RS60280B1 - Citotoksični proteini koji sadrže ciljane vezujuće regione za ćelije i regioni shiga toksina a podjedinice za selektivno ubijanje određenih vrsta ćelija - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na citotoksične proteine koji sadrže vezujuće regione imunoglobulinskog tipa i efektorske regione Shiga toksina izvedeni iz Podjedinica članova familije Shiga toksina, kao što je definisano u zahtevima. Citotoksični proteini ovog pronalaska imaju primenu za selektivno ubijanje određenih vrsta ćelija, i kao terapeutik raznih oboljenja, uključujući kancere, imune poremećaje, i mikrobne infekcije.

STANJE TEHNIKE

Sintetički dizajnirane kompozicije zasnovane na prirodnim toksinima dizajnirane su u pokušajima da se stvore novi terapeutici koji pokazuju ciljanu citotoksičnost nakon primene na pacijenta (Pastan I, et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007)). Toksini ili skraćene verzije koji se javljaju u prirodi su spojeni u imunoglobulinske domene ili receptore ligande rekombinantnim proteinskim inženjeringom (Chaudhary V et al, Nature 339: 394-97 (1989); Strom T et al., Semin Immunol 2: 467-79 (1990); Pastan I et al., Annu Rev Biochem 61: 331-54 (1992); Foss F et al, Curr Top Microbiol Immunol 234: 63-81 (1998)). Cilj takvog molekularnog inženjeringa je da se dizajniraju himerni molekuli sa dvostrukom funkcionalnošću: 1) isporuku toksina na specifične ćelijske vrste ili mesta u organizmu nakon sistemske primene i 2) efektiranje ciljane citotoksičnosti na određene ćelije koristeći snažne mehanizme citotoksičnosti koji su efikasni jesu eukariotske ćelije.

Familija Shiga toksina srodnih proteinskih toksina, naročito toksini izolovani iz S. disenteriae i E. coli, je sastavljena od različitih prirodnih toksina koji su strukturno i funkcionalno povezani (Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Na primer, familija Shiga toksina obuhvata pravi Shiga toksin (Stx) izolovan iz S. dysenteriae serotipa 1, varijante 1 toksina slični Shiga (SLT1 ili Stx1 ili SLT-1 ili Slt-1) izolovani iz serotipa enterohemoragične E. coli, i varijante 2 toksina slični Shiga (SLT2 ili Stx2 ili SLT-2) izolovani iz serotipa enterohemoragične E. coli. SLT1 se razlikuje samo na osnovu jednog ostatka iz Stx, i oba su označena kao Verocitotoksini ili Verotoksini (VTs) (O'Brien A et al., Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). Članovi familije Shiga toksina dele istu ukupnu strukturu i mehanizam delovanja (Engedal, N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). Članovi familije Shiga toksina sadrže ciljne domene koji preferirano vezuju određeni glikofingolipid koji je prisutan na površini nekih ćelija domaćina i enzimatski domen koji može trajno inaktivirati ribozome jednom unutar ćelije (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).

Članovi familije Shiga toksina su angažovani od strane bakterije kao faktori virulencije tokom infekcije domaćina (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). U inficiranom domaćinu, Shiga toksini su citotoksični zbog snažne toksične sposobnosti da inhibiraju sinteze proteina i da pokreću smrt apoptonske ćelije (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Snažni citotoksični efekti Shiga toksina na ćelije domaćina mogu rezultirati hemoragičnim kolitisom i hemolitičkim uremičkim sindromom (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).

Članovi familije Shiga toksina dele istu, multimeričnu, proteinsku strukturu okarakterisanu sa A(B)s postavkom Shiga protein podjedinica (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Svaki Shiga toksin se sastoji od dve proteinske podjedinice, A i B, koji se povezuju u A(B)s ostatku kako bi se obrazovao holotoksin protein kompleks. Shiga toksin A Podjedinica je 32 kilodalton monomer koji sadrži enzimski domen, a Shiga toksin B Podjedinica je 7.7 kilodalton podjedinica koja se vezuje za četiri druge Shiga toksin B Podjedinice kako bi se obrazovao pentamer Shiga toksin B Podjedinica. Pentamer B podjedinica povezuju se sa jednom A podjedinicom kako bi se obrazovao Shiga holotoksin, koji je oko 70 kilodaltona (O'Brien A, Holmes, R, Microbiol Rev 51: 206-20 (1987)).

Članovi familije Shiga toksina dele zajednički postupak za intoksikaciju ćelije domaćina koji se može podeliti u pet glavnih faza: vezivanje ćelijske površine, endocitoza, retrogradno kretanje podćelije u endoplazmatski retikulum, premeštanje iz endoplazmatskog retikuluma u citozol i enzimska inaktivacija ribozoma u citozolu. Prvo, Shiga holotoksini su usmereni na ćelijske površine specifičnih ćelija domaćina pomoću sposobnosti B podjedinice da specifično vezuju glikosfingolipid globotriaosilceramid Gb3, takođe poznat kao CD77, predstavljen na eksoplazmičnom membranskom listu (Ling, H et al, Biochemistry 37: 1777-88 (1998); Thorpe C et al, Infect Immun 67: 5985-93 (1999); Soltyk A et al, J Biol Chem 277: 5351-59 (2002)).

Drugo, Shiga holotoksini iskorišćavaju endocitotsku mašineriju ćelije domaćina da bi ušli u ćeliju domaćina, gde se holotoksini u početku nalaze u endozomima (Sandvig K et al, J Cell Biol 108: 1331-43 (1989); Sandvig K et al, Histochem Cell Biol 117:131-141 (2002)). Treće, Shiga holotoksini iskorišćavaju intracelularnu transportnu mašinu ćelije domaćina da bi došli do endoplazmatskog retikuluma i dobili pristup citozolu (Nichols B et al, / Cell Biol 153: 529-41 (2001); Lauvrak S et al, J Cell Sci 117: 2321-31 (2004); Saint-Pol A et al, Dev. Cell 6: 525-38 (2004)). Četvrto, enzimatski aktivni fragmenti Shiga holotoksina retrotranslociraju iz lumena endoplazmatskog retikuluma u citozol (Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Falguieres T, Johannes L, Biol Cell 98: 125-34 (2006); Tarn P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10 (2007)). Peto, citozolna frakcija enzima Shiga toksina enzimski aktivnih fragmenata izaziva citotoksičnost inaktiviranjem ribozoma ćelije domaćina (Tarn, Microbiology 153: 2700-10 (2007)).

Tokom procesa intoksikacije Shiga toksinom, Podjedinica A Shiga toksina proteolitički se cepa između sačuvanog ostatka arginina i ostatka metionina (npr. Arg251-Met252 u StxA) sa furinom, ćelija domaćina endoproteaze (Garred 0 et al,JBiol Chem 270: 10817-21 (1995)). Fragment amino-terminala odcepljenog furina, Podjedinica A Shiga toksina se naziva Shiga toksin "A1 fragment" (ili Stxn-A1, SLTn-A1, SLT-nA1). Shiga toksin A1 fragment je 28 kilodalton protein koji sadrži katalitički domen Shiga toksina (Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994)). Mehanizam citotoksičnosti Shiga toksina na ćelije domaćina je pretežno kroz A1 fragmente snažne katalitičke inaktivacije eukariotskih ribozoma i inhibicija sinteze proteina široke ćelije (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).

Fragment Shiga toksina A1 inhibira transformaciju proteina svojim moćnim aktivnostima depurinacije prema univerzalno sačuvanoj nukleobazi adenina na položaju 4,324 u alfa-sarcinricin petlji od 28S ribozomske RNK eukariotskog ribozoma (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Nakon što se početni broj ribozoma inaktivira, predviđa se da ćelija domaćina doživljava dovoljno smanjenje sinteze proteina tako da indukuje smrt ćelije putem apoptoze (Iordanov M et al, Mol Cell Biol 17: 3373-81 (1997); Smith W et al, Infect Immun 71: 1497-504 (2003); Lee S et al, Cell Microbiol 10: 770-80 (2008); Tesh V, Future Microbiol 5: 431-53 (2010)).

A-B toksin koji inaktivira ribozom može trajno da osakati jedan ribozom sa drugim unutar iste ćelije pri brzini od približno 1,500 ribozoma po minuti (Endo Y, Tsurugi K, Eur J Biochem 171: 45-50 (1988); Endo Y et al, J Biol Chem 263: 8735-9 (1988)). Zaštita A-B toksina je prijavljena da je jako visoka, tako da najmanje jedan molekul toksina može ubiti ćeliju (Yamaizumi M et al, Cell 15: 245-50 (1978); Antignani A, Fitzgerald D, Toxins 5: 1486-502 (2013)). Veruje se da pojedinačni molekul A-B toksina može nepovratno da inaktivira 300 ribozoma u 35 minuta i da je dovoljno da ubije ćeliju kancera (Weldon J, Pastan I, FEBS Journal 278: 4683-700 (2011)). Ovaj nivo citotoksičnog potencijala se dalje predviđa za podjedinicu A Shiga toksina, za koju se sugeriše da bi jedan molekul premešten u citozol bio dovoljan da ubije ćeliju (Tarn, Microbiology 153: 2700-10 (2007)).

Holotoksini familije Shiga toksina su predviđeni da budu suviše toksični za nenamernu upotrebu kao terapija (Jain, R, Tumor physiology and antibody delivery, Front Radiat Ther Oncol 24: 32-46 (1990)). Međutim, članovi familije Shiga toksina imaju potencijal da budu sintetički projektovani za terapijsku primenu od strane racionalnih izmena na strukturi, karakteristika, i bioloških aktivnosti toksina (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010); Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). Shiga holotoksini imaju bipartitnu strukturu sastavljenu od dva nekovalentno vezana modularna dela: A-deo koji sadrži enzimski aktivni fragment A1 i B-deo koji sadrži mesta vezivanja za ciljanu ćelijsku površinu Gb3. Pošto su podjedinice Shiga toksina modularne, pretpostavlja se da se terapeutske kompozicije mogu stvoriti na osnovu zasebnih struktura i funkcija grupa A i B (U.S. prijava 20090156417 A1; Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010); Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011); E.P. prijava 2402367 A1; U.S. prijava 20130196928 A1).

A-grupa članova familije Shiga toksina je stabilna, enzimatski aktivna i citotoksična, nezavisno od bilo koje B-grupe (Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). Podjedinica A Shiga toksina 1 je katalitički aktivna, sposobna da enzimski inaktivira ribozome in vitro i citotoksična čak i ako je okrnjena ili spojena sa drugim proteinskim domenima (Haddad J et al, / Bacteriol 175: 4970-8 (1993); Al-Jaufy A et al, Infect Immun 62: 956-60 (1994); Al-Jaufy A et al, Infect Immun 63: 3073-8 (1995); LaPointe, / Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Di R et al, Toxicon 57: 535-39 (2011)). Skraćene Podjedinice A koje su slične Shiga toksinu 1 su katalitički aktivne, sposobne da enzimatski inaktiviraju ribozome in vitro i citotoksične kada se eksprimira unutar ćelije (LaPointe, J Biol Chem 280:23310-18 (2005)).

Ideja povezivanja toksina sa ciljanim domenom da bi se stvorio himerni molekul koji selektivno ubija ćelije kancera nije nova (Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev Cancer 8: 473-80 (2008)). Na primer, od 1970-ih imunotoksini su razvijeni korišćenjem tri, primarna kandidata za toksine: bakterijski toksin za difteriju, bakterijski pseudomonas egzotoksin i biljni toksin koji je na primer bio ricin (Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)). Od 2013, međutim, ova tri toksina ostala su "među najboljim izborima za razvoj imunotoksina" (Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)). Do danas niko nije opisao citotoksični protein koji sadrži amino kiselinsku sekvencu izvedenu iz Shiga toksina u kombinaciji sa ciljanjem ćelije, imunoglobulinskim vezujućim regionom koji je bio u stanju da specifično i selektivno ubije ciljani ćelijski tip u okruženju ćelijske kulture kod kičmenjaka ili čak laboratoriji. Bilo bi poželjno da sadrže citotoksične proteine koji sadrže regione Shiga toksina sposobni da ciljano ubijaju ćelije za razvoj efikasnih terapijskih molekula i da se koriste kao terapeutski molekuli za lečenje raznih oboljenja. Vallera et al. (2010) opisuje bioinženjerstvo jedinstvenog de-imunizirajućeg bispecifičnog ciljanog toksina koji simultano prepoznaje humane CD 22 i CD 19 receptore kod mišjeg modela metastaze B-ćele. Cizeau et al. (2012) opisuje inženjersku i biološku karakterizaciju deBouganin poveznog za anti-EpCAM Fab fragment, i njegovu primenu u onkologiji.

KRATAK OPIS PRONALASKA

Predmetni pronalazak obezbeđuje razne citotoksične proteine za selektivno ubijanje određenih tipova ćelije, proteini obuhvataju 1) vezujuće regione imunoglobulinskog tipa, kao što je definisano u zahtevima, kao što su iz imunoglobulina, i 2) efektorske regione Shiga toksina, kao što su skraćenice SLT-1A, kao što je definisano u zahtevima. Povezivanje vezujućih regiona sa izvedenim polipeptidima iz Podjedinice A Shiga toksina, omogućava inženjering citotoksičnih molekula zasnovanih na Shiga toksinu koji mogu biti ciljani na specifične ćelijske tipove.

Citotoksični proteini pronalaska se koriste za ciljano ubijanje ćelija i kao terapeutici za lečenje raznih oboljenja, poremećaja i stanja, uključujući karcinom, imuni poremećaj i mikrobne infekcije.

Citotoksični protein pronalaska obuhvata (a) vezujući region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida i koji je sposoban da specifično veže bar jedan ekstraćelijski ciljani biomolekul, kao što je diefinisano u zahtevima, i (b) efektorski region Shiga toksina koji sadrži polipeptid izveden iz amino kiselinske sekvence Podjedinice A najmanje jednog člana familije Shiga toksina, kao što je definisano u zahtevima.

Za određene primere izvođenja citotoksičnih proteina predmetnog pronalaska, vezujući region imunoglobulinskog tipa obuhvata polipeptid odabran između grupe koja se sastoji od: fragmenta antitela pojedinačnog domena, varijabilnog regiona pojedinačnog lanca, varijabilnog fragmenta antitela, antigenskog vezujućeg fragmenta, i Fd fragmenta.

Kao što je definisano u zahtevima, nakon primene citotoksičnog proteina pronalaska na ćeliju fizički spojenu sa ekstaćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa citotoksičnog proteina, citotoksični protein je sposoban da izazove smrt ćelije.

U određenim primerima izvođenja, nakon primene citotoksičnog proteina dve različite populacije ćelijskih tipova u odnosu na prisustvo ekstraćelijskog ciljanog biomolekula, citotoksični protein sposoban da prouzrokuje ćelijsku smrt ćelijskih tipova koji su fizički povezani sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom njegovog regiona imunoglobulinskog tipa na CD50najmanje tri puta ili manje od CD50na ćelijske tipove koji nisu fizički spojeni sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom njegovog vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa.

U određenim primerima izvođenja, vezujući region imunoglobulinskog tipa je dizajniran ili odabran na osnovu svoje sposobnosti da vezuje ekstraćelijski ciljani biomolekul odabran iz grupe koju čine: CD20, CD22, CD40, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, prostatski specifični membranski antigen, Cripto, endoglin, fibroblast aktivacioni protein, Lewis-Y, CD 19, CD21, CS1/ SLAMF7, CD33, CD52, , gpA33, Mucins, TAG-72, karbonska anhidraza IX, folatni vezujući protein, gangliosid GD2, gangliosid GD3, gangliosid GM2, gangliosid Lewis-Y2, VEGFR, Alfa Vbeta3, Alfa5betal, ErbBl/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, Tenascin, CD64, i mezotelin, BRCA1, MART-1 /MelanA, gplOO, tirozinaza, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, beta-catenin, MUM-1, caspaza-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, karcinoembrionski antigen, prostatni specifični antigen, antigen matične ćelije prostate, humani aspartil (asparaginil) beta-hidrokslaza, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, antigen povezan sa tirozinazom, HPV-E7, Epstein-Barr Virus antigeni, Bcr-Abl, alfa-fetoprotein antigen, 17-A1, antigen tumora bešike, CD38, CD 15, CD23, CD52, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305; C3AR, FceRIa, galektin-9, mrp-14, siglek-8, siglek-10, CD49d, CD13, Cd44, Cd54, CD63, CD69, CD123, CD193, TLR4, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD15, CD33, CD64, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, Galektin-3, CDlla-c, GITRL, MHC Klasa II, CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CDllc, CD123, i bilo koji drugi imunogenski fragment bilo kog prethodno navedenog.

Za određene primere izvođenja, citotoksični proteini obuhvataju efektorski region Shiga toksina koji sadrži ili koji se sastoji od amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3. Dalji primeri izvođenja su citotoksični proteini gde efektorski region Shiga toksina obuhvata ili se sastoji od amino kiselina 1 do 241 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; amino kiselina 1 do 251 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; i/ili amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3.

U određenim primerima izvođenja, citotoksični proteini obuhvataju vezujući region imunoglobulinskog tipa koji sadrži ili koji se sastoji od amino kiselina 269-508 SEQ ID NO:4. Dalji primeri izvođenja su citotoksični proteini koji sadrže ili koji se sastoje od SEQ ID NO:4.

U određenim primerima izvođenja, citotoksični proteini obuhvataju vezujući region imunoglobulinskog tipa koji sadrži ili koji se sastoji od amino kiselina 1-119 SEQ ID NO:5. Dalji primeri izvođenja su citotoksični proteini koji sadrže ili koji se sastoje od SEQ ID NO: 5.

U određenim primerima izvođenja, citotoksični proteini obuhvataju efektorske regione Shiga toksina koji obuhvataju mutaciju u odnosu na A Podjedinice članova familije Shiga toksina koji se nalaze u prirodi koji menjaju enzimsku aktivnost efektorskog regiona Shiga toksina dok zadržavaju citotoksičnu aktivnost, mutacije odabrane između bar jednog amino kiselinskog ostatka brisanja ili supstitucije, kao što je definisano u zahtevima.

Pronalazak takođe obuhvata farmaceutske kompozicije koje sadrže citotoksični protein pronalaska i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač, kako je definisano u zahtevima; i upotrebu takvog citotoksičnog proteina u postupcima pronalaska kao što je ovde detaljnije opisano, i kao što je definisano u zahtevima.

Pored citotoksičnih proteina pronalaska, polinukleotidi koji su sposobni da kodiraju citotoksični protein pronalaska su u okviru predmetnog pronalaska, kao i ekspresijski vektori koji sadrže polinukleotid pronalaska i transformisane ćelije domaćina koje sadrže ekspresioni vektor pronalaska, kako je definisan u zahtevima.

Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje in vitro postupke ubijanja ćelije(a) koje sadrže korak kontakta ćelije(a) sa citotoksičnim proteinom pronalaska, kako je definisano u zahtevima.

Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje lečenje oboljenja, poremećaja i stanja kod pacijenta kome je potrebno korišćenje terapeutski efikasne količine citotoksičnog proteina ili farmaceutske kompozicije pronalaska, kako je definisano u zahtevima. U nekim primerima izvođenja, oboljenje, poremećaj ili stanje je izabrano između bilo kog od sledećih: karcinoma, tumora, imunog poremećaja ili mikrobne infekcije. U određenim primerima izvođenja, karcinom koji se leči je izabran iz grupe koja se sastoji od: karcinoma kostiju, karcinoma dojke, karcinoma centralnog / perifernog nervnog sistema, karcinoma gastrointestinalnog sistema, karcinoma germskih ćelija, žlezdanog karcinoma, karcinoma glave i vrata, hematološkog karcinoma, kancera bubrega mokraćnih kanala, karcinoma jetre, karcinoma pluća / pleure, karcinoma prostate, sarkom, karcinoma kože i karcinoma materice. U nekim primerima izvođenja, imuni poremećaj koji treba lečiti je imuni poremećaj povezan sa bolešću odabranom iz grupe koja se sastoji od: amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, Crohnova bolest, dijabetes, odbacivanje transplantata, transplantacija u odnosu na bolest domaćina, Hashimotov tiroiditis, hemolitički uremički sindrom, bolest povezana sa HIV-om, eritematoza lupusa, multipla skleroza, poliarteritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vaskulitis.

Među određenim primerima izvođenja predmetni pronalazak jeste citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeni protein za primenu u lečenju ili prevenciji kancera, imunog poremećaja, ili mikrobne infekcije, kao što je definisano u zahtevima.

Ove i druge karakteristike, aspetci i prednosti predmetnog pronalaska će se bolje razumeti u pogledu na sledeći opis, priložene zahteve, i prateće slike. Prethodno navedeni elementi pronalaska mogu se slobodno kombinovati ili ukloniti u cilju da drugi primeri izvođenja pronalaska budu u okviru zahteva, bez ikakvih izjava da se suprotstave takvoj kombinaciji ili uklone u daljem tekstu.

KRATAK OPIS CRTEŽA I SLIKA

Slika 1 prikazuje opštu građu primernih citotoksičnih proteina.

Slika 2 grafički prikazuje "αCD38-scFv spojen sa SLT-1A" da je posebno citotoksičan za CD38+ ćelije kada se porede sa CD38- ćelijama. Procentualna vijabilnost ćelija je prikazana preko logaritma na osnovu 10 koncentracije citotoksičnog proteina.

Slika 3 grafički prikazuje "αHER2-VHH spojen sa SLT-1A" da je posebno citotoksičan za HER2+ ćelije kada se poredi sa HER2- ćelijama. Procentualna vijabilnost ćelija je prikazana preko logaritma na osnovu 10 koncentracije citotoksičnog proteina.

Slika 4 grafički prikazuje promenu u ukupnoj telesnoj luminescenciji sa primenom αCD20scFv spojenog sa SLT-1A verzijama 1 i 2 u distribuiranom Raji-luc ksenograftnom modelu.

Slika 5 grafički prikazuje povećano preživljavanje miševa Raji-luc ksenografta uz primenu αCD20scFv spojenog sa SLT-1 A verzijama 1 i 2.

Slika 6 grafički prikazuje promenu u zapremini tumora uz primenu αCD20scFv spojenog sa SLT-1 A verzijama 1 i 2 u Raji potkožnom ksenograftnom modelu.

Slika 7 prikazuje trošenje B-ćelije u ne-humanoj primatnoj studiji uz primenu αCD20scFv::SLT-1A verzija 1. Naročito, podset CD20+ B-ćelija koje iskazuju CD21 su analizirane.

Slika 8 prikazuje trošenje B-ćelije u ne-humanoj primatnoj studiji uz primenu αCD20scFv::SLT-1A verzija 1. Naročito, podset CD20+ B-ćelija koje iskazuju CD21 su analizirane.

DETALJAN OPIS

Predmetni pronalazak je detaljnije opisan u daljem tekstu koristeći ilustrativne, neograničavajuće primere izvođenja, i reference na pratećim slikama. Ovaj pronalazak može, međutim, biti realizovan u mnogo različitih oblika unutar obima pronalaska i ne treba ga tumačiti kao ograničen na primere izvođenja koji su navedene u daljem tekstu. Umesto toga, ovi primeri izvođenja su dati tako da je ovaj pronalazak temeljan i prenosi obim pronalaska onim stručnjacima koji su iz ove oblasti.

Da bi se ovaj pronalazak mogao lakše razumeti, određeni pojmovi su definisani u daljem tekstu. Dodatne definicije mogu se naći u detaljnom opisu pronalaska.

Kao što je korišćeno u opisu i priloženim patentnim zahtevima, izrazi "a", "a" i "the" uključuju i jednine i množinu, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.

Kako što je korišćeno u opisu i priloženim patentnim zahtevima, izraz "i / ili" kada se odnosi na dve vrste, A i B, označava najmanje jednu od A i B. Kao što je korišćeno u opisu i priloženim zahtevima, termin "i / ili "kada se odnosi na više od dve vrste, kao što su A, B i C, znači najmanje jednu od A, B ili C, ili bar jednu od bilo koje kombinacije A, B ili C (sa svakom vrstom u jednini ili u višestrukim mogućnostima).

Kroz ovaj opis, izraz "obuhvata" ili varijacije poput "sadrži" ili "sadržati" podrazumeva uključivanje navedenog celog broja (ili komponenti) ili grupe celih brojeva (ili komponenti), ali ne i isključenje bilo kog drugi celi brojevi (ili komponente) ili grupa celih brojeva (ili komponenti).

Kroz ovaj opis, izraz "uključujući" se koristi da znači "uključuje, ali nije ograničen na".

"Uključujući" i "uključujući, ali ne ograničavajući se na njih" koriste se naizmenično.

Izraz "amino kiselinski ostatak" ili "amino kiselina" uključuje referencu na amino kiselinu koja je ugrađena u protein, polipeptid ili peptid. Izraz "polipeptid" uključuje bilo koji polimer amino kiselina ili amino kiselinskih ostataka. Izraz "polipeptidna sekvenca" odnosi se na niz amino kiselina ili amino kiselinskih ostataka koji fizički sadrže polipeptid. "Protein" je makromolekul koja sadrži jedan ili više polipeptidnih lanaca. "Peptid" je mali polipeptid veličine manje od ukupno 15-20 amino kiselinskih ostataka.

Izrazi "amino kiselina", "amino kiselinski ostatak" ili polipeptidna sekvenca uključuju amino kiseline koje se javljaju u prirodi i, ako drugačije nije ograničeno, uključuju i poznate analoge prirodnih amino kiselina koji mogu funkcionisati na sličan način kao i prirodne amino kiseline. Ovde su opisane amino kiseline opisane skraćenicama, kao što sledi u Tabeli A:

TABELA A. Nomenklatura Amino Kiselina

1

Izraz "konzervativna supstitucija" u odnosu na polipeptid, odnosi se na promenu amino kiselinskog sastava polipeptida koja ne menja suštinski funkciju i strukturu celokupnog polipeptida (videti Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York (2. izdanje, 1992)).

Kao što je korišćeno ovde, izrazi "eksprimirana", "eksprimirajuća" ili "izražava" odnosi se na prevođenje polinukleotida ili nukleinske kiseline u polipeptid ili protein. Izraženi polipeptid ili proteini mogu ostati unutar ćelijske, postati sastavni deo ćelijske površinske membrane ili se izlučiti u vanćelijski prostor.

Kao što je korišćeno ovde, simbol "a" je skraćenica za vezujući region imunoglobulinskog tipa koji se može vezati za biomolekul koji sledi. Simbol "a" koristi se za označavanje funkcionalne karakteristike vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa zasnovanog na njegovoj sposobnosti vezivanja za biomolekul koja sledi nakon simbola.

Izraz "selektivna citotoksičnost" u pogledu citotoksične aktivnosti citotoksičnog proteina odnosi se na relativne nivoe citotoksičnosti između ciljane ćelijske populacije i neciljane populacije ćelija koji su prisutni, a koji se mogu izraziti kao odnos polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za ciljanu vrstu ćelije preko CD50za neciljanu vrstu ćelije kako bi se pokazala preferencijalnost ubijanja ćelija ciljanog ćelijskog tipa.

Za potrebe predmetnog pronalaska, izraz "efektor" znači obezbeđivanje biološke aktivnosti, kao što je citotoksičnost, biološka signalizacija, enzimska kataliza, subcelularno usmeravanje i / ili intermolekularno vezivanje što rezultira regrutovanjem faktora i / ili alosteričnim efektima.

Za potrebe predmetnog pronalaska, fraza "izvedena iz" znači da polipeptidna regija sadrži sekvence amino kiselina koje se prvobitno nalaze u proteinu i sada mogu da sadrže adicije, delecije, skraćenja ili druge izmene koje čine originalni niz tako da je ukupna funkcija i struktura suštinski očuvana.

I. Opšta Struktura Citotoksičnog Proteina

Predmetni pronalazak pruža različite citotoksične proteine za selektivno uništavanje specifičnih ćelijskih tipova, pri čemu svaki protein sadrži 1) vezujući region imunoglobulinskog tipa za ćelijsko ciljanje, kao što je definisano u zahtevima; i 2) efektorski region Shiga toksina, kao što je definisano u zahtevima. Povezivanje vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa za ćelijsko ciljanje sa izvedenim regionima Podjedinice A Shiga toksina omogućava tehničko specifično ciljanje ćelijskog tipa Shiga toksina snažne citotoksičnosti. Citotoksični proteini pronalaska kako su definisani u zahtevima sadrže efektorske regione Shiga toksina izvedene iz A Podjedinice članova familije Shiga toksina povezanih sa vezujućim regionima imunoglobulinskog tipa koji se mogu posebno vezati za najmanje jedan ekstraćelijski ciljani biomolekul u fizičkoj povezanosti sa ćelijom, kao što je ciljani biomolekul izražen na površini ćelije. Ova opšta struktura je modularna u tome što bilo koji broj različitih vezujućih regiona imunoglobulinskog tipa može biti povezano sa efektorskim regionima izvedeni iz Podjedinice A Shiga toksina, da bi se stvorile varijacije iste opšte strukture.

A. Vezujući Regioni Imunoglobulinskog Tipa

Citotoksični proteini pronalaska obuhvataju vezujući region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida sposobni da selektivno i određeno vežu ekstraćelijski ciljani biomolekul, kao što je definisano u zahtevima. Izraz "vezujući region imunoglobulinskog tipa" kao što je ovde definisano se odnosi na polipeptidni region koji je sposoban da veže jedan ili više ciljanih biomolekula, kao što je antigen ili epitope. Vezujući regioni imunoglobulinskog tipa su funkcijski definisani sa njihovom sposobnosti da se vežu za ciljane molekule. Vezujući regioni imunoglobulinskog tipa su obično izvedeni iz antitela ili struktura koje su slične antitelu; međutim, alternativne skele iz drugih izvora razmatraju se u okviru termina.

Proteini imunoglobulina (Ig) imaju strukturni domen poznat kao Ig domain. Ig domeni se kreću u dužini od oko 70-110 amino kiselinskih ostataka i poseduju karakterističan Ig-pregib, u kome se obično 7 do 9 antiparalelnih beta lanaca raspoređuje u dva beta lista koja obrazuju sendvič strukturu. Ig nabor je stabilizovan hidrofobnim interakcijama amino kiselina na unutrašnjim površinama sendviča i visoko očuvanim disulfidnim vezama između cisteinskih ostataka u lancima. Ig domeni mogu biti promenljivi (IgV ili V-set), konstantni (IgC ili C-set) ili intermedijarni (Igl ili I-set). Neki Ig domeni mogu biti povezani sa regijonom koji određuje komplementarnost (CDR), takođe se odnosi na kao antigenski vezujući region (ABR), što je važno za specifičnost antitela koji se vezuje za njihove epitope. Domeni slični Ig se takođe nalaze u neimunoglobulinskim proteinima i na osnovu toga su klasifikovani kao članovi Ig superfamije proteina. HUGO Komitet Genske Nomenklature (HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC)) obezbeđuje listu članova familije domena slični Ig.

Vezujući region imunoglobulinskog tipa može biti polipeptidna sekvenca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta gde je sekvenca amino kiselina varirana od prirodnog antitela ili domena sličnog Ig ne-imunoglobulinskog proteina, na primer molekularnim inženjeringom ili bibliotetskim skriningom. Zbog važnosti tehnika rekombinantne DNK i in vitro bibliotetskog skrininga u generisanju regiona koji vezuju imunoglobulin, antitela se mogu redizajnirati tako da dobiju željene karakteristike, kao što su manja veličina, ulazak u ćeliju ili druga terapijska poboljšanja. Moguće varijacije su mnoge i mogu se kretati od promene samo jedne amino kiseline do potpunog redizajna, na primer, promenljive regije. Tipično, promene u promenljivom regionu će se izvršiti u cilju poboljšanja karakteristika vezivanja antigena, poboljšanja stabilnosti promenljive regije ili smanjenja potencijala za imunogene odgovore.

Postoji veliki broj vezujućih regiona imunoglobulinskog tipa za koje se smatra da su komponente predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vezujući region imunoglobulinskog tipa potiče iz regiona za vezanje imunoglobulina koji može da vezuje ekstraćelijski ciljani biomolekul, kako je definisano u zahtevima. U nekim drugim primerima izvođenja pronalaska, vezujući region imunoglobulinskog tipa sadrži inženjerski polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput vezujućeg regiona imunoglobulina obezbeđivanjem visokog afiniteta vezivanja za ekstraćelijski ciljani biomolekul. Ovaj inženjerski polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skele koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.

Postoji veliki broj vezujućih regiona izvedenih iz imunoglobulina i ne-imunoglobulinskih inženjerskih polipeptida u stanju tehnike koji su koristni za ciljanje polipeptida za određene ćelijske tipove preko njihovih visokih vezujućih sposobnosti. Vezujući region imunoglobulinskog tipa predmetnih citotoksičnih proteina je odabran iz grupe koja obuhvata: fragmente antitela pojedinačnog domena, varijabilne fragmente pojedinačnog lanca (scFv) fragmente, varijable antitela (Fv), antigenske vezujuće (Fab) fragmente, i Fd fragmente (videti, Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al, Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012), za pregled).

U skladu sa nekim drugim primerima izvođenja otkrića, vezujući region imunoglobulinskog tipa obuhvata izvedeni, alternativni skelet imunoglobulinskih domena koji pokazuju slične funkcionalne karakteristike, kao što je visoka sposobnost i određeno vezivanje ciljanih biomolekula, i omogućava izvođenje poboljšanih karakteristika, kao što je veća stabilnost ili

1

smanjena imunogeničnost. Za određene primere izvođenja citotoksičnih proteina koji su ovde otkriveni, vezujući region imunoglobulinskog tipa je odabran iz grupe koja obuhvata projektovani, izveden fibronektinom, 10<h>fibronektinski tip III (10Fn3) domen (monotela, AdNectins™, ili AdNexins™); projektovani, izveden tenaksin, tenaksin tip III domen (Centryns™); projektovani, ankirin ponovljeni motif koji sadrži polipeptid (DARPins™); projektovani, izvedeni receptor niske gustine lipoproteina, A domen (LDLR-A) (Avimers™); lipocalin (anticalini); projektovani, izvedeni proteaza inhibitor, Kunitz domen; projektovani, izvedeni Protein-A, Z domen (Affibodies™); projektovani, gama-B cristalin-izvedeni skeletni ili projektovani, ubihitin-izvedeni skelet (Affilins); Sac7d-izvedeni polipeptidi (Nanoffitins® ili afitini); projektovani, Fyn-izvedeni, SH2 domen (Fynomers®); i projektovano antitelo miša i bilo koji genetski manipulisani odgovarajući predmeti prethodno navedenog koji zadržava njegovu vezujuću funkcionalnost (Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al, Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al, Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al, Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007)).

Bilo koja od gore navedenih vezujućih regiona imunoglobulina može se koristiti kao komponenta predmetnog pronalaska sve dok komponenta vezujućeg regiona ima konstantu disocijacije od 10<-5>do 10<-12>mola/liter, poželjno manje od 200 nM, prema ekstraćelijskom ciljanom biomolekuli kako je ovde opisano.

Ovaj sistem je modularan, tako da se različiti, raznovrsni vezujući regioni imunoglobulinskog tipa mogu koristiti sa istim efektivnim regionom Shiga toksina kako bi se obezbedilo raznoliko ciljanje različitih ekstraćelijskih ciljanih biomolekula i tako cilja citotoksičnost ili citostaze na različite vrste ćelija.

B. Efektorski Regioni Shiga Toksina Izvedenih iz A Podjedinica Članova Familije Shiga Toksina

Za svrhu predmetnog pronalaska, fraza "efektorski region Shiga toksin" se odnosi na polipeptidni region izveden iz A Podjedinice familije Shiga toksina koji je sposoban da inaktivira ribozome i ostvaruje citotoksične i/ili citostatične efekte. Član familije Shiga toksin se odnosi na bilo koji član familije proteinskih toksina koji se javljaju u prirodi koji su strukturno i funkcionalno povezani, posebno toksini izolovani iz S. dysenteriae i E. coli (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Na primer, familija Shiga toksina obuhvata istinski Shiga toksin (Stx) izolovan iz S. dysenteriae serotipa 1, Shiga-slični toksin 1 varijante (SLT1 ili Stxl ili SLT-1 ili Slt-1) izolovan iz serotipa enterohemoragične E. coli, i Shiga-slični toksin 2 varijante (SLT2 ili Stx2 ili SLT-2) izolovan iz serotipa enterohemoragične E. coli. SLT1 se razlikuje samo po jednom ostatku od Stx, a oba se odnose na kao Verocitotoksini ili Verotoksini (VTs) (O'Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). Iako SLT1 i SLT2 varijante su samo oko 53-60% slične jedna drugoj na sekvencionalnom nivou amino kiselina, one dele mehanizme enzimske aktivnosti i citotoksičnosti koji su uobičajeni članovima familije Shiga toksina (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Preko 39 različitih Shiga toksina je opisano, kao što su definisani podtipovi Stx1a, Stx1c, Stx1d, i Stx2a-g (Scheutz F et al, / Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)). Članovi familije Shiga toksina nisu prirodno ograničeni na bilo koje bakterijske vrste zbog toga što Shiga-toksin-kodirajući geni se mogu raširiti između bakterijskih vrsta preko horizontalnog genskog transfera (Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol.21: R242-6 (2011)). Kao primer prenosa među vrstama, Shiga toksin je otkriven u soju A. haemolyticus izolovanom iz pacijenta (Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006)). Jednom kada Shiga toksin koji kodira polinukleotid ulazi u novu podvrstu ili vrstu, pretpostavlja se da je sekvenca amino kiselina Shiga toksina sposobna da razvije male varijacije u sekvenci zbog genetskog odliva i/ili selektivnog pritiska, a da pritom održava mehanizam citotoksičnosti uobičajenih za članove familije Shiga toksina (videti Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)).

Efektorski regioni Shiga toksina pronalaska mogu sadržati ili se sastoje u osnovi od polipeptida koji je izveden iz A Podjedinice Shiga toksina odvojene od bilo kog oblika njegove prirodne B Podjedinice Shiga toksina. Pored toga, citotoksični proteini predmetnog pronalaska ne mogu da sadrže bilo koji polipeptid koji sadrži ili se sastoji u osnovi od funkcionalnog vezujućeg domena prirodne B podjedinice Shiga toksina. Umesto toga, regioni izvedeni iz A Podjedinice Shiga toksina su funkcionalno povezani sa heterolognim vezujućim regionima imunoglobulinskog tipa da bi izvršili ciljanje ćelija.

U određenim primerima izvođenja, efektorski region Shiga toksin pronalaska kao što je definisano u zahtevima može obuhvatati ili sadržati Podjedinicu A Shiga toksina pune dužine SLT-1A (SEQ ID NO: 1), StxA SEQ ID NO: 2, ili SLT-2A (SEQ ID NO: 3), primećujući da Podjedinice A Shiga toksina koje se javljaj u prirodi mogu sadržati prekursorske forme koje sadrže signalne sekvence od oko 22 amino kiseline na njihovim amino-terminalima koji su uklonjeni da bi se stvorila zrela Podjedinica A Shiga toksina. U drugim primerima izvođenja, efektorski region Shiga toksina pronalaska kao što je definisano u zahtevima, obuhvata ili sadrži u osnovi skraćenu Podjedinicu A Shiga toksina koja je kraća od celokupne Podjedinice A Shiga toksina.

1

Skraćene Podjedinice 1 A Shiga-sličnog toksina su katalitički aktivne, sposobne za enzimsko inaktiviranje ribozoma in vitro, i citotoksične kada se eksprimira unutar ćelije (LaPointe, / Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Najmanji fargment Podjedinice A Shiga toksina koji pokazuje enzimsku aktivnost jeste polipeptid sastavljen od ostataka 1-239 SltlA (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Iako je najmanji fragment Podjedinice A Shiga toksina prijavio da zadržava značajnu katalitičku aktivnost jesu ostaci 75-247 StxA (Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)), skraćeni StxA koji iskazuje de novo unutar eukariotske ćelije zahteva samo do ostatka 240 kako bi dostigao citozol i izvršio katalitičku inaktivaciju ribozoma (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).

Efektorski regioni Shiga toksina obično mogu biti manji od pune dužine A podjedinice. Poželjno je da efektorski region Shiga toksina održava polopeptidni region iz amino kiselinske pozicije 77 do 239 (SLT-1 A SEQ ID NO: 1 ili StxA SEQ ID NO: 2) ili da bude ekvivalentan u drugim Podjedinicama A članova familije Shiga toksina. Na primer, u određenim primerima izvođenja pronalaska, efektorski regioni Shiga toksina izvedeni iz SLT-1 A mogu obuhvatati ili sadržati amino kiseline 75 do 251 SEQ IDNO: 1, 1 do 241 SEQ IDNO: 1, 1 do 251 SEQ ID NO: 1, ili amino kiseline 1 do 261 SEQ ID NO: 11. Slično efektorski regioni Shiga toksina izvedeni iz StxA mogu obuhvatati ili sadržati amino kiseline 75 do 251 SEQIDNO: 2, 1 do 241 SEQIDNO: 2, 1 do 251 SEQ ID NO: 2, ili amino kiseline 1 do 261 SEQ ID NO: 2. Dodatno, efektorski regioni Shiga toksina izvedeni iz SLT-2 mogu obuhvatati ili sadržati amino kiseline 75 do 251 SEQ IDNO: 3, 1 do 241 SEQ IDNO: 3, 1 do 251 SEQ IDNO: 3, ili amino kiseline 1 do 261 SEQ ID NO:3.

Pronalazak dalje obezbeđuje varijante citotoksičnih proteina pronalaska, gde se efektorski region Shiga toksina razlikuje od Podjedinice A Shiga toksina koji se javlja u prirodi do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili više amino kiselinskih ostataka (ali ne više od onog koji zadržava najmanje 85%, 90%>, 95%, 99% ili više identifikacionih sekvenci amino kiselina). Tako, polipeptidna regija izvedena iz A Podjedinice člana familije Shiga toksina može sadržati supstitucije, brisanja, skraćenja ili druge izmene u originalnoj sekvenci sve dok je najmanje 85%, 90%, 95%, 99% ili više identiteta sekvence amino kiselina održavano u Podjedinici A Shiga toksina koja je prisutna u prirodi, kako je definisano u zahtevima.

Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, efektorski region Shiga toksina sadrži ili se sastoji od amino kiselinskih sekvencija koje imaju najmanje 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.7% ukupne identičnosti sekvenci za SLT-1 A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), ili SLT-2A (SEQ ID NO:3).

1

Opciono, ili puna dužina ili skraćena verzija Podjedinice A Shiga toskina može sadržati jednu ili više mutacija (npr. supstitucije, brisanja, ubacivanje ili inverzije). U određenim primerima izvođenja poželjno je da efektorski region Shiga toksina ima dovoljno istovetnih sekvenci u Podjedinici A Shiga toksina koji se javljaju u prirodi kako bi zadržao citotoksičnost nakon ulaska u ćeliju, bilo poznatim metodama transformacije ćelije domaćina, transfekcije, infekcije ili indukcije, ili internalizacijom posredovan sa ciljanjem vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa povezanog sa efektorskim regionom Shiga toksina. Najkritičniji ostaci za enzimsku aktivnost i/ili citotoksičnost u Podjedinicama A Shiga toksina mapirani su u sledeće položaje ostataka: aspargin-75, tirozin-77, glutamat-167, arginin-170, i arginin-176 među ostalim (Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)). U bilo kojim primerima izvođenja pronalaska, efektorski region Shiga toksina može poželjno, ali ne nužno da održava jednu ili više sačuvanih amino kiselina na položajima, kao što su one koje se nalaze na položajima 77, 167, 170, i 203 u StxA, SLT-1 A, ili ekvivalentni Rčuvani položaj kod drugih članova familije Shiga toksina koji su obično potrebni za citotoksičnu aktivnost. Sposobnost citotoksičnog proteina pronalaska da izazove smrt ćelija, npr. njegova citotoksičnost, može se meriti korišćenjem bilo kog ili više brojnih testova dobro poznatih u stanju tehnike.

U određenim primerima izvođenja otkrića, jedan ili više amino kiselinskih ostataka može biti mutiran ili izbrisan u cilju da se smanji ili eliminiše citotoksična aktivnost efektorskog regiona Shiga toksina. Citotoksičnost Podjedinica A članova familije Shiga toksina može biti ukinuta ili eliminisana mutacijom ili skraćivanjem. Označene pozicije tirozin-77, glutamat-167, arginin-170, tirozin-114, i triptofan-203 su pokazale da su važne za katalitičku aktivnost Stx, Stx1, i Stx2 (Hovde C et al, Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al, Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al, Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al, Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al, Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). Mutacijom oba i glutamat-167 i arginin-170 eliminiše enzimsku aktivnost Slt-1 A1 u inktivacijskom testu ćelije bez ribozoma (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). U drugom pristupu koji koristi de novo izražavanje Slt-1 A1 u endoplazmičnom retikulumu, mutacijom oba i glutamat-167 i arginin-170 eliminiše Slt-1 A1 fragment citotoksičnosti na tom ekspresionom nivou (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Analiza skraćenja pokazala je da fragment StxA iz ostataka 75 do 268 i dalje zadržava značajnu enzimsku aktivnost in vitro (Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)). Skraćeni fragment Slt-1 A1 koji sadrži ostatke 1-239 pokazao je značajnu enzimsku aktivnost in vitro i citotoksičnost de novo ekspresijom u citozolu (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Ekspresija Slt-1 A1 fragmenta skraćena na ostatke 1-239 u endoplazmičnom retikulumu nije citotoksična zbog toga što se nije moglo retrotranslocirati u citozol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).

1

Za potrebe predmetnog pronalaska, određeni redosled ili orijentacija nisu fiksirani za efektorski region Shiga toksina i vezujući region imunoglobulinskog tipa u odnosu jedni na druge ili na N-terminal(e) citotoksičnog proteina i C-terminal(e) (vidi npr. Sliku 1). U gore navedenim citotoksičnim proteinima, regioni imunoglobulinskog tipa i efektorski regioni Shiga toksina mogu biti direktno povezani jedan sa drugim i/ili prikladno povezani jedan sa drugim ili više interventnih sekvenci polipeptida, kao što je jedan ili više linkera koji su dobro poznati u tehnici.

Ekstraćelijski Ciljani Biomolekuli

Vezujući region imunoglobulinskog tipa citotoksičnog proteina pronalaska sadrži polipeptidni region spsoban da se veže posebno za esktraćelijski ciljani biomolekul, poželjno koji je fizički spojen za površinu ćelijskog tipa od interesa, kao što je ćelija kancera, ćelija tumora, plazma ćelija, inficirana ćelija ili ćelija domaćina koja sadrži intraćelijski patogen.

Izraz "ciljani biomolekul" odnosi se na biološki molekul, obično protein ili protein modifikovan post-translacijskim modifikacijama, kao što je glikozilacija, koja je sposobna da se veže za vezujući region imunoglobulinskog tipa da cilja citotoksični protein za određeni ćelijski tip ili lokacija unutar organizma. Ekstraćelijski ciljani biomolekuli mogu da sadrže različite epitope, uključujući nepromenjene polipeptide, polipeptide modifikovane dodatkom biohemijskih funkcionalnih grupa i glikolipide. Poželjno je da ekstraćelijski ciljani biomolekul bude endogeno internalizovan ili da bude lako primoran na internalizaciju tokom interakcije sa citotoksičnim proteinom.

Za svrhe predmetnog pronalaska, termin "ekstraćelijski" u pogledu modifikacije ciljanog biomolekula se odnosi na biomolekul koji ima bar deo svoje strukture izložene ekstraćelijskoj sredini. Ekstraćelijski ciljani biomolekuli uključuju komponente ćelijske membrane, transmembranske proteinske proteine, biomolekule vezane ćelijskom membranom, biomolekule vezane za ćelijsku površinu, i izlučene biomolekule.

U pogledu na predmetni pronalazak, izraz "fizički povezan" kada se koristi za opisivanje ciljanog biomolekula označava i kovalentne i/ili nekovalentne intermolekularne interakcije koje spajaju ciljani biomolekul, ili njegov deo, za spoljašnji deo ćelije, kao što je mnoštvo nekovalentnih interakcija između ciljanog biomolekula i ćelije u kojoj je energija svake pojedinačne interakcije od oko 1-5 kilo kalorija (npr. elektrostatičke veze, vodonične veze, Van der Walls interakcije, hidrofobne sile itd.). Svi proteini integralne membrane se mogu fizički povezati sa ćelijskom membranom, kao i proteinima periferne membrane. Na primer, ekstraćelijski ciljani biomolekul može da sadrži transmembransko opruženo područje, lipidno sidro, glikolipidno sidro i/ili da

1

bude nekovalentno povezan (npr. putem nespecifičnih hidrofobnih interakcija i/ili interakcija vezivanja lipida) sa faktorom koji sadrži bilo koji jedan od gore navedenih.

Vezujući regioni imunoglobulinskog regiona citotksičnih proteina pronalaska mogu biti kontruisani ili selektovani na osnovu raznih kriterijuma, kao što je određena ekspresija ćelijskog tipa njihovih ciljanih biomolekula i/ili fizička lokalizacija njihovih ciljanih biomolekula u pogledu na određene ćelijske tipove. Na primer, određeni citotoksični proteini predmetnog pronalaska sadrže vezujuće domene imunoglobulina koji mogu da vezuju ciljane ćelijske površine koje su eksprimirane samo jednim tipom ćelije na ćelijskoj površini. Ovo dozvoljava ciljano ubijanje ćelija određenih tipova ćelija sa velikom preferencijalnošću (bar trostrukim citotoksičnim efektom) preko ’’posmatračkih’’ tipova ćelija koji ne izražavaju ekstraćelijski ciljani biomolekul. Alternativno, ekspresija ciljanog biomolekula vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa može biti neekskluzivna za jedan tip ćelije ako je ekstraćelijski ciljani biomolekul izražen u dovoljno malim količinama i/ili fizički povezan u malim količinama sa ćelijskim tipovima koji neće biti ciljani. Ovo takođe dozvoljava ciljano ubijanje ćelija određenih ćelijskih tipova sa velikom preferencijalnošću (bar trostrukim citotoksičnim efektom) preko ’’posmatračkih’’ tipova ćelija koji ne izražavaju značajne količine ekstraćelijskog ciljanog biomolekula ili nisu fizički vezani sa značajnim količinama ekstraćelijskog ciljanog biomolekula. Ciljana ćelija može biti ubijena koristeći citotoksične proteine pronalaska pod različitim uslovima ćelije, kao što je ex vivo, in vitro uzgojena ili in vivo, uključujući ćelije in situ na njihovim izvornim mestima u esktraćelijskom organizmu.

Ekstraćelijski ciljani biomolekuli vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa citotoksičnih proteina pronalaska mogu da sadrže biomarkere srazmerno ili isključivo prisutne na ćelijama raka, imunim ćelijama i ćelijama zaraženim intracelularnim patogenima, kao što su virusi, bakterije, gljivice, prioni, ili protozoja.

U određenim primerima izvođenja, vezujući region imunoglobulinskog tipa je odabran za određeno i visoko afinitetno vezivanje za površinski antigen na ćelijskoj površini ćelije kancera, gde je antigen u ekspresiji ograničen na ćelije kancera (videti Glokler J et al, Molecules 15: 2478-90 (2010); Liu Y et al, Lab Chip 9: 1033-6 (2009)). U odnosu na druge primere izvođenja, vezujući region imunoglobulinskog tipa je odabran za određeno i visoko afinitetno vezivanje za površinski antigen na ćelijskoj površini ćelije kancera, gde je antigen preterano izražen ili preferirano izraženo sa ćelijama kancera u poređenju sa ćelijama koje nisu kancer.

Neki reprezentativni ciljani biomolekuli obuhvataju, ali nisu ograničeni na sledeće numerisane ciljeve povezani sa kancerima i/ili određenim imunim ćelijskim tipovima. Mnogi vezujući regioni

1

imunoglobulinskog tipa koji prepoznaju epitope povezane se ćelijama kancera u stanju tehnike, kao što su vezujući regioni koji ciljaju B-limfocitni antigenski protein CD20 (CD20), CD22, CD25, CD30, CD40, CD79, CD248 (endosialin), CD33 (Siglec-3), CD52 (CAMPATH-1 antigen), karcinoembrionski antigenski protein (CEA), epidermalni receptor rastućeg faktora (EGFPv/ErbBl), humani epidermalni receptor rastućeg faktora 2 (HER2/Neu/ErbB2/CD340), epitelijalni ćelijski adhezioni molekul (EpCAM), Ephrin tip-B receptor 2 (EphB2), Epstein-Barr Virus antigenski proteini, prostata specifični membranski antigen protein (PSMA), endoglin (END/CD 105), fibroblastni aktivacioni protein (FAP/seprase), i vaskularni endotelijalni receptori faktora rasta (VEGFRs) (videti Bagley R et al, Int J Oncol 34: 619-27 (2009)). Ova lista ciljanih biomolekula ima za nameru da bude ne organičena. Iskusan stručnjak će razumeti da se bilo koji željeni ciljni biomolekul povezan sa tipom ćelija kancera može koristiti za dizajniranje ili izbor vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa koji će biti spojen sa efektorskim regionom Shiga toksina za proizvodnju citotoksičnog proteina pronalaska.

Primeri drugih ciljanih biomolekula koji su jako povezani sa ćelijama kancera su B-limfocitni antigen protein CD 19 (CD 19), CD21, CS1 (SLAM familija broj 7 ili SLAMF7), ćelijska površina A33 antigen protein (gpA33), mucini (kao što je MUC1), tumor-povezani glikoprotein 72 (TAG-72), karboninska anhidraza IX (CA9/CAIX), folatni vezujući protein (FBP), gangliozid GD2, gangliozid GD3, gangliozid GM2, integrini alfa-V beta-3 (avPs), integrini alfa-5 beta-1 (a5Pi), receptor tirozin-protein kinaza erB-3, rastući faktor 1 receptor sličan insulinu (IGF1R), efrin tip-A receptor 3 (EphA3), tumor nekrozis faktor receptor 10A (TRAIL-R1/DR4), tumor nekrozis faktor receptor 10B (TRAIL-R2), receptorski aktivator nuklearne faktor kapa B (RANK), Tenascin C, Claudin proteini (CLDN3, CLDN4), mesotelin (MSLN) i CD64 (FcyRI) (videti, Hough C et al, Cancer Res 60: 6281-7 (2000); Thepen T et al, Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000); Pastan I et al, Nat Rev Cancer 6: 559-65 (2006); Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Fitzgerald D et al., Cancer Res 71: 6300-9 (2011); Scott et al, Cancer Immun 12: 14-22 (2012)). Lista ciljanih biomolekula ima za nameru da bude ne ograničavajuća.

Dodatno, postoje brojni drugi primeri ciljanih biomolekula, kao što su melanoma antigen prepoznat sa T-ćelijskim proteinima (MART-l/melanA), melanocitni protein PMEL (gplOO), tirozinaza, tirozinaza-srodni protein 1 (TRP-1), tirozinaza-srodni protein 2 (TRP-2), melanomapovezani antigen protein (MAGE-1), melanoma-povezani antigen 3 (MAGE-3), GAGE/PAGE proteini, BAGE proteini, Preferencijalni Ekspresioni Antigen Melanoma (PPvAME) proteini, receptor za naprednu glikaciju i proizvode (RAGE), kancer-testis antigen NY-ESO-1, kancertestis antigen LAGE proteini, lisofosfatidlglicerol aciltransferaza 1 (LPGAT1/IAA0205), SART proteini, ADP-ribosiltransferaze (ART1, ART4), Wilms' tumor antigen, prostatni specifični antigen protein (PSA), protein matične ćelije prostatnog antigena (PSCA), human aspartil

2

(asparaginyl) beta-hidroksilaza (HAAH), efrin tip-A receptor 2 (EphA2), receptor tirozin-protein kinaza erbB-3, tirozinaza povezani antigen (TAA), tačka prekida kluster region-c-abl onkogenih (BCR-ABL) proteini, alfa-fetoprotein antigen 17-A1 protein, antigen tumora mokraćne bešike (BTA), CD38, CD15, CD23, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, FceRIa, galectin-9, mrp-14, siglec-8, siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD15, CD64, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, Galectin-3, CD1 la-c, GITRL, MHC Class II, CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, i CD123 (videti, Scott A et al, Cancer Immunity 12: 14 (2012); Cheever M et al, Clin Cancer Res 15: 5323-37 (2009), za ciljane biomolekule i imati na umu da su ciljani molekuli opisani u njemu neograničavajući primeri). Iskusan stručnjak će razumeti da se bilo koji željeni ciljni biomolekul povezan sa tipom ćelija kancera može koristiti za dizajniranje ili izbor vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa koji će biti spojen sa efektorskim regionom Shiga toksina za proizvodnju citotoksičnog proteina pronalaska.

II. Primeri Specifično Strukturnih Varijacija Citotoksičnog Proteina

Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, citotoksični proteini efektorskog regiona Shiga toksina obuhvataju ili sadrže amino kiseline 75 do 251 SLT-1 A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), ili SLT-2A (SEQ ID NO:3). Drugi primeri izvođenja su citotoksični proteini gde efektorski region Shiga toksina obuhvata ili sadrži amino kiseline 1 do 241 SLT-1 A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), ili SLT-2A (SEQ ID NO:3). Ostali primeri izvođenja su citotoksični proteini gde efektorski region Shiga toksina obuhvata ili sadrži amino kiseline 1 do 251 SLT-1 A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), ili SLT-2A (SEQ ID NO:3). Drugi primeri izvođenja su citotoksični proteini gde efektorski region Shiga toksina obuhvata ili sadrži amino kiseline 1 do 261 SLT-1 A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), ili SLT-2A (SEQ ID NO:3).

Za određene primere izvođenja predmetnog pronalaska, vezujući region imunoglobulinskog tipa obuhvataju ili sadrže amino kiseline 269-508 SEQ ID NO:4, koji pokazuju jaku sposobnost vezivanja posebno za humani CD38. Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, vezujući region imunoglobulinskog tipa obuhvata ili sadrži amino kiseline 1-119 SEQ ID NO:5, koji pokazuju jaku sposbnost vezivanja posebno za humani HER2.

Kao što je korišćeno ovde, izraz "varijabilni domen teškog lanca (VH) " ili "varijabilni domen lakog lanca (VL)" respektivno se odnosi na bilo koje antitelo VH ili VL domena (npr. humani VH ili VL domen) kao i na bilo koji njegov derivat zadržavajući barem kvalitativnu sposobnost vezivanja antigena za odgovarajuće prirodno antitelo (npr. humanizovani VH ili VL domen izveden iz prirodnog murinskog VH ili VL domena). VH ili VL domen se sastoji od „okvira“ regiona koji su prekinuta sa tri CDRs ili ABRs. Okvirni regioni služe za prilagođavanje CDRa za specifično vezivanje za epitop antigena. Od amino-terminusa do karboksil-terminusa, VH i VL domeni sadrže sledeće okvirne (FR) i CDR regione: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4.

U opsegu ovog otkrića je upotreba fragmenata, varijanti i/ili derivata polipeptida citotoksičnih proteina pronalaska koji sadrže funkcionalno mesto za vezivanje ekstraćelijskog ciljanog biomolekula, i još poželjnije koji mogu da vezuju ciljani biomolekul sa visokim afinitetom (npr. kao što pokazuje KD). Na primer, pronalazak obezbeđuje polipeptidne sekvence koje se mogu vezati za CD38 i polipeptidne sekvence koje se mogu vezati za HER2. Bilo koji vezujući region imunoglobulinskog tipa koji sadrži polipeptid može biti supstituisan za ovaj region koji se vezuje za CD38 ili HER2, izraženo na ćelijskoj površini, sa konstantom disocijacije od 10<-5>do 10<-2>mola/litru, poželjno manje od 200 nM.

Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, vezujući region imunoglobulinskog tipa može biti izveden iz nanotela® ili pojedinačnog domena imunoglobulinskog izvedenog regiona VHH. Uopšteno, nanotela su konstruisana iz fragmenata pojedinačnih, monomernih varijabilnih domena antitela (sdAbs) koji se javljaju u prirodi, sorta koja se nalazi u vrstama riba i hrskavskih riba (Chondrichthyes). Nanotela su napravljena od ovih antitela koja se javljaju u prirodi skraćivanjem jednostrukog, monomernog varijabilnog domena kako bi se stvorio manji i stabilniji molekul. Zbog male veličine, nanotela se mogu vezati za antigene koji nisu dostupni celom antitelu. Između određenih primera izvođenja predemtnog pronalaska, vezujući region imunoglobulinskog tipa može se izvesti iz nanotela® ili pojedinaćnog domena imunoglobulinskog izvedenog regiona VHH(npr. amino kiseline 1-119 SEQ ID NO:5), koje pokazuju jaku sposobnost vezivanja posebno za humane HER2 proteine.

III. Uopštena Funkcija Citotoksičnog Proteina

Predmetni pronalazak pruža različite citotoksične proteine za selektivno ubijanje specifičnih tipova ćelija, pri čemu svaki protein sadrži 1) vezujući region imunoglobulinskog tipa za ciljano ćelijsko definisanje u zahtevima; i 2) efektorski region Shiga toksina za ubijanje ćelija kao što je definisano u zahtevima. Vezivanje ćelija koje ciljaju vezujuće regione imunoglobulinskog tipa sa Podjedinicom A Shiga toksina omogućava upravljanje specifičnog vezivanja ćelijskog tipa snažne citotoksičnosti ili citostaze Shiga toksina. U nekim primerima izvođenja, citotoksični proteini pronalaska mogu da vezuju ekstraćelijske ciljane biomolekule povezane sa ćelijskom površinom određenog ćelijskog tipa i ulaze u te ćelije. Jednom internalizovani unutar ciljanog ćelijskog tipa, određeni primeri izvođenja citotoksičnih proteina pronalaska su sposobni da usmere fragment citotoksičnog Shiga toksina polipeptida u citozol ciljane ćelije. Jednom kada su u citozolu ciljanog ćelijskog tipa, određeni primeri izvođenja citotoksičnih proteina pronalaska su sposobni da enzimaski inaktiviraju ribozome i eventualno ubiju ćeliju. Ovaj sistem je modularan u tome što bilo koji broj različitih vezujućih regiona imunoglobulinskog tipa može da se koristi za ciljanje ove moćne citotoksičnosti na razne, raznolike tipove ćelija i zbog toga što su različite Podjedinice A Shiga toksina izvedenih efektorskih regiona snažne citotoksičnosti jednom unutar eukariotske ćelije.

A. Ubijanje ćelije putem ciljane citotoksičnosti Shiga Toksina

Pošto su članovi familije Shiga toksina prilagođeni za ubijanje eukariotskih ćelija, citotoksični proteini dizajnirani pomoću efektorskih regiona Shiga toksina mogu pokazati moćnu aktivnost ubijanja ćelija. Podjedinice članova familije Shiga toksina sadrže enzimske domene koji mogu ubiti eukariotsku ćeliju jednom u ćelijskom citozolu. Određeni primeri izvođenja citotoksičnih proteina pronalaska koriste prednost ovog citotoksičnog mehanizma.

Kao što je definisano u zahtevima, kada dođe u kontakt sa ćelijom fizički spojenom za ekstraćelijski ciljani biomolekul vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa citotoksičnog proteina pronalaska, citotoksični protein može da izazove smrt ćelije. Ubijanje ćelija može se izvršiti korišćenjem citotoksičnog proteina pronalaska pod različitim uslovima ciljanih ćelija, kao što je ciljana ćelija kojom se manipuliše ex vivo, ciljana ćelija kultivisana in vitro, ciljana ćelija unutar uzorka tkiva kultivisanog in vitro, ili ciljane ćelije in vivo.

B. Selektivna Citotoksičnost među ûelijskim Tipovima

Ciljanjem dostave enzimski aktivnih regiona Shiga toksina koristeći visoko-afinitetne vezujuće regione imunoglobulinskog tipa na određene ćelijske tipove, ova moćna aktivnost ubijanja ćelija može biti ograničena na preferencijalno ubijanje odabranih tipova ćelija.

U određenim primerima izvođenja, nakom primene citotoksičnog proteina pronalaska na smešu ćelijskih tipova, citotoksični protein je sposoban za selektivno ubijanje onih ćelija koje su fizički spojene sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom za ćelijske tipove koji nisu fizički spojeni sa ekstraćelijski ciljanim biomolekulom. Budući da su članovi familije Shiga toksina prilagođeni za ubijanje eukariotskih ćelija, citotoksični proteini dizajnirani pomoću efektorskih regiona Shiga toksina mogu pokazati moćnu citotoksičnu aktivnost. Ciljanjem izvođenja enzimatski aktivnih regiona Shiga toksina na specifične ćelijske tipove koristeći visoko-afinitetne vezujuće regione

2

imunoglobulinskog tipa, ova moćna aktivnost ubijanja ćelija može biti ograničena na preferencijalno ubijanje samo onih tipova ćelija koje žele da budu ciljane sa njihovim fizičkim povezivanjem sa ciljanim biomolekulom izabranih vezujućih regiona imunoglobulinskog tipa.

U određenim primerima izvođenja, citotoksični protein pronalaska je sposoban da selektivno ili preferirano uzrokuje smrt određenog tipa ćelija unutar smeše dve ili više različitih ćelijskih tipova. To omogućava ciljanu citotoksičnu aktivnost na specifične ćelijske tipove sa velikom preferencijalnošću, kao što je trostruki citotoksični efekat, nad tipovima ćelija koji su „prolazni“ koji ne izražavaju ciljani biomolekul. Alternativno, ekspresija ciljanog biomolekula vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa može biti neekskluzivna za jedan tip ćelije ako je ciljani biomolekul izražen u dovoljno malim količinama i/ili fizički povezan u malim količinama sa tipovima ćelija koje ne treba da budu ciljani. Ovo omogućava ciljano ubijanje ćelija specifičnih tipova ćelija sa velikom preferencijalnošću, kao što je trostruki citotoksični efekat, nad tipovima ćelija koji su „prolazni“ koji ne izražavaju značajne količine ciljanih biomolekula ili nisu fizički povezani sa značajnim količinama ciljanog biomolekula.

U određenim primerima izvođenja, nakon davanja citotoksičnog proteina dvema različitim populacijama ćelijskih tipova, citotoksični protein je sposoban da izazove smrt ćelije kao što je definisano polu-maksimalnom koncentracijom citotoksičnosti (CD50) na populaciji ciljanih ćelija, čiji članovi izražavaju ekstraćelijski ciljani biomolekul vezujućeg regiona citotoksičnog proteina, u dozi najmanje tri puta nižoj od doze CD50 istog citotoksičnog proteina za populaciju ćelija čiji članovi ne izražavaju ekstraćelijski ciljani biomolekul vezujućeg regiona citotoksičnog proteina.

U određenim primerima izvođenja, citotoksična aktivnost prema populacijama ćelijskih tipova fizički spojenih sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom je najmanje 3-puta veća od citotoksične aktivnosti prema populacijama ćelijskih tipova koji nisu fizički povezani sa bilo kojim ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa. Prema predmetnom pronalasku, selektivna citotoksičnost se može kvantifikovati u odnosu na odnos (a/b) (a) citotoksičnosti prema populaciji ćelija određenog ćelijskog tipa fizički spojenog sa ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona za (b) citotoksičnost prema populaciji ćelija ćelijskog tipa koji nije fizički povezana sa ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa. U nekim primerima izvođenja, odnos citotoksičnosti ukazuje na selektivnu citotoksičnost koja je najmanje 3-puta, 5-puta, 10-puta, 15-puta, 20-puta, 25-puta, 30-puta, 40-puta, 50-preklopi, 75 puta, 100 puta, 250 puta, 500 puta, 750 puta ili 1000 puta veća za populacije ćelija ili tipova ćelija fizički spojenih sa ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa u poređenju sa populacijama ćelija ili tipova ćelija koji nisu fizički spojeni sa ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa.

Ova preferencijalna funkcija ubijanja ćelija omogućava ublažavanje ćelije određenim citotoksičnim proteinima pronalaska pod različitim uslovima i u prisustvu neciljanih ćelija prolaznika, kao što su smeše ćelija koje manipulišu ex vivo, in vitro kultivisana tkiva sa smešama ćelijskih tipova, ili in vivo u prisustvu višestrukih ćelijskih tipova (npr. in situ ili na svom izvornom mestu u okviru višećelijskog organizma).

Dodatno, katalitički neaktivni oblici citotoksičnih proteina pronalaska opciono mogu se koristiti za dijagnostičke funckije. Konjugacija dodatnih dijagnostičkih agenasa koji su poznati u tehnici za citotoksične proteine pronalaska mogu dozvoliti za snimanje intraćelijskih organela (npr. Golgi, endoplazmični retikulum, i citozolne pregrade) pojedinačnih ćelija kancera, imunih ćelija, ili mikrobno inficiranih ćelija u uzorku pacijenta ili biopsije. Na primer, ovo može biti korisno u dijagnostikovanju neoplastičnih ćelijskih tipova, procenjivanju progresije antikancer terapija tokom vremena, i/ili procenjivanje rezidualne ćelije kancera nakon hirurške ekscizije tumorske mase.

Varijacije u Polipeptidnoj Sekvenci Citotoksičnog Proteina koji Održava Ukupnu Strukturu i Funkciju

U određenim prethodno navedenim primerima izvođenja, citotoksični protein pronalaska predstavlja varijaciji u kojima postoje jedna ili više konzervativnih supstitucija amino kiselina uvedenih u polipeptidni region(e). Kao što je ovde korišćeno, izraz "konzervativna supstitucija" označava da je jedna ili više amino kiselina zamenjeno drugim, biološki sličnim amino kiselinskim ostatkom. Primeri uključuju supstituciju amino kiselinskih ostataka sa sličnim karakteristikama, npr. male amino kiseline, kisele amino kiseline, polarne amino kiseline, osnovne amino kiseline, hidrofobne amino kiseline i aromatične amino kiseline (videti, na primer, Tabelu B u nastavku). Primer konzervativne supstitucije sa ostatkom koji se obično ne nalazi u endogenim, peptidima i proteinima sisara je konzervativna supstitucija ostatka arginina ili lizina, na primer, ornitinom, kanavaninom, aminoetilcisteinom ili drugom osnovnom amino kiselinom. Za dalje informacije koje se tiču fenotipsko tihih supstitucija u peptidima i proteinima (videti npr. Bowie J et al, Science 247: 1306-10 (1990)). U donjoj šemi nalaze se konzervativne supstitucije amino kiselina grupisanih po fizikalno-hemijskim svojstvima. I: neutralna, hidrofilna, II: kiseline i amidi, III: bazična, IV: hidrofobna, V: aromatične, glomazne amino kiseline.

TABELEA B. Primeri Konzervativnih Amino Kiselinskih Supstitucija

2

U određenim primerima izvođenja, kao što je definisano u zahtevima, citotoskični protein pronalaska može obuhvatati funkcionalne fragmente ili varijacije polipetidnog regiona pronalaska koji imaju, najviše, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 amino kiselinskih supstitucija kada se poredi sa polipeptidnom sekvencom koja je ovde navedena, sve dok zadržava merljivu biološku aktivnost sama ili kao komponenta citotoksičnog proteina. Kao što je definisano u zahtevima, varijacije citotoksičnih proteina su unutar obima pronalaska kao rezultat promene polipeptida citotoksičnog proteina promenom jedne ili više amino kiselina ili brisanjem ili ubacivanjem jedne ili više amino kiselina, kao što je u vezujućem regionu imunoglobulinskog tipa ili efektorskom regionu Shiga toksina, da bi se postigla željena svojstva, kao što su promenjena citotoksičnost, promenjene citostatičke efikasnosti, promenjena imunogenost i/ili promenjen poluživot u serumu. Polipeptid citotoksičnog proteina pronalaska može dalje biti sa ili bez signalne sekvence.

U određenim primerima izvođenja, citotoksični protein ovog pronalaska deli najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identifikacija sekvenci amino kiselina sa bilo kojim od amino kiselinskih sekvenci citotoksičnog proteina koji je ovde naveden, sve dok zadržava merljivu biološku aktivnost, kao što je citotoksičnost, vezivanje ekstraćelijskog ciljanog biomolekula, enzimska kataliza ili subcelularno usmeravanje. Vezujući region imunoglobulinskog tipa može se razlikovati od amino kiselinskih sekvenci citotoksičnog proteina koji je ovde naveden, sve dok zadržava funkcionalnost vezivanja za svoj ekstraćelijski ciljani biomolekul. Funkcionalnost vezivanja će se najverovatnije zadržati ako su amino kiselinske sekvence CDRs ili ABRs identične. Na primer, citotoksični protein je unutar obima zahteva koji se sastoji od 85% identiteta amino kiselina citotoksičnog proteina koji je ovde naveden, a koji u svrhu određivanja stepena identiteta amino kiselina, amino kiselinski ostaci koji formiraju CDR ili ABR su zanemareni. Funkcionalnost vezivanja može da bude određena od strane stručnog lica koristeći standardne tehnike.

U određenim primerima izvođenja, efektorski region Shiga toksina mogu da se izmene da bi se promenila enzimska aktivnost efektorskog regiona Shiga toksina, zadržavajući citotoksičnu aktivnost, kako je definisano u zahtevima. Moguće izmene uključuju mutacije u regionu Shiga toksina koji je izabran iz grupe koja se sastoji od: brisanja i supstitucije amino kiselinskih ostataka.

2

Citotoksičnost A Podjedinica članova familije Shiga toksina može se ukinuti ili eliminisati mutacijom ili skraćivanjem. Položaji obeleženi tirozin-77, glutamat-167, arginin-170, tirozin-114 i triptofan-203 pokazali su se važnim za katalitičku aktivnost Stx, Stx1, i Stx2 (Hovde C et al, Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al, Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al, Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al, Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al, Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). Mutacijom oba glutamat-167 i arginin-170 eliminiše enzimsku aktivnost Slt-1 A1 u inaktivacionoj analizi ćelija bez ribozoma (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). U drugom pristupu koristeći de novo ekspresiju Slt-1 A1 u endoplazmičnom retikulumu, mutacijom oba glutamat-167 i arginin-170 eliminiše Slt-1 A1 fragment citotoksičnosti na tom ekspresionom nivou (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Analiza skraćivanja pokazuje da fragment StxA od ostatka 75 do 268 još uvek zadržava značajnu enzimsku aktivnost in vitro (Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)).

Skraćeni fragment Slt-1 A1 koji sadrži ostatke 1-239 prikazuje značajnu enzimsku aktivnost in vitro i citotoksičnost sa de novo ekspresijom u citozolu (LaPointe, / Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Ekspresija Slt-1 A1 fragmenta skraćenog do ostataka 1-239 u endoplazmičnom retikulumu nije citotoksična jer se nije moglo ponovo premestiti u citozol (LaPointe, J Biol Chem 280:23310-18 (2005)).

Najkritičniji ostaci za enzimsku aktivnost i/ili citotoksičnost u podjedinicama A Shiga toksina mapirani su u sledeće ostatke: aspargin-75, tirozin-77, glutamat-167, arginin-170 i arginin-176, između ostalih (Di, Toxicon 57: 535-39 (2011)). Konkretno, dvostruko mutirana konstrukcija Stx2A koja sadrži glutamat-E167-li-lizin i arginin-176-lizin mutacije bila je potpuno inaktivirana; dok su mnoge pojedinačne mutacije u Stx1 i Stx2 pokazale desetostruko smanjenje citotoksičnosti. Dalje, skraćivanje Stx1 A na 1-239 ili 1-240 smanjuje njegovu citotoksičnost, a slično tome, skraćivanje Stx2 A na konzerviranom hidrofobnom ostatku smanjuje njegovu citotoksičnost.

Skraćene 1A podjedinice slične Shiga toksinu su katalitički aktivni, sposobni da enzimski inaktivišu ribozome in vitro, i citotoksični kada se ekspresuju unutar ćelije (LaPointe, / Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Najmanji fragment Podjedinice A Shiga toksina koji pokazuje puni anzimsku aktivnost jeste polipeptid koji je sastavljen od ostataka 1-239 Slt1A (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Iako najmanji fragment Podjedinice A Shiga toksina za koji je prijavljeno da zadržava značajnu katalitičku aktivnost jesu ostaci 75-247 StxA (Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)), skraćeni StxA pokazuje de novo unutar eukariotske ćelije koji zahteva samo do ostatka 240 kako bi se dostigao citozol i vršila katalitička inaktivacija ribozoma (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).

2

U određenim primerima izvođenja otkrića izvedenog iz SLT-1 A (SEQ ID NO:1) ili StxA (SEQ ID NO:2), ove promene uključuju supstituciju asparagina u položaju 75, tirozin u položaju 77, tirozin u položaju 114, glutamat u položaju 167, arginin u položaju 170, arginin upoložaju 176, i / ili supstituciju triptofana u položaju 203. Primeri takvih supstitucije će biti poznate stručnjaku na osnovu prethodnog stanja tehnike, kao što su asparagin u položaju 75 do alanina, tirozin u položaju 77 serinom, supstitucija tirozina u položaju 114 alaninom, zamena glutamata u položaju 167 sa aspartatom, supstitucija arginina u položaju 170 alaninom, supstitucija arginina u položaju 176 lizinom i/ili supstitucija triptofana u položaju 203 alaninom.

Citotoksični proteini kako su definisani u zahtevima pronalaska opciono se konjuguju sa jednim ili više dodatnih agenasa koja mogu uključivati terapeutske i/ili dijagnostičke agense poznate u tehnici.

Produkcija, Proizvodnja i Prečišćavanje Citotoksičnog Proteina

Citotoksični proteini pronalaska mogu se proizvesti korišćenjem tehnika biohemijskog inženjeringa, dobro poznati onima koji poznaju ovo područje. Na primer, citotoksični proteini pronalaska mogu se proizvesti standardnim sintetskim postupcima, korišćenjem rekombinantnih ekspresijskih sistema ili bilo kojim drugim pogodnim postupkom. Stoga se citotoksični proteini mogu sintetizovati na više načina, uključujući npr. postupke koji obuhvataju: (1) sintezu polipeptida ili polipeptidne komponente citotoksičnog proteina korišćenjem standardne metodologije čvrste ili tečne faze, bilo po koracima ili po sastavu fragmenta, i izolovanje i prečišćavanje konačnog proizvoda od peptidnog jedinjenja; (2) eksprimiranje polinukleotida koji kodira polipeptid ili polipeptidnu komponentu citotoksičnog proteina u ćeliji domaćina i vraćanje proizvoda ekspresije iz ćelije domaćina ili kulture ćelije domaćina; ili (3) in vitro ekspresija polinukleotida koji kodira polipeptid ili polipeptidnu komponentu citotoksičnog proteina i oporavlja proizvod ekspresije; ili bilo kojom kombinacijom postupaka iz (1), (2) ili (3) za dobijanje fragmenata peptidne komponente, koji nakon toga spajaju (npr. ligacijom) fragmente za dobijanje peptidne komponente, i oporavljaju peptidnu komponentu.

Može biti poželjnije sintetizovati polipeptid ili polipeptidnu komponentu citotoksičnog proteina pronalaska pomoću sinteze peptida u čvrstoj ili tečnoj fazi. Citotoksični proteini pronalaska mogu se prikladno proizvesti standardnim sintetskim postupcima. Tako se peptidi mogu sintetizovati, npr. postupcima koji obuhvataju sintetizaciju peptida sa standardnom metodologijom čvrste ili tečne faze, bilo po koracima ili po sastavu fragmenta, i izolovanje i prečišćavanje konačnog peptidnog proizvoda. U tom kontekstu, referenca se može uputiti na WO 1998/11125 ili, inter alia, Fields, G et al, Principles and Practice of Solid-Phase Peptide

2

Synthesis (Synthetic Peptides, Gregory A. Grant (ed.), Oxford University Press, U.K., 2nd ed., 2002) i primeri sinteze u njima.

Citotoksični proteini pronalaska mogu se pripremiti (proizvesti i prečistiti) korišćenjem rekombinantnih tehnika dobro poznatih u stanju tehnike. Uopšteno, postupci za pripremu polipeptida kultivisanjem ćelija domaćina transformisanih ili transficiranih vektorom koji sadrži kodirajući polinukleotid i obnavljanje polipeptida iz ćelijske kulture su opisani u, npr. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989); Dieffenbach et al, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY., U.S., 1995). Svaka pogodna ćelija domaćina može da se koristi za proizvodnju citotoksičnog proteina pronalaska. ûelije domaćina mogu biti stabilne ćelije ili prolazno transficirane, transformisane, transducirane ili inficirane jednim ili više ekspresijskih vektora koji pokreću ekspresiju polipeptida pronalaska. Pored toga, citotoksični protein pronalaska može se proizvesti modifikovanjem polinukleotida koji kodira citotoksični protein što rezultira promenom jedne ili više amino kiselina ili brisanjem ili ubacivanjem jedne ili više amino kiselina u cilju postizanja željenih svojstava, kao što je promena citotoksičnosti, promena citostatičnog efekta, promena imunogenost i/ili promena poluživot u serumu.

Shodno tome, predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju citotoksičnog proteina pronalaska prema gore navedenim postupcima i korišćenjem polinukleotidnog enkodirajućeg dela ili celog polipeptida pronalaska, vektora ekspresije koji sadrži najmanje jedan polinukleotid pronalaska koji može da kodira deo ili ceo polipeptid pronalaska kada se unese u ćeliju domaćina i/ili ćelija domaćin koja sadrži polinukleotidni ili ekspresijski vektor ovog pronalaska.

Kada se polipeptid ili protein eksprimiraju korišćenjem rekombinantnih tehnika u ćeliji domaćina ili sistemu bez ćelija, pogodno je odvojiti (ili pročistiti) željeni polipeptid ili protein od drugih komponenti, kao što su faktori ćelije domaćina, kako bi se dobili preparati koji su visoke čistoće ili su u osnovi homogeni. Prečišćavanje se može izvesti postupcima dobro poznatim u tehnici, kao što su tehnike centrifugiranja, tehnike ekstrakcije, hromatografske tehnike i tehnike frakcije (npr. odvajanje veličine filtracijom gela, razdvajanje naboja kolonom za razmenu jona, hromatografija hidrofobne interakcije, hromatografija reverzne faze, hromatografija na silika ili katjonske razmene kao što su DEAE, hromatofokusiranje i hromatografija proteina A Sepharose za uklanjanje kontaminanta) i tehnike taloženja (npr. taloženje etanolom ili taloženje amonijum sulfata). Bilo koji broj biohemijskih tehnika prečišćavanja može se koristiti za povećanje proteina pronalaska, izborno se prečišćava u homo-multimernim oblicima (odn. proteinski kompleks od dva ili više identičnih citotoksičnih proteina).

2

U Primerima navedenim u nastavku dole su opisi neograničavajući primeri postupaka za proizvodnju citotoksičnog proteina pronalaska, kao i specifični, ali neograničavajući aspekti proizvodnje citotoksičnog proteina za otkrivene, primere, citotoksične proteine.

Farmaceutske Kompozicije koje sadrže Citotoksični Protein

Predmetni pronalazak obezbeđuje citotoksične proteine za primenu, sam ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, u farmaceutskoj kompoziciji, za lečenje ili profilaksu stanja, oboljenja, poremećaja, ili simptoma koji su u više detalja opisani u nastavku (npr. karcinomi, maligni tumori, nemaligni tumori, imuni poremećaji i mikrobne infekcije).

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže citotoksični protein pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat, prema pronalasku, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska može sadržati homo-multimerne i/ili hetero-multimerne oblike citotoksičnih proteina pronalaska. Farmaceutske kompozicije biće korisne u postupcima lečenja, ublažavanja ili sprečavanja oboljenja, stanja, poremećaja ili simptoma koji su detaljnije opisani u daljem tekstu. Svako takvo oboljenje, stanje, poremećaj ili simptom je predviđen kao zasebna realizacija u pogledu upotrebe farmaceutskih kompozicija prema pronalasku. Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije za upotrebu u bar jednom postupku lečenja kako je definisano u zahtevima, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu.

Kao što je ovde korišćeno, izrazi "pacijent" i "subjekat" upotrebljavaju se naizmenično kako bi se odnosili na bilo koji organizam, obično kičmenjake, kao što su ljudi i životinje, koji pokazuju simptome, znake i/ili indikacije na najmanje jednu bolest, poremećaj ili stanje. Ovi izrazi uključuju sisare, kao što su neograničavajući primeri primata, stočnih životinja (npr. goveda, konji, svinje, ovce, koze, itd.), životinje u pratnji (npr. mačke, psi itd.) i laboratorijskih životinja (npr. miševi, zečevi, pacovi itd.).

Kao što je ovde korišćeno, "lečen", "lečiti" ili "lečenje" i njegove gramatičke varijante odnose se na pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Izrazi se mogu odnositi na usporavanje početka ili stope razvoja stanja, poremećaja ili bolesti, smanjenje ili ublažavanje simptoma povezanih sa njim, generisanje potpune ili delimične regresije stanja ili neku kombinaciju bilo čega od gore navedenog. U svrhu ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, smanjenje ili ublažavanje simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizaciju (npr. ne pogoršanje) stanja bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, ublažavanje ili ublažavanje bolesnog stanja i remisija (bilo delimična ili totalna), bilo da se može otkriti ili neotkriti. "Lečen", "lečiti" ili "lečenje" takođe može značiti produženje preživljavanja u odnosu na očekivano vreme preživljavanja ako ne bude primljeno. Subjekat (npr. čovek) kome je potrebno lečenje može biti subjekat koji je već pogođen oboljenjem ili poremećajem u pitanju. Izrazi „lečen“, „lečiti“ ili „lečenje“ uključuju inhibiciju ili smanjenje povećanja težine patološkog stanja ili simptoma u odnosu na odsustvo lečenja, a ne mora nužno da podrazumeva potpuni prekid relevantne bolesti, poremećaj ili stanje.

Kao što je ovde korišćeno, izrazi "sprečen", "sprečavati", "sprečavaju" i gramatičke njegove varijante odnose se na pristup sprečavanju razvoja ili promene patologije stanja, oboljenja ili poremećaja. Prema tome, „prevencija“ se može odnositi na profilaktičke ili preventivne mere. U svrhu ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje ili usporavanje simptoma, napredovanje ili razvoj bolesti, bilo detektibilnu ili neotkrivenu. Subjekat (npr. čovek) kome je potrebna prevencija može, dakle, biti subjekat koji još nije suočen sa određenom bolešću ili poremećajem. Izraz "prevencija" uključuje usporavanje početka oboljenja u odnosu na odsustvo lečenja, a ne mora nužno da podrazumeva i trajnu prevenciju relevantnog oboljenja, poremećaja ili stanja. Prema tome, „sprečavati“ ili „sprečavanje“ stanja može se u određenim kontekstima odnositi na smanjenje rizika od razvoja stanja ili sprečavanje ili odlaganje razvoja simptoma povezanih sa stanjem.

Kao što je ovde korišćeno, "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" je količina ili doza smeše (npr. terapeutska kompozicija ili agens) koja proizvodi bar jedan željeni terapeutski efekat kod subjekta, kao što je sprečavanje ili lečenje cilja stanja ili blagotvorno ublažavanje simptoma povezanih sa stanjem. Najpoželjnija terapeutski efikasna količina je količina koja će proizvesti željenu efikasnost određenog lečenja odabranog od strane stručnjaka za određenu temu kome je potrebna. Ova količina će se razlikovati u zavisnosti od različitih faktora koje stručno lice razume, uključujući, ali ne ograničavajući se na karakteristike terapeutskog jedinjenja (uključujući aktivnost, farmakokinetiku, farmakodinamiku i bioraspoloživost), fiziološka stanja subjekta (uključujući starost, pol, tip oboljenja, stadijum oboljenja, opšte fizičko stanje, reaktivnost na dato doziranje i vrstu leka), prirodu farmaceutski prihvatljivog nosača ili nosača u formulaciji i način primene. Stručnjak u kliničkoj i farmakološkoj nauci moći će da odredi terapeutski efikasnu količinu rutinskim eksperimentisanjem, naime praćenjem reakcije subjekta na davanje jedinjenja i prilagođavanjem doze u skladu sa tim (videti npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995)).

1

Dobijanje ili Proizvodnja Farmaceutske Kompozicije koja sadrži Citotoksični Protein

Farmaceutske prihvatljive soli ili solvati bilo kojih citotoskičnih proteina pronalaska su takođe u okviru predmetnog pronalaska.

Izraz "solvat" u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na kompleks definisane stehiometrije koji se formira između rastvora (in casu, polipeptidnog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema pronalasku) i rastvarača. Rastvarač u ovoj vezi može, na primer, biti voda, etanol ili druge farmaceutski prihvatljive, tipično male molekulske organske vrste, kao što je, ali nije ograničeno na, sirćetna kiselina ili mlečna kiselina. Kada je rastvarač voda, takav solvat se obično naziva hidrat.

Citotoksični proteini predmetnog pronalaska ili njihove soli mogu biti formulisani kao farmaceutske kompozicije pripremljene za skladištenje ili davanje, koji obično sadrže terapeutski efikasnu količinu jedinjenja pronalaska ili njegove soli u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača. Farmaceutski prihvatljivi nosači za terapijsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci, i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985). Kao što je korišćeno ovde, "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje sve fiziološki prihvatljive, odn. kompatibilne rastvarače, disperzijske podloge, obloge, antimikrobne agense, izotonične agense i agensi za odlaganje apsorpcije.

Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači uključuju one koji se koriste u formulacijama pogodnim za oralnu, rektalnu, nazalnu ili parenteralnu (uključujući potkožno, intramuskularno, intravenozno, intradermalno i transdermalno) primenu. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za trenutnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Primeri pogodnih vodenih i nevodnih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol i polietilen glikol), i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i organski estri za ubrizgavanje, poput etiloletata. Pravilna fluidnost može se održati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom površinski aktivnih supstanci. U nekim primerima izvođenja, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, potkožnu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. ubrizgavanjem ili infuzijom). U zavisnosti od odabranog načina primene, citotoksični protein ili druga farmaceutska komponenta može biti obložen materijalom namenjenim da zaštitu jedinjenja od dejstva niskog pH i drugih prirodnih inaktivacionih stanja sa kojima aktivni citotoksični protein može da naiđe kada se primenjuje na pacijenta određenim načinom primene.

2

Formulacije farmaceutskih kompozicija pronalaska mogu se prikladno predstaviti u obliku jedinične doze i mogu se pripremiti bilo kojim postupkom dobro poznatim u farmaceutskoj tehnici. U takvom obliku, kompozicija je podeljena u jedinične doze koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente. Jedinični dozni oblik može biti upakovani preparat, pakovanje koje sadrži diskretne količine preparata, na primer, upakovane tablete, kapsule i praškovi u bočicama ili ampulama. Jedinični dozni oblik može takođe biti sama kapsula, ravna kapsula ili tableta, ili može biti odgovarajući broj bilo kog od ovih pakovanih oblika. Može se dobiti u obliku injekcije u jednoj dozi, na primer u obliku olovke. Kompozicije se mogu formulisati za bilo koji pogodan način i sredstvo davanja. Subkutani ili transdermalni načini primene mogu biti naročito pogodni za ovde opisane terapeutske citotoksične proteine.

Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu takođe da sadrže pomoćne supstance kao što su konzervansi, ovlaživači, emulgatori i agensi za raspršivanje. Prevencija prisustva mikroorganizama može se obezbediti i postupcima sterilizacije i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola ili sorbinske kiseline. Uključivanje izotoničnih agenasa, poput šećera ili natrijum hlorida, u kompozicije takođe može biti poželjno. Pored toga, produžena apsorpcija injekcionog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem agenasa koja odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat i želatina.

Farmaceutska kompozicija pronalaska takođe opciono uključuje farmaceutski prihvatljiv antioksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa su antioksidansi rastvorljivi u vodi kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit; antioksidansi rastvorljivi u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilirani hidroksianizol (BHA), butilirani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propilgallat i alfa-tokoferol; i helatni agensi za metal, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetra sirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina i fosforna kiselina.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili kombinaciju različitih citotoksičnih proteina pronalaska i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.

Terapeutske kompozicije su obično sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga naručena struktura pogodna visokoj koncentraciji leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, alkohol kao što je etanol, poliol (npr. glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol), ili bilo koje pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih supstanci prema hemiji formulacije koja je dobro poznata u struci. U nekim primerima izvođenja, izotonični agensi, npr. šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola ili natrijum hlorida mogu biti poželjni u kompoziciji. Produžena apsorpcija kompozicija za ubrizgavanje može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatin.

Rastvori ili suspenzije koji se koriste za intradermalnu ili subkutanu primenu obično uključuju jedan ili više: sterilni razblaživač poput vode za injekcije, fiziološkog rastvora, fiksiranih ulja, polietilen glikola, glicerina, propilen glikola ili drugih sintetskih rastvarača; antibakterijski agensi poput benzil alkohola ili metil parabena; antioksidansi kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatni agensi kao što je etilendiamineterosirćetna kiselina; puferi poput acetata, citrata ili fosfata; agensi za podešavanje toničnosti, kao što su, na primer, natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti pomoću kiselina ili baza, kao što je hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid, ili puferi sa citratom, fosfatom i acetatom. Takvi preparati se mogu zatvoriti u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili bočice sa više doza napravljene od stakla ili plastike.

Sterilni rastvori za ubrizgavanje mogu se pripremiti ugrađivanjem citotoksičnog proteina pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom prethodno opisanih sastojaka, a po potrebi i sterilizacionom mikrofiltracijom. Disperzije se mogu pripremiti uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži disperzioni medijum i druge sastojke, poput onih opisanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, postupci pripreme su sušenje vakuumom i sušenjem smrzavanjem (liofilizacija) koji daju prašak aktivnog sastojka uz dodatak bilo kojeg dodatnog željenog sastojka iz sterilno filtriranog rastvora.

Kada je projektovana primena terapeutski efikasne količine citotoksičnog proteina pronalasku sa, npr. intravenoznim, kožnim ili subkutanim ubrizgavanjem, vezujući agens će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena. Postupci za pripremu parenteralno prihvatljivih proteinskih rastvora, uzimajući u obzir odgovarajući pH, izotoničnost i stabilnost, su u opsegu stručnog lica. Poželjna farmaceutska kompozicija za intravensku, kožnu ili supkutanu injekciju će sadržati, pored vezujućih agenasa, izotonični nosač, kao što su ubrizgavanje natrijum hlorida, Ringerova injekcija, injekcija dekstroze, injekcija dekstroze i natrijum hlorida, laktairana Ringerova injekcija, ili drugi nosač koji je poznat u tehnici. Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može takođe da sadrži stabilizatore, konzervanse, pufere, antioksidanse ili druge aditive koji su dobro poznati onima koji poznaju ovu oblast.

4

Kao što je ovde opisano, jedinjenje se može pripremiti sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polihidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, polorthoesteri i pollaktična kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili su opšte poznati onima koji poznaju ovo oblast (videti npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978)).

U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska može biti formulisan da obezbedi željenu distribuciju in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera isključuje mnoga velika i/ili hidrofilna jedinjenja. Da bi se terapijsko jedinjenje ili kompozicija pronalaska usmerila na određeno mesto in vivo, oni mogu da budu formulisani, na primer, u lipozome koji mogu da sadrže jednu ili više grupa koje se selektivno transportuju u određene ćelije ili organe, poboljšavajući na taj način ciljanu isporuku leka. Primeri ciljne grupe uključuju folat ili biotin; manozide; antitela; receptor površinski aktivnog proteina A receptor; i pi20 katenin.

Polinukleotidi, Ekspresioni Vektori, i ûelije Domaćina

Pored citotoksičnih proteina predmetnog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju takve citotoksične proteine spadaju u opseg ovog pronalaska. Izraz "polinukleotid" je ekvivalentan izrazu "nukleinske kiseline", pri čemu oba uključuju polimere deoksiribonukleinske kiseline (DNK), polimere ribonukleinske kiseline (RNA), analoge ovih DNK ili RNK generisane korišćenjem nukleotidnih analoga i derivate, fragmente i njihovi homolozi. Polinukleotid pronalaska može biti jedno-, dvo- ili trolančani. Otkriveni polinukleotidi su posebno otkriveni da uključuju sve polinukleotide koji mogu da kodiraju primeran citotoksični protein, na primer, uzimajući u obzir kolebanje za koje se zna da se toleriše u trećem položaju RNK kodona, a istovremeno kodira za istu amino kiselinu kao različit RNK kodon.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji kodiraju citotoksični protein pronalaska ili njegov komplement. Polinukleotidi mogu da uključuju, npr. sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira polipeptid najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili više, identičan je polipeptidu koji sadrži jednu od amino kiselinskih sekvenci citotoksičnog proteina. Otkriće takođe uključuje polinukleotide koji sadrže nukleotidne sekvence koje hibridizuju pod strogim uslovima do polinukleotida koji kodira citotoksični protein pronalaska, ili njegov fragment ili derivat, ili antisens ili komplement bilo koje takve sekvence.

Derivati ili analozi polinukleotida (ili citotoksičnih proteina) pronalaska uključuju, između ostalog, molekule polinukleotida (ili polipeptida) koji imaju regione koji su u osnovi homologni polinukleotidima ili citotoksičnim proteinima pronalaska, npr. barem oko 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98% ili čak 99% identiteta (sa preferiranim identitetom od 80-99%) preko polinukleotidne ili polipeptidne sekvence iste veličine ili kada u poređenju sa poravnatim redosledom u kome se poravnanje vrši pomoću računarskog programa homologije poznatog u stanju tehnike. Primer programa je GAP program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, U.S.) koji koristi početno podešavanje, koji koristi algoritam Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math.2: 482-9 (1981). Takođe su obuhvaćeni polinukleotidi sposobni hibridizirati se na komplement sekvence koja kodira proteine pronalaska pod strogim uslovima (videti npr. Ausubel F, et al, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993)), i u nastavku. Striktni uslovi su poznati stručnjacima i mogu se naći u Aktuelnim protokolima iz molekularne biologije (John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec.6.3.1-6.3.6(1989).

Predmetni pronalazak dalje omogućava ekspresijske vektore koji sadrže polinukleotide u obimu pronalaska. Polinukleotidi koji mogu kodirati citotoksične proteine pronalaska mogu se umetnuti u poznate vektore, uključujući bakterijske plazmide, virusne vektore i vektor faga, koristeći materijal i postupke dobro poznate u struci za proizvodnju ekspresijskih vektora. Takvi ekspresijski vektori će uključivati polinukleotide neophodne da podrže proizvodnju razmatranih citotoksičnih proteina unutar bilo koje ćelije domaćina po izboru ili ekspresijskih sistema bez ćelija (npr. PTxbl i pIVEX2.3 opisani u primerima u nastavku). Specifični polinukleotidi koji sadrže ekspresijske vektore za upotrebu sa specifičnim tipovima ćelija domaćina ili sistemima za ekspresiju bez ćelija poznati su stručnjacima uobičajene struke, mogu se odrediti rutinskim eksperimentima ili se mogu kupiti.

Izraz "ekspresioni vektor", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotid, linearni ili kružni oblik, koji sadrži jednu ili više ekspresijskih jedinica. Izraz "jedinica za ekspresiju" označava polinukleotidni segment koji kodira polipeptid od interesa i sposoban je da obezbedi ekspresiju segmenta nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu. Ekspresijska jedinica obično sadrži promotor transkripcije, otvoreni okvir za čitanje koji kodira interesantni polipeptid i terminator transkripcije, sve u operativnoj konfiguraciji. Ekspresijski vektor sadrži jednu ili više jedinica za ekspresiju. Prema tome, u kontekstu ovog pronalaska, ekspresijski vektor koji kodira citotoksični protein koji sadrži jedan polipeptidni lanac (npr. ScFv genetski rekombinovan sa efektorskim regionom Shiga toksina) sadrži najmanje ekspresionu jedinicu za jedan polipeptidni lanac, dok je citotoksični protein koji sadrži, npr. dva ili više polipeptidnih lanaca (npr. jedan lanac koji sadrži VL domen i drugi domen koji sadrži VH domen vezan za efektorski region toksina) uključuje najmanje dve ekspresione jedinice, po jednu za svaki od dva polipeptidna lanca proteina. Za ekspresiju višelančanih citotoksičnih proteina, ekspresijska jedinica za svaki polipeptidni lanac se takođe može zasebno sadržati na različitim ekspresioni vektorima (npr. ekspresija se može postići jednom ćelijom domaćinom u koju su uvedeni ekspresioni vektori za svaki polipeptidni lanac).

Ekspresioni vektori koji su sposobni da usmeravaju prolaznu ili stabilnu ekspresiju polipeptida i proteina dobro su poznati u stanju tehnike. Ekspresioni vektori obično uključuju, ali nisu ograničeni na, jedno ili više sledećeg: heterologna signalna sekvenca ili peptid, poreklo replikacije, jedan ili više marker gena, pojačivač, promotor i sekvenca za završavanje transkripcije, od kojih je svaki dobro poznat u tehnici. Opcione regulatorne kontrolne sekvence, integracione sekvence i korisni markeri koji se mogu koristiti su poznati u stanju tehnike.

Izraz "ćelija domaćina" odnosi se na ćeliju koja može podržati replikaciju ili ekspresiju vektora ekspresije. ûelije domaćini mogu biti prokariotske ćelije, kao što su E. coli ili eukariotske ćelije (npr. ćelije kvasca, insekata, vodozemaca, ptice ili sisara). Stvaranje i izolacija ćelijskih linija domaćina koje sadrže polinukleotid pronalaska ili sposobne da proizvode citotoksični protein pronalaska mogu se izvršiti korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici.

Citotoksični proteini u obimu ovog pronalaska mogu biti varijante ili derivati citotoksičnih proteina ovde opisanih koji se dobijaju modifikovanjem polinukleotida koji kodira citotoksični protein menjanjem jedne ili više amino kiselina ili brisanjem ili ubacivanjem jedne ili više amino kiselina koje mogu da ih učine pogodnijim kako bi se postigla željena svojstva, kao što je optimalnija ekspresija od strane ćelije domaćina.

Postupci za Korišćenje Citotoksičnog Proteina ili Njegove Farmaceutske Kompozicije

Uopšteno, cilj pronalaska je da se obezbedi farmakološki aktivni agens, kao i kompozicije koje sadrže iste, koje se mogu koristiti u prevenciji i/ili lečenju oboljenja, poremećaja i stanja, kao što su određeni karcinomi, tumori, imuni poremećaji ili dalje patološka stanja koja su ovde navedena. Shodno tome, predmetni pronalazak pruža in vitro metodu korišćenja citotoksičnih proteina pronalaska za ubijanje ćelija i takođe obezbeđuje lečenje oboljenja, poremećaja i stanja kao što je ovde opisano.

Posebno, cilj pronalaska je da obezbedi takve farmakološki aktivne agense, kompozicije i/ili postupke koji imaju određene prednosti u poređenju sa agensima, kompozicijama i/ili postupcima koji su trenutno poznati u stanju tehnike. Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke kako je definisano u zahtevima za upotrebu citotoksičnih proteina sa određenim polipeptidnim sekvencama i njihovim farmaceutskim kompozicijama. Na primer, bilo koja od polipeptidnih sekvenci u SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, ili 5 mogu se posebno koristiti kao komponenta citotoksičnog proteina koji se koristi u sledećim metodama.

Predmetni pronalazak obezbeđuje in vitro postupke ubijanja ćelije koji obuhvataju korak kontakta sa ćelijom, sa citotoksičnim proteinom pronalaska, kao što je definisano u zahtevima. Citotoksični proteini i farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se koristiti za ubijanje određenog ćelijskog tipa nakon kontakta sa ćelijom ili ćelijama sa jednom od zahtevanih kompozicija materije. U nekim primerima izvođenja, citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje specifičnih tipova ćelija u smeši različitih tipova ćelija, kao što su smeše koje sadrže ćelije raka, inficirane ćelije i/ili hematološke ćelije. U određenim primerima izvođenja, citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje ćelija raka u smeši različitih tipova ćelija. U nekim primerima izvođenja, citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje specifičnih ćelijskih tipova u smeši različitih tipova ćelija, kao što su tkiva pre transplantacije. U nekim primerima izvođenja, citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje specifičnih ćelijskih tipova u mešavini ćelijskih tipova, kao što je materijal tkiva pre primene u terapeutske svrhe. U nekim primerima izvođenja, citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za selektivno ubijanje ćelija zaraženih virusima ili mikroorganizmima ili na drugi način selektivno ubijanje ćelija koje eksprimiraju određeni ekstraćelijski ciljni biomolekul, kao što je biomolekul površinske ćelije. Citotoksični proteini i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska imaju različite primene, uključujući npr. upotrebu u iscrpljivanju neželjenih tipova ćelija iz tkiva bilo in vitro ili in vivo, upotrebu u modulaciji imunih odgovora za lečenje transplantata u odnosu na domaćina, upotrebu kao antivirusnih agenasa, upotrebu kao anti-parazitskih agenasa i upotrebu u pročišćavanju tkiva za transplantaciju neželjenih ćelijskih tipova.

U određenim primerima izvođenja, citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska, sam ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjima ili farmaceutskim kompozicijama, može pokazati snažnu aktivnost ubijanja ćelija kada se daje populaciji ćelija, in vitro ili in vivo kod subjekta kao što je kod pacijenta u potrebi za lečenjem. Ciljanjem isporuke enzimatski aktivnih regiona Shiga toksina koristeći vezujuće regione imunoglobulinskog tipa visokog afiniteta za ćelije kancera određene ćelije raka, neoplastične ćelije, maligne ćelije, nemaligne ćelije tumora ili inficirane ćelije.

Predmetno otkriće obezbeđuje postupak ubijanja ćelije kod pacijenta, pri čemu postupak obuhvata korak davanja pacijentu najmanje jednog citotoksičnog proteina predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije.

Određeni primeri izvođenja citotoksičnog proteina ili njegovih farmaceutskih kompozicija mogu da se koriste za ubijanje ćelije kancera kod pacijenta ciljanjem ekstraćelijskog biomolekula koji je pronađen fizički povezan za ćeliju kancera ili tumora. Izrazi "ćelija kancera" ili "kancerska ćelija" odnose se na različite neoplastične ćelije koje rastu i dele se na nenormalno ubrzan način i biće jasne stručnoj osobi. Izraz ćelija kancera uključuje i maligne i nemaligne ćelije. Uopšteno, karcinom i/ili tumori mogu se definisati kao oboljenja, poremećaji ili stanja koja podležu lečenju i/ili prevenciji. Kanceri i tumori (maligni ili nemaligni) koji se sastoje od ćelija kancera i/ili ćelija tumora biće jasni stručnjaku.

Određeni primeri izvođenja citotoksičnog proteina ili njegovih farmaceutskih kompozicija mogu se koristiti za ubijanje imunoloških ćelija (bilo zdravih ili malignih) kod pacijenta ciljanjem ekstraćelijskog biomolekula koji je fizički povezana sa imunološkom ćelijom.

Određeni primeri izvođenja citotoksičnog proteina ili njegovih farmaceutskih kompozicija mogu se koristiti za ubijanje inficirane ćelije kod pacijenta ciljajući ekstraćelijski biomolekul koji je fizički povezana sa inficiranom ćelijom.

U obimu predmetnog pronalaska je upotreba citotoksičnog proteina pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije za potrebe ex vivo iscrpljivanja T ćelija iz izolovane ćelijske populacije uklonjene iz pacijenta. U jednom neograničavajućem primeru, citotoksični protein može da se koristi u postupku za profilaksu odbacivanja transplantacije organa gde je donorski organ perfuziran pre transplantacije citotoksičnim proteinom pronalaska ili njegovom farmaceutskom kompozicijom u cilju pročišćavanja organa donora T-ćelije.

Takođe je u okviru predmetnog pronalaska upotreba citotoksičnog proteina pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije za pročišćavanje populacija ćelija pacijenta (npr. koštane srži) od malignih, neoplastičnih ili na drugi način neželjenih T-ćelija, a zatim ponovno ubrizgavanje materijal koji troši T-ćelije na pacijenta.

Takođe je u okviru predmetnog pronalaska upotreba citotoksičnog proteina pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije u svrhu iscrpljivanja T-ćelija iz populacije ćelija donora kao profilaksa protiv oboljenja transplantata protiv domaćina i indukcije tolerancije, u pacijentu koji će biti podvrgnut transplantaciji koštane srži i/ili matičnih ćelija.

Određeni primeri izvođenja citotoksičnog proteina ili njihovih farmaceutskih kompozicija mogu se koristiti za ubijanje zaražene ćelije kod pacijenta ciljajući ekstraćelijski biomolekul koji je fizički povezan sa zaraženom ćelijom.

Dodatno, predmetno otkriće obezbeđuje postupak lečenja oboljenja, poremećaja ili stanja kod pacijenta koji obuhvata korak primene pacijentu kome je potrebna terapeutski efikasna količina najmanje jednog citotoksičnog proteina pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije.

Posmatrana oboljenja, poremećaji i stanja koja se mogu lečiti ovom metodom uključuju karcinom, maligni tumor, nemaligni tumor, imuni poremećaji i mikrobne infekcije. Primena "terapeutski efikasne doze" jedinjenja pronalaska može rezultirati smanjenjem težine simptoma oboljenja, povećanjem učestalosti i trajanja perioda bez simptoma oboljenja ili prevencijom oštećenja ili invaliditeta zbog neželjene bolesti.

Terapeutski efikasna količina jedinjenja predmentog pronalaska će zavisiti od načina primene, vrste sisara koji se leči i fizičkih karakteristika konkretnog pacijenta koji se razmatra. Ovi faktori i njihov odnos prema određivanju ovog iznosa dobro su poznati iskusnim stručnjacima iz medicinske oblasti. Ova količina i način davanja mogu se prilagoditi tako da postignu optimalnu efikasnost, a mogu zavisiti od faktora kao što su težina, ishrana, istovremeni lekovi i drugi faktori, dobro poznati stručnjacima u medicini. Veličine doze i režim doziranja koji su najprikladniji za ljudsku upotrebu mogu se voditi rezultatima dobijenim predmetnim pronalaskom i mogu biti potvrđeni u pravilno projektovanim kliničkim ispitivanjima. Efikasan protokol doziranja i lečenja može se odrediti uobičajenim načinima, počevši od male doze kod laboratorijskih životinja, a zatim povećavajući dozu tokom praćenja dejstva, a takođe i sistematski menjati režim doziranja. Brojni faktori mogu se uzeti u obzir od strane lekara prilikom određivanja optimalne doze za određeni subjekt. Takva razmišljanja su poznata stručnjaku.

Prihvatljiv način primene može se odnositi na bilo koji način primene poznat u oblasti tehnike, uključujući, ali ne ograničavajući se na aerosol, enteral, nazalni, oftalmološki, oralni, parenteralni, rektalni, vaginalni ili transdermalni (npr. lokalno davanje kreme, gela ili masti ili preko transdermalnog flastera). "Parenteralna primena" je obično povezana sa injekcijom na ili u komunikaciji sa predviđenim mestom dejstva, uključujući intratumoralnu injekciju, infraorbitalnu, infuziju, intraarterijsku, intrakapsularnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intrapulmonarnu, intraspinalnu, intrasternalnu, intratekularnu, intrauterinsku, intravenska, subarahnoidna, subkapsularna, potkožna, transmukozna ili transtrahealna primena.

4

Za primenu farmaceutske kompozicije pronalaska, raspon doza će generalno biti od oko 0.0001 do 100 mg / kg, i češće od 0.01 do 5 mg / kg, težine tela domaćina. Primeri doziranja mogu biti 0.25 mg / kg telesne težine, 1 mg / kg telesne težine, 3 mg / kg telesne težine, 5 mg / kg telesne težine ili 10 mg / kg telesne težine ili unutar raspona od 1-10 mg / kg. Primer režima lečenja je davanje jednom ili dva puta dnevno, ili jednom ili dva puta nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom mesečno, jednom u dva ili tri meseca ili jednom u tri do 6 meseci. Doziranje može da odabere i prilagodi lekar po potrebi kako bi se maksimizirala terapijska korist za određenog pacijenta.

Farmaceutske kompozicije pronalaska će se tipično davati istom pacijentu u više navrata.

Intervali između pojedinih doza mogu biti, na primer, 2-5 dana, nedeljno, mesečno, svaka dva ili tri meseca, svakih šest meseci ili godišnje. Intervali između davanja takođe mogu biti neredovni, zasnovani na regulisanju nivoa u krvi ili drugim markerima kod subjekta ili pacijenta. Režimi doziranja za jedinjenje pronalaska uključuju intravensku primenu 1 mg / kg telesne težine ili 3 mg / kg telesne težine sa jedinjenjem koje se daje svake dve do četiri nedelje tokom šest doza, zatim svaka tri meseca u telesnoj težini od 3 mg / kg ili 1 mg / kg telesne težine.

Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se primeniti preko jednog ili više načina primene, koristeći jedan ili više različitih postupaka poznatih u stanju tehnike. Kao što će znati stručno lice, put i/ili način davanja će se razlikovati u zavisnosti od željenih rezultata.

Putevi davanja citotoksičnih proteina ili farmaceutskih kompozicija pronalaska uključuju, npr. intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, potkožni, spinalni ili drugi parenteralni putevi primene, na primer injekcijom ili infuzijom na ili u komunikaciji sa predviđenim mestom dejstva (npr. intratumumoralna injekcija). U drugim primerima izvođenja, citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija pronalaska mogu se primeniti ne-parenteralnim putem, kao što su topikalni, epidermalni ili mukozni način primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili lokalno.

Terapeutski citotoksični proteini ili farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se primeniti sa jednim ili više različitih medicinskih uređaja poznatih u stanju tehnike. Na primer, u jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska može se primeniti sa injekcijskim uređajem za injekcije bez igala. Primeri dobro poznatih implantata i modula korisnih u ovom pronalasku su u oblasti tehnike, uključujući npr. implantabilne mikro-infuzione pumpe za isporuku sa kontrolisanom brzinom; uređaji za ordiniranje kroz kožu; infuzione pumpe za isporuku sa preciznom brzinom infuzije; uređaji za infuziju sa varijabilnim protokom za kontinuirano davanje lekova; i osmotski sistemi za isporuku lekova. Ovi i drugi takvi implantati, sistemi za isporuku i moduli poznati su stručnjacima.

Citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija pronalaska mogu se primeniti sami ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih ili dijagnostičkih agenasa. Kombinovana terapija može da sadrži citotoksični protein pronalaska ili njegovu farmaceutsku kompoziciju kombinovanu sa najmanje jednim drugim terapeutskim agensom izabranim na osnovu određenog pacijenta, oboljenja ili stanja koje će se lečiti. Primeri drugih takvih agenasa uključuju, između ostalog, citotoksični, antikancerološki ili hemoterapijski agens, antiinflamatorni ili anti-proliferativni agens, antimikrobni ili antivirusni agens, faktore rasta, citokine, analgetik, terapeutski aktivan mali molekul ili polipeptid, jedno lančano antitelo, klasično antitelo ili njegov fragment, ili molekul nukleinske kiseline koji modulira jedan ili više signalnih puteva, i slični modulirajući terapeutici koji mogu dopuniti ili na drugi način biti korisni u terapijskom ili profilaktičkom režimu lečenja.

Lečenje pacijenta sa citotoksičnim proteinom ili farmaceutskom kompozicijom pronalaska pogodno vodi do ćelijske smrti ciljanih ćelija i/ili inhibicije rasta ciljanih ćelija. Kao takvi, citotoksični proteini pronalaska i njihove farmaceutske kompozicije, biće korisni u postupcima za lečenje različitih patoloških poremećaja u kojima bi ubijanje ili iscrpljivanje ciljanih ćelija moglo biti korisno, kao što su, između ostalog, karcinom, imuni poremećaji i inficirane ćelije. Predmetno otkriće pruža metode za suzbijanje ćelijske proliferacije i lečenje ćelijskih poremećaja, uključujući neoplazije, preaktivne B-ćelije i preaktivne T-ćelije.

U određenim primerima izvođenja, citotoksični proteini i farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se koristiti za lečenje ili sprečavanje karcinoma, tumora (malignih i nemalignih), imunih poremećaja i mikrobnih infekcija. U daljem aspektu, gornja ex vivo metoda može se kombinovati sa gornjom in vivo metodom za lečenje ili sprečavanje odbacivanja primalaca transplantacije koštane srži i postizanje imunološke tolerancije.

U određenim primerima izvođenja, predmetno otkriće pruža postupke za lečenje malignih oboljenja ili neoplazme i drugih karcinoma povezanih sa krvnim ćelijama kod sisara, kao što je čovek, pri čemu postupak obuhvata korak primene na subjekta kome je potrebna terapeutski efikasna količina citotoksičnog protein ili farmaceutske kompozicije pronalaska.

Citotoksični proteini i farmaceutske kompozicije pronalaska imaju različite primene, uključujući npr. upotrebu u uklanjanju neželjenih T-ćelija, primenu u modulaciji imunih odgovora za lečenje grafta prema domaćinu, upotrebu kao antivirusni agensi, upotrebu kao antimikrobni agensi i upotrebu u pročišćavanju transplantacijska tkiva neželjenih ćelijskih tipova. Citotoksični proteini i farmaceutske kompozicije pronalaska su uobičajeni anti-neoplastični agensi - što znači da su sposobna za lečenje i/ili sprečavanje razvoja, sazrevanja ili širenja neoplastičnih ili malignih ćelija inhibiranjem rasta i/ili izazivanjem smrti karcinom ili tumorske ćelije.

U određenim primerima izvođenja, citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija pronalaska mogu se koristiti za lečenje oboljenja ili poremećaja posredovanih B ćelijama, plazmom ćelijama ili antitelom, kao što su na primer leukemija, limfom, mijelom, amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, Crohnova bolest bolest, dijabetes, odbacivanje transplantata, bolest transplantata protiv domaćina, Hashimotov tiroiditis, hemolitički uremički sindrom, oboljenja povezana sa HIV-om, lupusna eritematoza, multipla skleroza, poliarteritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni sindrom i vaskulitis.

U drugom aspektu, pojedini primeri izvođenja citotoksičnih proteina i farmaceutskih kompozicija pronalaska su antimikrobni agensi - što znači da su sposobna za lečenje i/ili sprečavanje sticanja, razvoja ili posledica mikrobioloških patogenih infekcija, kao što su izazvane sa virusima, bakterijama, gljivicama, prionima ili protozoama.

U obimu predmetnog pronalaska je obezbediti profilaksu ili lečenje oboljenja ili stanja posredovanih T-ćelijama ili B-ćelijama korišćenjem citotoksičnog proteina pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije, u svrhu sistematskog ubijanja T-ćelije ili B-ćelije kod pacijenta. Ova upotreba je kompatibilna sa pripremom ili kondicioniranjem pacijenta za transplantaciju koštane srži, transplantaciju matičnih ćelija, transplantaciju tkiva ili transplantaciju organa, bez obzira na izvor transplantiranog materijala, npr. ljudski ili neljudski izvori.

U obimu predmetnog pronalaska je da se obezbedi primalac koštane srži za profilaksu ili lečenje oboljenja domaćina protiv grafta putem ciljanog ubijanja T-ćelija domaćina korišćenjem citotoksičnog proteina ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska.

Citotoksični proteini i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu se koristiti u postupku lečenja kancera koji uključuje davanje pacijentu, kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine citotoksičnog proteina ili farmaceutske kompozicije predmentog pronalaska. U određenim primerima izvođenja predmentog pronalaska, kancer koji se leči je izabran iz grupe koja se sastoji od karcinoma kostiju (poput multiplog mijeloma ili Evingov sarkom), karcinoma dojke, kancera centralnog / perifernog nervnog sistema (poput kancera mozga, neurofibromatoze ili glioblastoma), karcinoma gastrointestinalnog sistema (kao što je kancer želuca ili kolorektalni karcinom), karcinom germskih ćelija (poput kancera jajnika i testisa), karcinom žlezde (kao što je kancer pankreasa, paratireoida, feokromocitom, karcinom pljuvačke ili štitne

4

žlezde), karcinom glave vrata (poput kancera nazofarinksa, oralnog karcinoma ili faringeksa), hematoloških karcinoma (poput leukemije, limfoma ili mijeloma), karcinoma bubrežnih i mokraćnih puteva (poput kancera bubrega i mokraćne bešike), karcinoma jetre, pluća / pleure (poput mezotelioma, karcinoma pluća malih ćelija ili karcinom pluća ne-malih ćelija), karcinoma prostate, sarkoma (poput angiosarkoma, fibrosarkoma, Kaposijevog sarkoma ili sinovijalnog sarkoma), karcinoma kože (kao karcinom bazalnih ćelija, skvamozni ćelijski karcinom ili melanom) i karcinom materice.

Citotoksični proteini i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu se koristiti u postupku lečenja imunog poremećaja koji obuhvata primenu na pacijenta, kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine citotoksičnog proteina ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, imuni poremećaj povezan je sa upalom povezane sa obolenjem odabranim iz grupe koja obuhvata amiloidozu, ankilozirajući spondilitis, astmu, Crohnovu bolest, dijabetes, odbacivanje transplantata, transplantat u odnosu na bolest domaćina, Hashimotov tiroiditis, hemolitički uremički sindrom, obolenja povezana sa HIV-om, eritematoza lupusa, multipla skleroza, poliarteritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vaskulitis.

Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska je citotoksični protein kao komponenta leka za primenu u lečenju ili prevenciji karcinoma, tumora, imunog poremećaja ili mikrobne infekcije. Na primer, imuni poremećaji koji se javljaju na koži pacijenta mogu se lečiti takvim lekom u nastojanju da smanje upalu. U drugom primeru, tumori kože se mogu lečiti takvim lekom u nastojanju da se smanji veličina tumora ili potpuno eliminiše tumor.

Među određenim primerima izvođenja predmetnog otkrića je postupak primene citotoksičnog proteina ili farmaceutske kompozicije pronalaska za obeležavanje ili otkrivanje unutrašnjosti ćelija kancera i / ili tipova imunih ćelija. Na osnovu sposobnosti citotoksičnih proteina i farmaceutskih kompozicija pronalaska da uđu u specifične ćelijske tipove i da se kreću kroz ćelije retrogradnim intracelularnim transportom, unutrašnji odeljci specifičnih ćelijskih vrsta obeleženi su za detekciju. To se može izvesti na ćelijama in situ kod pacijenta ili na ćelijama i tkivima uklonjenim iz organizma, npr. materijal za biopsiju.

Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima selektivnih citotoksičnih proteina koji sadrže efektorske regione Shiga toksine izvedene iz A Podjedinica članova porodice Shiga toksina i vezujućih regiona imunoglobulinskog tipa koji mogu da vezuju ekstraćelijske ciljane biomolekule fizički povezane sa određenom ćelijom vrste.

PRIMERI

Sledeći primeri pokazuju određene primere izvođenja predmetnog pronalaska. Međutim, treba razumeti da su ovi primeri samo radi ilustracije i ne nameravaju i ne treba ih tumačiti u potpunosti definitivno u pogledu uslova i obima ovog pronalaska, koji su definisani u zahtevima. Primeri su izvedeni korišćenjem standardnih tehnika, koje su dobro poznate i rutinske onima koji su stručni, osim ako je drugačije opisano u više detalja.

Sledeći primeri demonstriraju sposobnost primernih citotoksičnih proteina da selektivno ubijaju ćelije fizički spojene sa ekstracelularni ciljani biomolekul vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa. Primeri citotoksičnih proteina se vezuju za ciljane biomolekule izražene sa ciljanim ćelijskim tipovima i ulaze u ciljane ćelije. Internalizovani citotoksični proteini preusmerili su svoj efektorski region Shiga toksina u citozol radi neaktivacije ribozoma i posle toga prouzrokovali apoptotsku smrt ciljanih ćelija. Stoga su primerni citotoksični proteini sposobni da ciljaju specifične ćelijske tipove zahvaljujući njihovim vezujućim regionima imunoglobulinskog tipa dovodeći citotoksične proteine u neposrednu blizinu sa ćelijskim tipovima koji su fizički spojeni za ciljani biomolekulo vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa.

Jedno primerno izvođenje primera obuhvata fragment Podjedinice A Shiga toksina koji je kombinovan sa pojedinačnim lancem, varijabilnog fragmenta, vezujućeg regiona koji je sposban da se veže za CD38 visokog afiniteta. Ovaj primerni citotoksični protein je spsoban da selektivno ubije ćelije koje ekspresuju CD38 na njihovoj površini. Drugi primerni citotoksični protein obuhvata fragment Podjedinice A Shiga toksina koji je kombinovan sa pojedinačnim domenom fragmenta antitela, vezujući region sposoban da veže HER2 visokog afiniteta. Ovaj drugi primerni citotoskični protein je sposoban da selektivno ubije ćelije koje eskpresuju HER2 na njihovoj površini. Treći primerni primer izvođenja obuhvata fragment Podjedinice A Shiga toksina koji je kombinovan sa pojedinačnim domenom fragmenta antitela, vezujući region sposoban da veže CD20 visokog afiniteta. Ovaj treći primerni citotoskični protein je sposoban da selektivno ubije ćelije koje eskpresuju CD20 na njihovoj površini. Drugi primeri citotoskičnih proteina uključuju one sa vezujućim regionima koji ciljaju Epstein-Barr antigene, Leishmania antigene, neurotenzin receptore, receptore epidermalnog rastućeg faktora, i CCR5.

Primer 1. A CD38-ciljani, citotoskični protein izveden iz Podjedinice A Shiga-sličnog toksina-1 ("αCD38-scFv spojen sa SLT-1A")

4

Konstrukcija, Dobijanje, i Prečišćavanje Citotoksičnog Proteina "αCD38-scFv spojen sa SLT-1 A"

Prvo, efektorski region Shiga toksina i vezujući region imunoglobulinskog tipa su konstruisani ili selektovani. U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz podjedinice A Shigasličnog Toksina 1 (SLT-1 A). Polinukleotid je dobijen tako da enkodira amino kiseline 1-251 SLT-1 A (Cheung M et al, Mol Cancer 9: 28 (2010)). Vezujući region imunoglobulinskog tipa αCD38scFv je izveden iz monoklonskog antitela αCD38 HB7 (Peng et al, Blood 101: 2557-62 (2003); see also GenBank Accession BD376144, National Center for Biotechnology Information, U.S.) tako da je kreiran pojedinačni lanac varijabilnog fragmenta (scFv) sa dva varijabilna regiona imunoglobulina (VLi VH) odvojeni sa linkeron koji je poznat u tehnici.

Drugo, vezujući region imunoglobulinskog tipa i efektorski region Shiga toksina su povezani zajedno kako bi obrazovali spojeni protein. U ovom primeru, polinukleotid koji kodira efektorski region Shiga toksina koji sadrži amino ksieline 1-251 SEQ ID NO: 1 je kloniran u okvir sa polinukleotidom koji kodira linker izveden iz murinskog IgG3 molekula i u okvir sa polinukleotidom koji kodira vezujući region imunoglobulinskog tipa αCD38scFv koji sadrži amino kiseline 269-508 SEQ ID NO:4. U određenim eksperimentima, kodirajuća sekvenca pune dužine citotoksičnog proteina ovog primera počinje sa polinukleotidom koji kodira Strep-tag® kako bi se olakšala detekcija i prečišćavanje. Polinukleotidna sekvenca koja kodira citotoskični protein "αCD38-scFv spojen sa SLT-1 A" ovog primera je kodon optimizovan za efikasnu ekspresiju u E. coli koristeći usluge iz DNA 2.0, Inc. (Menlo Park, CA, U.S.).

Treće, fuzioni protein je dobijen ekspresijom polinukleotida koji kodira citotoksični protein αCD38-scFv spojen sa SLT-1 A. Ekspresija "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1 A" citotoksičnog proteina (SEQ ID NO:4) je ostvarena upotrebom oba sistema za prevođenje proteina bez bakterija i bez ćelija.

U ovom primeru "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1A" proizvedenog od strane E. coli ekspresionim sistemom, polinukleotid "ubačene" sekvence koja kodira "αCD38-scFv spojen sa SLT-1A" je kloniran u pTxbl vektor (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) koristeći standardnu proceduru za proizvodnju polinukleotidne sekvence koja kodira citotoksični protein αCD38-scFv spojen sa SLT-1 A" vezan za okvir polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju ceo amino terminal vektora. Polinukleotidna sekvenca za ubacivanje plazmida je verifikovana od strane Sanger sekvencioniranja (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.) i transformisana u T7 Shuffle® ćelije (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). "αCD38-scFv spojen sa SLT-1A" protein je dobijen i prečišćen prema IMPACT™ (Intein Mediated Purification with an Affinity

4

Chitin-binding Tag) sistemskom uputstvu (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). Prečišćavanje je izvršeno korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici, kao što je korišćenje imobilisanih ciljeva Strep-tag® ili vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa.

U ovom primeru "αCD38-scFv spojen sa SLT-1A" proizvodnja od strane slobodne ćelije, translacionog sistema proteina, polinukleotidne "ubačene" sekvence koja kodira "αCD38-scFv spojen sa SLT-1A" je kloniran u pIVEX2.3 vektor sa stop kodonom direktno posle kodiranja regiona koristeći In-Fusion® HD Klonirajući Opremu (Clonetech, Mountain View, CA, U.S.) prema instrukcijama proizvođDča. Polinukleotidna sekvenca za ubacivanje plazmida je verifikovana od strane Sanger sekvencioniranja (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.). αCD38-scFv spojen sa SLT-1 A" protein je dobijen koristeći sistem brze 5 Prime™ RTS 100 E. coli Disulfide Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD, U.S.) prema instrukcijama proizvođDča.

Prečišćavanje je izvršeno korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici, kao što je korišćenje imobilisanih ciljeva Strep-tag® ili vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa.

Određivanje Maksimalnog Specifičnog Vezivanja (Bmax) i Konstante Ravnoteže Vezivanja (KD) αCD38-scFv spojen sa SLT-1A" Vezujućih Ciljanih Tipova ûelije

Vezujuće karakteristike "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1A" proteina proizvedenog kao što je prethodno opisano su određene analizom protočne citometrije zasnovanoj na florescenciji. Uzorci koji sadrže CD38 pozitivne (+) ćelije i CD38 negativne (-) ćelije su suspendovane u fosfatnom pufernom slanom rastvoru (1X PBS) (Hyclone Brand, Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.) koji sadrži 1 procenat goveđeg seruma albumina (BSA) (Calbiochem, San Diego, CA, U.S.), u daljem tekstu "1X PBS+1%BSA" inkubirane na 1 sat na 4 stepena Celzijusa (°C) sa 100 µL raznih razblaženja "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1A" protein kako bi se analiziralo. Najveće koncentracije "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1 A" proteina su selektovane kako bi dovele do zasićenja reakcije vezivanja. Posle jedno časovne inkubacije, uzorci ćelije su isprani dva puta sa 1X PBS+1%BSA. Uzorci ćelije su inkubirani 1 sat na 4°C sa 100 µL 1X PBS+1%BSA koji sadrži 0.3 µg Strep-tag® mAb-FITC (# A01736-100, Genscript, Piscataway, NJ, U.S.).

Uzorci ćelije su potom isprani svaki put sa 1X PBS+1%BSA, resuspendovane u 200 µL 1X PBS i nanete na protočnu citomertiju zasnovanu na fluorescenciji. Podatak srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) za sve uzorke je dobijen prikupljanjem podataka koristeći samo FITC uzorak kao negativna kontrola. Grafikoni su crtani od MFI nasuprot "koncentraciji ćelija" koristeći Prism softver (GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.). Korišćenje Prism softverske funkcije za vezivanje na jednom mestu [Y = BMAX*X / (KD+ X)] pod naslovom vezivanje-

4

zasićenost, Bmaxi KDsu izračunati koristeći osnovne korigovane podatke. Bmaxje maksimum specifičnog vezivanja prijavljenog u MFI. KDje konstanta ravnoteže vezivanja, prijavljena u nanomolima (nM).

Bmaxza "αCD38-scFv spojen sa SLT-1A" vezan za CD38+ ćelije je izmeren da bude oko 100,000 MFI sa KDod oko 13 nM (Tabela 1), dok nije bilo vezivanja za CD38- ćelije posmatrane u ovoj analizi.

Tabela 1. Vezujuće karakteristike: Reprezentativne vrednosti Bmaxi KDza primerne citotksične proteine

Određivanje Polovine Maksimalne Inhibicijske Koncentracije (IC50) "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1 A" na Eukariotske Ribozome in vitro

Sposobnost inaktivacije ribozoma "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1 A" je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro translacionoj analizi proteina koristeći TNT® Brza Spojena Transkripciona/ Translaciona Oprema (L1170 Promega, Madison, WI, U.S.). Oprema uključuje Luciferase T7 Kontrolni DNK i TNT® Brz Master Mix. Reakcija aktivnosti ribozoma pripremljena je u skladu sa uputstvima proizvođDča da se naprave “TNT“ reakcione smeše.

Serija 10-puta razblaženja "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1A" koja treba da se testira je pripremljena u odgovarajućem puferu, a serije identičnih komponenata TNT reakcione smeše je kreirana za svako razblaženje "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1A." Svaki uzorak u razblaženoj seriji "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1 A" proteina je kombinovan sa svakom TNT reakcionom smešom zajedno sa Luciferase T7 Kontrolnom DNK. Testni uzorci su inkubirani na 1.5 sat na 30°C. Posle inkubacije, Luciferase Reagens Analize (E1483 Promega, Madison, WI, U.S.) je dodat u sve testne uzorke, a količina luciferase proteinske translacije je izračunata sa luminiscencijom prema instrukcijama proizvođDča. Nivo translacione inhibicije određen je nelinearnom regresijskom analizom log-transformisanih koncentracija ukupnog proteina nasuprot relativnim jedinicama luminiscencije. Korišćenje statističkog softvera (GraphPad

4

Prism, San Diego, CA, U.S.), vrednost polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) izračunata je za svaki uzorak. Potom, podaci su normalizovani računanjem "procenta SLT-1 A-samo kontrolnog proteina" koristeći Prism softversku funkciju log(inhibitor) vs. odgovor (tri parametera) [Y = Bottom ((Top-Bottom) / (1+10^(X-LogIC50)))] ispod naslova doza-odgovorinhibicija. IC50za eksperimentalne proteine i SLT-1 A-samo kontrolnog proteina su izračunati. Procenat SLT-1 A-samo kontrolnog proteina je izračunat sa [(IC50SLT-1 A kontrolni protein / IC50eksperimentalni protein) x 100].

Inhibicijski efekat "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1A" na sintezu proteina bez ćelija je bio jak. Eksperimenti zavisnosti od doze utvrdili su da IC50"αCD38-scFv spojen sa SLT-1 A" na sintezu proteina u ovim analizama bez ćelije je oko 14 pikomola (pM) ili unutar 10% SLT-1 A-samo pozitivne kontrole (Tabela 2).

Tabela 2. Ribozomska Inaktivacija: Reprezentativne polu-maksimalne inhibicione koncentracije (IC50) za primerne citotoksične proteine

Određivanje Selektivne Citotoksičnosti i Polu-Maksimalna Citotoksična Koncentracija (CD50) αCD38-scFv spojenog sa SLT-1 A" Korsiteći Analizu Ubijanja Ćelije

Citotoksične karakteristike "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1A" su određene sledećom analizom ubijanja ćelije. Ovim testom određuje se sposobnost citotoksičnog proteina da ubije ćelije koje eksprimiraju ciljane biomolekule njegovog vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa u poređenju sa ćelijama koje ne izražavaju ciljani biomolekul. ûelije su postavljene (2 x 103 po bunarčLću) u 20 µL mediijumu u 384 bunarčLća na pločama. "αCD38-scFv spojen sa SLT-1A" protein je razblažen ili petostruko ili desetostruko u 1X PBS i dodato je 5 µL razblaženja ćelijama. Kontrolni bunarčLći koji sadrže samo medijum su korišćeni za osnovnu korekciju. Uzorci ćelije su inkubirani sa "αCD38-scFv spojen sa SLT-1A," ili samo sa puferom, na 3 dana na 37°C i u atmosferi od 5% ugljen dioksida (CO2). Ukupni opstanak ćelija ili procentna održivost određena je korišćenjem luminescentnog očitavanja korišćenjem CellTiter-Glo® Testa Vitalnosti Luminescentne ûelije (G7573 Promega Madison, WI, U.S.) prema instrukcijama proizvođDča. Procenat vitalnosti eksperimentalnih bunarčLća je izračunat korišćenjem sledeće

4

jednačine: (Test RLU – Prosečni Medijum RLU) / (Prosečne ûelije RLU – Prosečni Medijum RLU) * 100. Log polipeptidne koncentracije versus Procentne Viabilnosti je ucrtano u Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.) a log (inhibitor) vs. normalizovani odgovor (promenljivi nagib) anlizom je korišćena za određivanje vrednosti polu-maksimalne koncentracije citotoksika (CD50) za "αCD38-scFv spojenog sa SLT-1 A."

Eksperimenti zavisnosti od doze utvrdili su da CD50"αCD38-scFv spojenog sa SLT-1 A" proteina je oko 0.2-0.7 nM za CD38 ćelije u zavisnosti od ćelijske linije kada se poredi sa 470 nM za CD38- ćelijsku liniju, koja je slična za CD50za SLT-1A-samo negativnu kontrolu (Tabela 3; Slika 2). CD50"αCD38-scFv spojen sa SLT-1 A" je oko 700-3000 puta veća (manja citotoskičnost) za ćelije koje nisu fizički spojene za esktraćelijski ciljani biomolekul CD38 kada se poredi sa ćelijama koje su fizički spojene za esktraćelijski ciljani biomolekul CD38, npr. ćelijske linije koje ekspresuju CD38 na njihovoj površini.

Tabela 3. Selektivna Citotoskičnost: Reprezentativne polu-maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za αCD38-scFv spojen sa SLT-1A

Primer 2. HER2-ciljani, citotoksični protein izveden iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (αHER2-VHHspojen sa SLT-1A)

Konstrukcija, Dobijanje, i Prečišćavanje "αHER2-VHHspojenog sa SLT-1 A"

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A). Polinukleotid je odobijen tako da kodira amino kiseline 1-251 SLT-1 A (Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010)). Vezujući region imunoglobulinskog tipa je αHER2 VHHizveden iz pojedinačnog domena varijabilnog regiona kamiljeg antitela (VHH) protein 5F7, kao što je opisano u Objavljenoj U.S. Patentnoj Prijavi 2011/0059090.

Drugo, vezujući region imunoglobulinskog tipa i efektorski region Shiga toksina su povezani zajedno kako bi obrazovali spojeni protein. U ovom primeru, polinukleotid koji kodira αHER2VHHvarijabilni region izveden iz proteina 5F7 koji sadrži amino kiseline 1-119 SEQ ID NO: 5 je kloniran u okvir sa polinukleotidom koji kodira linker koji je poznat u tehnici i u okvir sa polinukleotidom koji kodira efektorski region Shiga toksina koji sadrži amino kiseline 1-251 SEQ ID NO: 1. U određenim eksperimentima, kodirajuća sekvenca pune dužine citotoksičnog proteina ovog primera počinje sa polinukleotidom koji kodira Strep-tag® kako bi se olakšala detekcija i prečišćavanje. Polinukleotidna sekvenca koja kodira citotoksični protein "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" ovog primera je kodon optimizovan za efikasniju ekspresiju u E. coli koristeći usluge iz DNA 2.0, Inc. (Menlo Park, CA, U.S.).

αHER2-VHHspojen sa SLT-1A" fuzioni protein (SEQ ID NO: 5) je proizveden sa ekspresijom iz polinukleotida koji ga kodiraju. Ekspresija "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" citotoskičnog proteina je ostvarena upotrebom oba sistema za prevođenje proteina bez bakterija i bez ćelija.

U ovom primeru "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" proizveden sa E. coli ekspresionim sistemom, polinukleotidna "ubačena" sekvenca koja kodira "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" je klonirana u pTxb1 vektor (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) koristeći standardne postupke za proizvodnju polinukleotidne sekvence koja kodira citotoksični protein "αHER2-VHHspojen za SLT-1 A" vezan za okvir u polinukleotidnoj sekvenci koja kodira amino-terminalnu celinu vektora. Polinukleotidna sekvenca plazmidnog umetka verifikovana je Sanger sekvenciranjem (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.) i transformisana u T7 Shuffle® ćelije (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" protein je dobijen i proizveden prema IMPACT™ (Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag) sistemskom uputstvu (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). Pročišćavanje je izvršeno korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici, kao što je korišćenje imobilizovanih ciljeva Strep-tag® ili vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa.

U ovom primeru " αHER2-VHHspoje sa SLT-1 A" proizvodnja sa slobodnom ćelijom, proteinskim translacionim sistemom, polinukleotidnom "ubačenom" sekvencom koja kodira αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" je kloniran u pIVEX2.3 vektor sa stop kodonom direktno posle kodiranja regiona koristeći In-Fusion® HD Klonirajuću Opremu (Clonetech, Mountain View, CA, U.S.) prema instrukcijama proizvođDča. Polinukleotidna sekvenca plazmidnog umetka verifikovana je Sanger sekvenciranjem (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.). "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" protein je proizveden koristeći ubrzani translacioni sistem 5 Prime™ RTS 100 E. coli Disulfidna Oprema (5 Prime, Gaithersburg, MD, U.S.) prema instrukcijama proizvođDča. Pročišćavanje je izvršeno korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici, kao što je korišćenje imobilizovanih ciljeva Strep-tag® ili vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa.

1

Određivanje Maksimalnog Specifičnog Vezivanja (Bmax) i Konstante Ravnoteže Vezivanja (KD) αHER2-VHHspojenog sa SLT-1 A" za Ciljani ûelijski Tip

Vezujuće karakteristike "αHER2-VHHspojen sa SLT-1A" proteina dobijen kao što je prethodno opisano su određene sa analizom protočne citometrije na bazi fluorescencije. Uzorci koji sadrže HER2 pozitivne (+) ćelije i HER2-negativne (-) ćelije su suspendovani u 1X PBS+1%BSA i inkubirani na 1 sat na 4°C sa 100 µL raznih razblaženja "αHER2-VHHspojen sa SLT-1A" proteina koji se analiziraju. Najveće koncentracije "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" proteina su selektovane da vode do zasićenja vezujuće reakcije. Posle jedno časovne inkubacije, uzorci ćelije su isprani dva puta sa 1X PBS+1%BSA. Uzorci ćelije su inkubirani na 1 sat na 4°C sa 100 µL 1X PBS+1%BSA koji sadrži 0.3 µg αStrep-tag® mAb-FITC (# A01736-100, Genscript, Piscataway, NJ, U.S.).

Uzorci ćelije su potom isprani dva puta sa 1X PBS+1%BSA, resuspendovani u 200 µL 1X PBS i podvrgnuti protočnoj citometriji na bazi fluorescencije. Podatak srednje vrednosti fluorescentnog intenziteta (MFI) za sve uzorke je dobijen dobijajući podatak koristeći FITC-samo uzorka kao negativna kontrola. Grafikoni su prikazani pomoću MFI nasuprot "koncentraciji ćelija" koristeći Prism softver (GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.). Koristeći Prism softver funkciju vezivanja za jedno mesto [Y = Bmax*X / (KD+ X)] ispod naslova vezivanje-zasićenje, Bmaxi KDsu izračunati koristeći osnovni korigovani podatak. Bmaxje maksimalno specifično vezivanje prijavljeno u MFI. KDje konstanta ravnoteže vezivanja, prijavljeno u nM.

Bmaxza "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" vezan za HER2+ ćelije je izmeren da bude oko 110,00 MFI sa KDod oko 2.4 nM (Tabela 1); pri čemu je Bmax za "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" vezan za HER2- ćelije izmeren da bude oko 12,000 MFI sa KDod oko 810 nM (Tabela 1).

Određivanje Polu Maksimalne Inhibicione Koncentracije (IC50) "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" Eukariotskih Ribozoma in vitro

Sposobnost ribozomske neaktivnosti "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro analizom proteinske translacije korišćenjem Opreme TNT® Brze Spojene Transkripcije/Translacije (LI 170 Promega, Madison, WI, U.S.). Oprema obuhvata Luciferase T7 Kontrolni DNK i TNT® Brzu Master Smešu. Reakcija aktivnosti ribozoma je pripremljena prema instrukcijama proizvođDča kako bi se napravila "TNT" reakciona smeša.

Serije od desetostrukog razblaženja "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" koje treba da se testiraju su pripremljene u odgovarajućem puferu, a serije identičnih komponenti TNT reakcione smeše

2

su napravljeni od svakog razblaženja "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A." Svaki uzorak u razblaženim serijama "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" proteina je kombinovan sa svakom TNT reakcionom smešom zajedno sa Luciferase T7 Kontrolnim DNK. Testirani uzorci su inkubirani 1.5 sat na 30°C. Posle inkubacije, Luciferase Reagens Analize (E1483 Promega, Madison, WI, U.S.) je dodat svim testiranim uzorcima, a količina luciferase proteinske translacije je izmerena sa luminiscencijom prema proizvođačevim instrukcijama. Nivo translacione inhibicije određen je nelinearnom regresijskom analizom log-transformisanih koncentracija ukupnog proteina u odnosu na relativne jedinice luminescence. Koristeći statistički softver (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.), vrednost polovine maksimalne inhibicione koncentracije (IC50) je izračunata za svaki uzorak. Zatim su podaci normalizovani izračunavanjem vrednosti "procenat SLT-1 A-samo kontrolnog proteina" koristeći Prism softversku funkciju log(inhibitor) vs. odgovor (tri parametra) [Y = Bottom ((Top-Bottom) / (1+10^(X-LogIC50)))] ispod naziva doza-odgovorinhibicija. IC50za eksperimentalne proteine i SLT-1 A-samo pozitivni kontrolni protein su izračunati. Procenat SLT-1 A-samo pozitivnog kontrolnog proteina je izračunata sa [(IC50SLT-1 A kontrolni protein / IC50eksperimanetalni protein) x 100].

Inhibicioni efekat "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" na sintezi proteina bez ćelija je bio jak.

Eksperimenti dozne zavisnosti IC50" αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" na sisntezi proteina u ovoj analizi slobodne ćelije su bili oko 13 pM ili slična SLT-1 A-samo pozitivno kontrolnoj (Tabela 2).

Određivanje Selektivne Citotoksičnosti i Polu Maksimalne Citotoskične Koncentracije (CD50) αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" Koristeći Analizu Ubijanja ûelije

Citotoksične karakteristike "αHER2-VHHspojen sa SLT-1A" su određene sledećom analizom ubijanja ćelije. Ova analiza određuje kapacitet citotoksičnog proteina da ubije ćelije koje iskazuju ciljani biomolekuli njegovog vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa kada se poredi sa ćelijama koje ne iskazuju ciljane biomolekule. ûelije su postavljene (2 x 103 po bunarčLću) u 20 µL medijumu u 384 bunarčLća na pločama. "αHER2-VHHspojen sa SLT-1A" protein je razblažen petostruko ili desetostruko u 1X PBS i 5 µL razblaženja je dodato ćelijama. Kontrolni bunarčLći koji sadrže samo medijum su korišćeni za osnovnu korekciju. Uzorci ćelije su inkubirani sa "αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A," ili samo sa puferom, na 3 dana na 37°C i na atmosferi od 5% CO2. Ukupni opstanak ćelija ili procentna održivost su određeni korišćenjem luminescentnog očitavanja korišćenjem CellTiter-Glo® Testa vitalnosti luminescentne ćelije (G7573 Promega Madison, WI, U.S.) prema instrukcijama proizvođača. Procenat vitalnosti eksperimentalnih bunarčLća izračunat je pomoću sledeće jednačine: (Test RLU – Prosečni Medijum RLU) / (Prosečne ûelije RLU – Prosečni Medijum RLU) * 100. Log koncentracije polipeptida versus Procenat Vijabilnosti je iscrtan u Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.), a analiza log (inhibitor) vs. normalizovani odgovor (varijabilni nagib) je korišćena za određivanje vrednosti polu maksimalne citotoskične koncentracije (CD50) za "αHER2-VHHspojen sa SLT-1A."

Eksperimenti dozne zavisnosti su odredili da je CD50"αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A" proteina oko 15 nM za HER2 ćelijsku liniju kada se poredi sa oko 1700 nM za HER2- ćelijsku liniju (Tabela 4; Slika 3). CD50"αHER2-VHHspojen sa SLT-1A" proteina je oko 110 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje nisu fizički spojene sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom HER2 kada se poredi sa ćelijama koje su fizički spojene sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom HER2, npr. ćelijska linija koja ekspresuje HER2 na njegovoj ćelijskoj površini.

Tabela 4. Selektivna Citotoskičnost: Reprezentativne polu maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za αHER2-VHHspojen sa SLT-1 A

Primer 3. CD20-ciljani, citotoskični protein izveden iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (αCD20-scFv spojen sa SLT-1A)

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz podjedinice A Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A). Vezujući region imunoglobulinskog tipa αCD20-scFv je konstruisan kao rekombinant scFv izveden iz 1H4 CD20 monoklonalnog antitela (Haisma et al. (1999), Blood 92: 184-90), koji sadrži vezujući region imunoglobulinskog tipa sposoban da vezuje humani CD20. Ovi heterologni regioni su kombinovani kako je gore opisano u Primerima 1-2. Ukratko, polinukleotid koji kodira rekombinantni scFv izveden iz 1H4 CD20 monoklonalnog antitela kloniran je u okviru sa polinukleotidnim derivatom koji kodira „murinski hinger“ iz murinskog IgG3 molekula i u okviru sa polinukleotidnim kodiranjem SLT-1 A (ostaci 1-251 SEQ ID NO:1). Različiti CD20-ciljani citotoksični protein, "αCD20scFv spojen sa SLT-1 A" verzija 2 je konstruisan i proizveden na sličan način koji se samo razlikuje u vezujućem regionu između αCD20-scFv i SLT1-A izveden iz efektorskog regiona Shiga toksina. Ekspresija obe verzije αCD20-scFv spojen sa SLT-1 A" citotoskičnog proteina je postignuta korišćenjem ili bakterijskih i/ili slobodnih ćelija, proteinskih translacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.

Karakteristike vezivanja ćelija citotoksičnog proteina "αCD20scFv spojen sa SLT-1 A" određuje se testom protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji kao što je opisano u Primerima 1-2.

4

Tokom više eksperimenata, KD"αCD20-scFv spojen sa SLT-1 A" za Raji (CD20+) ćelije je određen da bude oko 80-100 nM. U jednom eksperimentu, Bmaxza "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" je izmeren da bude oko 140,000 MFI sa KDod oko 83 nM, sa obzirom da u ovom testu nije primećeno značajnije vezivanje za CD20-ćelije (Tabela 1).

Inhibiciona efikasnost "αCD20-scFv spojen sa SLT-1 A" na sintezi slobodne ćelije je bila jača. Više eksperimenata utvrdilo je da IC50"αCD20-scFv spojen sa SLT-1 A" je oko 50 pM. U jednom eksperimentu, IC50"αCD20-scFv spojen sa SLT-1 A" na sintezi proteina je oko 38 pM ili u okviru 19% SLT-1 A-samo pozitivne kontrole (Tabela 2).

Citotoksični proteini "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" su određeni testom ćelijskog ubijanja kao što je opisano u Primerima 1-2, ali ciljajući CD20 ćelije. Tokom više eksperimenata, "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" pokazao je ubijanje ćelija specifičnih za CD20 sa 10 do 1000 puta specifičnošću u poređenju sa ubijanjem ćelija negativnih ćelijskih linija CD20. CD50"αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" proteina je izmereno da je oko 3-70 nM za CD20+ ćelije, u zavisnosti od ćelijske linije, kada se poredi sa preko 600-2,000 za CD20- ćelijske linije (Tabela 5). CD50αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" protein je oko 100 do 400 puta veći (manja citotoksičnost) za ćelije koje nisu fizički povezane sa ekstraćelijskim ciljanim CD20 u poređenju sa ćelijama fizički spojenim sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom CD20.

Tabela 5. Selektivna Citotoksičnost: Reprezentativne polu maksimalne citotksične koncentracije (CD50) za αCD20-scFv spojen sa SLT-1 A

Određivanje Ciljane Citotoksičnosti Citotoksičnog Proteina Korišćenjem in vivo Studija Ksenografta

Dva modela ksenografta zasnovana na imuno kompromitiranim sojevima miša korišćena su za proučavanje sposobnosti citotoksičnih proteina "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzije 1 i 2 da ubiju CD20 tumorske ćelije in vivo i u okruženju tumora tokom vremena i za različite doze. Ovi sistemi ksenografta modela oslanjaju se na dobro okarakterisane sojeve miša kojima nedostaju reakcije grafta naspram domaćina, pored ostalih nedostataka imunog sistema. Prvo, proučavan je intravenski model tumora korišćenjem SCID (teški kombinovani imuni deficit) da bi se stvorili diseminovani tumori širom miševa u cilju testiranja in vivo efekata "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" na humanim tumorskim ćelijama. Drugo, model potkožnog tumora proučavan je korišćenjem BALBc/golih miševa da bi se stvorili potkožni tumori na miševima, ponovo u cilju testiranja in vivo efekata "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" na humanim tumorskim ćelijama.

Za prvi ksenograft sistem, trideset dva C.B.-17 SCID miša (u četiri grupe od po osam životinja) su izazvana sa 1 x 10<7>Raji-luc humane limfoma izvedenim ćelijama (Molecular Imaging, Ann Arbor, MI, U.S.) u 200 mL PBS. Na dan 5-9 i 12-16 sledeće grupe kod kojih je izazvan tumor su primile putem intravenoznog davanja sledeće grupe: Grupa 1: PBS; Grupa 2: "αCD20-scFv spojen sah SLT-1A" verzija 2 pri dozi od 2mg/kg; Grupa 3: "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 1 pri dozi od 2mg/kg; i Grupa 4: αCD20scFv::SLT-1A verzija 1 pri dozi od 4mg/kg (Dani 5-9 samo). Bioluminescencija, U 1 X 10<6>fotona/sekundnim jedinicama (p/s), je izmerena na dan 5, 10, 15, i 20 koristeći Caliper IVIS 50 sistem optičke slike (Perkin Elmer, Waltham, MA, U.S.). Slika 4 pokazuje kako obe verzije "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A," i "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 1 na oba dozna nivoa, rezultuje u statističko značajnom manjem nivou bioluminescencije kada se poredi sa kontrolnim PBS. Smanjenje ukupne bioluminescence odrazilo se na statistički značajna smanjenja diseminovanog opterećenja tumora nakon lečenja sa citotoksičnim proteinom pronalaska. Slika 5 pokazuje statistički značajan porast preživljavanja primenom bilo koje verzije αCD20scFv::SLT-1A. Srednja dob preživljavanja povećana je za pet dana sa svim lečenjima u poređenju sa kontrolnom PBS.

Za drugi ksenograft model, dvadeset osam BALBc/golih (u četiri grupe od po šest ili sedam životinja) su izazvane subkutaneozno sa 2.5 x 10<6>Raji humane limfoma izvedenim ćelijama (Washington Biotechnology, Simpsonville, MD, U.S.). Zapremina tumora je određena korišćenjem standardnih modela koji su poznati u tehnici koristeći kaliper. Dan 0 je postavljena na tački na kojoj je prosečna zapremina tumora za svaki miš dostigla približno 160 mm<3>(jedan miš iz svake grupe imao je tumor veći od 260 mm<3>pa je isključeno). Na dane 0-4 i 7-11 grupe su primile intravensku primenu sledećih po grupama: Grupa 1: PBS; Grupa 2: "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 2 pri dozi od 2 mg/kg; Grupa 3: "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 1 pri dozi od 2 mg/kg; Grupa 4: "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 1 pri dozi od of 4 mg/kg. Zapremina tumora je merena i uhvaćena kao funkcija dana proučavanja. Slika 6 koja prikazuje kako se leči "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" (pri oba dozna nivoa) rezultovana je značajno smanjenom zapreminom tumora u poređenju sa kontrolnim PBS do dana 24. To se takođe odražava na broj miševa bez tumora do 54. dana, prikazan u Tabeli 6.

Tabela 6. Eliminacija Tumora sa Primernim Citotoksičnim Proteinima u Subkutaneoznom -Tumor Mišijem Modelu

Određivanje in vivo Efekata Citotoksičnog Proteina u Ne-humanim Primatima

Primerni citotoksični protein "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 1 se primenjivao na nehumane primate u cilju da se testiraju in vivo efekti. Primećeno je in vivo smanjenje limfocita B periferne krvi kod primata cinomolgus nakon parenteralne primene različitih doza "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 1.

U jednom eksperimentu, deset primata cinomolgusa ubrizgano je intravenski PBS ili "αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 1 pri različitim dozama (50, 150, i 450 mikrograma leka/kilogramu telesne težine (mcg/kg)) na alternativnim danima u toku 2 nedelje. Zatim su prikupljeni uzorci periferne krvi pre doziranja 3. i 8. dana analizirani na procenat B-limfocita koji su iskazali CD20 (Slike 7 i 8). Kod majmuna cinomolgus opisane su dve različite podvrste B-ćelija; CD21 negativne, CD40 pozitivne ćelije koje izražavaju visok nivo CD20, i CD21 pozitivne i CD40 pozitivne koje izražavaju niži nivo CD20 nego sa protočnom citometrijom (Vugmeyster et al.., Cytometry 52: 101-9 (2003)). Osiromašenje B-ćelija koje zavisi od doze u poređenju sa početnim nivoima iz uzoraka krvi prikupljenih pre lečenja primećeno je 3. dana (4, 14 i 45% smanjenje kod životinja doziranih na 50, 150 i 450 mcg / kg) i 8. dana (32, 52 i 75% smanjenje kod životinja dozirani na 50, 150 i 450 mcg/kg) (Tabela 7). Ovaj eksperiment pokazuje da αCD20-scFv spojen sa SLT-1A" verzija 1 je sposbna da ubije CD20 pozitivne, primatne B-ćelije in vivo.

Tabela 7. Trošenje Anti-CD20-scFv spojen sa SLT-1A Verzija 1 Proteinske Dozne Zavisnosti B-ûelije u Ne-Humanim Primatima

Primer 4. Citotoksični protein izveden iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina-1 i antitelo αEpstein-Barr-antigena

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1A). Vezujući region imunoglobulinskog tipa αEpstein-Barr-antigena je izveden iz monoklonskog antitela protiv Epstein Barr antigena (Fang C et al., J Immunol Methods 287: 21-30 (2004)), koji obuhvata vezujući region imunoglobulinskog tipa sposoban da veže humanu ćeliju inficiranu sa Epstein-Barr virusom ili transformiše ćeliju koja ekspresuje Epstein-Barr antigen. Epstein-Barr antigen je ekspresovan na višestrukim ćelijskim tipovima, kao što su ćelije inficirane sa Epstein-Barr virusom i ćelijama kancera (npr. limfoma i nasfarnigeal ćelija kancera). Dodatno, Epstein-Barr infekcija je povezana sa drugim oboljenjima, npr., multipla sklerozom.

Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αEpsteinBarr

Vezujući region imunoglobulinskog tipa αEpstein-Barr-antigena i efektorski region Shiga toksina su povezani zajedno kako bi obrazovali protein. Na primer, fuzioni protein je dobijen ekspresijom polinukleotida koji kodira αEpstein-Barr-antigen-vezujući protein SLT-1A::αEpsteinBarr. Ekspresija SLT-1A::αEpsteinBarr citotoksičnog proteina je postignuta korišćenjem ili bakterije i/ili slobodne ćelije, proteinskog translacionog sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.

Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αEpsteinBarr

Karakteristike vezivanja citotoksičnog proteina ovog primera za pozitivne ćelije Epstein-Barr antigena i negativne ćelije Epstein-Barr antigena su određene analizom protočne citometrije na bazi fluorescencije, kao što je gore opisano u prethodnim primerima. Bmaxza SLT-1A::αEpsteinBarr na Epstein-Barr antigen pozitivne ćelije je izmeren da bude približno 50,000-200,000 MFI sa KDunutar opsega od 0.01-100 nM, pri čemu ne postoji značajno vezivanje za Epstein-Barr antigen negativne ćelije u ovoj analizi.

Sposobnosti inaktivacije ribozoma SLT-1 A::αEpsteinBarr citotoksičnog proteina je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro proteinskom translacijom kao što je gore opisano u prethodnom primeru. Inhibicioni efekat citotoksičnog proteina ovog primera na proteinskoj sintezi slobodne ćelije je značajan. IC50of SLT-lA::αEpsteinBarr na sitezi proteina u ovoj analizi slobodne ćelije je približno 0.1-100 pM.

Određivanje Citotoksičnosti Citotoksičnog Proteina SLT-lA::αEpsteinBarr Koristeći Analizu Ubijanja ûelije

Citotoksične karakteristike SLT-1 A: :αEpsteinBarr su određene opštom analizom ubijanja ćelije kao što je gore opisano u prethodnim primerima koristeći Epstein-Barr antigen pozitivne ćelije. Dodatno, selektivne citotoksične karakteristike SLT-1A::αEpsteinBarr su određene istom opštom analizom ubijanja ćelije koristeći Epstein-Barr antigen negativne ćelije kao poređenje sa Epstein-Barr antigen pozitivnim ćelijama. CD50citotoksičnog proteina ovog primera je približno 0.01-100 nM za Epstein-Barr antigen pozitivnih ćelija u zavisnosti od ćelijske linije. CD50citotoksičnog proteina je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoskičnost) za ćelije koje ne ekspresuju Epstein-Barr antigen na ćelijskoj površini kada se proedi sa ćelijama koje ekspresuju Epstein-Barr antigen na ćelijskoj površini.

Određivanje In Vivo Efekata Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αEpsteinBarr koristeći Životinjske Modele

Životinjski modeli se koriste za određivanje in vivo efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::αEpsteinBarr na neoplastičnim ćelijama. Različiti sojevi miševa koriste se za testiranje efekta citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograft tumorima kod miševa koji su posledica ubrizgavanja u one miševe humanih neoplastičnih ćelija koji izražavaju Epstein-Barr antigene na njihovim ćelijskim površinama.

Primer 5. Citotoksični protein izveden iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina-1 i antitelo αLeishmania-antigena

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A). Vezujući region imunoglobulinskog tipa αLeishmania-antigena je izveden iz antitela generisan, koristeći tehnike koje su poznate u tehnici, na ćelijskoj površini Leishmania antigena prisutnog na humanim ćelijama kačenjem na intraćelijsku tripanozomatidnu protozou (videti Silveira T et al, Int J Parasitol 31: 1451-8 (2001); Kenner J et al, / Cutan Pathol 26: 130-6 (1999); Berman J and Dwyer, Clin Exp Immunol 44: 342-348 (1981)).

Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αLeishmania

Vezujući region imunoglobulinskog tipa α-Leishmania-antigen i efektorski region Shiga toksin su vezani zajedno da obrazuju protein. Na primer, fuzioni protein je proizveden ekspresijom polinukleotida koji kodira Leishmania-antigen-vezujući protein SLT-1A::αLeishmania. Ekspresija SLT-1A::αLeishmania citotoskičnog proteina se izvodi upotrebom sistema za prevođenje proteina bez bakterija i / ili ćelija, kao što je opisano u prethodnim primerima.

Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αLeishmania

Karakteristike vezivanja citotoksičnog proteina ovog primera za Leishmania antigen pozitivnih ćelija i Leishmania antigen negativnih ćelija je određen sa analizom protočne citormetirje na bazi fluorescencije kao što je opisano gore u ranijim primerima. Bmaxza SLT-1A::αLeishmania do Leishmania antigen pozitivnih ćelija je izmeren da bude približno 50,000-200,000 MFI sas KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, pri čemu nema značajnog vezivanja za Leishmania antigen negativnih ćelija u ovoj analizi.

Sposobnost inaktivacije ribozoma SLT-1A::αLeishmania citotoksičnog proteina je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro proteinske traslacije kao što je opisano gore u prethodnim primerima. Inhibicioni efekat citotoskičnog proteina ovog primera na proteinskoj sintezi slobodne ćelije je značajan. IC50SLT-1A::αLeishmania na sintezi proteina u ovoj analizi slobodne ćelije je približno 0.1-100 pM.

Određivanje Citotoksičnosti Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αLeishmania Koristeći Analizu Ubijanja Ćelije

Citotoksične karakteristike SLT-1 A: :αLeishmania su određene opštom analizom ubijanja ćelije kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći Leishmania antigen pozitivne ćelije. Dodatno, selektivne citotoksične karakteristike SLT-1A::αLeishmania su određene istom analizom ubijanja ćelije korsiteći Leishmania antigen negativnih ćelija kao poređenje sa Leishmania antigenom pozitivnih ćelija. CD50citotoksičnog proteina ovog primera je približno 0.01-100 nM za Leishmania antigen pozitivne ćelije u zavisnosti od ćelijske linije. CD50citotoksičnog proteina je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne ekspresuju Leishmania antigen na ćelijskoj površini kada se poredi sa ćelijama koje ekspresuju Leishmania antigen na ćelijskoj površini.

Primer 6. Citotoksični protein izveden iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina-1 i vezujući regioa imunoglobulinskog tipa αNeurotenzin-Receptora

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A). Vezujući region imunoglobulinskog tipa αNeurotenzin-Receptora je izveden iz DARPin™ (GenBank Accession: 2P2CR) ili monoklonskog antitela (Ovigne J et al, Neuropeptides 32: 247-56 (1998)) koji vezuje humani neurotenzin receptor. Neurotenzin receptor je ekspresovan sa raznim ćelijama kancera, kao što je kancer dojke, kancer debelog creva, kancer pluća, melanoma, i kancer ćelija pankreasa.

Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog Proteina SLT-1A:: αNeurotenzinR

Vezujući region imunoglobulinskog tipa αNeurotenzinR i efektorski region Shiga toksin su vezani zajedno da obrazuju protein. Na primer, fuzioni protein je proizveden ekspresijom polinukleotida koji kodira neurotenzin-receptor-vezujući protein SLT-1A::αNeurotensinR.

Ekspresija SLT-1 A::αNeurotensinR citotoksičnog proteina se izvodi upotrebom sistema za prevođenje proteina bez bakterija i / ili ćelija, kao što je opisano u prethodnim primerima.

Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αNeurotenzinR

Karakteristike vezivanja citotoksičnog proteina ovog primera za neurotenzin receptor pozitivnih ćelija i neurotenzin receptor negativnih ćelija je određen sa analizom protočne citormetirje na bazi fluorescencije kao što je opisano gore u ranijim primerima. Bmaxza SLT-1A::αNeurotenzinR do neurotenzin receptor pozitivnih ćelija je izmeren da bude približno 50,000-200,000 MFI sa KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, pri čemu nema značajnog vezivanja za Leishmania antigen negativnih ćelija u ovoj analizi.

Sposobnost inaktivacije ribozoma SLT-1A::αNeurotenzinR citotoksičnog proteina je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro proteinske traslacije kao što je opisano gore u prethodnim primerima. Inhibicioni efekat citotoksičnog proteina ovog primera na proteinskoj sintezi slobodne ćelije je značajan. IC50SLT-1A::αNeurotenzinR na sintezi proteina u ovoj analizi slobodne ćelije je približno 0.1-100 pM.

Određivanje Citotoksičnosti Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αNeurotenzinR Koristeći Analizu Ubijanja ûelije

Citotoksične karakteristike SLT-1 A:: αNeurotenzinR su određene opštom analizom ubijanja ćelije kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći Leishmania antigen pozitivne ćelije. Dodatno, selektivne citotoksične karakteristike SLT-1 A::αNeurotenzinR su određene istom analizom ubijanja ćelije koristeći neurotenzin receptor negativnih ćelija kao poređenje sa neurotenzin receptor pozitivnih ćelija. CD50citotoksičnog proteina ovog primera je približno 0.01-100 nM za neurotenzin receptor pozitivnih ćelija u zavisnosti od ćelijske linije. CD50

1

citotoksičnog proteina je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne ekspresuju neurotenzin receptor na ćelijskoj površini kada se poredi sa ćelijama koje ekspresuju neurotentin receptor na ćelijskoj površini.

Određivanje In Vivo Efekata Citotoksičnog Proteina SLT-1 A::αNeurotensinR koristeći Životinjske Modele

Životinjski modeli se koriste za određivanje in vivo efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::αNeurotensinR na neoplastičnim ćelijama. Različiti sojevi miševa koriste se za testiranje efekta citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograft tumorima kod miševa koji su posledica ubrizgavanja u one miševe humanih neoplastičnih ćelija koji izražavaju neurotenzin receptore na njihovim ćelijskim površinama.

Primer 7. Citotoksični protein izveden iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina-1 i vezujući region imunoglobulinskog tipa αEGFR

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A). Vezujući region imunoglobulinskog tipa αEGFR je izveden iz AdNectin™ (GenBank Accession: 3QWQ B), the Affibody™ (GenBank Accession: 2KZI A; U.S. patent 8,598,113), ili antitela, od kojih svi vezuju jedan ili više receptora ljudskog faktora rasta.

Ekspresija receptora epidermalnog faktora rasta povezana je sa humanim ćelijama kancera, kao što su, na primer, ćelije kancera pluća, ćelije kancera dojke i ćelije kancera debelog creva.

Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αEGFR

Vezujući region imunoglobulinskog tipa αEGFR i efektorski region Shiga toksin su vezani zajedno da obrazuju protein. Na primer, fuzioni protein je proizveden ekspresijom polinukleotida koji kodira EGFR vezujući protein SLT-1A::αEGFR. Ekspresija SLT-1A::αEGFR citotoksičnog proteina se izvodi upotrebom sistema za prevođenje proteina bez bakterija i / ili ćelija, kao što je opisano u prethodnim primerima.

Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αEGFR

Karakteristike vezivanja citotoksičnog proteina ovog primera za EGFR+ ćelije i EGFR- ćelije je određen sa analizom protočne citormetirje na bazi fluorescencije kao što je opisano gore u ranijim primerima. Bmaxza SLT-1A::αEGFR do EGFR+ ćelije je izmereno da bude približno

2

50,000-200,000 MFI sa KDunutar opsega od 0.01-100 nM, pri čemu nema značajnog vezivanja EGFR- ćelija u ovoj analizi.

Sposobnost inaktivacije ribozoma SLT-1A::αEGFR citotoksičnog proteina je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro proteinske traslacije kao što je opisano gore u prethodnim primerima. Inhibicioni efekat citotoksičnog proteina ovog primera na proteinskoj sintezi slobodne ćelije je značajan. IC50SLT-1A::αEGFR na sintezi proteina u ovoj analizi slobodne ćelije je približno 0.1-100 pM.

Određivanje Citotoksičnosti Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αEGFR Koristeći Analizu Ubijanja ûelije

Citotoksične karakteristike SLT-1A::αEGFR su određene opštom analizom ubijanja ćelije kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći EGFR+ ćelije. Dodatno, selektivne citotoksične karakteristike SLT-1A: :αEGFR su određene istom analizom ubijanja ćelije koristeći EGFR-ćelije kao poređenje sa Leishmania antigenima pozitivnih ćelija. CD50citotoksičnog proteina je približno 0.01-100 nM za EGFR+ ćelije koje zavise od ćelijske linije. CD50citotoksičnog proteina je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne ekspresuju EGFR na ćelijskoj površini kada se poredi sa ćelijama koje ekspresuju EGFR na ćelijskoj površini.

Određivanje In Vivo Efekata Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αEGFR koristeći Životinjske Modele

Životinjski modeli se koriste za određivanje in vivo efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::αEGFR na neoplastičnim ćelijama. Različiti sojevi miševa koriste se za testiranje efekta citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograft tumorima kod miševa koji su posledica ubrizgavanja u one miševe humanih neoplastičnih ćelija koji izražavaju EGFR(s) na njihovim ćelijskim površinama.

Primer 8. Citotoksični protein izveden iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina-1 i antitelo αCCR5

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A). Vezujući region imunoglobulinskog tipa αCCR5 je izveden iz monoklonskog antitela protiv humanog CCR5 (CD195) (Bernstone L et al, Hybridoma 31: 7-19 (2012)). CCR5 se pretežno eksprimira na T-ćelije, makrofage, dendritičke ćelije i mikrogliju. Pored toga, CCR5 igra ulogu u patogenezi i širenju virusa humane imunodeficijencije (HIV).

Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αCCR5

Vezujući region imunoglobulinskog tipa αCCR5 i efektorski region Shiga toksin su vezani zajedno da obrazuju protein. Na primer, fuzioni protein je proizveden ekspresijom polinukleotida koji kodira αCCR5-vezujući protein SLT-1A::αCCR5. Ekspresija SLT-1A::αCCR5 citotoksičnog proteina se izvodi upotrebom sistema za prevođenje proteina bez bakterija i / ili ćelija, kao što je opisano u prethodnim primerima.

Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αCCR5

Karakteristike vezivanja citotoksičnog proteina ovog primera za CCR5+ ćelije i CCR5- ćelije je određen sa analizom protočne citormetirje na bazi fluorescencije kao što je opisano gore u ranijim primerima. Bmaxza SLT-1A::αCCR5 do CCR5+ ćelije je izmereno da bude približno 50,000-200,000 MFI sa KDunutar opsega od 0.01-100 nM, pri čemu nema značajnog vezivanja CCR5- ćelije u ovoj analizi.

Sposobnost inaktivacije ribozoma SLT-1A::αCCR5 citotoksičnog proteina je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro proteinske traslacije kao što je opisano gore u prethodnim primerima. Inhibicioni efekat citotoksičnog proteina ovog primera na proteinskoj sintezi slobodne ćelije je značajan. IC50SLT-1A::αCCR5 na sintezi proteina u ovoj analizi slobodne ćelije je približno 0.1-100 pM.

Određivanje Citotoksičnosti Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αCCR5 Koristeći Analizu Ubijanja ûelije

Citotoksične karakteristike SLT-1A::αCCR5 su određene opštom analizom ubijanja ćelije kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći CCR5+ ćelije. Dodatno, selektivne citotoksične karakteristike SLT-1A::αCCR5 su određene istom analizom ubijanja ćelije koristeći CCR5-ćelije kao šređenje sa CCR5+ ćelijama. CD50citotoksičnog proteina je približno 0.01-100 nM za CCR5+ ćelije koje zavise od ćelijske linije. CD50citotoksičnog proteina je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne ekspresuju CCR5 na ćelijskoj površini kada se poredi sa ćelijama koje ekspresuju CCR5 na ćelijskoj površini.

4

Određivanje In Vivo Efekata Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αCCR5 koristeći Životinjske Modele

Životinjski modeli se koriste za određivanje in vivo efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::αCCR5 o iscrpljivanju T-ćelija iz materijala donatora (videti Tsirigotis P et al., Immunotherapy 4: 407-24 (2012)). Primati koji nisu humani koriste se za određivanje in vivo efekata SLT-1A::αCCR5. Bolest transplantata naspram domaćina analizira se u rezus makaki nakon transplantacije bubrega, kada su donirani organi prethodno lečeni sa SLT-1A::αCCR5 (videti Weaver T et al, Nat Med 15: 746-9 (2009)). Primećeno je in vivo iscrpljivanje T limfocita periferne krvi kod primata cinomolgus nakon parenteralne primene različitih doza SLT-1A::αCCR5. Primena SLT-1A::αCCR5 da blokira HIV infekciju testira se davanjem akutne doze SLT-1A::αCCR5 na ne-humane primate u cilju da bi se znatno iscrpile cirkulirajuće T-ćelije nakon izlaganja virusu simijske imunodeficijencije (SIV) (videti Sellier P et al, PLoS One 5: e10570 (2010)).

Primer 9. Citotoksični protein izveden iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina-1 i antitelo αUL18

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A). Vezujući region imunoglobulinskog tipa αUL18 je izveden iz generisanog antitela, koristeći tehnike koje su poznate u tehnici, na površinu ćelije citomegalovirusnog proteina UL18, koji je prisutan na humanim ćelijama inficiranim sa citomegalovirusom (Yang Z, Bjorkman P, Proc Natl Acad Sci USA 105: 10095-100 (2008)). Infekcija humanim citomegalovirusom je povezana sa raznim kancerima i inflamacionim poremećajima.

Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αUL18

Vezujući region imunoglobulinskog tipa αUL18 i efektorski region Shiga toksin su vezani zajedno da obrazuju protein. Na primer, fuzioni protein je proizveden ekspresijom polinukleotida koji kodira αUL18-vezujući protein SLT-1A::αUL18. Ekspresija SLT-1A::αUL18 citotoksičnog proteina se izvodi upotrebom sistema za prevođenje proteina bez bakterija i / ili ćelija, kao što je opisano u prethodnim primerima.

Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αUL18

Karakteristike vezivanja citotoksičnog proteina ovog primera za citomegalovirusni protein UL18 pozitivne ćelije i cytomegalovirusni protein UL18 negativnih ćelija je određen sa analizom protočne citormetirje na bazi fluorescencije kao što je opisano gore u ranijim primerima. Bmaxza SLT-1A::αUL18 do citomegalovirusnog proteina UL18 pozitivnih ćelija je izmeren da bude približno 50,000-200,000 MFI sa KDunutar opsega od 0.01-100 nM, pri čemu nema značajnog vezivanja za citomegalovirusni protein UL18 negativnih ćelija u ovoj analizi.

Sposobnost inaktivacije ribozoma SLT-1A::αUL18 citotoksičnog proteina je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro proteinske traslacije kao što je opisano gore u prethodnim primerima. Inhibicioni efekat citotoksičnog proteina ovog primera na proteinskoj sintezi slobodne ćelije je značajan. IC50of SLT-1A::αUL18 na sintezi proteina u ovoj analizi slobodne ćelije je približno 0.1-100 pM.

Određivanje Citotoksičnosti Citotoksičnog Proteina SLT-1A::αUL18 Koristeći Analizu Ubijanja ûelije

Citotoksične karakteristike SLT-1 A:: αUL 18 su određene opštom analizom ubijanja ćelije kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći citomegalovirusni protein UL18 pozitivnih ćelija. Dodatno, selektivne citotoksične karakteristike SLT-1A::αUL18 su određene istom analizom ubijanja ćelije koristeći citomegalovirusni protein UL18 negativnih ćelija kao poređenje sa citomegalovirusnim proteinom UL18 pozitivnih ćelija. CD50citotoksičnog proteina ovog primera je približno 0.01-100 nM za citomegalovirusni protein UL18 pozitivnih ćelija u zavisnosti od ćelijske linije. CD50citotoksičnog proteina je približno 10-10,000 puta veći (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne ekspresuju citomegalovirusni protein UL18 na ćelijskoj površini kada se poredi sa ćelijama koje ne ekspresuju citomegalovirusni protein UL18 na ćelijskoj površini.

Primer 10. Razni citotoksični proteini koji ciljaju razne ćelijske tipove

U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A), Shiga toksina (StxA), i/ili Shiga-sličnog Toksina 2 (SLT-2A). Vezujući region imunoglobulinskog tipa je izveden iz imunoglobulinskog domena iz molekula koji je izabran iz kolne 1 Tabele 8 i koji vezuje ekstraćelijski ciljani biomolekul u koloni 2 Tabele 8. Primerni citotoksični proteini ovog primera su kreirani i testirani kao što je opisano u prethodnim primerima koristeći ćelije koje ekspresuju odgovorajuće ekstraćelijske ciljane biomolekule. Primerni proteini ovog primera mogu se koristiti za dijagnostikovanje i lečenje oboljenja, stanja, ili poremećaja koja su uključena u koloni 3 Tabele 8.

Tabela 8. Razni Vezujući Regioni Imunoglobulinskog Tipa za ûeliju koja Cilja

Citotoksične Proteine

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. Citotoksični protein koji sadrži:

a) vezujući region imunoglobulinskog tipa:

(i) koji sadrži jedan ili više: pojedinačni-domen fragmenta antitela, varijabilni fragment jednostrukog lanca, varijabilni fragment antitela, antigenski-vezujući fragment, i Fd fragment; i

(ii) koji je sposoban da se specifično veže za bar jedan ekstraćelijski ciljani biomolekul;

i

b) efektorski polipeptid citotoksičnog Shiga toksina A Podjedinice koji sadrži:

amino kiselinsku sekvencu koja je bar 85% identična amino kiselinskoj sekvenci koja je prikazana u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3; ili amino kiselinsku sekvencu odabranu između:

(i) amino kiseline 75 do 251 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3;

(ii) amino kiseline 1 do 241 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3;

(iii) amino kiseline 1 do 251 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3; i (iv) amino kiseline 1 do 261 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3;

pri čemu nakom primene citotoksičnog proteina na ćeliju fizički spojenu sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona imunoglobulinksog tipa, citotoksični protein je sposoban da izazove smrt ćelije.

2. Citotoksični protein prema zahtevu 1, pri čemu nakon primene citotoksičnog proteina na prvu populaciju ćelija čiji članovi su fizički spojeni za ekstraćelijske ciljane biomolekule vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa, i drugu populaciju ćelija čiji članovi nisu fizički spojeni za bilo koji esktraćelijski ciljani biomolekul vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa, citotoksični efekat citotoksičnog proteina na članove navedene prve populacije ćelija u odnosu na članove navedene druge populacije ćelija je bar 3 puta veći.

3. Citotoksični protein prema zahtevu 2, pri čemu navedena prva populacija ćelija je fizički spojena za navedeni ekstraćelijski ciljani biomolekul uz pomoć kovalentnih i/ili ne kovalentnih intermolekularnih interakcija koje sapajaju ekstraćelijski ciljani biomolekul, ili njegov deo, za spoljašnji deo ćelije; ili pri čemu navedeni ekstraćelijski ciljani biomolekul jeste integralna membrana proteina ili periferna membrana proteina ekspresovana sa ćelijom ili prvom populacijom ćelija.

4. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu vezujući region imunoglobulinskog tipa je sposoban da se veže za ekstraćelijski ciljani biomolekul odabran između grupe koja se sastoji od: CD20, CD22, CD40, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EphB2, specifičnog membranskog antigena prostate, Cripto, endoglin, fibroblast aktivacionog protein, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/ SLAMF7, CD33, CD52, EpCAM, gpA33, mucin, TAG-72, karbonske anhidraze IX, folatnog vezujućeg proteina, ganglioside GD2, ganglioside GD3, ganglioside GM2, ganglioside Lewis-Y2, VEGFR, Alfa V beta3, Alfa5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANKL, tenascin, CD64, mezotelina, BRCA1, MART-1/MelanA, gp100, tirozinaze, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, beta-catenin, MUM-1, caspaze-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, karcinoembrionskog antigena, specifičnog antigena prostate, antigena matične ćelije prostate, humani aspartil (asparaginil) beta-hidroksilaza, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, tirozinaza-povezani antigen, HPV-E7, Epstein-Barr Virus antigen, Bcr-Abl, alfa-fetoprotein antigen, 17-A1, antigen tumora bešike, CD38, CD15, CD23, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, FceRIa, galectin-9, mrp-14, Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, IgE, CD107a, CD203C, CD14, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, galectin-3, CD11a-c, GITRL, MHC Class II, CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, i bilo koji drugi imunogenski fragment bilo kog porekla.

5. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu efektorski polipeptid citotoksičnog Shiga toksina sadrži amino kiselinsku sekvencu odabranu između:

(i) amino kiseline 75 do 251 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3;

(ii) amino kiseline 1 do 241 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3;

(iii) amino kiseline 1 do 251 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; i

(iv) amino kiseline 1 do 261 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3.

6. Citotoksični protein prema zahtevu 4, pri čemu vezujući region imunoglobulinskog tipa sadrži sekvencu amino kiseline 269-508 SEQ ID NO: 4;

ili pri čemu vezujući region imunoglobulinskog tipa sadrži sekvencu amino kiseline 1-119 SEQ ID NO: 5, kao što pri čemu citotoksični protein sadrži polipeptidnu sekvencu SEQ ID NO: 5.

7. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu efektorski polipeptid citotoksičnog Shiga toksina sadrži mutaciju u odnosu na A Podjedinicu člana familije Shiga toksina koji se može javiti u prirodi koji menja enzimsku aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina dok zadržava citotoksičnu aktivnost; pri čemu je mutacija odabrana između bar jednog brisanja ili supstitucije ostatka amino kiseline.

8. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-7, u obliku homo-multimera ili heteromultimera.

9. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-8, u obliku farmaceutski prihvatljive soli ili solvata.

10. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-9, konjugovan za dijagnostički agens.

11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-10 i bar jedan farmaceutski prihvatljivi ekscipijens ili nosač.

12. Polinukleotid sposoban da kodira citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-7, ili njegov komplement.

13. Ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 12.

14. Transformisana ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid prema zahtevu 12 ili ekspresioni vektor prema zahtevu 13.

15. In vitro postupak ubijanja ćelije, postupak koji sadrži korak kontakta ćelije sa citotoksičnim proteinom prema bilo kom od zahteva 1-10.

16. In vitro postupak obeležavanja unutrašnjosti ćelije kancera ili imune ćelije, pri čemu postupak obuhvata korak kontakta ćelije sa citotoksičnim proteinom prema zahtevu 10.

17. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-10 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11 za primenu u lečenju oboljenja, poremećaja, ili stanja kod pacijenta.

18. Citotoksični protein ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 17, pri čemu lečenje jeste oboljenje, poremećaj, ili stanje odabrano između grupe koja se sastoji od: kancera, tumora, imunog poremećaja, i mikrobne infekcije;

kao što je kancer koji je izabran iz grupe koja se sastoji od: kancera kostiju, kancera dojke, kancera centralnog / perifernog nervnog sistema, kancera gastrointestinalnog sistema, kancera mikrobne ćelije, kancera žlezda, kancera glave i vrata, hematološkog kancera, kancera bubrega i mokraćnih puteva, kancera jetre, kancera pluća / pleure, kancera prostate, sarkoma, kancera kože i kancera materice;

ili pri čemu je imuni poremećaj povezan sa oboljenjem odabranim iz grupe koja se sastoji od: amiloidoze, ankilozirajućeg spondilitisa, astme, Crohnove bolesti, dijabetesa, odbacivanja transplantata, bolest grafta u odnosu na domaćina, Hashimotov tiroiditis, hemolitički uremički sindrom, bolest povezana sa HIV-om, lupus eritmatosus, multipla skleroza, poliarteritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vaskulitis.