KR20110060973A - 줄기세포 및 전구세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도 - Google Patents

줄기세포 및 전구세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유류의 줄기세포와 전구세포 분화를 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 표유류, 특히 인간 줄기 세포가 특정세포 또는 조직계통을 따라 분화와 성숙을 조절하고 제어하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 특정세포 및 조직계통을 따라서 줄기 또는 전구세포군의 분화, 특히 산후 태반으로부터 생성되는 배아유사 줄기세포의 분화를 또는 초기 전구세포가 과립구 계통으로 분화를 위하여 조절하는 특정 작은 유기분자의 용도에 관련된다. 최종적으로, 본 발명은 이식 및 다른 의학적 치료에 있어서 그러한 분화된 줄기 및 전구세포의 용도와 관련된다.

Description

줄기세포 및 전구세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도{Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof}
본 출원은 2002년 4월 12일에 출원된 미국 예비출원 제60/372348호; 2002년 12월 31일에 출원된 미국 예비출원 제60/437348호; 및 2002년 12월 31에 출원된 미국 예비출원 제60/437350호의 이익을 주장하며, 이들은 각각 본 명세서에 그대로 포함된다.
본 발명은 포유류의 줄기 및/또는 전구세포 분화를 조절하는 방법에 관련된다. 본 발명의 방법은 포유류, 특히 인간의 줄기 및 전구세포가 특정세포 및 조직계통을 따라 분화하고 성숙하는 것을 조절하고 제어하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 특정세포 및 조직계통을 따라서 줄기 또는 전구세포군의 분화, 특히 산후 태반으로부터 생성되는 배아유사 줄기세포의 분화를 또는 초기 전구세포가 과립구 계통으로 분화를 위하여 조절하는 특정 작은 유기분자의 용도에 관련된다. 또한 본 발명은 CD34+, CD45+ 및 CD133+ 전구세포와 같은 전구세포의 특정 계통의 분화를 조절하기 위한 이러한 유기분자들의 용도와 관련된다. 또한 본 발명은 전구세포 발달의 시간적 측면 및 시험관내에서 이러한 시간적 측면에 기초한 모델에 관련된다. 나아가, 본 발명은 그러한 세포 및/또는 작은 유기 화합물의 약학적 조성물을 포함하는 예방적 및 치료적 방법에서 이러한 조절된 세포의 용도에 관련된다. 최종적으로, 본 발명은 이식 및 다른 의학적 치료에 있어서 그러한 분화된 줄기 및 전구세포의 용도와 관련된다.
인간 줄기 및 전구 세포의 식별, 분리 및 발생에 많은 관심이 있다. 줄기 세포는 다양한 성숙 세포 계통을 생산할 수 있는 토티포텐트(totipotential) 또는 플루리포텐트(pluripotential) 전구 세포이고, 전구세포는 특정 세포계통의 세포를 생산할 수 있는 세포이다. 이러한 능력은 기관 및 조직 발달에 필요한 세포 분화 및 특정화의 기초로서 역할한다.
줄기 및 전구세포를 이식하는데 있어서 최근의 성공은 질병, 유독한 약품 및/또는 방사선 노출로 인한 미엘로압레이션 후의 골수의 재건 및/또는 보충을 위한 새로운 임상적인 도구를 제공하였다. 줄기세포가 많은, 전체는 아닐지라도, 조직을 재증식시키고 생리학적 및 해부학적 기능을 회복하는데 사용될 수 있는 것을 나타내는 그 이상의 증거가 존재한다. 조직 공학, 유전자 치료, 전달 및 세포 치료학에서 줄기세포의 적용이 또한 빠르게 발전하고 있다.
많은 다른 유형의 포유류 및 전구 줄기 세포가 특정지워졌다. 예를 들면, 배아 줄기세포, 배아 종자세포, 성인 줄기세포 또는 수임 줄기세포 또는 전구세포가 알려졌다. 특정 줄기세포는 분리 및 특정되었을 뿐만 아니라, 정해진 정도까지 분화가 허용되는 조건하에서 배양되었다. 그러나, 근본적인 문제가 남아있다; 즉, 조혈 전구세포와 같은 줄기세포 및 전구세포의 분화를 제어하거나 조절하기가 어렵다. 현재, 이러한 세포들의 분화를 조절하는 현존하는 방법은 조잡하고 조절되지 않아서, 셀이 원하지 않는 시간에 원하지 않는 세포 유형으로 분화된다. 또한, 결과물인 세포의 수득율도 일반적으로 낮다.
나아가, 치료 또는 연구 목적으로 인간 줄기세포를 충분하게 얻는 것이 문제이다. 정상적으로 성인 조직에서 발생하는 일군의 줄기 또는 전구세포의 분리는 기술적으로 어렵고, 부분적으로 혈액 또는 조직에서 발견되는 줄기 또는 전구세포의 제한된 양 및 골수 흡입물을 얻는데 포함되는 중요한 불편함으로 인해 비싸다. 일반적으로, 치료 및 연구 목적을 위해 충분한 양으로 대안적인 근원으로부터 줄기 및 전구세포를 수집하는 것은, 예를 들면 제공 대상물 또는 환자로부터 세포 또는 조직을 수집하고, 배양 및/또는 시험관내 세포의 증식, 해부 등을 포함하여 일반적으로 힘이 든다. 낙태아를 포함하는 배아 또는 태아조직으로쿠터 이러한 세포의 획득은 특히 줄기세포에 관해서는 종교적 및 윤리적 관심이 생겼다. 인간 배아 및 태아는 독립적인 삶을 구성한다는 널리 고정된 믿음은 의료적인 연구를 포함한 모든 목적에 있어서 그러한 근원의 사용에 정치적인 제한을 생겨나게 했다. 따라서 배아 또는 태아조직으로부터 발생된 세포의 사용을 요하지 않는 대안적인 근원이 임상적으로 줄기세포의 사용에서 그 이상의 진보를 위해 요구된다. 그러나, 줄기 또는 전구세포, 특히 인간 줄기 또는 전구세포의 가능한 대한적인 근원은 거의 없으며, 따라서 공급이 제한적이다.
Hu 등 (WO 00/73421 "Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells,", 2000년 12월 7일 공개)은 추후 사용을 위하여 분만에서 분리되고 배양되고 냉동보존되고 또는 분화하기 위해 유도된 태반으로부터 기인한 인간 양막 상피세포를 개시한다. Hu 등에 따르면, 태반은 분만 후 즉시 수집되고, 양막은 예를 들면 절개에 의해 융모막으로부터 분리된다. 양막 상피 세포는 표준 세포 분리법에 따라서 양막으로부터 분리된다. 개시된 세포는 다양한 배지에서 배양되고, 배양에서 확장되고, 냉동보존되고 또는 분화가 유도될 수 있다. Hu 등은 양막 상피세포가 멀티포턴트(그리고 가능한 플루리포텐트한)하고, 각막표면상피 또는 질상피와 같은 상피조직으로 분화할 수 있다는 것을 개시한다. 그러나, 이러한 방법의 단점은 그들이 힘이들고, 줄기세포의 수득률이 매우 낮다는 것이다.
세포군의 생체밖 확장에 대한 일반적으로 유용한 방법은 또한 힘이든다. 예를 들면, Emerson 등은(Emerson et al., U. S. Patent No. 6,326, 198 entitled "Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells", issued December 4, 2001); 인간 줄기세포 분열 및/또는 인간 조혈 전구 줄기세포의 최적화에 대한 생체밖 배양에 대한 방법과 배양 배지조건을 개시한다. 개시된 방법에 따라, 골수로부터 기인한 인간 줄기세포 또는 전구세포는 연속적으로 또는 정기적으로, 약 24 내지 48시간 주기 당 배양 ml당 배지 1ml의 속도로 교체되고, 바람직하게는 관류되는 액체 배양 배지에서 배양된다. 생리학적으로 가능한 조건하에서 배양을 유지하면서, 대사 산물은 제거되어지고 고갈된 영양분은 다시 채워진다.
Kraus 등은(Kraus et al., U. S. Patent No. 6,338, 942, entitled "Selective expansion of target cell populations," issued January 15, 2002) 미리 정해진 표적 세포군은 세포의 출발 샘플을 탯줄 혈액 또는 말초 혈액으로부터 성장 배지에 주입하고, 표적 세포 군의 세포를 분열되게 하고, 세포(CD34 세포와 같은)의 미리 정해진 군에 대한 특정 친화성을 갖는 결합하는 분자(CD34에 대한 단클론 항체)를 포함하는 선택 원소와 성장 배지 내 세포들을 접촉함으로써 선택적으로 확장될 수 있다고 개시한다.
Rodgers 등은 (U. S. Patent No. 6,335, 195 entitled "Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation", issued January 1, 2002) 조혈 및 중간엽 줄기 세포의 체외 배양과 안지오텐시노겐(angiotensinogen), 안지오텐신 I (AI), AI 유사물, AI 조각 및 이들의 유사물, 안지오텐신 II (AII), All 유사물, All 조각 또는 이들의 유사물 또는 All AT2 유형 2 수용체 작용제의 존재 하에서 단독으로 또는 다른 성장 인자 및 사이토카인과 병용하여 성장에 의한 계통-특정 세포 증식 및 분화의 유발에 대한 방법을 개시한다. 줄기 세포는 골수, 말초 혈액 또는 탯줄 혈액으로부터 기인된다. 그러나, 이러한 방법들의 단점은 줄기 세포의 증식과 분화를 유발하는 이러한 체외적인 방법(ex vivo method)은 앞서 설명한 바와 같이 시간이 많이 소비되고, 또한 결과로서 줄기세포이 낮은 수율이 나타난다는 것이다.
줄기 및 전구 세포는 암, 선천성 대사이상(inborn errors of metabolism), 혈색소병증 및 면역결핌증을 포함하는 다양한 장애의 치료에 사용되는 잠재력을 갖는다. 탯줄 혈액 또는 태반으로부터 줄기 세포를 포함하는 사용 및 연구의 하나의 중요한 분야는 골수 및 다른 관련된 이식에 대해서 적은 양의 세포를 발생시키는 그러한 세포를 사용해 왔다. 그러나. 현재까지, 실질적으로 많은 인간 CD34+또는 CD133+전구 세포와 같은 줄기 또는 전구 세포를 생산하는 방법을 기술한 사람은 없다. 특히, 많은 나중의 세포는 전구 세포를 사용하는 처리방법을 용이하게 할 것이다. 본 명세서에서 개시된 본 발명의 방법은 이러한 필요성을 제기한다.
비타민 A 및 레티노익 산(RA)과 같은 레티노이드는 줄기세포의 분화에 영향을 주는 것으로 알려져 왔다. 예를 들면, 레티노익 산은 비정상적으로 수임(만성 골수 백혈병) 조혈 줄기세포의 증식을 억제하고(Nadkarni 등, 1984, Tumori 70: 503-505), 전골수구 백혈병 세포에서 분화 및 자가-재생 능력의 상실을 유발하는 것(Melchner 등, 1985, Blood 66 (6):, 1469-1472)으로 알려졌다. 또한, 레티노익 산은 배아 줄기 세포로부터 뉴런의 분화를 유발하고, 자발 중배엽 분화를 억제하는 것으로 알려져 왔다(Slager et al., Dev. Genet. 1993; 14 (3): 212-24, Ray et al., 1997, J. Biol. Chem. 272 (30): 18702- 18708). 또한, 레티노익 산은 변환된 종자세포 전구체 (DAMJANOV et al., 1993, Labor. Investig. 68 (2): 220-232), 태반세포 전구체(Yan et al., 2001, Devel. Biol. 235: 422-432) 및 내피 세포 전구체(Hatzopoulos et al., 1998, Development 125: 1457-1468)의 분화를 유발하는 것으로 알려져 왔다. 그러나, 분화에 대한 레티노이드의 영향은 줄기 세포의 분화를 제어하는 조절할 수 있는 방법으로서 사용될 수 있도록 완전하게 이해되지는 않았다.
아미노프테린(aminopterin) 및 아메토프테린(amethopterin)(메토트렉세이트 :methotrexate)와 같은 폴릭 산 유사물의 조혈 줄기 세포의 분화에 대한 영향은 연구되어져 왔다. 폴릭산 유사물들은 급성 림프모구 빈혈 및 다른 혈액 증식 장애 및 암에서 화학요법제로서 사용되고, 줄기세포의 특정 군을 사멸시킴으로써 줄기세포의 분화에 영향을 나타내었고(DeLoia et AL., 1998, Human Reproduction 13 (4): 1063-1069), 따라서 환자에게 투여하기 위하여 다량의 줄기세포의 분화를 조절하는 효과적인 도구는 아니다.
또한, 적혈구 생성인자, 키트 리간드(Kit ligand), M-CSF 및 GM-CSF와 같은 단백질 뿐만 아니라, IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-11과 같은 여러 사이토카인은 조혈 계통에서 특정 세포 유형으로 줄기세포의 분화가 이루어지는 것이 알려졌으나(Dushnik-Levinson 등, 1995, Biol. Neonate 67:77-83), 이러한 과정은 잘 이해되지 않으며, 너무 조잡하고 막연하여 줄기세포의 분화를 조절하는 조절가능한 방법에 대해 허용하지 못하고 여전히 남아있다.
현재까지, 어느 누구도 줄기세포 또는 전구세포의 분화에 있어서 하기 논의되는 면역조절 화합물과 같은 화합물의 사용을 기술하지 않았다. 특히, 어느 누구도 CD34+ 전구세포와 같은 전구세포의 분화, 돌출세포 계통과 분리되어, 이식 면역 내성을 북돋우는데 유용한 능력을 조절하는 이러한 화합물의 사용을 밝힌 적은 없다. 마찬가지로, 어느 누구도 이러하 세포를 포함하는 약학적 조성물을 생산하기 위하여 전구세포 군을 확장하는 본 명세서에서 기술된 화합물의 사용을 기술하지 않았다. 이러한 확장된 전구세포 배양은 이식대숙주병의 치료와 면역 내성의 발달에서 유용할 것이다. 줄기 및 전구세포 분화에 걸친 조절은 치료적으로 유용한 세포 군을 생산할 수 있기 때문에, 돌기 세포 및/또는 과립 백혈구의 제어된 생산을 위하여 골수모양 돌기 세포 계통의 세포 또는 인간 CD34+또는 CD133+전구세포와 같은 초기 전구세포의 분화를 제어 및 조절하는 능력이 필요하다.
3. 본 발명의 요약
본 발명은 포유류, 특히 인간의 줄기세포 또는 전구세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 특정세포 및 조직 계통을 따라 인간 줄기세포의 분화와 성숙을 조절하고 제어하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 그러한 조절 또는 제어에 영향을 주는 면역조절 작은 유기 화합물, 보다 바람직하게는 아미노-치환된 이소인돌린, 특히 액티미드™(Actimid™) 또는 레비미드™(Revimid™) 화합물의 사용을 포함한다. 본 발명은 특정 방법으로 그들의 분화를 조절하기 위하여 특정 시간에서 전구세포에 이러한 화합물의 투여가 더 예상된다.
본 발명의 방법은 중간엽, 조혈, 아디포제닉(adipogenic), 헤파토제닉(hepatogenic), 신경성, 글리제닉(gliogenic), 연골형성(chondrogenic), 바소제닉(vasogenic), 근육성(myogenic), 연골형성 또는 골원성 계통을 포함하되 이에 한정되지는 않는 특정 세포 계통으로 줄기세포 또는 전구세포의 분화의 조절을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 조혈 계통의 세포로 줄기세포 분화의 조절을 포함한다.
또한, 본 발명은 특정 세포 유형, 예를 들면 중간엽 세포, 조혈세포, 지방세포(adipocyte), 간세포, 신경모세포, 아교모세포, 연골세포, 내피세포(EC) 전구체, 근육세포, 연골세포 또는 골모세포로 수임세포의 조절을 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 본 발명은 수임 조혈 전구세포에서 적혈구, 혈소판 또는 호중성 백혈구, 단핵세포, 마크로파지, 호산구, 호염기구, 마스트 세포, B-세포, T세포 또는 플라스마 세포와 같은 백혈구의 조절을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 조혈계통, 특히 CD34+, CD133+, 및 CD45+조혈 계통의 세포로의 줄기세포의 분화를 조절하는 것과 그러한 세포들을 포함하는 예방적으로 또는 치료적으로 유익한 약학적 조성물을 생산하는 방법에 관계된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 돌기세포 계통 또는 과립백혈구 계통, 내피계통 또는 카디오미오사이트(cardiomyocyte) 계통의 세포로의 초기 전구세포의 분화를 조절하는데 관련된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 전구세포의 조혈 계통, 특히 돌기세포 또는 과립백혈구 계통, 내피계통, 신경계통 또는 카디오미오사이트 계통으로의 분화를 조절하는데 방법을 제공한다. 특정 실시예에서, 상기 전구세포는 CD34+ 또는 CD133+ 세포이다. 그러한 조절은 본 발명의 화합불로 배양하는 동안 전구세포를 접촉함으로써 이루어진다. 하나의 실시예에서, 상기 화합물은 TNF-알파 활성의 억제제이다. 보다 특정한 실시예에서, 상기 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 면연조절 화합물, 또는 탈리도마이드(thalidomide) 또는 보다 바람직하게 아미노-치환된 이소인돌린이다. 더욱 더 특정한 실시예에서, 상기 화합물은 액티미드™ 또는 레비미드™이다.
다른 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 전구세포의 돌기세포로의 분화를 억제하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 그러한 전구세포의 확장된 배양을 산출하기 위한 배양의 처음 6일동안 전구세포의 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 과립백혈구로의 초기 전구세포 발달의 촉진을 포함하는데, 이것은 감염에 대항하는데 유용할 수 있다. 전구체(CD15+)에 수임 과립백혈구(granulocyte) 계통의 증가는 암 화학치료법의 가장 일반적인 투여 제한 독성을 나타내는 호중성 백혈구 감소증 및 연속적인 감염성 합병증의 감소에서 잠재적인 사용이 가능하다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 돌기세포 분화를 억제하는데 사용될 수 있는데, 이것은 이식대숙주병의 영향을 완화시키는데 유용하다.
본 발명의 전구세포는 본 발명의 화합물에 의해 조절되므로 이식(즉, 조혈 재건)에 유용하고, (이자, 심장, 간, 신장, 간, 뇌, 폐, 방광, 장 또는 근육세포와 같은) 세포 및 조직 대체의 재생가능한 근원으로서 정상적인 노화, 손상 또는 심장병, 중풍, 파킨슨 병 및 알츠하이머 병과 같은 질명을 치료하기 위한 재생적 의학에 사용될 수 있다. 세포들은 또한 본 발명의 화합물의 작용을 중재하는 세포내 생화학적 경로의 결정에 유용할 것이다. 이러한 세포들은 또한 새로운 약물 및 독소를 측정하는데, 예를 들면, 잠재적인 항암 약물을 결정하기 위해서, 발생 결점의 근원을 이해하기 위해서 등 유용할 것이다.
본 발명의 방법은 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 발생을 증가시키고 단위 생산을 형성하는 전체 콜로니를 향상시키는 반면, 특별하게 적혈세포 또는 적혈구 콜로니(BFU-E 및CFU-E)의 발생을 억제하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 줄기 세포 및 CD34+ 전구세포와 같은 전구세포를 조절하는데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 골수 주입 속도를 향상시킴으로써 조혈 줄기세포 이식에 중요한 이익을 제공하는 콜로니 형성 속도를 촉진시키는데 사용될 수도 있다.
탯줄 혈액, 태반 및 다른 근원들로부터 분리된 줄기세포를 포함하되 이에 한정되지는 않는 어떤 포유류 줄기 세포는 본 발명의 방법에 따라서 사용될 수 있다. 줄기세포는 예를 들면, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니아피그, 고양이, 돼지, 양, 소, 말, 원숭이 등, 더욱 바람직하게는 인간인 어떤 포유류 종들로부터 분리될 수 있다. 줄기세포는 플루리포텐트 세포, 즉, 완전한 분화 다양성을 갖고, 자가-재생인 세포를 포함할 수 있고, 조직내에 잠재적 또는 침묵적으로 남아있을 수 있다. 또한 줄기세포는 멀티포턴트 세포 또는 수임 전구세포를 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 실시예에서, 본 발명은 정상임신기간이 다 찬 태반 내에 존재하거나 또는 그에 의해 후에 생성되는 생육가능하고, 침묵적이고, 플루리포텐트한 줄기세포를 사용하는데, 즉, 그러한 세포들은 성공적인 분만과 태반 압박방출, 태반의 실혈과 관류가 뒤따르며, 10억개 정도의 응집된 세포들의 생산과 재생을 가져오는데, 5000만 내지 1억개의 멀티포턴트 및 플루리포턴트 줄기세포를 산출한다. 그러한 세포들은 본 명세서에서 인간 태반 줄기세포 또는 배아유사 줄기세포를 의미한다.
본 발명의 하나의 특정 실시예에서. 세포, 예를 들면 골수에 또는 배아유사 줄기세포, CD34+ 또는 CD133+세포와 같은 전구세포, 플루리포텐트세포 및 멀티포텐트 세포를 포함하되 이에 한정되지는 않는 산후 관류 태반에 내부 세포는 본 발명의 화합물에 노출되고 분화가 유도된다. 내부세포는 시험관 내에서 증식될 수 있다. 다른 실시예에서, 원하는 세포 유형 또는 계통으로 분화가 일어나도록 내부 세포는 태반 및 배양배지로부터 모아질 수 있고, 적절한 조건 하에서 충분한 시간동안 시험관내에서 배양될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 줄기 또는 전구세포는 탯줄혈액, 말초혈액 또는 성인혈액과 같은 다른 근원으로부터 유래되고, 본 발명의 화합물에 노출되고 분화가 유도된다. 바람직한 실시예에서, 분화는 적절한 조건 하에서 충분한 시간동안 원하는 계통 또는 세포유형으로 분화가 일어날 수 있도록 분화가 수행된다. 본 발명의 화합물은 추가에 의해, 본래의 장소에 생성 또는 줄기 또는 전구세포가 본 발명의 화합물과 접축할 수 있는 어떤 다른 방식으로 분화/배양 배지에 사용된다.
본 발명의 화합물의 투여 시기가 CD34+전구세포의 분화에 심오한 영향을 미친다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시예에서, CD34+전구세포의 돌기세포로의 분화는 본 발명의 화합물과 배양의 첫날 전구세포의 접촉을 포함하는 방법에 의해 연기되거나 억제된다. 다른 실시예에서, CD34+ 전구세포로부터 CD1a+의 발달은 배양 첫날 본 발명의 화합물과 상기 전구세포의 접촉을 포함하는 방법에 의해 감소되거나 예방될 수 있다. 다른 실시예에서, CD34+ 전구세포로부터 기인한 CD1 a+세포군의 유지는 상기 화합물의 부존재하에서 6일간 상기 전구세포를 배양한 후에 본 발명의화합물과 상기 전구세포를 접촉함으로써 증가된다.
또한 본 발명은 CD34+ 및 CD133+과 같은 초기 전구세포의 분화를 조절하는 방법을 포함하는데, 증식 및 분화 시기 동안 다양한 시간에 전구세포와 하나 이상의 본 발명의 화합물을 접촉하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 단지 배양 첫날에 상기 세포와 하나 이상의 화합물의 접촉을 포함하는 전구세포의 분화를 조절하는 방법을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 배양의 첫날과 12일 사이의 어느 날에 한번 투여로 상기 화합물과 접촉된다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 0-12일 사이에 (0과 12를 포함하여) 다른 날에 상기 화합물과 적어도 두 번 접촉된다. 또 다른 실시예에서, 상기 세포는 증식 및/또는 분화 시기 중 하루에 두 번, 하루에 한번 또는 2일에 한번 하나 이상의 화합물과 접촉된다. 다른 실시예에서, 상기 접촉은 시험관 내에서 이루어진다. 또 다른 실시에에서, 상기 접촉은 대상물에 생체내에서 이루어진다. 더욱 바람직한 실시예에서, 상기 대상물은 인간, 비인간 포유류, 조류 또는 파충류이다.
요컨데, 본 발명의 화합물에 산후 관류된 태반에서 배양될 수 있는 내부 또는 외부 줄기 또는 전구세포의 노출은 태반내에서 세포가 배양되는 동안 일어날 수 있고, 또는 바람직하게는 세포가 재생되고 태반으로부터 제거된 후 시험관내에서 일어날 수 있다.
본 발명은 줄기 및/또는 전구 세포 발달의 조절자로서 TNF-알파 활성을 갖는 화합물의 사용을 포함한다. 특정 실시예에서, 화합물은 탈리도마이드 유사물, 액티미드™(Celgene Corp., Warren, NJ) 및 레비미드™(Celgene Corp., Warren, NJ)를 포함하되 이에 한정되지는 않는 IMiDs™으로 알려진 계통의 화합물과 같은 면역조절 화합물이다.
또한 본 발명은 질병을 치료하거나 예방하기 위하여 전처리된 줄기 또는 전구세포의 이식을 포함한다. 하나의 실시예에서, 이식에 필요한 환자는 또한 이식 전, 그동안 및/또는 그 후에 본 발명의 화합물이 투여된다.
본 발명은 본 발명의 방법으로부터 생산된 전구세포 또는 특정 세포 유형의 사용을 더 포함한다. 즉, 본 발명은 조혈 전구체의 분화로부터 만들어진 백혈구, 과립 백혈구 또는 돌기세포의 사용을 포함하는데, 상기 전구체의 분화는 본 발명의 화합물을 사용하여 조절되고 제어된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 줄기 세포 및 본 발명의 작은 분자 화합물 모두를 이들이 필요한 환자들에게 투여함으로써 생체내에서 줄기세포의 제어 또는 조절을 포함한다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 특히 상기 전구세포의 증식과 분화를 촉진하는 조건 하에서 배양의 처음 6일 동안 TNF-알파의 활성을 억제하는 것과 접촉된 CD34+ 또는 CD133+전구세포와 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 배양 6일 후 수집되고 냉동보존된 세포를 포함한다. 다른 특정 실시예에서, 약학적 조성물의 세포는 CD34+CD38-CD33- 또는 CD34+CD38-CD33+세포이다. 다른 특정 실시예에서, 세포와 접촉된 화합물은 본 발명의 면역조절 화합물 또는 탈리도마이드 또는 탈리도마이드 유사물이다. 다른 특정 실시예에서, 세포와 접촉된 화합물은 액티미드™ 또는 레비미드™이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 또한 CD34+ 또는 CD133+ 전구세포가 TNF-알파 활성을 억제하는 화합물과 접촉하는데, 여기서 상기 전구세포는 상기 전구세포의 증식과 분화를 허용하는 배양 조건하에서 배양 배지에서 6일간 배양되고; 배양 6일 후 상기 세포를 수집하고; 상기 세포가 약학적으로 수용가능한 운반체와 결합하는 것을 포함하는 약학적 조성물을 만드는 방법에 대해 제공한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 접촉은 배양 첫날에 실시된다. 본 발명의 다른 특정 실시예에서, 상기 접촉은 상기 배양 6일동안 적어도 두 번 실시된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 화합물은 본 발명의 작은 면역조절 화합물이다. 본 발명의 다른 특정 실시예에서, 상기 화합물은 액티미드™ 또는 레비미드™이다. 또 다른 특정 실시예에서, 상기 전구세포는 상기 배양 전에 다른 혈액 세포로부터 분리된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 배양 배지는 추가적으로 GM-CSF 및 TNF-알파를 더 포함한다. 본 발명의 더욱 특정한 실시예에서, 상기 액티미드™ 또는 레비미드™는 0.1 내지 10.0 μM 사이의 농도로 존재한다. 다른 더욱 특정한 실시예에서, 상기 액티미드™ 또는 레비미드™는 1.0 μM 농도에서 존재한다. 다른 특정 실시예에서, 상기 세포는 상기 수집 후에 냉동보존된다.
본 발명은 포유류 대상물에서 전구세포 군을 확장하는 방법을 더 제공하는데, 치료적으로 효과적인 양의 CD34+ 또는 CD133+전구세포 및 액티미드™ 또는 레비미드™를 상기 수용 포유류 대상물에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 상기 전구세포는 수용 포유류 대상물에서 분화된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 전구세포는 적혈구가 실질적으로 없는 세포 제제에서 상기 대상물에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 전구세포는 골수 세포, 태반세포, 탯줄혈액세포 또는 PBMCs를 포함하는 세포제제에서 수용 포유류 대상물에게 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 전구세포는 운반체와 결합하여 수용 포유류 대상체에 투여된다. 다른 특정 실시예에서, 상기 전구세포는 CD34+CD133+전구세포이다. 다른 특정 실시예에서, 전구세포는 관심있는 결합된 유전 물질을 발현한다.
본 발명은 또한 약학적 조성물로서 유용한 상기 방법에 의해 생산된 세포를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 냉동보존과 줄기세포상에 냉동보존제의 노출의 악영향을 중화하기 위하여 본 발명은 냉동보존하고 녹인 후 줄기세포 또는 전구세포, 예를 들면 CD34+전구세포를 조절하는 방법을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명은 증식 및 이동 능력이 있는 줄기세포상에 냉동보존제(예를 들면 DMSO)의 노출의 악영향을 중화하기 위하여 본 발명은 냉동보존하고 녹인 후 줄기세포를 조절하는 방법을 포함한다.
3.1. 정의
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생반응기(bioreactor)"라는 용어는 세포 증식, 생물학적 물질의 생산 또는 발현, 및 세포 조직, 오가노이드, 바이러스, 단백질, 폴리뉴클레오티드 및 미생물의 성장 또는 배양을 위한 생체밖 시스템을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "DC 세포"는 돌기세포를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "초기 전구세포"는 CD34+전구세포, CD133+ 전구세포 또는 포유류, 조류 또는 파충류 각각의 등가물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "배아 줄기세포"라는 용어는 주머니배(예를 들면, 4 내지 5일 성숙된 인간 배아)의 내부 세포군으로부터 유래되고, 플루리포턴트한 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "배아 유사(같은) 줄기세포(embryonic-like stem cell)"라는 용어는 주머니배의 내부 세포군으로부터 유래되지 않은 세포를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "배아 같은 줄기세포"는 또한 "태반 줄기세포"를 의미할 수 있다. 배아유사 줄기세포는 바람직하게 플루리포텐트하다. 그러나, 태반으로부터 얻어질 수 있는 줄기세포는 배아유사 줄기세포, 멀티포턴트 세포 및 수임 전구세포를 포함한다. 본 발명의 방법에 따라서, 일단 잔류 세포들은 제거하기에 충분한 시간동안 실혈되고 관류되어지면태반으로부터 기인된 배아유사 줄기세포는 분리된 태반으로부터 수집될 수 있다. 바람직하게, 배아유사 줄기세포는 비록 다른 포유류로부터 기인할 수 있을지라도 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 태반과 관련되어 사용되는 경우 "실혈된(exsanguinated)" 또는 "실혈(exsanguination)"은 태반으로부터 실질적인 모든 탯줄혈액을 제거 및/또는 배출하는 것을 의미한다. 본 발명에 따라서, 태반의 실혈은 예를 들면 배출, 중력 유발 유출, 마사지, 짜내기, 펌핑 등에 의해 이루어질 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 태반의 실혈은 태반을 태반의 실혈에 도움이 되는 항응고제와 같은 약품을 포함하거나 포함하지 않는 플루이드를 이용하여 관류, 린싱 또는 플러싱함으로써 더 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "관류한다(perfuse)" 또는 "관류(perfusion)"는 플루이드(fluid)를 기관이나 조직 위로 또는 통과하여 붓거나 또는 통과시키는 조작을 의미하는데, 바람직하게는 어떠한 잔류물, 예를 들면 부착되지 않은 세포를 기관이나 조직으로부터 제거하기 위하여 충분한 힘이나 압력으로 기관 또는 조직을 통하여 플루이드를 통과시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "관류액(perfusate)"은 기관이나 조직을 통하여 통과한 후 수집되는 플루이드를 의미한다. 바람직한 실시예에서, 관류액은 하나 이상의 항응집제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "내부 세포(endogeneous cell)"이라는 용어는 "외래가 아닌" 세포, 즉, 태반으로부터 유래된 자가 또는 자가조직의 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "외부 세포(exogenous cell)"는 태반 이외의 기관 또는 조직으로부터 기인된 "외래의" 세포, 즉 이종 유래의 세포 (즉, 태반 공여자 이외의 다른 근원으로부터 유래된 "비-자가 세포") 또는 자가조직의 세포(즉, 태반 공여자로부터 유래된 자가세포)를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "면역조절 화합물(immunomodulatory compound)"은 하기 5.3절에 개시된 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "오가노이드(organoid)"라는 용어는 표면 외관 또는 포유류 신체, 바람직하게는 인간 신체의 어떤 기관이나 샘처럼 실질적인 구조에서 비슷한 하나 이상의 세포 유형의 모임을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "멀티포텐트(multipotent) 세포"라는 용어는 포유류 신체의 약 260개 셀 유형의 어떤 작은 집합으로 성장하는 능력을 가진 세포를 의미한다. 플루리포텐트 세포와는 달리, 멀티포텐트 세포는 모두 세포 유형에서 벗어나서 형성되는 능력을 갖지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "플루리포텐트(pluripotent) 세포"라는 용어는 완전한 분화 다양성, 즉 포유류 신체의 약 260개 세포 유형의 어떤 것으로 성장할 수 있는 능력을 가진 세포를 의미한다. 플루리포텐트 세포는 자가재생할 수 있고, 조직 내에 잠재 또는 침묵으로 남을 수 있다. 토티포텐트 세포 (예를 들면 살균된 디플로이드 난세포)와는 달리, 배아줄기세포는 일반적으로새로운 주머니배를 형성할 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "전구세포(progenitor cell)"라는 용어는 특정 유형의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직을 형성하기 위하여 수임된 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "줄기세포"라는 용어는 조직과 기관의 특정화된 세포를 형성하기 위하여 무기한으로 재생산할 수 있는 마스터 세포를 의미한다. 줄기세포는 발달적으로 플루리포텐트 또는 멀티포텐트 세포이다. 줄기세포는 두개의 딸 줄기세포 또는 하나의 딸 줄기세포와 하나의 전구("통과") 세포를 생산하기 위해 나누질 수 있는데, 그런 다음 조직의 성숙한, 완전히 형성된 세포로 증식한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "토티포텐트 세포"라는 용어는 완전한 배아(예를 들면 주머니배)을 형성할 수 있는 세포를 의미한다.
5. 본 발명의 상세한 설명
본 발명은 본 발명의 화합물에 줄기 세포 또는 전구 세포들을 노출시키면 줄기 또는 전구 세포들이 특정한 군들의 전구 세포들로 또는 전구 세포들이 수지상 세포, 과립구 세포, 내피세포 또는 신경 세포와 같은 특정한 세포 타입으로 분화되는 것을 조절하는 조절가능한 수단을 야기한다는 예측하지 못한 발견에 부분적으로 기초한다. 상세하게는 본 발명의 화합물에 대한 줄기 또는 전구 세포의 노출은 CD34+, CD38+ 및 CD133+세포를 포함하는 조혈성 세포의 특정 군의 조절가능한 분화 및 팽창을 야기한다. 그러한 분화 조절은 세포 사멸에 의한 수율의 현저한 감소나 바람직하지 않은 세포 타입 또는 세포계없이 달성된다; 다른 말로 본 발명의 화합물은 하나 이상의 세포군의 아팝토시스를 야기하지 않는다. 더욱이 본 발명의 화합물에 조혈 전구 세포들을 노출은 특정 세포 타입들의 조절가능한 분화 및 팽창을 야기한다.
따라서 본 발명은 인간 줄기 세포 분화, 특히 CD34+조혈성 전구 세포 및 CD133+ 전구 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 전구 세포 군을 특정의 세포 및 조직 계통로 분화를 조절하는 TNF-알파 활성을 억제하는 작은 유기 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 조혈성 전구 세포를 TNF-알파 저해제 또는 길항제에 노출시키는 것을 포함하는 포유류, 조류 또는 파충류에 이식을 위한 인간 CD133+ 또는 CD34+ (특히 CD34+CD38- 세포)와 같은 초기 전구 세포를 팽창하는 방법을 포함하고, 여기서 저해제 또는 길항제는 작은 분자이다. 본 발명은 또한 뇌, 신장, 장 및 근육을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 이들 초기 전구 세포들로부터 다른 세포 타입을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 화합물은 또한 CD34+ 전구 세포로부터 수지상 세포의 분화를 억제하고 과립구 세포 분화를 촉진하는 작용을 한다.
본 발명과 혼합하여 사용될 수 있는 작은 분자 화합물의 예는 TNF-알파활성을 억제하는 화합물을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 방법에 사용된 화합물은 5.3에서 상술한다. 바람직한 실시예는 비록 탈리도마이드 가수분해 산물, 대사산물, 유도체 및 전구체가 사용될 수 있지만 탈리도마이드 아나로그이다. 특히 바람직한 실시예에서 본 화합물은 Actimid™ 및 Revimid™와 같은 IMiDs™(Celgene)이다.
본 발명의 방법은 원하는 세포계의 세포로 분화를 야기하기에 충분한 기간동안 본 발명의 화합물로 바람직하게는 인 비트로에서 줄기 또는 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기 또는 전구 세포들을 간엽, 조혈, 지방원성, 간원성, 신경성, 신경원성(gliogenic), 연골 원성, 혈관원성, 근원성, 골원성 계를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 특정한 세포 계로 분화를 조절하는 것을 포함한다. 특정한 실시예에서 줄기 또는 전구 세포의 조혈계 세포로의 분화가 조절된다. 특히 본 발명의 방법은 CD34+, CD133+, 및 CD45+ 조혈 전구세포에서 용량 의존적인 형태로 혈구 세포 콜로니 형성의 형성을 조절하는 곳에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 원하는 세포계의 세포로 분화를 야기하기에 충분한 기간동안 본 발명의 화합물로 바람직하게는 인 비트로에서 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는 CD34+ 전구 세포가 수지상 세포로 분화를 조절하는 것을 포함한다. 특정한 실시예에서 그러한 전구 세포가 수지상 세포로의 분화는 Actimid™ 또는 Revimid™ 또는 그것의 아나로그 또는 프로드러그로 세포를 접촉하여 조절된다. 또 다른 특정 실시예에서 CD34+ 전구 세포의 분화는 골수 계를 통한 분화 억제 및 과립구 계를 통한 분화 촉진을 조절한다. 더욱 특정한 실시예에서 CD34+ 전구 세포의 과립구 세포 계의 세포로의 분화는 상기 전구 세포들의 배양 첫날 본 발명의 화합물로 CD34+ 전구 세포를 접촉하는 것을 포함하는 방법을 통하여 조절된다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 포유류 줄기 또는 전구 세포는 제대혈 세포들("CB"세포들), 태반 및 다른 소스에서 분리된 줄기 세포들을 포함하나 이에 한정되지 아니한다. 줄기 세포들은 만능 세포 즉 조직 내에서 스스로 재생되고 휴지 또는 비활성을 유지할 수 있는 완전한 분화 다양성을 갖는 세포를 포함할 수 있다. 상기 줄기 세포들은 다기능 세포 또는 발생(committed)전구 세포들을 포함할 수 있다. 일 바람직한 실시예에서 본 발명은 다기능 또는 만능 줄기 세포들의 회수를 야기하는 성공적인 출산 및 태반 밀어내기, 방혈, 관류 후에 회수될 수 있는 전기간 태반 내에 존재하는 생존하고 비활성을 유지하는 다기능 줄기 세포들을 이용한다.
또 다른 실시예에서 전구 세포들은 특히 CD34+ 또는 CD133+와 같은 초기 전구 세포들이다. 바람직하게는 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포들은 인간 골수, 태반, 또는 제대혈로부터 유래한다. 다른 포유류로부터 온 이들 세포의 균등체도 사용될 수 있다. 예를 들어 쥐에서 Sca+ 전구세포들이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 조류 또는 파충류에서 온 초기 전구세포의 균등체도 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예에서 배아-유사 줄기 세포들, 전구 세포들, 만능 세포들 및 다기능 세포을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 태반 내생 또는 산후 관류된 태반에 의하여 생산된 세포들이 본 발명의 화합물에 노출되고 분리되고 관류된 태반에서 배양시에 분화가 유도된다. 산후 관류된 태반에서 증식된 내생적인 세포들이 수집될 수 있고/또는 생리활성 분자들이 관류액, 배양 배지 또는 태반 세포들 자체로부터 회수된다.
본 발명의 다른 실시예에서 산후 태반외의 다른 소스로부터 유래한 줄기 또는 전구 세포들이 본 발명의 화합물에 노출되고 인 비트로에서 배양시 분화가 유도된다. 따라서 본 발명은 본 발명의 화합물이 존재하고 원하는 분화에 적합한 조건 및/또는 배지하에서 줄기세포를 분화하는 것을 포함하는 포유류 줄기 세포들을 특정한 전구 세포들로 분화하는 방법을 포함한다.
더욱이 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 화합물이 존재하고 상기 분화에 적합한 조건 하에서 상기 전구 세포를 분화하는 것을 포함하는 특정한 전구 세포 군이 특정한 세포 타입으로 분화하는 것을 조정 또는 제어하는 방법을 포함한다. 대안적으로 줄기 또는 전구 세포는 본 발명의 화합물에 노출될 수 있고 후에 적당한 조건을 사용하여 분화될 수 있다. 적당한 조건의 예들은 인간 혈청으로 공급된 영양 배지 제제 및 성장 인자들로 공급된 MATRIGEL®과 같은 세포 배양 매트릭스를 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 증식 또는 분화 단계에서 배양 동안 여러 시간에서 본 발명의 화합물로 전구 세포를 접촉하여 생성될 수 있는 여러 세포 군들을 포함한다. 5.4 특히 5.4.2 이하를 참조.
특정 실시예에서 본 발명은 조혈 전구들의 이식전 컨디셔닝에서 조혈을 조절 및 제어하기 위하여 아마이드 및 이미드 작은 분자들 특히 탈리도마이드의 아미노 결합체를 채택하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 조혈 전구들의 엑스 비보에서 조혈을 조절 및 제어하기 위하여 작은 분자를 채택하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 인 비트로에서 화합물로 줄기 또는 전구 세포들을 배양하고 대상에 분화된 세포들을 직접 이식하는 것을 포함하는 인 비트로에서 줄기 또는 전구 세포 분화의 조절을 포함한다.
본 발명은 또한 그것이 필요한 환자에게 본 발명의 화합물 및 줄기 또는 전구 세포들을 투여하여 인 비보에서 줄기 또는 전구 세포 분화의 제어 또는 조절을 포함한다.
본 발명은 더욱이 질병을 예방 또는 치료하기 위하여 전처리된 줄기 또는 전구 세포들을 이식하는 것을 포함한다. 일 실시예에서 이식이 필요한 환자는 또한 이식 전, 이식 동안 및/또는 이식 후에 본 발명의 화합물이 투여된다. 다른 실시예에서 이식이 필요한 환자는 또한 예를 들어 탯줄 혈액 세포들, 성인 혈액 세포들, 말초 혈액 세포들 또는 골수 세포들과 같은 비처리된 줄기 또는 전구 세포들이 투여된다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법은 이미 이식된 줄기 세포에 대한 조절 효과를 야기하기 위하여 비조건화된 줄기 세포들 또는 전구 세포들의 수용체인 대상에 상기 화합물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시예에서 본 발명은 제대혈(또는 제대혈로부터 얻은 줄기 세포), 말초(즉 성인) 혈(또는 말초 혈로부터 얻은 줄기세포)을 이식하는 것을 포함하는 골수 이식을 포함하고, 여기서 제대혈 또는 줄기 세포들은 본 발명의 화합물로 전처리되었다. 더욱이 본 발명은 본 발명의 화합물의 존재하에서 분화된 조혈성 전구 세포들로부터 제조된 백혈구 세포들의 용도를 포함한다. 예를 들어 조혈성 전구의 분화에 의하여 생성된 백혈구 세포는 이식에 사용될 수 있거나 이식 전에 제대혈 또는 제대혈 줄기 세포들과 혼합될 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 얻어진 CD34+ 또는 CD133+와 같은 초기 전구 세포를 이식하는 것을 포함하는 골수 이식을 포함하고 여기서 상기 전구 세포들은 본 발명의 화합물로 전처리되었다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 주지상 전구체들은 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구체 세포들이다. 더욱이 본 발명은 본 발명의 화합물 존재하에서 분화된 CD34+ 전구세포에서 제조된 세포의 용도를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 화합물을 사용하여 CD34+ 전구세포의 분화에 의하여 생성된 CD34+CD38-CD33+ 전구 세포들, CD34+CD38-CD33- 전구체 세포들, 과립구 등이 이식에 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 사용하여 CD 133+ 세포들로부터 분화된 세포들 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 더욱이 줄기 세포에 대한 냉동 보존의 해로운 효과 및 냉동보존제에 대한 노출을 극복하기 위하여 줄기 세포를 컨디셔닝하고 냉동보존하고 해동하는 방법을 포함한다. 일부 실시예에서 본 발명은 줄기 세포들의 증식 또는 이동 활성에 대한 냉동보존제(예를 들어 DMSO)의 노출에 해로운 효과를 극복하기 위하여 줄기 세포를 컨디셔닝하고 냉동보존하고 해동하는 방법을 제공한다.
5.1. 줄기 세포들 및 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포들의 분화 조절
5.1.1. 줄기 세포들
본 발명은 인간 줄기 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 방법은 인 비트로에서 상기 화합물로 상기 줄기 세포들을 배양하고 대상에 분화된 세포를 직접 이식하는 것을 포함하는 인 비트로에서 줄기 또는 전구 세포 분화를 조절하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서 본 발명의 방법은 비조건화된 줄기 세포의 수용체인 대상에 상기 화합물을 운반하는 것을 포함하는 인 비보에서 줄기 또는 전구 세포 분화를 조절하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에 의하여 얻어진 배아-유사 줄기 세포들은 간엽, 조혈, 지방원성, 간원성, 신경성, 신경원성(gliogenic), 연골 원성, 혈관원성, 근원성, 골원성 계를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 특정한 세포 계로 분화가 유도될 수 있다.
일부 실시예에서 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 배아-유사 줄기 세포들은 이식 및 엑스 비보 처리 프로토콜에 서 사용하기 위하여 분화가 유도된다. 일부 실시예에서 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 배아-유사 줄기 세포들은 특정한 세포 타입으로 분화하기 위하여 유도되고 치료적 유전자 산물을 생산하기 위하여 유전공학적으로 조작된다. 특정한 실시예에서 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 배아-유사 줄기 세포들은 분화를 유도하는 작은 유기 분자와 같은 화합물로 배양되고 대상에 분화된 세포의 직접 이식이 수행된다. 바람직한 실시예에서 줄기 세포들의 분화를 제어 또는 조절하는데 사용되는 화합물들은 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이토카인, 올리고뉴크레오타이드 또는 핵산들이 아니다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 줄기 세포들은 제대혈 세포들, 태반 세포들, 배아 줄기 세포들, 배아-유사 줄기 세포들, 영양막 줄기 세포들, 전구 세포들, 골수 줄기 세포들 및 만능, 다기능 및 전능 세포를 포함하나 이에 한정되지 아니한다.
특히 본 발명의 방법은 간엽 줄기 세포외에 줄기 세포군을 특정한 조직계로 분화하는 것을 조절하는 것을 포함한다. 예를 들어 본 발명의 방법은 특정한 근골 재생 및 회복, 신혈관신생 및 심근, 골격근과 같은 특정한 근육 조직의 재군집(repopulation) 및 뇌, 철수, 간, 허파, 신장, 췌장을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 여러 기관의 혈관재생을 촉진하여 다기능 줄기 세포를 연골원성, 혈관원성, 근원성 및 골원성 계 세포로 분화하는 것을 조절하기 위하여 채택될 수 있다. 본 발명의 방법들은 다기능 줄기 세포를 지방원성, 연골원성, 골원성, 신경원성 또는 간원성 계로 분화하는 것을 조절하기 위하여 채택될 수 있다.
분화를 조절하기 위하여 사용된 약제는 태반 배양시에 세포들의 분화를 유도하기 위하여 산후 관류된 태반으로 공급될 수 있다. 대안적으로 상기 약제는 세포들이 수집되거나 태반으로부터 제거된 후에 인 비트로에서 분화를 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법들은 또한 이들 세포들이 조혈 계로 분화를 야기하기에 충분한 기간동안 본 발명의 화합물로 인 비트로에서 전구 줄기 세포들을 배양하는 것을 포함하는 전구 줄기 세포가 조혈 계의 세포로 분화를 조절하는 것을 포함한다. 특히 본 발명의 방법들은 CD34+, CD133+, 및 CD45+ 조혈 전구 세포에서 용량 의존적인 형태로 혈 세포 콜로니 형성의 형성을 조절하기 위하여 사용될 수 있다(용량에 대해서는 5.7 참조).
바람직하게는 본 발명의 방법들은 적혈구 세포 또는 조혈 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 특이적으로 억제하는 반면에 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성을 모두 증가시키고 전체 콜로니 형성 단위 생성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법들은 골수 접목의 속도 및 백혈구 및/또는 혈소판 생성의 회복을 촉진하여 조혈 줄기 세포 이식의 현저한 잇점을 제공하여 줄기 세포들의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있을 뿐 아니라 콜로니 형성의 속도를 촉진하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 예를 들어 신경 전구 세포 또는 신경 모세포가 감각 뉴런(예를 들어 레티날 세포, 후각 세포, 기계감각 뉴런, 화학감각 뉴런 등), 운동 뉴런, 피질 뉴런 또는 인터뉴런과 같은 특정한 뉴런 세포로 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 콜린작동성, 도파민작동성, GABA작동성 뉴런, 교 세포(수초를 생성하는 핍지신경교를 포함하는) 및 상의 세포(뇌실에 있는)을 포함하는 이에 한정되지 아니하는 세포 타입의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 실시예들에서 본 발명의 방법들은 심장의 퍼킨제 세포, 간의 담관 상피, 췌장의 베타-섬 세포, 신장 피질 또는 수질 세포들 및 눈의 망막 광수용체 세포들을 포함하나 이에 한정되지 아니하는 기관의 구성체인 세포의 분화를 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법들에 따라 얻어진 줄기 세포들의 분화상태의 측정은 세포 표면 마커들의 존재에 의하여 동정될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 배아-유사 줄기 세포는 OCT-4+ 및 ABC-pt 세포 표면 마커에 의하여 구별될 수 있다. 더욱 본 발명은 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2, SH3. SH4, OCT-4 및 ABC-p 마커를 갖거나 상기에서 언급한 바와 같이 CD34, CD38, CD45, SSEA3 및 SSEA4와 같은 세포 마커가 없는 배아-유사 줄기 세포들을 포함한다. 그러한 세포 표면 마커들은 당업계에서 알려진 방법들 예를 들어 후로우 사이토메트리 후에 세척 및 항-세포 표면 마커 항체로 염색하는 방법에 따라 결정된다. 예를 들어 CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위하여 세포들을 PBS로 세척하고 항-CD34 피코에리쓰린 및 항-CD38 후로르신 이소싸이오씨아나이트(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 이중염색하였다.
5.1.2. CD34+ 및 CD133+ 초기 전구 세포들
본 발명은 또한 인간 CD34+ 또는 CD133+ 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서 본 발명의 방법들은 인 비트로에서 상기 화합물로 줄기 세포들을 배양하고 대상에 배양된 세포들을 직접 이식하는 것을 포함하는 인 비트로에서 줄기 또는 전구 세포 분화의 조절을 포함한다.
본 발명의 방법들에 의하여 얻어진 전구 세포들은 CD34+ 전구 세포들, 골수 또는 과립구 계 및 CD133+ 세포들, 내피 또는 신경 세포 곌르 포함하나 이에 한정되지 아니하는 특정한 세포 계로 분화를 유도할 수 있다. 일부 실시예에서 전구 세포들은 이식 및 엑스 비보 치료 프로토콜에 사용되기 위하여 분화를 유도할 수 있다. 일부 실시예에서 전구 세포들은 특정한 세포 타입으로 분화하기 위하여 유도되고 치료적 유전자 산물을 생산하기 위하여 유전공학적으로 조작된다. 특정한 실시예에서 전구 세포들은 분화를 유도하는 작은 유기 분자와 같은 화합물로 배양되고 대상에 분화된 세포의 직접 이식이 수행된다. 바람직한 실시예에서 전줄기 세포들의 분화를 제어 또는 조절하는데 사용되는 화합물들은 폴리펩타이드, 펩타이드, 단백질, 호르몬, 사이토카인, 올리고뉴크레오타이드 또는 핵산들이 아니다. 또 다른 바람직한 실시예에서 전구 세포들은 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포로 분화를 야기한다.
바람직하게는 본 발명의 방법들은 적혈구 세포 또는 조혈 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 특이적으로 억제하는 반면에 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성을 모두 증가시키고 전체 콜로니 형성 단위 생성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법들은 골수 이식의 속도 및 백혈구 및/또는 혈소판 생성의 회복을 촉진하여 조혈 줄기 세포 이식의 현저한 잇점을 제공하며 줄기 세포들의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있을 뿐 아니라 콜로니 형성의 속도를 촉진하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 CD34+ 전구 세포들을 CD1a+ 세포 특히 CD86+CD1a+ 세포들로 분화하는 것을 감소하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 CD34+ 전구 세포들을 CD14+CD1a- 세포들로 분화하는 것을 저해하거나 감소하는데 사용될 수 있다. CD14+CDla-세포들은 피부 수지상 세포 또는 단핵구/마크로파지 전구 세포들이다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 동시자극 분자인 CD80 및 CD86의 CD34+ 전구 세포들을 증식하는 것에 대한 발현을 감소하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 증식하는 CD34+ 전구 세포들을 CD54brigh 세포들로 분화하고 CD54dim 세포들로 분화하는 것을 촉진하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 증식하는 CD133+ 세포들의 수를 증가시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 방법들은 증식하는 CD34+ 전구 세포들을 CD11c-CD 15+ 세포로 분화를 감소시키고, CD11c+CD 15- 세포로 분화를 증가시켜서 골수 수지상 세포 계에서 과립구 계로 분화를 이동시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법들에 따라 얻어진 줄기 세포들의 분화상태의 측정은 세포 표면 마커들의 존재에 의하여 동정될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 전구 세포는 CD34+ 및 CD133+ 세포 표면 마커에 의하여 구별될 수 있다. 더욱 본 발명은 대조군에 비하여 하나 이상의 상기에서 언급한 바와 같은 CD15, CD34, CD33, CD133, 또는 CD54dim을 포함하거나, 증가된 발현을 보이는 증식하는 전구 세포들을 포함한다. 본 발명은 대조군에 비하여 하나 이상의 HLA-DR, CD1a, CD11c, CD38, CD80, CD86, CD54bright 또는 CD14가 결핍되거나, 감소된 발현을 보이는 증식하는 전구 세포들을 포함한다. 바람직한 실시예에서 본 발명의 증식하는 전구 세포들은 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33-를 나타낸다. 그러한 세포 표면 마커들은 당업계에서 알려진 방법들 예를 들어 세척 및 항-세포 표면 마커 항체로 염색한 후에 후로우 사이토메트리하는 방법에 따라 결정된다. 예를 들어 CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위하여 세포들을 PBS로 세척하고 항-CD34 피코에리쓰린 및 항-CD38 후로르신 이소싸이오씨아나이트(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 이중염색하였다.
일부 실시예에서 분화된 세포들은 분화된 세포들의 패고사이틱(phagocytic) 능력을 규명하여 규명될 수 있다. 분화된, 또는 분화중인 세포의 패코사이토스 능력은 예를 들어 FITC로 덱스트란을 표지하고 공지된 방법들에 의하여 업테이크 양을 측정하여 측정할 수 있다. T 세포 자극하는 능력에 대하여 분화되고 분화하는 세포들의 능력은 항원-로딩된 세포와 T 세포를 혼합하고 T 세포 활성화의 레벨을 결정하는 혼합 백혈구 반응(MLR)에서 측정될 수 있다.
5.1.3. 세포들의 동정 및 특성화
일부 실시예에서 분화된 세포들은 차별적으로 발현되는 유전자들(예를 들어 관심있는 비분화된 전구 세포에서 유전자 풀 대 전구세포로부터 유래한 분화된 세포에서 유전자 풀을 규명하는)에 의하여 동정될 수 있다. 예를 들어 PCR과 같은 핵산 증폭 방법 또는 전사-기초한 증폭 방법(예를 들어 인 비트로 전사(IVT))가 예를 들어 폴리뉴크레오타이드 마이크로어레이의 사용에 의하여 세포의 여러 군들의 유전자 발현을 프로화일하는데 사용될 수 있다. 그러한 차별적인 유전자 발현을 프로화일하는 방법은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어 Wieland 외, Proc. Natl. Acad: Sci. USA 87: 2720-2724 (1990; Lisitsyn 외, Science 259: 946-951 (1993); Lisitsyn 외, Meth. Enzymology 254: 291-304 (1995); 미국특허 5,436, 142 ; 미국 특허 5, 501., 964; Lisitsyn 외, Nature Genetics 6: 57-63 (1994); Hubank 및 Schatz, 1994, Nucleic Acids Research 22: 5640-5648 ; Zeng 외, 1994, Nucleic Acids Research 22: 4381-4385 ; 미국특허 5,525, 471 ; Linsley 외, "RNA 증폭 방법"이란 제목의 미국 특허 6,271,002, 2001년 8월 7일 등록 ; Van Gelder 외, "프로모터를 이용한 유전자 조작 방법"이란 제목의 미국 특허 5,716,785, 1998년 2월 10일 등록; Stoflet 외, 1988, Science 239: 491-494,1988 ; Sarkar 외 Sommer, 1989, Science 244: 331-334; Mullis 외, 미국 특허 4,683, 195; Malek 외, 미국 특허 5,130, 238; Kacian 외 Fultz, 미국 특허 5,399, 491; Burg 외, 미국특허 5,437, 990; R. N Van Gelder 외. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,1663 ; D. J. Lockhart 외, 1996, Nature Biotechnol. 14,1675 ; Shannon, 미국 특허 6,132, 997; Lindemann 외, "감소 교잡화 및 차이 분석 방법"이란 표제의 미국 특허 6,235,503, 2001년 5월 22일 등록).
상업적으로 구입할 수 있는 키트들 예를 들어 유전자 발현을 프로화일하기 위한 젤-기초한 접근에 사용되는 키트들의 디스플레이 PROFILE™ 시리즈(Qbiogene, Carlsbad, CA)등이 사용가능하다. 상기 키트들은 진핵세포들에서 유전자 발현을 비교하기 위하여 Restriction Fragment Differential Display-PCR (RFDD-PCR)을 이용한다. 서브트랙티드(subtracted) 라이브러리에서 차별적으로 발현된 클론을 동정하기 위하여 PCR-Select Subtraction 키트(Clontech) 및 PCR-Select Differential Screening 키트(Clontech)도 사용될 수 있다. PCR-Select Subtraction 키트로 차별적으로 발현된 유전자들의 풀을 생성한 후에 PCR-Select Differential Screening 키트가 사용된다. 서브트랙티드 라이브러리는 테스터 및 드라이버 군으로부터 직접 합성된 프로브 서브트랙티드 cDNA에서 제조된 프로브 및 역-서브트랙티드 cDNA(역으로 수행된 2차 서브트랙션)에서 제조된 프로브로 교잡화하였다. 드라이버 프로브가 아니라 테스터와 교잡하는 클론들은 다르게 발현되지만 비-서브트랙티드한 프로브들은 적은 메세지를 검출하기에 충분한 만큼 민감하지 않다. 서브트랙티드 프로브들은 차별적으로 발현되는 cDNA들이 매우 풍부하나 가짜 양성 결과를 줄 수 있다. 제조업자(Clontech) 지시에 따라 양 서브트랙티드 및 비-서브랙티드 프로브들을 모두 사용하여 차별적으로 발현되는 유전자들을 동정한다.
또 다른 실시예에서 분화된 줄기 또는 전구 세포들은 당업계에게 통상적으로 알려진 예를 들어 Mesen Cult 배지(Stem Cell Technologies, INC., Vancouver British Columbia)와 같은 콜로니 형성 단위 분석에 의하여 동정되고 규명된다.
줄기 세포 또는 전구가 특정한 세포 형태로 분화되는 것을 결정하는 것은 당업계에게 통상적으로 알려진 방법 예를 들어 후로우 사이토메트리 또는 면역염색화학법(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-마커 항체들로 세포들을 염색), 광 또는 위상차 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사하거나 PCR 및 유전자 발현 프로화일과 같은 통상의 방법을 사용하여 유전자 발현의 변화를 측정하는 것과 같은 기술을 사용하여 형태나 세포 표면 마커들의 변화를 측정하는 방법에 의하여 달성될 수 있다.
5.2. 줄기 및 전구 세포 군들.
본 발명은 인간 줄기 세포 분화를 조절하는 방법을 제공한다. 제대혈 세포들, 말초 혈, 성인 혈, 골수, 태반, 간엽 줄기 세포들 및 다른 소스를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 임의의 포유류 줄기 세포들이 본 발명의 방법들내에 사용될 수 있다.비 바람직한 실시예에서 상기 줄기 세포들은 배아 줄기 세포 또는 태반외 다른 소스로 분리된 세포들이다.
간엽 줄기 세포들의 소스는 골수, 배아 난황낭, 태반, 제대혈, 태아 및 청소년 피브 및 혈을 포함한다. 골수 세포들은 예를 들어 장골능, 훼모라(femora), 티비애(tibiae), 척추, 갈비 또는 다른 수질 공간들에서 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 줄기 세포들은 만능 세포 즉 조직 내에서 스스로 재생되고 휴지 또는 비활성을 유지할 수 있는 완전한 분화 다양성을 갖는 세포를 포함할 수 있다. 상기 줄기 세포들은 다기능 세포 또는 단분화성 혈구 발생(committed)전구 세포들, 소섬유아세포(fibroblastoid) 세포를 포함할 수 있다. 일 바람직한 실시예에서 본 발명은 다기능 또는 만능 줄기 세포들의 회수를 야기하는 성공적인 출산 및 태반 밀어내기, 방혈, 관류 후에 회수될 수 있는 전기간 관류된 태반에서 분리된 생존하고 비활성을 유지하는 다기능 줄기 세포들인 줄기 세포를 이용한다.
줄기 세포군들은 상업적인 서비스를 통하여 얻어진 태반 줄기 세포들 예를 들어 LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ), ViaCord (Boston MA), Cord Blood Registry (San Bruno, CA) 및 Cryocell (Clearwater, FL)를 포함할 수 있다.
줄기 세포군들은 또한 미국특허출원번호 20020123141(2002년 9월 5일 공개, 제목은 '태반 줄기 세포 수집 방법") 및 미국특허출원번호 20030032179(2003년 2월 13일 공개, 제목은 "산후 포유류 태반 및 그것의 용도 및 그것으로부터 태반 줄기 세포들")에 기재된 방법에 따라 수집된 태반 줄기 세포를 포함할 수 있다.
일 실시예에서 제대혈로부터 얻은 줄기 세포가 사용될 수 있다. 태반으로부터 온 혈의 첫번 수집을 제대혈이라 하고 주로 CD34+ 및 CD38+ 전구 세포를 포함한다. 산후 관류의 첫 24시간내에 고농도의 CD34+CD38- 조혈 전구세포가 태반으로부터 분리될 수 있다. 약 관류 24시간 후에 고농도의 CD34-CD38- 세포들이 태반으로부터 상기 언급한 세포를 따라서 분리될 수 있다. 분리된 관류된 본 발명의 태반은 CD34+CD38-줄기 세포 및 CD34-CD38+ 줄기 세포들이 풍부한 많은 양의 줄기 세포들의 공급원을 제공한다: 24시간 또는 그 이상 관류된 분리된 태반은 CD34- 및 CD38- 줄기 세포가 풍부한 많은 양의 줄기 세포들의 공급원을 제공한다.
본 발명에서 사용되어지는 바람직한 세포는 방혈된 관류된 태반 또는 배아-유사 태반 줄기 세포들로부터 유래한 배아-유사 줄기 세포들이다. 본 발명의 배아-유사 줄기 세포는 후로우 사이토메트리 및 면역 조직화학염색과 같은 기술을 사용한 세포 표면 마커 및 형태의 변화 및 PCR과 같은 기술을 사용한 유전자 발현의 변화를 측정하여 규명할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 그러한 배아-유사 줄기 세포는 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, SH2, SH3, SH4, OCT-4 및 ABC-p와 같은 세포 표면 마커들의 존재 또는 CD34, CD38, CD45, SSEA3 및 SSEA4와 같은 세포 표면 마커들의 부재에 의하여 규명될 수 있다. 바람직한 실시예에서 그러한 배아-유사 줄기 세포는 OCT-4 및 ABC-p와 같은 세포 표면 마커들의 존재에 의하여 규명될 수 있다. 그러한 세포 표면 마커들은 당업계에서 알려진 방법들 예를 들어 후로우 사이토메트리 후에 세척 및 항-세포 표면 마커 항체로 염색하는 방법에 따라 결정된다. 예를 들어 CD34 또는 CD38의 존재를 결정하기 위하여 세포들을 PBS로 세척하고 항-CD34 피코에리쓰린 및 항-CD38 후로르신 이소싸이오씨아나이트(Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 이중염색하였다.
배아-유사 줄기 세포는 배아에서 유래한 것이 아니라 배아 줄기 세포의 특징을 갖는 태반에서 유래한다. 다른 말로 본 발명은 산후 관류된 태반으로부터 분리된 비분화된 줄기 세포들인 OCT-4+ 및 ABC-p+ 세포의 사용을 포함한다. 그러한 세포들은 인간 배아 줄기 세포들로 유용(즉 만능)하다. 상기에서 언급한 바와 같이 다수의 여러 만능 또는 다기능 줄기 세포들은 여러 시간에서 관류된 태반 예를 들어 CD34+ CD38+, CD34+ CD38- 및 CD34-CD38- 조혈세포로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 인간 태반이 배아-유사 줄기 세포의 공급원으로 산후에 사용된다.
예를 들어 자궁에서 밀어낸 후에 태반은 아폽토시스를 예방하거나 감소하기 위하여 가능한한 빠르게 방혈한다. 그 후에 방혈 후 가능한 빠르게 태반은 기관에 존재하는 다른 물질 인자, 단백질, 잔류 세포들 및 피를 제거하기 위하여 관류한다. 물질 찌거기도 태반으로부터 제거될 수 있다. 관류는 통상적으로 적어도 2에서 24시간 이상 동안 적당한 관류액을 가지고 계속한다. 몇몇 부가적인 실시예에서 태반은 적어도 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22 시간 동안 관류한다. 다른 말로 본 발명은 충분한 시간동안 방혈 및 관류(perfusion)에 의하여 산후 태반의 세포들이 활성화될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서 본 태반은 의약 개발, 질병의 치료 및 예방, 특히 이식 수술이나 치료 및 발생된(committed) 세포, 조직 및 소기관의 생성을 포함하는 연구에 사용될 수 있는 배아-유사 줄기 세포의 풍부한 공급원으로 사용될 수 있다. 출원번호10/004, 942(2001년 12월 5일 출원, "태반 줄기 세포의 수집 방법") 및 출원번호 10/076,180(2002년 2월 13일 출원, "산후 포유류 태반, 그것의 용도 및 그것으로부터 태반 줄기 세포")를 참조.
배아-유사 줄기 세포들은 태반 동맥 및/또는 정맥을 이용하는 관류 기술을 사용하여 얻어진 태반으로부터 추출된다. 태반은 바람직하게 방혈 및 잔류 혈(잔류 제대혈)의 수집에 의하여 얻어진다. 얻어진 태반은 그 후에 회수되는 유조직 및 혈관외 공간 내에서 잔류하는 엑스 비보 내추럴 바이오리엑터 환경을 형성하기 위한 방법으로 가공된다. 배아-유사 줄기 세포들은 빈 마이크로순환으로 이동하고 거기서 본 발명에 따라서 그들은 수집되고 바람직하게는 관류에 의하여 수집된 혈관속으로 세척에 의하여 수집된다.
특히 본 발명의 일부로 생각되는 것은 CD34+ 및 CD133+ 전구 세포가 골수 세포, 특히 수지상 또는 과립상 세포로 조절이다. 최근 보고는 그러한 세포들이 만능이어서 본 발명은 이들 전구가 뇌, 신장, 장, 간 또는 근육 세포로 발생하는 것을 조절하는 것을 생각할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 사용될 수 있는 포유류, 조류 또는 파충류 CD34+ 또는 CD133+ 줄기 또는 전구 세포는 제대혈, 말초 혈 성인 혈, 골수, 관류된 태반을 포함하는 태반, 간엽 줄기 세포 및 다른 공급원을 포함하나 이에 한정되지 아니한다(출원번호 20030032179, 2003년 2월 13일 출원, "산후 포유류 태반, 그것의 용도 및 그것으로부터 태반 줄기 세포"를 참조). 바람직한 실시예에서 상기 줄기 세포는 조혈 줄기 세포들 또는 골수로부터 분리된 세포들이다. 그러한 세포들은 다른 조직 또는 기관으로부터 얻을 수 있으나 그러한 공급원은 덜 바람직하다.
일 실시예에서 제대혈 또는 산후 태반으로부터 온 전구 세포들이 사용될 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이 제대혈은 주로 CD34+ 및 CD38+ 조혈 전구세포를 포함한다. 산후 관류의 첫 24시간내에 고농도의 CD34+ CD38- 조혈 전구 세포들이 분리된 관류된 태반으로부터 분리될 수 있다. 약 24시간 관류 후에 고농도의 CD34+ CD38- 세포들이 상기언급한 세포들을 따라 태반으로부터 분리될 수 있다. 다른 실시예에서 전구 세포군은 LifeBank USA (Cedar Knolls, NJ), ViaCord (Boston MA), Cord Blood Registry (San Bruno, CA) 및 Cryocell(Clearwater, FL)과 같은 상업적인 서비스를 통하여 얻을 수 있다.
5.3. 본 발명의 화합물
본 발명에 사용되는 화합물들은 "면역모듈 화합물(immunomudulatory compounds)"로 지칭되는데, 라세미 화합물(racemic), 스테레오메릭하게 순수하거나 또는 스테레오메릭하게 풍부한 면역모듈 화합물과 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 하이드레이트, 스테레오아이소머, 포접 화합물과 프로드러그를 포함한다. 본 발명에 사용되는 바람직한 화합물은 프로테인, 펩타이드, 올리고사카라이드 또는 다른 거대분자가 아닌, 약 1000g/mol 이하의 분자량을 갖는 작은 유기 분자이다.
달리 언급하지 않았다면, 본 발명에서 사용된 "입체이성질체적으로 순수한(stereomerically pure)"이라는 용어는 어떤 화합물의 한가지 스테레오아이소머를 포함하되, 그 화합물의 다른 스테레오아이소머는 실질적으로 포함하지 않는(free) 조성물을 의미한다. 예를 들어, 하나의 키랄 중심을 갖는 화합물의 스테레오메릭하게 순수한 조성물은 실질적으로 그 화합물의 반대되는 이성질체을 실질적으로 함유하지 않을 것이다. 두개의 키랄 센터를 가진 화합물의 입체이성질체적으로 순수한 조성물은 실질적으로 그 화합물의 다른 디애스테레오머들이 없을 것이다. 달리 언급하지 않았다면, "에난티오머적으로 순수한(enantiomerically pure)"이라는 용어는 하나의 키랄 중심을 갖는 화합물의 스테레오메릭하게 순수한 조성물을 의미한다. 달리 언급하지 않았다면, "입체이성질체적으로 풍부한(stereomerically enriched)"이라는 용어는 어떤 화합물의 한가지 스테레오아이소머를 약 60중량% 이상, 바람직하게는 약 70중량% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80중량% 이상 함유하는 조성물을 의미한다. 여기서 사용된 "에난티오머적으로 순수한(enantiomerically pure)"이라는 용어는 하나의 키랄 중심을 갖는 어떤 화합물의 스테레오메릭하게 순수한 조성물을 의미한다. 유사하게, "에난티오머적으로 풍부한(enantiomerically enriched)"이라는 용어는 하나의 키랄 중심을 갖는 어떤 화합물이 스테레오메릭하게 풍부한 조성물을 의미한다.
여기서 달리 언급하지 않았다면, 여기에서 사용된 "면역모듈 화합물(immunomudulatory compounds)" 또는 "IMiDs™"(셀젠사)이라는 용어는 TNF-α와, 단핵세포인 IL1β 및 IL12를 유도하는 LPS를 현저히 억제하고, IL6 생산을 부분적으로 억제하는 작은 유기분자를 포함한다. 본 발명의 특정한 면역모듈 화합물이 아래 개시되어 있다. 이러한 화합물들은 예를 들어, 셀젠사로부터 구입할 수 있으며, 또는 여기에 나열한 특허나 문헌에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있다.
TNF-α는 격렬한 염증이 일어나는 동안 마크로파아지와 단핵세포에 의해 생산되는 염증성 사이토카인이다. TNF-α는 세포 내 신호의 다양한 영역을 책임진다. TNF-α는 암에서 병리학적 역할을 수행한다. 이론에 제한됨이 없이, 본 발명의 면역모듈 화합물에 의해 발휘되는 생물학적 효과 중의 하나는 TNF-α의 합성이 줄어드는 것이다. 본 발명의 면역모듈 화합물은 TNF-α mRNA의 분해를 증진시킨다.
더욱이, 특정 이론에 제한됨이 없이, 본 발명에 사용되는 면역모듈 화합물은 또한 T 세포의 잠재적인 공동-자극제(co-stimulator)이며, 세포 증식을 도스(dose)에 따라 극적으로 증가시킨다. 본 발명의 면역모듈 화합물은 CD4+ T 세포 아집단(subset)보다는 CD8+ T 세포에 대하여 더욱 큰 공동-자극 효과를 갖는다. 부가적으로, 상기 화합물은 항염증 성질을 갖으며 T 세포를 효율적으로 공동 자극하는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역모듈 화합물의 특정한 예로서, 미국 특허 제5,929,117호에 개시된 치환 스티렌의 시아노 및 카르복시 유도체; 미국 특허 제5,874,448호에 개시된 1-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피퍼리딘-3-yl)이소인돌린 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피퍼리딘-3-yl)이소인돌린; 미국 특허 제5,798,368호에 개시된 테트라 치환된 2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)-1-옥소이소인돌린; 미국 특허 제5,635,517호에 개시되어 있는 것들을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 1-옥소 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)이소인돌린류(예를 들어, 탈리도마이드 및 EM-12의 4-메틸 유도체); 미국 특허 제5,698,579호 및 제5,877,200호에 개시된 비폴리펩타이드 환상 아미드 클래스를 포함하며, 이에 한정되지 않는다. 전술한 특허의 모든 내용이 본 명세서에 레퍼런스로 통합된다. 본 발명의 면역모듈 화합물에는 탈리도마이드(thalidomide)가 포함되지 않는다.
본 발명의 다른 특이적 면역모듈 화합물로는 미국 특허 제5,635,517호에 개시되어 있으며, 본 명세서에 통합되는 벤조 링 내에서 아미노 또는 치환 아미노로 치환된 1-옥소- 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)이소인돌린이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 화합물은 다음의 구조(I)를 갖는다:
Figure pat00001
여기서, X와 Y 중의 하나는 C=O이고, X와 Y 중의 다른 하나는 C=O 또는 CH2이고, R2는 수소 또는 저급 알킬(특히 메틸)이다. 특정한 면역모듈 화합물은 다음 화합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다;
*1-옥소-2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)-4-아미노이소인돌린;
1-옥소-2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)-5-아미노이소인돌린;
1-옥소-2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)-6-아미노이소인돌린;
1-옥소-2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)-7-아미노이소인돌린;
*1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)-4-아미노이소인돌린; 및
1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)-5-아미노이소인돌린.
본 발명의 다른 특정한 면역모듈 화합물은 미국 특허 제6,281,230호; 제6,316,471호; 제6,335,349호; 제6,476,052호 및 국제특허출원 PCT/US97/13375(국제공개번호 WO 98/03502)에 개시된 바와 같이 치환된 2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)프탈이미드 및 치환된 2-(2,6-디옥소피퍼리딘-3-yl)-1-옥소인돌린의 클래스에 속한다. 이들은 본 명세서에 모두 통합된다. 이러한 클래스의 대표적인 화합물로는 다음 화학식으로 표시되는 화합물이 있다;
Figure pat00002
여기서, R1는 수소 또는 메틸이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 이러한 화합물들을 이성질체적으로 순수한 형태(예를 들어 광학적으로 순수한 (R) 또는 (S) 이성질체)로 사용되는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 특정한 면역모듈 화합물은 미국 특허출원 제10/032,286호 및 09/972,487호와, 국제출원 PCT/US01/50401(국제공개번호 WO 02/059106)에 개시된 이소인돌-이미드의 클래스에 속한다. 이들은 레퍼런스로 본 명세서에 통합된다. 이러한 클래스의 대표적인 화합물로는 다음 화학식 II의 화합물, 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 솔베이트, 포접 화합물, 이성질체, 디아스테레오머, 라세메이트, 및 이들의 스트레오아이소머의 혼합물을 포함한다;
Figure pat00003
여기서, X와 Y 중의 하나는 C=O이고, X와 Y 중의 다른 하나는 C=O 또는 CH2이고;
R1는 H, (C1 -C8)알킬, (C3 -C7)사이클로알킬, (C2 -C8)알케닐, (C2 -C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C0 -C4)알킬-(C1 -C6)헤테로사이클로알킬, (C0 -C4)알킬-(C2 -C5)헤테로아릴, C(O)R3, C(S)R3, C(O)OR4, (C1 -C8)알킬-N(R6)2, (C1 -C8)알킬-C(O)OR5, C(O)NHR3, C(S)NHR3, C(O)NR3R3', 또는 (C1 -C8)알킬-O(CO)R5;
R2는 H, F, 벤질, (C1 -C8)알킬, (C2 -C8)알케닐 또는 (C2 -C8)알키닐;
R3 및 R3'는 독립적으로 (C1 -C8)알킬, (C3 -C7)사이클로알킬, (C2 -C8)알케닐, (C2 -C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C0 -C4)알킬-(C1 -C6)헤테로사이클로알킬, (C0 -C4)알킬-(C2 -C5)헤테로아릴, (C0 -C8)알킬-N(R6)2, (C1 -C8)알킬-OR6, (C1 -C8)알킬-C(O)OR5, (C1 -C8)알킬-O(CO)R5;
R4는 (C1 -C8)알킬, (C2 -C8)알케닐, (C2 -C8)알키닐, (C1 -C4)알킬-OR5, 벤질, 아릴, (C0 -C4)알킬-(C1 -C6)헤테로사이클로알킬 또는 (C0 -C4)알킬-(C2 -C5)헤테로아릴;
R5는 (C1 -C8)알킬, (C2 -C8)알케닐, (C2 -C8)알키닐, 벤질, 아릴 또는 (C2 -C5)헤테로아릴;
각각의 R6는 독립적으로 H, (C1 -C8)알킬, (C2 -C8)알케닐, (C2 -C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C2 -C5)헤테로아릴, 또는 (C0 -C8)알킬-C(O)O-R5이거나, R6 그룹은 조인하여 헤테로사이클로알킬 그룹을 형성할 수 있다;
n은 0 또는 1이고; 및
*는 키랄-카본 중심을 나타낸다.
식 II의 특정 화합물에서, n이 0이고, R1이 (C3 -C7)사이클로알킬, (C2 -C8)알케닐, (C2 -C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C0 -C4)알킬-(C1 -C6)헤테로사이클로알킬, (C0 -C4)알킬-(C2-C5)헤테로아릴, C(O)R3, C(O)OR4, (C1 -C8)알킬-N(R6)2, (C1 -C8)알킬-OR5, (C1 -C8)알킬-C(O)OR5, C(S)NHR3, 또는 (C1 -C8)알킬-O(CO)R5이고;
R2는 H 또는 (C1 -C8)알킬이고; 및
R3는 (C1 -C8)알킬, (C3 -C7)사이클로알킬, (C2 -C8)알케닐, (C2 -C8)알키닐, 벤질, 아릴, (C0 -C4)알킬-(C1 -C6)헤테로사이클로알킬, (C0 -C4)알킬-(C2 -C5)헤테로아릴, (C5 -C8)알킬-N(R6)2, (C0 -C8)알킬-NH-C(O)OR5, (C1 -C8)알킬-OR5, (C1 -C8)알킬-C(O)OR5, (C1 -C8)알킬-O(CO)R5 또는 C(O)OR5; 및 다른 값들은 동일하게 한정된다.
식 2의 다른 특정한 화합물에서, R2는 H 또는 (C1 -C4)알킬이다.
식 2의 다른 특정한 화합물에서, R1는 (C1 -C8)알킬 또는 벤질이다.
식 2의 다른 특정한 화합물에서, R1는 H, (C1 -C8)알킬, 벤질, CH2OCH3, CH2CH2OCH3 또는
Figure pat00004
이다.
식 2의 또 다른 실시예에서, R1는
Figure pat00005
,
Figure pat00006
또는
Figure pat00007
이고, Q는 O 또는 S이고, R7는 각각 서로 독립적으로 H, (C1 -C8)알킬, 벤질, CH2OCH3 또는 CH2CH2OCH3이다.
식 II의 다른 특정한 화합물에서, R1는 C(O)R3이다.
식 II의 다른 특정한 화합물에서, R3는 (C0 -C4)알킬-(C2 -C5)헤테로아릴, (C1 -C8)알킬, 아릴 또는 (C0 -C4)알킬-OR5이다.
식 II의 다른 특정한 화합물에서, 헤테로아릴은 피피딜, 푸릴 또는 티에닐(thienyl)이다.
식 II의 다른 특정한 화합물에서, R1는 C(O)OR4이다.
식 II의 다른 특정한 화합물에서, C(O)NHC(O)의 H는 (C1 -C4)알킬, 아릴 또는 벤질로 대체될 수 있다.
본 발명의 면역모듈 화합물의 또 다른 실시예는 미국 특허출원 제09/781,179호, 국제공개번호 WO 98/54170호 및 미국 특허 제6,395,754호에 개시된 이소인돌-이미드의 클래스에 속한다. 이들 각각은 레퍼런스로 본 명세서에 통합된다. 대표적인 화합물로는 다음 화학식 III의 화합물, 그의 약학적으로 허용 가능한 염, 하이드레이트, 솔베이트, 포접 화합물, 이성질체, 디아스테레오머, 라세메이트, 및 이들의 스트레오아이소머의 혼합물을 포함한다;
Figure pat00008
여기서, X와 Y 중의 하나는 C=O이고, X와 Y 중의 다른 하나는 C=O 또는 CH2이고;
R은 H 또는 CH2OCOR이고;
(i) R1, R2, R3 또는 R4는 서로 독립적으로 할로겐 원소, 탄소수가 1 내지 4인 알킬 또는 탄소수가 1 내지 4인 알콕시 또는 (ii) R1, R2, R3 또는 R4 중의 하나가 니트로 또는 NHR5이고 R1, R2, R3 또는 R4 중의 나머지는 수소이고;
R5는 수소 또는 탄소수가 1 내지 8인 알킬이고;
R6는 수소, 탄소수가 1 내지 8인 알킬, 벤조, 클로로 또는 플루오로이고;
R'는 R7-CHR10-N(R8R9)이고,
R7는 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(CnH2n)-으로서 n은 0 내지 4이고;
R8 및 R9는 서로 독립적으로 수소 또는 탄소수가 1 내지 8인 알킬이거나, 또는 R8 및 R9가 함께 테트라메닐렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH2CH2[X]X1CH2CH2-로서 [X]X1은 -O-, -S-, 또는 -NH-이고;
R10는 수소, 탄소수가 1 내지 8인 알킬 또는 페닐이고; 및
*는 키랄-탄소 중심을 나타낸다.
본 발명의 가장 바람직한 면역모듈 화합물은 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피퍼리딜))-이소인돌린-1,3-디온 및 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-피퍼리딘-2,6-디온이다. 이러한 화합물은 표준적인 합성방법(미국 특허 제5,635,517호를 보라. 이 특허는 레퍼런스로 본 명세서에 통합된다)을 통하여 얻어질 수 있다. 상기 화합물로는 셀젠사, 워렌, NJ.로부터 구입하여 이용할 수 있다. 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피퍼리딜))-이소인돌린-1,3-디온(액티미드™)의 구조는 다음과 같다:
*
Figure pat00009
3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-yl)-피퍼리딘-2,6-디온(레비미드™)은 다음과 같은 화학구조를 갖고 있다:
Figure pat00010
5.4. 줄기 세포 배양의 방법
본 발명의 특정 실시예에서, 배아 줄기 세포, 배아-유사 줄기 세포, 전구 세포, 플러리포텐트(pluripotent) 세포, 토티포텐트 세포, 멀티포텐트 세포, 산후 관류 태반에 내재적(endogenous)인 세포, 탯줄 혈액 세포, 말초혈액 또는 성인 혈액으로부터 유래한 줄기 또는 전구 세포, 또는 골수 세포를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 줄기 또는 전구 세포는 본 발명의 화합물에 노출되고 분화되도록 유도된다. 이러한 세포는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 in vitro로 증식될 수 있거나, 선택적으로 산후 관류 태반 내에서 증식된다.
일정 실시예에서, 산후 관류 태반에 내재적인 세포는 태반 및 배양 매질로부터 모아지고, 적절한 조건 하에서 in vitro로 배양되며, 바람직한 세포 타입 또는 계통으로 분화를 유도하도록 충분한 시간 동안 배양된다. 미국특허출원 공개번호 제20030032179호, 2003년 2월 13일 발행, "Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom" 참조하기 바람. 상기 인용문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서 안에 포함된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 줄기 또는 전구 세포는 산후 관류 태반으로부터 유래되지 않는 대신에, 탯줄 혈액, 골수, 말초 혈액 또는 성인 혈액과 같은 다른 소스로부터 분리되고, 본 발명의 화합물에 노출되고 분화되도록 유도된다. 바람직한 실시예에서, 분화는 적절한 조건하에서 in vitro적으로 및 바람직한 계통(lineage) 또는 세포 타입으로 분화되도록 유도하기에 충분한 시간동안 행하여진다. 본 발명의 화합물은 추가적으로 in situ 생성, 또는 본 발명의 화합물과 줄기 또는 전구 세포와의 접촉을 가능하게 하는 어떠한 다른 방법으로 분화/배양 매질 내에서 사용된다.
다른 실시예에서, 예를 들어 in vitro에서 배양된 줄기 세포 또는 산후 관류 태반에서 배양된 줄기 세포와 같은 배양된 줄기 세포는 배양에서 증식되도록 예를 들어 에라이트로포이에틴, 사이토카인, 림포카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자(CSF), 인터페론, 케모카인, 인터루킨, 리간드를 포함하는 재조합 인간 조혈 성장 인자, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴(Tpo), 인터루킨, 및 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 또는 다른 성장 인자의 투여에 의하여 배양 내에서 증식되도록 자극된다.
배양된 세포의 모집 및/또는 분리 후에, 그들은 식별되고 콜로니 형성 유닛 분석법에 의해 특징지어 지는데, 그것들은 Mesen Cult™ medium (stem cell Technologies, Inc., Vancouver British Columbia)와 같이 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다.
In vitro로 줄기 또는 전구 세포를 배양하는 방법은 예를 들어 Thomson et al., 1998, Science 282: 1145-47 (배아 줄기 세포); Hirashima et al., 1999, Blood 93(4): 1253-63, and. Hatzopoulos et al., 1998, Development 125: 1457-1468 (표피 세포 전구체(endothelial cell progenitors)); Slager et al., 1993, Dev. Genet. 14 (3): 212-24 (신경 또는 근육 전구체(progenitors)); Genbachev et al., 1995, Reprod. Toxicol. 9 (3): 245-55 (cytotrophoblasts, 즉 태반 표피 세포 전구체); Nadkarni et al. 1984, Tumori 70: 503-505, Melchner et al., 1985, Blood 66 (6): 1469-1472, 국제 PCT 출원 제WO00/27999호, 2000년 5월 18일 발행, Himori et al., 1984, Intl. J. Cell Cloning 2: 254-262, and Douay et al., 1995, Bone Marrow Transplantation 15: 769-775 (조혈 전구 세포); Shamblott et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726-31 (원시 종자 세포); Yan et al., 2001, Devel. Biol. 235: 422-432 (영양막 줄기 세포)와 같은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다. 그러한 방법은 만약 전구 세포의 배양이 분화된 세포의 바람직한 군(들)을 생성하기 위하여 표시된 시간에 본 발명의 화합물로 세포를 배양하는 단계 또는 단계를 포함한다면 본 발명의 방법에서의 사용을 위하여 쉽게 적용될 수 있다.
5.4.1. 줄기 세포 in vitro 배양
본 발명의 방법은 대상(subject)에게 분화된 세포의 직접적 이식 후에 특정 바람직한 세포 계통의 세포로 세포들을 유도하도록 in vitro로 본 발명의 작은 유기 분자와 같은 화합물과 함께 세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기 세포 또는 전구 세포의 in vitro 조절을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 세포는 조혈 세포 계통으로 분화하도록 유도된다.
특정 실시예에서, 관심의 대상인 배양된 줄기 세포는 0.1ug/ml, 0.2ug/ml, 0.3ug/ml, 0.4ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml, 5ug/ml 또는 10ug/ml 농도의 본 발명의 화합물에 in vitro로 노출된다. 바람직하게는 관심의 대상인 세포는 약 0.005ug/ml 내지 약 5mg/ml의 탈리도마이드, 약0.005ug/ml 내지 약 5mg/ml의 Actimid™(Celgene Corp., Warren, NJ), 약 0.005ug/ml 내지 약 5mg/ml의 Revimid™(Celgene Corp., Warren, NJ) (5.7.장 "약학적 조성물" 참조)에 노출된다.
특정 실시예에서, 배아-유사 줄기 세포는 관류 용액 내로 영양제, 호르몬, 비타민, 성장 인자, 또는 그들의 어떠한 혼합물의 도입에 의해 태반 생반응기 내에서 증식하도록 유도된다. 혈청 및 다른 성장 인자는 증식 관류 용액 또는 매질 내로 첨가될 수 있다. 성장 인자는 일반적으로 단백질이고 사이토카인, 림포카인, 인터페론, 콜로니 자극 인자(CSF), 인터페론, 케모카인, 및 인터루킨을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수도 있는 다른 성장 인자는 리간드를 포함하는 재조합 인간 조혈 성장 인자, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴(Tpo), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 백혈병 억제 인자, 기초 섬유아세포 성장 인자, 태반 유래 성장 인자 및 표피 성장 인자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
*관류 용액 내로 도입되는 성장 인자는 미분화된 배아-유사 줄기 세포, 수임된(committed) 전구 세포, 또는 분화된 세포(예를 들어 분화된 조혈 세포)의 증식을 자극할 수 있다. 성장 인자는 앞서 서술된 것처럼 면역글로블린, 호르몬, 효소 또는 성장 인자를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 생물학적 물질 및 생반응적(bioactive) 분자의 생성을 촉진할 수 있다. 배양된 태반은 사용된 매질을 제거하고, 방출된 세포를 분리시키고, 신선한 매질을 첨가하기 위하여 주기적으로 "공급되어야(fed)"한다. 배양된 태반은 오염의 가능성을 줄이기 위하여 멸균 조건에서 저장되어야 하고, 태반의 세포에 영양분의 충분한 공급을 유지하는 조건을 생성하도록 간헐적이고 주기적인 압력 하에서 유지되어야 한다. 태반의 관류 및 배양은 효율성과 증가된 수용량을 위하여 자동화 및 컴퓨터조절화 될 수 있음이 인식되어야 한다.
5.4.2. 전구 세포 in vitro 배양
본 발명의 방법은 또한 전구 세포, 특히 CD34+ 및 CD133+ 전구 세포의 발달의 조절 및 조정을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 전구 세포는 조혈 세포 계통으로 분화되도록 유도된다. 특정 실시예에서, 계통은 과립구 계통(lineage)이다. 대안적 실시예에서, CD133+ 세포는 내피 세포, 뇌 세포, 신장 세포, 간 세포 또는 내장관 세포로 분화되도록 유도된다.
전구 세포는 위에서 언급된 표준 방법에 의해 배양될 수 있다. 부가적으로, 전구 세포의 배양은 다양한 시기 또는 배양 동안의 시간 프레임에 세포를 접촉하여 전구 세포 분화를 다른 세포 계통으로 유도하는 것을 포함한다.
따라서, CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포를 배양하는 한 가지 방법으로, 세포는 0일에 줄기 세포 인자(SCF), Flt-3L, GM-CSF 및 TNF-알파를 포함하는 매질에 놓여지고, 6일 동안 배양된다. 6일째에, 세포는 GM-CSF와 TNF-알파를 포함하는 매질 내에 재-위치되고, 추가적으로 6일 동안 배양이 계속된다. 이러한 방법은 된다. 가지돌기 세포의 생성을 초래한다. 이러한 방법의 한 변형으로, 세포는 초기에 GM-CSF 및 IL-4를 포함하는 매질 내에 놓여지고, 6일째에 단핵구-조절 매질로 옮겨진다 (Steinman et al., 국제 PCT공개 제WO97/29182호 참조). 일군의 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포를 생성하기 위하여, 전구 세포는 0일에 본 발명의 화합물과 접촉하도록 놓여지고, CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포는 6일째에 모아진다.
발명자들은 본 발명의 화합물, 특히 Actimid™ 또는 Revimid™의 첨가의 시기가 CD34+ 세포의 특정 계통의 세포로의 분화의 경로, 및 CD133+ 세포의 분화에 실질적인 영향을 미친다는 것을 밝혀내었다. 표준 조건 하에서 배양된 CD34+ 전구 세포는 골수 발달 경로 또는 계통을 따른다. 즉 초기 플레이팅(즉 초기 배양 후) 12일 내에 가지 세포가 된다. 그러나 배양의 첫 6일 동안 몇몇 특정 시기 중 하나에서 본 발명의 화합물의 첨가는 이러한 경로를 실질적으로 변경한다. 예를 들어, CD34+ 세포, 특히 골수에서 유래한 CD34+가 본 발명의 화합물, 특히 Actimid™ 또는 Revimid™에 배양의 첫 일에 노출된다면, 골수 계통을 따른 분화는 억제되는데, 이것은 본 발명의 화합물에 노출되지 않은 (즉, DMSO에 노출된) 대조군과 비교하여 배양 6일째에 CD34+CD38- 세포의 수의 증가 및 CD1a+CD14- 세포의 수의 감소로 증명된다. 더욱이, 본 발명의 화합물에의 노출은 CD80 및 CD86과 같은 가지 세포 계통 내의 세포에 의해 발현되는 표면 마커를 발현하는 세포의 발달의 억제를 야기한다. 배양의 시작일, 또는 배양의 시작 일 후 3일까지 일정 포인트에서의 본 발명의 화합물과의 접촉은 CD34+ 전구 세포의 발달에 그러한 조절을 야기한다. CD34+ 세포 수의 증가는 본 발명의 화합물의 다회 투여가 0일 내지 6일 사이에, 예를 들어, 0일과 2일에 투여, 0일과 4일에 투여, 3일과 6일에 투여, 또는 2일, 4일, 및 6일에 투여로 주어지는 경우 증대된다.
본 발명의 특정 유용한 측면으로, CD34+ 전구 세포 배양의 첫 일에 본 발명의 화합물의 첨가, 및 12일 동안 노출의 지속은 세포 표면 마커로 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33-의 특정 조합을 발현하는 특정 전구 세포의 발달을 야기한다. CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 세포 군은 분화에 있어 중간(intermediate) 단계를 나타낸다. 이러한 군은 예를 들어 과립구 세포와 같은 빠르게-발달하는 일군의 조혈 계통 세포가 필요한 환자에게 쉽게 이식될 수 있는 확장가능한 일군의 전구 세포로써 유용하다. 다른 실시예에서, CD+ 세포는 증식 상(phase) (약 6일) 동안 표준 매질 (즉, Actimid™, Revimid™ 또는 이와 유사한 것에 노출되지 않은) 내 놓여지고, 배양되며, 그 후 Actimid™, Revimid™ 또는 이와 유사한 것을 포함하는 동일 또는 유사한 매질로 교체되고, 12일까지 배양을 계속한다. 이러한 실시예에서, 분화하는 세포는 전형적으로 CD80, CD86 및 CD14의 감소된 발현을 나타내지만, 대조군과 비교하여 CD1a+ 세포 군의 증가된 저항성을 야기한다. 그러한 분화 세포는 가지 세포가 되는 것이 막아지지 않는다. 다른 실시예에서, CD34+ 세포는 증식 상 (플레이팅 후 1-6일) 동안 적어도 연속된 3일 동안 Actimid™, Revimid™ 또는 본 발명의 다른 화합물로 처리된다. 다른 실시예에서, CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포는 두 번 또는 그 이상 플레이팅 후 첫 6일 동안 Actimid™, Revimid™ 또는 본 발명의 다른 화합물로 처리된다. 그러한 다회 처리는 CD34+ 또는 CD133+ 군 양쪽의 증식의 증가를 야기한다. Actimid™ 또는 본 발명의 다른 화합물을 이용한 다회 처리는 또한 CD34+ 전구 세포의 분화에 있어 CD11c+CD15- 계통으로부터 CD11c-CD15+ 계통으로의 이동을 야기한다. 즉 골수 가지 세포 계통으로부터 과립구 계통으로의 이동을 야기한다(도 6B).
배양 0일로부터 전구 세포의 처리, 특히 0일과 6일 사이의 다회 투여는 또한 CD133+ 전구 세포, 특히 CD34+CD133+ 전구체 군의 증가를 야기한다. CD133+ 세포는 CD34+ 서브셋(subset)과 동일한 방식으로 확장할 수 있고, 그들의 다계통 능력을 보유하고 있기 때문에 CD34 분리에 대안적인 조혈 마커이다(Kobari et al., J. Hematother. Stem Cell Res. 10 (2): 273-81 (2001) 참조). CD133+는 인간 태아 뇌 조직으로부터의 CD34-세포 내에 존재하고, 신생아 마우스 내로 주사될 때 유력한 주입(engraftment), 증식, 이동, 및 신경 분화를 보이는 것으로 보고 되어왔다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19:97(26):14720-5 (2000) 참조). CD133+ 조혈 줄기 세포는 NOD-SCID 마우스 내에서 증대된 클론원성 능력 및 높은 이식(engraftment)성을 가진 전구체 활성이 풍푸한 것으로 나타나 왔다.
전술한 사실들에도 불구하고, 본 발명의 화합물이 배양 3일 후에 증식하는 CD34+ 전구 세포와 접촉하도록 놓여진다면 (즉, 초기 배양 후 3-6일 사이의 일정 시기에), 증식 전구 세포, 이미 세포 표면 마커 CD1a의 발현을 시작한 증식 전구 세포는 DMSO-처리 대조군에 비하여 이러한 마커의 발현의 실질적으로 증가된 저항성을 보여준다. 세포독성이 이러한 증가된 저항성과 무관하다는 것을 인식하는 것은 중요하다. 즉, Actimid™을 이용한 처리는 다른 세포 군이 세포자멸사하도록 야기하지 않는다. 최종적인 효과는 존재하는 면역 능력의 유지 및 새로운 면역 능력의 발전이다.
따라서 본 발명의 방법의 일 실시예에서, CD34+ 세포의 가지 세포로의 분화는 CD34+ 전구 세포를 본 발명의 화합물과 배양 0일에 (즉, 배양의 첫째 날에) 접촉하는 것에 의하여 조절 (즉, 억제)된다. 다른 실시예에서, CD34+ 세포의 과립구 세포로의 분화는 CD34+ 전구 세포를 배양의 0일에 (즉, 배양의 첫째 날에) 본 발명의 화합물과 접촉하는 것에 의해 촉진된다. 다른 실시예에서, CD34+ 세포의 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포 군으로의 분화는 CD34+ 전구 세포를 배양의 첫 3일 동안 본 발명의 화합물과 CD34+ 전구 세포를 접촉하는 것에 의해 촉진된다. 다른 실시예에서, CD34+CD133+ 군은 전구 세포를 본 발명의 화합물과 배양 0일부터 6일까지 수회 접촉시켜 촉진 또는 증가된다. 다른 실시예에서, CD1a+ 세포 군의 저항성은 CD34+ 전구 세포를 본 발명의 화합물과 배양 6일째에 접촉시켜 촉진 또는 증가되는데, 여기에서 상기 CD34+ 세포는 CD1a 표면 마커를 나타내는 세포로 분화되고, 여기에서 상기 배양은 6일까지의 기간 동안 상기 화합물과 접촉하지 않는 것을 포함한다.
상기 실시예에서, Actimid™, Revimid™, 또는 관련된 화합물의 투여에 있어 적절한 변형이 in vivo적으로 전구 세포에 만들어 질 수 있음은 이해되어야 한다. 즉, 그러한 세포가 in vitro 전구 세포에게와 같이 환자 내로 이식 또는 인그래프트(engraft)될 수 있다.
본 발명의 방법은 줄기 세포 또는 전구 세포를 특정 바람직한 세포 계통의 세포로의 분화를 유도하기 위하여 in vitro로 본 발명의 작은 유기 분자와 같은 화합물과 세포를 배양하는 것을 포함하는 줄기 세포 또는 전구 세포 in vitro 분화의 조절과, 그 후의 대상에게 분화된 세포의 직접적 이식을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 세포는 조혈 세포 계통으로 분화된다. 대안적 실시예에서, CD133+ 세포는 내피 세포, 뇌 세포, 신장 세포, 간 세포, 또는 내장관 세포로 분화되도록 유도된다.
여기에서 설명된 방법은 포유류에서 유래된, 바람직하게는 인간에게서 유래된 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포의 사용을 위하여 예시된 것이나, 조류 또는 파충류 전구 세포의 사용을 위해서도 또한 예시된 것임이 인식되어야 한다. 그러나 본 발명의 화합물은 잠재적으로 다양하게 전구 세포가 유래된 종에 따라 포텐트(potent)하다. 배양 방법에 있어 몇몇의 변형도, 특히 투여된 화합물(들)의 농도와 관련하여, 그러므로 또한 예시된다. 예를 들어, 쥣과 기원의 전구 세포는 본 발명의 화합물 예를 들어 Actimid™과 같은 화합물에 덜 민감하고, 인간 기원의 전구 세포에서 1uM의 농도롤 얻을 수 있는 효과를 얻기 위해서는 더 높은 농도가 필요하다. 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 그러한 최적화가 통상적인 것임을 이해할 것이다.
5.5. 줄기 및 전구 세포의 유전 조작
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 따라 분화된 줄기 또는 전구 세포는 본 발명의 화합물에 노출되기 전에 또는 노출된 후에 예를 들어 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터를 사용하여, 또는 리포솜 또는 화학적 매개 DNA 업테이크(uptake)와 같은 기계적 수단을 사용하여 유전적으로 조작된다. 특정 실시예에서, CD34+ 전구 세포는 유전적으로 조작되고, 그 후 본 발명의 화합물로 처리된다; 더 특정적 실시예에서, 상기 화합물은 Actimid™, Revimid™, 또는 이들의 유사체이다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 본 발명의 화합물로 처리되고, 그 후 유전적으로 조작된다.
트랜스유전자를 함유하는 벡터는 예를 들어 트랜스펙숀, 트랜스포메이숀(transformation), 트랜스덕션, 일렉트로포레이션(electroporation), 감염(infection), 미세주사, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 리포솜, LIPOFECTIN™, 리소솜 융합, 합성 양이온 리피드, 유전자 건(gun) 또는 DNA 벡터 트랜스포터의 사용, 이러한 것은 트랜스유전자를 예를 들어 딸 배아-유사 줄기 세포 또는 배아-유사 줄기 세포의 분할에 의해 생성된 전구 세포와 같은 딸 세포에게 전달하는 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려진 방법에 의하여 관심 있는 세포 내로 도입될 수 있다. 포유류 세포의 트랜스포메이숀 또는 트랜스펙숀에 대한 다양한 기술에 관해서는 Keown et al., 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.을 참조하기 바람.
바람직하게는, 트랜스유전자는 기술이 세포 핵 막 또는 다른 존재하는 세포성 또는 유전적 구조를 파괴하는 것이 아닌 한 어떠한 기술을 사용하여도 도입된다. 일정 실시예에서, 트랜스유전자는 마이크로주사(microinjection)에 의하여 핵 유전 물질(nucleic genetic material)로 삽입된다. 세포 및 세포 구조물의 마이크로주사는 일반적으로 본 발명이 속한 분야에서 알려져 있으며 실행된다.
태반 내의 세포 배양과 같이 배양된 포유동물 세포의 안정한 트랜스펙숀을 위하여, 세포의 단지 작은 부분(fraction)이 외래 DNA를 그들의 유전체내로 통합한다. 통합(integration)의 효율성은 벡터 및 사용된 트랜스펙숀 기술에 달려있다. 인티그런트(integrant)를 식별하고 선택하기 위하여, 선택적 마커(예를 들어 항생제에 대한 저항성과 같은)를 코딩하는 유전자가 일반적으로 호스트 배아-유사 줄기 세포내로 관심 있는 유전자 서열과 함께 도입된다. 바람직한 선택적 마커는 G418, 히그로마이신(hygromycin) 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여한다. 도입된 핵 산으로 안정하게 트랜스펙숀된 세포는 약물 선택(drug selection)에 의하여 식별된다 (예를 들어, 선택적 마커 유전자를 포함한 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 죽는다). 그러한 방법은 특히 대상 또는 환자 내로 재조합 세포의 도입 또는 이식 전에 포유동물 세포 (예를 들어 배아-유사 줄기 세포) 내 동종의(homologous) 재조합을 포함하는 방법에 있어 유용하다.
많은 선택 시스템이 배아-유사 세포와 같은 변형된 호스트 줄기 세포, 또는 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포와 같은 전구 세포를 선택하기 위하여 사용될 수 있다. 특히, 벡터는 검출가능한 또는 선택가능한 일정 마커를 함유할 수 있다. 선택의 다른 방법은 herpes simplex 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), 하이포싼틴-구아닌(hypoxanthine-guanine) 포스포리보실 트랜스페라제(phosphoribosyltransferase) (Szybalska and Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026), 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라제 (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817)와 같은 다른 마커에 대한 선택을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유전자는 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포 내로 적용될 수 있다. 또한, 다음의 유전자에 대한 선택의 기초와 같이 항대사체(antimetabolite) 저항성이 사용될 수 있다: dhfr, 이것은 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여함 (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, 이것은 마이코페놀릭 산(mycophenolic acid)에 대한 저항성을 부여함 (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, 이것은 아미노글리코사이드 G-418에 대한 저항성을 부여함 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); 및 hygro, 이것은 히그로마이신에 대한 저항성을 부여함 (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147).
트랜스유전자는 관심 있는 세포의 유전체 내로 통합되는데(integrate), 바람직하게는 랜덤(random) 통합에 의해서다. 다른 실시예에서, 트랜스유전자는 예를 들어 직접적 동종 재조합(directed homologous recombination) (즉, 관심 있는 세포의 유전체 내의 관심 있는 유전자의 "넉-인" 또는 "넉-아웃"), Chappel, 미국특허 제5,272,071호; 및 PCT 공개 제WO91/06667호, 1991년 5월 16일 발행; 미국특허 제5,464,764호; Capecchi et al., 1995년 11월 7일 발행; 미국특허 제5,627,059호, Capecchi et al., 1997년 5월 6일 발행; 미국특허 제5,487,992호, Capecchi et al., 1996년 1월 30일 발행)와 같은 직접적인 방법에 의해서도 통합될 수 있다.
동종(homologous) 재조합을 통한 목표 유전자 조정을 거친 세포의 생성을 위한 방법은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다. 구성체(construct)는 적어도 바람직한 유전적 조절을 거친 흥미 있는 유전자의 일정 부분을 포함할 것이고, 목표 유전자자리(locus)와 동종인(homology)인 영역, 즉 호스트의 유전체 내에 목표 유전자의 내생의(endogenous) 복사와 같은 영역을 포함할 것이다. 동종 재조합을 위하여 사용된 방법과는 대조적으로, 무작위 통합을 위한 DNA 구성체는 재조합을 조절하기 위한 동종의 영역을 포함할 필요가 없다. 마커는 트랜스유전자의 삽입에 대한 양성 및 음성 선택을 수행하기 위하여 목표 구성체 또는 무작위(random) 구성체 내에 포함될 수 있다.
예를 들어 동종 재조합 배아 유사 줄기 세포, 내재적 태반 세포 또는 태반에서 배양된 외인성 세포와 같은 동종 재조합 세포를 생성하기 위하여, 목표 세포의 유전체에 내재적인 유전자 서열의 5' 및 3' 말단에 관심 있는 유전자가 플랭크(flank)된 동종 재조합 벡터가 제조되며, 이것은 벡터에 의해 운반되는 관심 있는 유전자와 목표 세포의 유전체 내의 내재적 유전자 사이에 동종 재조합이 발생하도록 한다. 추가적 플랭킹(flanking) 핵 산 서열은 목표 세포의 유전체의 내재적 유전자와 성공적인 동종 재조합을 위하여 충분한 길이이다. 일반적으로, 플랭킹 DNA(5' 및 3' 말단 양쪽)의 수 킬로베이스(kilobases)가 벡터에 포함된다. 동종 재조합 벡터 및 재조합 줄기 세포로부터 동종 재조합 동물을 구성하는 방법은 본 발명이 속한 분야에서 잘 알려져 있다 (예를 들어 Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51: 503; Bradley, 1991, Curr. Opin. Bio/Technol. 2: 823-29; 및 PCT 공개 번호 제WO90/11354호, 제WO91/01140호, 및 제WO93/04169호 참조).
특정 실시예에서, Bonadio et al.의 방법(미국특허 제5,942,496호, 제목: Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells, 1999년 8월 24일 발행; 및 PCT 제W095/22611호, 제목: Methods and compositions for stimulating bone cells, 1995년 8월 24일 발행)이 줄기 세포, 전구 세포 또는 예를 들어 골수 전구 세포와 같이 태반에서 배양된 외래의 세포와 같은 관심 있는 세포 내로 핵 산을 도입하기 위하여 사용된다.
5.6. 분화를 위하여 조정된 줄기 세포 및 전구 세포의 용도
5.6.1. 일반적인 용도
본 발명의 줄기 세포 및 CD34+ 및 CD133+ 전구 세포는 이식 및 ex vivo 치료 프로토콜에서의 사용을 위하여 분화되도록 유도된다. 일 실시예에서, 줄기 세포 군은 특정 세포 타입으로 분화되고 치료적 유전 프로덕트를 제공하도록 유전적으로 조작된다. 다른 실시예에서, 전구 세포 군은 초기 전구 세포로 팽창되고 치료적 유전 프로덕트를 제공하도록 유전적으로 조작된다. 다른 실시예에서, 전구 세포 군은 과립구와 같은 특정 세포 타입으로 분화되고, 치료적 유전 프로덕트를 제공하도록 유전적으로 조작된다.
본 발명의 화합물은 또한 이식의 목적이 질병 및/또는 임상적 마이에로아브레이션(myeloablation)으로부터 초래된 호중성백혈구감소증 및 백혈구감소증의 반전(reversal)과 같은 골수 백혈구 생성을 재복원하는 것인 임상적 세팅에서 유용성을 가진다. 본 발명의 화합물은 또한 초기 전구 세포 또는 과립구의 생성의 복원에 있어 유용성을 가지는데, 이는 질병, 다양한 알려진 치료적 부작용, 또는 마이에로아브레이션으로부터 초래된다. 본 발명의 화합물은 또한 때때로 골수 억제 없이 적혈구 생성의 억제가 바람직한 경우에 유용하다.
일정 실시예에서, 본 발명의 화합물로 처리된 줄기 세포는 그것이 필요한 환자에게 탯줄 혈액 또는 말초 혈액으로부터의 줄기 세포와 같은 비처리된 세포와 함께 투여된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 화합물로 처리된 CD34+ 또는 CD133+ 세포는 그것이 필요한 환자에게 탯줄 혈액 또는 말초 혈액으로부터의 줄기 세포와 같은 비처리된 세포와 함께 투여된다. 일 실시예에서, 본 발명의 화합물로 배양의 첫 일부터 처리된 CD34+ 전구 세포는 그것이 필요한 환자에게 비처리된 세포와 함께 투여된다. 더 특정 실시예에서, 운반된 전구 세포는 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포이다.
예를 들어 배아-유사 또는 조혈 줄기 세포와 같은 줄기 세포, 또는 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되며, 주사제로 제제화될 수 있다 (PCT 제WO96/39101호 참조, 이것은 그 전체가 인용에 의하여 본 명세서에 포함됨). 대안적 실시예에서, 세포 및 조직, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되며, 미국특허 제5,709,854호; 제5,516,532호; 또는 제5,654,381호에 개시된 것과 같은 폴리머화 또는 크로스 링킹 하이드로겔을 사용하여 제제화된다. 상기 문헌은 그 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
배아-유사 줄기 세포는 전형적으로 전구 세포가 사용되는 치료적 또는 연구적 프로토콜에서 특정 클래스의 전구 세포(예를 들어 연골세포, 간세포, 조혈 세포, 췌장 실질 세포, 신경세포, 근육 전구 세포 등) 대신에 사용될 수 있다.
5.6.2. 조직 대체 또는 보강
본 발명의 방법에 따라서 분화가 조절된 본 발명의 줄기 세포, 특히 배아-유사 줄기 세포, 및 전구 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포 군과 같은 바람직한 세포 군의 이식 또는 주입에 관한 다양한 치료적 프로토콜에 사용될 수 있다. 줄기 또는 전구 세포는 존재하는 조직을 대체 또는 보강하기 위하여, 새로운 또는 개조된 조직을 도입하기 위하여, 또는 생물학적 조직 또는 구조를 결합하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 태반으로부터의 배아-유사 줄기 세포와 같은 줄기 세포, 또는 조혈 전구 세포와 같은 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 일치되는 및 일치되지 않는 HLA 타입을 포함하는, 자가의 및 동종이형의(allogenic)의 조혈 이식물로써 사용될 수 있다. 동종이형의 조혈 이식물로써 배아-유사 줄기 세포의 사용에 있어, 미국특허 제5,800,539호, 1998년 9월 1일 발행; 및 미국특허 제5,806,529호, 1998년 9월 15일 발행에 개시된 것과 같은 공여 세포의 면역학적 거부를 줄이기 위하여 호스트를 처리하는 것이 바람직하다. 상기 문헌은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
예를 들어, 배아-유사 줄기 세포, 그들의 분화는 예를 들어 간, 췌장, 신장, 폐, 신경 시스템, 근육 시스템, 뼈, 골수, 흉선, 비장, 점막 조직, 생식선, 또는 머리털의 줄기 또는 전구 세포를 보강 또는 대체하는 것과 같은 치료적 이식 프로토콜에서 사용될 수 있는 본 발명의 방법에 따라 조절된다. 마찬가지로, 조혈 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 골수 또는 내피 전구 세포 대신에 사용될 수 있다.
예를 들어 배아-유사 줄기 세포와 같이, 줄기 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 연골, 힘줄, 또는 인대의 보강, 치료 또는 대체를 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 일정 실시예에서, 인공삽입물 (예를 들어 엉덩이 보철)은 본 발명의 배아-유사 줄기 세포로부터 성장한 대체 연골 조직 구조물로 코팅된다. 다른 실시예에서, 관절 (예를 들어 무릎)은 배아-유사 줄기 세포로부터 성장한 연골 조직 구조물로 재구성(reconstruct)된다. 연골 조직 구조물은 또한 다른 타입의 관절을 위한 다양한 재구성 수술에서 적용될 수 있다 (프로토콜에 관해서는 예를 들어 Resnick, D., and Niwayama, G., eels., 1988, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d ed., W. B. Saunders Co. 참조).
본 발명의 방법에 따라 처리된 줄기 세포 및 전구 세포는 질병으로부터 유래한 조직 및 장기의 손상을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 실시예에서, 환자는 예를 들어 화학요법 또는 방사요법 후에 면역 시스템을 자극하기 위하여, 심근경색 후에 심장 조직을 치료하기 위하여와 같이, 질병의 결과로 손상된 조직 또는 장기를 재생성 또는 회복시키기 위하여 환자는 배아-유사 줄기 세포를 투여 받을 수 있다. 본 방법에 따라, 본 발명의 면역조절 화합물로 처리된, 또는 본 발명의 면역조절 화합물과 함께 투여된 처리된 줄기 및/또는 전구 세포는 간의, 췌장의 또는 심장의 조직을 치료 및/또는 대체하기 위하여 그것이 필요한 개체에게 이식될 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 처리된 줄기 세포 및 전구 세포는 또한 골수 이식에 있어 골수 세포를 보강 또는 대체하기 위하여 사용될 수 있다. 인간 자가 및 동종이형의 골수 이식은 현재 백혈병, 림포마 및 다른 생명을 위협하는 장애와 같은 질병을 대한 치료로써 사용된다. 그러나 이러한 절차의 단점은 많은 양의 공여 골수가 그들이 이식을 위한 충분한 세포를 가지고 있는지 확인하기 위하여 제거되어야 한다는 것이다.
본 발명의 방법에 따라 모아진 배아-유사 줄기 세포는 많은 골수 기부에 대한 필요성을 감소시키는 줄기 세포 및 전구 세포를 제공할 수 있다. 작은 양의 골수 기부을 얻고, 그 후 수용자에게 주입 또는 이식하기 전에 태반에서 배양 및 확장을 통해 줄기 세포 및 전구 세포의 수를 확장하는 것 또한 본 발명의 방법에 따라서이다,
본 발명의 방법을 사용하여 얻어진 많은 수의 배아-유사 줄기 세포 및/또는 전구체는, 일정 실시예에서, 많은 골수 기부에 대한 필요성을 감소시킨다. 골수 이식에서 주입을 위하여 환자의 체중kg 당 약 1X108 내지 2X108개의 골수 단핵 세포가 주입되어야 한다 (즉 70kg 공여자에 대하여 약 70ml의 골수). 70ml를 얻기 위해서는 기부(donation) 프로세스에 있어 집중적인 기부 및 심각한 혈액의 손실을 필요로 한다. 특정 실시예에서, 작은 골수 기부(예를 들어 7-10ml)로부터의 세포는 수용자(recipient) 내로 주입하기 전에 예를 들어 태반 생반응기 내에서와 같이 증식에 의해 확장될 수 있다. 줄기 세포, 및 전구 세포, 특히 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 따라서 대량의 골수 기부에 대한 필요성을 감소 또는 제거하는 줄기 및/또는 전구 세포를 제공할 수 있다.
태반으로부터 분리된 배아-유사 줄기 세포는, 특정 실시예에서, Tay-Sachs, Niemarm-Pick, Fabry's, Gaucher's, Hunter's, Hurler's 신드롬과 같은 리소솜 축적병 및 다른 강들리오시드증, 점액다당류증, 및 글리코겐증을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 특정 질병 또는 질환을 치료하는 자가 또는 이종유래 효소 대체 치료에서 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 세포는 아드레노류코이상증(adrenoleukodystrophy), 낭 섬유증, 글리코겐 축적 질환, 갑상샘저하증, 낫 적혈구 빈혈, Pearson 신드롬, Pompe 병, 페닐케토뇨증(PKU), 및 Tay-Sachs 질환, 포르파린증, 단풍시럽뇨병, 호모시스틴뇨증, 점액다당류증, 만성 육아종 질명, 및 티로신혈증을 치료하기 위한 유전자 치료에서 자가 또는 이종유래 트랜스유전자 운반체로써, 또는 암, 종양 또는 다른 병적 상태를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 세포는 각막 표피 상해, 연골 수복(repair), 얼굴 박피술, 점막, 고막, 내장 내층, 신경학적 구조(예를 들어 망막, 기저막의 청각 신경, 코 표피의 후각 신경), 화상 및 피부, 두피 (머리털) 이식의 외상적 손상에 대한 상처 치료를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 대체 치료 또는 프로토콜의 자가 또는 이종유래 조직 재생성, 또는 질병이 있는 장기 또는 조직의 재구성을 위하여 사용될 수 있다.
더욱이, 작은 수의 줄기 세포 및 전구 세포는 일반적으로 혈류 내에서 순환한다. 다른 실시예에서, 그러한 외래의 줄기 세포 또는 외래의 전구 세포는 혈액이 회수되고, 하나 또는 그 이상의 성분이 선택적으로 제거되고, 혈액의 남은 부분이 공여자로 다시 재주입되는 절차인 성분채집술(apheresis)에 의해 모아진다. 성분채집술에 의해 모아진 외인성 세포는 본 발명의 방법에 따라 확장되고, 따라서 골수 기부에 대한 필요성을 완전히 제거한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 따른 조혈 전구 세포의 확장은 화학요법에 더하여 보충적 치료로써 사용된다. 암 세포를 타켓으로 하여 암 세포를 파괴하기 위해 사용되는 대부분의 화학요법 성분은 모든 증식 세포, 즉 세포 분할을 수행하는 세포를 죽여서 그 효과를 나타낸다. 골수는 체내에서 가장 활발히 증식하는 조직 중의 하나이기 때문에, 조혈 줄기 세포는 종종 화학요법 성분에 의해 손상되거나 파괴되며, 결과적으로 혈액 세포 생성이 감소하거나 중단된다. 화학요법치료는 환자의 조혈 시스템이 화학요법치료를 재시작하기 전에 혈액 세포 공급을 보충하도록 하기 위하여 주기적으로 중단되어야 한다. 원래 무활동의(quiescent) 줄기 세포가 화학요법치료를 다시 재개할 정도의 수치까지 백혈구 수치를 증식하고 증가시키기 위해서는 한달 또는 그 이상의 시간이 걸린다(다시 때, 골수 줄기 세포는 파괴된다).
화학요법 치료 사이에 혈액 세포는 재생성 되는 반면, 그러나, 암은 자라고 자연적 선택에 의하여 화학요법 약물에 저항성이 될 수도 있는 시간을 가진다. 그러므로 화학요법치료가 길수록, 치료 사이의 기간이 짧을수록, 암을 성공적으로 사멸할 가능성은 커진다. 화학요법치료 사이의 시간을 줄이기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 분화된 배아-유사 줄기 세포 또는 전구 세포는 환자에게 도입될 수 있다. 그러한 치료는 환자가 낮은 혈액 세포 수를 보이는 시기를 줄이고, 그러므로 화학요법 치료의 빠른 재개를 가능하도록 한다.
다른 실시예에서, 인간 태반 줄기 세포는 만성 육아종 질환과 같은 유전적 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
5.6.3. 염증의 경감
줄기 및 전구 세포, 그들의 분화는 본 발명의 방법에 따라 조절되는데, 일반적인 항-염증 성분으로 사용될 수 있다. 발명자들은 줄기 및 전구 세포, 예를 들어 탯줄 혈액으로부터의 줄기 및 전구 세포가 환자에게 이식될 때, 염증 반응을 줄이거나 또는 실질적으로 제거할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 염증 반응을 가진 환자에게, 또는 염증 반응이 일어날 수 있는 환자에게 그것의 분화가 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물에 의해 조정된 줄기 세포 또는 전구 세포를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 줄기 세포는 배아-유사 줄기 세포이고, 전구 세포는 조혈 줄기 세포, 특히 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포이다.
발명자들은 또한 본 발명의 화합물 즉, IMiDs를 이용한 개체의 치료는 면역 반응을 조정, 보강 또는 감소시키는 세포의 발달 및 분화를 자극한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 다른 실시예는 면역 반응을 가진, 또는 면역 반응을 일으킬 가능성이 있는 개체에게 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 상기 개체의 치료 방법을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 방법은 상기 개체에게 투여 전에 본 발명의 화합물을 줄기 또는 전구 세포와 접촉하고, 그 후 상기 개체에게 상기 세포의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 그렇게 처리된 세포는 치료학적으로 유효한 양만큼 상기 개체에게 본 발명의 화합물 하나 또는 그 이상이 함께 투여된다.
다른 실시예에서, 염증은 본 발명의 화합물 및/또는 세포와 함께 다른 화합물의 투여에 의해 감소된다. 예를 들어, 그러한 부가적 화합물은 프레드니손과 같은 스테로이드, 또는 cox-1/cox-2 억제제 아세틸살리실 산(아스피린), 이부프로펜, 아세트아미노펜, cox-1-특이 억제제와 같은 specific inhibitors, 비-스테로이드성 항-염증 성분, 또는 이러한 화합물의 유도체를 포함한다. 그러한 부가적인 항-염증 성분은 정맥내, 국소내, 피하내(intradermally), 또는 흡입과 같은 어떠한 표준 경로에 의해서도 투여될 수 있고, 본 발명의 화합물 및/또는 세포와 동시에, 또는 다른 시간에 투여될 수도 있다.
상기 방법은 염증과 관련된, 염증에 의해 야기된, 또는 염증을 일으키는 어떠한 질환 또는 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 사고 상처와 같은 외상에 의해 야기된 염증을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 외과 수술, 특히 자연적 조직의 이식, 합성 혈관 이식, 심 밸브 또는 혈관성형술과 같은 혈관-관련 외과 수술과 관련된 손상 또는 손상에 의한 염증을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 협착 또는 재협착을 막기 위하여 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 심장 질환, 동맥경화증, 앨러지 또는 과민증, 면역 장애, 관절염과 같은 자가 면역 장애, 또는 감염에 의한 염증과 같은 질병 또는 질환을 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 어떠한 질환 또는 상태로부터 야기된 염증을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 이미 존재하는 염증성 상태를 치료하는 것에 더하여, 본 발명의 화합물의 세포 및/또는 화합물은 예방학적으로 개체에게 투여될 수 있는데, 이를 통하여 염증의 발생 가능성을 줄일 수 있다. 이것은 특히 수술 전 치료의 형태로써 유용하다. 이것에 의한 수술 후 염증 반응의 감소는 성공적 결과에 대한 가능성을 높이고, 입원 기간과 무력한 기간을 줄인다.
상기 치료의 항-염증 효과의 효율성 모니터링은 육안 관찰(visual inspection), MRI 또는 CAT 스캔, 전신 또는 국소 온도의 평가 등과 같이 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. C-반응성(reactive) 단백질로 알려진 단백질은 염증에 대한 마커이기 때문에, 상기 치료 방법의 효율성은 개체, 특히 전에 염증을 경험한 영역에서 C-반응성 단백질의 양의 감소를 평가하여 모티터링될 수 있다.
5.6.4. 가지 세포 및 과립구 세포 군의 제조
본 발명의 화합물은 줄기 및/또는 전구 세포의 분화를 과립구 발달 경로 대 가지 세포 발달 경로로 조절하기 위하여 특이적으로 투여될 수 있다. 유사한 방식으로, 본 발명의 세포는 확장된 일군의 가지 세포 또는 과립구를 제조하기 위하여 in vivo 또는 ex vivo로 조절될 수 있다.
가지 세포(dendritic cell)는 면역-기초 치료에 있어 반응물로써 사용될 수 있다. 예를 들어, 가지 세포는 T 임파구 및 단백질 항원과 in vitro로 같이 배양될 수 있고, 따라서 T 세포의 ex vivo 항원-특이적 활성을 유도한다. 활성화된 T 세포는 그 후 in vivo 항원-특이적 면역 반응을 초래하기 위하여 자가적으로(autologously) 투여된다 (WO97/24438). 다른 실시예에서, T 세포는 재조합 구조물로부터 항원 단백질을 직접적으로 발현하는 가지 세포로 T 임파구를 접촉시켜 in vitro 활성화될 수 있다. 활성화된 T 세포는 자가 주입을 위해 사용될 수 있다 (WO97/29183).
특이 펩타이드 또는 단백질 절편으로 활성화된 T 세포는 단백질, 그 펩타이드 또는 절편이 유래된 세포 또는 미생물에 대항하는 면역 성분이 된다. 예를 들어, 가지 세포는 종양-특이 펩타이드로 로딩될 수 있다. 전립선 암의 치료에 있어 DC-유도 ex vivo T 세포 활성화의 특이적 적용은 미국특허 제5,788,963호에 잘 개시되어 있다. Mayordomo 등은 합성 종양 펩타이드로 자극받은 골수-유도 가지 세포가 보호적이고 치료적인 항-종양 면역을 나타낸다는 것을 보여주었다 (Nature Medicine 1: 1297-1302 (1995); J. Exp. MED., 183: 1357-1365 (1996)). 미국특허 제5,698,679호는 가지 세포를 포함하는 목표 항원 표시 세포(antigen presenting cell, APC)에 항원성 펩타이드를 in vivo로 전달하는 면역글로블린 융합 단백질을 개시하고 있다. 동일한 접근이 바이러스성, 박테리아성, 또는 기생출성 백신을 생성할 수 있는 바이러스, 박테리아 또는 기생출으로부터 유래된 펩타이드 또는 항원을 사용하여 행하여 질 수 있다.
가지 세포는 또한 다양한 면역-관련 장애의 치료에 있어 치료적 중재로서의 목표이다. 예를 들어 가지 세포는 AIDS의 발병기전 및 병리생리기전에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다(예를 들어 HIV 바이러스에 대한 레저보어로서 작용함). Zoeteweij et al., J. Biomed. Sci. 5 (4): 253-259 (1998); Grouard et al., Curr. Opin. Immunol. 9 (4): 563-567 (1997); Weissman et al., Clin. MICROBIOL. REV. 10 (2): 358-367 (1997) 참조. DC의 HIV 감염을 막기 위한 성분으로의 약학적 후보들을 스크리닝하는 in vitro 방법은 미국특허 제5,627,025호에 잘 개시되어 있다. 다른 실시예에서, 가지 세포는 수용자 내에서 공여자 조직 또는 장기에 T 세포가 반응하지 않도록 유도하기 위하여 조작될 수 있다 (미국 특허 제6,375,950호 참조).
과립구는 예를 들어 박테리아성 신생아 패혈증, 암 환자에 있어 호중성백혈구감소증-관련 감염, 및 골수 이식을 받은 환자에 있어서의 잠재적 감염과 같은 감염의 치료 또는 예방을 위한 과립구 수혈에서 사용될 수 있다. 과립구는 또한 앨러지의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, IgE-매개 감염에 관련된 과립구(즉, 몇몇이 앨러젠(allergen)에 대하여 특이성을 가지는 IgE 항체로 코팅된 과립구)는 앨러젠에 대항하여 이미 설립된 면역 반응의 증상을 경감하기 위하여 비활성화되고 사용될 수 있다(미국특허 제6,383,489호 참조).
따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 개체 내의 일군의 과립구는 본 발명의 치료학적으로 유효한 양의 화합물을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 의하여 본 발명의 전구 세포로부터 확장된다. 여기에서 상기 양은 상기 개체에 내재적인 CD34+ 세포로부터 복수의 과립구의 생성을 야기할 정도로 충분한 양이다. 다른 실시예에서, 일군의 과립구는 일군의 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포를 상기 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 의해서 개체 내에서 확장된다. 여기에서 상기 세포는 적어도 3일 동안 본 발명의 화합물과 접촉하고, 상기 개체에게 상기 군의 세포를 투여한다. 다른 실시예에서, 일군의 과립구는 상기 개체에게 일군의 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포와 본 발명의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 방법에 의하여 개체 내에서 확장된다. 여기에서 본 발명의 상기 화합물의 투여량은 복수의 상기 군의 세포의 분화를 과립구로 유도하기에 충분한 양이다. 상기 실시예의 특정 실시예에서, CD34+ 전구 세포는 CD34+CD38-CD33+ 세포이다.
5.6.5. 다른 질병 및 질환의 치료
본 발명의 분화된 줄기 및 전구 세포, 또는 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 병용하여 다양한 다른 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 일정 실시예에서, 예를 들어, 질병 또는 질환은 혈관 또는 심혈관 질환, 동맥경화증, 당뇨병, 재생불량빈혈, 척수형성이상증, 심근 경색, 졸도 장애, 다발성 경화증, 발작, 뇌졸중, 저혈압, 심장 정지, 허혈, 염증, 노화-관련 인식 기능의 손실, 방사선 상해, 뇌성 중풍, 신경퇴행성 질환, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 레이 병, AIDS 치매, 기억력 손실, 근육위축가쪽경화증(ALS), 허혈성 신장 질환, 뇌 또는 척수 상해, 심장-폐 바이패스, 녹내장, 망막 허혈, Tay-Sachs, Niemarm-Pick, Fabry's, Gaucher's, Hunter's, Hurler's 신드롬과 같은 리소솜 축적병 및 다른 강들리오시드증, 점액다당류증, 및 글리코겐증, 선천적 대사 장애, 아드레노류코이상증(adrenoleukodystrophy), 낭 섬유증, 글리코겐 축적 질환, 감상샘 저하증, 낫적혈구빈혈, Pearson 신드롬, Pompe 병, 페닐케토뇨증(PKU), 포르파린증, 단풍시럽뇨병, 호모시스틴뇨증, 점액다당류증, 만성 육아종 질환 및 티로신혈증, Tay-Sachs 병, 암, 종양 또는 다른 병리적 또는 종양적 병태를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시예에서, 본 발명의 세포(예를 들어 본 발명의 화합물에 노출된 세포)는 외상, 특히 염증을 포함하는 외상으로 인한 어떠한 종류의 상해를 치료하는데 사용될 수 있다. 그러한 외상-관련 병태의 예는 뇌, 척수 상해를 포함하는 중추 신경 시스템(CNS) 상해, 또는 말초 신경 시스템(PNS)에 있어 CNS 상해 주위의 조직; 또는 신체의 어떠한 다른 부분의 상해를 포함한다. 그러한 외상은 사고에 의해 야기될 수 있고, 또는 수술 또는 혈관성혈술과 같은 치료적 절차의 정상적 또는 비정상적 결과에 의한 것일 수도 있다. 외상은 예를 들어 발작 또는 정맥염과 같이 혈관의 파열 또는 폐쇄와 관련될 수 있다. 특정 실시예에서, 세포는 세포는 각막 표피 상해, 연골 수복(repair), 얼굴 박피술, 점막, 고막, 내장 내층, 신경학적 구조(예를 들어 망막, 기저막의 청각 신경, 코 표피의 후각 신경), 화상 및 피부, 두피 (머리털) 이식의 외상적 손상에 대한 상처 치료를 포함하는, 하지만 이에 한정되지 않는, 대체 치료 또는 프로토콜의 자가 또는 이종유래 조직 재생성, 또는 질병이 있는 장기 또는 조직의 재구성을 위하여 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 질병 또는 장애는 재생불량성 빈혈, 척수형성이상증, 백혈병, 조혈 질환 또는 장애의 골수 장애이다. 다른 특정 실시예에서, 대상은 인간이다.
5.7. 약학적 조성물들
본 발명은 1회 투여량 및/또는 하나 또는 그 이상의 복수의 투여량를 구비하는 약학적 조성물들을 포함하며, 특정 세포 타입 예컨대, 조혈 리니지 세포 특히, 마이에로이드(myeloid) 리니지 세포 내에서 이들 줄기 및/또는 전구 세포의 분화를 억제, 조정 및/또는 조절하기에 충분한 효과를 발휘하는 개체에 대한 조건부 또는 비조건부 인체의 CD34+ 또는 CD 133 전구 또는 줄기세포의 이식 전 또는 후에 상기 투여량 또는 복수의 투여량은 1회 또는 복수회 투여시 효과적이다. 상기 문맥에서, 그리고 본 발명의 다른 문맥과 마찬가지로, "개체"는 예컨대, 포유류, 조류, 또는 파충류에 투여되는 혼합물 또는 세포들의 각 개체를 의미한다.
따라서, 일 실시예에 있어서, 개체에 투여되는 본 발명에 따른 혼합물의 1회 투여량 또는 복수 투여량은 가지 세포 내로 내생적인 CD34+ 전구 세포의 분화를 조절한다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기의 1회 투여량 또는 복수의 투여량은 투여되었던 상기 개체 내의 과립 세포들의 수를 증가시킨다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 1회의 투여량 또는 복수의 투여량은 투여된 포유류의 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 전구 세포의 수를 증가시킨다.
다른 실시예에 있어서, 관심 대상인 CD34+ 또는 CD133+ 전구 또는 줄기 세포는 필요로 하는 환자 또는 인간 대상체에 이식된다. 이식에 수반하여, 본 발명의 화합물은 생체 내에서 관심 대상인 이식 세포의 분화를 조절하기 위해 인간 대상체 또는 환자에게 투여된다. 일 실시예에 있어서, 이러한 세포들은 과립구 내로 생체내에서 분화된다. 다른 실시예에 있어서, 인간 대상체 또는 환자의 관심 대상인 전구 또는 줄기 세포의 분화는 본 발명에 따른 화합물의 투여에 의해 in situ 조절된다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 TNF-α 활성을 억제하는 화합물 노출에 의해 분화된 조혈 전구 세포로 보강된 분리된 탯줄 혈액 줄기 또는 전구 세포 군을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 화합물로 접촉된 줄기 또는 전구 세포로 보강된 탯줄 혈액을 포함하는 약학적 조성물을 제공하며; 일 특정 실시예에서, 상기 줄기 또는 전구 세포는 상기 화합물에 의해 분화된다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 면역조절 화합물, 및 본 발명의 줄기 및/또는 전구 세포를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물들은 서로 다른 계발적/분화 경로를 따르는 상기 줄기 및/또는 전구 세포들의 분화를 조절하기 위해 투여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일 전에 준비될 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 약학적 조성물들은 여기에 개시된 방법에 따라 분화된 상기 세포들 자체의 줄기 또는 전구 세포들을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 복수의 줄기 세포들 및/또는 전구 세포들을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는데, 상기 복수의 줄기 및/도는 전구 세포들은 상기 세포들의 분화를 조절하는 상기 화합물들에 충분한 기간을 위해 그리고 농축에 상기 하나 또는 그 이상의 PDE IV 반응억제재가 접촉된다.
따라서, 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물들은 개체에 투여되는 상기 화합물과, 개별적으로 투여된 본 발명의 화합물과 공동으로 개체에 투여되는 본 발명에 따른 상기 세포들, 및 상기 개체에 투여된 본 발명에 따른 화합물과 접촉된 본 발명에 따른 상기 세포들을 포함한다.
본 발명은 대상물 안에 존재하거나, 이식할 CD34+ 또는 CD133+ 전구 세포들 또는 줄기 세포들의 분화 및/또는 증식을 효과적으로 조절하기 위해, 포유류 바람직하게는 인체 대상물에 본 발명의 화합물 또는 조성물들을 약학적으로 효과적인 양을 투여함으로써 질병 또는 장애의 방지 및 처치 방법을 제공한다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 포유류 내의 과립구 세포들의 수를 증가시키기 위해 CD34+ 및 CD133+ 전구 또는 줄기 세포들의 분화를 조절하기 위한 방법을 제공한다. 또 다른 실시예에 있어서, CD34+ 및 CD133+ 전구 또는 줄기 세포로부터 추출될 수 있는 세포 리니지는 포유류, 바람직하게는 인체에 본 발명에 따른 화합물의 투여에 의해 조절될 수 있다. 상기에서 사용된 용어 "포유류"는 어떠한 포유류도 포함한다. 바람직하게 포유류는 이러한 처지 또는 방지를 필요로 한다. 포유류의 예로서는 특히 한정되는 것은 아니지만 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 생쥐, 쥐, 토끼, 기니아 돼지, 원숭이 등과 더욱 바람직하게는 인간을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물들은 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 대부분의 포유류에 대한 투여는 본 발명에 따른 화합물의 전신 방출 결과(예, 혈관 내)이다. 투여 방법은 장(腸) 경로 예컨대, 경구투여, 버컬, 설하, 및 좌약과, 국부 투여 예컨대, 경피 및 진피와, 비경구적 투여를 포함한다. 적합한 비경구적 루트는 피하주사바늘 또는 카테터를 통한 주사 예컨대, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 복막내, 동맥내, 심실내, 경막내, 안내 및 앞방내 주사 및 비주사 루트 즉 질내 창, 또는 코 투여를 포함한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물들은 경구로 투여된다. 일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 화합물을 처치에 필요한 영역에 국부적으로 투여하는 것도 바람직하다. 이것은 예를 들어 수술중 국소 주입에 의해, 국소 기구 즉, 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터를 이용하여, 좌약을 이용하여, 또는 다공, 비다공이 존재하는 임플란트를 이용하여, 또는 실라스틱 멤브레인과 같은 멤브레인을 포함하는 젤라틴 재료, 또는 섬유들로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 상기 화합물은 전형적인 것은 물론 예를 들어, 리포솜, 미소입자, 마이크로캡슐 등의 캡슐화와 같은 비표준 전달 시스템을 통해서도 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 상기 화합물 및 조성물들은 소포 내, 특히 리포솜에 전달될 수 있다(see Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., in Liposomes in Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); LOPEZ-BERESTEIN, ibid., pp. 317-327; see generally ibid.). 다른 일 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 컨트롤된 방출 시스템 내로 전달될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 펌프가 사용될 수 있다(see Langer, supra ; Sefton, 1987, CRC Crit. REFBIOMED. ENG. 14: 201; Buchwald et AL., 1980, Surgery 88: 507 Saudek et al., 1989, N. Engl. JMED. 3: 574). 다른 예에 있어서, 중합 재료가 사용될 수 있다(see Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press. , Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger ANDPEPPAS, 1983, J. MACROMOL. Sci. Rev. Macromol. CLAIM. 23: 61 ; see also Levy et AL., 1985, Science 228: 190; During et AL., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et AL., 1989, J. Neurosurg 71: 105). 또 다른 예에 있어서, 컨트롤된 방출 시스템은 예들 들어 전신 투여의 일부에만 필요로 하는 간장(see, e. G., Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)) 등과 같이 처치될 목표 영역 근처에 위치될 수 있다. 또한, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533)에서 언급된 또 다른 컨트롤된 방출 시스템이 사용될 수도 있다. 조성물로서 투여되었을 때, 본 발명에 따른 화합물은 포유류에 적합한 투여 형태로 제공되기 위하여 약학적으로 허용되는 캐리어 또는 비히클의 적정량으로 제제화될 것이다. 상기 용어 "약학적으로 허용"된다는 것은 포유류 특히 인간에게 사용할 수 있는 조제로 일반적으로 인정되거나 또는 U.S 조제서에 리스트되어 있거나 또는 주 정부 또는 연방 정부의 통제 사무소에 의해 승인된 것을 의미한다. 상기 용어 "비히클" 은 희석액, 애주번트, 부형제 또는 포유류에 투여하기 위해 제재된 본 발명에 따른 화합물의 캐리어를 말한다. 이러한 약학적 비희클은 석유, 애니멀, 베지터블 또는 합성 오리진(예를 들면 땅콩 기름, 콩기름, 미네랄 기름, 참기름 등)을 포함하는 물 및 기름과 같은 액체일 수 있다. 상기 약학적 비히클은 염류 용액, 아라비아 고무, 젤라틴, 전분 올라, 활석, 각질, 콜로이드 실리카, 요소 등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정제, 농후제, 광택제 및 착색제 등의 약품이 사용될 수 있다. 바람직하게, 포유류에 투여되었을 때, 본 발명에 따른 화합물과 조성물 및 약학적으로 허용되는 비히클, 첨가제 또는 희석재는 멸균(sterile)이다. 본 발명에 따른 화합물이 정맥 내에 투여되었을 때, 수성 매개체는 예를 들어 물, 식염수, 및 액상 포도당 및 글리세린 용액과 같은 비히클이 바람직하다.
상기 화합물과 조성물은 캡슐, 타블릿, 필, 펠릿, 능형(lozenges), 분말, 과립, 시럽, 엘릭스(elixirs), 용액, 현탁, 에멀젼, 좌약 또는 이들의 지속성 방출 제재, 또는 포유류에 투여하기 적합한 다른 형태를 가질 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 상기 화합물과 조성물은 인체에 경구 또는 정맥 투여에 적합한 약학적 조성으로 루틴 단계에 따라 투여를 위해 제재화된다. 일 실시예에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 비히클은 경캅셀이다. 적합한 약학적 비히클의 예와 이것의 제재를 위한 방법은 레민톤(Remington)에 기재되어 있다(The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19TH ed., 1995, Chapters 86, 87, 88,91, and 92 참조).
경구 전달을 위해 제재화된 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 바람직하게, 캡슐, 태블릿, 필, 또는 압축된 약학적 형태를 형성한다. 또한, 태블릿 또는 필 형태에 있어서, 상기 화합물 및 조성물은 위장 영역 내의 흡수 및 소화를 지연시키기 위해 코팅되기 때문에 그 연장시간 동안 유지력을 제공할 수 있다. 또한, 삼투압적 활성 구동 화합물을 둘러싼 선택 투과성 멤브레인은 경구를 통해 투여되는 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물에 적합하다. 이러한 후자의 플랫폼에 있어서, 캡슐을 둘러싼 환경으로부터의 유체는 구멍을 통해 약제 조성물 또는 상기 약제를 치환하기 위해 부풀어오르는 구동 화합물에 의해 흡수된다. 이러한 전달 플랫폼은 즉각 방출 제재화의 프로파일과 반대되는 제로 오더(order) 전달 프로파일을 필수적으로 제공할 수 있다. 글리세롤 모노스테리에이트 또는 글리세롤 스테리에이트와 같은 시간 지연 재료 또한 사용될 수 있다. 경구 조성물은 표준 비히클, 부형재 및 제재 예컨대 마그네슘 스테리에이트, 소디움 사카린, 셀률로스, 마그네슘 카보네이트, 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니토르, 전분, 아라비아 고무, 규산 칼슘, 미결정성의 섬유소, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 시럽 및 메틸 섬유소을 포함할 수 있으며, 상기 제재화는 부가적으로 광택 성분, 즉 활석, 마그네슘 스테리에이트, 미네랄 오일, 웨팅 성분, 유화 및 지연 성분, 메틸- 및 프로필히드록시벤조네이트와 같은 보존 성분을 포함할 수 있다. 이러한 비히클은 약학적 등급이 바람직하다. 경구로 투입되는 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 프럭크토스, 아스파탐 또는 사카린과 같은 감미 성분을 포함하며, 하나 또는 그 이상의 페파민트, 노루발풀 오일, 또는 체리와 같은 향미 성분, 하나 또는 그 이상의 약학적 풍미를 제공하기 위한 착색 성분을 포함한다.
특정 장애 또는 조건의 처치를 위해 치료학적으로 유효한 투여 요법은 그 본성과 어려움(severity)에 의존하며, 의사의 판단에 의한 표준 임상 기술에 의해 결정될 수가 있다. 또한, 생체 밖 또는 생체 내 분석은 최적 투여량을 식별하는데 도움이 될 수 있다. 물론, 치료학적으로 효과적인 투여량으로 구성되는 본 발명에 따른 화합물 또한 상기 투여 루트에 의존한다. 일반적으로, 경구 투여를 위한 적합한 투여 범위는 1일당 킬로그램 체중에 대해 본 발명에 따른 화합물의 약 0.001 ~２０mg 이며, 바람직하게는 약 0.7 ~ 6mg이며, 더욱 바람직하게는 약 1.5 ~ 4.5mg이다. 바람직한 실시예에 있어서, 포유류 바람직하게 인체에는 1일당 본 발명에 따른 화합물의 약 0.01 ~ 1000mg이 경구로 투여되며, 더욱 바람직하게는 일회 또는 분리 투여량에 있어서 약 0.1 ~ 300mg 또는 약 1 ~ 250mg이다. 여기서, 상기 투여량은 총 투여된 양으로 서술된다. 즉 이것은 만약 하나 이상의 상기 화합물이 투여된다면, 바람직한 투여량은 투여된 상기 화합물의 총량과 일치하기 때문이다. 경구 조성물은 바람직하게 10 ~ 95w% 의 상기 화합물을 포함한다. 바람직한 유닛 경구-투여 형태는 필, 태블릿 및 캡슐을 포함하며, 더욱 바람직하게는 캡슐이다. 일반적으로 이러한 유닛-투여 형태는 약 0.01, 1, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 250, 500mg의 본 발명에 따른 화합물을 포함하며, 바람직하게는 투여 유닛 당 약 5 ~ 200mg의 화합물을 포함한다.
또 다른 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있으며(예, 근육내, 경막내, 정맥내, 및 동맥내 루트), 바람직하게는 정맥내로 투여된다. 일반적으로, 정맥내 투여를 위한 상기 화합물 및 조성물은 물, 살린, 링거액, 또는 덱스트로스 용액 등과 같은 무균 등장 액상 비히클 용액이다. 필요에 따라, 상기 조성물은 또한 솔루빌라이징 제재를 포함할 수 있다. 정맥내 투여를 위한 조성물은 주사 자리의 고통을 완하하기 위한 리그노카세인과 같은 국부 마취제를 선택적으로 포함할 수 있다. 정맥 투여를 위해, 본 발명에 따른 화합물과 조성물은 무균형태, 동결건조 분말 또는 엠플 또는 사키테(sachette)와 같은 밀봉 실링된 컨테이너 내의 워터-프리 농축물, 활성 제재의 양을 나타내는 컨테이너 형태로 제공될 수 있다. 이러한 분말 또는 농축물은 정맥 투여에 앞서 적정한 액상 매개체로 희석된다. 무균 물, 살린 용액 또는 다른 적합한 액상 매개체의 앰플은 투여에 앞서 희석을 위한 분말 또는 농축물로 제공될 수 있다. 또는 상기 조성물은 투여를 위한 프리믹스된 형태로 제공될 수도 있다. 정맥 내에 주입됨으로 인해 투여되는 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물은 예를 들어 무균 약학적-등급 물, 살린, 또는 다른 적합한 매개체를 담는 주입병으로 조제될 수 있다.
직장(直腸) 투여는 코코아 버터, 수정된 식물성 오일 및 다른 지방 베이스(fatty bases)와 같은 종래의 캐리어로 제재된 좌약의 사용을 통해 효과적일 수 있다. 좌약은 예컨대, (Remington : The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro ED., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed. , 1995, pp. 1591-1597, 참조)에 잘 알려진 포물레이션을 사용하는 잘 알려진 방법에 의해 조제될 수 있다.
국부적인 투여 형태로 투여 및 제재화하기 위해서는, 잘 알려진 로우션, 크림 및 연고와 같은 경피성 및 내피성 전달 매개체, 및 패치와 같은 경피성 전달 장치가 사용된다(Ghosh, T. K.; Pfister, W. R.; Yum, S. I. TRARASDERMAL AND TOPICAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, INTERPHARM Press, Inc. p. 249-297, 참조). 예를 들어, 저장소 타입의 패치 디자인은 접착제로 코팅된 백킹(backing) 필름 및 본 발명에 따른 화합물 및 조성물을 포함하는 저장소 구획을 구비하는데, 이것은 반투성 멤브레인(예, 미국특허 4,615, 699참조)에 의해 피부로부터 분리된 것이다. 백킹 레이어를 코팅한 상기 접착제는 피부에 집중 실을 제공하며 피부에 인접한 저장소를 홀딩하기 위해 저장소의 경계영역까지 확장된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 또는 그 이상의 화합물로 채워진 하나 또는 그 이상의 컨테이너로 이루어진 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 컨테이너와의 선택적 결합은 제약 또는 바이오 제품의 제조, 사용 또는 판매를 통제하는 정부 부처에 의해 처방되는 형태로 고지될 수 있으며, 상기 고지는 인체 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 부처에 의해 승인된 것을 반영한다. 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 포함한다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 키트는 본 발명에 따른 화합물과 다른 생화학적 활성제를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 인체에 사용하기에 앞서 소망하는 치료적 또는 예방적 활동을 위해 바람직하게 생체내 또는 생체 밖에서 분석 된다. 예를 들면, 생체내 분석은 본 발명에 따른 특정 화합물의 투여 또는 본 발명에 따른 화합물의 결합이 적합한가 아닌가를 결정하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물과 화합물은 동물 모델 시스템을 사용하여 안전성과 효과성이 증명될 수 있다. 다른 방법들은 숙력된 당업자들에게 알려진 것들로 본 발명의 범위에 포함된다.
*5.8. 본 발명에 따른 방법에 사용하는 분석
전술한 방법론 예컨대, CD34+ 세포와 같은 초기 전구 세포의 분화에 대한 액티미드™와 같은 IMiD들의 효과의 시험은 흥미있는 어떠한 화합물에도 적용될 수 있고, 분화에 대한 그것의 효과는 알려지는 것이 바람직하다. 이것은 이것은 몇 가지 방법으로 달성될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 화합물은 본 발명에 따른 다른 화합물 또는 액티미드™로 간단히 대체될 수 있다. 여기서, CD34+ 전구 세포 및/또는 CD133+ 전구 세포들은 허용되는 전구 세포들의 급증 및/또는 분화 및/또는 완전 분화된 세포들을 허락하는 조건에서 다양한 농축도로 대상체 화합물에 접촉될 수 있다. 여기에 개시된 배양 방법은, 특히 섹션 5.4에 개시된 배양 방법이다. 대상체 화합물의 효과가 만일 있다면, 전구 세포들로부터 분화되는 셀 개체수에 있어 변화를 측정함으로써 결정되고, 상기 변화는 표현형 변화에 의해 모니터될 수 있지만, 바람직하게는 존재하거나 또는 존재하지 않는 세포 표면 마커를 결정함으로써 평가된다. 본 발명에 따른 방법과 같이, 대상체의 상기 화합물은 최종 분화된 세포의 획득을 위한 최초 배양으로부터 언제든지 1회 투여량 내에서 투여될 수 있다. 선택적으로, 대상체의 상기 화합물은 증식 스테이지, 분화 스테이지 또는 양쪽 스테이지 동안 다수의 투여량이 투여될 수 있다. 상기 증식/분화 전구 세포의 표현형 특징 내의 변화는 바람직하게, DMSO 처치된 세포와 같은 세포의 컨트롤 배양과 비교된다. 특별한 관심은 제한되는 것은 아니지만 예컨대, 증식 비율의 조정;분화 비율의 조정; 전구 세포의 특정하게 수임된 전구(precursor) 세포들로의 분화 조정; 특정 세포 타입으로의 분화 블로킹; 및 특정 세포 타입으로의 분화 강화;와 같은 분화 또는 급증 효과이다.
또 다른 실시예에 있어서, 배양, 급증 및 분화는 상기와 같이 발생하지만, 관심 있는 화합물은 Actimid™을 따라 전구 세포와 접촉된다. 이러한 방법에 있어서, 다수 화합물의 효과는 어쩌면 상승적으로, 결정될 수 있다. 특별한 관심은 어떤 화합물은 혼자서 급증 또는 분화에 대해 미약한 또는 전혀 효과를 가지지 않는다는 것이지만, Actimid™와 결합해서는 상당한 효과를 가진다. 또 다른 실시예에 있어서, 관심 있는 어떤 두 개의 화합물은 일반적으로 전구 세포들의 급증과 분화를 허용하는 상기와 같은 배양 조건에서 전구 세포들과 접촉될 수 있다. 여기서, 관심 있는 두 개의 화합물과 접촉하는 전구 세포들의 실험은 바람직하게 상기 화합물들의 각 어느 하나에만 접촉되는 전구 세포로 컨트롤하거나, Actimid™와 접촉하는 세포로 컨트롤하거나, 화합물과 접촉하지 않거나 또는 DMSO와 접촉되는 세포로 컨트롤하는 것을 포함한다. 또한, 투여량에 있어서 상기 변화들과 투여 시기는 상기 및 섹션 5.4에 기재된다.
본 발명의 방법은 표유류, 특히 인간 줄기 세포가 특정세포 또는 조직계통을 따라 분화와 성숙을 조절하고 제어하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 특정세포 및 조직계통을 따라서 줄기 또는 전구세포군의 분화, 특히 산후 태반으로부터 생성되는 배아유사 줄기세포의 분화를 또는 초기 전구세포가 과립구 계통으로 분화를 위하여 조절하는 특정 작은 유기분자의 용도에 관련된다. 최종적으로, 본 발명은 이식 및 다른 의학적 치료에 있어서 그러한 분화된 줄기 및 전구세포의 용도와 관련된다.
도 1은 1㎍/ml 및 10㎍/ml의 농도에서 탈리도마이드(THD), 액티미드™ 및 레비미드™의 존재 하에 탯줄 혈액 CD34+을 배양한 결과를 나타내는 막대 그래프이다. 같은 부피의 DMSO가 역 조건으로서 사용되었다. 대집락형성단위-적혈구(BFU-E)의 조혈 콜로니, 콜로니형성단위-적혈구(CFU-E), 콜로니 형성단위-과립백혈구 마크로파지(CFU-GM) 및 콜로니의 총수(CFU-total)이 배양 14일째에 광학 마이크로현미경으로 스코어되었다. Y-축: 콜로니의 수. 구체적으로 6.1절을 참조한다.
도 2(A-F)는 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 적혈구 생성과 CD34+CD38- 세포의 확장을 저해한다. 탯줄 혈액 CD45+ 세포는 사이토카인, IL3, IL6, G-CSF, Epo 및 KL로 14일간 배양되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (IG). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 액티미드™ (5 ㎍/ml). F. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: Gly-A (FL1-H)염색의 상대적인 강도. Y-축: CD34 (F 2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.1절을 참조한다.
도 3(A-F)는 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 또는 레비미드™에 노출하는 것은 사이토카인, IL3, KL 및 G-CSF와 14일간 배양으로 인간 탯줄 혈액 CD34+세포상에서 CXCR4 의 발현을 저해한다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (IG). B. 대조군, CD45+세포. C. DMSO (0.3 μg/ml). D. Thal (0.3 ㎍/ml). E. 액티미드™ (0.3 ㎍/ml). F. 레비미드™ (0.3 μg/ml). X-축: CD34 (FL1-H)염색의 상대적인 강도. Y-축: CXCR4 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.2절을 참조한다.
도 4(A-F)는 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 CD34+및/또는 CD34+CD38- 세포군의 확장을 촉진한다. 탯줄 혈액 CD45+ 세포는 사이토카인, IL3, IL6, G-CSF, Epo 및 KL로 14일간 배양되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (IG). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (0.3 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (0.3 ㎍/ml). E. 액티미드™ (0.3 ㎍/ml). F. 레비미드™ (0.3 μg/ml). X-축: CD 38 (FL1-H)염색의 상대적인 강도. Y-축: CD34 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.2절을 참조한다.
도 5(A-F)는 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 인간 탯줄 혈액 전구세포의 중요한 보존을 산출한다. 탯줄 혈액 CD45+ 세포는 사이토카인, IL3, IL6, G-CSF, Epo 및 KL로 14일간 배양되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 액티미드™ (5 ㎍/ml). F. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: CD 38 (FL1-H)염색의 상대적인 강도. Y-축: CD34 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.2절을 참조한다.
도 6(A-F)는 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 CXCR4 발현을 저해하고 CD45+세포군을 확장한다. 탯줄 혈액 CD45+세포는 사이토카인, IL3, IL6, G-CSF, Epo 및 KL로 14일간 배양되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 액티미드™ (5 ㎍/ml). F. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: CD 45 (FL1-H)염색의 상대적인 강도. Y-축: CXCR4 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.2절을 참조한다.
도 7(A-F)은 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 많은 CD34+전구세포의 확장을 산출하고, 과립 백혈구와 단핵세포의 생산을 증가한다 . 탯줄 혈액 CD45+ 세포는 사이토카인, IL3, IL6, G-CSF, Epo,및 KL로 14일간 배양되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 액티미드™ (5 ㎍/ml). F. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: CD11b (FLI-H)염색의 상대적인 강도. Y-축: CD34 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.2절을 참조한다.
도 8(A-F)은 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 CD34+전구세포를 확장하고, 단핵세포 생산의 DMSO-매개 억압을 중화시킨다. 탯줄 혈액 CD45+ 세포는 사이토카인, IL3, IL6, G-CSF, Epo,및 KL로 14일간 배양되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 액티미드™ (5 ㎍/ml). F. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: CD14 발현(FLI-H)염색의 상대적인 강도. 최대(Maxis): CD34 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.3절을 참조한다.
도 9(A-F)는 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 B세포로의 분화상에 보다 작은 억제 효과를 나타낸다. 탯줄 혈액 CD45+ 세포는 사이토카인, IL3, IL6, G-CSF, Epo,및 KL로 14일간 배양되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 액티미드™ (5 ㎍/ml). F. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: CD38 (FL1-H) 염색의 상대적인 강도. Y-축: CD19 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.3절을 참조한다.
도 10(A-F)는 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 CD45+을 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 DMSO에 노출되어 형성된 CXCR5의 억압을 극복한다. 탯줄 혈액 CD45+ 세포는 사이토카인, IL3, IL6, G-CSF, Epo,및 KL로 14일간 배양되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 액티미드™ (5 ㎍/ml). F. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: CXCR5 (FL1 -H) 염색의 상대적인 강도. Y-축: CD34 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.3절을 참조한다.
도 11(A-E)는 플로우 시토그램이다. 인간 탯줄 혈액 단핵화된 세포(MNCs)를 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 CD34+CD38+세포군을 증가시킨다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: CD38 (FL1-H) 염색의 상대적인 강도. Y-축: CD34 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.3절을 참조한다.
도 12(A-E)는 플로우 시토그램이다. MNCs를 액티미드™ 및 레비미드™에 노출하는 것은 CXCR4+CD45+ 세포군을 하향규제하지만, CXCR4+CD45-세포군을 증가시킨다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. 대조군, 첨가된 화합물 없음. C. DMSO (5 μg/ml). D. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). E. 액티미드™ (5 ㎍/ml). F. 레비미드™ (5 μg/ml). X-축: CD45 (FL1-H) 염색의 상대적인 강도. Y-축: CXCR4 (FL2-H) 염색의 상대적인 강도. 구체적으로 6.3절을 참조한다.
도 13(A-E)는 플로우 시토그램이다. 탯줄 혈액의 유핵 세포 분획에서 조혈 전구체를 분화의 계통구류에 탈로미드, 액티미드™ 및 레비미드™의 효과. 플로우 시토그램은 액티미드™와 레비미드™가 대조군에 비하여 단핵세포 계통의 백분율을 증가시킨다는 것을 나타내는데, 림프계 및 골수 세포을 생기게하는 계통을 향해 이동하는 분화이 조절이 있음을 나타낸다. A. 대조군, 이뮤노글로불린 (Ig). B. DMSO (5 μg/ml). C. 탈리도마이드 ("Thal") (5 ㎍/ml). D. 액티미드™ (5 ㎍/ml). E. 레비미드™(5 μg/ml). 구체적으로 6.4절을 참조한다.
도 14. DC 세포로의 CD34+세포 분화 및 성숙에 미치는 액티미드™의 효과의 연구 개요. CD34+세포는 확장 및 성숙시기(1일 내지 12일)동안 또는 성숙시기(6일 내지 12일)동안 1.0μM 액티미드™ 및 DMSO의 존재 또는 부존재 하에서 배양되었다. 면역조직화학 마커(immunohistochemical marker)가 단클론항체와 조합된 FITC 및 PE를 사용하여 6일 및 12일에 측정되었다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 15(A-D). 액티미드™에 1일부터 노출된, 6일 CD34+세포의 표현형 특성을 나타내는 플로우 시토그램. 액티미드™는 거의 완전하게 CD86+CD1a+세포의 발달을 억제시켰다. 세포는 CDla FITC 및 CD14 PE 또는 CD1a FITC 및 CD86 PE로 이중라벨 되었다. A. DMSO로 처리된 CD34+세포로부터 발생한 CD86+CD1+세포(대조군). B: DMSO로 처리된 CD34+세포로부터 발생한 CD14+CD1+ 세포 (대조군). C: 액티미드™로 처리된 CD34+세포로부터 발생한CD86+CD1+ 세포. D: 액티미드™로 처리된 CD34+세포로부터 발생한 CD14+CD1+세포. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 16(A-D). 확장시기(1일 내지 6일) 동안 CD34+세포에 6일의 액티미드™ 노출 영향을 나타내는 플로우 시토그램. 6일후 액티미드™에 노출된 CD34+CD38 세포는 CD34+CD38-CD33+세포로 분화하였다. 세포는 CD33 FITC 및 CD83 PE 또는 C38 PE 및 CD34 PE로 이중라벨 되었다. A. DMSO로 처리되고 CD34 및 CD38에 대해 라벨된 세포 . B: DMSO로 처리되고 CD83 및 CD33에 대해 라벨된 세포 . C: 액티미드™로 처리되고 CD34 및 CD38에 대해 라벨된 세포 . D: 로 처리된 세포. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 17. 액티미드™는 배양 0일에서 6일까지 CD34+세포-기인된 세포 군에서 이동을 유발한다. 세포는 액티미드™의 서로다른 농도의 존재하에서 0일에서 6일까지 배양된 다음, CD34 및 CD38 PE 또는 CD1a 및 CD14로 이중라벨 되었다. 액티미드™는 CD34+CD38 세포에서 현저한 증가를, CDLA+CD14- 세포에서는 감소를 일으킨다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 18. 액티미드™로 다양한 시간에서 처리된 CD34+세포의 6일에서 표현형 변화. 세포는 6일동안 평판배양되고 배양되었다. 세포는 액티미드™로 단지 0일에서 1일, 단지 0일에서 2일, 단지 0일에서 3일, 단지 0일에서 4일, 단지 0일에서 5일, 또는 0일에서 6일 처리되었다. 6일 미만의 배양에 대해서, 액티미드™는 표시된 날에 씻겨지고, 세포는 DMSO에 재현탁되었다. 6일에서, 세포는 CD34 및 CD38 또는 CD1a 및 CD14로 라벨되엇다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 19(a-b). 액티미드™의 1회 또는 수회 투여로 처리된 CD34+전구체의 6일에서 표현형 변화. 도 19a: 조건 1: 0일에서 액티미드™의 1회 투여; 조건 2: 0일과 4일에서 투여된 액티미드™; 조건 3: 0일, 2일 및 4일에서 투여된 액티미드™. Y축은 특별한 표지자 또는 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. 도 19b: 조건 1: 0일에서 액티미드™의 1회 투여; 조건 2: 0일, 4일, 6일 및 8일에 투여된 액티미드™; 조건 3: 0일, 2일, 4일, 6일 및 8일에 투여된 액티미드™. 세포는 CD11c 및 CD 15, 과립 백혈구 표지자의 발현으로 평가되었다. Y축은 액티미드™ 또는 DMSO(대조군)와 접촉된 CD11c+CD15- 및 CD11c-CD15+세포의 백분율을 나타낸다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 20(A-F). 1 내지 12일 액티미드™(1μM)에 노출된 CD34+세포로부터 생성된 돌출 세포의 12일에서의 플로우 시토그램. 액티미드™는 12일에 대조군에 비하여 함께 자극하는 분자(co-stimulatory molecules) CD86 및 CD80의 감소를 일으킨다. 세포는 CD1a FITC 및 CD86 PE 항체, CD1a FITC 및 CD80 PE 항체, 또는 CD1a FITC 및 CD14 PE 항체로 이중 라벨되었다. A: DMSO로 처리되고 CD86 및 CD1a 세포에 대해 12일에 염색된 세포. B: DMSO로 처리되고 CD80 및 CD1a 세포에 대해 12일에 염색된 세포. C: DMSO로 처리되고 CD14 및 CD1a 세포에 대해 12일에 염색된 세포. D:액티미드™로 처리되고 CD86 및 CD1a 세포에 대해 12일에 염색된 세포. E: 액티미드™로 처리되고 CD80 및 CD1a 세포에 대해 12일에 염색된 세포. F: 액티미드™로 처리되고 CD14 및 CD1a 세포에 대해 12일에 염색된 세포. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 21(A-D). 1 내지 12일 액티미드™(1μM)에 노출된 CD34+세포로부터 생성된 돌출 세포의 12일에서의 플로우 시토그램. 액티미드™에 노출은 결국 접착분자 CD54 발현의 조절로 나타나는데, 대조군에 비하여 (도 21D에서, 서브판넬 E 및 F를 비교한다) CD54bright 발현에서의 감소 및 CD54dim 발현 증가를 초래한다. A: DMSO로 처리되고 HLA-DR에 대해 IgG1으로 염색된 세포. B: DMSO로 처리되고 CD54 및 CD40에 대해 염색된 세포. C: 액티미드™로 처리되고 HLA-DR에 대해 IgG1으로 염색된 세포. D: 액티미드™로 처리되고 CD54 및 CD40에 대해 염색된 세포. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 22 (A-B). 액티미드™는 CD34+ 전구 세포로부터 과립 백혈구 분화를 촉진한다. DMSO(도 22A) 또는 액티미드™(도 22B)의 존재 하에 12일 동안 성장된 다음, 과립 백혈구 표지자 CD15에 대한 항체로 라벨된 CD34+ 세포의 플로우 시토그램. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 표지자의 특별한 조합을 나타내는 세포 군의 백분율을 나타낸다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 23. 액티미드™는 CD1a+ 또는 CD14+전구체의 아포프토시스를 유발하지 않는다. CD1a+CD14- 및 CD1a-CD14+분리된 세포(DC 전구체)의 플로우 시토그램. CD34+전구세포는 SCF, Flt-3L, GM-CSF 및 TNF-알파의 존재하에서 6일간 배양되었다. 6일에, CD1a+CD14- 및 CD1a-CD14+ 세포는 자기 세포 소팅(magnetic cell sorting, Miltenyi)으로 분리되었고, 정제된 CD1a+CD14- 및 CD1a-CD14+ 군은 액티미드™(1 μM)과 함께 또는 없이 GM-CSF 및 TNF-알파의 존재하에 추가적인 2일동안 배양되었다. 그런 다음, 아포프토틱 세포는 Annexin V-FITC 염색, 아포프토시스에 대한 표지자, 프로피디움 아이오다이드(PI:propidium iodide)와 결합하여, 생존능력 탐침(viability probe)을 사용하여 모니터되었다. 각각의 시토그램에 표시된 백분율은 Annexin V-FITC 및/또는 프로피디움 아이오다이드에 대한 양성 염색 세포의 백분율을 나타낸다. Annexin V-FITC에 대한 양성인 세포의 수는 액티미드™로 처리된 및 대조군 세포에서 유사하였다(특히 각 시토그램에서 B3 및 B4를 비교한다). A: DMSO로 처리된 CD1a+CD14-세포. B: 액티미드™로로 처리된 CD1a+CD14-세포. C: DMSO로 처리된 CD1a-CD14+세포. D: 액티미드™로 처리된 CD1a-CD14+세포. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 24(A-D). 액티미드™의 존재 또는 부존재 하에 12일동안 성장한 CD34+세포의 플로우 시토그램. DMSO 대조군에 비하여 FITC-표지된 덱스트란의 감소된 섭취율에 의해 나타나는 바와 같이, 액티미드™는 만노오즈 수용체-매개 엔도시토시스에서 감소를 초래한다. A: DMSO 및 4°C. B. 액티미드™ 및 4°C. C: DMSO 및 37°C. B. 액티미드™ 및 37°C. 각각의 시토그램에서 백분율은 엔도시토시스를 나타내는 세포의 분획을 나타낸다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 25(A-D). 12일동안 배양되고 6 내지 12일 액티미드™의 존재 또는 부존재하에 배양된 CD34+ 세포의 플로우 시토그램. 액티미드™의 부존재 하에서 1-5일 배양한 후, 액티미드™의 존재하에 6-12일에 배양하는 것은 DMSO 대조군의 것에 비하여 만노오즈 수용체-매개 엔도시토시스가 결과로서 나타난다. 각각의 시토그램에서 백분율은 엔도시토시스를 나타내는 세포의 분획을 나타낸다. A: DMSO 및 4°C. B. 액티미드™ 및 4°C. C: DMSO 및 37°C. B. 액티미드™ 및 37°C. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 26. 액티미드™는 존재하는 항원에 대해서 12일동안 배양된 CD34+ 세포의 용량을 감소시킨다. CD34+ 세포는 액티미드™의 존재 또는 부존재 하에서 12일간 배양되었다; 액티미드™-처리된 세포는 12일에서 DMSO 대조군과 비교하여 실질적으로 감소된 자극도(stimulation index)를 보인다. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 27. 액티미드™는 6일에서 12일까지 액티미드™에서 배양된 CD34+세포에서 APC 감소 활성(reduction activity)을 거의 갖지 않는다. CD34+ 세포는 5일간 악티비드의 존재 또는 부존재 하에서 배양되었다. 처리된 세포의 항원-존재 용량은 대조군, DMSO-처리된 세포의 것과 비슷하다. 구체적으로 6.6을 참조한다.
도 28. GM-CSF 및 TNF-알파의 존재 하에서 배양된 CD34+ 조혈 전구세포의 분화 경로.
도 29. GM-CSF 및 TNF-알파의 존재 하에서 배양된 CD34+ 조혈 전구세포의 분화 경로에 대한 액티미드™의 영향을 보여주는 요약 차트. 구체적으로 6.6절을 참조한다.
도 30. 생쥐 Sca+Lin- 조혈 전구세포에 대한 성숙 조건을 나타내는 다이아그램. 세포들은 줄기세포 인자(SCF), Flt-3L, 과립 백혈구 마크로파지-콜로니 촉진 인자 (GM-CSF) 및 마크로파지-콜로니 촉진 인자 (MCSF)의 존재하에서, in the presence of DMSO 0. 1 % (대조군), 10 μM 액티미드™ 또는 10 μM 모든-트랜스 레티노익 산(all-trans retinoic acid:ATRA)의 존재 하에서 세포들을 DC 전구체 표현형으로 몰기 위해서 9일간 성장되었다. 그런 다음, 세포들은 GM-CSF 및 TNF-알파, 플러스 DMSO, 액티미드™ 또는 ATRA의 존재 하에서 생쥐 세포의 분화를 미숙 돌기 세포로 몰기위해서 9일로부터 12일까지 배양되었다. 구체적으로 6.8절을 참조한다.
도 31(A-E). 정상 배양 조건 하에서 9일에 존재하는 생쥐 세포(실시예 1, 물질 및 방법: 도 30의 설명 참조). 세포들은 CD80 (도 31A), CD11 (도 31B), CD32/16 (도 31C), MHC II ((I-Ab) (도. 31 D), CD 14 (도 31 E) 또는 Gr-1 (도 31IF)에 대한 항체로 라벨되었다. 9일에서 세포들은 CD88, CD11 및 CD32/16 표지자에 대한 것으로 라벨링을 나타내고, I-Ab 표지자에 대한 항체로 거의 라벨링 되지 않고, CD14 또는 Gr-1에 대해서는 전혀 라벨링되지 않았다. 구체적으로 6.8절을 참조한다.
도 32(A-I). DMSO, 액티미드™ 또는 ATRA로 처리된 12일에서의 생쥐세포의 플로우 시토그램. 세포들은 CD86 및 CD11b에 대한 항체로 라벨되었다. 도 32A-32C(윗줄): DMSO(대조군), 액티미드™ 또는 모든-트랜스 레티노익 산(ATRA)로 처리된 경우 CD86(Y축)을 나타내는 세포의 백분율을 나타내는 시토그램. 도 32D-32F(중간줄): 주 조직적합성 II(MHC II) 표지자를 나타내는 세포의 백분율; 윗줄에서와 같은 처리. 도 32G-32I(밑줄): CD11b를 나타내는 세포의 백분율; 윗줄에서와 같은 처리. 구체적으로 6.8절 참조한다.
6.1 실시예 1: CD34+ 전구 세포의 분화에 대한 탈리도마이드, Actimid™ 및 Revimid™의 효과
이하 실시예에서 있어서, CD34+(조혈 전구) 세포들의 분화에 대한 탈리도마이드(Thal), Actimid™("Actimid™") 및 Revimid™("Revimid™")의 효과 및 콜로니 형성 유닛(CFU)의 생성이 검토된다. 중요하게도, 상기 결과는 Actimid™ 및 Revimid™가 적혈구 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 명확하게 억제하는데 사용 가능하다는 것을 보여준 반면, 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성은 증강시켰고, 총 콜로니 형성 유닛(CFU-Total) 형성은 촉진하였음을 나타냈다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 줄기 세포의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있고, 또한 콜로니 형성의 속도를 자극하기 위하여 사용될 수 있으며, 골수 이식 및 백혈구 및/또는 혈소판 생성의 회복 속도를 개선시킴으로써 조혈 줄기 세포의 이식에 중요한 이점을 제공한다.
탯줄 혈액 CD34+ 조혈 전구체 세포는 96 웰 배양 디쉬에 웰당 1000 세포의 밀도로 20% 소태아 혈청 및 사이토카인(IL-3, G-CSF 및 kit-ligand (R&D Systems, Inc.)으로 보충된 IMDM 내에 플레이팅된다. 상기 세포는 탈리도마이드, Actimid™ 및 Revimid™에 노출되거나, 또는 DMSO (대조군 화합물)에 노출되고, 6일 동안 배양된다. 탯줄 혈액 CD34+ 세포는 96 웰 배양 디쉬에 웰당 1000 세포의 밀도로 20% 소태아 혈청 및 사이토카인(IL-3, G-CSF 및 kit-ligand(KL) (R&D Systems, Inc.)으로 보충된 IMDM 내에 플레이팅된다. 배양 후에, 니포는 염색되고, 형광 활성 세포 소터(sorter)(FACS)를 사용하여 분류된다. 염색된 세포 400ul는 배양되고, 1% 소태아 혈청을 가진 인 완충 생리식염수(PBS)로 1.0ml가 되도록 희석되었다. 세포는 줄기 세포 분화의 조절에 대한 영향을 결정하기 위해 카운팅된다. 얻어진 상기 카운터는 도 1에 도시된다.
이러한 결과는 본 발명에 따른 화합물이 조혈 전구 줄기 세포들의 리니지 수임의 조절에 효과적임을 나타낸다. 따라서, Actimid™ 및 Revimid™는 적혈구 세포 및 적혈구 콜로니(BFU-E 및 CFU-E)의 생성을 명확하게 억제하는데 사용 가능하다는 것을 보여준 반면, 백혈구 및 혈소판 형성 콜로니(CFU-GM)의 생성은 증강시켰고, 총 콜로니 형성 유닛(CFU-Total) 형성은 촉진하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 줄기 세포의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있고, 또한 특정 콜로니 형성 속도를 촉진하기 위하여 사용될 수 있으며, 골수 이식 및 백혈구 및/또는 혈소판 생성의 회복 속도를 향상시킴으로써 줄기 세포의 수임(commitment)을 바람직한 이식 가능한 계통으로 향하도록 함으로써 조혈 줄기 세포의 이식에 중요한 이점을 제공한다. 적혈구의 억제 및 Actimid™ 및 Revimid™에 의한 CD34+CD38- 전구 개체수의 팽창은 도 2에 도시된다.
6.2. 실시예 2: 인간 탯줄혈액 CD34+ 세포의 증식과 분화에 관한 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™) 및 탈리도마이드(Thalidomide)의 효과
다음의 실시예에서, CD34+ (조혈 전구)세포내에 있는 탯줄혈액(CB) 단핵세포의 증식과 분화에 관한 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™) 및 탈리도마이드(Thalidomide)의 효과가 연구된다. 탯줄혈액 단핵세포는 CD34+ (조혈 전구)세포의 소(少)모집단(母集團)을 포함하는 세포들의 혼합 모집단이다. 이 소(少) CD34+ (조혈 전구)세포 모집단의 부분 집합에는 CD34+CD38+ 세포들(전체 CB 단핵세포의 대략 1%)의 모집단 뿐만 아니라 CD34+CD38+ 세포들의 더 작은 모집단(전체 CB 단핵세포의 1% 이하)이 포함된다. 결과는 액티미드(Actimid™)가 CD34+ 세포들의 상향 조절(분화 촉진)을 초래하고, 양성 및 음성 조절과 비교해서 액티미드(Actimid™) 및 레비미드(Revimid™)가 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포의 분화를 둔화시키거나 억제시킨다는 것을 설명해준다.(도 3 ~ 도 7)
6.2.1. 물질과 방법
CB CD34+ 세포는 시토카인(IL3, GCSF 및 키트-리간드)(R&D 시스템)이 부가된 20% FCS IMDM(태아 장딴지 혈청/Iscove's Modified Dulbecco's Medium)내에서 24-웰 플레이트(24-well plate)에서 4×104 cells/ml로 초기화된다. 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™) 또는 탈리도마이드(Thal)는 3가지의 서로 다른 농도(5μg/ml, 1μg/ml 및 0.3μg/ml)로 배지(culture)내에 포함된다. 동일한 부피의 DMSO가 조절제로서 사용된다. 또한, 임의의 화합물은 음성 조절(negative control) 없이 사용된다.(도 3 ~ 도 7에서 "none"으로 지시됨) 세포들은 젖은 배양기내에 37℃, 5% CO2 조건에서 7일 동안 배양된 후, 각 웰(well)로부터 수집된다.
각 웰로부터의 전체 세포수는 CELLDYN® 1700으로 계수되고, CXCR4, CD45, CD34, CD38, CD 1lb의 발현 및 Gly-A 발현은 FACS(fluorescence-activated cell sorting) 염색에 의해 분석된다. 두개의 서로 다른 공여자(donor)(CB2276 및 CB2417)로부터의 CB 세포들은 서로 독립적으로 분리된 상태로 배양되고, 측정되며, 분석된다.(테이블 1)
6.2.2. 결과와 토의
CD34+ 세포의 시토카인-자극 팽창에 관한 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™) 및 탈리도마이드(Thalidomide)의 효과를 테스트했다. 도 4에 도시된 바와 같이, 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™) 및 탈리도마이드(Thalidomide)는 음성 조절(negative control)("none")과 비교할때 IL-3, 키트-리간드(KL) 및 G-CSF의 존재하에서 배양된 CD34+의 증식에 관하여 주목할만한 효과를 가지지 않았다. 그러나, DMSO 조절과 비교할 때, 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™) 및 탈리도마이드(Thalidomide)는 세포들의 수를 약간 더 증가시킨다. 이 실험들에서 동일한 양의 DMSO가 담체로서 사용되기 때문에 DMSO가 세포 증식에 관하여 부정적인 효과를 가진다는 것을 고려하면, 이 결과는 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™) 및 탈리도마이드(Thalidomide) 화합물이 IL-3, 키트-리간드(KL) 및 G-CSF의 존재하에서 배양된 CD34+의 증식에 관하여 자극 효능을 가진다는 것을 암시한다. 이점에 있어서, 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™)가 탈리도마이드(Thalidomide) 보다 더 큰 효능을 갖는다. 세포 분화의 발현에 관한 액티미드(Actimid™), 레비미드(Revimid™) 및 탈리도마이드(Thalidomide)의 효능은 표면 단백질 CXCR4와 CD34의 FACS 분석에 의해 분석된다.(도 3 및 도 4 참조) 탈리도마이드를 제외하고 액티미드(Actimid™)와 레비미드(Revimid™)는 CXCR4의 발현에 관하여 억제 효능을 나타낸다. 액티미드가 레비미드 보다 더 큰 효능을 갖는다. 표면 단백질 CD34+에 관하여, 액티미드는 CB2276과 CB2417 배지에서 모두 CD34+ 세포의 상향 조절(증식 촉진)을 유발한다. 그러나, 탈라도마이드와 레비미드는 다른 공여자를 제외한 하나의 공여자에서 약간 더 낮은 효능을 나타내었다. 흥미롭게도, 액티미드와 레비미드로 처리된 세포에 있어서, 세포가 조절되는 동안 CD34+와 CD34- 세포의 대부분은 CD38-가 되고, DMSO-처리 모집단 및 탈리도마이드-처리 모집단은 대부분 CD38+가 된다. 이것은 액티미드와 레비미드가 적혈구나 적혈구 집락(BFU-E와 CFU-E)의 생성을 억제하기 위해 사용되지만, 백혈구와 혈소판 형성 집락(CFU-GM)의 생성이나 전체 집락 형성 단위 생성은 확대한다는 것을 지시한다. 그러므로 본 발명의 방법은 줄기 세포의 분화를 조절하기 위하여 사용될 수 있고, 또한 집락 형성의 속도를 자극하기 위해 사용되는데, 골수 접목 및 백혈구의 회복 및/또는 혈소판 생성의 속도를 향상시키는 것에 의해 탯줄혈액 줄기세포 이식에 대하여 주목할만한 이익을 제공한다. 아래의 테이블 4 참조.
세포 분화의 발현에 관한 액티미드, 레비미드 및 탈리드마이드의 효능은 CD34+CD38+에 대한 CD34+CD38-인 세포 또는 CD11b+인 세포의 표면 단백질의 FACS 분석에 의해 분석된다.
테이블 1: 탯줄 혈액-유도 조혈전구 세포내의 CD34, CD38 및 CD11b의 세포 표면표지 발현과 세포 분화에 관한 효능에 대한 시험예
CD34 + CD38 -/ CD34 + CD38 + 세포 모집단
CB2276
Figure pat00011
CB2417
Figure pat00012
CD11b + 세포 모집단
CB2276
Figure pat00013
CB2417
Figure pat00014
CD11b+ 세포 군의 크기에 있어 유의적인 변화는 없었고, 레비미드™의 케이스에 있어, 좀 더 큰 CD11b+ 세포 모집단이 더 낮은 농도로 관찰된다.
그러나, CD1 lb 발현의 레벨은 평균 면역형광(mean immunofluorescence: MIF)에 의해 결정되는 바와 같이, 액티미드™-처리 세포 및 레비미드™-처리 세포에서 감소된다. 지시하는 CD11 b 발현은 억제된다. 이것은 액티미드™와 레비미드™의 존재하에서 배양될 때, CD11b+ 세포들이 적어도 분화상태에 놓여 있다는 것을 암시한다.
6.3. 실시예 3: 인간 탯줄 혈액 MNC 세포들에 관한 액티미드와 레비미드의 효능
이전 실시예에서, 액티미드™와 레비미드™는 탯줄 혈액 CD34+ 세포들의 발현을 하향-조절하고, CD34+CD38- 세포 모집단을 증가시키는 것으로 보인다. 이 실시예에 있어서, 액티미드와 레비미드는 탯줄 혈액 단핵세포(MNC)에 관해 거의 유사한 활성을 보인다.
6.3.1. 물질과 방법
표준화된 방법을 사용하여 냉동보존되고 해동되는 탯줄 혈액 MNCs는 표준 피콜 분리 방법(Ficoll separation method)에 의해 분리되고, 시토카인(IL6, KL 및 G-CSF 각각 10ng/ml)을 가진 20% FCS-IMDM에서, 24 웰-플레이트에서 0.5×106cells/ml로 3배 배양된다. 실험 그룹은 None(시토카인 단독), DMSO(1.7μl), 액티미드™(1.7μl DMSO에서 5.0μg), 레비미드™(1.7μl DMSO에서 5.0μg)이다. 배양된 세포는 1주일 배양후에 FACS 염색에 의해 분석되고, 수집된다. 그 결과가 테이블 2와 도 8 ~ 도 12에 요약되어 있다. 데이터는 3개의 독립된 웰로부터 평균 +/- SD로서 표현된다.
테이블 2
Figure pat00015
6.3.2. 결과와 토의
테이블 2와 도 8 ~ 도 12에 도시된 바와 같이, DMSO, 액티미드™ 또는 레비미드™로 배양된 MNCs의 전체 세포수는 제어 그룹("None" 시토카인 단독)에서 보다 더 작다. 이것은 DMSO의 효능으로 인한 것이다. MID 1으로 배양된 세포 배지가 모든 다른 그룹들 보다 CD34+ 세포들의 높은 퍼센트를 나타내지만, CD34+ 세포들의 전체 수는 모든 그룹에서 비슷하다. CD34+CD38- 세포들의 수는 IMJD1 및 레비미드™ 처리 세포들에서 더 높게 나타나고, 정제된 CD34+ 세포를 화합물로 처리한 결과는 일정하다. CD34+CD38- 세포들이 CD34+CD38+ 세포들 보다 더 높은 효율로 이식후에 접목되고, 증식된 덜 분화된 조혈 전구세포라는 것이 받아들여진다.(Dao et al., 1998, Blood 91(4): 1243-55; Huang et al., 1994, Blood 83(6): 1515-26)
DMSO는 탯줄 혈액 MNCs에서 CXCR4의 발현을 촉진한다. 액티미드™와 레비미드™는 두개의 제어 그룹과 비교할때 CD45+ 세포들에 관한 CXCR4 발현을 억제한다.
액티미드™-처리 세포와 레비미드™-처리 세포의 배지내에서 CXCR4+ 세포들의 대부분은 CD45 음성이다. 이 세포 모집단은 액티미드™-처리 세포와 레비미드™-처리 세포들에서 더 높게 나타난다.
이 결과는 액티미드™와 레비미드™가 줄기 세포들의 냉동 보존을 위한 노출 및/또는 냉동보존, 해동의 해로운 효과를 중화시키기 위해 줄기 세포를 조건화시키는데 유용하다는 것을 나타낸다. 또한, CD34+와 CD14+ 세포의 생성을 DMSO로 억제하는 것이 액티미드™와 레비미드™로 처리하는 것에 중화될 수 있고, CD34+와 CD14+ 세포들의 용량을 증식시키는 것을 강화한다.
6.4. 실시예 4: 단핵세포 생성에 관한 액티미드, 레비미드 및 탈리드마이드의 효능
6.4.1. 물질과 방법
정제된 인간 탯줄혈액 CD34+ 세포(90% 보다 더 큰 CD34+)가 젖은 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서, 14일 동안, 4×104 cells/ml로 시코카인(IL3, IL6, G-CSF, KL 및 Epo)으로 보충된 20% FCS IMDM 배지에서 배양된다. 실험 그룹은 (ⅰ) DMSO나 화학적 화합물이 첨가되지 않은 그룹("None"), (ⅱ) DMSO 단독 그룹, (ⅲ) DMSO내에 용해된 탈리드마이드 그룹, (ⅳ) DMSO내에 용해된 액티미드™ 그룹 및 (ⅴ) DMSO내에 용해된 레비미드™ 그룹으로 구성된다. 세포들의 부분 표본은 CD34-PE 짝 단클론항체와 CD14-FITC 짝 단클론항체와 함께 수집되고, 염색된다.
6.4.2. 결과와 토의
"None" 그룹은 전체 세포의 단지 0.95%만이 CD34+이다. DMSO-처리 그룹에 있어서는 세포들의 단지 0.17%만이 CD34+ 이었다. 이는 DMSO가 CD34+의 보존과 팽창에 있어서 부정적인 효능을 갖는 것을 암시한다. 탈리드마이드-처리 그룹에 있어서, 세포들의 0.24%가 CD34+이고, 이는 DMSO로 처리된 세포들과 유의적으로 다르지 않다. 그런, 액티미드™- 및 레비미드™-처리 그룹에 있어, 더 많은 퍼센트(각각 18.7%와 7.1%)의 CD34+ 세포가 존재하였다.(도 13에 묘사된 실험결과와 동봉된 도면 범례를 참조하라)
CD14는 단핵세포를 위한 표지이다. "None"그룹에 있어서, 세포들의 11.5%가 CD14+인 반면에, DMSO-처리 그룹에 있어서는 3.7%가 CD14+인데, 이는 단핵세포의 생성이 억제된다는 것을 나타낸다. 상술한 CD34 발현에 대한 케이스에서 살펴 본 바와 같이, 탈리드마이드-처리 그룹과 DMSO-처리 그룹에 대한 결과는 서로 비슷하다. 또한, 액티미드™-처리 그룹과 레비미드™-처리 그룹들이 DMSO에 노출되면, DMSO에 의해 억제된 단핵세포 생성이 액티미드™나 레비미드™로 처리되는 것에 의해 극복된다는 것을 추론할 수 있다.
6.5. 실시예 5: 탯줄 혈액 및 태반으로부터 이식된 유핵세포에 관한 액티미드 전처리의 효능
이 실험은 액티미드™ 전처리가 이식된 태반 유핵 세포(PLNC), 탯줄 혈액 유핵세포(UCBNC) 및 골수 세포(BMNC)의 생존을 강화시킨다는 것을 설명한다.
6.5.1. 물질과 방법
태반 유핵 세포(PLNC), 탯줄 혈액 유핵세포(UCBNC) 및 골수 세포(BMNC)는 인간 공여자로부터 획득된다. PLNC와 UCBNC는 상기 섹션 5.4에서 기술한 방법을 사용하여 태반과 탯줄로부터 획득된다.
세포들은 2% 인간 CB 혈청이 부가된 DMEM에서 24동안 10g/ml 액티미드™로 인큐베이션하는 것에 의해 전처리된다. 그리고 나서, 세포들은 씻겨지고, 자가 플라즈마내에서 재부유된 후, 표준화된 방법에 따라 치사(致死) 방사선 조사(900cGy)에 의해 생성된 골수 절제를 가지는 수용자로서의 성인 SJL/L 마우스들(잭슨 연구소)의 정맥내로 투여된다. 그러한 방사선 조사는 50일 뇌조사에 의한 90% 치사율 보다 더 높다.(Ende et al., 2001, Life Sciences 69(13): 1531-1539; Chen and Ende, 2000, J. Med. 31: 21-30; Ende et al., 2000, Life Sci. 67(1): 53-9; Ende and Chen, 2000, Am.J.Clin. Pathol. 114: 89)
6.5.2. 결과와 토의
이식된 PLNC, UCBNC 및 BMNC에 관한 액티미드 전처리의 효능이 아래의 테이블 3에 나타나 있다. 테이블 3에 도시된 바와 같이, 액티미드™ 전처리는 이식된 태반 유핵 세포(PLNC), 탯줄 혈액 유핵세포(UCBNC) 및 골수 세포(BMNC)의 생존을 증가시킨다.
테이블 3
Figure pat00016
약어
PLNC : 태반 유핵 세포
UCBNC : 탯줄 혈액 유핵 세포
BMNC : 골수 세포
N/A : 적용하지 않음
6.6. CD34+ 전구세포의 분화의 변형
6.6.1. 물질과 방법
골수 세포와 탯줄혈액 CD34+ 전구세포가 클로네틱스(Clonectics)로부터 획득되고, SCF, Flt-3L, GM-CSF 및 TNF-α의 존재하에서 6일 동안 BIT 95000(StemCell Technologies)과 함께 아이스코브 MDM(Iscove's MDM)에서 배양된 후, GM-CSF 및 TNF-α의 존재하에서 추가로 6일 동안 더 배양된다.
세포 표면 표현형의 분석: 세포들은 6일째에 4℃에서 30분 동안 이중 염색을 거치고, 12일째에는 FITC와 PE 집합체(conjugated) mAbs를 사용하여 이중 염색을 거친다. 사용된 항체는 BD 파르민겐(BD Pharmingen)으로 부터의 CD34(PE), CD38(FITC), CD33(FITC), CDla(FITC), CD86(PE), CD14(PE), CD83(PE), CD54(PE), CD11b(PE), CD11c(PE), HLA-DR(PE), CD15(FITC) 및 밀테니이(Miltenyi)로부터의 CD133(PE)이다. 형광 분석은 10,000 이벤트(Coulter)후에 팍스캔 플로우 세포측정기(FACScan flow cytometer)에 관해서 수행된다. 결과는 네가지의 독립적인 실험에 의해 산출된다.
아포프토시스(apoptosis)의 검출: 포스파티딜 세린(Phosphatidyl serine) 노출은 제조 명령에 따른 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)(BD Pharmingen apoptosis detection kit I)와 결합된 아네신(Annexin) V-FITC 염색을 사용하여 결정된다.
포식작용(Phagocytosis): 세포들의 엔도시틱(endocytic) 활성은 FITC-덱스트란(dextran) 섭취를 측정하는 것에 의해 분석된다. 세포들은 음성 조절로서 4℃에서 1시간 동안 그리고 37℃에서 1시간 동안 완전한 배지내에서 1mg/ml 덱스트란-FITC(Sigma)로 인큐베이트된다. 결과는 네가지의 독립적인 실험에 의해 산출된다.
T세포 증식 측정: 13일 배양후, CD34+-유인 DC 세포들을 수집하고나서, 미토미신 C(mitomicyn C)(50 μg/ml, Sigma)로 처리한 후, 건강 지원자로부터의 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)로부터 정제된 동종이형 성인 T세포를 위한 촉진 세포로서 사용된다. CD3+ T반응자 세포들은 5×104 cells/well의 농도에서 사용된다. 촉진 세포들은 화학 발광 검출을 위해 검은 96-웰의 평평한 바닥에서 깨끗한 바닥의 조직배양 플레이트에서 T세포들에 대해 다단계 투여된다. 배양은 10% 열-비활성화 FBS, 글루타민(glutamine) 및 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin)으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 수행된다. 배양 6일 후에, 세포 증식이 BrdU 화학발광 측정기(Roche, Nutley NJ)로 측정된다. 결과는 3배 배양으로부터 얻어진 평균 ±SD로서 존재한다.
6.6.2. 결과와 토의
액티미드™는 CD34+ 전구로부터 DC의 개발을 변경한다. DC의 생성에 관한 액티미드™의 효능을 연구하기 위해, CD34+ 전구 세포들을 확장과 성숙기의 12일 동안(1일째 부터 12일째 까지) 또는 성숙기의 6일 동안(6일째 부터 12일째까지) 액티미드™ 없이 또는 액티미드™와 함께 배양했다.(도 14) 1일째 부터 12일째까지의 액티미드™ 첨가는 DC 표현형(도 15)의 획득을 억제하고, 더 중요하게는 CD34+CD38- 모집단을 증가시키며, CD34+CD38- 세포들의 정상적인 분화를 CD34+CD38- 세포들로 변경시킨다.(도 16) 그러나, 액티미드™로 처리된 CD34+ 세포는 CD33 골수 표지를 획득했고, 이들 세포들은 6일째에 CD34+CD38-CD33+ 표현형이 존재했다. 액티미드™는 6일째에 CD1a+ 세포들의 생성을 방지하고, 특히 이중 양성 CD86+CD1a+ 세포들의 생성을 방지한다. 이 이중 양성 모집단은 표피 랑게르한수 DC의 전구물질인 것으로 생각된다. 또한, 액티미드™는 피부 DC와 단핵세포/대식세포 모두에 일어나는 CD14+CD1a-세포들의 생성을 감소시킨다. 초기 전구 모집단(CD34+CD38- 세포)에서의 증가와 골수 DC 전구(CD1a+CD14- 및 CD1a-CD14+ 세포)에서의 블록이 용량 의존적이고, 액티미드™의 1μM에서 최대값에 도달한다. 이 효능은 가역적이고, CD34 분화 경로와의 간섭은 CD34+ 전구가 적어도 3일 이상 동안 액티미드™로 배양되면 단지 관찰된다.(도 18)
0일과 6일 사이의 액티미드™의 복합 투여는 CD34+ 모집단에서의 증가를 증대시킨다.(도 19a)
또한, 액티미드™의 존재하에서 배양된 CD34+ 전구세포는 12일째에 공동 촉진 분자(CD86, CD80)의 억제된 발현을 표시한다.(도 20) CD54 접착 분자는 CD54bright의 억제된 발현과 CD54dim 모집단의 증가된 발현으로 변경된다.(도 21) HLA-DR 분자의 발현은 액티미드™로 처리된 CD34+ 전구내에서 감소된다.
어떠한 처리도 없이 0일-6일 동안 배양후에 6일째에 액티미드™를 첨가했을때, 또한 이미 CD1a+ 모집단이 생성되어 있을때, 액티미드™는 CD1a+ 모집단의 지속성을 증가시킨다.(테이블 1) 12일째에 액티미드™-처리 배지가 DMSO 제어 배지 보다 상대적으로 더 많은 CD1a+ 전구들을 함유한다. 또한, 6일째에 액티미드™를 첨가함에 따라, CD34+ 분화 세포들은 CD14+ 전구들의 생성과 공동-촉진 분자(CD86, CD80)들의 발현을 감소시킨다.
[표 1]
6일 부터 12일까지 액티미드의 존재하에서 CD34+ 전구 세포로부터 생성된 DC의 12일째 표현형 특성
Figure pat00017
액티미드™ 과립구적혈구의 분화를 촉진한다. DC 생성에 장애가 발행된다면 골수 모양의 분화 경로에 변화와 관련되는지를 결정하기 위해 골수장애 표지인 CD15의 발현을 모니터하였다. CD15 표면 분자의 발현은 액티미드™(도 22)가 존재하는 곳에서 배양되어진 CD34+ 전구 세포를 증가시켰다. 시토카인 칵테일이 존재하는 곳에서 DC 분화가 유도되었으며, 액티미드™의 첨가는 전구 세포를 더욱 과립구 적혈구 유사한 발현형으로 팽창/성숙으로 전환시켰다. 또한, 골수장애 분화에서의 편중도를 연구를 위하여, 랑게르한섬 세포와 사이질 DC를 위한 DC 전구체에 의해 발현되는 CD11c과, 과립구 적혈구 전구체로 발현되는 CD15의 2개의 표지의 발현을 모니터링하였다. CD11c+CD15-군에서의 감소는 CD11c-CD15+ 과립구 군의 동반된 증가와 관련있었다 (도 19b). 흥미롭게도 액티미드™의 다회 투여는 과립구 적혈구 계통으로 전이하는 것을 증가시켰다.
DC 생성에 대한 장애는 DCV 전구체의 특이한 살해에 의해 매개되는 것은 아니다. DC 전구체 내에서 감소가 특이적 살해에 의해 매개되는 지를 결정하기 위해, CD34+ 전구 세포는 SCF, Flt-3L, GM-CSF 및 TNF-α가 존재하는 상태에서 6일의 기간 동안 배양되었다. 6일째에, CD1a+CD14- 및 CD1a-CD14+ 세포(DC 전구체)들이 자기적 세포 분류(말테니)법에 의해 분리되었다. 정제된 양은 추가적으로 2일 동안 GM-CSF 및 TNF-α가 존재하는 상태에서, 액티미드™(1마이크로몰)로 처리하거나 존재하지 않는 상태로서 배양시켰다. 액티미드™의 처리(도 23)에 의존하는 아넥신 V+-PI-(초기 세포 자멸사) 및 아넥신V+-PI+(후기 세포자멸사) 기준에서는 어떠한 유효한 증가도 없었다.
CD34+ 전구 세포로부터 파생되는 DC의 기능적인 활동도가 변경되었다. 액티미드™의 존재 또는 부존재하에서 시토카인으로 배양되어진 CD34+ 전구 세포로부터 파생되는 세포의 포식 능력은 덱스트란-FITC의 만노즈 리셉터 매게 엔도사이토시스에 의해 분석되어졌다. 액티미드™가 1일에서 12일까지 첨가되었을 때, DMSO 조절(도 24)에 비교하여 포식능력의 상당한 감소가 있었다. 액티미드™가 6일에서 12일까지 첨가되었을때, 포식능은 DMSO 조절 세포(도 25)에 비교할만 하게 되었다.
액티미드™의 존재 또는 부존재한 조건에서 시토카인으로 배양된 CD34+ 세포의 항원 표현 능력(APC)은 12일째 혼합 류코사이트 반응(MLR) 분석에서 CD34+ 동종이형 T 세포의 증식을 유도하는 능력에 대한 측정을 통하여 평가되었다. 액티미드™는 1일에서 12일까지 첨가되었을때, CD34+ 세포는 DMSO 조절(도 26)에 비교되는 정도의 T-세포의 증식을 자극하기 위해 감소된 능력을 나타내었다. 반대로, 액티미드™가 6일부터 12일까지 첨가되었을 때, T-세포의 증식을 자극하기 위한 능력이 DMSO-조절 세포(도 27)에 비교될만하였다. CD34+ 세포에 의해 수행된 정상적인 분화 경로가 도 28에 나타나 있다.
이러한 결과는 액티미드™가 극적으로 CD34+ 전구 세포가 가지 세포로 분화되는 것을 어렵게한다는 것을 알려주고 있다. 그 결과로서, 액티미드™가 세포에 처리되면, 낮은 포식 능력과 APC 능력의 감소가 나타났다. 액티미드™는 초기에는 조혈 전구체인, CD34+CD38- 세포를 증가시켰다는 점 더욱 중요하다. 초기 조혈 전구체들은 이식 능력을 향상시키며 NOD-SCID 마우스 모델(타마키 등, J. Neurosci. Res. 69(6):976-86(2002)) 내의 재증식을 개선시키는 것으로 보여주고 있다. 더구나, 액티미드™가 골수 장애 분화가 가지 세포 분화를 선호하는 시토카인 압력이 존재함에도 과립백혈구 계통으로 전환됨으로써 CD34+ 세포 분화를 편향시켰다. 또한, 액티미드는 CD34+ 세포에 관하여 중독 효과를 가지지 않으며, 증식에 대한 세포의 능력을 약화시키지 않는다는 것을 발견하였다. 이러한 DC 기능의 조절 및 과립구성 분화의 증진은 다양한 암, 면역 장애, 감염 질병의 치료 및 조직 이식과 재생 의학에서 중요한 치료적 유용성을 가질 수 있다.
상술한 것에 대한 그래픽적인 요약을 위해 도 29를 참조하라
6.7. CD133+ 전구세포의 Actimid™ 모듈레이트 디퍼렌시에이션
Actimid™의 많은 도스는 CD34+ 집단의 증가를 강화시킴과 동시에, 통상적으로 CD34brihht 조혈 전구세포와 소정의 원시 CD34- 소집단에 의해 발현되는 CD133의 발현도 증대시킨다(도 19a, 19b 참조). Actimid™은 CD34+ CD133+ 원시 조혈세포를 풍부하게 함으로서, 줄기세포를 이식한 후에 조혈을 회복시키는 임상결과를 나타낸다. 더욱이, CD133+ 줄기세포는 또한 내피선을 발생시켜 상처 회복에 기여한다. Actimid™의 많은 도스는 랑거한스 DC 전구체(precursor)의 발생에 있어서 블록을 악화시키지 않는다.
6.8. 골수(BM) Sca+ 조혈 전구세포로부터 생쥐 가지세포의 발생
6.8.1. 원료 및 방법
순계 C57BL/6 쥐로부터 얻은 골수를 클로네틱스로부터 구하였다. 조혈 Sca+Lin- 전구세포들은 스핀셉(SpinSep) 생쥐 프로제니터 인리치먼트 칵테일(StemCell Technologies)을 사용하여 증가시켰고, 생쥐 성장인자 SCF, Flt3L, GM-CSF 및 M-CSF의 존재하에서 9일동안 BIT 95000(StemCell Technologies)을 구비한 Iscove's MDM 내에서 배양하여, Sca+ 세포와 DC 전구체 표현형의 증식을 촉진한 다음, GM-CSF 및 TNF-α의 존재하에서 3일동안 더 배양하여 세포들이 미성숙 DC 표현형이 되도록 하였다. 도 30을 보라. 풍부해진 Sca+Lin- 세포들은 DMSO(0.1%), 10μM의 Actimid™ 또는 10μM의 트렌스 레니노익 애시드(ATRA)(ICN Biomedicals)존재하에서 배양하였다. 화합물은 0일 및 9일에 세포에 가해졌다.
생쥐 세포 표면 표현형의 분석: 생쥐 세포는 9일 및 12일에 FITC 및 PE를 사용하여 이중 염색(실온에서 14분)을 행하였다. 사용된 항체는 BD Pharmingen으로부터 얻었다: 밀테니(Miltenyi)로부터 Sca(PE), CD1lb(FITC), Gr-1(FITC), CD86(PE), CD14(PE), CD80(PE), I-Ab(PE), CD40(PE) 및 CD32.1/16.1(FITC). 형광 분석법을 10,000번 획득 후에 FACScan flow cytometer(Coulter)에서 수행하였다.
6.8.2. 결과 및 토의
Actimid™가 Sca+ 전구(progenitor)로부터 생쥐 DC의 발육을 변화시키는 것으로 나타났다. 9일에 세포는 가지/골수모양의 마커들인 CD32/16(Fc 수용체), CD11b, CD80의 높은 표면 발현, I-Ab 및 CD86의 낮은 발현 및 CD14 및 Gr-1과 같은 선형 마커로서 낮은 발현을 갖는 DC 전구체 표현형을 나타낸다(도 31).
Actimid™는 9일까지는 세포 표면 마커 발현에 대하여 효과가 없는 반면, ATRA는 CD80, I-Ab 및 Sca+ 발현에 대한 현저한 억제조절(downregulation)을 나타낸다(데이터는 기재하지 않음). 그러나, 12일이 되면 Actimid™는 CD86 및 bright I-Ab 발현에 대한 억제조절(downregulation)과, CD11b 발현에 대한 촉진조절(upregulation)을 나타낸다(도 32). ATRA도 유사한 효과를 나타내나 Actimid™보다 더 현저한 효과를 나타낸다. 더불어, Actimid™는 CD40과 CD80의 발현에 대한 효과가 없는 반면, ATRA는 이들 분자에 대한 현저한 억제조절을 나타낸다(데이터 미기재).
이러한 결과는 Actimid™이 CD86과 MHC II의 발현을 억제조절하므로서 DC 전구체의 분화를 억제하여 DC를 미성숙하게 한다는 것을 시사한다. 이러한 화합물의 효과는 인간 조혈 전구에서 관찰된 것만큼 극적이지는 않으며, 쥐 내에서 Actimid™의 낮은 활성은 다른 모델에서 in vitro 및 in vivo의 그것에 필적한다. Actimid™의 효과는 쥐 내에서 테트라토겐(tetratogen)인 ATRA의 효과보다 훨씬 작다.
6.9. IMiD 이외의 화합물에 대한 분화분석의 적용
상술한 방법론, 즉, Actimid™과 같은 IMiD의 CD34+ 세포와 같은 초기 전구세포의 분화에 대한 효과 시험은 임의의 관심있는 화합물에도 적용될 수 있는데, 그 분화에의 효과를 아는 것이 요구되고 있다. 이 분석 방법의 다른 화합물에의 확장예로서, 우리는 (DMSO-처리된) 컨트롤 세포에 대한 DC계로의 CD34+ 세포의 분화에 대하여, Actimid™의 효과와 레티노인산(ATRA) 및 아스피린의 효과를 비교하였다. 레티노인산은 세포 증식 및 분화에 대한 알려진 효과, 어떤 암에 대한 치료용도, 및 그 알려진 기형유발작용 때문에 연구되어 왔다. 한편, 아스피린은 면역조절 기능 없는 범용 항염증제라는 점에서 연구되었다. SCF, Flt-3L, GM-CSF 및 TNF-α의 존재하 및 화합물의 존재 또는 부존재하에 6일 동안 배양된 CD34+ 전구세포의 6일째 결과는 다음 표 2에 기재된 바와 같다(윗쪽 화살표는 세포수의 증가, 아래쪽 화살표는 감소를 나타낸다).
표 2. CD34+ 전구 세포 분화에 대한 액티미드™, 레티노익 산, 및 아스피린의 영향 비교
Figure pat00018
문헌에서 다른 약제들은 세포 분화를 조절하는 것으로 나타났는데, 예를 들면, 최근의 논문은 CD34+ 전구세포로부터의 DC 발생의 피질스테로이드에 의한 조절기능을 보고하고 있다. 결과는 CD1a+ 수의 증가 및 CD14+ 수의 감소라는 점에서 Actimid™과 다르다.
6.10. 실시예 10: 특정 세포 타입으로의 분화 유도
제대혈 세포(cord blood cell) 및/또는 배아-유사 줄기 세포는 성장 인자에 노출됨으로써 특정 세포 타입으로 분화하도록 유도된다. 유도를 유발하기 위해 사용된 성장 인자는 다음의 것들을 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다: GM-CSF, IL-4, Flt3L, CD40L, IFN-알파, TNF-알파, IFN-감마, IL-2, IL-6, 레티노인산, 기본 섬유모세포 성장 인자, TGF-베타-1, TGF-베타-3, 간세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 카디오트로핀-1, 안지오텐시노겐, 안지오텐신 I(AI), 안지오텐신 II(AII), AII AT2 타입 2 수용체 작용제, 또는 그 유사체 또는 절편.
6.10.1. 뉴런으로의 분화 유도
본 실시예는 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포의 뉴런으로의 분화 유도에 대해 서술한다. 다음은 뉴런 분화 유도에 사용된 방법이다.
1. 태반 줄기 세포를 DMEM/20% FBS 및 1mM 베타-머캅토에탄올(mercaptoethanol)로 이루어진 예비유도 매체에서 24 시간 성장시킨다.
2. 예비유도 매체가 제거되고 세포들을 PBS로 세정한다.
3. DMEM 및 1-10mM 베타머캅토에탄올로 이루어진 뉴런 유도 매체를 첨가한다. 대안으로, DMEM/2% DMSO/200μM 부틸레이티드 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole)로 이루어진 유도 매체가 뉴런 분화 효율을 증진시키기 위해 사용될 수 있다.
4. 어떤 실시예에서는, 형태학적 및 세포적 변화가 무혈청 베타머캅토에탄올 매체에의 노출후 60분만에 일어날 수 있다(Woodbury et al., J. Neurosci. Res., 61:364-370). RT/PCR이 예컨대 신경 성장 인자 수용체 및 신경필라멘트 중쇄 유전자의 발현을 평가하는 데에 사용될 수 있다.
6.10.2. 지방세포로의 분화의 유도
본 실시예는 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포의 지방세포로의 분화 유도에 대해 서술한다. 다음은 지방 분화 유도에 사용된 방법이다.
1. 태반 줄기 세포를 MSCGM(Bio Whittaker) 또는 15% 제대혈청이 첨가된 DMEM에서 성장시킨다.
2. 유도/유지의 세 사이클이 사용된다. 각 사이클은 제대혈에 지방발생 유도 매체(Adipogenesis Induction Medium)(Bio Whittaker)를 공급하고, 세포들을 3일 동안(37℃, 5% CO2에서) 배양한 후, 지방발생 유도 매체(Bio Whittaker)에서 1 내지 3일 동안 배양하는 것으로 이루어진다. 사용된 유도 매체는 1μM 덱사메타손, 0.2mM 인도메타신, 0.01mg/ml 인슐린, 0.5mM IBMX, DMEM-하이 글루코스, FBS, 및 항생제를 함유한다.
3. 유도/유지의 세 사이클이 종료한 후, 세포들을 지방발생 유지 매체에서 추가적으로 7일 동안 배양한다. 매체는 매 2,3일 마다 교환한다.
4. 지방발생은 친지성 염색 오일 레드 O를 이용하여 쉽게 관찰할 수 있는 다중 세포질내 지질소포의 현상(development)에 의해 평가될 수 있다. 단백질 유전자를 묶는 지방산 및 리파아제의 발현을 검사하기 위해 RT/PCR 분석이 행해진다.
6.10.3. 연골세포로의 분화 유도
본 실시예는 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포의 연골세포로의 분화 유도에 대해 서술한다. 다음은 연골발생 분화 유도에 사용된 방법이다.
1. 태반 줄기세포를 MSCGM(Bio Whittaker) 또는 15% 제대혈청이 첨가된 DMEM에서 유지시킨다.
2. 태반 줄기세포를 무균 폴리프로필렌 튜브로 분별한다. 세포들을 원심분리(5분간 150xg)하고, 불완전 연골발생 매체(Incomplete Chondrogenesis Medium)(Bio Whittaker)로 두 번 세정한다.
3. 세정 완료후, 세포들을 0.01μg/ml TGF-베타-3을 함유하는 완전 연골발생 매체(Complete Chondrogenesis Medium)(Bio Whittaker)에 5x10(5) 세포/ml의 농도로 다시 현탁시킨다.
4. 0.5ml의 세포들을 15ml 폴리프로필렌 배양 튜브로 분별한다. 세포들을 5분간 150xg로 펠릿화한다. 펠릿은 매체 속에서 손상되지 않고 남아있다.
5. 느슨하게 막아진 튜브들을 37℃, 5% CO2 하에 24시간 배양한다.
6. 세포 펠릿들에 매 2,3일 마다 새롭게 준비된 완전 연골발생 매체를 공급한다.
7. 펠릿들을 저속 교반기를 사용하여 날마다 교반함으로써 매체 속에 현탁된 채로 유지시킨다.
8. 배양액에서 14-28일 보낸 후에 연골발생 세포 펠렛은 수집된다.
9. 연골발생은 예컨대, 에소이노필릭(esoinophilic) 기반 물질의 발생을 관찰함으로써, 세포 형태를 분석함으로써, 및/또는 콜라겐 2 및 콜라겐 9 유전자 발현을 위한 RT/PCR에 의해 특성화할 수 있다.
6.10.4. 골세포로의 분화 유도
본 실시예는 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포의 골세포로의 분화 유도에 대해 서술한다. 다음은 골발생 분화 유도에 사용된 방법이다.
1. 부착 배지 태반 줄기세포를 MSCGM(Bio Whittaker) 또는 15% 제대혈청이 첨가된 DMEM에서 배양한다.
2. 배지조직 배양 플라스크 안에 24시간 동안 놓아둔다.
3. MSCGM을 0.1μM 덱사메타손, 0.05mM 아스코르빈산-2-포스페이트, 10mM 베타 글리세로포스페이트를 함유하는 골발생 유도 매체(Osteogenic Induction Medium)(Bio Whittaker)로 대체함으로써 골발생 분화를 유도한다.
4. 세포들에 매 3,4일 마다 2-3주 동안 골발생 유도 매체를 공급한다.
5. 분화는 칼슘-특정 염색 및 알칼린 포스파타아제 및 오스테오폰틴 유전자 발현을 위한 RT/PCR을 이용하여 분석된다.
6.10.5. 간세포로의 분화 유도
본 실시예는 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포의 간세포로의 분화 유도에 대해 서술한다. 다음은 간발생 분화 유도에 사용된 방법이다.
1. 태반 줄기세포를 간세포 성장인자 20ng/ml; 및 표피 성장인자 100ng/ml를 첨가한 DMEM/20% CBS에서 배양한다. FBS 대신에 KnockOut Serum Replacement가 사용될 수도 있다.
2. 유도 플라스크에 IL-6 50ng/ml을 첨가한다.
6.10.6. 췌장세포로의 분화 유도
본 실시예는 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포의 췌장세포로의 분화 유도에 대해 서술한다. 다음은 췌장 분화 유도에 사용된 방법이다.
1. 태반 줄기세포를 기초 섬유모세포 성장인자 10ng/ml; 및 전환 성장인자 베타-1 2ng/ml를 첨가한 DMEM/20% CBS에서 배양한다. CBS 대신에 KnockOut Serum Replacement가 사용될 수도 있다.
2. 네스틴-양성(nestin-positive) 신경세포 배양액으로부터의 지속 매체를 50/50의 농도로 매체에 첨가한다.
3. 세포는 14-28일 동안 배양되고, 3-4일 마다 영양공급된다.
4. 분화는 RT/PCR에 의한 인슐린 단백질 또는 인슐린 유전자 발현 분석을 통해 특성화된다.
6.10.7. 심장세포로의 분화 유도
본 실시예는 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포의 심장세포로의 분화 유도에 대해 서술한다. 다음은 근육 분화 유도에 사용된 방법이다.
1. 태반 줄기세포를 레티노인산 1μM; 기초 섬유모세포 성장인자 10ng/ml; 전환 성장인자 베타-1 2ng/ml; 및 표피 성장인자 100ng/ml를 첨가한 DMEM/20% CBS에서 배양한다. CBS 대신에 KnockOut Serum Replacement가 사용될 수도 있다.
2. 대안으로, 태반 줄기세포를 50ng/ml의 카디오트로핀-1(Cardiotropin-1)이 첨가된 DMEM/20% CBS에서 24시간 배양한다.
3. 대안으로, 태반 줄기세포를 무단백질 매체에서 5-7일간 유지하고, 인간 심장근육 추출물로 자극한다(증대 투약 분석(escalating dose analysis)). 심장근육 추출물은 1% 제대혈청이 첨가된 1% HEPES 완충액에 1 그램의 인간 심장근육을 균질화시켜 제조한다. 현탁액은 60분간 배양하고, 원심분리하여 상청액을 모은다.
4. 세포들을 매 3,4일 마다 재공급하면서 10-14일간 배양한다.
*5. 분화는 카디악 액틴(cardiac actin) RT/PCR 유전자 발현 분석을 이용하여 평가된다.
6.10.8. 분화 전 및/또는 후의 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포의 특성화
배아-유사 줄기세포, 제대혈 및/또는 배아-유사 줄기세포로 스파이크된 제대혈의 수는, 형태학적 변화를 측정함으로써, 흐름세포측정과 같은 기술을 이용한 세포 표면 마커에 의해, 그리고 PCR과 같은 기술을 이용한 유전자 발현의 변화를 측정함으로써, 분화 전 및/또는 후에 특성화된다. 성장인자에 노출된 세포들 및/또는 분화된 세포들은 다음의 세포 표면 마커의 존재 또는 부존재에 의해 특성화된다: CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, 및 ABC-p+. 바람직하게, 배아-유사 줄기세포는 분화전에, 세포 표면 마커 OCT-4+, APC-p+, CD34- 및 CD38-의 존재에 의해 특성화된다. 이러한 마커들을 가지는 줄기세포들은 인간 배아 줄기세포 만큼 다능하다. 제대혈은 분화전에, 세포 표면 마커 CD34+ 및 CD38+의 존재에 의해 특성화된다. 배아-유사 줄기세포, 탯줄 혈액 세포 및/또는 배아-유사 줄기 세포가 주입된 탯줄 혈액 세포의 군들로부터 유래된 분화된 세포는 바람직하게는 이러한 마커들을 발현하지 않는다.
본 발명은 상술한 특정의 실시예들에 의해 그 범위가 한정되는 것은 아니다. 여기에 서술된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형예가 본 명세서의 서술로부터 이 기술분야의 전문가들에게는 자명할 것이다. 그러한 변형예들은 후술하는 특허청구범위에 속하는 것이다.
7. 문헌
본 명세서에서 인용된 모든 레퍼런스들은 본 명세서에 그 전체가 레퍼런스로서 통합되고, 각 개별 간행물, 특허 또는 특허출원에서 구체적으로 또 개별적으로 시사하고 있는 바와 같은 한도에서의 모든 의도에서, 그 전체가 레퍼런스로서 통합된다.
모든 간행물의 인용은 본 출원의 출원일 이전의 개시를 위한 것이고, 이것이 선행 발명이라는 이유로 그러한 간행물보다 본 발명이 앞선 것이 아니라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 아니된다.

Claims (17)

  1. 줄기 세포 또는 전구 세포가 분화하는 조건에서 아미노-치환 탈리도미드(thalidomide) 아나로그와 상기 줄기 세포 또는 전구 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 아미노-치환 탈리도미드 아나로그는 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온 및 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온으로 구성된 그룹으로부터 선택되고,
    여기서 상기 접촉은 인 비트로에서 수행되고; 그리고
    여기서 상기 아미노-치환 탈리도미드 아나로그와 접촉하지 않은 포유류 CD34+ 또는 CD133+ 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 분화된 CFU-GM 및 BFU-E의 수에 대비하여 상기 접촉이 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 분화된 BFU-E의 수는 검출가능하게 감소시키고 CFU-GM의 수는 검출가능하게 증가시키는,
    포유류 CD34+ 또는 CD133+ 줄기 세포 또는 전구 세포의 모세포-형성 단위(unit)-적혈구(BFU-E)로의 분화는 억제하는 반면 콜로니-형성 단위(unit)-과립구/마크로파지(CFU-GM)로의 분화는 촉진하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 줄기 또는 전구 세포는 상기 접촉 후에 조혈 세포로 분화되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 태반 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 말초 혈 줄기 세포 또는 골수 줄기 세포인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노-치환 탈리도미드 아나로그의 농도는 0.005 μg/ml 내지 5 mg/ml인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포 또는 전구 세포는 인간 줄기 세포 또는 전구 세포인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 포유류 줄기 세포 또는 전구 세포는 CD34+ 세포인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포는 상기 접촉의 결과로 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 세포들로 분화되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 CD34+ 또는 CD133+ 세포는 상기 분화 전에 냉동보존되고 해동된 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 세포는 상기 접촉의 결과로 하기를 나타내는 세포로 분화되는 방법:
    대조군 대비 CD11c 발현의 감소;
    대조군 대비 CD38 발현의 감소;
    대조군 대비 CD80 발현의 감소;
    대조군 대비 CD86 발현의 감소;
    대조군 대비 CD1a 발현의 감소;
    대조군 대비 CD14 발현의 감소;
    대조군 대비 CD54bright 발현의 감소;
    대조군 대비 HLA-DR 발현의 감소;
    대조군 대비 CD15 발현의 증가;
    대조군 대비 CD33 발현의 증가;
    대조군 대비 CD54dim 발현의 증가;
    대조군 대비 CD133 발현의 증가; 또는
    상기 마커 특성들의 조합;
    여기서 상기 대조군은 상기 아미노-치환 탈리도미드 아나로그와 접촉하는 것을 제외하고 상기 줄기 세포 또는 전구 세포와 동일한 조건에서 배양된 CD34+ 세포임.
  10. 줄기 세포 또는 전구 세포가 분화하는 조건에서 아미노-치환 탈리도미드(thalidomide) 아나로그와 상기 줄기 세포 또는 전구 세포를 접촉시키는 것을 포함하며,
    여기서 상기 아미노-치환 탈리도미드 아나로그와 접촉하지 않은 포유류 CD34+ 또는 CD133+ 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 분화된 CFU-GM 및 BFU-E의 수에 대비하여 상기 접촉이 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 분화된 BFU-E의 수는 검출가능하게 감소시키고 CFU-GM의 수는 검출가능하게 증가시키며;
    여기서 상기 아미노-치환 탈리도미드 아나로그의 농도는 0.005 μg/ml 내지 5 mg/ml인, 포유류 CD34+ 또는 CD133+ 줄기 세포 또는 전구 세포의 콜로니-형성 단위(unit)-과립구/마크로파지(CFU-GM)로의 분화 촉진용 약제 제조를 위한 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온 및 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온으로부터 선택된 아미노-치환 탈리도미드 아나로그의 용도.
  11. 제10항에 있어서, 상기 줄기 또는 전구 세포는 상기 접촉 후에 조혈 세포로 분화되는 용도.
  12. 제10항에 있어서, 상기 줄기 세포는 태반 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 말초 혈 줄기 세포 또는 골수 줄기 세포인 용도.
  13. 제10항에 있어서, 상기 줄기 또는 전구 세포는 인간 줄기 또는 전구 세포인 용도.
  14. 제10항에 있어서, 상기 포유류 줄기 또는 전구 세포는 CD34+ 세포인 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포는 상기 접촉의 결과로 CD34+CD38-CD33+ 또는 CD34+CD38-CD33- 세포로 분화되는 용도.
  16. 제10항에 있어서, 상기 CD34+ 또는 CD133+ 세포는 상기 분화 전에 냉동보존되고 해동된 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 세포는 상기 접촉의 결과로 하기를 나타내는 세포로 분화되는 방법:
    대조군 대비 CD11c 발현의 감소;
    대조군 대비 CD38 발현의 감소;
    대조군 대비 CD80 발현의 감소;
    대조군 대비 CD86 발현의 감소;
    대조군 대비 CD1a 발현의 감소;
    대조군 대비 CD14 발현의 감소;
    대조군 대비 CD54bright 발현의 감소;
    대조군 대비 HLA-DR 발현의 감소;
    대조군 대비 CD15 발현의 증가;
    대조군 대비 CD33 발현의 증가;
    대조군 대비 CD54dim 발현의 증가;
    대조군 대비 CD133 발현의 증가; 또는
    상기 마커 특성들의 조합;
    여기서 상기 대조군은 상기 아미노-치환 탈리도미드 아나로그와 접촉하는 것을 제외하고 상기 줄기 세포 또는 전구 세포와 동일한 조건에서 배양된 CD34+ 세포임.
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Families Citing this family (214)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0610728B2 (ja) 1986-05-28 1994-02-09 コニカ株式会社 新規な界面活性剤を含有するハロゲン化銀写真感光材料
US5635517B1 (en) 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
HU228769B1 (en) * 1996-07-24 2013-05-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1-oxoisoindolines and their use for production of pharmaceutical compositions for mammals to reduce the level of tnf-alpha
JP2003523166A (ja) 1998-09-29 2003-08-05 ガミダ セル リミテッド 幹細胞および前駆細胞の増殖と分化を制御する方法
BR0009403A (pt) * 1999-02-04 2001-11-27 Technion Res & Dev Foundation Método de expansão/conservação das células detronco hemopoiéticas indiferenciadas ou dascélulas progenitoras, método de preparação deum meio condicionado de célula estomacal útil naexpansão/conservação das células de troncohemopoiéticas indiferenciadas ou das célulasprogenitoras, método de transplante de célulasde tronco hemopoiéticas indiferenciadas ou decélulas progenitoras em um recipiente, tampão debiorreator e biorreator
US7629360B2 (en) * 1999-05-07 2009-12-08 Celgene Corporation Methods for the treatment of cachexia and graft v. host disease
US6458810B1 (en) 2000-11-14 2002-10-01 George Muller Pharmaceutically active isoindoline derivatives
AU2002253795B2 (en) 2000-11-30 2007-02-01 The Children's Medical Center Corporation Synthesis of 4-Amino-Thalidomide enantiomers
EP2305795B1 (en) * 2000-12-06 2019-07-03 Celularity, Inc. Method of collecting placental stem cells
US7311905B2 (en) * 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
US20080152629A1 (en) * 2000-12-06 2008-06-26 James Edinger Placental stem cell populations
ES2432493T3 (es) * 2001-02-14 2013-12-03 Anthrogenesis Corporation Placenta de mamífero post-parto, su uso y células madre de la misma
WO2002083710A2 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 Wyeth Holdings Corporation Removal of bacterial endotoxin in a protein solution by immobilized metal affinity chromatography
IL152904A0 (en) 2002-01-24 2003-06-24 Gamida Cell Ltd Utilization of retinoid and vitamin d receptor antagonists for expansion of renewable stem cell populations
EP1465982A4 (en) 2002-01-25 2006-06-07 Gamida Cell Ltd PROCESS FOR EXPANSION OF STEM AND PRESERVATIVE CELLS AND EXPANDED CELL POPULATIONS THEREWITH OBTAINED
AU2003217961B2 (en) * 2002-03-08 2008-02-28 Signal Pharmaceuticals, Llc Combination therapy for treating, preventing or managing proliferative disorders and cancers
WO2003078567A2 (en) * 2002-03-18 2003-09-25 Gamida-Cell Ltd. Methods of inducing differentiation in ex vivo expanded stem cells
ZA200408369B (en) * 2002-04-12 2006-11-29 Celgene Corp Methods for identification of modulators of angiogenesis, compounds discovered thereby, and methods of treatment using the compounds
US7498171B2 (en) * 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
US7393862B2 (en) * 2002-05-17 2008-07-01 Celgene Corporation Method using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for treatment of certain leukemias
EP1556033A4 (en) 2002-05-17 2006-05-31 Celgene Corp METHODS AND COMPOSITIONS USING CYTOKINE INHIBITOR SELECTIVE MEDICAMENTS FOR THE TREATMENT AND MANAGEMENT OF CANCERS AND OTHER DISEASES
USRE48890E1 (en) 2002-05-17 2022-01-11 Celgene Corporation Methods for treating multiple myeloma with 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione after stem cell transplantation
US7968569B2 (en) 2002-05-17 2011-06-28 Celgene Corporation Methods for treatment of multiple myeloma using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
US7323479B2 (en) * 2002-05-17 2008-01-29 Celgene Corporation Methods for treatment and management of brain cancer using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-methylisoindoline
CA2488013A1 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Celgene Corporation Methods of using jnk or mkk inhibitors to modulate cell differentiation and to treat myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes
US8404716B2 (en) 2002-10-15 2013-03-26 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine
US8404717B2 (en) * 2002-10-15 2013-03-26 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes using lenalidomide
US11116782B2 (en) 2002-10-15 2021-09-14 Celgene Corporation Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine
US7189740B2 (en) * 2002-10-15 2007-03-13 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myelodysplastic syndromes
JP2006510606A (ja) 2002-10-15 2006-03-30 セルジーン・コーポレーション 骨髄異形成症候群を治療および管理するための選択的サイトカイン阻害剤の使用方法およびそれを含む組成物
US20050203142A1 (en) * 2002-10-24 2005-09-15 Zeldis Jerome B. Methods of using and compositions comprising immunomodulatory compounds for treatment, modification and management of pain
US20040091455A1 (en) * 2002-10-31 2004-05-13 Zeldis Jerome B. Methods of using and compositions comprising immunomodulatory compounds for treatment and management of macular degeneration
EP1567154A4 (en) 2002-11-06 2006-05-31 Celgene Corp METHODS AND COMPOSITIONS USING CYTOKINE SELECTIVE INHIBITION DRUGS FOR TREATING AND CONTROLLING CANCERS AND OTHER DISEASES
US8034831B2 (en) 2002-11-06 2011-10-11 Celgene Corporation Methods for the treatment and management of myeloproliferative diseases using 4-(amino)-2-(2,6-Dioxo(3-piperidyl)-isoindoline-1,3-dione in combination with other therapies
US7563810B2 (en) 2002-11-06 2009-07-21 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myeloproliferative diseases
US20050054097A1 (en) * 2002-11-17 2005-03-10 Tony Peled EX-VIVO expansion of hematopoietic system cell populations in mononuclear cell cultures
AU2003298775B2 (en) * 2002-11-26 2008-07-17 Anthrogenesis Corporation Cytotherapeutics, cytotherapeutic units and methods for treatments using them
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
EP2399990B1 (en) 2003-06-27 2015-07-22 DePuy Synthes Products, Inc. Cells derived from post-partum umbilical cord for use in treatment of disease of the heart and circulatory system
US8518390B2 (en) 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US8491883B2 (en) 2003-06-27 2013-07-23 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
IL161903A0 (en) * 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
UA83504C2 (en) 2003-09-04 2008-07-25 Селджин Корпорейшн Polymorphic forms of 3-(4-amino-1-oxo-1,3 dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione
GB0321337D0 (en) * 2003-09-11 2003-10-15 Massone Mobile Advertising Sys Method and system for distributing advertisements
US20080027113A1 (en) * 2003-09-23 2008-01-31 Zeldis Jerome B Methods of Using and Compositions Comprising Immunomodulatory Compounds for Treatment and Management of Macular Degeneration
US7612096B2 (en) * 2003-10-23 2009-11-03 Celgene Corporation Methods for treatment, modification and management of radiculopathy using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3yl)-4-aminoisoindoline
WO2005046593A2 (en) * 2003-11-06 2005-05-26 Celgene Corporation Methods and compositions using thalidomide for the treatment and management of cancers and other diseases.
EP1530970A1 (en) * 2003-11-13 2005-05-18 Medizinische Hochschule Hannover Composition and method for inducing immune tolerance towards cell, tissue and/or organ transplants
KR20120039065A (ko) * 2003-12-02 2012-04-24 셀진 코포레이션 혈색소병증　및　빈혈의　치료　및　관리를　위한　방법및　조성물
US20050143344A1 (en) * 2003-12-30 2005-06-30 Zeldis Jerome B. Methods and compositions using immunomodulatory compounds for the treatment and management of central nervous system disorders or diseases
US20070037276A1 (en) * 2004-02-23 2007-02-15 Eudes Francois Marie De Crecy Continuous culture apparatus with mobile vessel, allowing selection of fitter cell variants and producing a culture in a continuous manner
EP2298864B1 (en) * 2004-03-22 2017-10-11 Mesoblast International Sàrl Mesenchymal stem cells and uses therefor
BRPI0509019A (pt) * 2004-03-22 2007-08-07 Celgene Corp métodos para tratar, prevenir ou controlar um distúrbio ou doença de pele, para tratar, prevenir ou controlar ceratose senil e para tratar ou controlar ceratose, composição farmacêutica, forma de dosagem unitária individual, e, kit
WO2005097190A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-20 Celgene Corporation Systems and methods for providing a stem cell bank
US20050222209A1 (en) * 2004-04-01 2005-10-06 Zeldis Jerome B Methods and compositions for the treatment, prevention or management of dysfunctional sleep and dysfunctional sleep associated with disease
EP1744749A4 (en) * 2004-04-14 2009-04-22 Celgene Corp METHODS OF USE AND COMPOSITION COMPRISING IMMUNOMODULATOR COMPOUNDS FOR THE TREATMENT AND CARE OF MYELODYSPLASIC SYNDROMES
WO2005108559A2 (en) 2004-04-23 2005-11-17 Bioe, Inc. Multi-lineage progenitor cells
US7622108B2 (en) 2004-04-23 2009-11-24 Bioe, Inc. Multi-lineage progenitor cells
US20050239842A1 (en) * 2004-04-23 2005-10-27 Zeldis Jerome B Methods of using and compositions comprising immunomodulatory compounds for the treatment and management of pulmonary hypertension
US20050265980A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Becton, Dickinson And Company Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells
EP1799812A4 (en) 2004-09-16 2009-09-09 Gamida Cell Ltd EX VIVO CULTIVATION METHODS OF STEM CELLS AND PRECURSOR BY CO-CULTURE WITH MESENCHYMAL CELLS
KR100823090B1 (ko) 2004-11-22 2008-04-18 한훈 제대혈 유래 줄기세포를 이용한 척수하반신 마비의 세포치료용 조성물
JP2008520731A (ja) * 2004-11-23 2008-06-19 セルジーン・コーポレーション 中枢神経系傷害を治療及び管理するための、免疫調節性化合物を使用した方法及び組成物
CA2589041C (en) 2004-12-23 2019-08-20 DePuy Synthes Products, Inc. Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same
EP1835924B1 (en) 2004-12-23 2013-08-21 Ethicon, Incorporated Treatment of parkinson's disease and related disorders using postpartum derived cells
EP1838842A2 (en) * 2004-12-23 2007-10-03 Ethicon, Incorporated Treatment of osteochondral diseases using postpartum-derived cells and products thereof
CA2598029A1 (en) * 2005-02-24 2006-10-05 The Scripps Research Institute Isolated myeloid-like bone marrow cell populations and methods of treatment therewith
BRPI0608294A2 (pt) * 2005-02-28 2010-01-12 Regenetech Inc método e composição para reparo de células e tecidos epiteliais e de outros tipos
US20060270707A1 (en) * 2005-05-24 2006-11-30 Zeldis Jerome B Methods and compositions using 4-[(cyclopropanecarbonylamino)methyl]-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindole-1,3-dione for the treatment or prevention of cutaneous lupus
WO2007005807A2 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Anthrogenesis Corporation Repair of tympanic membrane using placenta derived collagen biofabric
US7928280B2 (en) * 2005-07-13 2011-04-19 Anthrogenesis Corporation Treatment of leg ulcers using placenta derived collagen biofabric
EP1919365A2 (en) * 2005-07-13 2008-05-14 Anthrogenesis Corporation Ocular plug formed from placenta derived collagen biofabric
US20070059824A1 (en) * 2005-09-12 2007-03-15 Yong Zhao Human umbilical cord blood-derived pluripotent fibroblast-like-macrophages
US9388382B2 (en) * 2005-10-05 2016-07-12 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Isolation of CD14 negative, CD45 positive and CD117 positive embryonic-like stem cells free of monocytes from human umbilical cord blood mononuclear cells
WO2008048671A1 (en) * 2006-10-18 2008-04-24 University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
EP1941031B1 (en) 2005-10-05 2013-12-25 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Isolated embryonic-like stem cells derived from human umbilical cord blood
ZA200803929B (en) * 2005-10-13 2009-08-26 Anthrogenesis Corp Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells
NZ597304A (en) * 2005-10-13 2013-06-28 Anthrogenesis Corp Immunomodulation using placental stem cells
US8846393B2 (en) 2005-11-29 2014-09-30 Gamida-Cell Ltd. Methods of improving stem cell homing and engraftment
WO2007070870A1 (en) 2005-12-16 2007-06-21 Ethicon, Inc. Compositions and methods for inhibiting adverse immune response in histocompatibility-mismatched transplantation
US8741638B2 (en) 2005-12-19 2014-06-03 DePuy Synthes Products, LLC In vitro expansion of postpartum-derived cells in roller bottles
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
EP1976978A2 (en) * 2005-12-29 2008-10-08 Anthrogenesis Corporation Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source
AU2014201181B2 (en) * 2005-12-29 2017-07-20 Celularity Inc. Placental stem cell populations
ZA200804717B (en) * 2005-12-29 2010-02-24 Anthrogenesis Corp Improved composition for collecting and preserving a placental stem cells and methods of using the composition
PL2471907T3 (pl) 2005-12-29 2019-07-31 Celularity, Inc. Populacje komórek macierzystych łożyska
US20110171182A1 (en) * 2006-03-23 2011-07-14 Pluristem Ltd. Methods for cell expansion and uses of cells and conditioned media produced thereby for therapy
EP2548951B1 (en) * 2006-03-23 2016-05-04 Pluristem Ltd. Methods for cell expansion and uses of cells and conditioned media produced thereby for therapy
CA2646491A1 (en) 2006-04-17 2007-10-25 Bioe, Inc. Differentiation of multi-lineage progenitor cells to respiratory epithelial cells
EP4094578A1 (en) * 2006-05-11 2022-11-30 Celularity Inc. Methods for collecting and using placenta cord blood stem cells
EP2023912A2 (en) * 2006-05-26 2009-02-18 Celgene Corporation Methods and compositions using immunomodulatory compounds in combination therapy
CL2007002218A1 (es) * 2006-08-03 2008-03-14 Celgene Corp Soc Organizada Ba Uso de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina 2,6-diona para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de linfoma de celula de capa.
US7993918B2 (en) * 2006-08-04 2011-08-09 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using placental stem cells
WO2008021391A1 (en) 2006-08-15 2008-02-21 Anthrogenesis Corporation Umbilical cord biomaterial for medical use
US8372437B2 (en) 2006-08-17 2013-02-12 Mimedx Group, Inc. Placental tissue grafts
KR100825864B1 (ko) * 2006-09-21 2008-04-28 부산대학교 산학협력단 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용세포치료제
WO2008060377A2 (en) 2006-10-04 2008-05-22 Anthrogenesis Corporation Placental or umbilical cord tissue compositions
CN101622007A (zh) 2006-10-06 2010-01-06 人类起源公司 天然(端肽)胎盘胶原组合物
US8562972B2 (en) 2006-10-23 2013-10-22 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
WO2008056368A2 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 Gamida-Cell Ltd. Use of ex-vivo cultured hematopoietic cells for treatment of peripheral vascular diseases
CA2677679A1 (en) * 2007-02-12 2008-08-21 Anthrogenesis Corporation Hepatocytes and chondrocytes from adherent placental stem cells; and cd34+, cd45- placental stem cell-enriched cell populations
NZ612888A (en) 2007-02-12 2015-02-27 Anthrogenesis Corp Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
CA2688504A1 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Children's Hospital & Research Center At Oakland Method of isolating stem and progenitor cells from placenta
EP2192908A4 (en) * 2007-07-25 2010-09-01 Bioe Inc DIFFERENTIATION OF PRECURSOR CELLS OF MULTIPLE ABSTRACTS AGAINST CHONDROCYTES
US9200253B1 (en) 2007-08-06 2015-12-01 Anthrogenesis Corporation Method of producing erythrocytes
WO2009020590A1 (en) * 2007-08-07 2009-02-12 Celgene Corporation Methods for treating lymphomas in certain patient populations and screening patients for said therapy
EP4559488A3 (en) 2007-09-07 2025-08-13 MiMedx Group, Inc. Placental tissue grafts and improved methods of preparing and using the same
KR20140107677A (ko) * 2007-09-19 2014-09-04 플루리스템 리미티드 지방 또는 태반 조직 유래의 부착 세포 및 이의 치료 용도
KR20220122774A (ko) * 2007-09-26 2022-09-02 셀룰래리티 인코포레이티드 인간 태반 관류액으로부터의 혈관형성 세포
RU2536242C2 (ru) 2007-09-28 2014-12-20 Антродженезис Корпорейшн Угнетение опухолей с помощью плацентарного перфузата человека и выделенных из плаценты человека вспомогательных натуральных клеток-киллеров
ES2525718T3 (es) 2007-10-05 2014-12-29 DePuy Synthes Products, LLC Reparación y regeneración de tejido renal mediante células derivadas de tejido de cordón umbilical humano
EP2217329B1 (en) 2007-11-07 2018-01-10 Anthrogenesis Corporation Use of umbilical cord blood in the treatment of premature birth complications
WO2009073146A2 (en) * 2007-11-29 2009-06-11 Celgene Corporation Use of immunomodulatory compounds for the treatment of transverse myelitis, multiple sclerosis, and other disorders
US8236538B2 (en) 2007-12-20 2012-08-07 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Methods for sterilizing materials containing biologically active agents
CA2712724A1 (en) * 2008-01-29 2009-08-06 Celgene Corporation Use of lenalidomide or pomalidomide for treating a disease associated with cd59 deficiency
KR20200011604A (ko) 2008-08-20 2020-02-03 안트로제네시스 코포레이션 개선된 세포 조성물 및 그의 제조 방법
CA2734237C (en) * 2008-08-20 2019-07-02 Anthrogenesis Corporation Treatment of stroke using isolated placental cells
CA2734446C (en) 2008-08-22 2017-06-20 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
RU2539786C2 (ru) 2008-09-02 2015-01-27 Плуристем Лтд. Выращенные в прикрепленной к субстрату культуре клетки из ткани плаценты и их использование при лечении
RU2015130665A (ru) * 2008-11-19 2018-12-24 Антродженезис Корпорейшн Амниотические адгезивные клетки
DK2375907T3 (da) * 2008-11-21 2019-06-11 Celularity Inc Behandling af sygdomme, lidelser eller tilstande i lungerne under anvendelse af placentaceller
WO2010062999A1 (en) * 2008-11-28 2010-06-03 Stematix, Inc Diabetes cell therapy
US10179900B2 (en) 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
JP5518893B2 (ja) 2008-12-19 2014-06-11 アドバンスト・テクノロジーズ・アンド・リジェネレイティブ・メディスン・エルエルシー 肺ならびに肺の疾患および障害の治療
US8771677B2 (en) * 2008-12-29 2014-07-08 Vladimir B Serikov Colony-forming unit cell of human chorion and method to obtain and use thereof
EP2411504B1 (en) 2009-03-26 2017-05-10 DePuy Synthes Products, Inc. Human umbilical cord tissue cells as therapy for alzheimer's disease
MX353489B (es) 2009-07-02 2018-01-16 Anthrogenesis Corp Metodo para producir eritrocitos sin celulas alimentadoras.
DK3284818T3 (da) * 2010-01-26 2022-06-20 Celularity Inc Behandling af knoglerelateret kræft ved hjælp af placenta stamceller
DK2556145T3 (en) 2010-04-07 2016-11-07 Anthrogenesis Corp Angiogenesis using placental stem cells
EP2555783A1 (en) 2010-04-08 2013-02-13 Anthrogenesis Corporation Treatment of sarcoidosis using placental stem cells
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
MX342995B (es) 2010-07-13 2016-10-21 Anthrogenesis Corp Métodos de generar células asesinas naturales.
EP2625264B1 (en) 2010-10-08 2022-12-07 Terumo BCT, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
US8574899B2 (en) 2010-12-22 2013-11-05 Vladimir B Serikov Methods for augmentation collection of placental hematopoietic stem cells and uses thereof
AR084753A1 (es) 2010-12-30 2013-06-05 Anthrogenesis Corp Composiciones que comprenden celulas adherentes derivadas del saco amniotico (amdac) y plasma rico en plaquetas (prp)
US20120171161A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Sascha Abramson Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof
WO2012092485A1 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules
AU2012229300B2 (en) 2011-03-11 2017-04-20 Celgene Corporation Methods of treating cancer using 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4H-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione
KR101903339B1 (ko) 2011-03-22 2018-10-01 플루리스템 리미티드 방사선 또는 화학적 손상을 치료하는 방법
US9633751B2 (en) 2011-04-01 2017-04-25 The Boeing Company Liquid lithium first walls for electromagnetic control of plasmas in fusion power reactor environments
ES2707579T3 (es) 2011-06-01 2019-04-04 Celularity Inc Tratamiento del dolor usando citoblastos placentarios
WO2013055476A1 (en) 2011-09-09 2013-04-18 Anthrogenesis Corporation Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells
EP2794854B1 (en) 2011-12-23 2018-06-20 DePuy Synthes Products, Inc. Detection of human umbilical cord tissue-derived cells
HK1202581A1 (en) 2012-02-13 2015-10-02 Gamida-Cell Ltd. Mesenchymal stem cells conditioned medium and methods of generating and using the same
RU2482870C1 (ru) * 2012-02-27 2013-05-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "РОНЦ им. Н.Н. Блохина" РАМН) Средство, индуцирующее дифференцировку стволовых кроветворных клеток в тромбоциты
KR101508323B1 (ko) * 2012-02-28 2015-04-14 건국대학교 산학협력단 세포 배양액
US20150087065A1 (en) * 2012-04-20 2015-03-26 St. Jude Children's Research Hospital Method for generation of conditionally immortalized hematopoietic progenitor cell lines with multiple lineage potential
US9175266B2 (en) 2012-07-23 2015-11-03 Gamida Cell Ltd. Enhancement of natural killer (NK) cell proliferation and activity
US9567569B2 (en) 2012-07-23 2017-02-14 Gamida Cell Ltd. Methods of culturing and expanding mesenchymal stem cells
BR112015002285B1 (pt) 2012-08-09 2022-05-10 Celgene Corporation Uso do composto 3-(4-((4-(morfolinometil)benzil)oxi)-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona para tratar ou gerenciar câncer
CN114134113A (zh) 2012-08-13 2022-03-04 人类起源公司 自然杀伤细胞及其用途
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
AU2014215458A1 (en) 2013-02-05 2015-08-13 Anthrogenesis Corporation Natural killer cells from placenta
KR101767802B1 (ko) * 2013-03-15 2017-08-11 에프. 호프만-라 로슈 아게 줄기세포를 간세포로 개선되게 분화시키기 위한 화합물
CN105246480A (zh) 2013-04-02 2016-01-13 细胞基因公司 使用4-氨基-2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-异吲哚啉-1,3-二酮治疗和控制中枢神经系统癌症的方法和组合物
UA117141C2 (uk) 2013-10-08 2018-06-25 Селджин Корпорейшн Склади (s)-3-(4-((4-(морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл)піперидин-2,6-діону
KR20160098244A (ko) * 2013-11-15 2016-08-18 안트로제네시스 코포레이션 사람 태반 관류액 세포를 포함하는 조성물, 상기 세포의 부분모집단 및 이의 용도
JP6633522B2 (ja) 2013-11-16 2020-01-22 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド バイオリアクターにおける細胞増殖
TW201540323A (zh) 2014-01-15 2015-11-01 Celgene Corp ３－（５－胺基－２－甲基－４－側氧基－４ｈ－喹唑啉－３－基）－哌啶－２，６－二酮之調配物
WO2015148704A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Terumo Bct, Inc. Passive replacement of media
US10006005B2 (en) * 2014-06-27 2018-06-26 National University Corporation Chiba University Culture medium and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells to hepatoblasts
US9499514B2 (en) 2014-07-11 2016-11-22 Celgene Corporation Antiproliferative compounds and methods of use thereof
KR20170042598A (ko) 2014-08-22 2017-04-19 셀진 코포레이션 항체와 조합된 면역조절 화합물을 이용하여 다발성 골수종을 치료하는 방법
US20160090569A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled Feed
CA3177726A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
JP2018527302A (ja) 2015-06-26 2018-09-20 セルジーン コーポレイション 免疫調節化合物を用いたカポジ肉腫またはｋｓｈｖ誘発性リンパ腫の治療方法、及びバイオマーカーの使用
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
WO2017035443A1 (en) 2015-08-27 2017-03-02 Celgene Corporation Pharmaceutical compositions comprising 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4h-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione
US12551509B2 (en) 2015-11-18 2026-02-17 Lucina Patent Holdco, Llc Acellular regenerative products and methods of their manufacture
US10159675B2 (en) 2015-12-02 2018-12-25 Celgene Corporation Cycling therapy using 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4H-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione
EP3397263B1 (en) 2015-12-30 2023-09-20 Celgene Corporation T lymphocyte production methods and t lymphocytes produced thereby
CN108430473B (zh) 2016-01-08 2021-08-31 细胞基因公司 抗增殖化合物以及其药物组合物和用途
EP3399981B1 (en) 2016-01-08 2023-08-02 Celgene Corporation Solid forms of 2-(4-chlorophenyl)-n-((2-2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolin-5-yl) methyl)-2,2-difluoroacetamide, and their pharmaceutical compositions and uses
WO2017120437A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Celgene Corporation Formulations of 2-(4-chlorophenyl)-n-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolin-5-yl)methyl)-2,2-difluoroacetamide
JP7034949B2 (ja) 2016-05-25 2022-03-14 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 細胞の増殖
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
WO2018013693A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Celgene Corporation Solid dispersions and cocrystals comprising 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione compositions and methods of use thereof
GB201618106D0 (en) 2016-10-26 2016-12-07 Lift Biosciences Ltd Cancer-killing cells
US10434095B2 (en) 2017-01-27 2019-10-08 Celgene Corporation 3-(1-oxo-4-((4-((3-oxomorpholino)methyl)benzyl)oxy)isoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and isotopologues thereof
WO2018165142A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Celgene Corporation Solid forms of 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4h-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione, and their pharmaceutical compositions and uses
US12234441B2 (en) 2017-03-31 2025-02-25 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN117247899A (zh) 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
EP4201399A3 (en) 2017-06-30 2023-08-09 Celgene Corporation Compositions and methods of use of 2-(4-chlorophenyl)-n-((2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolin-5-yl) methyl) -2,2-difluoroacetamide
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
CN113454207A (zh) 2018-11-30 2021-09-28 细胞结构公司 用新型芳香族化合物扩增自然杀伤细胞和ilc3细胞
WO2020252464A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Celularity Inc. Populations of natural killer cells for treating cancers
JP7558246B2 (ja) * 2019-07-24 2024-09-30 ミルテニー バイオテック ベー．フェー． ウント コー． カー・ゲー コロニー形成細胞を同定するためのアッセイ
US20220273716A1 (en) 2019-07-25 2022-09-01 Celularity Inc. Populations of natural killer cells comprising a cd38 chimeric antigen receptor
WO2021022229A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Celularity Inc. Populations of natural killer cells comprising a cleavage resistant cd16
JP2022554346A (ja) 2019-11-05 2022-12-28 セルジーン コーポレーション ２－（４－クロロフェニル）－ｎ－（（２－（２，６－ジオキソピペリジン－３－イル）－１－オキソイソインドリン－５－イル）メチル）－２，２－ジフルオロアセトアミドとの併用療法
WO2021113849A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Celularity Inc. Her2+ cancer treatment with populations of natural killer cells comprising a cleavage resistant cd16
GB201918341D0 (en) * 2019-12-12 2020-01-29 Lift Biosciences Ltd Cells for treating infections
WO2021155312A1 (en) 2020-01-29 2021-08-05 Celularity Inc. Placental derived natural killer cells for treatment of coronavirus infections
KR102384905B1 (ko) 2020-11-25 2022-04-11 (주)신한메탈 파이프 절단 마킹장치
GB2619893A (en) 2021-03-23 2023-12-20 Terumo Bct Inc Cell capture and expansion
US20240277775A1 (en) * 2021-06-14 2024-08-22 Vigencell Inc. Pharmaceutical use of cord blood immunosuppressive cell
WO2023278628A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Celularity Inc. Human placental hematopoietic stem cell derived natural killer cells in acute myeloid leukemia (aml) remission with minimal residual disease (mrd) or relapsed/refractory aml
US20250276063A1 (en) 2021-07-29 2025-09-04 Celularity Inc. Placenta-dervied nk cells as a senol ytic for therapeutic and other uses
EP4402281A2 (en) * 2021-09-14 2024-07-24 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Methods and compositions for perturbing monocyte and neutrophil lineages
AU2022400940A1 (en) * 2021-11-30 2024-06-13 Ohio State Innovation Foundation Engineered cells and uses thereof
AU2023206330A1 (en) 2022-01-11 2024-08-22 Celularity Inc. Cleavage resistant cd16 constructs and uses thereof
US12152699B2 (en) 2022-02-28 2024-11-26 Terumo Bct, Inc. Multiple-tube pinch valve assembly
WO2023201282A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Novel gspt1 compounds and methods of use of the novel compounds
USD1099116S1 (en) 2022-09-01 2025-10-21 Terumo Bct, Inc. Display screen or portion thereof with a graphical user interface for displaying cell culture process steps and measurements of an associated bioreactor device
WO2024064646A1 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Celgene Corporation Salts and solid forms of (s)- or racemic 3-(4-((4-(morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and methods of using the same
EP4677071A1 (en) * 2023-03-10 2026-01-14 UL Cell Therapeutic PTE. Ltd System and method for converting adipose derived mesenchymal stem cells to hematopoietic stem/progenitor cells and differentiating into blood cells and applications of same
WO2025085416A1 (en) 2023-10-16 2025-04-24 Bristol-Myers Squibb Company Gspt1 compounds and methods of use of the compounds

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3228601A (en) 1964-02-20 1966-01-11 Monarch Marking Systems Inc Controls for marking machine
IL47062A (en) * 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4615699A (en) 1985-05-03 1986-10-07 Alza Corporation Transdermal delivery system for delivering nitroglycerin at high transdermal fluxes
CA1340843C (en) 1987-07-31 1999-12-07 J. Lawrence Burg Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5004681B1 (en) * 1987-11-12 2000-04-11 Biocyte Corp Preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5399493A (en) * 1989-06-15 1995-03-21 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
AU633958B2 (en) 1989-07-25 1993-02-11 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5545522A (en) 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
ATE174058T1 (de) 1989-11-06 1998-12-15 Cell Genesys Inc Herstellung von proteinen mittels homologer rekombination
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
US6326198B1 (en) 1990-06-14 2001-12-04 Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism, GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells
WO1992014455A1 (en) 1991-02-14 1992-09-03 The Rockefeller University METHOD FOR CONTROLLING ABNORMAL CONCENTRATION TNF α IN HUMAN TISSUES
US5367057A (en) * 1991-04-02 1994-11-22 The Trustees Of Princeton University Tyrosine kinase receptor flk-2 and fragments thereof
US6046019A (en) * 1991-07-09 2000-04-04 Goumeniouk; Alexander P. Diagnostic kits and methods for making granulocyte cell counts
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
FI943024L (fi) 1991-12-23 1994-06-22 British Bio Technology Kantasoluja estävät proteiinit
US5672346A (en) * 1992-07-27 1997-09-30 Indiana University Foundation Human stem cell compositions and methods
US5436142A (en) 1992-11-12 1995-07-25 Cold Spring Harbor Laboratory Methods for producing probes capable of distingushing variant genomic sequences
AU694111B2 (en) 1993-03-31 1998-07-16 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
GB9308271D0 (en) 1993-04-21 1993-06-02 Univ Edinburgh Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method
US5709854A (en) 1993-04-30 1998-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo
US5698579A (en) 1993-07-02 1997-12-16 Celgene Corporation Cyclic amides
US5605914A (en) 1993-07-02 1997-02-25 Celgene Corporation Imides
US5463063A (en) 1993-07-02 1995-10-31 Celgene Corporation Ring closure of N-phthaloylglutamines
US5665754A (en) * 1993-09-20 1997-09-09 Glaxo Wellcome Inc. Substituted pyrrolidines
US5599703A (en) * 1993-10-28 1997-02-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy In vitro amplification/expansion of CD34+ stem and progenitor cells
CA2175578A1 (en) 1993-11-03 1995-05-11 Alec Sehon Cell control and suppression
IL107483A0 (en) 1993-11-03 1994-02-27 Yeda Res & Dev Bone marrow transplantation
US5942496A (en) 1994-02-18 1999-08-24 The Regent Of The University Of Michigan Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
US5516532A (en) 1994-08-05 1996-05-14 Children's Medical Center Corporation Injectable non-immunogenic cartilage and bone preparation
US5627025A (en) 1994-08-12 1997-05-06 The Rockefeller University Method for the identification of compounds capable of abrogating human immunodeficiency virus (HIV) infection of dendritic cells and T-lymphocytes
US5698679A (en) 1994-09-19 1997-12-16 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for targeting an immune response
US5525471A (en) 1994-10-12 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Enzymatic degrading subtraction hybridization
US5874301A (en) 1994-11-21 1999-02-23 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
US6429221B1 (en) 1994-12-30 2002-08-06 Celgene Corporation Substituted imides
US5703098A (en) 1994-12-30 1997-12-30 Celgene Corporation Immunotherapeutic imides/amides
US5801195A (en) 1994-12-30 1998-09-01 Celgene Corporation Immunotherapeutic aryl amides
HU226558B1 (en) 1994-12-30 2009-03-30 Celgene Corp Immunotherapeutic imides/amides and their use for reducing levels of tnfalpha
US5925567A (en) 1995-05-19 1999-07-20 T. Breeders, Inc. Selective expansion of target cell populations
US5643915A (en) 1995-06-06 1997-07-01 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Treatment of ischemia/reperfusion injury with thalidomide alone or in combination with other therapies
US5830708A (en) 1995-06-06 1998-11-03 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods for production of a naturally secreted extracellular matrix
US5731325A (en) 1995-06-06 1998-03-24 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Treatment of melanomas with thalidomide alone or in combination with other anti-melanoma agents
US5654312A (en) 1995-06-07 1997-08-05 Andrulis Pharmaceuticals Treatment of inflammatory and/or autoimmune dermatoses with thalidomide alone or in combination with other agents
AU6223296A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Novartis Ag Methods for obtaining compositions enriched for hematopoieti c stem cells and antibodies for use therein
US6306575B1 (en) 1995-06-16 2001-10-23 Stemcell Technologies, Inc. Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations
US5654381A (en) 1995-06-16 1997-08-05 Massachusetts Institute Of Technology Functionalized polyester graft copolymers
US5788963A (en) 1995-07-31 1998-08-04 Pacific Northwest Cancer Foundation Isolation and/or preservation of dendritic cells for prostate cancer immunotherapy
US5635365A (en) * 1995-08-07 1997-06-03 Emory University Noninvasive diagnosis for allograft rejection
US5728845A (en) 1995-08-29 1998-03-17 Celgene Corporation Immunotherapeutic nitriles
US5728844A (en) 1995-08-29 1998-03-17 Celgene Corporation Immunotherapeutic agents
US5658940A (en) 1995-10-06 1997-08-19 Celgene Corporation Succinimide and maleimide cytokine inhibitors
US5800539A (en) 1995-11-08 1998-09-01 Emory University Method of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation without graft failure or graft vs. host disease
DE69635899T2 (de) 1995-11-17 2006-11-23 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Polypeptid, das die differenzierung unterdrueckt
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
JP2000505650A (ja) 1996-02-08 2000-05-16 アメリカ合衆国 樹状突起細胞を形質転換し、そしてｔ細胞を活性化するための方法及び組成物
US7659119B2 (en) 1996-02-12 2010-02-09 Argos Therapeutics, Inc. Method and compositions for obtaining mature dendritic cells
US5635517B1 (en) 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
US6281230B1 (en) 1996-07-24 2001-08-28 Celgene Corporation Isoindolines, method of use, and pharmaceutical compositions
US5798368A (en) 1996-08-22 1998-08-25 Celgene Corporation Tetrasubstituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolines and method of reducing TNFα levels
NZ333903A (en) 1996-07-24 2000-02-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1oxoisoindolines and method of reducing TNF-alpha levels in a mammal
HU228769B1 (en) 1996-07-24 2013-05-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1-oxoisoindolines and their use for production of pharmaceutical compositions for mammals to reduce the level of tnf-alpha
RU2188819C2 (ru) 1996-08-12 2002-09-10 Селджин Корпорейшн НОВЫЕ ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ СНИЖЕНИЯ УРОВНЕЙ ФДЭ, TNFα И NFκB
US5851984A (en) 1996-08-16 1998-12-22 Genentech, Inc. Method of enhancing proliferation or differentiation of hematopoietic stem cells using Wnt polypeptides
US5945337A (en) 1996-10-18 1999-08-31 Quality Biological, Inc. Method for culturing CD34+ cells in a serum-free medium
US6335195B1 (en) 1997-01-28 2002-01-01 Maret Corporation Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation
US5958738A (en) 1997-03-24 1999-09-28 Roche Diagnostics Corporation Procedure for subtractive hybridization and difference analysis
CA2295295A1 (en) 1997-07-31 1999-02-11 Celgene Corporation Substituted alkanohydroxamic acids and method of reducing tnf.alpha. levels
US6093531A (en) 1997-09-29 2000-07-25 Neurospheres Holdings Ltd. Generation of hematopoietic cells from multipotent neural stem cells
US5874448A (en) 1997-11-18 1999-02-23 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6 dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing TNFα levels
US5955476A (en) 1997-11-18 1999-09-21 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing inflammatory cytokine levels
EP1064277B1 (en) 1998-03-16 2005-06-15 Celgene Corporation 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline derivatives, their preparation and their use as inhibitors of inflammatory cytokines
EP1075535A4 (en) * 1998-05-07 2006-01-18 Univ Maryland METHOD OF DIAGNOSING AND TREATING CHRONIC PELVIC PAIN SYNDROME
DE69937347T2 (de) 1998-06-08 2008-09-04 Osiris Therapeutics, Inc. Regulierung der hämatopoietischen stammzelldifferenzierung durch verwendung von menschlichen mesenchymalen stammzellen
US6020358A (en) 1998-10-30 2000-02-01 Celgene Corporation Substituted phenethylsulfones and method of reducing TNFα levels
WO2000027999A2 (en) 1998-11-12 2000-05-18 Cell Science Therapeutics, Inc. Lymphoid tissue-specific cell production from hematopoietic progenitor cells in three-dimensional devices
KR100672892B1 (ko) 1999-03-18 2007-01-23 셀진 코오퍼레이션 치환된 1-옥소- 및 1,3-디옥소이소인돌린스 및 염증성사이토킨 수치를 감소시키기 위한 약학적 조성물로서의이들의 사용
IN191359B (ko) 1999-04-20 2003-11-29 Nat Inst Immunology
US6132997A (en) 1999-05-28 2000-10-17 Agilent Technologies Method for linear mRNA amplification
AU4860900A (en) 1999-06-02 2000-12-18 Lifebank Services, L.L.C. Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human amniotic epithelial cells
US6271002B1 (en) 1999-10-04 2001-08-07 Rosetta Inpharmatics, Inc. RNA amplification method
US6280718B1 (en) 1999-11-08 2001-08-28 Wisconsin Alumni Reasearch Foundation Hematopoietic differentiation of human pluripotent embryonic stem cells
US7182953B2 (en) * 1999-12-15 2007-02-27 Celgene Corporation Methods and compositions for the prevention and treatment of atherosclerosis restenosis and related disorders
BR0110877A (pt) 2000-05-15 2003-03-11 Celgene Corp Métodos de tratamento de câncer primário, de aumento da dosagem de um inibidor de topoisomerase, de redução ou prevenção de um efeito adverso associado com quimioterapia e com terapia de radiação, de aumento da eficácia terapêutica de um inibidor de topoisomerase, e de proteção de um paciente canceroso dos efeitos adversos associados com a administração de uma droga anti-câncer, composição farmacêutica, forma de dosagem, e, kit para uso no tratamento de câncer
US6576464B2 (en) 2000-11-27 2003-06-10 Geron Corporation Methods for providing differentiated stem cells
US7311905B2 (en) 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
US20080152629A1 (en) 2000-12-06 2008-06-26 James Edinger Placental stem cell populations
EP2305795B1 (en) 2000-12-06 2019-07-03 Celularity, Inc. Method of collecting placental stem cells
US20030045552A1 (en) 2000-12-27 2003-03-06 Robarge Michael J. Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
EP2316918B1 (en) 2001-02-14 2015-07-01 Anthrogenesis Corporation Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom
ES2432493T3 (es) 2001-02-14 2013-12-03 Anthrogenesis Corporation Placenta de mamífero post-parto, su uso y células madre de la misma
EP1399382B1 (en) * 2001-06-29 2011-04-13 Showa Denko K.K. Production of high-purity fluorine gas and method for analyzing trace impurities in high-purity fluorine gas
AU2002352696A1 (en) 2001-11-16 2003-06-10 University Of North Carolina At Chapel Hill Cell substrates and methods of use thereof
NZ534643A (en) 2002-02-13 2010-06-25 Anthrogenesis Corp Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta and uses and methods of treatment using said cells
US20030187515A1 (en) 2002-03-26 2003-10-02 Hariri Robert J. Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric
KR20050000400A (ko) 2002-04-12 2005-01-03 셀진 코포레이션 줄기 및 전구 세포 분화의 조절, 측정 및 이들의 용도
US7498171B2 (en) 2002-04-12 2009-03-03 Anthrogenesis Corporation Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof
ZA200408369B (en) 2002-04-12 2006-11-29 Celgene Corp Methods for identification of modulators of angiogenesis, compounds discovered thereby, and methods of treatment using the compounds
CA2488013A1 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Celgene Corporation Methods of using jnk or mkk inhibitors to modulate cell differentiation and to treat myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes
US7189740B2 (en) 2002-10-15 2007-03-13 Celgene Corporation Methods of using 3-(4-amino-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myelodysplastic syndromes
AU2003298775B2 (en) 2002-11-26 2008-07-17 Anthrogenesis Corporation Cytotherapeutics, cytotherapeutic units and methods for treatments using them
CN1770976A (zh) 2003-02-13 2006-05-10 人类起源公司 利用脐带血治疗患有疾病、紊乱或状况的个体的用途
KR20120039065A (ko) 2003-12-02 2012-04-24 셀진 코포레이션 혈색소병증　및　빈혈의　치료　및　관리를　위한　방법및　조성물
US20050266391A1 (en) 2004-01-15 2005-12-01 Bennett Brydon L Methods for preserving tissue
WO2005097190A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Celgene Corporation Systems and methods for providing a stem cell bank
US7244759B2 (en) 2004-07-28 2007-07-17 Celgene Corporation Isoindoline compounds and methods of making and using the same
US7147626B2 (en) 2004-09-23 2006-12-12 Celgene Corporation Cord blood and placenta collection kit
US7909806B2 (en) 2004-09-23 2011-03-22 Anthrogenesis Corporation Cord blood and placenta collection kit
WO2006135843A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Celgene Corporation Human placental collagen compositions, processes for their preparation, methods of their use and kits comprising the compositions
WO2007005807A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Anthrogenesis Corporation Repair of tympanic membrane using placenta derived collagen biofabric
US7928280B2 (en) 2005-07-13 2011-04-19 Anthrogenesis Corporation Treatment of leg ulcers using placenta derived collagen biofabric
EP1919365A2 (en) 2005-07-13 2008-05-14 Anthrogenesis Corporation Ocular plug formed from placenta derived collagen biofabric
JP4562618B2 (ja) 2005-08-18 2010-10-13 陽一 佐藤 空き缶処理車
NZ597304A (en) 2005-10-13 2013-06-28 Anthrogenesis Corp Immunomodulation using placental stem cells
ZA200803929B (en) 2005-10-13 2009-08-26 Anthrogenesis Corp Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells
PL2471907T3 (pl) 2005-12-29 2019-07-31 Celularity, Inc. Populacje komórek macierzystych łożyska
ZA200804717B (en) 2005-12-29 2010-02-24 Anthrogenesis Corp Improved composition for collecting and preserving a placental stem cells and methods of using the composition
EP1976978A2 (en) 2005-12-29 2008-10-08 Anthrogenesis Corporation Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source
KR20090031895A (ko) 2006-06-09 2009-03-30 안트로제네시스 코포레이션 태반 니치 및 줄기 세포 배양을 위한 이의 용도
US7993918B2 (en) 2006-08-04 2011-08-09 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using placental stem cells
WO2008021391A1 (en) 2006-08-15 2008-02-21 Anthrogenesis Corporation Umbilical cord biomaterial for medical use
WO2008042441A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Anthrogenesis Corporation Use of umbilical cord biomaterial for ocular surgery
WO2008060377A2 (en) 2006-10-04 2008-05-22 Anthrogenesis Corporation Placental or umbilical cord tissue compositions
CN101622007A (zh) 2006-10-06 2010-01-06 人类起源公司 天然(端肽)胎盘胶原组合物
US8562972B2 (en) 2006-10-23 2013-10-22 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
CA2677679A1 (en) 2007-02-12 2008-08-21 Anthrogenesis Corporation Hepatocytes and chondrocytes from adherent placental stem cells; and cd34+, cd45- placental stem cell-enriched cell populations
NZ612888A (en) 2007-02-12 2015-02-27 Anthrogenesis Corp Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells
US20100172830A1 (en) 2007-03-29 2010-07-08 Cellx Inc. Extraembryonic Tissue cells and method of use thereof
KR20220122774A (ko) 2007-09-26 2022-09-02 셀룰래리티 인코포레이티드 인간 태반 관류액으로부터의 혈관형성 세포
RU2536242C2 (ru) 2007-09-28 2014-12-20 Антродженезис Корпорейшн Угнетение опухолей с помощью плацентарного перфузата человека и выделенных из плаценты человека вспомогательных натуральных клеток-киллеров
EP2217329B1 (en) 2007-11-07 2018-01-10 Anthrogenesis Corporation Use of umbilical cord blood in the treatment of premature birth complications
CA2734237C (en) 2008-08-20 2019-07-02 Anthrogenesis Corporation Treatment of stroke using isolated placental cells
KR20200011604A (ko) 2008-08-20 2020-02-03 안트로제네시스 코포레이션 개선된 세포 조성물 및 그의 제조 방법
CA2734446C (en) 2008-08-22 2017-06-20 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
RU2015130665A (ru) 2008-11-19 2018-12-24 Антродженезис Корпорейшн Амниотические адгезивные клетки
DK2375907T3 (da) 2008-11-21 2019-06-11 Celularity Inc Behandling af sygdomme, lidelser eller tilstande i lungerne under anvendelse af placentaceller
WO2010141654A1 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Anthrogenesis Corporation Improved method of collecting placental cells
MX353489B (es) 2009-07-02 2018-01-16 Anthrogenesis Corp Metodo para producir eritrocitos sin celulas alimentadoras.
DK3284818T3 (da) 2010-01-26 2022-06-20 Celularity Inc Behandling af knoglerelateret kræft ved hjælp af placenta stamceller
US20110280849A1 (en) 2010-03-26 2011-11-17 Anthrogenesis Corporation Tumor suppression using human placenta-derived intermediate natural killer cells and immunomodulatory compounds
DK2556145T3 (en) 2010-04-07 2016-11-07 Anthrogenesis Corp Angiogenesis using placental stem cells
EP2555783A1 (en) 2010-04-08 2013-02-13 Anthrogenesis Corporation Treatment of sarcoidosis using placental stem cells
MX342995B (es) 2010-07-13 2016-10-21 Anthrogenesis Corp Métodos de generar células asesinas naturales.
US9713375B1 (en) 2015-02-26 2017-07-25 Brett Einar Rahm Collapsible portable table

Also Published As

Publication number Publication date
CA2481386A1 (en) 2003-10-23
IL211508A (en) 2013-12-31
US20090226406A1 (en) 2009-09-10
NZ579676A (en) 2011-07-29
EP1551953B8 (en) 2017-02-15
WO2003087392A3 (en) 2005-04-28
JP4448333B2 (ja) 2010-04-07
NZ593792A (en) 2013-09-27
MX345394B (es) 2017-01-30
EP1551953B1 (en) 2016-08-24
IL164531A (en) 2012-06-28
AU2009200256A1 (en) 2009-02-19
MXPA04009998A (es) 2004-12-13
HK1090086A1 (en) 2006-12-15
NZ536049A (en) 2010-04-30
AU2003224945A1 (en) 2003-10-27
IL164531A0 (en) 2005-12-18
JP5636415B2 (ja) 2014-12-03
US8889411B2 (en) 2014-11-18
EP1551953A4 (en) 2007-07-18
US7498171B2 (en) 2009-03-03
US20030235909A1 (en) 2003-12-25
CN102505006B (zh) 2015-06-17
AU2009200256B2 (en) 2012-03-08
KR20120012980A (ko) 2012-02-13
EP2390311A1 (en) 2011-11-30
AU2003224945B2 (en) 2008-10-23
CN102505006A (zh) 2012-06-20
WO2003087392A9 (en) 2004-12-29
KR101216201B1 (ko) 2012-12-28
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