KR20140036143A

KR20140036143A - 항암 융합 단백질

Info

Publication number: KR20140036143A
Application number: KR1020137020558A
Authority: KR
Inventors: 예지 스체판 피에치콜란; 세바스티안 도미니크 파블락; 바르틀로미 마체 제렉; 피오트르 카밀 로즈가
Original assignee: 아다메드 에스피. 제트 오.오.
Priority date: 2011-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2014-03-25
Anticipated expiration: 2032-01-05
Also published as: AU2012204900A1; PL219845B1; IL226205B; WO2012093158A1; AU2012204900B2; KR101950043B1; EA025830B1; CY1119149T1; JP5797773B2; SG190049A1; CN103228788A; MX339203B; EA201391005A1; CN103228788B; RS56095B1; PL2661496T3; BR112013016980B1; IL226205A0; MX2013007872A; BR112013016980A2

Abstract

hTRAIL95보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로부터 시작하는 단편인, hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편, 또는 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 상기 기능적 단편의 동족체인 도메인 (a), 및 항-혈관형성 이펙터 펩티드의 서열인 도메인 (b)를 포함하는 융합 단백질로서, 여기서 상기 도메인 (b)의 서열은 도메인 (a)의 C-말단 또는 N-말단에 부착된다. 상기 융합 단백질은 암 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.

Description

항암 융합 단백질{ANTICANCER FUSION PROTEIN}

본 발명은 치료학적 융합 단백질, 특히 재조합 융합 단백질 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 항-혈관형성 펩티드의 서열과 조합하여 가용성(soluble) 인간 TRAIL 단백질의 서열의 단편을 함유하는 융합 단백질과, 그를 함유하는 약제학적 조성물, 치료, 특히 항암제로서의 그의 용도, 및 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터, 및 이들 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

Apo2L(Apo2-리간드)로도 알려진, 사이토카인 패밀리(종양 괴사 인자-관련된 세포사멸 유도 리간드)에 속하는 TRAIL 단백질은 바이러스에 의해 감염된 세포 및 종양 세포에서 세포사멸의 강력한 활성제이다. TRAIL은 체내에서 자연적으로 발생하는 리간드이다. TRAIL 단백질, 그의 아미노산 서열, 코딩 DNA 서열 및 단백질 발현 시스템은 EP0835305A1호에서 최초로 기술되었다.

TRAIL 단백질은 세포사멸 유발 TRAIL 표면 수용체 1 및 2(TRAIL-R1/R2)에 결합하여 이들 수용체를 활성화시킴으로써 그의 항암 활성을 나타낸다. DR4 및 DR5로도 알려진 이들 수용체(사멸 수용체 4 및 사멸 수용체 5)는 TNF 수용체 패밀리에 속하며 상이한 타입의 암세포에 의해 과발현된다. 이들 수용체의 활성화는 실행 카스파제의 활성화 및 그에 의한 핵산의 분해를 초래하는 활성화된 카스파제-8에 의해, 억제 유전자 p53으로부터 독립한 세포사멸의 외부 신호화 경로를 유도할 수 있다. TRAIL 활성화에서 방출된 카스파제-8은 또한 Bid 단백질의 방출 및 그에 의한 미토콘드리아 경로의 간접적인 활성화를 야기할 수 있으며, Bid 단백질은 미토콘드리아로 전위되고, 이것은 시토크롬 c의 방출을 자극하여, 사멸 수용체로부터 세포사멸 신호를 간접적으로 증폭시킨다.

TRAIL은 이 단백질에 내성인 건강한 세포 내에서의 세포사멸을 필수적으로 유도하지 않고 종양 세포에 선택적으로 작용한다. 그러므로, TRAIL의 엄청난 잠재력은 혈액암 및 고형 종양을 포함하는 광범위하고 상이한 타입의 종양 세포에 작용하며 동시에 정상 세포에는 영향을 주지 않으며 잠재적으로 상당히 작은 부작용을 나타내는 항암제로 인식되었다.

TRAIL 단백질은 281 아미노산 길이를 갖는 타입 II 막 단백질이며 프로테아제에 의한 절단시 아미노산 잔기 114-281을 포함하는 그의 세포외 영역은 생물학적으로도 또한 활성인 20 kDa 크기의 가용성 sTRAIL 분자를 형성한다. TRAIL 및 sTRAIL 형태 양자는 표적(target) 세포 상에 존재하는 TRAIL 수용체와의 상호 작용을 통해 세포사멸을 촉발할 수 있다. TRAIL 분자의 가용성 부분의 강한 항종양 활성 및 매우 낮은 전신 독성은 세포주(cell lines) 시험을 사용하여 입증되었다.

또한, INN 둘라너민(dulanermin)으로 알려진 hTRAIL의 아미노산 114-281에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 가용성 TRAIL(rhTRAIL)에 관한 인간 임상 연구는 그의 양호한 내성 및 용량 제한 독성의 부재를 보여주었다.

예를 들어 EP 1 688 498에서, 122-281hTRAIL의 재조합 원형으로 재배치된 돌연변이에 대해 최근 보고된 바와 같이, 114-284보다 짧은 TRAIL의 단편은 막 사멸 수용체와 결합하고, 이들 수용체를 통해 세포사멸을 유도할 수 있다.

현재 보고된 간 세포 상의 재조합 TRAIL 단백질의 독성 효과는 변형(modification), 즉 전신 독성을 나타내지 않는 태그되지 않은 TRAIL인 폴리히스티딘 태그의 존재와 연관되는 것으로 나타난다.

그러나, 추가의 연구 및 개발 중, 많은 암세포가 TRAIL에 대한 원발성 또는 후천성 내성을 또한 보여주는 것으로 나타났다(예를 들어 WO2007/022214호 참조). TRAIL에 대한 내성의 메커니즘이 완전하게 이해되진 않았지만, 세포 표면 수용체의 레벨로부터 신호화 경로 내의 실행 카스파제까지의 범위의 TRAIL-유도 세포사멸 경로의 상이한 레벨에서, 그 자체는 명백할 수 있는 것으로 믿어진다. 이러한 내성은 항암제로서의 TRAIL의 유용성을 제한한다.

더욱이, 환자에 대한 임상 실험에서 단일 요법으로서의 TRAIL의 실제 효능은 낮은 것으로 입증되었다. 이러한 TRAIL에 대한 종양의 낮은 효능 및 내성을 극복하기 위하여, 다양한 조합 요법이 방사- 및 화학 요법제로 제작되었으며, 이것은 상승적인 세포사멸 효과를 초래하였다(WO2009/002947호; A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14(2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC 등, J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9(2010), p.1527-1533). 선택된 통상의 화학 요법제(파클리탁셀(paclitaxel), 카르보플라틴(carboplatin)) 및 단일클론 항-VEGF 항체와의 조합에 의한 암치료를 위한 rhTRAIL의 용도는 WO2009/140469호에 기술되어 있다. 그러나, 이러한 조합은 종래의 화학 요법 또는 방사선 요법의 공지된 결함을 필수적으로 내포한다.

더욱이, TRAIL 요법과 관련된 문제는 그의 낮은 안정성 및 투여 후 신체로부터의 신속한 제거로 입증되었다.

암 치료에서의 목적 중 하나는 종양 혈관형성의 억제이다. 혈관형성 (혈관신생)은 종양에 산소 및 영양분을 공급하는 새로운 혈관이 생기는 병리학적, 시간-비제한적 프로세스이다. 혈관형성은 종양의 성장 및 확장에 필수불가결하고, 그 전이를 촉진한다.

암 치료에서 종양 혈관형성의 억제의 유리한 효과는 알려져 있다. 암 치료 및 상보적인 암 치료 양자로서, 혈관형성의 프로세스를 억제 또는 조절하는 물질의 임상적 사용에 대한 시도가 행해졌다.

혈관형성의 억제제로는, 인간 신체 내에 자연적으로 존재하는 내인성인 것 및 많은 외인성 항-혈관형성 물질 양자가 알려져 있다. 이들 중에서 내인성 단백질의 단백질 가수분해 단편을 포함하는, 공지의 혈관형성에 대한 단백질성 억제제가 존재한다. 예로서, 혈관형성의 단백질 억제제, 예컨대 안지오스타틴 (플라스미노겐의 단편), 엔도스타틴 (콜라겐 XVIII의 C-말단 단편), 칼레티큘린(calreticulin), 바소스타틴(vasostatin) - 칼레티큘린 단편, 프로락틴의 단편, 메탈로프로테이나제 2의 단편, 또는 텀스타틴(tumstatin) - 콜라겐 IV의 단편을 언급할 수 있다 (Cao Y. Angiogenesis modulates adipogenesis 및 obesity. J Clin Invest. 2007;117(9):2362-2368, Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discov. 2007;6:273-286).

예를 들어, 텀스타틴은 28 kDa 크기의 펩티드로서 - 콜라겐 타입 IV의 단편이고, 인테그린 αvβ3에 결합 가능하고, 내피 세포 증식의 억제에 의해 혈관형성을 방지할 수 있다. 또한, 텀스타틴은 초점 접착 키나아제 (FAK) 및 포스파티딜리노시톨 3-키나아제 PI3 및 단백질 키나아제 PKB/Akt의 활성을 독립적으로 억제한다.

항-혈관형성 활성은 또한, 혈관 내피에 위치된 수용체를 통해 작용하고 신생혈관형성의 주요 자극제인 혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF)와 같은, 혈관형성 유발 단백질의 억제에 의해 발휘될 수 있다.

암 치료를 포함하는 임상 치료에서는 VEGF에 대해 지시된 특정의 물질, 예컨대 모노클로널 항체 베바시주맙(bevacizumab) 및 라니비주맙(ranibizumab)이 항-혈관형성 인자로서 이미 사용되고 있다.

내피에 위치된 수용체와 독립적으로 내피 세포의 증식 및 이동을 자극하는 기타 혈관형성유발 인자가 또한 알려져 있으며, 이는 예를 들어 사이토카인, 예컨대 혈소판-유도 성장 인자 PDGF 및 상피세포 성장 인자 EGF, TNF, 및 앙기오포에이틴을 포함한다.

혈관형성의 프로세스에는 또한 효소 아미노펩티다아제 N (APN/CD13)이 관련되어 있으며, 이는 막통과(transmembrane) 메탈로프로테아제이다. 이러한 효소의 억제는 신생물 프로세스(neoplastic process)의 억제를 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다. 아미노펩티다아제 N의 많은 천연 및 합성 억제제가 알려져 있다(Bavouis B., Dauzonne D., Aminopeptidase-N/CD13 (EC 3.4.11.2) inhibitors: chemistry, biological evaluations, 및 therapeutic prospects. Medical Research Review, 2006, 26, (1), 88-130).

APN/CD13D의 천연 억제제는 주로 미생물에 의해 제조된 물질들을 포함한다. 대표적으로, 여러 가지 중에서 베스타틴, 커큐민, 및 아미제닌을 들 수 있다. 또한 CNGRC 모티프를 함유하는 짧은 펩티드도 CD13에 효과적으로 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다(Arap 등, Science, 279:377-380, 1998).

많은 항-혈관형성 물질들이 현재 임상 시험을 포함한, 상이한 연구 단계에 있다. 그러나, 혈관형성을 억제하는 것을 목적으로 한 공지의 요법들은 많은 잘 알려진 단점을 갖고 있다. 예를 들어, 유방암의 치료에서 치료적 모노클로널 항체인 베바시주맙(bevacizumab)의 이점은 최근 의심받고 있다. 많은 항-혈관형성 약물은, 예를 들어, 매우 짧은 반감기, 낮은 안정성, 열악한 생물학적 이용가능성 및 독성 부작용을 나타낸다.

항-혈관형성 약물의 안정성은 매우 중요한데, 그 이유는 치료의 선택성의 결여 및 연장된 사용 때문이다. 종양학 질환의 본질 및 효과적인 치료에 대한 강력한 수요는 그러한 그룹의 약물에 대한 등록 과정을 단순화하는 것을 필요로 하며, 따라서 약물의 모든 부작용 및 결점을 알아내는 것이 불가능하다. 비록, 모든 빠르게 증식하는 세포에 관한 화학요법과 반대로, 항-혈관형성 약물은 상이한 혈관 형성 단계에 관한 것으로, 이는 요법의 독성의 감소를 초래한다. 그러나, 종양 세포에 대한 선택성을 확보하면서 혈관형성을 억제하는 것을 목적으로 하는 항암 치료에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 따라서 향상된 독물학적 특성을 갖는 새로운 항-혈관형성 항암 치료에 대한 필요성이 존재한다.

메탈로프로테아제 절단 부위 링커(링커)로 연결된 TRAIL114-281 및 항-혈관형성제 바소스타틴의 서열을 함유하는 구조화된(constructed) 융합 단백질은 A.I. Guo 등에 의해 「Chinese Journal of Biochemistry 및 Molecular Biology 2008, vol. 24(10), 925-930」에 종양 세포 내에서 세포사멸-유도 효과를 나타내는 것으로 기술되었다.

항-혈관형성제 칼레티큘린 및 TRAIL114-281의 서열을 함유하는 구조화된 융합 단백질은 CN1609124A에서 종양 세포 내에서 세포사멸-유도 효과를 나타내는 것으로 기술되었다.

CN 1256347C은 키니노젠 D5 60-148 및 TRAIl 114-281로 이루어진 융합 단백질을 기술하고 있다.

GGGSGGSG를 코딩하는 링커와 연결된 TRAIL114-281의 N- 또는 C-말단에 부착된 항-혈관형성제 키니노스타틴, 바소스타틴 및 칸스타틴의 서열을 함유하는 구조화된 융합 단백질은 Feng Feng-Yi “Phase and Clinical Trial of Rh-Apo2L and Apo2L-Related Experimental Study”, Ph.D. degree thesis, Chinese Peking Union Medical, 2006-10-01; http://www.lw23.com/lunwen_957708432에 언급되어 있다.

혈관 형성 억제제 텀스타틴의 서열 텀스타틴183-230 및 TRAIL114-281을 함유하는 구조화된 융합 단백질은 N.Ren 등에 의해 「Academic Journal of Second Military Medical University 2008, vol. 28(5), 676-478」에 췌장 암세포의 세포사멸의 유도를 나타내는 것으로 기술되었다.

US2005/244370호 및 대응하는 WO2004/035794호는 세포 표면 결합 도메인으로서 TNF 패밀리 리간드 CD40의 또 다른 멤버의 세포외 부분과 펩티드 링커에 의해 연결된 이펙터(effector) 도메인으로서 TRAIL95-281의 구조체를 기술한다. 구조체의 활성화는 그의 CD40 부분의 결합을 통한 것으로 서술되어 있다.

본 발명은 이펙터 펩티드가 TRAIL의 작용을 강화 또는 보완하는, 항-혈관형성 활성을 갖고 TRAIL 단편을 포함하지 않는 짧은 이펙터 펩티드 도메인 및 TRAIL로부터 유도된 도메인을 포함하는 신규 융합 단백질을 제공하는 것에 의해 이 문제의 해결책을 제시한다.

본 발명에 따른 단백질은 선택적으로 암 세포에 대해 지시된 것으로, 여기서 단백질의 개별적인 성분이 그 효과를 발휘하고, 특히 이펙터 펩티드는 종양 혈관형성을 억제한다. 종양 환경 내로 본 발명의 단백질의 전달은 신체 내에서 건강한 세포에 대한 독성 및 부작용을 최소화하는 것과, 투여의 빈도를 감소시키는 것을 가능하게 한다. 또한, 본 발명에 따른 단백질을 사용하는 표적 치료는, 혈관의 낮은 투과성에 의해 유발되는 이미 알려진 비특이적 항-혈관형성 치료의 낮은 효율의 문제점을 회피하는 것을 가능하게 한다.

또한, 많은 경우에 본 발명의 융합 단백질은 가용성 TRAIL 및 상기 서열의 단편을 포함하는 그 변이체보다 더 강력한 것으로 밝혀졌다. 지금까지는, 본 발명의 융합 단백질에 사용되는 공지의 이펙터 펩티드는 약물에 사용되지 않았는데, 그 이유는 바람직하지 않은 키네틱스, 비특이적 프로테아제에 의한 신속한 분해 또는 표적 부위에서 이펙터 펩티드의 적절한 작용을 가능하게 하는데 필수인 경로의 활성화의 적절한 서열의 결여에 기인한 체내 축적 때문이다. 융합 단백질 내로의 이펙터 펩티드의 도입은, 그들의 작용이 바람직한 부위에 대한 선택적 전달을 가능하게 한다. 또한, 이펙터 펩티드의 부착은 단백질의 질량을 증가시키고, 이는 연장된 반감기 및 종양 내에서 단백질 보유의 증가와 그의 효율 향상을 초래한다. 추가적으로, 많은 경우, 신규의 융합 단백질은 또한 TRAIL에 대한 내성을 극복한다.

본 발명은 지금부터 하기 도면을 참고로 하여 상세히 기술될 것이다.
도 1은 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4, 실시예 5및 실시예 6에 따른 본 발명의 융합 단백질의 개략적 구조를 나타낸다.
도 2는 실시예 7, 실시예 8, 실시예 9, 실시예 10 및 실시예 11에 따른 본 발명의 융합 단백질의 개략적 구조를 나타낸다.
도 3은 실시예 12, 실시예 13, 실시예 14 및 실시예 15에 따른 본 발명의 융합 단백질의 개략적 구조를 나타낸다.
도 4는 비타원율로 표현된 실시예 1, 실시예 4, 실시예 5, 실시예 9 및 실시예 14의 융합 단백질 및 rhTRAIL95-281에 대한 원편광 이색성 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 1, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 9의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116이 존재하는 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 6은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 1, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 9의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116이 존재하는 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 7은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549가 존재하는 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 8은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549가 존재하는 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 9는 실시예 16, 실시예 17, 실시예 18, 및 실시예 19에 따른 본 발명의 융합 단백질의 개략적 구조를 나타낸다.
도 10은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 5, 실시예 4, 실시예 9, 및 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116이 존재하는 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 11은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 5, 실시예 4, 실시예 9, 및 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116이 존재하는 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 12는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 13은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 14는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 Colo205가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 15는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 Colo205가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 16은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 SW620이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 17은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 SW620이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 18은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549가 존재하는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 19는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549가 존재하는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 20은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 NCI-H460이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 21은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 NCI-H460이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 22는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 5, 실시예 6, 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 23은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 5, 실시예 6, 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 24는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 5의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 NCI-H460-Luc2가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 25는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 5의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 NCI-H460-Luc2가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 26은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 5 및 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 27은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 5 및 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 28은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간암 PLC/PRF/5가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 29는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간암 PLC/PRF/5가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 30은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 HepG2 간암이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 31은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 HepG2 간암이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 32는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 PANC-1 췌장암이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 33은 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 PANC-1 췌장암이 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.
도 34는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 다중약물-내성인 인간 자궁 육종 MES-SA/Dx5가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 나타낸다.
도 35는 hTRAIL114-281과 비교된 실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 다중약물-내성인 인간 자궁 육종 MES-SA/Dx5가 존재하는 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스의 종양 성장 억제 값 (%TGI)을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 :

hTRAIL95보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로부터 시작하는 단편인, 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편, 또는 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 상기 기능적 단편의 동족체인 도메인 (a), 및

항-혈관형성 이펙터 펩티드의 서열인 도메인 (b)

를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로,

여기서 상기 도메인 (b)의 서열은 도메인 (a)의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착되고,

단, 이펙터 펩티드가 칼레티큘린, 텀스타틴 183-230, 키니노젠 D5, 바소스타틴, 키니노스타틴 및 칸스타틴으로 이루어진 그룹에서 선택된 융합 단백질은 배제한다.

용어 "가용성 hTRAIL 서열의 기능적 가용성 단편(the functional soluble fragment of a sequence of soluble hTRAIL)"은 세포의 표면에 있는 그 수용체에 결합시 포유동물 세포에서 세포사멸 신호를 유도할 수 있는 임의의 이러한 가용성 hTRAIL의 단편을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.

TRAIL 서열의 동족체의 70% 이상의 존재가 기술분야에 알려져 있는 것이 당업자에게 또한 이해될 것이다.

본 발명의 융합 단백질에서 이펙터 펩티드의 도메인 (b)는 hTRAIL 단백질도 아니고 hTRAIL 단백질의 일부나 단편도 아니라는 것을 이해하여야 한다.

본 발명에 따른 용어 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 복수의 아미노산으로부터의 분자 빌트(molecule built)로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 용어 "펩티드"는 올리고펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다.

본 발명에서 펩티드의 아미노산 서열은 펩티드의 N-말단(N-종결)에서 그의 C-말단(C-종결) 쪽으로의 방향으로 당업계에서 채택되는 통상의 방식으로 제시할 것이다. 그러므로, 임의의 서열은 그 선형 제시의 왼쪽 측 상에 그의 N-말단 및 오른쪽 측 상에 C-말단을 가질 것이다.

본 발명의 융합 단백질은 도메인 (a)의 C-말단 또는 N-말단에 부착된, 이펙터 펩티드의 하나 이상의 도메인 (b)를 도입한다.

특정 실시 양태에서, 도메인 (a)는 hTRAIL95부터 hTRAIL121까지 범위의 아미노산으로부터 시작하여, 아미노산 hTRAIL281로 종결하는 것을 포함하는 hTRAIL 서열의 단편이다.

특히, 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 및 hTRAIL121-281에 상응하는 서열로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 기술분야의 당업자에게는 hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 및 hTRAIL121-281이, 각각, 수탁 번호 제P50591호로 젠뱅크에 게재된 공지의 hTRAIL 서열에서(서열 번호 16), 번호 95, 119, 120 및 121로 마킹된 아미노산으로 시작하는 인간 TRAIL 단백질의 단편을 나타낸다는 것이 명백할 것이다.

다른 특별한 실시 양태에서, 도메인 (a)는, hTRAIL95보다 낮지 않은 아미노산 위치에서 시작하고, 아미노산 hTRAIL281에서 종결하는, 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편의 동족체로서, 그 서열은 원래의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 85% 이상 동일하다.

이러한 실시 양태의 특정 변형에서, 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL120-281, hTRAIL121-281 및 hTRAIL122-281에 상응하는 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 단편의 동족체이다.

hTRAIL 단편의 동족체는 이러한 단편의 아미노산 서열의 변경/변형이며, 여기서 하나 이상의 아미노산은 1 아미노산, 2 아미노산, 3 아미노산, 4 아미노산, 5 아미노산, 6 아미노산, 및 15% 이하의 아미노산을 포함하여 변화되고, 변형된 서열의 단편은 hTRAIL 서열의 기능성, 즉 세포 표면 사멸 수용체에 결합하고, 포유동물 세포에서 세포사멸을 유도하는 능력을 보존한다는 것을 이해하여야 한다. 아미노산 서열의 변형은, 예를 들어, 아미노산의 치환, 삭제 및/또는 부가를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 변형된 서열을 갖는 hTRAIL 단편의 동족체는 본래의 hTRAIL 단편과 비교하여 사멸 수용체 DR4 (TRAIL-R1) 또는 DR5 (TRAIL-R2)에 대한 변형된 친화도를 나타낸다.

용어 "변형된 친화도"는 증가된 친화도 및/또는 변경된 수용체 선택성을 갖는 친화도를 의미한다.

바람직하게는, 변형된 서열을 갖는 hTRAIL 단편의 동족체는 본래의 hTRAIL 단편과 비교하여 사멸 수용체 DR4 또는 DR5에 대한 증가된 친화도를 나타낸다.

특히 바람직하게는, 변형된 서열을 갖는 hTRAIL 단편의 동족체는 사멸 수용체 DR4와 비교하여 사멸 수용체 DR5에 대한 증가된 친화도, 즉 증가된 선택성 DR5/DR4를 나타낸다.

또한 바람직하게는, 변형된 서열을 갖는 hTRAIL 단편의 동족체는 수용체 DR1 (TRAIL-R3) 및/또는 DR2 (TRAIL-R4)에 대한 친화도와 관련하여 사멸 수용체 DR4 및/또는 DR5에 대한 증가된 선택성을 나타낸다.

사멸 수용체 DR4 및 DR5에 대한 증가된 친화도 및/또는 선택성을 초래하는 hTRAIL의 변형은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP 또는 공개 Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18;283(29):20560-8에 알려져 있으며, 이는 DR4에 대한 증가된 선택성을 갖는 D218H 돌연변이를 기술한다. 사멸 수용체 5에 대한 향상된 선택성을 갖는 신규의 TRAIL 돌연변이 DR5-A 및 DR5-B의 생성은(Apoptosis. 2009 Jun;14(6):778-87), DR4에 대한 감소된 친화도를 갖는 D269H 돌연변이를 기술한다. DR1 및 DR2 수용체와 비교하여 DR4 및 DR5에서 선택된 하나의 수용체에 대한 증가된 친화도 및 DR4와 비교하여 수용체 DR5에 대한 증가된 친화도를 초래하는 hTRAIL 돌연변이는 또한 WO2009077857 및 WO2009066174에 기술된다.

적절한 돌연변이는 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 및 251로 이루어진 그룹에서 선택된 천연의 hTRAL의 위치에 있는 하나 이상의 돌연변이, 특히 염기성 아미노산 예컨대 라이신, 히스티딘 또는 아르기닌으로의 아미노산의 치환과 관련된, 또는 글루탐산 또는 아스파르그산과 같은 아미노산의 치환과 관련된 돌연변이이다. 특히, WO2009066174에 기재된 바와 같이, G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E 및 K251Q로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 들 수 있다.

적절한 돌연변이는 또한 195, 269 및 214로 이루어진 그룹에서 선택된 천연의 hTRAL의 위치에 있는 하나 이상의 돌연변이, 특히 염기성 아미노산, 예컨대 라이신, 히스티딘 또는 아르기닌으로의 아미노산의 치환과 관련된 돌연변이이다. 특히, WO2009077857에 기재된 바와 같이, D269H, E195R, 및 T214R로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 들 수 있다.

특별한 실시 양태에서, hTRAIL의 단편의 동족체인 도메인 (a)는, WO2009066174에 기재된 바와 같은, 천연의 TRAIL 서열의 D218H 돌연변이, 또는 Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP., Apoptosis. 2009 Jun;14(6):778-87에 기재된 바와 같은, 천연의 TRAIL 서열의 Y189N R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H 돌연변이에서 선택된다.

도메인 (b)는 특히, 하기 그룹에서 선택될 수 있다:

- VEGF, PDGF 및 EGF에 대한 수용체로부터 선택된 성장 인자에 대한 수용체의 억제제;

- 단편 183-230 이외의 텀스타틴 또는 이의 단편, 및

- 아미노펩티다아제 N (CD13)의 억제제

성장 인자의 수용체의 억제제의 그룹 내에서, 도메인 (b)의 이펙터 펩티드는, 그 자체가 혈관형성 활성이 없으면서 천연의 리간드에 경쟁적으로 VEGF 수용체를 결합시키는 인간 혈관 내피세포 성장 인자 VEGF의 단편일 수 있다. 그 결과, VEGF의 혈관형성 활성은 차단되고, 신생 혈관 형성의 자극이 존재하지 않고 종양 성장이 억제된다. 특히, 상기 그룹의 이펙터 펩티드는, VEGF 신호 경로 및 구체적으로 첨부한 서열 목록의 서열 번호 17에 제시된 인간 VEGF의 7-아미노산 단편을 억제하는 펩티드이다.

본 발명의 융합 단백질 내로 도입된 VEGF 헵타펩티드의 서열을 포함하는 펩티드는, 혈관형성 프로세스의 억제에 의해 암 세포를 효율적으로 제거할 것으로 여겨진다.

또한 성장 인자에 대한 수용체의 억제제의 그룹 내에, 도메인 (b)의 이펙터 펩티드는, 그 자체가 혈관형성 활성이 없으면서 천연의 리간드에 경쟁적으로 PDGF 수용체를 결합시키는 혈소판-유래의 성장 인자 PDGF의 단편일 수 있다. 그 결과 PDGF의 혈관형성 활성은 차단되고, 신생 혈관 형성의 자극이 존재하지 않고 종양 성장이 억제된다.

특히, 그러한 이펙터 펩티드는, 19-아미노산 펩티드 - 첨부한 서열 목록의 서열 번호 22이 서열에 나타낸 PDGF 리간드의 단편이다.

본 발명의 융합 단백질 내로 도입된 혈소판-유래의 성장 인자 PDGF단백질 단편의 서열을 포함하는 펩티드는, 혈관형성 프로세스의 억제에 의해 암 세포를 효율적으로 제거할 것으로 여겨진다.

또한 성장 인자에 대한 수용체의 억제제의 그룹 내에, 도메인 (b)의 항-혈관형성 이펙터 펩티드는, 그 자체가 혈관형성 활성이 없으면서 천연의 리간드에 경쟁적으로 EGF 수용체를 결합시키는 상피세포 성장 인자 EGF의 펩티드 단편일 수 있다. 그 결과 EGF의 혈관형성 활성은 차단되고, 신생 혈관 형성의 자극이 존재하지 않고 종양 성장이 억제된다. 세포내 키나아제의 활성화 없이 EGF 수용체에 결합 가능하고, EGR 활성을 차단할 수 있는 그러한 차단 펩티드 Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 및 Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu는, 예를 들어 EP0641358로부터 알려져 있다. 특히, 그러한 이펙터 펩티드-EGF 리간드의 단편은 첨부한 서열 목록의 서열 번호 23의 서열에 나타낸다.

본 발명의 융합 단백질 내로 도입된 상피세포 성장 인자 EGF의 서열을 포함하는 펩티드는, 혈관형성 프로세스의 억제에 의해 암 세포를 효율적으로 제거할 것으로 여겨진다.

텀스타틴 및 그 단편의 그룹 내에, 도메인 (b)의 이펙터 펩티드는, 텀스타틴 단백질의 25-아미노산 단편(단편 I)일 수 있고, 이는 첨부된 서열 목록의 서열 번호 18의 서열에 의해 나타냈다. 상기에 제시한 그룹의 이펙터 펩티드는 또한 첨부한 서열 목록의 서열 번호 19의 서열에 의해 나타낸, 또다른 텀스타틴 단백질의 18-아미노산 단편(단편 II)이다. 도메인 (b)의 항-혈관형성 이펙터 펩티드는, 텀스타틴 펩티드 단편들, 특히 임의의 순서로 서로 가까이 위치된 단편 및 단편 II의 조합일 수 있다. 한 실시 양태에서, 도메인 (b)는 단편 I/단편 II의 조합 (서열 번호 18/서열 번호 19) 또는 단편 II/단편 I의 조합 (서열 번호 19/서열 번호 18)이다.

본 발명의 융합 단백질 내로 도입된 텀스타틴 단백질 단편 I 및/또는 II의 서열을 포함하는 펩티드는, 혈관형성 프로세스의 억제에 의해 암 세포를 효율적으로 제거할 것으로 여겨진다.

효소 아미노펩티다아제 N/CD13과 결합하여 그 활성을 억제하는, 아미노펩티다아제 N/CD13의 억제제의 그룹은 모티프 NGR 또는 RGD를 함유하는 짧은 펩티드를 포함할 것이다.

아미노펩티다아제 N에 효율적으로 결합하는 모티브 NGR을 포함하는 펩티드는, 예를 들어 Arap 등(Science, 279:377-380, 1998)에 의해 기술된다. 아미노펩티다아제 N의 세포외 도메인에는 RGD 모티프에 대한 친화도를 나타내는 단편 또한 존재한다. 양자의 모티프(RGD 및 NGR)는 안타고니스트로서 신생혈관형성의 프로세스와 관련된 인자와 결합한다. 따라서, NGR 모티프를 닮은 RGD 모티프는 아미노펩티다아제 N과 결합할 것이고, 그 결과 그 억제제로서 작용할 것이다(Friedlander 등, Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins. Science (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995; Pasqualini 등 Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 2000 Feb 1;60(3):722-7).

아미노펩티다아제 N/CD13의 억제제의 그룹 내에, 도메인 (b)의 항-혈관형성 이펙터 펩티드는, 첨부된 서열 목록의 서열 번호 20에 의해 나타낸 CD13에 결합하는 5-아미노산 펩티드일 수 있다. 이러한 그룹의 또다른 이펙터 펩티드는 또한 첨부된 서열 목록의 서열 번호 21에 의해 나타낸, CD13에 결합하는 9-아미노산 펩티드이다.

본 발명의 융합 단백질 내로 도입된 아미노펩티다아제 N/CD13과 결합하는 단백질 단편의 서열을 포함하는 펩티드는, 혈관형성 프로세스의 억제에 의해 암 세포를 효율적으로 제거할 것으로 여겨진다.

본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 이펙터 펩티드 도메인 (b), 특히 2 또는 3개의 도메인 (b)를 포함할 수 있다. 본 발명의 융합 단백질의 한 실시 양태에서는, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20 , 서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 23으로부터 선택된 2개의 유사한 또는 상이한 이펙터 도메인 (b)를 함유하고, 여기서 상기 이펙터 도메인 (b)는 서로 나란히 위치된다. 본 발명의 융합 단백질의 다른 실시 양태에서는, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 23으로부터 선택된 2개의 유사한 또는 상이한 이펙터 도메인 (b)를 함유하고, 여기서 상기 이펙터 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단 및/또는 C-말단에 위치된다.

특히 본 발명의 융합 단백질의 실시 양태는 3개의 이펙터 도메인을 포함한다.

예로서, 융합 단백질은 텀스타틴 (서열 번호 18)의 단편 I 및 텀스타틴 (서열 번호 19)의 단편 II의 서로 나란히 위치된 도메인 (a)의 N-말단에 및 도메인 (a)의 C-말단에 위치된 VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 펩티드를 포함한다.

본 발명의 융합 단백질의 특정 실시 양태에서, 이펙터 펩티드는 서열 번호 17 (VEGF로부터 유도된 헵타펩티드), 서열 번호 18 (텀스타틴 단백질의 단편 I (아미노산 74-98)), 서열 번호 19 (텀스타틴 단백질의 단편 II (아미노산 197-214)), 서열 번호 20 (CD13에 결합하는 펩티드), 서열 번호 21 (CD13에 결합하는 펩티드), 서열 번호 22 (PDGF의 단편) 및 서열 번호 23 (EGF의 단편)으로 이루어진 그룹에서 선택된 항-혈관형성 활성을 갖는 펩티드이다.

암세포의 표면에 제시된 TRAIL 수용체에 결합시, 융합 단백질은 2중 효과를 발휘할 것이다. TRAIL의 기능적 단편 또는 보존된 기능성을 갖는 그 동족체인 도메인 (a)는, 그것의 공지된 작용제 활성 - 즉, 세포 표면 상의 사멸 수용체에 대한 결합 및 세포사멸의 외인성 경로의 활성화를 발휘할 것이다. 항-혈관형성 펩티드를 포함하는 융합 단백질의 내재화 후, 도메인 (b)는 TRAIL 도메인의 활성과 동시에 그 활성을 세포내로 강력하게 발휘할 수 있을 것이다. 이러한 방식으로, TRAIL의 항암 활성은 다른 성분 및 메커니즘의 활성화 - 예컨대 천연 VEGF, PDGF 및 EGF 리간드의 결합 부위의 입체 장해, 혈관형성 및 신생혈관생성의 억제, 포스파티딜이노시톨 3-키나아제, 단백질 키나아제 B (PKB/Akt)의 활성화 억제 또는 키나아제 Akt 및 NFk 경로에 의한 TRAIL 과발현의 간접 자극에 의해 강화될 수 있다.

본 발명의 실시 양태 중 하나에서, 도메인 (a) 및 도메인 (b)는 세포 환경, 특히 종양 세포 환경에 존재하는 프로테아제에 의해 인식된 절단 부위의 서열을 포함하는 하나 이상의 도메인 (c)에 의해 연결된다. 하나 이상의 도메인 (c)에 의한 도메인 (a)와 도메인 (b)의 연결은 도메인 (a) 및 (b) 간 하나 이상의 도메인 (c)가, 특히 1 또는 2개의 도메인 (c)가 존재할 수 있다는 것을 의미한다.

프로테아제 절단 부위는 하기에서 선택될 수 있다:

- 메탈로프로테아제 MMP, 특히 서열 번호 24로 지정된 (Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro/PLGLAGEP), 또는 서열 번호 55로 지정된 (Pro Leu Gly Ile Ala Gly Glu /PLGIAGE), 또는 서열 번호 56으로 지정된 (Pro Leu Gly Leu Ala Gly GluPro /PLGLAGEP)에 의해 인식되는 서열;

- 유로키나제 uPA, 특히 서열 번호 25로 지정된 Arg Val Val Arg (단문자 관례로 RVVR) 또는 부착되는 서열의 마지막 아미노산과 함께, 서열 번호 25를 형성하는 이의 단편에 의해 인식되는 서열,

및 이들의 조합.

본 발명의 한 실시 양태에서, 프로테아제 절단 부위는 임의의 순서로 서로 나란히 위치한, 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열 및 유로키나제 uPA에 의해 인식되는 서열의 조합이다.

한 실시 양태에서, 도메인 (c)는 MMP/uPA 서열 번호 24/서열 번호 25의 조합 또는 uPA/MMP 서열 번호 25/서열 번호 24의 조합이다.

다른 실시 양태에서, 도메인 (c)는 MMP/uPA 서열 번호 55 /서열 번호 25의 조합 또는 uPA/MMP 서열 번호 25/서열 번호 55의 조합이다.

다른 실시 양태에서, 도메인 (c)는 MMP/uPA 서열 번호 56 /서열 번호 25의 조합 또는 uPA/MMP 서열 번호 25/서열 번호 56의 조합이다.

프로테아제들인 메탈로프로테아제 MMP 및 유로키나아제 uPA는 종양 환경에서 과발현된다. 프로테아제에 의해 인식되는 서열의 존재는 도메인 (b)로부터 도메인 (a)의 절단, 즉 기능성 도메인 (b)의 방출과, 그에 따른 활성화를 가능하게 한다.

이펙터 펩티드의 신속한 방출을 가능하게 하는 것에 의한 프로테아제 절단 부위의 존재는, 세포에 존재하는 프로테아제에 의한 융합 단백질의 랜덤 분해가 발생하기 전에 펩티드를 그 작용 위치로 수송하는 기회를 증가시킨다.

융합 단백질의 주요 기능성 요소와는 별개로, 절단 부위 도메인(들), 본 발명의 융합 단백질은 가요성 입체 글리신-시스테인-알라닌 링커 (스페이서)의 중립 서열/서열들을 포함할 수 있다. 그러한 링커/스페이서는 잘 알려져 있고, 문헌에 기재되어 있다. 융합 단백질의 서열 내로의 이들의 도입은 숙주 세포에서 그 과발현의 프로세스에 의해 생성된 단백질의 정확한 폴딩을 제공하는 것을 의도한 것이다.

특히, 가요성 입체 링커는 글리신, 시스테인 및 알라닌 잔기의 조합인 서열 번호 26 및 서열 번호 27로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 가요성 입체 링커는 글리신 및 세린 잔기로 이루어진 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 54로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.

추가적으로, 가요성 입체 링커는, 가요성 입체 링커로서 작용하는 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 54의 임의의 단편, 예를 들어 단편 Gly Gly Gly /GGG 또는 단편 Gly Gly/GG일 수 있다.

한 실시 양태에서, 가요성 입체 링커는 또한 단일 아미노산 잔기, 예컨대 단일 글루탐산 잔기, 시스테인, 세린, 프롤린 또는 글리신 잔기에서 선택될 수 있다.

다른 실시 양태에서, 가요성 입체 링커는 글루탐산 잔기, 시스테인, 세린, 프롤린 또는 글리신의 단일 아미노산 잔기 및 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 54로 이루어진 링커의 임의의 조합일 수 있다.

본 발명의 융합 단백질의 특별한 실시 양태는, 이펙터 펩티드로서 VEGF로부터 유도된 헵타펩티드를 포함하는, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6 및 서열 번호 46, 서열 번호 47 및 서열 번호 48로 나타낸 단백질로 이루어진 그룹에서 선택된 항-혈관형성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 본 발명의 융합 단백질의 다른 특별한 실시 양태는, 이펙터 펩티드로서 CD13에 결합하는 서열을 포함하는, 서열 번호 7 및 서열 번호 8로 나타낸 단백질로 이루어진 그룹에서 선택된 항-혈관형성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다.

본 발명의 융합 단백질의 특별한 실시 양태는, 이펙터 펩티드로서 PDGF의 단편을 포함하는, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11 및 서열 번호 49로 나타낸 단백질로 이루어진 그룹에서 선택된 항-혈관형성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다.

본 발명의 융합 단백질의 특별한 실시 양태는, 이펙터 펩티드로서 텀스타틴 및 및 II 단편을 포함하는, 서열 번호 12 및 서열 번호 13으로 나타낸 단백질로 이루어진 그룹에서 선택된 항-혈관형성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다.

본 발명의 융합 단백질의 특별한 실시 양태는, 이펙터 펩티드로서 EGF의 단편을 포함하는, 서열 번호 14 및 서열 번호 15로 나타낸 단백질로 이루어진 그룹에서 선택된 항-혈관형성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다.

본 발명의 융합 단백질의 특별한 실시 양태는, 이펙터 펩티드로서 VEGF로부터 유도된 헵타펩티드, 텀스타틴 펩티드의 단편 I 및 텀스타틴 펩티드의 단편 II를 포함하는, 서열 번호 3으로 나타낸 단백질로 이루어진 그룹에서 선택된 항-혈관형성 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다.

전술한 대표적인 융합 단백질의 구조의 상세한 설명은 도 1 내지 3 및 도 9에, 및 후술하는 실시예에 나타낸다.

본 발명에 따라, “융합 단백질”은 2 이상의 단백질 또는 그의 단편을 함유하는 단일 단백질 분자로서, 추가의 화학 링커 없이, 이들 각각의 펩티드 사슬 내에서 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결된 것을 의미한다.

융합 단백질은 또한 대안적으로 단백질 구조체 또는 키메라 단백질로서 기재될 수도 있다. 본 발명에 따라, 용어 "구조체" 또는 "키메라 단백질"은, 사용된다면, 상술한 바와 같은 융합 단백질을 언급하는 것으로 이해되어야 한다.

당업자에게 이와 같이 정의된 융합 단백질은 펩티드 및 단백질의 공지의 화학 합성 방법에 의해 합성될 수 있다는 것은 명백할 것이다.

융합 단백질은 화학 펩티드 합성 방법, 특히 캐리어로서 적당한 수지를 사용한 고체상에서의 펩티드 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 통상적으로 공지된 것이며, 그 중에서도 특히 논문 예컨대 「보단스즈키(Bodanszky) 및 보단스즈키, 펩티드 합성의 실시(The Practice of Peptide Synthesis), 1984, Springer-Verlag, 뉴욕, Stewart 등, Solid Phase Peptide Synthesis, 2판, 1984, 피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chemical Company)」에 기술되어 있다.

융합 단백질은 연속 단백질로서 펩티드의 화합 합성의 방법에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 단백질의 개별 단편(도메인)은 별개로 합성하고 그 후 제2 펩티드의 카르복실 말단으로부터 한 펩티드 단편의 아미노 말단을 축합하여, 펩티드 결합을 통해 한 연속 펩티드에서 함께 조합할 수 있다. 이러한 기술은 통상적으로 공지된 것이다.

결과로 얻어진 펩티드의 구조를 증명하기 위해, 펩티드의 분자량을 결정하는 고분해능 질량 분석법(high resolution mass spectrometry)과 같은 공지의 펩티드의 아미노산 조성을 분석하는 공지 방법이 사용될 수 있다. 펩티드 서열을 확인하기 위해, 순차적으로 펩티드를 분해하고 아미노산의 서열을 식별하는 단백질 서열 분석기도 또한 사용할 수 있다.

바람직하게는, 그러나, 본 발명의 융합 단백질은 숙주 세포 내의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 유전자 발현 방법에 의해 생성된 재조합 단백질이다.

본 발명의 추가의 양상은 앞서 정의한 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열, 특히 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열이다.

바람직하게는, 상술한 바와 같이 융합 단백질을 코딩하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 특히 DNA는 대장균(E. coli)에서의 발현에 최적화된 서열이다.

본 발명의 또 다른 양상은 또한 상술한 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열, 특히 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터이다.

본 발명의 또 다른 양상은 상술한 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 융합 단백질의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포는 대장균 세포이다.

융합 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 생성 방법은 공지되어 있다. 간단히, 이 기술은 폴리뉴클레오티드 분자의 생성, 예를 들어 표적 단백질의 아미노산 서열을 코딩하고 숙주에서 표적 단백질의 발현을 지시하는 DNA 분자를 생성하는 것으로 구성된다. 그후, 폴리뉴클레오티드 분자를 코딩하는 표적 단백질은 폴리펩티드의 효율적 발현을 보장하는 적절한 발현 벡터로 도입된다. 재조합 발현 벡터는 그후 형질 감염(transfection)/형질 전환(transformation)을 위해 숙주 세포에 도입되고, 그 결과로서 형질 전환된 숙주 세포가 생성된다. 이것은 그후 형질 전환 세포의 배양에 의해 표적 단백질을 과발현시키고, 수득 된 단백질을 정제하며, 임의로 발현에 사용된 태그 서열을 절단하여 자르거나 또는 단백질을 정제한다.

발현 및 정제의 적당한 기술이 예를 들어 논문「Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990), 및 A. Staron 등, Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995」에 기술되어 있다.

숙주 세포에서 DNA 서열의 도입 및 복제를 위한 발현 벡터로서 코스미드, 플라스미드 또는 변형된(modified) 바이러스가 사용될 수 있다. 전형적으로 플라스미드가 발현 벡터로서 사용된다. 적당한 플라스미드는 공지되어 있으며 상업적으로 입수 가능하다.

본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 및 적당한 숙주 세포에 도입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 필수 조절 서열을 포함한다. 조절 서열의 선택은 숙주 세포의 타입에 의존되며 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 이러한 조절 서열의 예는 전사 프로모터(promoter) 및 인핸서(enhancer) 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 코딩 서열 전에 삽입된 전사 개시 신호를 함유하는 리보솜 결합 서열, 및 코딩 서열 후에 삽입된 전사 터미네이터 서열이다. 더욱이, 사용된 숙주 세포 및 벡터에 따라, 복제 개시점, 추가적인 DNA 제한 부위, 인핸서, 및 전사의 유도를 허용하는 서열과 같은 기타 서열이 발현 벡터에 도입될 수 있다.

발현 벡터는 형질전환된 세포에 명확한 표현형을 부여하고 형질전환된 세포의 특이적 선택을 할 수 있게 하는 마커 유전자(marker gene) 서열을 또한 포함할 것이다. 더욱이, 벡터는 또한 삽입 없이 플라스미드를 취한 것으로부터 표적 단백질의 삽입된 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 세포를 구분하도록 허용하는 제2 마커 서열을 함유할 수 있다. 가장 종종, 전형적인 항생물질 내성 마커가 사용된다, 그러나 세포 내(in vivo)의 존재가 자기방사(autoradiography) 기술, 분광 광도법 또는 생체- 및 화학-루미네선스를 사용하여 용이하게 결정될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 다른 리포터 유전자(reporter genes)도 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포에 따라, β-갈락토시다아제, β-글룩쿠로니다제(β-gluckuronidase), 루시페라제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 또는 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자가 사용될 수 있다.

또한, 발현 벡터는 폴딩이 용이하게 되는 예컨대 페리플라스마(periplasma)인 적절한 세포 구획으로 단백질을 수송하는 신호 서열을 함유할 수 있다. 추가로 N-말단에 부착된 Histag 또는 C-말단에 부착된 GST와 같은 라벨/태그를 코딩하는 서열이 존재할 수 있으며, 이것은 니켈 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피를 통해, 친화성의 원리를 사용하여 생성된 단백질의 후속 정제를 용이하게한다. 추가로 숙주 세포 내에서 단백질 분해에 대하여 단백질을 보호하는 서열, 뿐만 아니라 그의 용해도를 향상시키는 서열도 또한 존재할 수 있다.

표적 단백질의 서열에 부착된 보조 성분은 그의 활성을 차단하거나, 또는 예를 들어 독성으로 인한 것과 같은 또 다른 이유 때문에 장해가 될 수 있다. 이러한 성분은 제거되어야 하는데, 이는 효소 또는 화학 절단에 의해 성취될 수 있다. 특히, 6-히스티딘 태그 HisTag 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질 정제를 허용하도록 부착된 이러한 타입의 다른 마커가 제거되어야 하는데 그 이유는 가용성 TRAIL 단백질의 간 독성에 대한 그의 기술된 효과 때문이다. 원핵 세포: 에스캐리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 박테리아, 사카로마이세스 세르비시아에(Saccharomyces cervisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모, 및 진핵생물 세포주(곤충, 포유동물, 식물)를 포함하는 다양한 공지 숙주 세포를 기재로 하는 이형(heterologous) 발현 시스템이 사용될 수 있다.

바람직하게는, 손쉬운 배양 및 유전자 조작, 및 다량의 수득 생성물로 인해, 대장균(E. coli) 발현 시스템이 사용된다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 표적 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열이 대장균 내에서 발현을 위해 최적화될 것이고, 즉 당업계에 공지된 가능한 서열 변이체에서 선택된 대장균 내의 발현에 최적인 코돈을 코딩 서열 내에 함유할 것이다. 더욱이, 발현 벡터는 코딩 서열에 부착된 대장균에 적당한 상술한 성분을 함유할 것이다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시 양태에서 대장균 내의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열은 하기로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열의 군에서 선택되고:

서열 번호 31; 서열 번호 32; 서열 번호 33, 서열 번호 34; 서열 번호 35; 서열 번호 36; 서열 번호 37; 서열 번호 38; 서열 번호 39; 서열 번호 40; 서열 번호 41, 서열 번호 42; 서열 번호 43 서열 번호 44; 서열 번호 45, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52; 서열 번호 53; 이것은 각각 하기의 아미노산 서열로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 코딩한다:

서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 3; 서열 번호 4; 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 7; 서열 번호 8; 서열 번호 9; 서열 번호 10; 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13; 서열 번호 14 서열 번호 15, 서열 번호 46; 서열 번호 47; 서열 번호 48; 및 서열 번호 49.

바람직한 실시 양태에서, 본 발명은 또한 상기 예시된 폴리뉴클레오티드 서열인 서열 번호 31 내지 서열 번호 45 및 서열 번호 50 내지 서열 번호 53의 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 대장균의 형질 전환에 적당한 발현 벡터, 뿐만 아니라, 이러한 발현 벡터로 형질전환된 대장균 세포를 제공한다.

형질 전환, 즉 박테리아 숙주 세포, 특히 대장균으로의 DNA 서열의 도입은 예를 들어 저온(4℃)에서 칼슘 이온으로 처리하고, 그후 열 충격(37-42℃에서)을 수행하여 또는 전기천공법에 의해 DNA를 받아들일 수 있도록 제조된 컴피턴트(competent) 세포 상에서 일반적으로 수행된다. 이러한 기술은 공지되어 있으며 일반적으로 발현 시스템의 제조자에 의해 결정되거나, 또는 문헌 및 실험 작업을 위한 매뉴얼, 예컨대 Maniatis 등, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982에 기재되어 있다.

대장균 발현 시스템 내의 본 발명의 융합 단백질의 과발현의 절차가 하기에서 더 기술될 것이다.

본 발명은 또한 활성 성분으로서 상기 정의된 바의 본 발명의 융합 단백질 및 적당한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 통상의 보조 성분을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 담체 또는 희석제 내에 용해 또는 분산된 본 발명의 유효량의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 보조 성분을 함유할 것이며, 바람직하게는 단위 투여 형태 또는 다수의 투여량을 함유하는 제제로 제제화된 약제학적 조성물의 형태일 것이다. 약제학적 형태 및 그의 제제화 방법 뿐만 아니라 기타 성분, 담체 및 희석제는 당업자에게 공지되어 있으며 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이들은 논문「Remington's Pharmaceutical Sciences, ed.20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA 」에 기술되어 있다.

용어 "약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및 보조 성분"은 당업계에 공지된 임의의 용매, 분산 매체, 계면활성제, 항산화제, 안정화제, 방부제(예컨대 항세균제, 항진균제), 등장제를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 선택된 투여 경로 및 원하는 투여 형태, 예컨대 경구, 비경구, 흡입, 국소용 액체, 고체 및 에어로졸 형태에 따른 다양한 타입의 담체, 희석제 및 부형제를 함유할 수 있으며, 이러한 선택된 형태는 주사(injection)와 같은 투여 경로를 위해 무균이어야 한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 종양내(intratumourous)와 같은 주사 경로, 또는 단일 또는 지속 정맥내 주입(infusion)을 포함하는 비경구이다.

한 실시 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양에 직접적으로 주사하여 투여될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 투여될 수 있다. 여전히 또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은, 필요에 따라, 적절한 pH로 완충되고 체액으로 등삼투성(isoosmotic)인 약제학적으로 허용 가능한 수성 또는 비수성 매질 내에 용액 또는 분산액일 수 있으며, 또한 수용체의 조직 또는 혈액과 상용성이 있는 조성물을 만드는 산화 방지제, 완충액, 세균발육 저해제, 가용성 물질도 함유할 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 기타 성분은 예를 들어 물, 에탄올과 같은 알콜, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올, 트리글리세리드와 같은 지질, 식물성 오일, 리포솜을 포함할 수 있다. 물질의 적당한 유동성 및 입자 크기는 레시틴과 같은 코팅 물질, 및 히드록시프로필셀룰로스 폴리소르베이트와 같은 계면활성제 등에 의해 제공될 수 있다.

액체 비경구 조성물을 위한 적당한 등장제(isotoning agent)는 예를 들어 글루코스와 같은 당, 및 염화 나트륨 및 그의 조합이다.

대안적으로 주사 또는 주입 투여를 위한 약제학적 조성물은 예컨대 발열원 없는 무균수와 같은 적당한 담체 내에서 사용되기 전에 즉시 재구성을 위해 동결 건조된 분말과 같은 분말 형태일 수 있다.

비경구 투여를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 용액, 스프레이 또는 에어로졸을 포함하는 비내 투여의 형태도 또한 가질 수 있다. 바람직하게는 비내 투여를 위한 형태는 수용액일 것이며 코 분비물과 유사한 특성을 유지하도록 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 유지한 완충 또는 등장성이 될 것이다. 더욱이, 공지의 비강내 제제에서와 같은 방부제 또는 안정화제를 함유할 것이다.

조성물은 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키는 다양한 항산화제를 함유할 수 있다. 더욱이, 미생물의 작용을 방지하기 위해, 조성물은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 예를 들어, 파라벤, 클로로-부탄올, 티메로살, 소르브산, 및 이러한 타입의 공지된 유사 물질을 포함하는 다양한 항세균 및 항진균제를 함유할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들어 약 0.01wt% 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다. 특히 더, 조성물은 조성물 단위의 1중량% 내지 75중량%의 양으로, 또는 예를 들어 25중량% 내지 60중량%의 양으로 함유될 수 있으며, 지시된 값으로 제한되는 것은 아니다. 인간을 포함하는 환자에게 투여되는 본 발명에 따른 조성물의 실제 복용량은 체중, 상태의 심각성, 치료될 질환의 타입, 선행 또는 수반되는 치료학적 개입, 투여 환자 및 투여 경로와 같은 육체적 및 생리적 인자에 의해 결정될 것이다. 적당한 단위 복용량, 전체 복용량 및 조성물 내에서 활성 성분의 농도가 치료하는 의사에 의해 결정된다.

조성물은 예를 들어 약 1 마이크로그램/kg의 환자의 체중 내지 약 1000mg/kg의 환자의 체중의 복용량으로, 예컨대 5mg/kg의 체중 내지 100mg/kg의 체중 범위 또는 5mg/kg의 체중 내지 500mg/kg의 체중 범위로 투여될 수 있다. 융합 단백질 및 이를 함유하는 조성물은 항암 또는 항종양을 나타내며 암 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 인간을 포함하는 포유동물의 암 질환 치료를 위한 상기 정의된 바의 본 발명의 융합 단백질의 용도도 또한 제공한다. 본 발명은 이러한 치료가 필요한 대상에게 상기 정의된 바의 본 발명의 융합 단백질의 항암 유효량을, 임의로 적절한 약제학적 조성물의 형태로 투여하는 것을 포함하는 인간을 포함하는 포유동물의 암 질환 치료 방법도 또한 제공한다.

본 발명의 융합 단백질은 백혈병, 육아종증(granulomatosis), 골수종(myeloma) 및 기타 혈액암과 같은 혈액암의 치료를 위해 사용될 수 있다. 융합 단백질은 또한 유방암, 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer)을 포함하는 폐암, 대장암, 췌장암, 난소암, 방광암, 전립선암, 신장암, 뇌종양(brain cancer), 등과 같은 고형 종양의 치료를 위해 또한 사용될 수 있다. 암의 치료에서 융합 단백질 투여의 적절한 경로는 투여 경로를 위한 적절한 형태 및 조성물의 주사 또는 주입의 형태로 본 발명의 융합 단백질을 투여하는 것으로 구성되는 특히 비경구 경로일 것이다. 본 발명은 하기의 특정 융합 단백질의 일반 절차 및 실시예에서 더 상세히 기술될 것이다.

융합 단백질의 과발현을 위한 일반적 절차

플라스미드의 제조

표적 융합 단백질의 아미노산 서열은 대장균(Escherichia coli) 내의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는, 그것을 코딩하는 DNA 서열을 생성하도록 하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. 이러한 절차는 대장균(Escherichia coli) 내의 표적 단백질 합성의 추가 단계의 효율을 향상시키는 것을 가능하게 한다. 그 결과의 뉴클레오티드 서열은 그 후 자동적으로 합성되었다. 추가로, 제한 효소 NdeⅠ(리딩 스트랜드의 5'-말단에서) 및 XhoⅠ(리딩 스트랜드의 3'-말단에서)의 절단 부위는 표적 단백질을 코딩하는 위의 결과의 유전자에 첨가하였다. 이들은 벡터 pET28a(노바겐)로 유전자를 클로닝하기 위해 사용되었다. 이들은 또한 다른 벡터에 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 구조체로부터 발현된 표적 단백질은 트롬빈에 위해 인식된 부위에 의해 진행된 폴리히스티딘 태그(6 히스티딘)가 N-말단에 설치되며, 이것은 후속하여 친화성 크로마토그래피를 통해 정제를 위해 제공되었다. 일부 표적은 임의의 태그 없이, 특히 히스티딘 태그 없이 발현되었고, 이들은 후속하여 SP 세파로스로 정제하였다. 수득한 구조체의 정확성은 효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ을 사용하여 단리된 플라스미드의 제한 분석에 의해, 이어서 표적 단백질의 전체 리딩 프레임의 자동 시퀀싱에 의해 우선적으로 확인되었다. 시퀀싱을 위해 사용된 프라이머는 벡터 내에 존재하는 T7 프로모터 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') 및 T7 terminator (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3') 의 서열에 상보적이다. 수득한 플라스미드는 제조자의 추천에 따라 형질전환된 상용의 대장균 균주 내의 표적 융합 단백질의 과발현을 위해 사용되었다. 선택 배지(LB 한천, 카나마이신 50 ug/ml, 1% 글루코스) 상에서 수득된 콜로니는 카나마이신(50ug/ml) 및 1% 글루코스가 보충된 LB 액체 배지 내에서 밤새 배양하여 제조하기 위해 사용되었다. 진탕 배양기에서 약 15시간의 성장 후, 배양액은 적절한 배양액을 접종하기 위해 사용되었다.

융합 단백질의 과발현 및 정제 - 일반 절차 A

카나마이신(30ug/ml) 및 100uM 황산 아연이 있는 LB 배지를 밤새 배양액으로 접종하였다. 배양액은 600nm에서 광학 밀도(OD)가 0.60-0.80에 도달될 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후 IPTG는 0.25 - 1mM 범위의 최종 농도까지 첨가하였다. 25℃에서 진탕(shaking) 배양 3.5-20 시간 후, 배양액은 25분간 6,000g에서 원심분리하였다. 박테리아 펠릿은 pH 7.4의 50mM KH₂PO₄, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸을 함유하는 완충액에서 재현탁 시켰다. 현탁액은 8분 동안 얼음 상에서 초음파(40% 진폭, 15-초 펄스, 10초 간격)처리하였다. 수득한 추출물은 20000g, 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 맑게 하였다. Ni-세파로오스(GE 헬스케어) 수지는 박테리아 세포 추출물의 제조용으로 사용된 완충액으로 평형하게 하여 전처리하였다. 수지는 그후 추출물의 원심 분리 후 상청액으로 4℃에서 밤새 배양하였다. 그후, 이것은 크로마토그래피 컬럼에 적재하고 pH 7.4의 50mM KH₂PO₄, 0.5M NaCl, 20mM 이미다졸 완충액 15 내지 50 부피로 세정하였다. 수득된 단백질은 pH 7.4의 0.5M NaCl이 있는 50mM KH₂PO₄ 완충액 내에서 이미다졸 구배(gradient)를 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 수득된 분획은 SDS-PAGE로 분석하였다. 적절한 분획은 혼합하고 50mM 트리스 완충액, pH 7.2, 150mM NaCl, 500mM L-아르기닌, 0.1mM ZnSO₄, 0.01% 트윈(Tween) 20에 대하여 4℃에서 밤새 투석하고, 동시에 존재하는 경우 Histag는 트롬빈(1:50)으로 절단하였다. 절단 후, 트롬빈은 벤즈아미딘 세파로오스TM 수지를 사용하여 정제에 의해 Histag로 발현된 표적 융합 단백질로부터 분리하였다. Histag 없이 발현된 표적 융합 단백질의 정제는 SP 세파로스 상에서 수행하였다. 생성물의 순도는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분석하였다(Maniatis 등, Molecular Cloning. 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 1982).

융합 단백질의 과발현 및 정제 - 일반 절차 B

카나마이신(30ug/ml) 및 100uM 황산 아연이 있는 LB 배지를 밤새 배양액으로 접종하였다. 배양액은 600nm에서 광학 밀도(OD)가 0.60-0.80에 도달될 때까지 37℃에서 배양하였다. 그후 IPTG는 0.5 -1mM 범위의 최종 농도까지 첨가하였다. 25℃에서 진탕 하면서 20 시간 인큐베이션 후, 배양액은 25분 동안 6000g에서 원심분리하였다. 과발현 후 박테리아 세포는 pH 7.8의 50mM KH₂PO₄, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸, 5mM 베타-메르캅토에탄올, 0.5mM PMSF(페닐메틸술포닐 플루오라이드)를 함유하는 완충액 내에서 프렌치 프레스(French Press)로 분열시켰다. 수득한 추출물은 8.000g에서 50분 동안 원심분리하여 맑게 하였다. Ni-세파로오스 수지는 수득된 상청액으로 밤새 배양하였다. 그후 결합 단백질이 있는 수지는 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 비결합 단백질을 함유하는 분획을 세정-제거하기 위해, 컬럼은 15 내지 50 부피의 완충액 50mM KH₂PO₄, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸, 5mM 베타-메르캅토에탄올, 0.5mM PMSF(페닐메틸술포닐 플루오라이드), pH7.8로 세정하였다. 그후, 베드와 특이적으로 결합하는 대부분의 단백질을 세정-제거하기 위해, 컬럼은 50mM KH₂PO₄, 0.5M NaCl, 500mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0,5mM PMSF를 함유하는 완충액, pH 7.5로 세정하였다. 수득된 분획은 SDS-PAGE로 분석하였다(Maniatis 등, Molecular Cloning. 콜드 스프링 하버, 뉴욕, 1982). 표적 단백질을 함유하는 분획을 결합하고, 단백질이 히스티딘 태그와 함께 발현된 경우, 트롬빈으로 절단하여(1U/4mg의 단백질, 16℃에서 8시간) 폴리히스티딘 태그를 제거하였다. 그후, 분획은 완충액 제제(500mM L-아르기닌, 50mM 트리스, 2.5mM ZnSO₄, pH 7.4)에 대하여 투석되었다.

실시예 1. 서열 번호 1의 융합 단백질

서열 번호 1의 단백질은, VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 서열 TRAIL 121-281 헵타펩티드의 N-말단에서 이펙터 펩티드로서 부착된, 173 아미노산의 길이 및 19.8 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드 및 TRAIL 서열의 사이에 가요성 글리신 입체적 링커 (서열 번호 28)가 도입된다.

융합 단백질의 구조는 도 1에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 31로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

상술한 구조의 아미노산 서열인 서열 번호 1은 그의 코딩 DNA 서열인 서열 번호 31을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. 하나는 His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하고, 다른 하나는 임의의 태그가 없는 2가지 버전의 DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 모두 노바겐(Novagen)으로부터 입수한, 대장균 BL21(DE3) 및 튜너(Tuner)(DE3)pLysS 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 2. 서열 번호 2의 융합 단백질

서열 번호 2의 단백질은, 이펙터 펩티드로서 VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 서열 TRAIL 95-281 헵타펩티드의 N-말단에서 부착된, 199 아미노산의 길이 및 22.8 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드 및 TRAIL 서열의 사이에 가요성 글리신 입체적 링커 (서열 번호 28)가 도입된다.

융합 단백질의 구조는 도 1에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 32로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 2는 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 32를 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 갖는 DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한, 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 3. 서열 번호 3의 융합 단백질

서열 번호 3의 융합 단백질은, VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 서열 TRAIL 121-281 헵타펩티드의 N-말단에서, 및 텀스타틴 (각각, 서열 번호 18 및 서열 번호 19)의 서열 TRAIL 121-281 단편 I 및 II의 C- 말단에서 이펙터 펩티드로서 부착된, 230 아미노산의 길이 및 26.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 서열 TRAIL의 N-말단에 부착된 이펙터 펩티드 및 TRAIL 서열의 사이에는 글리신 가요성 입체 링커 (서열 번호 28)가 도입된다. 서열 TRAIL의 C-말단에 부착된 이펙터 펩티드 및 TRAIL 서열의 사이에는 3개의 글리신 잔기 Gly Gly Gly, 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24) 및 유로키나아제 uPA (서열 번호 25)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열이 도입되며, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다.

융합 단백질의 구조는 도 1에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 33으로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 3은 그의 코딩 DNA 서열인 서열 번호 33을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 갖는 DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한, 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 B에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 4. 서열 번호 4의 융합 단백질

서열 번호 4의 단백질은, 서열 TRAIL 121-281의 N-말단에, VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 헵타펩티드의 2개의 서열이 이펙터 펩티드로서 부착된, 187 아미노산의 길이 및 21.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드의 2개의 서열 사이에는 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24) 에 의해 인식되는 절단 부위의 서열이 도입되며, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. MMP 절단 부위의 서열 및 이펙터 단백질의 서열 사이에는 단일 글루탐산 잔기 E가 도입된다. 이펙터 펩티드(서열 번호 17) 및 TRAIL의 서열 사이에는 가요성 입체 글리신 링커 (서열 번호 28)가 도입된다.

융합 단백질의 구조는 도 1에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 44로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 4는 그의 코딩 DNA 서열인 서열 번호 34를 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. 하나는 His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하고, 다른 하나는 임의의 태그가 없는 2가지 버전의 DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 스트라타겐(Stratagene)으로부터 입수한 대장균 BL21DE3pLysSRIL 균주 및 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 튜너(DE3)를 사용하여 일반 절차 B에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 5. 서열 번호 5의 융합 단백질

서열 번호 5의 단백질은, 서열 TRAIL 121-281의 N-말단에, VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 헵타펩티드의 2개의 서열이 이펙터 펩티드로서 부착된, 187 아미노산의 길이 및 21.8 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드의 2개의 서열 사이에 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. MMP 절단 부위의 서열 및 이펙터 단백질의 서열 사이에는 단일 글루탐산 잔기 E가 도입된다. 추가로 TRAIL의 N-말단에는 2개의 글리신 잔기가 부착된다.

융합 단백질의 구조는 도 1에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 5 및 서열 번호 55로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 5는 그의 코딩 DNA 서열인 서열 번호 35를 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. 하나는 His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하고, 다른 하나는 임의의 태그가 없는 2가지 버전의 DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 튜너(DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 6. 서열 번호 6의 융합 단백질

서열 번호 6의 단백질은, 서열 TRAIL 95-281의 N-말단에, VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 헵타펩티드의 2개의 서열이 이펙터 펩티드로서 부착된, 222 아미노산의 길이 및 25.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드의 2개의 서열 사이에 단백질은 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 55)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. 이펙터 펩티드 (서열 17) 및 TRAIL의 서열 사이에는 시스테인 가요성 입체 링커 (서열 번호 26)가 도입된다.

융합 단백질의 구조는 도 1에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 36으로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 6은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 36을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열이 없는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 튜너(DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 7. 서열 번호 7의 융합 단백질

서열 번호 7의 단백질은, 서열 TRAIL 119-281의 N-말단에, CD13 (서열 번호 20)의 리간드인 서열이 이펙터 펩티드로서 부착된, 168 아미노산의 길이 및 19.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다.

융합 단백질의 구조는 도 2에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 7 및 서열 번호 37로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 7은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 37을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. 하나는 His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하고, 다른 하나는 임의의 태그가 없는 2가지 버전의 DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 튜너(DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 8. 서열 번호 8의 융합 단백질

서열 번호 8의 단백질은, 서열 TRAIL 95-의 N-말단에 CD13 (서열 번호 21)의 리간드인 서열이 이펙터 펩티드로서 부착된, 201 아미노산의 길이 및 23.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. TRAIL의 서열 및 이펙터 펩티드의 서열 사이에, 단백질은 가요성 글리신-세린 링커 (서열 번호 30)의 서열을 함유한다.

융합 단백질의 구조는 도 2에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 38로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 8은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 38을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는 DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 튜너(DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 9. 서열 번호 9의 융합 단백질

서열 번호 9의 단백질은, 서열 TRAIL 119-281의 N-말단에, PDGF (서열 번호 22)의 서열이 이펙터 펩티드로서 부착된, 192 아미노산의 길이 및 22.1 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. TRAIL의 서열 및 이펙터 펩티드 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유한다. 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다.

융합 단백질의 구조는 도 2에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 9 및 서열 번호 39로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 9는 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 39를 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. 하나는 His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하고, 다른 하나는 임의의 태그가 없는 2가지 버전의 DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 로세타(Rosetta) (DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 10. 서열 번호 10의 융합 단백질

서열 번호 10의 단백질은, 서열 TRAIL 95-281의 N-말단에, PDGF (서열 번호 22)의 단편이 이펙터 펩티드로서 부착된, 216 아미노산의 길이 및 24.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. TRAIL의 도메인 및 이펙터 펩티드 서열의 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다.

융합 단백질의 구조는 도 2에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 40으로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 10은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 40을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 모두 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 및 튜너(DE3)pLysS 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 11. 서열 번호 11의 융합 단백질

서열 번호 11의 단백질은, 서열 TRAIL 95-281의 N-말단에, PDGF (서열 번호 22) 단편이 이펙터 펩티드로서 부착된, 226 아미노산의 길이 및 25.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. TRAIL의 서열 및 이펙터 펩티드 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유한다. 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. TRAIL 서열 및 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 절단 부위의 서열 사이에 단백질은 또한 가요성 글리신-시스테인-알라닌 링커 (서열 번호 27)를 함유한다.

융합 단백질의 구조는 도 2에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 11 및 서열 번호 41로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 11은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 41을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열이 없는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 모두 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 및 튜너(DE3)pLysS 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 12. 서열 번호 12의 융합 단백질

서열 번호 12의 단백질은, 서열 TRAIL 121-281의 N-말단에, 텀스타틴 (서열 번호 18 및 서열 번호 19)의 단편 I 및 II가 이펙터 펩티드로서 부착된, 217 아미노산의 길이 및 25 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. TRAIL의 서열 및 이펙터 펩티드 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. TRAIL 서열 및 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 절단 부위의 서열 사이에 단백질은 또한 3개의 글리신 잔기 Gly Gly Gly로 이루어진 가요성 링커를 함유한다.

융합 단백질의 구조는 도 3에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 42로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 12는 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 42를 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 모두 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 및 튜너(DE3)pLysS 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 13. 서열 번호 13의 융합 단백질

서열 번호 13의 단백질은, 서열 TRAIL 121-281의 N-말단에, 텀스타틴 (서열 번호 19)의 단편 II가 이펙터 펩티드로서 부착되고, 서열 TRAIL 121-281의 C-말단에, 텀스타틴 (서열 번호 18)의 단편 I이 이펙터 펩티드로서 부착된, 220 아미노산의 길이 및 25.1 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. TRAIL의 서열 및 이펙터 펩티드 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. TRAIL 서열 및 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 절단 부위의 서열 사이에 단백질은 또한 3개의 글리신 잔기 Gly Gly Gly를 함유하고, 서열 TRAIL의 C-말단 및 텀스타틴의 단편 II 사이에 3개의 글리신 잔기 Gly Gly Gly로 이루어진 가요성 링커를 함유한다.

융합 단백질의 구조는 도 3에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 13 및 서열 번호 43으로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 13은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 43을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 B.21 (DE3) 균주 및 스트라타겐으로부터 입수한 BL21DE3pLysSRIL 균주를 사용하여 일반 절차 B에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 14. 서열 번호 14의 융합 단백질

서열 번호 14의 단백질은, 서열 TRAIL 120-281의 N-말단에, EGF (서열 번호 23)의 단편이 이펙터 펩티드로서 부착된, 181 아미노산의 길이 및 21 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. TRAIL 도메인의 N-말단 및 이펙터 펩티드 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 56)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다.

융합 단백질의 구조는 도 3에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 44로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 14는 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 44를 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 균주 및 스트라타겐으로부터 입수한 BL21DE3pLysSRIL 균주를 사용하여 일반 절차 B에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 15. 서열 번호 15의 융합 단백질

서열 번호 15의 단백질은, 서열 hTRAIL95-281의 N-말단에, EGF (서열 번호 23)의 단편이 이펙터 펩티드로서 부착된, 217 아미노산의 길이 및 24.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. TRAIL 도메인의 N-말단 및 이펙터 펩티드 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 24)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. TRAIL 서열 및 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 절단 부위의 서열 사이에 단백질은 단일 프롤린 잔기에 이어 가요성 글리신-시스테인-알라닌 링커 (서열 번호 26)를 함유한다.

융합 단백질의 구조는 도 3에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 15 및 서열 번호 45로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 15는 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 45를 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 B에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 16. 서열 번호 46의 융합 단백질

서열 번호 46의 단백질은, 서열 hTRAIL95-281의 N-말단에, 서로 연결된 VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 2개의 헵타펩티드가 이펙터 펩티드로서 부착된, 211 아미노산의 길이 및 24.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드들 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 55)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다.

융합 단백질의 구조는 도 9에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 46 및 서열 번호 50으로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 46은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 50을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 B에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 17. 서열 번호 47의 융합 단백질

서열 번호 47의 단백질은, 서열 TRAIL 120-281의 N-말단에, 서로 연결된 VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 2개의 헵타펩티드가 이펙터 펩티드로서 부착된, 200 아미노산의 길이 및 22.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드들 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 55)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. 이펙터 단백질 및 TRAIL 도메인의 사이에 단백질은 이어서 삼량체 형성을 촉진하는 가요성 링커 (서열 번호 26) 및 가요성 글리신-세린 링커 (서열 번호 54)를 함유한다.

융합 단백질의 구조는 도 9에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 47 및 서열 번호 51로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 47은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 51을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 B에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 18. 서열 번호 48의 융합 단백질

서열 번호 48의 융합 단백질은, 서열 TRAIL 120-281의 N-말단에, 서로 연결된 VEGF (서열 번호 17)로부터 유도된 2개의 헵타펩티드가 이펙터 펩티드로서 부착된, 192 아미노산의 길이 및 21.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드들 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. 이펙터 단백질 및 TRAIL 도메인의 사이에 단백질은 이어서 삼량체 형성을 촉진하는 가요성 링커 (서열 번호 26) 및 가요성 글리신-세린 링커 (서열 번호 54)를 함유한다.

융합 단백질의 구조는 도 9에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 48 및 서열 번호 52로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 48은 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 52를 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하여 일반 절차 B에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 19. 서열 번호 49의 융합 단백질

서열 번호 49의 단백질은, 서열 TRAIL 120-281의 N-말단에, PDGF 단편 (서열 번호 22)이 이펙터 펩티드로서 부착된, 206 아미노산의 길이 및 23.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질이다. 이펙터 펩티드 및 TRAIL의 서열 사이에, 단백질은 유로키나아제 uPA (서열 번호 25) 및 메탈로프로테아제 MMP (서열 번호 55)에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 함유하고, 그로 인해 상기 이펙터 펩티드는 종양 환경에서 절단될 것이다. TRAIL 서열 및 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 절단 부위의 서열 사이에 단백질은 이어서 삼량체 형성을 촉진하는 가요성 글리신-시스테인-알라닌 링커 (서열 번호 26) 및 가요성 글리신-세린 링커 (서열 번호 54)를 함유한다.

융합 단백질의 구조는 도 9에 도식적으로 나타내었으며 그의 아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 코딩 서열이 각각 서열 번호 49 및 서열 번호 53으로 첨부된 서열 목록에 나타낸다.

아미노산 서열인 서열 번호 49는 그의 코딩 DNA 서열인 DNA 서열 번호 53을 생성하기 위한 템플레이트로서 사용되었다. His tag 및 트롬빈에 의해 인식되는 부위를 발현하는 것을 가능하게 하는 서열을 갖지 않는, DNA의 코딩 서열을 함유하는 플라스미드가 생성되었으며 융합 단백질의 과발현은 상기 기술된 일반 절차에 따라 수행되었다. 과발현은 모두 노바겐(Novagen)으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 및 튜너(DE3)pLysS 균주를 사용하여 일반 절차 A에 따라 수행되었다. 단백질은 상기 기술된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.

실시예 20. 융합 단백질의 항종양 활성의 시험

종양 세포주에 대한 세포독성 분석으로 시험관 내 및 마우스 생체 내에서 융합 단백질의 항종양 활성의 시험을 행하였다. 비교를 위해서, rhTRAIL114-281 단백질 및 위약(placebo)을 사용하였다.

1. 원편광 이색성(circular dichroism)의 측정 - 얻어진 단백질의 2차 구조 함량의 결정

실시예 1, 실시예 4, 실시예 5, 실시예 9 및 실시예 14에 대하여 원편광 이색성 (CD)에 의해 그들의 구조의 관점에서 융합 단백질 제제의 품질을 측정하였다.

단백질의 2차 구조 및 입체형태의 측정을 위해 원편광 이색성을 사용하였다. CD 방법은 타원 편광의 외관 및 빛의 편광면 회전으로 명백해지는 단백질 구조의 광학 활성을 사용한다. 원자외선(far UV)에서 단백질의 CD 스펙트럼은 주 폴리펩티드 사슬의 입체형태에 대한 정확한 데이터를 제공한다.

투석

분석될 단백질의 샘플을 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0,1 mM ZnCl₂, 80 mM 사카로오스, 5mM DTT, pH 7,4 (또는 대안적으로 전술한 바와 같이 과발현되었지만 His-tag가 결여되고 SP 세파로스 상에서 정제된 단백질에 대해 5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0,1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, 80 mM 사카로오스, pH 8,0 - 별표 *로 결과 표 5에 표시됨)로 이루어진 완충액으로 제제화 후 컷 오프 12 kDa로, 투석 백(Sigma-Aldrich)에서 투석하였다. 4℃에서 몇 시간 동안 교반하면서, 단백질 제제와 비교하여 100배 과량 (v/v)의 완충액에 대해, 투석을 수행하였다. 투석을 완료한 후, 각각의 제제를 원심분리하고(25 000 rpm, 10 분, 4℃), 적절한 상청액을 수집하였다. 상기와 같이 얻어진 샘플 중 단백질 농도를 3회의 평균으로서 브래드포드(Bradford) 법에 의해 판정하였다.

브래드포드 법을 사용한 단백질 농도의 측정

시약의 단백질 농도의 분석에서 에탄올 (4.8% v / v) 인산 (V) (5.95% v / v) 및 물의 혼합물에 쿠마씨 G-250 17.5 mg을 용해하여 시약을 제조하였다. 단백질 농도를 측정하기 위하여 1-10 ml의 샘플을 800 ml의 브래드포드 시약에 가하였다. 브래드포드 시약 및 단백질을 용해한 적절한 체적의 완충액을 함유하는 비교 샘플을 측정하였다. 실온에서 샘플을 5분 이상 인큐베이션 후 595 nm의 파장에서 분광광도계 캐리(spectrophotometer Cary 300)로 흡광도를 판독하였다. 단백질 농도는 10 농도 1-10 μg/ml 범위에서 BSA에 대해 제조된 표준 곡선으로부터 계산하였다. 출발 단백질 농도는 샘플 측정의 제조 도중 희석을 고려한 후 추정하였다.

원편광 이색성 측정

0.1-2.7 mg/ml 농도 범위의 단백질에 대한 원편광 이색성의 측정을, 0.2 mm 또는 1 mm의 광로를 갖는 석영 큐벳트에서 Jasco J-710 분광편광계로 수행하였다. 7 l/분의 질소의 흐름 하에서 측정을 수행하였으며, 이는 195 내지 250 nm의 파장 범위에서 측정을 행하는 것을 가능하게 한다. 측정의 파라미터 : 스펙트럼 해상도 - 1 nm; 광선의 반치폭 1 nm; 감도 20 mdeg, 1파장에 대한 평균 시간 - 8 초, 스캔 속도 10 nm/분, 3회 측정의 평균.

3회 측정의 평균으로서 결과를 제시하였다. 실시예 1, 실시예 4, 실시예 5, 실시예 9 및 실시예 14에 따른 단백질 및 rhTRAIL114-281에 대한 원편광 이색성 스펙트럼을 도 4에 나타낸다.

2차 구조 함량의 결정

얻어진 스펙트럼을 CDPro 소프트웨어를 사용하여 193-250 nm의 범위에서 수치로 분석하였다. 이러한 파장 범위에서 너무 낮은 신호 대 노이즈 비율 때문에, 광전자증배관에서의 전압이 700 V를 넘는 포인트는 생략하였다.

얻어진 데이터는 CDPro 소프트웨어를 사용하여, 분석된 단백질에서 특정의 2차 구조 함량의 산출을 제공한다(표 1).

대조군(rhTRAIL114-281)은 주로 β-시트 구조 타입을 갖는 단백질에 대한 특징적인 CD 스펙트럼을 나타낸다(220 nm 파장에서 최소인 급격한 윤곽의 타원율). 이것으로 2차 구조 성분의 산출이 확인되며, 이는 미미한 수(marginal number)의 α-헬릭스 성분을 제시한다. 얻어진 결과는 또한 TRAIL 단백질의 결정 구조로부터의 데이터와 부합하고 실시예 4, 실시예 9 및 실시예 14의 본 발명의 단백질에 대해 특징적이며, 여기서 베타 성분은 그 조성의 40%를 초과하여 구성한다.

모든 융합된 단백질의 경우, 이색성 스펙트럼은 파장 220 nm에서 1개의 최소값을 특징으로 한다. 융합된 단백질에서 TRAIL에 부착된 작은 이펙터 단백질 분자는 소량의 단백질을 구성하고, 정의된 2차 구조를 필연적으로 생성하지 않지만, 분석된 단백질은 초기의 단백질와 크게 상이해서는 안 된다. 실시예 5에 따른 단백질의 경우에 알파 구조의 높은 함량과 같은 상당한 차이, 또는 실시예 1로부터의 단백질에 대해 관찰된 바와 같은 시트는, 가능하게는 분석에 사용된 제한된 범위, 특히 180-200 nm 범위의 CD 스펙트럼에 기인한다.

2. 시험관 내 세포주 테스트

세포주

MTT 세포독성 테스트

MTT 분석은 세포 증식, 생존능력 및 세포독성을 측정하기 위해 사용되는 비색 분석이다. 이는 미토콘드리아 효소 숙시네이트-테트라졸륨 환원효소 1에 의한 황색 테트라졸륨 염 MTT (4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)의 비수용성 보라색 염료 포르마잔으로의 분해로 구성된다. MTT 환원은 살아있는 세포에서만 일어난다. 데이터 분석은 단백질의, 대조군 세포 대비 처리된 모집단에서 세포 수의 50% 환원이 발생하는, IC₅₀ 농도의 측정으로 이루어진다(ng/ml로). 결과는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 테스트는 문헌의 상세한 설명에 따라 수행하였다(Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvment of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183).

세포 배양 배지를 정해진 밀도(100 μl 당 10⁴ - 10⁵ 세포)로 희석하였다. 이어서 100 μl의 적절하게 희석된 세포 현탁액을 96-웰 플레이트에 3번 적용하였다. 그와 같이 제조된 세포를 사용된 배지에 따라 5% 또는 10% CO₂에서 24시간 동안 37℃에서 배양하고, 이어서 (100 μl의 배지 중) 상기 세포에 다양한 농도의 테스트 단백질을 함유하는 100 μl의 배지를 추가로 가하였다. 3-4회의 세포 분열에 상응하는 다음 72시간에 걸쳐 테스트 단백질과 함께 세포를 배양하고, 그 후 테스트 단백질을 갖는 배지에 MTT의 작업 용액[5 mg/ml] 20 ml를 가하고, 5% CO₂에서 3시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서 MTT 용액의 배지를 제거하고, 100 μl 의 DMSO를 가하여 포르마잔 결정을 용해하였다. 혼합 후, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(레퍼런스 필터 690 nm).

EZ4U 세포독성 테스트

비착생 세포주에서 단백질의 세포독성 활성을 테스트하기 위하여 EZ4U (Biomedica) 테스트를 사용하였다. 이 테스트는 MTT의 변형이며, 여기서 테트라졸륨 염의 환원시 형성된 포르마잔은 수용성이다. 단백질(7개 농도의 단백질, 각각 3번)과 함께 세포를 72 시간 연속 배양한 후 세포 생존능력 연구를 행하였다. 이러한 기준에서 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 IC₅₀ 값을 (2개의 독립적인 실험의 평균으로서) 측정하였다.

시험관 내 세포독성 테스트의 결과를 표 4에 IC₅₀ 값 (ng/ml)으로서 요약하였으며, 이는 용매만으로 처리된 대조군 세포에 대해 50% 수준에서 융합 단백질의 세포독성 효과가 관찰되는 단백질 농도에 해당한다.

표 4에서, 후속적으로 제거된 히스티딘 태그로 최초로 발현된 단백질은 실시예 번호.에서 a)로서 지정된다. 히스티딘 태그 없이 최초로 발현된 단백질은 실시예 번호.에서 b)로서 지정된다. 각각의 실험은 3부로 행해진 2개 이상의 독립적인 실험의 평균값을 나타낸다. 단백질 제제의 활성 결여의 기준으로는 2000 ng/ml의 IC₅₀ 한도를 적용하였다. 2000을 넘는 IC₅₀ 값을 갖는 융합 단백질은 비활성인 것으로 간주하였다.

이러한 테스트를 위한 세포는, 종래의 항암제에 대해 내성인 암 세포주로서 독소루비신 라인 MES-SA/DX5에 대해 내성인 및 TRAIL 단백질에 대해 민감한 종양 세포주, TRAIL 단백질에 대해 천연적으로 내성인 종양 세포주를 포함하도록 선택하였다(TRAIL에 대해 천연적으로 내성의 기준 : TRAIL 단백질에 대한 IC₅₀ > 2000).

비-암세포에서 융합 단백질의 영향/독성의 평가를 위해 건강한 대조군 세포주로서 분화되지 않은 HUVEC 세포주를 사용하였다.

TRAIL에 대해 천연적으로 내성인 세포에 본 발명의 특정 융합 단백질을 투여함으로서 TRAIL에 대한 세포주의 내성 극복의 가능성을 얻어진 결과로 확인하였다. TRAIL에 대해 민감한 세포 내로 본 발명의 융합 단백질을 투여할 때, 일부의 경우 작용의 효능의 분명하고 강력한 강화가 관찰되었으며, TRAIL 단독에 대한 IC₅₀과의 비교시 융합 단백질의 IC₅₀ 값의 감소가 명백하였다. 더욱이, 전통적인 항암제 독소루비신에 대해 내성인 세포에서 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성이 얻어졌고, 일부의 경우 TRAIL 단독의 활성보다 더 강력했다.

비-암세포주에 대해 얻어진 2000을 넘는 IC₅₀ 값은, 건강한 세포에 대해서는 본 발명의 단백질의 사용과 관련된 독성 작용이 없음을 나타내며, 이는 단백질의 전신 독성 가능성이 낮음을 나타낸다.

확장된 패널의 종양 세포주에 대해 선택된 단백질 제제의 세포독성 활성의 분석

표 5는 브로드한 범위의 가장 일반적인 암에 상응하는, 상이한 장기로부터의 브로드한 패널의 종양 세포에 대해 선택된 본 발명의 융합 단백질의 시험관 내 세포독성 활성의 테스트 결과를 나타낸다.

표 5에서, 후속적으로 제거된 히스티딘 태그로 최초로 발현된 단백질은 실시예 번호.에서 a)로서 지정된다. 히스티딘 태그 없이 최초로 발현된 단백질은 실시예 번호.에서 b)로서 지정된다.

얻어진 IC₅₀ 값으로, 융합 단백질의 높은 세포독성 활성과 그에 따른 암 치료에서의 잠재적 유용성을 확인하였다.

3. 이종이식에서 생체 내 융합 단백질의 항암 효능

인간 대장암 HCT116, Colo205 및 SW620 세포, 인간 비-소세포폐암 A549 및 NCI-H460-Luc2 세포, 인간 간세포암 PLC/PRF/5 (CLS) 세포, 인간 췌장암종 PANC-1 세포, 인간 간암종 HepG2 세포, 인간 대세포 폐암종 NCI-H460 세포, 및 인간 자궁암종 MES-SA/Dx5 다중약물 내성 세포의 마우스 모델에서 단백질 제제의 항종양 활성을 테스트하였다.

세포

HCT116 및 A549 (ATCC CCL-185) 세포를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민으로 보충된 Opti-MEM (Invitrogen, Cat.22600-134)과 1:1 비율로 혼합된 RPMI 1640 배지 (Hyclone, Logan, UT, USA)에 두었다. 마우스 이식의 당일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 서포트로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하고, 25x10⁶세포/ml의 농도까지 카운트 및 희석하였다.

PLC/PRF/5 (CLS), SW620 및 PANC-1 세포를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민으로 보충된 DMEM (HyClone, Logan, UT, USA)에 두었다. 마우스 이식의 당일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 서포트로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하고, 25x10⁶세포/ml의 농도까지 카운트 및 희석하였다.

HepG2 세포를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민으로 보충된 MEM (HyClone, Logan, UT, USA)에 두었다. 마우스 이식의 당일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 서포트로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하고, 25x10⁶세포/ml의 농도까지 카운트 및 희석하였다.

NCI-H460-Luc2, NCI-H460 및 Colo205를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민으로 보충된 RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, USA)에 두었다. 마우스 이식의 당일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 서포트로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하고, 25x10⁶세포/ml의 농도까지 카운트 및 희석하였다.

MES-SA/Dx5 세포를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민으로 보충된 McCoy’s (HyClone, Logan, UT, USA)에 두었다. 마우스 이식의 당일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 서포트로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하고, 25x10⁶세포/ml의 농도까지 카운트 및 희석하였다.

마우스

본 발명의 단백질의 항암 활성의 시험은 Charles River Germany로부터 입수한 4-5주령 또는 7-9주령 CD- 누드(Crl:CD1-Foxn1^nu 1) 마우스 또는 4-5 주령 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스로, 또는 Centrum Medycyny Doswiadczalnej(Białystok)로부터 입수한 4-5주령 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스로 수행하였다. 마우스를 음식물과 탈이온수에 대한 자유로운 접근(아드리비툼)과 함께 특정 병원체가 없는 조건 하에 두었다. 동물에 대한 모든 실험은 New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research에 의해 발행되고, IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)에 의해 승인된 가이드라인: "Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education"에 따라 행하였다.

실험 과정 및 평가

종양 크기는 전자 캘리퍼를 사용하여 측정하였고, 종양 체적은 식 : (a² x b)/2를 사용하여 계산하였으며, 여기서 a = 25 종양의 짧은 쪽 대각선(mm) 및 b = 종양의 긴 쪽 대각선(mm)이다. 종양 성장의 억제는 하기 식:

TGI [%] (종양 성장 억제) = (WT/WC) x 100 - 100%

을 사용하여 계산하였으며, 여기서 WT는 치료군에서 평균 종양 체적을 의미하고, WC는 대조군에서 평균 종양 체적을 의미한다.

실험 결과는 평균값 ± 표준 편차(SD)로 제시된다. 모든 계산 및 그래프는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 제작하였다.

인간 대장암 모델

마우스 Crl : CD1 - Foxn1 ^nu 1

0일에 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 HCT116 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~ 60-90 mm³ (14일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 70 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 1 (10 mg/kg), 실시예 4 (10 mg/kg), 실시예 5 (10 mg/kg), 및 실시예 9 (10 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (10 mg/kg)을 투여하였다. 10일 동안 매일 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 1, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 9의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 HCT116 대장암이 존재하는 마우스 Crl:CD1-Foxn1^nu에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 5에 도시되고, 도 6은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 5 및 6에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 1, 실시예 4, 실시예 5 및 실시예 9의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 27일째에 대조군에 비해 각각 67.8; 69.8; 84.4 및 66.2% TGI로, 종양 HCT116 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 44% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

마우스 Crl : CD1 - Foxn1 ^nu

HT116 모델

0일에 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 HCT116 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~ 50-78 mm³ (8일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 63 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 5 (10 mg/kg), 실시예 4 (10 mg/kg), 실시예 9 (10 mg/kg), 실시예 1 (10 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (10 mg/kg) 및 대조군으로서 제형 완충액 (50 mM Trizma Base, 150 mM NaCl, 80 mM 사카로오스, 250 mM L-아르기닌, 1 mM 글루타티온, Zn² ⁺ 0.1 mM, pH 7.3)을 투여하였다. 5일 동안 매일 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하고, 이어서 (2-일 중지 후) 추가 5일 동안 매일 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 5, 실시예 4, 실시예 9, 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 HCT116 대장암이 존재하는 마우스 Crl:CD1-Foxn1^nu에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 10에 도시되고, 도 11은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 10 및 11에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 5, 실시예 4, 실시예 9, 및 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 27일째에 대조군에 비해 각각 80%, 79%, 66% 및 68% TGI로, 종양 HCT116 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 44.3% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

마우스 Crl : SHO - Prkdc ^scid Hr ^hr

HT116 모델

0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 HCT116 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~ 380-430 mm³ (14일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 400 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 6 (30 mg/kg), 실시예 11 (45 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제, 비교로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg) 및 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0,1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 이틀마다 6회 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 6 (30 mg/kg), 실시예 11 (45 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 HCT116 대장암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 12에 도시되고, 도 13은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 12 및 13에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 32일째에 대조군에 비해 각각 42% 및 44.5% TGI로, 종양 HCT116 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 5.6% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

마우스 Crl : SHO - Prkdc ^scid Hr ^hr

COLO205 모델

0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 Colo205 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~ 90-130 mm³ (13일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 115 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 6 (30 mg/kg), 실시예 19 (30 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제, 비교로서 rhTRAIL114-281 (30 mg/kg) 및 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0,1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 이틀마다 6회 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 6 (30 mg/kg), 실시예 19 (45 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 Colo205 대장암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 14에 도시되고, 도 15는 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 14 및 15에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 33일째에 대조군에 비해 각각 100% 및 100% TGI로, 종양 Colo205 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 18.8% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

마우스 Crl : SHO - Prkdc ^scid Hr ^hr

SW620 모델

0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 SW620 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~ 290-350 mm³ (17일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 320 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 6 (30 mg/kg), 실시예 11 (40mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제, 비교로서 TRAIL114-281 (30 mg/kg) 및 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0,1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 이틀마다 6회 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 SW620 대장암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 16에 도시되고, 도 17은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 16 및 17에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 31일째에 대조군에 비해 각각 62% 및 23% TGI로, 종양 SW620 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, -9% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 어떠한 억제 효과도 없었다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

테스트된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소에 의해 명백해지는 중요한 부작용을 일으키지 않았다(즉, 기준 체중의 10% 미만). 이는 단백질의 낮은 전신 독성을 보여준다.

인간 폐암 모델

마우스 Crl : CD1 - Foxn1 ^nu 1

0일에 Crl:CD1-Foxn1^nu 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 A549 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~80-100 mm³ (14일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 90 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 1 (10 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (10 mg/kg)을 투여하였다. 12일 동안 이틀마다 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 1의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 A549 폐암이 존재하는 마우스 Crl:CD1-Foxn1^nu에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 7에 도시되고, 도 8은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 7 및 8에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 33일째에 대조군에 비해 44.8% TGI로, 종양 A549 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 16.5% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

Cby.Cg-foxn1(nu)/J

0일에 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 A549 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~60-90 mm³ (19일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 75 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 1 (15 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg), 대조군으로서 주사용 물을 투여하였다. 이틀마다 6회 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 1의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 A549 폐암이 존재하는 마우스 Cby.Cg-foxn1(nu)/J에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 18에 도시되고, 도 19는 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 18 및 19에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 33일째에 대조군에 비해 44.8% TGI로, 종양 A549 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 16.6% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

마우스: Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr

A. 0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 NCI-H460 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~150-170 mm³ (13일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 160 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 6 (30 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (30 mg/kg), 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0,1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 이틀마다 6회 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 6의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 NCI-H460 폐암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 20에 도시되고, 도 21은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 20 및 21에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 6의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 28일째에 대조군에 비해 88.5% TGI로, 종양 NCI-H460 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 17.5% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

B. 0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 3:1의 비율로 0.2 ml HBSS:마트리겔(Matrigel)의 혼합물에 현탁된 7x10⁶의 A549 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~140-165 mm³ (19일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 150 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 5 (60 mg/kg), 실시예 6 (50 mg/kg), 실시예 11 (50 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg), 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0.1 mM ZnCl₂, 100 mM L-아르기닌, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 이틀마다 6회 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 5, 실시예 6, 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 A549 폐암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 22에 도시되고, 도 23은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 22 및 23에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 5, 실시예 6, 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 38일째에 대조군에 비해 각각 39.3%, 39.3% 및 28% TGI로, 종양 A549 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 5.3% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

C. 0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.1 ml HBSS에 현탁된 7x10⁶의 NCI-H460-Luc2 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~100-120 mm³ (19일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 110 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 5 (우선 40 mg/kg 투여에 이어, 30 mg/kg 투여)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg), 대조군으로서 제형 완충액 (19 mM NaH₂PO₄, 81 mM Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0.1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, pH 7.4)을 투여하였다. 이틀마다 6회 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 5의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 NCI-H460-Luc2 폐암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 24에 도시되고, 도 25는 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 24 및 25에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 5의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 29일째에 대조군에 비해 97.2% TGI로, 종양 NCI-H460-Luc2 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 76% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

D. 0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS:마트리겔의 0.1 ml 혼합물에 현탁된 7x10⁶의 A549 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~100-120 mm³ (17일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 110 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 5 (50 mg/kg), 실시예 1 (50 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg), 대조군으로서 제형 완충액 (19 mM NaH₂PO₄, 81 mM Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0.1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, pH 7.4)을 투여하였다. 이틀마다 6회 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 5, 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 A549 폐암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 26에 도시되고, 도 27은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 26 및 27에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 5 및 실시예 1의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 34일째에 대조군에 비해 각각 52.5% 및 41.6% TGI로, 종양 A549 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 21.8% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

간암 모델

마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr

A. 0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 PLC/PRF/5 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~190-220 mm³ (31일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 200 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 6 (40 mg/kg) 및 실시예 11 (50 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (30 mg/kg), 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0.1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 스킴 : 매 3일마다 4회 투여 및 이틀마다 2회 투여에 따라 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 PLC/PRF/5 간암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 28에 도시되고, 도 29는 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 28 및 29에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 6 및 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 49일째에 대조군에 비해 각각 70.6% 및 63.8% TGI로, 종양 PLC/PRF/5 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, -18% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 어떠한 종양 세포 성장에 대한 억제 효과도 얻어지지 않았다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr

A. 0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.2 ml HBSS 완충액에 현탁된 5x10⁶의 HepG2 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~190-220 mm³ (31일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 200 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 6 (30 mg/kg), 실시예 19 (30 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (30 mg/kg), 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0.1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 이틀마다 6회로 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 PLC/PRF/5 간암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 30에 도시되고, 도 31은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 30 및 31에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 6 및 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 33일째에 대조군에 비해 각각 82.6% 및 43% TGI로, 종양 HepG2 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 12.6% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 약간의 종양 세포 성장에 대한 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

췌장암 모델

0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.1 ml의 HBSS:마트리겔 3:1 혼합물에 현탁된 7x10⁶의 PANC1 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~87-110 mm³ (27일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 95 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 11 (50 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg), 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0.1 mM ZnCl₂, 100 mM L-아르기닌, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 이틀마다 6회로 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 11의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 PANC1 췌장암이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 32에 도시되고, 도 33은 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 32 및 33에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 11의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 40일째에 대조군에 비해 43% TGI로, 종양 PANC1 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 12.0% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 약간의 종양 세포 성장에 대한 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

다중약물-내성인 인간 자궁 육종 모델

0일에 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr 마우스에 0.5 x 25 mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.1 ml의 HBSS:마트리겔 10:1 혼합물에 현탁된 7x10⁶의 MES-SA/Dx5 세포를 우측에 피하로(sc) 이식하였다. 종양이 ~167-190 mm³ (19일)의 크기에 도달할 때, 마우스를 임의로 추출하여 ~ 180 mm³의 그룹의 평균 종양 크기를 얻었고, 치료군으로 할당하였다. 치료군에 실시예 6, 실시예 19 (30 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제 및 비교로서 rhTRAIL114-281 (10 mg/kg), 대조군으로서 제형 완충액 (5 mM NaH₂PO₄, 95 mM Na₂HPO₄, 200 mM NaCl, 5 mM 글루타티온, 0.1 mM ZnCl₂, 10% 글리세롤, 80 mM 사카로오스, pH 8.0)을 투여하였다. 이틀마다 6회로 제제를 정맥내로(i.v.) 투여하였다. 치료군의 평균 종양 크기가 ~ 1000 mm³에 도달할 때, 척수의 파괴로 마우스를 희생시켰다. 대조군은 TRAIL114-281을 받았다.

실시예 18, 실시예 6, 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질 및 비교로 rhTRAIL114-281로 치료된 MES-SA/Dx5 자궁 육종이 존재하는 마우스 Crl:SHO-Prkdc^scidHr^hr에서 얻어진 실험 결과는 종양 체적 변화의 다이어그램으로 도 34에 도시되고, 도 35는 대조군의 백분율로서 종양 성장 억제(% TGI)를 도시한다.

도 34 및 35에 그래프로 제시된 실험 결과는, 실시예 6, 실시예 19의 본 발명의 융합 단백질의 투여가, 실험 33일째에 대조군에 비해 각각 99.7% 및 99.7% TGI로, 종양 MES-SA/Dx5 성장 억제를 유발하였음을 도시한다. 비교 참조로서 사용된 rhTRAIL114-281에 대해서는, 29% 수준의 TGI로, 대조군에 비해 약간의 종양 세포 성장에 대한 억제 효과가 얻어졌다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 rhTRAIL114-281 단독에 비해 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.

SEQUENCE LISTING <110> Adamed Sp. z o.o. Pieczykolan, Jerzy Szczepan Pawlak, Sebastian Dominik Zerek , Bartlomiej Maciej Rozga, Piotr Kamil <120> Anticancer fusion protein <130> KP4 <150> PL393578 <151> 2010-01-05 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 173 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein sequence <400> 1 Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly Arg Val Ala Ala 1 5 10 15 His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn 20 25 30 Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser 35 40 45 Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly 50 55 60 Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys 85 90 95 Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile 100 105 110 Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu 115 120 125 Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu 130 135 140 Asn Asp Arg Ile Phe Val 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Pro Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Gly Pro Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ser 20 25 30 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 35 40 45 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 50 55 60 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 65 70 75 80 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 85 90 95 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 100 105 110 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 115 120 125 Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 130 135 140 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 145 150 155 160 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 180 185 190 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 195 200 205 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 210 215 <210> 16 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank/P50591 <309> 1996-10-01 <313> (1)..(281) <400> 16 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank/AAI72307.1 <309> 2009-03-16 <313> (333)..(339) <400> 17 Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg 1 5 <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank/AAF72632.1 <309> 2000-05-30 <313> (74)..(98) <400> 18 Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala 1 5 10 15 Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu 20 25 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank/AAF72632.1 <309> 2000-05-30 <313> (197)..(214) <400> 19 Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu Ala Ser Leu 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ctgtattcta tttatcaggg tggcatcttc 420 gaactgaaag aaaacgatcg tatttttgtt tcggtgacca acgaacacct gattgatatg 480 gatcatgaag catcgttttt cggcgcgttt ctggtcggc 519 <210> 32 <211> 597 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 32 cgcaaacgta aaaaaagccg tggtggtggc ggtggcacca gcgaagaaac cattagcacc 60 gttcaggaaa aacagcagaa tattagtccg ctggttcgtg aacgtggtcc gcagcgtgtt 120 gcagcacata ttaccggcac ccgtggtcgt agcaataccc tgagcagccc gaatagcaaa 180 aatgaaaaag cactgggtcg caaaattaat agctgggaaa gcagccgtag cggtcatagc 240 tttctgagca atctgcatct gcgtaatggt gaactggtga ttcatgaaaa aggcttttat 300 tatatttata gccagaccta ttttcgcttt caggaagaaa ttaaagaaaa taccaaaaat 360 gataaacaaa tggtgcagta tatctataaa tacaccagct atccggatcc gattctgctg 420 atgaaaagcg cacgtaatag ctgttggagc aaagatgcag aatatggtct gtatagcatt 480 tatcagggtg gcatttttga actgaaagaa aatgatcgca tttttgtgag cgtgaccaat 540 gaacatctga ttgatatgga tcatgaagcc agcttttttg gtgcatttct ggtgggt 597 <210> 33 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 33 cgtaaacgta aaaaaagccg tggtggtggt ggcggtcgtg ttgcagcaca tattaccggc 60 acccgtggtc gtagcaatac cctgagcagc ccgaatagca aaaatgaaaa agcactgggt 120 cgcaaaatta atagctggga aagcagccgt agcggtcata gctttctgag caatctgcat 180 ctgcgtaatg gtgaactggt gattcatgaa aaaggctttt attatattta tagccagacc 240 tattttcgct ttcaggaaga aattaaagaa aataccaaaa atgataaaca aatggtgcag 300 tacatttaca aatataccag ctatccggat ccgattctgc tgatgaaaag cgcacgtaat 360 agctgttgga gcaaagatgc agaatatggt ctgtatagca tttatcaggg tggcattttt 420 gaactgaaag aaaatgatcg catttttgtg agcgtgacca atgaacatct gattgatatg 480 gatcatgaag ccagcttttt tggtgcattt ctggttggtg gcggtggtcc gctgggtctg 540 gcaggtcgtg ttgttcgtac catgccgttt ctgttttgca atgttaatga tgtgtgcaat 600 tttgccagcc gcaatgatta tagctattgg ctgtgcaatt attatagcaa tagctatagc 660 ttttggctgg ctagtctgaa tccggaacgt 690 <210> 34 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 34 cgcaaacgta aaaaaagccg tccgctgggt attgccggtg aacgtaaacg caaaaaatct 60 cgtggtggtg gtggcggtcg tgttgcagca catattaccg gcacccgtgg tcgtagcaat 120 accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa aaagccctgg gtcgcaaaat taatagctgg 180 gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg 240 gtgattcatg aaaaaggctt ttattatatt tatagccaga cctattttcg ctttcaggaa 300 gaaattaaag aaaacaccaa aaatgataaa caaatggtgc agtatatcta taaatacacc 360 agctatccgg atccgattct gctgatgaaa agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat 420 gcagaatatg gcctgtatag catttatcag ggtggcattt ttgaactgaa agaaaatgat 480 cgcatttttg tgagcgtgac caatgaacat ctgattgata tggatcatga agccagcttt 540 tttggtgcat ttctggtggg t 561 <210> 35 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 35 cgtaaacgta aaaaaagccg tgttgttcgt ccgctgggta ttgccggtga acgtaaacgc 60 aaaaaatcac gtggtggtcg tgttgcagca catattaccg gcacccgtgg tcgtagcaat 120 accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa aaagcactgg gtcgcaaaat taatagctgg 180 gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg 240 gtgattcatg aaaaaggctt ttattatatt tatagccaga cctattttcg ctttcaggaa 300 gaaattaaag aaaataccaa aaatgataaa caaatggtgc agtacattta caaatatacc 360 agctatccgg atccgattct gctgatgaaa agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat 420 gcagaatatg gtctgtatag catttatcag ggtggcattt ttgaactgaa agaaaatgat 480 cgcatttttg tgagcgtgac caatgaacat ctgattgata tggatcatga agccagcttt 540 tttggtgcat ttctggttgg t 561 <210> 36 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 36 cgtaaacgta aaaaaagccg tgttgttcgt ccgctgggta ttgcaggtga acgtaaacgt 60 aaaaaaagcc gtggtggtgg ttgtgcagca gcatgtgcag catgtaccag cgaagaaacc 120 attagcaccg ttcaggaaaa acagcagaat attagcccgc tggttcgtga acgtggtccg 180 cagcgtgttg cagcacatat taccggtacc cgtggtcgta gcaataccct gagcagcccg 240 aatagcaaaa atgaaaaagc actgggtcgt aaaattaata gctgggaaag cagccgtagc 300 ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg cgtaatggtg aactggttat tcatgaaaaa 360 ggtttttatt atatttatag ccagacctat tttcgttttc aggaagaaat taaagaaaat 420 accaaaaatg ataaacagat ggttcagtat atttataaat ataccagcta tccggatccg 480 attctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc tgttggagca aagatgcaga atatggtctg 540 tatagcattt atcagggtgg tatttttgaa ctgaaagaaa atgatcgtat ttttgttagc 600 gttaccaatg aacatctgat tgatatggat catgaagcaa gcttttttgg tgcatttctg 660 gttggt 666 <210> 37 <211> 505 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 37 tgtaatggtc gttgtccgca gcgtgttgca gcacatatta ccggcacccg tggtcgtagc 60 aataccctga gcagcccgaa tagcaaaaat gaaaaagccc tgggtcgcaa aattaatagc 120 tgggaaagca gccgtagcgg tcatagcttt ctgagcaatc tgcatctgcg taatggtgaa 180 ctggtgattc atgaaaaagg cttttattat atttatagcc agacctattt tcgctttcag 240 gaagaaatta aagaaaacac caaaaatgat aaacaaatgg tgcagtatat ctataaatac 300 accagctatc cggatccgat tctgctgatg aaaagcgcac gtaatagctg ttggagcaaa 360 gatgcagaat atggcctgta tagcatttat cagggtggca tttttgaact gaaagaaaat 420 gatcgcattt ttgtgagcgt gaccaatgaa catctgattg atatggatca tgaaagccag 480 cttttttggt gcatttctgg tgggt 505 <210> 38 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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gagcagcccg aatagcaaaa atgaaaaagc cctgggtcgt 180 aaaattaata gctgggaaag cagccgtagc ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg 240 cgtaatggcg aactggtgat tcatgaaaaa ggcttttatt atatttatag ccagacctat 300 tttcgctttc aggaagaaat taaagaaaat accaaaaatg ataaacaaat ggtgcagtat 360 atctataaat ataccagcta tccggatccg attctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc 420 tgttggagca aagatgccga atatggtctg tatagcattt atcagggtgg catttttgaa 480 ctgaaagaaa atgatcgcat ttttgtgagc gtgaccaatg aacatctgat tgatatggat 540 catgaagcca gcttttttgg tgcatttctg gttggt 576 <210> 40 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 40 tatggtcgtc cgcgtcagag cggtaaaaaa cgtaaacgta aacgcctgaa accgacccgt 60 gttgttcgtc cgctgggtct ggcaggcacc agcgaagaaa ccattagcac cgttcaggaa 120 aaacagcaga atattagtcc gctggttcgt gaacgtggtc cgcagcgtgt tgcagcacat 180 attaccggca cccgtggtcg tagcaatacc ctgagcagcc cgaatagcaa aaatgaaaaa 240 gcactgggtc gcaaaattaa tagctgggaa agcagccgta gcggtcatag ctttctgagc 300 aatctgcatc tgcgtaatgg tgaactggtg attcatgaaa aaggctttta ttatatttat 360 agccagacct attttcgctt tcaggaagaa attaaagaaa ataccaaaaa tgataaacaa 420 atggtgcagt atatctataa atacaccagc tatccggatc cgattctgct gatgaaaagc 480 gcacgtaata gctgttggag caaagatgca gaatatggtc tgtatagcat ttatcagggt 540 ggcatttttg aactgaaaga aaatgatcgc atttttgtga gcgtgaccaa tgaacatctg 600 attgatatgg atcatgaagc cagctttttt ggtgcatttc tggtgggt 648 <210> 41 <211> 678 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 41 tatggtcgtc cgcgtcagag cggtaaaaaa cgtaaacgta aacgtctgaa accgacccgt 60 gttgttcgtc cgctgggtct ggcaggtggt ggttgtgcag cagcatgtgc agcatgtacc 120 agcgaagaaa ccattagcac cgttcaggaa aaacagcaga atattagccc gctggttcgt 180 gaacgtggtc cgcagcgtgt tgcagcacat attaccggta cccgtggtcg tagcaatacc 240 ctgagcagcc cgaatagcaa aaatgaaaaa gcactgggtc gtaaaattaa tagctgggaa 300 agcagccgta gcggtcatag ctttctgagc aatctgcatc tgcgtaatgg tgaactggtt 360 attcatgaaa aaggttttta ttatatttat agccagacct attttcgttt tcaggaagaa 420 attaaagaaa ataccaaaaa tgataaacag atggttcagt atatttataa atataccagc 480 tatccggatc cgattctgct gatgaaaagc gcacgtaata gctgttggag caaagatgca 540 gaatatggtc tgtatagcat ttatcagggt ggtatttttg aactgaaaga aaatgatcgt 600 atttttgtta gcgttaccaa tgaacatctg attgatatgg atcatgaagc aagctttttt 660 ggtgcatttc tggttggt 678 <210> 42 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 42 accatgccgt ttctgttttg caatgttaat gatgtgtgca attttgccag ccgcaatgat 60 tatagctatt ggctgtgcaa ttattatagc aatagctata gcttttggct ggcttctctg 120 aatccggaac gtgttgttcg tccgctgggt ctggcaggcg gtggtggtcg tgttgcagca 180 catattaccg gcacccgtgg tcgtagcaat accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa 240 aaagcactgg gtcgcaaaat taatagctgg gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg 300 agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg gtgattcatg aaaaaggctt ttattatatt 360 tatagccaga cctattttcg ctttcaggaa gaaattaaag aaaataccaa aaatgataaa 420 caaatggtgc agtacattta caaatatacc agctatccgg atccgattct gctgatgaaa 480 agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat gcagaatatg gtctgtatag catttatcag 540 ggtggcattt ttgaactgaa agaaaatgat cgcatttttg tgagcgtgac caatgaacat 600 ctgattgata tggatcatga agccagcttt tttggtgcat ttctggttgg t 651 <210> 43 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 43 tgcaattatt atagcaatag ctatagcttt tggctggcaa gcctgaatcc ggaacgtgtt 60 gttcgtccgc tgggtctggc tgggggtggc ggtcgtgttg cagcacatat taccggcacc 120 cgtggtcgta gcaataccct gagcagcccg aatagcaaaa atgaaaaagc actgggtcgc 180 aaaattaata gctgggaaag cagccgtagc ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg 240 cgtaatggtg aactggtgat tcatgaaaaa ggcttttatt atatttatag ccagacctat 300 tttcgctttc aggaagaaat taaagaaaat accaaaaatg ataaacaaat ggtgcagtac 360 atttacaaat ataccagcta tccggatccg attctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc 420 tgttggagca aagatgcaga atatggtctg tatagcattt atcagggtgg catttttgaa 480 ctgaaagaaa atgatcgcat ttttgtgagc gtgaccaatg aacatctgat tgatatggat 540 catgaagcca gcttttttgg tgcatttctg gttggtggcg gtggtactat gccgtttctg 600 ttttgcaatg ttaatgatgt gtgcaatttt gccagccgca atgattatag ctattggctg 660 <210> 44 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 44 ctgggtctgc gtagcctgcg tgaacgtgtt gttcgtccgc tgggtctggc aggtccgcag 60 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 120 agcaaaaatg aaaaagccct gggtcgtaaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 180 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc 240 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcagg aagaaattaa agaaaatacc 300 aaaaatgata aacaaatggt gcagtatatc tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 360 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgccgaata tggtctgtat 420 agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 480 accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 540 ggt 543 <210> 45 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial construct <400> 45 ctgggtctgc gtagcctgcg tgaacgtgtt gttcgtccgc tgggtctggc aggtccgggt 60 ggtggttgtg cagcagcatg tgcagcatgt accagcgaag aaaccattag caccgttcag 120 gaaaaacagc agaatattag cccgctggtt cgtgaacgtg gtccgcagcg tgttgcagca 180 catattaccg gtacccgtgg tcgtagcaat accctgagca gcccgaatag caaaaatgaa 240 aaagcactgg gtcgtaaaat taatagctgg gaaagcagcc gtagcggtca tagctttctg 300 agcaatctgc atctgcgtaa tggtgaactg gttattcatg aaaaaggttt ttattatatt 360 tatagccaga cctattttcg ttttcaggaa gaaattaaag aaaataccaa aaatgataaa 420 cagatggttc agtatattta taaatatacc agctatccgg atccgattct gctgatgaaa 480 agcgcacgta atagctgttg gagcaaagat gcagaatatg gtctgtatag catttatcag 540 ggtggtattt ttgaactgaa agaaaatgat cgtatttttg ttagcgttac caatgaacat 600 ctgattgata tggatcatga agcaagcttt tttggtgcat ttctggttgg t 651 <210> 46 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 46 Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Ile Ala Gly 1 5 10 15 Glu Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr 20 25 30 Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly 35 40 45 Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn 50 55 60 Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys 65 70 75 80 Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn 85 90 95 Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr 100 105 110 Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu 115 120 125 Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr 130 135 140 Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys 145 150 155 160 Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly 165 170 175 Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn 180 185 190 Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe 195 200 205 Leu Val Gly 210 <210> 47 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 47 Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Ile Ala Gly 1 5 10 15 Glu Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys 20 25 30 Ala Ala Cys Gly Ser Gly Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr 35 40 45 Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His 65 70 75 80 Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His 85 90 95 Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln 100 105 110 Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr 115 120 125 Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser 130 135 140 Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser 145 150 155 160 Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe 165 170 175 Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser 180 185 190 Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 195 200 <210> 48 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 48 Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg Val Val Arg Lys Arg Lys Lys Ser Arg 1 5 10 15 Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ser Gly Gln Arg 20 25 30 Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser 35 40 45 Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser 50 55 60 Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu 65 70 75 80 Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr 85 90 95 Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys 100 105 110 Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro 115 120 125 Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys 130 135 140 Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu 145 150 155 160 Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu 165 170 175 Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 180 185 190 <210> 49 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 49 Tyr Gly Arg Pro Arg Gln Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu 1 5 10 15 Lys Pro Thr Arg Val Val Arg Pro Leu Gly Ile Ala Gly Glu Gly Gly 20 25 30 Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Ser Gly Gln Arg Val Ala 35 40 45 Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu 65 70 75 80 Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn 85 90 95 Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln 100 105 110 Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp 115 120 125 Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro 130 135 140 Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala 145 150 155 160 Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys 165 170 175 Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp 180 185 190 Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 195 200 205 <210> 50 <211> 633 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 50 cgtaaacgta aaaaaagccg tgtggtgcgt ccgctgggca ttgcgggcga acgtaaacgt 60 aaaaaaagcc gtaccagcga agaaaccatt agcaccgtgc aggaaaaaca gcagaacatt 120 agcccgctgg tgcgtgaacg tggcccgcag cgtgtggcgg cgcatattac cggcacccgt 180 ggccgtagca acaccctgag cagcccgaac agcaaaaacg aaaaagcgct gggccgtaaa 240 attaacagct gggaaagcag ccgtagcggc catagctttc tgagcaacct gcatctgcgt 300 aacggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc ttttattata tttatagcca gacctatttt 360 cgttttcagg aagaaattaa agaaaacacc aaaaacgata aacagatggt gcagtatatt 420 tataaatata ccagctatcc ggatccgatt ctgctgatga aaagcgcgcg taacagctgc 480 tggagcaaag atgcggaata tggcctgtat agcatttatc agggcggcat ttttgaactg 540 aaagaaaacg atcgtatttt tgtgagcgtg accaacgaac atctgattga tatggatcat 600 gaagcgagct tttttggcgc gtttctggtg ggc 633 <210> 51 <211> 600 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 51 cgtaaacgta aaaaaagccg tgttgttcgt ccgctgggta ttgccggtga acgtaaacgc 60 aaaaaatcac gtggtggtgg ttgtgcagca gcatgtgcag cctgtggtag cggtcagcgt 120 gttgcagcac atattaccgg cacccgtggt cgtagcaata ccctgagcag cccgaatagc 180 aaaaatgaaa aagcactggg tcgcaaaatt aacagctggg aaagcagccg tagcggtcat 240 agctttctga gcaatctgca tctgcgtaat ggtgaactgg tgattcatga aaaaggcttt 300 tactacatct acagccagac ctatttccgc tttcaagaag agattaaaga aaataccaaa 360 aatgataaac aaatggtgca gtatatttac aaatatacca gctatccgga tccgatcctg 420 ctgatgaaaa gcgcacgtaa tagctgttgg agcaaagatg cagaatatgg cctgtatagc 480 atttatcagg gtggcatctt tgaactgaaa gaaaacgatc gtattttcgt gagcgtgacc 540 aatgaacatc tgatcgatat ggatcatgaa gccagctttt ttggtgcatt tctggtgggt 600 <210> 52 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 52 cgtaaacgta aaaaaagccg tgttgtgcgc aaacgcaaaa aatcacgtgg tggtggttgt 60 gcagcagcat gtgcagcctg tggtagcggt cagcgtgttg cagcacatat taccggcacc 120 cgtggtcgta gcaataccct gagcagcccg aatagcaaaa atgaaaaagc actgggtcgc 180 aaaattaaca gctgggaaag cagccgtagc ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg 240 cgtaatggtg aactggtgat tcatgaaaaa ggcttttact acatctacag ccagacctat 300 ttccgctttc aagaagagat taaagaaaat accaaaaatg ataaacaaat ggtgcagtat 360 atttacaaat ataccagcta tccggatccg atcctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc 420 tgttggagca aagatgcaga atatggcctg tatagcattt atcagggtgg catctttgaa 480 ctgaaagaaa acgatcgtat tttcgtgagc gtgaccaatg aacatctgat cgatatggat 540 catgaagcca gcttttttgg tgcatttctg gtgggt 576 <210> 53 <211> 676 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 53 tatggtcgtc cgcgtcagag cggtaaaaaa cgtaaacgta aacgcctgaa accgacccgt 60 gttgttcgtc cgctgggtat tgccggtgaa ggtggtggtt gtgcagcagc atgtgcagcc 120 tgtggtagcg gtcagcgtgt tgcagcacat attaccggca cccgtggtcg tagcaatacc 180 ctgagcagcc cgaatagcaa aaatgaaaaa gcactgggtc gcaaaatcaa tagctgggaa 240 agcagccgta gcggtcatag ctttctgagc aatctgcatc tgcgtaatgg tgaactggtg 300 attcatgaaa aaggctttta ttacatttat agccagacct atttccgctt tcaagaagaa 360 attaaagaaa ataccaaaaa tgataaacaa atggtgcagt atatttacaa atataccagc 420 tatccggatc cgattctgct gatgaaaagc gcacgtaata gctgttggag caaagatgca 480 gaatatggtc tgtatagcat ttatcagggt ggcatttttg aactgaaaga aaatgatcgc 540 atttttgtga gcgtgaccaa tgaacatctg attgatatgg atcatgaagc cagctttttt 600 ggtgcatttc tggtgggtta ataactcgag ggtacctgga gcacaagact ggcctcatgg 660 gccttccgct cactgc 676 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> flexible linker <400> 54 Cys Gly Ser Gly 1 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Pro Leu Gly Ile Ala Gly Glu 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Pro Leu Gly Leu Ala Gly Glu Pro 1 5

Claims

융합 단백질로서:
- hTRAIL95보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로부터 시작하는 가용성(soluble) hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편, 또는 70% 이상의 서열 상동성(sequence identity)을 갖는 상기 기능적 단편의 동족체(homolog)인 도메인 (a); 및
- 항-혈관형성(anti-angiogenic) 이펙터 펩티드의 서열로 이루어진 도메인 (b)
를 포함하고,
여기서 도메인 (b)의 서열은 도메인 (a)의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착되고, 상기 이펙터 펩티드는 칼레티큘린, 텀스타틴 183-230, 키니노젠 D5, 바소스타틴, 키니노스타틴 및 칸스타틴으로 이루어진 그룹에서 선택되지 않는 것인, 융합 단백질.
청구항 1에 있어서, 도메인 (a)는 hTRAIL95에서 hTRAIL121까지의 범위의 아미노산으로부터 시작하여, 아미노산 281로 종결하는 가용성 hTRAIL (서열 번호 16) 단백질 서열의 단편을 포함하는 것인, 융합 단백질.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 및 hTRAIL121-281로 이루어진 그룹에서 선택된 것인, 융합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 도메인 (b)는:
- VEGF, PDGF 및 EGF에 대한 수용체들로부터 선택된 성장 인자에 대한 수용체의 억제제;
- 텀스타틴의 단편, 및
- 아미노펩티다아제 N (CD13)의 억제제
로 이루어진 그룹에서 선택된 것인, 융합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 성장 인자의 억제제의 그룹으로 이루어진 도메인 (b)는 VEGF, PDGF 및 EGF에서 선택되고, 서열 번호 17, 서열 번호 22 및 서열 번호 23으로 이루어진 것인, 융합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 텀스타틴 또는 그 단편으로 이루어진 도메인 (b)는, 각각 텀스타틴 단편 I 및 텀스타틴 단편 II를 나타내는 서열 번호 18 및 서열 번호 19로 이루어진 것인, 융합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 아미노펩티다아제 N (CD13)의 억제제로 이루어진 도메인 (b)는 서열 번호 20 및 서열 번호 21로 이루어진 것인, 융합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 도메인 (a) 및 도메인 (b) 사이에, 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열, 유로키나제 uPA에 의해 인식되는 서열, 및 그의 조합에서 선택된 프로테아제 절단 부위를 포함하는 도메인 (c)를 함유하는 것인, 융합 단백질.
청구항 8에 있어서, 상기 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열은 서열 번호 24, 서열 번호 55 또는 서열 번호 56이고, 상기 유로키나제 uPA에 의해 인식되는 서열은 서열 번호 25인 것인, 융합 단백질.
청구항 8 또는 청구항 9에 있어서, 도메인 (c)는 메탈로프로테아제 MMP 및 유로키나제 uPA에 의해 인식되는, 서로 나란히 위치된 서열의 조합인 것인, 융합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은, 도메인 (a), 도메인 (b), 도메인 (c) 및/또는 도메인 (d) 사이에 글리신, 글리신-세린 또는 시스테인 가요성 입체 링커 또는 그의 조합을 더 포함하는 융합 단백질.
청구항 11에 있어서, 상기 가요성 입체 링커는 GG, E, GGGCAAACAAC (서열 번호 26), GGCAAACAAC (서열 번호 27), GGGGG (서열 번호 28), GGGG (서열 번호 29), GGG (서열 번호 30) 및 GSG (서열 번호 54)로 이루어진 그룹에서 선택된 것인, 융합 단백질.
청구항 1에 있어서, 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 3; 서열 번호 4; 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 7; 서열 번호 8; 서열 번호 9; 서열 번호 10; 서열 번호 11; 서열 번호 12; 서열 번호 13; 서열 번호 14; 서열 번호 15; 서열 번호 46; 서열 번호 47; 서열 번호 48 및 서열 번호 49로 이루어진 그룹에서 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질.
청구항 1에 있어서, 서열 번호 1; 서열 번호 2; 서열 번호 3; 서열 번호 4; 서열 번호 5; 서열 번호 6; 서열 번호 9; 서열 번호 10; 서열 번호 11; 서열 번호 14; 서열 번호 15; 서열 번호 46; 서열 번호 47; 서열 번호 48 및 서열 번호 49로 이루어진 그룹에서 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질.
청구항 1에 있어서, 서열 번호 7 및 서열 번호 8로 이루어진 그룹에서 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질.
청구항 1에 있어서, 서열 번호 12 및 서열 번호 13으로 이루어진 그룹에서 선택된 서열에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 단백질인 융합 단백질.
청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 18에 있어서, 대장균(E. coli)에서의 유전자 발현에 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 19에 있어서, 서열 번호 31; 서열 번호 32; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 35; 서열 번호 36; 서열 번호 37; 서열 번호 38; 서열 번호 39; 서열 번호 40; 서열 번호 41; 서열 번호 42; 서열 번호 43; 서열 번호 44; 서열 번호 45; 서열 번호 50; 서열 번호 51; 서열 번호 52 및 서열 번호 53으로 이루어진 그룹에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 19에 있어서, 서열 번호 31; 서열 번호 32; 서열 번호 33; 서열 번호 34; 서열 번호 35; 서열 번호 36; 서열 번호 39; 서열 번호 40; 서열 번호 41; 서열 번호 44; 서열 번호 45; 서열 번호 50; 서열 번호 51; 서열 번호 52 및 서열 번호 53으로 이루어진 그룹에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 19에 있어서, 서열 번호 37 및 서열 번호 38로 이루어진 그룹에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 19에 있어서, 서열 번호 42 및 서열 번호 43으로 이루어진 그룹에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열.
청구항 18 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
청구항 24에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
청구항 25에 있어서, 대장균 세포인 숙주 세포.
임의의 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여, 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 활성 성분으로서 포함하는, 약제학적 조성물.
청구항 27에 있어서, 비경구 투여를 위한 형태로 된 약제학적 조성물.
인간을 포함하는 포유동물의 신생물 질환(neoplastic disease) 치료를 위한, 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질의 용도.
청구항 27 또는 청구항 28에 기재된 융합 단백질의 항신생물 유효량(antineoplastic-effective amount)을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는, 인간을 포함하는 포유동물의 암 질환 치료 방법.