KR20080002995A - Ｈｅｒ２ 세포 수용체를 표적하는 이뮤노리포좀 조성물 - Google Patents

Ｈｅｒ２ 세포 수용체를 표적하는 이뮤노리포좀 조성물 Download PDF

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Abstract

성장 인자 수용체, 이를 테면, HER2를 발현하는 세포를 표적하는 리간드를 함유하는 리포좀으로 구성된 이뮤노리포좀 조성물이 기재된다. HER2-발현 세포에 이뮤노리포좀의 결합은 봉입 약제의 세포질 전달을 위한 이뮤노리포좀의 내면화를 유도한다.

Description

ＨＥＲ２ 세포 수용체를 표적하는 이뮤노리포좀 조성물{IMMUNOLIPOSOME COMPOSITION FOR TARGETING TO A HER2 CELL RECEPTOR}
본 발명의 내용은 리포좀 조성물에 관한 것이다. 특히, 세포로 리포좀-봉입 약제의 전달을 위하여 특정 세포 수용체를 표적으로 하는 리포좀에 관한 것이다.
리포좀은 수성기를 캡슐화하고 있는 중심이 같은 질서정연한 지질 이중층으로 구성된 구형의 비히클이다. 리포좀은 수성기 또는 지질이중충에 포함된 치료용 약제를 위한 전달 비히클로서 제공된다. 리포좀-봉입 형태에서 약제의 전달은 약제에 따라, 예를 들어, 감소된 약제 독성, 변형된 약물 동력 또는 개선된 약제 가용성을 포함하는 다양한 잇점을 제공할 수 있다. Stealth®라 불리는 친수성 중합체 사슬 또는 장기-순환 리포좀의 표면 코팅을 포함하여 제형화될 경우에 더 나아가 리포좀은 단핵식세포계에 의해 리포좀의 감소된 제거의 일부분으로 기인하는 장기 혈액 순환 반감기라는 잇점을 제공한다. 연장된 반감기는 종종 주사 자리로부터 그들의 원하는 표적 영역 또는 세포에 도달하기 위한 적절한 리포좀에 필수적이 다.
표적화 리포좀은 표적하는 리간드 또는 리포좀의 표면에 부착되는 친화성 부분을 갖는다. 표적하는 리간드는 항체 또는 그의 단편일 수 있으며, 이 경우 리포좀을 이뮤노리포좀이라 언급한다. 표적화 리포좀이 전신적으로 투여되면 봉입된 치료용 약제를 표적 조직, 영역 또는 세포로 전달한다. 표적화 리포좀은 특정한 영역 또는 세포로 바로 도달하기 때문에, 건강한 조직은 치료용 약제에 노출되지 않는다. 이러한 표적하는 리간드는 리포좀의 지질 성분(예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,013,556호 참조)의 극성 머리 그룹 잔기에 표적하는 리간드의 공유결합 커플링으로 리포좀의 표면에 직접적으로 부착될 수 있다. 그러나 이 접근은 기본적으로 표적하는 리간드와 그의 의도된 표적 사이의 상호작용을 간섭하는 표면-결합 중합체 사슬이 결여된 리포좀에 대하여 적절하다(Klibanov, A. L., et al., Biochim . Biophys. Acta., 1062:142-148 (1991); Hansen, C. B., et al., Biochim . Biophys . Acta, 1239:133-144 (1995)).
대안적으로, 표적화 리간드는 중합체 사슬의 유리 말단에 부착하여 리포좀에 표면 코팅을 형성할 수 있다(Allen. T. M., et al., Biochim . Biophys . Acta, 1237:99-108 (1995); Blume, G. et al., Biochim . Biophys . Acta, 1149:180-184 (1993)). 이 접근에서, 표적하는 리간드는 노출되어 의도된 표적과 상호작용을 위하여 쉽게 이용가능하다.
성장 인자 수용체-티로신 키나아제는 많은 인간 암의 병인에서 중요한 역할 을 하는 HER2(c- erbB2 , neu) 원발암유전자 및 p185HER2를 코딩한다. p185HER2의 과발현은 유방암의 20-30%에서 발생하고, 이들 환자에 대해서는 좋지 않은 예후가 예상된다(Park, J.W. et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 92:1327 (1995)).
p185HER2 수용체는 항체-기반 치료에 있어서 매력적인 표적이며, p185HER2 과-발현은, 존재한다면, 통상 기본적으로 유방 종양 이내에서 상동적으로 일어나지만, 특정한 정상의 상피 세포에서는 단지 낮은 수준으로 발현된다. 뮤린 항-p185HER2 단일클론 항체, muAb4D5 및 이 항체의 인간화 변형, 트라스투주마브(trastuzumab)가 개발되었다(Carter, P. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); 미국 특허 번호 제 5,677,171호). p185HER2에 결합하는 다양한 항체도 또한 기재되어 있다(WO 99/55367).
HER2 수용체에 대한 특이적인 항체를 함유하는 리포좀이 보고되었다(Park, J.W. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 92:1327 (1995); Park, J.W. et al., J. Controlled Release, 74:95 (2001 ); Nielsen, U. B. et al., Biochim . Biophys. Acta, 1591 :109 (2002); 미국 특허 번호 제 6,214,388호). 세포 결합 및 흡수 정도에서 리포좀 당 항체의 수, 즉, 항체 밀도 사이에서 나타나는 관계가 기재되었다(Nielsen, U. B. et al., Biochim . Biophys . Acta, 1591 :109 (2002)). 상기 연구의 결과는 리포좀 표면에서 0 내지 30까지의 항체 밀도 변화는 세포 흡수의 증가에 상응하며, 이는 리포좀 당 최대 30 항체까지였음을 지적한다. 리포좀 당 30 내지 100의 항-HER2 항체 수의 증가는 리포좀의 세포 흡수를 증가시키지 않았다.
암 치료의 유효성은 가능한 건강한 세포에는 거의 영향을 미치지 않으면서 직접적으로 암 세포를 표적하고 사멸시키는 치료의 능력과 관련 있다. 종양 세포를 특정적으로 표적하는 약제의 개념은 광범위하게 논의되어 왔고, 특정 암 세포에 고 선택적인 제형 및 이러한 특정 암 세포에 대하여 최적의 생체 내 결합으로 설계된 제형이 요망된다.
관련 기술의 예시 및 이들과 관련된 제한을 하기에 설명하고자 하나 한정적인 것은 아니다. 기술과 관련된 다른 제한이 본 명세서를 읽고 도면을 연구한 당업자들에게 나타날 수 있을 것이다.
발명의 요약
일 측면에서, (i) 비히클-형성 지질; (ii) 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 친수성 중합체로 구성된 항-HER2 수용체 항체 컨쥬게이트; 및 (iv) 봉입 약제로 구성되는 리포좀을 포함하는 조성물이 기재된다. 컨쥬게이트의 양은 평균적으로, 리포좀 당 약 2 항체 초과, 평균적으로, 리포좀 당 약 25 항체 미만을 제공하기 위한 유효량으로 존재한다.
한 구체예에서, 항체는 5,000-50,000 달톤의 분자량, 더욱 바람직하게는 10,000-50,000 및 더더욱 바람직하게는 10,000-30,000의 분자량을 갖는다. 다른 구체예에서, 항체는 100,000 달톤 미만의 분자량, 더욱 바람직하게는 약 35,000 달 톤 미만 및 더더욱 바람직하게는 30,000 달톤 미만의 분자량을 갖는다.
다른 구체예에서, 항제는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%로, 서열번호 2와 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 친수성 중합체는 750-5000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이다.
다른 구체예에서, 봉입 약제는 세포독성 약제이다. 또 다른 구체예에서, 봉입 약제는 항종양제이다. 안트라사이클린, 이를 테면 독소루비신이 봉입 약제의 예시이다.
다른 구체예에서, 컨쥬게이트의 양은 생체 내 투여 48 시간 후, 평균적으로, 리포좀 당 약 20 항체 미만을 제공한다.
다른 측면에서, (i) 적어도 하나의 견고한 비히클-형성 지질; (ii) 소수성 부분 및 폴리에틸렌 글리콜으로 구성된 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 폴리에틸렌 글리콜 및 서열 번호 2에 적어도 80% 동일성을 갖는 항-Her-2 수용체 단쇄 항체로 구성된 컨쥬게이트; 및 (iv) 항종양 활성을 갖는 봉입 약제로 구성된 리포좀을 포함하는 이뮤노리포좀 제형이 제공된다. 상기 리포좀은 생체 내 투여 96 시간 후 리포좀 당 약 2 초과 약 15 항체 미만을 제공하는데 유효한 컨쥬게이트의 양으로 특정지어진다.
한 구체예에서, 견고한 비히클-형성 지질은 수소화 대두 포스파티딜콜린이다.
다른 구체예에서, 상기 리포좀은 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, (i) 적어도 하나의 견고한 비히클-형성 지질; (ii) 소수성 부분 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 폴리에틸렌 글리콜 및 서열 번호 2에 동일성을 갖는 항-Her-2 수용체 단쇄 항체로 구성된 컨쥬게이트; 및 (iv) 항종양 활성을 갖는 봉입 약제로 구성된 리포좀을 포함하는 이뮤노리포좀 제형이 기재된다. 상기 이뮤노리포좀 제형은 생체 내 투여 시, 유사 성분으로 구성되었지만 상기 항체는 결여되어있는 리포좀의 곡선 아래 영역 보다 25% 초과 또는 이하로 낮은 곡선 아래 영역을 제공한다.
한 구체예에서, 컨쥬게이트의 양은 생체 내 투여 48 시간 후, 평균적으로, 리포좀 당 약 20 항체 미만을 제공한다. 다른 구체예에서, 컨쥬게이트의 양은 생체 내 투여 96 시간 후, 평균적으로, 리포좀 당 약 15 항체 미만을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 생체 내 투여 48 시간 후, 평균적으로, 리포좀 당 2 항체 초과, 생체 내 투여 48 시간 후, 평균적으로, 리포좀 당 약 20 항체 미만을 제공한다.
또 다른 측면에서, (i) 적어도 하나의 견고한 비히클-형성 지질; (ii) 소수성 부분 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 임의의 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 폴리에틸렌 글리콜 및 서열 번호 2에 적어도 80% 동일성을 갖는 항-Her-2 수용체 단쇄 항체로 구성된 컨쥬게이트; 및 (iv) 항종양 활성을 갖는 봉입 약제로 구성된 리포좀을 포함하는, 이뮤노리포좀 제형이 기재된다. 상기 조성물은 상기 이뮤노리포좀 투여 96 시간 후, 각각의 리포좀으로부터 항체의 30-60%가 해리되어, 생체 내 투여 96 시간 후 리포좀 당 약 25 항체 미만을 갖는 조성물을 제공하는 특성에 의해 특정지어진다.
또 다른 측면에서, (a) 친수성 중합체 사슬의 외부 코팅 및/또는 봉입 약제를 임의로 갖는 리포좀을 제공하고; (b) 소수성 부분, 폴리에틸렌 글리콜 및 서열 번호 2에 적어도 80% 동일성을 갖는 항-Her-2 수용체 단쇄 항체로 구성된 컨쥬게이트를 배양하며; (i) 생체 내 투여 96 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 2 초과 항체; (ii) 평균적으로 리포좀 당 150 미만 항체; 및/또는 (iii) 생체 내 투여 96 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 15 미만 항체를 제공하는 것으로 선택되는 컨쥬게이트의 양으로 구성되는 특정 공정에 따라 제조되는 리포좀 조성물이 기재된다.
한 구체예에서, 컨쥬게이트의 양은 평균적으로 리포좀 당 12 항체 이하, 대안적으로 10 이하, 대안적으로 8 이하를 제공한다.
다른 측면에서, 상술한 바와 같으나, 생체 내 투여 전 리포좀이 리포좀 당 25 항체 미만을 가지며 생체 투여 후, 상기 리포좀이 상기 항체의 약 20-50%를 상실하지만 여전히 세포독성을 위하여 Her-2 수용체에 결합하는 것을 충분하게 유지하는 리포좀을 포함하는 조성물이 기재된다.
다른 측면에서, 이뮤노리포좀 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (i) 비히클-형성 지질; (ii) 임이의 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 친수성 중합체 및 표적, 이를 테면, HER-2 수용체의 세포 외 도메인에 대하여 친화성 결합을 갖는 항체로 구성되는 컨쥬게이트; 및 (iv) 봉입 약제로 구성된 이뮤노리포좀을 제공하는 것을 포함한다. 상기 컨쥬게이트는 리포좀 당 선택된 항체의 제 1의 수 를 제공하기 위하여 충분한 제 1의 양으로 조성물에 포함된다. 상기 리포좀을 시험관 내 또는 생체 내에서 혈액과 접촉시키고, 혈액과 리포좀의 접촉 상의 하나 이상의 시점에서 리포좀 당 항체 수를, 예를 들어, 크로마토그래피와 같은 적절한 분석 기술로 결정한다. 혈액과 접촉 후 제 1의 선택된 시점에서 항체의 수를 결정하는 것을 기초로, 이러한 시점에서 혈액과 접촉 후에 리포좀 당 적어도 두개의 항체를 제공하기 위하여 리포좀 당 항체의 보다 많은 제 2의 수를 제공하는데 충분한 컨쥬게이트의 제 2의 양이 선택된다.
한 구체예에서, 상기 방법은 리포좀 당 50 항체 미만을 제공하는데 유효한 컨쥬게이트의 제 2의 양을 선택하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 리포좀 당 30 이하를 제공하는데 유효한 컨쥬게이트의 제 2의 양이 선택된다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 리포좀 당 150 항체 미만, 더욱 바람직하게는 리포좀 당 100 항체 이하 및 더더욱 바람직하게는 리포좀 당 75 항체 미만을 제공하는 컨쥬게이트의 제 1의 양을 갖는 리포좀을 제공하는 것을 포함한다.
상기 기재된 예시 측면 및 구체예에 더하여, 추가의 측면 및 구체예를 도면에 대한 참조 및 하기 설명의 연구에 의해 나타내어 질 것이다.
도 1a-1b는 지질-중합체-항체 컨쥬게이트의 제조에 대한 합성 반응 도식을 보여주며 여기에서 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol; PEG) 비스(아민)의 DSPE 카르밤산염의 말레이미드가 형성된다;
도 2a는 유리 약제(삼각형), 리포좀에 봉입(원)되거나 리포좀 당 2(원), 5(사각형), 7.5(다이아몬드) 또는 15(삼각형) 항체를 포함하는 이뮤노리포좀에 봉입되어 투여된 독소루비신에 노출 10분 후, μg/mL로 나타낸 독소루비신 농도의 함수로서, 무처리된 대조군 세포의 퍼센트로서 발현되는 세포 생존력을 보여준다;
도 2b는 유리 약제(다이아몬드), 리포좀에 봉입(삼각형)되거나 리포좀 당 7.5(X 표시), 15(* 표시), 30(원) 또는 45(사각형) 항체를 포함하는 이뮤노리포좀에 봉입되어 투여된 독소루비신에 노출 4 시간 후, μg/mL로 나타낸 독소루비신 농도의 함수로서, 무처리된 대조군 세포의 퍼센트로서 발현되는 세포 생존력을 보여준다;
도 3a-3h는 인간 혈장에서 이뮤노리포좀을 배양하는 동안 제거한 분취물로부터 리포좀 당 15 scFv 항체를 갖는 이뮤노리포좀으로부터 방사성표지(125I)scFv의 용출 프로필을 보여주며, 분취물은 0 시간(도 3a), 1 시간(도 3b), 4 시간(도 3c), 8 시간(도 3d), 24 시간(도 3e), 48 시간(도 3f), 72 시간(도 3g) 및 96 시간(도 3e)의 시간에서 제거되었다;
도 4a는 시험관 내 인간 혈장에서 시간(시)으로 나타내는, 배양 시간 함수로서 7.5:1(다이아몬드), 15:1(사각형), 30:1(원), 45:1(삼각형) 및 90:1(*)의 항체/리포좀 비를 갖는 이뮤노리포좀 제형으로부터 125I 표지 scFv 항체의 해리를 보여준다;
도 4b는 시험관 내 인간 혈장에서 시간으로 나타내는, 배양 시간 함수로서 7.5:1(다이아몬드), 15:1(사각형), 30:1(원), 45:1(삼각형) 및 90:1(*)의 scFv 항체/리포좀 비를 갖는 이뮤노리포좀 제형에 남아있는 125I-표지의 퍼센트를 보여준다;
도 5a는 시험관 내 인간 혈장에서 시간으로 나타내는, 배양 시간 함수로서 두 개의 상이한 연구(다이아몬드, 사각형)에서 리포좀 당 15 항체를 갖는 이뮤노리포좀 제형으로부터 해리된 방사성표지 항체의 퍼센트를 보여준다;
도 5b는 인간 혈장에서 시간으로 나타내는, 배양 시간 함수로서 리포좀 당 15 항체를 갖는 이뮤노리포좀에 남아있는 방사성표지 항체의 퍼센트(다이아몬드) 및 이뮤노리포좀으로부터 해리된 방사성표지 항체의 퍼센트(사각형)를 보여준다;
도 6a는 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서 혈장 샘플의 리포좀 분획에서 회수된 125I-표지 scFv 항체의 퍼센트를 보여준다;
도 6b는 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서 세파로오스 CL-4B 컬럼에서 분리 후 혈장의 리포좀 분획에서 ng/mL로 나타낸, 회수된 125I-표지 scFv 항체의 농도를 보여준다;
도 6c는 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서 세파로오스 CL-4B 컬럼에서 분리 후 래트 혈장의 유리 또는 혈장 분획에서 ng/mL로 나타낸, 회수된 125I-표지 scFv 항체의 농도를 보여준다;
도 7a는 혈장(다이아몬드), 혈액(폐쇄 사각형)에 남아있는 125I-표지 scFv 항체의 퍼센트 및 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, 혈장에서 독소루비신의 퍼센트(삼각형)를 보여준다. 또한 래트에 2 mg/kg의 독소루비신 농도에서 유리 컨쥬게이트로서 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, 혈장(개방 원) 및 혈액(개방 사각형)에서 125I-표지 scFv 항체의 퍼센트를 보여준다;
도 7b는 래트에 2 mg/kg 농도에서 15:1 이뮤노리포좀 제형 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, μg/mL로 나타낸, 독소루비신의 혈장 농도를 보여준다;
도 8은 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/μg으로 나타낸, 혈액에서 독소루비신에 대한 125I-표지 scFv 항체의 비의 플랏이다;
도 9는 독소루비신을 함유하는 페길화 리포좀(다이아몬드) 또는 리포좀 당 15(사각형), 75(삼각형), 150(X) 또는 300(*) scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀의 생체 내 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, μg/mL로 나타낸, 혈장 독소루비신 농도의 플랏이다;
도 10a-10b는 유방 종양 이종 이식편을 가진 마우스에 살린(개방 원), 독소루비신(개방 사각형)을 함유하는 페길화 리포좀 또는 리포좀 당 7.5(다이아몬드), 15(삼각형), 30(폐쇄 사각형) 또는 45(폐쇄 원) scFv 항체를 함유한 이뮤노리포좀으로 처리하고 마우스에서 초기 종양 크기에 대한 상대적 퍼센트로 종양 용적을 보여주며(도 10a) 체중의 변화 퍼센트를 보여준다(도 10b);
도 11은 유방암 이종 이식편을 가진 마우스에 살린(개방 원), 2 mg/kg(개방 사각형) 및 3 mg/kg(개방 다이마몬드)의 농도로 독소루비신을 함유하는 폐길화 리포좀 또는 2 mg/kg(폐쇄 사각형), 3 mg/kg(폐쇄 다이아몬드) 또는 4 mg/kg(폐쇄 삼각형)의 농도의 15:1 이뮤노리포좀 제형으로 처리하고, 일수로 나타내는, 시간 함수로서, 초기 종양 용적의 퍼센트에 대한 상대적 종양 용적의 플랏이다;
도 12는 평균적으로 리포좀 당 15 scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀(원) 또는 페길화 리포좀(사각형)에 봉입된 독소루비신(10 mg/mL)을 원숭이에 정맥 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/mL로 나타낸 혈장 독소루비신 농도의 그래프이다;
도 13a는 평균적으로 리포좀 당 15 scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀에 1 mg/kg(원), 5 mg/kg(사각형) 및 10 mg/kg(삼각형)의 독소루비신 농도로 봉입된 독소루비신을 원숭이에 정맥 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/mL로 나타낸 혈장 독소루비신 농도의 그래프이다;
도 13b는 평균적으로 리포좀 당 15 scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀에 1 mg/kg(원), 5 mg/kg(사각형) 및 10 mg/kg(삼각형)의 독소루비신 농도로 봉입된 독소루비신을 원숭이에 정맥 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/mL로 나타낸 혈장 항체 농도의 그래프이다;
도 14a는 평균적으로 리포좀 당 15 scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀에 1 mg/kg(다이아몬드), 5 mg/kg(사각형) 및 10 mg/kg(삼각형)의 독소루비신 농도로 봉입된 독소루비신을 원숭이에 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/μg으로 나타낸 혈장에서 scFv 항체/독소루비신 농도 비의 플랏이다;
도 14b는 평균적으로 리포좀 당 15 scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀에 1 mg/kg(다이아몬드), 5 mg/kg(사각형) 및 10 mg/kg(삼각형)의 독소루비신 농도로 봉입된 독소루비신을 원숭이에 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, 초기 항체/독소루비신 비로 표준화된 혈장에서 scFv 항체/독소루비신 농도 비의 플랏이며;
도 15a는 평균적으로 리포좀 당 15 scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀에 0.5 mg/kg(사각형), 2 mg/kg(삼각형) 및 4 mg/kg(역삼각형)의 독소루비신 농도로 봉입된 독소루비신을 원숭이에 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/mL로 나타낸 독소루비신 농도의 플랏이다;
도 15b는 평균적으로 리포좀 당 15 scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀에 4 mg/kg의 독소루비신 농도로 봉입된 독소루비신을 6개월 기간을 통하여 6회 원숭이에 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/mL로 나타낸 독소루비신 농도의 플랏이며, 1회에 상응하는 데이터(역삼각형) 및 6회 투여에 상응하는 데이터(삼각형)이다;
도 15c는 유리 약제(삼각형)의 독소루비신 4 mg/kg, 페길화 리포좀에 봉 입(DOXIL®; 사각형)되거나 평균적으로 리포좀 당 15 항체를 갖는 이뮤노리포좀에 봉입된(역삼각형) 독소루비신 4 mg/kg을 원숭이에 투여한 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/mL로 나타낸 독소루비신 농도의 플랏이다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1은 본원에서 HER2 수용체 및 p185HER2 수용체라고도 언급되어지는 c-erb-B2 수용체의 세포 외 도메인에 대하여 결합 친화성을 갖는 항체의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 2는 F5로 설계된, HER2 수용체의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단쇄 항체(scFv)의 아미노산 서열이다.
I. 정의
다른 언급이 없다면, "비히클-형성 지질"은 안정한 미셀 또는 리포좀 조성물의 부분을 형성할 수 있는 임의의 지질을 언급하고 전형적으로 하나 이상의 소수성, 탄화수소 사슬 또는 스테로이드 그룹을 포함하며, 그의 극성 머리 그룹에서 화학적 활성 그룹, 이를 테면, 아민, 산, 에스테르, 알데하이드 또는 알코올을 포함할 수 있다.
본원에서 이용되는, "항체"는 전체의 항체 및 임의의 항원 결합 단편 또는 그의 단쇄을 포함한다. 따라서 항체는 이뮤노글로블린 분자의 적어도 한 부분, 이로 제한하는 것은 아니지만, 중쇄 또는 경쇄 또는 그의 리간드 결합 부분의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR), 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크(framework; FR) 영역 또는 그의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함하는 분자를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다.
더 나아가 "항체"는 항체 소화 단편, 그의 특정 부분 및 변이체를 포함하고, 항체 모방체 또는 항체 또는 그의 특정 단편 또는 그의 부분의 구조 및/또는 작용을 모방하는 항체의 도메인을 포함하며, 단쇄 항체 및 그의 단편을 포함한다. 작용 단편은 성장 인자 수용체인 포유류 HER2 단백질에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 구성되는 1가의 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 가교로 결합되는 두개의 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., Nature, 341 : 544-546 (1989)); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)을 포함하는 항체의 "항원 결합 부분" 을 포함한다. 또한, Fv 단편, VL 및 VH의 두개의 도메인은 분리 유전자에 의해 코딩되지만, 그들은 1가 분자[단쇄 Fv(single chain Fv; scFv)로 공지됨; 예를 들어, Bird et al. Science, 242:423-426 (1988), Huston et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 85:5879-5883 (1988) 참조]를 형성하기 전에 VL 및 VH 영역 쌍에서 그들이 단일 단백질 사슬로 형성가능하게 하는 합성 링커에 의한, 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있다. 이러한 단쇄 항체는 또한 항체라는 용어에 포함될 수 있다. 이들 항체는 당업자들에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득되며, 분획은 무손상 항체에서와 같은 방식으로 효용을 위하여 스크리닝된다.
이러한 분획은 당업계에 공지 및/또는 본원에 기재된, 효소적 절단, 합성 또는 재조합 기술로 생산될 수 있다. 항체는 또한 하나 이상의 종결 코돈이 원래의 종결 자리의 업스트림에 도입된 항체 유전자를 이용하여 다양한 트렁케이트 형태로 생산될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 중쇄 부분을 코딩하는 조합 유전자는 CH1 도메인 및/또는 중쇄의 힌지 영역을 코딩하는 DNA 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 항체의 다양한 부분은 통상의 기술에 의해 화학적으로 함께 결합될 수 있거나, 유전자 공학 기술을 이용하여 인접 단백질로서 제조될 수 있다.
"HER2 수용체" 및 "p185HER2"는 HER2 또는 ERRB2 유전자(v-erb-b2, 적아구 백혈병 바이러스 종양유전자 호몰로그 2)에 의해 코딩된 단백질을 의미하며, 또한 종양유전자 호몰로그에서 유래된 신경/교아종; 조류 백혈병 바이러스(v-erb-b2) 종양유전자 호몰로그 2; v-erb-b2 조류 백혈병 바이러스 종양유전자 호몰로그 2(종양유전자 호몰로그에서 유래된 신경/교아종)를 지칭한다. HER2/ERRB2 유전자는 수용체 타이로신 키나아제의 상피성장 인자(epidermal growth factor; EGF) 수용체 패밀리의 멤버를 코딩한다. HER2에 대한 코딩 서열은 번역 산물이 NP_004439로 제공되는 참조 서열 NM_004448로 제공된다. HER2 수용체는 그 자신의 도메인과 결합하는 리간드를 갖지 않으므로 성장 인자와 결합할 수 없다. 그러나, HER2 수용체는 다른 리간드-결합 EGF 수용체 패밀리 멤버에 단단하게 결합하여 헤테로다이머를 형성하고, 다운스크트림 신호 경로의 키나아제-중재 활성, 이를 테면, 미토젠-활성 단백질 키나아제 및 포스파티틸이노시톨-3 키나아제를 포함하는 그들을 결합하고 강화하는 리간드를 안정화시킨다. 아형의 아미노산 위치 654 및 655(아형 b의 624 및 625 위치)에서 대립 변이는 보고되어 있으며, lle654/lle655가 가장 일반적인 대립이다. 선택적 스플라이싱은 몇몇의 추가적 전사 변이, 약간의 상이한 아형을 코딩하는 결과를 가져온다. 모든 대립 및 선택적 변이는 "HER2 수용체"의 의미에 포함된다.
"내면화 항체"는 세포 표면에서 수용체 또는 다른 리간드와 결합하고 세포로, 예를 들어, 효소 또는 다른 기관으로 또는 세포질로 수송되는 항체이다.
"분리"는 그의 자연 상태에서 정상적으로 그에 동반되는 성분이 실재적으로 또는 기본적으로 없는 물질을 의미한다.
두개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성" 또는 퍼센트 "상동성"은 같거나 같은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 퍼센트를 갖는 두개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미하며, 최대 상응성에 대한 비교 및 얼라인은 시각적 조사에 의해 또는 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 측정된다.
본원에 이용된, 항체의 "친화성"은 미리정해진 항원에 대한 항체의 해리 상수, KD를 의미한다. 고 친화성 항체는 미리정해진 항원에 대하여, 10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-9 M 이하 및 더더욱 바람직하게는 10-10 M 이하의 KD를 갖는다. 본원에 이용된 "해리상수" 또는 "KD," 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 반응의 해리율을 의미한다. "KD"는 관련 비율(k1)의 비에 대한 해리 비율의 비(k2)이며, 또한 또는 "온-비율(kon)"에 대한 "오프-비율(kOff)"로도 지칭된다. 따라서, KD는 k2/k1 또는 koff/kon과 동일하고 몰 농도(M)로 나타내어진다. 더 작은 KD가 더 강한 결합을 의미한다. 즉 10-6 M(또는 1 μM) KD는 10-9 M(또는 1 μM)에 비하여 약한 결합을 나타낸다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대하여 특이한 항체"는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 이용된다. 본원에 이용된 "특이 결합" 및 "특이적인 결합"은 다른 항원 또는 단백질보다 더 큰 친화성을 가지고 미리정해진 항원에 대하여 결합하는 항체를 의미한다. 전형적으로, 항체는 10-6 M 이하의 해리 상수(KD)로 결합하고, 미리정해진 항원 외의 비-특이 항원(예를 들어, BSA, 카제인, 또는 임의의 특정 폴리펩티드)에 결합을 위한 그의 KD보다 적어도 두배 이하인 KD로 미리정해진 항원에 결합한다. "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이한 항체"는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 이용된다.
본원에서 설명 및 청구된 바와 같이, 서열번호 2로 나타낸 서열은 "보존적 서열 변형", 즉, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치지 않거나 특성을 변경시키지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 이러한 보존적 서열 변형은 뉴클레오티드 및 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 당업계에 공지된 표준 기술, 이를 테면, 부위 지정 돌연변이 및 PCR-중재의 돌연변이에 의해 서열번호 2로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 확인되어 있다. 이들 패밀리는 염기 측쇄(예: 라이신, 알기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예: 아스파르트산, 글루타민산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예: 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예: 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
II. 리포좀 조성물
한 측면에서, 본 발명은 성장 인자 수용체 HER2에 대하여 결합 특이성을 갖는 항체를 표적 리간드로서 포함하는 리포좀으로 구성된 리포좀 조성물에 관한 것이다. HER2 표적 리간드는 지질-중합체-항체 컨쥬게이트, 본원에서 지질-중합체-리간드 컨쥬게이트로도 언급되는 형태로 리포좀으로 통합된다. 하기에 기술할 것과 같이, 항체는 HER2 수용체의 외부 도메인에 대하여 특이적 친화성을 가지며 HER2 수용체를 발현하는 세포에 대하여 리포좀을 표적한다. 하기 문단은 리포좀 지질 및 치료 시약을 포함하는 리포좀 성분, HER2 표적 리간드를 함유하는 리포좀의 제조 및 질환의 치료를 위하여 리포좀 조성물을 이용하는 방법을 설명한다.
A. 리포좀 지질 성분
본 발명의 조성물에 이용하기에 적절한 리포좀은 우선 비히클-형성 지질로 구성된 것을 포함한다. 이러한 비히클-형성 지질은 인지질의 예로서, 내부와 접촉하는 그의 소수성 부분, 이중층 막의 소수성 영역 및 외부로 향한 그의 머리 그룹 부분, 막의 극성 표면을 가지고 수중에서 이중층 비히클로 자발적으로 형성할 수 있는 것이다. 지질 이중층로 안정한 통합이 가능한 지질, 이를 테면, 콜레스테롤 및 그의 다양한 유사체가 또한 리포좀에 이용될 수 있다.
비히클-형성 지질은 바람직하게는 두개의 탄화수소 사슬, 전형적으로 아실 사슬 및 머리 그룹, 극성 또는 비극성을 갖는 지질이다. 인지질, 이를 테면, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨 및 스핀고미엘린을 포함하는 다양한 합성 비히클-형성 지질 및 자연적으로-발생한 비히클-형성 지질이 있으며, 여기에서, 두개의 탄화수소 사슬은 전형적으로 약 14-22 개의 탄소 원자 길이를 가지며, 다양한 불포화도를 갖는다. 상기-기재한 그의 탄소 사슬이 다양한 포화도를 갖는 지질 및 인지질은 상업적으로 얻을 수 있거나 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 다른 적절한 지질은 당지질, 세레브로사이드 및 스테롤, 이를 테면 콜레스테롤을 포함한다.
양이온 지질은 또한 본 발명의 리포좀에 이용하기에 적절하며, 여기에서 양이온 지질은 지질 조성물의 적은 성분으로서 또는 과반수로서 또는 단독 성분으로서 포함될 수 있다. 이러한 양이온 지질은 전형적으로 지방친화성 부분, 이를 테면, 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬을 가지며, 여기에서, 지질은 전체적으로 순 양성 전하를 갖는다. 바람직하게, 지질의 머리 그룹은 양성 전하를 갖진다. 양이온 지질의 예는 1,2-디올레일옥시-3-(트리메틸아미노)프로판(DOTAP); N-[1-(2,3,-디테트라데실옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE); N-[1-(2,3,-디올레일옥시)프로필]-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드(DORIE); N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이(DOTMA); 3[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-Chol); 및 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB)을 포함한다. 양이온 비히클-형성 지질은 또한 중성 지방, 이를 테면, 디올레오일포스파티딜 에탄올아인(DOPE) 또는 양친매성 지질, 이를 테면, 인지질일 수 있고, 양이온 지질, 이를 테면, 폴리리신 또는 다른 폴리아민 지질로 유도될 수 있다. 예를 들어, 중성 지질(DOPE)은 폴리리신으로 유도되어 양이온 지질을 형성할 수 있다.
비히클-형성 지질은 특정한 유동성 또는 강도를 달성하기 위하여, 혈청에서 리포좀의 안정성을 조절하기 위하여, 표적 컨쥬게이트의 삽입에 대한 유효한 조건을 조절하기 위하여, 기재될 것과 같이 및/또는 리포좀에 봉입된 시약의 방출 비율을 조절하기 위하여 선택될 수 있다. 더욱 단단한 지질 이중층 또는 액체 결정형 이중층을 갖는 리포좀은 상대적으로 단단한 지질, 예를 들면, 상대적으로 고 상 변이 온도, 예를 들면 60℃ 이하의 온도를 갖는 지질의 통합으로 이루어진다. 단단한 즉, 포화된 지질은 지질 이중층에서 보다 큰 막 강도에 기여한다. 다른 지질 성분, 이를 테면, 콜레스테롤은 지질 이중층 구조에서 막 강도에 기여하는 것으로 공지되어 있다.
한편, 지질 유동성은 상대적으로 유동적인 지질, 전형적으로 상대적으로 낮은 액체 대 액체-결정형 상 전이 온도, 예를 들어, 상온 미만의 온도를 갖는 지질 상을 갖는 지질의 통합에 의해 이루어진다.
리포좀은 또한 친수성 중합체에, 또한 본원에서 언급된 "지질중합체"에 공유결합적으로 부착된 비히클-형성 지질을 포함한다. 기재된 바와 같이, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,013,556호는 리포좀 조성물에서 리포좀 주위의 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 형성하는 중합체-유도 지질을 포함한다. 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅은 이러한 코팅이 결여된 리포좀과 비교할 경우 리포좀의 생체 내 혈액 순환 수명을 증가시키는데 유효하다.
친수성 중합체로 유도하기에 적절한 비히클-형성 지질은 상기 리스트된 임의의 지질을 포함하며, 특히 인지질, 이를 테면, 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine; DSPE)을 포함한다.
비히클-형성 지질로 유도하기에 적절한 친수성 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필옥사졸린, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리하이드록시프로필메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아스파타아미드 및 친수성 펩티드 서열을 포함한다. 중합체는 호모중합체 또는 블록 또는 랜덤 공중합체로서 이용될 수 있다.
바람직한 친수성 중합체 사슬은 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)이며, 바람직하게는 500-10,000 달톤, 더욱 바람직하게는 750-10,000 달톤, 더더욱 바람직하게는 750-5000 달톤의 분자량을 갖는 PEG 사슬이다. PEG의 메톡시 또는 에톡시-캡핑 유사체는 또한 바람직한 친수성 중합체이며, 다양한 중합체의 크기로, 예를 들면, 120-20,000 달톤으로 상업적으로 입수가능하다.
친수성 중합체로 유도된 비히클-형성 지질의 제조는, 예를 들어, 미국 특허 제 5,395,619호에 기재되어 있다. 이렇게 유도된 지질을 포함하는 리포좀의 제조는 또한, 기재되어 있으며, 여기에서, 전형적으로 이렇게 유도된 지질의 1-20 몰 퍼센트가 리포좀 제형에 포함된다(예를 들어, 미국 특허 제 5,013,556호 참조).
B. 표적 항체
리포좀 조성물은 또한 세포에 대한 지질 입자를 표적으로 하는 항체를 포함한다. 한 구체예에서, 항체는 종양 유래의 세포의 표면에서 HER2 수용체에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 종양-유래 세포의 표면에서 HER2 수용체와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 도메인을 포함한다. 대안적인 구체예에서, 항체는 종양-유래 세포의 표면에서 HER2 수용체와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 단쇄 항체이다.
바람직한 구체예에서, 본원에서 기재된 리포좀 조성물에 이용을 위한 항체는 종양-유래 세포의 표면에서 HER2 수용체와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 결합 도메인을 포함하는 단쇄 항체이며 본원에서 서열번호 2로서 식별되는 서열을 갖는다. 이 항체의 제조는 WO 99/55367에 기재되어 있고 항체를 F5로 칭한다. 항체는 HER2/neu 종양유전자의 c-erb-B2 단백질 산물의 세포 외 도메인에 특이적으로 결합하는 단쇄 항체 분획(single chain antibody fragment; scFv)이며, 또한 본원에서 항-HER2 항체 또는 HER2 수용체에 대한 결합 친화성을 갖는 항체로 언급된다. F5 항체는 링커 분자에 의해 결합된 인간 항체 가변 도메인으로 구성되며 말단 시스테인(27.6 kD 분자량)을 갖는 251개의 아미노산을 함유하며, 적절한 HER2 결합 친화성(Kd = 150-300 nM 또는 1.5-3 × 10-7 M)을 갖는다. 본 발명의 항-HER2 항체는 그들의 막 표면에서 HER2 수용체를 발현하는 세포로 빠르게 내면화된다.
한 구체예에서, 항-HER2 항체는 서열번호 2에 대해 보존적 치환을 나타내는 서열을 갖는다.
C. 지질-중합체-항체 컨쥬게이트의 제조
상술한 바와 같이, 항-HER2 항체는 공유결합적으로 친수성 중합체 사슬의 자유 말단 끝에, 비히클-형성 지질에 대하여 그의 거의 끝에 부착된다. 선별된 지질에 선별된 친수성 중합체를 부착하는 기술 및 선변될 리간드와 반응을 위한 중합체의 유리, 부착되지 않은 말단을 활성화시키는 기술은 다양하고, 특히, 친수성 중합체 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol; PEG)은 광범위하게 연구되어왔다(Allen, T. M., et al., Biochemicia et Biophysica Acta, 1237:99-108 (1995); Zalipsky, S., Bioconjugate Chem., 4(4):296-299 (1993); Zalipsky, S., et al. FEBS Lett., 353:71-74 (1994); Zalipsky, S. et al., Bioconjugate Chemistry, 6(6):705-708 (1995); Zalipsky, S., in STEALTH LIPOSOMES (D. Lasic and F. Martin, Eds.) Chapter 9, CRC Press, Boca Raton, FIa. (1995)).
통상적으로, PEG 사슬은 커플링에 대한 적절한 반응성 그룹, 예를 들어, 설프하이드릴, 아미노 그룹 및 다양한 리간드에 존재하는 알데하이드 또는 케톤(전형적으로 항체의 카보하이드레이트 일부의 적절한 산화로부터 유래됨)을 함유하기 위하여 작용화 된다. 이러한 PEG-말단 반응성 그룹의 예는 말레이미도(설프하이드릴과 반응을 위하여), N-하이드로숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS) 또는 NHS-카본 에스테르(제 1의 아민과 반응하기 위하여), 하이드라지드 또는 하이드라진(알데하이드 또는 케톤과 반응하기 위하여), 요도아세틸(설프하이드릴 그룹과 선택적으로 반응함) 및 디티오피리딘(티올-반응성)을 포함한다. 이러한 그룹으로 PEG를 활성화시키기 위한 합성 반응 기작은 미국 특허 제 5,631,018, 5,527,528, 5,395,619에 기재되어 있고, 합성 반응 절차를 기재한 관련된 부분은 특히 참조로서 본원에 포함된다.
예시적인 합성 반응 도식은 도 1a-1b에 나타낸다. 반응의 상세한 설명은 미국 특허 번호 제 6,326,353호에서 제공된다. 간단하게, 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol; PEG) 비스(아민)(화합물 I)는 2-니트로벤젠 술포닐 클로라이드와 반응하여 모노보호된 산물(화합물 II)을 생성한다. 화합물 II는 트리에틸아민(triethylamine; TEA)에서 카보닐 디이다졸과 반응하여 모노 2-니트로벤젠술폰아미드(화합물 III)의 이미다졸 카보메이트를 형성한다. 화합물 III은 TEA에서 DSPE와 반응하여 2-니트로벤질 술포닐 클로라이드로 하나의 말단에서 보호되는 유도된 PE 지질을 형성한다. 보호 그룹은 산 처리에 의해 제거되어 PEG 사슬에서 말단 아민을 갖는 DSPE-PEG 산물(화합물 IX)을 제공한다. 말레산 무수물과의 반응은 상응하는 말레아믹 산물(화합물 V)을 제공하며, 아세트산 무수물과의 반응에서는 원하는 PE-PEG-말레이미드 산물(화합물 Vl)을 제공한다. 화합물은 본원에 기재된 항-인테그린 항체를 커플링하기 위하여 티오에테르 결합(화합물 VII)을 통하여 설프하이드릴 그룹과 반응한다.
상술한 임의의 비히클-형성 지질과 조합하는 상술한 임의의 친수성 중합체는 지질-중합체-리간드 표적 컨쥬게이트를 제조하는데 개질제로서 이용될 수 있으며 임의의 선별된 중합체를 위한 적절한 반응 서열은 당업자들에 의해 결정될 수 있음은 이해될 것이다.
D. 리포좀 제조
리포좀-부착 중합체 사슬의 말단 끝에 부착되는 표적 리간드를 갖는 리포좀을 제조하기 위한 다양한 접근이 기재되었다. 하나의 접근은 말단-작용 지질-중합체 유도체를 포함하는 지질 비히클의 제조를 포함한다; 즉, 지질-중합체 컨쥬게이트에서 유리 중합체 말단이 반응성 또는 "활성화"(예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,326,353호 및 6,132,763호 참조)이다. 이러한 활성화 컨쥬게이트는 리포좀 조성물을 포함하며 활성화 중합체 말단은 리포좀 형성 후에 표적 리간드와 반응한다. 다른 접근에서, 지질-중합체-리간드 컨쥬게이트는 리포좀 형성 시점에서 지질 조성물에 포함된다(예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,224,903호, 5,620,689호 참조). 또 다른 접근에서, 지질-중합체-리간드 컨쥬게이트의 미셀 용액은 리포좀의 현택액으로 배양되고 지질-중합체-리간드 컨쥬게이트는 앞서-형성된 리포좀으로 삽입된다(예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,056,973호, 6,316,024호 참조).
봉입제를 포함하고 표면-결합 표적 리간드를 함유하는 리포좀, 즉 표적되는 치료용 리포좀은 이들 임의의 접근으로 제조된다. 바람직한 제조 방법은 삽입 방법이며, 여기에서 앞서-형성된 리포좀을 표적 컨쥬게이트와 배양하여 리포좀의 이중층으로 표적 컨쥬게이트의 삽입을 달성한다. 이 접근에서, 리포좀은 다양한 기술, 이를 테면 Szoka, F., Jr., et al ., Ann . Rev . Biophys . Bioeng., 9:467 (1980)에 상세하게 기재된 기술로 제조되며, 본 발명의 방침에서 제조되는 리포좀의 특정한 예는 하기에 기재될 것이다. 전형적으로, 리포좀은 멀티라멜라 비히클(multilamellar vesicle; MLV)이며, 단순한 지질-필름 수화 기술로 형성될 수 있다. 이 절차에서, 적절한 유기 용매에 용해된 상기 기술된 타입의 리포좀-형성 지질의 혼합물은 용기에서 증발되어 얇은 필름을 형성한 다음, 수용성 매질로 회수된다. MLV를 형성하기 위한 지질 피름 수화물은 전형적으로 약 0.1 내지 10 마이크론의 크기이다.
리포좀은 리포좀 표면에서 친수성 중합체 사슬의 표면 코팅을 형성하기 위하여 친수성 중합체로 유도된 비히클-형성 지질을 포함할 수 있다. 하기 기재된 삽입 단계 이 후, 지질-중합체 컨쥬게이트의 임의의 첨가로, 리포좀은 지질-중합체-표적 리간드를 포함하게 될 것이다. 리포좀 형성 시점 및 지질-중합체 컨쥬게이트의 형성에서 지질 혼합물에 첨가된 추가의 중합체 사슬은 리포좀 지질 이중층의 내부 및 외부표면으로부터 확장되는 중합체 사슬을 유도한다. 리포좀 형성 시점에서 지질-중합체 컨쥬게이트의 첨가는 전형적으로 성분, 예를 들어 비히클-형성 지질을 형성하는 잔여 리포좀을 갖는 중합체-유도 지질의 1-20 몰 퍼센트를 포함함으로써 이루어진다. 중합체-유도 지질의 제조 방법 및 중합체-코팅 리포좀의 형성 방법의 예는 참조로 본원에 포함되는 미국 특허 번호 제 5,013,556호, 5,631,018호 및 5,395,619호에 기재되어 있다. 친수성 중합체가 안정적으로 지질에 커플될 수 있거나 불안정한 결합을 통하여 커플될 수 있는 것은 이해될 것이며, 이는 혈류 또는 자극 반응에서 그들이 순환하면서 코팅된 리포좀이 중합체 사슬의 코팅을 제거하도록 한다.
리포좀은 또한 치료용 또는 진단용 시약을 포함하며, 예시 시약은 하기에 제공된다. 선별된 시약은 (i) 수용액 시약으로 지질 필름을 수화하여 수용성 화합물의 수동성 포착, (ii) 지질 필름 함유 시약을 수화하여 지방 친화성 화합물의 수동성 포착 및 (iii) 내부/외부 리포좀 pH 기울기에 대한 이온화 약제의 적재를 포함하는 표준 기술에 의해 리포좀으로 통합된다. 다른 방법, 이를 테면, 역-상 증발도 또한 적절하다.
리포좀 형성 후, 리포좀은 실재적으로 동일한 크기 범위, 전형적으로는 약 0.01 내지 0.5 마이크론, 더욱 바람직하게는 0.03-0.40 마이크론을 갖는 리포좀 집단을 수득하여 사이징될 수 있다. REV 및 MLV를 위한 하나의 효과적인 사이징 방법은 0.03 내지 0.2 마이크론의 범위에서, 전형적으로 0.05, 0.08, 0.1 또는 0.2 마이크론에서 선별된 균일한 구멍 크기를 갖는 폴리카보네이트 막의 시리즈를 통하여 리포좀의 수용성 현탁액을 압출하는 것과 관련 있다. 막의 구멍 크기는 개략적으로 상기 막을 통한 압출에 의해 생산된 리포좀의 가장 큰 크기에 상응하며, 특히 여기에서 제조는 같은 막을 통하여 두배 이상으로 압출된다. 균질화(homogenization) 방법은 또한 100 nm 이하의 사이즈로 리포좀을 다운-사이징하는데 유용하다(Martin, F. J., in SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS - MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY, P. TyIe, Ed., Marcel Dekker, New York, pp. 267-316 (1990)).
리포좀의 형성 후, 표적 리간드는 통합되어 세포-표적, 치료용 리포좀을 획득한다. 표적 리간드는 상술한 바와 같이 제조한 지질-중합체 컨쥬게이트와 함께 앞서-형성된 리포좀을 배양함으로써 통합된다. 앞서-형성된 리포좀과 컨쥬게이트는 컨쥬게이트와 리포좀을 조합하기에 유효한 조건 하에 배양되며, 이는 외부 리포좀 이중층과 컨쥬게이트의 상호작용 또는 리포좀 이중층으로 컨쥬게이트의 삽입을 포함할 수 있다. 더욱 특징적으로, 두개의 성분은 표적 리간드가 리포좀 표면으로부터 외부로 향하게 되는 방식으로 리포좀과 컨쥬게이트의 조합을 달성하는 조건 하에 함께 배양됨으로써 그와 같은 기원의 수용체와 상호작용이 유용하게 된다. 이러한 조합 또는 삽입을 달성하는데 유효한 조건이 원하는 삽입률을 포함하는 몇몇의 변이 기초 하에 결정되는 것은 이해될 것이며, 여기에서 더 높은 배양 온도는 더 빠른 삽입률을 달성할 수 있으며, 리간드가 안전하게 그의 활성에 영향을 미치지 않고 가열될 수 있는 온도이며, 지질 및 지질 조성물의 더 작은 정도의 상 변이 온도이다. 이는 또한 삽입이 용매, 이를 테면, 폴리에틸렌글리콜 및 에탄올을 포함하는 양친매성 용매 또는 세정제 존재 하에 다양할 수 있다는 것은 이해될 것이다.
지질-중합체-리간드 컨쥬게이트의 형성에서 표적 컨쥬게이트는 전형적으로 컨쥬게이트가 수용성 용매와 혼합될 경우 미셀 용액을 형성할 것이다. 컨쥬게이트의 미셀 용액은 리포좀과 컨쥬게이트의 배양 및 조합 또는 리포좀 지질 이중층으로 컨쥬게이트의 삽입을 위하여 앞서-형성된 리포좀의 현탁액과 혼합된다. 배양은 리포좀의 외부 이중층 소편과 지질-중합체-항체 컨쥬게이트의 조합 또는 삽입을 달성하는데 유효하며, 이뮤노리포좀을 형성하는데 유효하다.
제조 후, 이뮤노리포좀은 바람직하게 예를 들어, 30°또는 90°에서 동적 광 산란에 의한 측정으로, 약 150 nm 미만, 바람직하게 약 85-120 nm 및 더욱 바람직하게 90-110 nm의 크기를 갖는다.
E. 예시적 이뮤노리포좀
본 발명의 방침에서 수행된 연구에서, 항HER2 scFv 항체를 갖는 이뮤노리포좀을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조하였다. 요약하자면, 리포좀을 지질 HSPC, 콜레스테롤 및 mPEG-DSPE로부터 제조하였다. 치료용 시약 독소루비신을 암모늄 이온 기울기에 대한 원격 적재에 의해 리포좀으로 적재하였다(Doxil®). 본원에서 서열번호 2로서 식별되는 서열을 갖는 항-HER2 항체와 실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조된 지질-중합체-항체 표적 컨쥬게이트를 앞서-형성된 리포좀과 컨쥬게이트의 과반수를 함유하는 미셀 용액의 배양으로 앞서-형성된 리포좀으로 삽입하였다. 리포좀 당 평균 2, 5, 7.5, 15, 30, 45, 75, 100, 150 및 300 항체를 갖는 이뮤노리포좀, 또한 본원에서 2:1, 5:1, 7.5:1, 15:1, 30:1, 45:1, 75:1, 100:1, 150:1 및 300:1 제형으로 언급되는 이뮤노리포좀을 실시예 1에서 상세히 설명한 바와 같이, 반응물 농도를 조절하여 제조하였다.
7.5, 15, 30 및 45 항체를 함유하는 이뮤노리포좀의 HER2-발현 세포(SK-BR03) 및 비-HER2-발현 세포(MCF-7)로의 시험관 내 흡수를 실시예 2에 기재한 바와 같이 측정하였다. 결과는 표 1에 요약한다.
SK - BR -3 및 MCF - 7세포에서 항- HER2 이뮤노리포좀의 세포 결합/흡수의 요약
세포 처리 독소루비신(pg/세포)±SE(n=3)
SK-BR-3 (IHC 3+) 대조 리포좀(항-HER2 항체 없음) NS*
항-HER2 이뮤노리포좀(7.5:1) 6.02±0.19
항-HER2 이뮤노리포좀(15:1) 8.35±0.27
항-HER2 이뮤노리포좀(30:1) 6.66±0.22
항-HER2 이뮤노리포좀(45:1) 4.39±0.16
MCF-7 대조 리포좀(항-HER2 항체 없음) NS
항-HER2 이뮤노리포좀(15:1) NS
항-HER2 이뮤노리포좀(30:1) NS
*NS= 유의하지 않음(not significant); 검출 한계 미만
표 1의 데이터는 15:1 및 30:1 제형 각각에 대하여 세포 당 2.58 pg 및 세포 당 1.75 pg의 독소루비신 수준을 갖는, HER-2 양성 SK-BR-3 세포에서 항-HER2 이뮤노리포좀의 양성 세포 결합/흡수를 보여준다. MCF-7 세포에서 항-HER2 이뮤노리포좀의 결합/흡수는 낮은 HER2 발현 수준을 가져 유의적이지 않았다. 양쪽 세포주에서 항-HER2 항체를 함유하지 않은 리포좀의 결합/흡수는 유의적이지 않았다.
실시예 3에 기재된 다른 연구에서, SK-BR-3 인간 유방 암종 세포에서 리포좀 당 2, 5, 7.5 및 15 항체를 함유한 항-HER2 이뮤노리포좀의 독성을 측정하였다. 유리 독소루비신 및 페길화 독소루비신에 양성 및 음성 대조군으로 제공되는 리포좀을 각각 적재하였다. SK-BR-3 세포를 10분 동안 항-HER2 이뮤노리포좀에 노출시킨 다음 세포 생존력을 측정하였다. 결과는 도 2a에 나타낸다.
도 2a는 유리 약제(삼각형), 리포좀에 봉입(원)되거나 리포좀 당 2(원), 5(사각형), 7.5(다이아몬드) 또는 15(삼각형) 항체를 함유하는 이뮤노리포좀에 봉입되어 투여될 경우, μg/mL로 나타낸, 독소루비신 농도의 함수로서, 무처리된 대조군 세포의 퍼센트로서 나타내는, 세포 생존력을 보여준다. 리포좀 조성물의 독성에서 상이함은 약 0.5 μg/mL의 독소루비신 농도에서 나타나며, 여기에서 이뮤노리포좀은 유리 약제(삼각형)와 대략적으로 유사한 시험관 내 독성이 제공되는 리포좀 당 5(사각형) 또는 7.5(다이아몬드) 항체를 갖는다. 그러나, 리포좀 당 15 항체(삼각형)를 갖는 이뮤노리포좀은 약 4 μg/mL 독소루비신에서 50%의 세포 생존력을 가졌으며, 유리 약제의 같은 농도보다 큰 독성이 있었다. 리포좀 당 2 항체를 갖는 이뮤노리포좀은 비-표적 페길화 리포좀 독소루비신보다 작은 세포독성이 있었다.
Her2-표적화 이뮤노리포좀의 세포 사멸 효과는 리포좀 당 항체의 농도와 관련 있다. 10-분 노출 후에 5, 7.5 및 15의 scFv/리포좀 비를 갖는 항-Her2 이뮤노리포좀 제형에 대한 IC50 값은 각각, 대략 30, 16 및 3.9 μg/mL이었다. 10분 약제 노출 후 2의 scFv/리포좀 비를 갖는 항-Her2-표적화 이뮤노리포좀 제형에 대한 독성은 거의 없거나 없었다. 유리 독소루비신에 대한 IC50은 대략 9.5 μg/mL이었다. 거의 없거나 없는 독성은 PEG-코팅 리포좀에 봉입된 독소루비신을 위하여 언급되었다. 15의 scFv/리포좀 비를 갖는 항-Her2 이뮤노리포좀은 유리 독소루비신보다 더 큰 독성을 가졌고, 이는 내면화에 따르는 빠른 결합을 갖는 표적 제형의 잇점을 가르킨다.
따라서, 한 구체예에서, 리포좀 당 2 항체 초과 제공, 특히 계획된 24, 48 또는 96 시간 이상으로 생체 내 혈액에서 이뮤노리포좀의 순환 후에 평균적으로 리포좀 당 2 항체 초과 제공되는 지질-중합체-항체 번쥬게이트의 양을 포함하는 이뮤노리포좀 제형은 하기에서 좀더 논의될 것이다.
시험관 내 독성을 측정하는 대안적인 방법을 수행하였고, 여기에서 리포좀 및 이뮤노리포좀 제형을 세포와 함께 4 시간 동안 배양하였다. 다음으로 세포를 세정하고 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 3일의 마지막에 세포 수를 크리스탈 바이올렛 염색으로 측정하였다. 결과는 도 2b에 나타낸다. 도 2b는 μg/mL로 나타낸 독소루비신 농도의 함수로서, 무처리된 대조군 세포의 퍼센트로서 나타내는 세포 생존력을 보여준다. 다양한 이뮤노리포좀으로부터 독소루비신의 다양한 농도에 4 시간 노출은 제형의 시험관 내 세포독성의 상이함을 설명한다. 리포좀 당 7.5 및 45 항체를 함유하는 이뮤노리포좀은 유리 독소루비신(다이마몬드) 독성보다 다소 작거나 같은 독성이 있었다. 15 및 30 항체를 갖는 이뮤노리포좀은 유리 독소루비신보다 큰 독성이 있었다. 또한 도 2b는 15 및 30 항체를 갖는 이뮤노리포좀은 세포독성에서 유리 독소루비신보다 더 강력하였다.
실시예 4에 기재한 다른 연구에서, 혈액에서 HER2-표적화 리포좀의 안정성을 측정하였다. 125I-표지 scFv 항체를 함유한 이뮤노리포좀을 7.5, 15, 30, 45 및 90의 scFv 항체/리포좀 비로 제조하였다. 이뮤노리포좀을 인간 혈장에서 배양하고, 분석을 위하여 선택된 시점에서 분취물을 이동하였다. 인간 혈장에서 리포좀 물질의 두배 분취물을 배양으로부터 이동하고 각각의 시점에 대하여 세파로오스 CL-4B 컬럼에 적용하였다.
도 3a-3h는 인간 혈장에서 이뮤노리포좀의 배양 동안 제거한 분취물로부터 리포좀 당 15 scFv 항체를 갖는 이뮤노리포좀으로부터 125I-표지 지질-PEG-scFv 컨쥬게이트의 용출 프로필을 보여주며, 분취물은 0 시간(도 3a), 1 시간(도 3b), 4 시간(도 3c), 8 시간(도 3d), 24 시간(도 3e), 48 시간(도 3f), 72 시간(도 3g) 및 96 시간(도 3e)의 시점에서 이동되었다. 리포좀 분획에서 방사성은 2-3 분획 이내의 매우 좁은 범위의 분획 이내에서 회수되었으며 전형적으로 총 용리액의 6-9 mL 이내에서 수집되었다. 혈장 단백질의 광범위한 크기 범위에서 기인한 혈장 분획은 적어도 12 분획 이상으로 세파로오스 CL-4B 컬럼으로부터 용출되었다. 모든 시점을 통하여 리포좀 및 혈장 분획은 서로 구별되었다. 해리(및 상응하는 조합)된 125I-표지 지질-PEG-scFv 컨쥬게이트의 퍼센트를 계산하기 위하여, 리포좀 및 혈장 분획으로부터 방사성을 조합하여 125I-표지의 총 양을 제공하였다. 상기 총 양은 세파로오스 CL-4B 컬럼에 적용된 샘플에서 총 방사성 비율로 측정하였다.
도 4a는 인간 혈장에서 시간으로 나타내는, 배양 시간 함수로서 7.5:1(다이아몬드), 15:1(사각형), 30:1(원), 45:1(삼각형) 및 90:1(*)의 scFv 항체/리포좀 비를 갖는 이뮤노리포좀 제형으로부터 125I-표지 scFv 항체의 해리를 보여준다. 도 4b는 같은 제형에 대하여 이뮤노리포좀에 남아있는 125I-표지의 퍼센트로서 데이터를 플랏한다. 제형으로부터 항체의 해리의 비율 및 정도(독소루비신의 양과 비교)는 리포좀 당 항체의 초기 농도를 제외하고 기본적으로 동일하다.
다른 연구에서, 리포좀 당 15 항체를 갖는 이뮤노리포좀 제형을 제조하고 인간 혈장에서 시험관 내 배양 동안 제형으로부터 방사성표지의 해리를 측정하였다. 결과는 도 5a-5b에 나타낸다.
도 5a는 시간으로 나타내는, 배양 시간 함수로서 두 개의 연구(다이아몬드, 사각형)에 대한 이뮤노리포좀 제형으로부터 해리된 방사성표지된 항체의 퍼센트를 보여준다. 두개의 연구에서 결과는 일치하고 24 시간의 배양은 이뮤노리포좀으로부터 항체의 약 30%가 해리되었음을 가르킨다. 인간 혈장에서 96 시간 배양 후, 항체의 50%가 이뮤노리포좀과 더 이상 조합하지 않는다.
도 5b는 인간 혈장에서 배양 시간 함수로서, 이뮤노리포좀(다이아몬드)에 남아있는 방사성표지 항체의 퍼센트 및 이뮤노리포좀(사각형)으로부터 해리된 방사성표지 항체의 퍼센트로서 15:1 이뮤노리포좀 제형을 이용한 연구로부터 데이터를 플랏하고, 여기에서 해리가 유도된 혈장은 혈장 분획에서 회수된 방사성으로서 기재된다. 도 5b는 총 scFv 물질의 퍼센트로서 발현되는 혈장 분획에서 상응하는 증가를 갖는 리포좀 분획에서 방사표지된 scFv의 감소를 보여준다. 방출된 scFv 항체의 양에서 초기의 감소가 대략 48 시간 후에 정상 상태에 도달하는 것을 관찰하였다. 0 시간 시점에서, 방사성의 85%가 혈장 분획에서 잔여물을 갖는 리포좀 분획에서 회복되었다. 방사성이 조합된 리포좀에서 감소는 해리된 scFv 항체의 30% 초과로 24 시간 이내에 더욱 명확해졌고 혈장 분획으로부터 회복되었다. 리포좀 분획에서 초기 scFv 항체 감소로, 혈장 분획에서 방사성의 양이 96 시간 배양시간을 통하여 대략 50% 해리에 상응하는 증가(리포좀 분획의 감소에 상응함)를 보여준다.
따라서, 한 구체예에서, 생체 내 투여 24 시간 후, 더욱 바람직하게는 투여 48 시간 후 및 더더욱 바람직하게는 투여 96 시간 후, 평균적으로 리포좀 당 두개의 항체 초과 및 평균적으로 리포좀 당 150 항체 미만을 갖는 이뮤노리포좀 조성물이 제공된다. 다른 구체예에서, 이뮤노리포좀 조성물은 평균적으로 리포좀 당 초기 항체 양을 가지며, 조성물을 제공하기 위하여, 생체 내 투여되는 이뮤노리포좀 복용량으로부터 30-60%의 항체 해리를 가지며, 생체 투여 48 또는 96 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 50 항체 미만, 더욱 바람직하게는 평균적으로 리포좀 당 약 30 항체 미만 및 더더욱 바람직하게는 평균적으로 리포좀 당 약 15 항체 미만을 갖는다. 하나의 바람직한 구체예에서, 평균적으로 이뮤노리포좀은 평균적으로 리포좀 당 항체를 2 내지 15 포함한다. 선별된 시간, 이를 테면, 24, 48 또는 96 시간 동안 37℃, 인간 혈장에서 이뮤노리포좀을 배양하고 리포좀으로부터 항체(또는 지질-중함체-항체 작제물)를 해리하기 위하여 적절한 분석 기술을 이용하여 분석하는 시험관 내 분석을 이용하여 생체 내 리포좀 당 항체의 수를 측정할 수 있다는 것은 이해 될 것이다.
래트에 단회 정맥 주사 후 이뮤노리포좀에서 항체의 안정성을 측정하기 위한 생체 내 연구를 수행하였다. 실시예 5에서 기재한 바와 같이, 래트를 125I-표지 이뮤노리포좀(15:1 제형) 또는 125I-표지 scFv 항체-PEG-DSPE 컨쥬게이트로 정맥 주사하여 처리하였다. 혈액 샘플을 투여 5분 및 1, 3, 8, 24 및 48 시간 후에 채취하였다. 총 혈액 샘플 및 혈장 샘플에서 125I를 측정하였고 주사된 농도의 퍼센트(%)로 나타내었다. 또한 이뮤노리포좀으로 처리한 그룹으로부터의 혈장 샘플을 독소루비신 농도에 대하여 분석하였다. 게다가, 각각의 시점에서 혈장 샘플의 부분을 크기-배제 컬럼으로 통과시켜 리포좀-결합 컨쥬게이트로부터 유리 컨쥬게이트를 분리하여 리포좀 분획과 조합된 방사성이 있는 지를 결정하였다.
도 6a는 혈장 샘플의 리포좀 분획에서 회수된 방사성표지된 scFv 항체-PEG-DSPE 컨쥬게이트의 퍼센트를 보여준다. 모든 시점을 통하여 방사성의 85% 미만이 단지 리포좀 분획에서 발견되었다. 이는 모든 유리 항체 또는 컨쥬게이트(즉 해리된 리포좀이 아닌)가 순환으로부터 빠르게 제거됨을 가르킨다.
도 6b는 세파로오스 CL-4B 컬럼에서 분리 후 혈장의 리포좀 분획에서 방사성표지된 유리 scFv 항체의 농도를 보여준다. 이 분획에서 scFv 항체의 양은 매우 작은 양(100 ng/mL 이하)으로 회복되어 중요하지 않았다. 연구 기간을 통하여, 유리 scFv 항체의 회복은 총 회복의 15% 미만이었다.
리포좀 분획, 즉, 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형의 투여 후 "유리 항체" 또는 "유리 컨쥬게이트"와 조합되지 않은 방사표지된 scFv 항체의 농도를 도 6c에 나타낸다. 처음의 시점(5분)에서, 초기의 방사표지된 scFv 항체 농도는 예상된 주사 농도의 20%까지 감소하였다. 방사표지된 scFv 항체 제거의 초기 비율은 처음의 10 시간 동안 또는 투여 후에 빨랐다. 투여 후 처음의 48 시간 동안, 방사표지된 scFv 항체 농도는 처음의 시점에서 방사표지된 scFv 항체 농도의 90%까지 감소하였다. 비교해 보면 순환에서 독소루비신의 40%가 남았다(도 7a).
실시예 5에서 기재한 바와 같이, 또한 이뮤노리포좀 및 독소루비신의 약물 동력 변수를 측정하였다. 표 2에 약물 동력 변수를 요약한다. 도 7a-7b는 시간함수로서의 농도를 나타낸다.
표 2: 15:1 이뮤노리포좀 제형 및 scFv -항체-PEG- DSPE 컨쥬게이트의 약물 동력 변수
Figure 112007083668136-PCT00001
a 마지막 시점(투여 96 시간(h) 후)에 대하여 수치 적분을 이용하여 계산함.
b 정상 상태에서 분포 용적.
c 혈장으로부터의 독소루비신의 제거.
도 7a는 혈장(다이아몬드) 및 혈액(폐쇄 사각형)에 남아있는 125I-표지 scFv 항체의 퍼센트; 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, 혈장(삼각형)에서 독소루비신의 퍼센트를 나타낸다. 또한 유리 컨쥬게이트 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, 혈장(개방 원) 및 혈액(개방 사각형)에서 125I-표지 scFv 항체의 퍼센트를 나타낸다. 이뮤노리포좀을 투여한 동물 및 125I-표지 scFv 항체-PEG-DSPE 컨쥬게이트를 투여한 동물 둘 모두에서 투여 5분 후 혈액 및 혈장에서 방사성이 피크되었다. 이뮤노리포좀을 투여한 동물에서, 혈액 및 혈장의 125I 수준은 각각 5분에서 78.4 ± 4.1 및 77.2 ± 3.7%이었고, 96 시간에서 4.4 ± 0.9 및 4.1 ± 0.8%이었다. 혈장에서 독소루비신 농도는 5분에서 127 ± 19.7% 또는 69.4 ± 10.8 μg/mL이었고 96 시간에서 11.8 ± 3.9% 또는 6.4 ± 2.2 μg/mL이었다. 크기-배제 컬럼으로부터 용출된 125I의 프로필은 컬럼 유출의 리포좀 분획에 상응하는, 단일 피크를 보여주었다. 혈액 및 혈장에서 주사된 125I 농도의 퍼센트를 기초로 한 이뮤노리포좀의 반감기의 제거는 각각, 25.6 시간(h) 및 25.0 시간이었다. 혈장에서 독소루비신의 농도를 기초로 한 이뮤노리포좀의 반감기의 제거는 31.6 시간이었다.
25I-표지 scFv 항체-PEG-DSPE 컨쥬게이트를 처리한 동물에서, 혈액 및 혈장의 125I 수준은 각각, 5분에서 41.8 ± 6.0 및 40.8 ± 3.1%이었고, 8 시간에서 2.9 ± 0.6 및 2.7 ± 1.1%이었다. 24 또는 48 시간 시점에서는 방사성이 검출되지 않았다. 혈액 및 혈장에서 컨쥬게이트의 반감기의 제거는 각각, 2.1 및 2.0 시간이었다.
도 7b는 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, μg/mL로 나타낸 독소루비신의 혈장 농도를 보여준다. 보는 바와 같이, 독소루비신은 투여 96 시간 후 혈액에 존재한다.
도 8은 래트에 15:1 이뮤노리포좀 제형 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/μg으로 나타낸, 혈액에서 독소루비신에 대한 25I-표지 scFv 항체 비의 플랏이다. 투여 후 처음의 24 시간 동안 성분의 비가 감소한 다음 투여 후 약 50 시간에서 평평해진다. 감소 비는 순환으로부터 리포좀의 제거 또는 리포좀으로부터 독소루비신의 상실보다 빠른 비율로 scFv 항체가 리포좀으로부터 상실됨을 보여준다.
요약하자면, 생체 내 연구는 이뮤노리포좀이 래트에 단회 정맥 투여 후 96 시간 동안 순환에서 존재함을 나타낸다. 항체-PEG-DSPE 컨쥬게이트는 크기-배제 크로마토그래피로 증명된 것과 같이 리포좀과 밀접하게 조합되었다. 125I-표지 이뮤노리포좀 투여 후 혈액/혈장에서 125I의 반감기는 대략 25 시간이었고, 혈장에서 독소루비신의 반감기는 31.6 시간이었다. 유리 형태로 투여한 경우, 항체-PEG-DSPE 컨쥬게이트는 단회 정맥 투여 후 대략 8 시간 동안 순환에서 존재하였다. 유리 컨쥬게이트의 순환 반감기는 대략 2 시간이었다. 혈청에서 이뮤노리포좀의 안정성을 측정한 생체 내 데이터는 모든 시점을 통하여, 리포좀 분획에서 방사성의 85% 초과가 존재하였음을 나타내었으며, 이는 해리된 항체 또는 유리 항체-컨쥬게이트가 혈청 분획으로부터 빠르게 제거됨을 의미한다. 이뮤노리포좀은 혈청 및 혈액 모두에서 대략 25 시간으로 측정된 반감기를 가진 반면 유리 항체 또는 항체-컨쥬게이트의 반감기는 혈액 및 혈장 둘 모두에서 대략 2 시간이었다(표 2).
실시예 6은 리포좀 당 15, 75, 150 및 300 scFv 항체를 갖는 이뮤노리포좀 제형의 약물 동력 측정하기 위하여 수행된 다른 생체 내 연구를 기재한다. 요약하자면, 이뮤노리포좀 제형의 하나를 단회 정맥 주사로 처리하였다. 대조군 마우스에 페길화 리포좀 독소루비신을 투여하였다. 대략적으로 투여 5분 및 4, 8, 24, 48, 72 및 96 시간 후 혈장을 수집하였고 총 독소루비신을 측정하였다. 결과는 도 9에 나타낸다.
대조 제형(다이아몬드)으로 처리한 동물 및 15:1(폐쇄 사각형) 및 75:1(삼각형) 이뮤노리포좀 제형으로 처리한 동물에서 유사 독소루비신 농도 대 시간 프로필을 측정하였다. 리포좀 당 150(X 표시) 및 300(* 표시)를 갖는 이뮤노리포좀으로 처리한 동물에 대하여, Cmax, AUC 및 반감기에 대하여 유의하게 낮은 값을 측정하였고, 빠른 제거 및 더 높은 분포 용적을 동반하였다.
도 9의 데이터로부터 결정된 약물 동력 변수를 표 3에 나타낸다.
Figure 112007083668136-PCT00002
AUClast =마지막 측정된 시점에 대하여 계산된 곡선-아래-부위.
처음의 샘플링 시점, 즉 주사 후 대략 5분에서 혈장의 독소루비신 농도가 피크되었다. 페길화 리포좀 대조군 제형, 15:1 이뮤노리포좀 제형 및 75:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스에서 Cmax 값은 각각 39.0 + 0.27, 39.9 + 5.49 및 43.3 + 1.30 μg/mL이었다. 상응하는 약제 수준은 투여 24 시간 후, 각각 10.1 ± 1.82, 9.05 ± 0.69 및 13.6 ± 5.0 μg/mL로, 투여 96 시간 후, 각각 0.32 ± 0.19, 0.56 ± 0.41 및 0.28 ± 0.12 μg/mL로 감소하였다. 매우 유사한 약물 동력 프로필이 새 개의 처리 그룹에서 측정되었다. 150:1 이뮤노리포좀 제형 및 300:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스에서 Cmax 값은 75:1 또는 그 보다 낮은 이뮤노리포좀 제형, 즉, 각각 20.6 ± 3.88 및 10.5 ± 6.13 μg/mL로 처리한 마우스에서보다 주목할만하게 감소되었다. 상응하는 약제 수준은 24 시간에서 각각 4.56 ± 0.52 및 0.58 ± 0.19 μg/mL로 감소하였다. 96 시간의 끝부분에서, 150: 1 및 300:1 이뮤노리포좀 제형으로 처리한 그룹의 동물의 반은 혈장에서 약제 수준이 검출되지 않았다.
페길화 리포좀 대조군 제형, 15:1 이뮤노리포좀 제형 및 75:1 이뮤노리포좀 제형이 투여된 마우스에서 AUClast 값은 각각 751.5, 763.1 및 898.3 μg·h/mL이었다. 150:1 및 300:1 이뮤노리포좀 제형이 투여된 마우스에서 AUClast 값은 각각 287.7 및 81.5 μg·h/mL이었다.
페길화 리포좀 대조군 제형, 15:1 이뮤노리포좀 제형 및 75:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스에서 혈장 반감기는 각각 14.8, 17.0 및 12.8이었다. 150:1 및 300:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스에서 혈장 반감기는 각각 3.30 및 3.91 시간이었다.
페길화 리포좀 대조군 제형, 15:1 이뮤노리포좀 제형 및 75:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스에서 독소루비신의 혈장 제거는 각각 0.070, 0.068 및 0.059 mL/시간(hr)이었다. 150:1 및 300:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스에서 독소루비신의 혈장 제거는 각각 0.183 및 0.645 mL/hr이었다.
페길화 리포좀 대조군 제형, 15:1 이뮤노리포좀 제형 및 75:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스에서 분포 용적은 각각 1.49, 1.50 및 1.23 mL이었다. 150:1 및 300:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스에서 분포 용적은 각각 3.57 및 12.0 mL이었다.
실시예 6에서는 0, 15 또는 75의 scFv/리포좀 비를 함유한 리포좀의 단회 환약 투여 후 마우스에서 관찰된 약물 동력 프로필을 보여준다. 150 또는 300의 scFv/리포좀 비를 함유한 이뮤노리포좀을 투여한 동물에 있어서, 더 빠른 제거 및 더 높은 분포 용적을 동반하는, Cmax, AUC 및 반감기에 대하여 더 낮은 값을 관찰하였며, 여기에서, 변수는 리간드 농도에 대하여 반비례하였다. 따라서, 한 구체예에서, 표적 항체가 결여된 유사 리포좀 제형에 대한 AUC, Cmax 및/또는 반감기보다 (i) 30% 초과 또는 (ii) 30% 이하, 더욱 바람직하게는 25% 이하, 더더욱 바람직하게는 20% 이하의 AUC, Cmax 및/또는 반감기를 갖는 이뮤노리포좀 제형이 제공된다. 예를 들어, 항체가 결여된 대조군 페길화 리포좀 제형의 AUC는 751 μg·h/mL이었다. 15:1 및 75:1 이뮤노리포좀 제형의 AUC는 각각 763 μg·h/mL 및 898 μg·h/mL이었다. 15:1 이뮤노리포좀 제형은 항체 부재를 제외한 조성물과 동일하게 상응하는 리포좀 제형의 AUC보다 1.6% 낮은(즉, 25% 이하로 낮은) AUC 값을 가졌다. 75:1 이뮤노리포좀 제형은 상응하는 리포좀 제형의 AUC보다 큰 AUC 값을 가졌다. 대조적으로, 150:1 및 300:1 이뮤노리포좀 제형에 대한 AUC 값은 리포좀 제형의 AUC보다 30%를 초과하여 유의하게 낮았다. 유사하게, 75:1 및 15:1 이뮤노리포좀 제형에 대한 Cmax 및 반감기의 약물 동력은 리포좀, 비-항체 표적화 리포좀 제형과 상응하는 변수보다 25% 초과하여 낮았다.
따라서, 도 2a 및 도 5b의 데이터를 고려할 경우 도 9의 데이터는 이뮤노리포좀 제형 및 한 구체예에서 약 20,000-50,000 달톤, 더욱 바람직하게는 25,000-35,000 달톤의 분자량을 함유하는 이뮤노리포좀은 생체 내 투여 전 바람직하게 평균적으로 리포좀 당 약 4-30(종말점을 포함) 항체, 더욱 바람직하게는 평균적으로 리포좀 당 약 5-25(종말점을 포함) 항체 및 더더욱 바람직하게는 평균적으로 리포좀 당 약 6-20(종말점을 포함) 항체를 가짐을 가르킨다. 생체 내 투여 전 리포좀 당 항체 수에 대한 다른 바람직한 범위는 약 5-30, 약 6-25 및 약 4-15 및 약 7-15이다.
다른 바람직한 구체예에서, 이뮤노리포좀 제형은 생체 내 투여 약 96 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 2 항체 초과 약 16 항체 미만을 가지며, 더욱 바람직하게는 생체 내 투여 약 96 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 2 항체 초과 약 12 항체 미만을 가지며, 더더욱 바람직하게는 생체 내 투여 약 96 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 2 항체 초과 약 10 항체 미만을 가지며, 가장 바람직하게는 생체 내 투여 약 96 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 2 항체 초과 약 8 항체 미만을 갖는다. 대안적으로, 이뮤노리포좀 제형은 혈액에서 생체 순환 약 48 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 2 항체 초과, 생체 내 정맥 투여 약 48 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 20 항체 미만을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명은 표적 항체가 결여된 유사한 리포좀 제형의 AUC의 30% 이내, 바람직하게는 25% 이내, 더욱 바람직하게는 20% 이내인 AUC를 갖는 이뮤노리포좀 제형을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 표적 항체가 결여된 유사한 리포좀 제형의 용량-표준화 AUC의 30% 이내, 바람직하게는 25% 이내, 더욱 바람직하게는 20% 이내인 용량-표준화 AUC를 갖는 이뮤노리포좀 제형을 제공한다.
다른 연구는 이뮤노리포좀 조성물의 항종양 효과를 측정하기 위하여 수행하였다. 실시예 7에서 기재한 바와 같이, 세포 표면에서 HER2 수용체를 디스플레이한다고 공지된 BT-474 인간 유방 종양이 이종이식된 마우스를 표적 항체를 갖지 않거나(대조군) 리포좀 당 7.5, 15, 30 또는 45 항체를 갖는 이뮤노리포좀 제형으로 처리하였다. 결과는 도 10a-10b에 나타낸다.
도 10a는 살린(개방 원), 독소루비신(개방 사각형)을 함유하는 페길화 리포좀 또는 리포좀 당 7.5(다이아몬드), 15(삼각형), 30(폐쇄 사각형) 또는 45(폐쇄 원) scFv 항체를 함유한 이뮤노리포좀 투여 후 마우스에서 퍼센트로 나타낸 상대적 종양 용적을 보여준다. 살린 대조 그룹(개방 원)에서 종양은 평균 23.9 ± 7.5일에서 4배의 크기가 되었다. 45:1, 30:1, 15:1 및 7.5:1의 항체:리포좀 비를 갖는 이뮤노리포좀 제형으로 처리한 동물은 각각 35.1 ± 2.9, 32.9 ± 4.4, 36.1 ± 1.9 및 38.0 ± 0일 이상에서 4배의 종양 용적을 가졌다. 대조 리포좀 제형(Doxil®, 개방 원)으로 처리한 동물에서 종양은 29.2 ± 6.0일 이상에서 4배 크기의 종양을 가졌다. 38일 연구의 끝에서, 45:1, 15:1 및 7.5:1의 항체:리포좀 비를 갖는 이뮤노리포좀으로 처리한 그룹에서 각각의 동물은 종양을 갖지 않거나 작은 혹의 크기가 10 ㎣보다 작았다.
살린 대조군과 비교할 경우 리포좀 또는 이뮤노리포좀 독소루비신을 처리한 모든 동물에서 종양 성장 지연을 나타내었다. HER2-표적화 이뮤노리포좀 제형으로 처리한 동물은 비-표적화 리포좀 독소루비신(Doxil®)을 처리한 동물에서보다 종양 성장에서 다소 큰 지연을 가졌다.
도 10b는 처리 기간 동안 테스트 동물의 체중 변화의 퍼센트를 나타낸다.
요약하자면, 연구는 독소루비신이 봉입된 리포좀으로 처리되거나 독소루빈신이 봉입된 이뮤노리포좀으로 처리된 이 BT-474 인간 유방 암 이식 모델을 대조 동물의 항종양 활성과 비교할 경우 항종양 활성의 향상의 결과를 나타낸다. 이뮤노리포좀 제형 7.5-45에서 항체:리포좀 비의 다양함에 의한 항종양 효과의 상이함은 없었다.
종양-함유 마우스의 생체 내 용량 범위 연구에서 측정을 위하여 15:1 이뮤노리포좀 제형을 선별하였다. 실시예 8에서 기재한 바와 같이, 마우스를 페길화 리포좀에 봉입되거나 이뮤노리포좀에 봉입된 독소루비신의 다양한 농도(2, 3, 4 mg/kg)로 처리하였다. 모든 마우스에 3주 동안 매 주마다 적절한 제형의 정맥 투여를 하였다. 종양의 크기를 종양 용적에 대하여 격주마다 측정하였고, 결과는 도 11에 나타낸다.
도 11은 유방암 이종 이식을 갖는 마우스를 살린(개방 원), 2 mg/kg(개방 사각형) 및 3 mg/kg(개방 다이마몬드) 농도의 독소루비신을 함유하는 폐길화 리포좀 또는 2 mg/kg(폐쇄 사각형), 3 mg/kg(폐쇄 다이아몬드) 또는 4 mg/kg(폐쇄 삼각형)농도의 15:1 이뮤노리포좀 제형으로 처리하고 일수로 나타내는, 시간 함수로서, 초기 종양 용적의 퍼센트에 대한 상대적 종양 용적의 플랏이다. 처리하지 않은 대조 동물(개방 원)에서 종양은 평균 11.1 ± 1.9일에서 3배 종양 용적(tumor volume tripling time; TVTT)을 가졌다. 2, 3 및 4 mg/kg(각각 개방 사각형, 다이마몬드, 삼각형)의 리포좀 독소루비신으로 처리한 동물은 각각 16.7 ± 4.8 days, 26.0 ± 3.9 및 34.2 ± 9.0일 이상에서 3배 종양 용적(TVTT)을 가졌다. 15:1 이뮤노리포좀 제형으로 처리한 동물은 각각 2, 3 및 4 mg/kg 농도 수준에 대하여 34.2 ± 6.6, 29.5± 8.6 및 49.0 초과에서 TVTT되었다.
종양 성장 지연은 처리하지 않은 대조 그룹과 비교할 경우 모든 약제 처리 그룹에서 관찰되었다. 이뮤노리포좀 처리 그룹에 대해서는 아니었지만 폐길화 리포좀 처리 그룹에 대해서는 농도 반응 관계를 나타내었다. 그러나, 4 mg/kg의 15:1 이뮤노리포좀 처리는 모든 다른 처리 그룹에서보다 종양 성장에 더 큰 지연을 나타냈으나 관계는 이뮤노리포좀 처리 그룹에 대하여 명백하지 않다. 2 및 4 mg/kg의 15:1 이뮤노리포좀의 처리는 4 mg/kg의 페길화 리포좀을 처리한 마우스에 대한 TVTT보다 큰 TVTT를 제공하였다. 더 나아가, 각각 농도의 15:1 이뮤노리포좀에 대한 TVTT는 페길화 리포좀을 처리한 마우스에 대한 TVTT보다 컸다.
다른 연구에서, 실시예 9에서 기재한 바와 같이, 봉입된 독소루비신 및 평균적으로 리포좀 당 15 scFv 항체를 함유하는 이뮤노리포좀 제형은 단일 정맥 주사에 대하여 3개의 농도로 투여되었다. 이뮤노리포좀, 독소루비신 및 항체의 약물 동력을 측정하였고 결과는 도 12-14에 나타낸다.
도 12는 독소루비신 농도 10 mg/mL의 15:1 이뮤노리포좀 제형(원) 및 페길화 리포좀(사각형)을 원숭이에 정맥 투여 후, 시간으로 나타내는, 시간 함수로서, ng/mL로 나타낸 혈장 독소루비신의 농도를 보여준다. 이뮤노리포좀의 혈액 순환 반감기는 scFv 항체가 결여된 페길화 리포좀과 기본적으로 동등하다.
도 13a-13b는 1 mg/kg(원), 5 mg/kg(사각형) 및 10 mg/kg(삼각형)의 독소루비신 농도로 15:1 이뮤노리포좀의 정맥 투여 후 시간 함수로서 혈장 독소루비신 농도(도 13a) 및 혈장 항체 농도(도 13b)를 보여준다. 혈장에서 총(유리 및 봉입된) 독소루비신 농도는 투여 후 시간 함수에서 감소된다(도 13a). 총(유리 및 해리된 이뮤노리포좀) 항체 농도는 투여 4 시간 후에서 큰 초기 감소를 나타낸 다음 천천히 감소한다.
항체 대 독소루비신 농도의 비를 도 13a-13b에 나타낸 데이터로부처 측정하였고 도 14a-14b에 나타낸다. 도 14a에서, 혈장에서 scFv 항체/독소루비신 농도의 농도 비는 ng/μg로 나타낸다. 도 14b에서 비는 초기 항체/독소루비신에 대하여 표준화하고 퍼세트로 나타낸다. 두개의 도에서, 1 mg/kg, 5 mg/kg 및 10 mg/kg의 독소루비신 농도로 투여된 이뮤노리포좀을 각각 다이아몬드, 사각형 및 삼각형으로 나타낸다. 두 데이터는 투여 후 처음 4 시간에서, 리포좀으로부터 해리된 항체의 대략 40%의 항체 상실 및 투여 후 8 시간 이내에 혈류로부터 제거된 항체를 설명한다. 이뮤노리포좀으로부터 항체의 상실 또는 이뮤노리포좀으로부터 지질-중합체-항체 작제물의 상실일 수 있는 항체 상실을 설명하는 데이터는 이해될 것이다.
따라서, 이뮤노리포좀 제형은 설계될 수 있으며, 여기에서 이뮤노리포좀은 약 24 시간 또는 48 시간의 생체 내 순환 동안 조합된 항체의 20-50%를 상실하지만, 이뮤노리포좀은 세포독성을 위하여 충분한 HER2 수용체에 대한 결합을 유지한다. 상기 설명한 바와 같이, 비-표적화 리포좀 독소루비신과 비교하여 시험관 내 세포독성을 위하여 약 두개 이상의 항체가 요구된다.
따라서, 생체 내 투여를 위한 이뮤노리포좀 제형을 제조하는 방법이 제공되며, 여기에서 친수성 부분-소수성 중합체-항체 작제물은 리포좀 당 제 1의 선택된 항체의 수를 제공하기에 충분한 제 1의 양으로 제형에 포함된다. 이뮤노리포좀을 시험관 내 또는 생체 내에서 혈액과 접촉시키기 위하여 제공하고 혈액과 리포좀의 접촉에서 하나 이상의 시점에서 이뮤노리포좀 당 항체의 수가 결정된다. 예를 들어, 시험관 내 용기로부터 혈액의 분치물을 취하거나 동물로부터 혈액 샘플을 취한다. 많은 적절한 분석 기술, 이를 테면 방사면역측정법, 크로마토그래피, 전기영동 등 중 임의의 것을 이용하여 항체의 수에 대하여 혈액을 분석한다. 복수의 시점에서 항체의 수가 측정된다면, 혈액에서 시간 함수로서 항체 상실을 보여주는 플랏이 작제될 수 있다. 이 정보를 이용하여, 혈액과 접촉 후 선별된 시점에서의 항체의 수가 결정되며 두번째로 제공하기에 충분한 친수성 부분-소수성 중합체-항제 작제물의 제 2의 양, 이러한 시점에서 혈액과 접촉 후 리포좀 당 적어도 두개의 항체를 제공하기 위하여 리포좀 당 더 많은 항체의 수가 선택된다. 다음으로 작제물의 제 2의 양을 이용하여 이뮤노리포좀이 제조된다. 예를 들어, 투여 96 시간 후 리포좀 당 5 항체를 가지며, 혈액 배양 데이터가 이뮤노리포좀으로부터 약 50%의 항체 해리를 보이거나 표적 수용체와 상호작용을 위하여 이용할 수 없다면, 이뮤노리포좀은 초기에, 생체 내 투여 전에 적어도 10 항체를 포함하여야 한다. 통상, 컨쥬게이트의 제 2의 양은 즉, 초기, 항체 수 투여 전에 제공하기 위하여 선택된 컨쥬게이트의 양은 리포좀 당 50 미만 항체, 더욱 바람직하게는 리포좀 당 30 이하로 수득되기 위하여 선택된다.
다른 구체예에서, 상기 약물 동력 데이터의 일부에서 기초된 방법은 리포좀 당 150 항체 미만, 더욱 바람직하게는 리포좀 당 100 항체 이하 및 더더욱 바람직하게는 리포좀 당 75 항체 이하로 제공되는 컨쥬게이트의 제 1의 양을 갖는 리포좀을 제공하는 것을 포함한다.
III . 이용 방법
리포좀은 봉입된 형태로 치료용 또는 진단용 시약을 포함한다. 봉입은 리포좀의 지질 이중층(들)에서 시약의 봉입뿐만 아니라 리포좀의 수용성 코아 및 수용성 공간에서 시약의 캡슐화를 포함한다. 본 발명의 조성물의 이용을 위하여 봉입된 시약는 매우 다양하고, 치료용 및 진단용 적용에 대하여 적절한 시약의 예는 하기에 제공된다.
투여되는 용량은 공지된 인자, 이를 테면, 특정한 시약의 약력학 특성 및 투여의 형태 및 경로; 수령자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 현행 치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과에 따라 매우 다양할 수 있다. 용량은 1회 또는 시간, 일 또는 주의 선택된 간격으로 제공되는 주기적인 용량일 수 있다.
임의의 적절한 투여 경로는 정맥 및 다른 비경구 형태인 것이 바람직하다.
다른 관점에서, 조합된 치료 처방이 계획될 수 있으며, 여기에서, 상술한 바와 같이 이뮤노리포좀 조성물은 제 2의 시약과 조합하여 투여될 수 있다. 제 2의 시약은 생물학적 시약, 이를 테면, 펩티드, 항체 등뿐만 아니라 다른 약제 화합물을 포함하는 임의의 치료용 시약일 수 있다. 제 2의 시약은 이뮤노리포좀 투여와 동시에 또는 연속적으로 같거나 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 특별히 바람직한 조합은 제한하는 것은 아니지만, 시클로포스파미드, 택산, 비노렐빈, Herceptin® 및 Avastin®을 포함한다. Her2-표적화 리포좀은 비-표적화 리포좀, 이를 테면, DOXIL®에서 투여된 동량의 같은 약제의 농도에 비교하여 더 나은 완전한 종양 억제를 제공한다. 따라서 치료 처방은 Her2-표적화 이뮤노리포좀 및 제 2의 치료용 시약이 봉입된 제 1의 세포독성 시약의 농도를 포함하여 계획되며, 여기에서, 시약의 하나 또는 둘 모두가 개선된 임상적 결과, 이를 테면, 더 나은 종양 억제를 달성하기 위하여, 단독으로 투여된 약제에 대하여 요구되는 농도보다 작은 농도로서 투여된다. Her2-표적화 이뮤노리포좀이 두개 이상의 약제의 조합으로 투여될 수 있다는 것은 이해될 것이다. 특정한 환자를 위한 적절한 약제는 숙련된 의료 조력자에 의해 식별될 수 있다. 리포좀 및 두개 이상의 시약에 봉입된 화학 요법 시약을 포함하는 Her2-표적화 이뮤노리포좀 조성물로 구성된 치료 처방이 계획될 수 있으며, 여기에서 시약의 적어도 하나 및 바람직하게는 하나 이상이 개선된 임상적 결과를 달성하기 위하여, 단독으로 제공된 경우 추천되는 시약의 농도보다 작은 농도로 투여된다.
본원에서 기재한 치료 방법은, 하나의 구체예에서, 세포 당 105 HER2 수용체보다 및 바람직하게는 세포 당 106 HER2 수용체보다 많이 발현하는 환자 집단에 투여를 위한 것이다. 세포 수용체의 밀도는 면역 조직 화학 및 이러한 결정을 위하여 구입할 수 있는 키트, 이를 테면 HercepTest®를 이용하여 측정될 수 있다. 본원에서 기재한 항체가 세포에 의해 내면화되고, 세포내적으로 전달되는 약제가 증가하므로, 세포 당 105 HER2 수용체보다 및 바람직하게는 세포 당 106 HER2 수용체보다 많이 발현하는 대상은 특히 본원에서 기재한 HER2-표적화 이뮤노리포좀 조성물에 잘 반응한다. 방법에서 생검 또는 적절한 생물학적 샘플은 환자로부터 수득되며, 샘플은 종양 세포 당 HER2 수용체의 수를 결정하기 위하여 분석되고, 수용체의 수가 세포 당 106 HER2 수용체보다 많다면 환자는 본원에 기재된 이뮤노리포좀 조성물로 처리된다. 한 바람직한 구체예에서, 환자는 세포 당 3+(2,000,000) 수용체의 IHC 점수를 갖는다.
IV. 실시예
하기 실시예는 더 나아가 본원에 기재된 발명을 설명하려는 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
재료: 수소화 대두 포스파티딜콜린(Hydrogenated soy phosphatidylcholine; HSPC)은 lipoid K. G.(Ludwigshafen, Germany)에서 구입하였다. 콜레스테롤은 Croda, Inc.(New York, NY)로부터 제공받았으며 N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜에탄올아민, 나트륨 염(mPEG-DSPE)은 Syngena, Ltd.(Liestal, Switzerland)로부터 제공받았다. 염산독소루비신 은 Meiji Seika Kaisha Ltd.(Tokyo, Japan)로부터 제공받았다. 방사성 컨쥬게이트(scFv-PEG-DSPE)는 Hermes Bioscience(San Francisco, CA)로부터 0.0983 mCi/mL의 특정한 활성으로 제공받았다. 인간 혈장은 Bioreclamation(East Meadow, NY)로부터 제공받았다. 컬럼 성분-세파로오스 CL-4B는 Amersham Pharmacia(Uppsala, Sweden)로부터 제공받았다. 0.4% 아지드화 나트륨(Sigma, St Louis, Mo)를 포함하는 용출 버퍼-염화나트륨 용액(0.9% NaCl)은 Baxter(Deerfield, IL)로부터 제공받았다.
실시예 1
HER2 -표적화 이뮤노리포좀 의 제조
봉입된 독소루비신을 함유하는 리포좀을 Alza Corporation Mountain View, CA (DOXIL®)로부터 제공받았다. 리포좀을 수소화 대두 포스파티딜콜린(HSPC, 56.4 mole%), 콜레스테롤(38.3 mole%) 및 메톡시폴리에틸렌 글리콜-디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(methoxypolyethyleneglycol-di-stearoyl-phosphatidylethanolamine; mPEG-DSPE, 5.3 mole%, mPEG MW 2000 Da)로 구성하였다. 최종 제제에서 독소루비신의 농도는 1 mM 지질 당 100 μg이었다. 제조를 위하여 이용된 내부버퍼는 10% 수크로오스이었고 외부 버퍼는 10% 수크로오스 및 10 mM 히스티딘이었다. 최종 제형에서 리포좀의 평균 직경은 93 nm이었다.
당업계에 공지된 절차 및 상기에서 간단하게 논의되었고 도 1a-1b에서 설명 한 것과 같이, 항-HER2 수용체 scFv 항체(서열번호 2)를 일단 말레이미드-유도된 페길화 인지질(maleimide-derivatized PEGylated phospholipid; mPEG-DSPE)로 컨쥬게이트하여 지질-PEG-scFv 컨쥬게이트를 형성하였다.
다음으로 지질-중합체-항체 작제물의 미셀 현탁액과 리포좀을 배양하여 지질-PEG-항-HER2 항체 작제물을 독소루비신-적재 리포좀의 지질 이중층에 결합시켰다. 평균적으로 2, 5, 7.5, 15, 30, 45, 75, 100, 150 및 300 항체를 함유하는 이뮤노리포좀을 표 A에 요약한 바와 같이, 인지질의 몰 당 항체의 양을 조정함으로써 제조하였다.
표 A
scFv 항체:리포좀 비 인지질 uM 당 scFv 항체 양(㎍)
150 60
100 40
75 30
45 18
30 12
15 6
7.5 3
5 2
2 0.8
이뮤노리포좀 당 항체의 이론적 평균 수를 단백질 및 인지질 농도를 결정함으로써 확인하였고 항체의 수를 100 nm 리포좀 당 80,000 인지질의 평균 및 28.714 kDa의 항체 분자량을 기초로 하여 계산함으로써 확인하였다. 이뮤노리포좀에서 항체의 수를 항체 분자량, 리포좀의 크기 및 리포좀의 조성물을 결정함으로써 이뮤노리포좀의 형성 후에 결정할 수 있다. 15:1 이뮤노리포좀 제형에 대한 예로서, scFv 항체 15 몰/인지질 80,000 몰 x 28.714 kDa = 5.4 g/mol이다. 배양하는 동안 리포좀에 삽입 또는 조합된 컨쥬게이트가 90%라고 가정한다면: 5.4/90% = 인지질 1 μmol 당 첨가된 6 μg scFv 항체이다. 따라서, 본원에 기재된 이뮤노리포좀 당 항체의 수는 집단에서 리포좀 당 항체의 평균 수가 보고된, 리포좀 집단에서 항체의 평균 분포를 반영한다.
지질-중합체-항체 컨쥬게이트를 리포좀과 결합시킨 후, 독소루비신의 농도는 1 mM 지질 당 86-92 μg이었고 이뮤노리포좀의 평균 직경은 93-117 nm이었다.
실시예 2
이뮤노리포좀의 시험관 내 흡수
SK-BR-3 및 MCF7 세포를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)로부터 구입하였다. SK-BR-3 세포를 10% 우태아혈청으로 보충된 변형된 배지 McCoy's 5A에서 시험관 내 배양으로 유지하였다. MCF7 세포를 우태아혈청과 함께 듈비코 변형 이글(Dulbecco's Modified Eagles') 배지에서 유지하였다.
24-웰 플레이트에 SK-BR-3 또는 MCF7 세포를 웰 당 1.5 × 105 세포 / 0.5 mL 성장 배지로 첨가하였다. 부착 및 순화를 위하여 하룻밤 동안 배양 후, 세포를 2회 반복하여 이뮤노리포좀(항-HER2 항체: 리포좀; 7.5:1, 15:1, 30:1 및 45:1) 또는 웰 당 0.5 mL 성장 배지에서 0.015 mg/mL의 리포좀으로 처리하였다. 다음으로 24-웰 플레이트를 4 시간 동안 37℃, 5% CO2 및 100% 습도에서 40-60 rpm으로 회전하는 배양기 내부에 넣고 회전 플렛폼에 두었다. 배양 후, 세포 배지를 흡인하고 세포를 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)으로 4회 세정하였다. 이 후, 세포를 각각의 웰에 1% Triton X-100 0.1 mL을 첨가하여 용해하였다. 플레이트를 회전시켜 혼합하고 상온에서 15분 동안 회전 플랫폼에 두었다. 이 단계 동안, 세포가 플레이트의 바닥으로부터 분리되고 세포 핵이 눈에 보이는 클럼프로 형성되었다. 액시드 이소프로판올(1.0 mL)을 Triton X-100 용액을 함유하는 웰에 첨가하고 눈에 보이는 클럼프가 없어질 때까지 회전 또는 피펫팅으로 혼합하였다.
세포 용해물 내의 독소루비신 함량을 470 nm의 여기 파장 및 590 nm의 방사 파장을 이용하는 분광형광계로 측정하였다. 분광형광계 설정은 하기와 같이 하였다: 2 nm 너비 슬릿, 통합 시간 1초, 광전자 배증관 볼트 950 V 및 단일 파장 포착 형태. 백그라운드 세포 용해물의 형광을 제거하고 세포 용해물 내의 독소루비신 양을 다항회귀분석을 이용하는 표준 곡선에 맞춘 동시에 측정된 표준(샘플 당 독소루비신 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 및 2500 ng)으로부터 측정하였다. 독소루비신의 세포 흡수를 표준 곡선으로부터의 보간법으로 측정하였다. 데이터는 접종된 세포 당 독소루비신의 pg으로 나타내고 표 1에 보여준다. 검출 수준 미만의 값을 NS(유의적이지 않음; not significant)라 칭하였다.
실시예 3
HER2 - 표적화 리포좀의 시험관 내 세포독성
SK-BR-3 인간 유방암 세포주를 American Tissue Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)으로부터 구입하였다. 세포를 10% 우태아혈청으로 보충된 변형된 McCoy's 5A 배지에서 시험관 내 배양으로 유지하고 37℃, 가습 배양기에서 유지하였다.
세포를 유리 형태의 독소루비신(1.8 mg/mL), 페길화 리포좀에 봉입된 독소루비신(2.06 mg/mL) 또는 리포좀 당 2 항체(1.86 mg/mL), 리포좀 당 5 항체(2.12 mg/mL), 리포좀 당 7.5 항체(1.99 mg/mL) 또는 리포좀 당 15 항체(2 mg/mL)를 갖는 이뮤조리포좀 제형에 10분 동안 노출시켰다.
대수-기 SK-BR-3 인간 유방암 세포를 Versene(1:5000)을 이용하여 배양하고, 5 × 104 세포/mL 농도의 성장 배지에서 재현탁시켰다. 0.1 mL의 분취물(5 × 103 세포)을 96-웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가하였다. 부착을 위하여 하룻밤 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 테스트 물질로 대체하였다. 성장 배지로 0.0137, 0.0412, 0.1235, 0.37, 1.11, 3.33, 10 및 30 μg/mL로 희석된 독소루비신, S-DOX 또는 STEALTH 49 제형 변이체의 분취물을 각각의 웰에 3번 반복하여 첨가하였다. 테스트 물질 없는 배지를 대조 웰에 첨가하였다. 세포를 테스트 물질에 37℃에서 10분 동안 노출시켰다. 배양의 마지막에, 배지를 포함하는 약제를 흡입하고 세포를 0.2 mL 성장 배지로 세정하였다. 세정 후, 세포를 성장 조건 하에 신선한 0.2 mL 배지에서 72 시간 동안 다시 배양하였다. 배양의 마지막에, 눈에 보이는 세포의 양을 Promega CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(증식으로 눈에 보이는 세포의 수의 측정을 위하여 테트라졸리움을 기초로 한 비색분석법, Madison, WI)를 이용하여 측정하였다. 요약하자면, 웰로부터 배지를 흡입하고 신선한 0.1 mL 배지 및 Promega(Lot No. 186817) 0.02 mL로 대체하였다. 다음으로 플레이트를 490 nm에서 마이크로플레이트 리더기로 흡광도 기록한 후에 3-4 시간 동안 배양하였다. 세포 생존력을 하기 식을 이용하여 처리하지 않은 대조군의 %로 측정하였다:
생존력 % = (A-Ao)/(A100-Ao) × 100%
상기 식에서 A는 측정된 흡광도이며, A0은 공시료의 흡광도이며, A100은 처리하지 않은 세포를 갖는 웰의 흡광도이다. 세포 생존력 퍼센트를 약제 농도 함수로서 플랏하고 IC50(50% 세포 성장 저해를 일으키는 농도)을 보간법으로 측정하였다.
이뮤노리포좀 제형에 대한 대조군의 퍼센트로서의 세포 생존력을 도 2a에 요약한다.
실시예 4
혈장에서 리포좀으로부터 Her2 - 표적화 부분의 시험관 내 해리
실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조된 독소루비신을 함유하는 페길화 리포좀을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조되기에 충분한 125I-표지 지질--PEG-scFv 컨쥬게이트와 조합시켜 리포좀 당 7.5, 15, 30, 45 및 90 scFv 항체를 갖는 이뮤노리포좀을 생성하였다. 리포좀 및 컨쥬게이트를 60℃에서 1 시간 동안 배양하여 리포좀의 외부 이중층으로 컨쥬게이트를 삽입시켰다. 배양의 마지막에 용액을 냉각시킨 다음 2-8℃에 저장하였다. 각각의 리포좀 제형을 10% 수쿠로오스/10 mM 히스 티딘에 대하여 희석하고 독소루비신 함량을 측정하였다. 각각의 제형에서 리포좀은 크기, 독소루비신 캡슐화, 지질-PEG-항체 컨쥬게이트 삽입 퍼센트 및 scFv 항체 농도로 특정지었으며, 이를 표 B에 요약한다. 15 scFv 항체를 함유하는 제형의 특정적인 최종 활성은 28.4 μCi/mL이었다.
표 B
리포좀 제형 독소루비신 효능 mg/mL 독소루비신 캡슐화 % 입자 크기(nm) 90°/30° 컨쥬게이트 삽입 % scFv 항체 농도 ㎍/mL
90 scFv/리포좀 2.19 98 85/101 91 472
45 scFv/리포좀 2.00 98 83/93 90 229
30 scFv/리포좀 2.11 99 81/94 91 152
15 scFv/리포좀 2.10 99 80/94 89 79
7.5 scFv/리포좀 2.12 98 82/100 88 39
리포좀으로부터 항체, 컨주게이트 또는 둘 모두의 해리를 나타내는, 125I 표지의 해리를 하기와 같이 측정하였다. 인간 혈장을 125I-표지 HER2-표적화 이뮤노리포좀과 혼합하고 96 시간을 통하여 37℃에서 배양하였다. 각각의 시점(0, 1, 4, 8, 72, 96 시간)에서 혈장의 분취물을 이동하여 베드 용적 32 mL을 갖는 준비된 28 × 1.2 cm 세파로오스 CL-4B 컬럼에 두었다. 세파로오스 CL-4B 컬럼을 1 mL 100 mM 플라시보 리포좀 및 1 mL 래트 혈장으로 선-조정하였다. 컬럼을 0.4% 아지드화 나트륨을 함유한 0.9% 살린으로 용출하였다. 각각의 분획(1 mL)을 감마선 계측기를 이용하여 125I 방사성에 대하여 계측하였다.
총 활성을 또한 각각의 분취물에 대하여 측정하였고 세파로오스 CL-4B 컬럼으로부터의 회수는 적용된 각각의 샘플에 대하여 ∼90% 이상이었다. 모든 시점을 통하여, 적용된 분취물로부터 이동된 총 분획에 대한 상대적 컬럼으로부터 방사성의 회수는 90% 이상이었다. 결과는 하기 표에 나타내며, 15:1 이뮤노리포좀에 대한 용출 프로파일은 도 3a-3h에 나타낸다. 도 4a는 시간 함수로서 이뮤노리포좀 제형으로부터 125I 표지 해리율을 나타낸다. 도 5a는 두개의 상이한 연구에서 리포좀 당 15 항체를 갖는 이뮤노리포좀 제형으로부터 125I 표지 해리율을 나타낸다. 도 5b는 리포좀 당 15 항체를 갖는 이뮤노리포좀 제형으로부터 125I 표지의 방출이 유도된 혈장을 나타낸다.
상이한 F5/ 리포좀 비에서 이뮤노리포좀으로부터 125 I F5의 혈장 방출
Figure 112007083668136-PCT00003
실시예 5
혈장에서 리포좀으로부터 Her-표적화 부분의 생체 내 해리
125I 표지 scFv 항체를 공지된 기술을 이용하는 로도-비드를 이용하여 제조하였다. 요약하자면, scFv 항체(서열번호 2), Na[125I] 및 로도-비드를 조합하고 계속하여 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응을 티오황산염으로 켄칭하였다. 과도한 Na[125I]를 제거하기 위하여 반응 용액을 DG-10 탈염 컬럼을 이용하여 분리하였다. 방사성의 가장 많은 양을 함유하는 처음의 피크에서 물질의 풀을 만들고 A280을 이용하여 결정되는 단백질 농도를 측정하였다. 요오드화 scFv 항체를 최종적으로 멸균을 위하여 0.2 μm 필터를 통하여 통과시키고 4℃에 저장하였다. 물질은 1개월 이내에 이용하였다.
리포좀 당 15 항체를 갖는 이뮤노리포좀을 60℃에서 1 시간 동안 리포좀과 125I-표지 scFv 항체-PEG-지질 컨쥬게이트를 함께 배양함으로써 상술한 바와 같이 제조하였다. 용액 배양의 마지막에 냉각시키고 연속하여 2-8℃에 저장하였다. 다음으로 이뮤노리포좀을 10% 수크로오스/10 mM 히스티딘에 대하여 희석하고 독소루비신 함량을 측정하였다. 최종 독소루비신 함량은 2.1 mg/mL이었다. 제형의 샘플을 크기= 96 nm, pH = 6.5, 독소루비신 % = 99 %, 항체 삽입의 퍼센트 = 89 % 및 항체 농도 = 49 μg/mL로 특정지었다. 이뮤노리포좀의 최종 특정 활성은 0.018 mCi/mL이었다.
유리 125I-scFv 항체-PEG-지질을 10% 수크로오스/10 mM 히스티딘에서 최종 농도 49 μg/mL로 희석하였다. 충분한 방사성 컨쥬게이트를 제공하기 위하여 냉각시킨 scFv 항체-PEG-지질 컨쥬게이트를 용액에 첨가하여 최종 활성이 0.5 μCi/mL이 되게하였다.
대략 11 주령 및 358-376 g 체중의 9 마리 수컷 CD-1 래트(Charles River Laboratories)를 이 연구에 이용하였다. 동물을 적어도 1주일 동안 실험실 조건에 순화시켰다.
0일에, 모든 동물을 투여하기 전에 설치류 핫박스에서 따뜻하게 하였다. 동물을 지침서대로 억류하여 측면의 꼬리 정맥에 125I-표지 이뮤노리포좀 또는 유리 125I-F5 컨쥬게이트를 단회 정맥 주사하였다. 래트 당 투여된 용량은 대략 독소루비신 2 mg/kg 및/또는 항체-PEG-지질 컨쥬게이트 49 mg/kg이었다.
체중 및 임상적 고찰을 투여 일(0일)에 기록하였다. 케이지 측면 관찰을 4일 동안 매일 하였다. 혈액 샘플을 흡입마취(이소플루오란/O2) 하에 후안구동을 통하여 헤파린화 마이크로퓨지 튜브에 수집하였다. 6 마리 래트에 이뮤노리포좀을 투여하고 투여 후 대략 5분 및 1, 3, 8, 24, 48, 72 및 96 시간 후에 혈액 샘플(~ 1.2 mL)을 수집(시점 당 3 마리)하였다. 3 마리 래트에 항-PEG-지질 컨쥬게이트를 투여하고, 투여 후 대략 5분 및 1, 3, 8, 24 및 48 시간 후에 혈액 샘플(~ 0.6 mL) 을 수집하였다.
각각의 동물로부터의 총 혈액 샘플 100 μL의 분취물을 감마선 계측기를 이용하여 계측하였다. 잔여 혈액 샘플을 4-8℃에서 20분 동안 2500 RPM(~ 750 ×g)으로 원심분리하여 혈장을 수득하였다. 혈장 샘플의 분취물(50 또는 100μL)을 유지하고 125I에 대하여 계측하였다. 이뮤노리포좀을 투여한 래트에 대하여, 혈장 샘플의 분리 세트를 -40℃ 저장하고 다음에 분광형광계를 이용하여 독소루비신 농도에 대하여 분석하였다. 혈장의 나머지를 크기-배제 컬럼을 통하여 용출하여 리포좀-결합 항체-PEG-DSPE 컨쥬게이트로부터 분리하였다. 컬럼은 대략 22 mL의 배드 용적을 갖는 세파로오스-CL-4B 비드를 함유하였다. 컬럼 버퍼 용액(0.9% 살린 및 0.02% NaN3)을 대략 0.5 mL/분의 유량으로 중력 공급하였다.
모든 샘플에 대하여, 하나의 중요한 피크를 리포좀 분획과 결합된 scFv 항체에 상응하는 분획 10-15 근처에서 관찰하였다. 리포좀 분획을 지나서 분획으로부터 회수된 방사성을 "유리 scFv 항체"라고 고려하였다. 즉, 혈장 단백질로 결합되거나 통합된 미셀 또는 단량체 scFv 항체-PEG-DSPE 컨쥬게이트일 수 있다. 각각 1 mL을 갖는 대략 40개의 분획을 수집하고 125I에 대하여 계측하였다.
표 C는 리포좀 분획과 결합된 항체의 회수된 농도 및 해리된 유리 분획의 농도를 나타낸다. 결과는 도 6a-6c에 나타낸다.
표 C
Figure 112007083668136-PCT00004
약물 동력 변수
총 혈액 및 혈장 샘플을 Packard Cobra 5010 감마선 계측기(Serial # 401611)로 125I의 방사성에 대하여 계측(분당 계측: counts per minute; CPM)하였다. CPM를 하기 식에 따라 주입된 용량의 퍼센트(%)로 전환하였다:
Inj.% = [(관측된 CPM/mL) / ((CPM/mL Inj. × Inj.용적) / BW) × 0.065] × 100
상기 식에서 Inj.: 주사; BW: 체중; 및 0.065는 동물의 총 혈액 용적을 측정(즉, 6.5% BW) 하기 위하여 이용하였다. 혈장에 주사된 퍼센트를 계측하기 위하여, 혈장 용적을 혈액 용적의 퍼센트가 60%(0.6)가 되도록 하여 측정하였다.
혈액 및 혈장에서 125I의 반감기(T1 /2β)의 제거는 하기와 같이 계측되었다:
T1 /2β = In(2)/Kel
상기 식에서 In(2) = 0.693이고 Kel(제거 함량) = (In(C1) - In(C2))/ │T1 -T2│이고, 여기에서, C1 및 C2는 시간 T1 및 T2에서 주사된 용량의 평균 퍼센트를 의미한다. 이뮤노리포좀을 투여한 래트에 대한 T1 및 T2는 각각 8 시간 및 96 시간이었으며, scFv-PEG-DSPE 컨주게이트를 투여한 래트에 대한 T1 및 T2는 각각 5분 및 8 시간이었다.
게다가, 혈장 독소루비신 농도를 분광형광계를 이용하여 측정하였다. 약물 동력 변수, 예를 들어, 곡선 아래의 부위(area under the curve; AUC), 분포 용적의 정상 상태(steady state volume of distribution; Vss), 제거(Clearance; CLt) 및 반감기를 WINNONLIN Noncompartmental Analysis Program Version 4.1을 이용하여 계측하였다.
원자료를 표 D에 나타낸다. 약물 동력 변수를 표 2 및 도 7a-7b에 나타낸다.
Figure 112007083668136-PCT00005
실시예 6
마우스에 이뮤노리포좀의 생체 내 투여
PEG 코팅을 갖는 리포좀 및 리포좀 당 15, 75, 150 및 300 scFv 항체를 갖는 이뮤노리포좀을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조하였다. 제형을 표 E에 요약한다.
표 E
제형 그룹 리포좀 당 scFv 항체의 대략적인 수 독소루비신 농도(mg/mL)
1 리포좀(항체 없음), 대조군 0 2.06
2 15:1 이뮤노리포좀 15 2.00
3 75:1 이뮤노리포좀 75 2.04
4 150:1 이뮤노리포좀 150 1.68
5 300:1 이뮤노리포좀 300 2.05
암컷 ICR 마우스 115(투여 그룹 당 21 마리 × 5개의 투여 그룹 + 여분의 10마리 = 115) 마리를 Charles River로부터 제공받았다. 동물을 통상의 플라스틱 바닥의 케이지에서 사료 및 물을 자유공급하고 12 시간/12 시간 빛/어둠의 조명 일정으로 사육하였다. 동물을 연구의 시작 전에 실험실 조건에 적어도 1주일 동안 순화시켰다.
투여 일을 0일로 하였다. 이용된 모든 마우스에 측면 꼬리 정맥을 통하여 대조 또는 상기 기재한 이뮤노리포좀 테스트 제형의 하나의 단회 주사를 투여하였다. 투여 용적을 각각의 개별 동물에 대하여 계측하였고 0.24 내지 0.33 mL의 범위였다. 마우스를 투여하기 전에 설치류 핫박스에서 따뜻하게 하였다. 대조 리포좀 및 15:1 및 300:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스는 대략 2.0 mg/kg으로 투 여하였다. 75:1 및 150:1 이뮤노리포좀 제형을 투여한 마우스는 각각 대략 2.40 및 1.65 mg/kg으로 투여하였다.
혈액 샘플(각각 ~ 1 mL)을 제형 당 시점 당(5분 및 4, 8, 24, 48, 72 및 96 시간) 3 마리의 마우스로부터 수집하였다. 혈액 샘플을 흡입마취(산소/이소플루오란) 하에 간문맥을 통하여 헤파린-코팅 시린지로 수집한 즉시 폴리에틸렌 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 혈액 샘플을 습한 얼음에 저장한 다음 3-8℃에서 10분 동안 대략 2500 CPM(~ 750 ×g)으로 원심분리하였다. 혈장 샘플을 수득하고 -40℃에 저장하였다. 혈장 샘플 및 투여 용액을 총 독소루비신에 대하여 LC/MS 분석으로 분석하였다.
평균 혈장 독소루비신 농도를 시간에 대하여 플랏(도 9)하였고 약물 동력 변수를 계측하기 위하여 이용하였다. 혈장 농도는 모든 개별 동물의 혈장 농도이기때문에 약물 동력 변수를 평균 혈장 독소루비신 HCl 농도를 이용하여 계측하였고 그러므로, 약물 동력 변수를 나타내는 표준 편차가 없으며, 약물 동력 변수는 WINNONLIN version 4.0(Pharsight Corp., Mountain View, CA)을 이용하여 계측하였다. 약물 동력 변수를 표 3에 나타낸다.
실시예 7
생체 내 효율
PEG 코팅을 갖는 리포좀 및 리포좀 당 15, 75, 150 및 300 scFv 항체를 갖는 이뮤노리포좀을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 제조하였다.
대략 4-5주령의 암컷 NCR.nu/nu 동형접합 마우스(Charles River Laboratories, Hollister, CA)를 제공받아 이용하였다. 평균 체준은 대략 25 g이었다. 동물을 12-시간 빛-및-어둠 사이클의 격리 케이지에서 유지하였다. 사료 및 물은 자유롭게 이용가능하도록 하였다.
BT-474 인간 유방 세포를 습한 5% CO2 배양기에서 37℃로 시험관 내 배양(10 μg/mL 우 인슐린, 300 mg/mL L-글루타민 및 10% 우태아혈청이 보충된 RPMI 1640 배지)에서 유지하였다. 대수-기 유방 암 세포를 트립신화하고 세포 배양 플라스크로부터 배양하여 최종 농도 16 × 107 세포/mL을 수득하였다. 각각의 마우스의 목 뒤 부위에 피하 주사(0.1 mL 중에 16 × 106 세포)하였다. 에스트라디올 펠렛(0.72 mg 17β 에스트라디올, Innovative Research of America, Sarasota, FL)을 또한 종양형성 가능성을 증가시키기 위하여 종양 세포를 주입하기 2일 전에 각각의 마우스 옆구리에 피하로 주입하였다. 종양 세포 주입 23일 후 평균 종양 용적이 대략 80 ㎣에 도달했을 때 처리를 시작하였다.
5마리의 동물을 각각의 처리 그룹으로 할당하였다. 다양한 항체:리포좀 비를 함유하는 이뮤노리포좀 제형을 적절하게 희석하고, 가열(40℃)된 놋쇠 저지기에서 압류된 마우스의 측면 꼬리 정맥으로 대략 0.2 mL의 용적으로 정맥투여(IV)하였다. 각각의 주사 바로 전에, 마우스를 가열 전구를 가진 통풍이 잘되는 아크릴 박스에서 따뜻하게 유지시켰다. 대조 리포좀(Doxil®)으로 처리하는 것도 또한 포함 하며 양성 대조군으로 제공하였다. 동물을 음성 대조군으로 제공된 살린으로 처리하였다. 모든 처리 그룹에 이용한 독소루비신 농도는 대략 주 당(qw) 4 mg/kg이었고 처리는 2주 동안 계속하였다.
동물 체중을 약제 독성을 측정하기 위하여 한 주에 2회 측정하였다. 체중 상실이 15% 초과 발생하였거나 임의의 비정상적인 상태가 진행되었다면 안락사를 제공하고 동물을 연구로부터 제거하였다. 임상적 고찰은 케이지 이내에서의 행동, 활성, 탈수 및 아픔 또는 고통의 신호를 포함하였다. 모든 임상적 고찰을 연구 폴더에 기록하였다. 연구 기간의 마직막에, 모든 동물을 AVMA Panel on Euthanasia (1993)에 따라 100% 이산화탄소의 흡입으로 안락사시켰다.
종양은 최대 38일 동안 주마다 2회 3차원으로 측정하였다. 종양 용적을 하기 식에 따라 계측하였다:
V = 1/2 × D1 × D2 × D3;
상기 식에서 D1 -3는 밀리미터(㎜)로 측정한 수직 직경이다.
종양이 성장하여 그의 초기의 용적에 4배(×4)가 되는데 요구되는 시간을 종양 용적 4배 시간(Tumor volume quadrupling time; TVQT)이라고 정의하고 연구 종말점에서 이용하였다. TVQT를 각각의 처리 그룹에 대하여 측정하고 평균(M) ± 표준 오차(SE)로서 일수로 표현하였다.
다양한 처리 그룹의 종양 성장에서 지연의 통계 분석을 Student's t test로 수행하였다.
결과는 도 10a-10b에 나타내고 표 F에 요약하였다.
표 F
처리 그룹 약제 농도 (mg/kg) 복용 처방 마우스 수 TVQTb (M±SE, 일수) 성장 지연(일수) 치료 수c
1 살린 - 매주×2 4a 23.9 ± 7.5 - -
2 45:1 이뮤노리포좀 4 매주×2 5 >35.1 ± 2.9 >11.2 1
3 30:1 이뮤노리포좀 4 매주×2 5 >32.9 ± 4.4 >9.0 -
4 15:1 이뮤노리포좀 4 매주×2 5 >36.1 ± 1.9 >12.2 1
5 7.5:1 이뮤노리포좀 4 매주×2 5 >38.0 ± 0 >14.1 1
6 대조군 리포좀 항체 없음(Doxil®) 4 매주×2 5 >29.2 ± 6.0 >5.3 -
a 그룹 1에서 하나의 동물을 종양 퇴화에 기인한 연구로부터 제외하였다.
b 처리 그룹에서 임의의 개개의 종양이 38-일 연구 기간의 마지막까지 그의 용적의 ×4에 도달하지 않을 경우, 계측에 38일을 이용하였고, '>'를 상기 그룹에 대하여 표시하였다.
c 38일에 종양 크기가 10 ㎣ 미만,.
실시예 8
생체 내 용량 범위 연구
대략 4-5 주령, 암컷 무흉선 nu/nu 마우스(Harlan Laboratories, IN)를 연구에 이용하였다. 평균 체중은 대략 20 g이었다. 동물을 격리 케이지에서 12-시간 빛-및-어둠 사이클에 유지시켰다. 사료와 물은 자유공급하였다.
BT-474 인간 유방 세포를 습한 5% CO2 배양기에서 37℃로 시험관 내 배양(10 μg/mL 우 인슐린, 300 mg/mL L-글루타민 및 10% 우태아혈청이 보충된 RPMI 1640 배지)에서 유지하였다. 대수-기 유방 암 세포를 트립신화하고 세포 배양 플라스크로부터 배양하여 최종 농도 15 × 107 세포/mL을 수득하였다. 각각의 마우스의 목 뒤 부위에 피하 주사(0.2 mL 중에 30 × 106 세포)하였다. 에스트라디올 펠렛(0.72 mg 17β 에스트라디올, Innovative Research of America, Sarasota, FL)을 또한 종양형성 가능성을 증가시키기 위하여 종양 세포를 주입하기 2일 전에 각각의 마우스 옆구리에 피하로 주입하였다. 종양 세포 주입 17일 후 모든 처리 그룹에 대하여 평균 종양 용적이 106 내지 126 ㎣의 범위일 때 처리를 시작하였다.
처리 그룹은 표 G에 요약한다. 7마리의 동물을 각각의 처리 그룹으로 할당하였다. 리포좀 및 이뮤노리포좀 제형을 가열(40℃)된 놋쇠 저지기에서 압류된 마우스의 측면 꼬리 정맥으로 대략 0.2 mL의 용적으로 정맥투여(IV)하였다. 각각의 주사 바로 전에, 마우스를 가열 전구를 가진 통풍이 잘되는 아크릴 박스에서 따뜻하게 유지시켰다. 리포좀 제형 및 이뮤노리포좀 제형에 이용한 독소루비신 농도는 2, 3 또는 4 mg/kg이었다. 모든 처리를 3주 동안 매주 1회 지속하였다.
표 G
처리 그룹 약제 농도 (mg/kg) 복용 처방 (n) Inj. 경로 마우스 수 TVTTa (M±SE, 일수) 성장 지연(일수)
1 살린 - - - 7 11.1 ± 1.9 -
2 대조군 리포좀, 항체 없음(Doxil®) 2 매주 ×3 IV 7 16.7 ± 4.8 5.6
3 대조군 리포좀, 항체 없음(Doxil®) 3 매주 ×3 IV 6 26.0 ± 3.9 14.9
4 대조군 리포좀, 항체 없음(Doxil®) 4 매주 ×3 IV 7 >34.2 ± 9.0 >23.2
5 15:1 이뮤노리포좀 2 매주 ×3 IV 7 >36.1± 6.6 >25.0
6 15:1 이뮤노리포좀 3 매주 ×3 IV 5 >29.5± 8.6 >18.4
7 15:1 이뮤노리포좀 4 매주 ×3 IV 6 >49.0 >37.9
a 종양 3배 시간(Tumor volume tripling time)
종양은 49일 동안 주마다 2회 3차원으로 측정하였다. 종양 용적을 하기 식에 따라 계측하였다:
V = 1/2 × D1 × D2 × D3;
상기 식에서 D1 -3는 밀리미터(㎜)로 측정한 수직 직경이다.
종양이 성장하여 그의 초기의 용적에 3배(×3)가 되는데 요구되는 시간을 종양 용적 3배 시간(Tumor volume tripling time; TVTT)이라고 정의하고 종말점에서 이용하였다. 종양 용적 3배 시간을 각각의 처리 그룹에 대하여 측정하고 평균(M) ± 표준 오차(SE)로서 일수로 표현하였다. 동물 체중을 약제 독성을 평가하기 위하여 1주에 2회 측정하였다.
다양한 처리 그룹의 종양 성장에서 지연의 통계 분석을 Student's t test로 수행하였다. 결과는 도 11에 나타낸다.
실시예 9
생체 내 약물 동력 및 독성 연구
3 내지 8 연령, 2.5 내지 4.5 kg 체중의, 38마리의 실험을 당하지 않은 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)를 무작위적으로 그룹 당 3마리의 수컷(M) 및 3마리의 암컷(F)을 6개의 처리 그룹에 할당하고 표 H에 요약하였다.
표 H
그룹 동물 수 (M/F) 농도 (mg/kg) 투여 농도 (mg/mL) 투여 용적 (mL/kg)
1 살린 3/3 0 0 10
2 15:1 이뮤노리포좀 플라시보 3/3 0 0 10
3 15:1 이뮤노리포좀, 저 3/3 1 1 1
4 15:1 이뮤노리포좀, 중 3/3 5 1 5
5 15:1 이뮤노리포좀, 고 3/3 10 1 10
6 페길화 리포좀 (Doxil®, 경쟁자) 3/3 10 2 5
평균적으로 15개의 단쇄 항-HER2 항체를 갖는 이뮤노리포좀을 상술한 바와 같이 제조하였다. 1일에, 동물을 말초혈관에서 천천히 단회 정맥주사(~ 1 mL/분)하고 투여 후 28일 동안 모니터하였다. 임상적 고찰 및 사료 소비 모니터를 적어도 하루에 1회 수행하였다. 체중은 주마다 2회 측정하였다. 혈액을 혈액학 및 투여-전 혈청 화학 분석을 위하여 1(투여 1 시간 후), 4, 14 및 28일에 채취하였다. 독성동태 분석을 위하여 혈액을 투여-전 및 투여 완료 5분, 1, 4, 8, 24, 48, 72 및 96 시간 후에 채취하였다. 혈액 샘플을 혈장 독소루비신 및 항체 농도에 대하여 분석하였다. 결과는 도 12-14에 나타낸다.
실시예 10
생체 내 반복 투여 독성 연구
3 내지 8 연령, 2.5 내지 4.5 kg 체중의, 70마리의 실험을 당하지 않은 시노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)를 무작위적으로 그룹 당 5마리의 수컷(M) 및 5마리의 암컷(F)을 7개의 처리 그룹에 할당하고 표 I에 요약하였다.
표 I
그룹 동물 수 (M/F) 농도 (mg/kg) 투여 농도 (mg/m2) 누적 용량 (mg/m2)
1 살린 5/5 0 0 0
2 15:1 이뮤노리포좀 플라시보 5/5 0 0 0
3 15:1 이뮤노리포좀, 저 5/5 0.5 6 36
4 15:1 이뮤노리포좀, 중 5/5 2 24 144
5 15:1 이뮤노리포좀, 고 5/5 4 48 288
6 페길화 리포좀 (Doxil®, 경쟁자) 5/5 4 48 288
7 독소루비신(유리 약제) 5/5 4 48 288
평균적으로 HER2 세포 수용체에 대하여 친화성이 있는 15개의 단쇄 항체를 갖는 이뮤노리포좀을 상술한 바와 같이 제조하였다. 동물을 6개 처리 모두에 대하여 4주마다 한번 지시한 용량을 정맥투여하였다. 혈액을 혈액학 및 투여-전 혈청 화학 분석을 위하여 선택된 시점에 채취하였다. 혈액 샘플을 혈장 독소루비신에 대하여 분석하였고 결과는 도 15a-15c에 나타낸다.
많은 실시예 측면 및 구체예를 상기에 논의하였지만 당업자는 임의의 변형, 치환, 첨가 및 그의 하위-조합을 인지할 것이다. 그러므로 하기 첨부된 청구항 및 이후 도입될 청구는 그들의 진정한 관점 및 범위 이내에서 이러한 모든 변형, 치환, 첨가 및 그의 하위-조합을 포함할 것으로 판단된다.
SEQUENCE LISTING <110> Alza Corporation Hjortsvang, Kristen Guo, Luke Wong, Francis M.P. Najafi, Azar Huang, Anthony Abra, Robert Kelley, Laura <120> IMMUNOLIPOSOME COMPOSITION FOR TARGETING TO A HER2 CELL RECEPTOR <130> 553258195WO0 <140> Not Yet Assigned <141> Filed Herewith <150> US 60/674,029 <151> 2005-04-22 <150> US 60/736,669 <151> 2005-11-14 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 738 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Cys Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Thr Cys Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Cys 145 150 155 160 Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr 225 230 235 240 Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Ala 290 295 300 Ala Cys Gly Cys Gly Thr Thr Cys Gly Cys Ala Thr Thr Thr Gly Ala 305 310 315 320 Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr 340 345 350 Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly 355 360 365 Thr Thr Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys 370 375 380 Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Thr 385 390 395 400 Cys Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys 405 410 415 Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly 420 425 430 Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys 435 440 445 Ala Gly Ala Gly Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys 450 455 460 Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys 465 470 475 480 Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly 485 490 495 Gly Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Cys Thr Gly 500 505 510 Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala 515 520 525 Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Cys 530 535 540 Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Thr Ala Ala 545 550 555 560 Cys Ala Cys Cys Ala Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala 565 570 575 Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Thr 580 585 590 Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys 595 600 605 Thr Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys 610 615 620 Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys 625 630 635 640 Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ala 645 650 655 Gly Gly Cys Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys 660 665 670 Cys Ala Gly Thr Cys Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Ala 675 680 685 Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Thr Gly Gly Gly Thr 690 695 700 Gly Thr Thr Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys 705 710 715 720 Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Ala Gly 725 730 735 Gly Thr <210> 2 <211> 246 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 130 135 140 Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser 145 150 155 160 Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Gly Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro 165 170 175 Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser 180 185 190 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Phe Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser 195 200 205 Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Thr Val Leu Gly 245

Claims (37)

  1. (i) 비히클-형성 지질; (ii) 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 친수성 중합체, 및 HER2 수용체의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하는 항체로 구성되고, 평균적으로, 리포좀 당 약 2 초과 및 약 25 미만의 항체를 제공하기에 유효량으로 존재하는 컨쥬게이트; 및 (iv) 봉입 약제로 구성된 리포좀을 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 항체가 20,000-50,000 달톤의 분자량을 갖는 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 항체가 서열번호 2와 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 친수성 중합체가 750-5000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜인 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 봉입 약제가 세포독성 약제 또는 항종양제인 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 봉입 약제가 안트라사이클린인 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 약제가 독소루비신인 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 양이 생체 내 투여 48 시간 후, 평균적으로, 리포좀 당 약 20 미만의 항체를 제공하는 조성물.
  9. (i) 적어도 하나의 견고한 비히클-형성 지질; (ii) 소수성 부분 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 폴리에틸렌 글리콜 및 HER2 수용체의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하고, 서열 번호 2 또는 그의 보존적 치환체에 동일성을 갖는 단쇄 항체로 구성된 컨쥬게이트; 및 (iv) 항종양 활성을 갖는 봉입 약제로 구성된 리포좀을 포함하는 리포좀 제형으로서, 여기에서 상기 리포좀은 리포좀을 96 시간 동안 37℃에서 배양하고 리포좀으로부터 단쇄 항체의 해리를 측정하는 시험관 내 어세이로 입증된 바와 같이, 생체 내 투여 96 시간 후 리포좀 당 약 2 초과 및 약 15 미만의 항체를 제공하는데 유효한 컨쥬게이트의 양을 특징으로 하는 제형.
  10. 제 9항에 있어서, 견고한 비히클-형성 지질이 수소화 대두 포스파티딜콜린인 제형.
  11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 리포좀이 콜레스테롤을 추가로 포함하는 제 형.
  12. 제 9항 내지 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 봉입 약제가 안트라사이클린인 제형.
  13. 제 12항에 있어서, 봉입 약제가 독소루비신인 제형.
  14. 제 9항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 양이 생체 내 투여 48 시간 후, 평균적으로, 리포좀 당 약 12 미만의 항체를 제공하는 제형.
  15. (i) 적어도 하나의 견고한 비히클-형성 지질; (ii) 소수성 부분 및 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 폴리에틸렌 글리콜 및 HER2 수용체의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하고, 서열 번호 2에 적어도 80% 동일성을 갖는 단쇄 항체로 구성된 컨쥬게이트; 및 (iv) 항종양 활성을 갖는 봉입 약제로 구성된 리포좀을 포함하는 이뮤노리포좀 제형으로서, 생체 내 투여 시 상기 이뮤노리포좀 제형은, 유사 성분으로 구성되나 상기 항체가 결여된 리포좀의 곡선 아래 영역 보다 25%를 초과하거나 그 이하로 낮은 곡선 아래 영역을 제공하는 제형.
  16. 제 15항에 있어서, 견고한 비히클-형성 지질이 수소화 대두 포스파티딜콜린인 제형.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 리포좀이 콜레스테롤을 추가로 포함하는 제형.
  18. 제 15항 내지 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 봉입 약제가 안트라사이클린인 제형.
  19. 제 18항에 있어서, 봉입 약제가 독소루비신인 제형.
  20. 제 15항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 양이 리포좀을 48 시간 동안 37℃에서 배양하고 리포좀으로부터 단쇄 항체의 해리를 측정하는 시험관 내 어세이로 입증된 바와 같이, 생체 내 투여 48 시간 후 평균적으로, 리포좀 당 2 초과의 항체 및 리포좀 당 약 20 미만의 항체를 제공하는 제형.
  21. 제 15항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 양이 리포좀을 96 시간 동안 37℃에서 배양하고 리포좀으로부터 단쇄 항체의 해리를 측정하는 시험관 내 어세이로 입증된 바와 같이, 생체 내 투여 96 시간 후 평균적으로, 리포좀 당 2 초과의 항체 및 리포좀 당 약 15 미만의 항체를 제공하는 제형.
  22. (i) 적어도 하나의 견고한 비히클-형성 지질; (ii) 소수성 부분 및 폴리에틸 렌 글리콜로 구성된 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 폴리에틸렌 글리콜 및 HER2 수용체의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하고 서열 번호 2와 동일한 서열을 갖는 단쇄 항체로 구성된 컨쥬게이트; 및 (iv) 항종양 활성을 갖는 봉입 약제로 구성된 리포좀을 포함하는 이뮤노리포좀 제형으로서, 여기에서, 상기 리포좀을 96 시간 동안 37℃에서 배양하고 리포좀으로부터 단쇄 항체의 해리를 측정하는 시험관 내 어세이로 입증된 바와 같이, 상기 리포좀의 투여 96 시간 후, 각각의 리포좀으로부터 30-60%의 항체가 해리되어, 생체 내 투여 96 시간 후, 리포좀 당 약 25 미만의 항체를 갖는 조성물을 제공하는 제형.
  23. 친수성 중합체 사슬의 외부 코팅 및 봉입 약제를 갖는 리포좀을 제공하고; 상기 리포좀을 소수성 부분, 폴리에티렌 글리콜 및 HER2 수용체의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하는 단쇄 항체로 구성된 일정량의 컨쥬게이트와 배양하는 것을 포함하며; 상기 컨쥬게이트의 양은 상기 리포좀을 96 시간 동안 37℃에서 배양하고 상기 리포좀으로부터 단쇄 항체의 해리를 측정하는 시험관 내 어세이로 입증된 바와 같이, 생체 내 투여 96 시간 후 평균적으로 리포좀 당 약 2 초과 및 약 15 미만의 항체를 제공하도록 선택되는 공정에 따라 제조되는 리포좀 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, 항체가 서열 번호 2로 식별되는 서열을 갖는 조성물.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 약제가 독소루비신인 조성물.
  26. 제 23항 내지 제 25항 중의 어느 한 항에 있어서, 컨쥬게이트의 양이 평균적으로, 리포좀 당 약 2-10 항체를 제공하는 조성물.
  27. (i) 비히클-형성 지질; (ii) 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 친수성 중합체 및 HER2 수용체의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하는 항체로 구성된 컨쥬게이트; 및 (iv) 봉입 약제로 구성된 리포좀을 포함하는 조성물로서, 상기 리포좀은 생체 내 투여 전, 리포좀 당 25 미만의 항체를 가지며, 생체 투여 후, 상기 리포좀이 상기 항체의 20-50%를 상실하지만 여전히 세포독성에 충분한 상기 Her-2 수용체에 대한 결합을 유지하는 조성물.
  28. 제 27항에 있어서, 항체가 서열번호 2인 조성물.
  29. 제 27항 또는 제 28항에 있어서, 약제가 독소루비신인 조성물.
  30. (i) 비히클-형성 지질; (ii) 지질중합체; (iii) 소수성 부분, 친수성 중합체 및 HER2 수용체의 세포 외 도메인과 특이적으로 결합하는 항체로 구성되고; 리포좀 당 제 1의 선택된 수의 항체를 제공하기 위하여 충분한 제 1의 양을 포함하는 컨쥬게이트; 및 (iv) 봉입 약제로 구성된 리포좀을 제공하고;
    상기 리포좀을 혈액과 접촉시키고;
    혈액과 상기 리포좀의 접촉 시 하나 이상의 시점에서 리포좀 당 항체 수를 결정하고;
    상기 결정을 기초로, 혈액과 접촉 후에 리포좀 당 적어도 두개의 항체를 제공하기 위하여 리포좀 당 제 2의 보다 높은 수의 항체를 제공하는데 충분한 컨쥬게이트의 제 2의 양을 선택하는 것을 포함하는, 리포좀 조성물의 제조 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 접촉이 시험관 내에서 리포좀을 혈액과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 접촉이 생체 내에서 리포좀을 혈액과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  33. 제 31항 또는 32항에 있어서, 제공이 인지질, 폴리에틸렌 글리콜 친수성 부분 및 본원에서 서열 번호 2로서 식별되는 서열을 갖는 단쇄 항체로 구성된 컨쥬게이트를 갖는 리포좀을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 제공이 봉입 약제로서 독소루비신을 갖는 리포좀을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  35. 제 30항에 있어서, 선택이 리포좀 당 50 미만의 항체를 제공하는데 유효한 컨쥬게이트의 제 2의 양을 선택하는 것을 포함하는 방법.
  36. 제 30항에 있어서, 제공이 리포좀 당 150 미만의 항체를 제공하는 컨쥬게이트의 제 1의 양을 갖는 리포좀을 제공하는 것을 포함하는 방법.
  37. 제 30항에 있어서, 선택이 리포좀 당 30 이하의 항체를 제공하는데 유효한 컨쥬게이트의 제 2의 양을 선택하는 것을 포함하는 방법.
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