KR20130137620A - 식물계에서의 중금속 감소 - Google Patents

식물계에서의 중금속 감소 Download PDF

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Abstract

(a) (i) SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28 또는 29 또는 51과 최소한 71%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 또는 (ii) SEQ ID NOs: 3 내지 23 또는 30 내지 50 또는 53 중 어느 것과 최소한 65%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 또는 (iii) SEQ ID NOs. 24 내지 26 또는 52 중 어느 것과 최소한 65%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지고, 중금속 수송 활성을 갖는 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드; 또는
(b) SEQ ID NOs: 1 내지 23 또는 27 내지 51 또는 53 중 어느 것의 영역과 최소한 65% 동일한, 길이가 최소한 15 연속 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 구축물; 또는
(c) 서로 최소한 부분적으로 상보적인 두 개 이상의 서열을 포함하고, 그리고 여기서 센스 가닥은 제1 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 제2 서열을 포함하고, 그리고 여기서 서열들 중 하나 이상은 NtMRP RNA의 최소한 10 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 RNA; 또는
(d) (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 (b)에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물 또는 식물 세포가 제공된다.

Description

식물계에서의 중금속 감소{HEAVY METAL REDUCTION IN PLANTA}
본 발명은 중금속 수송에 관여하는 ABC 수송체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 식물에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 변형시키는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 세포이하 (subcellular)에서 중금속 수송에 관여하는 하나 이상의 ABC 수송체의 발현 또는 활성의 조절(예를 들면, 감소 또는 억제)에 관한 것이다.
식물들은 뿌리세포와 기타 관다발조직의 표면에 발현된 막관통 수송체에 의해 매개된 다양한 수송 메카니즘에 의해 그들의 환경으로부터 금속 이온 기질을 흡수함에 의해 - 아연과 구리와 같은 - 필수 중금속을 얻는다. 한 메카니즘은 시토졸로부터 독소의 수송을 이용한다. 예를 들면, 글루타티온 S-컨쥬게이트 (GS-X) 펌프류(family)는 포유류, 이스트 세포뿐만 아니라 식물에서 화합물의 제거/격리에 책임있는 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체의 한 분류이다. 포유류 및 식물 MRP, cMOAT (소관 다특이성 음이온 수송체), 및 YCF1 (이스트 카드뮴 인자) 유전자에 의해 암호화된 GS-X 펌프의 분자 구조와 기능은 분자 진화에 걸쳐 보존되어 온 것으로 보인다.
식물들은 미생물 생성물, 알레로케미칼 (상호대립억제작용물질: allelochemicals), 농약 및 중금속과 같은, 세포 생존이 이들 약제의 축적을 감소시키거나 또는 탈독성화하는 메카니즘에 의존하도록 하는 외인성 독소에 노출된다. 중금속(납, 카드뮴, 수은 등)은 주된 환경적 독물들로, 이들은 활성 산화종 발생, DNA 손상, 및 살아 있는 유기체의 세포에서 효소의 활성부위에 결합함에 의한 효소 불활성화를 야기한다. 중금속에 의한 환경 오염은 산업화 및 개체군 크기의 증가에 의해 대폭적으로 증가하고 있다. 중금속에 의해 오염된 토양은 정상적인 식물 성장을 억제하고 식품의 오염을 야기한다. 많은 중금속들이 인류 건강에 매우 유독하고 저농도에서 암을 유발한다.
동물과 인간에 의해 소비되는 식물 또는 식물 생성물로부터 카드뮴과 같은 중금속의 함량을 감소시키는 것은 매우 바람직하고 긴급히 요구된다. 본 발명의 목적은 이러한 요구를 충족시키는 것이다.
본 발명의 한 면은 첨부된 청구항에 의해 구성된다.
한 면에서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다: SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 51과 적어도 71% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 구성되거나 또는 본질적으로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드; SEQ ID NOs: 3 내지 23 또는 30 내지 50 또는 53중 어느 것과 적어도 65% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 구성되거나 또는 본질적으로 구성된 단리된 폴리뉴클레오티드; SEQ ID NOs: 24 내지 26 또는 52 중 어느 것과 적어도 65% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 구성되거나 또는 본질적으로 구성된 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로, 여기서 상기 폴리펩티드는 중금속 수송체 활성이다.
추가의 면에서, SEQ ID NOs: 1 내지 23 또는 27 내지 51 중 어느 것의 영역과 적어도 65% 동일한, 길이가 적어도 15 연속 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 구축물이 제공된다.
추가의 면에서, 적어도 부분적으로 서로 상보성인, 적어도 두 개의 서열을 포함하는 이중-가닥 리보폴리뉴클레오티드가 제공되고 여기서 센스 가닥은 제1 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 제2 서열을 포함하고, 여기서 서열들 중 적어도 하나는 NtMRP RNA의 적어도 10 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
적절히는, 이중-가닥 RNA는 NtMRP RNA의 적어도 10 뉴클레오티드와 적어도 65% 서열 상동성을 갖는 제1 서열; 제2 서열; 및 제1 서열과 동일한 방향(orientation)으로 위치하는, 제1 서열의 역 상보 서열을 갖는 제3 서열을 포함하고, 여기서 제2 서열은 제1 서열과 제3 서열 사이에 위치하고, 제2 서열은 제1 서열과 제3 서열에 기능적으로 연결된다.
적절히는, 제1 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 65% 서열 상동성을 갖는다: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID No. 23, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 및 SEQ ID NO: 53.
적절히는, 제3 서열은 다음에 상응하는 서열의 역 보체와 적어도 65% 서열 상동성을 갖는다: SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID No. 23, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 및 SEQ ID NO: 53.
추가의 면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 발현벡터가 제공된다.
추가의 면에서, 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 구축물, 이중 가닥 리보뉴클레오티드 또는 발현벡터를 포함하는 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물 세포가 제공된다.
추가의 면에서, 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물 세포를 포함하는, 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물이 제공된다.
추가의 면에서, 상기 식물로부터의 세포 또는 조직을 포함하는, 바이오매스(biomass), 씨앗 또는 잎을 포함하는 식물 재료가 제공된다.
추가의 면에서, 상기 식물 또는 식물 세포의 일부 또는 상기 식물 재료를 포함하는 담배 제품이 제공된다.
추가의 면에서, 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물이 제공되고, 여기서 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성은 감소되고, 상기 식물의 잎은 카드뮴 함량이, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 적어도 5% 감소된다.
추가의 면에서, 식물의 조직을 포함하는 바이오매스, 씨앗 또는 잎이 제공된다.
추가의 면에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현 및 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성을, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현 및 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 감소시키는 단계를 포함하는, 적어도 식물의 일부에서 카드뮴 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
추가의 면에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 얻은 또는 얻을 수 있는 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물이 제공되고, 여기서 식물의 적어도 일부에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현 및 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 적어도 약 5%의 카드뮴 함량이 감소한다.
추가의 면에서, SEQ ID NOs: 24 내지 26 또는 SEQ ID NO:52 중 어느 것에 기재된 서열에 의해 발현된 단리된 NtMRP 폴리펩티드가 제공되고, 여기서 폴리펩티드는 중금속 수송체 활성을 갖는다.
추가의 면에서, 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다.
추가의 면에서, (a) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플을 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 특이적으로 검출하는 하나 이상의 탐침에 접촉시키는 단계; 및 (c) 증폭 산물의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 샘플에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 검출방법이 제공되고, 여기서 증폭 산물의 존재는 샘플 중 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타낸다.
본 발명의 추가의 면은 다음을 기재한다.
하나 이상의 조절 서열(regulatory sequence)에 기능적으로 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 유전자.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 구축물 또는 이중-가닥 RNA, 여기서 폴리뉴클레오티드는 적어도 15-30 폴리뉴클레오티드, 30-50 뉴클레오티드, 50-100 뉴클레오티드, 100-150 뉴클레오티드, 150-200 뉴클레오티드, 200-300 뉴클레오티드, 300-400 뉴클레오티드, 400-500 뉴클레오티드, 500-600 뉴클레오티드 또는 600-700 뉴클레오티드를 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진다.
본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드, 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구축물 또는 이중-가닥 RNA 및 여기에 공유결합으로 부착된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트.
본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드, 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구축물, 이중-가닥 RNA, 컨쥬게이트 또는 발현 벡터를 포함하는 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물 세포.
본 발명에 따른 돌연변이성, 비자연발생 또는 돌연변이 식물 세포를 포함하는, 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물.
적절히는, 수집된 잎의 건조 바이오매스는 대조 식물의 것과 거의 같다.
본 발명의 식물로부터의 조직을 포함하는 바이오매스, 씨앗 또는 잎.
본 발명에 따른 바이오매스, 씨앗 또는 잎과 결합하는 또는 이용하는 소비제품.
본 발명에 따른 바이오매스, 씨앗 또는 잎 또는 본 발명에 따른 소비제품, 여기서 카드뮴 함량의 감소는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현 및 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 적어도 약 5% 감소된다.
본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드, 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구축물, 이중-가닥 RNA, 컨쥬게이트 또는 발현벡터를 포함하는 세포주.
돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물의 적어도 일부에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성을, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 감소시키는 단계를 포함하는, 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물의 제조방법.
NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성을, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 감소시키는 단계를 포함하는, 적어도 식물의 일부에서 카드뮴 수준을 감소시키는 방법.
적절히는, 상기 방법은 상기 식물을 폴리뉴클레오티드 구축물, 이중-가닥 RNA, 컨쥬게이트, 발현벡터, 메가뉴클레아제, 또는 아연 손가락 단백질(zinc finger protein)과 접촉시키는 제1 단계를 포함한다.
적절히는, 상기 방법은 상기 식물을 돌연변이체와 접촉시키는 제1 또는 추가의 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 얻어진 또는 얻을 수 있는 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물, 여기서 식물의 적어도 일부에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여, 카드뮴 함량 감소는 적어도 5%이다.
세포에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성을 조절 (예를 들면, 감소 또는 억제)하는 방법으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구축물, 이중-가닥 RNA, 컨쥬게이트 또는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함한다.
NtMRP 폴리뉴클레오티드를 검출, 단리, 증폭 또는 분석하는 방법으로, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오티드를 본 발명에 따른 단리된 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 10 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 혼성하는 단계를 포함한다.
NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 식물의 적어도 일부에서 카드뮴 함량을 적어도 5%까지 감소시키기 위한, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성을 조절(예를 들면, 감소 또는 억제)하는 약제(agent)의 용도.
본 발명에 따른 방법 또는 용도로, 여기서 약제는 NtMRP 폴리뉴클레오티드, 키메릭 NtMRP 유전자, NtMRP 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물, 안티센스 RNA, 이중 가닥 RNA, cDNA, NtMRP 폴리뉴클레오티드와 그것에 공유적으로 부착된 적어도 하나의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드를 포함하는 컨쥬게이트, 리보자임, 돌연변이체, 아연 손가락, 소분자 또는 메가뉴클레아제이거나 또는 그들로부터 유래된다.
추가의 면에서, (a) 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 담배 식물로부터 씨앗을 얻는 단계; (b) 씨앗을 식물로 재배하거나 성장시키는 단계; (c) 식물을 수확하는 단계; 및 (d) 수확한 식물로부터 담배 제품을 제조하는 단계를 포함하는 담배 제품의 제조방법이 제공된다.
상기 구현예들은 상기의 면의 각각의 구현예로서 기재된다.
카드뮴의 양이 더 낮게 존재하는 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물의 제조는 많은 이점을 제공한다.
예를 들면, 돌연변이성, 비자연 발생 또는 유전자이식 식물을 포함하여, 식물은 다양한 카드뮴 농도를 함유하는 토양에서, 또는 바람직한 카드뮴 농도보다 덜 함유하는 토양에서 성장할 수 있다. 이들 식물과 파생된 씨앗들은 좀더 넓은 범위의 토양 환경에서 그들을 경작하는데 더 많은 선택권을 제공할 수 있고, 이것은 전문 종사자 (예를 들면, 농부)가 이용가능한 경작가능 토양의 양을 증가시킬 수 있다.
추가의 예를 들면, 돌연변이성, 비자연발생 또는 식물 (그로부터 얻어진 바이오매스, 씨앗 및 잎을 포함)은 대조 카운터파트와 비교하여 감소된 카드뮴 함량을 나타내고, 식용 제품으로 직접 소비될 수 있다. 이들 식용 식물의 소비는 더 몸에 좋은 선택일 것이다. 기재된 방법에 따라 조작될 수 있는 적합한 식물은 담배, 쌀, 옥수수, 호박, 콩, 상추, 감자, 비트(beats), 허브, 밀, 보리 및 당근 등을 포함하여, 맥아 등을 포함하여 농업적 용도로 경작될 수 있는 식물을 포함한다.
추가의 예로서, 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물의 높이 및/또는 중량은 대조 식물과 실질적으로 동일하다. 그러므로, 대조 식물과 비교하여 식물의 건조 수집된 잎에서는 중요한 차이가 발견되지 않았고 NtMRP 전자의 변형이 건조 바이오매스에 통계적으로 의미있는 효과를 갖지 않았다는 것을 나타낸다. 이것은 식물이 가시적 외관에서의 손상이 산업적으로 허용되지 않거나 또는 허용할 수 없는 감소된 생산수득률을 가져올 수 있는 담배를 포함한 다양한 제품의 상업적 생산에 사용될 수 있으므로 유리하다.
도 1(a)은 NtMRP4 유전자자리의 개략도이다; 도 (b)는 NtMRP4의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 여기서 5' 및 3' UTR 영역은 밑줄이 그어졌고; 엑손은 볼드체 대문자로 나타내었고; 인트론은 일반 소문자로 나타내었고; 개시 및 정지 코돈은 회색으로 나타내었다. NtMRP4 RNAi 서열의 발생을 위한 5' 및 3' 프라이머 서열은 이탤릭체로 나타내고 줄을 그어 지웠다(strikethrough).
도 2는 7일 동안 수경재배 조건하에서 카드뮴 처리 동안 NtMRP4 폴리뉴클레오티드의 발현을 나타낸다. 3주 KY14 묘(seedlings)를 0, 0.05 및 0.5 CdCl2 로 처리하고 (a) 그리고 4주 N. rustica 및 N. tabacum (TN90) 묘목(plantlet)을 1주 동안 0.5 μM CdCl2로 처리하였다(b). RNA를 단리하였고 반정략적(semi-quantitative) RT-PCT로 처리하였다
도 3은 야생형 필드에서 경작된 식물과 비교하여 NtMRP4 RNAi 세포주의 세포주 1 및 2에서 잎 카드뮴 감소를 나타낸다.
도 4는 2개의 NtMRP4 RNAi 배양된 세포주에 대한 잎에서의 카드뮴 감소를 나타낸다. 이 실험에서 NtMRP4 삽입이 없는 벡터 대조가 첨가되었다.
도 5는 인트론-엑손 구조 및 NtMRP4 클로닝 영역이 지속되는(spanning) 게놈성 NtPMI-BAC-GOTOWE_5_gDNA BAC 클론 서열을 따른 인트론과 엑손의 위치를 나타낸다. cDNA 서열 (염기쌍 1-4, 521 상부 가닥) 및 MRP4 코딩 영역 (염기쌍 61, 781-69,748 하부 가닥)을 포함하는 게놈성 BAC 클론 서열의 동질성은 100%이다.
도 6은 NtMRP3의 뉴클레오티드 서열로 5' 및 3' UTR 영역은 이탤릭체이고; 액손은 대문자 볼드체이고; 인트론은 일반 소문자이고; 그리고 개시 및 정지 코돈은 대문자, 이탤릭 볼드체이다.
본 출원의 범위 내에서 사용된 기술적 용어 및 표현은 일반적으로 식물 및 분자 생물학의 적절한 분야에서 그들에 통상 적용되는 의미를 갖는다. 다음의 용어 모두는 본 출원의 완전한 내용에 정의된다. 용어 "포함하는"은 다른 요인들 또는 단계들을 배제하지 않고, 정관사 "a" 또는 "an"은 복수를 배제하지 않는다. 단일 단계는 청구항에 인용된 여러 특징들의 기능을 만족시킬 것이다. 특정 속성 또는 값과 연결된 용어 "본질적으로", "약", "대략" 등은 또한 각각 정확한 속성 또는 값을 정의할 것이다. 주어진 숫자값 또는 범위의 내용에서 용어 "약"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 10% 이내 또는 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 이내를 말한다.
'폴리뉴클레오티드'는 뉴클레오티드의 중합체를 말하고, 이것은 개변된 또는 개변되지 않은 데옥시리보폴리뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보폴리뉴클레오티드 (RNA)일 것이다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는, 제한없이, 게놈성 DNA, 상보성 DNA (cDNA) (예를 들면, SEQ ID No. 27), mRNA, 또는 안티센스 RNA일 수 있다. 더욱이, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥과 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA, DNA와 RNA를 포함하는 혼성 분자, 또는 단일 가닥과 이중 가닥 영역의 혼합물을 갖는 혼성 분자일 수 있다. 이에 더하여, 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 둘 다를 포함하는 3중 가닥 영역으로 구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 포스포티오에이트와 같은, 하나 이상의 개변된 염기를 함유할 수 있고, 그리고 펩티드 폴리뉴클레오티드 (PNA)일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드는 cDNA, 게놈성 DNA, 올리고뉴클레오티드, 또는 개별적인 뉴클레오티드의 단리된 또는 클론된 단편들, 또는 상기의 조합으로부터 조립될 수 있다. 비록 본 발명에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열이 DNA 서열로 표시되지만, 서열은 그들의 상응하는 RNA 서열 및 그들의 역 보체를 포함하여, 그들의 보체 (예를 들면, 완전 보체) DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다.
용어 'NtMRP 폴리뉴클레오티드'는 뉴클레오티드의 중합체가 SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 또는 51에 기재된 서열을 포함하거나, 구성되거나 본질적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이 용어는 또한 SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 또는 51과 실질적으로 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 서열; SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 또는 51의 단편; 및 그것과 실질적으로 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28, 29 또는 51의 단편을 포함한다. 변이체는, NtMRP3 유전자 또는 NtMRP4 유전자와 같은, 단리된 NtMRP 유전자의 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 비록 본 발명의 NtMRP 폴리뉴클레오티드 서열이 DNA 서열로서 나타나지만, 서열은 그들의 상응하는 RNA 서열, 및 그들의 역 보체 및 안티센스 DNA 또는 RNA 서열을 포함하여, 그들의 보체 (예를 들면, 완전 보체) DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 예시적인 단편은 SEQ ID NOs: 3 내지 23 및 30 내지 50 및 53일 수 있다.
용어 "NtMRP3 폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체가 SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO:51에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 구성되거나 또는 본질적으로 구성된 구현예를 말한다. 용어는 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:51과 실질적으로 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 변이체; SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO:51의 단편; 및 그것과 실질적으로 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO:51의 단편을 내포한다. 본 명세서에 기재된 바에 따르면, 변이체는 단리된 NtMRP3 유전자의 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 예시적인 단편은 SEQ ID NOs: 30 내지 50에 나타난다.
용어 "NtMRP4 폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 27에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 구현예를 말한다. 용어는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 27과 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드 변이체; SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 27의 단편; 및 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 27와 실질적으로 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 그것의 단편을 내포한다. 변이체는 단리된 NtMRP3 유전자의 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예시적인 단편은 SEQ ID NOs: 3 내지 23 및 53에 기재된다.
용어 "NtMRP 폴리뉴클레오티드"는 SEQ ID NOs: 24 내지 26 및 52와 실질적으로 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 폴리펩티드; SEQ ID NOs: 24 내지 26 및 52의 단편; 및 SEQ ID NOs: 24 내지 26 및 52와 실질적으로 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 그것의 단편을 말한다. NtMRP 폴리펩티드는 세포막을 가로질러 중금속 (예를 들면, 카드뮴)을 수송함에 의해 작용할 수 있는 SEQ ID NOs: 24 내지 26 및 52와 충분히 또는 실질적으로 동일하거나 유사한 정도를 포함하는 단편 및 서열을 포함한다. NtMRP 폴리펩티드는 또한 어떠한 유형의 변경 (예를 들면, 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환; 글리코실란 상태의 변화; 재접힘 또는 이성질화, 3-차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입하여 생산된 변이체 또는 돌연변이를 포함하고, 이것은 고도로 조작되거나 자연적으로 단리될 수 있다. NtMRP 폴리펩티드는 선형 형태일 수 있고 또는 공지의 방법을 사용한 고리화될 수 있다. 변이체는 NtMRP4 폴리펩티드의 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성을 가질 수 있다.
용어 "NtMRP3 폴리펩티드"는 폴리펩티드가 SEQ ID NO:52에 기재된 서열을 포함하고, 구성되고 또는 본질적으로 구성되는 구현예를 말하고, 또는 SEQ ID NO:52와 실질적으로 상동인 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열; SEQ ID NO:52의 단편; 및 SEQ ID NO:52와 실질적으로 상동이고 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 그것의 단편을 포함하고, 구성되고 또는 실질적으로 구성되는 폴리펩티드를 말한다. NtMRP3 폴리펩티드는 세포막을 가로질러 중금속 (예를 들면, 카드뮴)을 수송함에 의해 작용할 수 있는 SEQ ID NO: 52와 충분히 또는 상당한 정도의 동일성 또는 유사성을 포함하는 단편 및 서열을 포함한다. NtMRP3 폴리펩티드는 또한 어느 유형의 변형 (예를 들면, 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환; 글리코실란 상태의 변화; 재접힘 또는 이성질화, 3-차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입하여 생산된 변이체 또는 돌연변이를 포함하고, 이것은 고도로 조작되거나 자연적으로 단리될 수 있다. NtMRP3 폴리펩티드는 선형 형태이거나 공지의 방법을 사용하여 고리화될 수 있다. 변이체는 NtMRP3 폴리펩티드의 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 가질 것이다.
용어 "NtMRP4 폴리펩티드"는 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, 또는 SEQ ID NO: 26에 기재된 서열을 포함하거나, 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 구현예를 말하거나 또는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, 또는 SEQ ID NO: 26와 실질적으로 상동이거나 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열; SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, 또는 SEQ ID NO: 26의 단편; 및 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, 또는 SEQ ID NO: 26와 실질적으로 상동성이거나 (즉, 서열 유사성) 또는 실질적으로 동일한 그것의 단편을 포함하거나, 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 폴리펩티드를 말한다. NtMRP4 폴리펩티드는 세포막을 가로질러 중금속 (예를 들면, 카드뮴)을 수송함에 의해 작용할 수 있는 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, 또는 SEQ ID NO: 26과 충분한 또는 실질적인 정도의 동일성 또는 유사성을 포함하는 단편 및 서열을 포함한다. NtMRP4 폴리펩티드는 또한 어느 유형의 변형 (예를 들면, 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환; 글리코실란 상태의 변화; 재접힘 또는 이성질화, 3-차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)을 도입하여 생산된 변이체 또는 돌연변이를 포함하고, 이것은 고도로 조작되거나 자연적으로 단리될 수 있다. NtMRP4 폴리펩티드는 선형 형태이거나 공지의 방법을 사용하여 고리화될 수 있다. 변이체는 NtMRP4 폴리펩티드의 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는다.
용어 "단리된"은 그것의 천연 환경으로부터 취한 독립체(entity)를 말하지만, 이것은 순도를 기록하지는 않는다.
'유전자 서열'은 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활성인 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 말하고, 단백질의 단편을 오직 암호화하는 부분적 코팅 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 '벡터'는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 구축물 및 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트 등을 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 성분들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 비히클을 말한다. 적절한 벡터는 환형, 이중가닥 폴리뉴클레오티드 플라즈마; 선형 이중-가닥 폴로뉴클레오티드 플라즈마; 및 기타 어느 기원의 벡터와 같은 염색체-외 복제가 가능한 에피솜을 포함한다.
'발현 벡터'는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 구축물 및 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트 등의 발현을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드 성분들의 조합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 비히클을 말한다. 적절한 발현 벡터는 환형, 이중가닥 폴리뉴클레오티드 플라즈마; 선형 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 플라즈마; 및 기타 기능적으로 동등한 어느 기원의 발현 벡터와 같은 염색체외-복제가 가능한 에피솜을 포함한다. 발현 벡터는 최소한, 하기에 정의된 바와 같은, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 구축물 또는 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트의 상부에 위치하고 기능적으로 연결된 프로모터를 포함한다.
'구축물'은 하나 이상의 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이중-가닥, 재조합 폴리뉴클레오티드 단편을 말한다. 구축물은 상보적 "센스 또는 코딩 가닥"과 염기쌍된 "주형 가닥"을 포함한다. 주어진 구축물은 2 가지 가능한 배열, 발현벡터와 같은 벡터 내에 위치한 프로모터의 방향에 대하여 동일한(또는 센스) 방향으로 또는 역(또는 안티-센스) 방향으로 벡터에 삽입될 수 있다.
용어 "컨쥬게이트"는 그들 스스로는 폴리뉴클레오티드 또는 모노머가 아닌 하나 이상의 모이어티에 폴리펩티드의 공유결합에 의해 형성된 화합물을 말한다 ("컨쥬게이트된 모이어티").
'주형 가닥'은 NtMRP 게놈성 단편, NtMRP cDNA, 또는 NtMRP 구축물과 같은 폴리뉴클레오티드 듀플렉스, 또는 RNA 폴리머라제에 의해 전사될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어느 폴리뉴클레오티드 단편의 "센스 또는 암호화 가닥"의 서열을 보완하는 서열을 포함하는 가닥을 말한다. 전사 중, RNA 폴리머라제는 발생기 RNA 합성 중 3'-에서-5' 방향으로 주형 가닥을 따라 전위될 수 있다.
'센스 가닥'은 본 명세서에서 DNA 듀플렉스에서 주형 가닥의 서열과 상보적인 서열을 포함하는 가닥을 말하는 용어 "코딩 가닥"과 교환하여 사용된다. 예를 들면, 동정된 NtMRP 게놈성 클론에 대한 센스 가닥의 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2로 기재된다. 예를 들면, 센스 가닥이 가상 서열 5'-TAATCCGGT-3'을 포함한다면, 가상 표적 mRNA 내의 실질적으로 동일한 상응하는 서열은 5'-UAAUCCGGU-3'이다.
'역 상보적 서열'은 센스 서열과 동일한 방향으로, 동일한 가닥 내에 위치된 관심의 "센스 서열" (예를 들면, 엑손 서열)과 상보적인 서열을 말한다. 예를 들면, 가닥이 가상 서열 5'-TAATCCGGT-3'을 포함한다면, 역 상보적 서열 5'-ACCGGATTA-3'은 스페이서 서열에 의해 분리된, 센스 서열에 기능적으로 연결될 것이다.
'NtMRP', 'NtMRP3' 또는 'NtMRP4 RNA 전사물(transcript)'은, 본 명세서에 기재된 바와 같은 내인성 NtMRP3 또는 NtMRP4 유전자 또는 cDNA의 전사로부터 생성된, 관심의 숙주 식물 세포 내에 생산된 폴리리보폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 그러므로, 이 용어는 RNA 종 또는 구조적/기능적 수준에서 충분한 유사성을 갖는 RNA 변이체를 포함하는 NtMRP3 또는 NtMRP4 또는 NtMRP3 또는 NtMRP4 RNA로부터의 전사 산물로 생산된 어느 RNA 종 또는 RNA 변이체를 포함한다. 예를 들면, NtMRP3 또는 NtMRP3 RNA 전사물은: (1) 단리된 NtMRP3 또는 NtMRP3 유전자 또는 cDNA의 전사로부터 생산된 pre-mRNAs 및 mRNAs; (2) 단리된 NtMRP3 유전자 (즉, 동정된 NtMRP3 유전자와 실질적으로 동일하고, ABC 수송체의 관련 아형(isoform)을 암호화하는 기타 구별되는 유전자)의 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 어느 유전자의 전사로부터 생산된 pre-mRNAs 및 mRNAs; 및 (3) NtMRP3 유전자의 대립형질의 전사로부터 생산된 pre-mRNAs 및 mRNAs를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. NtMRP3 RNA 전사물은 특정 유전자의 이핵 RNAs ("hnRNAs")의 선택적 RNA 스플리싱 반응의 결과로서 생산된 RNA 변이체, 이와 같은 선택적 RNA 스플리싱 반응으로부터 생성된 mRNA 변이체 및 어느 중간체 RNA 변이체를 포함한다.
추가의 예로서, NtMRP4 또는 NtMRP4 RNA 전사물은: (1) 단리된 NtMRP4 또는 NtMRP4 유전자 또는 cDNA의 전사로부터 생산된 pre-mRNAs 및 mRNAs; (2) 단리된 NtMRP4 유전자 (즉, 동정된 NtMRP4 유전자와 실질적으로 동일하고 ABC 수송체의 관련 아형(isoforms)을 암호화하는 기타 구별되는 유전자)의 서열과 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% 의 서열 상동성을 갖는 어느 유전자의 전사로부터 생산된 pre-mRNAs 및 mRNAs; 및 (3) NtMRP 또는 NtMRP4 유전자의 대립형질의 전사로부터 생산된 pre-mRNAs 및 mRNAs를 포함한다. NtMRP 및 NtMRP4 RNA 전사물은 특정 유전자의 이핵 RNAs ("hnRNAs")의 선택적 RNA 스플리싱 반응의 결과로서 생산된 RNA 변이체, 이와 같은 선택적 RNA 스플리싱 반응으로부터 생성된 mRNA 변이체 및 어느 중간체 RNA 변이체를 포함한다.
'상동성', '동일성' 또는 '유사성'은 서열 정렬에 의해 비교된 두 폴리펩티드 간에 또는 두 폴리뉴클레오티드 분자들 간의 서열 유사성 정도를 말한다. 비교되는 두 별개의 폴리뉴클레오티드 서열들 간의 상동성 정도는 비교 위치에서 동일한 또는 매칭되는 뉴클레오티드의 갯수의 함수이다. 동일성 비율의 항으로 표시된 유사성 정도는 가시적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정될 수 있다. 선택적으로, 두 폴리뉴클레오티드 서열의 동일성 비율은 GAP 컴퓨터 프로그램, 버전 6.0, Devereux et al . 기재 ( Nucl . Acids Res. 12:387, 1984) 을 사용한 서열 정보와 위스콘신 대학 유전자 컴퓨터 그룹 (UWGCG), ClustalW, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman을 사용한 서열 정보를 비교함에 의해 결정될 것이다. GAP 프로그램에 대한 일상적인 디폴트 계수는: (1) (동일한 경우 1 및 동일하지 않은 경우 0의 값을 갖는) 뉴클레오티드에 대해 단항 비교 매트릭스 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979에 기재된 바와 같은 Gribskov and Burgess, Nucl . Acids Res. 14:6745, 1986의 측량 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해 페널티 3.0 및 각각의 갭에서 각각의 상징에 추가 페널티 0.10; 및 (3) 말단 갭에 대해는 페널티 없음을 포함한다. 서열 비교의 분야에서 당업자에게 알려진 다양한 프로그램이 선택적으로 사용될 수 있다.
용어 "상류"는 선형 폴리뉴클레오티드 서열을 따라 참조 요소에 대한 상대적 방향/위치를 말하고, 이것은 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 말단을 향한 방향/위치를 나타낸다. "상류"는 "참조 요소의 5' 말단"과 상호교환하여 사용될 수 있다.
'기능적으로-연결된'은 기능적 전사 유니트 또는 기능적 발현 벡터를 생산하기 위한 개별의 폴리펩티드 요소, 단편 또는 서열의 연결을 말한다.
'프로모터(promoter)'는 NtMRP RNAi 구축물과 같은 - 이중 가닥 DNA 단편에 통상적으로 상부에 위치하고 기능적으로 연결된 폴리펩티드 요소/서열을 말한다. 예를 들면, 적절한 프로모터는 RNA 합성을 개시하기 위해, RNA 폴리머라제와 다양한 인자들을 포함하여 전사 복합체를 모아서 NtMRP RNAi 구축물의 전사 활성을 가능하게 한다. 프로모터는 관심의 자연 유전자에 가까운 영역으로부터 전적으로 유래될 수 있고, 또는 다양한 자연 프로모터 또는 합성 NDA 분획으로부터 유래된 다양한 요소들로 구성될 수 있다.
'인핸서(enhancer)'는 프로모터 활성을 증가시킴에 의해 전사 활성을 강화하기 위해, 전사 활성제와 같은 전사 조절 단백질을 모집할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 말한다. 적절한 인핸서는 관심의 자연 프로모터에 가까운 영역으로부터 유래될 수 있고 (상동성 기원) 또는 비천연 컨텍스트로부터 유래될 수 있고 (이형 기원) 그리고 프로모터의 활성 또는 조직-특이성을 강화시키기 위해, RNAi 발현 벡터와 같은 NtMRP 구축물 내에 어느 관심의 프로모터에 기능적으로 연결될 수 있다. 몇몇 인핸서는 전사 유니트의 배열에 대하여 어느 배열로도 작용할 수 있다. 예를 들면, 인핸서는 프로모터와 NtMRP 구축물을 포함하는 전사 유니트의 상류 또는 하류에 놓일 수 있다.
본 발명에 사용되는 바에 따르면, 용어 '식물'은 그것의 생활주기 또는 발달의 어느 단계의 어느 식물 및 그것의 자손을 말한다. 한 구현예에서, 식물은 담배 식물이고, 이것은 니코티아나 속(genus)에 속하는 식물을 말한다. 담배 식물의 바람직한 종, 품종, 잡종 및 변종들을 본 명세서에 기재하였다.
용어 '식물 세포'는 식물의 구조적 및 생리적 단위를 말한다. 식물 세포는 세포벽이 없는 원형질체, 단리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태일 수 있고, 또는 식물 조직, 식물 기원 또는 전체 식물과 같은 더 분화된 단위의 일부일 수 있다.
'식물 재료'는 어느 고체, 액체 또는 기체 조성물 또는 그것이 조합물을 포함하고, 바이오매스, 잎, 잎 조각, 주맥, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃의 일부, 열매, 화분, 난세포, 접합체, 씨앗, 꺾꽂이 순, 분비물, 추출물, 세포 또는 조직 배양물 또는 기타 식물의 다른 부분을 포함하는 식물 또는 식물의 산물을 말한다. 한 구현예에서, 식물 재료는 바이오매스, 씨앗 또는 잎을 포함하거나 구성된다. 또 다른 예에서, 식물 재료는 잎을 포함하거나 구성된다.
용어 "품종(variety)"은 동일한 종의 다른 식물로부터 그들을 구별하는 일정한 특성을 공유하는 식물의 개체군을 말한다. 하나 이상의 구별가능한 특질을 소유하면서, 품종은 추가로 그 품종 내의 개개들 사이에 매우 작은 전체적인 변이에 의해 특징된다. 품종은 종종 상업적으로 시판된다.
용어 "계통(line)" 또는 "육종 계통"은 식물 육종 중 사용되는 식물의 군을 나타낸다. 계통은 다른 특질에 대하여 개개 사이에 몇몇 차이가 있지만, 하나 이상의 관심의 특질에 대해 개개 사이에 거의 차이를 나타내지 않기 때문에 품종과 구별된다.
용어 "감소" 또는 "감소된"은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 폴리펩티드 활성, 전사 활성, 및/또는 단백질 발현과 같은 양 또는 활성의 약 10% 내지 약 99%의 감소, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%, 200% 또는 300%의 감소를 말한다.
용어 "억제" 또는 "억제된"은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 폴리펩티드 활성, 전사 활성 및/또는 단백질 발현과 같은, 양 또는 활성의 약 98% 내지 약 100%의 감소, 또는 적어도 98%, 적어도 99%, 특히 100%의 감소를 말한다.
용어 "증가" 또는 "증가된"은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 폴리펩티드 활성, 전사 활성 및/또는 단백질 발현과 같은, 양 또는 활성의 약 10% 내지 약 99&의 증가, 또는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%, 200% 또는 300% 이상의 증가를 말한다.
대조 식물 또는 대조 식물 세포의 컨텍스트에서 용어 "대조"는 특정 유전자 또는 단백질 - NtMRP와 같은-의 발현 또는 활성이 변형(예를 들면, 증가 또는 감소)되지 않은 식물 또는 식물 세포를 의미하고, 따라서 이것은 - NtMRP와 같은- 특정 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 변형되지 않은 식물과의 비교를 제공할 수 있다. 대조 식물은 빈(empty) 벡터를 포함할 수 있다. 대조 식물은 야생형 식물에 해당할 것이다.
발명의 상세한 설명
NtMRP3 및 NtMRP4 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 NtMRP 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 본 명세서에 기재된다. 도 6에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 기재된 바와 같은 NtMRP3 게놈성 클론은: 인트론 1 (SEQ ID NO:30), 인트론 2 (SEQ ID NO:31), 인트론 3 (SEQ ID NO:32), 인트론 4 (SEQ ID NO:33), 인트론 5 (SEQ ID NO:34), 인트론 6 (SEQ ID NO:35), 인트론 7 (SEQ ID NO:36), 인트론 8 (SEQ ID NO:37), 인트론 9 (SEQ ID NO:38), 인트론 10 (SEQ ID NO:39), 엑손 1 (SEQ ID NO:40), 엑손 2 (SEQ ID NO:41), 엑손 3 (SEQ ID NO:42), 엑손 4 (SEQ ID NO:43), 엑손 5 (SEQ ID NO:44), 엑손 6 (SEQ ID NO:45), 엑손 7 (SEQ ID NO:46), 엑손 8 (SEQ ID NO:47), 엑손 9 (SEQ ID NO:48), 엑손 10 (SEQ ID NO:49) 및 엑손 11 (SEQ ID NO:50)을 포함한다.
다양한 구현예들이 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29의 단편, 또는 그들의 변이체를 포함하는, NtMRP3 유전자자리에 위치한 게놈성 단편으로 대표되는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대해 제공된다
다양한 구현예들이 SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:51의 단편, 또는 그들의 변이체를 포함하는, NtMRP3 유전자 자리의 cDNA 서열로 대표되는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대해 제공된다.
다양한 구현예들이 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29, 또는 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29의 단편과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 서열 상동성을 갖는 단리된 NtMRP 폴리뉴클레오티드에 대해 제공된다.
다양한 구현예들이 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO: 51 또는 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO: 51의 단편과 적어도 71%, 72%, 73%, 74% 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 서열 상동성을 갖는 NtMRP 폴리뉴클레오티드 변이체의 것을 보완하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대해 제공된다.
다양한 구현예들이 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO: 51, 또는 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO: 51의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드에, 보통의 내지 매우 엄격한 조건하에서 특이적으로 혼성화될 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대해 제공된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2로 기재된 NtMRP4 게놈성 클론은: 인트론 1 (SEQ ID NO:3), 인트론 2 (SEQ ID NO:4), 인트론 3 (SEQ ID NO:5), 인트론 4 (SEQ ID NO:6), 인트론 5 (SEQ ID NO:7), 인트론 6 (SEQ ID NO:8), 인트론 7 (SEQ ID NO:9), 인트론 8 (SEQ ID NO:10), 인트론 9 (SEQ ID NO:11), 인트론 10 (SEQ ID NO:12), 엑손 1 (SEQ ID NO:13), 엑손 2 (SEQ ID NO:14), 엑손 3 (SEQ ID NO:15), 엑손 4 (SEQ ID NO:16), 엑손 5 (SEQ ID NO:17), 엑손 6 (SEQ ID NO:18), 엑손 7 (SEQ ID NO:19), 엑손 8 (SEQ ID NO:20), 엑손 9 (SEQ ID NO:21), 엑손 10 (SEQ ID NO:22) 및 엑손 11 (SEQ ID NO:53) 또는 SEQ ID No. 23을 포함한다.
다양한 구현예가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 단편, 또는 그들의 변이체를 포함하는, NtMRP4 유전자 자리에 위치한 게놈성 단편들을 대표하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대해 제공된다.
다양한 구현예가 SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:27의 단편, 또는 그것의 변이체를포함하는 단리된 cDNA에 대해 제공된다.
다양한 구현예가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO. 27 또는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO. 27의 단편과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 서열 상동성을 갖는 단리된 NtMRP 폴리뉴클레오티드 변이체에 대해 제공된다.
다양한 구현예가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO. 27, 또는SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:27의 단편과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 서열 상동성을 갖는 단리된 NtMRP 폴리뉴클레오티드 변이체를 보충하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대해 제공된다.
다양한 구현예가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID No. 27, 또는SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID No. 27의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드에, 보통의 내지 매우 엄격한 조건하에서, 특이적으로 혼성화될 수 있는 단리된 폴리뉴클레오티드에 대해 제공된다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드는, 비록 몇몇 경우, 폴리뉴클레오티드 동족체가 포함되지만, 일반적으로, 예를 들면, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 O-메틸포스포로아미디트 연결(linkage); 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 백본 및 연결을 포함하는 포스포디에스테르 결합을 함유한다. 기타 유사 폴리뉴클레오티드는 양의 백본; 비-이온성 백본; 및 비-리보스 백본을 가진 것을 포함한다. 리보스-포스페이트 백본의 변형은 다양한 원인에 대해, 예를 들면, 생리적 환경에서 이와 같은 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해, 또는 생체칩 상의 프로브로서 수행될 수 있다. 자연발생 폴리뉴클레오티드와 유사체의 혼합물이 제조될 수 있고; 선택적으로, 다양한 폴리뉴클레오티드 유사체의 혼합물, 및 자연발생 폴리뉴클레오티드 및 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다.
예를 들면, 포스포라미테이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포스포로아미디트 연결 및 펩티드 폴리뉴클레오티드 백본 및 연결을 포함하여 다양한 폴리펩티드 유사체가 알려져 있다. 기타 유사한 폴리뉴클레오티드는 양성 백본, 비-이온성 백본 및 비-리보스 백본을 갖는 것을 포함한다. 하나 이상의 탄소고리 당을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 또한 포함된다.
또 다른 유사체는 펩티드 폴리뉴클레오티드 유사체인 펩티드 폴리뉴클레오티드 (PNA)를 포함한다. 이들 백본은 자연발생 폴리뉴클레오티드의 고도로 하전된 포스포디에스테르 백본과 달리, 자연 조건하에서 실질적으로 비-이온성이다. 이것은 유리한 결과를 가져올 것이다. 우선, PNA 백본은 개선된 혼성화 반응 속도를 나타낼 수 있다. PNA는 미스매치 대 완벽히 매치된 염기쌍들에 대해 녹는점 (Tm)에서의 변화가 크다. 통상적으로 DNA와 RNA는 내부 미스매치의 경우 Tm에서 2~4 ℃의 온도 하락을 나타낸다. 비-이온성 PNA 백본을 사용하여, 하락은 7~9℃에 가깝다. 유사하기는, 비-이온성 특성으로 인해, 이들 백본에 부착된 염기들의 혼성화는 비교적 염 농도에 민감하지 않다. 이에 더하여, PNA는 세포 효소에 의해 덜한 정도로 열화되거나 열화되지 않을 것이고, 따라서 더욱 안정하다.
기재된 NtMRP 폴리뉴클레오티드, 및 그들의 단편의 조합의 사용은 폴리뉴클레오티드 혼성화 분석에서 프로브로서 또는 폴리뉴클레오티드 증폭 분석에서 사용하기 위한 프라이머로서의 사용 또는 RNAi 분자와 같은, 다양한 폴리뉴클레오티드 구축물의 개발에서 단편의 사용이다. 이와 같은 단편들은 일반적으로, 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 이상의 DNA 서열의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, DNA 단편은 적어도 약 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60 이상의 DMA 서열의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 그러므로, 추가의 면에서, 본 명세서에 기재된 프로브 및/또는 프라이머의 사용을 포함하는 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법이 제공된다.
혼성화 조건의 선택에 영향을 미치는 기본적인 계수들과 조건에 적합한 장비화에 대한 안내가 Sambrook, J., E. F. Fritsch, 및 T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 기재되어 있다. 유전 암호에 대한 지식을 상기 설명된 아미노산 서열과 결합하여 사용하여, 열화된 올리고뉴클레오티드의 세트를 제조할 수 있다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)에서 프라이머로서 유용하고, 반면 폴리뉴클레오티드 단편은 단리되고 증폭된다. 특정 구현예에서, 열화된 프라이머는 비-인간 라이브러리에 대해 프로브로서 사용될 수 있다. 이와 같은 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 게놈성 라이브러리, 및 심지어 전자 EST (발현 서열 태그) 또는 DNA 라이브러리를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 이 방법으로 동정된 상동성 서열은 그리고 나서 본 발명에서 동정된 NtMRP 서열의 비-인간 상동체를 동정하는데 프로브로서 사용될 수 있다.
또한 잠재적 용도는 감소된 엄격 조건하에서, 통상적으로 보통으로 엄격한 조건에서, 및 일반적으로 높은 엄격한 조건에서 본 명세서에 기재된 NtMRO 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 (예를 들면, 프라이머 또는 프로브)이다. 혼성화 조건의 선택에 영향을 미치는 기본적인 계수들과 적절한 조건을 구성하기 위한 안내는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)에 기재되어 있고, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 염기 조성을 기준으로 본 분야의 당업자에게 쉽게 측정될 수 있다.
보통의 엄격한 조건을 얻는 하나의 방식은 5x 표준 소듐 시트레이트을 함유하는 예비세척 용액, 0.5% 소듐 도데실 설페이트, 1.0 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (pH 8.0), 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충액, 6x 표준 소듐 시트레이트, 및 약 55 ℃의 혼성화 온도 (또는 유사한 다른 혼성화 용액, 예를 들면, 약 50% 포름아미드를 함유하는 용액, 혼성화 온도 약 42℃에서), 및 0.5x 표준 소듐 시트레이트, 0.1% 소듐 도데실 설페이트 중에서 약 60℃의 세척 조건의 사용을 포함한다. 일반적으로, 높은 엄격한 조건은 상기와 같은 혼성화 조건으로 정의되지만, 대략 68℃에서, 0.2x 표준 소듐 시트레이트, 0.1% 소듐 도데실설페이트로 세척한다. SSPE (1x SSPE는 0.15M 염화나트륨, 10 mM 인산나트륨, 및 1.25 mM 에틸렌디아민테트라아세테이트산, pH 7.4이다)는 혼성화 및 세척 완충액에서 표준 소듐 시트레이트(1x 표준 소듐 시트레이트는 0.15M 염화나트륨 및 15 mM 시트르산 나트륨이다)에 대해 치환될 수 있고; 세척은 혼성화가 완료된 후 15분 동안 수행된다. 세척 온도 및 세척 염 농도는 원하는 정도의 엄격함을 얻기 위해, 본 분야의 당업자에게 알려지고 아래에 더욱 기재된 혼성화 반응과 이중 안정성을 제공하는 기본 원칙을 적용함에 의해 필요에 따라 조절될 수 있다 (예를 들면, Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 참조). 폴리뉴클레오티드를 알려지지 않은 서열의 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 때, 혼성체 길이는 혼성화 폴리뉴클레오티드의 길이일 것으로 가정된다. 공지 서열의 폴리뉴클레오티드가 혼성화될 때, 혼성체 길이는 폴리튜클레오티드의 서열을 배열하고 최적 서열 보체의 영역 또는 영역들을 동정함에 의해 확인될 수 있다. 길이가 50 염기쌍 보다 적게 참여하는 혼성체에 대한 혼성화 온도는 혼성체의 녹는점 (Tm) 보다 5 ~10℃ 낮아야 하고, 여기서 Tm 은 다음의 식에 따라 결정된다. 길이가 18 염기쌍 미만인 혼성체의 경우, Tm (℃)=2(A+T 염기의 수)+4(G+C 염기의 수)이다. 길이가 18 염기쌍 이상인 혼성체의 경우, Tm (℃)=81.5+16.6(log10 [Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)이고, 여기서 N은 혼성체에서 염기의 수이고, [Na+]은 혼성화 완충액 중 소듐 이온의 농도이다 (1x 표준 소듐 시트레이트의 [Na+] = 0.165M). 통상적으로, 각각의 이와 같은 혼성화 폴리뉴클레오티드는 그것이 혼성화되는 폴리뉴클레오티드의 길이의 적어도 25% (일반적으로 적어도 50%, 60% 또는 70%, 가장 일반적으로는 적어도 80%)인 길이를 갖고, 그것이 혼성화되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 60% 서열 상동성 (예를 들면, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 또는 적어도 99%) 을 갖는다.
본 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 선형 DNA는 2개의 가능한 배열을 갖는다: 5'에서 3' 방향 및 3'에서 5' 방향. 예를 들면, 참조 서열이 5'에서 3' 방향으로 놓이고, 제2 서열인 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에 5'에서 3' 방향으로 놓이면, 참조 서열과 제2 서열은 동일한 방향으로 배열되고, 또는 동일한 배열을 갖는다. 통상적으로, 프로모터 서열과 주어진 프로모터의 조절 하에 관심의 유전자는 동일한 방향으로 놓인다. 그러나, 5'에서 3' 방향으로 놓인 참조 서열에 대하여, 제2 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드 분자/가닥 내에서 3'에서 5'방향으로 놓이면, 참조 서열 및 제2 서열은 안티-센스 방향으로 배열되거나 또는 안티-센스 배열을 갖는다. 서로 안티-센스 배열을 갖는 두 서열은 선택적으로 동일한 배열을 갖는 것으로 기재될 수 있다. 참조 서열 (5'에서 3' 방향)과 참조 서열의 역 상보적 서열 (5'에서 3' 방향으로 놓인 참조서열)은 동일한 뉴클레오티드 분자/가닥 내에 위치한다. 본 명세서에 기재된 서열들은 5'에서 3' 방향인 것으로 나타난다.
NtMRP 폴리펩티드는 어느 유형의 변경의 도입(예를 들면, 아미노산의 삽입, 결찰, 또는 치환; 글리코실화 상태의 변화; 재접힘 또는 이성질화, 3-차원 구조, 또는 자가-결합 상태에 영향을 미치는 변화)에 의해 생산된 변이체를 포함하고, 이것은 고도로 조작되거나 자연적으로 단리될 수 있다. NtMRP3 또는 NtMRP4 폴리펩티드는 선형 형태이거나 또는 공지의 방법으로 고리화될 수 있다. NtMRP4 폴리펩티드는 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40 연속 아미노산을 포함한다.
다양한 구현예들이 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:51 및 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:51의 단편, 또는 그것의 변이체를 포함하는, 구성되는 또는 본질적으로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단리된 NtMRP3 폴리펩티드에 대해 제공된다.
다양한 구현예가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:27의 단편, 또는 그들의 변이체를 포함하는, 구성된 또는 본질적으로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단리된 NtMRP4 폴리펩티드에 대해 제공된다.
다양한 구현예가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO:51 또는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:28 또는 SEQ ID NO:29 또는 SEQ ID NO;51의 단편과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 서열 상동성을 포함하는 단리된 NtMRP 폴리펩티드 변이체에 대해 제공된다.
NtMRP, NtMRP3 및 NtMRP4의 돌연변이 폴리펩티드 변이체들이 또한 청구항에 포함되고 그리고 본 명세서에서 NtMRP 및/또는 MtMRP3 및/또는 NtMRP4의 돌연변이 폴리펩티드 변이체를 포함하는 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자 변형 식물 (예를 들면, 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자 변형 담배 식물)로서 기재된다.
본 발명에 사용되는 용어 '비자연발생'은 자연적으로 형성되지 않거나 자연적으로 존재하지 않는 독립체(entity) (예를 들면, 폴리뉴클레오티드, 유전적 돌연변이, 폴리펩티드, 식물, 식물 세포 및 식물 재료)를 기재한다. 이와 같은 비자연발생 독립체 또는 인공적 독립체는 본 명세서에 기재된 또는 본 분야에 알려진 방법에 의해 제조되거나, 합성되거나, 개시되거나, 변형되거나, 개입되거나 또는 조작될 수 있다. 그러므로, 예로서, 비자연발생 식물, 비자연발생 식물 세포 또는 비자연발생 식물 재료는 여교배(backcrossing)와 같은 전통적인 식물 육종술을 사용하여 또는 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 메가뉴클레아제 등과 같은 유전자 조작술에 의해 제조될 수 있다. 추가의 예로서, 비자연발생 식물, 비자연발생 식물 세포 또는 비자연발생 식물 재료는 유전자이입에 의해 또는 제1 식물 또는 식물 세포로부터 제2 식물 또는 식물 세포(이것은 자연발생하는 것일 수 있다)로의 하나 이상의 유전적 돌연변이(예를 들면, 동질이상)의 수송에 의해 제조될 수 있고, 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 그것의 자손은 자연적으로 형성되지 않는 또는 자연에 존재하지 않는 유전적 구성물(예를 들면, 게놈, 염색체 또는 그것의 단편)을 포함한다. 그러므로, 생성된 식물, 식물 세포 또는 식물 재료는 인공적이거나 비자연 발생한다. 따라서, 인공 또는 비자연발생 식물 또는 식물 세포는, 생성된 유전적 서열이 제1 식물 또는 식물 세포와 다른 유전적 역교배를 포함하는 제2 식물 또는 식물 세포에서 자연발생하더라도, 제1의 자연발생 식물 또는 식물 세포에서의 유전적 서열을 변형함에 의해 제조될 수 있다. 유전적 배경에서의 차이는 유전형 차이에 의해 또는 폴리뉴클레오티드 서열화, 유전적 마커(예를 들면, 미소부수체(microsatellite) RNA 마커)의 존재 또는 부재와 같은, 본 분야에 알려진 분자 생물학 기술에 의해 확인될 수 있다.
폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현하기에 적합한 배양 조건하에서 변형된 또는 재조합 숙주 세포를 배양하여 제조될 수 있다. 생성된 발현된 펩티드는 그리고 나서 공지의 정제 과정을 사용하여 배양물로부터 정제될 것이다. 폴리펩티드의 정제는 또한 폴리펩티드에 결합할 약제를 함유하는 친화성 칼럼; 콘카나발린 A-아가로스, 헤파린-도요퍼얼® 또는 시바크롬 블루 3GA 세파로스®과 같은 친화성 수지에 걸쳐 하나 이상의 칼럼 단계; 페닐 에테르, 부틸 에테르, 또는 프로필 에테르와 같은 수지를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 단계; 또는 면역친화성 크로마토그래피를 포함한다.
선택적으로, 폴리펩티드는 또한 용이하게 정제되는 형태로 발현될 수 있다. 예를 들면, 말토스 결합 폴리펩티드 (MBP), 글루타티온-5-트란스퍼라제 (GST) 또는 티오레독신 (TRX)의 것과 같은 융합 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 이와 같은 융합 폴리펩티드의 발현 및 정제를 위한 키트는 각각, New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, N.J.), 및 InVitrogen 사로부터 시판된다. 폴리펩티드는 또한 에피토프로 태그될 수 있고 이어서 이와 같은 에피토프에 지향되는 특정 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매체 예를 들면, 매달린 메틸 또는 다른 지방족기를 갖는 실리카겔을 사용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계가 폴리펩티드를 더욱 정제하기 위해 사용될 수 있다. 상기 정제 단계들 중 몇몇 또는 모두는 다양한 조합으로 실질적으로 동종의 재조합 폴리펩티드를 제공하는데 사용될 수 있다. 이와 같이 정제된 폴리펩티드는 실질적으로 다른 폴리펩티드가 없고 본 명세서에서 "실질적으로 정제된 폴리펩티드"로 정의되고; 이와 같은 정제된 폴리펩티드는 NtMRP 폴리펩티드, 단편, 변이체 등을 포함한다. 폴리펩티드와 단편의 발현, 단리 및 정제는 본 명세서에 기재된 방법을 포함하여 어느 적절한 기술에 의해 수행될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
친화성-정제 발현된 폴리펩티드에 폴리펩티드에 대항하여 발생된 모노클로날 항체와 같은 친화성 칼럼을 사용하는 것도 또한 가능하다. 이들 폴리펩티드는 통상의 기술을 사용하여, 예를 들면, 고염 용리 완충액 중에서 친화성 칼럼으로부터 제거되고 그리고 나서 사용을 위해 저염 완충액으로 삼투될 수 있고, 또는 pH 또는 사용된 친화성 매트릭스에 의존하는 기타 성분들을 변화시킴에 의해, 또는 본 명세서로부터 유래된 폴리펩티드와 같은 친화성 모이어티의 자연발생 기질을 사용하여 경쟁적으로 제거될 수 있다.
폴리펩티드는 또한 공지의 통상의 화학적 합성법에 의해 생산될 수 있다. 합성 수단에 의한 폴리펩티드 또는 단편을 구축하는 방법은 본 분야의 당업자에게 알려져 있다. 합성으로 구축된 폴리펩티드 서열은 자연 폴리펩티드에 의한 1차, 2차 또는 3차 구조 또는 배좌 특성을 공유함에 의해, 생물학적 활성을 포함하여, 그들에 통상적인 생물학적 성질을 소유할 것이다.
구현예는 NtMRP 폴리펩티드의 발현수준을 감소시킴에 의해 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성을 감소시킴에 의해 잎 조각으로의 중금속 (예를 들면, 카드뮴) 수송을 감소시키거나 지연시키도록 변형된 돌연변이성, 비자연발생 또는 유전자이식 식물을 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. NtMRP RNA 전사의 정상상태 (steady-state) 수준은 대조 식물과 비교하여 감소될 수 있다. 결론적으로, 세포막을 가로질러 중금속 (예를 들면, 카드뮴)을 수송할 수 있는 기능적으로 활성인 NtMRP 수송체의 수가 줄어들 수 있고 또한 식물에서 카드뮴의 수준이 감소될 수 있다.
NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현의 감소는 약 5 % 내지 약 100　%의 감소, 또는 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 최대 100 %의 감소이고, 이것은 전사 활성 또는 단백질 발현에서의 감소를 포함한다.
NtMRP 단백질의 활성의 감소는 약 5 % 내지 약 100%, 또는 적어도 10 %, 적어도 20 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 98 %, 또는 최대 100 %의 감소이다.
억제는 약 98% 내지 약 100%의 감소, 또는 적어도 98 %, 적어도 99 %, 특히 100 %의 감소를 말한다.
본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 및 재조합 구축물은 관심의 식물 종에서 NtMRP 폴리펩티드의 발현을 조절 (예를 들면, 감소 또는 억제)하는데 사용될 수 있다. 안티센스 RNA, 리보자임 유도 RNA 분할, 전사후 유전자 발현억제 (PTGS), 예를 들면, RNA 간섭 (RNAi) 및 전사 유전자 발현억제 (TGS)를 포함하여, 다수의 폴리펩티드 기재 방법이 식물에서 유전자 발현을 억제한다고 알려져 있다. 적절한 폴리펩티드는 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 전장 폴리뉴클레오티드 또는 이와 같은 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함한다. 몇몇 예에서 전장 폴리펩티드 또는 그들의 단편의 보체가 사용될 수 있다. 통상적으로 단편은 적어도 10개의 연속 뉴클레오티드, 예를 들면, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 35, 40, 50, 80, 100, 200, 500 또는 그 이상의 연속뉴클레오티드이다. 일반적으로 더 짧은 서열의 사용을 위해 더 동종물이 보충을 위해 사용될 수 있다.
그러므로, NtMRP의 발현 또는 활성을 조절 (예를 들면, 감소 또는 억제)할 수 있는 조성물은, 하나 이상의 내인성 NtMRP 유전자의 전사를 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; NtMRP RNA 전사체 (예를 들면, 이중 가닥 RNA, siRNA, 리보자임)의 번역을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; NtMRP 단백질의 안정성을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리펩티드; NtMRP 단백질의 효소적 활성 또는 기질 또는 조절 단백질에 대한 NtMRP 단백질의 결합활성을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; NtMRP에 대한 특이성을 나타내는 항체; NtMRP 단백질에 대한 안정성 또는 NtMRP 단백질에 대한 효소 활성 또는 NtMRP 단백질의 결합활성을 간섭할 수 있는 소분자 화합물; NtMRP 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 손가락 단백질; 및 NtMRP 폴리뉴클레오티드에 대한 활성을 갖는 메가뉴클레아제를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
안티센스 기술은 NtMRP 폴리펩티드의 발현을 조절 (예를 들면, 감소 또는 억제)하는데 사용할 수 있는 잘 알려진 방법 중 하나이다. 억제될 유전자의 폴리펩티드는 클로닝되고 RNA의 안티센스 가닥이 전사되도록 조절 영역과 전자 종결 서열에 기능적으로 연결된다. 재조합 구축물은 그리고 나서 본 발명에 기재된 바와 같이 식물로 변형되고, RNA의 안티센스 가닥이 생산된다. 폴리뉴클레오티드는 억제될 유전자의 전체 서열일 필요가 없지만, 통상적으로 억제될 센스 가닥의 적어도 일부와 실질적으로 상보적일 것이다.
폴리뉴클레오티드는 리보자임, 또는 mRNA의 발현에 영향을 미치는 촉매적 RNA로 전사될 수 있다. 리보자임은 실질적으로 어느 표적 RNA와 특이적으로 쌍을 이루도록 그리고 특정 장소에서 포스포디에스테르 백본을 쪼개어, 표적 RNA를 기능적으로 불활성화시키도록 고안될 수 있다. 이형 폴리뉴클레오티드는 리보자임을 특정 mRNA 전사물을 쪼개도록 암호화하여, 폴리펩티드의 발현을 막을 수 있다. 비록 부위-특이적 인식 서열에서 mRNA를 쪼개는 다양한 리보자임이 사용될 수 있지만, 해머해드 리보자임이 특정 mRNA를 파괴하는데 유용하다. 해머해드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적 염기쌍을 형성하는 플랭킹 영역에 의해 지시를 받는 영역에서 mRNA를 쪼갠다. 유일한 요구사항은 표적 RNA가 5'-UG-3' 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것이다. 해머해드 리보자임의 구축 및 생산은 본 분야에 알려져 있다. 해머해드 리보자임 서열은 인 비보 분열을 증가시키기 위해 트랜스퍼 RNA (tRNA)와 같은 안정한 RNA에 임베드될 수 있다.
예를 들면, 구축물은 스스로에 어닐링 될 수 있는 RNA, 예를 들면 줄기-루프 구조를 갖는 이중 가닥 RNA로 전사되는 서열을 포함하여 제조될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 이중 가닥 RNA의 줄기 부분 중 한 가닥은 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 센스 코팅 서열과 유사하거나 또는 동일한 서열 또는 그것의 단편을 포함하고, 이것은 길이로 약 10 뉴클레오티드 내지 약 2,500 연속 뉴클레오티드이다. 센스 코팅 서열과 유사하거나 또는 동일한 서열의 길이는 10 연속 뉴클레오티드 내지 500 연속 뉴클레오티드, 15 연속 뉴클레오티드 내지 300 연속 뉴클레오티드, 20 연속 뉴클레오티드 내지 100 연속 뉴클레오티드, 또는 25 연속 뉴클레오티드 내지 100 연속 뉴클레오티드일 수 있다. 이중 가닥 RNA의 줄기 부분의 다른 가닥은 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 안티센스 가닥과 유사한 또는 동일한 서열 또는 그것의 단편을 포함하고, 그것의 길이는 센스 서열의 상응하는 길이보다 짧거나, 같거나, 길 수 있다. 몇몇 경우, 이중 가닥 RNA의 줄기 부분 중 하나의 가닥은 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 mRNA의 3' 또는 5' 비번역 영역 또는 그것의 단편과 유사하거나 또는 동일한 서열을 포함하고, 이중 가닥 RNA의 줄기 부분 중 다른 가닥은 각각 3' 또는 5' 비번역 영역에 상보적인 서열과 유사하거나 또는 동일한, NtMRP를 암호화하는 mRNA의 서열 또는 그것의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, 이중 가닥 RNA의 줄기 부분 중 하나의 가닥은 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 예비-mRNA에서 인트론의 서열과 유사하거나 또는 동일한 서열 또는 그것의 단편을 포함하고, 줄기 부분 중 다른 가닥은 예비-mRNA에서, 인트론의 서열과 상보적인 서열과 유사하거나 또는 동일한 서열, 또는 그것의 단편을 포함한다.
이중 가닥 RNA의 루프 일부는, 약 15 뉴클레오티드 내지 약 1000 뉴클레오티드, 약 20 뉴클레오티드 내지 약 500 뉴클레오티드, 약 25 뉴클레오티드 내지 약 250 뉴클레오티드와 같이, 약 3 뉴클레오티드 내지 약 5,000 뉴클레오티드일 수 있다. RNA의 루프의 일부는 인트론 또는 그것의 단편을 포함할 수 있다. 이중 표준 RNA는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 줄기-루프 구조를 가질 수 있다.
조절 영역 또는 전사 종료 서열에 기능적으로 연결된, 그리고 이중 가닥 RNA를 형성할 수 있는 RNA로 전사되는 서열을 포함하는 구축물은 본 발명에 기재된 바와같이 식물로 변형될 수 있다. 유전자의 발현을 억제하기 위해 RNAi를 사용하는 방법은 본 분야에 알려져 있다.
센스 배열에서 폴리뉴클레오티드 분자에 기능적으로 연결된 조절 영역을 포함하는 구축물은 유전자의 발현을 억제하는데도 사용될 수 있다. 전사 산물은 NtMRP 폴리펩티드의 센스 코딩 서열, 또는 그것의 단편과 유사하거나 또는 동일할 수 있다. 전사 산물은 또한 폴리아데닐화되지 않은(unpolyadenylated), 결핍 5' 캡 구조일 수 있고, 또는 접속점 없는 인트론을 함유한다. 전장 cDNA 뿐 아니라 부분적 cDNA 서열을 사용하여 유전자 발현을 억제하는 방법이 본 분야에 알려져 있다.
몇몇 구현예에서, 서로 상보적인 센스 및 안티센스 서열 둘 다에 대한 주형인 적어도 하나의 가닥을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구축물이 유전자의 발현을 억제하는데 사용된다. 센스 및 안티센스 서열은 더 큰 폴리뉴클레오티드 분자의 일부일 수 있고 또는 보체가 아닌 서열들을 갖는 별개의 폴리뉴클레오티드 분자의 일부일 수 있다. 센스 또는 안티센스 서열은 mRNA의 서열, mRNA의 3' 또는 5' 비번역 영역, 또는 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 예비-mRNA에서의 인트론과 동일하거나 또는 상보성인 서열, 또는 이들 서열의 단편일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 센스 또는 안티센스 서열은 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 전사를 구동하는 조절 영역의 서열과 동일하거나 또는 상보적이다. 각각의 경우, 센스 서열은 안티센스 서열과 상보성인 서열이다.
센스 및 안티센스 서열은 약 10 뉴클레오티드보다 더 길이가 길 수 있다 (예를 들면, 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 그 이상의 뉴클레오티드). 예를 들면, 안티센스 서열은 길이가 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 뉴클레오티드이다. 통상적으로, 센스 및 안티센스 서열의 길이 범위는 약 15 뉴클레오티드 내지 약 30 뉴클레오티드, 예를 들면, 약 18 뉴클레오티드 내지 약 28 뉴클레오티드, 또는 약 21 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드, 또는 약 23 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드이다.
몇몇 구현예에서, 안티센스 서열은 본 발명에 기재된 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA 서열과 상보적인 서열 또는 그것의 단편이다. 안티센스 서열에 상보적인 센스 서열은 NtMRP 폴리펩티드의 mRNA 내에 존재하는 서열일 수 있다. 통상적으로, 서열과 안티센스 서열은 표적 mRNA의 수준이 감소되도록 표적 mRNA의 15~30 뉴클레오티드 서열에 상응하도록 고안된다.
몇몇 구현예에서, 하나 이상의 센스 서열에 대한 주형인 적어도 하나의 가닥을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구축물(예를 들면, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 센스 서열)이 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 한편, 하나 이상의 안티센스 서열 (예를 들면, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 안티센스 서열)에 대한 주형인 적어도 하나의 가닥을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구축물이 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 구축물은 2개의 센스 서열과 2개의 안티센스 서열에 대한 주형인 적어도 하나의 가닥을 갖는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 복수 개의 센스 서열들은 같거나 또는 다를 수 있다. 복수 개의 안티센스 서열은 같거나 또는 다를 수 있다. 예를 들면, 구축물은 두 개의 동일한 센스 서열과 두 개의 동일한 안티센스 서열에 대한 주형인 하나의 가닥을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 선택적으로 단리된 폴리뉴클레오티드는 (1) 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 뉴클레오티드인 두 개의 동일한 센스 서열, (2) 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 또는 그 이상인 뉴클레오티드인 2 개의 동일한 센스 서열과 상보적인 하나의 안티센스 서열, (3) 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 또는 그 이상인 폴리뉴클레오티드인 센스 서열, 및 (4) 길이가 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 또는 그 이상의 뉴클레오티드인 센스 서열에 상보적인 3개의 동일한 안티서열에 대한 주형인 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 본 발명에 제공된 구축물은 센스 및 안티센스 서열의 어느 배열을 갖도록 고안될 수 있다. 예를 들면, 2개의 동일한 센스 서열은 두 개의 동일한 안티센스 서열이 뒤따를 수 있고 또는 두 개의 동일한 안티센스 서열 사이에 놓일 수 있다.
하나 이상의 센스 또는 안티센스 서열에 대한 주형인 적어도 하나의 가닥을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 상기 센스 또는 안티센스 서열을 포함하는 RNA 분자의 전사를 구동하기 위한 조절 영역에 기능적으로 연결될 수 있다. 이에 더하여, 이와 같은 폴리뉴클레오티드는 노팔린 합성효소 (nos) 유전자의 터미네이터와 같은 전사 종료 서열에 기능적으로 연결될 수 있다. 몇몇 경우, 두 개의 조절 영역이 두 전사물의 전사를 지시할 수 있다: 상부 가닥으로부터 하나, 그리고 저부 가닥으로부터 하나. 두 조절 영역은 같거나 또는 다를 수 있다. 두 전사물은 표적 RNA의 열화를 포함하여 이중-가닥 RNA 분자를 형성할 수 있다. 몇몇 경우, 폴리뉴클레오티드는 T-DNA 또는 식물-유래 트랜스퍼 DNA (P-DNA) 내에, 좌측 및 우측 T-DNA 경계 서열, 또는 P-DNA의 좌측 및 우측 유사-경계 서열이 폴리뉴클레오티드의 어느 쪽에 플랭크되거나 있도록 위치될 수 있다. 두 조절 영역 사이의 폴리펩티드 서열은 길이가 약 15 내지 약 300 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 200 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 100 뉴클레오티드, 약 15 애지 약 50 뉴클레오티드, 약 18 내지 약 50 뉴클레오티드, 약 18 내지 약 40 뉴클레오티드, 약 18 내지 약 30 뉴클레오티드, 또는 약 18 내지 약 25 뉴클레오티드일 수 있다.
따라서, NtMRP 단백질의 발현 또는 활성을 조절 (예를 들면, 하향 조절)할 수 있는 조성물은 하나 이상의 내인성 NtMRP 유전자(들)의 전사를 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; NtMRP RNA 전사 (예를 들면, 이중-가닥 RNA, siRNA, 리보자임)의 번역을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; NtMRP 단백질의 안정성을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; 기질 또는 조절 단백질에 대한 NtMRP 단백질의 효소활성 또는 NtMRP 단백질의 결합활성을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드; NtMRP 단백질에 대한 특이성을 나타내는 항체; NtMRP 단백질의 안정성 또는 NtMRP 단백질의 효소적 활성 또는 NtMRP 단백질의 결합 활성을 간섭할 수 있는 작은 분자 화합물; NtMRP 폴리뉴클레오티드를 결합시키는 아연 손가락 단백질; 및 NtMRP 폴리뉴클레오티드에 대한 활성을 갖는 메가뉴클레아제를 포함한다.
효과적인 안타고니스트는 잎(예를 들면 잎층 구조)으로의 중금속 (예를 들면, 카드뮴) 수송을 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%까지 감소시킬 수 있다. 한 구현예에서, NtMRP RNA 전사체의 번역을 간섭할 수 있는 서열-특이 폴리뉴클레오티드는 RNAi이다
RNA 간섭 ("RNAi") 또는 RNA 침묵은, 그것에 의해 특이적 mRNA가 효소적 열화에 표적될 수 있는 점진적으로 보전된 과정이다. 이중 가닥 RNA은 RNAi 경로를 개시하기 위해 세포 (예를 들면, 이중-가닥 RNA 바이러스, 또는 NtMRP RNAi 폴리뉴클레오티드)에 의해 도입 또는 생산되어야 한다. 이중 가닥 RNA는 이중 가닥 RNA-특이 엔도뉴클레아제 ("Dicer")인 RNases III에 의해 21-23 bp 길이 ("siRNAs")의 다중 siRNA 듀플렉스로 전환될 수 있다. siRNAs는 실질적으로 ATP-의존 과정을 통해 siRNA의 풀림을 촉진하는 RNA-유도 침묵 복합체에 의해 인식될 수 있다. siRNA의 풀린 안티센스 가닥은 활성화된 RISC를 siRNA 안티-센스 가닥과 상보적인 서열을 포함하는 표적화된 mRNA (예를 들면, NtMRP RNA 변이체)로 안내한다. 표적화된 mRNA 및 안티-센스 가닥은 A-형 나선을 형성할 수 있고, A-형 나선의 주요 홈은 활성화된 RISC에 의해 인식될 수 있다. 표적 mRNA는 siRNA 가닥의 5'-말단의 결합부위에 의해 정의된 단일부위에서 활성화된 RISC에 의해 분열될 수 있다. 활성화된 RISC는 또 다른 분열 사건을 촉매하기 위해 재사용될 수 있다.
NtMRP RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRP RNAi 구조물을 포함하는 NtMRP RNAi 발현 벡터는 NtMRP mRNA, NtMRP pre-mRNAs, 또는 관련 NtMRP RNA 변이체의 발현 수준을 낮춤에 의해 RNA 간섭 활성을 나타낸다. 발현 벡터는 본 명세서에 더욱 기재된 바와 같이, NtMRP RNAi 구축물에 상부 위치하고 기능적으로 연결된 프로모터를 포함한다. NtMRP RNAi 발현 벡터는 적절한 최소의 코어 프로모터, 관심의 NtMRP RNAi 구축물, 상류 (5') 조절 영역, 전사 터미날과 폴리아데닐화 신호를 포함하여, 하류(3') 조절 영역, 및 다양한 선택 마커와 같이, 당업자에게 알려진 기타 서열을 포함할 수 있다.
NtMRP 폴리뉴클레오티드는, 이중가닥 구조(즉, 안티센스 가닥과 상보성 센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNA 분자), 이중 가닥 머리핀형 구조 ("dsRNAi"), 단일 가닥 구조 (즉, 단지 안티센스 가닥만을 포함하는 ssRNA 분자)를 포함하여 다양한 형태로 생산될 수 있다. 구조들은, 자가-상보적 센스 및 안티센스 가닥을 갖는, 듀플렉스(duplex), 비대칭 듀플렉스, 머리핀 또는 비대칭 머리핀 2차 구조를 포함할 수 있다. NtMRP dsRNAi는 이중-가닥 NtMRP siRNAs로 효소적으로 전환될 수 있다. NtMRP siRNA 듀플렉스의 가닥 중 하나는 표적 NtMRP mRNA 및 관련 NtMRP RNA 변이체 내의 상보성 서열에 어닐링될 수 있다. siRNA/mRNA 듀플렉스는 서열-의존 방식으로 다중 부위에서 NtMRP RNA를 쪼개어, 표적 NtMRP mRNA 및 관련 NtMRP RNA 변이체의 열화를 가져온다.
이중-가닥 RNA 분자는 줄기-루프 구조의 단일 올리고뉴클레오티드로부터 조립된 siRNA 분자를 포함하고, 여기서 siRNA 분자의 자가-상보성 센스 및 안티센스 영역은 폴리뉴클레오티드 기재 또는 비-폴리뉴클레오티드-기재 링커, 뿐만 아니라 두 개 이상의 루프 구조 및 자가-상보성 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 줄기를 갖는 환형 단일-가닥 RNA에 의해 링크되고, 여기서 환형 RNA는 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 발생하기 위해 인비보 또는 인비트로에서 진행될 수 있다.
작은 머리핀 RNA (shRNA) 분자가 또한 기재되고, 이것은 통상적으로 스페이서 또는 루프 서열에 의해 분리된, 역 상보(센스) 서열에 더하여 특이적 안티센스 서열을 포함한다. 스페이서 또는 루프의 쪼개짐은 단일-가닥 RNA 분자와 그것의 역 보체를 제공하고, 이들은 (임의로 두 가닥 모두 또는 그 중 하나의 3' 말단과 5' 말단으로부터 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 추가 또는 제거하는 추가 과정에 의해) 이중-가닥 RNA-분자를 형성하도록 어닐링된다. 스페이서는 안티센스 및 센스 서열이 어닐링되고 스페이서의 분열 (그리고, 임의로 두 가닥 모두 또는 그 중 하나의 3' 말단 또는 5' 말단에서 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 추가 또는 제거를 가져오는 이후의 처리 단계)에 앞서 이중-가닥 구조 (또는 줄기)를 형성하도록 충분할 길이일 수 있다. 스페이서 서열은 통상적으로, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드로 어닐링될 때, shRNA를 포함하는 두 개의 상보적 뉴클레오티드 서열 영역 사이에 놓이는 관련없는 뉴클레오티드 서열이다. 스페이서 서열은 일반적으로 약 3 내지 약 100 뉴클레오티드 사이를 포함한다.
어느 관심의 NtMRP RNA 폴리뉴클레오티드는 NtMRP 머리핀 듀플렉스를 형성하기 위해 적절한 서열 조성물, 루프 크기, 및 줄기 길이를 선택함에 의해 생산될 수 있다. 머리핀 듀플렉스의 줄기 길이를 고안하기에 적합한 영역은, 약 14-30 뉴클레오티드, 약 30-50 뉴클레오티드, 약 50-100 뉴클레오티드, 약 100-150 뉴클레오티드, 약 150-200 뉴클레오티드, 약 200-300 뉴클레오티드, 약 300-400 뉴클레오티드, 약 400-500 뉴클레오티드, 약 500-600 뉴클레오티드, 및 약 600-700 뉴클레오티드와 같이, 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드의 줄기 길이를 포함한다. 머리핀 듀플렉스의 루프 길이를 고안하기 위한 적절한 범위는, 헤어 듀플렉스의 줄기 길이가 실질적이라면, 약 4-25 뉴클레오티드, 약 25-50 뉴클레오티드의 루프 길이를 포함한다. 특정 구현예에서, 이중-가닥 RNA 또는 ssRNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 40 뉴클레오티드이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 35 뉴클레오티드인 이중-가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드인 이중 가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 19 내지 약 25 뉴클레오티드인 이중 가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 길이가 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드인 이중 가닥 RNA 또는 ssRNA 분자이다. 특정 구현예에서, 21 뉴클레오티드보다 긴 듀플렉스된 영역을 갖는 머리핀 구조는 루프 서열 및 길이와 관련없이 효과적인 siRNA-지향 침묵을 촉진할 것이다.
표적 mRNA 서열은 통상적으로 길이가 약 14 내지 약 50 뉴클레오티드이다. 그러므로, 표적 mRNA는 바람직하기는 표적 서열에 대한 다음의 기준 중 하나 이상을 만족시킬 수 있는, 길이 약 14 내지 약 50 뉴클레오티드 사이의 영역에 대해 스캔될 수 있다: A+T/G+C의 비가 약 2:1 내지 약 1:2 표적 서열의 5' 말단에서 QAA 디뉴클레오티드 또는 CA 디뉴클레오티드; 표적 mRNA까지 적어도 10 연속 뉴클레오티드의 서열; 및 3개 이상의 연속 구아닌 (G) 뉴클레오티드 또는 3개 이상의 연속 시토신 (C) 뉴클레오티드의 "runs"이 없음. 이들 기준은 본 분야에 알려진 다양한 기술을 사용하여 평가될 수 있고, 예를 들면, BLAST와 같은 컴퓨터 프로그램이 선택된 표적 서열이 표적 mRNA에 고유한가를 찾는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 표적 서열은 시판되는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 선택 (및 siRNA 서열 고안)될 수 있다 (예를 들면, OligoEngine.TM. (Seattle, Wash.); Dharmacon, Inc. (Lafayette, Colo.); Ambion Inc.의 Target Finder (Austin, Tex.) 및 QIAGEN, Inc. (Valencia, Calif.)의 siRNA Design Tool).
한 구현예에서, 표적 mRNA 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 충족시키는 약 14 내지 약 30 뉴클레오티드 길이 사이로 선택된다. 또 다른 구현예에서, 표적 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 만족시키는 약 16 내지 약 30 뉴클레오티드 길이로 선택된다. 추가의 구현예에서, 표적 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 만족시키는 약 19 내지 약 30 뉴클레오티드 사이로 선택된다. 또 다른 구현예에서, 표적 서열은 상기 기준 중 하나 이상을 만족시키는 약 19 내지 약 25 뉴클레오티드 길이로 선택된다.
예시적인 구현예에서, siRNA 분자는 SEQ ID NOs:1-23에 기재된 바와 같은 서열 중 어느 하나의 적어도 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드에 상보적인 특이적 안티센스 서열을 포함한다.
siRNA 분자에 의해 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 서열의 보체와 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 한 구현예에서, siRNA 분자에 의해 포함되는 특이적 안티센스 서열은 표적 mRNA 서열의 보체와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 서열 상동성을 결정하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 미국 위스콘신 대학교 컴퓨터 그룹 (GCG) 소프트웨어의 또는 NCBI 웹사이트에 제공된 BLASTN 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 siRNA 분자의 특이적 안티센스 서열은 표적 mRNA의 서열로부터 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 뉴클레오티드에서의 차이에 의해 (예를 들면, 전이 또는 전환을 포함하여, 뉴클레오티드 치환에 의해) 다양성을 나타낼 수 있다. 이와 같은 뉴클레오티드 치환이 이중 가닥 RNA 분자의 안티센스 가닥에 존재할 때, 치환 뉴클레오티드가 함께 통상적으로 수소 결합된 염기쌍을 형성하는 센스 가닥의 상보적 서열은 상응하도록 치환되거나 또는 치환되지 않는다. 센스 서열에서는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환이 일어나지만, 안티센스 가닥에서는 일어나지 않는 이중-가닥 RNA 분자는 또한 고려된다. siRNA 분자의 안티센스 서열이 siRNA의 뉴클레오티드 서열과 표적 뉴클레오티드 서열 사이에 하나 이상의 불일치를 포함하는 경우, 불일치는 안티센스 서열의 3' 터미날, 5' 터미날 또는 중심부에서 발견될 것이다.
또 다른 구현예에서, siRNA 분자는 엄격한 조건하에서 자연발생하는 표적 유전자 또는 표적 mRNA의 일부에 선택적으로 혼성화할 수 있는 특이적 안티센스 서열을 포함한다. 적절한 엄격한 조건은, 예를 들면, 통상의 혼성화 과정에 따른 혼성화 및 1~3회의 세척 조건을 포함한다. 표준 소듐 시트레이트, 0.1~1% 소듐 도데실 설페이트, 약 5~30분 후 세척 용액의 교환에 의한 50~70℃를 포함한다. 본 분야의 당업자에게 알려진 바와 같이, 혼성화 조건의 엄격성의 변경은 시간, 또는 혼성화에 사용되는 용액의 온도 또는 농도 및 세척 단계의 변경에 의해 얻어질 수 있다. 적절한 조건은 또한 사용된 특정 뉴클레오티드 서열 중의 일부, 예를 들면, 표적 mRNA 또는 유전자의 서열이 사용된다.
듀플렉스 또는 이중가닥 구조를 갖는 RNAi 분자, 예를 들면, 이중가닥 RNA 또는 shRNA는 뭉툭한(blunt) 말단을 가질 수 있고, 또는 3' 또는 5' 돌출부(overhang)를 가질 수 있다. 본 발명에 사용되는 바에 따르면, "돌출부"는 하나의 RNA 가닥의 3'-터미날이 다른 가닥의 5'-터미날을 넘어 연장되거나 (3' 돌출부) 또는 그 반대(5' 돌출부)일 때 듀플렉스 구조로부터 돌출된 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드들을 말한다. 돌출부를 갖는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 그들의 변형된 버전일 수 있다. 한 구현예에서, RNAi 분자의 적어도 하나의 가닥은 길이가 약 1 내지 약 6 뉴클레오티드인 3' 돌출부를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 3' 돌출부는 길이가 약 1 내지 약 5 뉴클레오티드, 약 1 내지 약 3 뉴클레오티드 및 약 2 내지 약 4 뉴클레오티드이다.
RNAi 분자가 분자의 한 말단에 3' 돌출부를 포함하면, 다른 말단은 뭉툭한 말단일 수 있고 또는 역시 돌출부(5' 또는 3')를 가질 수 있다. RNAi 분자가 분자의 양쪽 말단에 돌출부를 포함하는 경우, 돌출부의 길이는 같거나 다를 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명에 기재된 RNAi 분자는 분자의 양쪽 말단에 약 1 내지 약 3 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 포함한다. 추가의 구현예에서, RNAi 분자는 분자의 양쪽 말단에 2 뉴클레오티드의 3' 돌출부를 갖는 이중가닥 RNA이다. 또 다른 구현예에서, RNAi의 돌출부를 갖는 뉴클레오티드는 TT 디뉴클레오티드 또는 UU 디뉴클레오티드이다.
표적 mRNA 서열에 대한 하나 이상의 돌출부를 포함하는 RNAi 분자의 상동성 비를 결정할 때, 돌출부(들)는 고려되거나 또는 고려되지 않을 수 있다. 예를 들면, 이중 가닥의 3' 돌출부로부터의 뉴클레오티드 및 5'- 또는 3'-터미날로부터 최대 2 뉴클레오티드는 siRNA 분자의 활성의 상당한 손실 없이 변형될 수 있다.
RNAi 분자는 하나 이상의 5' 또는 3'-캡 구조를 포함할 수 있다. RNAi 분자는 RNAi 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다의 3'-말단에; 또는 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다의 5'-말단에 캡 구조를 포함할 수 있다. 선택적으로, RNAi 분자는 RNAi 분자의 3'-말단과 5'-말단 둘 다에 캡 구조를 포함할 수 있다. 용어 "캡 구조"는 올리고뉴클레오티드의 어느 하나의 말단에 병합된 화학적 변경을 말하고 (예를 들면, U.S. Pat. No. 5,998,203 참조), 이것은 외인성 열화로부터 분자를 보호하고, 그리고 세포 내에서의 전달 또는 위치 결정을 용이하게 한다.
RNAi 분자에 적용할 수 있는 또 다른 변경은 RNAi 분자의 활성, 세포 분포, 세포 섭취, 생물학적 이용가능성 또는 안정성을 강화시키는 하나 이상의 모이어티 또는 컨쥬게이트의 RNAi 분자에 대한 화학적 연결이다. 폴리뉴클레오티드는 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해 합성 또는 변형될 수 있다. 화학적 변형은 2' 변형, 비자연적 염기의 도입, 리간드에 대한 공유적 부착, 및 인산염 연결의 티오인산염 연결로의 대체를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 이러한 구현예에서, 듀플렉스 구조의 온전성은 적어도 하나의, 그리고 통상적으로 두 개의 화학적 연결에 의해 강화된다. 화학적 연결은 잘 알려진 다양한 기술, 예를 들면, 공유, 이온, 또는 수소 결합; 소수성 상호작용, 반데르 발스 또는 스태킹(stacking) 상호작용 중 어느 것에 의해; 금속-이온 배위결합에 의해 또는 퓨린 유사체의 사용 중 어느 것에 의해 달성될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 두 단일 가닥 중 하나 또는 둘 다에서 뉴클레오티드는 예를 들면, 제한됨 없이, 특정 뉴클레아제와 같은 세포 효소의 활성을 예방 또는 억제하기 위해 변형될 수 있다. 2'-아미노 변형, 2'-플루오로 변형, 2'-알킬 변형, 하전되지 않은 백본 변형, 모폴리노 변형, 2'-O-메틸 변형 및 포스포라미데이트를 포함하여, 세포 효소의 활성을 억제하는 기술이 본 분야에 알려져 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 그러므로, 이중 가닥 RNA에서 뉴클레오티드 중 적어도 하나의 2'-히드록시기는 화학적 기에 의해 대체된다. 또한, 적어도 하나의 뉴클레오티드는 고정(locked) 뉴클레오티드를 형성하도록 변형될 수 있다. 이와 같은 고정 뉴클레오티드는 리보스의 2'-산소와 리보스의 4'-탄소를 연결하는 메틸렌 또는 에틸렌 다리를 함유한다. 고정뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드에 도입하는 것은 상보적 서열에 대한 친화성을 개선하고 녹는점을 몇 온도로 상승시킨다.
리간드는 RNAi 분자에, 예를 들면 그것의 세포 흡수를 강화시키기 위해 컨쥬게이트 된다. 특정 구현예에서, 소수성 리간드는 세포막의 직접 투과를 용이하게 하기 위해 분자에 컨쥬게이트된다. 이러한 접근은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 투과를 용이하게 하기 위해 사용되어 왔다. 특정 예에서, 양이온성 리간드의 올리고뉴클레오티드에 대한 컨쥬게이션은 뉴클레아제에 대한 내성을 증가시킨다. 양이온성 리간드의 대표적인 예는 프로필암모늄 및 디메틸프로필암모늄이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 양이온성 리간드가 올리고뉴클레오티드를 통해 분산될 때 mRNA에 대한 그들의 높은 결합 친화성을 유지한다.
본 발명에 기재된 분자 및 뉴클레오티드는 고체상 합성에 대한 잘 알려진 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 분야에 알려진 이와 같은 합성에 대한 다른 어느 수단도 부가적으로 또는 선택적으로 적용될 수 있다.
여러 가지 구현예가 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 51, 인트론 1 (SEQ ID NO:30), 인트론 2 (SEQ ID NO:31), 인트론 3 (SEQ ID NO:32), 인트론 4 (SEQ ID NO:33), 인트론 5 (SEQ ID NO:34), 인트론 6 (SEQ ID NO:35), 인트론 7 (SEQ ID NO:36), 인트론 8 (SEQ ID NO:37), 인트론 9 (SEQ ID NO:38), 인트론 10 (SEQ ID NO:39), 엑손 1 (SEQ ID NO:40), 엑손 2 (SEQ ID NO:41), 엑손 3 (SEQ ID NO:42), 엑손 4 (SEQ ID NO:43), 엑손 5 (SEQ ID NO:44), 엑손 6 (SEQ ID NO:45), 엑손 7 (SEQ ID NO:46), 엑손 8 (SEQ ID NO:47), 엑손 9 (SEQ ID NO:48), 엑손 10 (SEQ ID NO:49) 또는 엑손 11 (SEQ ID NO:50) 및 그것의 단편, 그리고 그들의 변이체 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP NAi 구축물을 포함하는 NtMRP 발현 벡터 (예를 들면, NtMRP3 발현 벡터)에 대해 제시된다. 본 발명에 기재된 바에 따르면, 특정 서열에 대한 참조는 또한 그것의 보체 또는 역보체를 포함한다.
여러가지 구현예들이 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:27, 인트론 1 (SEQ ID NO:3), 인트론 2 (SEQ ID NO:4), 인트론 3 (SEQ ID NO:5), 인트론 4 (SEQ ID NO:6), 인트론 5 (SEQ ID NO:7), 인트론 6 (SEQ ID NO:8), 인트론 7 (SEQ ID NO:9), 인트론 8 (SEQ ID NO:10), 인트론 9 (SEQ ID NO:11), 인트론 10 (SEQ ID NO:12), 엑손 1 (SEQ ID NO:13), 엑손 2 (SEQ ID NO:14), 엑손 3 (SEQ ID NO:15) 엑손 4 (SEQ ID NO:16), 엑손 5 (SEQ ID NO:17), 엑손 6 (SEQ ID NO:18) 엑손 7 (SEQ ID NO:19) 엑손 8 (SEQ ID NO:20), 엑손 9 (SEQ ID NO:21) 엑손 10 (SEQ ID NO:22), 엑손 11 (SEQ ID NO:53) 또는 SEQ ID NO. 23 및 그들의 단편, 및 그들의 변이체 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP RNAi 구축물을 포함하는 NtMRP 발현 벡터 (예를 들면, NtMRP4 발현 벡터)에 대해 제시된다. 본 발명에 기재된 바에 따르면, 특정 서열에 대한 참조는 또한 그들의 보체 또는 역보체를 포함한다.
다양한 구현예들이 하나 이상의 NtMRP 폴리뉴클레오티드(들) 또는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, 인트론 1 (SEQ ID NO:30), 인트론 2 (SEQ ID NO:31), 인트론 3 (SEQ ID NO:32), 인트론 4 (SEQ ID NO:33), 인트론 5 (SEQ ID NO:34), 인트론 6 (SEQ ID NO:35), 인트론 7 (SEQ ID NO:36), 인트론 8 (SEQ ID NO:37), 인트론 9 (SEQ ID NO:38), 인트론 10 (SEQ ID NO:39), 엑손 1 (SEQ ID NO:40), 엑손 2 (SEQ ID NO:41), 엑손 3 (SEQ ID NO:42) 엑손 4 (SEQ ID NO:43), 엑손 5 (SEQ ID NO:44), 엑손 6 (SEQ ID NO:45) 엑손 7 (SEQ ID NO:46) 엑손 8 (SEQ ID NO:47), 엑손 9 (SEQ ID NO:48), 엑손 10 (SEQ ID NO:49), 엑손 11 (SEQ ID NO:50) 또는 SEQ ID NO:51 및 그들의 단편, 및 그들의 변이체 또는 그들 중 두 개 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 서열 상동성을 갖는 NtMRP RNAi 구축물 (예를 들면, NtMRP3 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP RNAi 구축물) 중 하나 이상을 포함하는 발현 벡터에 대해 제시된다. 본 발명에 기재된 바에 따르면, 특정 서열에 대한 참조는 또한 그들의 보체 또는 역보체도 포함한다.
다양한 구현예들이 NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 인트론 1 (SEQ ID NO:3), 인트론 2 (SEQ ID NO:4), 인트론 3 (SEQ ID NO:5), 인트론 4 (SEQ ID NO:6), 인트론 5 (SEQ ID NO:7), 인트론 6 (SEQ ID NO:8), 인트론 7 (SEQ ID NO:9), 인트론 8 (SEQ ID NO:10), 인트론 9 (SEQ ID NO:11), 인트론 10 (SEQ ID NO:12), 엑손 1 (SEQ ID NO:13), 엑손 2 (SEQ ID NO:14), 엑손 3 (SEQ ID NO:15) 엑손 4 (SEQ ID NO:16), 엑손 5 (SEQ ID NO:17), 엑손 6 (SEQ ID NO:18) 엑손 7 (SEQ ID NO:19) 엑손 8 (SEQ ID NO:20), 엑손 9 (SEQ ID NO:21), 엑손 10 (SEQ ID NO:21), 엑손 11 (SEQ ID NO:22) 또는 SEQ ID NO. 23 및 그들의 단편, 및 그들의 변이체 또는 그들 중 두 가지 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 서열 상동성을 갖는 NtMRP RNAi 구축물 (예를 들면, NtMRP4 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP4 RNAi 구축물)을 포함하는 발현 벡터에 대해 제시한다.
다양한 구현예들이 NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 자가-어닐링으로 머리핀 구조를 형성할 수 있는 NtMRP RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRP RNAi 구축물 (예를 들면, NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRP RNAi 구축물)을 포함하는 발현 벡터에 대해 제시하고; 여기서 상기 구축물은 (a) SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, 인트론 1 (SEQ ID NO:30), 인트론 2 (SEQ ID NO:31), 인트론 3 (SEQ ID NO:32), 인트론 4 (SEQ ID NO:33), 인트론 5 (SEQ ID NO:34), 인트론 6 (SEQ ID NO:35), 인트론 7 (SEQ ID NO:36), 인트론 8 (SEQ ID NO:37), 인트론 9 (SEQ ID NO:38), 인트론 10 (SEQ ID NO:39), 엑손 1 (SEQ ID NO:40), 엑손 2 (SEQ ID NO:41), 엑손 3 (SEQ ID NO:42) 엑손 4 (SEQ ID NO:43), 엑손 5 (SEQ ID NO:44), 엑손 6 (SEQ ID NO:45) 엑손 7 (SEQ ID NO:46), 엑손 8 (SEQ ID NO:47), 엑손 9 (SEQ ID NO:48), 엑손 10 (SEQ ID NO:49), 엑손 11 (SEQ ID NO:50) 또는 SEQ ID NO:51 및 그것의 단편, 및 그것의 변이체 또는 그들 중 두 가지 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 서열 상동성을 갖는 제1 서열; (b) 머리핀 구조의 루프를 형성하는 것의 스페이서 요소를 암호화하는 제2 서열; 및 (c) 제1 서열과 동일한 배열로 위치하는, 제1 서열의 역 상보적 서열을 포함하는 제3 서열을 포함하고, 여기서 제2 서열은 제1 서열과 제3 서열 사이에 위치하고, 제2 서열은 제1 서열과 제3 서열에 기능적으로 연결된다. 상기와 같이, 특이적 서열에 대한 참조는 또한 그들의 보체 및 역 보체를 포함한다.
다양한 구현예가 자가-어닐링을 하여 머리핀 구조를 형성할 수 있는 NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRP RNAi 구축물 (예를 들면, NtMRP4 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRPP4 RNAi 구축물)을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이고, 여기서 상기 구축물은 (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 인트론 1 (SEQ ID NO:3), 인트론 2 (SEQ ID NO:4), 인트론 3 (SEQ ID NO:5), 인트론 4 (SEQ ID NO:6), 인트론 5 (SEQ ID NO:7), 인트론 6 (SEQ ID NO:8), 인트론 7 (SEQ ID NO:9), 인트론 8 (SEQ ID NO:10), 인트론 9 (SEQ ID NO:11), 인트론 10 (SEQ ID NO:12), 엑손 1 (SEQ ID NO:13), 엑손 2 (SEQ ID NO:14), 엑손 3 (SEQ ID NO:15) 엑손 4 (SEQ ID NO:16), 엑손 5 (SEQ ID NO:17), 엑손 6 (SEQ ID NO:18) 엑손 7 (SEQ ID NO:19) 엑손 8 (SEQ ID NO:20), 엑손 9 (SEQ ID NO:21) 엑손 10 (SEQ ID NO:22), 엑손 11 (SEQ ID NO:53), SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO: 51 및 그들의 단편, 및 그들의 변이체 또는 그들 중 2 가지 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 서열 상동성을 갖는 제1 서열; (b) 머리핀 구조의 루프를 형성하는 것의 스페이서 요소를 암호화하는 제2 서열; 및 (c) 제1 서열과 동일한 배열로 위치한, 제1 서열의 역 상보서열을 포함하는 제2 서열, 여기서 상기 제2 서열은 제1 서열과 제3 서열 사이에 위치하고, 제2 서열은 제1 서열 및 제3 서열에 기능적으로 연결된다. 상기와 같이, 특정 구현예에 대한 참조는 그들의 보체 또는 역 보체를 포함한다.
기재된 서열은 머리핀 구조를 형성하지 않는 다양한 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 구축하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, NtMRP 이중가닥 RNA는 (1)NtMRP cDNA의 제1 가닥을 제1 프로모터에 기능적으로 연결함에 의한 전사, 및 (2) NtMRP cDNA 단편의 제1 가닥의 역 상보적 서열을 제2 프로모터에 기능적으로 연결함에 의해 전사하는 것을 포함한다. NtMRP 폴리뉴클레오티드의 각각의 가닥은 동일한 발현 벡터로부터 또는 다른 발현 벡터로부터 전사될 수 있다. RNA 간섭 활성을 갖는 NtMRP RNA 듀플렉스는 NtMRP RNA 수준을 감소시키기 위해 siRNA로 효소적으로 전환될 수 있다.
다양한 구현예가 자가-어닝링을 할 수 있는 NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRP RNAi 구조 (예를 들면, NtMRP3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 NtMRP3 발현 벡터 또는 NtMRP3 RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRP3 RNAi 구축물)을 포함하는 NtMRP 발현 벡터에 관한 것이고, 여기서 상기 구축물은 (a) SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50 및 SEQ ID NO:51, 및 그것의 단편, 및 그들의 변이체 또는 그들 중 두개 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상동성을 갖는 제1 서열; 및 제1 서열과 동일한 배열로 위치하는, 제1 서열의 상보성(예를 들면 역 상보성) 서열을 포함하는 제2 서열을 포함한다. 본 발명에 기재된 바와 같이, 특이적 서열에 대한 참조는 또한 그것의 보체 또는 역 보체를 포함한다.
또 다른 구현예는 자가-어닐링이 가능한, NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 NtMRP RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRP RNAi 구축물(예를 들면, NtMRP4 폴리뉴클레오티드 또는 NMRP4 RNAi 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 NtMRP4 RNAi 구축물)을 포함하는 NtMRP 발현 벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 구축물은, (a) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:53 및 그것의 단편, 그것의 변이체, 또는 그들 중 두 개 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 상동성을 갖는 제1 서열; 및 (b) 상기 제1 서열과 동일한 배열로 위치된, 제1 서열의 상보성 (예를 들면 역상보성) 서열을 포함하는 제2 서열을 포함한다. 여기에 기재된 바에 따르면, 특이적 서열에 대한 참조는 또한 그들의 보체 또는 역 보체를 포함한다.
다양한 조성물 및 방법이 NtMRP 유전자 발현의 공동-억제를 촉진하기 위해 NtMRP 유전자 패밀리의 맴버들에 대한 내인성 발현 수준을 조절 (예를 들면, 감소)하기 위해 제공된다. 공동-억제 현상은 이식유전자의 다중 사본들을 식물 세포 숙주에 도입한 결과 발생한다. 이식유전자의 다중 사본의 통합은 이식 유전자 및 표적 내인성 유전자의 감소된 발현을 가져올 수 있다. 공동-억제의 정도는 이식 유전자와 표적된 내인성 유전자 사이의 서열 상동성 정도에 의존한다. 내인성 유전자와 이식유전자 둘 다의 침묵은 전사를 막을 수 있는 침묵 유전자자리 (즉, 관심의 내인성 프로모터 및 내인성 유전자)의 광범위한 메틸화에 의해 일어날 수 있다. 선택적으로, 몇몇 경우, 내인성 유전자와 이식유전자의 공동-억제는 전사체가 생산되지만, 전사체의 축적을 방해하는 열화 정도가 강화된 후 전사적 유전자 침묵 ("P TGS")에 의해 일어날 수 있다. PTGS에 의한 공동-억제의 메카니즘은 RNA 간섭과 닮았다고 생각된다, 즉 RNA는 이 공정에서 중요한 개시제이며 표적인 것으로 보이고, 적어도 부분적으로, 아마도 mRNA의 RNA-안내 열화를 통해, 동일한 분자 조직에 의해 제어될 수 있다.
NtMRP 폴리뉴클레오티드의 공동-억제는, 이식유전자로서, NtMRP cDNA 또는 그것의 단편의 다중 사본들의 관심의 식물의 게놈으로의 통합에 의해 달성될 수 있다. 숙주 식물은 NtMRP cDNA 또는 그것의 단편에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현벡터로 변형될 수 있다. 다양한 구현예는: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO: 51으로 동정된 NtMRP (예를 들면, NtMRP cDNA) 또는 SEQ ID NOs 3 내지 23 또는 30 내지 50 중 어느 것과 같은, 그것의 단편에 기능적으로 연결된 프로모터 또는 그것과 적어도 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 그것의 변이체를 포함하는 NtMRP의 내인성 유전자의 공동-억제를 촉진하는 발현 벡터에 관한 것이다.
다양한 구현예가 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO. 29 또는 SEQ ID NO: 51으로 동정된 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 다중 사본 (예를 들면, NtMRP cDNA) 또는 SEQ ID NOs 3 내지 23 또는 30 내지 50 또는 53 중 어느 것과 같은 그것의 단편, 또는 그것과 적어도 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 변이체를 식물 게놈에 병합시킴에 의해 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 조절(예를 들면, 감소 또는 억제)하는 방법에 대해 제공되고, 상기 방법은: 식물 세포 숙주를 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID No. 28 또는 SEQ ID No. 29 또는 SEQ ID NO: 51 또는 (SEQ ID NOs 3 내지 23 또는 30 내지 50 중 어느 것과 같은) 그것의 단편 또는 그것과 적어도 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 변이체로 전환시키는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
다양한 조성물과 방법이 NtMRP mRNA의 번역을 억제함에 의해 NtMRP의 내인성 유전자 발현 수준을 감소시키는 것에 대해 제공된다. 숙주 식물 세포는: NtMRP mRNA의 일부에 상보적 서열을 갖는 RNA폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하도록 프로모터에 대해 안티센스 배열로 위치된, NtMRP 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 변이체 또는 그것의 단편에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 변형될 수 있다.
NtMRP m RNA의 번역을 억제하기 위한 다양한 발현 벡터는 다음을 포함할 수 있다: SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29 또는 SEQ ID NO:51로 동정된 NtMRP (예를 들면, NtMRP cDNA) 또는 SEQ ID NOs 3 내지 23 또는 30 내지 50 또는 51 중 어느 하나와 같은 그것이 단편, 또는 그것과 적어도 약 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 상동성을 갖는 변이체에 기능적으로 연결된 프모머터로 여기서 서열은 프로모터에 대해 안티센스 배열로 위치한다. 안티센스 NtRMP RNA 폴리뉴클레오티드의 길이는 다를 수 있고, 약 15-20 뉴클레오티드, 약 20-30 폴리뉴클레오티드, 약 30-50 뉴클레오티드, 약 50-75 뉴클레오티드, 약 75-100 뉴클레오티드, 약 100-150 뉴클레오티드, 약 150-200 뉴클레오티드, 및 약 200-300 뉴클레오티드일 수 있다.
돌연변이 NtMRP 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드를 얻는 방법이 또한 제공된다. 식물 세포 또는 식물 재료를 포함하여, 어느 관심의 식물이 부위-지향 돌연변이, 올리고뉴클레오티드-지향 돌연변이, 화학적-유도 돌연변이, 방사선-유도 돌연변이, 변형된 염기를 사용한 돌연변이, 틈이 많은(gapped) 듀플렉스 DNA를 사용한 돌연변이, 이중가닥 분열 돌연변이, 수리-결핍 숙주 균주를 이용한 돌연변이, 총 유전자 합성에 의한 돌연변이, DNA 이동 및 기타 동등한 방법을 포함하여, 돌연변이를 유도하는 여러 공지의 방법에 의해 유전적으로 변형될 수 있다.
선택적으로, NtMRP 유전자가 관심의 식물의 게놈으로 트랜스포존(transposons) (예를 들면, IS 요소)를 도입함에 의해 불활성화를 위해 표적될 수 있다. 이들 이동성 유전 요소들은 생식 타가수정 (sexual cross-fertilization)에 의해 도입될 수 있고 삽입 돌연변이는, 감소된 카드윰 수송과 같이, NtMRP 단백질 활성에서의 손실에 대해 스크린될 수 있다. 부모 식물에서 분쇄된 NtMRP 유전자는 부모 식물을 예를 들면, 생식 타가수정에 의해 트랜스포존-유도 돌연변이를 겪지 않은 식물과 교차함에 의해 다른 식물에 도입될 수 있다. 본 분야의 당업자에게 알려진 어느 표준 육종술을 사용할 수 있다. 한 구현예에서, 하나 이상의 NtMRP-연관 유전자가 하나 이상의 트랜스포존의 삽입에 의해 불활성화될 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 NtMRP 유전자의 동형 분열, 하나 이상의 NtMRP 유전자의 이형 분열, 또는 하나 이상의 NtMRP가 분열된다면 동형 및 이형분열 둘 다의 조합을 가져올 수 있다. 적절한 수송가능 요소들은 I 류 및 II 류로 분류된 2 가지 광의의 류로부터 선택될 수 있다. 적절한 I 류 수송가능 요소들은 레트로트랜스포존 (RNA유래 전이인자; retrotransposons), 레트로포존(retroposons), 및 SINE-형 요소를 포함한다. 이와 같은 방법은 본 분야의 당업자에게 알려져 있다.
선택적으로, NtMRP 유전자는 자가-분열 및 복제할 수 있는 다수의 작은 환형 RNA로부터 유래된 리보자임을 식물에 도입함에 의해 불활성화에 대해 표적될 수 있다. 이들 RNA는 단독으로 (비로이드) 또는 헬퍼 바이러스 (위성 RNA)로 복제될 수 있다. 적절한 RNA의 예는 아보카도 선블라치 비로이드(avocado sunblotch viroid)로부터 유래된 것과 토마토 둥근무늬 바이러스, 루체른 일시적 줄무늬 바이러스(lucerne transient streak virus), 벨벳 담배 모틀 바이러스(velvet tobacco mottle virus), 솔라늄 노디플로룸 모틀 바이러스 (solanum nodiflorum mottle virus) 및 서브태래이니언 클로버 모틀 바이러스(subterranean clover mottle virus)로부터 유래된 위성 RNA를 포함한다. 다양한 표적 RNA-특이 리보자임이 본 분야의 당업자에게 알려져 있다.
몇몇 구현예에서, NtMRP 폴리펩티드의 발현은 NtMRP3 및/또는 NtMRP4 유전자를 포함하여, NtMRP 유전자에서 돌연변이의 생성과 간은, 비-유전자 도입 수단에 의해 조절되고, 감소되고 또는 억제된다. 돌연변이를 무작위로 유전자 서열에 도입하는 방법은 화학적 돌연변이, EMA 돌연변이 및 방사선 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 표적화된 돌연변이를 세포에 도입하는 방법은 게놈 편집술, 특히 아연 손가락 뉴클레아제-매개 돌연변이, 경운(게놈에서 국소적 병변을 유래하는 약물 표적화), 동형 재조합, 올리고뉴클레오티드-지향 돌연변이, 및 메가뉴클레아제-매개 돌연변이를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
돌연변이의 몇몇 예는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 및 미스센스 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 동질이상(SNP), 단순 서열 반복이다. 돌연변이 후, 스크리닝이 수행되어 미성숙 정지 코돈을 생성한 결실 또는 기타 비-기능적 NtMRP 유전자를 동정할 수 있다. 돌연변이의 스크리닝은 서열화에 의해, 또는 NtMRP 유전자 또는 단백질에 특이적인 하나 이상의 프로브 또는 프라이머의 사용에 의해 수행될 수 있다. NtMRP 폴리뉴클레오티드에서 특이적 돌연변이가 또한 생성될 수 있고 감소된 MtMRP 유전자 발현, NtMRP mRNA의 감소된 안정성, 또는 NtMRP 단백질의 감소된 안정성을 가져올 수 있다. 이와 같은 식물은 "비자연 발생" 식물 또는 돌연변이 식물이라 부른다.
비자연발생 그리고 돌연변이 식물은 감소된 NtMRP 폴리펩티드 수준을 가져오는 하나 이상의 돌연변이의 어느 조합을 가질 수 있다. 예를 들면, 식물은 단일 NtMRP 유전자에서 단일 돌연변이를 가지거나 또는 단일 NtMRP에서 다중 돌연변이를 가질 수 있다. 따라서, NtMRP, NtMRP3 및 NtMRP4의 돌연변이 폴리펩티드 변이체를 포함하는 돌연변이 또는 비자연발생 식물 (예를 들면, 돌연변이 또는 비자연발생 또는 유전자이식 토마토 식물 등)이 기재된다.
한 구현예에서, 식물의 종자가 돌연변이되고 그리고 나서 1세대 돌연변이 식물로 성장한다. 1세대 식물은 그리고 나서 자가수분되고 1세대 식물의 종자는 2세대 식물로 성장하고, 이것은 그들의 NtMRP 유전자자리에서 돌연변이에 대해 스크리닝된다. 돌연변이된 식물 재료가 돌연변이에 대해 스크리닝될 수 있지만, 2세대 식물을 스크리닝하는 이점은 모든 체세포 돌연변이가 생식세포 돌연변이에 상응한다는 것이다. 본 분야의 당업자는, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 종자, 꽃가루, 식물 조직 또는 식물 세포를 포함하는 다양한 식물 재료가 NtMRP-돌연변이 식물을 생성하기 위해 돌연변이될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 돌연변이된 식물 재료의 유형은 식물 폴리펩티드가 돌연변이에 대해 스크리닝될 때 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 꽃가루가 비-돌연변이된 식물의 수분에 앞서 돌연변이된 경우, 그 수분에 의한 종자는 1세대 식물로 성장한다. 1세대 식물의 모든 세포는 수분에 돌연변이를 함유할 것이고; 그러므로 이들 1세대 식물은 2세대까지 기다리는 대신 NtMRP에 대해 스크리닝될 수 있다.
일차 지점 돌연변이와 짧은 결실, 삽입, 전환 및/또는 전이를 생성하는, 화학적 돌연변이 또는 방사선을 포함하는 돌연변이 유발요인이 돌연변이를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 돌연변이 유발요인은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 에틸 메탄술포네이트 (EMS), 메틸메탄 술포네이트 (MMS), N-에틸-N-니트로스우레아 (ENU), 트리에틸멜라닌 (TEM), N-메틸-N-니트로소우레아 (MNU), 프로카르바진, 클로람부실, 시클로포스파미드, 디에틸 설페이트, 아크릴아미드 모노머, 넬팔란, 니트로겐 머스타드, 빈크리스틴, 디메틸니트로스아민, N-메틸-N'-니트로-니트로소구아니딘(MNNG), 니트로소구아니딘, 2-아미노퓨린, 7,12-디메틸-벤즈(a)안트라센 (DMBA), 에틸렌 옥사이드, 렉사메틸포스포라미드, 바이설판, 디에폭시알칼 (디에폭시옥탄 (DEO), 디에폭시부탄 (BEB) 등), 2-메톡시-6-클로로-9[3-(에틸-2-클로로-에틸)아미노프로필아미노]아크리딘 디하이드로클로라이드 (ICR-170), 및 포름알데히드를 포함한다. 돌연변이 유발원인에 의해 직접적으로 원인인 된 것이 아닌 NtMRP 유전자 자리에서의 자발적 돌연변이가 또한 이들이 본 발명에 기재된 원하는 표현형을 가져온다면 역시 고려될 것이다. 적절한 돌연변이성 약제는, 예를 들면, X-선, 감마선, 고속 중성자 조사 및 UV 방사선과 같은 이온화 방사선을 포함한다.
본 분야의 당업자에게 알려진 식물 폴리뉴클레오티드 제조의 어느 방법이 NtMRP 돌연변이 스크리닝을 위한 식물 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 사용될 수 있다.
개개의 식물로부터 제조된 폴리뉴클레오티드는 돌연변이된 식물 조직으로부터 기원하는 식물의 전체 개체의 NtMRP 유전자에서 돌연변이에 대한 신속한 스크리닝을 위해 임의로 공유된다(pooled). 식물, 식물 세포 또는 식물 재료의 하나 이상의 순차적 세대가 스크리닝될 수 있다. 임의로 공유된 그룹의 크기는 사용된 스크리닝 방법의 민감도에 따른다.
폴리뉴클레오티드 샘플을 임의로 공유한 후, 이들은 폴리머라제 사슬 반응(PCR)과 같은, NtMRP 폴리뉴클레오티드-특이 증폭기술로 처리될 수 있다. NtMRP 유전자에 특이적인 하나 이상의 프라이머 또는 프로브 또는 NtMRP 유전자에 바로 인접한 서열이 공유된 폴리뉴클레오티드 샘플 내에서 NtMRP 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. 바람직하기는, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브가 유용한 돌연변이가 가장 잘 일어날 것 같은 NtMRP 유전자 자리의 영역을 증폭하도록 고안된다. 가장 바람직하기는, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브가 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 엑손 영역 내의 돌연변이를 검출하도록 고안된다. 이에 더하여, 지점 돌연변이에 대한 용이한 스크리닝을 위해 하나 이상의 프라이머 또는 프로브가 알려진 다형 부위를 피하는 것이 바람직하다. 증폭산물의 검출이 용이하도록, 하나 이상의 프라이머 또는 프로브가 어느 통상의 표식법을 사용하여 표식화될 수 있다. 하나 이상의 프라이머 또는 프로브는 본 분야에 잘 알려진 방법들을 사용하여 본 명세서에 기재된 NtMRP 서열을 기준으로 고안될 수 있다.
추가의 면에서 돌연변이 식물을 제조하는 방법이 제공된다. 방법은 기능적 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물의 적어도 하나의 세포를 제공하는 것을 포함한다. 그 다음, 식물의 적어도 하나의 세포는 NtMRP 유전자의 활성을 조절하는데 효과적인 조건하에서 처리된다. 그리고 나서 적어도 하나의 돌연변이 식물 세포가 돌연변이 식물로 증식되고, 여기서 돌연변이 식물은 대조 식물의 NtMPR 폴립펩티드와 비교하여 조절된 수준을 갖는다. 돌연변이 식물의 제조 방법의 한 예에서, 처리 단계는 적어도 하나의 세포를 상기와 같은 화학적 돌연변이 유도제로 그리고 적어도 하나의 돌연변이 식물 세포가 생성되기에 효과적인 조건하에서 처리하는 것을 포함한다. 이 방법의 또 다른 구현예에서, 처리 단계는 적어도 하나의 세포를 적어도 하나의 돌연변이 식물 세포를 생성하기에 효과적인 조건 하에서 방사선 원에 노출하는 것을 포함한다. 용어 "돌연변이 식물"은 유전형이 대조 식물과 비교하여, 적절히는 유전공학 또는 유전자 조작 이외의 다른 수단에 의해 변화된 돌연변이 식물을 포함한다.
특정 구현예에서, 돌연변이 식물, 돌연변이 식물 세포 또는 돌연변이 식물 재료는 또 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 재료에서 자연발생되었고 그리고 원하는 특성을 수여하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들 돌연변이는 또 다른 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 (예를 들면, 돌연변이가 유래되는 식물과 다른 유전적 배경을 갖는 식물, 식물 세포 또는 식물 재료)에 병합되어 거기에 상기 특성을 수여할 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 제1 식물에서 자연발생 돌연변이는, 제1 식물과 다른 유전적 배경을 갖는 제2 식물과 같은, 제2 식물에 도입될 수 있다. 그러므로 당업자는 원하는 특성을 수여하는 NtMRP 유전자의 하나 이상의 돌연변이 대립형질을 그것의 게놈에서 자연발생 식물을 찾거나 동정할 수 있다. 자연발생 돌연변이 대립형질은 육종, 여교배 및 유전자 이입을 포함한 다양한 방법에 의해 제2 식물에 수송되어 NtMRP 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 세포주, 변종 또는 혼성물을 생산할 수 있다. 원하는 특성을 나타내는 식물들은 돌연변이 식물의 공유에서 벗어나 스크리닝될 수 있다. 적절히는, 선택은 본 발명에 기재된 NtMRP 뉴클레오티드 서열에 대한 지식을 사용하여 수행된다. 결론적으로, 대조와 비교하여 카드뮴의 조절된 (예를 들면 감소된) 수준을 시사하는 유전적 특성에 대해 스크리닝하는 것이 가능하다. 이와 같은 스크리닝 접근법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 통상의 폴리뉴클레오티드 증폭 및/또는 혼성화 기술의 적용을 포함할 수 있다. 그러므로, 추가의 면은 돌연변이 식물을 동정하는 방법에 관한 것으로 상기 방법은: (a) 식물로부터 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물을 제공하는 단계; 및 (b) NtMRP 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 대조 식물의 NtMRP 폴리뉴클레오티드와 비교한 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 서열에서의 차이는 상기 식물이 NtMRP 돌연변이 식물이라는 것을 나타낸다. 또 다른 면에서 대조 식물과 비교하여 카드뮴의 조절된(예를 들면, 감소된) 수준이 축적된 돌연변이 식물을 동정하는 방법에 제공되고, 상기 방법은: (a) 스크리닝될 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 NtMRP 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는가를 결정하는 단계; 및 (c) 적어도 상기 식물의 일부에서 카드뮴 함량을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 샘플이 대조 식물과 비교하여 암호화된 단백질의 발현 또는 활성을 조절 (예를 들면, 감소)하는 NtMRP 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하고 그리고 식물의 적어도 일부가 NtMRP의 발현 또는 활성이 조절 (예를 들면, 감소)되지 않은 대조 식물과 비교하여 조절된 (예를 들면, 감소) 카드뮴 함량을 갖는다면, 조절된 (예를 들면 감소) 카드뮴 수준을 축적하는 자연발생 돌연변이 식물을 나타낸다. 또 다른 면에서 대조 식물과 비교하여 조절된 (예를 들면 감소) 카드뮴 수준을 축적하는 돌연변이 식물을 제조하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은: (a) 제1 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 NtMRP 폴리뉴클레오티드에서 그 안의 카드뮴의 조절된 (예를 들면, 감소) 수준을 가져오는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는가를 결정하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 돌연변이를 제2 식물에 수송하는 단계를 포함한다. 돌연변이(들)는 유전공학, 유전자 조작, 유전자 이입, 식물 육종, 역교배 등과 같은 본 분야에 알려져 있는 다양한 방법을 사용하여 제2 식물에 수송될 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 식물은 자연발생 식물이다. 한 구현예에서, 제2 식물은 제1 식물과 다른 유전적 배경을 갖는다. 또 다른 면에서, 대조 식물과 비교하여 조절된 (예를 들면, 감소) 카드뮴 수준을 축적하는 돌연변이 식물의 제조방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은: (a) 제1 식물로부터 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플이 그 안에 조절된 (예를 들면, 감소된) 카드뮴 수준을 가져오는 NtMRP 폴리뉴클레오티드에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는가를 결정하는 단계; 및 (c) 제1 식물로부터 하나 이상의 돌연변이를 제2 식물로 유전자 이입하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 유전자 이입 단계는, 임의로 역교배 등을 포함하는, 식물 육종을 포함한다. 한 구현예에서, 제1 식물은 자연발생 식물이다. 한 구현예에서, 제2 식물은 제1 식물과 다른 유전적 배경을 갖는다. 한 구현예에서, 제1 식물은 품종 (엘리트 품종)이 아니다. 한 구현예에서 제2 식물은 품종 또는 엘리트 품종이 아니다. 추가의 면은 본 발명의 방법으로 얻은 또는 얻을 수 있는 돌연변이 식물 (품종 또는 엘리트 품종 돌연변이 식물)에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 돌연변이 식물은 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 서열 내와 같은, 식물의 특정 영역에 대해서만 국소화되는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 본 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 나머지 유전적 서열은 돌연변이 전의 식물과 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 것이다.
특정 구현예에서, 돌연변이 식물은, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 서열 내와 같은, 식물의 하나 이상의 영역에 그리고 게놈의 하나 이상의 추가 영역에 국소화된 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 본 구현예에 따르면, 돌연변이 식물의 나머지 게놈 서열은 돌연변이 전의 식물과 같지 않거나 또는 실질적으로 같지 않을 것이다. 특정 구현예에서, 돌연변이 식물은 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상 또는 다섯 이상의 엑손 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않을 수 있고; 또는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상, 다섯 이상의 인트론에 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않을 수 있고; 또는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 프로모터에 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않을 수 있고; 또는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 3' 비번역 영역에 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않을 수 있고; 또는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 5' 비번역 영역에 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않을 수 있고; 또는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 코드 영역에 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않을 수 있고; 또는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 비-코드 영역에 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않을 수 있고; 또는 그것이 두 개 이상, 셋 이상, 넷 이상, 다섯 이상, 또는 여섯 이상의 조합일 수 있다.
추가의 면에서, NtMRP를 암호화하는 유전자에 돌연변이를 포함하는 식물, 식물 세포 또는 식물 재료를 동정하는 방법이 제공되고, 상기 방법은: (a) 식물, 식물 세포 또는 식물 재료를 돌연변이시키는 단계; (b) 상기 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 그들의 자손으로부터 폴리뉴클레오티드 샘플을 얻는 단계; 및 (c) NtMRP를 암호화하는 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그들의 변이체 또는 단편을 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 서열에서의 차이는 그 안에 하나 이상의 돌연변이의 표시이다.
아연 손가락 단백질이 NtMRP의 발현 또는 활성을 조절 (예를 들면, 감소 또는 억제)하는데 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 게놈성 폴리뉴클레오티드 서열이 아연 손가락 뉴클레아제-매개 돌연변이에 의해 변형된다. 게놈성 폴리뉴클레오티드 서열을 아연 손가락 단백질 결합을 위한 유일한 부위에 대해 연구된다. 선택적으로, 게놈성 폴리뉴클레오티드 서열은 아연 손가락 단백질 결합을 위한 두 개의 유일한 부위로서 연구되고, 여기서 두 부위는 반대 가닥에 있고 서로 밀접하고, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 염기쌍 분리되어 있다. 따라서, NtMRP 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 손가락 단백질이 제공된다. 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브는 DNA 이중 나선으로 알파-나선(α-나선)이 삽입된 베타-베타-알파 구조로 접힌 대략 30 아미노산으로 구성된다. "알파-나선"은 제1 아미노산에 비해 -4 위치에서 아미노산의 각 N-H 기의 수소가 아미노산의 C=O 기에 결합하는 오른손 코일 또는 왼손 코일인 단백질의 2차 구조인 모티브를 말한다. 본 명세서에 사용되는 "베타-배럴" (β-barrel)은 제1 가닥이 제2 가닥에 수소결합하여 근접된 구조를 형성하는 두 개의 베타-가닥(β 가닥)을 포함하는 단백질의 2차 구조의 모티브를 말한다. 본 명세서에서 사용된 바에 따르면, "베타-베타-알파 구조"는 두 개의 역병렬 β-가닥과 하나의 α-나선을 포함하는 β-배럴로 이루어진 단백질의 구조를 말한다. 용어 "아연 손가락 DNA-결합 도메인"은 아연 이온을 포함하고 특이 3개의 염기쌍 DNA 서열에 결합할 수 있는 단백질 도메인을 말한다. 용어 "비자연발생 아연 손가락 DNA-결합 도메인"은 변형될 NDA를 포함하는 세포 또는 기관에서 발생하지 않는 아연 손가락 DNA-결합 도메인을 말한다.
표적 DNA내의 3개의 염기쌍 서열과 결합하는 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브 내의 키 아미노산은 알파-나선의 시작에 대해 아미노산 -1, +1, +2, +3, +4, +5 및 +6이다. 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브의 α-나선의 시작에 대해 위치 -1, +1, +2, +3, +4, +5 및 +6에서의 아미노산은, 다른 3 염기쌍 서열을 결합하는 새로운 DNA-결합 도메인 또는 모티브를 발생하기 위해 베타-배럴(β-배럴) 백본을 유지하는 동안, 변형될 수 있다. 이와 같은 새로운 DNA-결합 도메인은 비자연발생 아연 손가락 DNA-결합 도메인일 수 있다. α-나선의 개시에 대해 위치 -1, +1, +2, +3, +4, +5 및 +6에서 아미노산에 의해 3 염기쌍 서열 인식에 더하여, 이들 아미노산의 몇몇은 또한 3 염기쌍 서열 인식 부위 외부의 염기쌍과 상호작용할 수 있다. 2개, 3개, 4개 5개, 6개 또는 그 이상의 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브를 결합시킴에 의해 아연 손가락 단백질은 더 긴 DNA 서열에 특이적으로 결합하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 두 개의 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브를 포함하는 아연 손가락 단백질은 특정 6 염기쌍 서열을 인식할 수 있고 4개의 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브를 포함하는 아연 손가락 단백질은 특정 12 염기쌍 서열을 인식할 수 있다. 아연 손가락 단백질은 천연 또는 야생형 아연 손가락 단백질로부터 절단 또는 연장 또는, 파아지 디스플레이 선택, 세균성 2-혼성 선택 또는 세균성 1-혼성 선택과 같은, 그러나 이것으로 제한되는 것은 아닌, 선택법과 결합된 부위-지향 돌연변이 과정에 의해 천연 또는 야생형 아연 손가락 단백질로부터 유래된 두 개 이상의 천연 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브 또는 두 개 이상의 비-천연 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브 또는 천연 및 비-천연 아연 손가락 DNA 결합 도메인의 어느 조합을 포함할 수 있다. 본 문맥에서 사용된 바에 따르면, "절단(truncation)"은 천연 아연 손가락 단백질에서 발견되는 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브의 전체 수보다 적게 함유하는 아연 손가락 단백질을 말한다. 본 문맥에서 사용되는 바에 따르면, "연장"은 천연 아연 손가락 단백질에서 발견되는 아연 손가락 DNA-결합 도메인 또는 모티브의 전체 수보다 더 함유하는 아연 손가락 단백질을 말한다. 아연 손가락 단백질 결합을 위한 게놈 서열 내에서 폴리뉴클레오티드를 선택하는 기술은 본 분야에 알려져 있다.
표적 유전자에 독특한 특이 뉴클레오티드 서열에 결합하는 아연 손가락 단백질 도메인의 고안을 위한 방법이 알려져 있다. 18 뉴클레오티드를 포함하는 서열이 더 고등 생물의 게놈에서 독특한 위치를 구체화하는데 충분하다는 것이 산출되었다. 그러므로, 통상적으로 아연 손가락 단백질 도메인은 6 아연 손가락을 함유하고, 각각은 특정 삼중(triplet)과 상호작용을 위한 그들 특이적으로 고안된 알파 나선을 갖는다. 그러나, 몇몇 경우, 더 짧거나 더 긴 뉴클레오티드 표적 서열이 바람직하다. 그러므로, 단백질에서의 아연 손가락 도메인은 2 내지 12 손가락, 3 내지 8 손가락, 5 내지 7 손가락 또는 6 손가락을 함유할 수 있다.
사용을 위한 아연 손가락 단백질은 링커, 바람직하기는 가요성 링커를 통해 적어도 제2 DNA 결합 도메인, 임의로 제2 아연 손가락 폴리펩티드에 링크된 적어도 하나의 아연 손가락 폴리펩티드를 포함한다. 아연 손가락 단백질은 2 개 이상의 DNA-결합 도메인, 뿐만 아니라 하나 이상의 조절 도메인을 함유할 수 있다. 아연 손가락 폴리펩티드는 선택 유전자에서 선택된 표적 부위를 인식하도록 조작될 수 있다.
한 구현예에서, 아연 손가락 단백질은 자연발생 아연 손가락 단백질로부터 유래된 골격 (또는 백본)을 포함한다. 어느 자연발생 아연 손가락 단백질로부터 유래된 골격 (또는 백본)이 사용될 수 있다. 예를 들면, C2H2 모티브를 포함하는 아연 손가락 단백질로부터 유래된 골격 (또는 백본)을 포함하는 아연 손가락 단백질이 사용될 수 있다.
또 다른 구체적인 예에서, 아연 손가락 단백질은 식물 세포에서 자연적으로 기능하는 아연 손가락 단백질로부터 유래된 골격 (또는 백본)을 포함한다. 예를 들면, 아연 손가락 단백질은 C3H 아연 손가락, QALGGH 모티브, RING-H2 아연 손가락 모티브, 9 아미노산 C2H2 모티브, Arabidopsis LSD1의 아연 손가락 모티브 및 BBF/Dof 도메인 단백질의 아연 손가락 모티브를 포함할 수 있다.
아연 손가락 단백질은 본 분야에 알려진 어느 적절한 방법을 통해 식물 세포에 제공될 수 있다. 예를 들면, 아연 손가락 단백질은 식물 세포에 외인성으로 첨가될 수 있고, 식물 세포는 아연 손가락 단백질이 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하고 식물 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 조건하에서 유지된다. 선택적으로, 아연 손가락 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 식물 세포에서 발현될 수 있고 식물 세포는 발현된 아연 손가락 단백질이 표적 뉴클레오티드 서열에 결합하고 그리고 식물 세포에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 조건하에서 유지된다.
아연 손가락 유전자는 어느 적절한 식물 발현 벡터를 사용하여 식물에서 발현될 수 있다. 더 고등 식물에서 유전자의 발현에 유용한 통상의 벡터는 본 분야에 알려져 있다. 조절 도메인에 더하여, 종종 아연 손가락 단백질은, 용이한 정제, 발현 모니터링, 또는 세포 또는 아세포 국소화 모니터링을 위해, 말토즈 결합 단백질 ("MBP"), 글루타티온 S 트란스퍼라제 (GST), 헥사히스티딘, c-myc, 또는 FLAG 에피토프와 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
한 구현예에서, 돌연변이된 또는 비자연발생 식물 또는 돌연변이된 또는 비자연발생 식물 세포가 아연 손가락 뉴클레아제-매개 돌연변이에 의해 생산될 수 있다.
특정 구현예에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 일부 또는 전체를 포함하는 게놈성 DNA 서열이 아연 손가락 뉴클레아제 매개 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 게놈성 DNA 서열은 아연 손가락 단백질 결합을 위한 독특한 부위에 대해 조사된다. 선택적으로, 게놈성 DNA 서열은 아연 단백질 결합을 위한 2 개의 독특한 부위에 대해 조사되고 여기서 두 부위는 반대 가닥 위에 서로 밀접하게 있다. 두 아연 손가락 단백질 표적 부위는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상 염기쌍으로 떨어질 수 있다. 아연 손가락 단백질 결합 부위는 NtMRP 유전자의 프로모터 영역과 같은, 그러나 이것으로 제한되는 것은 아닌, NtMRP 유전자 서열의 코딩 서열에 또는 NtMRP 유전자의 발현을 제어하는 조절 요소 중에 있을 것이다.
따라서, 본 명세서는 NtMRP 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 손가락 단백질을 제공한다.
아연 손가락 뉴클레아제-매개 돌연변이에 의해 NtMRP 유전자를 암호화하는, 게놈성 DNA 서열과 같은, 유전자 서열을 돌연변이하는 방법은 임의로 하나 이상의 다음의 단계를 포함한다: (i) 유전자 서열에서 다른 표적 부위에 선택적으로 결합하는 적어도 두 개의 아연 손가락 단백질을 제공하는 단계; (ii) 단계 (i)의 두 다른 비-천연 아연 손가락 단백질 중 하나와 식물 세포에서 작용가능한 발현 조절 서열에 기능적으로 연결된 뉴클레아제를 포함하는 각각 다른 아연 손가락 뉴클레아제를 암호화하는 두 발현 구축물을 구축하는 단계; (iii) 두 발현 구축물을 식물세포에 도입하는 단계. 여기서 두 다른 아연 손가락 뉴클레아제는 돌출되어, 이중 가닥된 브레이크가 표적 부위 중 적어도 하나에 또는 그 근처에서 식물 세포의 게놈 중의 게놈성 DNA 서열에 도입된다. 두 발현 구축물의 식물 세포로의 도입은 동시에 또는 순차적으로, 임의로 제1 구축물을 취한 세포의 선택을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 이중 가닥 브레이크(DSB)는 DNA 또는 RNA의 두 가닥 모두에서 브레이크로 불린다. 이중 가닥 브레이크는 표적 부위의 것으로부터 제거된 5 염기쌍 내지 1500 염기쌍보다 많지 않은, 특히 5 염기쌍 내지 200 염기쌍보다 많지 않은, 특히 5 염기쌍 내지 20 염기쌍보다 많지 않은 부위에서 게놈성 DNA 서열에서 발생한다. 이중 가닥 브레이크는 표적 부위에서 또는 근처에서 게놈성 DNA 서열에서의 돌연변이를 야기하는 비-동형 말단 연결을 용이하게 한다. "비-동형 말단 연결(NHEJ)"은 동형 주형의 요구 없이 직접 결찰에 의해 이중 가닥 브레이크를 수선하는 수선 메카니즘을 말하며 그러므로 이중 가닥 브레이크가 발생하기 전의 서열에 비해 돌연변이성이다.
이 방법은 임의로 (iv) 식물 세포에 적어도 이중 가닥 브레이크의 뉴클레오티드 서열 상류와 동형인 제1 영역과 이중 가닥 브레이크의 뉴클레오티드 서열 하류와 동형인 제2 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 이형 뉴클레오티드 서열의 결실 또는 삽입을 함유하는 NtMRP 폴리뉴클레오티드 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 그러므로, 폴리뉴클레오티드는 표적 부위에서 또는 근처에서 동형 재조합이 용이하고 따라서 게놈으로의 이형 서열의 삽입 또는 게놈으로부터 게놈성 DNA 서열의 결실을 가져온다. 식물세포에서 생성된 게놈성 DNA 서열은 발현된 돌연변이 NtMRP 단백질, 초기 번역 중지 코돈 또는 mRNA로의 프리-mRNA의 적절한 과정을 간섭하여 유전자의 감소된 발현 또는 불활성을 가져오는 서열 모티브의 효소 활성을 방해하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 단백질에 대해 코딩하는 유전자 서열을 돌연변이시켜 단백질 합성을 방해하는 방법이 본 분야의 당업자에게 알려져 있다.
아연 손가락 뉴클레아제는 NtMRP 폴리뉴클레오티드에 결합하는 아연 손가락 단백질에 대해 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드와 유형 IIS 엔도뉴클레아제의 것과 같은, 그러나 이것으로 제한되는 것은 아닌, 비-특이 엔도뉴클레아제에 대해 암호화하는 제2 폴리뉴클레아제의 융합물을 제조하여 구축될 수 있다. 유형 IIS 엔도뉴클레아제는 별개의 인식 도메인과 엔도뉴클레아제 분열 도메인을 갖는 제한 효소이고 여기서 효소는 인식 부위에서 제거된 부위에서 DNA를 쪼갠다. 유형 IIS 엔도뉴클레아제의 비-제한적 예는, AarI, BaeI, CdiI, DrdII, EciI, FokI, FauI, GdiII, HgaI, Ksp632I, MboII, Pfl1108I, Rle108I, RleAI, SapI, TspDTI 또는 UbaPI를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
융합 단백질의 고안 및 구축 방법, 유형 IIS 엔도뉴클레아제의 서열 인식 부위로부터 엔도뉴클레아제 도메인의 선택 및 분리 방법, 아연 손가락 단백질과 엔도뉴클레아제의 융합 단백질을 포함하는 아연 손가락 뉴클레아제의 고안 및 구축 방법이 본 분야에 알려져 있다. 특정 구현예에서, 아연 손가락 뉴클레아제에서의 뉴크레아제 도메인은 FokI이다. 아연 손가락 단백질과 FokI의 뉴클레아제 간의 융합 단백질은 두 염기쌍으로 이루어진 스페이서를 포함하고 또는 선택적으로, 스페이서는 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 염기쌍으로 구성된다. 한 구현예에서, 제1 아연 손가락 뉴클레아제의 엔도뉴클레아제가 제2 아연 손가락 뉴클레아제와 접촉 후 다이머화될 수 있도록 7 염기쌍 스페이서를 갖는 융합 단백질이 기재되고, 여기서 상기 아연 손가락 뉴클레아제를 형성하는 두 아연 손가락 단백질은 표적 DNA 서열의 상류 및 하류에 결합될 수 있다. 이합체화 후, 아연 손가락 뉴클레아제는 표적 뉴클레오티드 서열에서 이중 가닥 브레이크를 유도할 수 있고, 이것은 이어서, 이중 가닥 브레이크의 양쪽 측면에 플랭크된 영역과 상동성을 갖는 외인성 뉴클레오티드 서열과 비-상동성 말단 연결 또는 상동성 재조합될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 아연 손가락 활성인자를 가져오는 아연 손가락 단백질과 인핸서 단백질을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 아연 손가락 활성인자는 다음 단계를 포함하는, NtMRP 유전자의 상향 조절 또는 활성화 전사에 사용될 수 있다: (i) NtMRP 유전자의 코딩 서열에 기능적으로 연결된 서열 또는 프로모터 내의 영역에 결합하는 아연 손가락 단백질을 가공하는 단계, (ii) 상기 아연 손가락 단백질과 전사 활성화제 간의 융합 단백질을 제조하는 단계, (iii) 식물 세포와 같은 세로에서 프로모터 활성을 조절하면서, 상기 아연 손가락 활성화제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 구축물을 제조하는 단계, (iv)상기 유전자 구축물을 세포에 도입시키는 단계, 및 (v) 세포를 배양하고 아연 손가락 활성화제의 발현을 허용하는 단계, 및 (vi) NtMRP 단백질의 발현이 증가된 세포를 특성화하는 단계.
또 다른 구현예에서, 본 명세서는 아연 손가락 억제제를 가져오는 아연 손가락 단백질과 유전자 억제제의 융합 단백질을 제공한다. 아연 손가락 억제제는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 전사를 하향 조절 또는 억제하는데 사용될 수 있고, 다음 단계를 포함한다: (i) NtMRP 폴리뉴클레오티드에 기능적으로 연결된 서열 또는프로모터 내의 영역에 결합하는 아연 손가락 단백질을 가공하는 단계, 및 (ii) 상기 아연 손가락 단백질과 전사 억제제 사이의 융합 단백질을 제조하는 단계, 및 (iii) 식물 세포와 같은 세포에서 프로모터 활성을 조절하면서 상기 아연 손가락 억제제에 대해 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구축물을 발달시키는 단계, 및 (iv) 상기 유전자 구축물을 세포에 도입하는 단계, 및 (v) 상기 아연 손가락의 발현을 제공하는 단계, 및 (vi) NtMRP 폴리뉴클레오티드의 전사가 감소된 세포를 특성화하는 단계.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 아연 손가락 메틸라제를 가져오는 아연 손가락 단백질과 메틸라제를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 아연 손가락 메틸라제는 식물 세포와 같은 세포에서, 다음 단계를 포함하는 NtMRP 폴리뉴클레오티드 프로모터 영역 내의 영역을 메틸화함에 의해 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현을 하향조절 또는 억제하는데 사용될 수 있다: (i) NtMRP 폴리뉴클레오티드의 프로모터 내의 영역에 결합하는 아연 손가락 단백질을 엔지니어링하는 단계, 및 (ii) 상기 아연 손가락 단백질과 메틸라니 사이의 융합 단백질을 제조하는 단계, 및 (iii) 세포에서 프로모터 활성의 조절하에 상기 아연 손가락 메틸라제를 암호화하기 위한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 유전자 구축물을 전개시키는 단계, 및 (iv) 상기 유전자 구축물을 세포에 도입하는 단계, 및 (v) 아연 손가락 메틸라제의 발현을 허용하는 단계, 및 (vi) 세포에서 NtMRP 단백질의 발현이 감소되거나 또는 실질적으로 없는 세포를 특징화하는 단계.
다양한 구현예에서, 아연 손가락 단백질은 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 조절 서열에 결합하기 위한 본 명세서에 기재된 발명에 따라 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로, 조절 서열은 전사 시작 부위, 개시 코돈, 엑손의 영역, 엑손-인트론 경계, 터미네이터 또는 정지 코돈을 포함할 수 있다. 아연 손가락 단백질은 뉴클레아제, 활성화제, 억제 단백질을 포함할 수 있다. 아연 손가락 단백질은 뉴클레아제, 활성화제, 또는 억제 단백질에 융합될 수 있다.
다양한 구현예에서, 아연 단백질 뉴클레아제는 NtMRP 폴리뉴클레아제의 게놈성 DNA 서열의 조절 영역, 코딩 영역, 또는 비-코딩 영역에 이중 가닥된 브레이크를 도입시키고, NtMRP 폴리뉴클레아제의 발현 수준의 감소, 저해 또는 실질적 저해를 가져오고, 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성의 감소, 억제 또는 실질적 억제를 가져온다.
본 명세서는 식물 세포와 같은 세포를 수정하는 방법으로, 상기 방법은 식물 세포의 게놈은 아연 손가락 뉴클레아제-매개 돌연변이에 의해 변형되고, 이것은 (a) 게놈성 뉴클레오티드 서열에서 변형을 위해 다른 표적 부위에 선택적으로 결합하는 적어도 두 개의 비천연 아연 손가락 단백질을 동정하고 제조하는 단계; (b)이중 가닥 브레이크가 식물 게놈에서, 특히 게놈성 뉴클레오티드 서열에서의 표적 부위에서 또는 근처에서 게놈성 뉴클레오티드에 도입되도록, 식물 세포에 각각 적어도 두 개의 비천연 아연 손가락 단백질 중 하나와 뉴클레아제를 포함하는 적어도 두 개의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 그리고, 임의로, (c) 상기 세포에 이중 가닥 브레이크의 상류 서열과 상동성인 제1 영역과 이중 가닥 브레이크의 하류 영역과 상동성인 제2 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여, 게놈에서 폴리뉴클레오티드를 DNA와 재조합하는 단계를 포함한다. 또한, 융합 단백질의 하나 이상을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 구축물을 포함하는 세포가 기재된다.
또 다른 면에서, 본 명세서는 I-CreId와 같은 메가뉴클레아제를 사용하여 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자 이식 또는 기타 유전적으로 변형된 식물을 생산하는 방법을 더욱 제공한다. 자연발생 메가뉴클레아제 뿐 아니라 재조합 메가뉴클레아제가 NtMRP 유전자의 방해를 허용하도록 식물의 DBA에서 단일 부이 또는 비교적 소량의 부에서 구체적으로 이중 가닥 브레이크를 일으키도록 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제는 변형된 DNA 인식 특성을 갖는 엔지니어링된 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제 단백질은 공지의 다양한 다른 메카니즘에 의해 식물 세포에 전달될 수 있다.
메가뉴클레아제는 변형된 DNA 인식 특성을 갖는 엔지니어링된 메가뉴클레아제일 수 있다. 이 인용구는 자연발생 메가뉴클레아제 I-CreI로부터 유래된 메가뉴클레아제의 구조-기반 엔지니어링에 대한 방법을 기재한다. 이들 엔지니어링된 메가뉴클레아제는 식물의 게놈에서 발견된 예비-결정된 22 염기쌍 DNA 서열을 인식하고 절단하는데 사용될 수 있다. 메가뉴클레아제 단백질은 본 분야에 알려진 다양한 다른 메카니즘에 의해 식물로 전달될 수 있다.
본 명세서의 한 면은 식물 세포 또는 식물에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 불활성시키기 위한 메가뉴클레아제의 사용을 허용한다. 본 발명과 관련된 한 면은 또한, 다음을 포함하는 메가뉴클레아제를 사용한 식물에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다: (a) NtMRP 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포를 제공하는 단계; (b)뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 암호화하는 구축물을 상기 식물 세포에 도입하는 단계; 및 (c) 메가뉴클레아제가 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 불활성화시키는 단계.
메가뉴클레아제는 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 암호화 영역 내의 뉴클레아제 인식 부위를 쪼개는데 사용될 수 있다. 이와 같은 쪼개짐은 주로 비-동형 말단 연결(joining)에 의한 돌연변이 DNA 손상이 따르는 메가뉴클레아제 인식 부위에서의 DNA의 결실을 가져온다. 유전자 암호화 서열에서의 이와 같은 돌연변이는 통상적으로 유전자를 불활성화시키기에 충분하다. 이 방법은, 우선, 메가뉴클레아제 발현 카세트를 적절한 변형법을 사용하여 식물 세포로 전달하는 것을 포함한다. 가장 높은 효율을 위해, 메가뉴클레오티드 발현 카세트를 선택가능한 마커에 연결하고 선택제의 존재하에 성공적으로 변형된 세포에 대해 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 접근법은 메가뉴클레아제 발현 카세트의 게놈으로의 통합을 가져오지만, 이것은 식물이 규제 승인이 요구된다면 바람직하지 않다. 이와 같은 겨우, 메가뉴클레아제 발현 카세트 (및 링크된 선택가능한 마커 유전자)는 통상의 육종술을 사용하여 순차적으로 식물 세대로부터 분리될 수 있다. 선택적으로, 식물 세포는 선택가능 마커가 부족한 메카뉴클레아제 발현 카세트로 초기에 변형될 수 있고, 선택제가 부족한 매질에서 성장할 수 있다. 이와 같은 상황에서, 처리된 세포의 일부는 메가뉴클레아제 발현 카세트를 분획은 획득할 것이고 메가뉴클레아제 발현 카세트를 게놈에 일시적으로 삽입함 없이 엔지니어링된 메가뉴클레아제를 발현할 것이다. 변환 효율을 고려하지 않으므로, 후자의 변형 과정은 원하는 게놈 변형을 얻기 위해 더 많은 수의 처리된 세포를 요구할 수 있다.
메가뉴클레아제 발현 카세트의 전달에 이어서, 식물 세포는 초기에 사용된 특정 변형 과정에 일반적인 조건하에서 성장한다. 이것은 변형된 세포가 26℃ 미만의 온도의 주로 암실에서 매질 상에서 성장한다는 것을 의미한다. 이와 같은 조건은 일정한 기간, 바람직하기는 1~4일 동안 사용되어 식물 세포가 변형 과정으로부터 회복되도록 한다. 이와 같은 초기 회복 기간 이후의 어느 시점에, 성장 온도는 메가뉴클레아제 인식 부위를 쪼개고 돌연변이시키도록 엔지니어링된 메가뉴클레아제의 활성을 자극하기 위해 상승될 수 있다.
어느 특정의 적용에서, 식물의 게놈에서부터 NtMRP 폴리뉴클레아제를 정확히 제거하는 것이 바람직하다. 이와 같은 적용은 가능하기는 엔지니어링된 메가뉴클레아제의 쌍을 사용하는 것이 가능하고, 이들 각각은 의도된 결실의 둘 중 어느 측에서 메가뉴클레아제 이식 부위를 쪼갠다.
본 명세서에 제공된 재조합 구축물이 NtMRP 단백질 발현 수준을 조절 (예를 들면, 감소 또는 억제)하기 위해 식물 또는 식물 세포를 변형시키는데 사용될 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 식물 또는 세포에서 NtMRP 폴리펩티드를 발현하는데 적합한 조절 영역에 기능적으로 연결된 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러므로, 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 NtMRP 폴리펩티드 또는 그것의 변이체를 암호화하는 암호화 서열을 포함할 수 있다.
재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 NtMRP 폴리펩티드는 자연 NtMRP 폴리펩티드일 수 있고, 또는 세포와 이종일 수 있다. 몇몇 경우, 재조합 구축물은 조절 영역에 기능적으로 연결된 NtMRP-조절 폴리펩티드의 발현을 감소 또는 억제하는 폴리펩티드를 함유한다. 적절한 조절 영역의 예가 본 명세서에 기재된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물을 함유하는 벡터가 또한 제공된다. 적절한 벡터 백본은 예를 들면, 플라즈미드, 바이러스, 인공 염색체, BACs, YACs, 또는 PAC와 같은 본 분야에 일상적으로 사용되는 것들을 포함한다. 적절한 발현 벡터는 플라스미드 및 박테리오파아지, 바쿨로바이러스, 및 레트로바이러스로부터 유래된 바이러스 벡터를 포함한다. 수많은 벡터와 발현 시스템이 상업적으로 이용가능하다.
벡터는 또한, 예를 들면, 복제의 기원, 스케폴드 부착 부위 (SAR) 또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 식물 세포에 대한 선택가능한 혈청형을 제공할 수 있다. 예를 들면, 마커는 항생물질(예를 들면, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신), 또는 제초제 (예를 들면, 글리포스페이트, 클로르술푸론 또는 포스피노트리신)에 대한 내성과 같은 살생물제 내성을 제공할 수 있다. 이에 더하여, 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 검출 (예를 들면 정제 또는 국소화)가 용이하도록 고안된 태그 서열을 포함할 수 있다. 루시페라제, 베타-글루쿠로니다제 (GUS), 녹색 형광 단백질 (GFP), 글루타티온 S-트란스퍼라제 (GST), 폴리히스티딘, c-myc 또는 헤마글루티인 서열과 같은 태그 서열은 통상적으로 암호화된 폴리펩티드와의 융합물로 발현된다. 이와 같은 태그는 카르복실 또는 아미노 터미날 중 어느 것을 포함하여, 폴리펩티드 내의 어느 곳에도 삽입될 수 있다.
다양한 구현예가, NtMRP 유전자발현을 감소 또는 침묵시키고, 그리고 그것에 의해 NtMRP 수송자의 발현 수준이 관심의 식물 조직에서 감소될 수 있는 식물을 생산하는데 사용될 수 있는 다양한 방법으로 NtMRP 유전자 발현 수준을 감소시키도록 변형된 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물을 대상으로 한다. 중금속 수송율 및 중금속 수송의 분포 패턴, 특히 카드뮴 수송은 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 생산된 식물에서 변형될 수 있다.
유전자 조작에 사용하기에 적합한 식물은 외떡잎 및 쌍떡잎식물 그리고 다음의 과 중 하나의 종을 포함하는 식물 세포계를 포함한다: 쥐꼬리망초과(Acanthaceae), 부추과(Alliaceae), 알스트로에메리아과(Alstroemeriaceae), 수선화과(Amaryllidaceae), 협죽도과(Apocynaceae), 종려과(Arecaceae), 국화과(Asteraceae), 매자나무과(Berberidaceae), 홍목과(Bixaceae), 십자화과( Brassicaceae), 파인애플과(Bromeliaceae), 삼과(Cannabaceae), 석죽과(Caryophyllaceae), 개비자나무과(Cephalotaxaceae), 명아주과(Chenopodiaceae), 콜키쿰(Colchicaceae), 박과(Cucurbitaceae), 마과(Dioscoreaceae), 마황과(Ephedraceae), 코카나무과(Erythroxylaceae), 대극과(Euphorbiaceae), 콩과(Fabaceae), 꿀풀과(Lamiaceae), 아마과(Linaceae), 석송과(Lycopodiaceae), 아욱과(Malvaceae), 여로과(Melanthiaceae), 파초과(Musaceae), 도금양과(Myrtaceae), 니사나무과(Nyssaceae), 양귀비과(Papaveraceae), 소나무과(Pinaceae), 질경이과(Plantaginaceae), 벼과(Poaceae), 장미과(Rosaceae), 꼭두서니과(Rubiaceae), 버드나무과(Salicaceae), 무환자나무과(Sapindaceae), 가지과(Solanaceae), 주목과(Taxaceae), 차나무과(Theaceae), 또는 포도나무과(Vitaceae).
적합한 종은 아벨모스쿠스(Abelmoschus), 아비에스(Abies), 에이서(Acer), 아그로스티스(Agrostis), 알리움(Allium), 알스트로에메리아(Alstroemeria), 아나마스(Ananas), 안드로그라피스(Andrographis), 안드로포곤(Andropogon), 아르테미시아(Artemisia), 아룬도(Arundo), 아트로파(Atropa), 베르베리스(Berberis), 베타(Beta), 빅사(Bixa), 브라시카(Brassica), 칼렌둘라(Calendula), 카멜리아(Camellia), 캄프토테카(Camptotheca), 칸나비스(Cannabis), 캅시쿰(Capsicum), 카르타무스(Carthamus), 카타란투스(Catharanthus), 세팔로탁수스(Cephalotaxus), 크리산테뭄(Chrysanthemum), 신코나(Cinchona), 시트룰러스(Citrullus), 코페아(Coffea), 콜키쿰(Colchicum), 콜레우스(Coleus), 쿠쿠미스(Cucumis), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 시노돈(Cynodon), 다투라(Datura), 디안투스(Dianthus), 티지탈리스(Digitalis), 디오스코레아(Dioscorea), 엘라에이스(Elaeis), 에페드라(Ephedra), 에리안투스(Erianthus), 에리트록실룸(Erythroxylum), 유칼립투스(Eucalyptus), 페스투카(Festuca), 프라가리아(Fragaria), 갈란투스(Galanthus), 글리신(Glycine), 고십피움(Gossypium), 헬리안투스(Helianthus), 헤베아(Hevea), 호르데움(Hordeum), 히오스시아무스(Hyoscyamus), 자트로파(Jatropha), 락투카(Lactuca), 리움(Linum), 롤리움(Lolium), 루피누스(Lupinus), 리코페르시콘(Lycopersicon), 리코포디움(Lycopodium), 만니호트(Manihot), 메디카고(Medicago), 멘타(Mentha), 미스칸투스(Miscanthus), 무사(Musa), 미코디아나(Nicotiana), 오리자(Oryza), 파니쿰(Panicum), 파파베르(Papaver), 파르테니움(Parthenium), 펜니세툼(Pennisetum), 페투니아(Petunia), 팔라리스(Phalaris), 플레움(Phleum), 피누스(Pinus), 포아(Poa), 포인세티아(Poinsettia), 포풀러스(Populus), 라우울피아(Rauwolfia), 리시누스(Ricinus), 로사(Rosa), 사카룸(Saccharum), 살릭스(Salix), 산구이나리아(Sanguinaria), 스코폴리아(Scopolia), 세칼레(Secale), 솔라눔(Solanum), 솔르그훔(Sorghum), 스파르티나(Spartina), 스피나세아(Spinacea), 타나세툼(Tanacetum), 타쿠스(Taxus), 테오브로마(Theobroma), 트리티오세칼레(Triticosecale), 트리티쿰(Triticum), 우니올라(Uniola), 베라트룸(Veratrum), 빈카(Vinca), 비티스(Vitis) 및 제아 속의 맴버들을 포함할 수 있다.
적절한 종은 파니쿰 (Panicum) spp., 소르구훔(Sorghum) spp., 미스칸투스( Miscanthus) spp., 사카룸(Saccharum) spp., 에리안투스(Erianthus) spp., 포풀러스(Populus) spp., 안드로포곤 게라르디(Andropogon gerardii) (big bluestem), 펜니세툼 푸르푸럼(Pennisetum purpureum) (elephant grass), 팔라리스 아룬디나세아(Phalaris arundinacea) (reed canarygrass), 시노돈 닥틸론(Cynodon dactylon) (bermudagrass), 페스투카 아룬디나세아(Festuca arundinacea) (tall fescue), 스파티나 펙티나타 (partina pectinata) (prairie cord-grass), 메디카고 사티바(Medicago sativa) (alfalfa), 아룬도 도낙스(Arundo donax) (giant reed), 세칼레 세리알레(Secale cereale) (rye), 살릭스(Salix) spp. (willow), 유칼립투스(Eucalyptus) spp. (eucalyptus), 트리티코세칼레(Triticosecale) (triticum wheat times rye), 밤부(bamboo), 헬리안투스 아누스(Helianthus annuus) (sunflower), 카르타무스 틴토리우스(Carthamus tinctorius) (safflower), 자트로파 쿠르카스(Jatropha curcas) (jatropha), 리시누스 콤무니스(Ricinus communis) (castor), 엘라에이스 구니엔시스(Elaeis guineensis) (palm), 리눔 우시타티시뭄(Linum usitatissimum) (flax), 블라시카 준세아(Brassica juncea), 베타 불가리스(Beta vulgaris) (sugarbeet), 만니호트 에스쿨렌타(Manihot esculenta) (cassaya), 리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum) (tomato), 락투사 사티바(Lactuca sativa) (lettuce), 무사 파라디시아카(Musa paradisiaca) (banana), 솔라눔 튜베로숨(Solanum tuberosum) (potato), 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea) (broccoli, cauliflower, Brussels sprouts), 카멜리아 시넨시스(camellia sinensis) (tea), 프라가리아 아나나사(Fragaria ananassa) (strawberry), 테오브로마 카카오(Theobroma cacao) (cocoa), 코페아 아라비카(Coffea arabica) (coffee), 비티스 비니페라(Vitis vinifera) (grape), 아나나스 코모수스(Ananas comosus) (pineapple), 캅시쿰 아눔(Capsicum annum) (hot & sweet pepper), 알리움 세파(Allium cepa) (onion), 쿠쿠미스 멜로(Cucumis melo) (melon), 쿠쿠미스 사티부스(Cucumis sativus) (cucumber), 쿠쿠비타 막시마(Cucurbita maxima) (squash), 쿠쿠르비타 모스카타(Cucurbita moschata) (squash), 스피나세아 올레라세아(Spinacea oleracea) (spinach), 시트룰러스 라나투스(Citrullus lanatus) (watermelon), 아벨모스쿠스 에스쿨렌투스(Abelmoschus esculentus) (okra), 솔라눔 멜론게나(Solanum melongena) (eggplant), 로사(Rosa) spp. (rose), 디안투스 가리오필러스(Dianthus caryophyllus) (carnation), 페투니아(Petunia) spp. (petunia), 포인세티아 풀체리마(Poinsettia pulcherrima) (poinsettia), 루피누스 알버스(Lupinus albus) (lupin), 유니올라 파니쿨라타( Uniola paniculata) (oats), 벤트그래스(bentgrass) (Agrostis spp.), 포풀러스 트레물로이드(Populus tremuloides) (aspen), 피누스(Pinus) spp. (pine), 아비에스 (Abies) spp. (fir), 에이서(Acer) spp. (maple), 호르데움 불가레(Hordeum vulgare) (barley), 포아 프라텐시스(Poa pratensis) (bluegrass), 롤리움(Lolium) spp. (ryegrass) 및 플레움 프라텐스(Phleum pratense) (timothy), 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum) (switchgrass), 소르그훔 비콜로르(Sorghum bicolor) (sorghum, sudangrass), 미스칸투스 기간테우스(Miscanthus giganteus) (miscanthus), 사카룸(Saccharum) sp. (energycane), 포퓰러스 발사미페라(Populus balsamifera) (poplar), 제아 마이즈(Zea mays) (corn), 글리신 맥스(Glycine max) (soybean), 브라스시카 나푸스(Brassica napus) (canola), 트리티쿰 아네스티붐(Triticum aestivum) (wheat), 고시피움 히르스툼(Gossypium hirsutum) (cotton), 오리자 사티바(Oryza sativa) (rice), 헬리안투스 아누스(Helianthus annuus) (sunflower), 메티카고 사티바(Medicago sativa) (alfalfa), 베타 불가리스(Beta vulgaris) (sugarbeet), 또는 펜니레툼 글라우쿰(Pennisetum glaucum) (pearl millet)을 포함할 수 있다.
다양한 구현예가 NtMRP 유전자 발현 수준을 조절 (예를 들면, 감소 또는 억제)하기 위해 변형된, 담배 식물과 같은 식물을 생산하는 돌연변이 식물, 비자연발생 식물 또는 유전자 조작 식물에 대한 것으로, 여기서 NtMRP의 발현 수준은 대조 식물과 비교하여 관심의 식물 조직내에서 감소된다. 기재된 조성물 및 방법은 엔. 루스티카 (N. rustica ) 및 엔. 타바쿰 (N. tabacum ) (예를 들면, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, 및 Petico)을 포함한, 니코티아나(Nicotiana ) 속의 어느 종에도 적용될 수 있다. 다른 종은 엔. 아카울리스(N. acaulis ), 엔. 어큐미나타 (N. acuminata ), 엔. 아쿠니마타 var. 멀티플로라(N. acuminata var . multiflora), 엔. 아프리카나 (N. africana ), 엔. 알라타(N. alata ), 엔. 암플레시카울리스 (N. amplexicaulis ), 엔. 아렌트시 (N. arentsii ), 엔. 아테누에이타 (N. attenuata), 엔. 베나비데시 (N. benavidesii ), 엔. 벤타미아나 (N. benthamiana ), 엔. 비겔로비(N. bigelovii ), 엔. 보나리엔시스 (N. bonariensis ), 엔. 카비콜라 (N. cavicola ), 엔. 클로벨란디 (N. clevelandii ), 엔. 코르디폴리아 (N. cordifolia), 엔. 코림보사 (N. corymbosa ), 엔. 데브네이 (N. debneyi ), 엔. 엑셀리오르 (N. excelsior ), 엔. 포르게티아나 (N. forgetiana ), 엔. 프라그란스 (N. fragrans), 엔. 글라우카 (N. glauca ), 엔. 글루티노사 (N. glutinosa ), 엔. 굿스피디 (N. goodspeedii ), 엔. 고세이 (N. gossei ), 엔. 하이브리드 (N. hybrid ), 엔. 인글루바 (N. ingulba ), 엔. 카와가미 (N. kawakamii ), 엔. 나이티아나 (N. knightiana), 엔. 랑스도르피 (N. langsdorffii ), 엔. 리니어리스 (N. linearis ), 엔. 롱기플로라 (N. longiflora ), 엔. 마리티마 (N. maritima ), 엔. 메갈로시폰 (N. megalosiphon ), 엔. 미에르시 (N. miersii ), 엔. 녹티플로라(N. noctiflora ), 엔. 누디카울리스 (N. nudicaulis ), 엔. 오비투스폴리아 (N. obtusifolia ), 엔. 옥시덴탈리스 (N. occidentalis ), 엔. 옥시덴탈리스 subsp. 레스페리스 (N. occidentalis subsp . hesperis ), 엔. 오토포라 (N. otophora ), 엔, 파니쿨라타 (N. paniculata), 엔. 파우시플로라 (N. pauciflora ), 엔. 페트유니오이데스 (N. petunioides), 엔. 플럼바기니폴리아 (N. plumbaginifolia), 엔. 쿼드리발비스 (N. quadrivalvis ), 엔. 라이몬디 (N. raimondii), 엔. 레판다 (N. repanda ), 엔. 로슬라타 (N. rosulata ), 엔. 로술라타 subsp. 인굴바 (N. rosulata subsp . ingulba ), 엔. 로트운디폴리아 (N. rotundifolia), 엔. 세트첼리이 (N. setchellii ), 엔. 시물란스 (N. simulans ), 엔. 솔라니폴리아 (N. solanifolia ), 엔. 스페가찌니 (N. spegazzinii), 엔. 스톡토니 (N. stocktonii ), 엔. 수아베올렌스 (N. suaveolens ), 엔. 실베스트리스 (N. sylvestris ), 엔. 씨르시플로라 (N. thyrsiflora ), 엔. 토멘토사 (N. tomentosa ), 엔. 토멘토시포르미스 (N. tomentosiformis ), 엔. 트리고노필라 (N. trigonophylla ), 엔. 움브라티카 (N. umbratica ), 엔. 운둘라타 (N. undulata), 엔. 벨루티나 (N. velutina ), 엔. 위간디오이데스 (N. wigandioides ), 및 엔. 엑스 산데라에 (N. x sanderae )을 포함한다.
담배 품종과 엘리트 담배 품종의 용도가 또한 본 발명에서 고려된다. 그러므로, 유전자이식, 비자연발생 또는 돌연변이 식물은 하나 이상의 이식유전자 또는 하나 이상의 유전적 돌연변이 또는 그들의 조합을 포함하는 담배 품종 또는 엘리트 담배 품종일 수 있다. 유전적 돌연변이(들) (예를 들면, 하나 이상의 다형)는 개별적인 담배종 또는 담배 품종 (예를 들면, 엘리트 담배 품종)으로는 자연적으로 존재하지 않는 돌연변일 수 있고, 또는 돌연변이가 개별적인 담배 종 또는 담배 품종 (예를 들면, 엘리트 담배 품종)에 자연발생하지 않는 한, 자연적으로 발생하지 않는 돌연변이 일 수 있다.
특히 융용 담배(Nicotiana tabacum ) 품종은 베리종, 흑색종, 황색종 및 오리엔탈형 담배를 포함한다. 다양한 변종 또는 품종의 비-제한적인 예는 다음과 같다: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, 코커(Coker) 176, 코커 319, 코커 371 골드, 코커 48, CD 263, DF911, DT 538 LC 갈파오(Galpao) 담배, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, 하이브리드 403LC, 하이브리드 404LC, 하이브리드 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, 리틀 크리덴던(Little Crittenden), 맥네어(McNair) 373, 맥네어 944, msKY 14xL8, 내로우 리프 마돌(Narrow Leaf Madole), 내로우 리프 마돌 LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, 닐 스미스 마돌(Neal Smith Madole), 옥스포드(OXFORD) 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, '페리큐(Perique)' 담배, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, 스페이트(Speight) 168, 스페이트 172, 스페이트 179, 스페이트 210, 스페이트 220, 스페이트 225, 스페이트 227, 스페이트 234, 스페이트 G-28, 스페이트 G-70, 스페이트 H-6, 스페이트 H20, 스페이트 TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, 잔티(Xanthi) (Mitchell-Mor), 벨(Bel)-W3, 79-615, 삼순 홈스(Samsun Holmes) NN, KTRDC 넘버 2 하이브리드 49, 버얼리(Burley) 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, PO1, PO2, PO3, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, 뱅켓(Banket) A1, 바스마 드라마(Basma Drama) B84/31, 바스마 지크나(Basma I Zichna) ZP4/B, 바스마 잔티(Basma Xanthi) BX 2A, 바텍(Batek), 베수키 젬버(Besuki Jember), C104, 코커(Coker) 347, 리올로 미시오네로(Criollo Misionero), 델크레스트(Delcrest), 드제벨(Djebel) 81, DVH 405, 갈파오 코눔(Galpao Comum), HB04P, 힉스 브로드리프(Hicks Broadleaf), 바쿨라크 엘라소나(Kabakulak Elassona), 쿠차게 (Kutsage) E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, 레드 러시안, 삼순, 사플락( Saplak), 심마바(Simmaba), 탈가르(Talgar) 28, 위슬시카(Wislica), 야얄다그( Yayaldag), 프릴렙(Prilep) HC-72, 플릴렙 P23, 프릴렙 PB 156/1, 프릴렙 P12-2/1, 야카(Yaka) JK-48, 야카 JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, 바스마, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, 바스마 잔티, R149, GR153, 페티트 하바나(Petit Havana). 상기 저 컨버터 아변종은, 비록 본 명세서에 구체적으로 기재되지 않았지만, 또한 고려된다.
추가의 면에서, NtHMA 수송체의 발현이 또한 감소되어 식물에서 카드뮴의 함량을 더욱 감소시키도록 추가로 변형된 돌연변이의, 비자연발생 또는 유전자 이식 식물이 제공된다. 식물에서 카드뮴의 함량을 감소시키기 위한 NtHMA 수송체의 사용은 WO2009074325에 기재되어 있다. 제공된 한 구현예에 따르면, 단리된 NtMRP 폴리뉴클레오티드, NtMRP 키메릭 유전자, NtMRP 폴리뉴클레오티드 구축물, NtMRP 이중-가닥 RNA, NtMRP 컨쥬게이트 및/또는 단리된 NtHMA 폴리뉴클레오티드, NtHMA 키메릭 유전자, NtHMA 폴리뉴클레오티드 구축물, NtHMA 이중가닥 RNA, NtHMA 컨쥬게이트 및/또는 NtHMA 발현 벡터와 함께 NtMRP 발현 벡터가 제공된다.
구현예는 또한 대조와 비교하여 소량의 카드뮴이 축적되도록 NtMRP 발현 또는 활성을 조절(예를 들면, 감소 또는 억제)하기 위해 변형된 돌연변이 식물, 비자연발생 식물, 혼성 식물 또는 유전자이식 식물을 생성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 얻어진 식물은 대조 식물과 전반적인 외관(예를 들면, 표현형)에서 유사하거나 또는 실질적으로 유사하다. 돌연변이 정도, 식물 당 잎의 수, 줄기 길이, 잎 식립 각도, 잎 크기 (폭과 길이), 마디 사이의 거리 및 층-주맥 비율과 같은 다양한 표현형 특성이 현장 관찰에 의해 평가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 식물의 높이 또는 중량, 또는 높이와 중량은 대조 식물과 실질적으로 동일하다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 건조 수집된 식물의 잎과 대조의 비교에서 중요한 차이는 발견되지 않았고, 그러므로 이것은 NtMRP 전사의 조정은 건조 바이오매스에서 통계적으로 유의한 효과를 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 한 면은 돌연변이 식물, 비자연발생 식물, 하이브리드 식물 또는 유전자 이식 식물의 종자이다. 바람직하기는, 종자는 담배 종자이다. 추가의 면은 돌연변이 식물, 비자연발생 식물, 하이브리드 식물 또는 유전자 이식 식물의 화분 또는 밑씨이다. 이에 더하여 돌연변이 식물, 비자연발생 식물, 하이브리드 식물, 유전자 이식 식물은 수컷 불임을 제공하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다는 것이 기재된다.
본 발명은 돌연변이 식물, 비자연발생 식물, 하이브리드 식물, 또는 유전자이식 식물 또는 그것의 일부의 재생시킬 수 있는 세포의 조직 배양을 제공하고, 이 배지는 부모의 형태학 및 생리적 특성 모두를 발현할 수 있는 식물을 재생한다. 재생가능한 세포는 잎, 화분, 배아, 떡잎, 배축, 뿌리, 근단, 꽃가루, 꽃과 그것이 일부, 배젖, 순, 줄기, 잎자루, 중과피 및 캡슐 또는 셀 또는 그들로부터 유래된 원생생물을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 구현예에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절(예를 들면, 감소 또는 억제)된 식물은 카드뮴과 같은 중금속의 수준이, 특히 잎에서 감소될 수 있다. 카드뮴의 수준은 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절(예를 들면, 감소 되는 억제)되지 않은 대응하는 대조 식물에서의 카드뮴 수준과 비교하여, 적어도 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 약 100%, 125%, 150% 또는 200% 또는 그 이상까지 감소될 수 있다. 몇몇 구현예에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절(예를 들면 감소 또는 억제)된 식물은 뿌리에서 카드뮴의 증가된 또는 감소된 수준을 가질 수 있다. 몇몇 구현예에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절(예를 들면, 감소 또는 억제)된 식물이 뿌리에서 카드뮴의 감소된 또는 증가된 수준을 갖고, 그리고 잎에서 카드뮴 수준의 감소를 가질 수 있다. 몇몇 구현예에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현이 조절(예를 들면, 감소 또는 억제)된 식물이 수확가능한 바이오매스에서 카드뮴의 수준이 감소될 수 있다.
발현은 예를 들면, RT-PCR, 노던 블로팅, RNase 보호, 프라이머 연장, 웨스턴 블롯팅, 단백질 겔 전기영동, 면역침강법, 효소-연결된 면역분석칩 분석 및 질량분석과 같은 방법을 포함하여 평가될 수 있다. 폴리펩티드가 조직-특혜 또는 광범위하게 발현되는 프로모터의 조절하에 발현된다면, 발현은 전체 식물 또는 선택된 조직에서 평가될 수 있다는 것을 명심하여야 한다. 유사하기는, 폴리펩티드가 특정 시간, 예를 들면 전개 중 특정 시간 또는 유도 후 발현된다면, 발현은 원하는 시기에 선택적으로 평가될 수 있다.
돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물의 개체는 원하는 특성 또는 표현형을 갖는 개체의 맴버들로부터 스크리닝 또는 선택될 수 있다. 예를 들면, 단일 형질전환 사상이 NtMRP 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 원하는 수준의 발현을 갖는 이들 식물에 대해 스크리닝될 수 있다. 물리적 및 생화학적 방법은 발현 수준을 동정하는데 사용될 수 있다. 이들은 폴리뉴클레오티드의 검출을 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; RNA 전사를 검출하기 위한 노던 블로팅, S1 RNase 보호, 프라이머- 연장, 또는 RT-PCR 증폭; 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소 분석; 및 폴리펩티드를 검출하기 위한 단백질 겔 전기영동, 웨스터 블로팅, 면역 침강 및 효소-연결 면역조사를 포함한다. 인 시츄 혼성화, 효소 오염, 및 면역오염과 같은 기타의 기술이 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 발현을 검출하는데 사용될 수 있다.
식물의 개체는, 카드뮴의 조절된 (예를 들면 감소된 또는 억제된) 수준과 같은 원하는 특질을 갖는 이들 식물에 대해 스크리닝될 수 있다. 선택 또는 스크리닝은 하나 이상의 세대에 대해 또는 하나 이상의 지리적 장소에서 수행될 수 있다. 몇몇 경우, 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자 이식 식물은 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자 이식 식물에서 원하는 표현형을 생산하는데 필요한 또는 원하는 표현형을 유도하는 조건하에서 성장하고 선택될 수 있다. 이에 더하여, 선택 및 스크리닝은 표현형이 식물에 의해 나타날 것으로 예측되는 특정 발달 단계 중 적용될 수 있다. 선택 또는 스크리닝은 NtMRP 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 또는 활성이 조절(예를 들면, 감소 또는 억제) 되지 않은 대조 식물과 그들의 카드뮴 함량에서 통계적으로 의미있는 차이를 갖는 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자 이식 식물을 선택하기 위해 수행될 수 있다.
단리된 폴리뉴클레오티드, 키메릭 유전자, 폴리뉴클레오티드 구축물, 이중가닥 RNA, 컨쥬게이트 또는 발현 벡터와 같은 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물 세포 및 식물이 본 발명에 기재된다. 식물 또는 식물 세포는 안정하게 변형되기 위해 게놈에 병합된 재조합 폴리뉴클레오티드를 가짐으로써 변형될 수 있다. 안정하게 변형된 세포는 통상적으로 각각이 세포 분할을 갖는 도입된 폴리뉴클레오티드를 유지한다. 식물 또는 식물 세포는 또한 재조합 폴리뉴클레오티드가 게놈에 병합되지 않도록 일시적으로 변형될 수 있다. 일시적으로 변형된 세포는 통상적으로 각각의 세포 분할된 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드의 모든 또는 몇몇 부분을 손실하여 도입된 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 분할의 충분한 수 이후 딸 세포에서 검출될 수 없다.
폴리뉴클레오티드를 단엽 식물과 다엽 식물에 도입하는 기술은 본 분야에 잘 알려져 있고, 그리고 예를 들면, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스 벡터-매개 형질전환, 전기천공 및 입자 총 형질전환을 포함한다. 이종 폴리뉴클레오티드를 식물 염색체에 병합시키기 위한 아그로박테리움 시스템은 식물 유전공학에서 광범위하게 연구되고, 변형되고, 그리고 이용되어왔다. 센스 또는 안티센스 배열로, 조절 서열에 기능적으로 연결된 정제된 단백질에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 네이크된 재조합 폴리뉴클레오티드 분자는 종래의 방법으로 적절한 T-DNA 서열에 연결된다. 이들은 폴리에틸렌 글리콜 기술에 의해 또는 전기 천공술에 의해 담배 원형질체에 도입되고, 이들 모두는 표준이다. 선택적으로, 본 발명의 정제된 단백질을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 이와 같은 벡터는생 아그로박테리움 세포에 도입되고, 이것은 그리고 나서 폴리뉴클레오티드를 식물 세포로 수송한다. T-DNA 벡터의 수반 없이 네이크된 폴리뉴클레오티드에 의한 형질전환은 원형질체와 리보좀을 함유하는 폴리펩티드의 융합을 통해 또는 전기천공을 통해 수행될 수 있다. T-DNA 벡터에 의해 동행되지 않은 네이크된 폴리뉴클레오티드가 또한 불활성, 고속 미세투사를 통해 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다.
세포 또는 배양된 조직이 형질전환을 위한 수혜 조직으로 사용된다면, 식물은, 필요하다면, 본 분야의 당업자에게 알려진 기술에 의해, 형질전환된 배양물로부터 재생될 수 있다.
재조합 구축물에 포함되어질 조절 영역의 선택은, 효능, 선택 가능성, 유도성(inducibility). 원하는 발현 수준, 및 세포 또는 조직-특혜적 표현을 포함하여, 여러 인자들에 의존하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 코딩 서열에 대해 조절 영역의 적절히 선택하고 위치시키는 것에 의해 코딩 서열의 발현을 조절하는 것은 본 분야의 당업자에게는 일상적인 일이다. 폴리뉴클레오티드의 전사는 유사한 방식으로 조절될 수 있다. 몇몇 적합한 조절 영역은 특정 세포 유형에서만 또는 우선적으로 전사를 개시한다. 식물 게놈 폴리뉴클레오티드에서 조절 영역을 종정하고 특성화하기 위한 방법이 본 분야에 알려져 있다.
적합한 프로모터는 다른 조직 또는 세포 유형에 존재하는 (예를 들면, 뿌리-특이 프로모터, 순-특이 프로모터, 물관부-특이 프로모터), 또는 다양한 발달 단계 동안 존재하는, 또는 다른 환경 조건에 대한 반응으로 존재하는 조직-특이 인자에 의해 인식되는 조직-특이 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는 특정 인듀서(inducers)를 요구함 없이 대부분의 세포 유형에서 활성일 수 있는 구성 프로모터를 포함한다. NtMRP RNAi 폴리펩티드 생산을 조절하기에 적합한 프로모터의 예는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos 또는 유니퀴틴- 또는 파세올린- 프로모터를 포함한다. 본 분야의 당업자는 재조합 프로모터의 다중 변이체를 생산할 수 있다.
조직-특이 프로모터는 식물 생장 조직 또는 생식 조직에서와 같이, 오직 특정 세포 또는 조직에서 식물 발달 중 특정 시간에만 활성인 전사 조절 요소이다. 조직특이 발현은 예를 들면, 특정 조직에서 폴리뉴클레오티드의 발현이 바람직할 때 유리하다. 발달 조절 하의 조직-특이 프로모터의 예는 식물생장 조직과 같은 특정 조직, 예를 들면, 뿌리 또는 잎, 또는 열매, 배주, 열매, 화분, 피스톨, 꽃 또는 어느 배아 조직과 같은 생식 조직에서만 (또는 우선적으로)전사를 개시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 생식조직 특이 프로모터는 예를 들면, 꽃밥-특이, 배주-특이, 배아-특이, 배젖-특이, 외피-특이, 종자 및 종피-특이, 화분-특이, 꽃잎-특이, 꽃받침-특이, 또는 그들의 조합물 일 수 있다.
적합한 잎-특이 프로모터는 피루베이트, C4 식물 (옥수수)의 오르소포스페이트 디키나아제 (PPDK) 프로모터, 옥수수의 cab-m1Ca+2 프로모터, 애기장대(Arabidopsis thaliana) myb-연관 유전자 프로모터 (Atmyb5), 리불로오스 바이포스페이트 카르복실라아제(RBCS) 프로모터 (예를 들면, 잎과 경-성장(light-grown) 종자에서 발현된 토마토 RBCS 1, RBCS2 및 RBCS3A 유전자, 발달기의 토마토 과실에서 발현되는 RBCS1 및 RBCS2 또는 잎새와 잎집의 잎살 세포에서 고수준으로 배타적으로 발현되는 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제 프로모터)를 포함한다.
적합한 노화-특이 프로모터는 열매 숙성, 노화 및 잎의 이탈 중 활성인 토마토 프로모터, 시스테인 프로테아제를 암호화하는 유전자의 옥수수 프로모터를 포함한다. 적합한 꽃밥-활성 프로모터가 사용될 수 있다. 본 분야의 당업자에게 알려진 적합한 뿌리-특이 프로모터가 선택될 수 있다. 적합한 종자-특이 프로모터는 종자-특이 프로모터(이들 프로모터는 종자 저장 단백질의 프로모터와 같이 종자 발달 중 활성이다)와 종자-발아 프로모터(이들 프로모터는 종자 발아 중 활성이다) 모두를 포함한다. 이와 같은 종자-선호 프로모터는, Cim1 (시토킨-유도 메시지); cZ19B1 (옥수수 19 kDa zein); milps (미오-이노시톨-1-포스페이트 합성효소); Zm-40라고도 알려진 mZE40-2; nuclc; 및 celA (셀룰로스 합성효소)를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. Gama-zein은 배젖-특이 프로모터이다. Glob-1은 배아-특이 프로모터이다. 쌍떡잎식물의 경우, 종자-특이 프로모터는 콩. 베타.-파세올린, 나핀, b-콘글리시닌, 소이빈 렉틴, 크루시페린 등을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 외떡잎식물의 경우, 종자-특이 프로모터는 옥수수 15 kDa 제인 프로모터, 22 kDa 제인 프로모터, 27 kDa 제인 프로모터, g-제인 프로모터, 27 kDa g-제인 프로모터 (gzw64A 프로모터와 같은, Genbank Accession number S78780 참조), 왁시 프로모터, 위축(shrunken) 1 프로모터, 위축 2 프로모터, 글로불린 1 프로모터 (Genbank Accession number L22344 참조), Itp2 프로모터, cim1 프로모터, 옥수수 end1 및 end2 프로모터, nuc1 프로모터, Zm40 프로모터, eep1 및 eep2; lec1, 티오레독신 H 프로모터; mlip15 프로모터, PCNA2 프로모터; 및 위축-2 프로모터를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
유도성 프로모터의 예는 병원균 공격, 혐기조건, 상승된 온도, 빛, 가뭄, 찬 온도, 또는 고염도에 반응성인 프로모터를 포함한다. 병원균-유도 프로모터는 발병-관련 단백질 (PR 단백질)로부터의 프로모터를 포함하고, 이들은 병원체에 의해 감명이 유도된다 (예를 들면, PR 단백질, SAR 단백질, 베타-1,3-글루카나제, 키티나제).
식물 프로모터에 더하여, 다른 적합한 프로모터들이 세균 기원으로부터 유도될 수 있고 (예를 들면, 옥토파인 합성효소 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터 및 Ti 플라스미드로부터 유래된 다른 프로모터들), 또는 바이러스 프로모터로부터 유래될 수 있다 (예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 및 19S RNA 프로모터, 담배 모자이크 바이러스의 구성 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 및 35S 프로모터 또는 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터).
컨쥬게이트된 모이어티의 예는 단백질 (예를 들면, 항체), 지방산 사슬, 당 잔기, 글리코단백질, 폴리머 (예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 이들의 조합물과 같은 거대분자 화합물을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 세포 섭취를 증가시키는 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다.
모이어티의 비-제한적 예는 항체, 폴리펩티드, 콜레스테롤 모이어티와 같은 지질 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-s-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방산, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 포스포리피드, 예를 들면, 디-엑사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1-디-o-헥사데실-rac-글리세로-S-h-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민 또는 렉실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
모이어티는 예를 들면, 길이가 약 1 내지 50 아미노산 잔기인 양으로 하전된 펩티드와 같은, 양으로 하전된 중합체 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 산화물일 수 있다. 적합하기는, 폴리알킬렌 옥사이드와 같은 양으로 하전된 중합체는 방출가능한 링커와 같은 링커를 통해 올리고머에 부착될 수 있다.
NtMRP 폴리펩티드 발현이 측정되는 경우, 세포에서 NrMRP를 암호화하는 mRNA의 양의 검출은 예를 들면, PCR 또는 노던 블로팅에 의해 정량화될 수 있다. 샘플에서 NtMRP 폴리펩티드의 양의 변화를 측정하는 경우, 항-NtMRP 항체의 사용에 의한 NtMRP의 검출은 공지의 기술을 사용하여 세포 중의 NtMRP 폴리펩티드의 양을 정량화하는데 사용될 수 있다. 선택적으로 생리적 활성 (예를 들면, 카드뮴과 같은 중금속 수송)은 시험약제와 접촉 전 후로 측정될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 폴리펩티드와 면역반응성인 항체가 제공된다. NtMRP 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합 폴리펩티드 등이 그것과 면역반응성이 항체를 생산하는데 "면역원"으로 사용될 수 있다. 이와 같은 항체는 구체적으로 항체의 항원-결합 부위를 거쳐 폴리펩티드에 결합된다. 구체적으로 결합 항체는 NtMRP 류 폴리펩티드, 동족체, 및 변이체를 특이적으로 인식하고 그들과 결합할 수 있는 것들이다. 한 구현예에서, 항체는 본 명세서에 기재된 NtMRP 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적이고 다른 폴리펩티드와 교차-반응하지 않는다.
더욱 구체적으로, 폴리펩티드, 단편, 변이체, 융합 폴리펩티드 등은 항체의 형성을 끌어낼 수 있는 항원 결정요인 또는 에피토프를 함유한다. 이들 항원 결정요인 또는 에피토프는 선형 또는 배좌(불연속)일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드의 아미노산의 단일 선택으로 구성될 수 있고, 반면 배좌 또는 불연속 에피토프는 폴리펩티드 접힘에 아주 인접하게 되는 폴리펩티드 사슬의 다양한 영역으로부터 선택된 아미노산들로 구성된다. 에피토프는 공지의 방법 중 어느 것에 의해 동정될 수 있다. 이에 더하여, 폴리펩티드로부터의 에피토프는 조사에서 연구 시약으로 사용될 수 있고, 폴리클로날 혈청과 같은 물질로부터 특이적으로 결합하는 항체 또는 배양된 하이브리도마로부터의 상청액을 정제하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 에피토프 또는 그것의 변이체는 고체상 합성, 화학적 또는 효소적 폴리펩티드 분열과 같은 공지의 기술을 사용하여 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
폴리펩티드에 대한 다클론성 및 단일클론성 항체는 둘 다 통상의 기술로 제조될 수 있다. 폴리펩티드에 특이적인 단일클론성 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 또한 고려할 수 있다. 이와 같은 하이브리도마는 종래의 기술에 의해 생산되고 동정될 수 있다. 항체의 생산을 위해, 다양한 숙주 동물이 NtMRP 폴리펩티드, 단편, 변이체 또는 그들의 돌연변이를 주입함에 의해 면역화될 수 있다. 이와 같은 숙주 동물은, 두서너 가지 예를 들면, 토끼, 마우스와 래트를 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 다양한 애쥬번트가 면역 반응을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 숙주의 종에 따라, 이와 같은 애쥬번트는 프로인트 (완전 및 불완전) 보조액, 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄 겔, 라이솔레시틴과 같은 표면활성물질, 플루론성 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펙 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 포자충과 같은 잠재적으로 융용한 인간 애쥬번트를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 단일클론성 항체는 종래의 기술에 의해 회수될 수 있다. 이와 같은 단일클론성 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, 및 이들의 어느 아류를 포함하여, 어느 면역글로불린 종류 일 수 있다.
항체는 인 비트로 또는 인 비보 중 어느 것에서 폴리펩티드 또는 단편의 존재를 검출하기 위한 조사에 사용될 수 있다. 항체는 또한 면역친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩티드 또는 단편을 정제하는데 사용될 수 있다.
다양한 구현예가 NtMRP 폴리펩티드의 발현 수준이 잎층으로의 카드뮴 수송을 줄이거나 지연시키도록 실질적으로 감소된, 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물, 또한 바이오매스 및 종자를 제공한다.
잎 층은 시가, 궐련과 같은 다양한 흡연 물품, 및 무연 담배 제품(즉, 비-연소)과 같은 다양한 소비품에 병합될 수 있다.
이들 흡연성 물품 및 무연 제품에서 카드뮴 감소%는 비-돌연변이, 비자연발생 또는 비-유전자이식 카운터파트(counterpart)로부터 유래된 소비품과 비교하여, 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 200% 또는 300% 낮은 값일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 이들 흡연 물품 및 무연 제품의 카드뮴 함량은 약 0.01 내지 약 0.05 백만분율 (ppm), 약 0.01 내지 약 0.1 ppm, 약 0.01 내지 약 0.5 ppm, 약 0.01 내지 약 1.0 ppm, 또는 약 0.01 내지 약 5 ppm의 값이다. 몇몇 구현예에서, 이들 흡연 물품 및 무연 제품의 카드뮴 함량은 약 0.001 ppm 이하, 약 0.01 ppm 이하, 또는 약 0.05 ppm 이하 또는 약 0.49 ppm 이하 또는 약 0.5 ppm 이하이다. 식물에서의 카드뮴 축적 정도는 실질적으로 유전형과 생육 환경의 복잡성에 기인하는 여러 계수들에 따라 변할 수 있다. 예를 들면, 야생(field-grown) 담배 잎에서 카드뮴 농도는 농사 기후, 토양 품질, 품종, 및 사용된 비료의 유형과 기원과 같은 요인들에 따라 지극히 변할 수 있다. 더욱이, 담배 식물의 다른 부분들 내에서 상대적인 카드뮴 분포 패턴은 종, 기원/조직, 및 성장 조건 (즉, 야생 대 수중 재배)에 따라 다를 수 있다. 평균적으로, 야생 담배 잎 (주막과 정맥을 포함)에서 측정된 카드뮴 농도는 대략 0.5 내지 5 ppm (백만분률 또는 담배 잎의 건조 중량의 마이크로그램/그램)의 범위일 수 있다. 그러나, 많은 게재된 카드뮴 수준은 통상적으로 담배 제품성숙 단계, 담배 종, 또는 분석을 위해 수확된 (즉, 잎의 잎자리로부터 제거된) 특정 잎 부분을 정의하지 않는다. 몇몇 품종에서, 낮은 곳의 잎이 중간 및 상부 잎보다 더 많은 카드뮴 수준을 축적할 수 있다. 세포내 수준에서, 세포벽, 세포질, 엽록체, 핵, 및 액포를 포함하여, 식물 세포의 다양한 세포 구성성분에서 발견될 수 있다.
더욱이, 담배 잎에서 측정된 카드뮴 농도는 담배 식물이 생장하는 토양 환경에서의 카드뮴 농도에 매우 실질적으로 의존할 수 있다. 카드뮴-오염 영역에서 성장한 담배의 잎은, 대략 0.4 내지 대략 8 ppm 범위의 카드뮴을 축적할 수 있는 비-오염 영역에서 성장한 유전적으로 동일한 카운터파트의 잎과 비교하여 약 35 ppm 이상의 카드뮴을 축적할 수 있다. 카드뮴 오염 영역에서 성장한 잎 안의 액포는 매우 높은 카드뮴 농도를 축적할 수 있다. 기재된 조성물을 관심의 주어진 식물 종에 적합되도록 적용할 방법은 본 분야의 당업자에게 알려져 있다.
식물에서 중금속 농도는 본 분야의 공지의 다양한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직한 방법은 유도성 결합 플라즈마-질량 분광 광도법의 사용을 포함한다 ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
본 발명에 기재된 돌연변이의, 비자연발생 또는 유전자이식 식물은 예를 들면, 농업에서의 다른 용도를 가질 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 돌연변이의, 비자연발생 또는 유전자이식 식물은 동물 사료 및 인간 식품을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 명세서의 식물의 종자는 제조품을 형성하기 위해 본 분야에 알려진 수단에 의해 컨디셔닝되고 포장재에 포장될 수 있다. 종이 또는 천과 같은 포장재는 본 분야에 잘 알려져 있다. 종자의 포장은 라벨, 예를 들면, 포장재에 부착된 태그 또는 라벨, 포장재에 인쇄된 라벨, 또는 포장지에 삽입된 라벨을 포함할 수 있고, 라벨은 그 안에 종자의 특성을 기재한다.
돌연변이 NtMRP 대립형질을 수반하는 식물이 유용한 계통, 변이체 및 혼성화물을 생성하도록 식물 육종 프로그램에서 사용될 수 있다. 특히, 돌연변이 NtMRP 대립형질은 상기 상업적으로 중요한 변이체에 유전자침투될 수 있다. 그러므로, 식물을 육종하는 방법이 제공되고, 이것은 본 발명의 돌연변이 식물, 비자연발생 식물 또는 유전자이식 식물을 다른 유전적 동일성을 포함하는 식물과 교배하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 자손 식물을 또 다른 식물과 교배하고, 그리고 임의로 원하는 유전적 자질 또는 유전적 배경을 갖는 자손이 얻어질 때까지 교배를 반복하는 것을 포함한다. 이와 같은 육종법에 의해 유치되는 하나의 목적은 원하는 유전적 자질을 다른 변이체, 육종 계, 혼성물 또는 품종, 특히 상업적으로 관심있는 것들에 도입하는 것이다. 또 다른 목적은 단일 식물 변종, 계통, 혼성화물 또는 품종에 다른 유전자들의 유전적 변형물의 스태킹을 용이하게 하는 것이다. 종내 뿐만 아니라 종간 교배가 고려된다. 이와 같은 교배로부터 생긴, 육종주로도 불리는 자손 식물은 또한 비자연발생 식물의 예이다.
한 구현예에서, 비자연발생 식물의 생산방법이 제공되고, 상기 방법은: (a) 돌연변이 또는 유전자이식 식물을 제2 식물과 교배하여 자손 종자를 산출하는 단계; (b) 자손 종자를 식물 성장 조건하에서 성장시켜 비자연발생 식물을 산출하는 단계. 상기 방법은 추가로 다음을 포함한다: (c) 비자연발생 식물의 앞선 세대를 자신과 또는 다른 식물과 교배하여 후손 종자를 산출하는 단계; (d) 식물 성장 조건하에서 단계 (c)의 자손 종자를 성장시켜 추가의 비자연발생 식물을 산출하는 단계; 및 (e) 비자연발생 식물의 추가의 세대를 생성하기 위해 단계 (c) 및 (d)의 교배 및 성장 단계를 복수 회 반복하는 단계. 상기 방법은 임의로 단계 (a) 전에, 특성화되고 돌연변이 또는 유전자이식 식물과 동일하지 않은 유전자 동일성을 포함하는 부모 식물을 제공하는 단계를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 육종 프로그램에 따라, 교배 및 성장 단계는 비자연발생 식물의 세대를 발생시키기 위해, 0 내지 2회, 0 내지 3회, 0 내지 4회, 0 내지 5회, 0 내지 6회, 0 내지 7회, 0 내지 8회, 0 내지 9회, 또는 0 내지 10회 반복된다. 역교배는 후손이 그것의 부모 또는 그것의 부모와 유전적으로 유사한 또 다른 식물 중 하나와 교배되어 다음 세대에서 부모의 것과 가까운 유전적 동일성을 갖는 후손 식물을 얻는 방법의 한 예이다. 식물 교배, 특히 담배 식물 육종 기술이 본 분야에 잘 알려져 있고 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명은 이들 방법에 의해 생산된 비자연발생 식물을 추가로 제공한다.
본 발명의 방법의 몇몇 구현예에서, 변종 NtMRP 유전자에 대한 육종 및 스크리닝으로부터 생산된 계가 표준 현장 과정을 사용하는 현장에서 평가된다. 원래의 돌연변이되지 않은 부모를 포함하는 대조 유전형이 포함되고 엔트리를 무작위 완비 블록 설계에서 또는 기타 적절한 현장 설계에서 현장에 배열한다. 담배의 경우, 표준 농경법상 관행이 사용되었고, 예를 들면, 담배를 수확하고, 중량을 측정하고 경화 전 또는 경화 동안 화학적 및 기타 일반적인 시험을 위해 샘플화한다. 자료의 통계적 분석을 수행하여 부모계와 선택계의 유사성을 확인한다. 선택된 식물의 세포유전학적 분석을 임의로 시행하여 염색체 상보성 및 염색체 쌍 관계를 확인한다.
DNA 지문채취, 단일 뉴클레오티드 다형성, 미부수체(microsatellite) 마커, 또는 유사한 기술이 NtMRP 유전자의 돌연변이 대립형질을 다른 담배에 전달 또는 육종하기 위해 마커-보조 선택 육종 프로그램에 사용될 수 있다. 예를 들면, 사육자는 돌연변이 대립형질을 함유하는 유전형을 농업적으로 바람직한 유전형과 혼성화하여 분리집단(segregating population)을 생성할 수 있다. F2 또는 역교배 세대의 식물은 본 발명에 서술된 기술 중 하나를 사용하여, NtMRP 유전 서열 또는 그들의 단편으로부터 전개된 마커를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 대립형질을 소유하는 것으로 동정된 식물들은 스크리닝 될 제2 개체를 생성하도록 역교배 또는 자가수분될 수 있다. 예상되는 유전 패턴 또는 사용된 MAS 기술에 따라, 원하는 개별적인 식물의 동정을 돕기 위한 역교배의 각각의 사이클 전에 선택된 식물들을 자가수분하는 것이 필요하다. 역교배 또는 기타 육종 과정이 반복 부모의 원하는 세포형이 회수될 때까지 반복될 수 있다.
명세서에 따르면, 육종 시스템에서, 성공적인 교배는 생식력이 있는 F1 식물을 산출한다. 선택된 F1 식물은 부모 중 하나와 교배될 수 있고, 그리고 제1 역교배 세대 식물은 자가 수분하여 변종 NtMRP 유전자 발현 (예를 들면, NtMRP 유전자의 공(null) 버전)을 위해 다시 스크리닝 되는 개체를 생산한다. 역교배, 자가 수분 및 스크리닝 공정은 최종 스크리닝이 생식력 있고 회수된 부모와 상당히 유사한 식물을 생산할 때까지 예를 들면, 적어도 4회 반복된다. 필요하다면, 이 식물은 자가수분되고 그리고 자손은 식물이 변종 NtMRP 유전자 발현을 나타냄을 확인하도록 순차적으로 다시 스크리닝 된다. 몇몇 예에서, F2 세대의 식물 개체는 변종 NtMRP 유전자 발현에 대해 스크리닝 되고, 예를 들면, 식물은 본 발명의 NtMRP에 대한 뉴클레오티드 서열 정보를 기준으로 하는 프라이머를 사용한 PCR 방법을 사용하여, 표준 방법에 따른 NtMRP 유전자의 부재로 인해 NtMRP를 발현시키지 못한다고 확인된다. 혼성 변이체는 제1 변종의 자성(female) 부모 식물 (즉, 종자 부모)의 자가수분을 막고, 제2 변종의 웅성(male) 부모 식물로부터의 화분이 자성 부모 식물을 수정시키도록 하고, 그리고 F2 혼성 종자가 웅성 식물에서 형성되도록 함으로써 생산될 수 있다. 자성 식물의 자가수분은 꽃 발달의 초기 단계에서 꽃을 무력화시킴에 의해 막을 수 있다. 선택적으로, 화분 형성은 웅성 불임의 형태를 사용하여 자성 부모 식물에서 막을 수 있다. 예를 들면, 웅성 불임은 세포질 웅성 불임 (CMS) 또는 유전자이식 웅성 불임을 사용하여 생산될 수 있고, 여기서 유전자이식은 작은 홀씨형성 및/또는 화분 형성, 또는 자기-불화성을 억제한다. CMS를 함유하는 자성 부모 식물이 특히 유용하다. 자성 부모 식물이 CMS인 구현예에서, 화분을 웅성 생식 식물로부터 수확하고 CMS 자성 부모 식물의 암술머리에 손으로 적용시키고, 그리고 생성된 F1 종자를 수확한다.
본 발명의 변종 및 계통은 단교배 F1 혼성화물을 형성하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같은 구현예에서, 부모 변종의 식물은 웅성 부모 식물로부터 자성 부모 식물로 천연 타가수분이 용이하도록 실질적으로 동종의 인접한 개체로서 성장될 수 있다. 자성 부모 식물로부터 형성된 F1 종자는 선택적으로 종래의 수단에 의해 수확된다. 또한 두 부모 식물 변종을 대량으로 성장시키고 자가수분의 결과로서 자성 부모에서 형성된 F1 혼성 종자와 웅성 부모에서 형성된 종자의 블렌드를 수확할 수 있다. 선택적으로, 3-방식 가교가 수행될 수 있고 여기서 단일-교배 F1 혼성화물이 자성 부모로서 사용될 수 있고 다른 웅성 부모와 교배될 수 있다. 또 다른 선택으로서, 이중교배 혼성화물이 생성될 수 있고 여기서 두 가지의 다른 단일-교배의 F1 자손이 스스로 교배된다.
돌연변이의, 비자연발생 또는 유전자이식 식물의 개체를, 원하는 특질 또는 표현형을 갖는 개체의 맴버들에 대해 스크리닝 또는 선택할 수 있다. 예를 들면, 단일 형질전환 사상의 자손의 개체를 NtMRP 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 원하는 수준의 발현을 갖는 이들 식물에 대해 스크리닝할 수 있다. 물리적 및 생화학적 방법이 발현 수준을 확인하는데 사용될 수 있다. 이들 방법은 폴리뉴클레오티드의 검출을 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; RNA 전사체를 검출하기 위한 노던 블로팅, S1 RNase 보호, 프라이머-연장, 또는 RT-PCR 증폭; 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소 분석; 및 폴리펩티드를 검출하기 위한 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블로팅, 면역침강, 및 효소-링크 면역 조사를 포함한다. 인 시츄 혼성화, 효소 염색, 및 면역 염색과 같은 다른 기술들이 또한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 발현을 검출하는데 사용될 수 있다.
돌연변이의, 비자연발생 또는 유전자이식 식물 세포 및 세포가 본 발명에 기재되고 이것은 하나 이상의 단리된 NtMRP 폴리뉴클레오티드와 같은 하나 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 구축물, 하나 이상의 이중가닥 RNA, 하나 이상의 컨쥬게이트 또는 하나 이상의 벡터/발현벡터를 포함한다.
NtMRP의 발현은, 예를 들면, RT-PCR, 노던 블로팅, RNase 보호, 프라이머 연장, 웨스턴 블로팅, 단백질 겔 전기영동, 면역침강, 효소-링크된 면역분석, 칩 분석 및 질량 스펙트럼을 포함하는 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 폴리펩티드가 조직-특혜적 또는 광범위하게 발현하는 프로모터의 조절하에 발현된다면, 발현은 전체 식물에서 또는 선택된 조직에서 평가될 수 있다는 것을 명심하라. 유사하기는, 폴리펩티드가 특정 시간에, 예를 들면, 발달의 특정 시간에 또는 유도 후에 발현된다면, 발현은 원하는 시기에 선택적으로 평가될 수 있다.
제한됨 없이, 본 발명의 식물은 NtMRP의 발현 또는 활성이 조절(예를 들면, 감소 또는 억제)되기 전 또는 후에 다른 목적을 위해 변형될 수 있다. 다음의 유전적 변형 중 하나 이상이 돌연변이의, 비자연발생 또는 유전자이식 식물에 존재할 수 있다. 한 구현예에서, 중금속 섭취 또는 중금속 수송에 관여하는 하나 이상의 추가의 유전자가 변형되어, 식물 또는 (잎과 같은) 식물의 일부가 변형되지 않은 대조 식물 또는 그것의 일부에서보다 낮은 중금속 함량을 가질 수 있다. 비제한적인 예는 양이온 확산 촉진제(CDF) 류, Zrt-, Irt-유사 단백질 (ZIP) 류, 양이온 교환기 (CAX) 류, 구리 수송체 (COPT) 류, 중금속 P-형 ATPases (WO2009074325에 기재된 바와 같은, HMAs) 류, 천연 내성-연관 마크로파아지 단백질의 동족체 류(NRAMP), 및 ATP-결합 카세트(ABC) 수송자의 류의 또 다른 맴버를 포함하고, 이것은 카드뮴과 같은 중금속의 수송에 참여한다. 본 발명에 사용되는 용어 중금속은 전이금속을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 질소함유 대사성 중간체의 전환에 포함되는 하나 이상의 유전자가 변형되어 식물 또는 (잎과 같은) 식물의 일부가, 가열되었을 때, 대조 식물 또는 그것의 일부보다, 적어도 하나의, 낮은 수준의 담배-특이 니트로사민(예를 들면, 4-(메틸니트로사미노)-1-(3-피리딜)-1-부타논, N-니트로소노르니코틴, N-니트로소아나타빈, 및 N-니트로소아나바신)을 생산한다. 변형될 수 있는 유전자의 비제한적인 예는
니코틴의 노르니코틴으로의 전환에 참여하고 WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 및 PCT/US2011/021088에 개시되어 있는 CYP82E4, CYP82E5 및 CYP82E10와 같은, 니코틴 디메틸라제를 암호화하는 유전자를 포함한다. 다른 변형의 예는 제조제 내성을 포함하고, 예를 들면, 글리포세이트는 다양한 스펙트럼의 제초제의 활성성분이다. 글리포세이트 내성 유전자이식 식물은 aroA 유전자 (Salmonella typhimurium 및 E. coli로부터의 글리포세이트 EPSP 합성효소)의 전달에 의해 진행된다. 술포닐우레아 내성 식물은 아라비도프시스(Arabidopsis)로부터 돌연변이 ALS (acetolactate synthetase)를 형질전환함에 의해 생성된다. 돌연변이 Amaranthus hybridus 로부터의 포토시스템 II의 OB 단백질은 아트라진 내성 유전자이식 식물을 생산하기 위해 식물로 수송되었고; 그리고 브로목시닐 내성 유전자이식 식물은 폐렴 간균(Klebsiella pneumoniae )으로부터 bxn g유전자를 병합함으로써 생산되었다. 또 다른 예시적인 변형은 곤충에 내성인 식물을 가져온다. 투린지네시스균 (Bacillus thuringiensis ; Bt) 독소는 최근 브로콜리에서 설명된 바와 같이, Bt-내성 해충의 출현을 연기시키는 효과적인 방법을 제공할 수 있고, 여기서 플라즈미드 cry1Ac 및 cry1C Bt 유전자는 단일 단백질에 대한 배추좀나방(diamondback moths) 내성을 제어하고 내성 곤충의 진화를 상당히 지연시킨다. 또 다른 예시적인 변형은 식물이 병원균(예를 들면, 바이러스, 세균, 균류)에 의해 발생한 질병에 내성이 되도록 한다. Xa21 유전자를 발현하는 식물(세균성 마름병에 대한 내성)과 Bt 융합 유전자와 키티나제 유전자 둘 다를 발현하는 식물(노란명반나비에 대한 내성 및 sheath에 대한 내성)을 엔지니어링하였다. 또 다른 예시적 변형은 웅성 불임과 같은 변형된 생식 능력을 가져온다. 또 다른 예시적인 변형은 식물을 비생물적 스트레스 (예를 들면, 가뭄, 온도, 염도)에 견디도록 하고, 내성 유전자이식 식물은 아라비도프시스로부터 아실글리세롤 포스페이트 효소의 전송에 의해 생산되었고; 만니톨과 소르비톨의 합성에 관여하는 만니톨 디하이드로게나제 및 소르비톨 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자는 가뭄 내성을 향상시킨다. 또 다른 예시적인 변형은 식물이 인간에 사용할 수 있는 좋은 면역원성 특성을 갖도록 한다. 예를 들면, N-글리칸에 알파-1,3-링크된 푸코스 잔기, 베타-1,2-링크된 크실로스 잔기 또는 둘 다가 실질적으로 결핍된 단백질을 생산할 수 있는 식물이 사용될 수 있다. 또 다른 예시적인 변형은 단백질과 오일 저장이 개선된 식물, 개선된 광합성 효능을 갖는 식물, 연장된 보관기간을 갖는 식물, 탄수화물 함량이 개선된 식물 및 균류에 대해 내성인 식물; 알칼로이드의 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 식물을 가져올 수 있다. S-아데노실-L-메티오닌 (SAM) 및/또는 시스타이오닌 감마-합성효소 (CGS)의 발현이 조절된 유전자 이식 식물이 또한 고려된다.
제한 없이, 본 발명의 식물들은 추가로 변형될 수 있다. 이와 같은 추가의 변형의 예는 다음을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다 : (a) 제초제에 내성을 갖는 식물, 예를 들면, 글리포세이트는 많은 광범위한 제초제의 활성 성분이다. 글리포세이트 내성 유전자이식 식물은 aroA 유전자(Salmonella typhimurium 및 E. coli 로부터 글리포세이트 EPSP 합성효소)를 수송함에 의해 개발되었고; 술포닐우레아 내성 식물은 아라비도프시스로부터의 돌연변이 ALS (acetolactate synthetase) 유전자를 형질전환에 의해 생산되었고; 돌연변이 아마란투스 하이브리두스(Amaranthus hybridus)로부터 포스포시스템 II의 OB 단백질은 아트라진 내성 유전자이식 식물을 생산하기 위한 식물로 수송되었고; 그리고 브로목시닐 내성 유전자이식 식물은 폐렴간균( Klebsiella pneumoniae )로부터의 bxn 유전자를 병합함으로써 생산된다); (b) 곤충에 내성인 식물, 튜린지엔시스 균(Bacillus thuringiensis : Bt) 독소는 Bt-내성 해충의 출현을 연기시키는 효과적인 방식을 제공할 수 있고, 최근 브로콜리에서 설명된 바에 따르면 여기서 피라미드된 cry1Ac 및 cry1C Bt 유전자는 단일 단백질에 대한 배추좀나방 내성을 조절하고 내성 곤충의 진화를 상당히 연기시킨다; (c) 바이러스에 내성인 식물, 담배 모자이크 바이러스 식물은 바이러스 코트 단백질을 도입함에 의해 생산되었다. 다른 바이러스 내성 유전자이식 식물은 담배 바이러스 내성 감자 식물, RSV 내성 벼, 및 YMV 내성 검은 녹두 및 청색 녹두를 포함한다; (d)세균에 내성인 식물, Bt 융합 유전자 및 키티나제 유전자 둘 다를 발현하는 식물 (노란명반나비에 대한 내성 및 칼집에 내한 내성)과 함께 Xa21 유전자를 발현하는 식물 (세균성 마름병에 대한 내성)이 엔지니어링되었다; (e) 스트레스 내성 유전자 이식 식물: 차고 관대한 유전자이식 식물이 아라비도프시스로부터의 아실 글리세롤 포스페이트를 이송함에 의해 생산되었다; 만니톨과 소르비톨의 합성에 관여하는 만니톨 디하이드로게나제와 소르비톨 디하이드로게나제를 암호화하는 유전자가 가뭄 내성을 향상시킨다; (f) 인간에게 사용하기에 호의적인 면역원성 특성을 갖는 단백질을 생산하는 식물, 예를 들면, 알파-1,3-링크 푸코스 잔기, 베타-1,2-링크 자일로스 잔기, 또는 둘 다가 그것의 N-글리칸에 실질적으로 부족한 단백질을 생산할 수 있는 단백질이 사용될 수 있다; 그리고 (g)다른 유전자 이식 식물의 예는, 개선된 저장 단백질 및 오일을 갖는 식물, 광합성 효율이 증가된 식물, 보관 기간이 늘어난 식물, 탄수화물 함량이 개선된 식물 및 균류에 대해 내성인 식물; 알킬로이드의 생합성이 포함되는 효소를 암호화하는 식물; 세균성 유기 수은 알콜중독치료 경로를 위한 유전자(수는 환원 효소, merA) 및 유기 수은 화합물 리아제, merB를 아라비도프시스에서 교배하여 결합하였고, 그리고 두 유전자를 발현하는 식물은 야생형 식물보다 50-배 높은 메틸수은 농도에서 성장할 수 있었다.
하나 이상의 이러한 특성은 또 다른 담배 품종의 돌연변이의, 비자연발생 또는 유전자이식 담배 식물로 침투될 수 있고 또는 그것으로 직접 형질전환될 수 있다. 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자 이식 담배 식물로의 특성의 침투는 본 분야에 알려진 식물 육종의 어느 방법에 의해 달성될 수 있고, 예를 들면, 계통육종법, 역교배, 이중게놈-반수체(doubled-haploid) 육종법 등이다 (Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development . Crop Species . W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp. 참조). 상기의 분자 생물학-기반 기술, 특히 RFLP 및 마이크로세틀라이트 마커가 이와 같은 역교배에서 현재 부모와의 최고의 유전적 동일성을 갖는 자손을 동정하는데 사용될 수 있다. 이것은 현재 부모와 적어도 90%, 바람직하기는 적어도 95%, 더욱 바람직하기는 적어도 99% 유전적 동일성을 갖고 공여자 부모로부터 침투된 특성을 더욱 포함하는 변종들의 생산을 가속한다. 이와 같은 유전적 동일성의 결정은 본 분야에 알려진 분자 마커를 기준으로 할 수 있다.
가장 최근의 역교배 세대는 이동되는 폴리뉴클레오티드에 대한 순수한 육종 자손을 제공할 수 있다. 생성된 식물은 이동된 특성에 더하여, (예를 들면, 하나 이상의 단일 유전자 특성) 일반적으로 돌연변이의, 비자연발생 또는 유전자이식 식물의 형태학적 및 생리학적 특성을 본질적으로 모두 갖는다. 정확한 역교배 프로토콜은 적절한 시험 프로토콜을 결정하기 위해 선택되는 특성에 따를 것이다. 비록 역교배법이 전이될 특성이 우세한 대립형질일 때는 단순하지만, 열성 대립형질이 또한 전이될 수 있다. 이 경우, 바람직한 특성이 성공적으로 수송되었는지를 결정하기 위해 후손에 시험을 도입하는 것이 필요할 수 있다.
다양한 구현예가 돌연변이 식물, 비자연발생 식물, 또는 유전자이식 식물뿐 아니라 NtMRP 폴리펩티드의 발현 수준이 감소되어 소량의 카드뮴이 그 안에 축적된 바이오매스를 제공한다.
이와 같은 식물의 일부, 특히 담배 식물, 그리고 더욱 바람직하기는 담배 식물의 잎 층 및 주맥은, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 에어로졸 형성 재료, 에어로졸 형성 장비, 흡연 물품, 흡연가능한 물품, 무연 제품 및 담배 제품을 포함하는 다양한 소비품에 병합되거나 또는 제조에 사용될 수 있다. 에어로졸 형성 재료의 예는 담배 조성물, 담배, 담배 추출물, 절단 담배, 절단 필러, 경화된 담배, 확대된 담배, 균일화된 담배, 재구성 담배 및 파이프 담배를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 흡연 물품 및 흡연가능 물품은 에어로졸 형성 장비의 형태이다. 흡연 물품 및 흡연가능 물품의 예는 궐련, 가는 담배, 및 시가를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 무연 제품의 예는 씹는 담배, 및 스누프를 포함한다. 특정 에어로졸 형성 장비에서, 연소보다는, 담배 조성물 또는 또 다른 에어로졸 형성 재료가 에어로졸을 생산하기 위한 하나 이상의 전기 가열 요소에 의해 가열된다. 또 다른 유형의 가열된 에어로졸 형성 장비에서, 에어로졸은 연소 연료 요소 또는 가열원으로부터 물리적으로 분리된 에어로졸 형성 재료로 열이 전달됨에 의해 생산되고, 상기 재료는 열원의 내부에, 주변에 또는 하류에 위치할 수 있다. 무연 담배 제품 및 다양한 담배-함유 에어로졸 형성 재료는, 플레이크, 필름, 탭, 발포체 또는 비드와 같은 어느 포멧의 다른 성분들과 함께 결합하여, 또는 그 위에 놓여, 혼합하여, 둘러싸인, 건조 입자, 조각, 분말,또는 슬러리를 포함하여, 어느 형태의 담배를 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바에 따르면, 용어 '연기'는 궐련과 같은 흡연물품에 의해 생산된 또는 에어로졸 형성 재료를 연소함에 의해 생산된 에어로졸의 형태를 설명하는데 사용된다.
한 구현예에서, 본 발명에 기재된 돌연변이의, 유전자이식 및 비자연발생 담배 식물로부터의 경화된 재료가 제공된다. 녹색 담배 잎의 경화 과정은 본 분야의 당업자에게 알려져 있고, 제한됨 없이 공기-경화, 불-경화, 연도-경화 및 햇빛-경화를 포함한다. 녹색 담배 잎의 경화 과정은 수확된 담배의 유형에 따른다. 예를 들면, 버지니아 플루(브라이트) 담배는 통상적으로 플루-경화되고, 버얼리 및 특정 다크종은 보통 공기-경화되고, 파이프 담배, 씹는 담배 및 스누프는 보통 불-경화된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 돌연변이 담배식물, 유전자이식 담배 식물 또는 비자연발생, 바람직하기는 경화된 잎을 포함하는 담배-함유 에어로졸 형성 재료를 포함하는 담배 제품이 기재된다. 본 발명의 담배 제품은 추가로 변형되지 않은 담배를 포함할 수 있는 혼합 담배 제품일 수 있다.
돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물은 또 다른 용도, 예를 들면, 농업에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물은 동물 사료 또는 인간 식품을 만드는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이, 비자연발생 식물 또는 유전자이식 식물을 경작하고, 그리고 경작된 식물로부터 종자를 수집하는 것을 포함하는 종자를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 식물의 종자는 본 분야의 공지의 수단에 의해 컨디셔닝되고 포장재에 넣어져 제품을 형성할 수 있다. 종이나 천과 같은 포장재는 본 분야에 알려져 있다. 종자 포장은 그 안의 종자의 특성을 설명한 라벨, 예를 들면, 포장재에 부착된 태그 또는 라벨, 포장재에 인쇄된 라벨, 또는 포장 내에 삽입된 라벨을 가질 수 있다.
식물을 동정, 선택 또는 육종을 위해 유전자형을 위한 조성물, 방법 및 키트는 본 명세서에 포함되어 있고 폴리뉴클레오티드 샘플에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 존재를 측정하는 수단을 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 적어도 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 일부를 특이적으로 증폭하기 위한 하나 이상의 프라이머와 증폭 또는 검출을 수행하기 위한 하나 이상의 프로브 및 임의로 하나 이상의 시약을 포함한다.
따라서, NtMRP 폴리뉴클레오티드에 상응하는 약 10 이상의 연속 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브가 기재된다. 상기 프라이머 또는 프로브는 NtMRP 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 (예를 들면 특이적으로 혼성화되는 약 15, 20, 25, 30, 40, 45 또는 50 이상의 연속 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이루어질 수 있다. 몇몇 구현예에서, 프라이머 또는 프로브는 약 10 내지 50 연속 뉴클레오티드, 약 10 내지 40 연속 뉴클레오티드, 약 10 내지 30 연속 뉴클레오티드 또는 약 15 내지 30 연속 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 이루어질 수 있고, 이들은 유전자 동정 (예를 들면, 서던 혼성화) 또는 단리 (예를 들면, 인 시츄 혼성화 또는 세균 콜로니 또는 박테리오파아지 플라그) 또는 유전자 검출 (예를 들면, 폴리뉴클레오티드 증폭 또는 검출에서 하나 이상의 증폭 프라이머로서)의 서열-의존 방법에 사용된다. 하나 이상의 특이 프라이머 또는 프로브가 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부를 증폭하거나 검출하기 위해 고안될 수 있고 사용될 수 있다. 구체적인 예로서, 두 가지 프라이머가 폴리머라제DMA 또는 RNA와 같은 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 단편을 증폭하기 위한 폴리머라제 사슬 반응 프로토콜에 사용될 수 있다. 폴리머라제 사슬 반응은 또한, NtMRP 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래된 제1 프라이머와 NtMRP 프로모터 서열, mRNA 전구체의 3' 말단 또는 벡터로부터 유래된 서열과 같은, NtMRP 폴리뉴클레아제 서열의 상류 또는 하류 서열에 혼성화되는 제2 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 인 비트로 폴리뉴클레오티드 증폭에 사용되는 열적 및 등온 기술의 예가 또한 본 분야에 알려져 있다. 샘플은 식물, 식물 세포 또는 식물 재료 또는 식물로부터 제조되거나 유래된 제품이거나 또는 그로부터 유래될 수 있고, 상기 식물 세포 또는 식물 재료는 본 발명에 기재된다.
그러므로, 추가의 면에서, 다음 단계를 포함하는 샘플에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법이 제공된다: (a) 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 또는 포함하는 것으로 추정되는 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플을 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 또는 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (c) 증폭 산물의 존재를 검출하는 단계, 여기서 증폭 산물의 존재는 샘플에서 NtMRP 폴리펩티드의 존재를 표시한다. 추가의 면에서, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 또는 프로브의 용도를 제공한다. NtMRP 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 특이적으로 검출하기 위한 하나 이상의 프라이머 또는 프로브를 포함하는, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부를 검출하기 위한 키트가 또한 제공된다. 상기 키트는 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)과 같은 폴리뉴클레오티드 증폭을 위한 시약, 또는 서던 블로팅, 노던 블로팅, 인 시츄 혼성화 또는 마이크로분석과 같은 폴리뉴클레오티드 프로브 혼성화 검출술에 사용되는 시약을 포함할 수 있다. 키트는 웨스턴 블로팅, ELISAs, SELDI 질량 분석기 또는 시험 스트립과 같은 항체 결합-검출을 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 DNA 서열화를 위한 시약을 포함할 수 있다. 키트는 카드뮴과 같은 중금속을 측정하기 위한 시약 및/또는 지시사항을 포함할 수 있다. 몇몇 경우, 키트는 기재된 하나 이상의 방법에 대한 지시사항을 포함할 수 있다. 기재된 키트는 유전적 동일성 결정, 계통발생 연구, 유전형, 배체형(haplotyping), 계통 분석 또는 특히 공동-우세 스코어링으로 특정한 식물 육종에 유용하다.
본 발명은 NtMRP 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물, 식물 세포 또는 식물 재료의 유전자형(genotyping)법을 제공한다. 유전자형은 염색체 쌍의 상동성을 구별하는 방법을 제공하고 식물 개체군에서 분리자를 구별하는데 사용될 수 있다. 분자 마커법은 계통발생 연구, 작물 변종 중 유전적 관계를 특성화, 교배적 또는 체세포 잡종의 동정, 단일유전자 특성에 영향을 미치는 염색체 단편의 국소화, 맵 기재 클로닝, 및 정량적 유전의 연구에 사용될 수 있다. 유전자형의 구체적인 방법은 증폭 단편 길이 다형성(AFKPs)를 포함하여, 다양한 분자 마커 분석술을 사용할 수 있다. AFLPs는 뉴클레오티드 서열 변동성에 의해 증폭된 단편들 사이의 대립형질 차이의 산물이다. 그러므로, 이들 기술에 AFL 분석물로 사용되는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에 유전적으로 연결된 염색체 서열뿐 아니라 NtMRP의 분리에 따른 수단이 제공된다.
본 발명은 추가로 다음의 실시예에서 기재되고, 이것은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
다음의 실시예들은 예로서 제공되는 것으로 이것으로 제한하려는 것은 아니다. 다른 언급이 없는 한, 분자 생물학, 식물 생물학, 생물정보학 및 식물 육종의 종래의 기술과 방법이 적용된다.
실시예 1: NtMRP3 DNA의 게놈 서열의 동정
담배 BAC 라이브러리. 박테리아 인공 염색체 (BAC) 라이브러리를 다음과 같이 제조하였다: 니코티아나 타바쿰 변종 힉스 브로드 리프(Hicks Broad Leaf)의 온실 성장 식물의 잎에서 핵을 단리하였다. 고분자량 DNA를 표준 프로토콜에 따라 핵으로부터 단리하고 BamHI 및 HindIII으로 부분적으로 소화시키고 그리고 BAC 벡터 pINDIGO5의 BamHI 또는 HindIII 부위에서 클로닝하였다. 평균길이가 135 메가 염기쌍으로 담배 게놈의 대략 9.7배를 포함하는 320,000 이상의 클론을 얻었다.
담배 게놈 서열 어셈블리. 무작위로 뽑은 다수의 BAC 클론을 평균길이 550 염기쌍의 1,789,999 가공하지 않은 서열을 발생하는 생거법을 사용하여 서열화에 제출하였다. 대장균 (Escherichia coli )의 Mcr+ 균주를 사용하여 메틸 필터링을 적용하여 형질전환하였고 오직 하이포메틸화된 DNA 만을 단리하였다. 모든 서열을 CELERA 게놈 어셈블러를 사용하여 어셈블리하였고 200,000 이상의 콘티그(contig) 및 596,9780 단일 서열을 포함하는 800,000 이상의 서열을 산출하였다. 콘티그 크기는 평균 길이 1,000 염기쌍인 120 내지 15,300 염기쌍 사이였다.
NtMRP DNA의 게놈성 서열을 NtMRP3 DNA를 포함하는 게놈의 일부를 함유하는 ABC를 서열화하여 동정하였다. 서열을 도 6에 나타내었다.
실시예 2: NtMRP3 RNAi 발현 벡터를 갖는 담배 변종의 형질전환
담배 종자를 살균하고 5 ml/L 식물 방부제 혼합물 (PPM)이 보충된 MS 기본 배지를 함유하는 기본 페트리 디쉬에서 발아시켰다. 발아 후, 대략 7 내지 10일에 묘목을 선택하여 다양한 NtMRP RNAi 발현 벡터로 형질전환시켰다. 아그로박테리움 Agrobacterium tumefaciens LBA4404의 단일 콜로니에 50　mg/l 카나마이신 (kanamycin mono sulphate)을 함유하는 액체 LB 매질로 접촉시키고, 48시간 동안 28℃에서 상호 흔들면서 배양하였다 (150 사이클/분). 배양된 세포를 원심분리 (6000×g, 10분)로 수집하고, 그리고 20g-1 슈크로스를 함유하는 액체 MS 매질 20 ml를 사용하여, 최종 밀도 0.4-0.7 OD600로 현탁시켰다. 7~10일 묘목 외식편을 5분 동안 세균 현탁액에 담그고, 멸균필터종이에 블로팅하였다. 50 개 외식편을 100 mm X 20 mm 페트리 디쉬에 REG 아가 배지( 0.1 mg l-1 1-나프탈렌아세트산 (NAA) 및 1 mg l-1 벤질아미노퓨린 (BAP)이 보충된 MS 기본 매질)의 40 ml 부분표본에 놓았다. 외식편을 25℃에서 아구로박테리움과 공동 재배하였다. 공동-재배 3일 후, 외식편을 세척하고 RCPK 매질 (100 mg-1 카나마이신, 500　mg　l-1 카르베니실린 및 5ml PPM을 갖는 REG 매질)로 이송하여 형질전환을 위해 선택하였다. 외식편을 매 2주마다 서브배양하였다. 선택적 조건하에서 8~12주 성장 후, 그들의 게놈으로 NtMRP RNAi 발현 구축물을 병합시킨 형질변환체를 나타내는 생존 식물을 발근(rooting) 매질(100 mg l-1 카나마이신이 보충된 MS 기본 매질)로 이송하였다. 발근 식물을 포트에 옮기고 추가 성장을 촉진시켰다.
실시예 3: 담배 식물에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현
NtMRP3 폴리펩티드의 발현을 측정하기 위해, 전체 세포 RNA를 식물의 다양한 부분으로부터 단리하였다. 전체 RNA를 TRI® 시약 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하여 단리하였다. DNA 불순물을 제거하기 위해, 정제된 RNA를 RNase-프리 DNase (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX)로 처리하였다. 첫번째 cDNA 가닥을 합성하기 위해, 전체 RNA의 대략 10 ㎍을 고용량 cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 역전사하였다. 샘플에서의 NtMRP3 전사체의 수준을 측정하기 위해, 정량적 2-단계 RT-PCR를 Taqman MGB 프로브-기준 화학에 따라 수행하였다. RT 혼합물은 4 μM dNTP 믹스, 1X 랜덤 ㅍ프라이머, 1X RT 온충액, 10 g cDNA, 50U Multiscribe 역전사효소(Applied Biosystems), 2U Superase-In RNase 억제제 (Ambion), 및 뉴클레아제-프리 물을 함유한다. PCR 혼합물은 1X Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM 전방 프라이머, 400 nM 역 프라이머, 250 nM Taqman MGB 프로브, cDNA 2 ng, 및 뉴클레아제-프리 물을 함유한다. RT-PCR을 ABI 7500 리얼-타임 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 증폭 조건하에서 수행하였다: 50℃ 2분; 95℃ 10분; 95℃ 15초 40 사이클; 및 60℃ 1분.
실시예 4: 담배 식물에서 NtMRP 뉴클레오티드 발현의 침묵(Silencing)
추정 NtMRP3 전사체를 암호화하는 첫번째 부분 서열을 Tobacco Genome Initiative (TGI) 주석을 사용하여 발견하였다. 이 특별한 서열로부터, 프라이머를 RNAi 접근법을 사용하여 담배에서 침묵 NtMRP3 폴리뉴클레오티드 발현을 생성하였다. 상응하는 NtMRP3 RNAi 서열을 cDNA로부터 RT-PCR에 의해 증폭하였고, 그리고 나서 사용자 지침에 따라(Invitrogen) 엔트리 벡터를 거쳐 Gateway 벡터 pB7GWIWG2(II)에 삽입하였다. 이 벡터는 식물의 모든 조직에서 유전자 이식의 구성 발현에 대한 프로모터(칼리플라워 모자이크 바이러스 CaMV 35S 프로모터)와 아가 플레이트 상의 Basta(30 mg/ml)를 사용한 제초제 선택을 위한 막대 유전자를 함유한다. 그리고 나서 구축물을 전형적인 잎 디스크 과정을 사용하여 아가로박테리움 우메파사이엔스 (Agrobacterium tumefasciens )를 거쳐 버얼리 종 담배 KY14의 게놈에 삽입하였다. 캘리로부터, 개개의 계통을 재생하였고 Basta에서 선택하였다. RNAi 침묵 계통을 RT-PCR에 의해 모니터하고 종자 생산을 위해 성장시켰다. T1 종자를 수집하고, 선택을 위해 Basta-함유 아가 플레이트 상에서 재-성장시키고, 내성 식물을 현장에서 경작하기 전에 플로팅 트레이에서 성장시켰다.
식물 대략 500 mg을 세척하고 마이크로웨이브-가속 반응 시스템으로 진한 HNO3 10 ml에서 소화시켰다 (CEM corporation, Mathews, NC). 중금속 농도를 유도성 결합 플라즈마-질량 스펙트럼을 사용하여 분석하였다("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). 비-유전자이식 담배 제조로서, 광택-보장, 버지니아 담배 잎, CTA-VTL-2로 이루어진 샘플을 비슷한 조건에서 제조하였다.
실시예 5: NtMRP4 DNA의 게놈 서열 동정
NtMRP4 DNA의 게놈성 서열을 NtMRP4 DNA를 포함하는 게놈의 일부를 함유하는 BAC를 서열화하여 동정하였다. 서열을 도 1에 나타내었다.
실시예 6: NtMRP4 RNAi 발현 벡터를 사용한 담배 변종의 형질전환
담배 종자를 살균하고 5 ml/L 식물 방부제 혼합물 (PPM)이 보충된 MS 기본 배지를 함유하는 기본 페트리 디쉬에서 발아시켰다. 발아 후, 대략 7 내지 10일에 묘목을 선택하여 다양한 NtMRP RNAi 발현 벡터로 형질전환시켰다. Agrobacterium tumefaciens LBA4404의 단일 콜로니에 50　mg/l 카나마이신 (kanamycin mono sulphate)을 함유하는 액체 LB 매질에 접촉시키고, 48시간 동안 28℃에서 상호 흔들면서 배양하였다 (150 사이클/분). 배양된 세포를 원심분리 (6000×g, 10분)로 수집하고, 그리고 20g-1 슈크로스를 함유하는 액체 MS 매질 20 ml를 사용하여, 최종 밀도 0.4-0.7 OD600로 현탁시켰다. 7~10일 묘목 외식편을 5분 동안 세균 현탁액에 담그고, 멸균필터종이에 블로팅하였다. 50개 외식편을 100 mm X 20 mm 페트리 디쉬에 REG 아가 배지( 0.1 mg l-1 1-나프탈렌아세트산 (NAA) 및 1 mg l-1 벤질아미노퓨린 (BAP)이 보충된 MS 기본 매질)의 40 ml 부분표본에 놓았다. 외식편을 25℃에서 Agrobacterium와 공동 재배하였다. 공동-재배 3일 후, 외식편을 세척하고 RCPK 매질 (100 mg-1 카나마이신, 500　mg　l-1 카르베니실린 및 5ml PPM을 갖는 REG 매질)로 이송하여 형질전환을 위해 선택하였다. 외식편을 매 2주마다 서브배양하였다. 선택적 조건하에서 8~12주 성장 후, 그들의 게놈으로 NtMRP RNAi 발현 구축물을 병합시킨 형질변환체를 나타내는 생존 식물을 발근 매질(100 mg l-1 카나마이신이 보충된 MS 기본 매질)로 이송하였다. 발근된 식물을 포트에 옮기고 추가 성장을 촉진시켰다.
실시예 7: 담배 식물에서 NtMRP5 폴리뉴클레오티드의 발현
NtMRP4 폴리펩티드의 발현을 측정하기 위해, 전체 세포 RNA를 식물의 다양한 부분으로부터 단리하였다. 전체 RNA를 TRI® 시약 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하여 단리하였다. DNA 불순물을 제거하기 위해, 정제된 RNA를 RNase-프리 DNase (TURBO DNA-free, Ambion, Austin TX)로 처리하였다. 첫번째 cDNA 가닥을 합성하기 위해, 전체 RNA의 대략 10 ㎍을 고용량 cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 역전사하였다. 샘플에서의 NtMRP3 전사체의 수준을 측정하기 위해, 정량적 2-단계 RT-PCR를 Taqman MGB 프로브-기준 화학에 따라 수행하였다. RT 혼합물은 4 μM dNTP 믹스, 1X 랜덤 프라이머, 1X RT 완충액, 10 g cDNA, 50U Multiscribe 역전사효소(Applied Biosystems), 2U Superase-In RNase 억제제 (Ambion), 및 뉴클레아제-프리 물을 ㅎ함유한다. PCR 혼합물은 1X Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 400 nM 전방 프라이머, 400 nM 역 프라이머, 250 nM Taqman MGB 프로브, cDNA 2 ng, 및 뉴클레아제-프리 물을 함유한다. RT-PCR을 ABI 7500 리얼-타임 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 증폭 조건하에서 수행하였다: 50℃ 2분; 95℃ 10분; 95℃ 15초 40 사이클; 및 60℃ 1분.
꽃잎, 수술, 암술, 꽃받침, 줄기, 잎 및 뿌리의 cDNA를 사용하는 RT-PCT로 결정된 바에 따라, NtMRP4 폴리뉴클레오티드를 담배 조직에서 발현시켰다.
담배 식물이 수경재배 용액에서 재배될 때, NtMRP4 폴리뉴클레오티드의 발현은 N. tabacum의 뿌리와 잎 묘목 모두에서 카드뮴에 의해 약간 상향-조절된다 (TN90, 도 2 참조. 그러나, 비록 NtMRP4 폴리뉴클레오티드가 N. rustica,의 잎에서도 유도된다는 것이 발견되었지만, N. tabacum,와 비교하여 반대 자료가 N. rustica (down-regulation)의 뿌리에서 관찰되었고(하강-조절), 그것에 의해, NtMRP4 폴리뉴클레오티드가 뿌리에서 카드뮴의 축적과 N. rustica의 고카드뮴 내성에 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다.
실시예 8: 담배 식물에서 NtMRP4 폴리뉴클레오티드의 침묵
추정 NtMRP3 전사체를 암호화하는 첫번째 부분 서열(CHO_SL022xb24f1.ab1)을 Tobacco Genome Initiative (TGI) 주석을 사용하여 발견하였다. 이 특별한 서열로부터, 프라이머를 RNAi 접근법을 사용하여 담배에서 침묵 NtMRP4 폴리뉴클레오티드 발현을 생성하였다(도 1). 상응하는 NtMRP4 RNAi 서열을 cDNA로부터 RT-PCR에 의해 증폭하였고, 그리고 나서 사용자 지침에 따라(Invitrogen) 엔트리 벡터를 거쳐 Gateway 벡터 pB7GWIWG2(II)에 삽입하였다. 이 벡터는 식물의 모든 조직에서 유전자 이식의 구성 발현에 대한 프로모터(칼리플라워 모자이크 바이러스 CaMV 35S 프로모터)와 아가 플레이트 상의 Basta(30 mg/ml)를 사용한 제초제 선택을 위한 막대 유전자를 함유한다. 그리고 나서 구축물을 전형적인 잎 디스크 과정을 사용하여 Agrobacterium tumefasciens을 거쳐 버얼리 종 담배 KY14의 게놈에 삽입하였다. 캘리로부터, 개개의 계통을 재생하였고 Basta에서 선택하였다. RNAi 침묵 계통을 RT-PCR에 의해 모니터하고 종자 생산을 위해 성장시켰다. 도 3은 NtMRP4 침묵이 계통 1과 2를 포함하여, 유전자이식 계통에 효과적이라는 것을 나타낸다. T1 종자를 수집하고, 선택을 위해 Basta-함유 아가 플레이트 상에서 재-성장시키고, 내성 식물을 현장에서 경작하기 전에 플로팅 트레이에서 성장시켰다.
식물 대략 500 mg을 세척하고 마이크로웨이브-가속된 반응 시스템으로 진한 HNO3 10 ml에서 소화시켰다 (CEM corporation, Mathews, NC). 중금속 농도를 유도성 결합 플라즈마-질량 스펙트럼을 사용하여 분석하였다("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). 비-유전자이식 담배 제조로서, 광택-보장, 버지니아 담배 잎, CTA-VTL-2로 이루어진 샘플을 비슷한 조건에서 제조하였다.
도 4는 연이은 두 해에 두 연속적인 현장 실험 후, 시험된 두 개의 NtMRP4 RNAi 계통(계통 1 및 계통 2)에서 20%에 가까운 잎 카드뮴 감소를 나타낸다. 각각의 경우, 실험 단위는 블록 내에서 무작위인 4개의 수집된 식물의 4개의 독립적인 복제물로 이루어진다 (wt, 계통 1 및 계통 2 그리고 두 번째 해의 현장 실험에서의 벡터 대조 식물들). 이에 더하여, 공간 경향을 조절하기 위해, 대조 샘플을 블록에 첨가하였다. NtMRP4 RNAi 계통의 분석연구는 카드뮴의 평균 수준의 감소에서의 강하고 통계적으로 중요한 결과를 설명한다.
실시예 9: NtMRP4 폴리뉴클레오티드의 발현이 침묵된 담배 식물로부터 유래된 식물의 길이 및 중량 분석
침묵된 NtMRP4 계통의 길이와 중량은 대조 식물과 비교하여 약간 영향을 받았다. 그러나, NtMRP4 RNAi 식물과 야생형 또는 벡터 대조 식물간에 건조 수집된 식물에서는 중요한 차이가 발견되지 않았고, 그러므로 NtMRP4 전사체는 건조 바이오매스에 통계적으로 관련된 효과는 없다는 것을 나타낸다. 이들 자료는 동일한 담배 배경 (KY14)에서 (NtMRP4 폴리뉴클레오티드에 상응하는) 과발현 AtMRP4가 (유전자이식 계통에 따른) 잎에서 10~30% 더 카드뮴 축적을 가져온다는 또 다른 현장 실험에 의해 확인된다. NtMRP4 단백질에 대해 코딩하는 mRNA는 담배 잎에서 카드뮴의 수준을 상당히 감소시킨다는 것이 확실하다.
실시예 10: NtMRP4에서 EMS-유도된 돌연변이의 동정
DNA 라이브러리를 에틸 메탄술포네이트 (EMS)에 노출되었던 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum ) 식물로 만들고 개개의 식물의 NrMRP4 유전자의 관련 부분을 서열화함에 의해 NtMRP4 폴리뉴클레오티드의 엑손 1과 엑손 2에서의 돌연변이에 대해 스크린닝하였다.
엑손 1의 경우
NtMRP4Exon1FW (5'-CATCTCCTTACGAAGGATACTACC-3') 및
NtMRP4Exon1REV (5'-GCTGCAAGCTCTCCTTTTCTAA-3')를 서열화에 사용하였고,
엑손 2의 경우
NtMRP4Exon2FW (5'-GTGCAATCTGGCAAATATAGTGAG-3') 및
NtMRP4Exon2REV (5'-AAAATGACATAGGAGCATGCAGTA-3')를 서열화에 사용하였다.
NtMRP4 폴리뉴클레오티드의 엑손 1과 엑손 2에서 발견된 모든 돌연변이에 대한 개요를 표 1에 나타내었다. 원래의 코돈(codon ori) 및 돌연변이 코돈(codon mut)을 원래의 아미노산 (AS ori)과 아미노산 치환 (AS mut) 또는 정지코돈을 표시하였다.
실시예 11: 아연 손가락 뉴클레아제 표적 부위를 선택하기 위한 검색 프로토콜
이 실험은 유전자의 발현을 변형시키는 툴을 개발하기 위해, 주어진 게놈 데이타베이스와 비교하여 주어진 유전자 서열에서 독특한 표적 부위의 발생을 스크리닝하기 위해 NtMRP4 유전자를 어떻게 검색하는가를 설명한다. 아래 기재된 것, 서열 모티브를 포함하여, 본 발명의 방법, 및 담배와 같은 식물에서 상응하는 유전자 서열을 변형시키는 어느 부위 또는 모티브의 사용에 의해 확인된 표적 부위가 본 발명에 포함된다.
검색 알고리즘
예를 들면, 실시예 1의 담배 게놈 서열 어셈블리와 같은, DNA 데이타베이스 내의 접미사 배열을 사용하는 주어진 공간 크기에 의해 분리된 2 고정-길이 부분열 DNA 모티브의 출현에 대하여 입력 쿼리(표적)를 스크리닝하는 컴퓨터 프로그램을 개발하였다. 접미사 배열 구축물과 연구는 오픈 소스 libdivsufsort 라이브러리-2.0.0 (http://code.google.com/p/libdivsufsort/)를 사용하고, 이것은 어느 인풋 스트링을 Burrows-Wheeler 변형 스트링으로 직접 전환시킨다. 프로그램은 전체 입력 (표적) 뉴클레오티드 서열을 스캔하고 선택된 DNA 데이타베이스에서 선택된 시간 횟수 이하로 발생하는 모든 서브스트링 조합을 돌려보낸다.
퀴리 서열의 아연 손가락 뉴클레아제-매개 돌연변이를 위한 표적 부위 선택
아연 손가락 DNA 결합 도메인은 3 염기쌍 뉴클레오티드 서열을 인식한다. 아연 손가락 뉴클레아제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 아연 손가락 DNA 결합 도메인을 포함하는 아연 손가락 단백질과 유형 IIS 제한 효소의 비-특이 뉴클레아제를 포함한다. 아연 손가락 뉴클레아제는 표적 서열에 이중가닥 브레이크를 도입하는데 사용될 수 있다. 이중 가닥 브레이크를 도입하기 위해, 한 쌍의 아연 손가락 뉴클레아제가 요구되고, 그 중 하나는 표적 서열의 플러스(상부) 가닥에 결합하고 다른 하나는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 동일한 표적서열의 마이너스 (하부) 가닥에 결합한다. 두 고정 길이 부분열 DNA 모티브의 각각에 대해 3의 복수를 사용함에 의해, 프로그램은 주어진 스페이서 길이에 의해 분리된 두 아연 손가락 단백질 표적 부위를 동정하는데 사용될 수 있다.
프로그램 입력:
1. 표적 쿼리 DNA 서열
2. 조사될 DNA 데이타베이스
3. 첫번째 부분열 DNA 모티브의 고정된 크기
4. 스페이서의 고정된 크기
5. 두번째 부분열 DNA 모티브의 고정된 크기
6. 프로그램 입력 2의 선택된 DNA 데이타베이스에서 프로그램 입력 4에서 분리된 프로그램 입력 3과 5의 조합의 발생의 임계 개수
프로그램 출력:
1. 각각의 서열에 대해 입력 6 임계계수가 최대인 DNA 데이타베이스에서 서열의 횟수와 함께 뉴클레오티드 서열의 리스트
실시예 12: 담배에서 NtMRP3 및 NtMRP4 전사체의 발현 자료수집
담배 엑손배열의 개발 및 분석. 실시예 1에 기재된 바에 따라 얻은 BAC 클론을 사용하여, 272,342 엑손을 담배 EST 데이타와 BAC 서열화로부터 얻은 메틸-필터드 서열을 조합하고 비교하여 동정하였다. 이들 엑손 각각에 대해, 4 개의 25-mer 올리고뉴클레오티드를 고안하고 담배 엑손 배열을 구축하는데 사용하였다. 엑손 배열은 표준 프로토콜을 사용한 Affymetrix (Santa Clara, USA)로 제조하였다.
담배에서 NtMRP3 및 NtMRP4 의 발현. RNA를 Cd+ (Cd 오염) 및 Cd- (Cd 결핍) 토양에서 성장한 니코티아나종으로부터 단리하고, 표준 혼성화 프로토콜 및 분석 툴을 사용하여 분석하였다. 발현 자료수집을 NtMRP3 및 NtMRP4 전사체의 변종에서 Cd 축적에 대한 유전자 세트를 확인하고 토양 Cd의 영향을 측정하기 위해 수행하였다. 사용한 NtMRP3 및 NtMRP4 프로브를 첫번째 및 최종 엑손과 3'UTR 영역에 위치시켰다. 표 2의 결과는 Cd이 축적된 토양에서 성장한 엔. 타바쿰 (N. tabacum ) 식물의 잎이 동일한 토양에서 성장한 엔. 러스티카 (N. rustica ) 식물보다 더 많은 Cd를 축적한다는 것을 나타낸다. N. tabacum 식물의 뿌리는 N. rustica 식물의 뿌리보다 Cd을 덜 축적한다. 흥미롭게도, NtMRP3 및 NtMRP4 둘 다 Cd에 의해 규제되지 않았지만, 그들의 발현은 두 니코티아나 종에서 달랐고 이것은 두 유전자가 니코티아나 어세센에서 Cd 섭취, 자리이동 및 축적을 다르게 구동한다는 것을 제안한다 (데이타는 3개의 생물학적 복제의 평균에 대응하는 log2 이다). 대조로서, 3개의 하우스키핑 유전자(UBP12, 엑손 1 및 2), α-튜블린 및 리보솜 단백질 S16의 발현을 나타내었다.
본 발명에 인용되거나 또는 기재된 어느 간행물은 본 출원일보다 앞서 기재된 관련 정보를 제공한다. 본 명세서의 설명은 본 발명자들이 이와 같은 기재보다 선행하여 자격을 주는 허락으로 구축되지 않는다. 본 명세서에 언급된 모든 출판물은 본 발명에 참조로서 병합된다. 기재의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위나 정신에서 벗어남 없이 본 분야의 당업자에게 이해될 수 있다. 비록 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 결합하여 기재되었지만, 본 발명은 이와 같은 특정 구현에로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 참으로, 세포, 분자 및 식물 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 당연한 본 발명의 수행을 위해 기재된 방식의 변형은 다음의 청구항의 범위 내로 간주 된다.
표 1
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SEQUENCE LISTING <110> Philip Morris Products S.A. Bovet, Lucien <120> Heavy Metal Reduction in Planta <130> 307486-20547 <140> PCT/EP2011/004383 <141> 2011-08-31 <150> EP 10009180.0 <151> 2010-09-03 <160> 148 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 9001 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 tcctagtact gtaagtgaac cagcaaggaa actgcaaagt agatttcttg ttcatcaaat 60 aaatccttga gctgagagat atgatttttt ctaaggaatt tctctttggc tctctgtagt 120 ggtgagtttg attcatattt caatctagtt tttagctttg cttaaaagct tcttcttgcc 180 actagaccaa atccttttcc tttttgcatg acactttttt gagtttcatt tctcttattt 240 atagagaaaa tcttttgatg gggatggttt tttttctctt ttgcattaat gattagaatt 300 tatcattgtt aaatggtact ccctcaataa ctttttgatt taaaaaaaaa actgtccttt 360 cattcataat catcatctcc tttattatat tactctaaac tgttgctaaa gttccttttt 420 gtatattttc cctacatgaa cttttgctgt actgtgaaag ttgatgaact tttattgtac 480 aatgttttgg tccagtagct aacagccctt ttatttaatt ctgagaggtc tctttctctt 540 tctcttcaca ctttcacatg tttccgtttc ctgtagattt ctcctttctc tttccttggt 600 tctttttcca actcataatc ttcatgtgat ttcaattttt gtttgttttt 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621 <210> 18 <211> 165 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 18 gcatctaatg atcagaccaa cattgatgtc ttcctcccgt tttttatgaa tctcactttg 60 gccatgttta tcacactgct cggcatcatc atcatcacat gccaatattc ttggcctacc 120 gtactacttt tgattcctct gggttggctt aatatctggt accgg 165 <210> 19 <211> 295 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 19 ggatattatc ttgcaacatc tcgtgaattg actcggcttg actcaattac aaaagcacct 60 gttattcatc atttctctga aagcatctca ggtgttatga ctatacgttg ctttaggaag 120 caggagatgt tttgtaacga gaatgtaaac cgagtgaatt ccaatctgcg aatggatttc 180 cacaacaatg gatccaatga atggttgggc tttcgactgg aattgatggg aagcttactt 240 ctttgtgttt ctgcaatgtt catgattgtc ttacctagca gcatcatcaa gccag 295 <210> 20 <211> 215 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 20 aaaatgttgg tttgtcacta tcatatggct tgtctcttaa tagtgtccta ttctggtcca 60 tctttgtgag ttgctttgtg gaaaataaaa tggtttctgt cgaaagatta aaacagttct 120 cagaaatacc atcagaagca gagtggagaa agatggattt tctcccacct tcaagttggc 180 caagccgtgg gaatgttgag cttgaaaacg tgcag 215 <210> 21 <211> 306 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tgattcacca ggtaaatttt 360 cctcctctac gtcatccttg tggttctttg cggaattatg caaccaactt tttatgtgtt 420 tcaaatatat atactgataa ctgaatactg tcattggtaa atcatagttg ttgataacgg 480 agataactgg agtgtcggac agaggcagct tctttgcttg ggaagagtga tgctaaaacg 540 tagcagactt ctatttatgg atgaggcaac tgcctctgtt gattcacaga cagatgcagt 600 gattcagaaa atcatccgcg aggactttgc ggcctgtact ataatcagca ttgcccacag 660 aataccaaca gtcatggact gtgatagagt tcttgttata gatgcaggtg ctgatttctc 720 tccttttact ttgtacctta ttttgaatct ggtaaatgat tatttatctg tatgtgatgg 780 tttccaacca atcatagtca gtacctttat gaagaaattg cctaatgtta gccaagtagt 840 agtaaatgca tgaagtcatt agcctatttg ttttggattt tgtgagtttc atacttcaaa 900 ctggaagctt atgctatact atctgatccc ttgtttgtat agattgcttt cttttccttt 960 ttctcggatt tatcttatat ataagcggac agagtaaaag aatgtaaaca tgcgtaattt 1020 gacctattat agcagattat ttgtcttatt ttccaggtcg ctgattccac ttattaggag 1080 tagttacacg tatttatctt ttaagtgaaa taatagtgta aagtttcttt tggcactgtc 1140 ggtgtaaaga agttaaactc ctttctttaa ccccggcatt tcttattcat gcaggaatag 1200 caaaagagtt tgacaaacca tctcgtttgc ttgaaaggcc ttcacttttt ggggctttgg 1260 ttcaagaata tgccaaccga t 1281 <210> 24 <211> 1488 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220> <221> SITE <222> (1357)..(1357) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1362)..(1363) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1366)..(1366) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1385)..(1385) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1392)..(1392) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1398)..(1398) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1432)..(1433) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1442)..(1442) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1457)..(1457) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1463)..(1463) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1479)..(1479) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1481)..(1481) <223> Xaa denotes putative stop codon <400> 24 Met Asp Met Arg Asn Ser Met Ser Ser Glu Ser Cys Leu Ala Ser Leu 1 5 10 15 Ser Cys Ser Ala Ser Thr Phe Gln Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Val 20 25 30 Lys Trp Leu Arg Phe Ile Phe Leu Ser Pro Cys Pro Gln Arg Thr Leu 35 40 45 Leu Ser Ser Ile Asp Val Leu Leu Leu Leu Thr Phe Ile Val Phe Ala 50 55 60 Val Gln Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Arg Ser Asn Glu His Ser Thr Ser 65 70 75 80 Ser Ile Asp Lys Pro Leu Ile Ala His Asn Arg Thr Ser Ser Pro Trp 85 90 95 Lys Val Ile Asp Gly Leu Tyr Trp Leu Phe Gln Ala Ile Thr His Val 100 105 110 Val Ile Thr Ile Leu Ile Val His Glu Lys Arg Phe His Ala Ile Ser 115 120 125 His Pro Leu Ser Leu Arg Val Phe Trp Ile Ala Asn Phe Val Val Met 130 135 140 Ser Leu Phe Phe Gly Cys Gly Ile Thr Arg Leu Val Ser Leu Lys Glu 145 150 155 160 Ile Asp Pro Asn Leu Arg Met Asp Asp Ile Ser Ser Leu Val Ser Phe 165 170 175 Pro Ile Ser Val Val Leu Phe Ile Val Ala Ile Lys Gly Ser Thr Gly 180 185 190 Val Ala 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putative stop codon <220> <221> SITE <222> (144)..(144) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (165)..(165) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (170)..(170) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (173)..(173) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (195)..(195) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (203)..(203) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (218)..(218) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (226)..(226) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (235)..(235) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (303)..(303) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (311)..(311) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (337)..(337) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (341)..(342) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE 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putative stop codon <220> <221> SITE <222> (588)..(589) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (593)..(593) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (601)..(601) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (612)..(612) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (628)..(628) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (631)..(631) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (643)..(643) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (699)..(699) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (707)..(707) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (719)..(719) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (728)..(728) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (758)..(758) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (778)..(778) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (802)..(802) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (810)..(810) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (821)..(821) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (830)..(831) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (838)..(838) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (885)..(885) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (913)..(913) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (915)..(915) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (927)..(927) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (965)..(967) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (973)..(973) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1009)..(1009) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1027)..(1027) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1055)..(1055) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1076)..(1076) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1099)..(1099) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1115)..(1115) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1118)..(1118) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1141)..(1141) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1154)..(1154) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1187)..(1187) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1201)..(1201) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1245)..(1245) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1260)..(1260) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1273)..(1273) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1288)..(1288) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1293)..(1293) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1321)..(1321) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1488)..(1488) <223> Xaa denotes putative stop codon <400> 25 Trp Ile Xaa Gly Thr Val Cys Leu Gln Asn Leu Val Xaa His His Phe 1 5 10 15 Leu Val Leu Pro Pro His Phe Asn Arg Gln Arg Ile Gln Gln Leu Leu 20 25 30 Asn Gly Xaa Asp Ser Phe Ser Ser Leu His Val His Lys Gly Leu Phe 35 40 45 Tyr Leu Pro Leu Met Cys Cys Phe Cys Leu Leu Ser Leu Tyr Leu Gln 50 55 60 Tyr Lys Ser Cys Thr Gln Ser Xaa Gly Pro Met Ser Thr Leu Leu Leu 65 70 75 80 Ala Leu Ile Ser Leu Xaa Leu His Thr Thr Gly Leu Leu Arg Leu Gly 85 90 95 Lys Ser Xaa Met Asp Cys Ile Gly Cys Phe Arg Arg Leu His Met Leu 100 105 110 Xaa Ser Leu Tyr Xaa Xaa Phe Met Arg Lys Asp Phe Thr Leu Phe Pro 115 120 125 Ile His Cys Pro Cys Ala Cys Phe Gly Leu Gln Thr Leu Xaa Leu Xaa 130 135 140 Val Cys Ser Leu Val Val Gly Ser Gln Gly Leu Cys His Leu Arg Lys 145 150 155 160 Leu Ile Leu Ile Xaa Glu Trp Met Ile Xaa Val His Xaa Phe His Phe 165 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Arg Glu Asp Phe 1400 1405 1410 Ala Ala Cys Thr Ile Ile Ser Ile Ala His Arg Ile Pro Thr Val 1415 1420 1425 Met Asp Cys Asp Arg Val Leu Val Ile Asp Ala Gly Ala Asp Phe 1430 1435 1440 Ser Pro Phe Thr Leu Tyr Leu Ile Leu Asn Leu Val Asn Asp Tyr 1445 1450 1455 Leu Ser Val Cys Asp Gly Phe Gln Pro Ile Ile Val Ser Thr Phe 1460 1465 1470 Met Lys Lys Leu Pro Asn Val Ser Gln Val Val Val Asn Ala Xaa 1475 1480 1485 <210> 26 <211> 1487 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <220> <221> SITE <222> (32)..(32) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (52)..(52) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (75)..(75) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (80)..(80) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (82)..(83) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (120)..(120) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (158)..(158) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (161)..(161) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (163)..(163) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (168)..(168) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (187)..(187) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (196)..(197) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (199)..(199) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (204)..(205) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (210)..(210) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (214)..(214) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (249)..(250) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (259)..(259) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (273)..(273) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (275)..(275) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (304)..(304) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (320)..(320) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (331)..(331) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (356)..(356) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (374)..(374) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (384)..(384) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (454)..(454) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (462)..(462) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (468)..(468) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (470)..(470) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (476)..(476) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (479)..(479) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (494)..(494) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (498)..(498) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (581)..(582) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (590)..(590) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (595)..(595) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (620)..(621) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (624)..(624) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (633)..(633) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (635)..(635) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (660)..(660) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (726)..(726) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (753)..(753) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (759)..(759) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (765)..(765) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (771)..(771) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (782)..(782) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (784)..(784) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (794)..(794) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (798)..(798) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (800)..(800) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (817)..(818) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (827)..(827) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (834)..(834) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (841)..(841) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (853)..(853) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (863)..(863) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (869)..(870) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (877)..(878) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (882)..(882) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (905)..(905) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (930)..(930) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (936)..(936) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1000)..(1000) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1013)..(1014) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1019)..(1019) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1061)..(1061) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1074)..(1074) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1079)..(1079) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1092)..(1092) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1104)..(1104) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1111)..(1111) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1132)..(1132) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1158)..(1158) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1177)..(1178) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1193)..(1193) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1230)..(1230) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1232)..(1232) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1237)..(1237) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1247)..(1247) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1254)..(1254) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1290)..(1291) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1301)..(1301) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1303)..(1303) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1317)..(1317) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1325)..(1325) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1333)..(1334) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1351)..(1351) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1380)..(1380) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1382)..(1382) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1404)..(1404) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1418)..(1418) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1437)..(1437) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1452)..(1452) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1455)..(1455) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1469)..(1469) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1474)..(1474) <223> Xaa denotes putative stop codon <220> <221> SITE <222> (1483)..(1485) <223> Xaa denotes putative stop codon <400> 26 Gly Tyr Glu Glu Gln Tyr Val Phe Arg Ile Leu Phe Ser Ile Thr Phe 1 5 10 15 Leu Phe Cys Leu His Ile Ser Ile Val Arg Gly Phe Ser Ser Cys Xaa 20 25 30 Met Val Lys Ile His Phe Pro Leu Ser Met Ser Thr Lys Asp Ser Ser 35 40 45 Ile Phe His Xaa Cys Ala Ala Phe Ala Tyr Phe His Cys Ile Cys Ser 50 55 60 Thr Lys Val Val Leu Lys Val Glu Val Gln Xaa Ala Leu Tyr Phe Xaa 65 70 75 80 His Xaa Xaa Ala Ser Asn Cys Thr Gln Gln Asp Phe Phe Ala Leu Glu 85 90 95 Ser His Arg Trp Thr Val Leu Val Val Ser Gly Asp Tyr Thr Cys Cys 100 105 110 Asn His Tyr Thr Asn Ser Ser Xaa Glu Lys Ile Ser Arg Tyr Phe Pro 115 120 125 Ser Thr Val Pro Ala Arg Val Leu Asp Cys Lys Leu Cys Ser Tyr Glu 130 135 140 Phe Val Leu Trp Leu Trp Asp His Lys Ala Cys Val Thr Xaa Gly Asn 145 150 155 160 Xaa Ser Xaa Phe Lys Asn Gly Xaa Tyr Lys Phe Ile Ser Phe Ile Ser 165 170 175 Tyr Phe Cys Cys Ser Leu His Cys Cys His Xaa Arg Phe Asp Arg Ser 180 185 190 Cys Cys Asn Xaa Xaa Phe Xaa Ile Ser Leu Lys Xaa Xaa Asn Gln Trp 195 200 205 Leu Xaa Thr Pro Gly Xaa Ile Gln Cys Glu Trp Leu Cys Phe Ser Phe 210 215 220 Ser Asn Ile Glu Ser Leu Leu Asp Leu Asp Glu Pro 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aatctcactt aagtgatgaa 720 accaatggtt atgaactcct ggataaatcc agtgtgagtg gctttgcttc agcttctcta 780 atatcgaaag ccttttggat ttggatgaac cctttactgc aaaaaggtta caagtcacct 840 ctcaagattg atgaagttcc ttcactttcc ccactgcata gagcagagaa aatgtctcaa 900 cttttcgaaa gaaattggcc taaacctgaa gaaatatcaa agcatcctgt ccgaacaaca 960 ttgctgcgtt gcttttggaa ggaagttatt tttactgcca ttcttgcagt aattagggta 1020 tgtgttatgt atgtagggcc aacactcata caaagatttg ttgattacac agcaggaaag 1080 aggacatctc cttatgaagg atactacctt ataggaactc tcctaatagc caaatttgtg 1140 gaagttctaa cctctcatca gttcaacttt aactcccaaa agcttggcat gcttattcga 1200 gcgacacttc tcacttcttt gtataagaag gggttaaggt tgtcatgctc agctagacag 1260 gctcatggtg ttggacagat tgtaaattat atggccgtcg atgctcagca gctgtccgat 1320 atgatgctac agctacattc catttggctc atgccattgc aagtttctgt ggctttaggc 1380 atcctttata cttacctcgg tgcttcaact gttgtaacgc tagctggact tgcagcagtg 1440 atggtatttg tggtgtttgg aactaaaaga aacaacaggt ttcaatttaa catcatgaag 1500 aatcgtgatt ctagaatgaa agcgacaaat gagatgctta attatatgcg cgttataaag 1560 ttccaggcat gggaagaaca ttttaacaaa agaattgaat ccttccgcga atccgagtat 1620 ggatggttgt ccaagttctt gtactcaatc gctgggaata tcattgtctt gtggagcact 1680 cctcttctag tggctacact cacttttgga agtgcaatct tgttgggaat cccgcttggt 1740 gcagggacag tgttcactgc aacatctctc ttcaagatgt tgcaggaacc gatcagggct 1800 ttccctcaat ccatgatctc actttcacaa gcaatgatat ctcttgatag attggacaaa 1860 tatatgatga gtaaggagtt agtggataaa gctgtggaaa gactagaagg ttgtgggggt 1920 acaattgcta tgcaggtgaa agatggagct ttttgctggg atgatgaaaa cagtaaagaa 1980 gaattgaaaa atgtaaactt tgagattaga aaaggagagc ttgcagcagt agtggggaca 2040 gttggggcgg ggaagtcttc cctccttgca tctgtacttg gtgagatgca caagttgtcg 2100 ggtcaggtca caatttgtgg ttcaactgcc tatgttgcac aaacatcgtg gattcagaat 2160 ggcacgatac aagaaaatat cctgtttggt atgccaatga acagagacag atacaaggaa 2220 gtgatccggg tttgctgctt ggagaaggac ttggaaataa tggagtttgg agaccagact 2280 gaaataggag aacgtggcat caacctcagt ggtggtcaga agcagcgaat ccagcttgca 2340 agagctgttt accaggactg tgatatttat cttctagatg atgtattcag 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cacatgccaa 3240 tattcttggc ctaccgtact acttttgatt cctctgggtt ggcttaatat ctggtaccgg 3300 ggatattatc ttgcaacatc tcgtgaattg actcggcttg actcaattac aaaagcacct 3360 gttattcatc atttctctga aagcatctca ggtgttatga ctatacgttg ctttaggaag 3420 caggagatgt tttgtaacga gaatgtaaac cgagtgaatt ccaatctgcg aatggatttc 3480 cacaacaatg gatccaatga atggttgggc tttcgactgg aattgatggg aagcttactt 3540 ctttgtgttt ctgcaatgtt catgattgtc ttacctagca gcatcatcaa gccagaaaat 3600 gttggtttgt cactatcata tggcttgtct cttaatagtg tcctattctg gtccatcttt 3660 gtgagttgct ttgtggaaaa taaaatggtt tctgtcgaaa gattaaaaca gttctcagaa 3720 ataccatcag aagcagagtg gagaaagatg gattttctcc caccttcaag ttggccaagc 3780 cgtgggaatg ttgagcttga aaacgtgcag gttagatatc gtccgaacac tcctctagtg 3840 cttaaaggag ttactctcag cattagaggg ggagagaaga taggtgttgt tggtcgtaca 3900 gggggtggaa aatcaacatt aattcaagtt ttctttcgtt tggtggagcc tgcagctgga 3960 agaataatca ttgatgacgt agatatatcc agacttgggc ttcatgatct tagatctcgc 4020 ttcgggatca ttccccaaga gccagtcctt tttgaaggaa ctgtgagaag caacattgac 4080 cccattggac aatattcaga tgatgaaatt tggaagagcc tcgaacgctg ccaactcaaa 4140 gatgtggtgt ctttaaaacc cgaaaaactt gattcaccag ttgttgataa cggagataac 4200 tggagtgtcg gacagaggca gcttctttgc ttgggaagag tgatgctaaa acgtagcaga 4260 cttctattta tggatgaggc aactgcctct gttgattcac agacagatgc agtgattcag 4320 aaaatcatcc gcgaggactt tgcggcctgt actataatca gcattgccca cagaatacca 4380 acagtcatgg actgtgatag agttcttgtt atagatgcag gaatagcaaa agagtttgac 4440 aaaccatctc gtttgcttga aaggccttca ctttttgggg ctttggttca agaatatgcc 4500 aaccgatcct ctgagctcta a 4521 <210> 28 <211> 6190 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 28 ccgtcaaccc agtcttggcc accacataaa cacagctttg acttgtctct cccttttccc 60 tattttcacc acccttttca atttcccacc ttatattcat tattatattt aatcaatcaa 120 atcaaagttg gaaaaaaagg gagtaataat caaatggagt agtatataca taccagaaca 180 atgaaagagc actcataagc taaagcccat aattcatcac gaaaccacaa tatagaggaa 240 acctgacgtg tcccttaaaa tctaaccttg aacctctgag acctccaaaa aaaacatcat 300 ggaaattgca aagggcatgt ctgtgtttca atctttgagg tatgttggcg ttgatgaatc 360 cctccgaaac cccattttct tacgtgtcat tagttgttct ttgcacctgg gattgttcct 420 tgtaattctt gggttgtgtt gttggaatac aatcaggagg gacaataatg ctggccacaa 480 acagagtagt actaggaatg ctaggttctt gtactacaaa tcaaccttgt tttgttcaat 540 aggtctagcc atctttagct ttgtgttatg tttgttagct catttttatt ggtatagaaa 600 tggttggtca gaagaaaaaa ttataaccct tttggatttt gcattaaagt tgctagcttg 660 gttgtcaatc tctgttttct tgcacaccca gttccttaat tcttgtgaaa ccaaataccc 720 tcttgtttta agagtttggt gggggctttt cttctttgtt tcttgttatt gccttgttat 780 agaccttgtt tatggggaaa agaaccaatc tttaccaact caattttgta tacctgatgt 840 tgttttcact cttatggggt tattcttctg ttttgttggg tttattgtta aaacagagag 900 tgaggagaat atgcttcagg aacccctctt aaatggtagt gttgccaatg gcatggactc 960 aaagaagtct actggggatc aaactgtcac cccttatgcc aatgctaaca tttttagtct 1020 ctttactttc tcttggatgg gtcccctaat ttctgttggc aacaagaaac cattagacct 1080 tgaggatgtt cctcagcttc actttgatga tagtgtcaaa gggagttttc ctatttttag 1140 agaaaaacta gaatctgtgg gtgggggaaa tagtaaccgt gtgactacct 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aagagcccat 2040 ctacaatctc ccagatacaa tttcaatgat tgctcaaacc aaagtttctc ttgatcgtat 2100 tgcatctttc ctttctcttg atgacttgca gcctgatgtc atagagaagc ttccaaaagg 2160 tagttctgat gaagcaattg agattgtagg tgggaacttc gcttgggatg catccacctc 2220 gactccactt ctaaaggatg taaatcttag agtgcttaat ggcatgagag ttgccatttg 2280 tggtacagtt ggttcaggaa aatcaagctt actgtctagc attttaggag agatgcccaa 2340 attatcaggg actattaaac ttagtggaac gaaggcttat gttgcacagt cgccctggat 2400 acagagtgga aagatagagg agaacatatt atttggtaaa gagatgcaga gggagaagta 2460 tgataaagtt cttgaagcgt gctccttaaa gaaagacctg gaaattctct cttttggcga 2520 tcaaacagaa ataggggaga ggggcattaa tttgagcggt ggacagaagc agagaataca 2580 gattgctcgt gctctttacc aagatgctga tgtttaccta tttgatgatc cgttcagtgc 2640 tgtggatgct cataccggat cccatctctt cagtgtaagt cctttcatat atatgcttta 2700 ttttcatgct tgatatattt tacctagcca cttgattgac ccatccttta attgcaggaa 2760 tgtataatgg ggctattgaa ttcaaaaaca gttttatatg ttacacatca agtggagttt 2820 ttgcctgctg cggatttgat cttggtactc tttcctttca gtaattatgg 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Nicotiana tabacum <400> 44 gcatcgacag atcaaagtgc aattgatctg aatgttccca ttcaagttgg atcctttgcc 60 ttcacaataa tacagctttt agggattatt ggagtaatgt cacaagttgc atggcaggtc 120 ttcattgtct ttattccggt cattgcagtt tgcatctggt tggag 165 <210> 45 <211> 295 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 45 caatattaca taccatcagc acgagaactg gcacggctaa atgggacatg caaagctcca 60 gtaatacagc actttgccga gacaatttca ggatcaagca caattagaag tttcgatcag 120 gaatctagat tccaggacac aagtatgaaa ttgatagaca attattctcg gcctaagttt 180 cacatcgctg ctgcaatgga gtggctttgt ttgcgtttgg atatgttatc tctgatcact 240 tttgctttct ctttaatttt cttgatctct cttcctgttg gaacaattga cccaa 295 <210> 46 <211> 215 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 46 gtgttgctgg cttagctgtt acatatgggc ttaatctgaa cataatacaa gctcgggttg 60 tttggaatct ttgtatgatg gaaaataaaa ttatttctgt tgaaagaata cttcagtata 120 ctgctcttcc aagtgaatct cctcttatca tagaatccaa cagaccagac cctaactggc 180 catcttgtgg agaggttgat tttagcaatc ttcag 215 <210> 47 <211> 306 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 47 gtccgatatg ctcctcacat gcctctcgtg ttgcgaggcc ttacatgcac tttctttggt 60 ggaaagaaga ctggaattgt cggtaggaca ggcagcggta aatctactct aatacagacc 120 ctcttccgca tagttgaacc agctgctgga caaataaaaa tagatggtat cagcatctcc 180 tcaattggtt tgcatgatct acggtctaga ttgagtataa ttccacagga tccaactatg 240 tttgagggaa cagttcgcag caacctagac ccgcttgaag agtattcaga tgaacaaatt 300 tgggag 306 <210> 48 <211> 64 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 48 gcgctcgata agtgtcagct aggagaagaa gtgaggaaga aagaaggcaa actttattct 60 acag 64 <210> 49 <211> 240 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 49 tatctgagaa tggagagaac tggagtgtag gccaaaggca gctggtctgc cttggccgtg 60 tgctactgaa aaagagcaag gtcctggtcc ttgacgaggc tacagcatct gtcgacactg 120 caactgataa tcttattcag caaactctaa ggctgcactt ctctgattcc acggttataa 180 ccattgctca taggattaca tctgtgcttg acagtgatat ggtcctacta ttagatcatg 240 <210> 50 <211> 125 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 50 ggctcattgc tgaatacggc actccagcca ggttgttaga gaacgaatcc tcattgtttg 60 ctaagctcgt ggcagagtat agtatgaggt caaattcaag ttttgagaat gtttcagaca 120 tgtga 125 <210> 51 <211> 4389 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 51 atggaaattg caaagggcat gtctgtgttt caatctttga ggagggacaa taatgctggc 60 cacaaacaga gtagtactag gaatgctagg ttcttgtact acaaatcaac cttgttttgt 120 tcaataggtc tagccatctt tagctttgtg ttatgtttgt tagctcattt ttattggtat 180 agaaatggtt ggtcagaaga aaaaattata acccttttgg attttgcatt aaagttgcta 240 gcttggttgt caatctctgt tttcttgcac acccagttcc ttaattcttg tgaaaccaaa 300 taccctcttg ttttaagagt ttggtggggg cttttcttct ttgtttcttg ttattgcctt 360 gttatagacc ttgtttatgg ggaaaagaac caatctttac caactcaatt ttgtatacct 420 gatgttgttt tcactcttat ggggttattc ttctgttttg ttgggtttat tgttaaaaca 480 gagagtgagg agaatatgct tcaggaaccc ctcttaaatg gtagtgttgc caatggcatg 540 gactcaaaga agtctactgg ggatcaaact gtcacccctt atgccaatgc taacattttt 600 agtctcttta ctttctcttg gatgggtccc ctaatttctg ttggcaacaa gaaaccatta 660 gaccttgagg atgttcctca gcttcacttt gatgatagtg tcaaagggag ttttcctatt 720 tttagagaaa aactagaatc tgtgggtggg 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ccaatcatag tcagtacctt tatgaagaaa ttgcctaatg 360 ttagccaagt agtagtaaat gcatga 386 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Oligonucleotide NtMRP4Exon1FW <400> 54 catctcctta cgaaggatac tacc 24 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Oligonucleotide NtMRP4Exon1REV <400> 55 gctgcaagct ctccttttct aa 22 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Oligonucleotide NtMRP4Exon2FW <400> 56 gtgcaatctg gcaaatatag tgag 24 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Oligonucleotide NtMRP4Exon2REV <400> 57 aaaatgacat aggagcatgc agta 24 <210> 58 <211> 12 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 58 gaagctggaa tg 12 <210> 59 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 59 attttaaaga g 11 <210> 60 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 60 gatcgacact 10 <210> 61 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 61 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11 <210> 75 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 75 tgccattgca a 11 <210> 76 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 76 tttctgtggc 10 <210> 77 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 77 ctttagccat c 11 <210> 78 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 78 tttatactta 10 <210> 79 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 79 ttcaactgtt 10 <210> 80 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 80 taacactagc 10 <210> 81 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 81 tggacttgca 10 <210> 82 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 82 cagtgatggt a 11 <210> 83 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 83 aggcaacaaa t 11 <210> 84 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 84 ttataaagtt 10 <210> 85 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 85 caggcatggg 10 <210> 86 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 86 caggcatggg a 11 <210> 87 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 87 attgaatctt t 11 <210> 88 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 88 cgcgagtccg a 11 <210> 89 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 89 aatctttccg c 11 <210> 90 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 90 agtacggatg 10 <210> 91 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 91 ttgtccaagt t 11 <210> 92 <211> 12 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 92 agttcttgta ct 12 <210> 93 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 93 aatagctggt 10 <210> 94 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 94 cattgtcttg t 11 <210> 95 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 95 gagcactcct 10 <210> 96 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 96 ttgtcttgtg 10 <210> 97 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 97 agcactcctc 10 <210> 98 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 98 tggagcactc 10 <210> 99 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 99 tcttctagtt g 11 <210> 100 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 100 tacgctcact t 11 <210> 101 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 101 atcccgcttg 10 <210> 102 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 102 cgcaggaaca 10 <210> 103 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 103 gaaccgatca 10 <210> 104 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 104 ggctttccct 10 <210> 105 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 105 aaccgatcag 10 <210> 106 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 106 gctttccctc 10 <210> 107 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 107 catgatctca 10 <210> 108 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 108 tttcacaagc a 11 <210> 109 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 109 atctcttgat a 11 <210> 110 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 110 attggacaaa t 11 <210> 111 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 111 tattagaagc t 11 <210> 112 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 112 gaatggattt t 11 <210> 113 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 113 ttcaccgcga 10 <210> 114 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 114 atctctcttc 10 <210> 115 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 115 aaacaaccaa a 11 <210> 116 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 116 agagcaatgc 10 <210> 117 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 117 ccttgaagaa t 11 <210> 118 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 118 aaaatcttct c 11 <210> 119 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 119 agaatcaaaa t 11 <210> 120 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 120 ttctcgaaga t 11 <210> 121 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 121 tatctaagga a 11 <210> 122 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 122 aaaacggaga 10 <210> 123 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 123 tcaacagtct a 11 <210> 124 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 124 atctgatagg 10 <210> 125 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 125 gggattctaa a 11 <210> 126 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 126 acttataaag 10 <210> 127 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 127 aagaagaaag 10 <210> 128 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 128 aacttataaa g 11 <210> 129 <211> 12 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 129 aaagagaaac tg 12 <210> 130 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 130 gctatatatt a 11 <210> 131 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 131 tgaagctttt g 11 <210> 132 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 132 gaagcttttg 10 <210> 133 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 133 ttggatggtg 10 <210> 134 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 134 ggcgtagtgc t 11 <210> 135 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 135 ttgtggcaaa 10 <210> 136 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 136 ttctctaatg 10 <210> 137 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 137 gttctctaat 10 <210> 138 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 138 gcaaagttct 10 <210> 139 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 139 taatggcaag 10 <210> 140 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 140 catatgaaac 10 <210> 141 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 141 caacaaatga 10 <210> 142 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 142 atgcttaatt 10 <210> 143 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 143 cttcagcrga y 11 <210> 144 <211> 12 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 144 gtgccatgtc ct 12 <210> 145 <211> 11 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 145 tgtccttcaa t 11 <210> 146 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 146 cttctctgtt 10 <210> 147 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 147 ggcatgggaa 10 <210> 148 <211> 10 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 148 aacattttaa 10

Claims (15)

  1. (a) (i) SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28 또는 29 또는 51과 최소한 71%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 또는
    (ii) SEQ ID NOs: 3 내지 23 또는 30 내지 50 또는 53 중 어느 것과 최소한 65%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 또는
    (iii) SEQ ID NOs. 24 내지 26 또는 52 중 어느 것과 최소한 65%의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지고, 중금속 수송 활성을 갖는 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드:
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드; 또는
    (b) SEQ ID NOs: 1 내지 23 또는 27 내지 51 또는 53 중 어느 것의 영역과 최소한 65% 동일한, 길이가 최소한 15 연속 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 구축물; 또는
    (c) 서로 최소한 부분적으로 상보적인 두 개 이상의 서열을 포함하고, 센스 가닥은 제1 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 제2 서열을 포함하고, 그리고 서열들 중 하나 이상은 NtMRP RNA의 최소한 10 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 RNA; 또는
    (d) (i), (ii) 또는 (iii)에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 (b)에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 발현 벡터
    를 포함하는 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물 또는 식물 세포.
  2. NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되고 그리고 상기 식물의 잎은, NtMRP의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 최소한 5%의 카드뮴 함량이 감소된, 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물.
  3. 제1항 또는 제2항의 식물의 세포 또는 조직을 포함하는 바이오매스, 종자 또는 잎을 포함하는 식물 재료.
  4. 제1항 또는 제2항의 식물의 일부 또는 제3항에 따른 식물 재료를 포함하는 담배 제품.
  5. NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성을, NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여 감소시키는 단계를 포함하는, 식물의 최소한 일부에서 카드뮴 수준을 감소시키는 방법.
  6. NtMRP 폴리뉴클레오티드의 발현과 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성 또는 그것에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되지 않은 대조 식물과 비교하여, 식물의 최소한 일부에서 카드뮴 함량이 최소한 약 5% 감소된, 제5항에 따른 방법으로 얻을 수 있는 돌연변이, 비자연발생 또는 유전자이식 식물.
  7. (i) SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28 또는 29 또는 51과 최소한 71% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 이루어진 또는 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오티드; 또는
    (ii) SEQ ID NOs: 3 내지 23 또는 30 내지 50 또는 53 중 어느 하나와 최소한 65% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 이루어진 또는 본질적으로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 발현되는 단리된 NtMRP 폴리펩티드; 또는
    SEQ ID Nos. 24 내지 26 또는 52 중 어느 것에 기재된 서열을 포함하는, 이루어진 또는 본질적으로 이루어진 단리된 NtMRP 폴리펩티드로, 여기서 상기 폴리펩티드는 중금속 수송 활성을 갖는 것인, 단리된 NtMRP 폴리펩티드.
  8. 제7항에 따른 단리된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  9. (a) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 상기 샘플을 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 최소한 일부를 특이적으로 검출하는 하나 이상의 프라이머 또는 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 증폭 산물의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 샘플에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하는 방법으로,
    증폭 산물의 존재는 샘플에서 NtMRP 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는, 검출 방법.
  10. SEQ ID NOs: 1, 2, 27, 28 또는 29 또는 51과 최소한 71% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 이루어진 또는 본질적으로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드;
    SEQ ID NOs: 3 내지 23 또는 30 내지 50 또는 53 중 어느 하나와 최소한 65% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 이루어진 또는 본질적으로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드;
    SEQ ID NOs. 24 내지 26 또는 52와 최소한 65% 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는, 이루어진 또는 본질적으로 이루어진 NtMRP 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 폴리펩티드는 중금속 수송 활성을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  11. SEQ ID NOs: 1 내지 23 또는 27 내지 51 또는 53 중 어느 것의 영역과 최소한 65% 동일한, 길이가 최소한 15 연속 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 구축물.
  12. 서로 최소한 부분적으로 상보적인 두 개 이상의 서열을 포함하는 이중가닥 RNA로, 여기서 센스 가닥은 제1 서열을 포함하고 안티센스 가닥은 제2 서열을 포함하고 그리고 여기서 상기 서열 중 최소한 하나는 NtMRP RNA의 최소한 10 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 RNA.
  13. 제12항에 있어서,
    NtMRP3 또는 NtMRP4의 최소한 10 뉴클레오티드와 최소한 65% 서열 상동성을 갖는 제1 서열;
    제2 서열; 및
    제1 서열과 동일한 배열로 위치하는, 제1 서열의 역 상보서열을 갖는 제3 서열을 포함하는 이중 가닥 RNA로,
    여기서 제2 서열은 제1 서열과 제3 서열 사이에 위치하고, 제2 서열은 제1 서열과 제3 서열에 기능적으로 연결되는 이중 가닥 RNA.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 제1 서열은 SEQ ID NOs: 3 내지 23 및 30 내지 50 및 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 최소한 65% 서열 상동성을 갖고 및/또는 제3 서열은 SEQ ID NOs: 3 내지 23 및 30 내지 50 또는 53에 상응하는 서열의 역 보체와 최소한 65% 서열 상동성을 갖는 이중 가닥 RNA.
  15. 제10항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제11항에 따른 폴리뉴클레오티드 구축물을 포함하는 발현 벡터.
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