KR20090051061A - 케모카인 수용체 활성의 조절제로서의 시클릭 유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 예상하지 못한 바람직한 약리학상 성질의 조합을 갖는 케모카인 수용체 활성의 조절제, 이들을 함유하는 제약 조성물, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환, 특히 당뇨병, 크론병, 아테롬성 동맥경화증 및 다발성 경화증의 치료 및 예방을 위한 제제로서 이들을 사용하는 방법, 및 상기 화합물 및 이들에 대한 중간체의 제조 방법에 관한 것이다. 활성 화합물의 대사물이 또한 본원에서 제공되며, 제약 조성물 및 이들의 용도가 또한 제공된다.

케모카인 수용체, 시클릭 유도체, 염증성 질환

Description

케모카인 수용체 활성의 조절제로서의 시클릭 유도체{CYCLIC DERIVATIVES AS MODULATORS OF CHEMOKINE RECEPTOR ACTIVITY}

본 출원은 각각 2008년 7월 28일 및 2007년 3월 21일에 출원된 미국 가출원 제60/834,235호 및 제60/896,026호 (이들 둘의 개시문은 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)의 우선권을 주장한다.

본 발명은 일반적으로 예상하지 못한 바람직한 약리학상 성질의 조합을 갖는 케모카인 수용체 활성의 조절제, 이들을 함유하는 제약 조성물, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환, 특히 당뇨병, 아테롬성 동맥경화증, 크론병 및 다발성 경화증의 치료 및 예방을 위한 제제로서 이들을 사용하는 방법, 및 상기 화합물 및 이들에 대한 중간체의 제조 방법에 관한 것이다. 활성 화합물의 대사물, 제약 조성물, 및 이들의 용도가 또한 본원에서 제공된다.

케모카인은 분자량 6 내지 15 kDa의 화학주성 사이토킨으로서, 매우 다양한 세포에 의해 방출되어 다른 세포 유형 중 대식세포, T 및 B 림프구, 호산구, 호염구 및 호중구를 유인하여 활성화시킨다 (문헌 [Charo and Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621]; [Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445]; 및 [Rollins, Blood 1997, 90, 909-928]에서 검토됨). 아미노산 서열 내의 처음 2개의 시스테인이 단일 아미노산에 의해 분리되어 있는지 (CXC) 또는 인접하여 있는지 (CC) 여부에 따라, 2 가지 주요 케모카인 부류인 CXC 및 CC가 존재한다. 인터류킨-8 (IL-8), 호중구-활성화 단백질-2 (NAP-2) 및 흑색종 성장 자극 활성 단백질 (MGSA)과 같은 CXC 케모카인은 1차적으로 호중구 및 T 림프구에 대해 화학주성을 나타내는 반면, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, 단핵세포 화학주성 단백질 (MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 및 MCP-5) 및 에오탁신(eotaxin) (-1 및 -2)과 같은 CC 케모카인은 다른 세포 유형 중 대식세포, T 림프구, 호산구, 수지상 세포 및 호염구에 대해 화학주성을 나타낸다. 또한, 상기 주요 케모카인 하위부류 어디에도 속하지 않는 케모카인인 림포탁틴(lymphotactin)-1, 림포탁틴-2 (둘 모두 C 케모카인임) 및 프락탈카인(fractalkine) (CX₃C 케모카인)이 존재한다.

케모카인은 "케모카인 수용체"로 지칭되는 G-단백질-커플링된 7-막횡단-도메인 단백질 부류에 속하는 특이적 세포-표면 수용체에 결합한다 (문헌 [Horuk, Trends Pharm. Sci. 1994, 15, 159-165]에서 검토됨). 케모카인 수용체가 이들의 동족 리간드에 결합하면 이들은 연합된 삼량체 G 단백질을 통해 세포내 신호를 전환시켜, 다른 반응 중 세포내 칼슘 농도의 신속한 증가, 세포 외형의 변화, 세포 부착 분자 발현의 증가, 탈과립 및 세포 이동의 촉진을 일으킨다. 아래 특징적인 패턴을 갖는 CC 케모카인에 결합하거나 이에 반응하는 10종 이상의 인간 케모카인 수용체가 존재한다 (문헌 [Zlotnik and Oshie Immunity 2000, 12, 121]에서 검토됨): CCR-1 (또는 "CKR-1" 또는 "CC-CKR-1") [MIP-1α, MCP-3, MCP-4, RANTES] (문헌 [Ben-Barruch, et al., Cell 1993, 72, 415-425] 및 [Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445]); CCR-2A 및 CCR-2B (또는 "CKR-2A"/"CKR-2B" 또는 "CC-CKR-2A"/"CC-CKR-2B") [MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5] (문헌 [Charo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 2752-2756] 및 [Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445]); CCR-3 (또는 "CKR-3" 또는 "CC-CKR-3") [에오탁신-1, 에오탁신-2, RANTES, MCP-3, MCP-4] (문헌 [Combadiere, et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 16491-16494] 및 [Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445]); CCR-4 (또는 "CKR-4" 또는 "CC-CKR-4") [TARC, MDC] (문헌 [Power, et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 19495-19500] 및 [Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445]); CCR-5 (또는 "CKR-5" 또는 "CC-CKR-5") [MIP-1α, RANTES, MIP-1β] (문헌 [Sanson, et al., Biochemistry 1996, 35, 3362-3367]); CCR-6 (또는 "CKR-6" 또는 "CC-CKR-6") [LARC] (문헌 [Baba, et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 14893-14898]); CCR-7 (또는 "CKR-7" 또는 "CC-CKR-7") [ELC] (문헌 [Yoshie et al., J. Leukoc. Biol. 1997, 62, 634-644]); CCR-8 (또는 "CKR-8" 또는 "CC-CKR-8") [I-309] (문헌 [Napolitano et al., J. Immunol, 1996, 157, 2759-2763]); CCR-10 (또는 "CKR-10" 또는 "CC-CKR-10") [MCP-1, MCP-3] (문헌 [Bonini, et al., DNA and Cell Biol. 1997, 16, 1249-1256]); 및 CCR-11 [MCP-1, MCP-2 및 MCP-4] (문헌 [Schweickert, et al., J. Biol. Chem. 2000, 275, 90550]).

포유동물 케모카인 수용체 이외에, 포유동물 사이토메갈로바이러스, 허피스바이러스 및 폭스바이러스가 감염된 세포에서 케모카인 수용체의 결합 성질을 갖는 단백질을 발현시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Wells and Schwartz, Curr. Opin. Biotech. 1997, 8, 741-748]에서 검토됨). RANTES 및 MCP-3과 같은 인간 CC 케모카인은 이들 바이러스에 의해 코딩된 수용체를 통해 칼슘을 신속하게 이동시킬 수 있다. 수용체 발현은 정상적인 면역계 감시 및 감염에 대한 반응을 파괴하여 감염을 허용할 수 있다. 또한, CXCR4, CCR2, CCR3, CCR5 및 CCR8과 같은 인간 케모카인 수용체는, 예를 들면 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)와 함께 미생물에 의한 포유동물 세포의 감염에 대한 공동-수용체로 작용할 수 있다.

케모카인 및 이들의 동족 수용체는 천식 및 알레르기성 질환 뿐만 아니라 자가면역 병리학적 증상, 예컨대 류마티스성 관절염 및 다발성 경화증, 및 대사성 질환, 예컨대 아테롬성 동맥경화증 및 당뇨병을 비롯한 염증성, 감염성 및 면역조절성 장애 및 질환의 중요한 매개자로서 포함된다 (문헌 [Charo and Rasonhoff, New Eng. J. Med. 2006, 354, 610-621]; [Z. Gao and W. A. Metz, Chem. Rev. 2003, 103, 3733]; [P. H. Carter, Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6, 510]; [Trivedi, et al., Ann. Reports Med. Chem. 2000, 35, 191]; [Saunders and Tarby, Drug Disc. Today 1999, 4, 80]; [Premack and Schall, Nature Medicine 1996, 2, 1174]에서 검토됨). 예를 들면, 케모카인 단핵세포 화학유인물질-1 (MCP-1) 및 그의 수용체 CC 케모카인 수용체 2 (CCR-2)는 염증 부위에 백혈구를 유인한 후에 이들 세포를 활성화시키는데 중추적 역할을 수행한다. 케모카인 MCP-1 이 CCR-2에 결합하는 경우, 이는 세포내 칼슘 농도의 신속한 증가. 세포 부착 분자 발현의 증가 및 백혈구 이동의 촉진을 유도한다. MCP-1/CCR-2 상호작용의 중요성은 유전자 조작된 마우스로의 실험에 의해 입증되었다. MCP-1^-/- 마우스는 여러 상이한 유형의 면역 공격 후에 염증 부위에 단핵세포를 동원할 수 없었다 (문헌 [Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601]). 이와 마찬가지로, CCR-2 -/- 마우스도 다양한 외인성 물질로 공격하는 경우에 단핵세포를 동원하거나 인터페론-γ를 생성할 수 없었으며, 게다가 CCR-2 널(null) 마우스의 백혈구는 MCP-1에 대한 반응에서 이동하지 않았고 (문헌 [Landin Boring, et al., J. Clin. Invest. 1997, 100, 2552]), 이에 따라 MCP-1/CCR-2 상호작용의 특이성이 입증되었다. 2 가지 다른 군에서 독립적으로 상이한 종의 CCR-2 -/- 마우스와 동등한 결과가 보고되었다 (문헌 [William A. Kuziel, et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 1997, 94, 12053] 및 [Takao Kurihara, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 1757]). MCP-1 -/- 및 CCR-2 -/- 동물의 생존력 및 일반적으로 정상인 건강상태는 MCP-1/CCR-2 상호작용의 파괴가 생리학적 위기를 유도하지 않는다는 점에서 주목할 만하다. 동시에, 이러한 데이타는 MCP-1/CCR2의 작용을 차단하는 분자가 다수의 염증성 및 자가면역 장애의 치료에 유용할 것이라는 결론을 도출한다 (문헌 [M. Feria and F. Dieaz-Gonzaelez, Exp. Opin. Ther. Patents 2006, 16, 49]; 및 [J. Dawson, W. Miltz, and C. Wiessner, C. Exp. Opin. Ther. Targets 2003, 7, 35]에서 검토됨). 이 가설은 이제 아래 기재된 다수의 상이한 동물 질환 모델에서 확인되었다.

MCP-1은 류마티스성 관절염 환자에서 상향조절되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Alisa Koch, et al., J. Clin. Invest. 1992, 90, 772-779]). 또한, 몇몇 전임상 연구에서 류마티스성 관절염을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 입증한 바 있다. MCP-1을 코딩하는 DNA 백신은 최근 래트에서 만성 폴리아주반트-유도된 관절염을 개선시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Sawsan Youssef, et al., J. Clin. Invest. 2000, 106, 361]). 이와 마찬가지로, 질환 징후는 콜라겐-유도된 관절염 (문헌 [Hiroomi Ogata, et al., J. Pathol. 1997, 182, 106]) 또는 연쇄상구균 세포벽-유도된 관절염 (문헌 [Ralph C. Schimmer, et al., J. Immunol. 1998, 160, 1466])에 걸린 마우스에게 MCP-1에 대한 항체를 직접 투여하여 제어할 수 있다. 아마도 가장 유의하게는, MCP-1, MCP- 1(9-76)의 펩티드 길항제가 관절염의 MRL-lpr 마우스 모델에서 (투여 시점에 따라) 질환 개시를 예방하고 질환 징후를 감소시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Jiang-Hong Gong, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 131]). 또한, 소분자 CCR2 길항제의 투여가 관절염의 설치류 모델에서 임상 스코어를 감소시킨다는 것이 입증되었다 (문헌 [C. M. Brodmerkel, et al., J. Immunol. 2005, 175, 5370] 및 엠. 지아(M. Xia) 등의 미국 특허 출원 0069123 (2006)). 항-CCR2 항체의 투여는 투여 시점에 따라 쥐과동물 CIA에 대해 다양한 효과를 나타낸다 (문헌 [H. Bruhl, et al., J. Immunol. 2004, 172, 890]). 최근 CCR2-/- 마우스로의 연구는 CCR2의 결실이 특정 실험 환경에서 설치류 관절염 모델을 악화시킬 수 있음을 시사하고 있다 (문헌 [M. P. Quinones, et al., J. Clin. Invest. 2004, 113, 856]; [M. P. Quinones, et al., J. Mol. Med. 2006, 84, 503]).

MCP-1은 아테롬성 동맥경화증 병소에서 상향조절되는 것으로 알려져 있으며, MCP-1의 순환 수준은 요법제로의 치료를 통해 감소되는 것으로 나타났다 (문헌 [Abdolreza Rezaie-Majd, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 1194 - 1199]). 몇몇 핵심 연구는 아테롬성 동맥경화증을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 입증하고 있다. 예를 들면, MCP-1 -/- 마우스가 LDL 수용체-결핍 마우스와 교배된 경우, 대동맥 지질 침착이 83％ 감소되는 것이 관찰되었다 (문헌 [Long Gu, et al., Mol. Cell 1998, 2, 275]). 이와 유사하게, MCP-1이 이미 인간 아포지단백질 B를 과발현시키는 마우스로부터 유전적으로 제외된 경우, 생성된 마우스는 MCP-1 +/+ apoB 대조군 마우스에 비해 아테롬성 동맥경화증 병소 형성으로부터 보호되었다 (문헌 [Jennifa Gosling, et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 773]). 이와 마찬가지로, CCR-2 -/- 마우스가 아포지단백질 E -/- 마우스와 교배된 경우, 아테롬성 동맥경화증 병소의 발생이 유의하게 감소하는 것이 관찰되었다 (문헌 [Landin Boring, et al., Nature 1998, 394, 894]; [T. C. Dawson, et al., Atherosclerosis 1999, 143, 205]). 마지막으로, 아포지단백질 E -/- 마우스에게 CCR2의 펩티드 길항제를 코딩하는 유전자를 투여하면 병소 크기가 감소하고 플라크 안정성이 증가하였다 (문헌 [W. Ni, et al., Circulation 2001, 103, 2096 - 2101]). CCR2-/- 마우스로부터의 골수를 ApoE3-레이덴(Leiden) 마우스에게 이식하면 초기 죽종형성이 억제되었으나 (문헌 [J. Guo, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2003, 23, 447]), 진전된 병소에 대해 서는 최소의 효과를 나타내었다 (문헌 [J. Guo, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005, 25, 1014]).

제2형 진성 당뇨병 환자는 전형적으로 질환의 중요 특징들 중 하나로 인슐린 내성을 나타낸다. 인슐린 내성은 또한 비만, 아테롬성 동맥경화증, 고혈압 및 이상지질혈증을 유도하는 "대사성 증후군" 또는 "증후군 X"로 알려진 이상 징후의 분류와 관련된다 (문헌 [Eckel, et al., Lancet 2005, 365, 1415]에서 검토됨). 염증은 제2형 당뇨병 및 "증후군 X" 병리학적 증상의 질환 진행을 악화시키는데 소정의 역할을 수행하는 것으로 인식되어 있다 (문헌 [Chen, Pharmacological Research 2006, 53, 469]; [Neels and Olefsky, J. Clin. Invest. 2006, 116, 33]; [Danadona and Aljada, Am J Cardiol. 2002 90, 27G-33G]; [Pickup and Crook, Diabetologia 1998, 41, 1241]에서 검토됨). MCP-1은 비만-유도된 인슐린 내성에 소정의 역할을 수행하는 것으로 인식되어 있다. 전형적으로, 인간 전구지방세포는 구성적으로 MCP-1을 발현시킨다 (문헌 [Gerhardt, Mol. Cell. Endocrinology 2001, 175, 81]). CCR2는 지방세포 상에서 발현된다; 시험관내에서 분화된 지방세포에 MCP-1을 첨가하면 인슐린-자극된 글루코스 흡수 및 몇몇 지방세포 형성 유전자 (LpL, 아디프신(adipsin), GLU-4), aP2, β3-아드레날린 수용체 및 PPARγ의 발현을 감시소킨다 (문헌 [P. Sartipy and D. Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1999, 96, 6902]). 제2형 당뇨병 환자의 순환 MCP-1의 수준은 비-당뇨병 대조군보다 훨씬 높고 (문헌 [S. Nomura, et al., Clin. Exp. Immunol. 2000, 121, 437)], 메트포르민 또는 티아졸리딘디온과 같은 항-당뇨병 요법으로의 치료에 의해 지방 조직으로부터의 MCP-1의 방출을 감소시킬 수 있다 (문헌 [J. M. Bruun, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005, 90, 2282]). 이와 마찬가지로, MCP-1은 또한 비만의 쥐과동물 실험적 모델에서 과발현되고, 일차적으로 지방 조직에 의해 생성된다 (문헌 [Sartipy and Loskutoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 7265]). 비만 마우스에서, MCP-1의 발현은 모두 인슐린 내성의 발생에 앞서 일어나며, 이와 동시에 일어난다 (문헌 [H. Xu, et al., J. Clin. Invest. 2003, 112, 1821]). 다른 연구는 MCP-1의 발현이 마우스의 생식선 주변 지방 조직에서의 체질량과 긍정적으로 서로 관련이 있음을 보여준다 (문헌 [Weisberg, et al., J. Clin. Invest. 2003, 112, 1796]). 이들 데이타에 부합하여, db/db 마우스에서의 인슐린 내성의 발생은 MCP-1의 유전자 결실을 통해서나 또는 우세한 음성 펩티드의 유전자-유도된 발현에 의해 개선되었다 (문헌 [H. Kanda, et al., J. Clin. Invest. 2006, 116, 1494]). 또한, 논리적으로 반대로 입증될 수 있다: 지방 조직에서의 MCP-1의 과발현은 인슐린 내성을 촉진시킨다 (문헌 [N. Kamei, et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 26602]). MCP-1의 유전자 결실이 db/db 마우스에서의 인슐린 내성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주는 하나의 모순되는 결과도 나타났다 (문헌 [F. Y. Chow, et al., Diabetologia 2007, 50, 471]). MCP-1에 대한 데이타에 부합하여, CCR2 (MCP-1 수용체)를 사용하는 직접적인 연구는 이것이 비만 및 비만-유도된 인슐린 내성의 형성에 소정의 역할을 수행한다는 것을 보여준다. 고지방 식사를 유지하면 야생형 (문헌 [C. L. Tsou, et al., J. Clin. Invest. 2007, 117, 902]) 및 ApoE^-/- 마우스 (문헌 [F. Tacke, et al., J. Clin. Invest. 2007, 117, 185]) 둘 모두에서 순환 CCR2⁺ 염증성 단핵세포의 수가 증가하였다. CCR2의 유전자 결실은 쥐과동물 지방 조직에서 활성화된 대식세포의 수를 감소시켰으나 (문헌 [C. N. Lumeng, et al., Diabetes 2007, 56, 16), M2 지방 대식세포의 집단에 영향을 미치지 않아 "부족(lean)" 상태를 유지하는 것으로 생각된다 (문헌 [C. N. Lumeng, et al., J. Clin. Invest. 2007, 117, 175]). CCR2의 유전자 결실은 실험 조건에 따라 (문헌 [A. Chen, et al., Obes. Res. 2005, 13, 1311]), 식사-유도된 비만을 감소시키고, 식사-유도된 비만 모델에서 인슐린 민감성을 개선시켰다 (문헌 [S. P. Weisberg, et al., J. Clin. Invest. 2006, 116, 115]; [P Cornelius, RP Gladue, RS Sebastian, WO patent 2006/013427 A2), 2006]). 소분자 CCR2 길항제의 투여가 또한 상기 동일한 모델에서 인슐린 민감성을 개선시켰다 (문헌 [S. P. Weisberg, et al., J. Clin. Invest. 2006, 116, 115]).

2 가지 연구에서 고혈압-유도된 혈관 염증, 재건 및 과형성에 있어 CCR2의 중요한 역할을 기재하고 있다 (문헌 [E Bush et al., Hypertension 2000, 36, 360]; [M Ishibashi, et al., Circ. Res. 2004, 94, 1203]).

MCP-1은 인간 다발성 경화증에서 상향조절되는 것으로 알려져 있으며, 인터페론 β-1b를 사용하는 효과적인 요법이 말초혈 단핵 세포에서의 MCP-1 발현을 감소시키는 것으로 나타났는데, 이는 MCP-1이 질환 진행에 소정의 역할을 수행한다는 것을 시사한다 (문헌 [Carla Iarlori, et al., J. Neuroimmunol. 2002, 123, 170 - 179]). 다른 연구는 다발성 경화증을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR-2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 입증하였으며; 이들 연구는 모두 다발성 경화증에 대한 통상적인 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 모델에서 입증되었다. EAE를 앓고 있는 동물에게 MCP-1에 대한 항체를 투여하면 질환의 재발이 유의하게 감소하였다 (문헌 [K. J. Kennedy, et al., J. Neuroimmunol. 1998, 92, 98]). 또한, 2 개의 보고서가 CCR-2 -/- 마우스가 EAE에 대해 내성을 나타냄을 보여주었다 (문헌 [B. T. Fife, et al., J. Exp. Med. 2000, 192, 899]; [L. Izikson, et al., J. Exp. Med. 2000, 192, 1075]). 후속 보고는 상이한 종의 마우스에서 CCR2 결실의 효과를 조사하여 처음 관찰 결과를 확대시켰다 (문헌 [S. Gaupp, et al., Am. J. Pathol. 2003, 162, 139]). 특히, 소분자 CCR2 길항제의 투여는 또한 C57BL/6 마우스에서의 질환 진행을 둔화시켰다 (문헌 [C. M. Brodmerkel, et al., J. Immunol. 2005, 175, 5370]).

MCP-1은 폐 이식 후에 폐쇄성 세기관지염 증후군이 발생한 환자에서 상향조절되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Martine Reynaud-Gaubert, et al., J. of Heart and Lung Tranplant, 2002, 21, 721-730]; [John Belperio, et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556]). 폐쇄성 세기관지염 증후군의 쥐과동물 모델에서, MCP-1에 대한 항체의 투여는 기도 폐색의 약화를 유도하고; 이와 마찬가지로, CCR2 -/- 마우스는 상기 동일한 모델에서 기도 폐색에 대한 내성을 나타낸다 (문헌 [John Belperio, et al., J. Clin. Invest. 2001, 108, 547-556]). 이들 데이타는 MCP-1/CCR2의 길항작용이 이식에 다른 기관의 거부반응을 치료하는데 유익할 수 있 음을 시사한다. 또한, 연구는 MCP-1/CCR2 축의 파괴가 섬 이식의 생존을 연장시킬 수 있음을 보여준다 (문헌 [I Lee et al., J Immunol 2003, 171, 6929]; [R Abdi et al., J Immunol 2004, 172, 767]). 래트 이식편 모델에서, CCR2 및 MCP-1은 이식편 혈관병증이 발생한 이식편에서 상향조절되는 것으로 나타났다 (문헌 [K Horiguchi et al., J Heart Lung Transplant. 2002, 21, 1090]). 다른 연구에서, 항-MCP-1 유전자 요법은 이식편 혈관병증을 약화시켰다 (문헌 [A Saiura et al., Artherioscler Thromb Vasc Biol 2004, 24, 1886]). 한 연구는 MCP-1의 차단에 의한 실험적 정맥 이식편 신생내막 형성의 억제를 기재하고 있다 (문헌 [H Tatewaki et al., J Vasc Surg. 2007, 45,1236]).

다른 연구는 천식을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 입증하고 있다. 오브알부민-공격된 마우스에서 항체를 무력화시키면서 MCP-1을 제거하면 기관지 과반응성 및 염증이 현저하게 감소하였다 (문헌 [Jose-Angel Gonzalo, et al., J. Exp. Med. 1998, 188, 157]). 이는 MCP-1에 대한 항체의 투여를 통해 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni) 알(egg)-공격된 마우스에서 알레르기성 기도 염증을 감소시킬 수 있음을 입증한다 (문헌 [Nicholas W. Lukacs, et al., J. Immunol. 1997, 158, 4398]). 이에 부합하여, MCP-1 -/- 마우스는 만손주혈흡충 알로의 공격에 대해 감소된 반응을 나타내었다 (문헌 [Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601]).

다른 연구는 신장 질환을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 입증하고 있다. 사구체신염의 쥐과동물 모델에서 MCP-1 에 대한 항체를 투여하면 사구체 반월형 형성 및 제I형 콜라겐의 침착이 현저하게 감소하였다 (문헌 [Clare M. Lloyd, et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 1371]). 또한, 유도된 신독성 혈청 신염을 앓고 있는 MCP-1 -/- 마우스는 이들의 MCP-1 +/+ 상대보다 유의하게 적은 관상 손상을 나타내었다 (문헌 [Gregory H. Tesch, et al., J. Clin. Invest. 1999, 103, 73]).

몇몇 연구는 전신 홍반성 루푸스를 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 입증하고 있다. CCR2^-/- 마우스는 전신 홍반성 루푸스의 쥐과동물 모델에서 이들의 야생형 상대에 비해 생존이 연장되고 신장 질환이 감소되는 것으로 나타났다 (문헌 [G. Perez de Lema, et al., J. Am. Soc. Neph. 2005, 16, 3592]). 이들 데이타는 MCP-1의 유전자 결실 (문헌 [S. Shimizu, et al., Rheumatology (Oxford) 2004, 43, 1121]; [Gregory H. Tesch, et al., J. Exp. Med. 1999, 190, 1813]) 또는 루푸스의 설치류 모델에서의 CCR2의 펩티드 길항제의 투여 (문헌 [H. Hasegawa, et al., Arthritis ＆ Rheumatism 2003, 48, 2555])에 대한 최근 연구에서 발견된 질환-변형 활성에 부합한다.

질환에 걸리지 않은 회장에 비해 크론병 환자의 소장에서 CCR2⁺ 고유판 림프구가 현저하게 30-배 증가하는 것이 관찰되었다 (문헌 [S. J. Connor, et al., Gut 2004, 53, 1287]). 또한, 대조군에 비해 활동성 크론병 환자에서 순환 CCR2⁺/CD14⁺/CD56⁺ 단핵세포의 서브셋이 확장되는 것에 유의한다. 몇몇 설치류 연구는 크론병/대장염을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 입증하고있다. CCR-2^-/- 마우스는 덱스트란 황산나트륨-유도된 대장염의 영향으로부터 보호되었다 (문헌 [Pietro G. Andres, et al., J. Immunol. 2000, 164, 6303]). CCR2, CCR5 및 CXCR3의 소분자 길항제의 투여 (쥐과동물 결합 친화도 = (각각) 24, 236 및 369 nM)는 또한 덱스트란 황산나트륨-유도된 대장염에 대해 보호된다 (문헌 [H. Tokuyama, et al., Int. Immunol. 2005, 17, 1023]). 마지막으로, MCP-1-/- 마우스는 대장염의 합텐(hapten)-유도된 모델에서 실질적으로 감소된 결장 손장을 나타내었다 (둘 모두 거시적이며 조직학적임) (문헌 [W. I. Khan, et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2006, 291, G803]).

2 개의 보고서가 염증성 장 질환 환자의 장 상피 세포 및 장 점막에서 MCP-1의 과발현을 기재하고 있다 (문헌 [H. C. Reinecker, et al., Gastroenterology 1995, 108, 40] 및 [Michael C. Grimm, et al., J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 804]).

한 연구는 경피증 (전신성 경화증)이 있는 MCP-1 유전자에서의 프로모터 다형성의 연관성을 기재하고 있다 (문헌 [S Karrer et al., J Invest Dermatol. 2005, 124, 92]). 조직 섬유증의 관련 모델에서, CCR2/MCP-1 축의 억제는 피부 (문헌 [T Yamamoto and K Nishioka, J Invest Dermatol 2003, 121, 510]; [AM Ferreira et al., J Invest Dermatol. 2006, 126, 1900]), 폐 (문헌 [T Okuma et al., J Pathol. 2004, 204, 594]; [M Gharaee-Kermani et al., Cytokine 2003, 24, 266]), 신장 (문헌 [K Kitagawa et al., Am J Pathol. 2004, 165, 237]; [T Wada et al., J Am Soc Nephrol 2004, 15, 940]), 심장 (문헌 [S Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134]) 및 간 (문헌 [S Tsuruta et al., Int J Mol Med. 2004, 14, 837])에서 섬유증을 감소시킨다.

한 연구는 폐포염을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 입증하고 있다. IgA 면역 복합체 폐 손상이 있는 래트를 래트 MCP-1 (JE)에 대해 생성된 항체로 정맥내 처치하는 경우, 폐포염의 징후는 부분적으로 완화된다 (문헌 [Michael L. Jones, et al., J. Immunol. 1992, 149, 2147]).

몇몇 연구는 암을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 보여주고 있다 (문헌 [M. J. Craig and R. D. Loberg, Cancer Metastasis Rev. 2006, 25, 611]; [I. Conti and B. Rollins, Seminars in Cancer Biology 2004, 14, 149]; [R. Giles and R. D. Loberg, Curr. Cancer Drug Targets 2006, 6, 659]에서 검토됨). 인간 유방 암종 세포를 갖는 면역결핍 마우스를 항-MCP-1 항체로 처치한 경우, 폐 미세전이의 억제 및 생존률 증가가 관찰되었다 (문헌 [Rosalba Salcedo, et al., Blood 2000, 96, 34 - 40]). 인간 임상 종양 표본을 사용하여, CCR2 발현은 전립선암 진행과 관련된다 (문헌 [Y. Lu, et al., J. Cell. Biochem. 2007, 101, 676]). 시험관내에서, MCP-1 발현은 전립선암 세포 성장 및 침입 (문헌 [Y. Lu, et al., Prostate 2006, 66, 1311])을 매개하는 것으로 나타났으며; 또한 전립선암 세포에 의해 발현된 MCP-1은 골 재흡수를 위한 인간 골수 전구세포를 유도하였다 (문헌 [Y. Lu, et al., Cancer Res. 2007, 67, 3646]).

다수의 연구가 재협착을 치료하는데 있어 MCP-1/CCR2 상호작용의 길항작용의 잠재적 치료적 가치를 기재하고 있다. 인간에서, MCP-1 수준은 재협착에 대한 위험과 직접적으로 서로 관련이 있다 (문헌 [F. Cipollone, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2001, 21, 327]). CCR2 또는 MCP-1이 결핍된 마우스에서는 동맥 손상 이후에 (야생형 한배 자손에 비해) 혈관내막 영역 및 내막/중막 비의 감소가 나타났다 (문헌 [Merce Roque, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 554]; [A. Schober, et al., Circ. Res. 2004, 95, 1125]; [W. J. Kim, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2003, 310, 936]). 마우스에서, 골격근에서의 MCP-1의 우세한 음성 억제제의 형질감염 (문헌 [K. Egashira, et al., Circ. Res. 2002, 90, 1167])이 또한 동맥 손상 이후에 혈관내막 과형성을 감소시켰다. 무력화 항체를 사용하는 CCR2의 차단은 영장류에서의 스텐팅(stenting) 이후에 신생내막 과형성을 감소시켰다 (문헌 [C. Horvath, et al., Circ. Res. 2002, 90, 488]).

2개의 보고서가 유도된 뇌 외상이 있는 래트에서 MCP-1의 과발현을 기재하고 있다 (문헌 [J. S. King, et al., J. Neuroimmunol. 1994, 56, 127] 및 [Joan W. Berman, et al., J. Immunol. 1996, 156, 3017]). 또한, 연구는 CCR2^-/- 마우스 (문헌 [O. B. Dimitrijevic, et al., Stroke 2007, 38, 1345]) 및 MCP-1-/- 마우스 (문헌 [P. M. Hughes, et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 2002, 22, 308])가 둘 모두 허혈/재관류 손상으로부터 부분적으로 보호된다는 것을 보여준다.

단핵세포/대식세포는 신경병증성 통증의 발병에 중요한 역할을 수행하는 것 으로 알려져 있다 (문헌 [Liu T, van Rooijen N, Tracey DJ, Pain 2000, 86, 25]). 이러한 개념에 부합하여, 최근 염증성 및 신경병증성 통증 둘 모두의 치료에 있어서의 CCR2에 대한 잠재적 역할이 기재되었다. CCR2^-/- 마우스는 이들의 야생형 상대에 비해, 백서 족부(intraplantar) 포르말린 주사 이후의 감소된 통증 행동 및 백서 족부 CFA 주사 이후의 약간 감소된 기계적 이질통을 비롯한, 염증성 통증에 대해 변형된 반응을 나타낸다 (문헌 [C. Abbadie, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 2003, 100, 7947]). 또한, CCR2-/- 마우스는 좌골 신경 손상 이후에 유의한 기계적 이질통을 나타내지 않았다. 이와 마찬가지로, 소분자 CCR2 길항제는 경구 투여 이후에 기계적 이질통을 손상 이전 수준의 약 80％까지 감소시켰다 (문헌 [C. Abbadie, J. A. Lindia, and H. Wang, WO PCT 110376, 2004]).

한 연구는 허혈성 심근병증에 있어 MCP-1의 중요한 역할을 기재하고 있다 (문헌 [N. G. Frangogiannis, et al., Circulation 2007, 115, 584]). 다른 연구는 MCP-1의 억제에 따른 실험적 심부전증의 약화를 기재하고 있다 (문헌 [S Hayashidani et al., Circulation 2003, 108, 2134]).

다른 연구는 MCP-1이 상기 언급되지 않은 다양한 질환 상태에서 과발현된다는 증거를 제공한다. 이러한 보고는 MCP-1 길항제가 상기 질환에 대한 유용한 요법이 될 수 있다는 상관된 증거를 제공한다. 다른 연구는 설치류 심장 동종이식편에서의 MCP-1의 과발현을 입증하였으며, 이는 이식 동맥경화증의 발병에 있어서의 MCP-1에 대한 역할을 시사한다 (문헌 [Mary E. Russell, et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 1993, 90, 6086]). MCP-1의 과발현은 특발성 폐 섬유증 환자의 폐 내피 세포에서 나타났다 (문헌 [Harry N. Antoniades, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1992, 89, 5371]). 이와 유사하게, MCP-1의 과발현은 건선 환자의 피부에서 나타났으며 (문헌 [M. Deleuran, et al., J. Dermatol. Sci. 1996, 13, 228] 및 [R. Gillitzer, et al., J. Invest. Dermatol. 1993, 101, 127]); CCR2+ 세포의 우세성과 관련된 상관적 발견이 또한 보고되었다 (문헌 [C. Vestergaard, et al., Acta Derm. Venerol. 2004, 84, 353]). 마지막으로, 최근 보고는 MCP-1이 HIV-1-관련 치매 환자의 뇌 및 뇌척수액에서 과발현된다는 것을 보여주고 있다 (문헌 [Alfredo Garzino-Demo, WO 99/46991]).

또한, CCR2 다형성은 적어도 하나의 서브셋의 환자에서 유육종증과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [P. Spagnolo, et al., Am J Respir Crit Care Med. 2003, 168, 1162]).

또한, CCR-2가 HIV의 몇몇 균주에 대한 공-수용체로서 포함됨을 유의해야 한다 (문헌 [B. J. Doranz, et al., Cell 1996, 85, 1149]). 또한, HIV 공-수용체로서의 CCR-2의 사용이 질환 진행과 서로 관련될 수 있는 것으로 결정되었다 (문헌 [Ruth I. Connor, et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 621]). 이러한 발견은 CCR-2 돌연변이 CCR2-64I의 존재가 인간 집단에서 HIV의 개시 지연과 서로 긍정적으로 관련되어 있다는 최근의 발견에 부합한다 (문헌 [Michael W. Smith, et al., Science 1997, 277, 959]). MCP-1이 이러한 과정에 관련되지는 않으나, CCR-2에 대한 결합을 통해 작용하는 MCP-1 길항제가 HIV-감염된 환자에서 AIDS에 대한 질환 진행을 지연시키는데 유익한 치료 효과를 나타낼 수 있을 것이다.

CCR2가 또한 인간 케모카인 MCP-2, MCP-3 및 MCP-4에 대한 수용체임에 유의해야 한다 (문헌 [Luster, New Eng. J. Med. 1998, 338, 436-445]). 본원에 기재된 신규 화학식 I의 화합물은 CCR-2 수용체로의 결합에 의해 MCP-1에 대해 길항작용을 하므로, 이들 화학식 I의 화합물은 또한 CCR-2에 의해 매개되는 MCP-2, MCP-3 및 MCP-4의 작용의 효과적인 길항제일 수 있다. 따라서, 본원에서 "MCP-1의 길항작용"이 언급된 경우, 이는 "CCR-2의 케모카인 자극의 길항작용"과 동등한 의미로 간주된다.

따라서, 케모카인 활성을 조절하는 화합물은 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환을 치료하는데 있어 광범위한 유용성을 입증할 수 있었다. 특허 공개공보 WO2005021500 (상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함되며, 본 출원인에게 양도됨)은 CCR2를 통해 MCP-1, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4 활성을 조절하는 화합물을 개시하고 있다. 또한, 이 참조 문헌은 보호기의 도입 및 추후 제거를 포함하는 다단계 합성을 포함하는 이들 화합물의 다양한 제조 방법을 개시하고 있다.

공지된 케모카인 조절제에 비해 개선된 약리학상 특징을 갖는 새로운 화합물을 찾는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 다른 G 단백질-커플링된 수용체 (즉, 5HT2A 수용체)에 대해 개선된 CCR-2 억제 활성 및 CCR-2에 대한 선택성을 갖는 새로운 화합물을 찾는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 하기 분류 중 하나 이상에서 유리하고 개선된 특징을 갖는 화합물을 찾는 것이 바람직할 수 있다:

(a) 제약 성질 (즉, 용해도, 투과도, 서방형 제제에 대한 적응성);

(b) 투여량 요구조건 (예를 들면, 보다 낮은 투여량 및/또는 일일 1회 투여);

(c) 혈중 농도 최고-대-최저(peak-to-trough) 특징을 감소시키는 요인 (즉, 제거율 및/또는 분포 부피);

(d) 수용체에서의 활성 약물의 농도를 증가시키는 요인 (즉, 단백질 결합, 분포 부피);

(e) 임상 약물-약물 상호작용에 대한 책임을 감소시키는 요인 (시토크롬 P450 효소 억제 또는 유도, 예컨대 CYP 2D6 억제, 문헌 [G.K. Dresser, J.D. Spence, D.G. Bailey, Clin. Pharmacokinet. 2000, 38, 41-57] (상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨) 참조);

(f) 부작용에 대한 잠재성을 감소시키는 요인 (예를 들면, G 단백질-커플링된 수용체보다 뛰어난 약리학상 선택성, 잠재적 화학적 또는 대사적 반응성, 제한된 CNS 침투 및/또는 이온-채널 선택성). 특히, 상기 언급된 약리학상 특징의 바람직한 조합을 갖는 화합물을 찾는 것이 바람직할 수 있다.

또한, 이러한 화합물을 제조하는 새롭고/거나 개선된 방법을 제공하는 것이 당업계에서 바람직할 수 있다. 이들 방법은 a) 보다 큰 규모의 생산, 예컨대 시험 공장 또는 제조 공장 규모에 대한 용이한 적응; b) 순도 (키랄 순도 포함), 안정성, 및/또는 중간체 및/또는 최종 화합물의 취급 용이성을 개선시킬 수 있는 방법 단계 및/또는 기술; 및/또는 c) 보다 적은 방법 단계를 특징으로 할 수 있으나 이 들로 한정되지는 않는다.

<발명의 요약>

따라서, 본원에서는 예상하지 못한 바람직한 약리학적 특징의 조합을 갖는 케모카인 활성의 신규 조절제 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물을 개시하고 있다.

본 개시문은 제약상 허용되는 담체 및 치료상 유효량의 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물 형태를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 개시문은 또한 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환, 특히 당뇨병, 다발성 경화증, 크론병 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 치료를 필요로 하는 숙주에게 치료상 유효량의 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물 형태를 투여하는 것을 포함하는, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환, 특히 당뇨병, 다발성 경화증, 크론병 및/또는 아테롬성 동맥경화증의 치료 방법을 제공한다.

본 개시문은 본원에 개시된 화합물 및 이들에 유용한 중간체의 제조 방법을 제공한다.

본 개시문은 또한 활성 화합물의 대사물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물, 이들의 제약 조성물, 및 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환, 특히 당뇨병, 다발성 경화증, 크론병 및/또 는 아테롬성 동맥경화증의 치료에 이들 대사물을 사용하는 방법을 제공한다.

본 개시문은 요법에 사용하기 위한 신규 시클릭 유도체를 제공한다.

본 개시문은 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환 치료용 의약의 제조를 위한 신규 시클릭 유도체의 용도를 제공한다.

도 1은 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트의 X-선 결정 구조를 도시하고 있다.

본 개시문은 일반적으로 예상하지 못한 바람직한 약리학상 성질의 조합을 갖는 케모카인 수용체 활성의 조절제, 이들을 함유하는 제약 조성물, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환, 특히 당뇨병, 아테롬성 동맥경화증, 크론병 및 다발성 경화증의 치료 및 예방용 제제로서 이들을 사용하는 방법, 및 상기 화합물 및 이에 대한 중간체의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 화합물은 예상치 못하게, 이들이 효능이 높고 우수한 안전성 기준을 갖는 처방과 함께 놀랍게도 고도의 경구 생체이용가능성을 포함하는 바람직한 약리학상 특징의 조합을 나타내었다.

공지의 CCR2 수용체의 조절제, 예컨대 적합한 정도의 막 투과성 (경구 생체이용가능성의 중요한 요인)을 나타내는, 2005년 3월 10일에 공개된 특허 공개공보 WO2005021500 (미국 특허 제7,163,937호, 2007년 1월 16일 발행, 본 출원인에게 양도됨)에 개시된 것들은 이들의 CCR2-결합 능력에 의해 측정된 바와 같이 충분한 효능을 나타내지 않고/거나, hERG 및 Ca 이온 채널 연구에 의해 측정된 이온 채널 선택성에 의해 나타난 바와 같이 안전성에 대한 적절한 기준이 결여되어 있다.

반면, 본원에서 "약리학상 특징 비교"라는 부제의 섹션에 제시된 데이타에 의해 설명되는 바와 같이, 상대적으로 극성인 본 발명의 분자는 놀랍게도 고도의 막 투과성을 나타내었으며, 또 우수한 이온 채널 선택성과 함께 강력한 CCR2 결합 능력을 유지하였다.

따라서, 본 발명은 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환을 치료하는데 유용할 것으로 예상되는 개선된 약리학상 특징을 갖는 신규 케모카인 조절제를 제공한다.

또한 본원에서 활성 화합물의 대사물, 이들의 제약 조성물, 및 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환, 특히 당뇨병, 아테롬성 동맥경화증, 크론병 및 다발성 경화증의 치료 및 예방에 이들을 사용하는 방법, 및 상기 화합물 및 이에 대한 중간체의 제조 방법이 제공된다. 활성 화합물은 N-((1R,2S,5R)-5-(tert-부틸아미노)-2-((S)-2-옥소-3-(6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린-4-일아미노)피롤리딘-1-일)시클로헥실)아세트아미드 (동시 계류 중인 특허 출원에 기재되어 있음, 대리인 정리 번호 11079) 및 N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필(메틸)아미노)-2-((S)-2-옥소-3-(6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린-4-일아미노)피롤리딘-1-일)시클로헥실)아세트아미드 (동시 계류 중인 특허 출원에 기재되어 있음, 대리인 정리 번호 10720)이다. 이들 대사물의 활성은 본원에서 "약리학상 특징 비교"라는 부제의 섹션에 기재되어 있다.

실시양태

한 실시양태에서, 본 개시문은

(i) N-((1R,2S,5R)-2-((3S)-3-((6-tert-부틸피리미도[5,4-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)아세트아미드;

N-((1R,2S,5R)-5-(메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필(메틸)아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)포름아미드;

N-((1R,2S,5R)-5-(디메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-6-tert-부틸-2-피리딘카르복스아미드;

N-((1R,2S,5R)-5-아미노-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)프로판아미드;

2-tert-부틸-N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(메탄술포닐아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-4-피리미딘카르복스아미드;

2-tert-부틸-N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(프로피오닐아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-4-피리미딘카르복스아미드;

N-((1R,2S,5R)-5-(tert-부틸아미노)-2-((3S)-3-((6-tert-부틸피리미도[5,4-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)메탄술폰아미드; 및

N-(((1S,2S,5R)-5-메톡시-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)메틸)아세트아미드; 또는

(ii) 상기 (i) 화합물들의 제약상 허용되는 염

으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 N-((1R,2S,5R)-2-((3S)-3-((6-tert-부틸피리미도[5,4-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)아세트아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 개시문은 N-((1R,2S,5R)-5-(메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필(메틸)아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)포름아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 N-((1R,2S,5R)-5-(디메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-6-tert-부틸-2-피리딘카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 N-((1R,2S,5R)-5-아미노-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)프로판아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 2-tert-부틸-N-((3S)-1-((1R,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(메탄술포닐아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-4-피리미딘카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 2-tert-부틸-N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(프로피오닐아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-4-피리미딘카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 N-((1R,2S,5R)-5-(tert-부틸아미노)-2-((3S)-3-((6-tert-부틸피리미도[5,4-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)메탄술폰아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 개시문은 N-(((1S,2S,5R)-5-메톡시-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)메틸)아세트아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물에 관한 것이다.

다른 실시양태는 제약상 허용되는 담체 및 실시예의 화합물을 포함하는 제약 조성물이다.

다른 실시양태는 케모카인 또는 케모카인 수용체 활성의 조절을 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 케모카인 또는 케모카인 수용체 활성의 조절 방법이다.

다른 실시양태는 CCR-2 수용체 활성의 조절을 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, CCR-2 수용체 활성의 조절 방법이다.

다른 실시양태는 MCP-1, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4의 활성, 및 CCR-2 수용체에 의해 매개되는 MCP-5 활성의 조절을 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, MCP-1, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4의 활성, 및 CCR-2 수용체에 의해 매개되는 MCP-5 활성의 조절 방법이다.

다른 실시양태는 MCP-1 활성의 조절을 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, MCP-1 활성의 조절 방법이다.

다른 실시양태는 CCR2 및 CCR5 활성의 억제를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, CCR2 및 CCR5 활성의 억제 방법이다.

다른 실시양태는 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 치료상 유효량의 실시예의 화합물을, 당뇨병, 비만, 대사성 증후군, 졸중, 신경병증성 통증, 허혈성 심근병증, 건선, 고혈압, 경피증, 골관절염, 동맥류, 열, 심혈관 질환, 크론병, 울혈성 심부전증, 자가면역 질환, HIV-감염, HIV-관련 치매, 건선, 특발성 폐 섬유증, 이식 동맥경화증, 물리적-유도성 또는 화학적-유도성 뇌 외상, 염증성 장 질환, 폐포염, 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 신독성 혈청 신염, 사구체신염, 천식, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증, 혈관염, 취약성 경화반, 류마티스성 관절염, 재협착, 정맥성 신생내막 과형성, 투석-이식편 신생내막 과형성, 동정맥 션트 혈관내막 과형성, 기관 이식, 만성 동종이식편 신장병 및 암으로부터 선택된 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 치료상 유효량의 실시예의 화합물을, 당뇨병, 비만, 크론병, 건선, 특발성 폐 섬유증, 이식 동맥경화증, 물리적-유도성 또는 화학적-유도성 뇌 외상, 염증성 장 질환, 폐포염, 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 신독성 혈청 신염, 사구체신염, 천식, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증, 및 류마티스성 관절염, 재협착, 기관 이식 및 암으로부터 선택된 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 치료상 유효량의 실시예의 화합물을, 당뇨병, 비만, 크론병, 전신 홍반성 루푸스, 사구체신염, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재협착 및 기관 이식으로부터 선택된 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 치료상 유효량의 실시예의 화합물을, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증, 크론병 및 당뇨병으로부터 선택된 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 치료상 유효량의 실시예의 화합물을, 재협착, 기관 이식 및 암으로부터 선택된 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 장애의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 당뇨병의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 다발성 경화증의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 다발성 경화증의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 아테롬성 동맥경화증의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 아테롬성 동맥경화증의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 재협착의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 재협착의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 기관 이식의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 기관 이식의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 암이 유방암, 간암, 전립선암 및 흑색종으로부터 선택되는 것인, 상기 암의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 적어도 부분적으로 CCR-2에 매개되는 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 적어도 부분적으로 CCR-2에 매개되는 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 대사성 질환, 암 및/또는 심혈관 질환의 치료 방법이다.

다른 실시양태는 CCR2 활성의 조절을 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, CCR2 활성의 조절 방법이다.

다른 실시양태는 CCR5 수용체에 의해 매개되는 MIP-1β 및 RANTES 활성의 조절을 필요로 하는 환자에게 치료상 유효량의 실시예의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, CCR5 수용체에 의해 매개되는 MIP-1β 및 RANTES 활성의 조절 방법이다.

다른 실시양태는 당뇨병, 비만, 대사성 증후군, 졸중, 신경병증성 통증, 허혈성 심근병증, 건선, 고혈압, 경피증, 골관절염, 동맥류, 열, 심혈관 질환, 크론병, 울혈성 심부전증, 자가면역 질환, HIV-감염, HIV-관련 치매, 건선, 특발성 폐 섬유증, 이식 동맥경화증, 물리적-유도성 또는 화학적-유도성 뇌 외상, 염증성 장 질환, 폐포염, 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 신독성 혈청 신염, 사구체신염, 천식, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증, 혈관염, 취약성 경화반, 류마티스성 관절염, 재협착, 정맥성 신생내막 과형성, 투석-이식편 신생내막 과형성, 동정맥 션트 혈관내막 과형성, 기관 이식, 만성 동종이식편 신장병 및 암의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 실시예의 화합물이다.

다른 실시양태는 요법에 사용하기 위한 실시예의 화합물이다.

다른 실시양태는 실시예의 화합물의 제조 방법이다.

다른 실시양태는

(i) N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

N-((1R,2S,5R)-5-아미노-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필(메틸)아미노)-2-((3S)-3-((1-옥시도-6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필아미노)-2-((3S)-3-((1-옥시도-6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드; 및

N-((1R,2S,5R)-5-(tert-부틸아미노)-2-((3S)-3-((1-옥시도-6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드; 또는

(ii) 상기 (i) 화합물들의 제약상 허용되는 염 또는 전구약물로부터 선택된 화합물이며, 여기서 상기 화합물들은 제약상 활성 화합물의 인간 대사물로서 유용하다.

본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 속성에서 벗어나지 않고 다른 특정한 형태로 실시될 수 있다. 본 발명은 또한 본원에서 언급된 발명의 다른 측면 및 실시양태의 모든 조합을 포함한다. 본 발명의 임의의 모든 실시양태는 본 발명의 추가적인 실시양태를 기재하기 위한 임의의 다른 실시양태와 함께 취해질 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 한 실시양태의 임의의 구성요소 (바람직한 측면 포함)는 추가적인 실시양태를 기재하기 위한 임의의 실시양태로부터의 임의의 모든 다른 구성요소와 조합되는 것으로 이해된다.

정의

본원에 기재된 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있다. 비대칭적으로 치환된 원자를 함유하는 본 발명의 화합물은 광학적으로 활성인 형태 또는 라세미체 형태로 단리될 수 있다. 광학적으로 활성인 형태의 제조 방법, 예컨대 라세미체 형태의 분할 또는 광학적으로 활성인 출발 물질로부터의 합성에 의한 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 올레핀, C=N 이중 결합 등의 많은 기하학상 이성질체가 또한 본원에 기재된 화합물에 존재할 수 있고, 모든 이러한 안정한 이성질체가 본 발명에 포함된다. 본 발명 화합물의 시스 및 트랜스 기하학상 이성질체가 기재되어 있고, 이들은 이성질체의 혼합물로서 또는 분리된 이성질체 형태로서 단리될 수 있다. 특정 입체화학 또는 이성질체 형태가 구체적으로 지시되지 않는 한, 한 구조의 모든 키랄, 부분입체이성질체, 라세미체 형태 및 모든 기하학상 이성질체 형태가 포함된다.

본원에 개시된 화합물의 한 거울상이성질체는 다른 것에 비해 더 우수한 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 모든 입체화학이 본 발명의 부분인 것으로 간주된다. 필요에 따라, 라세미체 물질의 분리는 키랄 컬럼을 사용하는 HPLC에 의해 또는 문헌 [Steven D. Young, et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995, 2602-2605]에서와 같이 캄폰산 클로라이드와 같은 분할제를 사용하는 분할에 의해 달성될 수 있다.

어구 "제약상 허용되는"은 공정한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기성 반응, 또는 다른 문제점 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기 적합하고, 합당한 이점/위험성 비율이 균형잡힌 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 나타내기 위해 본원에 사용된다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 산 또는 염기 염을 제조함으로써 모 화합물을 변형시킨, 개시된 화합물의 유도체를 나타낸다. 제약상 허용되는 염의 예로는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산 또는 유기산 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리염 또는 유기염 등이 있으나 이들로 한정되지는 않는다. 제약상 허용되는 염에는, 예를 들어 비독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상의 비독성 염 또는 4급 암모늄 염이 포함된다. 예를 들어, 이러한 통상의 비독성 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 술팜산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로부터 유래된 염, 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 팜산, 말레산, 히드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 술파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 에탄 디술폰산, 옥살산, 이세티온산 등과 같은 유기산으로부터 제조된 염이 포함된다.

본 발명의 제약상 허용되는 염은 염기성 또는 산성 잔기를 함유하는 모 화합물로부터 통상의 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리된 산 또는 염기 형태를 화학양론적 양의 적절한 염기 또는 산과 물 또는 유기 용매 중에서, 또는 이 둘의 혼합물 중에서 반응시킴으로써 제조할 수 있고, 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418] (그 개시문이 상기 거명을 통해 본원에 참고로 포함됨)에서 찾을 수 있다.

전구약물은 다수의 바람직한 제약적 특성 (예를 들면, 용해도, 생체이용가능성, 제조 과정 등)을 향상시키는 것으로 알려져 있으므로, 본 발명의 화합물은 전구약물 형태로 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 청구된 화합물의 전구약물, 이들의 전달 방법 및 이들을 함유하는 조성물을 포함한다. "전구약물"은 이 전구약물이 포유동물 대상체에게 투여되었을 때 생체내에서 본 발명의 활성 모 약물을 방출하는 임의의 공유 결합된 담체를 포함한다. 본 발명의 전구약물은 화합물에 존재하는 관능기를 개질시켜 제조하는데, 이 때 개질된 관능기는 통상의 조작법에 의해 또는 생체내에서 모 화합물로 절단된다. 전구약물은 본 발명의 전구약물이 포유동물 대상체에게 투여되었을 때 절단되어 각각 유리 히드록실, 유리 아미노 또는 유리 술프히드릴 기를 형성하는 임의의 기에 히드록시, 아미노 또는 술프히드릴 기가 결합되어 있는 본 발명의 화합물을 포함한다. 전구약물의 예로는 본 발명의 화합물의 알콜 및 아민 관능기의 아세테이트, 포르메이트 및 벤조에이트 유도체가 있으나 이들로 한정되지는 않는다.

"안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 등급의 순도로의 단리 및 효능있는 치료제로의 제제화에서 잔존하기에 충분히 강한 화합물을 나타낸다. 본 발명은 안정한 화합물의 구현을 목적으로 한다.

"치료상 유효량"은 MCP-1을 억제하는 데 효과적이거나 또는 염증성 장애를 치료 또는 예방하는 데 효과적인, 단독의 본 발명의 화합물의 양 또는 본 발명의 청구된 화합물들의 조합물의 양 또는 다른 활성 성분과 조합된 본 발명의 화합물의 양을 포함하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질환 상태의 치료를 포함하고, (a) 특히, 포유동물이 질환 상태가 되기 쉽지만 그 질환 상태를 앓고 있는 것으로는 아직 진단되지 않은 경우에 상기 포유동물에서 질환 상태의 발생을 예방하는 것; (b) 질환 상태를 억제하는 것, 즉 그 질환 상태의 발달을 저지하는 것; 및/또는 (c) 질환 상태를 경감시키는 것, 즉 질환 상태의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다.

하기 실시예는 본 발명의 화합물 및 출발 물질의 실시양태를 설명하는 것으로, 이들이 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다.

적절하게는, 반응은 무수 질소 (또는 아르곤)의 분위기 하에서 수행하였다. 무수 반응의 경우, Dri-Solv 용매 (EM)를 사용하였다. 다른 반응의 경우, 시약 등급 또는 HPLC 등급 용매를 사용하였다. 달리 언급되지 않은 한, 구입한 모든 시약은 받은 상태 그대로 사용하였다.

LC/MS 측정 결과는 시마주(Shimadzu) HPLC/워터스(Waters) ZQ 단일 4중 극자 질량 분석 혼성 시스템을 이용하여 수득하였다. 관심있는 피크에 대한 데이타는 양성-모드 전기분사 이온화로부터 기록하였다. NMR (핵 자기 공명) 스펙트럼은 통상적으로 지시된 용매 중에서 브루커(Bruker) 또는 JEOL 400 MHz 및 500 MHz 기기 상에서 수득하였다. 모든 화학적 이동은 내부 표준으로 용매 공명이 있는 테트라메틸실란으로부터 ppm으로 기록하였다. ¹H-NMR 스펙트럼 데이타는 통상적으로 다음과 같이 기록하였다: 화학적 이동, 다중도 (s = 단일 피크, br s = 넓은 단일 피크, d = 이중 피크, dd = 이중 피크의 이중 피크, t = 삼중 피크, q = 4중 피크, sep = 7중 피크, m = 다중 피크, app = 겉보기 값), 커플링 상수 (Hz), 및 적분값.

당업자라면 본원에 사용된 표준 약어를 인지하고 있을 것이다. 참조 용이성을 위해, 다음과 같은 약어가 포함되었으나, 반드시 이들로 한정되는 것은 아니다: sat. = 포화, HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피, AP = 영역 비율, KF = 칼-피셔(Karl-Fischer), RT = 실온, mmol = 밀리몰, HRMS = 고분할 질량 분광법, TBTU = O-벤조트리아졸-2-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, MTBE = TBME = tert-부틸 메틸 에테르, EDAC = N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드, EDC = N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드, TEA = 트리에틸아민, DPPA = 디페닐 포스포릴 아지드, IPA = 이소프로필 알콜, TFA = 트리플루오로아세트산, DCM = 디클로로메탄, THF = 테트라히드로푸란, DMF = N,N-디메틸포름아미드, BOP = (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포 늄 헥사플루오로포스페이트, EtOAc = 에틸 아세테이트, DMSO = 디메틸술폭시드, ℃ = 섭씨 온도, eq = 당량, g = 그램, mg = 밀리그램, mL (또는 ml) = 밀리리터, h = 시간, M = 몰농도(molar), N = 노르말(normal), min = 분, MHz = 메가헤르츠, tlc = 박층 크로마토그래피, v/v = 부피 대 부피 비율.

"α", "β", "R" 및 "S"는 당업자에게 익숙한 입체화학적 명칭이다.

실시예 1

N-(( 1R ,2S,5R)-2-((3S)-3-((6- tert - 부틸피리미도[5,4-d]피리미딘 -4-일)아미노)-2-옥소-1- 피롤리디닐 )-5-( 이소프로필(메틸)아미노 ) 시클로헥실 ) 아세트아미드

실시예 1, 단계 1: (1R,2S,5R)-tert-부틸 2-벤질옥시카르보닐아미노-7-옥소-6-아자-바이시클로[3.2.1]옥탄-6-카르복실레이트 (89.6 g, 0.24 mol, 문헌 [P. H. Carter, et al. PCT application WO 2005/021500] 참조)을 에틸 아세테이트 (1.5 L)에 용해시키고, 생성된 용액을 포화 NaHCO₃ (2×0.45 L) 및 포화 NaCl (1×0.45 L)로 세척하였다. 용액을 건조(Na₂SO₄)시킨 후, 3 L 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크로 직접 여과하였다. 그 용액을 질소를 직접 주입하여 퍼징한 후, 질소 분위기 하에서 10％ Pd/C (13.65 g)로 충전하였다. 플라스크를 배기시키고 수소로 다시 채우고; 이 작업을 2회 더 반복하였다. 수소를 30분간 용액에 버블링시킨 후, 반 응물을 H₂ 1 atm 하에서 18 시간 동안 교반하였다. 플라스크를 배기시키고 질소로 다시 채운 후, 새로운 촉매 (10％ Pd/C 6 g)로 충전하였다. 30분간 용액에 수소를 버블링시키고, 반응물을 H₂ 1 atm 하에서 18 시간 동안 교반하였다. 플라스크를 배기시키고 수소로 다시 채웠다. 혼합물을 셀라이트(Celite)로 여과하고; 여과 패드를 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여액(약 1.6 L EtOAc 부피)을 아세토니트릴(0.3 L)로 희석하고, 이어서 L-N-Cbz-메티오닌 (68 g, 0.24 mol), TBTU (77 g, 0.24 mol), 및 N,N-디이소프로필에틸아민 (42 mL, 0.24 mol)로 순차적으로 충전하였다. 반응물을 실온에서 4 시간 동안 교반하는 동안, 그것은 현탁액에서 맑은 용액으로 변화하였다. 포화 NH₄Cl (0.75 L) 및 물 (0.15 L)을 첨가하여 반응을 중지시키고; 혼합물을 EtOAc (0.75 L)로 더 희석하였다. 상을 혼합하고, 분리하고, 유기층은 포화 Na₂CO₃ (2×0.9 L) 및 포화 NaCl (1×0.75 L)로 세척하였다. 용액을 건조(Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하여 (1R,2S,5R)-tert-부틸 2-((S)-2-(벤질옥시카르보닐아미노)-4-(메틸티오)부탄아미도)-7-옥소-6-아자-바이시클로[3.2.1]옥탄-6-카르복실레이트를 오일 형태로 수득하였고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.

EtOAc [1.26 (t), 2.03 (s), 4.12 (q)] 및 N,N,N,N-테트라메틸우레아 [2.83 (s)]도 측정되었다.

실시예 1, 단계 2: (1R,2S,5R)-tert-부틸 2-((S)-2-(벤질옥시카르보닐아미노)-4-(메틸티오)부탄아미도)-7-옥소-6-아자-바이시클로[3.2.1]옥탄-6-카르복실레이트 (약 0.24 mol; 이전 절차 참조)를 요오도메탄 (1,250 g)에 용해시킨 후, 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고, 진공에서 농축하였다. 이 작업을 2회 더 반복하였다. 생성된 슬러지를 디클로로메탄 (0.4L)에 용해시키고, 빠르게 교반 중인 MTBE 용액 (4.0 L)에 부었다. 생성된 황색 고체를 흡입 여과를 통해 수집하고, 고진공 하에서 건조시켜 술포늄염 (179 g)을 수득하였다. 이 물질은 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.

MTBE [1.18 (s), 3.2 (s)] 및 미량의 N,N,N,N-테트라메틸우레아 [2.81 (s)]도 측정되었다.

실시예 1, 단계 3: 이전 단계에서 얻어진 모든 술포늄염 (약 0.24 mol)을 DMSO (2.0 L)에 용해시켰다. 생성된 용액을 질소 조건 하에서 실온에서 교반시키고, 세슘카보네이트(216 g)를 여러번 나누어 충전하였다. 현탁액을 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 여과하여 고체를 제거하였다. 용액을 약 0.22 L로 분할한 후 다음 절차에 따라 후처리하였다: 반응 혼합물 (약 0.22 L)을 에틸 아세테이트 (1.5 L)로 희석하고 연속해서 물 (3×0.5 L)과 염수 (1×0.3 L)로 세척하였다. 유기층을 건조 (Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 목적한 (1R,2S,5R)-tert-부틸 2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-7-옥소-6-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-6-카르복실레이트 (90.8 g, 83％)를 불순물인 테트라메틸 우레아 없이, 미세결정질 포말 형태로 수득하였다.

원하는 경우, 이 물질을 MTBE (1 부피)에 용해시키고, 헵탄 (3.3 부피)에 첨가하고, 그 결과 생성되는 침전물을 수집함으로써 고체로 분리할 수 있다.

실시예 1, 단계 4: THF (1L) 중 (1R,2S,5R)-tert-부틸 2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-7-옥소-6-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-6-카르복실레이트 (108 g, 0.236 mol)의 교반 용액에 리튬 하이드록사이드 일수화물 (21.74 g, 0.519 mol)을 충전하였다. 온도가 20 ℃를 넘지 않도록 물 (0.3 L)을 천천히 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하고, 휘발성 물질을 진공에서 제거하였다. 1N HCl (450 mL) 및 NaH₂PO₄를 첨가하여 pH를 약 4로 조절하였다. 생성된 백색 침전물을 여과시켜 수집하고, 물 (2×1 L)로 세척하였다. 고체를 디클로로메탄 (1.5 L) 및 물 (약 1 L)에 용해시켰다. 유기층을 건조(Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (0.7 L) 에 용해시키고, 생성된 용액은 1 시간 동안 환류 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 고체를 분리하고, 여 과하여 수집하였다. 이 고체를 이소프로판올에서 재결정화하여 정제하여 목적한 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)시클로헥산카르복실산을 백색 고체(104.5 g, 수율 93％) 형태로 수득하였다.

실시예 1, 단계 5: 용량 3 L의 둥근 바닥 플라스크에 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)시클로헥산카르복실산 (75.5 g, 0.158 mol), EDC·HCl (33.5 g, 0.175 mol), 1-히드록시벤조트리아졸 (23.6 g, 0.175 mol) 및 디클로로메탄 (1 L)을 충전하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하는 동안, 백색 현탁액이 맑은 용액으로 변화하였다. pH가 강염기(페이퍼)가 될 때까지 용액에 암모니아 (가스)를 버블링시키고, 10분 동안 반응물을 교반하였다; 이러한 암모니아 첨가 과정을 반복하고 반응물을 추가로 10분 동안 교반하였다. 물을 첨가하였다. 유기층은 포화 NaHCO₃, NaH₂PO₄, 및 염수로 세척하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 아세토니트릴 (0.5 L)로 슬러리화한 후, 농축하여, (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)시클로헥산카르복스아미드를 백색 고체 (75.9 g, 약 100％) 형태로 수득하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.

실시예 1, 단계 6: 반응물을 세 부분으로 균분하여 반응시킨 후, 다시 합하여 수성 후처리하였다. 5 L 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크에 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)시클로헥산카르복스아미드 (25.3 g, 53 mmol), 아세토니트릴 (1.9 L) 및 물/얼음 (2.6 L)을 충전하였다. 혼합물을 교반하고, 0 ℃까지 냉각시켰다. 요오도벤젠 디아세테이트 (25.77 g, 80 mmol)을 첨가하고, 반응물을 2 시간 동안 교반하였다; 추가로 0.5 당량의 요오도벤젠 디아세테이트를 첨가하였다. 반응물을 9 시간 동안 교반 (반응온도 < 10 ℃)하였다. 혼합물에 8 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 2 당량의 무수 아세트산을 충전하였다. 다음 30분간, 4 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민 및 2 당량의 무수 아세트산을 10분 간격으로 첨가하여 반응을 완결시켰다(HPLC). 아세토니트릴을 진공에서 제거하였다; 일부 고체를 잔류물로부터 분리하고, 여과하여 수집하였다. 남은 잔류물을 디클로로메탄 (3 L, 그 후 1 L)로 추출하였다. 유기층을 물, 포화 NaHCO₃ 및 염수 순서로 세척하였다. 수집된 고체를 활성 탄소 (15g)과 함께 유기층에 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 30분 동안 교반한 후, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 EtOAc (1 L)에 용해시키고, 생성된 용액을 75 ℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 실온으로 냉각시켰다. 분리된 고체는 여과시켜 수집하였다. 이 고체를 재결정화하여 추가로 정제하였다: 먼저 0.5 L CH₂Cl₂에 용해시키고, 진공에서 농축한 후, 1 L EtOAc로 재결정화하였다; 같은 과정을 3번 반복하였다. 상기 모 용액으로부터 얻어진 고체를 같은 방법을 이용하여 3번 재결정화하였다. 합쳐진 고체는 아세토니트릴 (0.7L)로 두 번 더 재결정화하여 66 g (84 ％)의 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (순도 > 99.5％ [HPLC])를 수득하였다.

호프만 전위 (Hofmann rearrangement)의 입체화학적 정확도를 도 1에 제시된 이 화합물의 X-선 결정 구조 분석으로 확인하였다.

실시예 1, 단계 7: 디클로로메탄 (216 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (66 g, 0.135 mol)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산 (216 mL)을 충전하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반시키고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고, 생성된 용액을 진공에서 농축하였다; 이 과정을 한번 더 반복하였다. 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 오일 형태로 수득하였고, 하기 단계 8에서 바로 사용하였다.

실시예 1, 단계 8: 메탄올 (675 mL) 중 벤질 (S)-1-((lS,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (약 0.135 mol)의 교반 용액에 아세톤 (37.8 g, 4 당량), 나트륨 아세테이트 (33.2 g, 3 당량), 및 나트륨 시아노보로하이드라이드 (16.9 g, 2 당량)을 순차적으로 충전하였다. 혼합물을 실온에서 6 시간 동안 교반하고, 여과하였다. 여액을 디클로로메탄 (1 L)에 용해시키고; 이 용액을 1N NaOH (1L)로 세척하였다. 여과하여 수집한 고체를 0 ℃에서 1N NaOH (IL)에 용해시키고, 디클로로메탄 (1 L)으로 추출하였다. 유기 추출물을 모아서 수성 HCl (1N HCl 200 mL + 물 800 mL)로 추출하였다. 수성층은 pH가 11이 될 때까지 포화 NaHCO₃ (500 mL), 그리고 1N NaOH (100 mL)로 염기화하였다. 수성층을 디클로로메탄 (2 L)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 건조 (Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하여 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 오일 형태로 수득하였다.

실시예 1, 단계 9 (하기 별법, 단계 9 참조): 디클로로메탄 (600 mL) 중 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (약 115 mmol)의 교반 용액을 0℃로 냉각시키고, 포름알데히드 (18.6 g, 37 wt％ 용액), 트리에틸아민 (23 mL) 및 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 (28.7 g)를 순차적으로 충전하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 디클로로메탄 (1.2 L까지)으로 희석하였다. 이 용액을 500 mL의 포화 NaHCO₃ + NaOH (포화 NaHCO₃, 1N NaOH로 pH를 11로 조절)로 세 번 세척하였다. 유기층을 수성 HCl (1N HCl 200 mL + 물 600 mL)로 추출하였다. 수성층을 포화 NaHCO₃ (500 mL), 그리고 1N NaOH (100 mL)로 pH가 11이 될 때까지 염기화하였다. 수성층을 디클로로메탄 (1.2 L)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 건조(Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하여, 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 오일 형태로 수득하여, 아래 단계 10에서 바로 사용하였다.

실시예 1, 단계 10: 메탄올 (600 mL) 중 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)-시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (약 0.115 mol)의 용액에 10％ Pd/C (50％ 습식 촉매 6 g)를 첨가하였다. 플라스 크를 배기시키고, 수소로 다시 채웠다. 혼합물을 H₂ 1 atm 에서 2 시간 동안 교반하고, 촉매를 셀라이트 (Celite)로 여과하여 제거하였다. 여액을 진공에서 농축하여 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)아세트아미드를 오일 형태로 수득하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.

실시예 1, 단계 11: 이소프로판올 (3 mL) 중 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)아세트아미드 (62 mg, 0.2 mmol)의 용액에 2-tert-부틸-8-클로로-피리미도[5,4-d]피리미딘 (49 mg, 1.1 당량, 문헌 [P. H. Carter et al, PCT application WO 2005/021500] 참조) 및 트리에틸아민 (40.4 mg, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 감압하에 용매를 제거하였다. 잔류물을 정제용 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 TFA 염 (125 mg, 86.3％) 형태로 수득하였다.

실시예 2

N-(( 1R ,2S,5R)-5-( 이소프로필아미노 )-2-((3S)-2-옥소-3-((6-( 트리플루오로메 틸 )-4- 퀴나졸리닐 )아미노)-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 아세트아미드

실시예 2, 단계 1: 메탄올 (3 mL) 중 벤질 (S)-1-((lS,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (30 mg, 0.07 mmol; 실시예 1, 단계 8 참조)의 용액에 10％ Pd/C (50％ 습식 촉매 30 mg)를 첨가하였다. 플라스크를 배기시키고, 수소 풍선을 이용하여 수소를 다시 채웠다. 혼합물을 실온, 수소 1 atm 분위기 하에서, 1.5 시간 동안 교반한 후, 여과하여 촉매를 제거하였다. 여액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 이소프로판올 (3 mL)에 용해시키고, 4-클로로-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (19.4 mg, 1.2 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (18 mg, 2 당량)를 순차적으로 충전하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 감압하에 용매를 제거하였다. 잔류물을 정제용 역상 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 TFA 염 (47 mg, 93％) 형태로 수득하였다.

실시예 3

N-(( 1R ,2S,5R)-5-( 메틸아미노 )-2-((3S)-2-옥소-3-((6-( 트리플루오로메틸 )-4-퀴나졸리닐)아미노)-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 아세트아미드

실시예 3, 단계 1: tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (43.2 g, 88 mmol; 실시예 1, 단계 6 참조) 샘플을 디클로로메탄 (200 mL)에 용해시켰다. 용액을 TFA (100 mL)로 충전하고, 2.5 시간 동안 교반하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (200 mL)에 다시 용해시키고, 생성된 용액을 순수한 디에틸 에테르 (2.0 L) 교반 용액에 적가하였다. 에테르로 세척하여 백색 고체를 수집하고, 염기성 염류 용액 (2.0 M NaCl 및 1.0 M K₂CO₃, 총 350 mL)에 용해시켰다. 디클로로메탄 (1.2 L)을 첨가하고, 2개의 상을 강하게 혼합한 후, 분리하였다. 수성층을 디클로로메탄 (3×450 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 건조(MgSO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축한 후, 고진공 펌핑하여 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (34.8 g, 정량)를 미세결정질 고체 형태로 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 389.5.

실시예 3, 단계 2: 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (34.8 g, 약 90 mmol) 샘플을 메탄올 (400 mL)에 용해시켰다. 플라스크를 질소로 퍼징하고, 트리에틸아민 (15.61 mL, 112 mmol), 그리고 4-메톡시벤즈알데히드(13.62 mL, 112 mmol)로 충전하였다. 반응물을 실온에서 14 시간 동안 교반하였고, 이때 반응물의 LC/MS를 통해 일차 아민이 완전히 소모되고, 목적한 이민이 형성된 것을 확인(LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 507.4)하였다. 반응물을 0℃로 냉각시키고, 1분에 걸쳐 나누어 나트륨 보로하이드라이드 (5.08 g, 134 mmol)로 충전하였다. 빙조를 30분 후에 제거하고, 용액을 3.5 시간 동안 추가로 교반하였다. 반응물을 진공에서 농축하여 백색 고체/점성 물질로 만든 후, 포화 NaHCO₃ 400 mL 및 EtOAc 1200 mL에 용해시켰다. 강하게 혼합한 후 상을 분리하였다. 유기층을 2×800 mL 0.5N HCl로 세척하였다. (주의: 소량의 세 번째 오일층이 첫 번째 추출 과정에서 바닥에 존재하였으나; 산 층으로 제거되었다.) 산 세척액을 합하여, 고체 NaOH로 pH 13까지 염기화하고, 실온으로 냉각시킨 후, EtOAc (1×1000 mL; 2 x 600 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 염수 (1×120 mL)로 세척, 건조(MgSO₄), 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고, 농축하였다; 이 과정을 반복하고, 고진공으로 펌핑하여 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(4-메톡시벤질아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (43.68 g, 86 mmol, 수율 96 ％)를 유동성 미세결정질 고체 형태로 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 509.6.

실시예 3, 단계 4: 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-((4-메톡시벤질)(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (25.0 g, 47.8 mmol) 샘플을 MeOH에 용해시켰다. 플라스크를 디히드록시팔라듐 (6 g, 8.54 mmol)으로 충전한 후, 제거하고, 수소 풍선을 이용하여 수소로 다시 채웠다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 여과(이소프로판올 세척액 3×80 mL)하였다. 잔류물을 고진공 하에서 농축 건조시켰다. 감압 조건에서 잔류물을 이소프로판올 (4×150 mL)로 공비 건조시켜서 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(메틸아미노)시클로헥실)아세트아미드 (12.5 g, 46.6 mmol, 수율 97 ％)를 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 269.

실시예 3, 단계 5: 디클로로메탄 중 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(메틸아미노)시클로헥실)아세트아미드 (12.5 g, 46.6 mmol)의 용액에 트리에틸아민 (12.98 mL, 93 mmol) 및 4-클로로-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (10.83 g, 46.6 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 감압 조건에서 건조 상태로 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (350 mL)에 용해시키고, 아세트산 수용액(1×200 mL, 1×100 mL; H₂O 30OmL 및 아세트산 16 mL로 조제함)으로 추출하였다. 산 수성층 (pH 4 내지 5)을 디클로로메탄 (2×300 mL)으로 추출하고, Na₂CO₃를 이용하여 pH 10 내지 11로 염기화한 후, 디클로로메탄 (2×350 mL; 필요한 경우 Na₂CO₃을 이용하여 수성층의 pH를 10 내지 11로 유지함)으로 추출하였다. 유기층은 포화 NaCl 용액 (1×200 mL)으로 세척하였다; NaCl 층을 디클로로메탄 (1×100 mL)으로 역추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 건조(Na₂SO₄)하고, 여과하고, 진공에서 농축하여 표제 화합물 (19.4 g, 90％)을 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 465. HPLC 측정 결과 순도는 99.4％이며, 단일 불순물 함량은 0.5％가 가장 큰 값으로 측정되었다.

실시예 3, 재결정화: 단계 5의 표제 화합물 (19.4 g) 샘플을 무수 에탄올 300 mL에 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 환류시켜, 고체를 완전히 용해시킨 후, 교반(농축시키기 전에 일부 고체가 형성됨)하면서 천천히 약 60 ℃로 냉각하였다. 혼합물을 교반(오일 조는 약 64 ℃로 유지함)하면서 생성물과 에탄올의 총 중량이 약 62 g이 될 때까지 감압하에 천천히 농축하였다. 상당한 양의 고체가 농축 중에 침전하였다. 혼합물을 천천히 실온으로 냉각시킨 후, 1 시간 동안 빙조에서 냉각시켰다. 차가운 혼합물을 여과하고, 고체를 차가운 에탄올 (약 15 mL)로 세척하였다. 고체를 감압하에 밤새 55 내지 60℃에서 건조시켜, 표제 화합물의 유리 염기 (17.4 g; 회수율 90％)를 수득하였다. HPLC 측정 결과 순도는 99.9％로 확인되었다.

실시예 4

N-(( 1R ,2S,5R)-5-아미노-2-((3S)-2-옥소-3-((6-( 트리플루오로메틸 )-4- 퀴나졸리닐 )아미노)-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 아세트아미드

실시예 4, 단계 1: 메탄올 (10 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (1.7 g, 3.48 mmol; 실시예 1, 단계 6 참조)의 용액에 10％ Pd/C (50％ 습식 촉매 0.6 g)를 첨가하였다. 플라스크를 배기시키고, 수소 풍선을 이용하여 수소를 다시 충전하였다. 혼합물을 실온에서 수소 1 atm 하에서 14 시간 동안 교반하고, 여과하여 촉매를 제거하였다. 여액을 진공에서 농축하여 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트를 수득하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 355.

실시예 4, 단계 2: 이소프로판올 (10 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (약 3.4 mmol)의 용액에 4-클로로-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (0.97 g, 1.2 당량) 및 디이소프로필에틸아민 (0.88 g, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 감압하에 용매를 제거하였다. 잔류물을 각각 1％와 5％의 MeOH가 함유된 디클로로메탄을 용리액으로 사용하는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-2-옥소-3-(6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린-4-일아미노)피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (2.0 g, 약 100 ％)를 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 551.

실시예 4, 단계 3: 디클로로메탄 (8 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-2-옥소-3-(6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린-4-일아미노)피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (1.65 g, 3 mmol)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산 (4 mL)을 충전하였다. 반응물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 메탄올 1 mL와 디클로로메탄 5 mL의 혼합물에 용해시켰다. 생성된 용액을 t-부틸메틸에테르 80 mL에 교반하면서 적가하였다. 형성된 고체를 여과하여 수집하고, 건조시켜, 표제 화합물을 TFA 염 (1.75 g, 86％) 형태로 수득하였다.

실시예 5

N-(( 1R ,2S,5R)-5-( 이소프로필(메틸)아미노 )-2-((3S)-3-((1- 옥시도 -6-( 트리플루오로메틸 )-4- 퀴나졸리닐 )아미노)-2-옥소-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 아세트아미드

실시예 5, 단계 1: tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-2-옥소-3- (6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린-4-일아미노)피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (실시예 4, 단계 2 참조) 샘플을 역상 HPLC로 정제하였다. 생성된 TFA 염을 EtOAc에 용해시키고, 1N NaOH 및 포화 NaCl로 연속해서 세척하였다. 유기 추출물을 건조(Na₂SO₄)시키고, 여과하여, 진공에서 농축하였다. 생성된 유리 염기 (117 mg, 0.21 mmol)를 메틸렌 클로라이드 (4 mL)에 용해시키고, 생성된 용액을 메타-클로로퍼옥시벤조산 (77％ 순도의 시판용 시약 105 mg)으로 충전하였다. 용액은 5분 내에 황색으로 변화하였다. 반응물을 3 시간 동안 교반한 후, 수성 Na₂S₂O₃을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고, 층을 분리하였다. 유기층을 포화 NaHCO₃ 및 염수로 연속해서 세척한 후, 건조 (Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하여, 4-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(tert-부톡시카르보닐아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일아미노)-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드를 황색 고체 형태로 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 567. 이 물질 전체를 메틸렌 클로라이드 (6 mL)에 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (2.5 mL)으로 처리하였다. 생성된 용액을 3 시간 동안 방치한 후, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 메틸렌 클로라이드 (6 mL)에 다시 용해시키고, 트리플루오로아세트산 (2.5 mL)으로 처리하였다. 생성된 용액을 0.5 시간 동안 방치한 후, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 역상 HPLC로 정제하여 동결건조 후 4-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일아미노)-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드의 TFA 염을 황색 분말 (13.6 mg) 형태로 수득하였다. LC/MS 실 측치 [M + H]⁺ = 467.3.

실시예 5, 단계 2: 4-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일아미노)-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (TFA 염, 13.6 mg) 샘플을 1 : 1 아세톤/메탄올 2 mL에 용해시켜, 생성된 용액에 나트륨 시아노보로하이드라이드 (메탄올 중 0.1 M 용액 0.3 mL)를 충전하였다. 1.5 시간 후, LC/MS 분석 결과, 출발 물질이 모두 소모되어 4-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일아미노)-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드로 변환된 것이 확인되었다. MS 실측치 [M + H]⁺ = 509.3. 이 물질을 분리하지 않고 추가로 반응시켰다: 용액에 37％ 수성 포름알데히드 (0.06 mL)를 충전하고 30분간 교반하였다. 이 때, LC/MS 분석결과에 따르면 목적한 4-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일아미노)-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드가 이 단계에서 생성([M + H]+ = 523.3)되었다. 질소 흐름을 공급하여 부피를 감소시켜 얻어진 잔류물을 역상 HPLC로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염을 황색 분말 (1.7 mg) 형태로 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 523.3.

실시예 5, 별법

실시예 5, 별법, 단계 1: 4-클로로-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (3.25 g, 13.97 mmol) 샘플을 N₂ 분위기 하에서 아세토니트릴 (60 mL)에 용해시켰다. 생성된 탁한 용액에 Cs₂CO₃ (6.83 g, 20.96 mmol) 및 페놀 (1.578 g, 16.77 mmol)을 충전하고, 실온에서 교반하였다. 약 65 시간 후, 반응물을 여과하여 고체 성분을 제거하였다. 유기층을 진공에서 농축하여 오렌지색 고체를 수득하였다. 이 물질을 1:3 EtOAc/헥산을 용리액으로 사용하는 자동 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔 80 g)로 정제하여, 목적한 4-페녹시-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린을 결정질 고체 형태로 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 291.1.

실시예 5, 별법, 단계 2: 무수 CH₂Cl₂ (20 mL) 중 4-페녹시-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (1.61 g, 5.55 mmol)의 용액에 3-클로로벤조퍼옥소산 (1.243 g, 5.55 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 이 때, 백색 고체가 침전되기 시작하였다. Me₂S 몇 방울로 반응을 중지시켰다. 혼합물에 헥산 40 mL를 첨가하여 불필요한 물질인 2-히드록시-4-페녹시-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (0.43 g)를 침전시키고, 여과하여 수집하였다. 여액을 농축하여 벤조산 부산물로 오염된, 목적한 물질인 4-페녹시-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (0.93 g)와 약 15 ％의 2-히드록시-4-페녹시-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드를 침전시켰다. 이 물질은 추가로 정제하지 않고 다음 반응에서 사용하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 307.06.

실시예 5, 별법, 단계 3: i-PrOH (2 mL) 중 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)아세트아미드 (50 mg, 0.161 mmol; 실시예 1, 단계 10 참조)와 4-페녹시-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (99 mg, 0.161 mmol)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.056 mL, 0.322 mmol)을 첨가하였다. 용기는 아르곤 조건 하에서 밀봉하고, 마이크로웨이브에서 120 ℃ 로 1 시간 동안 가열하였다. 주요 생성물 피크의 LC/MS 실측치: [M + H]⁺ = 523.3. 혼합물을 농축하고, 자동 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔 40 g, 용리액 8:92 10％ 진한 NH₄OH/MeOH)로 정제하였다. 목적한 생성물을 포함한 부분을 모아서 진공에서 농축하였다. 잔류물을 CH₂Cl₂ 및 헥산으로 결정화하였다. 두 결과물을 합하고, 진공에서 건조시켜, 표제 화합물인 4-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일아미노)-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (93 mg)를 수득하였다. ¹H-NMR 분석 결과 이 물질은 약 0.75 몰 당량의 CH₂Cl₂를 포함하고 있는 것으로 확인되었다.

실시예 6

N-(( 1R ,2S,5R)-5-( 이소프로필아미노 )-2-((3S)-3-((1- 옥시도 -6-( 트리플루오로메틸 )-4- 퀴나졸리닐 )아미노)-2-옥소-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 아세트아미드

실시예 6, 단계 1: 이 표제 생성물을 2단계로 진행된 실시예 5에 처음 기재된 합성의 일부로 합성하였다. 원하는 경우, 표제 화합물을 실시예 5에 따라 더 반응시키지 않고, 이 단계에서 정제할 수 있다.

실시예 6, 별법

실시예 6, 별법, 단계 1: MeOH (10 mL) 중 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (0.090 g, 0.209 mmol; 실시예 1, 단계 8 참조)의 용액에 약 100 mg의 10％ Pd/C (50％, 습식)를 첨가하였다. 혼합물을 H₂ (50 psi) 조건 하에서 14 시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거하고, 용매를 증발시켜 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필아미노)시클로헥실)아세트아미드를 포말 형태의 고체 잔류물 (50 mg, 0.169 mmol)로 수득하였다. 이 물질을 i-PrOH (2 mL)에 용해시키고, 생성된 용액에 4-페녹시-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (103 mg, 0.169 mmol; 실시예 5, 별법, 단계 2 참조)와 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.059 mL, 0.337 mmol)을 충전하였다. 용기를 아르곤 분위기 하에서 밀봉하고, 마이크로웨이브에서 120 ℃로 1 시간 동안 가열하였다. 반응물을 증발시켜 오일 형태의 잔류물을 수득하고, 자동 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 황색의 고체를 수득하였 다. 이 고체를 CH₂Cl₂-헥산으로 재결정화하여 목적한 4-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일아미노)-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (첫번째 생성물 43.5 mg, 두번째 생성물 3.1 mg)를 수득하였다.

실시예 7

N-((1R,2S,5R)-5-( 이소프로필(메틸)아미노 )-2-((S)-2-옥소-3-(6-( 트리플루오로메틸 ) 퀴나졸린 -4- 일아미노 ) 피롤리딘 -1-일) 시클로헥실 ) 포름아미드

실시예 7, 단계 1: 디클로로메탄 (400 mL) 중 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)시클로헥산카르복실산 (38 g, 0.0799 mol; 실시예 1, 단계 4 참조)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산 (100 mL)을 0℃에서 충전하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (100 mL)에 용해시키고, 생성된 용액을 디에틸 에테르 (1500 mL)에 교반하면서 적가하였다. 생성된 고체를 여과하여 수집하고, 디에틸 에테르 (3×50 mL)로 세척하였다. 백색 고체를 진공에 서 건조시켜 (1R,2S,5R)-5-아미노-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥산카르복실산을 TFA 염 (35.5 g, 86％) 형태로 수득하였다. 이 화합물을 추가로 정제하지 않고, 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 376.

실시예 7, 단계 2: 디클로로에탄 (350 mL) 중 (1R,2S,5R)-5-아미노-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥산카르복실산 (TFA 염, 35.5 g, 0.0725 mol)의 교반 용액에 N-메틸모르폴린 (29.3 g, 4.0 당량) 및 아세톤 (42.05 g, 10 당량)을 순차적으로 충전하였다. 혼합물을 실온에서 10분간 교반하고, 0 ℃에서 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 (30.7 g, 2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 14 시간 동안 교반한 후, 포름알데히드 (37 wt％ 용액, 28.4 g, 5 당량)와 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 (18.4 g, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 물 (70 mL)을 첨가하고, 10분 동안 계속 교반하였다. 유기 용매를 제거하기 위해서 감압하에 혼합물을 농축하였다. 포화 NaHCO₃ 용액을 이용하여 생성된 혼합물의 pH를 7 내지 8로 조절한 후, 1 N HCl로 pH 약 6으로 조절하였다. 혼합물을 디클로로메탄 (5×250 mL)으로 추출하였다. 추출물을 합하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (100 mL)에 용해시키고, 생성된 용액을 디에틸 에테르 (1500 mL)에 교반하면서 적가하였다. 형성된 고체를 여과하여 수집하고, 디에틸 에테르 (3×50 mL)로 세척하였다. 백색 고체를 진공에서 건조하여 (1R,2S,5R)-2-((S)-3- (벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥산카르복실산 (31 g, 99％)을 수득하였다. 이 화합물을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 432.

실시예 7, 단계 3: 1,4-디옥산 (200 mL) 중 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥산카르복실산 (15.0 g, 0.0348 mol)의 교반 용액에 N-메틸모르폴린 (5.26 g, 1.5 당량) 및 DPPA (14.3 g, 1.5 당량)을 O ℃에서 충전하였다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 혼합물에 2-(트리메틸실릴)에탄올 (6.16 g, 1.5 당량)을 충전한 후, 질소 보호 하에서 85 ℃에서 2.5 시간 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 감압하에 용매를 제거하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 (250 mL)에 용해시키고, 포화 NaHCO₃ (3×80 mL)와 염수 (3×80 mL)로 세척하였다. 용액을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 얻어진 잔류물을 각각 1％ 및 2.5％의 메탄올이 함유된 디클로로메탄을 용리액으로 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실카르바메이트 (9.3 g, 49％)를 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 547.

실시예 7, 단계 4: 디클로로메탄 (3 mL) 중 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로 필(메틸)아미노)시클로헥실카르바메이트 (272 mg, 0.5 mmol)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산 (2 mL)을 충전하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (50 mL)에 용해시키고, 포화 NaHCO₃ (15 mL)로 세척하였다. 수성층을 디클로로메탄 (4×30 mL)으로 추출하였다. 모든 디클로로메탄 층을 모아서, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여, 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아미노-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (190 mg, 94.5％)를 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 403.

실시예 7, 단계 5: 포름산 460 mg (10 mmol)에 무수아세트산 (204 mg, 2 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 0℃에서 교반하면서, 상기 용액의 1/5을 디클로로메탄 (3 mL) 중 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아미노-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (60 mg, 0.149 mmol) 및 트리에틸아민 (62.3 μl, 3 당량)의 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 물 1 mL를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 혼합물을 디클로로메탄 (60 mL)으로 희석하고 포화 NaHCO₃ (20 mL)로 세척하였다. 용액을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 여과하고, 진공에서 농축하여, 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-포름아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (50 mg, 78％)를 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 431.

실시예 7, 단계 6: 메탄올 (3 mL) 중 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-포름아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (50 mg, 0.116 mmol)의 용액에 10％ Pd/C (50％ 습식 촉매 40 mg)를 첨가하였다. 플라스크를 배기시키고, 수소 풍선을 이용하여 수소를 다시 채웠다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 촉매를 여과하여 제거하였다. 여액을 진공에서 농축하여 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)포름아미드 (35 mg, 100％)를 수득하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 297.

실시예 7, 단계 7: 이소프로판올 (3 mL) 중 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)포름아미드 (34 mg, 0.115 mmol)의 용액에 4-클로로-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (32 mg, 1.2 당량, 문헌 [P. H. Carter et al, PCT application WO 2005/021500] 참조)과 트리에틸아민 (29.1 mg, 2.5 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 정제용 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 TFA 염(76 mg, 91.7％) 형태로 수득하였다.

실시예 8

N-(( 1R ,2S,5R)-5-(디메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-( 트리플루오로메틸 )- 4-퀴 나졸리 닐)아미노)-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 아세트아미드

실시예 8, 단계 1: 디클로로메탄 (216 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (66 g, 0.135 mol; 실시예 1, 단계 6 참조)의 교반 용액에 트리플루오로아세트산 (216 mL)을 충전하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고, 생성된 용액을 진공에서 농축하였다; 이 과정을 한번 더 반복하였다. 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 오일 형태로 수득하였다.

실시예 8, 단계 2: CH₂Cl₂ (20 mL) 중 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트의 TFA 염 (500 mg, 0.99 mmol)의 용액에 포름알데히드 (5 mL, 37 wt％ 용액), 트리에틸아민 (0.35 mL, 2.4 mmol) 및 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 (315 mg, 1.5 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 16 시간 후, 용액을 CH₂Cl₂로 희석하고, 포화 NaHCO₃로 세척하였다. 유기층을 모아서, HCl 수용액 (1N HCl 5 mL 및 물 20 mL)으로 추출하였다. 수성층 을 모아서 NaOH 수용액 (1N NaOH 약 10 mL 및 물 20 mL)으로 염기화한 후, 디클로로메탄 (2×50 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여, 건조(Na₂SO₄)하고, 여과하고, 진공에서 농축하여, 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(디메틸아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 오일 (280 mg, 수율 68％) 형태로 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 417.

실시예 8, 단계 3: 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(디메틸아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (70 mg)와 10％ Pd/C (50％ 습식 촉매 30 mg)의 혼합물에 EtOAc (50 mL)를 첨가한 후, 플라스크를 배기시키고, 수소로 다시 채웠다. 혼합물을 H₂ 1 atm 하에서 16 시간 동안 교반하고, 촉매를 셀라이트 (Celite)로 여과하여 제거하였다. 여액을 진공에서 농축하여 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(디메틸아미노)시클로헥실)아세트아미드를 백색 고체 (40 mg, 수율 85％) 형태로 수득하여, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 283.

실시예 8, 단계 4: 이소프로판올 (6 mL) 중 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(디메틸아미노)시클로헥실)아세트아미드 (40 mg, 0.14 mmol)의 용액에 4-클로로-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (39 mg, 0.17 mmol) 및 트리에틸아민 (0.02 mL, 0.14 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 교반하고, 진공에서 조질의 오일로 농축하고, 반-정제용 역상 HPLC (구배 용리, 물 /메탄올/TFA)로 정제하여 표제 화합물 (70 mg, 수율 71 ％)을 수득하였다.

실시예 9

N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-2- 아세트아미도 -4-( 이소프로필(메틸)아미노 ) 시클로헥실 )-2-옥소-3- 피롤리디닐 )-6- tert -부틸-2- 피리딘카르복스아미드

실시예 9, 단계 1: 6-tert-부틸피콜리노니트릴 (662 mg, 4.1 mmol; 문헌 [P. H. Carter et al., PCT application WO 2005/021500] 참조)을 빙초산 (6.8 mL)에 용해시킨 후, 진한 HCl (1.6 mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 오일 조 (95 ℃)에서 밤새 가열하였다. 냉각시킨 후, 용액을 농축하였다. 생성된 조질의 고체를 부흐너 (Buchner) 깔대기를 이용하여 50/50 Et₂O/헥산으로 이동시켰다. 이 고체를 추가 50/50 Et₂O/헥산으로 세척하여 6-tert-부틸피콜린산, HCl 염 (880 mg)을 수득하였다.

실시예 9, 단계 2: N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)아세트아미드 (70 mg, 0.22 mmol; 실시예 1, 단계 10 참조)를 DMF (2 mL)에 용해시킨 후, 4-메틸모르폴린 (0.1 mL, 0.91 mmol) 및 tert-부틸피콜린산 HCl 염 (90 mg, 0.50 mmol)을 첨가하였다. 0℃로 냉각시킨 후, BOP (175 mg, 0.39 mmol)를 첨가하였다. 용액을 실온으로 데우고, 밤새 교반하였다. 이어서, 용액을 여과하고, 농축하였다. 생성된 잔류물을 역상 HPLC (구배 용리, 물/메탄올/TFA)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (85.1 mg)을 수득하였다.

실시예 10

N-((1R,2S,5R)-5-아미노-2-((3S)-2-옥소-3-((6-( 트리플루오로메틸 )-4- 퀴나졸리닐 )아미노)-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 프로판아미드

실시예 10, 단계 1: MeCN (150 mL) 및 H₂O (205 mL) 중 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)시클로헥산카르복스아미드 (2.0 g, 4.21 mmol; 실시예 1, 단계 5 참조)의 용액에 요오도벤젠 디아세테이트 (1.357 g, 4.21 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1 시간 동안 교반한 후, 녹고 있는 빙조에서 14 시간에 걸쳐 실온으로 데웠다. 혼 합물에 아세트산을 첨가하여 pH 4로 산성화시킨 후, 디에틸 에테르 (2×60 mL)로 추출하였다. 감압하에 수성층을 농축하여 아세토니트릴을 제거하였다. 포화 NaHCO₃를 이용하여 pH를 9 내지 10으로 조절한 후, 잔류 용액을 메틸렌 클로라이드 (2×80 mL)로 추출하였다. 메틸렌 클로라이드층을 건조 (Na₂SO₄)시키고, 진공에서 농축하여 목적한 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아미노-4-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (1.8 g, 4.03 mmol, 수율 96％)를 수득하였다.

실시예 10, 단계 2: DMF (3 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아미노-4-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (1.8 g, 4.03 mmol)의 용액에 프로피온산 (0.285 g, 3.85 mmol), BOP (1.704 g, 3.85 mmol) 및 트리에틸아민 (0.059 mL, 0.423 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 교반한 후, 물 (75 mL)에 부었다. 생성된 혼합물을 EtOAc (2×60 mL)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 포화 NaHCO₃ (2×40 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기상을 건조 (MgSO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 디에틸 에테르에 분산시켰다. 침전된 고체를 여과하여 수집하고, 디에틸 에테르 (2×40 mL)로 세척하고, 진공에서 건조시켜, tert-부틸 (1R,3R,4S)-4-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-3-프로피온아미도-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (1.6 g, 3.18 mmol, 수율 79％)를 수득하였다.

실시예 10, 단계 3: MeOH (10 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-4-((S)-3-(벤질 옥시카르보닐아미노)-3-프로피온아미도-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (900 mg, 1.79 mmol)의 용액에 탄소상 수산화팔라듐 (20％) (340 mg, 2.42 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 비우고, 수소 풍선을 이용하여 수소를 다시 채웠다. 혼합물을 실온에서 1.5 시간 동안 H₂ 1 atm 하에 교반하였다. 여과한 후, 감압하에 농축하여 tert-부틸 (1R,3R,4S)-4-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-3-프로피온아미도시클로헥실카르바메이트 (650 mg, 1.764 mmol, 수율 99％)를 수득하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.

실시예 10, 단계 4: 이소프로판올 (5 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-4-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-3-프로피온아미도시클로헥실카르바메이트 (650 mg, 1.764 mmol)의 용액에 4-클로로-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (492 mg, 2.117 mmol) 및 트리에틸아민 (0.492 mL, 3.53 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 50 ℃에서 4 시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 20％ AcOH 수용액 (30 mL)으로 희석한 후, 디에틸 에테르 (2×20 mL)로 추출하였다. 에테르 층을 20％ AcOH 수용액 (3×30 mL)으로 추출하였다. 수성층을 합하고, Na₂CO₃로 염기화하고, 메틸렌 클로라이드 (3×50 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 염수 (40 mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 감압하에 농축하여 tert-부틸 (1R,3R,4S)-4-((S)-2-옥소-3-(6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린-4-일아미노)피롤리딘-1-일)-3-프로피온아미도시클로헥실카르바메이트를 수득하였다. LC/MS 실측치 [M + H]⁺ = 565. 조질의 생성물 전량을 메틸렌 클로라이드 (5 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 TFA (3 mL)로 충전하고, 실온에서 30분 동안 교반한 후, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 정제용 역상 HPLC로 정제하여 표제 화합물을 메탄올 수용액 중 TFA 염으로 수득하였다. 이 용액을 진공에서 농축하여 메탄올을 제거하고, 잔류 용액을 포화 NaHCO₃로 염기화하고, 메틸렌 클로라이드 (3×50 mL)로 추출하고, 건조(Na₂SO₄)시키고, 진공에서 농축하여 표제 화합물을 유리 염기 (550 mg, 1.184 mmol, 수율 67％) 형태로 수득하였다.

실시예 11

2- tert -부틸-N-((S)-1-((1S,2R,4R)-4-( tert - 부틸아미노 )-2-( 메틸술폰아미도 )시클로헥실)-2- 옥소피롤리딘 -3-일)피리미딘-4- 카르복스아미드

실시예 11, 단계 1: 오븐에서 건조시킨 3-목 둥근-바닥 플라스크를 건조시킨 교반자, 건조시킨 환류 컨덴서 및 2개의 중격과 함께 준비하였다. N₂ 하에 냉각시킨 후, 플라스크에 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘 -1-일)-5-(tert-부톡시카르보닐아미노)시클로헥산카르복실산 (60 g, 126 mmol; 실시예 1, 단계 4 참조), 아세토니트릴 (800 mL), N-메틸모르폴린 (27.7 mL, 252 mmol), 및 디페닐포스포릴 아지드 (29.9 mL, 139 mmol)를 순차적으로 충전하였다. 반응물을 실온에서 1 시간 40분 동안 교반하였고, 이때 2-트리메틸실릴에탄올 (90 mL, 631 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 가열하기 시작하여, 30분 후에 환류 상태에 도달하였다. 1시간 동안 환류시키고, 이때 단계적으로 50℃까지 냉각시킨 후, 외부를 냉각시켜 15℃까지 온도를 낮추었다. 아세트산 (1.734 mL, 30.3 mmol)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응물을 진공에서 농축한 후, EtOAc (1.2 L)에 용해시켰다. 물 (1×0.3 L), 포화 NaHCO₃ (2×0.3 L), 1N HCl (1×0.3 L) 및 염수 (2×0.3 L)로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 건조 (Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 농축 과정에서 고체가 매우 빨리 나타나기 시작했다. 휘발성 물질을 제거한 후, 10％ EtOAc/헥산 (800 mL)을 첨가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 고체를 수집하고, 건조시켜 tert-부틸 (1R,3R,4S)-4-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-3-((2-트리메틸실릴)에톡시카르보닐아미노)시클로헥실카르바메이트 (60.5 g, 102 mmol, 수율 81％)를 수득하였다. HPLC 분석 결과, 이 물질의 순도는 72％이고, 12％에 해당하는 2가지 불순물이 포함되어 있는 것을 확인하였다. 이 물질을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다. 여액을 농축하여 추가로 4.38 g의 생성물을 수득하였다. 총 수율 = 64.9 g (87％).

실시예 11, 단계 2: 건조한 500 mL 용량의 둥근-바닥 플라스크를 교반자와 함께 준비하고, tert-부틸 (1R,3R,4S)-4-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-3-((2-트리메틸실릴)에톡시카르보닐아미노)시클로헥실카르바메이트 (60.5 g), CH₂Cl₂ (180 mL), 그리고 CH₂Cl₂ (120 mL) 및 메탄올 (30 mL) 중 파라-톨루엔술폰산 일수화물 (19.48 g, 102 mmol)의 용액을 순차적으로 충전하였다. 혼합물을 회전 증발기에 걸어, 대부분의 CH₂Cl₂를 제거하였다 (조 온도 약 20 ℃). 혼합물에 거품이 일기 시작할 때, 진공을 제거하고, 조 온도를 46℃로 증가시켰다 (온도는 44 내지 51 ℃ 사이에서 변화하였다; 온도는 조 외부에 얼음을 첨가하여 조절하였다). 혼합물을 정확히 1 시간 동안 이 온도에서 회전시킨 후 (가스 발생이 지속적으로 명백하였다), EtOAc (1 L)로 희석하였다. 유기상을 0.5N NH₄OH (2×250 mL)로 세척하였다. 수성 세척액을 합하여 따로 모아두었다. 유기상을 포화 NH₄Cl (1×250 mL) 및 포화 NaCl (1×250 mL)로 세척하였다; 이 수성 세척액을 제거하였다. 처음에 모아둔 NH₄OH 세척액을 EtOAc (1×250 mL)로 역추출하고, 이 유기 추출물을 포화 NH₄Cl (1×60 mL) 및 포화 NaCl (1×60 mL)로 세척하였다. 모든 유기 추출물을 합하여, 건조 (Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 SiO₂ 플러그 (폭 13 cm×높이 7.5 cm)로 용리시켜 정제하였다. 순수한 EtOAc (약 4 L)이 첫 번째로 용출되었다. 1:9 (MeOH 중 10％ NH₄OH)/CH₂Cl₂ (약 5 L)가 두 번째로 용출되었다. 목적한 생성물을 함유한 부분들을 모두 모으고, 증발시켜서 목적한 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)-5-아미노-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥 소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (31.6 g, 64.4 mmol, 수율 63％)를 수득하였다.

실시예 11, 단계 3: 메탄올 (10 mL) 중 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)- 5-아미노-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (1.03 g, 2.099 mmol)의 용액에 3,5-디-tert-부틸-1,2-벤조퀴논 (0.555 g, 2.52 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 2 시간 동안 교반한 후, THF (6 mL) 및 물 (2 mL)을 옥살산과 함께 첨가하여 pH를 4로 조절하였다. 이 혼합물을 농축하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 염수로 세척하였다. 유기층을 건조 (MgSO₄)시키고, 여과하고, 농축하였다. 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S)-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-옥소시클로헥실카르바메이트 (0.550 g, 1.123 mmol, 수율 53.5％)를 수득하였다.

실시예 11, 단계 4: 메틸렌 클로라이드 (0.4 mL) 중 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S)-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-옥소시클로헥실카르바메이트 (0.550 g, 1.123 mmol)의 용액에 t-부틸아민 (1.180 mL, 11.23 mmol) 및 티타늄(IV) 이소프로프산화물 (6.63 mL, 22.47 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 2 시간 동안 교반한 후, 나트륨 시아노보로하이드라이드 (127 mg, 2.022 mmol) 및 MeOH (1 mL)을 첨가하였다. 2 시간 후, 메틸렌 클로라이드 (50 mL)를 첨가하고, 이어서 1N NaOH를 첨가하였다. 혼합물을 셀라이트 (Celite)로 여과하여, 티타 늄염을 제거하였다. 여액을 건조시키고, 진공에서 농축하여 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부틸아미노)시클로헥실카르바메이트와 이 물질의 5S 부분입체이성질체를 혼합물 (510 mg, 0.933 mmol, 수율 83％)로 수득하였다.

실시예 11, 단계 5: 단계 4에서 얻어진 생성물 (510 mg, 0.933 mmol)을 CH₂Cl₂ (2 mL) 및 트리플루오로아세트산 (2.87 mL, 37.3 mmol)에 용해시켰다. 30분 후, 용액을 농축하여 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아미노-4-(tert-부틸아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트의 비스-TFA 염을 이 물질의 4S 부분입체이성질체와의 혼합물 (520 mg, 0.825 mmol, 수율 88％)로 수득하였다.

실시예 11, 단계 6: 단계 5에서 얻어진 아민의 일부 (362 mg, 0.57 mmol)를 메틸렌 클로라이드 (3 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액에 트리에틸아민 (0.125 mL, 0.900 mmol) 및 메탄술포닐 클로라이드 (0.070 mL, 0.900 mmol)를 순차적으로 충전하였다. 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하고, 포화 NaHCO₃ 용액으로 세척하고, 건조 (Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 메탄올 (3 mL)에 용해시켰다. 반응 용기를 Pd/C (150 mg, 1.410 mmol)로 충전하고, 수소 풍선을 연결했다. 1 시간 후, 용액을 여과하고, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 메탄올 (3 mL)에 다시 용해시키고, 반응 용기를 다시 Pd/C (150 mg, 1.410 mmol)로 충전하고, 수소 풍선을 연결했다. 1 시간 후, 용액을 여과하고, 진공에서 농축하 여 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부틸아미노)시클로헥실)메탄술폰아미드를 이 물질의 5S 부분입체이성질체와의 혼합물 (190 mg, 0.548 mmol, 수율 75％)로 수득하였다.

실시예 11, 단계 7: 단계 7에서 얻어진 아민 생성물 (190 mg, 0.548 mmol)을 메틸렌 클로라이드 (3 mL)에 용해시켰다. 2-tert-부틸피리미딘-4-카르복실산 (196 mg, 1.09 mmol; 문헌 [P. H. Carter et al, PCT application WO 2005/021500] 참조), EDC (210 mg, 1.097 mmol) 및 N-메틸모르폴린 (0.247 mL, 2.193 mmol)을 첨가한 후, HOBt (364 mg, 2.7 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새 교반하였다. 용액을 농축하고, 여과하고, 정제용 역상 HPLC로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염 (123 mg, 0.198 mmol, 36％)을 부분입체이성질체가 없이 수득하였다.

실시예 12

2- tert -부틸-N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-4-( tert - 부틸아미노 )-2-( 프로피오닐아미노 ) 시클로헥실 )-2-옥소-3- 피롤리디닐 )-4- 피리미딘카르복스아미드

실시예 12, 단계 1: 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-벤질옥시카 르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부틸아미노)시클로헥실카르바메이트 및 이 물질의 5S 부분입체이성질체 (68 mg, 0.141 mmol; 실시예 11, 단계 4 참조)를 MeOH (3 mL)에 용해시킨 후, 10％ Pd/C (100 mg, 0.940 mmol)를 첨가하고, 수소 풍선을 연결했다. 1 시간 후, 용액을 여과하고, 진공에서 농축하였다. 이후, 새로운 시약들로 반응을 다시 실시하였다. 1 시간 후, 용액을 여과하고, 농축하여 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부틸아미노)시클로헥실카르바메이트를 이 물질의 5S 부분입체이성질체와의 혼합물 (139.4 mg, 0.338 mmol, 수율 99％)로 수득하였다:

실시예 12, 단계 2: 상기 단계 1에서 얻어진 생성물 (139.4 mg, 0.338 mmol)을 CH₂Cl₂ (3 mL)에 용해시켰다. 이 용액을 2-tert-부틸피리미딘-4-카르복실산 (122 mg, 0.676 mmol), 1H-벤조[d][l,2,3]트리아졸-1-올 (91 mg, 0.676 mmol) 및 4-메틸모르폴린 (0.149 mL, 1.351 mmol)로 순차적으로 충전하였다. 용액을 1-(3-디메틸아미노)프로필)-3-에틸-카르보디이미드 히드로클로라이드 (130 mg, 0.676 mmol)로 충전하였다. 이 혼합물을 밤새 교반하였다. 용액을 농축하고, 여과하고, 정제용 역상 HPLC (Phenomenex 21×250 mm, 0.1％ 트리플루오로아세트산을 포함하는 0％부터 100％ 메탄올 수용액, 30분간, 15 mL/분, 220 nM, 생성물의 RT = 29.9분)로 정제하여 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)-5-(tert-부틸아미노)-2-((S)-3-(2-tert-부틸피리미딘-4-카르복스아미도)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트의 TFA 염 (92 mg, 0.134 mmol, 수율 39.5％)을 수득하였다.

실시예 12, 단계 3: 단계 2에서 얻어진 생성물 (92 mg, 0.134 mmol)을 CH₂Cl₂ (2 mL)에 용해시킨 후, 트리플루오로아세트산 (3.09 mL, 40.1 mmol)을 첨가하였다. 30분 후, 용액을 농축하여 N-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아미노-4-(tert-부틸아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일)-2-tert-부틸피리미딘-4-카르복스아미드의 TFA 염 (87 mg, 0.132 mmol, 수율 99％)을 수득하였다.

실시예 12, 단계 4: N-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아미노-4-(tert-부틸아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일)-2-tert-부틸피리미딘-4-카르복스아미드 (87 mg, 0.132 mmol)의 TFA 염을 CH₂Cl₂ (3 mL)에 용해시킨 후, 트리에틸아민 (0.092 mL, 0.660 mmol)을 첨가하였다. 용액을 0℃까지 냉각시키고, 프로피온산 무수물 (0.051 mL, 0.396 mmol)로 충전하였다. 30분 후, 용액을 농축하고, 여과하고, 정제용 역상 HPLC (Phenomenex 21×100mm, 0.1％ 트리플루오로아세트산을 포함하는 0％부터 100％ 메탄올 수용액, 10분간, 20 mL/분, 220 nM, 생성물의 RT = 8.2 분)로 정제하여 표제 화합물의 TFA 염을 수득하였다. 이 물질을 메틸렌 클로라이드에 용해시켰다. 생성된 용액을 포화 Na₂CO₃로 세척한 후, 건조시키고, 진공에서 농축하여 표제 화합물 (46 mg, 0.095 mmol, 수율 72％)을 수득하였다.

실시예 13

N-(( 1R ,2S,5R)-5-( tert - 부틸아미노 )-2-((3S)-3-((6- tert - 부틸피리미도[5,4-d]피리미딘 -4-일)아미노)-2-옥소-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 메탄술폰아미드

실시예 13, 단계 1: 2-(트리메틸실릴)에틸 (1R,2S,5R)-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부틸아미노)시클로헥실카르바메이트 및 이 물질의 5S 부분입체이성질체 (100 mg, 0.183 mmol; 실시예 11, 단계 4 참조)의 샘플을 디클로로메탄 (2 mL)에 용해시킨 후, 트리플루오로아세트산 (2.54 mL, 32.9 mmol)을 첨가하였다. 30분 후, 용액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (3 mL)에 용해시킨 후, 트리에틸아민 (0.100 mL, 0.720 mmol) 및 메탄술포닐 클로라이드 (0.018 mL, 0.234 mmol)를 첨가하였다. 2 시간 후, 포화 NaHCO₃ 용액으로 세척하고, 유기층을 건조 (Na₂SO₄)시키고, 여과하고, 농축하여 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(메틸술폰아미도)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 이 물질의 4S 부분입체이성질체와의 혼합물 (66 mg, 0.137 mmol, 수율 76％)로 수득하였다.

실시예 13, 단계 2: 상기 단계 1에서 얻어진 생성물 (0.066 g, 0.137 mmol)을 MeOH (4 mL)에 용해시키고, 10％ Pd/C (150 mg, 1.410 mmol)를 첨가하고, 수소 풍선을 연결했다. 1 시간 후, 용액을 여과하고, 진공에서 농축했다. 새로운 시약들로 반응을 다시 실시하였다. 1 시간 후, 용액을 여과하고, 농축하여 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부틸아미노)시클로헥실)메탄술폰아미드를 이 물질의 5S 부분입체이성질체와의 혼합물 (47.5 mg, 0.137 mmol, 수율 100％)로 수득하였다.

실시예 13, 단계 3: 단계 2에서 얻어진 생성물 (47.5 mg, 0.137 mmol)을 2-프로판올 (2 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 트리에틸아민 (0.057 mL, 0.411 mmol) 및 2-tert-부틸-8-클로로피리미도[5,4-d]피리미딘 (45.8 mg, 0.206 mmol; 문헌 [H. Carter et al., PCT application WO 2005/021500] 참조)으로 순차적으로 충전하였다. 2 시간 동안 교반한 후, 용액을 농축하였다. 잔류물을 정제용 역상 HPLC (Phenomenex Luna 5u C18 21.2×100 mm, 0.1％ 트리플루오로아세트산을 포함하는 ％ 메탄올 수용액, 12분에 걸쳐 구배, 20 mL/분, 220 nM, 생성물 체류시간 = 8.2 분)로 정제하여 생성물의 TFA 염을 수득하였다. 디클로로메탄에 용해시키고, 20％ Na₂CO₃ 용액으로 세척하였다. 유기층을 농축하여 표제 화합물 (18 mg, 0.034 mmol, 수율 24.66％)을 수득하였다.

실시예 14

N-(( 1R ,2S,5R)-5-( tert - 부틸아미노 )-2-((3S)-3-((1- 옥시도 -6-( 트리플루오로 메틸 )-4- 퀴나졸리닐 )아미노)-2-옥소-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 아세트아미드

실시예 14, 단계 1: 디클로로메탄 (400 mL) 중 tert-부틸 (1R,3R,4S)-3-아세트아미도-4-((S)-3-(벤질옥시카르보닐아미노)-2-옥소피롤리딘-1-일)시클로헥실카르바메이트 (100 g, 0.205 mol; 실시예 1, 단계 6 참조)의 용액에 TFA (400 mL)를 -20 ℃에서 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 감압하에, 용매 및 대부분의 TFA를 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 (2 L) 및 K₂CO₃ 수용액 (2 L)으로 희석하였다. 1N HCl로 pH를 10으로 조절하였다. 수성층을 디클로로메탄 (3×1L)으로 추출하였다. 합한 유기층을 건조 (Na₂SO₄)시키고, 농축하여 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 오일 (81 g, 수율 100％)로 수득하였다. 이 아민을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 바로 사용하였다.

실시예 14, 단계 2: 메탄올 (160 mL) 중 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-아미노시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (13.3 g, 34 mmol) 및 3,5-디-tert-부틸시클로헥사-3,5-디엔-l,2-디온 (7.54 g, 34 mmol)의 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 용액을 농축하고, 아세톤 (132 mL) 및 물 (33 mL)로 희석한 후, Dowex-50WX8-200 (33 g)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 여과하여 Dowex-50WX8-200을 제거하고, 디클로로메탄 (300 mL)으로 세척하였다. 여액을 진공에서 농축하여 대부분의 아세톤을 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (200 mL)로 희석하고, NaHCO₃ 수용액 (200 mL)과 염수 (200 mL)로 세척하였다. 합한 수성층을 디클로로메탄 (2×100 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 건조(Na₂SO₄)시키고, 농축하였다. 생성물인 벤질 (S)-1-((1S,2R)-2-아세트아미도-4-옥소시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 EtOAc (100 mL) 및 헥산 (200 mL)에서 결정화하여 고체 (12 g, 수율 90％)로 수득하였다 .

실시예 14, 단계 3: 0℃에서 디클로로메탄 (30 mL) 중 TiCl₄ (디클로로메탄 중 1M, 36 mL, 36 mmol)의 용액에 Ti(OiPr)₄ (10.8 mL, 36 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 디클로로메탄 (600 mL) 중 벤질 (S)-1-((1S,2R)-2-아세트아미도-4-옥소시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (23.25 g, 60 mmol)의 용액에 tert-부틸아민 (30 mL, 300 mmol)을 실온에서 첨가한 후, -50 ℃에서 TiCl₄/Ti(OiPr)₄ 용액을 첨가하였다. 실온으로 천천히 데워지도록 반응물을 방치하였다. 2 시간 후, 반응을 종결하였다 (메탄올 중 NaBH₄로 HPLC 샘 플을 완결시켜 반응을 HPLC로 모니터하였다). 용액을 10℃로 냉각시키고, BH₃·SMe₂ (디클로로메탄 중 1M, 66 mL, 66 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반한 후, Na₂CO₃ 수용액 (300 mL)으로 반응을 중지시켰다. 침전물을 여과하여 제거하였다. 2개의 층을 분리하고, 수성층을 디클로로메탄 (600 mL)으로 추출하였다. 합한 디클로로메탄 층을 1N HCl로 2회 (150 mL 및 15 mL) 추출하였다. (생성물 및 불필요한 트랜스 이성질체 모두 산성의 수성층에 존재하였다.) 합한 산성의 수성층을 12 M NH₄OH 수용액 (12 mL)으로 중화하여 pH를 약 8로 조절하고, 디클로로메탄으로 2회 (600 mL, 450 mL) 추출하였다. (생성물은 유기층에, 트랜스 이성질체는 여전히 수성층에 존재하였다.) 유기층에 트랜스 이성질체가 남아있지 않을 때까지, 합한 유기층을 NH₄Cl 수용액으로 3회 (3×200 mL) 세척하였다. 유기층을 건조 (Na₂SO₄)시키고, 농축하였다. 잔류물을 EtOAc/헥산 (200 mL/800 mL)에서 결정화하여 목적한 벤질 (S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(tert-부틸아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (20.80 g, 수율 78％)을 순도 99.5％의 백색 고체로 수득하였다.

실시예 14, 단계 4: 메탄올 (400 mL) 중 벤질 (S)-1-((lS,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(tert-부틸아미노)시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (43.3 g, 98 mmol)의 용액에 10％ 습식 Pd/C (4.34 g)를 첨가하였다. 혼합물을 제거하고, 수소 풍선을 이용하여 수소를 다시 채웠다. 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 메탄올 (500 mL)로 세척하고, 진공 하에 농축 건조시켰다. 수득한 조질의 생성물을 갑압하에 IPA (2×100 mL)로 증류하여 생성물인 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부틸아미노)시클로헥실)아세트아미드를 오일 (30 g, 수율 98％)로 수득하였다. 이 아민을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.

실시예 14, 단계 5: i-PrOH (2 mL) 중 N-((1R,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-(tert-부틸아미노)시클로헥실)아세트아미드 (50 mg, 0.161 mmol, 상기 기술한 대로 제조함) 및 4-페녹시-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (99 mg, 0.161 mmol; 실시예 5, 별법, 단계 2 참조)의 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.056 mL, 0.322 mmol)을 첨가하였다. 반응 용기를 아르곤 분위기 하에 밀폐하고, 120 ℃에서 마이크로웨이브에서 1 시간 동안 가열하였다. 주 생성물 피크의 LC/MS 실측치: [M + H]⁺ = 523.3. 별도의 반응 용기에서 동일한 스케일로 반응을 반복하였다. 두 반응물을 합하고 증발시켜 오일 잔류물을 수득하고, 용리액으로 8:92 (MeOH 중 10％ 진한 NH₄OH)을 이용하는 자동 플래쉬 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔)로 정제하였다. 목적한 생성물을 포함한 부분들을 모아서, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 CH₂Cl₂ 및 헥산에서 결정화하였다. 두 생성물을 합하고, 진공에서 건조시켜 4-((S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(tert-부틸아미노) 시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일아미노)-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 1-옥사이드 (101 mg)를 수득하였다. ¹H-NMR 분석 결과, 이 물질이 약 0.6 몰 당량의 CH₂Cl₂를 포함하고 있는 것으로 확인되었다.

실시예 15

N-(((1S,2S,5R)-5- 메톡시 -2-((3S)-2-옥소-3-((6-( 트리플루오로메틸 )-4- 퀴나졸리닐 )아미노)-1- 피롤리디닐 ) 시클로헥실 ) 메틸 ) 아세트아미드

실시예 15, 단계 1: 벤질 (1R,2S,5R)-7-옥소-6-옥사비시클로[3.2.1]옥탄-2-일카르바메이트 (9 g, 32.7 mmol; 문헌 [P. H. Carter et al., PCT application WO 2005/021500] 참조)의 샘플을 실온에서 THF (50 mL) 및 물 (16.67 mL)에 용해시킨 후, 나트륨 보로하이드라이드 (1.237 g, 32.7 mmol)를 중지시켰다. 반응 혼합물을 22 시간 동안 교반하였다. 포화 NaHCO₃ 용액으로 반응을 완결하였다. 반응 혼합물을 1 :9 MeOH-CH₂Cl₂ 혼합물 (5X)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시켰다. 의도한 생성물인, 벤질 (1S,2R,4R)-4-히드록시-2-(히드 록시메틸) 시클로헥실 카르바메이트 (8.75 g, 31.3 mmol, 수율 96％)를 포말 형태의 백색 고체로 수득하였다.

실시예 15, 단계 2: 벤질 (1S,2R,4R)-4-히드록시-2-(히드록시메틸)시클로헥실카르바메이트 (20.5 g, 73.4 mmol)의 샘플을 실온에서 무수 피리딘 (140 mL)에 용해시킨 후, 트리틸 클로라이드 (20.46 g, 73.4 mmol)를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2일 동안 교반하였다. 피리딘을 증발시키고, 잔류물을 EtOAc에 용해시켰다. 용액을 물 (2X)로 세척한 후, 염수로 세척하였다. 수성층을 합하여 EtOAc로 재추출하였다. 이 유기층을 염수로 세척하였다. 합한 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 증발시켜 오일 잔류물을 수득하고, 이 오일 잔류물로부터 EtOAc 및 헥산에서 백색 결정질 생성물을 수득하였다. 모 액체를 크로마토그래피 (20％, 40％ 그리고 70％의 EtOAc/헥산을 순차적으로 용리액으로 사용하는 400 g 실리카 겔)로 분석하였다. 목적한 위치이성질체인 벤질 (1S,2R,4R)-4-히드록시-2-(트리틸옥시메틸)시클로헥실카르바메이트 (33.08 g, 63.4 mmol, 수율 86％)를 백색 고체로 수득하였다.

또한, 소량의 불필요한 이성질체인 벤질 (1S,2R,4R)-2-(히드록시메틸)-4-(트리틸옥시)시클로헥실 카르바메이트 (1.17 g, 2.243 mmol, 수율 3.06％)를 수득하였다.

실시예 15, 단계 3: 벤질 (1S,2R,4R)-4-히드록시-2-(트리틸옥시메틸)시클로헥실카르바메이트 (11.5 g, 21.47 mmol)의 샘플을 실온에서 N₂ 하에 CH₂Cl₂ (100 mL)에 용해시킨 후, 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌 (11.50 g, 53.7 mmol), 분자체 (분말 4Å, 5g) 및 트리메틸옥소늄 테트라플루오로보레이트 (6.35 g, 42.9 mmol, 세 부분으로 나누어서)를 순서대로 첨가하였다. 반응 혼합물을 48 시간 동안 교반하였다. 출발 물질이 여전히 남아있었다. 트리메틸옥소늄 테트라플루오로보레이트 (1.5 g) 및 분자체 (1 g)을 추가로 첨가하고, 반응 혼합물을 5 시간 동안 교반하였다. CH₂Cl₂ 200 mL로 희석하고, 셀라이트 (Celite)로 여과하였다. 여액을 0.5N HCl (50 mL로 3X)로 세척하고, 포화 Na₂CO₃로 세척한 후, 무수 MgSO₄로 건조시켰다. 이후, 용액을 증발시키고, 진공에서 건조시켜 옅은 황색의 포말을 수득하였다. 황색 포말을 AcOH:물 (7:3) 100 mL에 넣고, 60℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 생성된 핑크색의 용액을 농축하고, 1N NaOH으로 염기화시켰다. 혼합물을 EtOAc (5X, 각 150 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 농축하고, 크로마토그래피 (7:3 EtOAc:헥산, 그리고 EtOAc를 순서대로 용리액으로 사용하는 300 g 실리카 겔)로 분석하였다. 목적한 벤 질(1S,2R,4R)-2-(히드록시메틸)-4-메톡시시클로헥실 카르바메이트 (6.1 g, 20.79 mmol, 97％)를 오일로 수득하였다.

실시예 15, 단계 4: 트리페닐포스핀 (7.39 g, 28.2 mmol)의 샘플을 0℃에서 THF (60 mL)에 용해시킨 후, 디에틸아조디카르복실레이트 (4.46 mL, 28.2 mmol)를 적가하였다. 0℃에서 30분간 교반을 계속하였고, 이때 THF (40 mL) 중 벤질(1S,2R,4R)-2-(히드록시메틸)-4-메톡시시클로헥실 카르바메이트 (4.13 g, 14.08 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 30분간교반하고, 이때 아지드화수소 용액(14.08 mL, 28.2 mmol) (벤젠 중 2M 용액으로)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 90분간 교반하였다. MeOH로 반응을 중지시키고, 밤새 실온에서 교반하였다. 붉은빛이 도는 황색 용액을 농축하고, 크로마토그래피로 분석하였다. 벤질 (1S,2S,4R)-2-(아지도메틸)-4-메톡시시클로헥실카르바메이트 (4.19 g, 13.16 mmol, 수율 93％)를 점성이 높은 오일로 수득하였다.

실시예 15, 단계 5: 벤질 (1S,2S,4R)-2-(아지도메틸)-4-메톡시시클로헥실카르바메이트 (4.7 g, 14.76 mmol)를 실온에서 THF에 용해시킨 후, 물 (0.293 mL, 16.24 mmol) 및 트리페닐포스핀 (4.26 g, 16.24 mmol)을 추가하였다. 반응물을 60℃에서 4 시간 동안 교반하였다. 반응물을 냉각시키고, 포화 Na₂CO₃ 수용액 (3.13 g, 29.5 mmol)으로 처리한 후, 디-t-부틸디카보네이트 (3.77 mL, 16.24 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물은 EtOAc와 물 로 구획되었다. 유기층을 염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시켰다. 용액을 농축하고 크로마토그래피 (30％ EtOAc/헥산을 용리액으로 사용하는 500 mL 실리카 겔)로 분석하였다. 목적한 tert-부틸 ((1S,2S,5R)-2-벤질옥시카르보닐아미노-5-메톡시시클로헥실)메틸카르바메이트를 점성 오일로 수득하였다.

실시예 15, 단계 6: 단계 5에서 얻어진 생성물의 샘플을 MeOH (100 mL)에 용해시켰다. 탄소상 팔라듐 (0.185 g, 1.743 mmol)을 그 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 50 psi 수소 하에 2 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc와 셀라이트 (Celite)로 여과하였다. 생성된 용액을 진공에서 농축하여 tert-부틸 ((1S,2S,5R)-2-아미노-5-메톡시시클로헥실)메틸카르바메이트를 무색 오일로 수득하고, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 정량적 수율을 예상하였다.

실시예 15, 단계 7: tert-부틸 ((1S,2S,5R)-2-아미노-5-메톡시시클로헥실)메틸카르바메이트 (2.53 g, 9.79 mmol)를 실온에서 CH₂Cl₂ (50 mL)에 용해시켰다. 그 용액을 1-히드록시벤조트리아졸 (1.456 g, 10.77 mmol), N-카르보벤질옥시-L-메티오닌 (4.16 g, 14.69 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (2.440 g, 12.73 mmol)로 순차적으로 충전하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. EtOAc로 희석하고, 포화 Na₂CO₃로 세척한 후, 염수로 세척하였다. 용액을 건조 (MgSO₄)시키고, 여과하고, 진공에서 농축하여 tert-부틸 ((1S,2S,5R)-2-((S)-2-벤질옥시카르보닐아미노-4-(메틸티오)부탄아미도)-5-메톡시시클로헥실)메틸카르바메이트를 무색의 끈적거리는 고체로 수득하였다.

실시예 15, 단계 8: 단계 7에서 얻어진 생성물의 샘플을 요오도메탄 (30 mL)에 용해시키고, 실온에서 2일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발시키고, 진공에서 건조시켰다. 잔류물을 CH₂Cl₂에 용해시키고, 증발시켰다. 이 과정을 4번 더 반복하였다. 생성된 잔류물을 진공에서 건조시켜 황색의 포말 형태의 고체를 수득하고, 이 고체를 DMF (20 mL)에 넣고 Cs₂CO₃ (6.36 g, 19.52 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. EtOAc로 희석하고, 물 (2X)로 세척하였다. 합한 수성층을 EtOAc (2X)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 MgSO₄로 건조시켰다. 용액을 농축하고, 크로마토그래피로 분석하여 tert-부틸 ((1S,2S,5R)-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-메톡시시클로헥실)메틸카르바메이트를 백색의 포말 형태의 고체로 수득하였다.

실시예 15, 단계 9: tert-부틸 ((1S,2S,5R)-2-((S)-3-벤질옥시카르보닐아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-메톡시시클로헥실)메틸카르바메이트 (0.75 g, 1.577 mmol)의 샘플을 실온에서 CH₂Cl₂ (15 mL)에 용해시켰다. 용액을 트리플루오로아세트산 (1.215 mL, 15.77 mmol)으로 충전하고, 6 시간 동안 교반하였다. 증발시키 고, 진공에서 건조시켰다. 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 포화 Na₂CO₃로 세척한 후, 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 농축하고, 진공에서 건조시켜 옅은 황색의 포말을 수득하였다. 이 물질을 실온에서 CH₂Cl₂ (10 mL)에 용해시켰다. 이 용액을 트리에틸아민 (0.659 mL, 4.73 mmol), 디메틸아미노피리딘 (0.019 g, 0.158 mmol) 및 무수 아세트산 (0.164 mL, 1.734 mmol)으로 순차적으로 충전하였다. 반응 혼합물을 90분 동안 교반한 후, 포화 NaHCO₃로 반응을 중지시켰다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂ (3X)로 추출하였다. 유기층을 합하고, 무수 MgSO₄로 건조시키고, 농축하고, 크로마토그래피로 분석하였다. 목적한 생성물인, 벤질 (S)-1-((1S,2S,4R)-2-(아세트아미도메틸)-4-메톡시시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트를 백색 고체로 수득하였다.

실시예 15, 단계 10: 벤질 (S)-1-((1S,2S,4R)-2-(아세트아미도메틸)-4-메톡시시클로헥실)-2-옥소피롤리딘-3-일카르바메이트 (614 mg, 1.471 mmol) 및 Pd/C (62.6 mg, 0.294 mmol)의 샘플을 실온에서 50 psi 수소 분위기 하에 2 시간 동안 MeOH (30 mL) 중 교반하였다. 현탁액을 EtOAc와 셀라이트 (Celite)로 여과하고, 농축하고, 진공에서 건조시켜 N-(((1S,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1-일)-5-메톡시시클로헥실)메틸)아세트아미드 (410 mg, 1.447 mmol, 수율 98％)를 백색 고체로 수득하였다.

실시예 15, 단계 11: N-(((1S,2S,5R)-2-((S)-3-아미노-2-옥소피롤리딘-1- 일)-5-메톡시시클로헥실)메틸)아세트아미드 (220 mg, 0.776 mmol)를 실온에서 2-프로판올 (10 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 트리에틸아민 (0.433 mL, 3.11 mmol)을 첨가하고, 이어서 4-클로로-6-(트리플루오로메틸)퀴나졸린 (235 mg, 1.009 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 농축하고 크로마토그래피 (CH₂Cl₂ 중 5％ MeOH, 그리고 이어서 10％ MeOH을 용리액으로 사용하는 120 g 실리카 겔)로 분석하여 표제 화합물 (300 mg, 0.626 mmol, 수율 81％)을 백색 고체로 수득하였다.

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약리학상 특징 비교

본 발명의 화합물 및 WO2005021500 (미국 특허 제7,163,937호에 대응됨, 본 출원인에게 양도됨)에서 찾아볼 수 있는 화합물의 약리학상 특징을 비교하는 분석 및 데이타를 아래에 기재하였다.

인간 말초혈 단핵 세포 결합 (" CCR2 결합")

문헌 [Yoshimura et al., J. Immunol. 1990, 145, 292]을 참조한다. 인간 CCR2 결합 분석은 트레이서 리간드로 ¹²⁵I-인간 MCP-1을 사용하여 인간 말초혈 단핵 세포 (hPBMC)로 확립하였다. hPBMC를 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) (메디아텍 셀그로(Mediatech Cellgro))를 사용하는 표준 프로토콜을 이용하여 인간 류코팩(leukopak) (바이올로지 스페셜티 인크.(Biological Specialty Inc.))으로부터 단리하였다. 단리된 hPBMC를 세척하고, 결합 완충액 (RPMI-1640, 0.1％ BSA, 20 mM Hepes, pH 7.4)에서 1×10⁷ 개/ml로 희석하였다. ¹²⁵I-MCP-1 (NEN/퍼크 엘머(Perk Elmer))을 결합 완충액에서 0.45 nM로 희석하였다. 화합물을 결합 분석에 사용된 최종 농도의 3배로 결합 완충액으로 희석하였다. 결합 분석을 96-웰 여과 플레이트 (밀리포어(Millipore))를 사용하여 수행하였다. 전체 ¹²⁵I-MCP-1 결합을 다음과 같이 평가하였다: 총 부피 150 ㎕의 반응물에 각각 5×10⁵개 세포, 0.15 nM ¹²⁵I-MCP-1, 및 화합물 (최종 농도 0 내지 100 nM)을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한 후에, 진공 다기관 여과 (밀리포어)를 이용하여 RPMI-1640, 0.1％ BSA, 0.4 M NaCl, 20 mM Hepes, pH 7.4로 3회 세척하였다. 세척 이후에, 플레이트를 실온에서 60 분 동안 공기-건조시켰다. 이어서 각각의 웰에 마이크로신트 20(Microscint 20) 25 ㎕를 첨가하였다. 플레이트를 봉하고, 1 분 동안 트릴럭스(Trilux) 상에서 계수하였다. 300 nM 냉각 MCP-1 (페프로텍 인크.(PeproTech Inc.))의 존재하에 비-특이적 결합을 결정하였다. 특이적 ¹²⁵I-MCP-1을 전체 결합과 비-특이적 결합 사이의 차이로 산출하였다. 모든 조건은 2회 시험하였다. IC50은 특이적 결합을 50％ 감소시키는데 필요한 경쟁 화합물의 농도로 정의하였다.

hERG 유동

hERG 채널을 안정하게 발현시키는 HEK293 세포를, 인큐베이터에서 10％ 시그마(Sigma) 태아 소 혈청, 비-필수 아미노산, 2 mM L-글루타민 및 500 ㎍/ml G418이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 중에서 성장시켰다 (37 ℃, 5％ CO₂). 세포 해리 완충액을 사용하여 플라스크로부터 세포를 추출한 후에, 384-웰 코닝(Corning) 폴리-D-리신 코팅된 흑색/투명 플레이트에 10％ 혈청 배지 중 2×10⁴개 세포/웰 (20 ㎕)의 밀도로 플레이팅하고, 세포의 전면성장 단일층이 생성될 때까지 5％ CO₂ 인큐베이터에서 15 내지 24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다.

BTC-AM 염료의 2 mM 저장액 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 미국 오리곤주 유진 소재)을 100％ DMSO로 제조한 후에, 분석 당일에 DMSO 중 10％(w/v) 플루론산에 1:1로 첨가하였다. 이어서, 염료를 hERG 외부 EP 완충액 (140 mM NaCl, 4.0 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1.0 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.3 및 10 mM 글루코스; 모든 완충액 성분은 시그마 케미칼(Sigma Chemical)로부터 입수함)으로 희석하였다. 이 BTC 염료 혼합물 (30 ㎕)을 세포에 첨가하여 2.5 μM의 최종 부가 농도를 제공하였다. 세포를 21 ℃에서 45 분 동안 인큐베이션하였다.

시험 화합물을 60 ㎕에서 10 mM DMSO로 희석하였다. 이어서, 이들 화합물은 384-웰 플레이트의 컬럼 1-10 및 11-20에서 DMSO로 1:2 비로 연속적으로 희석하였다. 분석-예비용 플레이트는, 벨로시티 11 바이오셀(Velocity 11 BioCel) 상에서 제조된 DMSO 연속 희석 플레이트로부터의 2.5 ㎕ 스탬핑(stamping)에 의해 제작하였다. EP 완충액 48 ㎕를 첨가한 후에 희석하여 수성 플레이트를 만들고, 이로부터 30 내지 45 분 후에 FLIPR에서 분석물을 판독하였다. 염료 부가 후에, 수성-희석된 화합물을 3개의 복제 플레이트의 세포 (10 ㎕)에 80 μM 내지 0.156 nM의 10-지점 농도 범위가 생성되도록 첨가하였다. 분석에서 최종 DMSO 농도는 1％이다. 분석-예비용 수성 플레이트를 제조하고, 사이바이오(Cybio) 액체 취급기에서 희석하였다.

염료와 함께 부가된 세포를 아르곤 레이져의 488 nm 선을 사용하여 염료를 여기시키는 FLIPR384 (몰레큘라 디아비시즈(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)에서 판독하였다. 540±30 nm 대역 필터를 사용하여 방출물을 여과하였다. 66 mM K₂SO₄ 및 1.3 mM Tl₂SO₄ (시그마/알드리치(Aldrich))를 함유하는 EP 완충액 20 ㎕/웰을 첨가하여 hERG 채널이 개방되도록 자극하였다. 각 플레이트에서, 데이타를 12초 동안 매 초마다 수집하였으며, 이 때 Tl⁺-함유 자극 완충액을 첨가하였다. 데이타 수집은 48초 동안 2초 마다 진행하였으며, 이후에는 추가 2 분 동안 3초 마다 계속하였다.

분석의 역학적 범위는 블랭크(blank) 웰 및 토탈(total) 웰로부터 결정하였다. 토탈 웰 (컬럼 21 및 22)은 플레이트에서 최대 hERG 활성화를 나타낸 웰이고 (시험 화합물이 존재하지 않음), 블랭크 웰 (컬럼 23 및 24)은 100％ hERG 억제를 나타낸 웰이다. 블랭크 웰은 400 nM의 표준 hERG 억제제 도페틸리드 (Ficker et al., 1998) 또는 E-4031을 함유하였다. 각각의 샘플 웰에서 본래 데이타 지점은 우선 세포/신호 변화, 음성 대조군 (블랭크) 백그라운드에 대해 수집하고, 온라인 FLIPR 소프트웨어를 사용하여 양성 대조군 (토탈)에 대해 표준화시켰다. 이어서, hERG Tl⁺ 유동 데이타에 대한 시험 화합물 농도 반응 곡선을 엑셀 피트(Excel Fit) (ID 비지니스 솔루션스 리미티드(ID Business Solutions Limited), 영국 서리 소재)를 사용하여 단일-부위 로그 방정식, Y= A + ((B-A)/1 + ((C/X)^∧D))) (여기서, A = 최대 억제)으로 고정시켰다. 데이타를 화합물의 주어진 조건에서 Tl⁺ 흐름에 대한 형광 변화의 최대 크기를 고정시켜 분석하였다. 화합물의 효력 (IC₅₀ 값)을 3중 웰의 평균으로부터 산출하였다.

나트륨 채널, 부위 2 결합 분석

문헌 [W. A. Catterall, et al., J. Biol. Chem. 1981, 256, 8922]을 참조한다. 표준 결합 완충액은 50 mM HEPES, 50 mM Tirs-HCl, pH 7.4, 130 mM 콜린 클로라이드, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl₂, 5.5 mM 글루코스, 40 ㎍/mL LqT를 함유하였다. 표준 결합 완충액 중 5 nM [³H]-바트라코톡신 및 원하는 농도의 시험될 화합물을 함유하는 반응 혼합물에 시냅토좀 (비스타(Wistar) 래트 뇌로부터 제조됨)을 첨가하여 결합 반응을 개시하였다. 이어서, 샘플을 혼합하고, 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 50 mM HEPES, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1.8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂ 및 1 mg/mL 소 혈청 알부민을 함유하는 빙냉 세척 완충액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 시냅토좀을 즉시 유리 섬유 필터로 수집하고, 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 필터에 남아있는 [³H]-바트라코톡신의 방사능을 액체 섬광 분광계를 이용하여 계수하였다.

병행 인공막 투과성 분석 ( PAMPA )

병행 인공막 투과성 분석 (PAMPA)은 위장관 (GIT) 지질로 지칭되는 특수 제제화된 레시틴-기재의 지질 조합으로 이루어진다. GIT 지질을 사용하여 Caco-2 분석에 사용된 것과 유사한 샌드위치 플레이트 조립체에 막을 형성하였다. GIT 지질은 인간에서 수동적으로 흡수되는 것으로 알려진 표준 화합물에 의해 측정된 바와 같이 생체내 막 조성 및 성능과 매우 유사하였다. PAMPA는 화합물 발견을 위한 투과성 스크리닝에 이용되는 시험관내 모델로 널리 사용된다. PAMPA 막을 통한 화합물의 통과 속도를 이용하여 투과 계수 (Pc)를 결정하였으며, 이는 화합물의 생체내 수동적 투과성과 관련이 있을 수 있다.

특정 화합물의 투과 계수 (Pc)를 첨부-측부 및 기저-측부 (pH 7.4)의 pH-의존성 설정에서 조사하였다. 모든 실험은 3회 결정으로 수행하였다.

화합물 (100％ DMSO 중 10 mM 저장액)을 pH 7.4 공여자 웰 완충액 (pION CAT #110151)에서 1:100으로 희석하여 1％ DMSO 중 100 μM 분석 용액을 제공하였다. 공여자 웰 완충액으로 희석한 화합물을 와트만 유니필터(Whatman Unifilter) 플레이트로 옮기고, 여과한 후에 분석 플레이트 (pION CAT #110163)의 공여자 웰에 200 ㎕ 분배하였다. 지질 용액 (pION CAT #110169) 4 ㎕를 여과 플레이트 (VWR CAT #13503)에 피펫팅하여 PAMPA을 형성하였다. 이어서, 막을 수용자 웰 완충액 (pH 7.4) (pION CAT #110139) 200 ㎕로 덮었다. PAMPA 분석 플레이트 (공여자 측면 및 수용자 측면)를 합하고, 실온에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 분리하고, 분광 광도 플레이트 (VWR CAT #655801)를 채웠다 (150 ㎕/웰). 공여자, 수용자, 참조 및 블랭크 플레이트를 스펙트라맥스(SpectraMax) UV 플레이트 판독기에서 판독하였다. 스펙트럼을 분석하여 Pc 값을 생성하는 pION 소프트웨어로 데이타를 획득하였다.

CCR2 화학주성

인간 CCR2 화학주성 분석을 인간 단핵구 세포주 THP-1로 수행하였다. THP-1 세포을 우선 페놀 레드-무함유, BSA-무함유 RPMI-1640 (pH 7.4) 중에서 15 분 마다 부드럽게 혼합하면서 37 ℃에서 30 분 동안 형광 염료 칼세인(Calcein)-AM으로 표지하였다. 이어서, 표지된 세포를 세척하고, 화학주성 완충액 (페놀 레드-무함유 RPMI-1640, 0.1％ BSA, pH 7.4)에서 1×10⁵/ml로 다시 현탁히였다. 시험 화합물을 화학주성 완충액으로 최종 분석 농도가 0.01 nM 내지 1 μM이 되도록 희석하였다. 리간드 MCP-1 (페프로텍 인크.)을 화학주성 완충액으로 20 nM으로 희석하였다. 분석을 수행하기 위해, 동일한 부피의 시험 화합물 희석액을 동일한 부피의 표지된 THP-1 세포와 혼합하고 (혼합물 1), 동일한 부피의 시험 화합물 희석액을 동일한 부피의 희석된 MCP-1 리간드와 혼합하였다 (혼합물 2). 혼합물을 둘 모두 독립적 으로 37 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후에 부드럽게 혼합하였다. 이어서, 50 ㎕의 혼합물 1을 상부 챔버에 넣고, 225 ㎕의 혼합물 2를 하부 챔버에 넣은 화학주성 플레이트 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))에서 MCP-1-유도된 화학주성을 측정하였다. 플레이트의 뚜껑을 덮고, 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 30 분 후에, 플레이트를 사이토플루오르(Cytofluor) 상에서 판독하였다. 모든 조건은 2회 시험하였다. 소리 측정을 위한 신호의 경우, 표지된 THP-1 세포 단독 (5×10⁴개/웰) 50 ㎕를 상부 챔버에 넣고, 리간드 MCP-1 단독 225 ㎕를 하부 챔버에 넣었다 (최종 농도 10 nM). 등급별 농도의 시험 화합물에 의해 달성된 억제를 화합물-무함유 MCP-1 대조군의 백분율로 산출하였다. IC50은 세포 화학주성의 50％ 억제에 도달하는데 필요한 시험 화합물의 농도로 정의하였다.

hERG 패치 클램프

전세포 패치-클램프를 사용하여 클로닝된 hERG 칼륨 채널 α 서브유닛을 안정하게 발현시키는 HEK-293 세포에서 hERG 전류를 직접 측정하였다. 화합물을 수성 완충액 (pH 7.4) 중에서 실온에서 시험하였다. 반복적인 시험 펄스 (0.05 Hz)를 2초 동안 -80 mV 내지 +20 mV의 유지 전위로부터 인가하고, 꼬리 전류를 -65 mV로의 전압 단계화에 의해 시험 펄스에 따라 유도하였다. 화합물로부터의 효과를 최대 고리 전류의 억제를 측정하여 산출하였다.

나트륨 채널 패치 클램프

전세포 패치 클램프를 사용하여 인간 심장 나트륨 채널, SCN5A를 발현시키는 HEK-293 세포에서 내부 나트륨 전류를 직접 측정하였다. 화합물을 단백질-무함유 수성 완충액으로 시험하였다. 정상 상태의 억제를 측정하기 위해, 나트륨 전류를 다음과 같은 전압 프로토콜을 이용하여 5초 마다 유도하였다: 세포를 -90 mV의 전위에서 유지하고, 60 ms 동안 -20 mV로 단계적 상승시켰다. -20 mV로의 시험 펄스 도중에 최대 전류의 억제를 측정하여 효과를 산출하였다. 상기 억제의 속도-의존도는 1 Hz 및 4 Hz의 주파수의 자극에 의해 평가하였다.

래트에서의 단일-투여량 약동학

수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트 (250 내지 300 g)를 약동학 연구에 사용하였다. 래트는 밤새 공복을 유지시킨 후에 PO 투여하고, 투여 4 시간 후에 먹이를 공급하였다. 혈액 샘플 (약 0.3 mL)을 경정맥으로부터 K₂EDTA-함유 튜브에 수집한 후에, 4 ℃ (1500 내지 2000 xg)에서 원심분리하여 혈장을 수득하였다. 경구 생체이용가능성 연구에서, 2 군의 동물 (N = 2 내지 3/군)에게 시험 화합물을 경정맥을 통한 정맥내 (IV) 주입 (10 분 동안)으로 또는 경구 위관영양법으로 투여하였다. 일련의 혈액 샘플을 투여한지 0.17 (오직 IV 이용), 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 수득하였다. 4 ℃ (1500 내지 2000 xg)에서 원심분리하여 수득한 혈장 샘플을 LC/MS/MS로 분석할 때까지 -20 ℃에 보관하였다.

원숭이에서의 단일-투여량 약동학

다양한 시험 화합물의 약동학을 교차-고안된 수컷 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 원숭이는 밤새 공복을 유지시킨 후에 PO 투여하고, 투여 4 시간 후에 먹이를 공급하였다. 한 군의 1 내지 3 마리의 동물 (3 내지 5 kg)에게 화합물을 대퇴부 정맥을 통한 정맥내 (IV) 주입 (10 분 동안)으로 또는 경구 위관영양법으로 투여하였으며, 처치 사이에 1 주일간 세척하였다. 일련의 혈액 샘플 (약 0.3 mL)을 투여한지 0.17 (오직 IV), 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후에 대퇴부 동맥으로부터 수집하고, 4 ℃ (1500 내지 2000 xg)에서 원심분리하여 혈장을 수득하였다. 샘플을 LC/MS/MS로 분석할 때까지 -20 ℃에 보관하였다.

약동학 분석의 위한 데이타 분석

약동학 파라미터를 혈장 농도 대 시간 데이타 (KINETICA(상표명) 소프트웨어, 버젼 4.2, 인나페이스 코포레이션(InnaPhase Corporation), 미국 펜실베니아주 필라델피아 소재)의 비-구획 분석으로 수득하였다. 최대 농도 (Cmax) 및 Cmax를 위한 시간을 실험적 관찰로부터 직접 기록하였다. 0 시부터 마지막 샘플링 시간까지의 곡선 아래 면적 (AUC(O-T))을 선형 및 로그 사다리꼴 합 공식의 조합을 이용하여 산출하였다. 전체 혈장 제거율 (CLTp), 분포의 정상 상태 부피 (Vss), 겉보기 제거 반감기 (T 1/2) 및 평균 체류 시간 (MRT)을 IV 투여 이후에 추정하였다. 정량화가능한 농도에서 최소 3개의 시점을 이용하여 T1/2를 평가하였다. 절대 경구 생체이용가능성 (F)을 경구 및 IV 투여에 따른 투여량-표준화된 AUC 값의 비로 추정하였다.

THP -1 결합

인간 CCR2 결합 분석을 또한 트레이서 리간드로서 ¹²⁵I-인간 MCP-1을 사용하 여, 내생 CCR2를 발현시키는 THP-1 인간 단핵 백혈구 세포주로 확립하였다. 방사성 리간드 경쟁 결합 분석을 이용하여 CCR2 수용체에 대한 시험 화합물의 결합 친화도를 평가하였다. 방사성 리간드 경쟁 연구를 위해, (50 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ 및 0.5％ BSA를 함유하는 분석 완충액 중) 2.5×10⁵개 THP-1 세포/웰을 함유하는 용액 100 ㎕를, 5 μM 내지 100 pM 범위의 최종 농도를 갖는 3배 연속 희석물 중 시험 화합물을 함유하는 96-웰 분석 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 분석 완충액 중 0.2 nM의 최종 농도의 ¹²⁵I-MCP-1 방사성 리간드 50 ㎕를 반응물에 첨가하였다. 실온에서 90 분 동안 인큐베이션한 후에, GF/B 필터 플레이트 (퍼킨엘머(PerkinElmer) 카달로그 번호 6005177) 상에서 수확한 후에 빙냉 세척 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.4, 0.1％ BSA, 0.5 M NaCl)으로 세척하여 결합하지 않은 리간드를 제거함으로써 결합 반응을 종결시켰다. 세척한 후에, 플레이트를 60 ℃에서 45 분 동안 건조시킨 다음 마이크로신트(MicroScint) 20 섬광 유액 40 ㎕를 첨가하고, 이를 봉하고, 팩커드 탑카운드(Packard TopCount) 판독기로 분석하였다. 10 μM (5000배 과량의 몰농도)의 실내 CCR2 소분자 길항제 (실시예 2k, WO2005021500; CCR2 IC50 = 2 nM)의 존재하에 비특이적 결합을 결정하였다. ¹²⁵I-MCP-1의 특이적 결합은 전체 결합 및 비-특이적 결합 사이의 차이로 산출하였다. 경쟁 데이타는 시험 화합물의 부재하의 방사성 리간드 특이적 결합의 억제 백분율 (전체 신호의 백분율)로 플롯팅하였다. 비-특이적 결합에 대해 보정한 후에, IC50 값을 결정하였다. IC50은 ¹²⁵I-MCP-1 특이적 결합을 50％ 감소시키는데 필요한 시험 화합물의 농도로 정의하였으며, 표준화된 데이타를 핏팅(fit)하기 위한 4개 파라미터 로그 방정식을 이용하여 산출하였다.

상기 기재된 분석에서 측정된 각 화합물에 대한 데이타를 아래 나타내었다.

유용성

실시예의 대표적인 화합물은 당업자에게 공지된 분석을 이용하여 케모카인 수용체 활성의 조절제인 것으로 밝혀졌다. 본 섹션에서, 본원 발명자들은 이러한 분석에 대해 기재하고 있으며, 이들의 참조 문헌을 제공하였다. 보다 많은 분석이 본원의 "약리학상 특징 비교"라는 부제의 섹션에 기재되어 있다. 이들 MCP-1 길항작용의 분석에서 활성을 나타내는 실시예의 화합물은 케모카인 및 이들의 동족 수용체와 연관된 인간 질환의 치료에 유용할 것으로 기대된다. 이들 분석에서의 활성은 특정 분석에서 측정하였을 때 30 μM 이하 농도의 IC₅₀을 나타내는 화합물로 정의하였다.

인간 PBMC 에 결합하는 MCP -1의 길항작용

(문헌 [Yoshimura et al., J. Immunol 1990, 145, 292])

실시예에 기재된 하나 이상의 화합물은 본원에 기재된 인간 PBMC (인간 말초혈 단핵 세포)에 결합하는 MCP-1의 길항작용에서 활성을 나타낸다.

밀리포어 여과 플레이트 (#MABVN1250)를 실온에서 30 분 동안 결합 완충액 (RPMI 1640 배지 중 0.5％ 소 혈청 알부민, 20 mM HEPES 완충액 및 5 mM 염화마그네슘) 100 ㎕로 처리하였다. 결합을 측정하기 위해, 기지의 농도의 화합물을 함유하거나 함유하지 않은 결합 완충액 50 ㎕를 ¹²⁵I 표지된 인간 MIP-1 50 ㎕ (최종 농도 150 pM의 방사성 리간드를 얻기 위함) 및 5×10⁵개의 세포를 함유한 결합 완충액 50 ㎕와 합하였다. 이러한 결합 분석에 사용된 세포는 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 구배 원심분리로 단리된 인간 말초혈 단핵 세포, 또는 인간 단핵세포 (문헌 [Weiner et al., J. Immunol. Methods. 1980, 36, 89]), 또는 내생 수용체를 발현시키는 HP-1 세포주를 포함할 수 있다. 화합물, 세포 및 방사성 리간드의 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 진공 다기관에 배치하여 진공을 적용하고, 플레이트를 0.5 M NaCl을 함유한 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 플라스틱 스커트를 플레이트로부터 제거하고, 플레이트를 공기 건조시키고, 웰에 구멍을 뚫어 카운팅하였다. 임의의 경쟁 화합물의 부재하에 얻은 총 카운트, 및 시험 화합물 대신 100 nM MCP-1을 첨가하여 측정한 백그라운드(background) 결합을 사용하여 결합 억제율(％)을 계산하였다.

MCP -1-유도된 칼슘 유입의 길항작용

(문헌 [Sullivan, et al., Methods Mol. Biol. 1999, 114, 125-133])

실시예에 기재된 하나 이상의 화합물은 본원에 기재된 MCP-1-유도된 칼슘 유입의 길항작용에서 활성을 나타낸다.

칼슘 이동은 형광 Ca^{2 +} 지시 염료, fluo-3을 사용하여 측정하였다. 기 세포를 0.1％ 소 혈청 알부민, 20 mM HEPES 완충액, 5 mM 글루코스, 1％ 소 태아 혈청, 4 μM fluo-3 AM 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 포스페이트-완충 염수 중 8×10⁵개 세포/ml에서 60 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 칼슘 분석에 사용된 세포는 문헌 [Weiner et al., J. Immunol. Methods 1990, 36, 89-97]에 기재된 바와 같이 단리된 인간 단핵세포 또는 내생 CCR2 수용체를 발현하는 세포주, 예컨대 THP-1 및 MonoMac-6을 포함할 수 있다. 이어서, 세포를 0.1％ 소 혈청 알부민, 20 mM HEPES, 5 mM 글루코스 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 포스페이트-완충 염수로 3회 세척하였다. 이 세포를 0.5％ 소 혈청 알부민, 20 mM HEPES 및 2.5 mM 프로베네시드를 함유하는 포스페이트-완충 염수 중에서 최종 농도 2 내지 4×10⁶개 세포/ml로 다시 현탁시켰다. 세포를 96-웰 흑벽 마이크로플레이트 (100 ㎕/웰)에 플레이팅하고, 상기 플레이트를 5 분 동안 200×g에서 원심분리하였다. 다양한 농도의 화합물을 상기 웰 (50 ㎕/웰)에 첨가하고, 5 분 후에 50 ㎕/웰의 MCP-1을 첨가하여 최종 농도 10 nM을 얻었다. 칼슘 이동을 형광-영상화 플레이트 판독기를 이용하여 검출하였다. 세포 단일층을 아르곤 레이저 (488 nm)로 여기시키고, 세포-관련 형광을 3분 동안 측정하였다 (처음 90초 동안은 1초 마다, 그리고 다음 90초 동안은 10초 마다 측정함). 데이타를 임의의 형광 단위로서 작성하고, 각 웰에 대한 형광 변화를 최대-최소 편차로서 측정하였다. 화합물-의존성 억제는 단독 MCP-1만의 반응에 상대적으로 계산하였다.

MCP -1-유도된 인간 PBMC 화학주성의 길항작용

(문헌 [Bacon et al., Brit. J. Pharmacol. 1988, 95, 966])

실시예에 기재된 하나 이상의 화합물은 본원에 기재된 MCP-1-유도된 인간 PBMC 화학주성 분석의 길항작용에서 활성을 나타낸다.

뉴로프로브(Neuroprobe) MBA96-96-웰 화학주성 챔버, 폴리필트로닉스(Polyfiltronics) MPC 96 웰 플레이트, 및 뉴로프로브 폴리비닐피롤리돈-무함유 폴리카르보네이트 PFD5 8-마이크로미터 필터를 37 ℃ 인큐베이터에서 가온하였다. 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC) (문헌 [Boyum et al., Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 1968, 97, 31]) (표준 피콜 밀도 분리 방법을 통해 신선하게 단리됨)를 DMEM에 1×10⁷ c/ml로 현탁시키고, 37 ℃에서 가온하였다. 인간 MCP-1의 6O nM 용액을 또한 37 ℃에서 가온하였다. 시험 화합물의 희석액을 DMEM로 필요한 농도의 2x로 만들었다. PBMC 현탁액 및 60 nm MCP-1 용액을 시험 화합물의 희석액을 포함하거나 포함하지 않는 미리 가온시킨 DMEM로 채워진 폴리프로필렌 튜브에서 1:1로 혼합하였다. 이들 혼합물을 37 ℃ 튜브 가온기에서 가온하였다. 분석을 시작하기 위해, MCP-1/화합물 혼합물을 뉴로프로브 화학주성 챔버의 바닥 부분에 배치한 폴리필트로닉스 MPC 96 웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 적절한 부피는 각 웰에 대해 400 ㎕이고, 분배 후에 양성 반월판이 있어야 한다. 8 마이크로미터 필터를 96 웰 플레이트의 상부에 부드럽게 놓고, 고무 개스킷을 상부 챔버의 바닥에 부착시키고, 챔버를 조립하였다. 200 ㎕ 부피의 세포 현탁액/화합물 혼합물을 상부 챔버의 적절한 웰에 첨가하였다. 상부 챔버를 플레이트 실러로 덮고, 조립된 장치를 45 분 동안 37 ℃ 인큐베이터에 넣었다. 인큐베이션 후에, 플레이트 실러를 제거하고, 남은 모든 세포 현탁액을 흡인 분리하였다. 챔버를 탈조립시키고, 필터를 부드럽게 제거하였다. 필터를 90 도 각도로 유지시키면서, 이동하지 않은 세포를 포스페이트 완충 염수를 부드럽게 흘려 세척하고, 필터의 상부를 고무 롤러의 첨단부로 닦았다. 이러한 세척 과정을 2회 더 반복하였다. 필터를 공기 건조시킨 후에, 45 초 동안 라이트 게임사(Wright Geimsa) 염료에 완전하게 침지시켰다. 이어서, 7 분 동안 증류수에 담가 필터를 세척한 다음 신선한 증류수에서 15초 동안 더 세척하였다. 필터를 다시 공기 건조시켰다. 필터에 이동된 세포는 광학 현미경으로 정량화하였다.

포유동물 케모카인 수용체는 인간과 같은 포유동물에서 면역 세포 기능을 방해하거나 촉진하기 위한 표적을 제공한다. 케모카인 수용체 기능을 억제하거나 촉진하는 화합물은 특히 치료 목적으로 면역 세포 기능을 조절하는 데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 자가면역 병리학적 증상, 예컨대 류마티스성 관절염 및 아테롬성 동맥경화증 뿐만 아니라, 천식 및 알레르기성 질환, 병원균 (정의에 의해 바이러스를 포함함)에 의한 감염을 비롯한 다양한 염증성, 감염성 및 면역조절성 장애 및 질환의 예방 및/또는 치료에 유용한 화합물에 관한 것이다.

예를 들어, 포유동물 케모카인 수용체 (예를 들면, 인간 케모카인 수용체)의 하나 이상의 기능을 억제하는 본 발명의 화합물은 염증성 또는 감염성 질환을 억제 (즉, 저하 또는 예방)하기 위해 투여될 수 있다. 그 결과, 백혈구 이동, 부착, 화학주성, 세포외유출 (예를 들면, 효소, 히스타민의 세포외유출) 또는 염증성 조절인자 방출과 같은 하나 이상의 염증성 과정을 억제한다.

이와 유사하게, 포유동물 케모카인 수용체 (예를 들면, 인간 케모카인)의 하나 이상의 기능을 촉진하는 본 발명의 화합물을 투여함으로써, 예를 들어 백혈구 이동, 부착, 화학주성, 세포외유출 (예를 들면, 효소, 히스타민의 세포외유출) 또는 염증성 조절인자 방출과 같은 면역 또는 염증성 반응을 자극 (유도 또는 강화)하여, 염증 과정을 유리하게 자극한다. 예를 들어, 호산구는 기생충 감염을 제거하기 위해 동원될 수 있다. 또한, 케모카인 수용체 내재화 유도를 통해 세포에서 수용체 발현을 손실시킬 만큼 충분한 화합물을 전달하거나 또는 잘못된 방향으로 세포를 이동시키는 방식으로 화합물을 전달하는 것이 예상되는 경우, 상기 염증성, 알레르기성 및 자가면역 질환의 치료가 또한 포유동물 케모카인 수용체의 하나 이상의 기능을 촉진하는 본 발명의 화합물에 의해 예상될 수 있다.

인간과 같은 영장류뿐만 아니라, 다양한 다른 포유동물도 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다. 예를 들어, 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 기니아 피그, 래트 또는 다른 소과, 양과, 말과, 개과, 고양이과, 설치류 또는 쥐과 종들을 비롯한 포유동물이 치료될 수 있으나 이들로 한정되지는 않는다. 그러나, 이 방법은 또한 조류 종과 같은 다른 종에서도 실행될 수 있다. 상기 방법에서 치료되는 대상체는 케모카인 수용체 활성의 조절이 요구되는 수컷 또는 암컷인 포유동물이다. 본원에 사용된 "조절"은 길항작용, 효능작용, 부분적 길항작용 및/또는 부분적 효능작용을 포함한다.

CCR5 결합 및 기능 분석

세포 유도 및 세포 배양

내생 CC 케모카인 수용체 5 (CCR5)를 안정하게 발현시키는 HT1080 세포의 한 풀을 해링턴(Harrington), 셔프(Sherf) 및 런들렛(Rundlett) (미국 특허 제6,361,972호 및 제6,410,266호 참조)에 의해 요약된 방법을 이용하여 개발하였다. 최고-발현 클론을 반복적인 유세포측정법을 이용하여 단리한 후에 서브-클로닝하였다. 이어서, 이들 세포를 6-웰 접시에서 3×10⁵개 세포/웰로 배양하고, 키메라 HA-태그가 부착된 G 단백질 Gqi5 (몰레큘라 디바이시즈; Ex-Gen (퍼멘테스(Fermentes)) 15 ㎕ 중 선형화된 벡터 DNA 5 ㎍을 형질감염에 사용함)를 함유하는 DNA 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염시키고 2일 후에, 웰을 합하고, P100 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅하고 7일 후에, 콜로니를 피킹하고, 증식시키고, 웨스턴 블롯(Western blot)으로 Gqi5 함량에 대해 분석하였다. Gqi5 (형질감염으로부터 유래됨) 및 CCR5 (내생)가 고도로 발현되는 클론 (3559.1.6으로 명명됨)을 선별하고, 아래 기재된 실험에 사용하였다. HT1080 세포 (클론 3559.1.6)를 습윤 대기하에 37 ℃, 5％ CO₂에서 10％ 투석된 태아 소 혈청, 2％ 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 및 500 ㎍/mL 히그로마이신 B (최종 농도)가 보충된 α-MEM과 배양하였다.

막 제조

1×10⁸개 HT1080 세포 (클론 3559.1.6)를 함유하는 세포 펠렛을 빙냉 막 제조 완충액 (50 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂) 5 mL에 다시 현탁시키고, 얼음 상에서 20 초 동안 폴리트론(Polytron) 균질화기 상에서 고속으로 균질화시켰다. 균질물을 다른 막 제조 완충액 25 mL로 희석하고, 12 분 동안 원심분리하였다 (48,000xg, 4 ℃). 세포 펠렛을 막 제조 완충액 5 mL에 다시 현탁시킨 후에 앞서 기재된 바와 같이 다시 균질화시켰다. 균질물을 막 제조 완충액 5 mL로 희석하고, CCR5 단백질 농도에 대해 분석하였다.

결합 분석

상기 기재된 막 제조 과정으로부터 신선하게 제조된 균질물을 결합 완충액 (50 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 0.1％ BSA; 하나의 완전한 프로테아제 억제제 정제를 첨가한 후에 분석함)으로 희석하여 최종 단백질 농도 10 ㎍/웰 (코닝, 인크(Corning, Inc.)로부터의 솔리드 백색 96-웰 플레이트)을 달성하였다. 이러한 막 제제를 WGA-SPA 비드 (아머샴(Amerhsam); 결합 완충액에 미리 담가둠)와 합하여 200 ㎍/웰의 농도가 되도록 하였다. 이어서, 막/SPA 비드 혼합물 (100 ㎕/웰)을 다양한 농도의 시험 제품 (음성 대조군으로 순수한 DMSO 사용; 시험 제품으로 다양한 농도의 본 발명의 실시예의 화합물 사용; 양성 대조군으로 500 nM MIP-1β 사용)을 함유하는 DMSO 2 ㎕로 미리-점적시킨 플레이트에 첨가하였다. [¹²⁵I]-MIP-1β (퍼킨 엘머; 물질을 50 ㎕/웰로 첨가하였을 때 0.1 nM [¹²⁵I]-MIP-1β의 최종 농도를 제공하도록 결합 완충액으로 희석함) 50 ㎕를 첨가하여 결합 분석을 개시하였다. 플레이트를 봉하고, 실온에서 4 내지 6 시간 동안 정치시킨 후에 팩커드 탑카운트(Packard TopCount) 상에서 계수하였다. 각 실험에 대한 윈도우를 정하기 위한 음성 및 양성 대조군을 사용하여 시험 제품에 대해 결합된 백분율을 산출하였다.

형광 영상화 플레이트 판독기 ( FLIPRV )-기재의 기능 분석

HT1080 세포 (클론 3559.1.6)를 384-웰 플레이트 (흑색/투명 바닥 바이오코트(Biocoat) PDL, 벡톤 디킨슨(Beckton Dickinson))에서 10,000개 세포/웰 (30 ㎕)로 플레이팅하고, 30 ㎕/웰의 Fluro-4 AM 형광 염료 (DMSO 440 ㎕에 Fluro-4 AM 1 mg을 용해시키고, 플루로닉 용액 100 ㎕로 희석한 후에 행크스(Hank) 완충액 10 mL로 추가로 희석하여 제조함)를 충전시켰다. 세포를 30 분 동안 37 ℃, 5％ CO₂에서 인큐베이션한 후에 3회 세척하고, 분석 완충액 (20 mM HEPES, 1.2 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 2.5 mM 프로베네시드(Probenecid), 0.5％ BSA, 1x 행크스)에 현탁시켰다. 시험 제품을 DMSO로 연속적으로 희석한 다음 분석 완충액으로 1:10 희석한 후에 세포에 첨가하였다 (10 ㎕/웰). FLIPR을 사용하여, 흐름 유도 (즉, 효능제 활성)에 대해 플레이트를 판독하였다 (10 내지 70 초). 이어서, 세포를 효능제 용액 (30 ㎕/웰; 100 μM MIP-1β 30 ㎕를 분석 완충액 100 mL로 희석시켜 제조함; 이 프로토콜은 분석에 최종 농도 5 nM MIP-1β를 전달함)으로 더 충전시키고, 플레이트를 1 분 동안 FLIPR을 사용하여 판독하였다. 시험 제품의 길항제 활성을 0.4％ DMSO/완충액 음성 대조군과 비교하여 결정하였다.

본 개시문의 하나 이상의 화합물은 CCR2 및 CCR5 둘 모두의 억제제이며, 케모카인과 연관된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 이중 길항제로 여겨진다.

케모카인 수용체 기능의 억제제로 치료될 수 있는 인간 또는 다른 종의 질환 또는 상태로는 천식, 알레르기성 비염, 과민성 폐 질환, 과민성 폐렴, 호산구성 봉와직염 (예를 들면, 웰(Well) 증후군), 호산구성 폐렴 (예를 들면, 뢰플러(Loeffler) 증후군, 만성 호산구성 폐렴), 호산구성 근막염 (예를 들면, 슐만(Shulman) 증후군), 지연형 과민반응, 간질성 폐 질환 (ILD) (예를 들면, 특발성 폐 섬유증, 또는 류마티스성 관절염 관련 ILD, 전신 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 전신 경화증, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 다발성근염 또는 피부근염)과 같은 호흡기 알레르기성 질환; 전신성 아나필락시(anaphylaxis) 또는 과민 반응, 약물 알레르기 (예를 들어, 페니실린, 세팔로스포린에 대한 알레르기), 오염된 트립토판의 섭취에 의한 호산구증 다성 근육통 증후군, 곤충 자상 알레르기; 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스, 중증 근무력증, 연소 발병 당뇨병과 같은 자가면역 질환; 사구체신염, 자가면역 갑상선염, 베체트병; 동종이식 거부반응, 또는 이식편대숙주 질환 등을 비롯한 이식 거부반응 (예를 들면, 이식술 수행시); 크론병, 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환; 척추관절증; 건피증; 건선 (T-세포 매개 건선을 포함) 및 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 두드러기와 같은 염증성 피부병; 혈관염 (예를 들면, 괴사성, 피부성 및 과민성 혈관염); 호산구성 근염, 호산구성 근막염; 피부 및 장기의 백혈구 침윤 동반 암을 비롯한 염증성 또는 알레르기성 질환 및 상태 등이 있다. 바람직하지 않은 염증성 반응을 억제해야 치료될 수 있는 하는 다른 질환 또는 상태로는, 재관류 손상, 아테롬성 동맥경화증, 특정 혈액암, 사이토킨 유도성 독성 (예를 들면, 패혈성 쇼크, 내독소성 쇼크), 다발성근염, 피부근염 등이 있다. 케모카인 수용체 기능의 억제제로 치료될 수 있는 인간 또는 다른 종의 감염성 질환 또는 상태로는 HIV 등이 있다.

케모카인 수용체 기능의 촉진제로 치료될 수 있는 인간 또는 다른 종의 질환 또는 상태로는, AIDS 또는 다른 바이러스성 감염과 같은 면역결핍 증후군이 있는 개체, 면역억제를 야기하는, 방사선 요법, 화학요법, 자가면역 질환을 위한 요법 또는 약물 요법 (예를 들면, 코르티코스테로이드 요법)을 받는 개체에서의 면역 억제; 수용체 기능의 선천성 결핍증 또는 다른 원인으로 인한 면역 억제; 및 윤충성 감염, 예를 들어 선충류 (회충); (편충, 요충, 회충, 십이지장충, 분선충, 선모충, 사상충), 흡충강 (흡충) (주혈흡충증, 간 흡충증), 조충 (촌충) (포낭충증, 무구조충증, 낭미충증), 내장의 기생충, 내장 유충 이행증 (예를 들면, 개회충), 호산구성 위장염 (예를 들면, 아니사키스(Anisaki) 종, 포카네마(Phocanema) 종), 피내 유충 이행증 (브라질 구충, 개구충) 등을 비롯한 기생충 질환과 같은 감염성 질환이 있으나 이들로 한정되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 화합물은 다양한 염증성, 감염성 및 면역조절성 장애 및 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

또한, 케모카인 수용체 내재화 유도를 통해 세포에서 수용체 발현을 손실시킬만큼 충분한 화합물을 전달하거나 또는 잘못된 방향으로 세포를 이동시키는 방식으로 화합물을 전달하는 것이 예상되는 경우, 상기 언급된 염증성, 알레르기성 및 자가면역 질환의 치료가 케모카인 수용체 기능의 촉진제에 의해 예상될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 G 단백질 커플링된 수용체의 추정되는 특이적 효능제 또는 길항제를 평가하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 케모카인 수용체의 활성을 조절하는 화합물의 제조 및 이들의 스크리닝 분석의 실행에 있어서 상기 화합물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 화합물은, 다른 화합물의 케모카인 수용체에 대한 결합 부위를, 예를 들어 경쟁적 억제를 통해 수립하거나 결정하는데 유용하거나, 또는 활성이 알려지지 않은 화합물을 활성이 알려진 화합물과 비교하기 위한 분석에서의 기준물질로서 유용하다. 새로운 분석법 또는 프로토콜을 개발할 경우, 본 발명에 따른 화합물은 이들의 유효성을 시험하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 화합물들은, 예를 들어 상기 기재된 질환과 관련된 제약 연구에 사용하기 위한 시판용 키트로 제공될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 케모카인 수용체의 추정되는 특이적 조절인자를 평가하는 데 유용하다. 또한, 본 발명의 화합물을 이용하여 상호작용의 특이적 부위 특정을 도울 수 있는 G 단백질 커플링된 수용체에 대해 결합하지 않는 화합물의 예로서 작용함으로써, 또는 상기 수용체에 대해 활성인 화합물의 구조적 변이체로서 작용함으로써, 케모카인 수용체가 아니라고 여겨지는 상기 G 단백질 커플링된 수용체의 특이성을 시험할 수 있다.

본원에 개시된 화합물은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈성 쇼크, 아테롬성 동맥경화증, 동맥류, 열, 심혈관계 사건, 혈역학 쇼크, 패혈성 증후군, 허혈 후 재관류 손상, 말라리아, 크론병, 염증성 장 질환, 미코박테리움 감염, 수막염, 건선, 울혈성 심부전증, 섬유성 질환, 악액질, 이식 거부반응, 자가면역 질환, 피부 염증성 질환, 다발성 경화증, 방사선 손상, 과산소 치조 손상, HIV, HIV 치매, 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 특발성 폐 섬유증, 수포성 유천포창, 윤충성 기생충 감염, 알레르기성 대장염, 습진, 결막염, 이식, 가족성 호산구증, 호산구성 봉와직염, 호산구성 폐렴, 호산구성 근막염, 호산구성 위장염, 약물 유도성 호산구증, 낭성 섬유증, 처크-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 림프종, 호지킨병, 결장 암종, 펠티(Felty) 증후군, 유육종증, 포도막염, 알츠하이머, 사구체신염 및 전신 홍반성 루푸스로, 식도 편평상피 세포 암종, 신경병증성 통증 및 비만으로부터 선택된 장애를 치료 또는 예방하는데 사용된다.

다른 측면에서, 상기 화합물은 류마티스성 관절염, 골관절염, 아테롬성 동맥경화증, 동맥류, 열, 심혈관계 사건, 크론병, 염증성 장 질환, 건선, 울혈성 심부전증, 다발성 경화증, 자가면역 질환, 피부 염증성 질환으로부터 선택된 염증성 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다.

다른 측면에서, 상기 화합물은 류마티스성 관절염, 골관절염, 아테롬성 동맥경화증, 크론병, 염증성 장 질환 및 다발성 경화증으로부터 선택된 염증성 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용된다.

다른 측면에서, 본원에 개시된 실시예의 화합물은 아래 열거된 것 등을 비롯한 다양한 암의 치료에 유용할 수 있다:

방광 (가속 및 전이성 방광 암 포함), 유방, 결장 (결장직장암 포함), 신장, 간, 폐 (소세포 및 비-소세포 폐암 및 폐 선암종 포함), 난소, 전립선, 고환, 비뇨생식기, 림프계, 직장, 후두, 췌장 (외분비 췌장 암종 포함), 식도, 위, 담낭, 자궁경부, 갑상선 및 피부 (편평상피 세포 암종)의 암종;

백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모양 세포 림프종, 조직구성 림프종, 및 버킷(Burkett) 림프종을 비롯한 림프 계통의 혈액 종양;

급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 및 전골수구 백혈병을 비롯한 골수 계통의 혈액 종양;

성상세포종, 신경아세포종, 신경교종 및 신경초종을 비롯한 중추 및 말초 신경계의 종양;

섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 비롯한 중간엽 기원의 종양; 및

흑색종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 정상피종, 갑상선 여포성 암 및 기형암종을 비롯한 다른 종양.

다른 실시양태에서, 유방암, 간암, 전립선암 및 흑색종으로부터 선택된 암의 치료 방법이 본원에 개시되어 있다. 또한, 본원에 개시된 화합물은 난소암 및 다발성 골수종의 치료에 유용할 수 있다.

본 발명은 다양한 비암성 증식성 질환의 치료 방법을 제공한다.

자가면역 병리학적 증상, 예를 들어 류마티스성 관절염 및 아테롬성 동맥경화증 및 상기 기재된 병상뿐만 아니라 천식 및 알레르기성 질환을 비롯한 염증성, 감염성 또는 면역조절성 장애 및 질환을 예방하고 치료하기 위한 조합 치료법은 본 발명의 화합물과 이러한 유용성이 알려진 다른 화합물의 조합물에 의해 예시된다. 예를 들어, 염증의 치료 또는 예방에서, 본 발명의 화합물은 소염제 또는 진통제, 예를 들어 오피에이트 효능제, 리폭시제나아제 억제제, 시클로옥시게나제-2 억제제, 인터류킨 억제제, 예를 들어 인터류킨-1 억제제, 종양 괴사 인자 억제제, NMDA 길항제, 산화질소의 억제제 또는 산화질소 합성의 억제제, 비스테로이드성 소염제, 포스포디에스테라아제 억제제, 또는 사이토킨-억제성 소염제, 예를 들어 화합물, 예컨대 아세트아미노펜, 아스피린, 코데인, 펜타이닐, 이부프로펜, 인도메타신, 케토롤락, 모르핀, 나프록센, 페나세틴, 피록시캄, 스테로이드성 진통제, 수펜타닐, 선린닥, 인터페론 알파 등과 함께 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 화합물들은 진통제; 상승제, 예를 들어 카페인, H2-길항제, 시메티콘, 수산화알루미늄 또는 수산화마그네슘; 충혈제거제, 예를 들어 페닐에프린, 페닐프로판올아민, 슈도페드린, 옥시메타졸린, 에피네프린, 나프타졸린, 크실로메타졸린, 프로필헥세드린 또는 레보데스옥시-에페드린; 진해제, 예를 들어 코데인, 히드로코돈, 카라미펜, 카르베타펜탄 또는 덱스트라메토르판; 이뇨제; 및 진정 또는 비진정 항히스타민제와 함께 투여될 수 있다. 마찬가지로, 본원에 개시된 화합물은 본 발명의 화합물이 유용한 질환 또는 상태의 치료/예방/억제 또는 완화에 사용되는 다른 약물과 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 다른 약물들은 소정 경로에 의해 그리고 이를 위해 통상적으로 사용되는 양으로, 본 발명의 화합물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물이 1종 이상의 다른 약물과 동시에 사용되는 경우, 본 발명의 화합물 이외에 그러한 다른 약물을 함유하는 제약 조성물이 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 화합물 이외에 1종 이상의 다른 활성 성분을 또한 함유하는 조성물을 포함한다.

개별적으로 또는 동일한 제약 조성물로 투여되어 본 발명의 화합물과 조합될 수 있는 다른 활성 성분의 예로는 (a) 인테그린 길항제, 예컨대 셀렉틴, ICAM 및 VLA-4를 위한 인테그린 길항제; (b) 스테로이드, 예컨대 베클로메타손, 메틸프레드니솔론, 베타메타손, 프레드니손, 덱사메타손 및 히드로코르티손; (c) 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 타크롤리무스, 라파마이신 및 다른 FK-506 유형 면역억제제; (d) 항히스타민제 (H1-히스타민 길항제), 예컨대 브로모페니라민, 클로르페니라민, 덱스클로르페니라민, 트리프롤리딘, 클레마스틴, 디펜히드라민, 디페닐피랄린, 트리펠렌아민, 히드록시진, 메트딜라진, 프로메타진, 트리메프라진, 아자타딘, 시프로헵타딘, 안타졸린, 페니라민, 피릴아민, 아스테미졸, 테르펜아딘, 로라타딘, 세티리진, 펙소페나딘, 데스카르보에톡실로라타딘 등; (e) 비스테로이드성 항천식제, 예컨대 b2-효능제 (테르부탈린, 메타프로테레놀, 페노테롤, 이소에타린, 알부테랄, 비톨테롤 및 피르부테롤), 테오필린, 크로몰린 나트륨, 아트로핀, 이프라트로퓸 브로마이드, 류코트리엔 길항제 (자피를루카스트, 몬텔루카스트, 프란루카스트, 이랄루카스트, 포빌루카스트, SKB-102,203), 류코트리엔 생합성 억제제 (질류톤, BAY-1005); (f) 비스테로이드성 소염제 (NSAID), 예컨대 프로피온산 유도체 (알미노프로펜, 베녹사프로펜, 부클록산, 카르프로펜, 펜부펜, 페노프로펜, 플루프로펜, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도프로펜, 케토프로펜, 미로프로펜, 나프록센, 옥사프로진, 피르프로펜, 프라노프로펜, 수프로펜, 티아프로펜산 및 티옥사프로펜), 아세트산 유도체 (인도메타신, 아세메타신, 알클로페낙, 클리다낙, 디클로페낙, 펜클로페낙, 펜클로즈산, 펜티아작, 푸로페낙, 이부페낙, 이속세팍, 옥스피낙, 술린닥, 티오피낙, 톨메틴, 지도메타신 및 조메피락), 페남산 유도체 (플루페남산, 메클로페남산, 메페남산, 니플룸산 및 톨페남산), 바이페닐카르복실산 유도체 (디플루니살 및 플루페니살), 옥시캄 (이속시캄, 피록시캄, 수독시캄 및 테녹시칸), 살리실레이트 (아세틸 살리실산, 술파살라진) 및 피라졸론 (아파존, 벤즈피페릴론, 페프라존, 모페부타존, 옥시펜부타존, 페닐부타존); (g) 시클로옥시게나제-2 (COX-2) 억제제; (h) 포스포디에스트라제 유형 IV (PDE-IV)의 억제제; (i) 케모카인 수용체의 기타 길항제; (j) 콜레스테롤 저하제, 예컨대 HMG-CoA 리덕타제 억제제 (로바스타틴, 심바스타틴 및 프라바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴 및 기타 스타틴), 격리제 (콜레스티르아민 및 콜레스티폴), 니코톤산, 페노피브르산 유도체 (겜피브로질, 클로피브래트, 페노피브레이트 및 벤자피브레이트), 및 프로부콜; (k) 항당뇨제, 예컨대 인슐린, 술포닐우레아, 비구아니드 (메트포르민), α-글루코시다제 억제제 (아카르보스) 및 글리타존 (트로글리타존 및 피오글리타존); (l) 인터페론 제제 (인터페론 알파-2a, 인터페론-2B, 인터페론 알파-N3, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b, 인터페론 감마-1b); (m) 항바이러스성 화합물, 예컨대 에파비렌즈, 네비라핀, 인디나비르, 간시클로비르, 라미부딘, 팜시클로비르 및 잘시타빈; (o) 기타 화합물, 예컨대 5-아미노살리실산 및 그의 전구약물, 항대사물질, 예컨대 아자티오프린 및 6-머캅토푸린, 및 세포독성 암 화학요법제가 있으나 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명의 화합물 대 제2 활성성분의 중량비는 각 성분의 유효 투여량에 따라 달라질 수 있으며 좌우될 것이다.

일반적으로, 각 화합물의 유효 투여량이 사용될 것이다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 화합물을 NSAID와 조합할 경우, 본 발명의 화합물 대 NSAID의 중량비는 일반적으로 약 1000:1 내지 약 1:1000, 또는 다르게는 약 200:1 내지 약 1:200일 것이다. 본 발명의 화합물 및 다른 활성 성분의 조합물은 또한 일반적으로 상기 기재된 범위 내에 있을 것이지만, 각각의 경우에 각 활성 성분의 유효한 투여량이 사용되어야 한다.

암 치료에서, 화학요법제 및/또는 다른 치료 (예를 들면, 복사 요법)의 조합이 유리하기도 하다. 제2 (또는 제3) 제제는 1차 치료제 보다 동일하거나 상이한 작용 메카니즘을 가질 수 있다. 이는 둘 이상의 투여된 약물이 상이한 방식으로 또는 세포 주기의 상이한 단계에 작용하고/거나, 둘 이상의 약물이 중복되는 독성 또는 부작용을 갖고/거나, 조합된 약물이 각각 환자에 의해 나타난 특정 질환 상태를 치료하는데 입증된 효능을 갖는, 세포독성 약물 조합을 사용하는데 특히 유용할 수 있다.

따라서, 본원에 개시된 화합물 (또는 본원에 개시된 다른 제제)은 다른 항암제 및 세포독성제, 및 암 또는 다른 증식성 질환의 치료에 유용한 치료와 함께 투여될 수 있다. 본원에서 본 발명은 또한 암 치료용 의약의 제조에 있어서의 본원의 화합물 (또는 본원에 개시된 다른 제제)의 용도를 포함하고/거나, 화합물을 다른 항암제 또는 세포독성제 및 암 치료용 처리와 함께 사용하는 법을 알려주는 설명서와 함께 본원의 화합물을 포함하는 패키지를 포함한다. 본 발명은 또한 화합물 및 하나 이상의 추가의 제제의 조합을 키트 형태 (예를 들면, 이들은 함께 포장되거나 또는 키트로서 함께 시판되는 별도의 패키지에 포함되거나, 또는 이들은 함께 제제화되어 포장됨)로 포함한다.

제2 (또는 그 이상의) 항암제는 아래 기재된 임의의 하나 이상의 제제로부터 선택될 수 있다:

알킬화제 (질소 머스타드, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아, 에틸렌이민 유도체 및 트리아젠 포함); 항-혈관신생제 (매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제 포함); 항대사물 (아데노신 데아미나제 억제제, 폴산 길항제, 퓨린 유사체 및 피리미딘 유사체); 항생제 또는 항체 (모노클로날 항체, CTLA-4 항체, 안트라사이클린 포함); 아로마타제 억제제;

세포-주기 반응 개질제; 효소; 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제;

호르몬제 및 항호르몬제 및 스테로이드제 (합성 유사체, 글로코코르티코이드, 에스트로겐/항-에스트로겐 [예를 들면, SERM], 안드로겐/항-안드로겐, 프로게스틴, 프로게스테론 수용체 효능제, 및 황체형성 호르몬-방출 [LHRH] 효능제 및 길항제 포함); 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)/인슐린-유사 성장 인자 수용체 (IGFR) 시스템 조절제 (IGFR1 억제제 포함); 인테그린-신호전달 억제제; 키나제 억제제, 예컨대 다중-키나제 억제제 및/또는 Src 키나제 또는 Src/abl의 억제제, 사이클린 의존성 키나제 [CDK] 억제제, panHer, Her-1 및 Her-2 항체, VEGF 억제제, 예컨대 항-VEGF 항체, EGFR 억제제, 미토겐-활성화된 단백질 [MAP] 억제제, MEK 억제제, 오로라(Aurora) 키나제 억제제, PDGF 억제제, 및 다른 티로신 키나제 억제제 또는 세린/트레오닌 키나제 억제제;

미세소관-파괴인자 제제, 예컨대 엑테인아시딘 또는 이들의 유사체 및 유도체; 미세소관-안정화제, 예컨대 탁산, 및 자연-발생 에포틸론 및 이들의 합성 및 반-합성 유사체;

미세소관-결합, 탈안정화제 (빈카 알칼로이드 포함); 및

토포이소머라제 억제제; 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제; 백금 배위 착체; 신호 변환 억제제; 및 항암제 및 세포독성제, 예컨대 생물학적 반응 개질제, 성장 인자, 및 면역 조절제로 사용되는 다른 제제.

또한, 본 발명의 화합물은 상기 언급된 증상과 관련된 부작용을 처리하는데 있어서의 특정한 유용성에 대해 선별된 다른 치료제와 함께 제제화되거나 또는 공동-투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 구역, 과민증 및 위 자극을 방지하는 제제, 예컨대 구토억제제, 및 H₁ 및 H₂ 항히스타민제와 함께 제제화될 수 있다.

상기 다른 치료제는 본 발명의 화합물과 함께 사용하였을 때, 예를 들면 문헌 [Physicians' Desk Reference] (PDR)에 지시된 양으로 또 다르게는 당업자에 의해 결정된 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물들은 치료 유효량으로 포유동물에게 투여된다. "치료 유효량"이란 포유동물에 단독으로 또는 추가의 치료제와 조합되어 투여될 경우, 질환 상태 또는 질환의 진행을 예방하거나 완화시키는 데 효과적인 본 발명의 화합물의 양을 의미한다.

투여량 및 제제

본 발명의 화합물은 정제, 캡슐제 (각각은 지연 방출형 또는 시간 방출형 제제를 포함함), 환약, 산제, 과립제, 엘릭시르(elixir), 팅크제(tincture), 현탁액제, 시럽제 및 유제와 같은 경구 투여형으로 투여될 수 있다. 이들은 또한 정맥내 (볼루스(bolus) 또는 주입), 복강내, 피하 또는 근육내 형태로 투여될 수 있고, 모든 투여형은 제약업계의 보통의 숙련자에게 공지되어 있다. 이들은 단독으로 투여될 수 있지만, 일반적으로 선택된 투여 경로 및 표준 제약 실무를 기준으로 선택되는 제약상 담체와 함께 투여될 것이다.

본 발명의 화합물을 위한 투여 처방은, 물론 공지된 요인, 예컨대 특정 제제의 약동학적 특성, 및 그의 투여 방식 및 경로; 수혜자의 종, 연령, 성별, 건강, 의학적 상태 및 체중; 징후의 특성 및 범위; 수반되는 치료의 종류; 치료의 빈도; 투여 경로, 환자의 신장 및 간장 기능, 및 목적하는 효과에 따라 변화될 것이다. 의사 또는 수의사들은 장애의 진행을 예방, 대항 또는 저지하는 데 필요한 약물의 유효량을 결정하고 처방할 수 있다.

일반적 지침에 따라, 각 활성 성분의 1일 경구 투여량은 표시된 효과를 위해 사용할 경우 약 0.001 내지 1000 mg/체중 (kg), 또는 약 0.01 내지 100 mg/체중 (kg), 또는 다르게는 약 1.0 내지 20 mg/kg일 것이다. 정맥내 투여량은 일정 속도 주입 동안 약 1 내지 약 10 mg/kg/분일 것이다. 본 발명의 화합물은 단일 1일 투여량으로 투여될 수 있거나, 또는 총 1일 투여량을 1일 당 2회, 3회 또는 4회로 나누어 투여할 수 있다. 한 실시양태에서, 활성 성분의 일일 경구 투여량은 3 내지 600 mg으로, 일일 1회 투여하거나 또는 일일 2회로 나누어 분할 투여된다. 별법으로, 활성 성분은 10 내지 20 mg의 투여량으로 일일 2회 투여되거나 또는 40 내지 100 mg의 투여량으로 일일 1회 투여될 수 있다. 별법으로, 활성 성분은 12.5 mg의 투여량으로 일일 2회 투여되거나 또는 75 mg의 투여량으로 일일 1회 투여될 수 있다. 별법으로, 활성 성분은 3, 10, 30, 100, 300 및 600 mg의 투여량으로 일일 1회 또는 2회 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물은 적합한 비강내 비히클의 국소 사용을 통해 비강내 형태로, 또는 경피성 피부 팻치를 사용한 경피 경로를 통해 투여될 수 있다. 경피 전달계의 형태로 투여되는 경우, 투여량 투여는 물론 투여 처방 동안 간헐적이기 보다는 연속적일 것이다.

전형적으로, 본 발명의 화합물들은 의도된 투여형, 즉, 경구용 정제, 캡슐제, 엘릭시르, 시럽제 등에 대해 적합하게 선택되고, 통상의 제약 실무에 부합하는 적합한 제약상 희석제, 부형제 또는 담체 (본원에서는 총괄적으로 제약상 담체라 함)와 혼합되어 투여된다.

예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로 경구 투여하기 위해, 활성 약물 성분은 경구용 비독성의 제약상 허용되는 불활성 담체, 예컨대 락토스, 전분, 수크로스, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 스테아르산 마그네슘, 인산이칼슘, 황산칼슘, 만니톨, 소르비톨 등과 조합될 수 있고; 액체형의 경구 투여를 위해, 경구 약물 성분은 임의의 경구용 비독성의 제약상 허용되는 불활성 담체, 예컨대 에탄올, 글리세롤, 물 등과 조합될 수 있다. 또한, 바람직하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제도 또한 혼합물에 혼입될 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 젤라틴, 천연당, 예컨대 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예를 들어 아카시아, 트래거칸트, 또는 나트륨 알기네이트, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 이러한 투여 형태에 사용된 윤활제에는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산 마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨 등이 포함된다. 붕해제에는 전분, 메틸 셀룰로스, 한천, 벤토나이트, 크산탄 검 등이 포함된다.

본 발명의 화합물은 또한 리포솜 전달계, 예컨대 소형 단일층상 소포, 대형 단일층상 소포 및 다중층상 소포의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 다양한 인지질, 예컨대 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로부터 형성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 표적가능한 약물 담체로서 가용성 중합체와 커플링될 수 있다. 이러한 중합체들은 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스파르트아미드페놀 또는 폴리에틸렌옥시드폴리라이신 (팔미토일 잔기로 치환됨)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 약물의 제어된 방출을 달성하는 데 유용한 생분해성 중합체의 부류, 예를 들어 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아실레이트, 및 히드로겔의 가교된 또는 양친매성 (amphipathic) 블록 공중합체와 커플링될 수 있다.

투여에 적합한 투여 형태 (제약 조성물)는 투여 단위 당 약 1 mg 내지 약 100 mg의 활성 성분을 함유할 수 있다. 이러한 제약 조성물에서, 활성 성분은 일반적으로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 내지 95 중량％의 양으로 존재할 것이다.

젤라틴 캡슐제는 활성 성분 및 분말형 담체, 예를 들어 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 등을 함유할 수 있다. 유사한 희석제가 압착 정제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 정제 및 캡슐제 모두는 지연 방출형 생성물로 제조되어 수 시간에 걸쳐 약물의 연속 방출을 제공할 수 있다. 압착된 정제는 당으로 코팅되거나 필름으로 코팅되어 불쾌한 맛을 차폐하고 대기로부터 정제를 보호하거나, 또는 장용 코팅되어 위장관에서 선택적으로 붕해될 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 환자의 순응도를 증가시키기 위해 착색제 및 향미제를 함유할 수 있다.

일반적으로, 물, 적합한 오일, 염수, 수성 덱스트로스 (글루코스) 및 관련된 당 용액 및 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 비경구 용액제에 적합한 담체이다. 비경구 투여용 용액제는 활성 성분의 수용성 염, 적합한 안정화제, 및 필요할 경우, 완충 물질을 함유할 수 있다. 단독 또는 조합된 중아황산나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 적합한 안정화제이다. 또한 시트르산 및 그의 염 및 나트륨 EDTA가 사용된다. 또한, 비경구 용액제는 보존제, 예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올을 함유할 수 있다.

적합한 제약상 담체는 당 분야에서 표준 참고 문헌인 문헌 [Reminqton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company]에 기재되어 있다.

본 발명의 화합물을 투여하기에 대표적으로 유용한 제약상 투여형을 하기와 같이 예시할 수 있다:

캡슐제

표준 2-조각 경질 젤라틴 캡슐제에 100 mg의 분말 활성 성분, 150 mg의 락토스, 50 mg의 셀룰로스 및 6 mg의 스테아르산 마그네슘을 충전시킴으로써 다수의 단위 캡슐제를 제조할 수 있다.

연질 젤라틴 캡슐제

대두유, 면실유 또는 올리브유와 같은 식용 오일 중 활성 성분의 혼합물을 제조하고, 정변위 펌프에 의해 젤라틴 내에 주입하여 100 mg의 활성 성분을 함유한 연질 젤라틴 캡슐제를 형성할 수 있다. 이 캡슐제를 세척하고 건조시켜야 한다.

정제

정제를 통상의 절차에 따라 투여 단위가 100 mg의 활성 성분, 0.2 mg의 콜로이드성 이산화규소, 5 mg의 스테아르산 마그네슘, 275 mg의 미세결정질 셀룰로스, 11 mg의 전분 및 98.8 mg의 락토스로 이루어지도록 제조할 수 있다. 적절한 코팅을 적용하여 좋은 맛 또는 지연 흡수성을 증가시킬 수 있다.

주사제

10 부피％의 프로필렌 글리콜 및 물 중 1.5 중량％의 활성 성분을 교반함으로써 주사 투여에 적합한 비경구 조성물을 제조할 수 있다. 이 용액제를 염화나트륨으로 등장성으로 만들고 멸균하여야 한다.

현탁액제

각 5 ml가 100 mg의 미분된 활성 성분, 200 mg의 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 5 mg의 나트륨 벤조에이트, 1.0 g의 소르비톨 용액, U.S.P., 및 0.025 ml의 바닐린을 함유하도록 경구 투여용 수성 현탁액제를 제조할 수 있다.

본 발명의 화합물이 다른 항응고제와 조합될 경우, 예를 들어 1일 투여량은 환자 체중 kg당 약 0.1 내지 100 mg의 화학식 I의 화합물 및 약 1 내지 7.5 mg의 제2 항응고제일 수 있다. 정제 투여형을 위해, 본 발명의 화합물은 일반적으로 투여 단위 당 약 5 내지 10 mg의 양으로, 제2 항응고제는 투여 단위당 약 1 내지 5 mg의 양으로 존재할 수 있다.

2종 이상의 상기 제2 치료제가 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 경우에는, 일반적으로 조합 투여 시의 치료제의 부가적 또는 상승적 효과로 인해, 각 성분의 양은 전형적인 1일 투여량 및 전형적인 투여 형태로 단독으로 투여하는 경우의 치료제의 통상의 제약 투여량에 비해 감소될 수 있다.

특히, 단일 투여 단위로 제공될 경우, 조합된 활성 성분 간의 화학적 상호작용에 대한 가능성이 존재한다. 이러한 이유로, 본 발명의 화합물 및 제2 치료제가 단일 투여 단위로 조합되는 경우, 이들은 활성 성분이 단일 투여 단위로 조합됨에도 불구하고, 활성 성분 간의 물리적 접촉을 최소화 (즉, 감소)하도록 제제화된다. 예를 들어, 하나의 활성 성분은 장용 코팅될 수 있다. 활성 성분 중 하나를 장용 코팅함으로써, 조합된 활성 성분간의 접촉을 최소화시키는 것뿐만 아니라, 위장관 내에서 이들 성분 중 하나의 방출을 제어하여, 이들 성분 중 하나가 위에서 방출되지 않고 오히려 장에서 방출되도록 할 수 있다. 활성 성분 중 하나는 또한 위장관 전체에서 지연 방출을 달성하고, 또한 조합된 활성 성분 간의 물리적 접촉을 최소화하도록 작용하는 물질로 코팅될 수 있다. 또한, 지연 방출형 성분은 추가적으로 장용 코팅되어 이 성분의 방출이 오직 장에서만 발생하도록 할 수 있다. 또 다른 접근법은, 하나의 성분을 지연 방출 및/또는 장 방출 중합체로 코팅하고, 다른 성분을 저점도 등급의 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC)와 같은 중합체 또는 당업계에 공지된 다른 적절한 물질로 코팅하여, 활성 성분을 추가로 분리하는 조합 생성물의 제제화를 포함한다. 중합체 코팅은 다른 성분과의 상호작용에 대한 추가의 방벽을 형성하도록 작용한다.

본 발명의 조합 생성물의 성분간의 접촉을 최소화시키는 이러한 방법 및 다른 방법들에서 단일 투여형으로 투여하거나, 또는 개별 투여형으로 그러나 동일한 방식으로 동일한 시간에 투여하는 것이, 일단 본 개시를 숙지한 당업자에게는 명백할 것이다.

또한, 본원에 개시된 특정 화합물은 다른 화합물의 대사물로서 유용할 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 순수한 화합물 (또한, 이후에 제약 조성물에 혼입될 수 있음)로 유용할 수 있거나, 또는 그 화합물의 전구약물의 투여 이후에 생성되는 대사물로서 유용할 수 있다. 한 실시양태에서, 화합물은 본원에 기재된 장애를 치료하는데 유용하게 되어 대사물로 유용할 수 있다.

본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 약 90 중량％ 이상 (약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 및 100％ 포함)의 순도를 갖는 화합물을 포함한다.

하나의 예로서, 본원에 개시된 화합물은 약 90 중량％ 초과의 순도를 가질 때 실질적으로 순수할 수 있으며, 여기서 나머지 약 10 중량％ 미만의 물질은 화합물의 다른 대사물, 화합물의 전구약물, 및/또는 그의 제조시 발생하는 반응 및/또는 처리 불순물을 포함한다.

명백하게, 본 발명의 다수의 변형 및 변화가 상기 교시 내용에 비추어 가능할 수 있다. 따라서, 첨부된 청구항의 범위 내에서 본 발명은 본원에 구체적으로 기재된 바와 다르게 실시할 수 있는 것으로 이해된다.

Claims (20)

1. (i) N-((1R,2S,5R)-2-((3S)-3-((6-tert-부틸피리미도[5,4-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)아세트아미드;

   N-((1R,2S,5R)-5-(메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

   N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필(메틸)아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)포름아미드;

   N-((1R,2S,5R)-5-(디메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

   N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-6-tert-부틸-2-피리딘카르복스아미드;

   N-((1R,2S,5R)-5-아미노-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)프로판아미드;

   2-tert-부틸-N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(메탄술포닐아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-4-피리미딘카르복스아미드;

   2-tert-부틸-N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(프로피오닐아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-4-피리미딘카르복스아미드;

   N-((1R,2S,5R)-5-(tert-부틸아미노)-2-((3S)-3-((6-tert-부틸피리미도[5,4- d]피리미딘-4-일)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)메탄술폰아미드; 및

   N-(((1S,2S,5R)-5-메톡시-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)메틸)아세트아미드; 또는

   (ii) 상기 (i)의 화합물들의 제약상 허용되는 염

   으로부터 선택된 화합물.
2. 제1항에 있어서, N-((1R,2S,5R)-2-((3S)-3-((6-tert-부틸피리미도[5,4-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)-5-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)아세트아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
3. 제1항에 있어서, N-((1R,2S,5R)-5-(메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
4. 제1항에 있어서, N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필(메틸)아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)포름아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
5. 제1항에 있어서, N-((1R,2S,5R)-5-(디메틸아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드 또 는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
6. 제1항에 있어서, N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-2-아세트아미도-4-(이소프로필(메틸)아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-6-tert-부틸-2-피리딘카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
7. 제1항에 있어서, N-((1R,2S,5R)-5-아미노-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)프로판아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
8. 제1항에 있어서, 2-tert-부틸-N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(메탄술포닐아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-4-피리미딘카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
9. 제1항에 있어서, 2-tert-부틸-N-((3S)-1-((1S,2R,4R)-4-(tert-부틸아미노)-2-(프로피오닐아미노)시클로헥실)-2-옥소-3-피롤리디닐)-4-피리미딘카르복스아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
10. 제1항에 있어서, N-((1R,2S,5R)-5-(tert-부틸아미노)-2-((3S)-3-((6-tert-부틸피리미도[5,4-d]피리미딘-4-일)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)메탄술 폰아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
11. 제1항에 있어서, N-(((1S,2S,5R)-5-메톡시-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)메틸)아세트아미드 또는 그의 제약상 허용되는 염인 화합물.
12. (i) N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필아미노)-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

    N-((1R,2S,5R)-5-아미노-2-((3S)-2-옥소-3-((6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

    N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필(메틸)아미노)-2-((3S)-3-((1-옥시도-6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드;

    N-((1R,2S,5R)-5-(이소프로필아미노)-2-((3S)-3-((1-옥시도-6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드; 및

    N-((1R,2S,5R)-5-(tert-부틸아미노)-2-((3S)-3-((1-옥시도-6-(트리플루오로메틸)-4-퀴나졸리닐)아미노)-2-옥소-1-피롤리디닐)시클로헥실)아세트아미드; 또는

    (ii) 상기 (i)의 화합물들의 제약상 허용되는 염

    으로부터 선택된 화합물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
14. 치료상-유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 당뇨병, 비만, 대사성 증후군, 졸중, 신경병증성 통증, 허혈성 심근병증, 건선, 고혈압, 경피증, 골관절염, 동맥류, 열, 심혈관 질환, 크론병, 울혈성 심부전증, 자가면역 질환, HIV-감염, HIV-관련 치매, 건선, 특발성 폐 섬유증, 이식 동맥경화증, 물리적-유도성 또는 화학적-유도성 뇌 외상, 염증성 장 질환, 폐포염, 대장염, 전신 홍반성 루푸스, 신독성 혈청 신염, 사구체신염, 천식, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증, 혈관염, 취약성 경화반, 류마티스성 관절염, 재협착, 정맥성 신생내막 과형성, 투석-이식편 신생내막 과형성, 동정맥 션트 혈관내막 과형성, 기관 이식, 만성 동종이식편 신장병 및 암으로부터 선택된 질환을 치료하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 질환이 당뇨병, 비만, 크론병, 전신 홍반성 루푸스, 사구체신염, 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증, 재협착 및 기관 이식으로부터 선택된 것인 방법.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 질환이 다발성 경화증, 아테롬성 동맥경화증, 크론병 및 당뇨병으로부터 선택된 것인 방법.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 당뇨병인 방법.
18. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 아테롬성 동맥경화증인 방법.
19. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 크론병인 방법.
20. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 방법.

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