KR20140001165A - 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에탄올발효를 하지 못하도록 피루베이트 탈탄산 효소를 불활성화 시킨 크렙트리 음성 효모인 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)균주와 이 균주에 여러 가지 외인성 유전자를 도입하여 다양한 유기산을 생산하는 효모 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하여 젖산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 피루베이트 탈탄산 효소 활성이 불활성화된 돌연변이 균주는 젖산 생산시 에탄올을 생산하지 않으며 이 균주에 외인성 유전자를 도입하여 유기산을 생산할 수 있는 균주를 통해 효과적으로 유기산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도{Kluyveromyces marxianus deficient in the ethanol fermentation and use thereof}

본 발명은 피루베이트 탈탄산효소를 불활성화 시킨 크렙트리 음성 효모인 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)균주와 이 균주에 여러 가지 외인성 유전자를 도입하여 다양한 유기산을 생산하는 효모 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하여 젖산(Lactic acid)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

석유자원의 고갈이 다가옴에 따라 석유로부터 추출되는 여러 가지 화합물을 재생 가능한 원료로부터 생산하는 신재생 에너지 및 바이오화학 분야의 연구가 경쟁적으로 진행되고 있다.

석유로부터 추출되는 여러 가지 화합물 중에서 젖산(Lactic acid, Lactate, 락테이트)과 같은 유기 생성물은 산업적으로 그 사용이 중요시되고 있다. 예를 들어, 유기산은 가소성 재료 및 다른 생성물을 합성하는데 사용될 수 있다. 이러한 유기 생성물에 대한 수요의 증대에 대응하여 더 효과적이고 비용효율적인 생산 방법이 개발되고 있다. 이러한 방법 중 한가지는 박테리아를 이용하는 것이다. 구체적으로, 일부 박테리아는 다량의 특별한 유기 생성물을 일정 발효조건 하에서 생성할 수 있다. 살아있는 박테리아를 생산자로 사용하는 것은 유기 생성물이 성장 배지 내에 축적되므로 박테리아의 성장에 한계를 가져오는 단점이 있었다. 해당 단점을 극복하기 위하여, 다양한 생성물 정제 기술이 합성과정에서 사용되어 왔다. 덧붙여서, 박테리아를 제외한 다른 미생물을 사용하는 것도 시도되었다.

상기 유기 생성물 중 가장 대표적인 화합물 중의 하나인 젖산은 생분해성 폴리머로서의 기능이 입증되어 미생물을 이용한 생산 방법이 연구개발되고 있다. 젖산을 생산하는 미생물인 락토바실러스는 이미 많은 종류가 알려져 있으나 이러한 미생물을 배양하여 젖산을 생산하면 두 가지 광학이성질체 젖산(D-lactate, L-lactate)이 함께 생산되는 단점이 있었다.

이로 인하여 최근에는 본래 젖산을 생산하지 못하는 효모의 유전자를 조작하여 젖산을 생산하는 방법이 개발되고 있다. 효모에서 젖산을 생산하기 위해서는 락테이트 탈수소 효소를 선택적으로 도입하면 D- 혹은 L-젖산을 순수하게 생산할 수 있다. 열안정성이 높은 생분해성 폴리머를 제작하기 위해서는 L-젖산과 함께 동량의 D-젖산을 필요로 하지만, L-젖산에 비하여, D-젖산 생산에 관한 연구는 상대적으로 부족한 상태이다. 일반적인 효모 균주를 젖산 생산 균주로 사용하면 젖산과 함께 에탄올이 부산물로 함께 생성되어 젖산의 생산성을 감소시키는 단점이 있다.

이러한 단점을 개선하기 위하여 피루베이트 탈탄산 효소를 불활성화시켜 에탄올 경로를 차단하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 피루베이트 탈탄산 효소가 불활성화된 균주는 야생균주에 비하여 성장이 매우 느려지는 단점을 내포하고 있다. 따라서, 순수한 광학이성질체 젖산을 선택적으로 고농도 생산하며, 부산물로 에탄올을 생산하지 않고, 피루베이트탈탄산 효소의 불활성화에도 성장능이 유지되며 낮은 pH에서도 생리적 특성을 유지하는 효모의 개발이 시급한 상황이다.

이러한 종래의 균주가 가지는 문제를 개선하기 위하여 본 발명자들은, 탄소원 사용능과 고온에 대한 저항성을 비교하여 최적의 균주를 선별하였으며 피루베이트 탈탄산 효소가 불활성화된 균주를 제작하고 클루이베로마이세스 막시아누스 균주에서 높은 활성을 나타내는 D 혹은 L-락테이트 탈수소 효소 유전자를 선별하여 최적 발현 균주를 제작함으로써 야생형 균주와 유사한 수준으로 성장이 회복되고 선택적으로 D 혹은 L-젖산을 생산할 수 있는 균주를 제작하였다. 이러한 방법으로 제작된 균주를 이용하면 저가의 바이오매스인 돼지감자 분말로부터 고농도의 순수한 D 혹은 L-젖산을 선택적으로 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 모균주인 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)에 있어서, 피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase)가 불활성화된 클루이베로마이세스 막시아누스 변이균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 젖산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 모균주인 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)에 있어서, 피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase)가 불활성화된 클루이베로마이세스 막시아누스 변이균주를 제공한다. 본 발명의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주는 크렙트리 음성 균주의 일종이다.

크렙트리(Crabtree)란, 글루코오스 첨가에 의해 세포의 호흡이 억제되는 현상을 뜻하는 크렙트리 효과(Crabtree effect)와 같은 의미이다. 본 발명에서 용어, "크렙트리 음성 균주"는 상기 크렙트리 현상, 곧 글루코오스 첨가에 의해 세포의 호흡이 억제되는 현상이 일어나지 않는 형질을 가지는 균주를 뜻한다.

본 발명에서 모균주는 바람직하게는 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)일 수 있다. 클루이베로마이세스 막시아누스는 고온에서의 성장 능력, 빠른 성장율 및 과량의 당에 노출되었을 때 에탄올을 생산하는 경향이 적은(크렙트리 음성형) 특성을 갖는 효모 균주이다. 특히, 과량의 이눌린(Inulin) 분해효소를 분비하기 때문에 이눌린을 과량 포함하고 있는 돼지감자를 영양원으로 사용할 수 있는 능력이 뛰어난 효모이다. 일반적인 효모 균주와 달리 클루이베로마이세스 막시아누스는 많은 strain이 보고되어 있으며, strain에 따라 매우 다양한 생리적 특성을 나타내는 특성이 있다. 심지어는 동일한 strain이라도 다른 연구 그룹간 상이한 결과가 보고되기도 하였다. 따라서, 본 발명에서는 요구하는 특성을 갖는 클루이베로마이세스 막시아누스의 특정 strain을 선별하는 것이 중요한 과정이다.

본 발명의 모균주인 클루이베로마이세스 막시아누스는, 바람직하게는 수탁번호 KCTC 7001, KCTC 7118, KCTC 7149, KCTC 7150, KCTC 7155, KCTC 7524, KCTC 17212, KCTC 17544, KCTC 17555, KCTC 17631, KCTC 17694, KCTC 17724, KCTC 17725, KCTC 17759(대전 한국생명공학연구원 소재 유전자은행), BY25569, BY25571, 및 BY25573(Yeast Genetic Resource center ,Japan)로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 KCTC 7155, KCTC 17631, BY25569, BY25571, 및 BY25573로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으며, 가장 바람직하게는 BY25571 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 대전 한국생명공학연구원 소재 유전자은행에서 15종의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주를 분양받고, Yeast Genetic Resource center (Japan)로부터 3종의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주를 분양받아 섬유소 기질 분해 능력, 고온내성 등을 조사하였다(실시예 1-1 및 1-2). 먼저, 섬유소 기질 분해 능력에 대해서는 표 1에서 볼 수 있듯이, 상기 클루이베로마이세스 막시아누스 균주를 2% Carboxymethyl cellulose(CMC)와 cellobiose(CB)가 포함된 YP(1% Yeast extract, 2% Peptone) 배지에서 키운 결과 KCTC 7155, KCTC 17724, KCTC 17631, BY25569, BY25571, 및 BY25573의 여섯 종의 균주의 생장능이 높아, 섬유소 기질 분해 능력이 높은 것을 확인하였다.

또한, 섬유소 기질 분해 능력이 높은 여섯 종의 균주에 대하여 고온 내성을 확인한 결과 KCTC 7155, BY25569, BY25571, BY25573 균주는 열에 대한 내성이 높은 것을 확인하였다 (도 1). 이에 따라 상기 4개의 균주는 모균주로서, 바람직한 특성을 가지고 있음을 확인하였다. 상기와 같은 실험으로 높은 섬유소 기질 분해 능력 및 고온내성을 가지는 균주를 모균주로 선별하여 이하 변이균주를 제작하였다. 구체적으로는, 높은 섬유소 기질 분해 능력과 고온내성을 가지는 4개의 균주 중에 대표적으로 BY25571 균주를 모균주로 선별하여 변이균주를 제작하였다.

한편, 본 발명의 목적은 알코올 생산이 적고 특정 유기산의 생성이 증가된 특성을 갖는 균주를 제공하는데 있다. 따라서, 상기 천연형 균주들을 바탕으로 알코올 생산이 적고 특정 유기산의 생산이 증가되는 형질전환체를 만들기 위해 피루베이트 탈탄산 효소 활성을 제거할 수 있다.

본 발명의 용어, "피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase, PDC)"는 피루베이트에 작용하여 탄산과 아세트 알데히드를 생성하는 반응(CH₃COCOOH->CH₃CHO + CO₂)를 촉매하는 효소이다. 알코올 생성과 관련해서는 알코올 발효의 한 단계에서 필수적인 효소이다. 따라서, 본 발명에서 상기 균주에 존재하는 피루베이트 탈탄산 효소를 불활성화시켜 발효에 의한 알코올 생성이 저해된 균주를 제공할 수 있다. 바람직하게는, 상기 균주는 당이 포함된 배지에서 배양시 에탄올의 생성이 피루베이트 탈탄산 효소가 불활성화되지 않은 균주에 비해 감소되는 것인 균주일 수 있다. 또한, 상기 피루베이트 탈탄산 효소의 불활성화는 해당 효소의 유전자에 치환, 결손, 또는 부가되어 이루어질 수 있다.

일반적으로 균주 내 유전자의 불활성화는 여러 가지 형태로 제작할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호구조의 변형 또는 안티센스(antisense)-RNA 기술에 의해 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호 구조는, 예를 들어 억제(repressor) 유전자, 활성화(activator) 유전자, 작동자(operator), 프로모터, 감쇠자(attenuator), 리보솜 결합 자리, 시작 코돈(codon) 그리고 종료자(terminator) 들이며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)을 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제하는 메커니즘인 RNA 간섭(RNA interference:RNAi) 방법을 사용할 수 있다. 또는, 단일 세포의 게놈 내에서 다른 위치로 이동할 수 있는 DNA 서열인 트랜스포존을 매개로 한 돌연변이를 일으켜 목적 유전자의 기능을 차단하여 불활성화하는 방법을 사용할 수도 있다. 유전자 단백질의 촉매 활성의 변화 또는 감소를 유도하는 돌연변이들은 당업계에 잘 알려져 있다(Qiu와 Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617(1997))).

바람직하게는, 유전자의 불활성화는 단일 또는 복합 염기서열의 변이, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 유전자 내에 외래 유전자의 삽입, 유전자군 전체의 결손, 유전자군의 프로모터의 억제 서열 삽입, 프로모터의 돌연변이, 유전자군의 발현 억제 조절 삽입, 유전자군의 단일 또는 복합 염기서열에 대한 RNAi 도입, 트랜스포존 매개 돌연변이 또는 이러한 변이체들의 조합 중 하나의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

상기에 기술한 방법들은 본 기술 분야에 통상의 사람에게 일반적으로 이해되어지며, Sambrook et al.(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press 2001)에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

유전자의 염기 서열 중 활성 부위의 단일 또는 복합 서열을 변화하여, 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 매우 낮출 수도 있고, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 염기서열 내부에 외래 유전자인 항생제 내성 유전자나 다른 유전자를 삽입하여 완전한 단백질이 발현되지 못하게 하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 염색체에 존재하는 유전자의 염기 서열을 모두 결손하는 방법을 사용할 수도 있다. 또는 상기 방법에 의한 변이체의 조합으로 불활성화시킬 수 있다.

상기 피루베이트 탈탄산 효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 서열번호 41을 포함하는 유전자일 수 있다.

상기 피루베이트 탈탄산 효소가 불활성화된 균주는 이에 제한되지 않으나, 수탁번호 KCTC12225BP인 균주일 수 있다.

한편, 알코올 생성에 관여하는 효소는 피루베이트 탈탄산 효소 외에도 알코올 탈수소 효소(Alcohol Dehydrogenase, ADH)가 있다. 본 발명의 "알코올 탈수소 효소"는 알코올 발효에 관여하는 효소로 알코올에서 수소를 이탈시켜 알데히드 또는 케톤을 형성하는 촉매이며, 가역적 촉매임에 따라 알코올이 생성되는 방향으로 반응을 진행시킬 수도 있는 촉매이다(CH₃CH₂OH + NAD⁺ <-> CH₃CHO + NADH + H⁺). 기질 특이성이 폭넓어 다른 알코올에도 작용한다.

본 발명의 균주는 피루베이트 탈탄산 효소의 불활성화에 더해 바람직하게는, 알코올 탈수소 효소가 추가로 불활성화될 수 있다. 상기 알코올 탈수소 효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 서열번호 37 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 하나 이상을 포함하는 유전자일 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서는 클루이베로마이세스 막시아누스 균주를 유전체 분석하여 4개의 ADH 유전자와 한 개의 PDC 유전자가 존재하고 있음을 확인하였다. 에탄올 생산을 저해하는 균주를 제작하기 위해 클루이베로마이세스 막시아누스 BY25571 균주의 알코올 탈수소 효소 유전자(ADH) 또는 피루베이트 탈탄산 효소 유전자 (PDC1)가 결실된 균주(수탁번호 KCTC12225BP)를 제작하였다 (실시예 2).

상기 5개 결실 변이 균주들이 에탄올을 탄소원으로 이용하는지 확인하기 위해 YP-2% 에탄올 배지에서 세포 성장을 확인하였다. YP-2% 글루코오스를 대조구로 하여 비교해 본 결과 5개 균주 모두 에탄올을 탄소원으로 잘 이용하는 것으로 확인하였다(도 7).

이에 더하여, 에탄올 발효를 통하여 각 균주들의 에탄올 생산량을 비교하였다. 각 균주들을 최소영양배지에서 24시간 seed culture 후 50g/L의 글루코오스가 첨가된 에탄올 발효배지(Y.E 0.5%, pepton 0.5%, KH₂PO₄, Ammonia sulfate 0.2%, MgSO₄·H₂O 0.04%)에서 30℃, 150rpm으로 배양하였으며 세포 생장과 생산된 에탄올을 측정하였다. 그 결과 adh 변이 균주들은 천연형 균주와 비교하였을 때 큰 차이 없이 에탄올이 생성되었지만, pdc1 변이 균주는 에탄올을 전혀 생산하지 않는 것을 확인하였다(도 7).

또한, 본 발명의 목적은 특정 유기산을 생성하는 특성을 갖는 균주를 제공하는데 있다. 이를 위해, 상기 알코올 생산 경로가 봉쇄된 크렙트리 음성 균주(클루이베로마이세스 막시아누스)에 특정 유기산 생성과 관련되는 여러 가지 외인성 유전자를 도입한 균주를 이용하여 다양한 유기산을 생산할 수 있다.

본 발명의 용어, "외인성 유전자"는 천연형 균주에 속해 있지 않았던 핵산 서열을 일정한 목적을 위해 외부에서 도입한 경우의 해당 유전자를 뜻한다. 특히, 본 발명에서는 특정 유기산의 생성과 관련되는 유전자를 의미한다.

바람직하게는, 본 발명에서는 균주의 목적이 되는 특정 유기산이 젖산일 수 있다. 더욱 바람직하게는 광학이성질체인 L-젖산 혹은 D-젖산일 수 있다.

상기 젖산을 생성하기 위해 균주에 도입되는 외인성 유전자는 바람직하게는 락테이트 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase, LDH) 활성을 갖는 유전자일 수 있다.

본 발명의 용어, "락테이트 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase)"는 일반적으로 NAD⁺를 이용하여 L-젖산 혹은 D-젖산에서 수소를 이탈시켜 피루브산으로 만드는 효소로, 이와는 역반응인 해당의 최종단계를 촉매할 때에는 NADH를 이용하여 피루브산을 환원하여 L-젖산 혹은 D-젖산을 생성하는 효소이다. 즉, L-락테이트 탈수소 효소 또는 D-락테이트 탈수소 효소일 수 있다. 상기, 락테이트 탈수소 효소 활성을 갖는 유전자는 천연형 락테이트 탈수소 효소뿐 아니라, 이와 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 의 상동성을 가지는 동일한 활성을 갖는 효소의 유전자를 포함한다. 천연형 락테이트 탈수소 효소에 돌연변이를 유도한 변이 유전자 또한, 락테이트 탈수소 효소 활성을 갖는 이상, 서열에 무관하게 본 발명의 락테이트 탈수소 효소에 포함된다.

상기 락테이트 탈수소 효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 서열번호 42 내지 50로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하는 유전자일 수 있다. 특히, L-젖산을 생산하는 락테이트 탈수소 효소는 서열번호 42 내지 46로 이루어진 군에서 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 유전자일 수 있으며, D-젖산을 생산하는 락테이트 탈수소 효소는 서열번호 47 내지 50로 이루어진 군에서 선택된 하나의 염기서열을 포함하는 유전자일 수 있다. 본 발명의 균주에서 락테이트 탈수소 효소는 클루이베로마이세스 막시아누스 유래의 TEF1a 프로모터를 이용하여 발현할 수 있다.

상기 알코올 생산 경로가 봉쇄된 크렙트리 음성 균주에 락테이트 탈수소 효소를 도입한 균주는 이에 제한되지 않으나, 수탁번호 KCTC12226BP인 균주일 수 있다.

본 발명에서 용어, "돌연변이"는, 유전자의 유전적 기능을 변화시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로는 유전자의 돌연변이는 생물의 여러 가지 변이 중 유전자의 양적 또는 질적인 변화에 의해 생긴 변이를 말한다. 즉, DNA 염기 중 하나 이상이 다른 염기로 치환된 분자 수준의 변화, 즉, DNA의 하나 또는 다수 염기의 치환, 결실, 부가, 역위, 중복 또는 염기 중 1~2개의 삽입 또는 결실에 따른 염기배열의 이동(frame shift)과 같은 분자 수준의 변화를 통해 그 DNA가 갖는 유전정보에 따라 제조되는 효소나 펩타이드가 만들어지지 않거나 활성이 소실되는 변화가 나타나거나 원래의 활성이 증대되거나 변화하는 것을 의미하는데, 본 발명의 유전자를 손상 또는 변화시키는 돌연변이 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 돌연변이 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 한 실시예에서는 L-락테이트 또는 D-락테이트 탈수소효소 (LDH) 유전자를 확보하기 위하여 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis로부터 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 시료를 주형으로 PCR을 수행하여 증폭된 유전자를 T-easy vector에 클로닝하여 각 유전자를 확보하였다. L-LDH 유전자와 D-LDH 유전자를 클루이베로마이세스 막시아누스에서 발현하기 위해 plasmid pTEFp-GAPt에 삽입하여 8개의 벡터를 구축하였다 (도 8). 구축된 벡터를 제한효소 NheⅠ으로 처리하여 선형 DNA 상태로 만들고 URA3 auxotroph균주인 BY25571 균주와 PDC1 mutant 균주인 BY25571Δpdc1에 형질전환하여 형질전환체로부터 단일 균주(수탁번호 KCTC12226BP)를 선별하였으며 배양조선에 따른 L-젖산과 D-젖산 생산량을 비교하여 최고농도의 L-젖산과 D-젖산을 생산하는 균주를 선별하였다(실시예 5).

본 발명의 균주는 L-락테이트 사이토크롬-c 산화환원효소(L-lactate cytochrome-c oxidreductase, CYB2)가 추가로 불활성화된 변이균주일 수 있다. 즉, 피부베이트 탈탄산 효소가 불활성화되고 이에 추가로 L-락테이트 사이토크롬-c 산화환원효소가 불활성화되는 것일 수 있다. 본 발명에서 불활성화는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "L-락테이트 사이토크롬-c 산화환원효소(L-lactate cytochrome-c oxidreductase, CYB2)"는 L-락테이트의 산화를 촉진하는 효소이다. 특히 본 발명의 L-락테이트 사이토크롬-c 산화환원효소는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 서열번호 57의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 균주는 원형질막 ATPase(plasma membrane ATPase, PMA1) 활성이 강화된 변이균주일 수 있다.

본 발명에서 "원형질막 ATPase(plasma membrane ATPase, PMA1)"는 수소이온 펌프의 하나로 양자 기울기를 유지하는 것을 통하여 각종 능동 수송의 원동력을 주는 효소이다. 특히 본 발명의 원형질막 ATPase는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 서열번호 58의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명에서 단백질의 활성을 강화하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 해당 단백질을 코딩하는 염기서열과 자체 혹은 외부로부터 도입된 발현조절부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 염색체에 삽입하는 방법, 벡터 시스템에 도입하는 방법에 의하여 카피수를 증가시키는 방법, 유전자의 발현을 조절하는 발현조절부위를 다른 조절서열로 치환, 발현조절부위의 염기서열 전체 혹은 일부 돌연변이가 유발된 변형, 유전자 자체의 변이도입에 의한 효소활성 강화 등에 의한 방법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이에 본 발명의 균주는 수탁번호 KCTC12435BP의 BY25571Δpdc1,cyb2-PMA1//L-LpLDH 균주일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 낮은 pH에서 젖산 생산성을 증가시키기 위해, 상기 실시예 2에서 제조한 균주(KCTC12225BP)에서 KmCYB2(L-lactate cytochrome-c oxidoreductase) 유전자를 결실시키고 KmPMA1(plasma membrane ATPase) 유전자를 과발현시키는 변이를 도입하였다. 이에 L-락테이트 탈수소 효소(L-LpLDH)를 도입하였다. 이렇게 제조한 균주를 BY25571Δpdc1,cyb2-PMA1//L-LpLDH로 명명하고, 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2013년 6월 26일 기탁하여, 수탁번호 KCTC12435BP를 수여받았다. 균주들을 배양하여 HPLC를 통하여 L-젖산 생산량을 확인한 결과 25571Δpdc1,cyb2-PMA1/L-LpLDH 균주의 경우 pH를 조절하는 조건과 pH를 조절하지 않는 조건 모두 25571Δpdc1/L-LpLDH보다 젖산 생산량이 20% 정도 증가한 것을 확인하였다(표 6).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 젖산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 젖산을 생산하는 방법은, 상기의 균주 중에서 에탄올 생성 경로가 봉쇄되고, 성장능이 유지되면서 젖산의 생산능이 높게 유지되는 형질전환 균주를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 균주의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 적절한 배양 방법으로는 유가식 배양(fed-batch culture), 회분식 배양(batch culture) 및 연속식 배양(cintinuous culture) 등이 가능하며, 바람직하게는 회분식 배양이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다.

본 발명에서 상기 균주는 저가로 대량공급이 가능한 바이오매스인 돼지감자 분말을 영양원으로 이용하여 배양될 수 있다. 본 발명의 용어, "돼지감자 분말 배지"는 일체의 전처리를 하지 않고 돼지감자 분말만을 포함하는 영양 배지이다. 완전 배지이기 때문에 선별을 위한 배지로는 사용될 수 없다.

상기 배양 배지를 이루는 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는, 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.

바람직하게는 상기 생산되는 젖산은 광학이성질체인 L-젖산과 D-젖산일 수 있다. 이는 도입하는 LDH의 종류에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 피루베이트 탈탄산 효소 활성이 불활성화된 돌연변이 균주는 에탄올을 생산하지 않으며 이 균주에 외인성 유전자를 도입하여 피루베이트를 유기산으로 전환할 수 있는 균주를 통해 바이오매스로부터 효과적으로 유기산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 strain이 다른 클루이베로마이세스 막시아누스 균주들의 고온내성을 확인한 도면이다.
도 2는 URA3 cassette를 이용한 ADH1 gene disruption 과정 및 PCR을 이용하여 ADH1 gene disruption을 확인하는 도면이다.
도 3은 URA3 cassette를 이용한 ADH2 gene disruption 과정 및 PCR을 이용하여 ADH2 gene disruption을 확인하는 도면이다.
도 4는 URA3 cassette를 이용한 ADH3 gene disruption 과정 및 PCR을 이용하여 ADH3 gene disruption을 확인하는 도면이다.
도 5는 URA3 cassette를 이용한 ADH4 gene disruption 과정 및 PCR을 이용하여 ADH4 gene disruption을 확인하는 도면이다.
도 6은 URA3 cassette를 이용한 PDC1 gene disruption 과정 및 PCR을 이용하여 PDC1 gene disruption을 확인하는 도면이다.
도 7은 에탄올 생산용 배지에서 세포성장에 따른 에탄올 생산량을 측정한 그래프이다.
도 8은 L-LDH 또는 D-LDH 발현을 위한 클루이베로마이세스 막시아누스 vector를 나타낸 모식도이다.
도 9는 30℃(A)와 35℃(B)에서 L-젖산 생산량, 포도당 소모를 측정한 그래프이다.
도 10은 돼지감자 분말로부터 L-젖산 생산량(A), D-젖산 생산량(B), 포도당 소모를 측정한 그래프이다.
도 11은 URA3 cassette를 이용한 CYB2 gene disruption 과정 및 PCR을 이용하여 CYB2 gene disruption을 확인하는 도면이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 선별

일반적인 효모 균주와 달리 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus, KM)는 상당히 많은 strain이 보고 되어있으며 그에 따라 매우 다양한 생리적 특성을 나타내며 심지어 동일한 strain이라도 다른 그룹에서는 상이한 결과가 보고되고 있다. 따라서 목적하는 용도에 적합한 strain을 선별하는 것이 클루이베로마이세스 막시아누스를 산업 균주로 활용하기 위해서는 매우 효율적인 방법이다.

대전 한국생명공학연구원 소재 유전자은행에서 15종의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주를 분양 받았고, Yeast Genetic Resource center (Japan)로부터 3종의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주를 분양 받아 섬유소 기질 분해 능력, 고온내성 등을 조사하였다.

실시예 1-1: 섬유소기질 분해 능력 비교

KM 균주는 원래 섬유소 분해기능이 없지만 일부 균주에서 약한 섬유소 분해능을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 섬유소 분해 효능이 강한 균주를 선별하기 위해 18종의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주를 2% Carboxymethyl cellulose(CMC)와 cellobiose(CB)가 포함된 YP(1% Yeast extract, 2% Peptone) 배지에서 30℃에서 48시간 동안 배양하여 셀룰라아제(cellulase) 활성에 의한 세포의 생장능을 분석하였다. 상기 섬유소 분해능력을 요하는 배지에서 대부분 균주의 생장이 약하게 있음을 확인하였고 특히 KCTC 7155 균주와 BY25569, BY25571, BY25573균주의 생장능이 비교적 높은 것을 확인하였다(표 1).

클루이베로마이세스 막시아누스 균주들의 섬유소 기질 활용 세포성장능 비교

strain	세포의 성장정도
	YP+CB	YP+CMC
KCTC 7001	++	+
KCTC 7118	-	-
KCTC 7149	++	+
KCTC 7150	++	+
KCTC 7155	+++	+++
KCTC 7524	++	+
KCTC 17212	++	+
KCTC 17544	++	+
KCTC 17555	++	++
KCTC 17631	+++	++
KCTC 17694	++	+
KCTC 17724	++	++
KCTC 17725	++	+
KCTC 17759	++	+
BY25569	+++	+++
BY25571	+++	+++
BY25573	+++	+++

실시예 1-2: 고온내성 비교

바이오에탄올 발효균주로서 섬유소 기질을 사용할 때 섬유소 분해효소의 최적온도가 40-50℃이므로 이러한 온도에서 내성을 갖는 효모의 개발이 필요하다. 섬유소 기질에서 성장성이 좋은 6종의 균주를 선별하여 고온에 대한 내성을 비교하였다. 세포 배양액을 YPD(1% Yeast extract, 2% Peptone 및 2% 글루코오스) 배지에 dotting 한 후 42℃, 45℃, 50℃에서 24시간동안 배양한 결과, KTCT 17724 균주는 열에 대한 내성이 낮았고 KTCT 7155, BY25569, BY25571, BY25573 균주는 열에 대한 내성이 높은 것을 확인하였다 (도 1). 이에 따라 상기 4개의 균주는 모균주로서, 바람직한 특성을 가지고 있음을 확인하였다. 섬유소기질 분해 능력과 열에 대한 내성이 높은 4개의 균주 중에 대표적으로 BY25571 균주를 모균주로 선별하여 변이균주를 제작하였다.

실시예 2. ADH1 , ADH2 , ADH3 , ADH4 , PDC1 유전자 결실 균주 제작

유전체 분석 결과 클루이베로마이세스 막시아누스 균주는 사카로마이세스 세레비지에와는 달리 4개의 알코올 탈수소 효소 유전자(ADH)와 한 개의 피루베이트 탈탄산 효소 유전자 (PDC1)가 존재하고 있음을 확인하였다. 에탄올 생산을 저해하는 균주를 제작하기 위해 클루이베로마이세스 막시아누스 BY25571 균주의 알코올 탈수소 효소 유전자 또는 피루베이트 탈탄산 효소 유전자가 결실된 균주를 제작하였다.

실시예 2-1: ADH1 유전자 결실 균주 제작

genomic DNA를 template로 하여 ADH1 ORF의 upstream과 downstream에서 각 300 bp의 DNA 절편을 HJ368(서열번호 1)과 HJ369(서열번호 2), HJ370(서열번호 3)과 HJ371(서열번호 4) primer를 이용하여 증폭 후 primer Tc-f(서열번호 6)와 U200r(서열번호 7), U200f(서열번호 8)와 Tc-r(서열번호 9)을 이용하여 증폭된 URA3 DNA 절편과 overlap extension PCR을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 두 절편을 연결하였고, PCR fragment는 BY25571 균주에 형질전환하여 ADH1 locus에 도입된 균주를 uracil이 없는 선택배지(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.077% Ura-DO supplement, 2% 글루코오스, 2% agar)에서 선별하였다. 형질전환 여부를 primer HJ368과 HJ372(서열번호 5), U200f와 HJ372를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 PCR band를 확인하였다. ADH1 유전자가 남아있는지 확인하기 위해 HJ394(서열번호 10)와 HJ371 primer를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 URA3 cassette에 의해 ADH1 유전자(서열번호 37)가 knock-out되었음을 확인하였다(도 2).

실시예 2-2: ADH2 유전자 결실 균주 제작

genomic DNA를 template로 하여 ADH2 ORF의 upstream과 downstream에서 각 300 bp의 DNA 절편을 HJ458(서열번호 11)과 HJ459(서열번호 12), HJ460(서열번호 13)과 HJ461(서열번호 14) primer를 이용하여 증폭 후 primer Tc-f와 U200r, U200f와 Tc-r을 이용하여 증폭된 URA3 DNA 절편과 overlap extension PCR을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 두 절편을 연결하였고, PCR fragment는 25571균주에 형질전환하여 ADH2 locus에 도입된 균주를 uracil이 없는 선택배지(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.077% Ura-DO supplement, 2% 글루코오스, 2% agar)에서 선별하였다. 형질전환 여부를 primer HJ458과 HJ462(서열번호 15), U200f와 HJ462를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 PCR band를 확인하였다. ADH2 유전자가 남아있는지 확인하기 위해 HJ463(서열번호 16)와 HJ461 primer를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 URA3 cassette에 의해 ADH2 유전자(서열번호 38)가 knock-out되었음을 확인하였다(도 3).

실시예 2-3: ADH3 유전자 결실 균주 제작

genomic DNA를 template로 하여 ADH3 ORF의 upstream과 downstream에서 각 300 bp의 DNA 절편을 HJ412(서열번호 17)과 HJ413(서열번호 18), HJ414(서열번호 19)과 HJ415(서열번호 20) primer를 이용하여 증폭 후 primer Tc-f와 U200r, U200f와 Tc-r을 이용하여 증폭된 URA3 DNA 절편과 overlap extension PCR을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 두 절편을 연결하였고, PCR fragment는 25571균주에 형질전환하여 ADH3 locus에 도입된 균주를 uracil이 없는 선택배지(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.077% Ura-DO supplement, 2% 글루코오스, 2% agar)에서 선별하였다. 형질전환 여부를 primer HJ412과 HJ416(서열번호 21), U200f와 HJ416를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 PCR band를 확인하였다. ADH3 유전자가 남아있는지 확인하기 위해 HJ434(서열번호 22)와 HJ415 primer를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 URA3 cassette에 의해 ADH3 유전자(서열번호 39)가 knock-out되었음을 확인하였다(도 4).

실시예 2-4: ADH4 유전자 결실 균주 제작

genomic DNA를 template로 하여 ADH4 ORF의 upstream과 downstream에서 각 300 bp의 DNA 절편을 HJ482(서열번호 23)과 HJ483(서열번호 24), HJ484(서열번호 25)과 HJ485(서열번호 26) primer를 이용하여 증폭 후 primer Tc-f와 U200r, U200f와 Tc-r을 이용하여 증폭된 URA3 DNA 절편과 overlap extension PCR을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 두 절편을 연결하였고, PCR fragment는 25571균주에 형질전환하여 ADH4 locus에 도입된 균주를 uracil이 없는 선택배지(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.077% Ura-DO supplement, 2% 글루코오스, 2% agar)에서 선별하였다. 형질전환 여부를 primer HJ482과 HJ486(서열번호 27), U200f와 HJ486를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 PCR band를 확인하였다. ADH4 유전자가 남아있는지 확인하기 위해 HJ487(서열번호 28)와 HJ485 primer를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 URA3 cassette에 의해 ADH4 유전자(서열번호 40)가 knock-out되었음을 확인하였다(도 5).

실시예 2-5: PDC1 유전자 결실 균주 제작

genomic DNA를 template로 하여 PDC1 ORF의 upstream과 downstream에서 각 300 bp의 DNA 절편을 HJ464(서열번호 29)과 HJ465(서열번호 30), HJ466(서열번호 31)과 HJ467(서열번호 32) primer를 이용하여 증폭 후 primer Tc-f와 U200r, U200f와 Tc-r을 이용하여 증폭된 URA3 DNA 절편과 overlap extension PCR을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 두 절편을 연결하였고, PCR fragment는 25571균주에 형질전환하여 PDC1 locus에 도입된 균주를 uracil이 없는 선택배지(0.67% yeast nitrogen base without amino acids, 0.077% Ura-DO supplement, 2% 글루코오스, 2% agar)에서 선별하였다. 형질전환 여부를 primer HJ464과 HJ486(서열번호 33), U200f와 HJ468를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 PCR band를 확인하였다. PDC1 유전자가 남아있는지 확인하기 위해 HJ469(서열번호 34)와 HJ467 primer를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 URA3 cassette에 의해 PDC1 유전자(서열번호 41)가 knock-out되었음을 확인하였다(도 6).

상기 클루이베로마이세스 막시아누스 BY25571 균주의 피루베이트 탈탄산 효소 유전자를 결실시켜 제조한 균주를 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2012년 6월 20일 기탁하여, 수탁번호 KCTC12225BP를 수여받았다.

실시예 3. 균주들의 에탄올 발효

에탄올 발효를 통하여 각 결손 변이 균주들의 에탄올 생산량을 비교하였다. 각 균주들을 최소영양배지에서 24시간 seed culture 후 50g/L의 글루코오스가 첨가된 에탄올발효배지(Y.E 0.5%, pepton 0.5%, KH₂PO₄, Ammonia sulfate 0.2%, MgSO₄·H₂O 0.04%)에서 30℃, 150rpm으로 배양하였으며 세포 성장과 생산된 에탄올을 측정하였다. 그 결과 adh 변이 균주들은 wild type 균주와 비교하였을 때 큰 차이 없이 에탄올이 생성되었고, pdc1 변이 균주는 예상한 대로, 세포의 성장은 야생형 균주에 비하여 50% 정도 감소하였으며 에탄올은 전혀 생산하지 못하였다(도 7). 피루베이트가 에탄올로 전환되기 위해서는 피루베이트 탈탄산 효소에 의하여 아세트 알데히드가 생성된 후에 다시 알코올 탈수소효소에 의하여 에탄올로 전환되어야 한다. 클루이베로마이세스 막시아누스 균주에서는 4 가지의 ADH 유전자가 존재하기 때문에 한개 내지 두개 ADH 유전자 결실만으로는 피루베이트가 에탄올로 전환되는 과정을 완벽하게 봉쇄할 수 없으며 반면에 피루베이트 탈탄산효소 유전자는 1개만 존재하기 때문에 pdc1 유전자의 결실만으로도 에탄올 생산 경로가 완벽하게 봉쇄됨을 확인할 수 있었다. pdc1 결실 균주가 야생형 균주에 비하여 성장이 감소하는 이유는 해당과정에서 형성된 NAD⁺/NADH 불균형을 해소하기 위해서는 에탄올 발효과정이 필요하지만 pdc1 결실 균주에서는 에탄올 발효경로가 봉쇄되었기 때문에 NAD⁺/NADH 불균형이 발생하였고 이러한 불균형은 균주 성장의 장애요인으로 작용하기 때문에 성장이 감소하는 것이다. 이러한 현상은 LDH 유전자를 발현하면 젖산 발효가 에탄올 발효를 대신하여 NAD⁺/NADH 불균형을 해소할 수 있기 때문에 pdc1 결실 균주에서 발생한 성장저하문제는 해결될 수 있을 것으로 기대하여 하기 실험을 진행하였다.

실시예 4. 미생물 유래의 L- 락테이트 또는 D- 락테이트 탈탄산 효소 ( LDH ) 발현

L-락테이트 탈수소효소와 D-락테이트 탈수소효소 (LDH) 유전자를 확보하기 위하여 젖산 탈수소효소 효소능이 우수한 것으로 알려진 Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactococcus lactis로부터 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 시료를 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 L-LDH와 D-LDH를 T-easy vector에 클로닝하여 각 유전자를 확보하였다.

L-LDH 유전자와 D-LDH 유전자를 클루이베로마이세스 막시아누스에서 발현하기 위해 plasmid pTEF1에 삽입하여 8개의 벡터를 구축하였다(도 8). pTEF1 vector는 LDH 유전자를 강력하고 구성적으로 발현하기 위하여 클루이베로마이세스 막시아누스 유래의 translation elongation factor 1a(TEF1a) 유전자의 프로모터를 포함하고 있으며, LDH 유전자의 전사를 종결하기 위하여 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAP) 유전자의 전사종결 부위를 포함하고 있다. 구축된 벡터를 제한효소 NheⅠ으로 처리하여 선형 DNA 상태로 만들고 URA3 auxotroph균주인 BY25571 균주와 PDC1 변이 균주인 BY25571Δpdc1에 형질전환하여 형질전환체로부터 단일 균주를 선별하였으며, PCR을 통하여 도입한 벡터가 염색체로 도입되었음을 확인하였다.

이 중 클루이베로마이세스 막시아누스 BY25571 균주의 피루베이트 탈탄산 효소 유전자를 결실시켜 제조한 수탁번호 KCTC12225BP 균주에 L-LpLDH를 도입한 균주를 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2012년 6월 20일 기탁하여, 수탁번호 KCTC12226BP를 수여받았다.

실시예 5. 반응온도에 따른 젖산 생산

젖산 생산을 위한 최적 반응온도를 확인하기 위해 30℃, 35℃에서 Flask 배양하였다. 각 균주들을 YPD 배지에서 진탕배양하여 세포를 회수한 후 증류수로 2회 세척한 다음 칼슘 카보네이트를 함유하는 YPD10 액체배지(1% 효모추출물, 2% 펩톤, 10% 포도당)에 접종하여 72시간동안 배양하였다. HPLC를 통하여 젖산 생산량을 확인한 결과 30℃보다는 35℃에서 젖산 생산량과 수율이 높은 것을 확인하였다. 30℃에서는 25571pdc1/L-LpLDH, 25571pdc1/D-LrLDH 균주에서 젖산 생산량이 가장 높았고 35℃에서는 25571pdc1/L-LpLDH, 25571pdc1/D-LpLDH 균주에서 젖산 생산량이 높은 것으로 확인하였다. 상기와 같은 결과를 보아, 온도에 따라서 유전자별 생산량이 다른 것을 확인할 수 있다(표 2). 최종적으로 L-젖산 생산은 25571pdc1/L-LpLDH균주를 이용하고, D-젖산 생산은 25571pdc1/D-LpLDH 균주를 이용하여 생산하였다.

30℃와 35℃에서 젖산 생산량 비교분석

균주	30℃ 발효			35℃ 발효
	젖산 생산량 (g/L)	생산성(%)	순도	젖산 생산량 (g/L)	생산성(%)	순도
25571pdc1/L-LaLDH	25	82	99	42	73	99
25571pdc1/L-LpLDH	31	79	99	46	79	99
25571pdc1/L-LrLDH	25	73	99	46	78	99
25571pdc1/L-LlLDH	18	53	99	22	61	99
25571pdc1/D-LaLDH	0.5	2	99	10	58	99
25571pdc1/D-LpLDH	39	63	99	40	78	99
25571pdc1/D-LrLDH	49	76	99	31	70	99
25571pdc1/D-LlLDH	30	45	99	30	45	99

실시예 6. Glucose 로부터 고농도의 젖산 생산

온도에 따른 젖산 생산효과를 발효를 통하여 확인하고 젖산의 생산성을 증가시키기 위하여 25571pdc1/L-LpLDH 균주로 유가식 배양을 수행하였다. 본배양에 들어가기 전에 100ml의 YPD 액체배지에 배양하여 활성화시킨 후 본 배양액에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 고농도 발효액에 40%의 glucose(final 10%)를 feeding하여 30℃와 35℃에서 젖산 전환 반응을 수행하였다. HPLC를 통하여 젖산 생산량을 확인한 결과 30℃에서는 140g의 glucose로부터 97.3 g/l의 젖산이 생성되어 79.2%의 전환율을 보였고, 35℃에서는 105.5 g/l의 젖산이 생성되어 88.1%의 전환율을 보였다(도 9). 따라서 플라스크 배양에서 확인한 바와 같이 35℃에서 배양하면 약 10% 정도 생산량이 증가함을 확인하였다.

실시예 7. 돼지감자 전분으로부터 젖산 생산

돼지감자 전분을 autoclave (121℃에서 20분)하여 얻은 상등액을 HPLC로 성분 분석 결과 60%의 inulin이 함유되어 있는 것을 확인하였다. Inulin 농도에 따른 젖산 생산량을 비교하기 위해 돼지감자전분을 농도별로 첨가하여 flask 배양하였다. 각 균주들을 YPD 배지에서 진탕배양하여 세포를 회수한 후 증류수로 2회 세척한 다음 3% calcium carbonate가 첨가된 돼지감자 전분에 접종하여 84시간 동안 배양하면서 시간별로 젖산 전환율을 비교하였다.

상기 결과를 정리하면 하기 표 3과 같다.

이눌린 함량에 따른 젖산 생산량 분석

이눌린 함량(%)	당 소모량 (g/L)	젖산 생산량 (g/L)	수율 (%)	젖산 광학순도 (%)
2	20.0	19.7	98.5	99
5	50.0	47.5	95.0	99
10	50.1	42.2	86.2	99
14	44.3	23.0	51.9	99

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이 Inulin 농도가 5% 이상일 경우 오히려 젖산 생산량이 감소하였으며, inulin 농도가 낮을수록 젖산 전환율이 좋은 것으로 확인하였다. 초기 균주 접종량이 많지 않았지만 실험한 네 가지 조건에서 사용된 Inulin이 모두다 fructose로 분해되었음을 확인하였다. 따라서 발효를 통하여 배양조건을 최적화하면 돼지감자로부터 고농도의 젖산생산이 가능할 수 있음을 확인하였다.

실시예 8. Nitrogen source 에 따른 젖산 생산량 분석

일반적으로 돼지감자로부터 젖산을 생산하기 위해서 대부분의 미생물들은 부족한 질소원을 공급해 주어야하기 때문에 필요한 질소원 공급량을 확인하기 위하여 돼지감자 전분에 yeast extract를 농도별로 첨가하여 젖산 생산량을 분석하였다. 각 균주들을 YPD 배지에서 진탕배양하여 세포를 회수한 후 증류수로 2회 세척한 다음 플라스크를 이용하여 3% calcium carbonate가 첨가된 돼지감자 전분에 접종하여 72시간 동안 배양하여 젖산 전환율을 비교하였다(표 4).

Yeast extract 첨가량에 따른 젖산 생산량 분석

Yeast extract 첨가량(%)	당 소모량 (g/L)	젖산 생산량 (g/L)	수율 (%)	젖산 광학순도 %)
0	56.8	53.3	93.8	99
0.1	58.3	50.4	86.3	99
0.2	59.0	50.3	85.3	99
0.3	59.0	50.3	85.2	99
0.4	58.1	49.2	84.7	99
0.5	59.4	48.9	82.3	99
1	57.6	48.2	83.7	99

상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, Yeast extract 첨가량이 증가하여도 젖산 생산량은 증가하지 않는 것으로 보아 돼지감자 전분 외에 다른 nitrogen source는 필요하지 않은 것으로 확인하였다.

실시예 9. 돼지감자 전분으로부터 고농도의 젖산 생산

25571pdc1/L-LpLDH 균주와 25571pdc1/D-LpLDH를 이용하여 돼지감자로부터 고농도의 젖산을 생산하기 위해 회분식 배양을 수행하였다. 100ml의 YPD 액체배지에 배양하여 활성화시킨 후 본 배양액에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하여 세포를 회수한 후 증류수로 2회 세척한 다음 돼지감자 전분에 접종하여 66시간 동안 배양하면서 시간별로 젖산 전환율을 비교하였다. HPLC를 통하여 젖산 생산량을 확인한 결과, L-젖산은 130.1 g/l 생성되어 98.9%의 전환율을 보였고, D-젖산은 122.3 g/l 생산되어 95.0%의 전환율을 보였다(도 10).

돼지감자를 이용하여 젖산을 생산하기위하여 진행된 최근의 연구결과와 본 발명의 결과를 비교하여 표 5에 정리하였다.

돼지감자를 영양원으로 한 젖산 생산 방법 비교

영양원	D/L type	사용균주	발효방법	광학순도	생산성(g/L/hr)	최종농도 (g/L)	효율 (g/g)	참고문헌
돼지감자분말 분해물 + corn steep powder	L	B. coagulans	fed- batch	99	2.5	134	96	Wang, L. et al.(2013)Bioreso urce technology, 130, 174-180.
돼지감자분말 분해물 + yeast extract	L	Immobilized L. lactis	fed- batch		2.85	142	92	Shi, Z. et al.(2012) Enzyme and microbial technology, 51, 263-268.
돼지감자분말 고온추출물 + yeast extract	L	L. paracasei	batch	93.2	0.25	92.5	98	Choi, H.Y. et al.(2012) Bioresource technology, 114, 745-747.
돼지감자분말 + sodium citrate	L	L. casei	fed- batch		4.7	141.5	93.6	Ge, X.Y. et al.(2010) Journal of microbiology and biotechnology, 20, 101-109.
돼지감자분말 + soybean flour + sucrose	L	A. niger + Lactobacillus	fed- batch		3.6	120.5	94.5	Ge, X.Y. et al.(2009) Bioresource technology, 100, 1872-1874
돼지감자분말	L	K. marxianus	batch	99	2	130	98	본 발명
	D	K. marxianus	batch	99	2	122	95

상기 표 5에서 확인할 수 있듯이, 아직까지 D-젖산을 본 발명과 유사한 농도로 생산하는 경우는 보고되지 않았으며 L-젖산의 경우에도 아무런 처리도 하지 않은 돼지감자 분말만을 영양원으로 이용하여 본 발명에서 제시한 농도로 L-젖산을 생산한 경우는 보고되지 않았다. 본 발명의 클루이베로마이세스 막시아누스 균주를 이용하면 아무런 전처리도 하지 않은 돼지감자 분말만을 영양원으로 사용하여 젖산을 생산할 수 있기 때문에 젖산 생산공정에서 많은 비중을 차지하는 배지 비용을 절감할 수 있으며 고순도의 광학이성질체를 선택적으로 생산할 수 있다.

실시예 10. 젖산 생산성 증가를 위한 균주 제작 및 젖산 생산능 측정

젖산을 생산하는 과정에서 균주의 생장환경은 점차 낮은 pH로 변화되기 마련이다. 본 발명자들은 이러한 낮은 pH에서 젖산 생산성을 증가시키기 위해, 상기 실시예 2에서 제조한 균주(KCTC12225BP)에서 KmCYB2(L-lactate cytochrome-c oxidoreductase) 유전자를 결실시키고 KmPMA1(plasma membrane ATPase) 유전자를 과발현시키는 변이를 도입하였다.

먼저, KmCYB2 유전자를 불활성하기 위하여 상기 실시예 2에서 설명한 ADH 유전자 결실방법과 동일한 방법을 사용하였다. 구체적으로, BY25571 genomic DNA를 template로 하여 KmCYB2 ORF의 upstream과 downstream에서 각 300 bp의 DNA 절편을 HJ628(서열번호 51)과 HJ629(서열번호 52), HJ630(서열번호 53)과 HJ631(서열번호 54) 프라이머를 이용하여 증폭 후 프라이머 Tc-f와 U200r, U200f와 Tc-r을 이용하여 증폭된 URA3 DNA 절편과 overlap extension PCR을 수행하였다. 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 두 절편을 연결하였고, 상기 overlap extension PCR 산물은 BY25571Δpdc1 균주(KCTC12225BP)에 형질전환시켰다. 도입한 PCR 단편이 CYB2 locus에 도입된 균주를 우라실(uracil)이 없는 선택배지에서 선별하였다. 형질전환 여부를 프라이머 HJ628과 HJ632(서열번호 55), U200f와 HJ632를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 예상되는 위치에서 PCR 밴드를 확인하였다. CYB2 유전자가 남아있는지 확인하기 위해 HJ633(서열번호 56)와 HJ631 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 확인한 결과 URA3 cassette에 의해 CYB2 유전자(서열번호 57)가 결실되었음을 확인하였다(도 11). URA3 cassette에 존재하는 URA3 유전자를 제거하기 위해 YPD 배지에서 4~6시간 배양 후 5-FOA 배지에서 선별하였다. PCR을 통해 URA3 유전자 pop-out 여부를 확인한 결과 URA3 유전자가 제거된 균주 BY25571Δpdc1,cyb2를 얻을 수 있었다.

이후, PMA1 유전자(서열번호 58)를 과발현하는 균주를 얻기 위해 BY25571 genomic DNA로부터 유전자를 확보하여 pTEF1 vector의 URA3 유전자를 LEU2 유전자로 교체한 벡터에 클로닝하여 발현벡터를 제작하였다. 제작된 벡터는 제한효소 PmlⅠ으로 선형화하여 상기에서 제조한 PDC1, CYB2 변이 균주인 BY25571Δpdc1,cyb2에 형질전환한 후 형질전환체로부터 단일 균주를 선별하였다. 여기서 얻어진 형질전환체에 L-LpLDH 유전자를 도입하기 위해 실시예 4에서 사용된 pTEF1-L-LpLDH 를 NheⅠ으로 처리한 후 형질전환하여 단일 균주를 선별하였다.

상기에서 제조한 균주를 BY25571Δpdc1,cyb2-PMA1//L-LpLDH로 명명하고, 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2013년 6월 26일 기탁하여, 수탁번호 KCTC12435BP를 수여받았다.

이후, 상기 제조한 형질전환체의 젖산 생산능을 확인하기 위하여, YPD 배지에서 진탕배양하여 세포를 회수한 후 증류수로 2회 세척한 다음 YPD10 액체배지 또는 칼슘 카보네이트를 함유하는 YPD10 액체배지에 접종하여 72시간 동안 배양하였다. HPLC를 통하여 L-젖산 생산량을 확인한 결과 25571Δpdc1,cyb2-PMA1/L-LpLDH 균주의 경우 pH를 조절하는 조건과 pH를 조절하지 않는 조건 모두 25571Δpdc1/L-LpLDH보다 젖산 생산량이 20% 정도 증가한 것을 확인하였다(표 6). 이와 같은 결과는 KmCYB2 유전자를 불활성화시키고 KmPMA1 유전자를 과발현함으로써 L-젖산의 산화 환원반응을 막고 세포 밖으로의 이동을 증가시켰기 때문으로 사료된다.

pH 관련 변이 균주의 젖산 생산능 분석

구분	균주	당 소모량 (g/L)	젖산 생산량	수율(%)	젖산의 광학 순도(%)
pH 미조절	25571Δpdc1/L-LpLDH	16.0	13.3	83.0	99
	25571Δpdc1,cyb2-PMA1/L-LpLDH	19.5	15.6	79.6	99
pH 조절	25571Δpdc1/L-LpLDH	51.3	40.9	79.6	99
	25571Δpdc1,cyb2-PMA1/L-LpLDH	61.9	48.6	78.4	99

상기 실험 결과들을 종합하면, 본 발명에서 피루베이트 탈탄산효소를 불활성화시킨 크렙트리 음성균주(클루이베로마이세스 막시아누스)에서 젖산 생성이 증가됨을 확인하고, 이에 알코올 탈수소 효소가 추가로 불활성화시키거나 락테이트 탈수소 효소를 도입시켜 젖산을 고농도로 생산할 수 있는 균주를 제작하였음을 확인하였다. 이에 더하여, 본 발명의 균주는 도입하는 락테이트 탈수소 효소를 D 또는 L-락테이트 탈수소 효소로 선택적으로 도입하여, 생산되는 젖산도 선택적으로 생산할 수 있으며, 돼지감자 분말을 영양원으로 사용할 수 있고, 특히 아무런 전처리 없이 돼지감자 분말을 그대로 사용할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원 KCTC12225BP 20120620 한국생명공학연구원 KCTC12226BP 20120620 한국생명공학연구원 KCTC12435BP 20130626

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Kluyveromyces marxianus deficient in the ethanol fermentation and use thereof <130> PA130599KR <150> 10-2012-0068809 <151> 2012-06-26 <160> 58 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ 368 primer <400> 1 gaaagtggaa tccagtccgg 20 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ 369 primer <400> 2 cgaccacacc cgtcctgttg tgttgtgtat atgatt 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ 370 primer <400> 3 gatgctgtcg gaatggacgc aaggaccctt ttgata 36 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ 371 primer <400> 4 ggcattaccg gtcggtccaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ 372 primer <400> 5 gcaagaatct ggcaaattgg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tc-f primer <400> 6 acaggacggg tgtggtcgcc atg 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U200r primer <400> 7 gttgacccaa tgcgtctccc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U200f primer <400> 8 gcaagaatct ggcaaattgg 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tc-r primer <400> 9 gtccattccg acagcatcgc cag 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ394 primer <400> 10 atggctattc cagaaactca aaag 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ458 primer <400> 11 tggacaccaa gttgccattg 20 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ459 primer <400> 12 cgaccacacc cgtcctgtgt cgtgggtgta accggac 37 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ460 primer <400> 13 gatgctgtcg gaatggacct tgccagaaat ttacga 36 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ461 primer <400> 14 ttaatctaaa ttgtatca 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ462 primer <400> 15 gatcgtcaat ttacagtc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ463 primer <400> 16 caatacgcta ccgctgac 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ412 primer <400> 17 tggctaactg actgactg 18 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ413 primer <400> 18 cgaccacacc cgtcctgttt ctagttgttg gttgttg 37 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ414 primer <400> 19 gatgctgtcg gaatggacga ctgtaaattg acgatc 36 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ415 primer <400> 20 tcaagcttat accaatttc 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ416 primer <400> 21 tctataaaga aggatggggg 20 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ434 primer <400> 22 taagggctgg gaaatcgg 18 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ482 primer <400> 23 gacgacttgg gcttggtg 18 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ483 primer <400> 24 cgaccacacc cgtcctgtgt ataatgtggg tgtacg 36 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ484 primer <400> 25 gatgctgtcg gaatggacac gaagctcagt ccaact 36 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ485 primer <400> 26 ggtaaaatgg ataatcgc 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ486 primer <400> 27 gtagaacaaa gaataggc 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ487 primer <400> 28 atgttcagac tagcacgc 18 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ464 primer <400> 29 atgtctgaaa ttactctag 19 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ465 primer <400> 30 cgaccacacc cgtcctgtac caacaacgtg caaaac 36 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ466 primer <400> 31 gatgctgtcg gaatggactt gttcgtcttg aacaac 36 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HJ467 primer <400> 32 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ccgatgacga agtcacccac 540 agagagaacc atgctgcata ccaccgtatc ttcttcaagc caagaatcct agtcaacgtc 600 aaggaggtgg acacttccac caccatgttg ggtgaaaaag tgggtgttcc attctatgtg 660 tctgctaccg ctctatgtaa attgggtaat ccaaaggaag gtgaaaagga tatcgctaga 720 ggttgtggcg agagcgacgt gaagccaatc cagatgattt ccactttggc ctcttgttct 780 ttgcaagaaa tcgtcgaagc agcaccttcc aaggaccaaa tccaatggtt ccaattgtat 840 gtcaacagtg accgtaagat taccgaggaa ttgatcaaaa acgtcgaaaa gctgggcttg 900 aaggctatct tcgttactgt ggatgcccca tctctcggta acagagaaaa ggatgctaag 960 gtcaaattca ccaacaagga cagttccgca aaggccatgg aaaagagcaa cgtcaaggaa 1020 tccaagggtg cttccagagc tctttccact ttcattgacc ctgctctatg ctgggatgat 1080 atcgttacct tgaaatcaaa gaccaagttg ccaattgtca ttaagggtgt tcaatgcgtc 1140 gaagacgtct tgaaagccgc agaaattggt gccgccggtg tcgtcttgtc caaccacggt 1200 ggtagacaac tagacttttc cagagcgcca atcgaagtct tggccgaaac aatgcctatt 1260 ctaaaagaaa agaaactaga cgacaagatc gaaatcttca tcgatggtgg tgtcagaaga 1320 ggtaccgata tattgaaggc cttgtgtctt ggtgccaagg gtgtcggttt 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tggtgttgtt atcccagccg atggtcgttt ggttaccgaa 600 gactgtttcg tccaaatcga tcaatctgct atcactggtg aatctttggc cgtcgacaag 660 agatacggtg actccacttt ctcttcttct actgttaaga gaggtgaagc tttcatgatt 720 gttactgcta ctggtgactc tactttcgtc ggtagagctg ctgctttggt taacaaggct 780 tccggtggta ctggtcactt cactgaagtt ttgaacggta tcggtactat tttgttgatt 840 ttggttattg tcactttgtt gttggtctgg gttgcttcct tctacagaac caacaagatt 900 gtcagaatct tgagatacac tttggccatc accattgttg gtgtcccagt tggtttgcca 960 gctgtcgtta ccaccaccat ggctgtcggt gctgcttact tggctaagaa gcaagctatt 1020 gttcaaaagc tatctgctat tgaatctttg gctggtgtcg aaatcttgtg ttccgacaag 1080 accggtactt tgaccaagaa caagttgtct ttgcacgaac catacactgt tgaaggtgtt 1140 gacccagatg acttgatgtt gactgcttgt ttggctgctt ctagaaagaa gaagggtttg 1200 gatgctattg acaaggcctt cttgaagtct ttgattaact acccaagagc taaggctgct 1260 ttgactaagt acaagttgtt ggaattccac ccattcgacc ctgtctctaa gaaggttact 1320 gctattgttg aatccccaga aggtgaaaga atcatctgtg ttaagggtgc tccattgttc 1380 gttttgaaga ctgttgaaga agaacatcca attccagaag atgtccgtga aaactacgaa 1440 aacaaggttg ctgaattggc ttccagaggt ttcagagctt tgggtgtcgc tagaaagaga 1500 ggtgaaggtc actgggaaat cttgggtgtt atgccatgta tggatcctcc aagagatgac 1560 actgctcaaa ctgttaacga agctaagcac ttgggtttga gagttaagat gttaactggt 1620 gacgctgtcg gtattgctaa ggaaacttgt agacaattgg gtttgggtac caacatttac 1680 aacgctgaaa gactaggtct aggtggtggt ggtgacatgc caggttctga attggctgac 1740 tttgttgaaa acgctgatgg tttcgctgaa gttttcccac aacacaagta caatgtcgtt 1800 gaaatcttgc aacaaagagg ttacttggtt gctatgactg gtgatggtgt taacgatgct 1860 ccttctttga agaaggctga tactggtatt gctgtcgaag gtgctactga tgctgctaga 1920 tctgctgctg atatcgtttt cttggctcca ggtttgtctg ctattattga tgctttgaag 1980 acctctagac aaattttcca cagaatgtac tcatacgtcg tttaccgtat cgctttgtcc 2040 ttgcatttgg aaattttctt gggtctatgg attgctatct tgaaccaatc tctaaacatt 2100 gacttggttg ttttcattgc tattttcgct gatgttgcta ccttggctat tgcttacgac 2160 aacgctccat actctccaaa gccagttaag tggaacttga gaagactatg gggtatgtcc 2220 gtcattttgg gtataatttt ggctatcggt acttggatta ccttgacctc tatgttcgtt 2280 ccaaagggtg gtatcatcca aaacttcggt tctattgacg gtgttttgtt cttgcaaatc 2340 tccttgaccg aaaactggtt gattttcatc actagagctg ctggtccatt ctggtcttcc 2400 atcccatctt ggcaattatc tggtgccgtt ctagctgttg acatcatcgc caccatgttc 2460 accttgttcg gctggtggtc tcaaaactgg aacgacatcg ttactgtcgt tagagtctgg 2520 attttctctt tcggtgtctt ctgtgtcatg ggtggtgctt actacatgat gtccgaatct 2580 gaagcctttg acagattcat gaacggtaag tcctctaagg aaagaccatc tggtagatct 2640 gttgaagatt tcctaatggc catgcaaaga gtctccactc aacacgaaaa ggaaaactaa 2700 2700

Claims (19)

1. 모균주인 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)에 있어서, 피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase)가 불활성화된 클루이베로마이세스 막시아누스 변이균주로서, 상기 모균주는 수탁번호 KCTC 7001, KCTC 7118, KCTC 7149, KCTC 7150, KCTC 7155, KCTC 7524, KCTC 17212, KCTC 17544, KCTC 17555, KCTC 17631, KCTC 17694, KCTC 17724, KCTC 17725, KCTC 17759, BY25569, BY25571, 및 BY25573로 이루어진 군에서 선택된 것인, 변이균주.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 모균주는 BY25571인 것인, 변이균주.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 변이균주는 당이 포함된 배지에서 배양시 에탄올의 생성이 피루베이트 탈탄산 효소가 불활성화되지 않은 균주에 비해 감소되는 것인, 변이균주.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 불활성화는 피루베이트 탈탄산 효소 유전자가 결손된 것인, 변이균주.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 변이균주는 수탁번호 KCTC12225BP인, 변이균주.
   
6. 제1항에 있어서,
   알코올 탈수소 효소(Alcohol Dehydrogenase)가 추가로 불활성화된, 변이균주.
   
7. 제1항에 있어서,
   락테이트 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase) 활성이 도입된, 변이균주.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 락테이트 탈수소 효소 활성을 갖는 유전자는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 프란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터 유래한 것인, 변이균주.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 락테이트 탈수소 효소 활성을 갖는 유전자는 서열번호 42 내지 50으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열인, 변이균주.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 락테이트 탈수소 효소는 클루이베로마이세스 막시아누스 유래의 TEF1a 프로모터를 이용하여 발현하는 것인, 변이균주.
    
11. 제7항에 있어서,
    상기 변이균주는 수탁번호 KCTC12226BP인, 변이균주.
    
12. 제1항에 있어서,
    L-락테이트 사이토크롬-c 산화환원효소(L-lactate cytochrome-c oxidreductase, CYB2)가 추가로 불활성화된, 변이균주.
    
13. 제12항에 있어서,
    원형질막 ATPase(plasma membrane ATPase, PMA1) 활성이 강화된, 변이균주.
    
14. 제12항에 있어서,
    상기 L-락테이트 사이토크롬-c 산화환원효소는 서열번호 57의 염기서열로 표시되는 것인, 변이균주.
    
15. 13항에 있어서,
    상기 원형질막 ATPase는 서열번호 58의 염기서열로 표시되는 것인, 변이균주.
    
16. 제13항에 있어서,
    상기 변이균주는 수탁번호 KCTC12435BP인, 변이균주.
    
17. 제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 젖산을 생산하는 방법.
    
18. 제17항에 있어서,
    상기 균주를 배양하는 단계는 돼지감자 분말을 영양원으로 하는 것인, 방법.
    
19. 제17항에 있어서,
    상기 젖산은 L-젖산 또는 D-젖산인 것인, 방법.

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