를 포함)를 포함하는 하이드롤라제에 대한 기질, 하나 이상의 관능기가 결여되고 임의로 링커를 포함하는 하이드롤라제 기질, 링커, 또는 돌연변이 하이드롤라제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물 및 키트를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 기질을 포함하는 고형 지지체, 본 발명의 기질을 포함하는 키트, 본 발명의 데할로게나제를 코딩하는 벡터를 포함하는 키트, 또는 본 발명의 세린 베타-락타마제를 코딩하는 벡터를 포함하는 키트를 포함한다.
또한, 하이드롤라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자(폴리뉴클레오티드)가 제공된다. 한 실시태양에서, 단리된 핵산 분자는 하나 이상의 선택된 숙주에서의 발현을 위해 최적화된 핵산 서열을 포함한다. 최적화된 서열은 코돈 최적화된, 즉, 다른 생물체, 예를 들어, 연관 관계가 먼 생물체에 비해 한 생물체에서 보다 흔히 사용되는 코돈이 사용되고, 아울러, 코작 서열 및(또는) 인트론을 첨가하거나 변형하고(또는) 바람직하지 못한 서열, 예를 들어, 잠재적 전사 인자 결합 부위를 제거하도록 변형된 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 데할로게나제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 선택된 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된다. 한 실시태양에서, 최적화된 폴리뉴클레오티드는 상응하는 비최적화된 서열에 더 이상 혼성화되지 않고, 예를 들어, 중간 정도의 또는 고도 엄격 조건 하에서 비최적화된 서열에 혼성화하지 않는다. 다른 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 상응하는 비최적화된 서열에 대해서 90% 미만, 예를 들어, 80% 미만의 핵산 서열 동일성을 갖고, 임의로, 비최적화된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 80% 이상, 예를 들어, 85% 이상, 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 또한, 제작물, 예를 들어, 단리된 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트 및 벡터와 아울러 단리된 핵산 분자, 제작물 또는 벡터를 포함하는 키트가 제공된다.
추가적으로 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제를 발현하는 방법이 제공된다. 방법은 돌연변이 하이드롤라제를 발현하기 위해서 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 한 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 세포로부터 단리될 수 있다. 돌연변이 하이드롤라제는 일시적으로 또는 안정적으로, 항상적으로 또는 조직 특이적 또는 약물 조절된 프로모터 하에서 등의 방법으로 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 단리된 숙주 세포가 제공된다.
한 실시태양에서, 본 발명은 돌연변이 하이드롤라제의 존재 또는 양을 검출 또는 결정하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질과 돌연변이 하이드롤라제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 돌연변이 하이드롤라제는 상응하는 야생형 하이드롤라제에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 하나 이상의 아미노산의 치환은 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 기질과의 안정한 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 생성하고, 돌연변이 하이드롤라제 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물 분자를 활성화시키는데 관여하는 상응하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기 또는 기질과의 에스테르 중간체를 형성하는 상응하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기의 치환이다. 관능기의 존재 또는 양은 검출되거나 또는 결정되고, 이로써 돌연변이 하이드롤라제의 존재 또는 양을 검출하거나 또는 결정한다. 한 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 세포 표면 중 또는 세포 표면 상에 존재한다. 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 세포 용해물이다.
아울러, 예를 들어, 분자를 단리하거나 세포 중의 특정 분자의 그 존재 또는 양, 위치, 예를 들어, 세포내, 아세포내, 또는 세포외 존재 또는 이동을 검출 또는 결정하기 위해서, 하나 이상의 관능기를 포함하는 상응하는 하이드롤라제에 대한 기질과 돌연변이 하이드롤라제를 사용하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 샘플 중의 목적하는 분자를 단리하는 방법을 제공한다. 방법은 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질로 목적하는 분자에 결합하는 단백질 및 돌연변이 하이드롤라제를 포함하는 융합 단백질과 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 돌연변이 하이드롤라제는 상응하는 야생형 하이드롤라제에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 하나 이상의 아미노산 치환은 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 기질과의 안정한 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 생성하고, 돌연변이 하이드롤라제 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물 분자를 활성화시키는데 관여하는 상응하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기에서의, 또는 기질과의 에스테르 중간체를 형성하는 상응하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기에서의 치환이다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 관능기가 고형 지지체 또는 고형 지지체에 결합하는 분자이다. 한 실시태양에서, 샘플은 온전한 세포를 함유하는 반면, 다른 실시태양에서, 샘플은 세포 용해물 또는 아세포 분획이다. 이후, 목적하는 분자를 단리한다.
예를 들어, 본 발명은 목적하는 단백질을 단리하는 방법을 포함한다. 방법은 돌연변이 하이드롤라제와 목적하는 단백질의 융합 단백질을 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 돌연변이 하이드롤라제는 상응하는 야생형 하이드롤라제에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 아미노산 치환은 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 기질과의 안정한 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 생성하고, 돌연변이 하이드롤라제 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물 분자를 활성화시키는데 관여하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기에서의, 또는 기질과의 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기에서의 치환이다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 관능기가 고형 지지체 또는 고형 지지체에 결합하는 분자이다. 이후, 목적하는 단백질을 단리한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 목적하는 단백질과 상호작용하는 것으로 예상되는 분자와 목적하는 단백질의 상호 작용을 변경하는 약물을 동정하는 방법을 포함한다. 방법은 하나 이상의 약물을, 돌연변이 하이드롤라제와 목적하는 단백질을 포함하는 융합 단백질과 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질과, 목적하는 단백질과 상호작용하는 것으로 예상되는 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 돌연변이 하이드롤라제는 상응하는 야생형 하이드롤라제에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 아미노산 치환은 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 기질과의 안정한 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 생성하고, 돌연변이 하이드롤라제 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물 분자를 활성화시키는데 관여하는 상응하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기에서의, 또는 기질과의 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기에서의 치환이다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 관능기가 고형 지지체 또는 고형 지지체에 결합하는 분자이다. 이후, 약물이 목적하는 단백질과 상호작용할 것으로 예상되는 분자와 목적하는 단백질 사이의 상호작용을 변경시키는지를 결정한다.
아울러, 고형 지지체에 결합된 본 발명의 기질 또는 고형 지지체에 결합된 돌연변이 하이드롤라제는 단백질 어레이, 세포 어레이, 소포/소기관 어레이 및 세포막 어레이를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 세포 내에서의 단백질의 발현, 위치 및(또는) 이동(통행)을 모니터함과 아울러 세포 내에서 미세환경 중의 변화를 모니터하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제 및 기질의 사용은 단백질의 기능 분석(예를 들어, 이온 채널)을 허용한다. 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제/기질 두쌍의 사용은 다중화, 동시적 검출 및 FRET- 또는 BRET-기재의 분석을 허용한다. 예를 들어, 촉매 트리아드의 상이한 잔기에서 치환을 갖는 돌연변이 데할로게나제는 각각이 본 발명의 특정 기질에 선택적으로 결합하지만, 다른 기질에는 결합하지 않거나, 또는 돌연변이 데할로게나제 및 돌연변이 베타-락타마제는 각각의 기질과 함께 사용되어서, 다중화를 허용한다. 다른 적용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위해서, 목적하는 단백질과 돌연변이 하이드롤라제를 포함하는 융합 단백질과 다른 분자 사이의 상호작용에 대한 상이한 화합물/약물의 영향을 결정하기 위해서, 돌연변이 하이드롤라제에 융합된 목적하는 단백질에 결합하는 분자를 단리하거나 또는 정제하기 위해서, 또는 세포, 그 소기관 또는 단편을 단리 또는 정제하기 위해서, 분석적 또는 산업적 목적을 위해(예를 들어, 테더링된 효소의 동력학적 파라미터를 연구하기 위해서, 효소 사슬/어레이를 생성하기 위해서, 산업적 성분을 대사시키기 위해서 등) 고형 기질 상에 본 발명의 상응하는 기질과 돌연변이 하이드롤라제를 접촉시켜 생성되는 안정한 복합체를 포획하는 것을 포함한다. 예를 들어, 목적하는 단백질은 돌연변이 하이드롤라제와 융합되어서, 이후 수용체기에 대한 리간드이고, 본 발명의 기질 중에 존재하는 관능기와 고형 지지체 상에 존재하는 수용체기의 특이적 상호작용을 통해 고형 지지체에 연결될 수 있다. 이같은 기질은 고형 지지체와 접촉하기 전에 융합 단백질과 접촉될 수 있거나, 융합 단백질과 접촉하기 전에 고형 지지체와 접촉될 수 있거나, 또는 융합 단백질과 고형 지지체와 동시에 접촉될 수 있다. 이같은 시스템은 생성된 복합체가 목적하는 단백질에 결합하는 분자를 검출 또는 단리하기 위해서 사용될 수 있도록 한다. 결합 분자는 단백질, 예를 들어, 결합 단백질과 관능기(예를 들어, GFP, 루시퍼라제, 항체)의 융합체, 예를 들어, 양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼린 포스파타제(AP) 또는 형광발색단에 컨쥬게이트된 것일 수 있다.
세포를 단리, 분류 또는 정제하기 위해서, 돌연변이 하이드롤라제는 세포의 외부 표면 상에서 발현될 수 있다(예를 들어, 원형질막 단백질과의 융합을 통해). 소기관을 단리, 정제 또는 분리하기 위해서, 돌연변이 하이드롤라제는 목적하는 소기관의 세포질 표면 상에 발현된다. 다른 실시태양에서, 성장하는 상이한 세포에 대한 최적의 플랫폼을 생성하기 위해서, 돌연변이 하이드롤라제는 세포외 매트릭스 성분 또는 외부 막 단백질과 융합되고, 3차원 세포 배양물 또는 조직 엔지니어링을 위한 플랫폼에 테더링된다. 그 예로서, 일차 신경 또는 배아 줄기 세포가 플랫폼에서 성장하여 공급층을 생성할 수 있다.
다른 적용은 세포의 검출 또는 표지화를 포함한다. 따라서, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제 및 상응하는 기질의 사용은 세포의 검출, 예를 들어, 동물 중으로 이식 또는 주입한 후, 시험관내 또는 생체 내에서 세포 이동(예를 들어, 혈관신생/주화성 분석, 동물 중으로 이식된 신경, 이식/주입된 정상, 악성, 또는 재조합적으로 개질된 세포의 이동 등) 및 면역조직화학 분석 전 생세포의 영상을 검출하는 것을 허용한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 신규 합성된 단백질을 표지화하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제 또는 그 융합체를 발현하는 벡터를 포함하는 세포를 관능기가 결여된 하이드롤라제에 대한 기질과 접촉시킨다. 이후, 세포를 약제(예를 들어, 유전자 발현의 유도제) 및 하나 이상의 관능기를 함유하는 하이드롤라제에 대한 기질과 접촉시킨다. 이후, 돌연변이 하이드롤라제 또는 그 융합체의 존재, 양 또는 위치를 검출하거나 또는 결정한다. 돌연변이 하이드롤라제 또는 그 융합체의 존재, 양 또는 위치는 신규 합성된 돌연변이 하이드롤라제 또는 그 융합체에 의한 것이다. 별법으로, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제 또는 그 융합체를 발현하는 벡터를 포함하는 세포를 관능기(예를 들어, 녹색 형광발색단)을 갖는 하이드롤라제에 대한 기질과 접촉시킨 후, 약물 및 상이한 관능기(예를 들어, 적색 형광발색단)을 갖는 기질과 접촉시킨다. 한 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 막 위치지정 신호와 융합되어서 막 내에서 또는 막 근처에서 일어나는 이벤트를 모니터하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 세포를 표지화하는 방법을 제공한다. 방법은 돌연변이 하이드롤라제를 포함하는 세포를 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질과 접촉시키는 것을 포함한다. 돌연변이 하이드롤라제는 상응하는 야생형 하이드롤라제에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 하나 이상의 아미노산 치환은 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 기질과의 안정한 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 생성하고, 돌연변이 하이드롤라제 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 상응하는 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물 분자를 활성화시키는데 관여하는 상응하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기에서의, 또는 기질과의 에스테르 중간체를 형성하는 상응하는 야생형 하이드롤라제 중의 아미노산 잔기에서의 치환이다. 이후, 관능기의 존재 또는 양을 검출하거나 또는 결정한다.
선별가능한 마커 단백질, 예를 들어, 네오마이신, 하이그로마이신, 또는 퓨로마이신에 대한 내성을 코딩하는 단백질을 발현하는 세포가 외래 DNA를 사용하여 세포를 안정적으로 형질전환시키기 위해 사용된다. 어떤 세포가 선별가능한 마커 단백질과 아울러 형광 표지된 분자를 함유하고 있는지 관찰하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 외부에서 생세포로 첨가되는 형광 분자를 가진 선별가능한 마커 단백질을 표지하는 것일 바람직할 것이다. 이 방법에 의해, 선별가능한 마커 단백질은 형광발색단의 첨가에 의해 필요할 때만 가시화될 것이고, 이어서 선별가능한 마커 단백질이 세포내 대사를 통해 자연적으로 재생될 때 형광이 사라질 것이다. 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명은 선별가능한 마커 단백질을 발현하는 세포를 표지하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 세포를 제공한다. 융합 단백질은 선별가능한 마커 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 항생제에 대한 내성을 부여하는 것 및 광학 검출성 분자를 포함하는 기질 또는 그 일부에 안정적으로, 및 임의로 비가역적으로 결합할 수 있는 제2 단백질을 포함한다. 예를 들어, 단백질은 기질로부터 자기 자신에게 알킬기 및 광학 검출성 분자를 비가역적으로 전달하여, 알킬 트랜스퍼라제를 표지하는 알킬 트랜스퍼라제, 예를 들어, O6-알킬구아닌 DNA 알킬 트랜스퍼라제일 수 있다. 본 발명의 이 실시태양에서 유용한 예시적인 단백질은 알킬 트랜스퍼라제, 펩티딜 글리신-알파-아미드화 모노옥시게나제, 타입 I 토포아이소머라제, 하이드롤라제(예를 들어, 세린 및 에폭시드 하이드롤라제)와 아울러, 본원에서 기술된 돌연변이 하이드롤라제, 아미노트랜스퍼라제, 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 아세틸 트랜스퍼라제, 데카복실라제, 옥시다제(예를 들어, 모노아민 옥시다제), 환원효소(예를 들어, 리보뉴클레오티드 환원효소), 합성효소(예를 들어, 시클릭 ADP 리보스 합성효소 또는 티미딜레이트 합성효소), 데하이드로게나제(예를 들어, 알데히드 데하이드로게나제), 생성효소(예를 들어, 산화질소 생성효소(NOS)), 락타마제, 시스타티온 감마라이아제, 펩티다제(예를 들어, 카르복시펩티다제 A), 아로마타제, 프로테아제(예를 들어, 세린 프로테아제), 크실라나아제, 글로코시다제, 만노시다제, 및 데메틸라제 및 하나 이상의 기질과 비가역적 또는 기타 안정한 결합을 형성하는 야생형 단백질을 포함하는 기타 단백질(예를 들어, 기작에 기초한 비활성화를 할 수 있는 효소)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 이 실시태양에서, 안정한 결합, 즉, 기질과 야생형 또는 돌연변이 효소 사이에 형성되는 결합은 30 분 이상, 바람직하게는 4 시간 이상 및 10 시간 이상까지의 t1/2을 가지며, 세척, 단백질 변성 및(또는) 고온에 의한 분해에 내성이어서, 예를 들어, SDS 중에서의 가열에 대해 안정하다.
융합 단백질을 발현하는 세포는 세포를 표지하기 위해서 기질과 접촉된다. 한 실시태양에서, 세포는 기질과 접촉하기 전에 고정된다. 다른 실시태양에서, 기질 및 고정제는 동시에 세포와 접촉된다. 다른 실시태양에서, 세포가 기질과 접촉한 후에, 고정제가 세포에 첨가된다. 한 실시태양에서, 융합 단백질은 기질과 에스테르 결합을 형성한다. 다른 실시태양에서, 융합 단백질은 기질과 티오에스테르 결합을 형성한다. 또한, 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자 및 융합 단백질을 발현하는 세포가 제공된다.
세포 상에서 영상 분석을 수행할 경우, 일반적으로 세포 구조의 대부분의 특징을 유지하는 파라포름알데히드, 아세톤 또는 메탄올과 같은 보존제(고정제)를 사용하여 세포를 고정하는 것이 바람직할 것이다. 이같이 고정된 세포는 이후 세포 내에서 특정 구조를 밝히기 위해서 흔히 형광 염료 또는 형광으로 표지된 항체를 첨가하여 분석된다. 형광으로 표지된 세포에 대한 다른 방법은 고정 전에 세포 중에서 형광 단백질(예를 들어, GFP)를 발현하는 것이다. 불행히도, 이들 단백질의 효율적인 형광은 보존제에 의해 파괴될 수 있는 단백질 구조에 의존하므로, 이들 세포의 영상화 효율을 감소시킨다.
따라서, 본 발명은 관능기(예를 들어, 형광발색단)을 갖는 세포를 표지하는 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제 또는 그 융합체를 발현하는 세포를 제공하고, 이 세포를 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질과 접촉시키는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 세포는 기질과 접촉하기 전에 고정된다. 다른 실시태양에서, 기질 및 고정제는 동시에 세포와 접촉된다. 다른 실시태양에서, 세포가 기질과 접촉한 후에, 고정제가 세포에 첨가된다. 이후, 세포 내에서 돌연변이 하이드롤라제 또는 그 융합체의 존재 또는 위치를 검출하거나 또는 결정한다. 한 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 기질과 에스테르 결합을 형성하는 반면, 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 기질과 티오에스테르 결합을 형성한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물, 조성물, 핵산, 단백질 또는 기타 물질을 제조하는데 유용한 본원에서 개시된 방법 및 중간체를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 로도코커스 로도크로우스 데할로게나제와 알킬할라이드 기질의 촉매 트리아드에서의 반응 기작도이다.
도 2는 야생형 DhaA 로도코커스 로도크로우스 데할로게나제 및 4종의 돌연변이 DhaA(H283Q, G, A 또는 F)의 3차원 모델을 나타낸다. 청록색 리본은 단백질의 결정 구조에 기초한 DhaA.WT의 3-D 모델이다(Newman et al., 1999)(패널 A). 자주색 리본은 H272Q, H272G 및 H272A 돌연변이체의 3-D 모델(패널 A) 또는 H272F 돌연변이체의 3-D 모델이다(패널 B). 3-D 모델은 제한적 자극된 어닐링(Restrained Stimulated Annealing) 분자 다이나믹스(MD) 기구를 포함하는 수개의 최적화 단계 이전의 분자 확률 밀도 함수를 계산하여 생성되었다. 3-D 모델링은 소프트웨어 InsightII(USA)를 이용하여 실리콘 그래픽스 컴퓨터-스테이션 상에서 수행되었다.
도 3은 야생형 및 돌연변이 DhaA 단백질의 정제를 나타낸다. GST-DhaA.WT-Flag(홀수 레인) 및 GST-DhaA.H272F-Flag(짝수 레인) 융합 단백질이 GSS-세파로스 4FF 상에서 가용성으로 효과적으로 정제되는 것으로 나타났다(레인 3 및 4-이. 콜라이 조상층액; 레인 5 및 6-세척액; 레인 7 내지 10-정제된 단백질). Xa 인자를 사용하여 융합 단백질을 처리하여 두 개의 단백질, GST 및 DhaA를 형성하였다(WT 또는 돌연변이체; 각각, 레인 11 및 12). 아울러, GST가 GSS-세파로스 4FF 상에서 효과적으로 제거되었다(WT 또는 돌연변이체; 각각 레인 13 및 14). 모든 단백질은 예상 분자량을 가졌다.
도 4는 야생형 DhaA 및 돌연변이체 DhaA에 의한 1-Cl-부탄의 가수분해를 예시하고 있다.
도 5는 다양한 농도의 (NH4)2SO4를 사용한 DhaA.WT 및 DhaA.H272F/A/G/Q 돌연변이체의 침전을 나타내고 있다. 레인 1, 5 및 9, 0% (NH4)2SO4; 레인 2, 6 및 10, 10% (NH4)2SO4; 레인 3, 7 및 11, 10-45% (NH4)2SO4; 레인 4, 8 및 12, 45-70% (NH4)2SO4. 패널 A: 레인 1-4, DhaA.WT; 레인 5-8, DhaA.H272G; 및 레인 9-12, DhaA.H272Q. 패널 B: 레인 1-4, DhaA.WT; 레인 5-8, DhaA.H272F; 레인 9-12, DhaA.H272A.
도 6은 야생형 DhaA의 기질 특이성을 기술하고 있다. 페놀 레드-기재 분석(E558)을 사용하여, 효소 첨가 후 처음 60초 동안에, 4번의 15초간의 기록을 통해 반응의 초기 속도를 결정하였다.
도 7은 관능기(예를 들어, 5-(및 6-)-카르복시플루오레세인(FAM), Anth(안트라센) 또는 바이오틴) 및 링커를 포함하는 DhaA에 대한 기질을 나타내고 있다.
도 8A는 야생형 DhaA에 의한 FAM-C14H2404-Cl 가수분해 생성물의 HPLC 분리를 나타내고 있다.
도 8B는 시간에 따른 FAM-C14H2404-Cl의 야생형 DhaA에 의한 가수분해에 의해 생성된 생성물의 HPLC 분석(기질 %로서)을 나타내고 있다.
도 9는 야생형 DhaA(패널 A에서 레인 1, 3 및 5; 및 패널 B에서 레인 1-8) 및 돌연변이 DhaA(DhaA.H272F)(패널 A에서 레인 2, 4 및 6; 및 패널 B에서 레인 9-14)의 TAMRA-C14H2404-Cl로의 결합(패널 A에서 레인 1 및 2); ROX-C14H2404-Cl로의 결합(패널 A에서 레인 3 및 4); FAM-C14H2404-Cl로의 결합(패널 A에서 레인 5 및 6); 또는 바이오틴-C18H3204-Cl로의 결합(패널 B)의 SDS-PAGE 분석을 나타내고 있다. 패널 B에서 바이오틴-C18H3204-Cl의 농도는 0μM(레인 1 및 8), 125μM(레인 2 및 9), 25μM(레인 3 및 10), 5μM(레인 4 및 11), 1μM(레인 5 및 12), 0.2μM(레인 6 및 13), 및 0.04μM(레인 7 및 14).
도 10은 기질(바이오틴-C18H3204-Cl)을 사용한 돌연변이 DhaA의 사전처리가 다른 기질의 결합을 저해한다는 것을 예시한다. DhaA.WT-레인 1 및 2; DhaA.H272 돌연변이체: F, 레인 3 및 4; G, 레인 5 및 6; A, 레인 7 및 8; 및 Q, 레인 9 및 10. 샘플 2, 4, 6, 8 및 10은 바이오틴-C18H3204-Cl로 사전처리되었다.
도 11은 효소 기질 복합체의 MALDI-TOF 분석을 나타내고 있다. FAM-C14H2404-Cl를 사용하여 인큐베이션된 GST-DhaA.WT 또는 GST-DhaA.H272F의 질량 분석.
도 12는 106번 잔기에서 치환을 갖는 DhaA 돌연변이체 및 106번 잔기 및 272번 잔기에서 치환을 갖는 DhaA 돌연변이체의 TAMRA-C14H2404-Cl로의 결합 성질의 SDS-PAGE 분석을 예시하고 있다. 2㎍의 단백질 및 32㎕의 25μM TAMRA-C14H2404-Cl를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 반응물 10㎕를 레인마다 로딩하였다. 레인 1-DhaA.D106C; 레인 2-DhaA.D106C:H272F; 레인 3-DhaA.D106E; 레인 4-DhaA.D106E:H272F; 레인 5-DhaA.D106Q; 레인 6-DhaA.D106Q:H272F; 레인 7-DhaA.WT; 및 레인 8-DhaA.H272F. 570 nm 필터를 사용하여 겔을 영상화하였다.
도 13은 고형 지지체(스트렙타비딘 코팅된 플레이트)에 테더링된 루시퍼라제와 돌연변이체 DhaA의 융합체를 갖는 샘플 중의 레닐라 루시퍼라제 활성의 분석을 나타내고 있다. 융합체의 포획은 DhaA의 기질(즉, 바이오틴-C18H3204-Cl)을 사용하여 달성되었다. 레닐라 루시퍼라제와 야생형 DhaA의 융합체를 갖는 분획에서는 활성이 나타나지 않았다.
도 14는 생체 내에서 바이오틴-C18H3204-Cl(패널 A) 또는 TAMRA-C12H2404-C1(패널 B)로 처리된 야생형 DhaA(DhaA.WT-Flag, 각 패널의 레인 1-4) 또는 돌연변이 DhaA.H272F(DhaA.H272F-Flag, 각 패널의 레인 5-7)를 발현하는 이. 콜라이의 2배 연속 희석물의 SDS-PAGE 분석을 보여주고 있다. 화살표는 DhaA-Flag의 Mr에 해당하는 Mr을 갖는 단백질을 표지한다.
도 15는 생체 내에서 진핵 세포 단백질에 대한 TAMRA-C12H2404-C1의 결합을 나타낸다. DhaA.WT-Flag(레인 1-4) 또는 DhaA.H272F-Flag(레인 5-8)을 발현하는 CHO-K1 세포 유래 단백질의 2배 연속 희석물을 TAMRA-C12H2404-C1로 처리하였다. 화살표는 DhaA-Flag의 Mr에 해당하는 Mr을 갖는 단백질을 표지한다.
도 16은 CHO-K1 세포에 대한 TAMRA-C12H2404-C1의 투과성을 예시한다. CHO-K1 세포(A, 밝은 바탕의 영상)를 TAMRA-C12H2804-C1(25μM, 37℃에서 5분)로 처리하고, PBS로 재빨리 세척하였다(패널 B). 패널 C는 세척 과정 후의 세포를 보여준다.
도 17은 GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag 또는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag로 트랜스펙트된 세포의 영상을 나타낸다. CHO-K1 세포를 GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag(패널 A-C) 또는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag(패널 D-F)를 코딩하는 DNA로 트랜스펙트하고, TAMRA-C12H2804-C1로 처리하였다. 패널 A,D-밝은 바탕; 패널 B, E-GFP 필터 세트; 및 패널 C, F-TAMRA 필터 세트.
도 18은 GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag(레인 1-4) 또는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag(레인 5-8)로 트랜스펙트된 세포 유래의 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. CHO-K1 세포는 GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag 또는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag 중 하나로 트랜스펙트되고, 이어서 TAMRA-C12H2404-C1(25μM)로 0, 5, 15 또는 60분 동안 처리되고, PBS(4×1.0 ml)로 세척되고, SDS-샘플 완충제 중에 수집되었다. 샘플을 SDS-PAGE 상에서 해상하고, 형광영상기 상에서 분석하였다. 레인 1-4에서, GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag를 각각 0, 5, 15, 60분 동안 처리하였다. 레인 5-8에서, GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag를 각각 0, 5, 15, 60분 동안 처리하였다. 화살표는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag의 Mr에 상응하는 Mr를 갖는 단백질을 표지한다.
도 19는 CHO-K1 세포에 대한 선택된 기질(패널 A, TAMRA 및 패널 B, ROX)의 독성을 예시한다.
도 20은 세린 베타-락타마제에 대한 반응식을 예시한다. 반응은 사전공유결합 조우 복합체의 형성을 시작하고(도 19A), 고에너지 아실화 4면체 중간체를 통해 진행하여(도 19B) 일시적으로 안정한 아실-효소 중간체를 형성하고, 촉매 잔기 Ser70을 통해 에스테르를 형성한다(도 19C). 이어서, 아실 효소는 가수분해 작용수에 의한 공격을 받아(도 19D), 고에너지 데아실화 중간체를 형성하고(도 19E)(Minasov et al., 2002), 분해되어 가수분해된 생성물을 형성한다. 이후, 생성물은 배출되어, 자유 효소를 재생한다.
도 21은 시간에 따른 GST-blaZ에 의한 FAP의 가수분해를 보여준다.
도 22는 GST와 blaZ.E166D, blaZ.N170Q 또는 blaZ.E166D:N170Q의 융합체로의 보셀린의 결합을 나타낸다. 레인 1-염료/blaZ 없음; 레인 2-blaZ.WT; 레인 3-blaZ.E166D; 레인 4-blaZ.N170Q; 및 레인 5-blaZ.E166D:N170Q.
도 23은 GST와 blaZ.E166D, blaZ.N170Q 또는 blaZ.E166D:N170Q의 융합체로의 CCF2의 결합을 나타낸다. 레인 1-염료/blaZ 없음; 레인 2-GST-blaZ.WT; 레인 3-GST-blaZ.E166D; 레인 4-GST-blaZ.N170Q; 및 레인 5-GST-blaZ.E166D:N170Q.
도 24는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-NLS3을 코딩하는 제작물로 트랜스펙트되고, TAMRA-C14H2404-C1로 염색된 CHO-K1 생세포의 형광 및 DIC 영상을 제공한다. TAMRA 필터-상부 좌측; GFP 필터-상부 우측; "A" 및 "B" 오버레이-바닥 좌측; 세포의 오버레이 영상 "C" 및 DIC 영상-바닥 우측. NLS3= SV40 T 항원 유래의 핵 위치지정 서열의 탠덤 반복서열.
도 25는 GFP-β-어레스틴 2(좌측)을 코딩하는 제작물 및 DhaA.H272F-β-어레스틴 2를 코딩하는 제작물로 트랜스펙트되고, TAMRA-C14H2404로 염색된(우측) CHO-K1 생세포의 형광 영상을 나타낸다.
도 26은 이. 콜라이 내에서 DhaA 발현의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 레인: 1, 분자량 표준; 2, 야생형 DhaA 조용해물; 3, 야생형 DhaA 무세포 용해물; 4, DhaA.H272F 조용해물; 5, DhaA.H272F 무세포 용해물; 6, 벡터 대조군 조용해물; 7, 벡터 대조군 무세포 용해물; 8, DhaA.E130Q C1 돌연변이체 조용해물; 9, DhaA.E130Q C1 돌연변이체 무세포 용해물; 10, DhaA.E130L A5 돌연변이체 조용해물; 11, DhaA.E130L A5 돌연변이체 무세포 용해물; 12, DhaA.E130A A12 돌연변이체 조용해물; 13, DhaA.E130A A12 돌연변이체 무세포 용해물; 14, 분자량 표준. 화살표는 DhaA 단백질의 위치를 나타낸다. -s, 원심분리 전의 용해물; +s, 원심분리 후의 용해물.
도 27은 용해물을 함유하는 DhaA의 면역블롯 분석을 나타낸다. 레인: 1, 야생형 DhaA 조용해물; 2, 야생형 DhaA 무세포 용해물; 3, DhaA.H272F 조용해물; 4, DhaA.H272F 무세포 용해물; 5, 벡터 대조군 조용해물; 6, 벡터 대조군 무세포 용해물; 7, 분자량 표준; 8, DhaA.E130Q C1 돌연변이체 조용해물; 9, DhaA.E130Q C1 돌연변이체 무세포 용해물; 10, DhaA.E130L A5 돌연변이체 조용해물; 11, DhaA.E130L A5 돌연변이체 무세포 용해물; 12, DhaA.E130A A12 돌연변이체 조용해물; 13, DhaA.E130A A12 돌연변이체 무세포 용해물; 14, 분자량 표준. 화살표는 DhaA 단백질의 위치를 나타낸다.
도 28은 시험관내 공유결합 알킬-효소 형성의 형광영상 분석을 나타낸다. 레인: 1, 형광 분자량 표준; 2, DhaA 야생형; 3, DhaA.H272F 돌연변이체; 4, DhaA-(벡터만의 대조군); 5, DhaA.E130Q 돌연변이체; 6, DhaA.E130L 돌연변이체; 7, DhaA.E130A 돌연변이체. 화살표는 형광 효소-알킬 공유결합 중간체의 위치를 나타낸다.
도 29는 전체 세포 중의 공유결합 알킬-효소 형성의 형광영상 분석을 나타낸다. 레인: 1, 형광 분자량 표준; 2, DhaA 야생형; 3, DhaA.H272F 돌연변이체; 4, DhaA-(벡터만의 대조군); 5, DhaA.E130Q 돌연변이체; 6, DhaA.E130L 돌연변이체; 7, DhaA.E130A 돌연변이체; 8, 형광 분자량 표준. 화살표는 형광 효소-알킬 공유결합 중간체의 위치를 나타낸다.
도 30 A-B는 스트렙타비딘(SA) 코팅된 비드 상에 포획된 DhaA-Flag의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. DhaA.H272F-Flag를 일시적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 바이오틴-C18H3204-Cl(25μM, 0.1% DMSO, 60분, 37℃)로 처리하거나(A) 또는 처리하지 않았다(B). 과량의 바이오틴-C18H3204-Cl를 세척해내고, 세포를 용해시키고, 10㎕의 세포 용해물을 5㎕의 SA-코팅된 비드(Pierce)와 함께 60분 동안 실온(RT)에서 인큐베이션하였다. 세포 용해물(레인 1), 비드에 결합되지 않은 단백질(레인 2) 및 비드에 결합된 단백질(레인 3)을 SDS-PAGE 상에서 해상하고, 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고, 항-Flag 항체(Sigma)로 프로브하였다.
도 30 C-D는 SA 코팅된 비드 상에 포획된 hR.Luc-DhaA의 분석을 예시한다. hR.Luc-커넥터-DhaA.H272F-Flag를 일시적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 바이오틴-C18H3204-Cl(25μM, 0.1% DMSO, 60분, 37℃)로 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 세포를 용해시키고, 10㎕의 세포 용해물을 5㎕의 SA-코팅된 비드(Pierce)와 함께 60분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 물질을 세척해내고, hR.Luc 활성을 프로메가(Promega)사의 "레닐라 루시퍼라제 분석 시스템" (C)를 사용하여 결정하거나, 포획된 hR.Luc를 웨스턴 블롯으로 분석하였다(D). C) 칼럼 1에서, 바이오틴-C18H3204-C1로 세포를 처리, 과량의 바이오틴-C18H3204-Cl를 세척; 칼럼 2에서, 비처리된 세포; 및 칼럼 3에서, 과량의 바이오틴-C18H3204-Cl를 세척해내지 않고, 바이오틴-C18H3204-Cl으로 처리된 세포. D) 세포 용해물(레인 1), 비드에 결합하지 않은 단백질(레인 2), 및 비드에 결합된 단백질(레인 3)을 SDS-PAGE 상에 해상하고, 니트로셀룰로스 막으로 이동시키고, 항-R.Luc 항체(Chemicon)으로 프로브하였다.
발명의 상세한 설명
정의
"친핵체"는 전자를 공여하는 분자이다.
"선별가능한 마커 단백질"은 제공되지 않았다면 필수 영양 성분이 되었을 것인 영양 성분이 결여된 배지에서 세포가 성장할 수 있는 능력(예를 들어, 효모 세포에서 TRP1 유전자) 또는 항생제 또는 기타 약물을 갖는 배지에서 세포가 성장할 수 있는 능력을 부여하는, 즉, 세포 중에서 선별가능한 마커 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 유전자를 갖지 않은 상응하는 세포에 비해서 세포에 항생제 또는 약물 내성을 부여하는, 효소 활성을 코딩한다. 숙주 세포가 선택 배지에서 선별가능한 마커를 발현하여야 할 때, 마커는 양성 선별가능한 마커로 지칭된다(예를 들어, 적절한 항생제 존재 하에서 성장할 수 있는 능력을 부여하는 항생제 내성 유전자). 또한, 특정 유전자를 함유하는 숙주 세포에 대해 선택하기 위해 선별가능한 마커를 사용할 수 있고(예를 들어, 발현되는 경우 5% 자당을 함유하는 배지에서 성장하는 박테리아 숙주 세포를 살생하는 sacB 유전자); 이같은 방식으로 사용되는 선별가능한 마커는 음성 선별 마커 또는 역-선별 마커로 지칭된다. 통상적인 선별가능한 마커 유전자 서열은 항생제, 예를 들어, 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 푸로마이신, 블레오마이신, 스트렙토마이신, 하이그로마이신, 네오마이신, 제오신™ 등에 대한 내성을 부여하는 서열을 포함한다. 선별가능한 영양요구성 유전자 서열은 예를 들어, 히스티디놀 존재 하에서 히스티딘 결여 배지에서의 성장을 허용하는 hisD를 포함한다. 적절한 선별가능한 마커 유전자는 블레오마이신-내성 유전자, 메탈로티오네인 유전자, 하이그로마이신 B-포스포트랜스퍼라제 유전자, AURI 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자, 티미딘 키나제 유전자, 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 등을 포함한다.
본원에서 사용된 "핵산"은 한 뉴클레오티드의 펜토스의 3' 위치가 다음번 뉴클레오티드의 펜토스의 5' 위치에 포스포디에스테르기에 의해 연결되고, 뉴클레오티드 잔기(염기)가 특정 서열, 즉, 선형 상의 순서로 뉴클레오티드에 연결된, 공유 결합된 서열의 뉴클레오티드이다. 본원에서 사용된 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 약 100 뉴클레오티드를 초과하는 서열을 함유하는 핵산이다. 본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드" 또는 "프라이머"는 짧은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부이다. 본원에서 사용된 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고"는 2개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 바람직하게는 3개 초과, 일반적으로 10개 초과, 그러나 250개 미만, 바람직하게는 200개 미만의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 분자로 정의된다. 올리고뉴클레오티드는 화학적 합성, DNA 복제, 증폭(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)), 역전사(RT) 또는 그 조합을 비롯한 임의의 방법으로 생성될 수 있다. "프라이머"는 프라이머 신장이 개시되는 조건 하에 놓였을 때 핵산 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 프라이머는 그 3' 말단에서 표적의 특정 서열(주형)에 실질적으로 상보적인 영역을 갖도록 선택된다. 프라이머는 프라이머 신장이 일어나도록 표적과 혼성화되도록 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머 서열은 표적의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 나머지 프라이머 서열이 표적에 실질적으로 상보적이라면, 비상보적인 뉴클레오티드 단편이 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있다. 프라이머 서열이 표적 서열과 혼성화되도록 충분히 상보적이고, 이로써 프라이머의 신장 생성물의 합성을 위한 복합체를 형성한다면, 비상보적인 염기 또는 보다 긴 서열이 프라이머 중으로 산재되어 들어갈 수 있다. 유전자 서열에 매칭하거나 또는 상보적인 프라이머가 증폭 반응, RT-PCR 등에서 사용될 수 있다.
핵산 분자는 "5-말단부"(5' 말단) 및 "3'-말단부"(3' 말단)을 가지는 것으로 지칭되는데, 이는 핵산 포스포디에스테르 결합이 치환 모노뉴클레오티드의 펜토스 환의 5' 탄소 및 3' 탄소에서 일어나기 때문이다. 새로운 결합이 5' 탄소가 되는 폴리뉴클레오티드의 말단은 5' 말단부 뉴클레오티드이다. 새로운 결합이 3' 탄소가 되는 폴리뉴클레오티드의 말단은 3' 말단부 뉴클레오티드이다. 본원에서 사용된 말단부 뉴클레오티드는 3'- 또는 5'-말단부의 말단 위치의 뉴클레오티드이다.
DNA 분자는 "5' 말단" 및 "3' 말단"을 가지는 것으로 지칭되는데, 이는 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 5' 인산이 한쪽 방향에서 이웃한 펜토스 환의 3' 산소에 포스포디에스테르 결합을 통해 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오티드를 형성하도록 모노뉴클레오티드가 반응하기 때문이다. 따라서, 올리고뉴클레오티드의 말단은 그 5' 인산이 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 3' 산소에 연결되지 않았다면, "5' 말단"으로 지칭되고, 그 3' 산소가 다음 모노뉴클레오티드 펜토스 환의 5' 인산에 연결되지 않았다면, "3' 말단"으로 지칭된다.
본원에서 사용된 핵산 서열은 보다 큰 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내부에 있더라도 5' 및 3' 말단을 갖는 것으로 지칭될 수 있다. 직쇄 또는 원형 DNA 분자 어느 쪽이라도, 분리된 원소는 "하류" 또는 3' 원소의 "상류" 또는 5'으로 지칭될 수 있다. 이러한 용어는 전사가 DNA 사슬을 따라서 5'에서 3'으로 이동하는 방식으로 진행된다는 사실을 반영한다. 일반적으로, 링크된 유전자(예를 들어, 오픈 리딩 프레임 또는 코딩 영역)의 전사를 지시하는 프로모터 및 인핸서 요소는 일반적으로 코딩 영역의 5' 또는 상류에 위치한다. 그러나, 인핸서 요소는 프로모터 요소 및 코딩 영역의 3'에 위치하더라도 그 영향을 발휘할 수 있다. 전사 종결 및 폴리아데닐화 신호는 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치한다.
본원에서 사용된 "코돈"이란 용어는 기본적 유전적 코딩 단위로, 특정 아미노산이 폴리펩티드 사슬 중으로 도입되거나, 개시 또는 종결 시그날이 되도록 특정하는 3개의 뉴클레오티드의 서열로 이루어진다. 구조 유전자를 지칭하기 위해 사용되는 경우, "코딩 영역"이란 용어는 mRNA 분자의 번역 결과로서 신생된 폴리펩티드에서 발견되는 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 영역은 5' 경계에 개시 메티오닌을 코딩하는 뉴클레오티드 트리플릿 "ATG"가 위치하고, 3' 경계에 종결 코돈(예를 들어, TAA, TAG, TGA)가 위치한다. 어떤 경우에는, 코딩 영역은 뉴클레오티드 트리플릿 "TTG"에 의해 개시되는 것으로도 알려져 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "단리된 및(또는) 정제된"은 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 단백질이 시험관내 제조, 단리 및(또는) 정제되어 생체내 물질과 연관되지 않는 것을 말한다. 따라서, "단리된 올리고뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"에서와 같이, 용어 "단리된"이 핵산과 관련하여 사용될 때, 이것은 그의 원천에서 통상적으로 연관되는 하나 이상의 오염물로부터 동정되고 분리된 핵산 서열을 말한다. 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과 다른 형태 또는 설정으로 존재한다. 반대로, 단리되지 않은 핵산(예, DNA 및 RNA)은 이들이 자연에서 존재하는 상태로 발견된다. 예를 들면, 주어진 DNA 서열(예, 유전자)은 이웃 유전자 부근의 숙주 세포 염색체 상에서 발견되고; RNA 서열(예, 특정 단백질을 코딩하는 특정 mRNA 서열)은 복수의 단백질을 코딩하는 다수의 다른 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견된다. 따라서, 게놈, cDNA 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 일정 조합을 포함하는 "단리된 핵산 분자"에 있어서, 상기 "단리된 핵산 분자"는 (1) "단리된 핵산 분자"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연관되어 있지 않고, (2) 자연에서는 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결되어 있거나, 또는 (3) 자연에서는 더 큰 서열의 일부로서 발생하지 않는다. 상기 단리된 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 핵산 분자가 단백질을 발현하기 위해 사용될 경우, 상기 핵산 분자는 최소한 센스 또는 코딩 가닥을 함유하나(즉, 핵산이 단일 가닥일 수 있음), 센스 및 안티센스 가닥 모두를 함유할 수도 있다(즉, 핵산이 이중 가닥일 수 있음).
본원에서 사용되는 용어 "야생형"은 천연 기원으로부터 단리된 유전자 또는 유전자 생성물의 특징을 갖는 유전자 또는 유전자 생성물을 말한다. 야생형 유전자는 집단에서 가장 자주 발견되는 것이며, 따라서, 당해 유전자의 "야생형" 형태로 임의로 표시된다. 반대로, 용어 "돌연변이"는 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때 서열 및(또는) 기능적 특성의 변화(즉, 변화된 특성)를 나타내는 유전자 또는 유전자 생성물을 말한다. 천연 돌연변이는 단리될 수 있는데, 야생형 유전자 또는 유전자 생성물과 비교할 때 이들이 변화된 특성을 갖는다는 사실에 의해 확인된다는 점을 주목한다.
용어 "재조합 DNA 분자"는 자연에서 일반적으로 함께 발견되지 않는 2종 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하이브리드 DNA 서열을 의미한다. 용어 "벡터"는 DNA 단편이 삽입되거나 클로닝될 수 있는 핵산 분자를 말하며, DNA 절편(들)을 세포에 전달하는데 사용될 수 있고, 세포에서 복제가 가능하다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스, 코스미드 등으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 벡터", "발현 벡터" 또는 "제작물"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적당한 DNA 또는 RNA 서열 및 목적하는 코딩 서열을 함유하는 DNA 또는 RNA 서열을 말한다. 원핵생물 발현 벡터는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 숙주 세포에서 자동 복제를 위한 복제 기점 및 가능하게는 다른 서열, 예를 들어, 임의적 작동유전자 서열, 임의적 제한 효소 부위를 포함한다. 프로모터는, RNA 중합효소가 DNA에 결합하여 RNA 합성을 시작하게 하는 DNA 서열로 정의된다. 진핵생물 발현 벡터는 프로모터, 임의로 폴리아데닐화 신호 및 임의로 인핸서 서열을 포함한다.
"펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 상응하는 전장 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 유전자 생성물을 코딩하는 유전자의 코딩 영역을 포함하는 핵산 서열 또는 그의 단편을 의미한다. 상기 코딩 영역은 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA 형태로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 경우, 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥(즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 적합한 전사의 개시 및(또는) 일차 RNA 전사체의 정확한 프로세싱을 허용하기 위해 필요한 경우, 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합부, 폴리아데닐화 신호 등과 같은 적당한 조절 요소가 상기 유전자의 코딩 영역에 아주 근접하여 위치할 수 있다. 별법으로, 본 발명의 발현 벡터에 사용되는 코딩 영역은 내인성 인핸서/프로모터, 스플라이스 접합부, 중간 서열, 폴리아데닐화 신호 등을 함유할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 코딩 영역은 내인성 및 외인성 조절 요소의 조합을 함유할 수 있다.
용어 "전사 조절 요소" 또는 "전사 조절 서열"은 핵산 서열(들)의 발현의 일정 측면을 조절하는 유전 요소 또는 서열을 말한다. 예를 들면, 프로모터는 작동가능하게 연결된 코딩 영역의 전사의 개시를 촉진하는 조절 요소이다. 다른 조절 요소는 전사 인자 결합 부위, 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호, 종결 신호 및 인핸서 요소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
진핵생물에서 전사 조절 신호는 "프로모터" 및 "인핸서" 요소를 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 상호작용하는 DNA 서열의 짧은 어레이로 이루어져 있다. 프로모터 및 인핸서 요소는 효모, 곤충 및 포유동물 세포에서의 유전자를 비롯한 다양한 진핵생물 원천으로부터 단리되었다. 프로모터 및 인핸서 요소는 또한 바이러스로부터 단리되었고, 프로모터와 같은 유사 조절 요소는 원핵생물에서도 발견된다. 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 목적하는 단백질을 발현하는데 사용되는 세포 유형에 의존한다. 일부 진핵생물 프로모터 및 인핸서는 넓은 숙주 범위를 갖는 반면, 다른 것은 제한된 세포 유형 하부군에서 기능적이다. 예를 들면, SV40 조기 유전자 인핸서는 많은 포유동물 종으로부터의 광범위한 세포 유형에서 매우 활성이며, 포유동물 세포에서 단백질의 발현에 널리 사용되었다. 넓은 범위의 포유동물 세포 유형에서 활성인 프로모터/인핸서 요소의 두 개의 다른 예는 라우스 육종 바이러스의 사람 연장 인자 I 유전자 (Uetsuki et al., 1989; Kim et al., 1990; 및 Mizushima and Nagata, 1990) 및 장 말단 반복서열(Gorman et al., 1982), 및 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 것들(Boshart et al., 1985)이다.
용어 "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능(즉, 상술한 바와 같은 프로모터 요소 및 인핸서 요소에 의해 제공되는 기능) 모두를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA 절편을 나타낸다. 예를 들면, 레트로바이러스의 장 말단 반복서열은 프로모터 및 인핸서 기능을 함유한다. 프로모터/인핸서는 "내인성", "외인성" 또는 "이종유래"일 수 있다. "내인성" 프로모터/인핸서는 게놈에서 주어진 유전자와 자연적으로 연결된 것이다. "외인성" 또는 "이종유래" 프로모터/인핸서는 연결된 프로모터/인핸서에 의해 유전자의 전사가 지시되도록 유전 조작(즉, 분자생물학적 기술)에 의해 유전자와 인접하여 위치된 것이다.
발현 벡터 상에 "스플라이싱 신호"의 존재는 종종 진핵생물 숙주 세포에서 재조합 전사체의 더 높은 발현 수준을 가져온다. 스플라이싱 신호는 일차 RNA 전사체로부터 인트론의 제거를 매개하며, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위로 이루어져 있다(Sambrook et al., 1989). 일반적으로 사용되는 공여자 및 수용자 부위는 SV40의 16S RNA로부터의 스플라이스 접합부이다.
진핵생물 세포에서 재조합 DNA 서열의 효과적인 발현은 효과적인 종결 및 생성된 전사체의 폴리아데닐화를 지시하는 신호의 발현을 필요로 한다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견되며, 수 백개의 뉴클레오티드 길이이다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리(A) 부위" 또는 "폴리(A) 서열"은 상기 종결 및 신생 RNA 전사체의 폴리아데닐화를 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리(A) 꼬리가 결여된 전사체는 불안정하여 쉽게 분해되기 때문에, 재조합 전사체의 효과적인 폴리아데닐화가 바람직하다. 발현 벡터에 사용되는 폴리(A) 신호는 "이종유래" 또는 "내인성"일 수 있다. 내인성 폴리(A) 신호는 게놈에서 주어진 유전자의 코딩 영역의 3' 말단에서 자연적으로 발견되는 것이다. 이종유래 폴리(A) 신호는 하나의 유전자로부터 단리되어 다른 유전자의 3'에 위치된 것이다. 일반적으로 사용되는 이종유래 폴리(A) 신호는 SV40 폴리(A) 신호이다. SV40 폴리(A) 신호는 237 bp BamH I/Bcl I 제한효소 단편 상에 함유되어 있고, 종결 및 폴리아데닐화를 지시한다(Sambrook et al., 1989).
진핵생물 발현 벡터는 "바이러스 레플리콘" 또는 "바이러스 복제 기점"을 함유할 수도 있다. 바이러스 레플리콘은 적당한 복제 인자를 발현하는 숙주 세포에서 벡터의 염색체외 복제를 허용하는 바이러스 DNA 서열이다. SV40 또는 폴리오마 바이러스 복제 기점을 함유하는 벡터는 적당한 바이러스 T 항원을 발현하는 세포에서 높은 카피 수(104 카피/세포 이하)로 복제된다. 반대로, 소 유두종 바이러스 또는 엡스타인바 바이러스로부터의 레플리콘을 함유하는 벡터는 염색체외에서 낮은 카피 수(약 100 카피/세포)로 복제된다.
용어 "시험관내"는 인공 환경, 및 인공 환경 내에서 일어나는 처리 또는 반응을 말한다. 시험관내 환경은 시험관 및 세포 용해질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "제자리"는 세포 배양물을 말한다. 용어 "생체내"는 자연 환경(예, 동물 또는 세포), 및 자연 환경에서 일어나는 처리 또는 반응을 말한다.
용어 "발현 시스템"은 목적하는 유전자의 발현을 결정(예, 검출)하기 위한 임의의 분석 또는 시스템을 말한다. 분자생물학 분야의 숙련된 자는 임의의 광범위한 발현 시스템이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 광범위한 적당한 포유동물 세포는 광범위한 원천(예, 미국 매릴랜드주 록랜드 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)으로부터 이용가능하다. 형질전환 또는 트랜스펙션 방법 및 발현 비히클의 선택은 선택된 숙주 시스템에 의존할 것이다. 형질전환 및 트랜스펙션 방법은, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989]에 기재되어 있다. 발현 시스템은, 목적하는 유전자(예, 리포터 유전자)를 조절 서열에 연결하고, 상기 유전자의 발현을 억제하거나 유도하는 약제로 처리한 후 유전자의 발현을 모니터하는 시험관내 유전자 발현 분석을 포함한다. 유전자 발현은 발현된 mRNA 또는 단백질(예, 리포터 유전자의 검출성 생성물)의 검출을 비롯한(이에 제한되지 않음) 임의의 적당한 수단, 또는 목적하는 유전자를 발현하는 세포의 표현형의 검출성 변화를 통해 검출될 수 있다. 발현 시스템은 절단 사건 또는 다른 핵산 또는 세포 변화가 검출되는 분석을 포함할 수도 있다.
용어 "유전자"는 코딩 서열 및 임의로, DNA 서열로부터 폴리펩티드의 생산에 필요한 조절 서열을 포함하는 상기 DNA 서열을 말한다. 폴리펩티드는 전장 코딩 서열, 또는 상기 코딩 서열의 임의의 부분(이 부분이 전장 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 유전자 생성물을 코딩한다면)에 의해 코딩될 수 있다.
핵산은 여러 종류의 돌연변이를 함유하는 것으로 알려져 있다. "점" 돌연변이는 단일 염기 위치에서 야생형 서열로부터 뉴클레오티드의 서열의 변화를 말한다. 돌연변이는 하나 이상의 염기가 삽입 또는 결실되어 핵산 서열이 참조 서열, 예를 들어, 야생형 서열과 다른 것을 지칭할 수도 있다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "혼성화하는" 및 "혼성화"는 상보체 서열의 표적 핵산에의 어닐링, 즉, 상보체 서열을 함유하는 두 개의 핵산 중합체(폴리뉴클레오티드)가 염기 짝짓기를 통해 어닐링될 수 있는 능력을 말한다. 용어 "어닐링된" 및 "혼성화된"은 전체를 통해 교환적으로 사용되며, 단지 부분 상보성을 갖는 영역의 결합을 비롯하여 상보체 서열과 표적 핵산 사이의 임의의 특이적 및 재현가능한 상호작용을 포함하는 것이다. 자연 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 일정 염기가 본 발명의 핵산에 포함될 수 있으며, 예를 들어, 이노신 및 7-데아자구아닌을 포함한다. 핵산 기술 업계의 숙련한 자는 예를 들면, 상보체 서열의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 구성 및 서열, 이온 강도 및 잘못 매치된 염기 쌍의 발생을 비롯한 다수의 변수를 고려하여 경험칙상 듀플렉스 안정성을 결정할 수 있다. 핵산 듀플렉스의 안정성은 용융 온도 또는 "Tm"에 의해 측정된다. 특정 조건 하에서 특정 핵산 듀플렉스의 Tm은 평균적으로 염기 쌍 절반이 분리되는 온도이다.
용어 "엄격도"는 핵산 혼성화가 수행되는 온도, 이온 강도, 다른 화합물의 존재 조건과 관련하여 사용된다. "고도의 엄격" 조건에서는, 높은 빈도의 상보체 염기 서열을 갖는 핵산 단편들 사이에서만 핵산 염기 짝짓기가 일어날 것이다. 따라서, 서로 완전히 상보성이 아닌 핵산이 혼성화되거나 서로 어닐링되는 것이 바람직한 경우 "중간 정도의" 또는 "저도의" 엄격도 조건이 종종 요구된다. 당업자는 다수의 동등한 조건이 중간 정도 또는 저도의 엄격도 조건을 포함하는데 사용될 수 있음을 잘 알고 있다. 혼성화 조건의 선택은 일반적으로 당업자에게 명백하며, 혼성화의 목적, 혼성화의 유형(DNA-DNA 또는 DNA-RNA) 및 서열들 사이에서 목적하는 관계 수준에 의해 좌우된다(예를 들어, 상기 방법의 일반적인 논의에 대해서 Sambrook et al., 1989; Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington D. C., 1985).
핵산 듀플렉스의 안정성은 잘못 매치된 염기 수의 증가에 따라 감소하며, 나아가 하이브리드 듀플렉스에서 잘못 매치된 것의 상대적인 위치에 따라 더 크거나 더 적은 수준으로 감소하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 혼성화의 엄격도는 상기 듀플렉스의 안정성을 최대화거나 최소화하는데 사용될 수 있다. 혼성화 엄격도는 혼성화 온도의 조절, 혼성화 혼합물 중 헬릭스 불안정화제(예, 포름아미드)의 백분율의 조절, 세척 용액의 온도 및(또는) 염 농도의 조절에 의해 변경될 수 있다. 필터 혼성화의 경우, 혼성화의 최종 엄격도는 종종 혼성화후 세척에 사용된 염 농도 및(또는) 온도에 의해 결정된다.
핵산 혼성화와 관련하여 사용될 경우, "고도의 엄격 조건"은 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브가 사용될 경우, 42℃에서 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH2P04 H20 및 1.85 g/l EDTA, NaOH로 7.4로 조절된 pH), O.5% SDS, 5X 덴하르트(Denhardt) 시약 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서의 결합 또는 혼성화에 이어, 42℃에서 0.1X SSPE, 1.0% SDS를 포함하는 용액 중에서의 세척과 동등한 조건을 포함한다.
핵산 혼성화와 관련하여 사용될 경우, "중간 정도의 엄격 조건"은 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브가 사용될 경우, 42℃에서 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH2P04 H20 및 1.85 g/l EDTA, NaOH로 7.4로 조절된 pH), O.5% SDS, 5X 덴하르트 시약 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서의 결합 또는 혼성화에 이어, 42℃에서 1.0X SSPE, 1.0% SDS를 포함하는 용액 중에서의 세척과 동등한 조건을 포함한다.
"저도의 엄격 조건"은 약 500개 뉴클레오티드 길이의 프로브가 사용될 경우, 42℃에서 5X SSPE (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH2P04 H20 및 1.85 g/l EDTA, NaOH로 7.4로 조절된 pH), O.1% SDS, 5X 덴하르트 시약[500 ml 당 50X 덴하르트는 5 g 피콜 (타입 400, 파마시아), 5 g BSA (분획 V; 시그마)를 함유함] 및 100 g/ml 변성 연어 정자 DNA로 구성된 용액 중에서의 결합 또는 혼성화에 이어, 42℃에서 5X SSPE, 0.1% SDS를 포함하는 용액 중에서의 세척과 동등한 조건을 포함한다.
"펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 길이 또는 번역후 변형(예, 글리코실화 또는 인산화)에 상관 없이 임의의 아미노산 쇄를 의미한다. 달리 특정되지 않는 한, 상기 용어들은 교환가능하다. 본 발명의 핵산 분자는 천연(야생형) 단백질 의 변형체(돌연변이), 또는 전장 돌연변이 단백질과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 단편을 코딩한다. 바람직하게는, 상기 돌연변이 단백질은 상응 야생형 단백질의 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
펩티드 결합이 제1 아미노산 잔기의 골격 아미노기와 제2 아미노산 잔기의 골격 카르복실기 사이에서 일어나기 때문에, 폴리펩티드 분자는 "아미노 말단" (N-말단) 및 "카르복시 말단" (C-말단)을 갖는다고 한다. 폴리펩티드 서열에 있어서 "N-말단" 및 "C-말단"은 각각 상기 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 영역의 부분을 포함하는 폴리펩티드 영역을 말한다. 폴리펩티드의 N-말단 영역의 부분을 포함하는 서열은 주로 상기 폴리펩티드 쇄의 N-말단 절반으로부터의 아미노산을 포함하나, 상기 서열에 제한되지 않는다. 예를 들면, N-말단 서열은 상기 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단 절반으로부터의 염기를 포함하는 폴리펩티드 서열의 내부 부분을 포함할 수 있다. 이는 C-말단 영역에도 동등하게 적용된다. N-말단 및 C-말단 영역은 각각 상기 폴리펩티드의 최종 N-말단 및 C-말단을 규정하는 아미노산을 포함할 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
폴리펩티드와 관련하여 사용될 경우, "단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩티드"에서와 같이, 용어 "단리된"은 그의 원천에서 통상적으로 연관된 하나 이상의 오염물로부터 동정되고 분리된 폴리펩티드를 말한다. 따라서, 단리된 폴리펩티드는 (1) 자연에서 발견되는 단백질과 연관되어 있지 않거나, (2) 동일한 원천으로부터의 다른 단백질, 예를 들어, 사람 단백질이 없거나, (3) 다른 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는다. 반대로, 단리되지 않은 폴리펩티드(예, 단백질 및 효소)는 이들이 자연에서 존재하는 상태로 발견된다. 용어 "단리된 폴리펩티드", "단리된 펩티드" 또는 "단리된 단백질"은 합성 기원 중 하나를 포함하는 cDNA 또는 재조합 RNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 펩티드 또는 단백질 또는 그의 소정의 조합을 포함한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "재조합 단백질" 또는 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 DNA 분자로부터 발현된 단백질 분자를 말한다. 반대로, 용어 "본래 단백질"은 천연(즉, 비-재조합) 원천으로부터 단리된 단백질을 나타내기 위해 사용된다. 단백질의 본래 형태와 비교시 동일한 특성을 갖는 단백질의 재조합 형태를 생산하는데 분자생물학 기술이 사용될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 용어 "융합 폴리펩티드"는 다른 단백질, 예를 들어, 돌연변이 하이드롤라제에 연결된 목적하는 단백질(예, 루시퍼라제, 친화 태그 또는 표적 서열)을 함유하는 키메라 단백질을 말한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "항체"는 실질적으로 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자 단편에 의해 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드를 갖는 단백질을 말한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 및 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 다시 각각 면역글로불린 군 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 규정한다.
기본 면역글로불린 (항체) 구조 유닛은 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 두 개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍으로 이루어져 있고, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kD) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kD)를 갖는다. 각 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 규정한다. 용어 가변 경쇄(V L ) 및 가변 중쇄(V H )는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 말한다.
항체는 온전한 면역글로불린, 또는 예를 들어 FabFc2, Fab, Fv, Fd, (Fab')2, 경쇄 및 중쇄 가변 영역만을 함유하는 Fv 단편, 불변 영역의 일부 및 가변 영역을 함유하는 Fab 또는 (Fab')2 단편, 단일쇄 항체(예, scFv), CDR-이식된 항체 등을 비롯한 다양한 형태의 변형체로 존재할 수 있다. Fv의 중쇄 및 경쇄는 동일한 항체 또는 키메라 Fv 영역을 생성하는 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항체는 동물(특히, 마우스 또는 래트) 또는 사람 기원일 수 있거나, 키메라 또는 인간화될 수 있다. 본원에서 용어 "항체"는 이들 다양한 형태를 포함한다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "세포", "세포주", "숙주 세포"는 교환적으로 사용되며, 이러한 모든 지칭은 이들 지칭의 자손 또는 잠재적 자손을 포함한다. "형질전환된 세포"는 본 발명의 핵산 분자가 도입된 세포 또는 그의 선조를 의미한다. 임의로, 본 발명의 핵산 분자는 적당한 세포주로 도입되어 상기 핵산 분자에 의해 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드를 생산할 수 있는 안정하게 트랜스펙션된 세포주를 생성할 수 있다. 벡터, 세포, 및 이러한 세포주를 제작하는 방법이 당업계에 널리 알려져 있다. 용어 "형질전환체" 또는 "형질전환된 세포"는 전달 수에 관계없이 최초로 형질전환된 세포로부터 유래된 일차 형질전환된 세포를 포함한다. 모든 자손은 인공 또는 우발 돌연변이로 인해 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있다. 그러나, 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능을 갖는 돌연변이 자손은 형질전환체의 정의에 포함된다.
용어 "상동성"은 상보성 정도를 말한다. 부분 상동성 또는 완전 상동성(즉, 동일성)일 수 있다. 상동성은 종종 서열 분석 소프트웨어(예, 미국 위스콘신주 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710, 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정된다. 상기 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 삽입 및 기타 변형에 상동성 정도를 지정함으로써 유사한 서열을 매치시킨다. 보존적 치환은 일반적으로 하기 군 내의 치환을 포함한다: 글라이신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
용어 "정제된" 또는 "정제하기 위한"은 목적하는 성분(예, 단백질 또는 핵산)으로부터 오염물의 일부를 제거하는 임의의 처리의 결과를 의미한다. 따라서, 정제된 성분의 퍼센트는 샘플에서 증가한다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "작동가능하게 연결된"은 주어진 유전자의 전사 및(또는) 목적하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생산되도록 하는, 핵산 서열의 연결을 말한다. 상기 용어는 또한 기능적(예, 효소적으로 활성인, 결합 파트너에 결합할 수 있는, 억제할 수 있는 등) 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 이의 전구체(예, 상기 단백질 또는 폴리펩티드의 프리- 또는 프리프로 형태)가 생산되도록 하는, 아미노산을 코딩하는 서열의 연결을 말한다.
본원에서 동정된 모든 아미노산 잔기는 자연적 L-배열 상태이다. 표준 폴리펩티드 명명법에 따라, 아미노산 잔기의 약어는 하기 대응 표에 나타낸 바와 같다.
대응 표
1-문자 3-문자 아미노산
Y Tyr L-티로신
G Gly L-글라이신
F Phe L-페닐알라닌
M Met L-메티오닌
A Ala L-알라닌
S Ser L-세린
I Ile L-이소류신
L Leu L-류신
T Thr L-트레오닌
V Val L-발린
P Pro L-프롤린
K Lys L-라이신
H His L-히스티딘
Q Gln L-글루타민
E Glu L-글루탐산
W Trp L-트립토판
R Arg L-아르기닌
D Asp L-아스파르트산
N Asn L-아스파라긴
C Cys L-시스테인
본원에서 사용될 경우, 용어 "폴리-히스티딘 트랙" 또는 (His 태그)는 2 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 분자(예, 5 내지 10개 잔기의 폴리-히스티딘 트랙)를 말한다. 폴리-히스티딘 트랙은 고정된 금속, 예를 들어, 니켈, 아연, 코발트 또는 구리 상에, 킬레이트 칼럼 상에, 또는 다른 분자(예, His 태그와 반응성인 항체)와의 상호작용을 통해 공유 결합된 분자의 친화도 정제를 허용한다.
본원에서 사용될 경우, "순수한"은 대상 종이 존재하는 우세한 종인 것(즉, 몰 기준으로 이것이 조성물 중의 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부함)을 의미하며, 바람직하게는, 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 고분자 종의 적어도 약 50%(몰 기준으로)를 구성하는 조성물이다. 일반적으로, "실질적으로 순수한" 조성물은 조성물 중에 존재하는 모든 고분자 종의 약 80% 초과, 더 바람직하게는 약 85%, 약 90%, 약 95% 및 약 99% 초과를 구성할 것이다. 가장 바람직하게는, 대상 종이, 조성물이 단일 고분자 종을 주성분으로 하는 본질적인 동질성까지(통상의 검출 방법에 의해 오염물 종이 조성물 중에서 검출될 수 없음) 정제된다.
I. 돌연변이 하이드롤라제 및 이의 융합체
본 발명의 범위 내의 돌연변이 하이드롤라제는 재조합 기술, 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 또는 순환 돌연변이를 거쳐 제조된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 돌연변이 하이드롤라제가 상응 비돌연변이(야생형) 하이드롤라제에 대한 기질, 예를 들어, 하나 이상의 관능기를 함유하도록 변형된 기질과 안정한(예, 공유) 결합을 형성할 수 있도록 하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 범위 내의 하이드롤라제는 펩티다아제, 에스테라아제(예, 콜레스테롤 에스테라아제), 글리코시다아제(예, 글루코사밀라아제), 포스파타아제(예, 알칼리성 포스파타아제) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 하이드롤라제는 카르복실산 에스테르 하이드롤라제, 티올에스테르 하이드롤라제, 포스포릭 모노에스테르 하이드롤라제, 포스포릭 디에스테르 하이드롤라제, 트리포스포릭 모노에스테르 하이드롤라제, 설푸릭 에스테르 하이드롤라제, 디포스포릭 모노에스테르 하이드롤라제, 포스포릭 트리에스테르 하이드롤라제, 5'-포스포모노에스테르를 생성하는 엑소데옥시리보뉴클레아제, 5'-포스포모노에스테르를 생성하는 엑소리보뉴클레아제, 3'-포스포모노에스테르를 생성하는 엑소리보뉴클레아제, 리보- 또는 데옥시리보핵산에 활성인 엑소뉴클레아제, 5'-포스포모노에스테르를 생성하는 엔도데옥시리보뉴클레아제, 5' 이외-포스포모노에스테르를 생성하는 엔도데옥시리보뉴클레아제, 변경된 염기에 특이적인 부위 특이적 엔도데옥시리보뉴클레아제, 5'-포스포모노에스테르를 생성하는 엔도리보뉴클레아제, 5' 이외-포스포모노에스테르를 생성하는 엔도리보뉴클레아제, 리보- 또는 데옥시리보핵산에 활성인 엔도리보뉴클레아제, 리보- 또는 데옥시리보핵산 글리코실라아제에 활성인 엔도리보뉴클레아제와 같은 에스테르 결합에 작용하는 효소; 글리코시다아제, 예를 들면, O- 및 S-글리코실을 가수분해하는 효소 및 N-글리코실 화합물을 가수분해하는 효소; 트리알킬설포늄 하이드롤라제 또는 에테르 하이드롤라제와 같은 에테르 결합에 작용하는 효소; 아미노펩티다아제, 디펩티다아제, 디펩티딜-펩티다아제 및 트리펩티딜-펩티다아제, 펩티딜-디펩티다아제, 세린형 카르복시펩티다아제, 메탈로카르복시펩티다아제, 시스테인형 카르복시펩티다아제, 오메가 펩티다아제, 세린 엔도펩티다아제, 시스테인 엔도펩티다아제, 아스파르트산 엔도펩티다아제, 메탈로엔도펩티다아제, 트레오닌 엔도펩티다아제 및 미지의 촉매적 기작을 갖는 엔도펩티다아제와 같은 펩티드 결합에 작용하는 효소(펩티드 하이드롤라제); 선형 아미드, 시클릭 아미드, 선형 아미딘, 시클릭 아미딘, 니트릴 또는 다른 화합물에서와 같이, 펩티드 결합 이외의 탄소-질소 결합에 작용하는 효소; 인 함유 무수물 및 설포닐 함유 무수물에서와 같은 산 무수물에 작용하는 효소; (막횡단 이동을 촉매하는) 산 무수물에 작용하는 효소; 산 무수물에 작용하거나, 세포 및 아세포 이동에 관여하는 효소; (예, 케톤성 물질에서) 탄소-탄소 결합에 작용하는 효소; (예, C-할로겐화물 화합물에서) 할로겐화물 결합에 작용하는 효소; 인-질소 결합에 작용하는 효소; 황-질소 결합에 작용하는 효소; 탄소-인 결합에 작용하는 효소; 및 황-황 결합에 작용하는 효소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 할로겐화물 결합에 작용하는 하이드롤라제의 예는 알킬할리다아제, 2-할로산 데할로게나제, 할로아세테이트 데할로게나제, 티록신 데요오디나아제, 할로알칸 데할로게나제, 4-클로로벤조에이트 데할로게나제, 4-클로로벤조일-CoA 데할로게나제 및 아트라진 클로로하이드롤라제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 시클릭 아미드에서 탄소-질소 결합에 작용하는 하이드롤라제의 예는 바르비츄라제, 디히드로피리미디나제, 디히드로오로타제, 카르복시메틸히단토인아제, 알란토인아제, 베타-락타마제, 이미다졸론프로피오나제, 5-옥소프롤린아제(ATP-가수분해), 크레아티닌아제, L-라이신-락타마제, 6-아미노헥사노에이트-시클릭-이량체 하이드롤라제, 2,5-디옥소피페라진 하이드롤라제, N-메틸히단토인아제(ATP-가수분해), 시아누린산 아미도하이드롤라제, 말레이미드 하이드롤라제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용될 경우, "베타-락타마제"는 클래스 A, 클래스 C 및 클래스 D 베타-락타마제 및 D-ala 카르복시펩티다아제/트랜스펩티다제, 에스테라제 EstB, 페니실린 결합 단백질 2X, 페니실린 결합 단백질 5 및 D-아미노 펩티다제를 포함한다. 바람직하게는, 베타-락타마제는 세린 베타-락타마제, 예를 들면, 에스. 아우레우스(S. aureus) PC1의 세린 베타-락타마제에서의 잔기 70에 상응하는 위치에서 촉매적 세린 잔기, 및 에스. 아우레우스 PC1의 세린 베타-락타마제에서의 잔기 166에 상응하는 위치에서 글루탐산 잔기, 임의로 에스. 아우레우스 PC1의 세린 베타-락타마제에서의 잔기 73에 상응하는 위치에서 라이신 잔기, 및 임의로 에스. 아우레우스 PC1의 베타-락타마제에서의 잔기 234에 상응하는 위치에서 라이신 잔기를 갖는 것이다.
한 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 그람-음성 (Keuning et al., 1985) 및 그람-양성 할로알칸을 이용하는 박테리아(Keuning et al., 1985; Yokota et al., 1987; Scholtz et al., 1987; Sallis et al., 1990)에서 발견되는 것과 같은 할로알칸 데할로게나제이다. 크산토박터 오토트로피쿠스(Xanthobacter autotrophicus) GJ10으로부터의 Dh1A (Janssen et al., 1988, 1989) 및 로도코커스로도크로우스로부터의 DhaA를 비롯한 할로알칸 데할로게나제는 상응하는 탄화수소의 가수분해적 탈할로겐화를 촉매하는 효소이다. 변환되는 할로겐화된 지방족 탄화수소는 하나 이상의 할로겐 군이 부착된 C2-C10 포화 지방족 탄화수소(여기서, 할로겐 중 2개 이상은 인접한 탄소 원자 상에 있음)를 포함한다. 상기 지방족 탄화수소는 휘발성 염소화된 지방족(VCA) 탄화수소를 포함한다. VCA는, 예를 들면, 디클로로에탄, 1,2-디클로로-프로판, 1,2-디클로로부탄 및 1,2,3-트리클로로프로판과 같은 지방족 탄화수소를 포함한다. 본원에서 사용될 경우, 용어 "할로겐화된 탄화수소"는 할로겐화된 지방족 탄화수소를 의미한다. 본원에서 사용될 경우, 용어 "할로겐"은 염소, 브롬, 요오드, 불소, 아스타틴 등을 포함한다. 바람직한 할로겐은 염소이다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 돌연변이 하이드롤라제 및 목적하는 단백질을 위한 아미노산 서열(예, 마커 단백질 또는 친화 태그(예, 루시퍼라제, GFP 또는 폴리히스티딘 서열), 핵산 결합 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 분비 단백질, 수용체 리간드, 혈청 단백질, 면역원성 단백질, 형광 단백질, 반응성 시스테인을 갖는 단백질, 수용체 단백질(예, NMDA 수용체), 채널 단백질(예, HERG 채널 단백질을 비롯한 나트륨-, 칼륨- 또는 칼슘-민감성 채널 단백질), 또는 전달 단백질(예, EAAT1-4 글루탐산 전달체)을 위한 서열, 및 표적 신호(예, 플라스티드 표적 신호, 핵 위치지정 신호 또는 미리스틸화 서열)를 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
II. 최적화된 하이드롤라제 서열, 및 상기 하이드롤라제를 코딩하는 벡터 및 숙주 세포
하이드롤라제 또는 이의 융합체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자는 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 임의로 최적화되며, 또한 임의로 전사 조절 서열(예, 하나 이상의 인핸서, 프로모터, 전사 종결 서열 또는 이들의 조합)에 작동가능하게 연결되어 발현 카세트를 형성한다.
한 실시태양에서, 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 코딩하는 핵산 서열은 야생형 또는 돌연변이 하이드롤라제 서열의 코돈을 특정 (선택된) 세포에서 우선적으로 사용되는 코돈으로 대체함으로써 최적화된다. 바람직한 코돈은 선택된 세포에서 비교적 높은 코돈 사용 빈도를 가지며, 바람직하게는, 이들의 도입은 선택된 숙주 세포에 존재하는 전사 인자에 대한 비교적 소수의 전사 인자 결합 부위 및 비교적 소수의 다른 바람직하지 못한 구조적 특징의 도입을 가져온다. 따라서, 최적화된 핵산 생성물은 개선된 코돈 사용 빈도로 인해 발현 수준이 개선되며, 바람직하지 못한 전사 조절 서열의 감소된 수로 인해 부적당한 전사 거동의 위험이 감소된다.
본 발명의 단리되고 최적화된 핵산 분자는 30%, 35%, 40% 초과 또는 45% 초과(예, 50%, 55%, 60% 또는 그 이상)의 코돈에서 상응 야생형 핵산 서열과 다른 코돈 조성을 가질 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 선호되는 코돈은 특정 유기체에서 동일한 아미노산을 위한 하나 이상의 다른 코돈보다 더 자주 사용되는 것이며, 더 바람직하게는, 상기 유기체에서 저-사용 코돈이 아니고, 핵산 분자의 발현을 위해 클로닝 또는 스크링하는데 사용되는 유기체에서 저-사용 코돈이 아닌 것이다. 또한, 일정 아미노산(즉, 3개 이상의 코돈을 갖는 아미노산)에 선호되는 코돈은 다른 (선호되지 않은) 코돈(들)보다 더 자주 사용되는 2개 이상의 코돈을 포함할 수 있다. 핵산 분자에서 다른 유기체에서보다 한 유기체에서 더 자주 사용되는 코돈의 존재는, 핵산 분자가 상기 코돈을 더 자주 사용하는 유기체의 세포에 도입될 경우 상기 세포에서 야생형 또는 모 핵산 서열의 발현보다 더 높은 수준으로 상기 세포에서 발현되는 핵산 분자를 생성한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 상이한 코돈은 포유동물에서 더 자주 사용되는 것들이며, 다른 실시태양에서, 상이한 코돈은 식물에서 더 자주 사용되는 것들이다. 상이한 유기체에 선호되는 코돈은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, www. kazusa.or.jp./codon/을 참조). 특정 유형의 포유동물(예, 사람)은 다른 유형의 포유동물보다 선호되는 여러 세트의 코돈을 갖는다. 마찬가지로, 특정 유형의 식물은 다른 유형의 식물보다 선호되는 여러 세트의 코돈을 갖는다. 본 발명의 한 실시태양에서, 상이한 코돈의 대부분은 원하는 숙주 세포에서 선호되는 코돈인 것들이다. 포유동물(예, 사람) 및 식물을 비롯한 유기체에 선호되는 코돈은 당업계에 알려져 있다(예, Wada et al., 1990; Ausubel et al., 1997). 예를 들면, 선호되는 사람 코돈은 CGC (Arg), CTG (Leu), TCT (Ser), AGC (Ser), ACC (Thr), CCA (Pro), CCT (Pro), GCC (Ala), GGC (Gly), GTG (Val), ATC(Ile), ATT(Ile), AAG (Lys), AAC (Asn), CAG (Gln), CAC (His), GAG (Glu), GAC (Asp), TAC (Tyr), TGC (Cys) 및 TTC (Phe)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(Wada et al., 1990). 따라서, 한 실시태양에서, 본 발명의 합성 핵산 분자는 증가된 수의 선호되는 사람 코돈, 예를 들어, CGC, CTG, TCT, AGC, ACC, CCA, CCT, GCC, GGC, GTG, ATC, ATT, AAG, AAC, CAG, CAC, GAG, GAC, TAC, TGC, TTC 또는 이들의 임의의 조합을 가짐으로써 야생형 핵산 분자 서열과 다른 코돈 조성을 갖는다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 분자는 야생형 핵산 서열에 비해 증가된 수의 CTG 또는 TTG 류신 코딩 코돈, GTG 또는 GTC 발린 코딩 코돈, GGC 또는 GGT 글라이신 코딩 코돈, ATC 또는 ATT 이소류신 코딩 코돈, CCA 또는 CCT 프롤린 코딩 코돈, CGC 또는 CGT 아르기닌 코딩 코돈, AGC 또는 TCT 세린 코딩 코돈, ACC 또는 ACT 트레오닌 코딩 코돈, GCC 또는 GCT 알라닌 코딩 코돈 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 선호되는 씨. 엘레간스(C. elegans) 코돈은 UUC (Phe), UUU (Phe), CUU (Leu), UUG (Leu), AUU (Ile), GUU (Val), GUG (Val), UCA (Ser), UCU (Ser), CCA (Pro), ACA (Thr), ACU (Thr), GCU (Ala), GCA (Ala), UAU (Tyr), CAU (His), CAA (Gln), AAU (Asn), AAA (Lys), GAU (Asp), GAA (Glu), UGU (Cys), AGA (Arg), CGA (Arg), CGU (Arg), GGA (Gly) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 실시태양에서, 선호되는 드로소필리아(Drosophilia) 코돈은 UUC (Phe), CUG (Leu), CUC (Leu), AUC (Ile), AUU (Ile), GUG (Val), GUC (Val), AGC (Ser), UCC (Ser), CCC (Pro), CCG (Pro), ACC (Thr), ACG (Thr), GCC (Ala), GCU (Ala), UAC (Tyr), CAC (His), CAG (Gln), AAC (Asn), AAG (Lys), GAU (Asp), GAG (Glu), UGC (Cys), CGC (Arg), GGC (Gly), GGA (gly) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 선호되는 효모 코돈은 UUU (Phe), UUG (Leu), UUA (Leu), CCU (Leu), AUU (Ile), GUU (Val), UCU (Ser), UCA (Ser), CCA (Pro), CCU (Pro), ACU (Thr), ACA (Thr), GCU (Ala), GCA (Ala), UAU (Tyr), UAC (Tyr), CAU (His), CAA (Gln), AAU (Asn), AAC (Asn), AAA (Lys), AAG (Lys), GAU (Asp), GAA (Glu), GAG (Glu), UGU (Cys), CGU (Trp), AGA (Arg), CGU (Arg), GGU (Gly), GGA (Gly) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유사하게, 식물에서 더 자주 사용되는 코돈의 증가된 수를 갖는 핵산 분자는 CGC (Arg), CTT (Leu), TCT (Ser), TCC (Ser), ACC (Thr), CCA (Pro), CCT (Pro), GCT (Ser), GGA (Gly), GTG (Val), ATC (Ile), ATT (Ile), AAG (Lys), AAC (Asn), CAA (Gln), CAC (His), GAG (Glu), GAC (Asp), TAC (Tyr), TGC (Cys), TTC (Phe) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는(이에 제한되지 않음) 식물 코돈의 증가된 수를 가짐으로써 야생형 또는 모 핵산 서열과 다른 코돈 조성을 갖는다(Murray et al., 1989). 선호되는 코돈은 상이한 종류의 식물에 대해 다를 수 있다(Wada et al., 1990).
한 실시태양에서, 하이드롤라제 또는 그의 융합체를 코딩하는 최적화된 핵산 서열은 상응 하이드롤라제 또는 그의 융합체를 코딩하는 비최적화된 핵산 서열에 비해 100% 미만, 예를 들어, 90% 미만 또는 80% 미만의 핵산 서열 동일성을 갖는다. 예를 들면, DhaA를 코딩하는 최적화된 핵산 서열은 상응 DhaA를 코딩하는 비최적화된 (야생형) 핵산 서열에 비해 약 80% 미만의 핵산 서열 동일성을 가지며, 선택적으로, 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된 DhaA는 상응 야생형 DhaA에 대해 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 실시태양에서, 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된 DhaA의 활성은 비최적화된 서열에 의해 코딩된 DhaA의 활성의 10% 이상, 예를 들어, 50% 또는 그 이상이다. 예를 들면, 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된 돌연변이 DhaA는 비최적화된 핵산 서열에 의해 코딩된 돌연변이 DhaA가 기질에 결합하는 것과 실질적으로 동일한 효능(즉, 적어도 50%, 80%, 100% 또는 그 이상)으로 동일한 기질에 결합한다.
핵산 분자 또는 발현 카세트는, 임의로 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 벡터(예, 플라스미드 또는 바이러스 벡터)에 도입될 수 있고, 상기 벡터는 목적하는 세포, 예를 들면, 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 바실루스(Bacillus) 종, 스타필로코커스(Staphylococcus) 종 등과 같은 원핵생물 세포, 및 식물(쌍자엽 또는 단자엽), 진균, 효모, 예를 들면, 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 또는 포유동물 세포를 비롯한 진핵세포에 도입될 수 있다. 바람직한 포유동물 세포는 소, 염소, 양, 개, 고양이, 비사람 영장류(예, 원숭이) 및 사람 세포를 포함한다. 바람직한 포유동물 세포주는 CHO, COS, 293, Hela, CV-1, SH-SY5Y (사람 신경모세포종 세포), HEK293 및 NIH3T3 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
코딩된 돌연변이 하이드롤라제의 발현은 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포에서 발현할 수 있는 임의의 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 바람직한 원핵생물 프로모터는 SP6, T7, T5, tac, bla, trp, gal, lac 또는 말토오스 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 진핵생물 프로모터는 항상성 프로모터, 예를 들면, CMV, SV40 및 RSV 프로모터와 같은 바이러스 프로모터, 및 조절 프로모터, 예를 들면, tet 프로모터, hsp70 프로모터 및 CRE에 의해 조절되는 합성 프로모터와 같은 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 박테리아 발현에 바람직한 벡터는 pGEX-5X-3을 포함하고, 진핵생물 발현에 바람직한 벡터는 pCIneo-CMV를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자, 발현 카세트 및(또는) 벡터는 칼슘 매개 형질전환, 전기천공, 미세주사, 지질감염(lipofection), 입자 충격 등을 비롯한 임의의 방법에 의해 세포에 도입될 수 있다.
III. 관능기
본 발명의 기질 및 방법에 유용한 관능기는 검출성 또는 검출될 수 있는 분자이다. 본 발명의 범위 내의 관능기는 이관능성 링커 또는 하이드롤라제에 대한 기질의 한 반응성 치환체에 공유 결합될 수 있으며, 본 발명의 기질의 일부로서, 자연에서 발견되는 기질에 결합되지 않은 관능기와 실질적으로 동일한 활성을 가지며, 돌연변이 하이드롤라제와 안정한 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 관능기는 상기 관능기를 갖는 기질과 돌연변이 하이드롤라제 사이의 안정한 복합체의 검출 및 임의적으로 단리를 촉진하는 하나 이상의 성질을 갖는다. 예를 들면, 관능기는 발산 또는 흡광, 자성, 전자 스핀 공명, 전기 용량, 유전상수 또는 전기 전도도와 같은 특징적 전자기 스펙트럼 성질을 갖는 것, 및 강자성, 상자성, 반자성, 발광, 전기화학발광, 형광, 인광, 염색, 항원성이거나 특유의 질량을 갖는 관능기를 포함한다. 관능기는 핵산 분자, 즉, DNA 또는 RNA (예, 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드), 단백질 (예, 발광 단백질), 펩티드, 예를 들면, 리간드에 의해 인식되는 에피토프 (예, 바이오틴 또는 스트렙타비딘), 합텐, 아미노산, 지질, 지질 이중층, 고형 지지체, 형광발색단, 발색단, 리포터 분자, 방사성핵종, 전자 비투과성 분자, MRI 조영제 (예, 망간, 가돌리늄 (III) 또는 철산화물 입자) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 관능기를 검출하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 혼성화, 증폭, 상기 핵산 분자에 특이적인 핵산 결합 단백질에의 결합, 효소적 분석 (예, 핵산 분자가 리보자임일 경우)에 의해 검출될 수 있거나, 또는 핵산 분자 자체가 검출성 또는 검출될 수 있는 분자, 예를 들면, 방사성표지 또는 바이오틴을 포함하는 경우, 이것은 상기 분자에 적당한 분석에 의해 검출될 수 있다.
관능기의 예는 합텐, 예를 들면, 키홀 림펫 헤마시아닌(KLH), 절단성 표지, 예를 들면, 광절단성 바이오틴, 및 형광 표지, 예를 들면, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 변형된 쿠마린 및 숙신이미드 또는 설포노숙신이미드 변형된 BODIPY (UV 및(또는) 가시광 여기된 형광 검출에 의해 검출될 수 있음), 로다민, 예를 들면, R110, 로돌, CRG6, 텍사스 메틸 레드(TAMRA), Rox5, FAM 또는 플루오로세인, 쿠마린 유도체, 예를 들면, 7-아미노쿠마린 및 7-히드록시쿠마린, 2-아미노-4-메톡시나프탈렌, 1-히드록시피렌, 레저루핀, 페날레논 또는 벤즈페날레논 (미국 특허 제4,812,409호), 아크리디논 (미국 특허 제4,810,636호), 안트라센, 및 α- 및 β-나프톨 유도체, 불소화 플루오로세인 및 로돌을 비롯한 불소화 크산텐 유도체 (예, 미국 특허 제6,162,931호), 및 생물발광 분자, 예를 들면, 루시퍼라제 또는 GFP와 같은 면역원성을 증진시키는데 유용한 분자를 포함한다. 상응 야생형 하이드롤라제에 대한 기질에 결합되는 것에 의해 돌연변이 하이드롤라제에 결합된 형광 (또는 생물발광) 관능기는 인산화와 같은 시스템의 변화를 실시간으로 감지하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 기질에서, 금속 이온의 케모센서(chemosensor), 예를 들면, Cu2+에 대한 카르보닐안트라센 변형된 글리실-히스티딜-라이신(GHK)과 같은 형광 분자가 상기 기질에 결합하는 단백질을 표지하기 위해 사용될 수 있다. 또한, BODIPY, 로다민 그린, GFP 또는 적외선 염료와 같은 생물발광 또는 형광 관능기가 관능기로서 유용하고, 예를 들면, BRET, FRET, LRET 또는 전기영동을 사용하는 상호작용 연구에 이용될 수 있다.
다른 관능기 부류는 수용체 그룹을 함유하는 분자("친화 분자")와 선택적으로 상호작용하는 분자이다. 따라서, 친화 분자를 포함하는 하이드롤라제에 대한 기질은, 상기 친화 분자와 기원이 생물학적 또는 비생물학적일 수 있는 다른 분자(예, 수용체 분자)와의 선택적 상호작용으로 인해, 상기 기질 및 돌연변이 하이드롤라제를 갖는 복합체의 분리를 촉진할 수 있다. 예를 들면, 친화 분자와 상호작용하는 특정 분자(수용체 분자로 지칭됨)는 유기 소분자, 화학기(예, 설프히드릴기 (-SH)), 항체와 같은 큰 생물분자 또는 상기 친화 분자에 대한 다른 천연 리간드일 수 있다. 상기 결합은 일반적으로 본래 화학적이고, 공유 또는 비공유 결합의 형성, 또는 이온결합이나 수소 결합과 같은 상호작용에 관여할 수 있다. 수용체 분자는 용액 중에서 유리 상태이거나, 스스로 고체 또는 반고체 표면, 중합체 매트릭스에 결합하거나, 또는 고체 또는 반고체 기질의 표면 상에 존재할 수 있다. 상기 상호작용은 빛, 온도, 압력, 또는 촉매로 작용하는 화학적 또는 생물학적 분자의 첨가와 같은 외부 인자에 의해 유발될 수 있다. 반응 혼합물로부터 복합체의 검출 및(또는) 분리는 친화 분자와 수용체 분자 사이의, 일반적으로 일종의 결합인 상호작용으로 인해 일어난다.
친화 분자의 예는 면역원성 분자, 예를 들면, 단백질, 펩티드, 탄수화물 또는 지질의 에피토프, 즉, 그 분자에 특이적인 항체를 제조하는데 유용한 임의의 분자; 바이오틴, 아비딘, 스트렙타비딘 및 이들의 유도체; 금속 결합 분자; 및 상기 분자들의 단편 및 조합을 포함한다. 친화 분자의 예는 His5 (HHHHH) (서열 19), HisX6 (HHHHHH) (서열 20), C-myc (EQKLISEEDL) (서열 21), Flag (DYKDDDDK) (서열 22), SteptTag (WSHPQFEK) (서열 23), HA Tag (YPYDVPDYA) (서열 24), 티오레독신, 셀룰로스 결합 도메인, 키틴 결합 도메인, S-펩티드, T7 펩티드, 칼모듈린 결합 펩티드, C-말단 RNA 태그, 금속 결합 도메인, 금속 결합 반응기, 아미노산 반응기, 인테인, 바이오틴, 스트렙타비딘 및 말토스 결합 단백질을 포함한다. 예를 들면, 바이오틴을 포함하는 하이드롤라제에 대한 기질이 돌연변이 하이드롤라제와 접촉된다. 돌연변이 하이드롤라제와 기질 사이의 복합체에서 바이오틴의 존재는 상기 복합체가 아비딘 분자, 예를 들면, 표면(예, 비드, 마이크로웰, 니트로셀룰로스 등) 상에 코팅된 스트렙타비딘 분자에 선택적으로 결합하게 한다. 적당한 표면은 크로마토그래피 분리를 위한 수지, 조직 배양 표면 또는 결합 플레이트와 같은 플라스틱, 마이크로티터 접시 및 비드, 세라믹 및 유리, 자성 입자를 포함하는 입자, 중합체 및 기타 매트릭스를 포함한다. 처리된 표면은, 예를 들어 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척되어, 바이오틴이 결여된 분자를 제거하고 바이오틴을 함유하는 복합체를 단리한다. 어떤 경우에, 이들 물질은 광학 섬유, 캠팻(chemfet) 및 플라스몬 검출기와 같은 생물분자 감지 장치의 일부일 수 있다.
친화 분자의 다른 예는 단실라이신(dansyllysine)이다. 단실 고리와 상호작용하는 항체는 상업적으로 이용가능하거나(Sigma Chemical; St. Louis, MO), 또는 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual (Harlow and Lane, 1988)]에 기재된 바와 같은 공지의 프로토콜을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 항-단실 항체를 크로마토그래피 칼럼의 충전 물질 상에 고정시킨다. 이 친화 칼럼 크로마토그래피 방법은 돌연변이 하이드롤라제와 본 발명의 기질 사이의 복합체가 그의 고정된 항체와의 상호작용으로 인해 상기 칼럼 상에 유지되도록 하는 반면 다른 분자는 칼럼을 통과시킴으로써 분리를 달성한다. 이어서, 항체-항원 상호작용을 붕괴시킴으로써상기 복합체를 방출시킬 수 있다. 이온 교환 또는 친화 세파로스, 세파크릴, 세파덱스 및 기타 크로마토그래피 수지와 같은 특정 크로마토그래피 칼럼 재료는 상업적으로 이용가능하다(Sigma Chemical; St. Louis, MO; Pharmacia Biotech; Piscataway, N. J.). 단실라이신은 그의 형광 특성으로 인해 편리하게 검출될 수 있다.
항체를 수용체 분자로 사용할 경우, 면역침전 및 필터 또는 다른 표면(예, 비드, 플레이트 또는 수지) 상에의 항체의 고정과 같은 다른 생화학적 분리를 통해 분리를 수행할 수도 있다. 예를 들면, 돌연변이 하이드롤라제와 본 발명의 기질의 복합체는 자성 비드를 친화 분자-특이적 또는 하이드롤라제-특이적 항체로 코팅함으로써 단리될 수 있다. 종종 비드는 자기장을 사용하여 혼합물로부터 분리된다.
다른 관능성 분자 부류는 전자기 방사선을 사용하여 검출성 분자를 포함하고, 크산텐 형광발색단, 단실 형광발색단, 쿠마린 및 쿠마린 유도체, 형광 아크리디늄 잔기, 벤조피렌 기재 형광발색단, 및 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸 및 3-N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)-2,3-디아미노-프로피온산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 형광 분자는 본래 아미노산과 다른 파장에서 높은 양자 수득량의 형광을 가지며, 더 바람직하게는, 스펙트럼의 가시광 또는 UV 및 가시광 부분 모두에서 여기될 수 있는 높은 양자 수득량의 형광을 갖는다. 미리 선택된 파장에서 여기 시, 상기 분자는 육안으로 또는 통상의 형광 검출 방법을 사용하여 낮은 농도에서 검출가능하다. 루테늄 킬레이트 및 이의 유도체 또는 니트록시드 아미노산 및 이의 유도체와 같은 전기화학발광 분자는 펨토 몰 범위 이하에서 검출가능하다.
형광 분자 이외에, 전자기장 및 방사선에 대한 분자의 상호작용 및 반응에 기초한 물리적 성질을 갖는 다양한 분자가 돌연변이 하이드롤라제와 본 발명의 기질 사이의 복합체를 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 성질은 전자기장 스펙트럼의 UV, 가시광 및 적외선 영역에서의 흡수, 라만 활성인 발색단의 존재를 포함하고, 공명 라만 분광법, 전자 스핀 공명 활성, 핵 자기 공명 및 분자 질량(예, 질량 분광계를 거침)에 의해 더 증강될 수 있다.
친화 분자를 갖는 복합체의 검출 및(또는) 단리 방법은 겔 투과, 고속 압력 또는 고압 액체 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 비롯한 크로마토그래피법을 포함한다. 다른 단백질 분리 방법, 예를 들면, 전기영동, 등전 포커싱 및 질량 분광법도 돌연변이 하이드롤라제와 본 발명의 기질 사이의 복합체의 검출 및 후속적인 단리에 유용하다.
IV. 링커
기호 'L'로도 식별되는 용어 "링커"는 하나 이상의 관능기를 반응기를 포함하는 기질 또는 반응기에 공유 결합시키는 기 또는 기들을 말한다. 본원에서, 링커는 단일 공유 결합이 아니다. 링커가 표적 효소에 의해 결합될 수 있는 기질을 생성한다면, 그의 구조는 중요하지 않다. 한 실시태양에서, 링커는 관능기(R)와 반응기를 약 5 내지 약 1000Å (5와 1000Å도 포함) 길이로 분리시키는 이가의 기일 수 있다. 다른 적당한 링커는 R과 반응기를 약 5 내지 약 100Å으로 분리시키는 링커, 및 R과 반응기를 약 5 내지 약 50Å, 약 5 내지 약 25Å, 약 5 내지 약 500Å 또는 약 30 내지 약 100Å으로 분리시키는 링커를 포함한다.
한 실시태양에서, 링커는 아미노산이다.
다른 실시태양에서, 링커는 펩티드이다.
다른 실시태양에서, 링커는 하나 이상(예, 1, 2, 3 또는 4)의 이중 또는 삼중 결합을 포함할 수 있고 하나 이상(예, 2, 3 또는 4)의 히드록시 또는 옥소 (=O)기로 치환될 수 있는, 약 2 내지 약 30개의 탄소 원자를 포함하는 이가의 분지 또는 비분지 탄소 쇄이고, 상기 쇄 내의 탄소 원자 중 하나 이상(예, 1, 2, 3 또는 4)은 비-퍼옥시드 O-, -S- 또는 -NH-로 대체될 수 있다.
다른 실시태양에서, 링커는 화학식 -W-F-W- (여기서, F는 (Cl-C30)알킬, (C2-C30)알케닐, (C2-C30)알키닐, (C3-C8)시클로알킬 또는 (C6-C10)아릴이고, W는 -N(Q)C(=O)-, -C(=O)N(Q)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -0-, -S-, -S(O)-, -S(0)2-, -N(Q)-, -C(=O)- 또는 직접 결합이고, 각 Q는 독립적으로 H 또는 (Cl-C6)알킬임)의 이가의 기이다.
다른 실시태양에서, 링커는 하나 이상(예, 1, 2, 3 또는 4)의 이중 또는 삼중 결합을 포함할 수 있고 하나 이상(예, 2, 3 또는 4)의 히드록시 또는 옥소 (=O)기로 치환될 수 있는, 약 2 내지 약 30개의 탄소 원자를 포함하는 이가의 분지 또는 비분지 탄소 쇄이다.
다른 실시태양에서, 링커는 하나 이상(예, 1, 2, 3 또는 4)의 이중 또는 삼중 결합을 포함할 수 있는, 약 2 내지 약 30개의 탄소 원자를 포함하는 이가의 분지 또는 비분지 탄소 쇄이다.
다른 실시태양에서, 링커는 약 2 내지 약 30개의 탄소 원자를 포함하는 이가의 분지 또는 비분지 탄소 쇄이다.
다른 실시태양에서, 링커는 하나 이상(예, 1, 2, 3 또는 4)의 이중 또는 삼중 결합을 포함할 수 있고 하나 이상(예, 2, 3 또는 4)의 히드록시 또는 옥소 (=O)기로 치환될 수 있는, 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자를 포함하는 이가의 분지 또는 비분지 탄소 쇄이다.
다른 실시태양에서, 링커는 하나 이상(예, 1, 2, 3 또는 4)의 이중 또는 삼중 결합을 포함할 수 있는, 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자를 포함하는 이가의 분지 또는 비분지 탄소 쇄이다.
다른 실시태양에서, 링커는 약 2 내지 약 20개의 탄소 원자를 포함하는 이가의 분지 또는 비분지 탄소 쇄이다.
다른 실시태양에서, 링커는 -(CH2CH20)1-10-이다.
다른 실시태양에서, 링커는 -C(=O)NH(CH2)3-; -C(=O)NH(CH2)5C(=O)NH(CH2)-; -CH20C(=O)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)-; -C(=O)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)3-; -CH20C(=O)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)3-; -(CH2)4C(=O)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)3-; -C(=O)NH(CH2)5C(=O)NH(CH2)20(CH2)20(CH2)3-이다.
특히, (Cl-C30)알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, 펜틸, 3-펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 또는 데실일 수 있고, (C3-C8)시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 또는 시클로헥실일 수 있고, (C2-C30)알케닐은 비닐, 알릴, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-헥세닐, 2--헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐 또는 데세닐일 수 있고; (C2-C30)알키닐은 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 3-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 4-펜티닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐, 4-헥시닐, 5-헥시닐, 헵티닐, 옥티닐, 노니닐 또는 데시닐일 수 있고, (C6-C10)아릴은 페닐, 인데닐 또는 나프틸일 수 있다.
링커와 관련하여 사용될 경우, 용어 "아미노산"은 D 또는 L 형태의 천연 아미노산 잔기(예, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Hyl, Hyp, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val), 및 비천연 아미노산(예, 포스포세린, 포스포트레오닌, 포스포티로신, 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 히푸르산, 옥타히드로인돌-2-카르복실산, 스타틴, 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실산, 페니실아민, 오르니틴, 시트룰린, α-메틸-알라닌, 파라-벤조일페닐알라닌, 페닐글라이신, 프로파길글라이신, 사르코신 및 tert-부틸글라이신)을 포함한다. 상기 용어는 또한 통상의 아미노산 보호기(예, 아세틸 또는 벤질옥시카르보닐)를 함유하는 천연 및 비천연 아미노산, 및 카르복시 말단에서 보호된(예, (Cl-C6)알킬, 페닐 또는 벤질 에스테르 또는 아미드로서) 천연 및 비천연 아미노산을 포함한다. 다른 적당한 아미노 및 카르복시 보호기는 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, Greene, Protecting Groups In Organic Synthesis; Wiley: New York, 1981, 및 여기에 인용된 문헌 참조). 아미노산은 카르복시 말단, 아미노 말단을 통해, 또는 임의의 다른 편리한 결합점(예, 시스테인의 황)을 통해 다른 분자에 결합될 수 있다.
링커와 관련하여 사용될 경우, 용어 "펩티드"는 2 내지 25개 아미노산(예, 이전에서 정의된 바와 같은 아미노산)의 서열 또는 펩티딜 잔기를 기재한다. 상기 서열은 선형 또는 환형일 수 있다. 예를 들면, 환형 펩티드는 제조될 수 있거나, 또는 서열에서 2개의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 다리의 형성에 기인할 수 있다. 펩티드는 카르복시 말단, 아미노 말단을 통해, 또는 임의의 다른 편리한 결합점(예, 시스테인의 황)을 통해 다른 분자에 결합될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드는 3 내지 25개 또는 5 내지 21개의 아미노산을 포함한다. 펩티드 유도체는 미국 특허 제4,612,302호; 제4,853,371호 및 제4,684,620호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 본원에 구체적으로 기술된 펩티드 서열은 아미노 말단을 좌측, 카르복시 말단을 우측으로 하여 쓰여 있다.
한 실시태양에서, 링커를 갖는 데할로게나제에 대한 본 발명의 기질은 하기 화학식 (I)을 갖는다:
<화학식 I>
R-링커-A-X
여기서, R은 하나 이상의 관능기 (예를 들면, 형광발색단, 바이오틴, 루미노포어(luminophore) 또는 플루오로젠(fluorogenic) 또는 루미노젠(luminogenic) 분자 등, 또는 마이크로스피어(microsphere), 막, 유리 비드(glass bead) 등을 포함하는 고형 지지체임)이고, 여기서 링커는 C, N, S 또는 O를 포함하는 다원자 직쇄 또는 분지쇄이고, A-X는 데할로게나제의 기질이고, X는 할로겐이다. 한 실시태양에서, A-X는 데할로게나제를 위한 할로지방족 또는 할로방향족 기질이다. 한 실시태양에서, 링커는 약 12 내지 약 30개 탄소 원자를 포함하는 2가 분지쇄 또는 비분지쇄 탄소 쇄이고, 이 쇄는 하나 이상의 (예. 1, 2, 3 또는 4개) 이중 또는 삼중 결합을 임의로 포함하고, 이 쇄는 하나 이상의 (예. 2, 3 또는 4개) 히드록시 또는 옥소 (=O) 기로 임의로 치환되고, 쇄 중의 하나 이상의 (예. 1, 2, 3 또는 4개) 탄소 원자는 비-퍼옥시드 -O-, -S- 또는 -NH-로 임의로 치환된다. 한 실시태양에서, A는 CH2CH2 또는 CH2CH2CH2이다. 한 실시태양에서, 로도코커스 데할로게나제와 같은 데할로게나제를 위한 기질 중의 링커는 C, N, S 또는 O를 포함하는 다원자 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는, 관능기 R이 방향족 고리 시스템을 포함하거나 고형 지지체인 경우 11-30개 원자이다.
다른 실시태양에서, 링커를 가지는 데할로게나제를 위한 본 발명의 기질은 화학식 (II)를 갖는다:
R-링커-CH2-CH2-CH2-X (II)
식에서, X는 할로겐, 바람직하게는 클로라이드이다. 한 실시태양에서, R은 형광발색단, 바이오틴, 루미노포어 또는 플루오로젠 또는 루미노젠 분자와 같은 하나 이상의 관능기이거나 또는 마이크로스피어, 막, 유리 비드 등을 포함하는 고형 지지체이다. R이 방사성표지이거나 또는 분광학적으로 활성인 이소토프와 같은 작은 검출성 원자인 경우, 링커는 0-30개 원자일 수 있다.
V. 예시적 기질 합성
[2-(2-히드록시- 에톡시 )-에틸]- 카르밤산 안트라센-9- 일메틸 에스테르. 200 ml의 CH2Cl2 중의 9-안트라센메탄올 (10 g, 48 mmol) 및 4-니트로페닐클로로포르메이트 (13.6 g, 67.5 mmol)의 교반 슬러리에 트리에틸아민 (6.7 ml, 0.19 mol)을 첨가하였다. 생성된 금색 용액을 실온에서 16 시간 동안 교반되도록 하였다. 이 시점에서, 2-(2-아미노에톡시)에탄올 (14.4 ml, 0.144 mol)을 첨가하고 추가 24시간 동안 계속하여 교반하였다. 그 후 유기층에 p-니트로페놀이 관찰될 때까지 CH2Cl2 반응 혼합물을 2% 소듐 히드록시드 (w/w) 용액으로 세척하였다. 디클로로메탄을 소듐 설페이트로 건조시키고, 여과 및 감압 하 증발시켰다.
조 생성물을 실리카겔 60 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였으며, 점진적으로 디클로로메탄 중의 1% 내지 3% 메탄올로 용출하였다. 7.6 g (58% 수득율)의 황색 고체가 단리되었다: 1H NMR(CDCl3) δ 8.38 (s, H-10), 8.28 (d, H-1, 8), 7.94 (d, H-4, 5), 7.44 (m, H-2, 3, 6, 7), 6.06 (s, CH 2 -anth), 5.47 (t, 상호교환가능, NH), 3.53 (bs,CH 2 -OH) 3.33 (m, 3개의 -CH 2 -). 매스 스펙트럼, m/e C20H22NO4 +에 대한 계산치: 340.15. 측정치: 340.23. C20H21NNaO4 +에 대한 계산치: 340.15. 측정치: 340.23.
화학식 III 화합물
{2-[2-(6- 클로로 - 헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}- 카르밤산 안트라센-9- 일메틸 에스테르. 100 ml 둥근 바닥 플라스크를, 불활성 대기 하에서 [2-(2-히드록시-에톡시)-에틸]-카르밤산 안트라센-9-일메틸 에스테르 (1.12 g, 3mmol) 및 신선한 소듐 히드리드, 미네랄 오일 중의 60% 분산액 (360 mg, 9mmol)으로 충전하였다. 20 ml 무수 THF를 첨가하고 반응을 30분간 교반시켰다. 이어 얼음/NaCl 배쓰로 플라스크를 -10과 -20℃ 사이로 냉각시킨다. 온도가 도달되면, 1-클로로-6-요오도헥산 (1 ml, 6 mmol)을 시린지로 첨가한다. 반응 혼합물을 얼음/NaCl 온도에서 2시간 동안 유지시킨 후, 하룻밤에 걸쳐 서서히 실온으로 승온시킨다. 이 시점에서 실리카겔 60을 감압 하에서 용매를 제거한 반응 혼합물 상으로 공동-흡수시킨다. 실리카겔 크로마토그래피를 처음에는 헵탄을 용출제로 사용하고, 이어 10%, 20%, 및 25% 에틸 아세테이트로 한다. 총 0.57 g(41 % 수득율)의 생성물이 적당한 분획에서 단리된다: 1H NMR (CDCl3) δ 8.48 (s, H-10), 8.38 (d, H-1, 8), 8.01 (d, H-4, 5), 7.52 (dt, H-2, 3, 6, 7), 6.13 (s,CH 2 -anth), 5.29 (bs, 상호교환가능, NH), 3.74 (m, 4H), 3.55-3.15 (m, 8H), 1.84 (m, 4H), 1.61 (m,1H), 1.43 (m, 1H), 1.25 (m, 2H). 매스 스펙트럼, m/e C26H32ClNO4H2O 에 대한 계산치: 475.21(100%), 476.22 (29.6%). 측정치: 475.21, 476.52.
화학식 IV 화합물
2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸-암모늄 트리플루오로 -아세테이트. 4 ml 디클로로메탄 중에 용해된 {2-[2-(6-클로로-헥실옥시)-에톡시]-에틸}-카르밤산 안트라센-9-일메틸 에스테르 (0.56 g, 1.2 mmol)에 2 방울의 아니솔을 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 얼음/NaCl 배쓰에 의해 냉각시킨다. 10분 후에 트리플루오로아세트산 (2 ml)를 첨가한다. 첨가에 의해 이 반응 혼합물이 어두운 갈색으로 변하고 30분간 교반시킨다. 감압 대기 하에 모든 휘발성 물질을 제거한다. 잔류물을 CH2Cl2 중에 다시 용해시키고 물로 2회 세척한다. 수성 분획을 동결시키고 밤새 동결건조시킨다. 오일성 잔류물이 남으며 이를 무수 DMF 중에 녹여 추가 반응에서 스톡 용액으로서 사용한다. 매스 스펙트럼, m/e C10H23ClN02 +에 대한 계산치: 224.14(100%), 226.14 (32%). 측정치: 224.2, 226.2.
화학식 V 화합물
2-[2-(6- 클로로 - 헥실옥시 )- 에톡시 ]- 에틸아민에의 리포터 기 컨쥬게이션을 위한 일반적 방법론. DMF 중의 리포터 기의 숙신이미딜 에스테르 1 당량에 3 당량의 2-[2-(6-클로로헥실옥시)에톡시]-에틸-암모늄 트리플루오로-아세테이트 스톡 용액을 첨가한 후 이어 디이소프로필에틸아민을 첨가한다. 반응을 실온에서 8 내지 16 시간 동안 교반한다. 제조용 스케일 HPLC 또는 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제를 완성한다.
N-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}- 플루오로세인 -5-아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 매스 스펙트럼, m/e C31H31ClNO8 -에 대한 계산치: 580.17(100%), 581.18(32%). 측정치: 580.18, 581.31.
화학식 VI 화합물
N-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}- 바이오틴 -아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 2% 내지 5% 메탄올)를 사용하여 정제를 완성하였다. 매스 스펙트럼, m/e C20H37ClN3O4S+에 대한 계산치: 450.22(100%), 452.22(32%). 측정치: 449.95, 451.89.
화학식 VII 화합물
N-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}- 테트라메틸로다민 -5-(및 -6)-아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 구조 이성체의 분리를 실현하였다. 매스 스펙트럼, m/e C35H43ClN3O6 +에 대한 계산치: 636.28(100%), 637.29(39.8%), 638.28(32.4%). 측정치: 636.14, 637.15, 638.14.
화학식 VIII 화합물 화학식 IX 화합물
N-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}- 로다민 R110 -5-(및 -6)-아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 구조 이성체의 분리를 실현하였다. 매스 스펙트럼, m/e C31H35ClN3O6 +에 대한 계산치: 580.2 (100%), 581.2 (35.6%), 582.2 (32.4%). 측정치: 580.4, 581.4, 582.2.
화학식 X 화합물 화학식 XI 화합물
6-({4-[4, 4디플루오로 -5-(티오펜-2-일)-4-보라-3a-4a- 디아자 -s- 인다센 -3-일]페녹시}-아세틸아미노)-헥산산 {2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}-아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 3% 내지 5% 메탄올)를 사용하여 정제를 완성하였다. 매스 스펙트럼, m/e C37H47BClF2N4O5S+에 대한 계산치: 743.3(100%). 측정치: 743.4.
화학식 XII 화합물
6-({4-[4, 4디플루오로 -5-(티오펜-2-일)-4-보라-3a-4a- 디아자 -s- 인다센 -3-일]스티릴옥시}-아세틸아미노)-헥산산 {2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}-아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (디클로로메탄 중 3% 메탄올)를 사용하여 정제를 완성하였다. 매스 스펙트럼, m/e C39H48BClF2N4NaO5S+에 대한 계산치: 791.3 (100%). 측정치: 7.91.3.
화학식 XIII 화합물
트리에틸암모늄 3-[5-[2-(4-tert-부틸-7-디에틸아미노-크로멘-2-일리덴)-에 틸리덴 ]-3-(5-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]- 에틸카바모일 }- 펜틸 )-2,4,6- 트리옥소 -테르라히드로-피리미딘-1-일]-프로판-1-술폰산 음이온. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 매스 스펙트럼, m/e C42H62ClN4O10S-에 대한 계산치: 849.4 (100%), 850.4 (48.8%), 851.4 (36.4%). 측정치: 849.6, 850.5, 851.5.
화학식 XIV 화합물
2- tert -부틸-4-{3-[1-(5-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]- 에틸카바모일 }- 펜틸 )-3,3-디메틸-5- 술포 -1,3- 디히드로 -인돌-2- 일리덴 ]- 프로페닐 }-7- 디에틸아미노 -크로메닐륨 클로라이드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 매스 스펙트럼, m/e C46H67ClN3O7S-에 대한 계산치: 840.4 (100%), 841.4 (54.4%). 측정치: 840.5, 841.5.
화학식 XV 화합물
N-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}-3-{4-[5-(4-디메틸아미노- 페닐 )옥사졸-2-일]-벤젠술포닐아미노}-프로피온아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 매스 스펙트럼, m/e C30H40ClN4O6S-에 대한 계산치: 619.2 (100%), 620.2 (35%). 측정치: 619.5, 620.7.
화학식 XVI 화합물
N-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}-9'- 클로로세미나프토플루오레세인 -5-(및 -6)-아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 구조 이성체 분리를 실현하였다. 매스 스펙트럼, m/e C35H34Cl2NO8 +에 대한 계산치: 666.17 (100%), 668.16 (64%), 667.17 (39.8%). 측정치: 666.46, 668.44, 667.51.
화학식 XVII 화합물 화학식 XVIII 화합물
N-{2-[2-(6- 클로로헥실옥시 )- 에톡시 ]-에틸}- 세미나프토디메틸로다민 -5-(및-6)-아미드. 상기 방법론을 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 매스 스펙트럼, m/e C37H38ClN2O7 -에 대한 계산치: 657.24 (100%), 658.24 (42%), 659.23 (32%). 측정치: 657.46, 658.47, 659.45.
화학식 XIX 화합물 화학식 XX 화합물
6-(3',6'- 디피발로일플루오레세인 -5-(및 -6)- 카르복스아미도 ) 헥산산 {2-[2-(6-클로로헥실옥시)-에톡시]-에틸}-아미드. 6-(3',6'-디피발로일플루오레세인-5-(및 -6)-카르복스아미도)헥산산 숙신이미딜 에스테르 (0.195g, 0.26 mmol)을 함유하고 있는 100ml 둥근 바닥 플라스크에, 25 ml Et2O 중의 2-[2-(6-클로로헥실옥시)-에톡시]-에틸아민 (~0.44 mmol)를 첨가한 후 이어 2 ml의 피리딘을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 감압 하에서 증발 후, 잔류물을 실리카 겔 60 컬럼 크로마토그래피에 적용하고 용출제로서 디클로로메탄 중의 2% 내지 5% 메탄올을 점진적으로 사용하였다. 적당한 분획을 수집하여 진공 하 건조시켰다 (0.186 g, 0.216 mmol, 및 84% 수득율). 매스 스펙트럼, m/e C47H60ClN2O11 +에 대한 계산치: 863.39 (100%), 864.39 (54.4%), 865.39 (34.6%). 측정치: 862.94, 864.07, 864.94.
화학식 XXI 화합물 화학식 XXII 화합물
6-( 플루오레세인 -5-(및 -6)- 카르복스아미도 ) 헥산산 {2-[2-(6-클로로헥실옥시)-에톡시]-에틸}-아미드. 6-(3',6'-디피발로일플루오레세인-5-(및-6)-카르복스아미도)헥산산{2-[2-(6-클로로헥실옥시)-에톡시]-에틸}-아미드 (0.186 g, 0.216 mmol)를 5 ml 메탄올에 용해시키고 0.5 ml 2M 소듐 카보네이트(aq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 16시간 동안 교반한 후 여과하였다. 제조용 스케일 HPLC를 사용하여 정제를 완성하였다. 구조 이성체의 분리를 실현하였다. 매스 스펙트럼, m/e C37H44ClN209 +에 대한 계산치 : 695.27 (100.0%), 696.28 (42.2%), 697.27 (32.3%). 측정치:
화학식 XXIII 화합물 화학식 XXIV 화합물
{2-[2-(4- 클로로부톡시 )- 에톡시 ]-에틸}- 카르밤산 안트라센-9- 일메틸 에스테르. 불활성 대기 하에서 50 ml 둥근 바닥 플라스크를 [2-(2-히드록시에톡시)에틸]-카르밤산 안트라센-9-일메틸 에스테르 (0.25 g, 0.74 mmol) 및 신선한 소듐 히드리드, 미네랄 오일 중의 60% 분산액 (150 mg, 3.75 mmol)으로 충전하였다. 10 ml 무수 THF를 첨가하고 반응을 5분 동안 교반하였다. 이 시점 후, 1-클로로-4-요오도부탄 (180μl, 1.5 mmol)을 시린지로 첨가한다. 반응을 실온에서 24 시간 동안 교반한다. 감압 하에서 용매를 제거한 반응 혼합물에 실리카겔 60을 공동 흡수시킨다. 초기에는 헵탄을 용출제로 사용하고, 이어 10%, 20%, 및 30% 에틸 아세테이트로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행한다. 총 0.1 g (32% 수득율)의 생성물을 적당한 분획으로부터 단리한다: 1H NMR (CDCl3) δ 8.50 (s, H-10), 8.40 (d, H-1, 8), 8.03 (d, H-4,5), 7.53 (dt, H-2, 3, 6, 7), 6.15 (s, CH 2 -anth), 5.19 (m, 상호교환가능, NH), 3.93-3.32 (m, 12H), 1.69-1.25 (m, 4H). 매스 스펙트럼, m/e C24H28ClN04H20에 대한 계산치: 447.18 (100.0%), 448.18 (27.1%). 측정치: 447.17, 448.41.
화학식 XXV 화합물
2-(2-{2-[2-(2- 클로로에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }-에틸)- 이소인돌 -1,3- 디온 . 2-(2-{2-[2-(2-히드록시-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에틸)-이소인돌-1,3-디온 (0.5 g, 1.55 mmol)을 문헌[Nielsen, J. and Janda, K.D. (Methods: A Companion to Methods in Enzymology 6, 361-371 (1994)]의 방법에 의해 제조하였다. 상기 시약에 폴리스티렌-지지된 트리페닐포스핀 약 3 mmol P/g (0.67 g, 2 mmol) 및 6 ml 카본 테트라클로리드를 환류 컨덴서가 장치된 25 ml 둥근 바닥에 첨가하였다. 반응 설정을 아르곤으로 살포하고, 이어서 2 시간 동안 가열하여 환류시켰다. 냉각하면서, 추가 폴리스티렌-지지된 트리페닐포스핀 (0.1 g, 0.3 mmol)을 첨가하고, 반응을 추가 1 시간 동안 환류시켰다. 냉각된 용액을 여과하고, 수지를 추가 카본 테트라클로라이드로 세척하였다. 용매를 증발시켜 0.4 g (75.5% 수득율)의 순수한 표제 화합물을 얻었다. 1H NMR(CDCl3) δ 7.82 (dd, 2 H), 7.69 (dd, 2H), 3.88 (t, 2H), 3.71 (q, 4H), 3.63-3.56 (m, 12H). 매스 스펙트럼, m/e C16H21ClN05 +에 대한 계산치: 342.11 (100.0%), 344.11 (32.0%). 측정치: 341.65, 343.64.
화학식 XXVI 화합물
2-[2-(2-{2-(2- 클로로에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }- 에톡시 )-에틸]- 이소인돌 -1,3-디온. 표제 화합물을 선행 실시예에 따라서 89%의 수율로 제조하였다. 1H NMR(CDCl3) δ 7.77 (dd, 2H), δ 7.64 (dd, 2H), 3.83 (t, 2H), 3.67 (m, 4H), 3.60-3.52 (m, 14H). 매스 스펙트럼, m/e C18H25ClN06 +에 대한 계산치: 386.14 (100.0%), 388.13 (32.0%). 측정치: 385.88, 387.83.
화학식 XXVII 화합물
2-{2-[2-(2-{2-[2-(2- 클로로에톡시 )- 에톡시 ]- 에톡시 }- 에톡시 )- 에톡시 ]-에틸}-이소인돌-1,3-디온. 표제 화합물을 2-(2-{2-[2-(2-클로로-에톡시)-에톡시]-에톡시}-에틸)-이소인돌-1,3-디온의 합성에 따라서 92%의 수득율로 제조하였다. 1H NMR(CDCl3) δ 7.84 (dd, 2H), 7.71 (dd, 2H), 3.90 (t, 2H), 3.74 (q, 4H), 3.67-3.58 (m, 18H). 매스 스펙트럼, m/e C20H29ClN07 +에 대한 계산치: 430.16 (100.0%). 측정치: 429.85
화학식 XXVIII 화합물
VI. 예시적 사용 방법
본 발명은 세포에서 분자의 발현, 위치 및(또는) 트래피킹(trafficking)을 모니터링하고, 세포 내에서의 미세 환경의 변화를 모니터링하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제, 및 관능기를 포함하는 상응하는 기질을 이용하여 세포(예를 들면, 유기체 또는 세포 배양물 중의 세포) 또는 세포 성분을 표지한다. 예를 들면, 세포는 돌연변이 하이드롤라제 및 핵 위치지정 신호 간 융합체를 코딩하는 것과 같은 돌연변이 하이드롤라제를 코딩하는 벡터와 접촉된다. 세포에서의 벡터의 발현은 일시적 또는 안정적일 수 있다. 이어서, 세포는 돌연변이 하이드롤라제에 의해 인식되는 본 발명의 기질과 접촉된다. 별법으로, 세포는 벡터 및 기질과 동시에 접촉된다. 이어서, 세포, 이의 용해물 또는 이의 아세포 분획 중 기질의 관능기의 존재 또는 위치가 검출 또는 결정된다.
본 발명의 기질은 바람직하게는 수성 또는 주로 수성 용액(물 및 약 6 이상의 pH를 갖는 수성 용액을 포함함)에 가용성이다. 그러나, 본 발명의 기질의 스톡 용액은 수성 용액 또는 완충제로 희석되기 전에 유기 용매 중에 용해될 수 있다. 바람직한 유기 용매는 비양자성 극성 용매, 예를 들면 DMSO, DMF, N-메틸피롤리돈, 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 테트라히드로푸란 및 다른 비히드록실, 완전 수혼화성 용매이다. 일반적으로, 이용되는 본 발명의 기질의 양은 합당한 시간 내에 최소 배경 또는 바람직하지 않은 표지로 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플 중 관능기의 존재를 검출하는데 필요한 최소량이다. 이용될 본 발명의 기질 및 상응하는 돌연변이 하이드롤라제의 정확한 농도는 실험 조건 및 요망되는 결과에 의존한다. 본 발명의 기질의 농도는 통상적으로 나노몰 내지 마이크로몰 범위이다. 상응하는 돌연변이 하이드롤라제와 본 발명의 기질에 대해 필요한 농도는 만족스러운 표지가 달성될 때까지 기질의 체계적 변이에 의해 결정된다. 출발 범위는 당업계에 공지된 방법에 의해 용이하게 결정된다.
한 실시태양에서, 광학 성질을 갖는 관능기를 포함하는 기질이 돌연변이 하이드롤라제와 함께 이용되어 샘플을 표지한다. 이러한 기질은 돌연변이 하이드롤라제가 기질에 결합하기 충분한 시간 동안 돌연변이 하이드롤라제를 포함하는 목적하는 샘플과 연합되고, 이 후 샘플은 관능기의 광학 반응을 유발하도록 선택된 파장에서 조사(illumination)한다. 임의로, 샘플을 세척하여 잔류, 과량 또는 비결합 기질을 제거한다. 한 실시태양에서, 표지를 이용하여 광학 반응을 표준 또는 예상 반응과 더 비교하는 것에 의해 샘플의 구체화된 특성을 결정한다. 예를 들면, 돌연변이 하이드롤라제 결합 기질을 이용하여 이들의 샘플 중에서의 공간적 및 시간적 분포에 관하여 샘플의 구체적 성분을 모니터링한다. 별법으로, 돌연변이 하이드롤라제 결합 기질을 이용하여 소정 분자의 존재 또는 양을 결정 또는 검출한다. 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제 결합 기질을 이용하여 관능기에 특이적으로 반응하는 분자의 존재에 대하여 샘플을 분석한다.
검출성 광학 반응은 직접 관찰에 의해서 또는 기계적으로 감지가능한 시험 시스템 중 파라미터의 변화 또는 발생을 의미한다. 상기 검출성 반응은 색상, 형광, 반사율, 화학발광, 광 편광, 광 산란 또는 x-선 산란의 변화 또는 출현을 포함한다. 통상적으로, 검출성 반응은 형광의 변화, 예를 들면 강도, 형광의 여기 또는 방사 파장 분포, 형광 수명, 형광 편광 또는 이의 조합의 변화이다. 검출성 광학 반응은 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플에 걸쳐서, 또는 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플의 국소 부분에서 발생할 수 있다. 표준 또는 예상 반응과의 광학 반응의 정도의 비교를 이용하여 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플이 주어진 특성을 가지는지 여부 및 어느 정도로 가지는지를 결정할 수 있다.
다른 실시태양에서, 관능기는 수용자 분자에 대한 리간드이다. 통상적으로, 기질이 특이적 결합쌍의 일원인 관능기 (리간드)를 포함하는 경우, 상보적 일원 (수용자)은 중합체, 중합체 막 또는 중합체 입자(예: 중합체 비드)와 같은 고체 또는 반고체 표면 상에 고정화된다. 대표적인 특이적 결합쌍은 바이오틴 및 아비딘 (또는 스트렙타비딘 또는 항-바이오틴), IgG 및 단백질 A 또는 단백질 G, 약물 또는 약물 수용체, 독소 및 독소 수용체, 탄수화물 및 렉틴 또는 탄수화물 수용체, 펩티드 및 펩티드 수용체, 단백질 및 단백질 수용체, 효소 기질 및 효소, 센스 DNA 또는 RNA 및 안티센스 (상보적) DNA 또는 RNA, 호르몬 및 호르몬 수용체, 및 이온 및 킬레이터를 포함한다. 천연 발생 수용체가 존재하는 리간드는 아비딘 및 스트렙타비딘, 항체, 효소 및 호르몬을 포함하는 천연 및 합성 단백질; RNA 및 단일 및 이중 나선 DNA에 대한 프라이머를 포함하는 뉴클레오티드 및 천연 또는 합성 올리고뉴클레오티드; 지질; 폴리사카라이드 및 탄수화물; 및 치료 약물 및 남용 약물 및 살충제를 포함하는 다양한 약물을 포함한다. 관능기가 칼슘, 나트륨, 마그네슘, 칼륨 또는 다른 생물학적으로 중요한 금속 이온의 킬레이트인 경우, 상기와 같은 관능기를 포함하는 기질은 이온의 지표로서 작용한다. 별법으로, 상기 기질은 pH 지표로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 이온 지표의 검출성 광학 반응은 형광의 변화이다.
돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플은 통상적으로 수동적 수단에 의해서, 즉 기질과의 인큐베이션에 의해서 표지된다. 그러나, 기질을 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플로 도입하는 임의의 방법, 예를 들면, 기질의 세포 또는 유기체로의 미세주사를 이용하여 기질을 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플로 도입할 수 있다. 본 발명의 기질은 사용 농도 내에서 생존 세포 및 다른 생물학적 성분에 일반적으로 비독성이다.
돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플은 본 발명의 기질과 접촉시킨 직후 관찰될 수 있다. 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플은 임의로 세척 용액, 투과 및(또는) 고정 용액 및 다른 추가 검출 시약을 함유하는 용액을 비롯하여 다른 용액과 표지 도중에 병합된다. 기질과의 접촉 후 세척은 일반적으로 세척 후 비특이적 배경의 감소로 인하여 광학 반응의 검출을 향상시킨다. 만족스러운 시각화가 더 낮은 표지 농도를 사용하는 것에 의하여 세척 없이 가능하다. 다수의 고정제 및 고정 조건은 당업계에 공지되어 있으며, 포름알데히드, 파라포름알데히드, 포르말린, 글루타르알데히드, 냉 메탄올 및 3:1 메탄올:아세트산을 포함한다. 고정은 통상적으로 세포 형태를 보존하고, 병원성 샘플을 이용하여 작업하는 경우 생물학적 위험을 감소시키기 위하여 이용된다. 기질의 선택된 양태는 세포 내에서 잘 유지된다. 고정은 당업계에 공지된 방법에 따라서 임의로 아세톤, 에탄올, DMSO 또는 다양한 세정제를 이용하는 등의 투과성화가 따라오거나 수반되어 본 발명의 큰 기질이 세포 막을 가로지르는 것을 가능하게 한다. 임의로, 기질의 사용은 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플 중에서 특이적 세포 성분, 세포내 기질 또는 세포 조건의 존재로 인하여 검출성 반응을 생성하는 추가 검출 시약의 사용을 겸비할 수 있다. 추가 검출 시약이 기질과 상이한 스펙트럼 성질을 가지는 경우, 다색 응용이 가능하다.
광학적 성질을 갖는 관능기를 포함하는 기질과 접촉한 후 또는 도중 임의의 시점에, 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플은 검출성 광학적 반응을 일으키는 파장의 빛으로 조사(illuminate)되고, 광학적 반응을 검출하기 위한 수단으로 관찰된다. 일부 기질은 대기 광을 이용하여 비색 검출가능하지만, 다른 기질은 모 형광발색단의 형광 성질에 의해 검출된다. 자외선 또는 가시 파장 방출 램플, 아크(arc) 램프, 레이저 또는 나아가 태양광 또는 통상적 실내 광 등에 의한 조사에 의해서, 상보적 특이 결합 쌍 일원에 결합된 기질을 비롯한 기질은 강한 가시 흡수 및 형광 방출을 나타낸다. 본 발명의 기질을 조사하기 유용한 선택된 장치는 휴대용 자외선 램프, 수은 아크 램프, 크세논 램프, 아르곤 레이저, 레이저 다이오드 및 YAG 레이저를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 조사원은 임의로 레이저 스캐너, 형광 마이크로플레이트 판독기, 표준 또는 미니 형광측정기 또는 크로마토그래픽 검출기에 통합된다. 상기 비색 흡광도 또는 형광 방출은 임의로 시각적 검사에 의해서, 또는 CCD 카메라, 비디오 카메라, 사진 필름, 레이저 스캐닝 장치, 형광측정기, 광다이오드, 양자 카운터, 에피플루오레센스 현미경, 스캐닝 현미경, 유세포 분석기, 형광 마이크로플레이트 판독기의 장치 중 임의의 것을 사용하는 것에 의해서, 또는 광증폭 튜브와 같은 신호를 증폭하는 수단에 의해서 검출된다. 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플을 유세포 분석기, 형광 현미경 또는 형광측정기를 이용하여 검사하는 경우, 장비는 임의로 제2 형광발색단의 것으로부터 기질의 형광 반응을 구별하는 것에 의하여 검출가능하게 상이한 광학 성질을 갖는 제2 형광발색단과 형광발색단인 관능기를 포함하는 기질 간을 구별 및 식별을 위하여 이용된다. 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플을 유세포 분석기를 이용하여 검사하는 경우, 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플의 검사는 임의로 분류 장치를 이용하는 것에 의한 기질의 형광 반응에 기초하여 돌연변이 하이드롤라제 또는 이의 융합체를 포함하는 샘플 내의 입자의 단리를 포함한다.
한 실시태양에서, 세포내 이동이 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제의 융합체를 이용하여 모니터링될 수 잇다. 예를 들면, 베타-어레스틴은 활성화되는 경우 세포질로부터 세포 막으로 이동하는, G-단백질 커플링된 수용체의 조절자이다. 돌연변이 하이드롤라제 및 베타-어레스틴의 융합체를 함유하는 세포 및 본 발명의 기질은 활성화된 G-단백질 커플링된 수용체와 연합되는 경우 세포질로부터 세포 막으로의 베타-어레스틴의 이동을 검출가능하게 한다.
다른 실시태양에서, FRET가 돌연변이 하이드롤라제 및 형광 단백질(예: GFP)의 융합체, 또는 형광 분자에 결합하는 단백질(예: O-알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제 (AGT))과의 융합체와 함께 이용될 수 있다(Keppler et al., 2003). 별법으로, 돌연변이 하이드롤라제와 목적 단백질의 융합체, 및 형광 단백질과 목적 단백질과 상호작용하는 것으로 추정되는 분자의 제2 융합체를 이용하여, 예를 들면 FRET를 이용하여 목적 단백질과 분자의 상호작용을 연구할 수 있다. 한 세포는 돌연변이 하이드롤라제 및 목적하는 단백질의 융합체를 함유하는 한편, 다른 세포는 형광 단백질 및 목적 단백질과 상호작용하는 것으로 추정되는 분자의 제2 융합체를 함유할 수 있다. 상기 2개 세포를 갖는 집락을 기질 및 약제(예: 약물)과 접촉시킬 수 있고, 이 후 세포를 모니터링하여 2개 집락에 대한 투여 약제의 효과를 검출할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 형광 단백질에 융합된다. 따라서, 형광 단백질을 검출하는 것에 의해서, 또는 세포를 본 발명의 기질과 접촉시키고 기질 중의 관능기를 검출하는 것에 의해서 융합 단백질이 세포 중에서 검출될 수 있다. 형광 단백질의 검출은 관능기의 검출 전 수행될 수 있다. 별법으로, 관능기의 검출은 형광 단백질의 검출 전 수행될 수 있다. 나아가, 이들 세포는 추가 기질, 예를 들면 상이한 관능기를 갖는 것, 및 관능기가 제1 기질과 이미 결합되지 않은 돌연변이 하이드롤라제에 공유 결합된 것인 검출된 세포 중의 상이한 관능기와 접촉될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제 및 전사 인자의 융합체를 이용하여 전사 활성화 경로의 활성화를 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 불활성 형태에서 세포질에 존재하나, 활성화에 의해 핵으로 위치이동하는 전사 인자(예: NF 카파 베타)에 대한 돌연변이 하이드롤라제의 융합체는 전사 활성화 경로를 모니터링할 수 있다.
다른 실시태양에서, 바이오틴은 기질 중 관능기로 이용되고, 융합체는 세포 중 다른 분자(예: 단백질)과 상호작용하는 것으로 추정되는 목적 단백질에 융합된 돌연변이 하이드롤라제를 포함한다. 상기 시약의 사용은 세포 중에서 돌연변이 하이드롤라제에 융합된 단백질과 상호작용하는 다른 분자의 포획을 가능하게 하고, 이에 의해 상호작용 분자(들)을 동정 및(또는) 포획 (단리)한다.
한 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 분비되는 단백질에 융합된다. 상기 융합체 및 본 발명의 기질을 이용하여, 분비된 단백질을 검출 및(또는) 모니터링할 수 있다. 유사하게, 돌연변이 하이드롤라제가 기질의 존재하에서 상이한 소포 구획 간에 이동되는 막 단백질에 융합되는 경우, 이들 구획 내에서의 단백질 가공을 검출할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제가 이온 채널 또는 전달 단백질, 또는 채널 또는 전달 단백질과 밀접히 연관된 단백질에 융합되는 경우, 세포 또는 유기체 막을 통한 이온의 이동을 이온 민감성 형광발색단을 함유하는 본 발명의 기질의 존재하에서 모니터링할 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이 하이드롤라제가 낭 또는 세포골격과 연합되는 경우, 기질의 존재하에서, 세포골격을 따른 단백질 또는 낭의 전달이 용이하게 검출될 수 있다.
다른 실시태양에서, 관능기는 약물 또는 독소이다. 이러한 관능기를 갖는 기질을 돌연변이 하이드롤라제 및 항체(예를 들면, 특이적 종양 세포에 연합하는 항원에 결합하는 것)와 같은 표적 분자의 융합체를 병합하여, 약물 또는 독소를 세포내 또는 동물 내에서 표적화할 수 있다. 별법으로, 관능기는 형광발색단일 수 있고, 기질에 존재하고 돌연변이 하이드롤라제 및 단일쇄 항체와 같은 표적화 분자의 융합체와 병합되는 경우, 표적화 분자는 표지될 수 있다(예를 들면, ELISA와 같은 시험관내 적용을 위한 표지된 항체).
또 다른 실시태양에서, 세포 표면 상에 발현된 단백질에 융합된 경우, 세포 표면 상의 돌연변이 하이드롤라제는 본 발명의 기질(에를 들면, 형광발색단을 함유하는 것)과 병합되는 경우 생체내 또는 시험관내 세포 이주(예: 암 세포 이주)를 모니터링하기 위하여 이용될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 기질은 세포 막에 대하여 투과성이 없거나 낮은 것이다. 별법으로, 이러한 시스템을 이용하여 상이한 시약(예를 들면, 약물)의 상이한 세포 풀에 대한 효과를 모니터링할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 돌연변이 하이드롤라제는 HERG 채널에 융합된다. K+-민감성 형광발색단을 함유하는 본 발명의 기질의 존재하에서, 상기 융합체를 발현하는 세포를 이용하여 약물-독성을 모니터링하는 등의 HERG 채널의 활성을 모니터링할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 기질은 세포 또는 유기체 중 소수성 영역을 모니터링하기 유용한 관능기(예: 나일 레드)를 포함한다.
따라서, 본 발명의 돌연변이 하이드롤라제 및 기질은 다양한 분석, 예를 들면 파지 디스플레이, 패닝(panning), ELISA, 웨스턴 블롯, 형광측정 마이크로볼륨 분석 기술(FMAT) 및 세포 및 아세포 염색에 유용하다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 추가로 기술될 것이다.
실시예 I
일반적 방법
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 분자 생물학 및 세포 신호전달 및 모델링 분야의 당업자들에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 하기에 기술되는 바와 같은 분광법의 실험실적 과정, 약물 발견, 세포 배양, 분자 유전학, 플라스틱 제조, 중합체 화학, 진단, 아미노산 및 핵산 화학 및 알칸 화학은 당업계에 공지되어 있고 통상적으로 이용되는 것이다. 표준 기술이 통상적으로 플라스틱, 신호 검출, 재조합 핵산법, 폴리뉴클레오티드 합성 및 미생물 배양 및 형질전환(예: 전기천공, 리포펙션)에 사용된다.
기술 및 방법은 일반적으로 당업계의 통상적인 방법 및 다양한 일반적 문헌(일반적으로 형광 기술에 대하여 본원에 참고문헌으로 삽입된 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 및 [Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983)]을 참조) 및 본원에 걸쳐서 제공되는 방법 및 문헌에 따라서 수행된다. 표준 기술이 화학 합성, 화학 분석 및 생물학적 분석에 사용된다.
재료
모든 올리고뉴클레오티드는 프로메가 코포레이션(Promega Corporation: 미국 위스콘신주 메디슨 소재) 또는 유니버시티 오브 아이오와 DNA 퍼실러티(University of Iowa DNA Facility; 미국 아이오와주 아이오와시 소재)이 합성, 정제 및 서열분석하였다. 제한 효소 및 DNA 변형 효소는 프로메가 코포레이션(미국 위스콘신주 메디슨 소재), 뉴 잉글랜드 바이오랩스 인크(New England Biolabs, Inc; 미국 메사추세츠주 베벌리 소재) 또는 스트라타진 클로닝 시스템스(Stratagene Cloning Systems; 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)로부터 입수하였고, 제조자의 프로토콜에 따라서 사용하였다. 적격 이. 콜라이 JM109는 프로메가 코포레이션에 의해 제공되거나 또는 스트라타진 클로닝 시스템스로부터 구입하였다. 소규모 플라스미드 DNA 단리는 퀴아겐 플라스미드 미니 키트(Qiagen Plasmid Mini Kit; 미국 캘리포니아주 채스워스 소재 퀴아겐 인크)를 이용하여 수행하였다. DNA 결찰은 스트라타진 클로닝 시스템스로부터 구입한 미리 시험한 시약 키트로 수행하였다. DNA 단편은 퀴아겐 인크로부터 구입한 퀴아퀵 겔 익스트렉션 키트(QIAquick Gel Extraction Kits) 또는 퀴아퀵 PCR 정제 키트(QIAquick PCR purification Kits)로 정제하였다.
DhaA 돌연변이 및 이의 융합체를 생성하기 위해 사용된 벡터는 다음과 같았다: pET21 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재 인비트로겐), pRL-null (미국 위스콘신주 메디슨 소재 프로메가), pGEX-5x-3 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재 아머샴 바이오사이언시즈) 및 EGFP 및 DsRED2 (양자 모두 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재 클론테크로부터 입수).
SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 관련 완충제 및 착색제, 및 전기블롯 이동 완충제는 바이오휘태커 몰레큘라 어플리케이션즈(BioWhittaker Molecular Applications, 미국 메인주 로크랜드 소재)로부터 입수하였다. 단백질 분자량 표준품은 인비트로겐으로부터 구입하였다.
시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)가 안티 플래그(Anti Flag(등록상표)) 모노클로날 항체(안티 플래그(등록상표) M2 모노클로날 항체(마우스)(F3165)), 안티 플래그(등록상표) M2 HRP 컨쥬게이트 및 안티 플래그(등록상표) M2 FITC 컨쥬게이트(각각 A8592 및 F4049)의 출처였다. 케미콘(Chemicon; 미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재)이 모노클로날 항-레닐라 루시퍼라제 항체(MAB4410)의 출처였다. 프로메가 코포레이션이 HRP-컨쥬게이션된 염소 항-마우스 IgG 및 HRP-컨쥬게이션된 스트렙타비딘(각각, W4021 및 G714)의 출처였다.
1-Cl-부탄, 1-Cl-헥산, 1-Cl-옥탄, 1-Cl-데칸, 1-Cl-부탄올, 1-Cl-헥산올, 1-Cl-옥탄올 및 1-Cl-데칸올은 알드리치 또는 플루카(Fluka)(미국)으로부터 얻었다. 모든 염, 일염기성 포타슘 포스페이트, 이염기성 포타슘 포스페이트, 이미다졸, HEPES, 소듐 EDTA, 암모늄 술페이트 및 트리스(Tris)-비함유 염기는 피셔(Fisher; Biotech Grade)로부터 입수하였다.
글루타티온 세파로스 4FF, 글루타티온, 모노Q(MonoQ) 및 세파로스 G-25 사전패킹된 칼럼을 아머샴 바이오사이언스로부터 구입했다.
루리아-브로쓰("LB")를 프로메가 코포레이션으로부터 구입했다.
방법
PCR 반응. DNA 증폭은 프로메가 코포레이션으로부터 공급되는 표준 중합효소 연쇄 반응 완충제를 이용하여 수행하였다. 통상적으로, 50 ㎕ 반응물은 1x 농도의 제조자 공급 완충제, 1.5 mM MgCl2, 125 μM dATP, 125 μM dCTP, 125 μM dGTP, 125 μM dTTP, 0.10-1.0 μM 전방향 및 역방향 프라이머, 5U AmpliTaq(등록상표) DNA 폴리머라제 및 <1 ng 표적 DNA를 포함하였다. 달리 지시하지 않는 한, DNA의 증폭에 대한 열적 프로파일은 35 사이클의 94℃에서 0.5 분, 55℃에서 1분; 및 72℃에서 1분이었다.
DNA 서열분석. 모든 클론은 디데옥시-종결 주기-서열분석법(Sanger et al., 1977) 및 퍼킨-엘머 모델 310 DNA 서열분석기(Perkin-Elmer Model 310 DNA sequencer; 미국 캘리포니아주 포스터시 소재)를 이용한 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
SDS-PAGE. 단백질은 샘플 완충제(1% SDS, 10% 글리세롤 및 1.0 mM β-머캅토에탄올, pH 6.8; 프로메가 코포레이션) 중에 가용화하고, 5 분 동안 비등하고, SDS-PAGE (4-20% 구배 겔; 바이오휘태커 몰레큘라 어플리케이션즈) 상에 분리하였다. 겔을 웨스턴 블롯 분석을 위하여 쿠마시 블루(Coomassie Blue; 프로메가 코포레이션)로 염색하거나, 또는 각 평가된 형광발색단에 대하여 적합한 Eex/Eem에서 형광영상화기(fluoroimager; 일본 소재 히타치) 상에서 분석하였다.
웨스턴 블롯 분석. 니트로셀룰로스 막(0.2 ㎛, Scheicher & Schuell, Germany)에 대한 단백질 전기영동 전달은 25 mM 트리스 염기/188 mM 글리세린 (pH 8.3), 20% (v/v) 메탄올 중에서 2.0 시간 동안 Xcell II 블롯 모듈(인비트로겐)에서 (4℃에서) 80 mA의 일정한 전류에서 수행하였다. 막은 TBST 완충제(10 mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6, 0.05% 트윈(Tween) 20을 함유함)으로 헹구고, 실온에서 30 분 동안 또는 4℃에서 밤새 블로킹 용액(TBST 완충제 중 3% 건조 우유 또는 1% BSA) 중에서 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 50 ㎖의 TBST 완충제로 세척하고, 항-FLAG(등록상표) 모노클로날 항체 M2 (희석 1:5,000), 항-레닐라 루시퍼라제 모노클로날 항체 (희석 1:5,000) 또는 HRP-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 (희석 1:10,000)으로 45 분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 막을 TBST 완충제 (50 ㎖, 5 분, 3회)로 세척하였다. 항체로 프로빙한 막을 HRP-컨쥬게이션된 당나귀 항-마우스 IgG (30 분, 실온)에서 인큐베이션하고, 이어서 세척 과정을 반복하였다. 단백질을 제조자의 지시에 따라서 증강 화학발광(enhanced chemiluminescence; ECL) 시스템(파마시아-아머샴)에 의해 가시화하였다. 단백질 수준을 컴퓨터 보조 밀도분석을 이용하여 정량화하였다.
단백질 농도. 단백질을 표준으로 소 혈청 알부민(BSA)를 이용하여 피어스 BCA 프로틴 분석(Pierce, Rockford, IL)의 마이크로티터 프로토콜에 의해 결정하였다.
통계적 분석. 데이타를 유사한 결과를 갖는 적어도 3개의 독립적 실험의 대표로 4회 수행한 실험으로부터의 평균 +/- S.E.M. 값으로 표현하였다. 통계적 유의성을 스튜던트 t 시험(student's t test)에 의해 평가하고, p<0.05일 때 유의한 것으로 고려하였다.
박테리아 세포. 로도코커스 로도크로우스와 함께 pET-3a를 함유하는 Dh5α 세포의 초기 스톡은 클리포드 제이. 운케퍼(Clifford J. Unkefer) 박사(Los Alamos National laboratory, Los Alamos, NM)가 기꺼이 제공하여 주었다 (Schindler et al., 1999; Newman et al., 1999). 박테리아를 프로메가 코포레이션에 의해 제공된 미리혼합된 시약을 이용하여 LB 중에서 배양하였다. 이. 콜라이 BL21 (λDE3) pET3 (-80℃, 10% 글리세롤 중에서 저장)의 냉동 스톡을 사용하여 암피실린 (50 ㎍/㎖) 보충된 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 아가 플레이트를 접종하였다 (Sambrook et al., 1989). 단일 집락을 선택하고, 이를 사용하여 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 루리아-베르타니 매질의 2개의 10 ㎖ 배양물을 접종하였다. 세포를 8 시간 동안 37℃에서 진탕 (220 rpm)하면서 배양하고, 이 후 2 ㎖을 이용하여 각각 2개의 50 ㎖의 50 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 루리아-베르타니 매질을 접종하였으며, 이를 밤새 37℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 10 ㎖의 상기 배양물을 사용하여 각각 2개의 0.5 L 암피실린을 갖는 루리아-베르타니 매질을 접종하였다. 배양물의 A600이 0.6에 도달하였을 때, 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.5 mM의 최종 농도로 첨가하고, 배양물을 추가 4 시간 동안 30℃에서 진탕하면서 유지하였다. 이어서, 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 10 mM 트리스-SO4, 1 mM EDTA, pH 7.5로 세척하였다. 세포 펠렛을 세포 용해 전에 -70℃에서 저장하였다.
포유동물 세포. CHO-K1 세포(ATCC-CCL61)을 95% 공기 및 5% CO2의 대기 중에서 37℃에서 햄즈 F12 영양물(Ham's F12 nutrients), 및 10% 우태아 혈청 (FBS), 100 U/㎖ 페니실린 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신으로 보충한 둘베코 개질된 최소 필수 배지(Dulbecco's modified minimal essential medium)의 1:1 혼합물 중에서 배양하였다.
토끼 해마(E18)의 일차 신경을 하기 기술된 바와 같이 단리하였다. 간략하게는, 브류어 박사(Dr. Brewer, 서던 일리노이 유니버시티)로부터 입수한 히베르네이트(Hibernate; 상품명) E 배지 (GIBCO, 미국 캘리포니아주 칼스버드 소재 인비트로겐) 중의 배아 (E18) 토끼 해마의 단편을 분리하고, 폴리-D-리신 코팅된 (0.28 mg/㎠; Sigma) 유리/플라스틱-웨어 상에 플레이팅하고, B27 보충물를 갖는 무혈청 Neurobasal(상품명) 배지 (NB27, GIBCO)중에서 배양하였다. 모든 배지는 매 2-3일마다 교환하였다.
트랜스펙션. 상이한 단백질의 일시적 발현을 연구하기 위하여, 세포를 35 mm 배양 접시 또는 24 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 약 80-90%의 컨플루언시에서, 세포를 제조자(GIBCO)의 지시에 따라서 리포펙타민/DNA/항생제가 없는 배지의 혼합물에 노출하였다. 다음 날, 배지를 신선한 배지로 교체하고, 세포를 다양한 기간 동안 성장시켰다.
형광. 96 웰 플레이트 중의 세포에서의 형광을 형광 플레이트 판독기 CytoFluorII (Beckman) 상에서 특정 형광발색단에 대하여 적합한 Eex/Eem에서 결정하였다(예를 들면, TAMRA에 대한 Eex/Eem은 540/575 nm).
실시예 II
DhaA 기재 테더링 시스템
A. 야생형 및 돌연변이 DhaA 단백질 및 이의 융합체
로도코커스 로도크로우스로부터의 할로-알칸 데하이드로게나제는 DhaA 유전자의 생성물 (MW 약 33 kDa)이다. 상기 효소는 지방족 및 방향족 할로겐화 화합물(예를 들면, 할로C3-할로C10)의 탄소-할로겐 결합을 절단한다. DhaA의 촉매 센터는 통상적으로 친핵체, 산 및 히스티딘 잔기를 포함하는 "촉매 트리아드"이다. 기질은 DhaA에 결합하여 E·S 복합체를 형성하고, 이 후 Asp106에 의한 친핵적 공격은 에스테르 중간체를 형성하고, 이어서 His272가 H2O를 활성화하고 이것이 중간체를 가수분해하여 촉매 센터로부터 생성물을 방출하는 것 같다. 촉매 His272 잔기의 점 돌연변이가 상기 단백질에 대한 관능기(FG)의 공유 테더링을 가능하게 하도록 효소의 효소적 활성을 손상시키는지 여부를 결정하기 위하여, 돌연변이 DhaA를 제조하였다.
재료 및 방법
돌연변이 DhaA 벡터를 제조하기 위하여, 4개의 프라이머 중첩-연장법을 기초로 하는 프로메가의 시험관내 돌연변이발생 키트를 이용하여 (Ho et al., 1989) F, A, G 또는 H 돌연변이에 대한 DhaA.H272를 제조하였다. 외부 프라이머는 올리고뉴클레오티드 5'-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3' (서열 1) 및 5'-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3' (서열 2)이였고, 내부 돌연변이성 프라이머는 다음과 같았다: H272F (5'-CCGGGATTGTTCTACCTCCAGGAAGAC-3'; 서열 3), H272A (5'-CCGGGATTGGCCTACCTCCAGGAAGAC-3'; 서열 4), H272G (5'-CCGGGATTGCAGTACCTCCAGGAAGAC-3'; 서열 5) 및 H272Q (5'-CCGGGATTGGGCTACCTCCAGGAAGAC-3'; 서열 6) (돌연변이 코돈은 밑줄로 표시함). 돌연변이된 데할로게나제 유전자를 pET-3a 벡터로 서브클로닝하였다. 돌연변이 데할로게나제의 과발현을 위하여, pET-3a 벡터를 적격의 이. 콜라이 BL21 (DE3)으로 형질전환하였다. 클론의 DhaA 서열을 DNA 서열분석에 의하여 확인하였다.
GST-DhaA (WT 또는 H272F/A/G/H 돌연변이체) 융합 카세트를 적합한 DhaA 코딩 영역을 pGEX5x3 벡터의 SalI/NotI 부위로 클로닝하는 것에 의해 제작하였다. 2개의 프라이머 (5'-ACGCGTCGACGCCGCCATGTCAGAAATCGGTACAGGC-3' 및 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAGCGCTTCAACCGGTGAGTGCGGGGAGCCAGCGCGC-3'; 각각 서열 7 및 8)을 DhaA의 5' 코딩 영역에 SalI 부위 및 코작 컨센서스 서열을 첨가하고, DhaA의 3' 코딩 영역에 NotI, EcoR47III 및 AgeI 제한효소 부위 및 종결 코돈을 첨가하하며, DhaA (WT 또는 돌연변이체) 주형으로부터 897 bp 단편을 증폭하도록 고안하였다. 얻은 단편을 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST) 유전자, Xa 인자 절단 부위를 코딩하는 서열 및 종결 코돈에 앞서 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함하는 벡터인 pGEX-5X-3의 SalI/NotI 부위로 삽입하였다.
이어서, Flag 코딩 서열을 pGEX5X-3 벡터의 AgeI/EcoR47III 제한효소 부위로 삽입하였다. 6개의 뉴클레오시드, AgeI 부위와 같은 프레임에는, 11개 아미노산 펩티드에 대한 서열이 있고, 그의 최종 옥타펩티드는 Flag 펩티드에 상응한다(Kodak Imaging Systems, Rochester, NY). Flag 펩티드(Kodak Imaging Systems, Rochester, NY)를 코딩하는 2개의 상보 올리고뉴클레오티드 (5'-CCGGTGACTACAAGGACGATGACGACAAGTGAAGC-3', 센스, 서열 9; 및 5'-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3', 안티센스, 서열 10)를 어닐링하였다. 어닐링된 DNA는 5' 말단에 AgeI 부위 및 3' 말단에 EcoR47III을 가졌다. 어닐링된 DNA는 AgeI 및 EcoR47III로 소화시키고, 이어서 AgeI 및 EcoR47III 부위에서 GST-DhaA.WT 또는 GST-DhaA.H272F 돌연변이 제작물내로 서브클로닝하였다. 모든 유전자 융합 제작물은 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
GST-DhaA 융합 단백질을 생성하기 위하여, 배양물이 600 nm에서 0.6의 광학 밀도에 도달하였을 때 이소프로필-b-D-티오갈락토피라노시드 (0.5 mM의 최종 농도)의 첨가에 의해 효소 발현을 유도하였다. 세포를 완충제 A (10 mM Tris-SO4, 1 mM EDTA, 1 mM β-머캅토에탄올, 및 10% 글리세롤, pH 7.5) 중에 수거하고, VibraCell(상품명) 초음파기 (Sonics & Materials, Danbury, CT, USA)를 이용하여 초음파분해에 의해 파괴하였다. 세포 파편을 1 시간 동안 19,800 x g에서 원심분리에 의해 제거하였다. 조 추출물을 추가로 제조자의 지시에 따라서 GSS-세파로즈 4 급속 칼럼 (Amersham Biosciences) 상에서 정제하였다. GST-DhaA 융합 단백질을 함유하는 용리 분획을 합하고, 10 mM Tris-SO4 완충제 (20 mM Na2SO4 및 1 mM EDTA-Na2를 함유함)에 대하여 밤새 4℃에서 투석하고, -20℃에서 사용시까지 저장하였다. DhaA (WT 또는 돌연변이체)를 생성하기 위하여, GST를 Xa 인자로 융합 단백질로부터 절단하고, 생성물을 제조자의 지시에 따라서 GSS-세파로즈 4 (Amersham Biosciences) 상에서 정제하였다. 단백질의 균일성은 SDS-PAGE로 확인하였다. 일부 실험에서, 무세포 추출물은 문헌[Newman et al. (1999)]에 기술된 바와 같이 45-70% 포화 암모늄 술페이트를 이용하여 분별하였다.
결과
도 3은 GST-DhaA.WT-Flag (레인 1) 및 GST-DhaA.H272F-Flag (레인 2) 융합 단백질의 강건한 IPTG 유도성 생성을 나타낸다. 나아가, 단백질은 가용성이고, GSS-세파로즈-4FF 상에서 효율적으로 정제될 수 있었다 (레인 5-10, 홀수 열은 GST-DhaA.WT-Flag에 상응하고, 짝수 열은 GST-DhaA.H272F-Flag에 상응한다). Xa 인자로의 융합 단백질의 처리는 2개의 단백질 GST 및 DhaA (WT 또는 돌연변이체, 각각 레인 11 및 12)의 형성을 일으켰고, GST는 GSS-세파로즈 4FF 상에서 효과적으로 제거되었다 (WT 또는 돌연변이, 각각 레인 13 및 14). 또한, 모든 단백질은 예상 분자량을 가졌다.
B. H272 의 돌연변이는 Cl- 알칸을 가수분해하는 DhaA 의 능력을 손상시킨다.
효소가 주변 매질로 효소 반응의 생성물을 방출할 수 없는 것은 테더링 시스템에 필수적이다. 이러한 무능력은 효소의 가수분해 활성의 유의한 감소에 의해 검출될 수 있다.
Cl-알칸의 DhaA (WT 또는 돌연변이체) 가수분해의 활성에 대한 점 돌연변이의 효과를 연구하기 위하여, 문헌[Holloway et al. (1999)]에 기술된 바와 같은 pH-지시제 염료 시스템을 이용하였다.
재료 및 방법
pH-지시제 염료 시스템에 대한 반응 완충제는 1 mM HEPES-SO4 (pH 8.2), 20 mM Na2SO4 및 1 mM EDTA로 이루어졌다. 페놀 레드를 최종 농도 25 ㎍/ml로 첨가하였다. 할로겐화 화합물을 용해된 분획의 기질이 탈할로겐화 반응의 최대 속도에 충분하다는 것을 보장할 수 있는 겉보기 농도로 첨가하였다. 기질-완충제 용액을 볼텍싱(vortexing)에 의해 30 초 동안 격렬하게 혼합하고, 기질의 유의한 증발을 방지하기 위하여 캐핑하고, 1-2 시간 내에 이용하였다. 각 동력학 측정에 선행하여, 페놀 레드를 HCl의 표준화 용액으로 적정하여 겉보기 소광 계수를 제공하였다. DhaA에 대한 정상-상태 동력학 상수는 558 nm에서 실온에서 베크만(Beckman) Du640 분광광도계 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) 상에서 결정하였다. 동력학 상수는 컴퓨터 프로그램 시그마플롯(SigmaPlot)을 이용하여 초기 속도로부터 계산하였다. 한 단위의 효소 활성은 특정 조건하에서 분 당 1.0 mM의 기질을 탈할로겐화하는데 필요한 양으로 정의된다.
결과
도 4에 나타낸 바와 같이, pH 7.0-8.2에서 0.1 mg/ml의 효소 및 10 mM 기질을 이용한 경우, 4가지 돌연변이체 어느 것에서도 효소 활성이 발견되지 않았다. 상기 조건하에서, 야생형 효소는 단백질 mg 당 5 단위의 1-Cl-부탄 활성을 가졌다. 따라서, 돌연변이체의 활성은 적어도 700배 감소하였다.
DhaA (WT 또는 1종의 돌연변이체)를 발현하는 이. 콜라이로부터 얻은 상층액 분취량을 (NH4)2SO4 농도를 증가시키며 처리하였다. 단백질을 각각의 (NH4)2SO4 농도에 대하여 2 시간 동안 (4℃) 노출하고, 원심분리에 의해 펠렛팅하고, 밤새 완충제 A에 대하여 투석하고, SDS-PAGE 상에서 분리하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 주 분획의 DhaA.WT 및 DhaA.H272F 돌연변이체를 45-70%의 (NH4)2SO4에 의해 침전시켰다. 낮은 (NH4)2SO4 농도에서 상기 단백질 침전물이 관찰되지 않았다. 반대로, DhaA.H272Q, DhaA.H272G 및 DhaA.H272A 돌연변이체는 10% (NH4)2SO4에 의해 침전될 수 있었다. 이는 DhaA.H272Q, DhaA.H272G 및 DhaA.H272A 돌연변이체의 유의한 물리-화학적 특성의 변화를 강하게 나타내는 것이다. 동시에, DhaA.H272F 돌연변이체는 이들 파라미터에 대하여 유의한 효과가 없었다. 이들 데이타는 DhaA의 3-D 구조에 대한 돌연변이의 효과의 컴퓨터 모델링 결과와 일관적인 것이고, 모든 시험 돌연변이 중에서 DhaA.H272F 돌연변이만이 예상 3-차원 모델에 대하여 유의한 효과가 없다는 것을 나타낸다 (도 2 참조). 상기 결과에 기초하여, DhaA.H272F를 추가 실험을 위하여 선택하였다.
공유 부가물을 형성하기 위해, Cl-알칸의 염소 원자를 DhaA (WT 또는 돌연변이)의 촉매 아미노산에 매우 근접하여 적합하게 위치시켰다 (도 2). DhaA의 결정 구조 (문헌[Newman et al., 1999])는 이들 아미노산들은 DhaA의 촉매 포켓의 내부 깊이에 위치한다는 것을 나타낸다 (대략 길이 10Å 및 단면적 20Å2). DhaA에 대한 기질 내의 반응기 (관능기를 포함)를 DhaA의 촉매 포켓에 들어가게 하기 위해서, Cl-함유 기질을 관능기와 연결시켜 관능기가 촉매 포켓의 바깥쪽에 위치하도록, 즉, DhaA의 3차원 구조를 방해/파괴하지 않도록 링커를 설계하였다.
DhaA가 긴 소수성 탄소 사슬을 가진 Cl-알칸을 가수분해할 수 있는지 결정하기 위해, DhaA.WT를 다양한 Cl-알칸 알콜과 접촉시켰다. 도 6에 도시된 바와 같이, DhaA.WT는 4 내지 10의 탄소 원자를 갖는 1-Cl-알칸 알코올을 가수분해할 수 있다. 더욱이, 긴-사슬 Cl-알칸의 수성 완충제 내에서의 낮은 용해도가 효소-기질 상호 작용의 효율에 영향을 미칠 수 있음에도, Cl-알칸의 초기 가수분해 속도 (IRH)는 탄소 사슬의 길이와 반비례 관계를 가졌다. 사실, 도 6에 도시된 바와 같이, 1-Cl-알칸-10-데칸올의 IRH는 1-Cl-데칸의 IRH보다 훨씬 높다. 더 중요하게, 이들 데이터는 DhaA가 상대적으로 극성인 기 (예를 들면, HO-기)를 함유하는 Cl-알칸을 가수분해할 수 있음을 나타낸다.
다른 길이 및(또는) 소수성의 링커들을 갖는 FAM-변형된 Cl-알칸을 제조하였다 (도 7). 링커가 12 이상의 원자 길이를 갖는 경우, DhaA.WT는 효율적으로 상대적으로 부피가 큰 관능기 (FAM)를 갖는 Cl-알칸을 가수분해하였다. DhaA.H272F/A/G/Q 돌연변이의 활성은 시험된 Cl-알칸 중 어떤 것에 있어서도 검출되지 않았다(데이터를 도시하지 않음). 또한, Cl-원자에 인접한 (CH2)6 영역의 변형은 DhaA.WT에 의한 14-원자 링커의 IRH의 현저한 감소를 초래하였다. 그럼에도, 링커의 길이 및 구조가 하이드롤라제의 촉매 부위와 양립할 수 있다면, 본 발명의 기질 내의 링커의 존재는 실질적으로 반응에 영향을 미치지 않는다.
일부 시료를 자동화된 HPLC (휴렛패커드 모델 1050) 시스템상에서 분석하였다. DAD 검출기를 200 내지 600nm에 걸친 자외선-가시광선 스펙트럼을 기록하기 위해 설치하였다. FAM-변형된 기질에 대해서는 480/520nm이고 TAMRA-변형된 기질에 대해서는 540/575nm인 Eex/Eem에서 형광이 검출되었다. 10mM 암모늄 아세테이트 (pH 7.0):ACN (아크릴로니트릴)의 선형 기울기가 25:75 내지 1:99 (v/v)인 분석용 역상 C18 컬럼 (애드솔보스피어 에이치에스 (Adsorbosphere HS), 5μ, 150×4.6mm; 휴렛-패커드, 클리프톤, 뉴저지)에 Cl-알칸의 에탄올 추출물 또는 Cl-알칸 가수분해의 생성물을 30분에 걸쳐 1.0ml/분으로 적용하여 분석하였다. 분리된 화합물의 정량화를 수집된 피크의 통합된 표면에 근거하였다.
도 8A는 기질의 완전한 분리 및 반응 생성물을 도시한다. 도 8B는 야생형 DhaA가 매우 효율적으로 FAM-C14H24O4-Cl을 가수분해하였음을 나타낸다. TAMRA-C14H24O4-Cl 또는 ROX.5-C14H24O4-Cl을 기질로서 사용할 경우 유사한 결과를 얻었다 (데이터는 도시하지 않음). 이들 데이터는 함께 DhaA.H272F 돌연변이에 의한 DhaA의 완전한 불활성화를 보여주는 pH-지시제 염료-기재 분석의 결과를 확인해 준다.
C. 시험관내에서의 관능기의 DhaA 돌연변이에의 공유 테더링
재료 및 방법
위스콘신 대학교의 생물 공학 센터에서 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 시간차(MALDI-TOF) 질량 분석기 브루커 비플렉스 (Bruker Biflex) III (브루커, 미국)을 사용하여 단백질의 MALDI 분석을 행하였다. 시료를 제조하기 위해, 200㎕의 완충제 (1mM HEPES-SO4 (pH 7.4), 20mM Na2SO4, 및 1mM EDTA) 내의 100㎍의 정제된 DhaA (WT 또는 H272F 돌연변이) 또는 GST-DhaA (WT 또는 H272F 돌연변이) 융합 단백질 (약 90%의 균질성으로 정제됨)을 기질 (FAM-C14H24O4-Cl, 최종 농도 1.0mM로)의 존재 또는 부재하에 실온에서 15분 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 반응 혼합물을 20mM CH3COONH4 (pH 7.0)에 대해서 밤새 4℃에서 투석하였고 단백질 및 단백질-기질 복합체의 M/Z 값을 측정하였다.
DhaA.D106 돌연변이를 제조하기 위해 사용한 올리고뉴클레오티드는 DhaA.D106C에 대해서는:
5'-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACTGCTGGGGC-3' (서열 13) 및 5'-TGAGCCCCAGCAGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3' (서열 14)를; DhaA.D106Q에 대해서는:
5'-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACCAGTGGGGC-3' (서열 34) 및 5'- TGAGCCCCACTGGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3' (서열 35)를; DhaA.D106E에 대해서는:
5'-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACGAATGGGGC-3' (서열 52) 및 5'- TGAGCCCCATTCGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3' (서열 53)를; 그리고 DhaA.D106Y에 대해서는:
5'-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACTACTGGGGC-3' (서열 54) 및 5'- TGAGCCCCAGTAGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3' (서열 55)를 포함하였다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 StyI 부위 및 3' 말단에 BlpI 부위를 함유하였다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드는 StyI 및 BlpI로 소화되고 StyI 및 BlpI 부위에서 GST-DhaA.WT 또는 GST-DhaA.H272F내로 서브클로닝되었다. 모든 돌연변이를 DNA 염기서열결정법에 의해 확인하였다.
결과
DhaA.H272 돌연변이가 관능기를 가진 Cl-알칸과 결합할 수 있었다는 것을 확인하기 위해, 이 돌연변이 또는 그 GST-융합체, 및 상응하는 야생형 단백질 또는 융합체를 FAM-C14H24O4-Cl, TAMRA-C14H24O4-Cl, ROX.5-C14H24O4-Cl, 또는 바이오틴-C18H32O4-Cl과 실온에서 15분 동안 접촉시켰다. 그 후 단백질을 SDS-PAGE에서 분리시켰다. 단백질을 함유하는 겔을 FAM-C14H24O4-Cl, TAMRA-C14H24O4-Cl, 또는 ROX.5-C14H24O4-Cl로 인큐베이팅하였고 각각의 형광발색단에 적합한 Eex/Eem에서 형광영상기 (히다치, 일본)로 분석하였다. 바이오틴-C18H32O4-Cl로 인큐베이팅한 단백질을 함유하는 겔을 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였고 HRP 컨쥬게이팅된 스트렙타비딘으로 프로빙하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, TAMRA-C14H24O4-Cl (패널 A의 레인 1 및 2), FAM-C14H24O4-Cl (패널 A의 레인 3 및 4), 및 ROX.5-C14H24O4-Cl (패널 A의 레인 5 및 6)은 DhaA.H272F (패널 A의 레인 2, 4 및 6)에 결합하였고 DhaA.WT (패널 A의 레인 1, 3 및 5)에 결합하지는 않았다. 바이오틴-C18H34O4-Cl은 DhaA.H272F (패널 B의 레인 9 내지 14)에 결합하였고 DhaA.WT (패널 B의 레인 1 내지 8)에 결합하지는 않았다. 더욱이, 바이오틴-C18H34O4-Cl의 DhaA.H272F (패널 B의 레인 9 내지 14)에의 결합은 용량 의존성이었고 0.2μM에서 검출할 수 있었다. 또한, SDS로 비등하는 것이 결합을 끊지 못했기 때문에, 기질과 DhaA.H272F 사이의 결합은 매우 강했다.
모든 시험된 DhaA.H272 돌연변이들, 즉, H272F/G/A/Q는 TAMRA-C14-Cl에 결합하였다 (도 10). 또한, 돌연변이를 기질들 (바이오틴-C18H34O4-Cl) 중의 하나로 전처리함이 다른 기질 (TAMRA-C14H24O4-Cl)의 결합을 완전하게 차단하였기 때문에, DhaA.H272 돌연변이들은 매우 특이한 방식으로 기질을 결합하였다 (도 10).
Cl-알칸과 DhaA.H272F 돌연변이 (또는 GST-DhaA.H272F 돌연변이 융합 단백질) 사이의 결합의 성질을 결정하기 위해, 이들 단백질들을 FAM-C14H24O4-Cl의 존재 및 부재하에 인큐베이팅하였고, MALDI에 의해 분석하였다. 도 11에 도시한 바와 같이, 돌연변이 DhaA.H272F 및 FAM-C14H24O4-Cl 사이의 결합은 강하다. 더욱이, E*S 복합체의 분석은 기질 (예를 들면, FAM-C14H24O4-Cl)과 DhaA.H272F 사이의 결합의 공유 성질을 나타내었다. MALDI-TOF 분석은 또한 기질/단백질 부가물이 1:1 관계로 형성됨을 확인한다.
촉매 트리아드 내의 다른 잔기, 즉 잔기 106에서의 DhaA 돌연변이를 제조하였다. 야생형 DhaA 내의 위치 106에서의 잔기는 공지된 친핵성 아미노산 잔기 중 하나인 D였다. DhaA 내의 잔기 106의 D는 D 이외의 친핵성 아미노산 잔기, 예를 들면, C, Y 및 E로 치환되었고, 야생형 DhaA와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정한 기질과의 결합을 형성할 수 있었다. 특히, 시스테인이 시스테인-기재 효소에 있어서 공지된 친핵체이고, 그 효소는 물을 활성화한다고 알려져 있지는 않다.
조절 돌연변이, DhaA.D106Q, 단일 돌연변이 DhaA.D106C, DhaA.D106Y, 및 DhaA.D106E, 및 이중 돌연변이 DhaA.D106C:H272F, DhaA.D106E:H272F, DhaA.D106Q:H272F, 및 DhaA.D106Y:H272F를 TAMRA-C14H24O4-Cl에 결합하기 위해 분석하였다 (도 12). 도 12에 도시된 바와 같이, TAMRA-C14H24O4-Cl은 DhaA.D106C, DhaA.D106C:H272F, DhaA.D106E, 및 DhaA.H272F에 결합하였다. 따라서, TAMRA-C14H24O4-Cl과 돌연변이 DhaA 내의 잔기 106에 있는 시스테인 또는 글루탐산 사이에 형성된 결합은 TAMRA-C14H24O4-Cl과 야생형 DhaA 사이에 형성된 결합에 비해 안정하였다. 위치 106에서의 다른 치환은 단독으로 또는 DhaA 내의 다른 잔기에서의 치환과 함께 유사한 결과를 낳을 수 있다. 또한, 위치 106에서의 특정한 다른 치환은 단독으로 또는 DhaA 내의 다른 잔기에서의 치환과 함께 특정한 기질과만 결합을 형성하는 돌연변이 DhaA를 초래할 수 있다.
실시예 III
본 발명의 돌연변이 DhaA 및 기질을 통한 루시퍼라제의 고형 지지체에의 테더링
재료 및 방법
phRLuc-링커-DhaA.WT-Flag 및 phRLuc-링커-DhaA.H272F-Flag 융합 카세트를 phRLuc 코딩 영역을 미리스트산 부착 펩티드 코딩 서열 (MAS)을 함유하는 pCIneo 벡터의 NheI/SalI 부위로 클로닝하여 제작하였다. 두 프라이머 (5'-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3'; 서열 11) 및 (5'-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3'; 서열 12)를 NheI 및 SalI 부위를 phRLuc의 5' 및 3' 코딩 영역에 각각 첨가하도록 그리고 900bp 단편을 phRLuc 주형 (pGL3 벡터, 프로메가)로부터 증폭하도록 설계하였다. 그 후, 미리스트산 부착 펩티드 코딩 서열을 NheI 및 SalI 제한 효소로 절제하였고 phRLuc를 함유하는 증폭된 단편을 pCIneo.DhaA. (WT 또는 H272F)-Flag 벡터의 NheI/SalI 제한 부위에 삽입하였다. 각 제작의 서열을 DNA 서열결정법에 의해 확인하였다. 프로메가의 TNT (등록상표) T7퀵 (Quick) 시스템을 사용하여 시험관내에서 융합 단백질을 생성하였다.
결과
DhaA.H272F-Cl-알칸 브릿지를 통한 단백질의 고형 지지체에의 테더링을 증명하기 위해, 레닐라 루시퍼라제의 융합 단백질 (hRLuc, 융합체의 N-말단)을 코드화하는 벡터, 단백질 커넥터 (17 아미노산, 표 I 참조), 및 DhaA (WT 또는 H272F 돌연변이)를 제조하였다. Flag 에피토프를 DhaA의 C-말단에 융합시켰다.
융합체 서열 펩티드 커넥터
GST-DhaA atcgaaggtcgtgggatccccaggaattcccgggtcgacgccgcc (서열 26) iegrgiprnsrvdaa (서열 27)
GFP-DhaA tccggatcaagcttgggcgacgaggtggacggcgggccctctagagccacc (서열 28) sgsslgdevdggpsrat (서열 29)
DhaA-Rluc accggttccggatcaagcttgcggtaccgcgggccctctagagcc (서열 30) tgsgsslryrgpsra (서열 31)
Rluc-DhaA tccggatcaagcttgcggtaccgcgggccctctagagccgtcgacgccgcc (서열 32) sgsslryrgpsravdaa (서열 33)
DhaA-Flag Accggt Tg
웨스턴 블롯이 뒤에 이어지는 SDS-PAGE 분석은 단백질이 그 예상된 분자량을 갖고 항-R.Luc 및 항-FlagR M2 항체에 의해 인식된다는 것을 보여주었다. 또한, 모든 융합 단백질을 레닐라 루시퍼라제 활성 (PBS pH 7.4 완충제 내의 프로메가의 레닐라 루시퍼라제 분석 시스템에 의해 결정됨)을 가졌다.
DhaA.H272F-Cl-알칸 브릿지를 통한 단백질의 고형 지지체에의 테더링을 기질로서의 바이오틴-C18H3204-Cl 및 고형 지지체로서의 스트렙타비딘 (SA)-피복된 96 웰 플레이트 (피어스, 미국)을 사용하여 나타내었다. 번역된 단백질을 바이오틴-C18H3204-Cl 기질과 25μM (최종 농도)에서 60분 동안 실온에서 접촉시켰다. 결합하지 않은 바이오틴-C18H3204-Cl을 세파덱스 G-25 미리 충전된 컬럼 (아머샴 바이오사이언시스) 상에서 겔-여과하여 제거하였다. 수집된 R. Luc-커넥터-DhaA 융합체 분획을 SA-피복된 96-웰 플레이트에 1시간 동안 실온에서 위치시켰고, 결합하지 않은 단백질을 세척하고 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 13A는 플레이트 상에 포획된 레닐라 루시퍼라제의 활성을 보여준다. 이들 데이타의 분석은 오직 돌연변이 DhaA를 함유하는 융합체만이 포획되었음을 나타내었다. 포획의 효율은 매우 높았다 (플레이트에 첨가된 레닐라 루시퍼라제 활성50% 초과가 포획됨). 반대로, 레닐라 루시퍼라제뿐만 아니라 야생형 DhaA를 함유하는 융합체의 포획 효율은 무시할 수 있을 정도로 작았다 (<0.1%). R.Luc-커넥터-DhaA.H272F를 바이오틴이 부착되지 않은 기질 (TAMRA-C14H2404-Cl)로 전처리하는 것은 포획 효율을 약 80% 정도 감소시켰다. 또한, 바이오틴이 부착되지 않은 기질로 전처리하는 것은 R.Luc-커넥터-DhaA.WT 또는 레닐라 루시퍼라제의 포획에 영향을 주지 않았다.
종합적으로, 이들 데이타는 활성 효소 (예를 들면, 레닐라 루시퍼라제)가 본 발명의 기질 (Cl-알칸-DhaA.H272F-브릿지)의 일부를 형성하는 고형 지지체에 테더링될 수 있고, 효소의 활성을 유지할 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 IV
생체 내의 돌연변이 DhaA 및 기질 시스템
A. 생체 내의 DhaA 돌연변이에의 관능기의 공유 테더링 : 원핵 생물 및 진핵 생물 내
재료 및 방법
본 발명의 기질을 원핵 생물에서 발현된 돌연변이 하이드롤라제에 결합시키는 것을 연구하기 위해, 이. 콜라이 세포 BL21 (λDE3) pLys65를 액체 배양에서 성장한 pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag 또는 pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag로 형질전환시키고, IPTG로 유도했다. TAMRA-C14H2404-Cl 또는 바이오틴-C18H3204-Cl를 유도된 세포 (최종 농도, 25μM)에 첨가하였다. 1시간 후, 세포를 수집하였고, 차가운 PBS (pH 7.3)로 세척하였고, 초음파 분해에 의해 분해시켰고, 1시간 동안의 19800 × g에서의 원심분리에 의해 분별하였다. 가용성 부분에 SDS-PAGE을 수행하였다. TAMRA-C14H2404-Cl로 처리된 세포로부터 단리된 단백질을 갖는 겔을 형광영상기 상에서 분석했지만, 바이오틴-C18H3204-Cl로 처리한 세포로부터의 단백질은 니트로셀룰로오스 막으로 전달하고 HRP-컨쥬게이팅된 스트렙타비딘으로 프로빙하였다.
포유동물 세포 내에서의 TAMRA-C14H2404-Cl의 결합을 연구하기 위해, DhaA.WT-Flag 및 DhaA.H272F-Flag 코딩 영역을 pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag 또는 pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag로부터 각각 절제하였고, 겔 정제하였고, pCIneo.CMV 벡터 (프로메가)의 SalI/NotI 제한 부위 내로 삽입하였다. 제작물을 DNA 서열결정법에 의해 확인하였다.
CHO-K1 세포를 24 웰 플레이트 (랩시스템(Labsystem))에서 평판 배양시켰고 pCIneo-CMV.DhaA.WT-Flag 또는 pCIneo-CMV.DhaA.H272F-Flag 벡터로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후, 배지를 25μM의 TAMRA-C14H2404-Cl을 함유하는 새로운 배지로 대체하였고 세포를 CO2 배양기 내에 60분 동안 위치시켰다. 이 배양에 이어서, 배지를 제거하고, 세포를 빠르게 PBS (pH 7.4; 네 번의 연속적인 세척: 1.0ml/㎠; 각각 5초)로 세척하였고 세포를 샘플 완충제 (1% SDS, 10% 글리세롤 등; 250㎕/웹)에서 가용화시켰다. 단백질 (10㎕/레인)을 SDS-PAGE (4 내지 20% 구배 겔) 상에서 분리시켰고 540/575nm의 Eex/Eem에서 형광영상기 (히다치, 일본)에 의해 TAMRA-C14H2404-Cl의 결합을 검출하였다.
결과
도 14A 및 B는 바이오틴-Cl8H3204-Cl (A) 및 TAMRA-Cl2H2404-Cl (B)를 이. 콜라이 단백질에 생체 내에서 결합시키는 것을 보여준다. 도 14A의 낮은 분자량 밴드는 HRP-SA에 의해 인식할 수 있는 이. 콜라이 단백질이고, 패널 B의 하부에서 검출되는 형광은 자유 TAMRA-Cl2H2404-Cl의 형광이었다. 도 15는 생체 내에서의 TAMRA-Cl2H2404-Cl의 진핵 생물 세포 단백질에 대한 결합을 보여준다.
도 14 및 도 15의 분석은 DhaA.WT-Flag가 아닌 DhaA.H272F-Flag 돌연변이가 TAMRA-Cl4H2404-Cl 또는 바이오틴-C18H32O4-Cl을 생체 내에서 결합한다는 것을 보여주었다. 더욱이, 후속하여 SDS-PAGE가 이어지는 SDS로 비등하는 것에 의해 돌연변이 효소와 기질 사이의 결합이 붕괴되지 않기 때문에, DhaA.H272F-Flag와 기질 사이의 결합은 매우 강했다 (아마도 공유 결합).
B. 본 발명의 기질에 대한 세포막의 투과성
재료 및 방법
CHO-K1 세포 (ATCC-CCL61)를 햄 (Ham)의 F12 영양소 및 10% 우태아 혈청 (FBS)가 보충된 둘베코의 변형된 최소 필수 배지의 1:1 혼합물, 100U/ml 페니실린, 및 100mg/ml 스트렙토마이신 내에서, 95% 공기 및 5% CO2 대기하에 37℃에서 배양하였다.
다른 기질의 흡수를 연구하기 위해, 세포를 LT-II 챔버 (Nunc) 또는 96 웰 플레이트 (랩시스템)에서 30000 세포/㎠의 밀도로 평판 배양하였다. 다음날, 배지를 다른 농도의 기질을 함유하는 배지로 대체하였고 세포를 다시 CO2 배양기 내에 2, 5 또는 15분 동안 위치시켰다. 배양의 마지막에, 기질을 함유하는 배지를 제거하였고 세포를 PBS (pH 7.4; 네 번의 연속적인 세척: 1.0ml/㎠; 각각 5초)로 빠르게 세척하였다. 그 후, 새로운 배지를 세포에 첨가하고, 세포를 37℃에서 CO2 배양기에 다시 위치시켰다. 96 웰 플레이트 내의 세포의 형광 수준을 FAM- 및 TAMRA-변형된 기질에 대해 각각 480/520nm 및 540/575nm인 Eex/Eem에서 형광 플레이트 판독기 사이토플루오르 (Cytofluor) II (베크만 (Beckman)) 상에서 측정하였다. 세포의 형광 영상을 FITC 및 TAMRA의 검출에 적합하게 설치된 필터를 갖는 도립 형광 현미경 악시오버트 (Axiovert)-100 (칼 짜이스 (Carl Zeiss)) 상에서 얻었다.
결과
도 16에 도시된 바와 같이, TAMRA-C14H2804-Cl (25μM, 37℃에서 5분)로 처리한 CHO-K1 세포는 빠르게 그리고 효율적으로 TAMRA-C14H2804-Cl로 로딩될 수 있다. 영상분석은 형광 염료가 세포막을 가로지른다는 것을 나타내었다. 도 16은 또한 TAMRA-C14H2804-Cl을 효율적으로 세포 외로 세척할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 함께 CHO-K1 세포의 원형질막이 TAMRA-C14H2804-Cl에 대해 투과성이라는 것을 나타낸다.
반대로, FAM-Cl4H2404-Cl은, 세포를 높은 농도 (즉, 100μM)의 FAM-Cl4H2404-Cl로 훨씬 긴 시간 (60분) 동안 전처리하였음에도 불구하고, CHO-K1 세포의 원형질막을 통과하지 못했다 (데이타는 도시하지 않음). 따라서, 본 발명의 다양한 기질, 예를 들면, TAMRA-C14H2404-Cl 및 FAM-Cl4H2404-Cl에 대한 세포 원형질막의 다른 투과성은 세포 표면상에 발현된 단백질 및 세포 내부에 발현된 단백질을 다른 형광 발색단으로 표지할 특정 기회를 제공하고, 따라서 바이플렉싱 (biplexing)을 가능하게 한다.
실시예 V
생체 내의 세포 영상화를 위한 DhaA -기재 테더링
A. 살아있는 포유동물 세포 내의 GFP 및 TAMRA - C 12 H 24 0 4 -Cl의 공동-위치지정
재료 및 방법
GFP-커넥터-DhaA 융합 카세트를 패커드의 벡터 코딩 GFP-DEVD-Rluc(h) (패커드 #6310066) 내의 레닐라 루시퍼라제 코딩 영역을 DhaA.WT-Flag 또는 DhaA.H272F-Flag 코딩 영역으로 대체하여 제작하였다. 두 프라이머 (5'-GGAATGGGCCCTCTAGAGCGACGATGTCA-3'; 서열 15, 및 5'-CAGTCAGTCACGATGGATCCGCTCAA-3'; 서열 16)를 ApaI 및 BamHI 부위 (밑줄)를 DhaA의 5' 및 3' 코딩 영역에 각각 첨가하도록 그리고 980bp 단편을 pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag 또는 pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag 주형으로부터 증폭하도록 설계하였다. R.Luc 코딩 영역을 ApaI 및 BamHI 제한 효소로 절제하였다. 그 후 DhaA를 함유하는 980bp 단편을 GFP-DEVD-Rluc(h) 코딩 벡터의 ApaI/BamHI 부위 내로 삽입하였다. 유전자 융합 제작물의 서열을 DNA 서열결정법에 의해 확인하였다.
일시적으로 GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag 또는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag 융합 단백질을 발현하는 세포를 LT-II 챔버 (Nunc)에서 30000 세포/㎠의 밀도로 평판 배양하였다. 다음날, 배지를 25μM의 TAMRA-C14H2404-Cl을 함유하는 새로운 배지로 대체하였고 세포를 다시 CO2 배양기 내에 60분 동안 위치시켰다. 배양의 마지막에, 기질을 함유하는 배지를 제거하였고, 세포를 PBS (pH 7.4; 네 번의 연속적인 세척: 1.0ml/㎠; 각각 5초)로 빠르게 세척하였고 새로운 배지를 세포에 첨가하였다. 세포를 다시 CO2 배양기 내에 위치시켰고 60분 후 세포를 PBS (pH 7.4; 네 번의 연속적인 세척: 1.0ml/㎠; 각각 5초)로 빠르게 세척하였다. 세포의 형광 영상을 GFP 및 TAMRA의 검출에 적합하게 설치된 필터를 갖는 도립 형광 현미경 악시오버트-100 (칼 짜이스) 상에서 얻었다.
결과
도 17에 도시된 바와 같이, GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag 또는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag 중 하나로 트랜스펙션된 세포는 GFP의 광 방사 특성을 갖는 단백질의 견고한 발현을 보였다. 설치된 TAMRA-필터로 얻은 동일한 세포의 영상 분석은 GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag를 발현하는 세포가 어두웠고 이 융합 단백질을 발현하지 못하는 세포와 구별할 수 없었다는 것을 보여주었다. 반대로, GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag를 발현하는 세포는 매우 밝았고 명백하게 인식할 수 있었다.
GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag 또는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag 벡터로 트랜스펙션된 CHO-K1 세포로부터 단리된 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 이들 세포가 항-Flag 항체에 의해 인식되는 단백질을 발현하고 융합 단백질에 대해 예측된 분자량을 가짐을 보여주었다 (데이타는 도시되지 않음). 이들 단백질의 SDS-PAGE 겔의 형광스캔은 TAMRA의 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag에 대한 강한/공유 결합을 보여주었고 GFP-커넥터-DhaA.WT-Flag에 대한 결합은 보이지 않았다 (도 18).
B. DhaA .WT-Flag 및 DhaA . H272F -Flag 내의 DhaA 의 융합 파트너는 기 능성이다
두 단백질의 융합체가 하나 또는 양 단백질의 활성 손실을 초래하는지 여부를 결정하기 위해, 융합체의 C- 또는 N-말단에 DhaA를 갖고 두 단백질 사이에 커넥터 서열, 예를 들면, 13 내지 17개 아미노산을 갖는 서열을 갖는 여러 개의 DhaA-기재 융합 단백질 (표 II 참조)을 제조하였다. 데이타는 융합체 내의 양 단백질의 기능성 활성이 보존됨을 보여주었다.
N-말단 단백질 커넥터 C-말단 단백질 단백질 #1의 기능 단백질 #2의 기능
GST + DhaA.H272F GSS 컬럼에 결합 결합
GFP + DhaA.H272F 녹색 형광 결합
R.Luc + DhaA.H272F 콜렌테라진의 가수분해 결합
DhaA.H272F + R.Luc 결합 콜렌테라진의 가수분해
DhaA.H272F + Flag 결합 항체에 의해 인식됨
C. Cl- 알칸의 독성
재료 및 방법
Cl-알칸의 독성을 연구하기 위해, CHO-K1 세포를 96 웰 플레이트에서 5000 세포/웰의 밀도로 평판 배양하였다. 다음날, 배지를 0 내지 100μM 농도의 Cl-알칸을 함유하는 새로운 배지로 대체하였고 세포를 다시 CO2 배양기 내에서 다른 시간 동안 위치시켰다. 세포의 생존 가능성을 셀티터-글로 (CellTiter-Glo)TM 발광 세포 생존 가능성 분석 (프로메가)을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다. 일반적으로, 100㎕의 셀티터-글로TM 시약을 직접 세포에 첨가하고 발광을 10분 째에 DYNEX MLX 마이크로티터 플레이트 발광 측정기를 사용하여 기록하였다. 일부 실험에 있어서는, 형광/발광 간섭을 방지하기 위해, 형광 Cl-알칸을 함유하는 배지를 제거하였고 세포를 셀티터-글로TM 시약을 첨가하기 전에 PBS (pH 7.4; 네 번의 연속적인 세척: 1.0ml/㎠; 각각 5초)로 빠르게 세척하였다. 대조군 실험은 이 방법이 셀티터-글로TM 분석의 민감성 또는 정확성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내었다.
결과
도 19에 도시된 바와 같이, TAMRA-Cl4H2404-Cl은 100μM 농도 (시험된 가장 높은 온도)에서 4시간의 처리 후에도 CHO-K1 세포 상에 독성을 보이지 않았다. 24시간의 처리 후, 6.25μM 농도 ("최대 비-독성 농도")에서 독성이 검출되지 않았다. 6.25μM 초과의 농도에서, CHO-K1 세포 내의 상대적인 발광이 용량-의존성 방법에 의해 IC50이 약 100μM이 되도록 감소하였다. 100μM에서 24시간 처리한 후에도 바이오틴-Cl8H3404-Cl의 독성은 관찰되지 않았다. 반대로, ROX5-Cl4H2404-Cl은, CHO-K1 세포 내의 RLU의 감소가 1시간의 처리 후에 검출될 수 있어 뚜렷한 독성 효과를 가졌다. 이 효과의 IC50 값은 25μM 농도에서의 명백한 ATP 감소 없이 약 75μM였다. ROX5-Cl4H2404-Cl 독성의 IC50 값 및 ROX5-Cl4H2404-Cl의 "최대 비-독성 농도"는 시간-의존성 방법에 의해 각각 12.5μM 및 6.25μM로 감소하였다.
D. TAMRA - 또는 DiAc -FAM-함유 기질 및 고정제와 접촉된 CHO 세포 내의 DhaA.D106C의 검출
CHO 세포 (ATCC, 패시지 4)를 항생 물질 없이 8-웰 챔버 슬라이드 (독일 덮개유리 시스템) 내로 10% FBS 및 1mM 글루타민을 함유하는 DMEM:F12 배지 (깁코 (Gibco)) (성장 배지)에 낮은 밀도로 접종하였다. 이틀 후, 세포를 도립상 현미경을 이용하여 검사하였다. 두 시각적 기준: 1) 챔버당 세포 컨플루언스 수준은 약 60 내지 80%, 및 2) 90% 초과의 세포는 접착성이고 평평화된 형태를 보임은 트랜스펙션 시약을 적용하기 전에 확인하였다. 배지를 150㎕의 새로운 사전-가온된 성장 배지로 대체하였고 세포를 약 1시간 동안 배양하였다.
세포를 TransIt TKO 시스템 (미리스 (Miris))를 사용하여 트랜스펙션시켰다. TKO 지질을 100㎕의 혈청이 없는 DMEM:F12 배지 당 7㎕의 지질을 첨가하여 희석하였고, 그 후 1.2㎍의 트랜스펙션-등급 DhaA.D106C DNA를 100㎕의 지질 함유 배지 당 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양한 후, 25㎕의 분취량을 각각의 배양 챔버 (0.3㎍ DNA) 내로 전달하였다. 세포를 다시 5 내지 6 시간 동안 배양기에 위치시켰고, 성장 배지로 두 번 세척하고, 300㎕의 새로운 성장 배지를 첨가한 후, 세포를 추가적인 24시간 동안 배양하였다.
트랜스펙션된 또는 트랜스펙션되지 않은 대조군 세포를 10% FBS/DMEM 내의 12.5μM TAMRA-Cl4H2404-Cl 또는 12.5μM DiAc-FAM-Cl4H2404-Cl로 5% CO2에서 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 따뜻한 성장 배지로 세 번 세척하였고, 300㎕의 새로운 성장 배지를 첨가한 후, 세포를 1시간 동안 배양하였다.
성장 배지를 따뜻한 PBS로 대체하였고 살아있는 세포를 로다민 필터 세트 (여기 필터=540, 방사 필터=560LP) 및 플루오레세인 필터 세트 (여기 필터=490, 방사 필터=520), 및 스폿 (Spot) CCD 카메라가 장착된 짜이스 악시오버트 100 도립 현미경을 사용하여 시각화하였다. 영상을 4 또는 16의 획득 설정에서 0.15 내지 0.60초의 노출 시간으로 포획하였다.
식별되고 특이적으로 표지한 트랜스펙션된 세포는 TAMRA-Cl4H2404-Cl 및 DiAc-FAM-C14H2404-Cl 표지된 세포 모두에서 명백히 보였다. 세포의 대다수는 트랜스펙션되지 않은 세포였고 그것들은 표지를 보유하지 않았다.
PBS를 제거하고 세포를 PBS 내 3.7% 파라포름알데히드/0.1% 트리톤으로 15분 동안 고정하였다. 고정제를 제거하고, PBS를 첨가하였고, 영상의 두 번째 세트를 TAMRA-Cl4H2404-Cl 및 DiAc-FAM-C14H2404-Cl 표지된 세포 모두에 대해 포획하였다.
PBS를 PBS 내의 50% 메탄올로 대체하였고 세포를 15분 동안 배양한 후, 95% 메탄올에서 15분간 배양하였다. 영상의 세 번째 세트를 포획한 후 동일 부피의 메탄올 및 아세톤의 혼합물을 세포에 가하고 15분 동안 배양하였다. 배지를 PBS로 대체하였고 영상의 네번째 세트를 획득하였다.
결과는 파라포름알데히드로의 고정화와 후속된 메탄올 및 아세톤 내에서의 고정된 세포 샘플의 처리 후 기질의 DhaA.D106C 돌연변이에의 결합이 안정함을 제시하였다. 또한, TAMRA 또는 FAM 형광의 밝기는 이들 조건하에서 변하지 않았다.
실시예 VI
돌연변이 β- 락타마제 ( blaZ )-기재 테더링
박테리아 저항성을 β-락탐 항생 물질에 부여하는 효소인 세린-β-락타마제는 아마도 세린 잔기 (문헌[Ambler et al. (1991)]의 A 부류 컨센서스 번호지정계의 Ser 70)의 히드록실기를 사용하여 넓은 범위의 β-락탐 화합물을 분해한다. 반응은 미리 공유된 인카운터(encounter) 복합체 (도 20A)의 형성으로 시작하고, 고-에너지 아실화 4면체 중간체 (도 20B)를 통해 일시적으로 안정한 아실-효소 중간체를 형성하도록 이동하고, 촉매 잔기 Ser 70 (도 20C)를 통해 에스테르를 형성한다. 후속하여, 아실-효소는 가수분해성 물 (도 20D)에 의해 공격당하여 고-에너지 탈아실화 중간체 (도 20E) (문헌[Minasov et al., 2002])를 형성하고, 붕괴되어 가수분해된 생성물 (도 20F)를 형성한다. 그 후, 생성물은 축출되고, 자유 효소가 재생된다. 세린 프로테아제에서처럼, 이 메카니즘은 세린 친핵체를 활성화하여 기질의 아미드 결합을 공격하고, 아실-효소 중간체를 형성한 후 부가물의 에스테르 중심 상의 공격을 위한 가수분해성 물을 활성화하기 위해 촉매 염기를 필요로 한다.
A. 돌연변이 β- 락타마제 및 그 융합체
재료 및 방법
스타필로코커스 아우레우스 PC1 blaZ 유전자를 가지는 플라스미드 pTS32 (문헌[Zawadzke et al., 1995])를 오. 허르츠버그 (O. Herzberg) 박사 (매릴랜드 대학교의 생물 공학 연구소)가 제공하였다. blaZ 유전자는 하기 서열을 가진다(서열 36):
점돌연변이를 blaZ 유전자 내로 도입하고 blaZ 코딩 영역을 pGEX-5X-3 벡터의 SalI/AgeI 부위 내로 클로닝하여 GST-blaZ (WT 및 E166D, N170Q, 또는 E166D:N170Q 돌연변이) 융합 카세트를 제작하였다. 내부의 돌연변이유발 프라이머는 다음과 같다:
E166D (5'-CCAGTTAGATATGACATAGAATTAAATTACTATTCACC-3', 서열 56; 5'-GGTGAATAGTAATTTAATTCTATGTCATATCTAACTGG-3', 서열 57);
N170Q (5'-CCAGTTAGATATGAGATAGAATTACAGTACTATTCACC-3', 서열 58; 및 5'-GGTGAATAGTACTGTAATTCTATCTCATATCTAACTGG-3', 서열 59); 및
E166D:N170Q (5'-CCAGTTAGATATGACATAGAATTACAGTACTATTCACC-3'; 서열 60 및 5'-GGTGAATAGTACTGTAATTCTATGTCATATCTAACTGG-3'; 서열 61).
두 외부 프라이머 (5'-CAACAGGTCGACGCCGCCATGAAAGAGTTAAATGATTTAG-3'; 서열 62; 및 5'-GTAGTCACCGGTAAATTCCTTCATTACACTCTTGGC-3'; 서열 63)를 N-말단 SalI 부위 및 코작 서열을 5' 코딩 영역에, AgeI 부위를 blaZ의 3' 코딩 영역에 첨가하고 806bp 단편을 blaZ.WT 주형으로부터 증폭시키도록 설계하였다. 생성되는 단편을, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST) 유전자, Xa 인자 절단 부위를 코딩하는 서열, 및 다중 클로닝 부위 (MCS) 이어서 Flag 및 종결 코돈을 코딩하는 서열을 함유하는 벡터 pGEX-5X-3의 SalI/AgeI 부위 내로 삽입하였다. 이 유전자 융합 제작물을 DNA 서열결정법에 의해 확인하였다.
GST-blaZ (WT 또는 돌연변이) 융합 단백질을 적합 이. 콜라이 BL21(λ DE3) 세포 내에서 과발현시키고 DhaA 및 GST-DhaA 융합 단백질에 대해 기술된 바와 같이 (완충제 A 대신 인산 칼륨 완충제 (0.1M, pH 6.8)를 사용한 것을 제외) 필수적으로 정제하였다. 단백질의 균질성을 SDS-PAGE에 의해 증명하였다.
발색성 기질 6-β-[(푸릴아크릴로일)아미도]페니실린산 트리에틸아민 염 (FAP)을 칼바이오켐 (Calbiochem) (라 졸라, 캘리포니아)으로부터 구입하였다. FAP의 가수분해를 베크만 Du640 분광 광도계 (베크만 코울터, 풀러톤, 캘리포니아) 상에서 344nm (델타E=1330M-1cm-1)에서의 흡착의 손실에 의해 모니터하였다. 모든 분석은 25℃에서 0.1M 인산 칼륨 완충제 내에서 pH 6.8로 수행하였다.
CCF2에 있어서, 세팔로스포린 중심은 7-히드록시쿠마린을 플루오레신에 연결시킨다. 손상되지 않은 분자에 있어서, 쿠마린의 여기 (Eex-409nm)는 플루오레신에 대해 FRET를 초래하고, 녹색 광을 방사한다 (Eem-520nm). β-락타마제에 의한 CCF2의 절단은 두 염료들의 공간 분리를 야기하고, FRET를 붕괴하여 쿠마린의 여기가 이제는 청색 형광 (Eex-447nm)을 초래하도록 한다. CCF2는 오로라 바이오사이언시스 코포레이션 (Aurora Biosciences Corporation) (샌디에고, 캘리포니아)에서 구입하였다. FRET 신호의 감소 및 청색 형광의 증가를 형광 다중-웰 플레이트 판독기 사이토플루오르 II (퍼셉티브 바이오시트템즈 (PerSeptive Biosystems), 프라밍암, 매사츄세츠, 미국) 상에서 측정하였다.
결과
스타필로코커스 아우레우스 PC1로부터의 β-락타마제를 포함하는 모든 β-락타마제는 다른 화학 구조의 β-락탐을 가수분해한다. 가수분해의 효율은 효소의 종류 및 기질의 화학 구조에 의존한다. 페니실린이 스타필로코커스 아우레우스 PC1로부터의 β-락타마제에 대한 바람직한 기질로 고려된다.
β-락타마제의 페니실린의 가수분해 능력에 대한 점돌연변이(들)의 영향을 문헌[Zawadzke et al. (1995)]에 기술된 바와 같이 연구하였다. 도 20에 도시된 바와 같이, GST-β-락타마제 PC1 융합 단백질은 효율적으로 FAP를 가수분해하였다. blaZ.E166D, blaZ.N170Q 또는 blaZ.E166D:N170Q blaZ 돌연변이에 의한 FAP의 가수분해는 60분 동안의 공동-배양 후에도 검출할 수 없었다. 그러므로, 이 돌연변이는 blaZ의 현저한 불활성화를 초래하였다.
blaZ.E166D, blaZ.N170Q, 또는 blaZ.E166D:N170Q 돌연변이가 β-락탐을 결합하고, 따라서 다른 관능기가 β-락탐을 통해 이들 단백질에 테더링될 수 있다는 것을 보여주기 위해, 이 돌연변이의 GST 융합체를 형광 페니실린인 보셀린 (BOCELLIN)TMFL (몰레큘러 프로브스사 (Molecular Probes Inc.), 유진, 오레곤)로 인큐베이팅하였다. 단백질을 SDS-PAGE 상에 분리시키고 형광영상기 (히다치, 일본) 상에서 특정 형광발색단에 적합한 Eex/Eem에서 분석하였다. 도 22의 데이타는 모든 blaZ 돌연변이는 보셀린을 결합한다는 것을 보여준다. 더욱이, 후속하여 SDS-PAGE가 이어지는 SDS로 비등하는 것에 의해 결합이 붕괴되지 않기 때문에, blaZ 돌연변이와 형광 기질 사이의 결합은 매우 강했고, 아마도 공유 결합이었다. 또한, 이중 돌연변이 blaZ.E166D:N170Q의 결합 효율 (단백질-결합된 형광발색단의 형광 신호의 강도에 의해 판정됨)은 단일 돌연변이의 결합 효율보다 매우 높았고, blaZ.N170Q의 결합 효율은 blaZ.E166D의 결합 효율보다 높았다. 이들 데이타는 β-락탐의 가수분해에 있어서의 각각의 아미노산의 역할에 대한 현재의 이해와 함께, 추가적인 돌연변이 (예를 들면, 보조 아미노산의 돌연변이)가 관능기의 돌연변이된 단백질에의 테더링의 효율을 향상시킬 수 있음을 보여준다.
β-락타마제의 세팔로스포린의 가수분해 능력에 대한 점돌연변이의 영향을 또한, 문헌[Zlokarnik et al. (1998)]에 기술된 FRET-기재 기질인 CCF2를 사용하여 연구하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, GST-β-락타마제 PC1 융합 단백질은 효율적으로 CCF2 (레인 2)를 가수분해하였다. 단일 점돌연변이 (즉, E166D 또는 N170Q)는 융합 단백질의 CCF2의 가수분해 능력을 감소시켰다 (레인 3 및 4). 두 아미노산 (blaZ.E166D:N170Q 돌연변이, 레인 5)의 대체는 CCF2 가수분해에 대한 훨씬 더 뚜렷한 영향을 가졌다. 그러나, 모든 blaZ 돌연변이는 CCF2를 가수분해할 수 있었다.
따라서, 위치 166 또는 170, 예를 들면, Glu166Asp 또는 Asnl70Gly에서의 아미노산 치환은 돌연변이 β-락타마제가 기질을 트래핑하고 따라서 기질의 관능기를 안정한, 예를 들면, 공유 결합을 통해 돌연변이 β-락타마제에 테더링할 수 있게 한다. 더욱이, H2O 활성화에 대한 보조 효과를 갖는 아미노산의 돌연변이는 테더링 효율을 증가시켰다.
실시예 VII
DhaA . H272F 의 살아있는 세포의 핵 및 세포질에의 테더링
재료 및 방법
GFP-커넥터-DhaA.H272F-NLS3 융합 카세트를, NLS3 (원숭이 바이러스 라지 T-항원으로부터의 핵 위치지정 서열 (NLS)의 세개의 탠덤 반복서열)을 코드화하는 서열을 pCIneo.GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag 벡터의 AgeI/BamHI 부위에 삽입하여 제작하였다. NLS3 펩티드를 코딩하는 두개의 상보적 올리고뉴클레오티드 (5'-CCGGTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTATGAG-3', 센스, 서열 37, 및 5'-GATCCTCATACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCA-3', 안티센스, 서열 38)를 어닐링하였다. 어닐링된 DNA는 5' 말단에 AgeI 부위를 갖고 3' 말단에 BamHI 부위를 가졌다. 어닐링된 DNA를 AgeI/BamHI 부위에서 GFP-커넥터-DhaA.H272F-Flag 제작물내로 서브클로닝하였다. 유전자 융합 제작물의 서열을 DNA 서열결정법으로 확인하었다.
DhaA.H272F-β-어레스틴2 융합 카세트를 GFP2-β-어레스틴2를 코드화하는 패커드의 벡터 (패커드 #6310176-1F1) 내의 pGFP2 코딩 영역을 DhaA.H272F-Flag 코딩 영역으로 대체하여 제작하였다. KpnI 부위를 DhaA의 3' 코딩 영역에 첨가하고 930bp 단편을 pGEX5X-3.DhaA.H272F-Flag 주형으로부터 증폭시키도록 두개의 프라이머 (5'-ATTATGCTGAGTGATATCCC-3'; 서열 39, 및 5'-CTCGGTACCAAGCTCCTTGTAGTCA-3'; 서열 40)를 설계하였다. pGFP2 코딩 영역을 Nhel 및 KpnI 제한 효소로 절제한 후, 코드화하는 DhaA.H272F를 함유하는 930bp 단편을 GFP2-β-어레스틴2 코딩 벡터의 NheI 및 KpnI 부위 내로 삽입하였다. 융합 제작물의 서열을 DNA 서열결정법으로 확인하였다.
일시적으로 GFP-커넥터-DhaA.H272F-NLS3, GFP2-β-어레스틴2 또는 DhaA.H272F-β-어레스틴2 융합 단백질을 발현하는 CHO-K1 또는 3T3 세포를 LT-II 챔버(Nunc) 내에서 30000세포/㎠의 밀도로 평판 배양하였다. 다음날, 배지를 25μM의 TAMRA-C14H2404-Cl을 함유하는 새로운 배지로 대체하였고 세포를 다시 CO2 배양기 내에 60분 동안 위치시켰다. 배양의 마지막에, 기질 배지를 제거하고, 세포를 PBS (pH 7.4; 네 번의 연속적인 세척: 1.0ml/㎠; 각각 5초)로 빠르게 세척하고, 새로운 배지를 세포에 첨가하였다. 세포를 다시 CO2 배양기 내에 위치시켰고 60분 후 세포를 PBS (pH 7.4; 1.0ml/㎠)로 빠르게 세척하였다. 세포의 형광 영상을 GFP 및 TAMRA의 검출에 적합한 필터 세트를 갖는 공초점 현미경 파스칼 (Pascal)-5 (칼 짜이스) 상에 얻었다.
결과
도 24의 영상에 의해 보이는 바와 같이, GFP 및 TAMRA는 GFP-커넥터-DhaA.H272F-NLS3를 발현하고 TAMRA-C14H2404-Cl과 접촉된 세포의 세포핵 내에 공동-위치지정되었다.
도 25의 영상에 의해 보이는 바와 같이, GFP-β-어레스틴2 발현 세포는 전형적인 β-어레스틴2 세포질 위치를 가진다. DhaA.H272F-β-어레스틴2의 SDS-PAGE 겔의 형광스캔은 DhaA 기질을 함유하는 TAMRA의 DhaA.H272F-β-어레스틴2 발현 세포에 대한 강한 결합을 보여주었다.
실시예 VIII
DhaA 촉매 잔기 130의 부위 지정 돌연변이유발
할로알칸 데할로게나제는 탄소-할로겐 결합의 절단에 관해 3-단계 메카니즘을 사용한다. 이 반응은, 크산토박터 오토트로피쿠스 ( Xanthobacter autotrophicus로부터의 할로알칸 데할로게나제 (DhlA)에 대해서는 각각 잔기 Asp124, His289 및 Asp260기이고 (문헌[Franken et al., 1991]), 로도코커스 데할로게나제 효소 (DhaA)에 대해서는 Asp106, His272 및 Glu130인 (문헌[Newman et al., 1999]) 친핵체, 염기 및 산으로 구성된 아미노산 잔기의 트리아드에 의해 촉매 작용을 받는다.
할로알칸 데할로게나제 친핵체 및 염기 잔기와 달리, 촉매 트리아드의 세번째 구성원의 역할은 아직 완전히 이해되지 않았다. 촉매 산은 촉매 His 잔기에 수소 결합되고 이미다졸 고리내 질소의 염기도를 증가시키는 것에 의해 His 잔기의 기능을 보조할 수 있다. DhlA 촉매 산 Asp260의 역할을 연구하기 위해 부위 지정 돌연변이유발을 사용한 문헌[Krooshof et al. (1997)]은 D260N 돌연변이가 촉매적으로 불활성임을 증명하였다. 또한, 돌연변이 단백질은 주로 봉입체에 축적되기 때문에 이 잔기는 명백하게 중요한 구조적 역할을 가졌다. 스피노고모나스 포시모빌리스 ( Sphinogomonas paucimobilis ) (LinB)로부터의 할로알켄 데할로게나제는 γ-헥사클로로시클로헥산 분해에 관여되는 효소이다 (문헌[Nagata et al., 1997]). 문헌[Hynkova et al., (1999)]은 LinB의 추정 촉매 잔기 (Glu-132)를 글루타민 (Q) 잔기로 대체하였다. 그러나, 심지어 매우 높은 기질 농도에서도 E132Q 돌연변이체에 대한 활성은 관찰되지 않았다.
단백질 제조에 있어서 DhaA 촉매 트리아드 산 Glu130의 역할 및 돌연변이 단백질의 형광-표지된 할로알칸 기질을 갖는 공유 알킬-효소 중간체를 형성하는 능력에 대한 역할을 조사하기 위해, 부위 지정 돌연변이유발을 위치 130에서 DhaA 글루탐산 (E) 잔기를 글루타민, 류신 및 알라닌으로 대체하기 위해 사용했다.
재료 및 방법
균주 및 플라스미드. 초적합 이. 콜라이 XL10 골드 (Gold) (스트라타진 (Stratagene); Tetr Δ(mcrA)183Δ(mcrCB - hsdSMR - mrr)173 endAl supE44 thi -1 recAl gyrA96 relA1 lac Hte[ F'proAB lacI q ZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr])를 부위 지정 돌연변이유발 반응의 형질 전환에 있어서 숙주로서 사용했다. 이. 콜라이 균주 JM109 ( e14 -( McrA -) recA1 endA1 gyrA96 thi -1 hsdR17(rK-mK+) supE44 relA1 Δ(lac-proAB) [ F' traD36 proAB lacI q Z Δ M15])를 유전자 발현 및 전 세포 효소 표지 연구에 대한 숙주로서 사용하였다. pGEX5X3DhaA.WT.FLAG라 불리는 플라스미드 pGEX5X3 내로 클로닝되는 GST-DhaA-FLAG 유전자 융합체를 E130 돌연변이유발에 대한 개시 주형으로서 사용하였다. pGEX5X3DhaA.H272F-FLAG라 불리는, DhaA 내의 H272F 돌연변이를 함유하는 돌연변이 플라스미드를 표지 연구에 있어서 양성 대조군으로서 사용하였고 클로닝 벡터 pGEX5X3를 음성 대조군으로서 사용하였다.
DhaA E130 잔기의 부위 지정 돌연변이유발. 돌연변이유발을 위해 사용한 올리고뉴클레오티드의 서열을 아래에 나타내었다. 밑줄 친 뉴클레오티드는 변경된 코돈의 위치를 나타낸다. 올리고뉴클레오티드를 인터그레이티드 DNA 테크놀로지스 (코랄빌, 아이오와)에 의해 100nmole 스케일로 합성하였고 5' 말단의 포스포릴화에 의해 변형하였다.
DhaA E130Q 5'-CAAAGGTATTGCATGTATGCAGTTCATCCGGCCTATCCCG-3' (서열 41)
DhaA E130L 5'-GTCAAAGGTATTGCATGTATGCTGTTCATCCGGCCTATCCCGAC-3' (서열 42)
DhaA E130A 5'-AGGTATTGCATGTATGGCGTTCATCCGGCCTATCCC-3' (서열 43).
부위 지정 돌연변이유발을 퀵채인지 멀티 키트 (QuikChange Multi kit)를 제조자의 지시 (스트라타진, 라졸라, 캘리포니아)에 따라 사용하여 수행하였다. 돌연변이유발 반응을 초적합 이. 콜라이 XL 10 골드 세포 내로 도입하였고 형질전환체를 암피실린 (100㎍/mL)을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 선별하였다. 각각의 형질전환체로부터 단리된 플라스미드 DNA를 처음에는 글루탐산 코돈 (GAAttc)의 대체에 기인한 EcoRI 부위의 손실에 대해 스크리닝하였다. 각각의 반응으로부터 바람직한 코돈 변화를 함유할 것이라 생각되는 클론을 선택하고 DNA 서열 분석 (세크라이트 (SeqWright), 휴스톤, 텍사스)을 하였다. pGEX5X3 벡터 내의 돌연변이의 서열을 확인하는데에 사용된 프라이머는 다음과 같았다: 5'-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG- 3' (서열 44).
DhaA 돌연변이 분석. 세개의 DhaA E130 치환 돌연변이체를 하기 제작물과 비교하였다: 야생형 DhaA, DhaA.H272F, 및 DhaA 음성 대조군 (오직 pGEX5X3 벡터). 각각의 클론의 밤새 배양한 배양물을 암피실린 (100㎍/mL)을 함유하는 2mL의 LB에서 30℃에서의 진탕에 의해 성장하였다. 밤새 배양한 배양물을 50mL의 새로운 LB 배지 및 암피실린 (100㎍/mL)을 함유하는 멸균 플라스크에서 1:50으로 희석하였다. 배양물을 25℃에서의 진탕에 의해 배양하여 불용성 단백질 종의 생성을 최소화하였다. 배양물이 미드-로그 상 (mid-log phase) (OD600=0.6)에 도달하는 경우, IPTG (0.1mM)를 첨가하고 배양물을 25℃에서의 진탕에 의해 추가적인 22시간 동안 인큐베이팅하였다. 전체 세포를 테트라메틸로다민 (TAMRA) 할로알켄 컨쥬게이팅된 기질로 표지하기 위해, 기질이 15μM의 농도로 첨가되기에 앞서 각각의 배양물의 세포 밀도를 OD600=1로 맞추었다. 세포를 4℃에서 약 18시간 동안 서서히 교반하면서 인큐베이팅하였다. 인큐베이팅에 이어서, 각각의 표지 반응으로부터의 20㎕의 세포를 6㎕의 4X SDS 로딩 염료에 첨가하였고 샘플을 4 내지 20% 아크릴아미드 겔 (트리스 글리신) 상에 로딩하기에 앞서 약 3분 동안 비등하였다. 시험관내 표지 연구를 위해, IPTG 유도 배양물의 조용해물 (crude lysate)을, 3mL의 세포 (OD600=1)를 수집하고 생성되는 펠릿을 75㎕ PBS 내에 재현탁시키는 것에 의해 제조하였다. 냉동/해동 단계에 이어서, 1.25mg/mL의 라이소자임을 함유하는 225㎕의 1X 세포 배양물 용해 시약 (프로메가 코포레이션, 매디슨, 위스콘신)을 세포의 용해를 촉진하기 위해 첨가하였다. 각 용해물의 20㎕의 샘플을 25㎕의 1X PBS와 조합하였다. TAMRA 표지된 할로알켄 기질을 25μM의 최종 농도로 첨가하였다. 표지 반응을 실온에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 각 표지 반응의 25㎕ 샘플을 6㎕의 4X SDS 로딩 염료에 첨가하고 샘플을 4 내지 20% 아크릴아미드 겔 (트리스 글리신) 상에 로딩하기에 앞서 약 3분 동안 비등하였다. 겔을 플루오르이미저 (FluorImager) SI 장치 (아머샴 바이오사이언시스, 피스카타웨이, 뉴저지) 세트를 사용하여 영상화하여 570nm에서의 방사를 검출하였다.
조용해물을 15분 동안 14000RPM으로 원심분리하여 세포 비함유 용해물을 생성하였다. 단백질 제조를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 모니터하였다. PVDF 막으로 이동한 단백질을 알칼린 포스파타제 (AP) (시그마, 세인트루이스, 미주리)로 컨쥬게이팅된 항-FLAGR 항체로 인큐베이팅하였다. 블롯을 알칼린 포스파타제 (프로메가 코포레이션, 매디슨, 위스콘신)에 대한 웨스턴 블루 안정화된 기질로 현상하였다.
결과
알킬-효소 중간체의 가수분해에 있어서 DhaA 촉매 산의 역할을 부위 지정 돌연변이유발에 의해 프로빙하였다. DhaA 코돈 E130을 글루타민 (Q), 류신 (L) 또는 알라닌 (A)에 대한 코돈으로 대체하였는데, 이 치환들이 효소의 구조를 거의 붕괴하지 않을 것이기 때문이다. 돌연변이유발에 이어서, 제한 엔도뉴클레아제 스크리닝 및 DNA 서열 분석을 바람직한 코돈 변화를 증명하기 위해 사용하였다. 서열 증명된 DhaA.E130Q, DhaA.E130L 및 DhaA.E130A 클론 (각각 C1, A5 및 A12로 불림)을 추가적인 분석을 위해 선택하였다. E130 돌연변이체를 단백질 발현 및 TAMRA 표지된 할로알칸 기질을 가진 공유 알킬-효소 중간체를 형성하는 능력에 대해 분석하였다. IPTG로 유도한 후 세개의 E130 유전자 변이체를 이. 콜라이 JM109 세포 내에서 과발현시켰다. 조 세포 용해물의 SDS-PAGE 분석은 야생형 및 돌연변이 dhaA 유전자를 발현하는 배양물이 단백질을 대략 동일한 수준으로 축적함을 보여주었다 (도 26; 레인 2, 4, 6, 8, 10, 및 12). 또한, 야생형 및 H272F 제작물에 의해 제조한 DhaA 단백질은 단백질의 양이 원심분리 후에 뚜렷하게 변하지 않았기 때문에 대부분 가용성이었다 (도 26; 레인 3 및 5). 벡터만의 레인 (도 26; 레인 6 및 7)에 존재하는 풍부한 22kDa 단백질 밴드는 GST 단백질을 나타내었다. 그러나, 이들 결과들은 현저하게 불용성인 DhaA 단백질을 축적하는 것으로 나타난 DhaA.E130Q, DhaA.E130L 및 DhaA.E130A 돌연변이체와는 완전히 대조적이다. 이 결과는 원심분리 후 세포 비함유 용해물 (도 26; 레인 9, 11, 및 13)에 존재하는 DhaA 단백질의 양의 현저한 손실이 있었다는 관찰에 근거한다. 그럼에도 불구하고, DhaA와 함께 공동이동하는 단백질 밴드는 원심분리 (+s) 후 각각의 DhaA.E130 돌연변이 레인에서 명백히 관찰되었고 이는 가용성 효소의 존재를 암시한다. 그러므로, 웨스턴 분석은 원심분리에 이어서 DhaA.E130 돌연변이체 내에서 관찰되는 단백질 밴드가 가용성 DhaA 물질을 나타내는지를 결정하는데 사용되었다. 도 27에 도시된 면역블롯을 통해 각각의 DhaA.E130 돌연변이 세포 비함유 용해물 (레인 9, 11, 및 13) 내에 가용성 DhaA 단백질이 존재함을 확인하였다.
또한, DhaA.E130 돌연변이의 알킬-효소 공유 중간체를 생성하는 능력에 대해 조사하였다. 다양한 제작물의 IPTG 유도된 배양물로부터 제조한 조용해물을 TAMRA 표지된 기질의 존재하에 인큐베이팅하였다. 도 28은 DhaA.H272F 돌연변이 (레인 3)가 이 중간체를 제조하는데 있어서 매우 효율적임을 보여주었다. WT DhaA 또는 음성 대조 용해물로는 그런 생성물을 검출할 수 없었다. 초기 검사 때에는, DhaA.E130 돌연변이체는 검출 가능한 수준의 공유 생성물을 생성할 수 없어 보였다. 그러나, 형광영상을 자세하게 조사하자, 매우 희미한 밴드가 관찰되었고 이는 잠재적으로 미세한 양의 공유 중간체 (도 28; 레인 5 내지 7)를 나타낼 수 있었다. 이 결과에 근거해서, 전체 세포의 공유, 형광 알킬-효소 중간체를 생성하는 능력을 조사하였다.
도 29는 각각의 DhaA.E130 돌연변이를 양성 (DhaA.H272F 돌연변이) 및 음성 (DhaA-) 대조군과 비교하는 생체 내 표지 시험의 결과를 도시한다. 기대했던 바와 같이, DhaA.H272F 돌연변이는 GST-DhaA-Flag 융합체 (도 29, 레인 3)에 대해 예측된 분자량 근처의 단일 형광 밴드에 의해 증명된 바와 같이 공유 알킬-효소 중간체를 생성할 수 있었다. 시험관내 표지 결과로 이전에 관찰된 바와 같이, 야생형 또는 음성 대조군 배양물 (도 29, 레인 2 및 3)로는 그런 생성물을 검출할 수 없었지만 정확한 위치로 이동하는 매우 희미한 형광 밴드를 DhaA.E130 치환된 돌연변이 세개 모두(도 29, 레인 5 내지 7)로 다시 검출하였다. 이 결과는 DhaA.E130Q, L 및 A 돌연변이가 공유 알킬-효소 중간체를 트래핑하는 능력을 가질 가능성을 나타낸다. 그러나, 이 반응의 효율은 DhaA.H272F 돌연변이 효소에 비해 극적으로 감소된 속도로 진행하는 것으로 보인다.
이 돌연변이유발 연구의 결과는 DhaA 촉매 산 잔기 DhaA.E130이 효소의 정확한 폴딩에 있어 중요한 구조적 역할을 한다는 것을 제안한다. DhaA 단백질은 DhaA.E130Q, DhaA.E130L 및 DhaA.E130A 조용해물 내에 대부분 불용성 단백질 복합체가 존재함에 의해 증명된 바와 같이 이 아미노산 위치에서의 치환에 명백히 민감하였다. 그럼에도, SDS-PAGE 및 면역블롯 분석에 근거하여, 현저한 양의 가용성 DhaA 단백질이 세 DhaA.E130 돌연변이 모두의 세포 비함유 용해물 내에서 검출되었다.
실시예 IX
살아있는 포유동물 세포 내에서 발현된 DhaA . H272F -Flag 및 DhaA . H272F -Flag 레닐라 루시퍼라제 융합 단백질의 포획
재료 및 방법
CHO-K1 세포를 24 웰 플레이트 (랩시스템) 내에서 30000세포/㎠의 밀도로 평판 배양하였고 pCIneo.DhaA.WT-Flag 또는 pCIneo.hRLuc-커넥터-DhaA.H272F-Flag 벡터로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후, 배지를 25μM 바이오틴-C18H3204-Cl 및 0.1% DMSO를 함유하는, 또는 0.1% DMSO를 단독으로 함유하는 새로운 배지로 대체하였고, 세포를 CO2 배양기 내에서 60분 동안 위치시켰다. 배양의 마지막에, 기질 배지를 제거하고, 세포를 PBS (pH 7.4; 네 번의 연속적인 세척: 1.0ml/㎠; 각각 5초)로 빠르게 세척하고, 새로운 배지를 세포에 첨가하였다. 일부 실험에 있어서는, 배지를 변경하지 않았다. 세포를 다시 CO2 배양기 내에 위치시켰다.
60분 후, 배지를 제거하고, 세포를 프로테아제 억제제 (시그마 #P8340)를 함유하는 PBS (pH=7.4, 200㎕/웰, RT) 내에서 수집하였다. 세포를 바늘 (IM1 23GTW)을 통한 분쇄에 의해 용해시켰다. 그 후, 세포 용해물을 마그나바인드 (MagnaBind) 스트렙타비딘 피복된 비드 (피어스 #21344)로 제조자의 프로토콜에 따라 인큐베이팅하였다. 간단히 말해서, 세포 용해물을 회전 접시를 사용해서 실온 (RT)에서 60분 동안 비드와 인큐베이팅하였다. 결합하지 않은 재료를 수집하고; 비드를 PBS (3×500㎕, pH=7.4, RT)로 세척하였고 SDS-샘플 완충제 (SDS-PAGE 분석용) 또는 PBS (pH=7.4, R.Luc 활성 결정용) 내에 재현탁하였다. 단백질을 SDS-PAGE 상에 분리시켰고, 니트로셀룰로오스 막으로 전달하였고, 항-Flag-Ab 또는 항-R.Luc-Ab로 분석하였고, 결합 항체를 증강된 화학발광 (ECL) 시스템 (파마샤 (Pharmacia)-아머샴)에 의해 검출시켰다. 비드에 결합한 hR.Luc의 활성을 프로메가의 "레닐라 루시퍼라제 분석 시스템"을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 결정하였다.
결과
살아있는 세포 내에 발현된 단백질의 포획은 다양한 분석 방법/기술로 그 단백질의 분석을 가능하게 해준다. 다수의 포획 도구를, 그 도구들이 고도로 특이화된 항체를 생성하거나 또는 목적하는 단백질을 특정 태그 펩티드/단백질로 유전적으로 융합하는 것을 요구하더라도, 이용할 수 있다 (문헌[Jarvik and Telmer, 1998]; 문헌[Ragaut et al., 1999]). 그러나, 그 태그는 살아있는 세포의 영상화에 대한 제한된 용도를 가질 뿐이다. DhaA.H272F 및 DhaA.H272F에 융합된 관능성 단백질을 포획하기 위해, SA-피복된 비드를 사용하였다 (문헌[Savage et al., 1992]).
바이오틴-C18H3204-Cl은 야생형 DhaA에 의해 효율적으로 가수분해되었고, 생체 내 및 시험관내에서 DhaA.H272F 및 DhaA.H272F 융합 단백질에 공유결합되었다. 더욱이, 결합을 이. 콜라이 및 포유동물 세포 모두에서 관찰하였다. 대조군 실험은 CHO-K1 세포 내에서 발현된 DhaA.H272F-Flag 단백질의 약 80%가 60분의 처리 후에 표지되었음을 나타내었다.
일시적으로 DhaA.H272F-Flag를 발현하는 CHO-K1 세포를 바이오틴-C18H3204-Cl로 처리하였다. 바이오틴-C18H3204-Cl 처리된 세포를 용해시키고 세포 용해물을 SA-피복된 비드로 인큐베이팅하였다. DhaA.H272F의 비드에의 결합을 항-FlagR 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 도 30D에 도시된 바와 같이, DhaA.H272F-Flag 포획은 바이오틴-C18H3204-Cl 처리의 부재하에서는 검출되지 않았다. 동시에, 세포를 바이오틴-C18H3204-Cl로 처리할 경우, 세포 내에서 발현된 DhaA.H272F-Flag의 50% 초과가 SA-피복된 비드 상에 포획되었다.
DhaA.H272F-Flag에 융합된 기능적으로 활성인 단백질의 포획을 보여주기 위해, 세포를 hR.Luc-커넥터-DhaA.H272F-Flag를 코드화하는 벡터로 트랜스펙션시켰고, 비드 상에 포획된 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 30C에 도시된 바와 같이, 현저한 루시퍼라제 활성이 바이오틴-C18H3204-Cl 처리된 세포의 용해물로 인큐베이팅한 비드 상에서 검출되었다. 동시에, 바이오틴-C18H3204-Cl로 처리하지 않은 세포로부터의 용해물로 인큐베이팅한 비드 상에서는 루시퍼라제 활성이 검출되지 않았다. 더욱이, 자유 바이오틴-C18H3204-Cl을 세척하여 제거하기 않을 경우, 바이오틴-C18H3204-Cl로 처리한 세포로부터의 용해물로 인큐베이팅한 비드 상에서는 hR.Luc 활성이 검출되지 않았다.
이와 같이, DhaA.H272F에 융합된 기능적으로 활성인 단백질 (hR.Luc)이 바이오틴-Cl8H3204-Cl 및 SA-코팅된 비드를 사용해 효과적으로 포획될 수 있음을 데이터는 보여준다. 상기 포획은 바이오틴-의존성이고, 과량의 바이오틴-Cl8H3204-Cl에 의해 경쟁제거될 수 있다. 비드의 hR.Luc 활성에 대한 유의한 억제 효과가 관찰되므로 (데이터 미기재), SDS-PAGE 및 항-R.Luc 항체로의 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 hR.Luc-커넥터-DhaA.H272F-Flag 융합 단백질의 포획 효능을 평가했다. 도 30D에서 처럼, 50 % 초과의 hR.Luc-커넥터-DhaA.H272F-Flag 융합 단백질이 바이오틴-의존적 방식으로 포획될 수 있다. 이는 DhaA.H272F-Flag의 포획 효능과 양호하게 일치한다 (도 30A 참조).
실시예 X
최적화된 DhaA Gene
DhaA 일반 서열 고안
인간 코돈 편향, 낮은 CG 함량, 선택된 제한 효소 인지 부위 및 감소된 수의 전사 조절 부위를 가진 합성 DhaA.H272F 유전자를 제조했다. 신호 서열이 없는 야생형 DhaA 유전자 (서열 51)로 코딩된 아미노산 서열, 및(또는) DhaA.H272F에 대해, 코돈-최적화 DhaA 유전자 및 플랭킹 서열의 아미노산 서열은 하기를 포함했다: 1) 개선된 코작 (Kozak) 서열 (GCCACCATGG; 서열 45) 및 BamHI 부위의 도입으로 인해 위치 2에 삽입된 Gly (따라서, Gly 삽입을 갖는 DhaA 돌연변이 내 H272F 활성 부위 돌연변이는 위치 273에서 일어남); 2) Gly 삽입을 갖는 DhaA 돌연변이 내 위치 293에서의 SmaI/XmaI/AvaI 부위 도입으로 인한 A292G 치환; 3) NaeI (NgoMIV) 부위 도입으로 인한 C-말단에서의 Ala-Gly 첨가; 4) 5' 플랭킹 서열 내 NheI, PvuII, EcoRV 및 NcoI 부위의 첨가; 5) 말단에서의 검색 알고리듬 에러 제거 및 ORF1 (즉, NNN-NGC-TAG-CCA-GCT-GGC-GAT-ATC-GCC-ACC-ATG-GGA; 서열 46)을 유지하기 위한 5' 플랭킹 서열 내 NNNN 첨가; 6) 말단에서의 검색 알고리듬 에러 제거를 위한 NotI 부위 3' 말단에서의 NNNN 첨가, ORF Leu-Ile-Lys를 갖는 PacI 부위, 및 두개의 정지 코돈(그 중 하나 이상이 TAA (즉, TAATAGTTAATTAAGTAAGCGGCCGCNNNN; 서열 47)).
서열 51은 하기 서열을 갖는다:
코돈 선택
코돈 사용 데이터를 코돈 사용 데이터베이스(Codon Usage Database(http: //www.kazusa.or.jp/codon/))에서 얻었는데, 이는 2002년 8월 15일자의 진뱅크 리릴스 (GenBank Release) 131.0에 기초한다(Nakamura et al., 2000). 코돈 사용 표를 하기에 대해 다운로딩했다: HS: 호모 사피엔스 [gbpri] 50,031 CDS's (21,930,294 코돈); MM: 무스 무스쿨러스(Mus musculus) [gbrod] 23,113 CDS's (10,345,401 코돈); EC: 에쉐르키아 콜라이 (Escherichia coli) [gbbct] 11,985 CDS's (3,688,954 코돈); 및 EC K12: 에쉐르키아 콜라이 K12 [gbbct] 4,291 CDS's (1,363,716 코돈). HS 및 MM를 비교하니 근접히 유사한 것으로 발견되므로, HS 표를 사용했다. EC 및 EC K12를 비교하니 근접히 유사한 것으로 발견되므로, EC K12 표를 사용했다.
코돈을 선택하는 전체적 전략은 저-사용 이. 콜라이 코돈을 피하면서 포유동물 세포 내 최적 발현을 위한 코돈 사용을 적응하는 것이었다. 하나의 "최상" 코돈을 각 아미노산에 대해 선택하고 사용하여 바람직한 단백질 서열을 역-번역하여 개시 유전자 서열을 생성했다. 또다른 선택 기준은 CG 디뉴클레오티드를 함유하는 고빈도 사용 HS 코돈을 피하는 것인데, CG의 메틸화는 전사 유전자 조절과 관련이 있고 안정한 세포주의 유전자 발현의 하향-조절을 일으키기 때문이다. 따라서, CG (8개의 인간 코돈) 및 TA (4개의 인간 코돈, Tyr 코돈 제외)를 함유하는 모든 코돈을 제외했다. C로 끝나는 코돈도 또한 피했는데, 이는 그가 하류 코돈과 CG를 형성할 수 있기 때문이다. 잔존 코돈 중에서, HS 내에서 가장 많이 사용되는 코돈을, 그보다 약간 적게 사용되는 코돈이 이. 콜라이에서 상당히 높게 사용되지 않는 한, 선택했다.
DhaA 유전자 서열
개시 DhaA 서열을 생성하기 위해, 벡터 NTI 8.0(Informax) 내 코돈 사용 표를 사용했다. DhaA.v2.1 단백질 서열 (서열 48)을 역-번역하여 개시 유전자 서열인 hDhaA.v2.1-0을 생성하고, 그 후 상기한 바와 같이 플랭킹 영역을 첨가하여 hDhaA.v2.1-OF (서열 49)를 생성했다.
추가의 최적화
서열 모티브의 동정 및 제거를 위해 사용된 프로그램 및 데이터베이스는 지노매틱스 소프트웨어 GmbH(Genomatix Software GmbH (독일 뭔헨 소재, http: //www.genomatix.de)): GEMS 런쳐 리릴스(Launcher Release) 3.5.1 (2003년 4월), 매트인스펙터 프로페셔널 리릴스 (MatInspector professional Release) 6.1 (2003년 1월), 매트릭스 패밀리 라이브러리 (Matrix Family Library Ver 3.1.1) (2003년 4월, 128개 패밀리 내의 318개 척추동물 매트릭스 포함), 모델인스펙터 프로페셔널 리릴스 4.8 (ModelInspector professional Release 4.8 (2002년 10월), 모델 라이브러리 (Model Library Ver 3.1) (2003년 3월, 226 모듈), 시퀀스셰이퍼 툴(S equenceShaper tool), 및 유저 디파인드 매트릭스 (User Defined Matrices)에서 유래했다. 개시 유전자 서열로부터 제거될 서열 모티브는 하기의 제한 효소 인지 서열이었다 (우선되는 것부터 순서대로); 프로모터 모듈을 포함하는 전사 인자 결합 서열 (즉, 정의된 배향의 2개의 전사 인자 결합 부위)(디폴트 스코어 이상), 및 척추동물 전사 인자 결합 서열(최소 스코어=0.75/매트릭스=최적화); 코작 서열, 스플라이스 공여자/수용자 서열, 폴리A 첨가 서열을 비롯한 진핵동물 전사 조절 부위; 및 이. 콜라이 프로모터 및 이. 콜라이 RBS (Met 코돈의 상류 20 bp 미만 내일 때)를 비롯한 원핵동물 전사 조절 부위.
유저 디파인드 매트릭스
하부군 DhaA
포멧: 매트릭스 명칭 (중심 유사성 역치/매트릭스 유사성 역치):
하부군 DhaA -EC
이. 콜라이 특이 서열 없음:
서열 모티브의 제거 전략
상기 특정된 바람직하지 않은 서열 모티브를, 특정 단백질 및 플랭킹 서열의 보유를 허용하는 별법적 코돈을 선택하여 개시 유전자 서열로부터 제거했다. 별법적 코돈을 전체 코돈 선택 전략에 최대한 맞도록 선택했다.
A. 일반 단계
- 매트릭스 패밀리 하부군 "DhaA" 또는 "DhaA-EC"를 사용해 매트인스펙터로, 및 디폴트 설정을 사용해 모델인스펙터로 바람직하지 않은 서열 매치를 동정하는 단계.
- 시퀀스셰이퍼로 가능한 대체 코돈을 동정하여 바람직하지 않은 서열 매치를 제거하는 단계 (ORF 유지).
- 합성 유전자 서열의 새로운 버젼으로 모든 변화를 도입하고 매트인스펙터 및 모델인스펙터로 재분석하는 단계.
B. 특정 단계
- 하부군 "DhaA-EC" 및 시퀀스셰이퍼 디폴트 잔존 역치 (0.70/Opt-0.20)를 사용한 바람직하지 않은 서열 매치를 제거하는 단계.
- 상기 접근법으로 제거될 수 없는 서열 매치를 위해, 보다 낮은 시퀀스셰이퍼 잔존 역치 (예를 들면, 0.70/Opt-0.05)를 사용하는 단계.
- 그래도 제거될 수 없는 서열 매치를 위해, 수동적으로 선택된 대체 코돈의 상이한 조합을 시도하는 단계 (특히 3개 초과의 염기 변화가 필요한 경우). 새로운 서열 매치가 도입된다면, 상기 단계를 사용해 그를 제거하는 단계 (상이한 개시 서열은 종종 상이한 제거 해결책을 준다).
- 문제되는 이. 콜라이 서열 모티브가 도입되었는지 검사하기 위해 하부군 "DhaA"를 사용하고, 그렇다면 이. 콜라이 서열이 아닌 것에 대해 상기한 동종 접근법을 사용해 그를 제거하는 단계.
플랭킹 (비-오픈 리딩 프레임) 서열에 대해 동종의 전략을 사용한다.
C. 추정 CpG 아일랜드의 동정 및 제거
사용된 소프트웨어: EMBOSS CpGPlot/CpGReport http://www.ebi.ac. uk/emboss/cpgplot/index.html) (Gardiner-Garden et al., 1987).
파라미터: 디폴트 (변형됨): 윈도우: 100; 스텝: 1; Obs/Exp: 0.6; MinPC: 50; 길이: 100; 리버스(Reverse): 없음; 상보체: 없음. 바람직하지 않은 서열 모티브의 제거 후, 유전자 서열을 상기 소프트웨어를 사용해 100개 이상의 염기의 추정 CpG 아일랜드에 대해 검사했다. CpG 아일랜드가 동정되면, 특정 단백질 및 플랭킹 서열의 보유를 허용하나 새로운 바람직하지 않은 서열 모티브를 도입하지 않는 별법적 코돈을 일부 CG 디뉴클레오티드 위치에서 선택하여 그를 제거했다.
D. 제한 부위
독특한 MunI/MfeI (C'AATTG) 부위를 도입하여 C-말단 근처의 추정 미리스틸화 부위 (GSEIAR)를 포함하는 C-말단 34개 아미노산을 제거했다. 또다른 독특한 부위인 NruI 부위를 도입하여 C-말단 80-100개 아미노산을 제거했다.
hDhaA.v2.1-6F (최종, 플랭킹 서열 가짐)
상이한 DhaA 유전자 (플랭킹 서열 없음)의 핵산 서열 동일성의 비교가 표 III에 보여진다.
상이한 DhaA 유전자 (플랭킹 서열 없음)의 GC 함량이 표 IV에 제공된다.
상이한 DhaA 유전자 내 발견된 척추동물 전사 인자 결합 서열 패밀리 (중심 유사성: 0.75/매트릭스 유사성: opt) 및 프로모터 모듈 (디폴트 파라미터: 최적화된 역치 또는 최대 스코어의 80%)은 표 V에 보여진다.
주석: 3' 플랭킹 영역 내 5' 결합 서열 매치를 제거하기 위한 hDhaA.v.2.1-OF 및 hDhaA.v2.1-6F 내 EcoRV 이전의 3 bp 삽입.
5' 플랭킹 영역 내 포함된 hDhaA.v2.1-6F의 잔존 전사 인자 결합 서열 매치: 패밀리: V$ NEUR (NeuroD, Beta2, HLH 도메인), 최상 매치: NEUROD1에 대한 DNA 결합 부위 (BETA-2/E47 이량체) (MEDLINE 9108015); 오픈 리딩 프레임 내 포함된 hDhaA.v2.1-6F의 잔존 전사 인자 결합 서열 매치: 패밀리: V$ GATA (GATA 결합 인자), 최상 매치: GATA-결합 인자 1 (MEDLINE 94085373), 패밀리: V$ PCAT (프로모터 CCAAT 결합 인자), 최상 매치: 세포 및 바이러스 CCAAT 박스, (MEDLINE 90230299), 패밀리: V$ RXRF(RXR 이종이량체 결합 부위), 최상 매치: 화르네소이드(Farnesoid) X-활성화 수용체 (RXR/FXR 이량체) (MEDLINE 11792716); 및 3' 플랭킹 영역 내 포함된 hDhaA.v2.1-6F의 잔존 전사 인자 결합 서열 매치: 패밀리: V$ HNF1 (간 핵내 인자 1), 최상 매치: 간 핵내 인자 1 (MEDLINE 95194383), 패밀리: V$ BRNF (Brn POU 도메인 인자), 최상 매치: POU 전사 인자 Brn-3 (MEDLINE 9111308), 패밀리: V$RBIT (B-세포 IgH 전사의 조절자), 최상 매치: 브라이트(Bright), IgH 전사의 B 세포 조절자 (MEDLINE 96127903), 패밀리: V$ CREB (Camp-반응성 요소 결합 단백질), 최상 매치: E4BP4, bZIP 도메인, 전사 리프레서 (MEDLINE 92318924), 패밀리: V$HOMS (호메오도메인 서브패밀리 S8), 최상 매치: S8 유형 호메오도메인에 대한 결합 부위 (MEDLINE 94051593), 패밀리: V$ NKXH (NKX/DLX-호메오도메인 부위), 최상 매치: DLX-1, -2, 및 -5 결합 부위 (MEDLINE 11798166), 패밀리: V$ TBPF (Tata- 결합 단백질 인자), 최상 매치: 양서류 C-형 LTR TATA 박스 (MEDLINE 6322120), 및 패밀리: V$ NKXH (NKX/DLX-호메오도메인 부위), 최상 매치: 전립선-특이 호메오도메인 단백질 NKX3.1 (MEDLINE 10871372).
오픈 리딩 프레임 내 hDhaA.v2.1-6F에 잔존하는 기타 서열 모티브는 단백질 서열 (Lys-Gly: AA(A/G)-GGN)을 유지하기 위해 제거되지 않은 Met 코돈의 11 b 상류의 이. 콜라이 RBS (AAGG), 및 전사 인자 결합 부위 서열의 도입으로 인해 제거되지 않은 BsmAI 제한효소 부위 (GTCTC)이었다.
DhaA 유전자 각각에 대한 코딩 서열의 추정 CpG 아일랜드를 디폴트 파라미터로 EMBOSS CpGPlot/CpGReport에서처럼 분석하고, 그 결과를 표 VI에 보여준다.
참고문헌
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모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 참고문헌으로 본원에 도입된다. 본 발명이 상기 명세서에서 그의 바람직한 소정의 실시태양에 대해 기술되었고, 많은 상세한 기술이 예시의 목적으로 제시되었으나, 본 발명이 추가의 태양에 적용되고 본원에 기술된 소정의 상세한 기술이 본 발명의 기본 원리에서 상당히 벗어나지 않으면서 변할 수 있음이 당업자에 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Wood, Keith V. Los, Georgyi V. Bulleit, Robert F. Klaubert, Dieter McDougall, Mark Zimprich, Chad Promega Corporation <120> Covalent Tethering of Functional Groups to Proteins <130> 341.020WO1 <150> US 60/444,094 <151> 2003-01-31 <150> US 60/474,659 <151> 2003-05-30 <160> 64 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 1 gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a 31 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 2 gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a 31 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 3 ccgggattgt tctacctcca ggaagac 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 4 ccgggattgg cctacctcca ggaagac 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 5 ccgggattgc agtacctcca ggaagac 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 6 ccgggattgg gctacctcca ggaagac 27 <210> 7 <211> 37 <212> DNA 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synthetic oligonucleotide <400> 30 accggttccg gatcaagctt gcggtaccgc gggccctcta gagcc 45 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic peptide <400> 31 Thr Gly Ser Gly Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Gly Pro Ser Arg Ala 1 5 10 15 <210> 32 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 32 tccggatcaa gcttgcggta ccgcgggccc tctagagccg tcgacgccgc c 51 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic peptide <400> 33 Ser Gly Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Gly Pro Ser Arg Ala Val Asp Ala 1 5 10 15 Ala <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 34 cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccaccagtgg ggc 43 <210> 35 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 35 tgagccccac tggtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc 42 <210> 36 <211> 1053 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 36 agcttactat gccattatta ataacttagc catttcaaca ccttctttca aatatttata 60 ataaactatt gacaccgata ttacaattgt aatattattg atttataaaa attacaactg 120 taatatcgga gggtttattt tgaaaaagtt aatattttta attgtaattg ctttagtttt 180 aagtgcatgt aattcaaaca gttcacatgc caaagagtta aatgatttag aaaaaaaata 240 taatgctcat attggtgttt atgctttaga tactaaaagt ggtaaggaag taaaatttaa 300 ttcagataag agatttgcct atgcttcaac ttcaaaagcg ataaatagtg ctattttgtt 360 agaacaagta ccttataata agttaaataa aaaagtacat attaacaaag atgatatagt 420 tgcttattct cctattttag aaaaatatgt aggaaaagat atcactttaa aagcacttat 480 tgaggcttca atgacatata gtgataatac agcaaacaat aaaattataa aagaaatcgg 540 tggaatcaaa aaagttaaac aacgtctaaa agaactagga gataaagtaa caaatccagt 600 tagatatgag atagaattaa attactattc accaaagagc aaaaaagata cttcaacacc 660 tgctgccttc ggtaagaccc ttaataaact tatcgccaat ggaaaattaa gcaaagaaaa 720 caaaaaattc ttacttgatt taatgttaaa taataaaagc ggagatactt taattaaaga 780 cggtgttcca aaagactata aggttgctga taaaagtggt caagcaataa catatgcttc 840 tagaaatgat gttgcttttg tttatcctaa gggccaatct gaacctattg ttttagtcat 900 ttttacgaat aaagacaata aaagtgataa gccaaatgat aagttgataa gtgaaaccgc 960 caagagtgta atgaaggaat tttaatattc taaatgcata ataaatactg ataacatctt 1020 atattttgta ttatattttg tattatcgtt gac 1053 <210> 37 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 37 ccggtgatcc aaaaaagaag agaaaggtag atccaaaaaa gaagagaaag gtagatccaa 60 aaaagaagag aaaggtatga g 81 <210> 38 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 38 gatcctcata cctttctctt cttttttgga tctacctttc tcttcttttt tggatctacc 60 tttctcttct tttttggatc a 81 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 39 attatgctga gtgatatccc 20 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 40 ctcggtacca agctccttgt agtca 25 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 41 caaaggtatt gcatgtatgc agttcatccg gcctatcccg 40 <210> 42 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 42 gtcaaaggta ttgcatgtat gctgttcatc cggcctatcc cgac 44 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 43 aggtattgca tgtatggcgt tcatccggcc tatccc 36 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 44 gggctggcaa gccacgtttg gtg 23 <210> 45 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic improved Kozak sequence <400> 45 gccaccatgg 10 <210> 46 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 1-36 <223> n = A, T, G, or C <400> 46 nnnngctagc cagctggcga tatcgccacc atggga 36 <210> 47 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 1-34 <223> n = A, T, G, or C <400> 47 taatagttaa ttaagtaagc ggccgcnnnn 30 <210> 48 <211> 296 <212> PRT 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Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn 195 200 205 Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu 210 215 220 Ala Tyr Met Asn Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe 225 230 235 240 Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu 245 250 255 Ala Glu Ser Leu Pro Asn Cys Lys Thr Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu 260 265 270 Phe Tyr Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala 275 280 285 Arg Trp Leu Pro Gly Leu Ala Gly 290 295 <210> 49 <211> 948 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 1-948 <223> n = A, C, T, or G <400> 49 nnnngctagc cagctggcga tatcgccacc atgggatccg agattgggac agggtttcct 60 tttgatcctc attatgtgga ggtgctgggg gagagaatgc attatgtgga tgtggggcct 120 agagatggga cacctgtgct gtttctgcat gggaatccta catcttctta tctgtggaga 180 aatattattc ctcatgtggc tccttctcat agatgtattg ctcctgatct gattgggatg 240 gggaagtctg ataagcctga tctggattat ttttttgatg atcatgtgag atatctggat 300 gcttttattg aggctctggg gctggaggag gtggtgctgg tgattcatga ttgggggtct 360 gctctggggt ttcattgggc taagagaaat cctgagagag tgaaggggat tgcttgtatg 420 gagtttatta gacctattcc tacatgggat gagtggcctg agtttgctag agagacattt 480 caggctttta gaacagctga tgtggggaga gagctgatta ttgatcagaa tgcttttatt 540 gagggggctc tgcctaagtg tgtggtgaga cctctgacag aggtggagat ggatcattat 600 agagagcctt ttctgaagcc tgtggataga gagcctctgt ggagatttcc taatgagctg 660 cctattgctg gggagcctgc taatattgtg gctctggtgg aggcttatat gaattggctg 720 catcagtctc ctgtgcctaa gctgctgttt tgggggacac ctggggtgct gattcctcct 780 gctgaggctg ctagactggc tgagtctctg cctaattgta agacagtgga tattgggcct 840 gggctgtttt atctgcagga ggataatcct gatctgattg ggtctgagat tgctagatgg 900 ctgcccgggc tggccggcta atagttaatt aagtaagcgg ccgcnnnn 948 <210> 50 <211> 951 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> 1-951 <223> n = A, T, G, or C <400> 50 nnnngctagc cagctggcgc ggatatcgcc accatgggat ccgagattgg gacagggttc 60 ccttttgatc 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ctaatagtta attaagtagg cggccgcnnn n 951 <210> 51 <211> 882 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <400> 51 atgtcagaaa tcggtacagg cttccccttc gacccccatt atgtggaagt cctgggcgag 60 cgtatgcact acgtcgatgt tggaccgcgg gatggcacgc ctgtgctgtt cctgcacggt 120 aacccgacct cgtcctacct gtggcgcaac atcatcccgc atgtagcacc gagtcatcgg 180 tgcattgctc cagacctgat cgggatggga aaatcggaca aaccagacct cgattatttc 240 ttcgacgacc acgtccgcta cctcgatgcc ttcatcgaag ccttgggttt ggaagaggtc 300 gtcctggtca tccacgactg gggctcagct ctcggattcc actgggccaa gcgcaatccg 360 gaacgggtca aaggtattgc atgtatggaa ttcatccggc ctatcccgac gtgggacgaa 420 tggccggaat tcgcccgtga gaccttccag gccttccgga ccgccgacgt cggccgagag 480 ttgatcatcg atcagaacgc tttcatcgag ggtgcgctcc cgaaatgcgt cgtccgtccg 540 cttacggagg tcgagatgga ccactatcgc gagcccttcc tcaagcctgt tgaccgagag 600 ccactgtggc gattccccaa cgagctgccc atcgccggtg agcccgcgaa catcgtcgcg 660 ctcgtcgagg catacatgaa ctggctgcac cagtcacctg tcccgaagtt gttgttctgg 720 ggcacacccg gcgtactgat ccccccggcc gaagccgcga gacttgccga aagcctcccc 780 aactgcaaga cagtggacat cggcccggga ttgcactacc tccaggaaga caacccggac 840 cttatcggca gtgagatcgc gcgctggctc cccgcactct ag 882 <210> 52 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 52 cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccacgaatgg ggc 43 <210> 53 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 53 tgagccccat tcgtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc 42 <210> 54 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 54 cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccactactgg ggc 43 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide <400> 55 tgagccccag tagtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc 42 <210> 56 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 56 ccagttagat atgacataga attaaattac tattcacc 38 <210> 57 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 57 ggtgaatagt aatttaattc tatgtcatat ctaactgg 38 <210> 58 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 58 ccagttagat atgagataga attacagtac tattcacc 38 <210> 59 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 59 ggtgaatagt actgtaattc tatctcatat ctaactgg 38 <210> 60 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 60 ccagttagat atgacataga attacagtac tattcacc 38 <210> 61 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 61 ggtgaatagt actgtaattc tatgtcatat ctaactgg 38 <210> 62 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 62 caacaggtcg acgccgccat gaaagagtta aatgatttag 40 <210> 63 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic primer <400> 63 gtagtcaccg gtaaattcct tcattacact cttggc 36 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic peptide <400> 64 Asp Glu Val Asp 1

Claims (109)

  1. 하기 화학식 (1)의 화합물:
    R-링커-A-X (I)
    식 중 R은 하나 이상의 관능기이고, 링커는 C, N, S, 또는 O를 포함한 다원자 직쇄 또는 분지쇄이며, A-X는 데할로게나제의 기질이고, X는 할로겐이다.
  2. 제1항에 있어서, 로도코커스 (Rhodococcus) 데할로게나제의 기질인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 X가 Cl 또는 Br인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 A가 (CH2)n이고 n = 4 내지 10인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 링커가 (CH2CH20)y를 포함하고 y=2 내지 8인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 링커가 R과 A를 분리시키는 12개 이상의 원자인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 링커가 3 내지 30개의 원자를 포함하는 것인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 링커가 11 내지 30개의 원자를 갖는 것인 화합물.
  9. 제1항에 있어서,
    인 화합물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 관능기가 아미노산, 단백질, 당단백질, 핵산 분자, 약물, 지질, 바이오틴 또는 고형 지지체인 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 관능기가 광학 검출성 분자인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 관능기가 형광발색단인 화합물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 R이
    중의 하나이고 식 중 Rl이 C1-C8인 화합물.
  14. 제1항에 있어서, 두개의 관능기를 포함하는 화합물.
  15. 제1항에 있어서, 하나 이상의 관능기가 Ca2 +에 결합하거나, K+에 결합하거나, Na+에 결합하거나, pH 민감성이거나, 방사성핵종이거나, 전자 불투과성이거나, 발색단이거나, MRI 조영제이거나, NO의 존재하에 형광성이거나 반응성 산소에 민감한 것인 화합물.
  16. 상응 야생형 데할로게나제에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 데할로게나제이며, 상기 돌연변이 데할로게나제가 하나 이상의 관능기를 포함하는 데할로게나제 기질과 결합을 형성하고, 상기 결합이 상응 야생형 데할로게나제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정하며, 돌연변이 데할로게나제 내의 하나 이상의 아미노산 치환이, 상응 야생형 데할로게나제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물분자의 활성화와 관련이 된 상응 야생형 데할로게나제 내의 아미노산 잔기에서의 치환, 또는 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 상응 야생형 데할로게나제 내의 아미노산 잔기에서의 치환이고, 물분자의 활성화와 관련이 된 잔기에서의 치환된 아미노산이 글루타민 또는 아스파라긴이 아닌 돌연변이 데할로게나제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 치환이 물분자를 활성화하는 야생형 데할로게나제 내의 잔기에서 일어나는 것인 돌연변이 데할로게나제.
  18. 제17항에 있어서, 물분자를 활성화하는 야생형 데할로게나제 내의 상기 잔기가 히스티딘인 돌연변이 데할로게나제.
  19. 제16항에 있어서, 상기 치환이 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 데할로게나제 내의 잔기에서 일어나는 것인 돌연변이 데할로게나제.
  20. 제19항에 있어서, 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 데할로게나제 내의 상기 잔기가 아스파르트산인 돌연변이 데할로게나제.
  21. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 로도코커스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) 데할로게나제의 아미노산 잔기 272번에 상응하는 위치에서 일어나는 것인 돌연변이 데할로게나제.
  22. 제21항에 있어서, 아미노산 잔기 272번에 상응하는 위치에서의 치환된 상기 아미노산이 페닐알라닌, 글라이신 또는 알라닌인 돌연변이 데할로게나제.
  23. 제16항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 로도코커스 로도크로우스 데할로게나제의 아미노산 잔기 106번에 상응하는 위치에서 일어나는 것인 돌연변이 데할로게나제.
  24. 제23항에 있어서, 아미노산 잔기 106번에 상응하는 위치에서의 치환된 상기 아미노산이 시스테인 또는 글루탐산인 돌연변이 데할로게나제.
  25. 제16항에 있어서, 목적하는 단백질을 추가로 포함하여 융합 단백질을 생성하는 돌연변이 데할로게나제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 목적하는 단백질이 선별가능한 마커 단백질, 막 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질, 구조 단백질, 효소, 효소 기질, 수용체 단백질, 전달 단백질, 전사 인자, 채널 단백질, 인-단백질, 키나제, 시그널 단백질, 대사 단백질, 미토콘드리아 단백질, 수용체 관련 단백질, 핵산 결합 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 분비 단백질, 수용체 리간드, 혈청 단백질, 면역원성 단백질, 형광 단백질, 또는 반응성 시스테인을 가진 단백질인 돌연변이 데할로게나제.
  27. 제16항에 있어서, 상응 야생형 데할로게나제와 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 돌연변이 데할로게나제.
  28. 상응 야생형 세린 베타-락타마제에 대해 두개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 세린 베타-락타마제이며, 상기 돌연변이 세린 베타-락타마제가 하나 이상의 관능기를 포함하는 세린 베타-락타마제 기질과 결합을 형성하고, 상기 결합이 상응 야생형 세린 베타-락타마제와 기질 사이에 형성된 결합 및 상기 두 개 이상의 아미노산 치환 중의 하나를 갖는 돌연변이 베타-락타마제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정하며, 돌연변이 세린 베타-락타마제 내의 두개 이상의 아미노산 치환이 상응 야생형 세린 베타-락타마제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물분자의 활성화와 관련이 된 상응 야생형 세린 베타-락타마제 내의 아미노산 잔기에서의 치환이고, 돌연변이 세린 베타-락타마제 내의 두개 이상의 아미노산 치환이 돌연변이 세린 베타-락타마제와 기질 사이에 형성된 결합의 안정성에 관련된 것인 돌연변이 세린 베타-락타마제.
  29. 제28항에 있어서, 상기 치환이 스타필로코커스 아우레스 (Staphylococcus aureus) 세린 베타-락타마제의 아미노산 잔기 166번 및 아미노산 잔기 170번에 상응하는 위치에서 일어나는 것인 돌연변이 베타-락타마제.
  30. 제29항에 있어서, 돌연변이 베타-락타마제 내의 아미노산 잔기 166번에 상응하는 위치에서의 치환된 상기 아미노산이 아스파르트산인 돌연변이 베타-락타마제.
  31. 제28항에 있어서, 돌연변이 베타-락타마제 내의 아미노산 잔기 170번에 상응하는 위치에서의 치환된 상기 아미노산이 글루타민인 돌연변이 베타-락타마제.
  32. 제31항에 있어서, 돌연변이 베타-락타마제 내의 아미노산 잔기 166번에 상응하는 위치에서의 치환된 상기 아미노산이 아스파르트산이고 돌연변이 베타-락타마제 내의 아미노산 잔기 170번에 상응하는 위치에서의 치환된 상기 아미노산이 글루타민인 돌연변이 베타-락타마제.
  33. 제28항에 있어서, 목적하는 단백질을 추가로 포함하여 융합 단백질을 생성하는 돌연변이 베타-락타마제.
  34. 제33항에 있어서, 상기 목적하는 단백질이 선별가능한 마커 단백질, 막 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질, 구조 단백질, 효소, 효소 기질, 수용체 단백질, 전달 단백질, 전사 인자, 채널 단백질, 인-단백질, 키나제, 시그널 단백질, 대사 단백질, 미토콘드리아 단백질, 수용체 관련 단백질, 핵산 결합 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 분비 단백질, 수용체 리간드, 혈청 단백질, 면역원성 단백질, 형광 단백질, 또는 반응성 시스테인을 가진 단백질인 돌연변이 베타-락타마제.
  35. a) 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질과 돌연변이 하이드롤라제를 접촉시키며, 이때, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 상응 야생형 하이드롤라제에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정한 기질과의 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 초래하며, 돌연변이 하이드롤라제 내의 하나 이상의 아미노산 치환이, 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물분자의 활성화와 관련이 된 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환, 또는 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환인 것인 단계; 및
    b) 관능기의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하여 돌연변이 하이드롤라제의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 단계
    를 포함하는 돌연변이 하이드롤라제의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 치환이 물분자를 활성화하는 야생형 하이드롤라제 내의 잔기에서 일어나는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 물분자를 활성화하는 야생형 하이드롤라제 내의 상기 잔기가 히스티딘인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 치환이 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 내의 잔기에서 일어나는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 내의 상기 잔기가 아스파르트산인 방법.
  40. a) 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질 및 돌연변이 하이드롤라제를 포함하는 융합 단백질을 샘플과 접촉시키며, 이때, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 상응 야생형 하이드롤라제에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정한 기질과의 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 초래하며, 돌연변이 하이드롤라제 내의 하나 이상의 아미노산 치환이, 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물분자의 활성화와 관련이 된 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환, 또는 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환이고, 융합 단백질이 목적하는 분자, 세포, 또는 세포내 기관에 결합하는 단백질을 포함하는 것인 단계; 및
    b) 목적하는 분자, 세포, 또는 세포내 기관을 단리하는 단계
    를 포함하는 목적하는 분자, 세포, 또는 세포내 기관을 샘플에서 단리하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 치환이 물분자를 활성화하는 야생형 하이드롤라제 내의 잔기에서 일어나는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 물분자를 활성화하는 야생형 하이드롤라제 내의 상기 잔기가 히스티딘인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 치환이 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 내의 잔기에서 일어나는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 내의 상기 잔기가 아스파르트산인 방법.
  45. 제40항에 있어서, 상기 하나 이상의 관능기가 고형 지지체 또는 고형 지지체에 결합하는 분자인 방법.
  46. 제40항에 있어서, 상기 목적하는 분자가 단백질인 방법.
  47. a) 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질을 돌연변이 하이드롤라제를 포함하는 세포와 접촉시키며, 이때, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 상응 야생형 하이드롤라제에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정한 기질과의 결합을 형성하는 돌연변이 하이드롤라제를 초래하며, 돌연변이 하이드롤라제 내의 하나 이상의 아미노산 치환이, 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물분자의 활성화와 관련이 된 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환, 또는 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환인 것인 단계; 및
    b) 관능기의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 단계
    를 포함하는 세포의 표지 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 치환이 물분자를 활성화하는 야생형 하이드롤라제 내의 잔기에서 일어나는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 물분자를 활성화하는 야생형 하이드롤라제 내의 상기 잔기가 히스티딘인 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 치환이 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 내의 잔기에서 일어나는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 내의 상기 잔기가 아스파르트산인 방법.
  52. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 하이드롤라제가 데할로게나제인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 기질이 R-링커-A-X를 포함하고, 식 중 R이 하나 이상의 관능기이며, 상기 링커가 C, N, S, 또는 O를 포함한 다원자 직쇄 또는 분지쇄이고, A-X가 데할로게나제의 기질이며, X가 할로겐인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 A가 (CH2)n이고 n = 4 내지 10인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 링커가 (CH2CH20)y를 포함하고 y=2 내지 8인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 상기 링커가 R과 A를 분리시키는 12개 이상의 원자인 방법.
  57. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 야생형 하이드롤라제가 세린 베타-락타마제인 방법.
  58. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 세포내 또는 세포 표면에 존재하는 것인 방법.
  59. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 관능기가 아미노산, 단백질, 당단백질, 핵산 분자, 약물, 지질, 바이오틴, 또는 고형 지지체인 방법.
  60. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 관능기가 광학 검출성 분자인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 하나 이상의 관능기가 형광발색단인 방법.
  62. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 기질이 두개의 관능기를 포함하는 것인 방법.
  63. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 관능기가 Ca2+에 결합하거나, K+에 결합하거나, Na+에 결합하거나, pH 민감성이거나, 전자 불투과성이거나, 발색단이거나, MRI 조영제이거나, 방사성핵종이거나, NO의 존재하에 형광성이거나 반응성 산소에 민감한 것인 방법.
  64. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포내 하나 이상의 관능기 존재가 돌연변이 하이드롤라제의 세포내 위치와 연관된 것인 방법.
  65. 제35항, 40항 또는 47항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 목적하는 단백질을 추가로 포함하여 융합 단백질을 생성하는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 목적하는 단백질이 선별가능한 마커 단백질, 막 단백질, 세포질 단백질, 핵 단백질, 구조 단백질, 효소, 효소 기질, 수용체 단백질, 전달 단백질, 전사 인자, 채널 단백질, 인-단백질, 키나제, 시그널 단백질, 대사 단백질, 미토콘드리아 단백질, 수용체 관련 단백질, 핵산 결합 단백질, 세포외 매트릭스 단백질, 분비 단백질, 수용체 리간드, 혈청 단백질, 면역원성 단백질, 형광 단백질, 또는 반응성 시스테인을 갖는 단백질인 방법.
  67. 제47항에 있어서, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 추가로 선별가능한 마커 단백질을 포함하는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 기질 내 하나 이상의 상기 관능기가 형광발색단인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 기질과 에스테르 결합을 형성하는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 기질과 티오에스테르 결합을 형성하는 것인 방법.
  71. 제47항에 있어서, 기질과 세포를 접촉시키기 전에 또는 후에 고정제를 세포에 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제47항에 있어서, 기질과 세포를 접촉시키는 동시에 고정제를 세포에 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  73. 제71항 또는 72항에 있어서, 상기 세포가 메탄올, 아세톤 및(또는) 파라포름알데히드로 고정되는 것인 방법.
  74. 제67항에 있어서, 기질과 세포를 접촉시키기 전에 또는 후에 고정제를 세포에 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  75. 제67항에 있어서, 기질과 세포를 접촉시키는 동시에 고정제를 세포에 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  76. 제74항 또는 75항에 있어서, 상기 세포가 메탄올, 아세톤 및(또는) 파라포름알데히드로 고정되는 것인 방법.
  77. 제52항에 있어서, 상기 돌연변이 데할로게나제가 선택된 숙주 세포에서의 발현에 최적화된 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 방법.
  78. 화학식 II 내지 XXVIII 중 하나의 화합물.
  79. 데할로게나제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 데할로게나제의 상기 핵산 서열이 선택된 숙주 세포에서의 발현에 최적화된 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  80. 제79항에 있어서, 데할로게나제가 상응 야생형 데할로게나제에 대한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 데할로게나제이고, 돌연변이 데할로게나제가 데할로게나제 기질과 결합을 형성하며, 상기 결합이 상응 야생형 데할로게나제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정하고, 돌연변이 데할로게나제 내의 하나 이상의 아미노산 치환이, 상응 야생형 데할로게나제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물분자의 활성화와 관련이 된 상응 야생형 데할로게나제 내의 아미노산 잔기에서의 치환, 또는 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 상응 야생형 데할로게나제 내의 아미노산 잔기에서의 치환인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  81. 제79항에 있어서, 상기 핵산 서열이 중간정도의 엄격 조건하에 서열 50 또는 그의 상보체에 혼성화되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  82. 제81항에 있어서, 상기 핵산 서열이 고도의 엄격 조건하에 서열 50 또는 그의 상보체에 혼성화되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  83. 제79항에 있어서, 상기 핵산 서열이 상응 야생형 데할로게나제에 85% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 돌연변이 데할로게나제를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  84. 제83항에 있어서, 상기 상응 데할로게나제가 서열 51에 의해 코딩되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  85. 제79항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열 51에 90% 미만의 핵산 서열 동일성을 갖는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  86. 제79항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열 50에 90% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  87. 융합 단백질이 선별가능한 마커 단백질, 및 관능기를 포함한 기질 또는 그의 일부에 비가역적으로 또는 안정하게 결합할 수 있는 단백질을 포함하는, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세포.
  88. 제87항에 있어서, 상기 관능기가 형광발색단인 단리된 세포.
  89. 제87항에 있어서, 관능기를 포함한 기질에 안정하게 결합할 수 있는 상기 단백질이 상응 야생형 하이드롤라제에 대한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 하이드롤라제이고, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 형광발색단을 포함하는 하이드롤라제 기질과 결합을 형성하며, 상기 결합이 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정하고, 돌연변이 하이드롤라제 내의 하나 이상의 아미노산 치환이, 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물분자의 활성화와 관련이 된 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환, 또는 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환인 단리된 세포.
  90. 제87항에 있어서, 상기 단백질이 관능기를 포함한 기질의 적어도 일부에 비가역적으로 결합하는 것인 단리된 세포.
  91. 선별가능한 마커 단백질, 및 관능기를 포함한 기질 또는 그의 일부에 비가역적으로 또는 안정하게 결합할 수 있는 제2의 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 세포를 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포의 표지 방법.
  92. 제91항에 있어서, 선별가능한 마커 단백질을 발현하는 상기 세포를, 기질과 세포를 접촉시키기 전에 선별하는 방법.
  93. 제91항에 있어서, 선별가능한 마커 단백질을 발현하는 상기 세포를, 기질과 세포를 접촉시킨 후에 선별하는 방법.
  94. 제91항에 있어서, 상기 관능기가 형광발색단인 방법.
  95. 제91항에 있어서, 기질과 세포를 접촉시키기 전에 또는 후에 고정제와 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  96. 제91항에 있어서, 기질과 세포를 접촉시키는 동시에 고정제와 세포를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  97. 상응 야생형 하이드롤라제에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 하이드롤라제이며, 상기 돌연변이 하이드롤라제가 하나 이상의 관능기를 포함하는 하이드롤라제 기질과 결합을 형성하고, 상기 결합이 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합보다 더 안정하며, 돌연변이 하이드롤라제 내의 하나 이상의 아미노산 치환이, 상응 야생형 하이드롤라제와 기질 사이에 형성된 결합을 절단하는 물분자의 활성화와 관련이 된 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환, 또는 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 상응 야생형 하이드롤라제 내의 아미노산 잔기에서의 치환이고, 물분자의 활성화와 관련이 된 잔기에서의 치환된 아미노산이 글루타민 또는 아스파라긴이 아닌 돌연변이 하이드롤라제.
  98. 제97항에 있어서, 상기 치환이 물분자를 활성화하는 야생형 하이드롤라제 내의 잔기에서 일어나는 것인 돌연변이 하이드롤라제.
  99. 제98항에 있어서, 물분자를 활성화하는 야생형 하이드롤라제 내의 상기 잔기가 히스티딘인 돌연변이 하이드롤라제.
  100. 제97항에 있어서, 상기 치환이 기질과 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 내의 잔기에서 일어나는 것인 돌연변이 하이드롤라제.
  101. 제100항에 있어서, 에스테르 중간체를 형성하는 야생형 하이드롤라제 내의 상기 잔기가 아스파르트산인 돌연변이 하이드롤라제.
  102. 제97항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 로도코커스 로도크로우스 데할로게나제의 아미노산 잔기 272번에 상응하는 위치에서 일어나는 것인 돌연변이 하이드롤라제.
  103. 제102항에 있어서, 아미노산 잔기 272번에 상응하는 위치에서의 치환된 상기 아미노산이 페닐알라닌 또는 글라이신인 돌연변이 하이드롤라제.
  104. 제97항에 있어서, 상기 하나 이상의 치환이 로도코커스 로도크로우스 데할로게나제의 아미노산 잔기 106번에 상응하는 위치에서 일어나는 것인 돌연변이 하이드롤라제.
  105. 제104항에 있어서, 아미노산 잔기 106번에 상응하는 위치에서의 치환된 상기 아미노산이 시스테인 또는 글루탐산인 돌연변이 하이드롤라제.
  106. 제97항에 있어서, 물분자의 활성화와 관련된 잔기에서의 치환된 상기 아미노산이 메티오닌, 아스파르트산 또는 알라닌인 돌연변이 하이드롤라제.
  107. 화학식 R-Y의 화합물과 화학식 Z-링커-A-X의 화합물(식 중, Y 및 Z는 반응하여 R-을 -링커-A-X에 링크할 수 있는 기들임)을 커플링하는 단계를 포함하는 화학식 R-링커-A-X 화합물의 제조 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 R-Y가 화학식 R 화합물의 활성화 에스테르이고 Z가 상기 활성화 에스테르와 반응하여 아미드 결합을 형성하기 적절한 아민인 방법.
  109. 상응 활성화 에스테르를 상응 아민과 커플링하여 화학식 R-링커-A-X 화합물을 제공하는 단계를 포함하는, 화학식 R-링커-A-X 화합물(식 중, 링커는 아미드 결합을 포함)의 제조 방법.
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