KR20140041908A - Ｆｃ 도메인에 융합된 항­ｖｅｇｆ 단일 가변 도메인 - Google Patents

Ｆｃ 도메인에 융합된 항­ｖｅｇｆ 단일 가변 도메인 Download PDF

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KR20140041908A
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Abstract

본 발명은 각각의 에피토프 결합 도메인이 VEGF에 결합할 수 있는, 항체의 단일쇄 Fc 영역에 의해 분리된 하나 또는 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물, 본 발명의 2개의 항원 결합 작제물을 포함하는 이합체, 상기 이합체를 포함하는 약학적 조성물 및 VEGF 신호전달과 관련된 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종 (DME), 습식 노인성 황반 변성 (Wet AMD), 당뇨 망막병증, 망막 정맥 폐쇄 (RVO), 및 각막 신혈관형성의 치료에서의 이의 용도, 및 상기 항원 결합 작제물을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열에 관한 것이다.

Description

ＦＣ 도메인에 융합된 항­ＶＥＧＦ 단일 가변 도메인{ANTI-VEGF SINGLE VARIABLE DOMAINS FUSED TO FC DOMAINS}
성장 인자의 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 패밀리 및 이들의 수용체는 혈관형성 및 혈관 투과의 필수적인 조절인자이다. VEGF 패밀리는 VEGF-A, PIGF(태반 성장 인자), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-E 및 뱀독 VEGF를 포함하며, 이들 각각은 혈관 패터닝(vascular patterning) 및 혈관 발달에서 명백한 역할을 갖는 것으로 생각된다. 단일 8-엑손 유전자로부터 전사된 mRNA의 대안적 스플라이싱으로 인해, VEGF-A는 신호 펩티드 절단 후에 남아있는 아미노산 수에 의해 확인된 적어도 9개의 서브타입(아이소형(isoform))을 갖는다. 예를 들어, 인간에서, 가장 현저한 아이소형은 가용성 형태 및 세포 결합 형태 사이에서 평형 상태로 존재하는 VEGF165이다. 보다 긴 아이소형(VEGF183, VEGF189 & VEGF206)은 고도로 양성으로 하전된 C-말단 영역을 갖고, 세포 표면 글리칸 및 이들의 생체이용률을 조절하는 헤파린과의 결합을 매개한다. 모든 VEGF-A 아이소형은 수용체-결합 VEGF 단편을 구성하는 약 110개의 N-말단 잔기의 코어를 통해 발생하는 결합을 갖는 동종이합체를 형성한다. 정상 환경 하에서, 및 고형 종양의 중심에서, VEGF의 발현은 주로 혈관 공급의 부족을 의미하는 저산소 조건에 의해 매개된다. 저산소증은 저산소증 유도성 인자 HIF-1α와 항시 발현되는 HIF-1α의 이합체화를 야기시켜, VEGF 유전자의 프로모터 영역 내의 저산소 반응 구성요소에 결합하는 전사 인자를 형성시킨다. 정상산소증 하에서, HIF-1α 단백질은 다수의 프롤린 하이드록실화 사건의 결과로서 유비퀴틴-매개 분해를 겪는다. 다른 종양-관련 VEGF 상향조절은 염증성 사이토카인 & 성장 인자를 통한 종양유전자 경로(즉, ras)를 통한 활성화로 인한 것 뿐만 아니라 기계적 힘에 의해 발생한다.
활성 VEGF 동종이합체는 VEGFR 패밀리의 수용체에 의해 세포 표면에 결합된다. VEGF-A에 대한 주요 혈관 내피 관련 수용체는 VEGFR1(Flt1) 및 VEGFR2(Flk-2; KDR)이다. 둘 모두의 수용체는 티로신 키나제 패밀리의 구성원이며, 활성화를 위해 리간드-매개 이합체화를 필요로 한다. 이합체화 후, 키나제 도메인은 자가인산화를 겪지만, VEGFR2에서의 키나제 활성의 정도는 VEGFR1에서의 키나제 활성의 정도보다 크다. VEGF의 혈관형성 신호전달은 주로 VEGFR2를 통해 매개되지만, VEGF의 친화성이 VEGFR1에 대한 것보다 약 3배 더 큰 것이 입증되었다(VEGFR2에 대한 100pM에 비해 KD ~30pM). 이는 VEGFR1이 VEGF를 격리시키고, VEGFR2 활성화의 정도를 조절하는 디코이(decoy) 수용체로 주로 작용한다는 제안을 유도하였다. VEGFR1 발현이 일부 종양과 관련되어 있으나, 이의 주요 역할은 배 발생 & 기관형성 동안에 있는 것으로 보인다. VEGF-A165가 또한 뉴로필린 수용체 NRP1 & NRP2에 의해 결합된다. 이들 수용체는 TK 도메인이 결핍되어 있으나, 이들은 VEGFR2에 대한 공동-수용체로 작용하고, VEGFR2에 VEGF를 전달함으로써 신호전달을 증대시키는 것으로 생각된다.
다수의 연구가 종양 혈관형성에서 중요 인자로서 VEGF-A를 확인하는 것을 도왔다. 예를 들어, VEGF-A는 대부분의 종양 및 종양 관련 기질에서 발현된다. 성장을 뒷받침하는 잘 발달되고 확장되는 혈관구조 시스템의 부재하에서, 종양 세포는 괴사 및 아폽토시스가 발생하게 되며, 이에 의해 지속적 세포 증식으로부터 발생할 수 있는 종양 부피에서의 증가에 대한 제한(대개 1 mm3)이 부과된다. VEGF-A의 발현은 괴사 영역에 인접한 저산소 종양 세포에서 가장 높고, 이는 성장하는 종양에서의 저산소증에 의한 VEGF-A의 유도가 혈관형성의 활성제 및 억제제의 균형을 변경시켜 종양에서 새로운 혈관의 성장을 발생시킬 수 있는 것을 나타낸다. 이러한 가설과 일치하게, VEGF-A를 억제하거나 포획하거나, VEGF-A의 신호전달 수용체 VEGFR-2를 차단하는 소분자량 티로신 키나제 억제제, 모노클로날 항체, 안티센스 올리고누클레오티드 등을 포함하는 다수의 방법이 치료제로서 개발되었다.
VEGF-A는 또한 다수의 안질환, 예컨대 노인성 황반 변성 (AMD), 습식 AMD, 지도형 위축(geographic atrophy), 당뇨 망막병증, 망막 정맥-폐쇄병, 당뇨병성 황반 부종 및 각막 혈관형성과 관련되었다. VEGF-A는 저산소증에 반응하여 다양한 안세포 유형에 의해 생산되며 혈관 투과를 촉진하고 내피 세포 성장을 자극하는 것을 포함하는 많은 기능을 지닌다.
AMD는 황반에서 중첩 광수용체의 변성을 초래하고 중심시력의 손실을 발생시키는 망막 색소 상피의 비정상으로서 정의된다. AMD는 주요 공중 위생의 부담이고 미국에서 9백만명이 넘는 사람이 AMD의 중기 또는 진행 형태를 지닌 것으로 추정된다. 조기 AMD는 시력 손실이 없는 드루젠(drusen) 및 망막 색소 상피의 과다색소침착 및 색소침착저하를 특징으로 한다. 시력 손실이 발생하는 진행된 AMD는 지도형 위축 또는 맥락막의 신혈관형성 (CNV)으로서 나타날 수 있다. 습식 AMD로도 불리는 CNV는 혈관의 비정상 성장의 결과이다.
라니비주맙 (루센티스), 베바시주맙 (아바스틴) 및 아플리베르셉트 (에일레아)는 신혈관 AMD에 보통 투여되는 항-VEGF 치료제의 예이다. 이러한 치료제의 존재에도 불구하고, AMD 및 그 밖의 안질환의 치료를 위한 추가 치료제에 대한 요구가 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 항체의 단일쇄 Fc 영역에 의해 분리된 하나 또는 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물에 관한 것이고, 이 때 각각의 에피토프 결합 도메인은 VEGF에 결합할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 작제물의 각각의 에피토프 결합 도메인은 dAb로도 일컬어지는 도메인 항체이다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기 항원 결합 작제물에 관한 것이다:
a) DOM 15-26-597-AS-Fc (SEQ ID No. 110)-피브로넥틴 x 4-DT02-K-044-085; 또는
b) DOM 15-26-597-IgG1 힌지-Fc (SEQ ID No. 110)-피브로넥틴 x 4-DT02-K-044-085; 또는
c) 전체 서열에 걸쳐 97% 이상의 아미노산 동일성을 지니는 (a) 또는 (b)의 변이체; 또는
d) 각각의 dAb 서열이 특수한 dAb의 서열에 97% 이상의 서열 동일성을 지니는 (a) 또는 (b)의 변이체.
본 발명은 추가로 본 발명의 2개의 항원 결합 작제물을 포함하는 이합체, 상기 이합체를 포함하는 약학적 조성물 및 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema)(DME), 습식 노인성 황반 변성(wet age-related macular degeneration)(Wet AMD), 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 망막 정맥 폐쇄(retinal vein occlusion)(RVO), 및 각막 신혈관형성(corneal neovascularisation)과 같은 VEGF 신호전달과 관련된 질환의 치료에서의 이의 용도, 및 상기 항원 결합 작제물을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열에 관한 것이다.
도면
도 1: 인간 VEGF165에 결합하는 DMS1529, DMS1576 및 베바시주맙(Bevacizumab) (아바스틴(Avastin))의 비교를 도시하는, EC50 값을 지닌 ELISA.
도 2a: Vk Fc-dAb DMS30000 3㎍/mL로 미리-포화시킨 후 MSD에 의한 VEGF에 대한 Vh dAb-Fc DMS1576의 결합.
도 2b: Vh dAb-Fc DMS1576 3㎍/mL로 미리-포화시킨 후 MSD에 의한 VEGF에 대한 Vk Fc-dAb DMS30000의 결합.
도 3: 베바시주맙 (아바스틴)에 비해 항-VEGF Vh dAb-Fc, Vk Fc-dAb 및 dAb-Fc-dAb 분자로부터의 VEGF 유도된 인간 탯줄 내피 세포 (HUVEC) 증식 검정의 최대 억제에 대한 분산의 가중 분석.
도 4: MSD에 의한 마우스 VEGF164에 대한 DMS1529 및 DMS30000의 결합.
발명의 상세한 설명
본 발명은 항체의 단일쇄 Fc 영역에 의해 분리된 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물에 관한 것이고, 이 때 각각의 에피토프 결합 도메인은 VEGF에 결합할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 작제물의 각각의 에피토프 결합 도메인은 dAb로도 일컬어지는 도메인 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프 결합 도메인"은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 도메인을 의미한다. 이는 도메인 항체 (dAb)일 수 있거나, 이는 자연 리간드가 아닌 리간드에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 공학처리된 CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디, SpA), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(transferrin)(트랜스-바디(trans-body)); 앙키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 인간 γ-크리스탈린(γ-crystallin) 및 인간 유비퀴틴(아필린(affilin)); PDZ 도메인; 전갈 독소(카리브도톡신(charybdotoxin)); 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠(kunitz) 유형 도메인; Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴(adnectin))으로 구성되는 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "도메인"은 단백질의 나머지와 독립적인 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 첨가되거나, 제거되거나, 다른 단백질에 전달될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "도메인 항체"는 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서 이는 VH, VHH 및 VL과 같은 완전한 항체 가변 도메인 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 대신된 변형된 항체 가변 도메인, 또는 트렁케이션되었거나 N- 또는 C-말단 연장뿐 아니라, 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 적어도 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함한다. 단일 가변 도메인은 상이한 가변 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프에 결합할 수 있다. "도메인 항체" 또는 "dAb( TM )"은 "단일 가변 도메인"으로도 언급될 수 있다. 도메인 항체는 인간 도메인 항체일 수 있으나, 이는 또한 설치류(예를 들어, WO 00/29004호에 개시되어 있음), 너스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드(Camelid) VHH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 도메인 항체를 포함한다. 카멜리드 VHH는 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생성하는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 VHH 도메인은 당 분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 "도메인 항체"인 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 VH는 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다. NARV는 너스 샤크를 포함하는 연골성 어류에서 확인된 면역글로불린 도메인 항체의 또 다른 유형이다 [Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)] . 이들 도메인은 또한 신규한 항원 수용체 가변 영역(통상적으로, V(NAR) 또는 NARV로 약어화됨)으로 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체의 단일쇄 Fc 영역"은 IgG, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 IgG4PE, 또는 IgA 항체의 단일 중쇄 Fc 영역을 의미한다. 단일 중쇄 Fc 영역은 CH1, CH2 및 CH3 불변 영역 항체 도메인 중 하나 이상, 예를 들어 3개 모두의 불변 영역 항체 도메인 또는 단지 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. CH1, CH2 및 CH3 불변 영역 항체 도메인 중 하나 이상을 포함하는 것에 추가하여, 항체의 단일 중쇄 Fc 영역은 항체의 힌지 영역(보통 CH1 및 CH2 도메인 사이에서 발견되는 그러한 영역)을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태에서, 항체의 단일쇄 Fc 영역은 단일 IgG1 중쇄, 예를 들어 CH2 및 CH3 항체 불변 도메인을 포함하는 단일 IgG1 중쇄이다.
추가 양태에서, 항체의 단일쇄 Fc 영역은 SEQ ID No. 110의 IgG1 서열이다.
추가 양태에서, 항체의 단일쇄 Fc 영역은 하기 서열이다:
Figure pct00001
.
한 양태에서, Fc 서열의 N 말단은 "AS"로 시작하거나 Fc의 시작부에 N-말단 아미노산이 없다 (Fc 서열은 ASTHTCPPC 또는 THTCPPC로 시작한다).
또 다른 양태에서, Fc 영역은 Fc의 N-말단 내에 돌연변이를 포함하며, 예를 들어 THTCPPC는 TATCPPC로 대체된다. 예를 들어, THTCPPC는 THPCPPC로 대체된다 (예컨대, SEQ ID 83 및 84). 상기 돌연변이는 본원에 기재된 임의의 서열에 존재할 수 있고, 본원에 기재된 그러한 특수한 서열의 변이체 서열이다.
항체의 Fc 영역은 이의 효과기 기능의 정도에 대해 선택될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "효과기 기능"은 항체 의존성 세포-매개 세포독성 활성(ADCC), 보체-의존성 세포독성 활성(CDC) 매개 반응, Fc-매개 포식작용 및 FcRn 수용체를 통한 항체 재이용 중 하나 이상을 나타내는 것을 의미한다. IgG 항체에 대해, ADCC 및 ADCP를 포함하는 효과기 기능은 중쇄 불변 영역과 면역 세포의 표면 상에 존재하는 Fcγ 수용체의 패밀리의 상호작용에 의해 매개된다. 인간에서, 이들은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)를 포함한다. 항원에 결합된 항원 결합 단백질과 Fc/Fcγ 복합체의 형성 사이의 상호작용은 세포독성, 면역 세포 활성화, 포식작용 및 염증성 사이토카인의 방출을 포함하는 광범위한 효과를 유도한다.
항원 결합 단백질의 불변 영역과 다양한 Fc 수용체(FcR) 사이의 상호작용은 항원 결합 단백질의 효과기 기능을 매개하는 것으로 생각된다. 유의한 생물학적 효과는 효과기 기능의 결과, 특히, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC), 보체의 고정(보체 의존성 세포독성 또는 CDC), 및 항원 결합 단백질의 반감기/청소일 수 있다. 보통, 효과기 기능을 매개하는 능력은 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 필요로 하며, 모든 항원 결합 단백질이 모든 효과기 기능을 매개하지는 않을 것이다.
효과기 기능은 ADCC 효과기 기능을 측정하기 위해, 예를 들어, 자연살세포에 대해 FcγRIII의 결합을 통하거나 단핵구/대식세포에 대해 FcγRI을 통하는 것을 포함하는 다수의 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 단백질은 자연살세포 검정에서 ADCC 효과기 기능에 대해 평가될 수 있다. 상기 검정의 예는 문헌[Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS USA, 103; 4005-4010]에서 발견될 수 있다. CDC 기능을 확인하기 위한 검정의 예는 문헌[1995 J Imm Meth 184:29-38]에 기재된 것을 포함한다.
인간 불변 영역의 일부 아이소형, 특히 IgG4 및 IgG2 아이소형은 본질적으로 a) 고전 경로에 의한 보체의 활성화, 및 b) 항체-의존성 세포 세포독성의 기능이 결핍되어 있다. 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역에 대한 다양한 변형은 요망되는 효과기 특성에 따라 수행될 수 있다. Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키고, 이에 따라 ADCC 및 CDC를 감소시키는 특정 돌연변이를 함유하는 IgG1 불변 영역이 따로 기재되었다(Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75(24); 12161-12168).
잔기 Asn297에 특정 돌연변이 또는 변경된 글리코실화를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역은 또한 Fc 수용체에 대한 결합을 향상시키는 것으로 기재되었다. 일부 경우에, 이들 돌연변이는 또한 ADCC 및 CDC를 향상시키는 것으로 밝혀졌다(Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).
본 발명의 한 구체예에서, 상기 돌연변이는 239, 332 및 330(IgG1)으로부터 선택된 위치 중 하나 이상, 또는 다른 IgG 아이소형 내의 동등한 위치에 존재한다. 적합한 돌연변이의 예는 S239D 및 I332E 및 A330L이다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명의 항원 결합 단백질은 S239D 및 I332E와 같이 위치 239 및 332에서 돌연변이되거나, 한 추가 구체예에서, 이는 S239D 및 I332E 및 A330L과 같이 239 및 332 및 330으로부터 선택된 3개 이상의 위치에서 돌연변이된다(EU 지표 넘버링).
본 발명의 대안적인 구체예에서, 항원 결합 단백질이 향상된 효과기 기능을 갖도록 하는 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC를 갖거나, 이는 향상된 ADCC 및 CDC 효과기 기능 둘 모두를 갖는다. 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키기에 적합한 방법의 예는 WO2003011878호, WO2006014679호 및 EP1229125호에 기재되어 있으며, 상기 모두는 본 발명의 항원 결합 단백질에 적용될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 VEGF에 결합할 수 있는 에피토프 결합 도메인을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "VEGF"는, 특히 VEGF-A, 예를 들어 인간 VEGF-A, 그리고 VEGF165와 같은 VEGF-A의 임의의 아이소형을 포함하는 어떠한 VEGF 분자를 언급한다.
본 발명의 항원 결합 작제물은, 한 양태에서, 항체의 단일쇄 Fc 영역에 의해 분리된 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함한다. 분리된 이라 함은 에피토프 결합 도메인이 또 다른 에피토프 결합 도메인에 직접 부착되지 않음을 의미한다. 한 양태에서, 에피토프 결합 도메인은 Fc 영역의 맞은편 말단에 위치한다. 한 에피토프 결합 도메인은 N-말단에 부착되고 다른 하나는 C-말단에 부착된다. 각각의 에피토프 결합 도메인은 독립적으로 선택되며 그러한 도메인은 VEGF 상의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
한 양태에서, 에피토프 결합 도메인은 항체의 Fc 영역의 N-말단 끝에 부착되고, 본 발명의 항원 결합 작제물에서, 중쇄 또는 경쇄 dAb이며, 이 때 경쇄 dAb는 카파 또는 람다 경쇄일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 작제물이 C-말단에 부착된 에피토프 결합 도메인을 지니는 경우, 에피토프 결합 도메인은 경쇄 dAb이고, 이 때 경쇄 dAb는 카파 또는 람다 경쇄일 수 있다.
또한 추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 작제물이 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 경우, Fc 영역의 N-말단에 부착된 하나는 중쇄 dAb이고, Fc 영역의 C-말단에 부착된 하나는 경쇄 dAb이다.
또한 추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 작제물이 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 경우, Fc 영역의 N-말단에 부착된 하나는 경쇄 dAb이고, Fc 영역의 C-말단에 부착된 하나는 경쇄 dAb이다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 융합 단백질로서 발현될 수 있거나, 에피토프 결합 도메인은 별도로 발현되고, 당 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 화학적 컨쥬게이션과 같은 또 다른 수단에 의해 연결될 수 있다.
에피토프 결합 도메인은 항체의 Fc 영역에 직접 부착되거나 링커를 통해 간접적으로 부착될 수 있다. dAb의 N-말단이 항체의 Fc 영역의 C-말단에 융합된 작제물에서, 펩티드 링커는 dAb의 항원 결합능을 향상시킬 수 있다. 실제로, dAb의 N-말단 끝은 항원-결합 활성에 수반된 상보성-결정 영역 (CDR)에 가깝게 위치한다. 따라서 펩티드 링커는 에피토프-결합부 및 단백질 스캐폴드의 불변 도메인 사이에서 스페이서로 기능할 수 있는데, dAb CDR이 항원에 더욱 용이하게 도달하도록 하고, 일부 환경에서, 보다 높은 친화성으로 결합하도록 할 수 있다. 더욱이, 특정 펩티드 링커, 예를 들어 7개가 넘는 아미노산 길이의 것들은 본원에 기재된 이종이합체 및 동종이합체에서 항체의 Fc 영역의 C-말단에 부착된 경쇄 dAb에 대한 항체의 Fc 영역의 N-말단에 부착된 중쇄 dAb의 결합을 촉진하고 가능하게 할 수 있다. 그러한 결합은 본 발명의 이합체 및 항원 결합 작제물의 항원 결합능 및/또는 그 밖의 특성을 향상시킬 수 있다.
항체의 Fc 영역의 C-말단 끝에서 융합되는 경우, 각각의 dAb는 Fc 부분의 CH3 도메인 부근에 위치할 수 있다. 이는 Fc 수용체 (예컨대 FcγRI, II, III 및 FcRn)에 대한 Fc 결합 특성에 영향을 미치지 않을 것으로 예상되는데, 그 이유는 상기 수용체가 CH2 도메인 (수용체의 FcγRI, II 및 III 부류에 대해) 또는 CH2와 CH3 도메인 사이의 힌지 (예컨대 FcRn 수용체)와 연동되기 때문이다. 상기 항원 결합 작제물의 또 다른 특징은 둘 모두의 dAb가 서로 공간적으로 가깝게 존재하는 것이 예상된다는 점이며, 적절한 링커의 제공에 의해 유연성(flexibility)이 제공되는 경우, 이러한 dAb가 심지어 동종이합체 종을 형성할 수 있고, 이에 따라 Fc 부분의 '지퍼가 채워진(zipped)' 4차 구조를 증대시켜, 작제물의 안정성을 향상시킬 수 있다.
적합한 링커의 예는 1개의 아미노산 내지 150개의 아미노산 길이, 또는 1개의 아미노산 내지 140개의 아미노산, 예를 들어, 1개의 아미노산 내지 130개의 아미노산, 또는 1 내지 120개의 아미노산, 또는 1 내지 80개의 아미노산, 또는 1 내지 50개의 아미노산, 또는 1 내지 20개의 아미노산, 또는 1 내지 10개의 아미노산, 또는 5 내지 18개의 아미노산, 또는 7개를 초과하나 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150개 이하의 아미노산일 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 이들 자체의 3차 구조를 가질 수 있고, 예를 들어, 본 발명의 링커는 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 링커의 크기는 단일 가변 도메인과 동등하다. 적합한 링커는 길이에 있어 1 내지 100 옹스트롬의 크기일 수 있고, 예를 들어 20 내지 80 옹스트롬의 크기일 수 있거나, 예를 들어, 20 내지 60 옹스트롬, 또는 예를 들어 40 옹스트롬 미만, 또는 20 옹스트롬 미만, 또는 5 옹스트롬 미만의 크기일 수 있다.
한 양태에서, 링커는 7개 초과 및 150개 이하의 아미노산 길이이다.
링커의 예는 이로 제한하려는 것은 아니지만 SEQ ID No. 57 내지 63 및 66 내지 82에 개요된 것들을 포함한다. 한 양태에서, 링커는 SEQ ID No. 58, 60, 62, 63 및 75로부터 선택된다.
본 발명의 항원 결합 작제물이 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 경우, 에피토프 결합 도메인은 동일하거나 상이한 링커에 의해 항체의 Fc 영역에 부착될 수 있다.
한 양태에서, 에피토프 결합 도메인을 항체의 Fc 영역의 N-말단에 부착시키기 위해 링커를 이용하는 경우, 링커는 SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60 및 62로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 양태에서, N-말단 링커는 SEQ ID no. 58 또는 SEQ ID No. 60이다.
한 양태에서, 에피토프 결합 도메인을 항체의 Fc 영역의 C-말단에 부착시키기 위해 링커를 이용하는 경우, 링커는 SEQ ID No. 63 및 SEQ ID No. 75로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 링커는 SEQ ID No. 63이다.
한 양태에서, 본 발명의 항원 결합 작제물에 사용되는 링커는 GS 잔기, 예를 들어 'GSTVAAPS' 또는 'TVAAPSGS' 또는 'GSTVAAPSGS' 중 하나 이상의 세트를 단독으로 또는 다른 링커에 추가하여 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(PAS)n(GS)m', '(GGGGS)n(GS)m', '(TVAAPS)n(GS)m', '(GS)m(TVAAPSGS)n', '(PAVPPP)n(GS)m', '(TVSDVP)n(GS)m', '(TGLDSP)n(GS)m'에 의해 항체의 Fc 영역에 연결되며, 여기서 n = 1-10, 및 m = 0-4이다.
이러한 링커의 예는 (PAS)n(GS)m (여기서 n=1 및 m=1), (PAS)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=1), (PAS)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=1), (PAS)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=1), (PAS)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=0), (PAS)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=0), (PAS)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (GGGGS)n(GS)m (여기서 n=1 및 m=1), (GGGGS)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=1), (GGGGS)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=1), (GGGGS)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=1), (GGGGS)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=0) (SEQ ID NO:49), (GGGGS)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=0) (SEQ ID NO:50), (GGGGS)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (TVAAPS)n(GS)m (여기서 n=1 및 m=1), (TVAAPS)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=1), (TVAAPS)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=1), (TVAAPS)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=1), (TVAAPS)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=0), (TVAAPS)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=0), (TVAAPS)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=1 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=2 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=3 및 m=1), 또는 (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=4 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=5 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=6 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=1 및 m=0), (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=2 및 m=10), (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=3 및 m=0), 또는 (GS)m(TVAAPSGS)n (여기서 n=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (PAVPPP)n(GS)m (여기서 n=1 및 m=1), (PAVPPP)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=1), (PAVPPP)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=1), (PAVPPP)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=1), (PAVPPP)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=0), (PAVPPP)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=0), (PAVPPP)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (TVSDVP)n(GS)m (여기서 n=1 및 m=1), (TVSDVP)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=1), (TVSDVP)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=1), (TVSDVP)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=1), (TVSDVP)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=0), (TVSDVP)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=0), (TVSDVP)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (TGLDSP)n(GS)m (여기서 n=1 및 m=1), (TGLDSP)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=1), (TGLDSP)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=1), (TGLDSP)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=1), (TGLDSP)n(GS)m (여기서 n=2 및 m=0), (TGLDSP)n(GS)m (여기서 n=3 및 m=0), (TGLDSP)n(GS)m (여기서 n=4 및 m=0)을 포함한다.
이용될 수 있는 추가의 링커는 WO 2009068649호에 기재되어 있다.
항원 결합 작제물은 링커로서 알부민 또는 이의 단편을 추가로 포함할 수 있고 DETYVPKEFNAETFGS, DETYVPKEFNAETF, EVDETYVPKEFNAETFTFHADGS, EVDETYVPKEFNAETFTFHAD, DDNPNLPRLVRPE, DEMPADLPSLAADF, HKDDNPNLPRLVRPEVDVM, 및 ENDEMPADLPSLAADFVESKD와 같이 인간 혈청 알부민으로부터 유래될 수 있다. 링커는 일부 추가 잔기를 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어, 이들은 추가의 글리신 및 세린 잔기를 포함할 수 있거나 링커의 한 쪽 말단으로부터 제거된 아미노산을 지닐 수 있는데, 예를 들어 한 양태에서 5개의 아미노산이 제거된다. 이러한 추가의 잔기는 알부민-유래 서열의 시작부 또는 단부에 있을 수 있거나, 알부민-유래 서열 내에 있을 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물에 관한 것이고, 여기서 각각의 에피토프 결합 도메인은 독립적으로 선택된 dAb이고, DOM 15-26-593, DOM 15-26-597, DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 97% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가 양태에서, 각각의 에피토프 결합 도메인은 DOM 15-26-593, DOM 15-26-597, DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 및 DT02-K-044-255로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 dAb이다.
추가 양태에서, 단일쇄 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb는 DOM 15-26-597 또는 DT02-K-044-085의 서열과 97% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가 양태에서, 단일쇄 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb는 DOM 15-26-597 또는 DT02-K-044-085이다.
추가 양태에서, 단일쇄 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb는 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 97% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가 양태에서, 단일쇄 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb는 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255이다.
추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 작제물은,
(a) DOM 15-26-597-AS-Fc (SEQ ID No. 110)-피브로넥틴 x 4-DT02-K-044-085; 또는
e) (b) DOM 15-26-597-IgG1 힌지-Fc (SEQ ID No. 110)-피브로넥틴 x 4-DT02-K-044-085; 또는
f) (c) 전체 서열에 걸쳐 97% 이상의 아미노산 동일성을 지니는 (a) 또는 (b)의 변이체; 또는
g) (d) 각각의 dAb 서열이 특수한 dAb의 서열과 97% 이상의 서열 동일성을 지니는 (a) 또는 (b)의 변이체이다.
본 발명은 추가로 항체의 단일쇄 Fc 영역에 부착된 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물에 관한 것이고, 여기서 에피토프 결합 도메인은 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 97% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 dAb이고, 추가로 에피토프 결합 도메인은 VEGF에 결합할 수 있다.
또한 추가 양태에서, 본 발명은 항체의 단일쇄 Fc 영역에 부착된 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물에 관한 것이고, 여기서 에피토프 결합 도메인은 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255로부터 선택된 dAb이다.
한 양태에서, 항원 결합 작제물은 하기 구조를 지닌다 (N에서 C 말단):
a. Fc-링커 C-DT02-K-044-085 dAb;
b. DOM 15-26-593 dAb-링커 N-Fc-링커 C-DT02-K-044-085 dAb;
c. DOM 15-26-597 dAb-링커 N-Fc-링커 C-DT02-K-044-085 dAb;
d. DT02-K-044-085 dAb-링커 N-Fc-링커 C-DT02-K-044-085 dAb;
e. Fc-링커 C-DT02-K-044-251 dAb;
f. DOM15-26-597 dAb-링커 N-Fc-링커 C-DT02-K-044-251 dAb;
g. DT02-K-044-251 dAb-링커 N-Fc-링커 C-DT02-K-044-251 dAb;
h. a-g에 대해, 링커 N은 SEQ ID NO:57-63 & SEQ ID NO:76-82에 기재된 임의의 것일 수 있다;
i. a-g에 대해, 링커 C는 SEQ ID NO:66-75 & SEQ ID NO:85-94에 기재된 임의의 것일 수 있다;
j. a-g에 대해, Fc는 SEQ ID NO:64,65,102 & SEQ ID NO:83,84,110에 기재된 임의의 것일 수 있다;
k. 적어도 97%의 아미노산 동일성을 지니는 a-j 중 어느 하나의 변이체;
l. dAb 서열이 특수한 dAb의 서열과 적어도 97%의 동일성을 지니는 a-j 중 어느 하나의 변이체.
추가 양태에서, 본 발명의 항원 결합 작제물은 하기 구조를 지닌다:
dAb1-링커N-Fc-링커C-dAb2
상기에서, dAb1은 하기로 정의될 수 있고:
Figure pct00002
링커N은 하기로 정의될 수 있고:
Figure pct00003
Fc는 하기로 정의될 수 있고:
Figure pct00004
링커C는 하기로 정의될 수 있고:
Figure pct00005
dAb2는 하기로 정의될 수 있다:
Figure pct00006
단백질에 결합할 수 있는 자연 발생 자가항체는 인간에 존재한다. 따라서 자가항체는 내인성 단백질 (나이브 피검체에 존재)뿐 아니라 치료를 위해 피검체에 투여된 단백질 또는 펩티드에 결합할 수 있다. 치료적 단백질-결합 자가항체 및 약물 치료에 반응하여 새롭게 형성된 항체를 총괄적으로 항-약물 항체 (ADA)로 지칭한다. 피검체에 투여된 치료적 단백질 및 펩티드와 같은 분자에 대해 이미-존재하는 항체는 그 분자를 유지하거나, 제거하거나 또는 중화시킴에 의해 그 효능에 영향을 줄 수 있고, 투여 반응, 과민성, 치료된 환자에서 변경된 임상 반응 및 변경된 생체이용률을 초래할 수 있었다. 감소된 면역원성 (즉, 피검체, 특히 인간 피검체에 투여되는 경우 이미-존재하는 ADA에 대한 감소된 결합능)을 지니는 인간 면역글로불린 (항체) 단일 가변 도메인 또는 dAb를 포함하는 치료용 분자를 제공하는 것이 유리할 수 있었다.
이에 따라, 본 발명의 한 양태에서, 변형되지 않은 동등한 분자에 비해 이미-존재하는 항체 (ADA)에 대한 감소된 결합능을 지닌, 변형된 dAb 또는 그러한 변형된 dAb를 포함하는 항원 결합 작제물 또는 이합체가 제공된다. 감소된 결합능이라 함은 변형된 분자가 감소된 친화성 또는 감소된 결합활성으로 이미-존재하는 ADA에 결합함을 의미한다. 상기 변형된 dAb는 (a) C-말단 첨가, 연장, 결실 또는 태그(tag), 및/또는 (b) 하나 이상의 아미노산 프레임워크 치환으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다.
한 양태에서, 변형된 dAb 또는 그러한 변형된 dAb를 포함하는 항원 결합 작제물 또는 이합체는,
a) 서열 VTVS(S)nX [VH dAb의 경우] 또는 VEIKpRqX [VL dAb의 경우]로 구성된 C-말단 서열; 및 또한 임의로
b) 인간 생식세포 프레임워크 서열에 비해 위치 14, 41, 108, 110, 또는 112에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고,
여기서:
n은 0 또는 1에서 독립적으로 선택된 정수이고;
p 및 q는, p가 1일 때, q가 0 또는 1일 수 있게 하고, p가 0일 때, q도 0이 되도록 하는, 각각 0 또는 1이며;
X는 존재하거나 부재할 수 있고, 존재하는 경우, 1 내지 8개 아미노산 잔기의 아미노산 연장을 나타낸다.
한 양태에서, dAb의 C-말단 서열은 VEIKpRqX이고, 여기서 p는 1이고 q는 0이며 X는 부재한다.
추가 양태에서, 이미-존재하는 ADA에 감소된 결합능을 지니는 상기 변형된 dAb는 하나 이상의 아미노산 치환을 지니고, 여기서 상기 하나 이상의 아미노산 치환은 P14A 치환, P41A 치환, L108A 치환, T110A 치환, S112A 치환, P14K 치환, P14Q 치환, 및 P14T 치환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가 양태에서, X가 존재하며, 1 내지 8개 아미노산의 연장부, 특히 알라닌 잔기, 예를 들어 단일 알라닌 연장, 또는 AS, AST, ASTK, ASTKG, ASTKGP 연장을 포함하는 1 내지 8개 아미노산의 연장부이다.
추가 양태에서, X가 존재하며, 1 내지 8개 아미노산의 연장부, 특히 A, AAA 또는 T 연장을 포함하는 1 내지 8개 아미노산의 연장부이다.
한 양태에서, 변형된 dAb는 C 말단에 존재하는 태그를 포함할 수 있다. 태그는 당 분야에 공지된 임의의 태그, 예를 들어, 친화성 태그, 예컨대 myc-태그, FLAG 태그, his-태그, PEG와 같은 화학적 변형, 또는 항체 Fc 도메인과 같은 단백질 도메인일 수 있다.
C 말단 첨가 또는 연장 또는 태그는 분자의 C 말단과의 직접 융합체 또는 컨쥬게이트로서 존재할 수 있다.
당업자에게 널리 공지된 면역검정을 이용하여 변형된 dAb가 ADA에 대한 요망되는 감소된 결합능을 지님을 확인할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항원 결합 작제물의 이합체에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "이합체"는 2개의 항원 결합 작제물, 즉 이합체를 형성하기 위해 서로 결합하는 2개의 사슬을 포함하는 폴리펩티드 복합체를 의미한다. 이합체는 본 발명의 2개의 동일한 항원 결합 작제물을 포함하는 동종이합체 또는 본 발명의 2개의 상이한 항원 결합 작제물을 포함하는 이종이합체일 수 있다. 본 발명의 동종이합체 및 이종이합체는 표적 VEGF 분자에 대해 개선된 특성, 예컨대 친화성을 지닐 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 동종이합체 및 이종이합체는 Biacore™, 예컨대 본원의 방법에 기재된 Biacore™ 방법에 의해 측정하는 경우, 항원에 대해 적어도 1mM의 Kd, 예를 들어 적어도 10nM, 1nM, 500pM, 200pM, 100pM, <100pM, 10pM, 5pM, 1pM의 Kd로 VEGF에 결합할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물 및 이합체의 생체내 반감기는 면역글로불린 불변 도메인 또는 FcRn(Fc 수용체 신생아) 결합 도메인의 변형에 의해 증가될 수 있다.
성체 포유동물에서, 신생아 Fc 수용체로도 공지된 FcRn은 IgG 아이소형의 항체에 결합하고, 분해로부터 이를 지키는 보호 수용체로 작용함으로써 혈청 항체 수준을 유지시키는데 중요한 역할을 한다. IgG 분자는 내피세포에 의해 세포내이입되고, 이들이 FcRn에 결합하는 경우, 순환으로 재순환된다. 대조적으로, FcRn에 결합하지 않는 IgG 분자는 세포에 진입하고, 리소좀 경로로 표적화되고, 여기서 이들은 분해된다.
신생아 FcRn 수용체는 항체 청소 및 조직을 통한 세포질통과(transcytosis) 둘 모두와 관련된 것으로 생각된다(Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 and Ghetie et al (2000) Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766 참조). 인간 FcRn과 직접적으로 상호작용하는 것으로 확인된 인간 IgG1 잔기는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함한다. 본 단락에 기재된 상기 위치 중 임의의 위치에서의 교환은 본 발명의 항원 결합 단백질의 증가된 혈청 반감기 및/또는 변경된 효과기 특성을 가능케 할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 FcRn에 대한 불변 도메인 또는 이의 단편의 친화성을 증가시키는 아미노산 변형을 가질 수 있다. 치료 및 진단 IgG 및 다른 생활성 분자의 반감기를 증가시키는 것은 상기 분자 투여의 양 및/또는 빈도의 감소를 포함하는 많은 이점을 갖는다. 한 구체예에서, 따라서, 본원에 제공된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 상기 아미노산 변형 중 하나 이상을 갖는 IgG 불변 도메인의 전부 또는 일부(FcRn 결합 부분)를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 변형된 IgG 불변 도메인에 컨쥬게이션된 비-IgG 단백질 또는 비-단백질 분자가 제공되며, 변형된 IgG 불변 도메인의 존재는 항원 결합 단백질의 생체내 반감기를 증가시킨다.
PCT 공개 번호 WO 00/42072호에는 변경된 FcRn 결합 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 개시되어 있으며, 상기 폴리펩티드는 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, 및 447 중 어느 하나 이상에서 아미노산 변형을 포함하고, Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 EU 지표의 넘버링이다(Kabat et al).
PCT 공개 번호 WO 02/060919 A2호에는 야생형 IgG 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG가 개시되어 있으며, 상기 변형된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 위치 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389, 및 428-435 중 하나 이상에 존재한다.
문헌[Shields et al. (2001, J Biol Chem; 276:6591-604)]에서는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 내의 잔기를 변경시킨 후, 인간 FcRn에 대한 결합을 평가하는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 이용하였다. 알라닌으로 변경되는 경우 FcRn에 대한 결합을 효과적으로 폐기시키는 위치는 I253, S254, H435, 및 Y436을 포함한다. E233-G236, R255, K288, L309, S415, 및 H433과 같은 다른 위치는 결합에서 덜 현저한 감소를 나타내었다. 여러 아미노산 위치는 알라닌으로 변경된 경우 FcRn 결합에서 개선을 나타내었고, 이들 중 현저한 것은 P238, T256, E272, V305, T307, Q311, D312, K317, D376, E380, E382, S424, 및 N434이다. 많은 다른 아미노산 위치는 FcRn 결합에서 약간의 개선(D265, N286, V303, K360, Q362, 및 A378)을 나타내거나, 변화를 나타내지 않았다(S239, K246, K248, D249, M252, E258, T260, S267, H268, S269, D270, K274, N276, Y278, D280, V282, E283, H285, T289, K290, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, E318, K320, K322, S324, K326, A327, P329, P331, E333, K334, T335, S337, K338, K340, Q342, R344, E345, Q345, Q347, R356, M358, T359, K360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, E388, N389, N390, K392, L398, S400, D401, K414, R416, Q418, Q419, N421, V422, E430, T437, K439, S440, S442, S444, 및 K447).
가장 현저한 효과는 FcRn에 대해 개선된 결합능을 갖는 조합 변이체에 대해 발견되었다. pH 6.0에서, E380A/N434A 변이체는 자연 IgG1에 비해 FcRn에 대해 8배를 초과하는 양호한 결합을 나타내었고, E380A에 대해서는 2배 및 N434A에 대해서는 3.5배였다. 상기에 T307A를 추가하는 것은 자연 IgG1에 비해 결합에 있어서 12배 개선을 초래하였다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 E380A/N434A 돌연변이를 포함하며, FcRn에 대한 증가된 결합을 갖는다.
문헌[Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol. ;169:5171-80)]에는 마우스 FcRn에 대한 인간 IgG1 힌지-Fc 단편 파지 디스플레이 라이브러리의 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝이 기재되어 있다. 여기에는 위치 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434, 및 436의 무작위 돌연변이유발이 개시되어 있다. IgG1-인간 FcRn 복합체 안정성에서의 주요 개선은 Fc-FcRn 접촉면 전체에 걸친 밴드 내에 위치된 잔기 치환(M252, S254, T256, H433, N434, 및 Y436), 및 V308, L309, Q311, G385, Q386, P387, 및 N389와 같이 주변의 잔기의 더 적은 정도의 치환에서 발생한다. 인간 FcRn에 대해 가장 높은 친화성을 갖는 변이체는 M252Y/S254T/T256E 및 H433K/N434F/Y436H 돌연변이를 조합시킴으로써 수득되었고, 이는 야생형 IgG1에 비해 친화성에서 57배 증가를 나타내었다. 상기 돌연변이된 인간 IgG1의 생체내 거동은 야생형 IgG1에 비해 시노몰구스 원숭이에서의 혈청 반감기에서 거의 4배 증가를 나타내었다.
따라서, 본 발명은 FcRn에 대한 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질의 변이체를 제공한다. 한 바람직한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 상기 변이체는 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역 내에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은 상기 부모 폴리펩티드에 비해 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 군으로부터 선택되고, Fc 영역 내의 아미노산의 넘버링은 케이뱃 내의 EU 지표의 넘버링이다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 변형은 M252Y/S254T/T256E이다.
추가로, 다양한 간행물에는 분자에 FcRn-결합 폴리펩티드를 도입(WO 97/43316; U.S. Patent N° 5,869,046; U.S. Patent N° 5,747,035; WO 96/32478; WO 91/14438)시키거나, FcRn-결합 친화성은 보존되나, 다른 Fc 수용체에 대한 친화성이 크게 감소된 항체를 분자와 융합(WO 99/43713)시키거나, 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합(WO 00/09560; U.S. Patent N° 4,703,039)시킴에 의해 반감기가 변형된 생리학적 활성 분자를 수득하는 방법이 기재되어 있다.
추가로, 감소된 생물학적 반감기를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 또한 제공된다. His435가 알라닌으로 돌연변이된 변이체 IgG는 FcRn 결합의 선택적 손실, 및 현저히 감소된 혈청 반감기를 발생시킨다(Firan et al. 2001, International immunology 13:993). 미국 특허 번호 6,165,745호에는 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 DNA 세그먼트에 돌연변이를 도입시킴으로써 감소된 생물학적 반감기를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 개시되어 있다. 돌연변이는 Fc-힌지 도메인의 위치 253, 310, 311, 433, 또는 434에서의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 특수한 항원 결합 작제물 서열, 예컨대 에피토프 결합 도메인 서열, 예컨대 dAb 서열, 또는 전체 항원 결합 작제물의 서열의 변이체에 관한 것이다. 적합하게는, 변이체는 명시된 서열과 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 한편, 적합하게는 부모 서열의 결합 특성, 또는 부모가 다중-특이적인 경우 하나 이상의 결합 특성, 예컨대 VEGF-A와 같은 VEGF에 대한 약간의 결합 친화성을 실질적으로 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로 임의의 변이체는 부모의 결합 친화성의 적어도 30%, 적합하게는 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과를 지닐 것이고, 적합하게는 부모 서열(그 이상)의 100%를 지닐 것이다.
한 양태에서, 항원 결합 작제물은 항원 결합 작제물이 VEGF, 예컨대 VEGF-A에 결합할 수 있는 한, 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산만큼 변화될 수 있다.
한 양태에서, 에피토프 결합 도메인 서열은 도메인 항체 (dAb)로부터의 CDR 또는 CDR들을 포함한다. 본원에서 동정되거나 언급된 임의의 서열의 CDR은 항원 결합 작제물이 VEGF, 예컨대 VEGF-A에 결합할 수 있는 한, 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산만큼 변화될 수 있다.
CDR은 항원 결합 단백질의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 이들은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 과가변 영역이다.
본 명세서를 통틀어, 가변 도메인 서열의 아미노산 잔기는 달리 명시되지 않는 한 케이뱃 넘버링 규칙에 따라 넘버링된다. 추가 정보를 위해, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조하라.
하기 표 (표 1)는 각각의 CDR 또는 결합 단위에 대해 각 넘버링 규칙을 이용한 한 가지 정의를 나타낸다. 가변 도메인 아미노산 서열을 넘버링하기 위해 케이뱃 넘버링 구조가 표 1에서 이용된다. CDR 정의 중 일부는 이용된 개개의 간행물에 따라 달라질 수 있음이 인지되어야 한다.
표 1: CDR 에 대한 넘버링 규칙
Figure pct00007
한 양태에서, 본 발명은 2개의 dAb를 포함하는 항원 결합 작제물을 제공하고, 이 때 각각의 dAb는 독립적으로 선택되며 하기를 포함한다:
i) CDR 서열 SEQ ID No. 111, 112 및 113 중 하나 이상;
ii) CDR 서열 SEQ ID No. 114, 115 및 116 중 하나 이상;
iii) CDR 서열 SEQ ID No. 117, 118 및 119 중 하나 이상;
iv) CDR 서열 SEQ ID No. 120, 121 및 122 중 하나 이상;
v) CDR 서열 SEQ ID No. 123, 124 및 125 중 하나 이상;
vi) CDR 서열 SEQ ID No. 126, 127 및 128 중 하나 이상; 또는
vii) CDR 서열 SEQ ID No. 129, 130 및 131 중 하나 이상.
추가 양태에서, 본 발명은 2개의 dAb를 포함하는 항원 결합 작제물을 제공하고, 이 때 항체의 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb는 하나 이상의 CDR 서열 SEQ ID No. 114, 115 및 116을 포함하고, 항체의 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb는 하나 이상의 CDR 서열 SEQ ID No. 117, 118 및 119를 포함한다.
또한 추가 양태에서, 본 발명은 하나의 dAb를 포함하는 항원 결합 작제물을 제공하며, dAb는 하기를 포함한다:
i) CDR 서열 SEQ ID No. 117, 118 및 119 중 하나 이상;
ii) CDR 서열 SEQ ID No. 120, 121 및 122 중 하나 이상;
iii) CDR 서열 SEQ ID No. 123, 124 및 125 중 하나 이상;
iv) CDR 서열 SEQ ID No. 126, 127 및 128 중 하나 이상; 또는
v) CDR 서열 SEQ ID No. 129, 130 및 131 중 하나 이상.
한 양태에서, 예를 들어 VEGF, 예컨대 VEGF-A와의 결합에 대해 본원에 기재된 항원 결합 작제물 또는 이합체와 경쟁하는 항원 결합 작제물 또는 이합체가 제공된다.
한 양태에서, 본원에 기재된 항원 결합 작제물 및 이합체는 VEGF-A와의 결합에 대해 아바스틴과 경쟁할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 항원 결합 작제물 및 이합체는 하나 이상의 항원을 중화시킬 수 있을 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 항원 결합 작제물에 관해 본 명세서를 통틀어 사용되는 용어 "중화시키다" 및 이의 문법적 변형예는 본 발명의 항원 결합 작제물의 존재하에 표적의 생물학적 활성이 그러한 항원 결합 작제물의 부재하에서의 표적의 활성에 비해 전적으로 또는 부분적으로 감소되는 것을 의미한다. 중화는 리간드 결합 차단, 리간드가 수용체를 활성화시키는 것의 방지, 수용체의 하향 조절, 또는 효과기 기능의 영향 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
중화를 평가하는 방법, 예를 들어 중화성 항원 결합 작제물의 존재하에 리간드와 그 수용체간의 감소된 결합능을 평가함에 의해 중화를 평가하는 방법은 당 분야에 알려져 있고, 수용체 결합 검정 (본원의 실시예 7, 17, 26, 41 및 50을 참조하라) 및 토끼 망막 누출 모델 (본원의 실시예 9 및 42를 참조하라)을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 작제물을 엔코딩하거나 에피토프 결합 도메인 서열과 같은 그러한 작제물의 일부를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열에 관한 것이다. 적합하게는, 폴리누클레오티드는 VEGF, 예컨대 VEGF-A에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 엔코딩한다. 본 발명은 또한 상기 항원 결합 작제물 또는 이의 일부와 적어도 70%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 항원을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열에 관한 것이다. 한 양태에서, 항원 결합 작제물 또는 이의 일부는 VEGF, 예컨대 VEGF-A에 결합하여 VEGF, 예컨대 VEGF-A 신호전달과 관련된 질환을 완전히 또는 부분적으로 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 특수한 폴리누클레오티드 서열과 적어도 70%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 971%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성을 갖는 폴리누클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명의 항원 결합 작제물은 본 발명의 항원 결합 작제물에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용한 숙주 세포의 트랜스펙션에 의해 생성될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 상기 항원 결합 작제물에 대한 상기 코딩 서열을 숙주 세포에서의 복제 및 발현, 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상적인 조절성 조절 서열과 작동가능하게 관련되도록 배치시킴으로써 생성된다. 조절성 서열은 프로모터 서열, 예를 들어, CMV 프로모터, 및 다른 공지된 항체로부터 유래될 수 있는 신호 서열을 포함한다. 유사하게, 상보적 항원 결합 작제물을 엔코딩하는 DNA 서열을 갖는 두 번째 발현 벡터가 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 두 번째 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 사슬이 기능적으로 발현되는 것을 보장하기 위해 코딩 서열 및 선택 마커가 관련된 것을 제외하고는 첫번째 발현 벡터와 동일하다. 대안적으로, 동종이합체 또는 이종이합체를 형성하는 2개의 항원 결합 작제물에 대한 코딩 서열은 단일한 벡터 상, 예를 들어, 동일 벡터 내의 2개의 발현 카세트 내에 존재할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
선택된 숙주 세포는 통상적인 기술에 의해 첫 번째 및 두 번째 벡터 둘 모두로 공동 트랜스펙션(또는 간단히 단일 벡터에 의해 트랜스펙션)되어 본 발명의 트랜스펙션된 숙주 세포를 생성할 수 있다. 트랜스펙션된 세포는 이후 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 발명의 공학처리된 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 생성한다. 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체는 적절한 검정, 예를 들어, ELISA 또는 RIA에 의해 배양물로부터 스크리닝된다. 유사한 통상적 기술이 본원에 기재된 다른 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 작제하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물의 작제에 사용되는 클로닝 및 서브클로닝 단계에 적합한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터의 통상적인 pUC 시리즈, 예컨대, pUC19가 이용될 수 있다. 추가로, 용이하게 복제될 수 있는 임의의 벡터는 다수의 클로닝 부위 및 선택 유전자(예를 들어, 항생제 내성)를 가지며, 용이하게 조작되며, 클로닝에 사용될 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서 제한 요인이 아니다.
발현 벡터는 또한 이종성 DNA 서열, 예를 들어, 포유동물 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR)의 발현을 증폭시키는데 적합한 유전자를 특징으로 할 수 있다. 다른 바람직한 벡터 서열은 폴리 A 신호 서열, 예를 들어, 소 성장 호르몬(BGH)으로부터의 폴리 A 신호 서열 및 베타글로빈 프로모터 서열(betaglopro)을 포함한다. 본원에서 유용한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 합성될 수 있다.
상기 벡터의 구성요소, 예를 들어, 레플리콘, 선택 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호서열 등은 시판 업체 또는 자연 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 선택된 숙주에서 재조합 DNA의 생성물의 발현 및/또는 분비를 유도하는데 사용하기 위한 공지된 절차에 의해 합성될 수 있다. 다수의 유형이 포유동물, 박테리아, 곤충, 효모, 및 진균 발현을 위해 당 분야에 공지된 다른 적절한 발현 벡터가 또한 상기 목적을 위해 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션된 세포주를 포함한다. 이러한 클로닝 벡터의 클로닝 및 다른 조작에 유용한 숙주 세포가 또한 통상적이다. 그러나, E. 콜라이(E. coli)의 다양한 균주로부터의 세포가 본 발명의 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체의 작제에서 클로닝 벡터의 복제 및 다른 단계에 사용될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 작제물, 이종이합체 또는 동종이합체의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 포유동물 세포, 예를 들어, NS0, Sp2/0, CHO(예를 들어, DG44), COS, HEK, 섬유모세포 세포(예를 들어, 3T3), 및 골수종 세포를 포함하며, 예를 들어, 이는 CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다. 인간 세포가 사용될 수 있고, 따라서 분자가 인간 글리코실화 패턴으로 변형되는 것이 가능할 수 있다. 대안적으로, 다른 진핵생물 세포주가 이용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주세포의 선택, 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생성 및 정제를 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. 1989: Cold Spring harbour Press, Molecular Cloning: Laboratory Manual]을 참조하라.
박테리아 세포 및 요망되는 경우, 당업자에게 공지된 효모 세포의 균주, 뿐만 아니라 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) 및 레피돕테라(Lepidoptera) 및 바이러스 발현 시스템이 숙주 세포로서 또한 이용가능하다. 예를 들어, 문헌[Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조하라.
또 다른 양태에서, 본 발명은 숙주 세포를 배양하고 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 분리시키는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 알파 1,6-푸코실트랜스퍼라제를 엔코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 비활성화된 단계; 및
b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 생산하는 방법을 제공한다.
항원 결합 작제물, 이종이합체 또는 동종이합체의 생산을 위한 상기 방법은, 예를 들어, 기능성 FUT8 유전자를 갖는 세포에서 생산된 동일한 단백질에 비해 증가되는 향상된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성을 갖는 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 생산시킬 수 있는, BioWa, Inc.(Princeton, NJ)로부터 이용가능한 POTELLIGENT™ technology system을 이용하여 수행될 수 있다. POTELLIGENT™ technology system의 양태는 모두 참조로서 본원에 포함되는 US7214775호, US6946292호, WO0061739호 및 WO0231240호에 기재되어 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 인지할 것이다.
본 발명은 또한
a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 Fc 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및
b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 생산하는 방법을 제공한다.
항원 결합 작제물, 이종이합체 또는 동종이합체의 생산을 위한 상기 방법은, 예를 들어, 재조합 숙주 세포가, IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열이 발현되어 상기 키메라 Fc 도메인이 결핍된 달리 동일한 단백질에 비해 증가되는 향상된 보체 의존성 세포독성(CDC) 활성을 갖는 항원 결합 작제물, 이종이합체 또는 동종이합체를 생산시키는 발현 벡터를 포함하는, BioWa, Inc.(Princeton, NJ) 및 Kyowa Hakko Kogyo(현재, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd.로부터 이용가능한 COMPLEGENT™ technology system을 이용하여 수행될 수 있다. COMPLEGENT™ technology system의 양태는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 WO2007011041호 및 US20070148165호에 기재되어 있다. 한 대안적 구체예에서, CDC 활성은 IgG 사슬의 Fc 영역으로 서열 특이적 돌연변이를 도입시킴으로써 증가될 수 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 인지할 것이다.
이러한 변형은 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 효과기 기능을 추가로 향상시키기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 한 양태에서, IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함하는, 돌연변이된 중쇄 불변 영역 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 작제물, 이종이합체 또는 동종이합체가 제공되며, IgG1 CH2 도메인은 239 및 332 및 330으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택될 수 있음)를 지녀서, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 및 향상된 CDC를 갖는다. 한 양태에서, IgG1 CH2 도메인은 돌연변이 S239D 및 I332E를 갖는다.
본 발명의 한 대안적 양태에서, 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 항원 결합 작제물, 이종이합체 또는 동종이합체가 제공된다. 한 상기 양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함하고, 푸코스 대 만노스의 비가 0.8:3 또는 그 미만이 되도록 하는 변경된 글리코실화 프로파일을 가지며, 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 탈푸코실화(defucosylation)되어 상기 항원 결합 단백질은 상기 돌연변이 및 변경된 글리코실화 프로파일이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는 동등한 항원 결합 단백질과 비교하여 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 및 향상된 CDC를 갖는다.
본 발명의 한 양태에서, 키메라 Fc 도메인이 결핍되어 있고 올리고당류 상에 푸코스를 갖는 달리 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가되는 ADCC 및 CDC 향상된 활성 둘 모두를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는, POTELLIGENT™ 및 COMPLEGENT™ technology systems을 조합시킨 BioWa, Inc.(Princeton, NJ)으로부터 이용가능한 ACCRETAMAB™ technology system을 이용하는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 작제물, 이종이합체 또는 동종이합체를 생산하는 방법이 제공된다.
항원 결합 작제물의 또 다른 발현 방법은 미국 특허 번호 4,873,316호에 기재된 바와 같이 유전자이식 동물에서의 발현을 이용할 수 있다. 이는 유전자이식에 의해 포유동물로 통합되는 경우 암컷이 이의 모유에서 요망되는 재조합 단백질을 생산하는 것을 가능케 하는 동물 카세인 프로모터를 이용하는 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항원 결합 작제물의 아미노산 서열 또는 이를 엔코딩하는 핵산, 또는 그 일부가 컴퓨터를 이용하여 설계되고 상기 작제물이 컴퓨터 상에 인 실리코(in silico) 존재하는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 작제물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약제에 사용하기 위한, 예를 들어 VEGF 신호전달, 예컨대 VEGF-A 신호전달과 관련된 질환, 예컨대 암 및 안질환(ocular disease), 예컨대 당뇨병성 황반 부종 (DME), 습식 AMD (노인성 황반 변성), 당뇨 망막병증, RVO, (망막 정맥 폐쇄), 및 각막 신혈관형성을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 작제물을 제공한다.
본 발명은 또한 치료량의 본 발명의 항원 결합 작제물을 투여하는 것을 포함하는, VEGF 신호전달, 예컨대 VEGF-A 신호전달에 의해 야기된 안구 혈관 질환, 예컨대 암 및 안질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종 (DME), 습식 AMD, 당뇨 망막병증, RVO, 및 각막 신혈관형성에 걸린 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 암 및 안질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종 (DME), 습식 AMD, 당뇨 망막병증, RVO, 및 각막 신혈관형성을 치료하기 위한 본 발명의 항원 결합 작제물에 관한 것이다.
치료 용량 및 지속기간은 인간 순환에서 본 발명의 분자의 상대 지속기간에 관한 것이며, 이는 환자의 치료되는 조건 및 전반적 건강에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 연장된 기간(예를 들어, 4 내지 6개월)에 걸친 반복된 투여(예를 들어, 주 1회 또는 2주에 1회)가 최대 치료 효능을 달성하는데 필요할 수 있음이 예견된다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 숙주에게 작용제를 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 작제물, 및 약학적 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하(s.c), 수막강내, 복막내, 근내(i.m.), 정맥내(i.v.), 또는 비내 투여에 특히 유용하다.
한 양태에서, 투여는 안구 적응증을 위한 것이고, 투여는 유리체내 (눈의 유리체에 직접 주입)와 같이 국소 안구 전달에 의하거나, 안구주위, 예를 들어 공막-통과, 결막하, 힘줄-아래, 눈둘레, 국소, 안구뒤이거나, 하측, 상측 또는 외측 곧은근으로 전달된다. 한 양태에서, 투여는 공막-통과 또는 국소 안구 전달에 의한다.
눈으로의 국소 투여의 경우, 예를 들어 유리체내 주입에 의해, 약학적 제조물은 30g 바늘을 이용하여 투여되는 50㎕의 부피와 같이, 25-30g의 바늘 게이지를 지닌 표준 주사기에 의한 단일 주입에 의해 투여되는 100㎕ 이하의 총 부피, 예를 들어 50-100㎕로 투여될 수 있었다. 잦지 않은 투여를 위해 제조되는 경우 상기 제형은 액체 부피 내에 15% 이하의 고형 현탁물을 함유할 수 있다. 상기 제형 중 활성 약제의 용량은 다양할 것이나, 바람직한 양태에서 25-30% 이하의 고형 현탁물을 포함할 수 있었다. 바람직한 양태에서, 안구 투여마다 0.5-2.5mg의 활성 약제가 투여된다.
한 양태에서, 투여는, 적합하게는 매달 주입 요법에 비해 감소된 빈도로 눈으로의 국소 투여를 가능하게 할 미립자 또는 겔-기반 시스템, 또는 리포솜 기반 시스템과 같은 지속성 또는 지효성 전달 시스템 또는 당업자에게 공지된 어떠한 다른 시스템을 이용한다. 상기 요법은 주 1회 또는 2주에 1회보다 덜 빈번하게 전달되게 할 수 있고, 예를 들어 이는 4주에 1회, 2개월 또는 8주, 3개월 또는 12주, 4개월 또는 16주, 5개월 또는 20주, 6개월 또는 24주, 9개월 또는 36주, 또는 12개월 또는 52주마다 1회일 수 있었다. 본 발명의 항원 결합 작제물, 이종이합체 및 동종이합체에 대한 바람직한 전달 빈도는 매 6개월 또는 24주에 1회이다.
본 발명의 치료제는 약학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 유효량의 본 발명의 항원 결합 작제물, 동종이합체 또는 이종이합체를 함유하는 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 예방적 작용제에서, 바람직하게는 주사 준비 형태로 생리학적 pH에서 완충된 항원 결합 작제물을 함유하는 수성 현탁액 또는 수용액이 바람직하다. 비경구 투여용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는, 수성 담체에 용해된 본 발명의 항원 결합 작제물 또는 이의 칵테일의 용액을 통상적으로 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등이 이용될 수 있다. 이들 용액은 멸균 제조될 수 있고, 일반적으로 미립자 물질을 함유하지 않는다. 이들 용액은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 근접시키기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 상기 약학적 제형 내의 본 발명의 항원 결합 작제물의 농도는 약 0.5 중량% 미만, 보통 약 1 중량% 또는 그 이상 내지 15 중량% 또는 20 중량% 만큼 매우 다양할 수 있고, 이는 주로 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등을 기초로 하여 선택될 것이다.
따라서, 근내 주사용의 본 발명의 약학적 조성물은 1 mL의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어, 약 50 ng 내지 약 30 mg, 또는 더욱 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원 결합 작제물을 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입용의 본 발명의 약학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거액, 및 링거액 ml 당 약 1 내지 약 30 및 바람직하게는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원 결합 작제물을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 널리 공지되어 있거나, 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 정맥내 투여가능한 항원 결합 작제물 제형의 제조를 위해, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되고, 독자가 특별히 참조하는 문헌[Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech. today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922. Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)]을 참조하라.
약학적 제조물인 경우 본 발명의 치료제는 단위 용량 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 적절한 치료적 유효 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 적합한 용량은 환자의 체중에 따라 환자에 대해 계산될 수 있고, 예를 들어, 적합한 용량은 0.01 내지 20mg/kg, 예를 들어, 0.1 내지 20mg/kg, 예를 들어, 1 내지 20mg/kg, 예를 들어, 10 내지 20mg/kg 또는, 예를 들어, 1 내지 15mg/kg, 예를 들어, 10 내지 15mg/kg의 범위일 수 있다. 질환을 효과적으로 치료하기 위해, 인간에서 본 발명에서 사용되는 적합한 용량은 0.01 내지 1000 mg, 예를 들어, 0.1 내지 1000mg, 예를 들어, 0.1 내지 500mg, 예를 들어, 500mg, 예를 들어, 0.1 내지 100mg, 또는 0.1 내지 80mg, 또는 0.1 내지 60mg, 또는 0.1 내지 40mg, 또는, 예를 들어, 1 내지 100mg, 또는 1 내지 50mg의 본 발명의 항원 결합 작제물의 범위 내일 수 있으며, 이는 비경구, 예를 들어, 피하, 정맥내 또는 근내 투여될 수 있다. 이러한 용량은 필요시 의사에 의해 적절히 선택된 적절한 시간 간격으로 반복될 수 있다.
본원에 기재된 항원 결합 작제물은 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적절한 담체 중에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린을 이용하여 효과적인 것으로 밝혀졌고, 당 분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 에피토프-결합 도메인을 생성하기 위해 이용될 수 있는 여러 방법이 당 분야에 공지되어 있다.
한 예에서, 상기 방법은 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 결부시키는 디스플레이 시스템을 이용한다. 이러한 디스플레이 시스템은 복수의 복제가능한 유전 패키지, 예를 들어, 박테리오파지 또는 세포(박테리아)를 포함할 수 있다. 디스플레이 시스템은 라이브러리, 예를 들어, 박테리오파지 디스플레이 라이브러리를 포함할 수 있다. 박테리오파지 디스플레이는 디스플레이 시스템의 예이다.
용어 "라이브러리"는 이종성 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 나타낸다. 라이브러리는 각각이 단일한 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는 구성원들로 구성된다. 이렇게, "라이브러리"는 "레퍼토리"와 동의어이다. 라이브러리 구성원 사이의 서열 차이가 라이브러리에 존재하는 다양성을 담당한다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 간단한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 한 예에서, 각각의 개별적 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 구성원을 함유한다. 유리하게는, 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능케 하기 위해 핵산은 발현 벡터에 통합된다. 따라서, 한 양태에서, 라이브러리는 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있고, 각각의 유기체는 해당 폴리펩티드 구성원을 생성시키도록 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리의 단일한 구성원을 함유하는 발현 벡터의 하나 이상의 카피를 함유한다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 다양한 폴리펩티드의 큰 레퍼토리를 엔코딩하는 잠재성을 갖는다.
다수의 적합한 박테리오파지 디스플레이 시스템(예를 들어, 1가 디스플레이 및 다가 디스플레이 시스템)이 기재되어 있다(예를 들어, Griffiths et al ., U.S. Patent No. 6,555,313 B1(참조로서 본원에 포함됨); Johnson et al ., U.S. Patent No. 5,733,743(참조로서 본원에 포함됨); McCafferty et al ., U.S. Patent No. 5,969,108(참조로서 본원에 포함됨); Mulligan-Kehoe, U.S. Patent No. 5,702,892(참조로서 본원에 포함됨); Winter, G. et al ., Annu . Rev . Immunol . 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al ., Appl . Biochem . Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al ., Comb . Chem . High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)을 참조하라). 박테리오파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 임의의 적합한 박테리오파지, 예를 들어, 필라멘트형 파지(예를 들어, fd, M13, F1), 용균 파지(예를 들어, T4, T7, 람다), 또는 RNA 파지(예를 들어, MS2) 상에서 디스플레이될 수 있다.
예를 들어, dAb 또는 다른 에피토프 결합 도메인의 선택에서 디스플레이 시스템(예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특징을 결부시키는 시스템), 예컨대 파지 디스플레이가 본원에 기재된 방법에서 사용되는 경우, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시키거나 증가시키는 것이 종종 유리하다. 이는 본원에 기재된 방법 또는 다른 적합한 방법을 이용하여 추가 라운드의 선택을 위해, 또는 추가 레퍼토리(예를 들어, 친화성 성숙 레퍼토리)를 제조하기 위해 충분한 양의 핵산 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 수득하는 효과적인 방식을 제공한다. 핵산은 임의의 적합한 방법을 이용하여 증폭될 수 있고, 예를 들어, 파지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭될 수 있다.
일반적으로, 적합한 파지 코트 단백질(예를 들어, fd pIII 단백질)과의 융합 단백질로서 펩티드 또는 파지 폴리펩티드의 레퍼토리를 디스플레이하는 파지의 라이브러리가 생성되거나 제공된다. 융합 단백질은 파지 코트 단백질의 첨단, 또는 요망시 내부 위치에 펩티드 또는 폴리펩티드를 디스플레이할 수 있다. 예를 들어, 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드는 pIII의 도메인 1에 대해 아미노-말단인 위치에 존재할 수 있다(pIII의 도메인 1은 또한 N1으로 언급된다). 디스플레이된 폴리펩티드는 pIII(예를 들어, pIII의 도메인 1의 N-말단)에 직접 융합될 수 있거나, 링커를 이용하여 pIII에 융합될 수 있다. 요망시, 융합체는 태그(예를 들어, myc 에피토프, His 태그)를 추가로 포함할 수 있다. 파지 코트 단백질을 갖는 융합 단백질로 디스플레이되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 생성될 수 있고, 예를 들어, 적합한 숙주 박테리아로 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 파지 벡터 또는 파지미드 벡터의 라이브러리를 도입시키고, 결과로서 발생한 박테리아를 배양시켜 파지를 생성(예를 들어, 요망시 적합한 헬퍼 파지 또는 상보성 플라스미드를 이용함)함으로써 생성될 수 있다. 파지의 라이브러리는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 침전 및 원심분리를 이용하여 배양물로부터 회수될 수 있다.
디스플레이 시스템은 임의의 요망되는 양의 다양성을 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리는 유기체, 유기체의 군, 요망되는 조직 또는 요망되는 세포 유형에 의해 발현되는 자연 발생 폴리펩티드에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있거나, 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 요망시, 폴리펩티드는 공통의 코어 또는 스캐폴드를 공유할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 모든 폴리펩티드는 단백질 A, 단백질 L, 단백질 G, 피브로넥틴 도메인, 안티칼린(anticalin), CTLA4, 요망되는 효소(예를 들어, 중합효소, 셀룰라제), 또는 면역글로불린 상과로부터의 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항체 가변 도메인)으로부터 선택된 스캐폴드를 기초로 할 수 있다. 이러한 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 폴리펩티드는 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열의 규정된 영역 및 공통의 아미노산 서열의 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 레퍼토리 내의 모든 또는 실질적으로 모든 폴리펩티드는 요망되는 유형을 지니며, 예를 들어, 요망되는 효소(예를 들어, 중합효소) 또는 항체의 요망되는 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 VH 또는 인간 VL)이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 디스플레이 시스템은 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하며, 여기서 각각의 폴리펩티드는 항체 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 레퍼토리 내의 각각의 폴리펩티드는 VH, VL 또는 Fv(예를 들어, 단일쇄 Fv)를 함유할 수 있다.
아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 스캐폴드의 임의의 요망되는 영역으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 돌연변이유발 방법(예를 들어, 저 정확도 PCR, 올리고누클레오티드-매개 또는 부위 지정 돌연변이유발, NNK 코돈을 이용한 다양화) 또는 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여 다양화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 라이브러리를 제조함으로써 항체 가변 도메인 또는 소수성 도메인의 상보성 결정 영역과 같은 표적 영역으로 도입될 수 있다. 요망시, 다양화되는 폴리펩티드의 영역은 무작위화될 수 있다.
레퍼토리를 구성하는 폴리펩티드의 크기는 주로 선택의 문제이며, 균일한 폴리펩티드 크기가 필요하지는 않다. 레퍼토리 내의 폴리펩티드는 적어도 3차 구조(적어도 하나의 도메인을 형성함)를 가질 수 있다.
에피토프 결합 도메인 또는 도메인의 집단이 임의의 적합한 방법을 이용하여 레퍼토리 또는 라이브러리(예를 들어, 디스플레이 시스템 내)로부터 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있다. 예를 들어, 도메인은 선택가능한 특징(예를 들어, 물리적 특징, 화학적 특징, 기능적 특징)을 기초로 하여 선택되거나 분리된다. 적합한 선택가능한 기능적 특징은 레퍼토리 내의 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어, 제네릭 리간드(generic ligand)(예를 들어, 초항원)에 대한 결합, 표적 리간드(예를 들어, 항원, 에피토프, 기질)에 대한 결합, 항체에 대한 결합(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 상에서 발현된 에피토프를 통함), 및 촉매 활성을 포함한다(예를 들어, Tomlinson et al ., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655를 참조하라).
면역글로불린 상과의 구성원 모두는 이들의 폴리펩티드 사슬에 대해 유사한 폴드를 공유한다. 예를 들어, 항체는 이들의 일차 서열과 관련하여 고도로 다양하나, 서열 및 결정학적 구조의 비교는 예상과 반대로 항체의 6개의 항원 결합 루프 중 5개(H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주쇄 형태, 또는 정준 구조를 채택하는 것을 나타냈다(Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol ., 196: 901; Chothia et al . (1989) Nature, 342: 877). 따라서, 루프 길이 및 중요 잔기의 분석은 인간 항체 대부분에서 발견되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주쇄 형태의 예측을 가능케 한다(Chothia et al . (1992) J. Mol . Biol ., 227: 799; Tomlinson et al . (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al . (1996) J. Mol . Biol ., 264: 220). 서열, 길이 및 구조와 관련하여 H3 영역이 훨씬 더 다양하나(D 세그먼트의 사용으로 인함), 이는 또한 루프 및 항체 프레임워크 내의 중요 위치에서 특정 잔기의 길이 및 존재, 또는 잔기의 유형에 따라 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주쇄 형태를 형성한다(Martin et al . (1996) J. Mol . Biol , 263: 800; Shirai et al . (1996) FEBS Letters, 399:1).
dAb는 유리하게는 도메인의 라이브러리, 예를 들어, VH 도메인의 라이브러리 및/또는 VL 도메인의 라이브러리로부터 어셈블리된다. 한 양태에서, 도메인의 라이브러리는 구성원의 주쇄 형태가 공지되는 것을 보장하도록 특정 루프 길이 및 중요 잔기가 선택되도록 설계된다. 유리하게는, 이들은 이들이 상기 논의된 바와 같이 비-기능성일 가능성을 최소화시키기 위해 자연 상태로 발견되는 면역글로불린 상과 분자의 실제 형태이다. 변화는 낮은 빈도로 발생할 수 있어, 작은 수의 기능성 구성원이 이의 기능에 영향을 미치지 않는 변경된 주쇄 형태를 가질 수 있다.
여러 공지된 주쇄 형태 또는 단일한 공지된 주쇄 형태를 선택했으면, 구조적 및/또는 기능적 다양성을 갖는 레퍼토리를 생성시키기 위해 분자의 결합 부위를 다양화시킴으로써 dAb가 작제될 수 있다. 이는 변이체가 이들의 구조 및/또는 이들의 기능에서 충분한 다양성을 갖도록 생성되어, 이들이 광범위한 활성을 제공할 수 있는 것을 의미한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 서열, 예를 들어, 적어도 90% 동일한 서열, 예를 들어, 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94% 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97% 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
핵산에 대해, 용어 "실질적 동일성"은 2개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교되는 경우에 적절한 누클레오티드 삽입 또는 결실과 함께 누클레오티드의 적어도 약 80%, 보통 누클레오티드의 적어도 약 90% 내지 95%, 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 98% 내지 99.5%에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 실질적 동일성은 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건하에서 가닥의 상보체에 하이브리드화되는 경우에 존재한다.
누클레오티드 및 아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한"은 최적으로 정렬되고, 적절한 삽입 또는 결실과 함께 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다. 대안적으로, 실질적 동일성은 DNA 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건하에서 가닥의 상보체에 하이브리드화되는 경우에 존재한다.
2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 개수 / 위치의 전체 개수 × 100)이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적인 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리듬을 이용하여 달성될 수 있다.
2개의 누클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 2개의 누클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 이용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]의 알고리듬을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 문헌[Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]의 알고리듬을 이용하여 결정될 수 있다.
예로서, 본 발명의 폴리누클레오티드 서열은 참조 서열과 동일, 즉, 100% 동일할 수 있거나, 이는 참조 서열에 비해 특정 정수 개수 이하의 누클레오티드 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 적어도 하나의 누클레오티드 결실, 변이 및 변위를 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 변경은 참조 누클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치, 또는 참조 서열 내의 누클레오티드 중 개별적으로 산재된 상기 말단 위치 사이 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 군 내에 어디에서도 발생할 수 있다. 누클레오티드 변경의 개수는 참조 서열 내의 누클레오티드의 전체 수에 (100으로 나누어진) 각각의 동일성 퍼센트의 숫자상 퍼센트를 곱한 후, 참조 서열 내의 누클레오티드의 상기 전체 수에서 상기 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 결정된다:
nn≤xn - (xn·y), 상기 식에서, nn은 누클레오티드 변경의 개수이고, xn은 참조 서열 내의 누클레오티드의 전체 수이고, y는 50% 동일성에 대해 0.50, 60%에 대해 0.60, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85, 90%에 대해 0.90, 95%에 대해 0.95, 97%에 대해 0.97 또는 100%에 대해 1.00이고, xn 및 y의 임의의 비-정수 곱은 xn으로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다. 참조 서열의 폴리누클레오티드 서열의 변경은 이러한 코딩 서열에 넌센스, 미스센스 또는 틀이동 돌연변이를 일으켜, 상기 변경 이후 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드를 변경시킬 수 있다.
유사하게, 또 다른 예에서, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 참조 서열과 동일, 즉, 100% 동일할 수 있거나, 이는 % 동일성이 100% 미만이 되도록 참조 서열에 비해 특정 정수 개수 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 보존성 및 비-보존성 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 변경은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 위치, 또는 참조 서열 내의 아미노산 중 개별적으로 산재된 상기 말단 위치 사이 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 군 내에 어디에서도 발생할 수 있다. 제공된 동일성 %에 대한 아미노산 변경의 개수는 참조 서열에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체 수에 (100으로 나누어진) 각각의 동일성 퍼센트의 숫자상 퍼센트를 곱한 후, 폴리펩티드 참조 서열 내의 아미노산의 상기 전체 수로부터 상기 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 결정된다:
na≤xa - (xa·y),
상기 식에서, na는 아미노산 변경의 개수이고, xa는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체 수이고, y는, 예를 들어, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85 등이고, xa 및 y의 임의의 비-정수 곱은 xa로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다.
본 발명의 주된 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 다양한 구체예에서 이용될 수 있다. 당업자는 단지 통상적인 연구만을 이용하여, 본원에 기재된 구체적인 절차에 대한 다수의 등가물을 인지하거나, 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려되며 본 청구범위에 포함된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야에서의 숙련된 기술자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로서 포함된다고 지시된 바와 같이 동일한 한도로 본원에 참조로서 포함된다. 청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용되는 경우 단수 형태의 이용은 "하나"를 의미할 수 있으나, 이것은 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와도 일치한다. 청구범위에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 비록 설명이 단지 양자 택일 및 "및/또는"을 의미하기 위한 정의를 뒷받침하고 있더라도, 양자 택일만을 나타내거나 대안들이 상호 배타적이라고 명백하게 지시되지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 이용된다. 본 명세서를 통틀어 "약"이라는 용어는 소정의 값이 장치에 대한 오차의 고유 변동을 포함함을 나타내기 위해 이용되며, 상기 방법은 값 또는 연구 피검체 사이에 존재하는 변동을 측정하기 위해 이용된다.
본원에서 사용되는 용어 "또는 이의 조합"은 이 용어 앞에 나열된 아이템의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 및 특정 상황에서 순서가 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 하나 이상을 포함하고자 한다.
실시예
본원에 기재된 특정 구체예는 예시로서 제공된 것이고 본 발명을 제한하는 것은 아님이 이해될 것이다.
실시예를 통틀어, dAb-Fc, Fc-dAb 및 dAb-Fc-dAb 분자가 언급된다. 이러한 용어 "dAb-Fc" 및 "Fc-dAb"는 각각의 항원 결합 작제물이 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 N-말단 (dAb-Fc) 또는 C-말단 (Fc-dAb)에 부착된 dAb를 지니는 2개의 항원 결합 작제물을 포함하는 이합체에 대한 간단한 언급이다.
유사하게, 용어 "dAb-Fc-dAb"는 각각의 항원 결합 작제물이 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 N-말단에 부착된 dAb 및 C-말단에 부착된 dAb를 지니는 2개의 항원 결합 작제물을 포함하는 이합체를 나타낸다.
실시예 1 - Vh dAb - Fc 분자의 발현
DMS1529 (SEQ ID NO:1 & 29)는 W02008/149150/A20호에 기재되어 있다. DMS1576 (SEQ ID NO:2 & 30)은 아미노산 56을 Y에서 N으로 전환시킨 DMS1529로부터 부위 지정 돌연변이유발에 의해 생성되었다. DMS1529 및 DMS1576은 진탕 플라스크 및 교반된 탱크 현탁 배양의 조합을 이용한 GlaxoSmithKline의 제네릭 모노클로날 항체 생산 공정 플랫폼을 이용하여 CHROMOS 푸울링된 (또는 벌크) 트랜스펙션 또는 안정한 폴리클로날 또는 모노클로날 CHO 세포주로부터 제조되었다. 생물반응기는 교반 속도, 용해된 산소 농도, pH 및 온도에 대한 제어된 조건에서 모니터되고 유지된다. 용해된 산소는 pH를 탄산나트륨 및 CO2의 자동 첨가를 통해 제어하면서 N2 중 40% O2를 첨가함에 의해 유지된다. 생산 배양 지속기간은 세포 생존력 및 최소 항체 역가의 조합으로부터 결정된다. 생산 기간의 끝에서, 생물반응기의 배양물은 심층 여과 및 살균 여과에 의해 정화되어 정화된 미가공 벌크(CUB)의 배치를 생성한다.
실시예 2 - Vh dAb - Fc 분자의 정제
DMS1529 및 DMS1576은 친화성 크로마토그래피 및 자동 FPLC 정제 시스템을 이용하여 정화된 세포 배양 상청액 (CUB, 실시예 1)으로부터 포획되었다. 일단 로딩되면, 결합된 생성물을 pH 중성 수성 완충제의 조합물을 이용하여 세척하여 특이적으로 결합되지 않은 불순물을 제거한 후 저 pH 용리시켰다. 90%가 넘는 결합된 생성물을 회수하고, 이어서 용리 푸울의 pH를 30분 동안 pH 3.5로 조정함으로써 바이러스 중화를 달성하였고, 그 후 pH를 pH 4.5로 조정하였다. 추가 정제가 요구되는 경우, 두 번째 컬럼 상에서의 결합을 달성하기 위해 추가의 pH 조정을 수행하였다. 결합 후에, 생성물을 동등한 pH의 저 전도성 완충제에서 세척시켜 특이적으로 결합되지 않은 불순물을 추가로 제거하였다. 그 후 정제된 dAb-Fc를 pH 및 염 변경을 이용하여 용리시키고 푸울로서 수집한 후 0.2㎛ 여과 및 저장하였다. 달리 언급되지 않는 한, 단지 첫 번째 친화성 컬럼을 이용하여 제조된 단백질을 하기 실시예에 기재된 시험관내 검정에서 VEGF 결합에 대해 분석하였으나, 시험 물질이 추가로 정제된 경우, 즉 두 번째 컬럼을 이용한 경우를 참조할 것이다.
실시예 3 - SDS - PAGE 및 크기-배제 크로마토그래피 ( SEC )에 의한 분자 분석
DMS1529 및 DMS1576의 분자 보전, 균질성 및 순도 백분율 (%)은 환원 및 비환원 조건 둘 모두에서, SDS-PAGE 및 분석적 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석되었다. SDS-PAGE 분석은 Novex "NuPAGE" 시스템을 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행되었고 겔은 Instant Blue Protein Stain Solution (Triple Red Ltd)로 염색되었다. 겔은 단량체 사슬당 예상되는 글리칸 사슬의 존재를 허용하면서 무손상 성숙 단백질의 예상되는 분자량 (~76-79kDa)에 일치하는 밴드 크기를 나타내었다. SEC는 TSK 겔 G2000SWXL 컬럼 (TOSOH, BioScience)을 이용하여 수행되었다. 중성 pH에서 소듐 포스페이트/소듐 클로라이드 기반 이동상을 0.5ml/분의 유속으로 이용하였다. 정제된 단백질(대략 1mg/ml에서)의 표준 샘플 주입 부피는 10㎕였다. 컬럼 유출물의 UV 흡광도를 214 & 280nm에서 모니터하였다. 모든 단백질 관련 피크의 면적을 통합시켜 피크 관련된 분자의 순도를 측정하였다. 단백질은 생물학 검정에서의 추가 분석 전에 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 >95% 순수한 표적 단백질인 것으로 확인되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 4 - VEGF 결합 ELISA
ELISA에 의해 VEGF165에 특이적으로 결합하는 DMS1529 및 DMS1576의 능력을 측정하고 베바시주맙 (아바스틴, Phillip Chapper & Co. Ltd., UK에서 공급된 임상 약물 제품)의 것과 비교하였다. F96 Maxisorp 96웰의 편평한 바닥 면역플레이트 (Nunc, Cat No: 439454)를 100㎕의 25㎍/ml의 hVEGF165 (HEK293 포유동물 세포로부터 제조된 VEGF의 GSK '내부(in house)' 공급원)로 코팅시키고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 0.05%의 Tween-20을 함유하는 PBS로 6회 세척하고, 200㎕의 차단 용액 (PBS 중 1% BSA)을 각각의 웰에 첨가시키고, 플레이트를 실온에서 1h 동안 인큐베이션시켰다. 그 후 플레이트를 0.05% Tween-20/PBS로 세척하였다. 90㎕의 검정 희석물 (PBS 중 0.1% BSA, 0.05% Tween-20)을 각각의 웰에 첨가시킨 다음, 10㎕의 각각의 샘플 또는 대조군 (80-0.08ng/ml의 농도 범위에 걸쳐 연속하여 2배 희석됨)을 차단 용액에서 플레이트를 가로질러 첨가시키고 실온에서 1hr 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 플레이트를 0.05% Tween-20/PBS로 세척하였다. PBS 중 0.1% BSA, 0.05% Tween-20에서 1:10,000으로 희석된 100㎕의 항-인간 IgG (Fc 특이적) HRP (Sigma, Cat No: A0170)를 적절한 웰에 첨가시켰다. 플레이트를 실온에서 1 hr 동안 인큐베이션시키고 0.05% Tween-20/PBS로 세척하였다. 100㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 액체 기질 시스템 (Sigma T0440)을 각 웰에 첨가하였다. 충분한 블루 컬러가 발색되면 (>2.0의 예상되는 OD450), 100㎕의 0.25M 황산 (Fisher Scientific J/8410/17)을 첨가함에 의해 15분 후에 반응을 중단시켰다. 기본적인 종말점 프로토콜을 이용하여 SpectraMax Plus384 Microplate Reader (Molecular Devices)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 판독하였다.
DMS1529 및 DMS1576 둘 모두는 유사한 방식으로 VEGF165에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났고, 두 분자 모두는 감소된 IC50 값 (도 1)에 의해 제시된 바와 같이 베바시주맙 (아바스틴)보다 더욱 효능이 있는 것으로 밝혀졌다.
실시예 5 - VEGF 결합 MSD
VEGF165에 특이적으로 결합하는 DMS1529 및 DMS1576의 능력은 MSD (Meso Scale Discovery) 검정에 의해 측정되었다. MSD 데이터는 항-Vh 또는 항-Fc 시약으로의 검출 후에 hVEGF165에 대한 DMS1529 및 DMS1576의 동등한 결합을 나타낸다.
실시예 6 - 표면 플라즈몬 공명을 이용한 VEGF 에 대한 DMS1529 및 DMS1576 의 결합
VEGF165에 대한 DMS1529 및 DMS1576 분자의 결합 친화성은 Biacore T100 (GE Healthcare), 실시예 6A 및 ProteOn XPR36 단백질 상호작용 어레이 시스템 (BioRad)을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정되었다 (데이터는 제시되지 않음)
실시예 6A - Biacore 를 이용한 VEGF 에 대한 DMS1529 및 DMS1576 의 결합
단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 C1 칩 상에 고정시킨 다음, 이러한 표면을 이용하여 항-VEGF 작제물을 포획하였다. 인간 재조합 VEGF (HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 '내부' 공급됨)를 256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 1nM, 0.25nM 및 0.0625nM의 분석물로서 이용하였다. 모든 결합 곡선을 완충제 주입 (즉, 0nM)과 이중 참조하였고, 데이터를 1:1 모델 및 2가 모델 (T100에 고유한) 둘 모두에 핏팅시켰다. 100mM H3PO4를 이용하여 재생을 수행하였다. 실온에서 HBS-EP를 진행 완충제로서 이용하여 진행을 수행하였다. 실험 데이터에 대한 분석 모델의 불충분한 핏팅으로 인해 DMS1529 및 DMS1576에 대해 신뢰할 만한 동력학은 수득될 수 없었다 (그러나 결합 및 해리 상수에 대해 추정할 수 있었고 이들은 표 2A에 요약되어 있다).
Biacore 및 ProteOn 데이터 둘 모두는 DMS1529 및 DMS1576이 표면 플라즈몬 공명을 이용하여 VEGF165와 유사한 결합 동역학을 지님을 나타낸다.
표 2A: ka , kd 및 KD 를 측정하기 위한 인간 VEGF 165 에 대한 DMS1529 및 DMS1576의 결합 동역학의 Biacore 분석
Figure pct00008
실시예 7 - VEGF R1 & R2 수용체 결합 검정
DMS1529 및 DMS1576의 효능을 VEGF 수용체 결합 검정에서 베바시주맙 (아바스틴)의 것과 비교하여 분석하였다. 이러한 검정은 VEGF R1 또는 VEGF R2에 대한 VEGF165의 결합 및 이러한 상호작용을 차단하는 시험 분자의 능력을 측정한다. MSD 표준 결합 96 웰 플레이트 (L11XA-3)를 중탄산염 완충제 (50㎕/웰)에서 0.25㎍/ml의 VEGF R1 (R&D Systems 321-FL) 또는 VEGF R2 (R&D 357-KD)로 코팅하고, 플레이트 실러로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, MSD 플레이트를 Tris 세척 완충제를 이용하여 3x 300㎕/웰로 세척하고, 웰로부터 과도한 세척 완충제를 제거하기 위해 조직의 패드 상에 블롯팅시켰다. 그 후 MSD 플레이트를 PBS 중 3% BSA (250㎕/웰)로 차단하고, 실온에서 1시간 동안 진탕(750 RPM)하면서 인큐베이션시켰다. 2x 농도의 항-VEGF 분자 (25㎕/웰)를 첨가하기 전에 MSD 플레이트를 다시 세척하고, 실온에서 10분 동안 진탕(750 RPM)하면서 인큐베이션시킨 후에 2x 농도의 rhVEGF, 25㎕/웰, R&D Systems (293-VE/CF, 배큘로바이러스를 이용하여 곤충 세포에서 제조됨) 또는 VEGF의 GSK '내부' 공급원 (HEK293 포유동물 세포로부터 제조됨, 표 3A 외에는 나중 데이터를 제시하지 않음)을 첨가하였다. 항-VEGF 분자 및 VEGF를 PBS 중 0.1% BSA를 이용하여 제조하였다. 항-VEGF 분자가 VEGF와 예비-인큐베이션되는 단계를 이용하여 초기 검정을 수행하였다. 동등한 부피의 2x 농도의 항-VEGF 분자를 동등한 부피의 2x 농도의 VEGF (R&D, 293-VE/CF)에 30분 동안 실온에서 첨가시킴에 의해 예비-인큐베이션 물질을 제조하였다. 사용된 최종 VEGF 농도는 10ng/ml이었다. VEGF가 없는 대조군 및 VEGF 단독의 대조군도 포함시켰다. MSD 플레이트를 진탕(750 RPM)하면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후에, PBS 중 1% BSA에서의 0.25㎍/ml의 검출 시약 (50㎕/웰, 염소 항-인간 VEGF 비오티닐화된 항체 - R&D Systems BAF293)을 첨가하기 전에 이를 다시 세척하고, 진탕(750 RPM)하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. MSD 플레이트를 다시 세척한 후에 PBS 중 1% BSA에서의 2㎍/ml의 스트렙타비딘 설포-TAG (50㎕/웰, MSD R32AD-1)를 첨가하고 진탕(750 RPM)하면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. MSD Sector Imager 6000에서 전기화학발광을 측정하기 전에, MSD 플레이트를 세척하고 150㎕/웰의 2x Read 완충제 T (MSD R92TC-1)를 첨가하였다. GraphPad Prism을 이용하여 곡선 핏팅 및 EC50 계산을 수행하였다. VEGFR1 및 VEGFR2에 대한 VEGF 결합을 억제하는 DMS1529, DMS1576 및 베바시주맙 (아바스틴)의 능력을 기재된 대로 측정하였다. EC50 값을 표 3A에 열거한다.
항-VEGF 작용제 및 VEGF가 VEGF 수용체 코팅된 MSD 플레이트로의 첨가 전에 예비-인큐베이션되지 않은 두 번째 검정을 수행하였다. 이러한 검정은 오로지 DMS1576 및 베바시주맙 (아바스틴)을 비교하기 위해 수행되었고 R&D Systems 출처의 VEGF만을 이용하였다 (293-VE/CF). VEGFR1 및 VEGFR2에 대한 VEGF 결합을 억제하는 DMS1576 및 베바시주맙 (아바스틴)의 능력을 예비-인큐베이션 단계 없이 상기 기재된 대로 측정하였다. EC50 값을 표 3B에 열거한다.
표 3A의 데이터로부터, DMS1529 및 DMS1576 둘 모두는 유사한 EC50 값을 갖는 것으로 보이고, 이러한 값은 VEGFR1 및 VEGFR2에 대한 둘 모두의 VEGF 결합에 대해 베바시주맙 (아바스틴)에 대한 EC50 값보다 거의 10배 더 낮았다 (즉, 더 큰 효능). 모든 항-VEGF 분자는 VEGFR1 및 VEGFR2 결합 검정 둘 모두에 대해 '내부' HEK293 생산된 VEGF에 비해 R&D Systems VEGF와의 결합에서 더 효능이 있었고 VEGF와의 예비-인큐베이션이 일어난 경우, 검정에서 더 효능이 있었다. DMS1576은 VEGF와의 예비-인큐베이션의 부재하에 VEGFR1 및 VEGFR2 둘 모두의 경우에 대해 베바시주맙 (아바스틴)에 대한 것에 비해 상대적인 EC50 값을 유지하였으므로, 이러한 단순화된 검정 유형은 새로운 분자의 분석을 위해 진보된 것이었다. 모든 RBA 검정에서, 비록 DMS1529 및 DMS1576 둘 모두가 베바시주맙 (아바스틴)보다 더 효능이 있다고 보여지나, 베바시주맙 (아바스틴)과 달리 DMS1529 또는 DMS1576 어떤 것도 이러한 검정에서 100% 억제에 완전히 도달한 것으로 보이지 않음을 주목하라 (데이터는 제시되지 않음).
표 3 VEGFR RBA 로부터의 EC50 값
(A) 항-VEGF & VEGF 시약의 예비-인큐베이션을 이용한 RBA
내부 VEGF 및 R&D Systems 출처의 VEGF (배큘로바이러스 생산됨)
Figure pct00009
(B) 변형된 RBA (항-VEGF 작용제와 예비-인큐베이션 없음)
R&D Systems 출처의 VEGF (배큘로바이러스 생산됨)
Figure pct00010
실시예 8 - 인간 탯줄 내피 세포 ( HUVEC ) 증식 검정
베바시주맙 (아바스틴)에 비해 인간 탯줄 정맥 내피 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 DMS1529 및 DMS1576을 검정하였다. 상기 검정은 규정된 VEGF165의 농도에 의해 유도되는 내피 세포 증식의 정도 및 이러한 효과를 차단하는 VEGF 길항제의 능력을 측정한다. 세포가 없는 외부 웰을 남기며, HUVEC를 96-웰 젤라틴-코팅된 플레이트에 웰 당 5000개 세포로 시딩하고, 부착을 허용하기 위해 수 시간 동안 인큐베이션하였다. 시험 분자를 2배 연속 희석된 등몰 농도 (최대 3.33x10-08M)로 검정하였고, 각각은 3중으로 수행되었다. VEGF165를 기본 배지에서 제조하여 75ng/ml의 최종 농도를 달성하였다. 세포 단층으로부터 배지를 수동으로 제거하고 50㎕의 기본 배지를 첨가시켜 세포가 마르는 것을 방지하였다. 25㎕의 VEGF165-함유 배지 및 25㎕의 기본 배지 또는 시험 항체-함유 배지를 적절하게 첨가하였다. 세포를 72시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포의 총 수를 Cell Titre Glo를 이용하여 측정하였다. HUVEC를 VEGF165로 처리한 지 72시간 후, VEGF165-미처리된 세포에 비해 세포의 총 수에서의 예상되는 증가를 발생시켰다 (데이터는 제시되지 않음). 이러한 VEGF-매개된 증가는 HUVEC 증식 및 HUVEC 세포 사멸의 방지 둘 모두에 대한 VEGF의 누적 효과를 나타내는 것으로 해석된다. 시험 화합물은 개별적인 플레이트 상에서 비교측정 분자인 베바시주맙 (아바스틴)에 대해 독립적으로 평가되었다.
DMS1529는 2번의 별도의 검정으로 평가되었다. 데이터는, DMS1529가 HUVEC 증식을 베바시주맙 (아바스틴)에 대한 ~100%에 비해 단지 ~50%만큼 억제할 수 있음을 제안하고, 최적합 곡선은 DMS1529가 이러한 검정에서 베바시주맙 (아바스틴)보다 높은 IC50 (즉, 덜 효능임)을 지님을 시사한다. DMS1576은 HUVEC 검정에서 여러 번 평가되었다. 한 샘플 데이터 세트에서, 데이터는, DMS1529와 유사하게, DMS1576이 HUVEC 증식을 베바시주맙 (아바스틴)에 대한 ~100%에 비해 단지 ~50%만큼 억제할 수 있음을 제안하고; 최적의 곡선은 DMS1576이 이러한 검정에서 베바시주맙 (아바스틴)보다 높은 IC50 (즉, 덜 효능임)을 지님을 시사한다. 그러나, 2개의 다른 데이터 세트는 베바시주맙 (아바스틴)에 비해 DMS1576의 최대 억제% 및 IC50에서의 보다 적은 감소분을 제안한다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 9 - VEGF 유도된 혈액-망막 붕괴에서의 성능: 토끼 망막 누출 모델
DMS1529 및 DMS1576을 토끼 안구에서의 인간 VEGF165 (R&D Systems) 유도된 혈액-망막 붕괴 (BRB) 모델에서 시험하고 베바시주맙 (아바스틴), 라니비주맙(Ranibizumab) (루센티스(Lucentis))), 및 케나코트(Kenacort) (트람시날론(Tramcinalone))와 비교하였다. 베바시주맙, 라니비주맙 및 케나코트의 모든 공급원은 앞서 기재한 대로 임상적 공급원으로부터 수득되었다 [Phillip Chapper & Co. Ltd, UK]. 상기 모델은 문헌에 다소 상세하게 기재되어 있고 'Edelman 모델'로도 알려져 있다 (Edelman JL, Lutz D, Castro MR, Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown, Exp Eye Res. 2005 Feb; 80(2):249-58).
본 연구의 목적은 토끼에서의 재조합 인간VEGF165-유도된 혈액 망막 장벽 붕괴 모델에서 망막 혈관 누출을 감소시키는데 있어서 두 용량: 높음 (H), 및 낮음 (L)의 DMS1529 및 DMS1576의 효능을 평가하는 것이었다. 높은 (H) 용량 및 낮은 (L) 용량은 라니비주맙 (루센티스)에 대한 등몰 투여에 기반하였다. 낮은 용량 (L)은 높은 용량의 3분의 1이었다. 베바시주맙 (아바스틴)은 또한 안구 적응증에 대한 임상에서 이용되는 용량으로부터 감소된 용량으로 투여되었다. 투여 및 주입 스케쥴을 표 4A에 제시한다.
간단히 말해, 모든 분자는 PD-10 탈염 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 10mM 히스티딘 HCl, 10% α-α 트레할로스 탈수화물, 0.01% 폴리소르베이트 80, pH 5.5으로 완충제 교환되었고, 비바스핀(Vivaspin) 20, 분자량 컷오프 5000Da, 스핀 농도 (Sartorius Stedim Biotech)를 이용하여 요망되는 농도로 농축되었는데, 둘 모두는 제조사의 지시에 따라 이용되었다. 상기 언급된 실시예에서 기재된 이러한 공정 후에 안정성, 기능 활성 및 균질성을 확인하기 위한 시험 후에, 샘플을 -80℃에서 동결시키고, 드라이아이스 상에서 수송하였다 (데이터는 제시되지 않음).
98마리의 GD79B 안료화된 토끼를 10마리 동물로 된 9개 그룹 및 8마리 동물로 된 한 그룹(케나코트 대조군을 위해 이용됨)으로 무작위로 나누었다. 각 그룹을 2개의 실험 세트에 상응하는 두 그룹으로 세분하였다. 시험 품목, 참조 또는 대조 품목을 유리체내 주입 (IVT, 50 ㎕)에 의해 오른쪽 눈에 -7일에 투여하였다. 왼쪽 눈은 처리되지 않은 채로 두어 음성 대조군으로서 활용하였다. 0일에, 500ng의 rhVEGF165 (혈관 투과 유도물질)의 단일 유리체내 주입에 의해 오른쪽 눈에서 혈액 망막 장벽(BRB) 붕괴를 유도하였다. VEGF 챌린지 47h 후 (2일) 소듐 플루오레세인을 모든 그룹에 정맥내 주입하였다. 추적자를 주입한 지 10분 이내에 오른쪽 눈에 대해 망막 혈관조영술을 수행하였고 사진을 찍었다. 1h 후에 비침습성 스캐닝 안구 형광광도측정법을 이용하여 유리체망막 구획에서 안구 플루오레세인 함량을 측정하였다. 오른쪽 눈/왼쪽 눈 플루오레세인 함량 (AUC) Rt 비를 망막 투과성 평가를 위해 측정하였다. 평가 기간의 끝에 (2일), 동물을 안락사시키고 모든 동물의 오른쪽 눈을 적출하였다. 스폰서인 GSK로의 수송시까지 스냅-동결된 안구 및 안방수 샘플을 -80℃에서 저장하였다. 플루오레세인 혈관조영상을 정성적 평가를 위해 수집하였다. 화합물은 GSK의 요청에 의해 비공개인 채로 두었다. 이에 대한 투여 스케쥴을 표 4A에서 요약한다.
유리체내 주입된 VEGF는 BRB의 붕괴를 유도하였으며, 이러한 붕괴는, 주입한 지 9일 후, E: 베바시주맙 (아바스틴), H: 라니비주맙 (루센티스, 고용량) 및 I: 라니비주맙 (루센티스, 저용량)으로 표지된 비공개 화합물로의 처리에 의해 시판 참조 (케나코트®)의 것과 유사한 효능으로 차단되었다. 오른쪽-유도된 눈과 왼쪽 눈 간에 유리체망막 플루오레세인 함량의 Rt 비의 낮은 수치가 관찰되었다 (화합물 E에 대해 Rt = 1.39 ± 0.77 (n = 9), 화합물 H에 대해 Rt = 1.05 ± 0.52 (n = 10) 및 화합물 I에 대해 Rt = 1.81 ± 1.76 (n = 10)). 케나코트-처리된 그룹은 유도되지 않은 동물의 것에 가까운 평균 Rt 비 (Rt = 1.15 ± 0.61)를 나타내었다.
비공개된 연구에서, 화합물 A: DMS1576 (고용량), B: DMS1576 (고용량), C: 비히클, 음성 대조군 D: DMS1576 (저용량), F: DMS1529 (저용량) 및 G: DMS1529 (고용량)로 처리한 후에 중요한 망막 혈관 누출이 오른쪽 유도된 눈에서 인지되었다. 화합물의 공개 및 비히클 대조군 화합물과의 비교 없이도, 화합물 A, B, C, D, F 및 G는 화합물 E, H 및 I보다 명백하게 덜 효과적이었다.
VEGF 유도된 토끼 망막 누출의 억제를 입증하는 공개 데이터 및 통계 분석을 표 4B에 제시한다. 이러한 분석을 위해 동일한 분자 및 용량에 해당하는 비공개 데이터를 푸울링시켰다. 표 4B에서의 데이터에 대해: P 값은 다중 비교 조정된 값 및 다중 비교 조정되지 않은 값으로 제시되고, 각각 'Dunnett' 및 '조정되지 않은' p 값으로 표지된다. 신뢰 구간은 조정되지 않은 p 값에 상응한다 (CI는 p>0.05에서 1의 비를 포함한다). 표 4B에서의 데이터 분석으로부터: 고용량의 DMS1529 (46%) 및 DMS1576 (41%)만이 VEGF 유도된 망막 누출의 정도를 부분적으로 감소시켰고, 저용량에서 상기 감소는 한층 적었다: DMS1529 (19%) 및 DMS1576 (25%). 동일한 조건하에, 화합물 E: 베바시주맙 (아바스틴, 75%), H: 라니비주맙 (루센티스, 고용량, 82%) 및 I: 라니비주맙 (루센티스, 저용량, 78%)은 시판되는 코르티코이드 참조(케나코트® 지연, 85%)와 유사한 효과를 지니며, VEGF-유도된 망막 혈관 누출을 억제하였다.
표 4A: 베바시주맙 ( 아바스틴 ), 라니비주맙 ( 루센티스 ) 및 케나코트 (트리암시날론( Triamcinalone)에 비해 DMS1529 , DMS1576 에 의한 VEGF 유도된 토끼 망막 누출의 억제를 위한 투여 및 주입 스케쥴
Figure pct00011
표 4B: 베바시주맙 ( 아바스틴 ), 라니비주맙 , ( 루센티스 ) 및 케나코트 ( 트리암시날론 )에 비해 DMS1529 , DMS1576 에 의한 VEGF 유도된 토끼 망막 누출의 억제
Figure pct00012
실시예 10 - 항- VEGF Vk dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 클로닝
dAb 서열 (SEQ ID NO:97-101, 105-109)을 포유동물 발현 벡터에서 인간 IgG1 아이소형의 제네릭 Fc의 N- 또는 C-말단 상에 클로닝시켰다. dAb는 링커 서열을 이용하여 Fc에 연결되었다: N-말단 링커는 AAAS (SEQ ID NO:57 & 76), 또는 TVAAPS (SEQ ID NO:59 & 78)이었고 C-말단 링커는 ((GS(TVAAPSGS)x3) (SEQ ID NO:66 & 85), 또는 알부민 도메인 3 (SEQ ID NO:71 & 90)이었다.
실시예 11 - 항- VEGF Vk dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 발현
관련된 Vk 항-VEGF dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자 (SEQ ID NO:3-9, 16-24, 31-37 & 44-52에 나열됨, 표 19)를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 HEK293 6E 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고 500ml 규모로 발현시켜 항체 단편 분자를 생산하였다. 500㎍의 플라스미드 DNA를 18ml의 OptiMEM (Invitrogen)에 첨가하고, 별도로 666㎕의 293펙틴을 18ml의 OptiMEM에 첨가시켰다. 두 개의 튜브 모두를 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. DNA/OptiMEM 용액을 가볍게 빙빙 돌리면서 293펙틴/OptiMEM 튜브에 천천히 첨가시켰다. 그 후 실온에서 25분 동안 DNA/293펙틴 트랜스펙션 복합체가 형성되게 하였다. HEK293E 현탁 세포 배양물을 희석시켜 1ml 당 0.5x 106개 세포를 수득하고 상기 트랜스펙션 복합체를, 배양 플라스크를 가볍게 빙빙 돌리면서, 500ml의 희석된 세포 배양물에 천천히 첨가시켰다. 그 후 플라스크를 135rpm으로 진탕시키면서 37℃, 5% CO2 인큐베이터로 돌려보냈다. 트랜스펙션한 지 24hrs 후에 12.5ml의 20% w/v 카세인-트립톤을 세포 배양물에 첨가시키고, 상기대로 계속 인큐베이션시켰다. 트랜스펙션한 지 6일 후에, 배양물을 5,500xg에서 20분 동안 원심분리시켜 세포를 펠렛화하였다; 상청액을 여과시키고 (0.22㎛) 분비된 단백질 발현에 대해 분석하였다. 통상적으로 50-100mg/L 상청액의 발현 수준이 달성되었다.
실시예 12 - Vk 항- VEGF dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 정제
Vk 항-VEGF dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자를 상청액으로부터 친화성 정제시켰다 (실시예 11을 참조하라). 소듐 포스페이트 완충제 (50:50 슬러리)에서 20ml의 현탁된 친화성 수지를 500ml의 여과된 상청액에 첨가하였다; 상청액/친화성 수지 혼합물을 +4℃에서 밤새, ~3h 동안 실온에서, 천천히 회전시켜 결합이 일어나게 하였다. 그 후에, 수지를 가라앉히고 상청액을 조심스럽게 따라 내었다. 상기 수지를 남아 있는 상청액에 재현탁시키고 비어 있는 드립(drip) 컬럼에 부었다. 상청액이 컬럼 밖으로 통과하게 한 다음, 수지를 3 x 10 컬럼 부피 세척액의 PBS에 이어서 4 x 컬럼 세척액의 Tris 완충제로 세척하였다. 4 x 컬럼 부피의 저 pH 완충제를 이용하여 용리를 수행하였고, 용리물을 1 x 컬럼 부피의 1M Tris pH 8.0를 함유하는 튜브로 수집하여 용리된 단백질을 중화시켰다.
실시예 13 - SDS - PAGE 및 크기-배제 크로마토그래피 ( SEC )에 의한 Vk 항-VEGF dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 분자 분석
실시예 12에 기재된 대로 정제된 항-VEGF dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자의 분자 보전, 균질성 및 % 순도를 실시예 3에 따라서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 겔은 단량체 사슬 당 예상되는 글리칸 사슬의 존재를 허용하면서 무손상 성숙 단백질의 예상되는 분자량에 일치하는 밴드 크기를 나타내었다 (dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자에 대해 각각 ~76kDa 내지 ~85kDa). 단백질은 생물학 검정에서의 추가 분석 전에 >95% 순수한 표적 단백질임이 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 확인되었다. dAb-Fc 또는 Fc-dAb 분자가 <95% 순수한 경우, 추가 SEC 정제를 수행하였다 (실시예 14를 참조하라).
실시예 14 - 크기-배제 크로마토그래피 ( SEC )에 의한 Vk 항- VEGF dAb - Fc 및 Fc-dAb 분자의 정제
필요한 경우, HiLoad 16/600 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare)을 이용하여 분취용 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 Vk dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자에 대해 수행하였다. 이용된 이동상은 0.5ml/분의 유속의 포스페이트 완충된 염수였고 0.5-2ml의 분획이 수집되었다. 컬럼 유출물의 UV 흡광도를 214 & 280nm에서 모니터하였다. dAb-Fc 또는 Fc-dAb 분자의 용리에 해당하는 피크에 대해 수집된 분획을 푸울링시켰다. 분자 보전, 균질성 및 % 순도를 실시예 13에 기재된 대로 SDS-PAGE 및 분석적 SEC에 의해 다시 분석하였다. 단백질은 생물학 검정에서의 추가 분석 전에 >95% 순수한 표적 단백질임이 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 확인되었다.
실시예 15 - Vk 항- VEGF dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 VEGF 결합 ELISA
VEGF165에 특이적으로 결합하는 Vk 항-VEGF dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자의 능력을 ELISA에 의해 측정하였다. 이것은 실시예 4와 유사한 방식으로 수행되었다. 시험된 모든 항-VEGF 화합물은 VEGF165에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 16 - Biacore 상에서 VEGF 에 대한 항- VEGF Vk dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 결합
VEGF165에 대한 항-VEGF Vk dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자의 결합 친화성을 실시예 6과 유사하나 약간 변형된 방식으로 Biacore T100을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 C1 칩 상에 고정시킨 다음, 상기 표면을 이용하여 항-VEGF 작제물을 포획하였다. 인간 재조합 VEGF165 (HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 '내부' 공급됨)를 64nM, 16nM, 4nM, 2nM, 1nM, 0.5nM 및 0.25nM의 분석물로서 이용하였다. 모든 결합 곡선은 완충제 주입 (즉, 0nM)과 이중 참조되었고, 데이터를 T100 고유의 1:1 모델에 핏팅시켰다. 50mM NaOH를 이용하여 재생을 수행하였다. 진행 완충제로서 HBS-EP를 이용하여 37℃에서 진행을 수행하였다.
Vk dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자를 DMS1576 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다. Biacore에 의해 측정시, 데이터는 Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000, DMS30001, DMS30002, DMS30003 및 DMS30004)가 VEGF와의 결합에 관해 DMS1576 및 Vk dAb-Fc에 비해 모두 향상됨을 나타낸다 (표 5를 참조하라).
표 5: VEGF 165 에 대한 항- VEGF dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )의 결합
Figure pct00013
실시예 17 - 항- VEGF Vk dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 VEGF R1 & R2 수용체 결합 검정
항-VEGF Vk dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자의 효능을 VEGF 수용체 (R1 및 R2) 결합 검정에서 실시예 7에 기재된 변형된 방법, 즉 예비-인큐베이션이 없는 방법을 이용하여 분석하고, Vh dAb-Fc, DMS1576 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다. Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000, DMS30003 및 DMS30004)는 VEGFR1 및 VEGFR2 둘 모두에 대해 DMS1576 및 베바시주맙 (아바스틴)보다 더욱 효능(즉, 보다 낮은 EC50 값, 표 6A & 6B를 참조하라)이 있는 반면, Vk dAb-Fc 분자 (DMS30005)는 VEGFR1에 대해 DMS1576보다 덜 효능이고 베바시주맙 (아바스틴)과 유사하게 효능이 있으며 VEGFR2에 대해 베바시주맙 (아바스틴)보다 더욱 효능이 있는 것으로 나타났다. VEGFR1에 대해, 상기 데이터는 Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000, DMS30003 및 DMS30004)에 의해 달성된 억제가 둘 모두 ≥90%인 Vh dAb-Fc 분자 (DMS1576) 및 베바시주맙 (아바스틴)에 비해 87-89%로 다소 감소함을 나타낸다. Vk dAb-Fc 분자 (DMS30005)는 82%로 추가로 감소된다. VEGFR2에 대해, 상기 데이터는 Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000, DMS30003 및 DMS30004)에 의해 달성된 억제가 모두 ≥90%인 Vh dAb-Fc 분자 (DMS1576) 및 베바시주맙 (아바스틴)의 것에 필적함을 나타낸다. Vk dAb-Fc 분자 (DMS30005)는 86%로 다소 감소된다.
표 6A: VEGFR1 수용체 결합 검정에서 베바시주맙 ( 아바스틴 )에 비해 항-VEGF 화합물의 EC 50 값
곡선 핏팅 및 EC50 계산은 GraphPad Prism을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00014
표 6B: VEGFR2 수용체 결합 검정에서 베바시주맙 ( 아바스틴 )에 비해 항-VEGF 화합물의 EC 50 값
곡선 핏팅 및 EC50 계산은 GraphPad Prism을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00015
실시예 18 - 인간 탯줄 내피 세포 ( HUVEC ) 증식 검정: 항- VEGF dAb - Fc 및 Fc-dAb 분자로의 억제
인간 탯줄 정맥 내피 세포의 VEGF 유도된 증식을 억제하는 Vk dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자의 능력을 실시예 8에 기재된 바와 같은 Vh dAb-Fc (DMS1576) 및 베바시주맙 (아바스틴)으로부터의 이러한 검정의 억제 능력과 비교하였다. Vk dAb-Fc 분자 (DMS30005 및 DMS30006)를 단일 검정으로 분석하였다 (데이터는 제시되지 않음). 데이터는 이러한 분자가 덜 효능이었고 (보다 낮은 IC50) DMS30005의 경우 베바시주맙 (아바스틴)에 대한 ~100%에 비해 ~70-80%로 증식을 충분히 억제할 수 없음을 나타내었다. 앞서 실시예 8에 나타낸 바와 같이, 데이터는 Vh dAb-Fc 분자 (DMS1576)가 베바시주맙 (아바스틴)보다 높은 IC50 (즉, 덜 효능임)을 지님을 시사한다. Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000, DMS30003 & DMS30004)를 여러 번 검정하였다. 데이터 세트는 Vk Fc-dAb 분자로 처리하여 달성된 억제가 베바시주맙 (아바스틴)으로 달성된 억제, 즉 ~100%에 필적하는 VEGF-매개 억제의 수준을 제공하였음을 나타낸다. 사실상, 모든 Vk Fc-dAb 분자는 중첩되거나 유사한 베바시주맙 (아바스틴) 곡선의 좌측으로 다소 이동한 최적 곡선을 생산하였으므로 이러한 검정에서 잠재적으로 더욱 효능이 있는 분자였다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 19 - 인간 VEGF 에 대한 항- VEGF Vh dAb - Fc 및 Vk Fc - dAb 분자의 결합의 차이 및 비간섭의 입증
Vk 기반 Fc-dAb 분자로 이미 미리-포화된 VEGF에 결합하는 Vh 기반 dAbFc 분자의 능력 및, 역으로, Vh 기반 dAbFc 분자로 이미 미리-포화된 VEGF에 결합하는 Vk 기반 Fc-dAb 분자의 능력을 Vk 기반 Fc-dAb 분자로서 DMS30000을 이용하고 Vh 기반 dAb-Fc 분자로서 DMS1576을 이용하여 변형된 MSD 검정에서 입증하였다.
19.A - Vk Fc - dAb DMS30000 로 미리- 포화된 후의 VEGF 에 대한 Vh dAb - Fc DMS1576의 결합
MSD 고 결합 96 웰 플레이트 (MSD L11XB-3)를 PBS (25㎕/웰) 중 3㎍/mL의 rhVEGF165 (HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 '내부' 공급됨)로 코팅하고, 플레이트 실러로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, MSD 플레이트를 Tris 세척 완충제를 이용하여 3x 300㎕/웰로 세척하고, 웰로부터 과도한 세척 완충제를 제거하기 위해 조직의 패드 상에 블롯팅시켰다. 그 후 MSD 플레이트를 PBS(250㎕/웰) 중 3% BSA로 차단하고, 실온에서 1시간 동안 진탕(750 RPM)하면서 인큐베이션시켰다. MSD 플레이트의 세척 후에, 포화시키는 DMS30000 농도 (≥3㎍/ml)를 첨가하고 (25㎕/웰) 실온에서 1시간 동안 진탕(750 RPM)하면서 인큐베이션시켰다. MSD 플레이트를 다시 세척한 다음 DMS1576 (25㎕/웰, 0-100ng/ml)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕(750 RPM)하면서 인큐베이션시켰다. DMS30000 및 DMS1576을 PBS 중 0.1% BSA에서 제조하였다. MSD 플레이트를 다시 세척한 후에 PBS 중 1% BSA에서의 1㎍/ml의 DMS1576에 함유된 Vh dAb에 특이적인 검출 시약(25㎕/웰, 내부 설포-TAG 표지된 항-Vh mAb)을 첨가하고 진탕(750 RPM)하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. MSD Sector Imager 6000에서 전기화학발광을 측정하기 전에, MSD 플레이트를 세척하고 150㎕/웰의 2x Read 완충제 T (MSD R92TC-1)를 첨가하였다.
도 2A의 데이터는 Vh 기반 dAb-Fc 분자 DMS1576이 Vk 기반 Fc-dAb 분자 DMS30000로 미리-포화된 VEGF165에 결합할 수 있음을 나타낸다.
19.B - Vh dAb - Fc DMS1576 으로 미리- 포화된 후의 VEGF 에 대한 Vk Fc - dAb DMS30000의 결합
MSD 고 결합 96 웰 플레이트 (MSD L11XB-3)를 PBS (25㎕/웰) 중 3㎍/mL의 VEGF (HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 '내부' 공급됨)로 코팅하고, 플레이트 실러로 덮고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, MSD 플레이트를 Tris 세척 완충제를 이용하여 3x 300㎕/웰로 세척하고, 웰로부터 과도한 세척 완충제를 제거하기 위해 조직의 패드 상에 블롯팅시켰다. 그 후 MSD 플레이트를 PBS(250㎕/웰) 중 3% BSA로 차단하고, 실온에서 1시간 동안 진탕(750 RPM)하면서 인큐베이션시켰다. MSD 플레이트의 세척 후에, 포화시키는 DMS1576 농도 (≥3㎍/ml)를 첨가하고 (25㎕/웰) 실온에서 1시간 동안 진탕(750 RPM)하면서 인큐베이션시켰다. MSD 플레이트를 다시 세척한 다음 DMS30000 (25㎕/웰, 0-100ng/ml)을 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕(750 RPM)하면서 인큐베이션시켰다. DMS30000 및 DMS1576을 PBS 중 0.1% BSA에서 제조하였다. MSD 플레이트를 다시 세척한 후에 PBS 중 1% BSA에서의 1㎍/ml의 DMS30000에 함유된 Vk dAb 에 특이적인 검출 시약(25㎕/웰, 내부 설포-TAG 표지된 항-Vh mAb)을 첨가하고 진탕(750 RPM)하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. MSD Sector Imager 6000에서 전기화학발광을 측정하기 전에, MSD 플레이트를 세척하고 150㎕/웰의 2x Read 완충제 T (MSD R92TC-1)를 첨가하였다.
도 2B의 데이터는 Vk 기반 Fc-dAb 분자 DMS30000이 Vh 기반 dAb-Fc 분자 DMS1576로 미리-포화된 VEGF165에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 19의 데이터 세트 둘 모두는 Vk Fc-dAb (DMS30000) 및 Vh dAb-Fc (DMS1576) 둘 모두가 상대 분자의 존재하에 VEGF165에 결합할 수 있음을 나타낸다. 실시예 19에 기재된 실험은 Vk 및 Vh 유래된 dAb의 두 계통이 VEGF 동종이합체 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있음을 시사한다.
실시예 20 - 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 클로닝
Vh-Vk dAb-Fc-dAb (SEQ ID NO: 10-11, 25, 38-39 & 53)는 포유동물 발현 벡터에서 Vh dAb-Fc (DMS1576, SEQ ID NO:2 & 30)의 C-말단으로 Vk dAb 서열 (DT02-K-044-085 (SEQ ID NO: 97 & 105) 또는 DT02-K-044-251 (SEQ ID NO: 100 & 108)을 클로닝시킴에 의해 공학처리되었다. C-말단 dAb는 ((GS(TVAAPSGS)x3) (SEQ ID NO:66 & 85) 또는 알부민 도메인 3 (SEQ ID NO:71 & 90) 링커 서열을 이용하여 Fc의 C-말단에 연결되었다. Vk-Vk dAb-Fc-dAb (SEQ ID NO:12-15, 26-28, 40-43 & 54-56)는 포유동물 발현 벡터에서 상응하는 Vk dAb-Fc (즉, DMS30000 (SEQ ID NO:3 & 31) 또는 DMS30003 (SEQ ID NO:6 & 34) 또는 DMS30013 (SEQ ID NO:16 & 44))의 C-말단으로 Vk dAb 서열 (DT02-K-044-085 (SEQ ID NO: 97 & 105) 또는 DT02-K-044-251 (SEQ ID NO:100 & 108)을 클로닝시킴에 의해 공학처리되었다. N-말단 dAb는 AS (SEQ ID NO:58 & 77) 또는 힌지 IgG1 (SEQ ID NO:60 & 79)을 이용하여 Fc의 N-말단에 연결되었다. SEQ ID NO: 27 및 28을 각각 생성하기 위해 하기 변화, 예를 들어 His 2 Ala 또는 Thr 3 Pro를 이용하여 Fc 영역 내에서 부위 지정 돌연변이유발을 수행하였다.
실시예 21 - 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 발현
관련된 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자 (SEQ ID NO:10-15, 25-28, 38-43 & 53-56에 나열됨)를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 HEK293 6E 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고 500ml 규모로 발현시켜 실시예 11에 기재된 방법을 이용하여 항체 단편 분자를 생산하였다. 통상적으로 50-100mg/L 상청액의 발현 수준이 달성되었다.
실시예 22 - 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 정제
dAb-Fc-dAb 분자를 상청액으로부터 친화성 정제시켰다 (실시예 21). 포스페이트 완충된 염수(50:50 슬러리) 중 2ml의 현탁된 친화성 수지를 500ml의 여과된 상청액에 첨가하였다; 상청액/친화성 수지 혼합물을 +4℃에서 밤새 천천히 회전시켜 결합이 일어나게 하였다. 그 후에, 수지를 가라앉히고 상청액을 조심스럽게 따라 내었다. 상기 수지를 남아 있는 상청액에 재현탁시키고, 비어 있는 드립 컬럼에 붓고, 상청액이 컬럼 밖으로 통과하게 하였다. 결합된 생성물을 pH 중성 수성 완충제의 조합물을 이용하여 세척시켜, 특이적으로 결합되지 않은 불순물을 제거하고, 저 pH 용리시켰다. 90%가 넘는 결합된 생성물이 회수되었고, 그 후 용리 푸울의 pH를 30분 동안 pH 3.5로 조정하여 바이러스 중화를 달성한 후, pH를 pH4.5로 조정하였다.
실시예 23 - 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 크기-배제 크로마토그래피 ( SEC )에 의한 분자 분석
실시예 22에 기재된 대로 정제된 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자의 분자 보전, 균질성 및 % 순도를 실시예 3에 기재된 대로 SDS-PAGE 및 분석적 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석하였다. 단백질은 생물학 검정에서의 추가 분석 전에 >95% 순수한 표적 단백질임이 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 확인되었다.
실시예 24 - 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 VEGF 결합 ELISA
VEGF165에 특이적으로 결합하는 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자의 능력을 실시예 4 & 15에 기재된 대로 ELISA에 의해 측정하였다. 시험된 모든 항-VEGF dAb-Fc-dAb는 VEGF165에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 25 - Biacore 상에서 VEGF 에 대한 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 결합
VEGF165에 대한 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자의 결합 친화성을 실시예 6과 유사하나 약간 변형된 방식으로 Biacore T100을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 C1 칩 상에 고정시킨 다음, 상기 표면을 이용하여 항-VEGF 작제물을 포획하였다. 인간 재조합 VEGF165 (HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 '내부' 공급됨)를 75nM, 15nM, 3nM 및 0.6nM의 분석물로서 이용하였다. 모든 결합 곡선은 완충제 주입 (즉, 0nM)과 이중 참조되었고, 데이터를 T100 고유의 1:1 모델에 핏팅시켰다. 50mM NaOH를 이용하여 재생을 수행하였다. 진행 완충제로서 HBS-EP를 이용하여 37℃에서 진행을 수행하였다.
dAb-Fc-dAb 분자를 이들의 상응하는 Vk Fc-dAb 및 Vh dAb-Fc 분자와 비교하였다. 이러한 검정 포맷의 데이터는 dAb-Fc-dAb 분자가 상응하는 Vk Fc-dAb보다 양호한 것 같지 않음을 제안할 수 있다. Vk Fc-dAb는 상응하는 dAb-Fc-dAb에 비해 우수한 오프-레이트(off-rate)를 지니는 것으로 보인다. 그러나, dAb-Fc-dAb "친화성"은 VEGF에 대한 두 상이한 결합 사건의 혼합, 즉 N-말단 dAb 및 C-말단 Vk dAb의 결합이므로, 그 자취(데이터는 제시되지 않음)가 충분한 내력을 말하는 것은 아닐지도 모른다. dAb-Fc-dAb에서, 즉 C-말단 Vk Fc-dAb에서와 동일한 배향에서, Vk dAb는 동일한 친화성을 지닐 것으로 예상되고, 이러한 데이터는 실시예 16에서 앞서 기재된 바를 확인시켜 준다. Fc의 N-말단에 Vh 또는 Vk dAb의 정위는 더 부족한 친화성을 초래하므로 (실시예 16을 참조하라), 조합된 분자의 전체적인 친화성을 악화시킬 것으로 보인다. 겉보기 친화성 (표 7을 참조하라)은 Biacore 상에서 이러한 분자에 대해 다음과 같은 효능을 나타낸다: Vh-Vk dAb-Fc-dAb (DMS30007 및 DMS30008)는 가장 좋지 않은 친화성을 지니고, Vk-Vk dAb-Fc-dAb (DMS30009, DMS30010, DMS30011 및 DMS30012)는 최상의 dAb-Fc-dAb 친화성을 지니며 서로 매우 유사할 것으로 보인다.
표 7: VEGF 165 에 대한 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자 및 상응하는 dAb - Fc - 및 Fc -dAb 분자의 결합
Figure pct00016
실시예 26 - 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 VEGF R1 & R2 수용체 결합 검정
항-VEGF Vh-Vk 및 Vk-Vk dAb-Fc-dAb 분자의 효능을 VEGF 수용체, R1 및 R2, 결합 검정에서 분석하였다. dAb-Fc-dAb의 VEGFR1 및 VEGFR2 둘 모두에 대한 효능 (EC50)은 Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000)의 것에 필적하는 것으로 나타났고 Vh dAb-Fc 분자 (DMS1576) 및 베바시주맙 (아바스틴) 둘 모두에 비해 더욱 효능이 있는 (즉, 더 낮은 EC50 값) 것으로 나타났다. 표 8A 및 8B를 참조하라. VEGFR1에 대해, 상기 데이터는 Vh-Vk dAb-Fc-dAb (DMS30007 및 DMS30008) 및 Vk-Vk dAb-Fc-dAb (DMS30009) 둘 모두에 의해 달성된 억제가 모두 ≥90%인 Vh dAb-Fc 분자 (DMS1576), Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000) 및 베바시주맙 (아바스틴)에 의해 달성된 것에 필적함을 나타낸다 (표 8A). VEGFR2에 대해, 상기 데이터는 Vh-Vk (DMS30022) dAb-Fc-dAb에 의해 달성된 억제가 모두 ≥90%로 달성된 Vh dAb-Fc 분자 (DMS1576), Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000 및 DMS30003) 및 베바시주맙 (아바스틴)에 의해 달성된 것에 필적하는 반면; Vh-Vk dAb-Fc-dAb (DMS30007 및 DMS30008) 및 Vk-Vk dAb-Fc-dAb 분자 (DMS30009, DMS30023 및 DMS30025)에 의해 달성된 억제는 ~75-87%로 보다 낮았음을 나타낸다 (표 8B).
표 8A: VEGFR1 수용체 결합 검정에서 베바시주맙 ( 아바스틴 )에 비해 항-VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 EC50 값
곡선 핏팅 및 EC50 계산은 GraphPad Prism을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00017
표 8B: VEGFR2 수용체 결합 검정에서 베바시주맙 ( 아바스틴 )에 비해 항- VEGF dAb-Fc-dAb 분자의 EC50 값
(i) 곡선 핏팅 및 EC50 계산은 GraphPad Prism을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00018
(ii)
Figure pct00019
실시예 27 - 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 인간 탯줄 내피 세포 ( HUVEC ) 증식 검정
인간 탯줄 정맥 내피 세포의 증식을 억제하는 Vh-Vk (DMS30022) 및 Vk-Vk (DMS30023 및 DMS30025) dAb-Fc-dAb 분자의 능력을 다음 변경을 갖는 실시예 8 & 18에 기재된 방법을 이용하여 Vh dAb-Fc 분자 (DMS1576), Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000) 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다: (i) 세포가 없는 외부 웰을 남기기보다, 전체 96 웰 플레이트를 이용하였고, (ii) 데이터는 비선형 회귀에 비해 Sigmodial 곡선 핏, 가변적인 기울기를 이용하여 GraphPad Prism을 이용해 분석되었다 (가변적인 기울기). 데이터는, 실시예 8 및 18에서 앞서 관찰된 대로, Vh dAb-Fc 분자 (DMS1576)가 베바시주맙 (아바스틴)보다 높은 EC50 (즉, 덜 효능임)을 지님을 시사한다; 대체로, Vk Fc-dAb 분자 (DMS30000)는 EC50에 관해 베바시주맙 (아바스틴)과 유사한 것으로 나타난 반면; 모든 Vh-Vk 및 Vk-Vk dAb-Fc-dAb 분자 (DMS300022, DMS300023, DMS300024 및 DMS300025)는 EC50에 관해 베바시주맙 (아바스틴)보다 모두 향상된 것으로 나타났다.
실시예 28 - 등온 열량측정법( ITC )에 의해 용해된 상태로 측정된 VEGF 결합 검정에서의 dAb - Fc - dAb 및 dAb - Fc 및 Fc - dAb 포맷의 성능
VEGF165에 결합하는 항-VEGF dAb-Fc-dAb, dAb-Fc 및 Fc-dAb의 용해 평형 결합 친화성 (KD), 화학양론 (N) 및 열역학 (ΔH, 엔탈피 및 ΔS, 엔트로피)을 Microcal VP-ITC를 이용하여 등온 적정 열량측정법(ITC)에 의해 측정하고 모노클로날 항체 베바시주맙 (아바스틴)의 것과 비교하였다. 본 실험의 주요 목적은 상이한 분자 포맷의 VEGF에 대한 결합의 상대적인 화학양론을 비교하는 것이었다. 3배가 넘는 VEGF165의 농도 초과량이 존재하고 포화가 달성될 때까지 VEGF165를 25℃에서 항체 용액으로 적정하였다. 모든 적정은 일관성을 확보하기 위해 VEGF165의 동일한 배치를 이용하였다. 통합된 결합 등온선을 표준 1:1 결합 모델을 이용하여 Origin software (Microcal version) 내에서 핏팅시켰는데, 그 이유는 다면적 거동의 조짐이 없었기 때문이다. 그 결과를 표 10에 요약한다.
표 10: VEGF 165 에 대한 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자, dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 결합
Figure pct00020
모든 항체는 25℃에서 엔탈피적으로 유리하고 엔트로피적으로 불리한 결합을 지닌다. 이중 dAb 포맷의 경우에 더 큰 용량을 지니며, dAb-Fc, Fc-dAb 및 dAb-Fc-dAb dAb 포맷간에 화학양론에 있어서 뚜렷한 차이가 있다. dAb-Fc-dAb 포맷은 또한 VEGF165가 과도하게 존재하는 경우 아바스틴 보다 높은 용량을 나타낸다. 측정된 친화성들은 동일한 순위에 있으며 다른 방법에 의해 측정된 것과 일치한다.
실시예 29 - 다양한 링커 변형을 지닌 항- VEGF Vh dAb - Fc , Vk dAb - Fc 및 Vk Fc-dAb 분자의 클로닝
dAb 서열 (SEQ ID NO: 96-97, 104-105, 표 19를 참조하라)은 포유동물 발현 벡터에서 인간 IgG1 아이소형의 제네릭 Fc의 N- 또는 C-말단 상에 클로닝되었다. dAb는 다양한 링커 서열을 이용하여 Fc에 연결되었고 (표 19를 참조하라, SEQ ID Nos 57-75 & 76-94): Vh dAb-Fc의 경우 dAb는 DOM15-26-597이었고; N-말단 링커는 AS (SEQ ID NO:58 & 77), 또는 TVAAPS (SEQ ID NO:59 & 78), 또는 힌지 IgG1 링커 (SEQ ID NO:60 & 79), 또는 힌지 IgG3 링커 (SEQ ID NO:61 & 80) 또는 피브로넥틴 x3 링커 (SEQ ID NO:62 & 81) 또는 피브로넥틴 x4 링커 (SEQ ID NO:63 & 82)였고; Vk dAb-Fc의 경우 dAb는 DT02-K-044-085이었고; N-말단 링커는 H2A IgG1Fc 점 돌연변이를 지닌 AS (SEQ ID NO:64 & 83), T3P IgG1Fc 점 돌연변이를 지닌 AS (SEQ ID NO:65 & 84), 또는 TVAAPS (SEQ ID NO:59 & 78), 또는 힌지 IgG1 링커 (SEQ ID NO:60 & 79), 또는 힌지 IgG3 링커 (SEQ ID NO:61 & 80) 또는 피브로넥틴 x3 링커 (SEQ ID NO:62 & 81) 또는 피브로넥틴 x4 링커 (SEQ ID NO:63 & 82)였고; Vk Fc-dAb는 DT02-K-044-085이었고; C-말단 링커는 (GS(TVAAPSGS)x3 (SEQ ID NO:66 & 85), 또는 피브로넥틴 x3 링커 (SEQ ID NO:67 & 86) 또는 피브로넥틴 x4 링커 (SEQ ID NO:68 & 87) 또는 알부민 도메인 1 (SEQ ID NO:69 & 88), 알부민 도메인 2 (SEQ ID NO:70 & 89), 트렁케이션된 알부민 도메인 3 링커 (Alb Dom 3-TFHAD, SEQ ID NO:72 & 91) 또는 Gly4Ser 3x 링커 (SEQ ID NO:73 & 92), Gly4Ser 4x 링커 (SEQ ID NO:74 & 93) 또는 나선형 링커 (SEQ ID NO:75 & 94)였다.
실시예 30 - 다양한 링커 변형을 지닌 항- VEGF Vh dAb - Fc , Vk dAb - Fc 및 Vk Fc-dAb 분자의 발현
관련된 Vh 항-VEGF dAb-Fc, Vk 항-VEGF dAb-Fc 및 Vk 항-VEGF Fc-dAb 분자 (실시예 29 SEQ ID NO: 132-134 및 155-176에 기재됨, 표 19)를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 HEK293 6E 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고 500ml의 규모로 발현시켜 실시예 11에 기재된 대로 항체 단편 분자를 생산하였다.
실시예 31 - 다양한 링커 변형을 지닌 항- VEGF Vh dAb - Fc , Vk dAb - Fc 및 Vk Fc-dAb 분자의 정제
실시예 30에 기재된 Vh 항-VEGF dAb-Fc, Vk 항-VEGF dAb-Fc 및 Vk 항-VEGF Fc-dAb 분자를 상청액으로부터 친화성 정제시켰다 (실시예 12를 참조하라).
실시예 32 - 다양한 링커 변형을 지닌 항- VEGF Vh dAb - Fc , Vk dAb - Fc 및 Fc-dAb 분자의 SDS - PAGE 및 크기-배제 크로마토그래피 ( SEC )에 의한 분자 분석
실시예 31에 기재된 대로 정제된 항-VEGF Vh dAb-Fc, 항-VEGF Vk dAb-Fc 및 항-VEGF Vk Fc-dAb 분자의 분자 보전, 균질성 및 % 순도를 실시예 3에 기재된 대로 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 겔은 단량체 사슬 당 예상되는 글리칸 사슬의 존재를 허용하면서 무손상 성숙 단백질의 예상되는 분자량에 일치하는 밴드 크기를 나타내었다 (dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자에 대해 ~76kDa 내지 ~85kDa). 단백질은 생물학 검정에서의 추가 분석 전에 >95% 순수한 표적 단백질임이 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 확인되었다. dAb-Fc 또는 Fc-dAb 분자가 <95% 순수한 경우, 추가 SEC 정제를 수행하였다 (실시예 14 & 33을 참조하라).
실시예 33 - 다양한 링커 변형을 지닌 항- VEGF Vh dAb - Fc , Vk dAb - Fc 및 Vk Fc-dAb 분자의 크기-배제 크로마토그래피 ( SEC )에 의한 정제
필요한 경우, 분취용 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)를 Vh dAb-Fc, Vk dAb-Fc 및 Vk Fc-dAb 분자에 대해 수행하였다.
실시예 34 - Biacore 상에서 VEGF 에 대한 다양한 링커 변형을 지닌 항- VEGF Vh dAb - Fc , Vk dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 결합
VEGF165에 대한 항-VEGF Vh dAb-Fc, Vk dAb-Fc 및 Fc-dAb 분자의 결합 친화성을 실시예 16과 유사하나 약간 변형된 방식으로 Biacore T100을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 C1 칩 상에 고정시킨 다음, 상기 표면을 이용하여 항-VEGF 작제물을 포획하였다. 인간 재조합 VEGF165 (HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 '내부' 공급됨)를 하기 상세된 일련의 다양한 희석 범위에 걸친 분석물로서 이용하였다. 모든 결합 곡선은 완충제 주입 (즉, 0nM)과 이중 참조되었고, 데이터를 T100 고유의 1:1 모델에 핏팅시켰다. 50mM NaOH를 이용하여 재생을 수행하였다. 진행 완충제로서 HBS-EP를 이용하여 37℃에서 진행을 수행하였다.
Vk Fc-dAb 분자를 16nM, 4nM, 2nM, 1nM, 0.5nM 및 0.25nM의 농도 범위에 걸쳐 DMS30000 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다. 이러한 데이터로부터, C-말단 링커 알부민 도메인 2 및 피브로넥틴 x4에 의해 IgG1Fc에 연결된 DT02-K-085 dAb를 지닌 Vk Fc-dAb 분자는 Biacore에서 DMS30000과 유사하게 거동하였다고 결론내렸다 (표 11A). 알부민 2 링커의 이용은 생물물리적 연구에서 바람직하지 않았으므로 (데이터는 제시되지 않음), 피브로넥틴 4 (fib4)가 DMS3000에서 (GS(TVAAPSGS)x3 링커를 대신하기에 바람직한 C-말단 링커였고, (GS(TVAAPSGS)x3 링커는 분자 발생에 문제되는 다수의 글리코실화된 아이소형을 제공한다 (데이터는 제시되지 않음). 추가 항-VEGF VkFc-dAb 데이터 세트가 4배 연속 희석물에서 128nM 내지 0.03125nM의 농도 범위에 걸쳐 유사한 Biacore 실험에 의해 생성되었고, 이것은 표 11B에 제시된다. 데이터는 DT02-K-085 dAb를 IgG1Fc에 부착시키기 위한 C-말단으로서 fib4 링커 (DMS30026)를 나선형 링커 (DMS30027)와 비교한다. fib4 링커가 바람직하다.
표 11A: VEGF 165 에 대한 항- VEGF Vk dAb - Fc 및 Fc - dAb 분자의 결합 및 DMS1576, DMS30000 , 항- VEGF dAb - Fc - dAb 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과의 비교
Figure pct00021
표 11B: VEGF 165 에 대한 항- VEGF Vh dAb - Fc , Vk dAb - Fc 및 Vk Fc - dAb 분자의 결합 및 DMS1576 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과의 비교
Figure pct00022
Vk dAb-Fc 분자를 16nM, 4nM, 2nM, 1nM, 0.5nM 및 0.25nMm의 농도 범위에 걸쳐 DMS1576 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였고, 이 때 N-말단 링커 N085 피브로넥틴 4 및 1xTVAAAPS에 의해 IgG1Fc에 연결된 DT02-K-085 dAb를 지닌 Vk dAbFc 분자가 비교되었다. 데이터는 1xTVAPPS가 DT02-K-085 dAb를 IgG1Fc의 N-말단에 부착시키기에 바람직한 2개의 링커임을 제안한다. Vk dAb-Fc 분자의 추가 예가 표 11B 및 11C에 제시되어 있다. 데이터는 4배 연속 희석물에서 128nM 내지 0.03125nM의 농도 범위에 걸쳐 생성되었고 N085 T113P (T2P) 또는 ASTHP 링커 (DMS30029), N085 extg1 또는 IgG1 힌지 링커 (DMS30028)에 의해 IgG1Fc의 N-말단에 부착된 DT02-K-085 dAb를 지닌 Vk dAb-Fc 단백질을 DMS1576과 비교하였다. 표 11B의 데이터로부터, IgG1 힌지 링커 (N085extg1)는 IgG1Fc의 N-말단으로의 DT02-K-085 dAb 부착을 위한, 1x TVAAPS를 능가하는 바람직한 링커로서 선택되었다.
Vh dAb-Fc 분자를 4배 연속 희석물에서 128nM 내지 0.03125nM의 농도 범위에 걸쳐 DMS1576 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다. 표 11B로부터의 데이터는 dAb-Fc의 N-말단으로의 15-26-597 Vh dAb의 부착을 위한 바람직한 링커가 피브로넥틴 반복체의 3 카피에 기반한 것임을 제안한다. 표 11C에 제시된 추가 데이터는, 그 밖의 링커가 Fc로의 15-26-597 dAb의 N-말단에 의한 부착에 이용되는 경우, 그 결과로서 생성된 dAb-Fc 단백질이 항 VEGF Biacore에서 2상 특성을 지님을 제안한다. Biacore 곡선의 형상으로부터, N597extg1 (IgG1 힌지) 링커는 이러한 데이터 세트로부터 차선으로 취해졌다.
표 11C: VEGF 165 에 대한 항- VEGF VhdAb - Fc , Vk dAb - Fc 분자의 결합 및 DMS1576 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과의 비교
Figure pct00023
Fc로의 15-26-597 dAb의 N-말단 커플링을 위해 링커 Fib3 또는 Fib4를 함유하는 Vh dAb-Fc 분자의 항-VEGF Biacore에서의 거동을 4배 연속 희석물에서 32nM 내지 0.03125nM의 VEGF의 농도 범위에 걸쳐 DMS1576과 비교하였다. 데이터를 표 11D에 제시한다. 데이터는 Fib3 링커에 비해 Fib4 링커를 사용하는 것에 이익은 없으나 Fib3 또는 Fib4 링커의 서열을 이용한 Fc로의 15-26-597 dAb의 N-말단 부착을 위해 링커가 DMS1576에 존재하는 'AS'로부터 길어지는 경우, Vh dAb-Fc는 항 VEGF Biacore에 의한 더욱 최적의 결합 동역학을 나타냄을 제안한다.
전체적인 데이터 세트는 신규한 링커를 이용하여 가장 최적의 항-VEGF dAb-Fc-dAb를 만드는 것이 효능을 개선시킬 뿐 아니라 추후 하기를 위해 글리코실화된 아이소형의 수를 감소시킴을 제안하였다:
(i) Fc에 DT-02-K44-085 Vk dAb의 C-말단 첨가; 피브로넥틴 x4 및 나선형 링커가 바람직하였다;
(ii) Fc에 DT-02-K44-085 Vk dAb의 N-말단 첨가; IgG1 힌지, ASTHP 및 1xTVAAPs 링커가 바람직하였다;
(iii) Fc에 15-26-597 Vh dAb의 N-말단 첨가; 피브로넥틴 3 링커가 바람직하였으나, IgG1 힌지 및 AS 링커가 추가로 뒤따랐다.
표 11D: VEGF 165 에 대한 Fibr4 및 Fibr3 N-말단 링커를 지닌 항- VEGF VhdAb -Fc 분자의 결합 및 DMS1576 과의 비교
Figure pct00024
실시예 35 - 변형된 링커를 지닌 항- VEGF Vh / Vk & Vk / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 클로닝
Vk-Vk dAb-Fc-dAb: DMS30034 및 DMS30035 (SEQ ID NO: 135-136, 177-178, 표 19) 및 Vh-Vk dAb-Fc-dAb: DMS30036-DMS30041 (SEQ ID NO: 137-142, 179-184, 표 19)는 Fc IgG1 서열 (SEQ ID: 102 & 110)의 N-말단 또는 C-말단 상에서 Vh-dAb-Fc 융합 벡터 (DMS1576, SEQ ID NO: 2 & 30)로부터 Vk dAb 서열 (DT02-K-044-085 (SEQ ID NO: 97 & 105) 또는 Vh dAb 서열, DOM15-26-597 (SEQ ID: 96 & 104)을 클로닝시킴에 의해 공학처리되었다. Fc IgG1을 포유동물 발현 벡터에서 피브로넥틴 x4 링커 (SEQ ID: 63 & 82, 표 19를 참조하라)에 의해 C-말단에서 Vk dAb (DT02-K-044-085 (SEQ ID NO: 97 & 105))의 N-말단으로 연결시켰다. N-말단 Vh dAb를 AS (SEQ ID NO:58 & 77, 표 19): DMS30038 (SEQ ID NO:139, 181, 표 19), 또는 힌지 IgG1 (SEQ ID NO:60 & 79, 표 19): DMS30037 (SEQ ID NO:138, 180, 표 19) 또는 피브로넥틴 3 (SEQ ID NO:67 & 86, 표 19): DMS30036 (SEQ ID NO:137, 179, 표 19) 및 DMS30040 (SEQ ID NO:141, 183, 표 19) 또는 피브로넥틴 4 (SEQ ID NO:60 & 79, 표 19): DMS30039 (SEQ ID NO:140, 182, 표 19) 및 DMS30041 (SEQ ID NO:142, 184, 표 19)를 이용하여 Fc의 N-말단에 연결시켰다. N-말단 Vk dAb를 힌지 IgG1 (SEQ ID NO:60 & 79, 표 19): DMS30034 (SEQ ID NO:135, 177, 표 19) 또는 ASTHP (H2A IgG1Fc, SEQ ID NO: 58 & 65; 77 & 84, 표 19): DMS30035 (SEQ ID NO:136, 178, 표 19) 또는 힌지 IgG1 (SEQ ID NO:60 & 79, 표 19): DMS30043 (SEQ ID NO: 143, 177, 표 19)을 이용하여 Fc의 N-말단에 연결시켰다. 서열 DMS 30035, 30040 및 30041 (각각 SEQ ID 136 & 178; 141 & 183; 및 142 & 148)에서, Fc는 Fc의 위치 3에 트레오닌 대신 프롤린을 함유하였다.
포유동물 세포에서의 안정한 발현을 위해, 피브로넥틴 x 4 링커 서열 및 C-말단 Vk dAb를 코돈 최적화시켜 전반적인 dAb-Fc-dAb 코돈 적응 지수 (인간)를 >0.95로 상승시켰다. 이러한 단편은 올리고누클레오티드 어셈블리에 의해 생성되었고 각각 DMS30034 (SEQ ID 135 & 177), DMS30036 (SEQ ID 137 & 179), DMS30037, (SEQ ID 138 & 180) 및 DMS30038 (SEQ ID 139 & 181)로 클로닝되어 DMS30043 (SEQ ID 143 & 177), DMS30044 (SEQ ID 144 & 179), DMS30045 (SEQ ID 145 & 180) 및 DMS30046 (SEQ ID 146 & 181)을 생성하였다. 정화를 위해, DNA 서열만을 변경시키고 단백질 아미노산 서열은 동일하게 남아 있었다.
실시예 36 - 변형된 링커를 지닌 항- VEGF Vh / Vk & Vk / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 발현
관련된 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자 (SEQ ID NO:135, 137-139 및 177, 179-181에 열거됨)를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 HEK293 6E 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고 500ml 규모에서 발현시켜 실시예 10 및 21에 기재된 방법을 이용하여 항체 단편 분자를 생산하였다. 통상적으로 >30mg/L 상청액의 발현 수준이 달성되었다.
실시예 37 - 변형된 링커를 지닌 항- VEGF Vh / Vk & Vk / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 정제
dAb-Fc-dAb 분자를 상청액으로부터 친화성 정제시켰다 (실시예 36). 포스페이트 완충된 염수(50:50 슬러리) 중 2ml의 현탁된 친화성 수지를 500ml의 여과된 상청액에 첨가하였다; 상청액/친화성 수지 혼합물을 +4℃에서 밤새 천천히 회전시켜 결합이 일어나게 하였다. 그 후에, 수지를 가라앉히고 상청액을 조심스럽게 따라 내었다. 상기 수지를 남아 있는 상청액에 재현탁시키고, 비어 있는 드립 컬럼에 붓고, 상청액이 컬럼 밖으로 통과하게 하였다. 결합된 생성물을 pH 중성 수성 완충제의 조합물을 이용하여 세척시켜, 특이적으로 결합되지 않은 불순물을 제거하고, 저 pH 용리시켰다. 90%가 넘는 결합된 생성물이 회수되었고, 그 후 용리 푸울의 pH를 30분 동안 pH 3.5로 조정하여 바이러스 중화를 달성한 후, pH를 pH4.5로 조정하였다.
실시예 38 - 변형된 링커를 지닌 항- VEGF Vh / Vk & Vk / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 크기-배제 크로마토그래피 ( SEC )에 의한 분자 분석
실시예 38에 기재된 대로 정제된 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자의 분자 보전, 균질성 및 % 순도를 실시예 3, 13 & 24에 기재된 대로 SDS-PAGE 및 분석적 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석하였다. 단백질은 생물학 검정에서의 추가 분석 전에 >95% 순수한 표적 단백질임이 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 확인되었다.
실시예 39 - 변형된 링커를 지닌 항- VEGF Vh / Vk & Vk / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 VEGF에 대한 결합 및 Biacore 상에서 Vh 및 Vk dAb - Fc 및 Vk Fc - dAb 와의 비교
VEGF165에 대한 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자의 결합 친화성을 실시예 25 & 34와 유사하나 약간 변형된 방식으로 Biacore T100을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 C1 칩 상에 고정시킨 다음, 상기 표면을 이용하여 항-VEGF 작제물을 포획하였다. 인간 재조합 VEGF165 (HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 '내부' 공급됨)를 4배 연속 희석물에서 32nM 내지 0.03125nM의 분석물로서 이용하였다. 모든 결합 곡선은 완충제 주입 (즉, 0nM)과 이중 참조되었고, 데이터를 T100 고유의 1:1 모델에 핏팅시켰다. 50mM NaOH를 이용하여 재생을 수행하였다. 진행 완충제로서 HBS-EP를 이용하여 37℃에서 진행을 수행하였다.
dAb-Fc-dAb 분자를 이들의 상응하는 Vk Fc-dAb 및 Vk dAb-Fc 및 Vh dAb-Fc 분자와 비교하였고, 그 데이터를 표 12A에 제시한다. 이러한 Vh/Vk dAb-Fc-dAb 중 일부: DMS30037 및 DMS30022 (표 12A를 참조하라)는 예상외로 Biacore에서 잘 수행되었고 양호한 온 레이트 및 오프 레이트를 지녔는데, 이는 매우 효능 있는 분자를 제안하는 것이다.
표 12A: VEGF 165 에 대한 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자 및 상응하는 dAb - Fc - 및 Fc-dAb 분자의 결합
Figure pct00025
가장 효능 있는 것으로 보이는 dAb-Fc-dAb를 DMS1576 및 아바스틴과 비교한 추가 Biacore 데이터 세트를 수득하였고 이의 예는 표 12B에 제시된다. 데이터 세트는, Vh/Vk dAb-Fc-dAb: DMS30022, DMS30036, DMS30037 및 DMS30038이 효능에 있어서 아바스틴과 유사해 보이고 Vk/Vk dAb-Fc-dAb DMS30034가 전반적인 KD에 있어서 DMS1576에 비해 개선되지 했지만(표 12B를 참조하라), 전체적으로 덜 효능임을 (오프-레이트에 관해 Kd s-1 1.04E-04, 표 12B를 참조하라) 재확인시켜 준다.
실시예 25와 대조적으로, 이러한 결과에서 보여진 VEGF에 대한 dAb-Fc-dAb 분자의 결합 데이터는, 둘 모두의 VEGF 결합 부위가 유사한 효능을 지닐 때 (예컨대, DMS30036, DMS30037 및 DMS30038) Biacore가 이가 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자를 분석하는데 매우 유익한 검정 포맷일 수 있고, 하나의 효능 결합 부위 및 하나의 덜 효능인 결합 부위를 갖는 분자, 예컨대 DMS30034를 구별하는데 이용될 수 있음을 제안한다.
표 12B: VEGF 165 에 대한 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자의 결합 및 DMS1576 및 아바스틴과의 비교
Figure pct00026
실시예 40 - 가장 효능인 Vh dAb - Fc 및 아바스틴에 비해 변형된 링커를 지닌 항- VEGF Vh / Vk & Vk / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 VEGF R2 수용체 결합 검정
변형된 링커를 지닌 항-VEGF Vh/Vk & Vk/Vk dAb-Fc-dAb 분자 중 일부의 효능을 VEGF 수용체 2 (R2) 결합 검정에서 실시예 7, 17 & 26에 기재된 변형된 방법, 즉 예비-인큐베이션이 없는 방법을 이용하여 분석하고, Vh dAb-Fc, DMS30030 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다. 데이터는 표 13A 및 13B에 제시된다. 표 13A의 데이터로부터, 시험된 모든 dAb-Fc-dAb 분자: DMS30022, DMS30023, DMS30034, DMS30036 및 DMS30037은 DMS30030에 비해 낮은 EC50 값에 의해 더욱 효능이 있고 베바시주맙 (아바스틴)보다 현저하게 더욱 효능이 있는 것으로 나타났다. 그러나, >94% 최대 억제를 달성한 아바스틴, DMS30022 및 DMS30030 그리고 78-84% 최대 억제를 달성한 DMS30023, DMS30034, DMS30036 및 DMS30037을 이용한 검정에서 분자에 의한 달성된 최대 억제율에 약간의 가변성이 존재하였다 (데이터는 제시되지 않음).
dAb-Fc-dAb: DMS30022 및 DMS30038을 Vh dAb-Fc, DMS30030 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교한 추가 데이터가 생성되었고, 이를 표 13B에 제시한다.
요약해 보면, DMS30022 및 DMS30038은 비슷하며 DMS30030에 비해 낮은 EC50 값에 의해 더욱 효능이 있고 베바시주맙 (아바스틴)보다 현저하게 더욱 효능이 있는 것으로 나타났다, 표 13B. 역시, >95% 최대 억제를 달성한 아바스틴, DMS30022 및 DMS30030 그리고 91% 최대 억제를 달성한 DMS30038을 이용한 검정에서 분자에 의한 달성된 최대 억제율에 약간의 가변성이 존재하였다 (데이터는 제시되지 않음).
표 13A: VEGFR2 수용체 결합 검정에서 DMS30030 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과 비교한 항- VEGF dAb - Fc - dAb 의 EC 50 값
곡선 핏팅 및 EC50 계산은 GraphPad Prism을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00027
표 13B: VEGFR2 수용체 결합 검정에서 DMS30030 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과 비교한 항- VEGF dAb - Fc - dAb : DMS30022 및 DMS30038 의 EC 50 값
곡선 핏팅 및 EC50 계산은 GraphPad Prism을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00028
실시예 41 - 인간 탯줄 정맥 내피 세포 ( HUVEC ) 증식 검정: 변형된 링커를 함유하는 항- VEGF Vh / Vk & Vk / Vk dAb - Fc - dAb 분자를 이용한 억제
인간 탯줄 정맥 내피 세포의 증식을 억제하는 변형된 링커를 지닌 dAb-Fc-dAb 분자: Vh-Vk (DMS30022, DMS30036, DMS30037) 및 Vk-Vk (DMS30023, DMS30034)의 능력을 다음 변경을 갖는 실시예 8 & 18 & 27에 기재된 방법을 이용하여 Vh dAb-Fc 분자 (DMS30030), Vk Fc-dAb 분자 (DMS30026) 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다: (i) 세포가 없는 외부 웰을 남기기보다, 전체 96 웰 플레이트를 이용하였고, (ii) 데이터는 비선형 회귀에 비해 Sigmodial 곡선 핏, 가변적인 기울기를 이용하여 GraphPad Prism을 이용해 분석되었다 (가변적인 기울기). 시험 화합물은 비교측정 분자인 베바시주맙 (아바스틴)에 대해 개별적인 플레이트 상에서 독립적으로 평가되었다; 상기 검정은 베바시주맙 (아바스틴): 20; DMS30030: 8; DMS30036: 8; DMS30022: 4; DMS30037: 8; DMS30026: 4; DMS30023: 4; DMS30034: 4 (데이터는 제시되지 않음)의 분자 당 총 데이터 세트를 이용하여, 적어도 4번의 별도의 경우에 대해 수행되었다. 검정에서 베바시주맙 (아바스틴)에 비해 특정 분자에 의해 생성된 상대 EC50 값 및 최대 억제 정도 둘 모두를 분석하는데 중점을 두었다.
데이터는 비선형 회귀에 비해 Sigmodial 곡선 핏, 가변적인 기울기를 이용하여 GraphPad Prism을 이용해 분석되었다 (가변적인 기울기). 개개의 곡선 핏을 각 분자 및 각각의 날에 핏팅시켰다. 다소의 불충분한 핏팅으로 인해, 플래토가 낮은 농도에서 관찰되지 않은 곡선에 대해 제약(constraint)을 도입시키기로 결정하였다. 이러한 제약은 가장 낮은 농도에서의 점수의 평균과 같을 것이다. 데이터는 최소값이 제약되었는지 아닌지에 관해 수동으로 선택되었고, 곡선 핏 및 파라메터는 이러한 기준 선택에 기반하여 자동으로 업데이트되었다. 곡선 최대값 및 표준 오차의 추정치를 가중치로서 1/(표준 오차)2, [SE]2를 이용하여, 분산의 가중 혼합 모델 분석을 이용하여 분석하였다. 분석은 임의 효과 조건(random effects terms)을 이용하여 플레이트 및 일(day)간 가변성에 대해 조정되었다. 이러한 분석으로부터, 예측 평균을 추정하였고, 아바스틴 (대조군)과 다시 비교하였다 (표 14A를 참조하라). 그 후 동일한 분석을 IC50에 대해 log10 규모로 수행하였고, 그 결과를 다시 변환시켰다. 이로부터, 기하 평균의 추정치가 생성되었고, 아바스틴 (대조군)에 대한 비율의 형태로 아바스틴과 다시 비교하였으며, 즉, 0.5의 비율은 아바스틴으로부터 50% 하락을 나타낼 것이다, (표 14B).
표 14A: HUVEC 검정에서 DMS30026 , DMS30030 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과 비교하여 95% 신뢰 구간 ( CI )을 지닌 항- VEGF dAb - Fc - dAb 의 최대 억제율의 예측된 기하 평균
이러한 분석으로부터 분자 DMS30022, DMS30034, DMS30036 및 DMS30037은 HUVEC 검정에서 가장 최대한의 억제를 유도한 것으로 보이며, 비록 이들이 아바스틴 그룹을 명백하게 능가하더라도, 신뢰 구간이 기준 영점과 중첩되어, 아바스틴으로부터 통계적으로 유의한 차이는 없었다, 데이터는 제시되지 않음 (표 14A).
표 14B: HUVEC 검정에서 DMS30026 , DMS30030 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과 비교하여 95% 신뢰 구간 ( CI )을 지닌 항- VEGF dAb - Fc - dAb 에 대한 IC50 의 기하 평균
Figure pct00030
95% 신뢰 구간 (CI)을 지닌 IC50 값의 기하 평균의 유사한 분석은 분자 DMS30022, DMS30023, DMS30036 및 DMS30037이 아바스틴보다 통계적으로 현저하게 낮은 IC50 값을 지녔음을 나타내었다, 데이터는 도시되지 않음 (표 14B).
분리된 데이터 세트를 상이한 오퍼레이터로부터 유사한 포맷으로 HUVEC 검정으로부터 생성하였다. 데이터는 HUVEC 검정에서 2개의 dAb-Fc-dAb: DMS30022 및 DMS30037의 거동을 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하는 것에 초점을 맞추었고 4중으로 수행되었다. 상기 데이터는, 둘 모두의 dAb-Fc-dAb가 HUVEC 검정에서 매우 유사한 IC50 값 및 최대 억제 수준을 지니고, 비록 이러한 특수한 데이터 세트에서 통계학적으로 그렇진 않으나, 베바시주맙 (아바스틴)보다 큰 효능이 있는 것으로 보임을 제안한다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 42 - VEGF 유도된 혈액-망막 붕괴에서 변형된 링커를 지닌 항- VEGF Vh/Vk & Vk / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 성능: 토끼 망막 누출 모델
DMS30022, DMS30030, DMS30034, DMS30036 및 DMS30037을 토끼 안구에서의 인간 VEGF165 (R&D Systems) 유도된 혈액-망막 붕괴 (BRB) 모델에서 시험하였고, 실시예 9에 기재된 대로 베바시주맙 (아바스틴), 및 케나코트 (트람시날론)에 대해 비교하였다.
본 연구 및 방법의 목적은 상기 실시예 9에 개요된 것과 유사하였다. 투여 및 주입 스케쥴이 표 15A에 제시된다.
모든 분자는 상기 실시예 9의 방법에 따라서 50mM 소듐 아세테이트 완충제 pH5.5, 104mM NaCl, 0.02mM EDTA로 완충제 교환되었다.
140마리의 HY79B 안료화된 토끼를 12마리 동물로 된 11개 그룹 및 8마리 동물로 된 한 그룹으로 무작위로 나누었고, 각 그룹은 케나코트 처리 그룹을 제외하고, 3마리 동물로 된 4 실험 세트로 세분되었다 (표 15A를 참조하라).
투여된 분자 중 일부 (DMS30036, DMS30037 및 DMS30022)의 평균 유리체내 수준을 MSD (MesoScale Discovery) 기반 기능성 VEGF 결합 검정에 의해 측정하였다 (데이터는 제시되지 않음). 측정된 분자의 경우, 수준들은 주입된 수준에서 예측된 것과 유사하였고 토끼 유리체에서의 분자에 대해 있음직한 반감기 범위였다 (데이터는 제시되지 않음). 플루오레세인 혈관조영상을 정성적 평가를 위해 수집하였다.
표 15A: 베바시주맙 ( 아바스틴 ) 및 케나코트 ( 트리암시날론 )에 비해 DMS30022, DMS30030 , DMS30034 , DMS30036 및 DMS30037 에 의한 VEGF 유도된 토끼 망막 누출의 억제를 위한 투여 및 주입 스케쥴
Figure pct00031
유리체내 주입된 VEGF는 BRB의 붕괴를 유도하였으며, 이러한 붕괴는, 주입한 지 9일 후, 공개된 하기 화합물: 3개 모두의 용량의 베바시주맙 (아바스틴); DMS30030 (L 및 L/3 용량); DMS30022 (L/3 용량), DMS30034 (L/3 용량), DMS30036 (L 용량), 및 DMS30037 (L 및 L/3 용량)로의 처리에 의해 시판 참조 (케나코트®)의 것과 유사한 효능으로 차단되었다. 비공개 연구에서, 비록 단일의 현저한 외형(outling) 데이터 점수의 존재가 분류에 영향을 주긴 했으나, 중요한 망막 혈관 누출이 비히클, 음성 대조군, 및 L/3 용량의 DMS30036으로 처리한 후에 오른쪽 유도된 눈에서 인지되었다 (데이터는 제시되지 않음). 형광성에 대한 이상 기록으로 인해 하나의 데이터 점수(토끼 134)가 DMS30037 L/3 투여된 그룹에서 추가 분석으로부터 제외되었음을 주목하라.
미가공 데이터를 추가로 통계 분석하였다: 동일한 분자 및 용량에 해당하는 비공개 그룹을 푸울링시켰고, 기하 평균 값을 95% 신뢰 구간(CI)으로 측정하였다. 기하 평균 데이터를 표 15B (i)에 제시하고, 비히클 값에 대한 비율 및 95% CI를 지닌 분산을 표 15B (ii)에 제시한다. 표 15B (i) 및 (ii)에서의 데이터 분석으로부터, 시판되는 코르티코이드 참조 (케나코트® 지연)는 VEGF 유도된 망막 누출의 정도를 80%만큼 감소시켰고, 3가지 상이한 용량의 베바시주맙 (아바스틴)은 용량 반응의 증거 없이 71.4-76.4%만큼 효과적이었고, DMS30022 (L/3)는 74.6%만큼 효과적이었고, DMS30037 (L)은 74.2%만큼 그리고 (L/3)은 67.4%만큼; DMS30036 L/3은 63.7%만큼; DMS30034 L/3은 59.5%만큼 및 DMS 30030 (L)은 65.5%만큼 그리고 L/3은 70.5%만큼 효과적이었다. DMS30022 및 DMS30037과 같은 Vh/Vk dAb-Fc-dAb가 이러한 모델에서 가장 효능 있는 포맷이었다고 결론 내렸다.
표 15B: 베바시주맙 ( 아바스틴 ) 및 케나코트 ( 트리암시날론 )에 비해 DMS30022, DMS30030 , DMS30034 , DMS30036 및 DMS30037 에 의한 VEGF 유도된 토끼 망막 누출의 억제
log10 왼쪽 눈 값 (LE)에 대해 조정된 log10 오른쪽 값 (RE)의 분석, (그룹 5에서 토끼 134 불투명 수정체 제외: DMS30037 L/3)
(i) 기하 평균
( ii ) 비히클에 대한 비율 및 감소율
Figure pct00033
실시예 43 - 차이니즈 햄스터 난소 ( CHO ) 세포로부터 Vh / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 대규모 정제
예를 들어, DMS30037은 친화성 크로마토그래피 및 자동 FPLC 정제 시스템을 이용하여 정화된 세포 배양 상청액으로부터 포획되었다. 일단 로딩되면, 결합된 생성물을 pH 중성 수성 완충제의 조합물을 이용하여 세척하여 특이적으로 결합되지 않은 불순물을 제거한 후 저 pH 용리시키고, 이로부터 90%가 넘는 결합된 생성물을 회수하였다. -40℃에서 저장한 후에, 용리 푸울을 해동시킨 다음, pH를 30분 동안 pH 3.6으로 조정함으로써 바이러스 중화를 달성하였고, 그 후 pH를 pH 6.0으로 조정하였다. 생성물이 불순물의 제거 공정을 촉진하는 생성물 비결합 조건하에 로딩되도록 pH 조정된 푸울을 두 번째 컬럼 상에서 추가 정제시켰다. 그 후 정제된 DMS30037을 푸울로서 수집한 후 0.2㎛ 여과 및 저장하였다. 추가로, DMS30037 친화성 컬럼 용리물을 저염 완충제에서 pH 7.5로 조정하고, 여과한 다음 농축시키고, 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 적합한 제형 완충제로 정용여과시켰다. 회수된 생성물을 0.2㎛ 멸균 여과시키고 저장하였다.
실시예 44 - 변형된 C-말단을 지닌 항- VEGF Vh / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 클로닝
Vk dAb의 C-말단에 변형을 지닌 Vh-Vk dAb-Fc-dAb: DMS30047-30054 (SEQ ID NO:147-154 & 185-192, 표 19)를, 변이체 Vk dAb 서열을 PCR에 의해 생성한 다음 DMS30045 및 DMS30046으로 각각 재클로닝시켜 변형된 포유동물 발현 벡터를 생성함에 의해 공학처리하였다. DMS30045로부터: (i) C-말단 아르기닌 잔기를 제거시켜 DMS30047 (DMS30037-R)을 생성하였고, (ii) C-말단 알라닌을 첨가시켜 DMS30048 (DMS30037+A)을 생성하였고, (iii) 3개의 C-말단 알라닌을 첨가시켜 DMS30049 (DMS30037+AAA)를 생성하였고 C-말단 트레오닌을 첨가시켜 DMS30050 (DMS30037+T)을 생성하였다. DMS30046으로부터: (i) C-말단 아르기닌 잔기를 제거시켜 DMS30051 (DMS30038-R)을 생성하였고, (ii) C-말단 알라닌을 첨가시켜 DMS30052 (DMS30038+A)를 생성하였고, (iii) 3개의 C-말단 알라닌을 첨가시켜 DMS30053 (DMS30038+AAA)을 생성하였고 C-말단 트레오닌을 첨가시켜 DMS30054 (DMS30038+T)를 생성하였다.
실시예 45 - 변형된 C-말단을 지닌 항- VEGF Vh / Vk dAb - Fc - dAb 분자 (DMS30047-30054)의 발현
관련된 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자 (SEQ ID NO:147-154 및 185-192에 열거됨, 표 19)를 엔코딩하는 발현 플라스미드를 HEK293 6E 세포로 일시적으로 트랜스펙션시키고 500ml 규모로 발현시켜 실시예 10, 21 및 36에 기재된 방법을 이용하여 항체 단편 분자를 생산하였다. 통상적으로 >30mg/L 상청액의 발현 수준이 달성되었다.
실시예 46 - 변형된 C-말단을 지닌 항- VEGF Vh / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 정제
dAb-Fc-dAb 분자를 상기 실시예 37에 기재된 대로 상청액 (실시예 45)으로부터 친화성 정제시켰다.
실시예 47 - 변형된 C-말단을 지닌 항- VEGF Vh / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 크기-배제 크로마토그래피 ( SEC )에 의한 분자 분석
실시예 46에 기재된 대로 정제된 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자의 분자 보전, 균질성 및 % 순도를 실시예 3 & 13에 기재된 대로 SDS-PAGE 및 분석적 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분석하였다. 단백질은 생물학 검정에서의 추가 분석 전에 >95% 순수한 표적 단백질임이 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 확인되었다.
실시예 48 - Biacore 상에서 VEGF에 대한 변형된 C-말단을 지닌 항-VEGF Vh/Vk dAb - Fc - dAb 분자의 결합
VEGF165에 대한 특정 항-VEGF dAb-Fc-dAb 분자 (약간의 C-말단 변형을 지님)의 결합 친화성을 실시예 34 & 40과 유사하나 약간 변형된 방식으로 Biacore T100을 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 C1 칩 상에 고정시킨 다음, 상기 표면을 이용하여 항-VEGF 작제물을 포획하였다. 인간 재조합 VEGF165 (HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션으로부터 '내부' 공급됨)를 4배 연속 희석물에서 32nM 내지 0.03125nM의 분석물로서 이용하였다. 모든 결합 곡선은 완충제 주입 (즉, 0nM)과 이중 참조되었고, 데이터를 T100 고유의 1:1 모델에 핏팅시켰다. 50mM NaOH를 이용하여 재생을 수행하였다. 진행 완충제로서 HBS-EP를 이용하여 37℃에서 진행을 수행하였다. 수득된 데이터는 표 16A, 16B & 16C에 제시된다. 표 16A의 데이터로부터, DMS30037 및 C-말단에서 변형된 여러 변이체: DMS30037+A (DMS30048), DMS30037+AAA (DMS30049), 및 DMS30037+T (DMS30050)의 거동은 Biacore 상에서 유사한 것으로 보이고 C-말단 변형은 부모에 비해 효능이 감소하지 않은 것으로 보인다.
추가 데이터 세트가 표 16B에 제시되며, 여기서 DMS30037 및 DMS30038 둘 모두의 성능을 C-말단에서 변형된 변이체: DMS30037-R (+R (DMS30047)로서 표지됨), DMS30037+T (DMS30050) 및 DMS30038-R (+R (DMS30051)로서 표지됨) 및 베바시주맙 (아바스틴)과 Biacore에서 비교하였다. 이러한 데이터 세트에서, 역시 모든 분자의 거동은 Biacore 상에서 유사한 것으로 보이고, C-말단 변형은 부모에 비해 효능이 감소되지 않은 것으로 보인다. 아바스틴에 대한 곡선을 보여주는 것 외에 의미있는 데이터는 획득될 수 없었다. 추가 데이터 세트는 표 16C에 표시되며, 여기서 분자 DMS30037 및 DMS30038을 C-말단에서 변형된 변이체: DMS30037-R (DMS30047), DMS30037+T (DMS30050), DMS30038-R, (DMS30051) 및 DMS30038+T (DMS30054) 및 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다. 역시 모든 dAb-Fc-dAb 분자의 거동은 Biacore 상에서 유사한 것으로 보이고, C-말단 변형은 부모에 비해 효능이 감소되지 않은 것으로 보인다. 이러한 데이터 세트에서, 표 16C를 참조하면, 베바시주맙 (아바스틴) 데이터는 오프-레이트가 지나치게 엄격하기 때문에 적당하게 측정될 수 없었다.
표 16A: VEGF 165 에 대한 C-말단 변형을 지닌 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자: DMS30037의 결합 및 DMS30037 과의 비교
Figure pct00034
표 16B: VEGF 165 에 대한 C-말단 변형을 지닌 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자: DMS30037 및 DMS30038 의 결합 및 부모 dAb - Fc - dAb 및 베바시주맙(아바스틴)과의 비교
Figure pct00035
표 16C: VEGF 165 에 대한 C-말단 변형을 지닌 항- VEGF dAb - Fc - dAb 분자: DMS30037 및 DMS30038 의 결합 및 부모 dAb - Fc - dAb 및 베바시주맙(아바스틴)과의 비교
Figure pct00036
실시예 49 - 변형된 C-말단을 지닌 항- VEGF Vh / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 VEGF R2 수용체 결합 검정
DMS30037 및 DMS30038에 기반하나 C-말단 변형을 지닌 항-VEGF Vh/Vk dAb-Fc-dAb 분자의 효능을 VEGF 수용체 2 (R2) 결합 검정에서 실시예 7, 17 & 26 & 40에 기재된 변형된 방법, 즉 예비-인큐베이션이 없는 방법을 이용하여 야생형 분자 및 베바시주맙 (아바스틴) 둘 모두와 비교하였다. 데이터는 표 17A에 제시되며, 시험된 모든 dAb-Fc-dAb 분자: DMS30037, DMS30037+T (DMS30050), DMS30037-R (DMS30047), DMS30038, DMS30038-R (DMS30051)는 유사한 효능을 지니고 베바시주맙 (아바스틴)보다 현저하게 더욱 효능이 있는 것으로 보인다, 표 17A. >93-98% 최대 억제를 달성한 모든 분자를 이용한 검정에서 분자에 의한 달성된 최대 억제율에 약간의 가변성이 존재하였다 (데이터는 제시되지 않음).
dAb-Fc-dAb: DMS30038, DMS30038+T (DMS30050) 및 DMS30038-R (DMS30051)을 베바시주맙 (아바스틴)과 비교한 추가 데이터가 동일한 검정 포맷으로 생성되었고, 이를 표 17B에 제시한다. 데이터로부터, DMS30038 및 이의 C-말단 변이체 (표 17B)는 RBA 검정에서 EC50 값에 의해 판단되는 유사한 효능을 지니며, 이러한 기준에 의해 베바시주맙 (아바스틴)보다 현저하게 더욱 효능이 있는 것으로 보인다. >94% 최대 억제를 달성한 모든 분자를 이용한 검정에서 분자에 의한 달성된 최대 억제율에 약간의 가변성이 존재하였다 (데이터는 제시되지 않음).
표 17A: VEGFR2 수용체 결합 검정에서 베바시주맙 ( 아바스틴 )과 비교한 C-말단 변형을 지닌 항- VEGF dAb - Fc - dAb 의 EC 50 값
곡선 핏팅 및 EC50 계산은 GraphPad Prism을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00037
표 17B: VEGFR2 수용체 결합 검정에서 베바시주맙 ( 아바스틴 )과 비교한 C-말단 변형을 지닌 항- VEGF dAb - Fc - dAb 의 EC 50 값
곡선 핏팅 및 EC50 계산은 GraphPad Prism을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00038
실시예 49 - 인간 탯줄 정맥 내피 세포 ( HUVEC ) 증식 검정: C-말단 변형을 함유하는 항- VEGF Vh / Vk dAb - Fc - dAb 분자의 억제
인간 탯줄 정맥 내피 세포의 증식을 억제하는 DMS30037 및 DMS30038에 기반하나 C-말단 변형을 지닌 dAb-Fc-dAb 분자: DMS30037-R (DMS30047) & DMS30037+T (DMS30050), DMS30038-R (DMS30051) & DMS30038+T (DMS30054)의 능력을 다음 변경을 갖는 실시예 8, 18, 27 & 41에 기재된 방법을 이용하여 베바시주맙 (아바스틴)과 비교하였다: (i) 세포가 없는 외부 웰을 남기기보다, 전체 96 웰 플레이트를 이용하였고, (ii) 데이터는 비선형 회귀에 비해 Sigmodial 곡선 핏, 가변적인 기울기를 이용하여 GraphPad Prism을 이용해 분석되었다 (가변적인 기울기). 시험 화합물은 비교측정 분자인 베바시주맙 (아바스틴)에 대해 개별적인 플레이트 상에서 독립적으로 평가되었다; 상기 검정은 베바시주맙 (아바스틴): 15; DMS30037: 7; DMS30038: 8; DMS30037-R (DMS30047): 3; DMS30037+T (DMS30050): 4; DMS30038-R (DMS30051): 4 & DMS30038+T (DMS30054): 4 (데이터는 제시되지 않음)의 분자 당 총 데이터 세트를 이용하여, 적어도 3번의 별도의 경우에 대해 수행되었다. 검정에서 베바시주맙 (아바스틴)에 비해 특정 분자에 의해 생성된 상대 EC50 값 및 최대 억제 정도 둘 모두를 분석하는데 중점을 두었다.
데이터는 비선형 회귀에 비해 Sigmodial 곡선 핏, 가변적인 기울기를 이용하여 GraphPad Prism을 이용해 분석되었다 (가변적인 기울기). 개개의 곡선 핏을 각 분자 및 각각의 날에 핏팅시켰다. 다소의 불충분한 핏팅으로 인해, 플래토가 낮은 농도에서 관찰되지 않은 곡선에 대해 제약을 도입시키기로 결정하였다. 제약에도 불구하고 불충분한 곡선 핏팅으로 인해 한 플레이트가 분석에서 제외되었다. 이러한 제약은 가장 낮은 농도에서의 점수의 평균과 같을 것이다. 데이터는 최소값이 제약되었는지 아닌지에 관해 수동으로 선택되었고, 곡선 핏 및 파라메터는 이러한 기준 선택에 기반하여 자동으로 업데이트되었다. 곡선 최대값 및 표준 오차의 추정치를 가중치로서 1/(표준 오차)2, [SE]2를 이용하여, 분산의 가중 혼합 모델 분석을 이용하여 분석하였다. 분석은 임의 효과 조건을 이용하여 플레이트 및 일간 가변성에 대해 조정되었다. 이러한 분석으로부터, 예측 평균을 추정하였고, 베바시주맙 (아바스틴, 대조군)과 다시 비교하였다 (표 18A를 참조하라). 그 후 동일한 분석을 IC50에 대해 log10 규모로 수행하였고, 그 결과를 다시 변환시켰다. 이로부터, 기하 평균의 추정치가 생성되었고, 베바시주맙 (아바스틴 대조군)에 대한 비율의 형태로 베바시주맙 (아바스틴)과 다시 비교하였으며, 즉, 0.5의 비율은 베바시주맙으로부터 50% 하락을 나타낼 것이다, (아바스틴, 표 18B을 참조하라).
표 18A: HUVEC 검정에서 부모 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과 비교하여 95% 신뢰 구간 ( CI )을 지닌 C-말단 변형된 항- VEGF dAb - Fc - dAb 의 최대 억제율의 예측된 기하 평균
Figure pct00039
이러한 분석으로부터 분자 DMS30037, DMS30037+T 및 DMS30037-R은 HUVEC 검정에서 가장 최대한의 억제를 유도한 것으로 보이며, 이들은 아바스틴 그룹을 능가하며, 신뢰 구간은 기준 영점과 중첩되지 않았으므로, 데이터는 아바스틴으로부터 통계적으로 유의하였다, 데이터는 제시되지 않음 (표 18A).
표 18B: HUVEC 검정에서 부모 및 베바시주맙 ( 아바스틴 )과 비교하여 95% 신뢰 구간 ( CI )을 지닌 C-말단 변형된 항- VEGF dAb - Fc - dAb 에 대한 IC50 의 기하 평균
Figure pct00040
95% 신뢰 구간 (CI)을 지닌 IC50 값의 기하 평균의 유사한 분석은 거의 모든 dAb-Fc-dAb 분자인 DMS30037, DMS30037+T, DMS30038, DMS30038+T 및 DMS30038-R이 베바시주맙 (아반스틴)보다 통계적으로 현저하게 낮은 IC50 값을 지녔음을 나타내었다, 데이터는 도시되지 않음 (표 18B를 참조하라). DMS30037-R로부터의 데이터 세트는 낮은 n 수(3)를 지니며 매우 가변적이었다.
전반적으로 데이터는 HUVEC 검정에서 둘 모두의 dAb-Fc-dAb: DMS30037 & DMS30038에 대한 C-말단 변형이 부모 분자와 매우 유사한 IC50 값 및 최대 억제 수준을 지니고, 최대 억제율 및 낮은 IC50 둘 모두에 관해 베바시주맙 (아바스틴)보다 더욱 효능이 있는 것으로 보임을 제안한다 (표 18A 및 18B를 참조하라).
실시예 50: 뮤린 VEGF 164 에 대한 Vh dAb - Fc ( DMS1529 ) and Vk Fc - dAb (DMS30000)의 교차-반응성
MSD (MesoScale Discovery), 고 결합 96 웰 플레이트 (MSD L11XB-3)를 1 또는 2㎍/mL의 mVEGF164 (R&D 493-MV/CF) (25㎕/웰)로 코팅하고, 밀봉시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, MSD 플레이트를 Tris 세척 완충제를 이용하여 3x300㎕/웰로 세척하고 PBS 중 3% BSA (250㎕/웰)로 차단시키고 진탕(750 RPM)시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. MSD 플레이트를 다시 세척한 후 DMS1529, DMS30000 또는 mVEGF R2 Fc (R&D 443-KD/CF) 표준 곡선 (25㎕/웰)을 첨가하고 진탕(750 RPM)시키면서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 표준을 PBS 중 0.1% BSA를 이용하여 희석시켰다. MSD 플레이트를 다시 세척한 후에 PBS 중 1% BSA에서의 1㎍/mL의 검출 시약 (25㎕/웰, 내부 설포-TAG 표지된 염소 항-인간 IgG, Fc 특이적 - Sigma I2136)을 첨가하고 진탕(750 RPM)시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. MSD Sector Imager 6000에서 전기화학발광을 측정하기 전에, MSD 플레이트를 다시 세척하고 150㎕/웰의 2x Read 완충제 T (MSD R92TC-1)를 첨가하였다. 데이터 분석 및 그래프 플롯팅에 엑셀을 이용하였다.
실시예 데이터 세트를 도 4에 제시하며, 여기서 MSD 신호를 DMS1529, DMS3000 및 마우스 VEGF R2 Fc 대조군 단백질에 대한 항체 농도에 대해 플롯팅한다.
3개 모두의 단백질은 농도 의존적인 방식으로 마우스 VEGF164에 확실하게 결합하는데, 이는 dAb가 마우스 VEGF164와 교차-반응함을 나타낸다.
표 19 : DNA 및 아미노산 서열 ID 표
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표 19 계속: DNA 및 아미노산 서열 ID 표
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Figure pct00107
SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited <120> Antigen Binding Constructs <130> PB64717 <160> 192 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1029 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM15-26-593-Fc dAb-Fc <400> 1 gaggtgcagc tgttggtgtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcttatccga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtttcagag atttcgcctt cgggttctta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatcct 300 cggaagttag actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagcgc tagcacccac 360 acctgccccc cctgccctgc ccccgagctg ctgggcggac ctagcgtgtt cctgttcccc 420 cccaagccta aggacaccct gatgatcagc aggacccccg aagtgacctg cgtggtggtg 480 gatgtgagcc acgaggaccc tgaagtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaagtg 540 cacaacgcca agaccaagcc cagagaggag cagtacaaca gcacctaccg cgtggtgtct 600 gtgctgaccg tgctgcacca ggattggctg aacggcaagg agtacaagtg caaagtgagc 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Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 405 410 415 His Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 420 425 430 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 435 440 445 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr Tyr Pro His Thr 450 455 460 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 465 470 475

Claims (51)

  1. 항체의 단일쇄 Fc 영역에 의해 분리된 2개의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물로서, 각각의 에피토프 결합 도메인이 VEGF에 결합할 수 있는 항원 결합 작제물.
  2. 제 1항에 있어서, 각각의 에피토프 결합 도메인이 도메인 항체 (dAb)인 항원 결합 작제물.
  3. 제 2항에 있어서, 하나의 dAb가 단일쇄 Fc 영역의 N-말단에 부착되고 다른 하나의 dAb가 단일쇄 Fc 영역의 C-말단에 부착되는 항원 결합 작제물.
  4. 제 3항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb가 중쇄 dAb인 항원 결합 작제물.
  5. 제 3항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb가 경쇄 dAb인 항원 결합 작제물.
  6. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb가 경쇄 dAb인 항원 결합 작제물.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 경쇄 dAb가 카파 또는 람다 경쇄 dAb인 항원 결합 작제물.
  8. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 dAb가 독립적으로 선택되고, DOM 15-26-593, DOM 15-26-597, DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 작제물.
  9. 제 2항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 dAb가 독립적으로 선택되고, DOM 15-26-593, DOM 15-26-597, DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 작제물.
  10. 제 2항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 dAb가 DOM 15-26-593, DOM 15-26-597, DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 및 DT02-K-044-255로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 항원 결합 작제물.
  11. 제 3항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb가 DOM 15-26-597 또는 DT02-K-044-085의 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 작제물.
  12. 제 3항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb가 DOM 15-26-597 또는 DT02-K-044-085의 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 작제물.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb가 DOM 15-26-597 또는 DT02-K-044-085인 항원 결합 작제물.
  14. 제 3항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb가 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 작제물.
  15. 제 3항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb가 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 작제물.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb가 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255인 항원 결합 작제물.
  17. 제 16항에 있어서, 단일쇄 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb가 DT02-K-044-085인 항원 결합 작제물.
  18. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 dAb가 독립적으로 선택되고,
    viii) CDR 서열 SEQ ID No. 111, 112 및 113 중 하나 이상;
    ix) CDR 서열 SEQ ID No. 114, 115 및 116 중 하나 이상;
    x) CDR 서열 SEQ ID No. 117, 118 및 119 중 하나 이상;
    xi) CDR 서열 SEQ ID No. 120, 121 및 122 중 하나 이상;
    xii) CDR 서열 SEQ ID No. 123, 124 및 125 중 하나 이상;
    xiii) CDR 서열 SEQ ID No. 126, 127 및 128 중 하나 이상; 또는
    xiv) CDR 서열 SEQ ID No. 129, 130 및 131 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 작제물.
  19. 제 18항에 있어서, 항체의 Fc 영역의 N-말단에 부착된 dAb가 하나 이상의 CDR 서열 SEQ ID No. 114, 115 및 116을 포함하고, 항체의 Fc 영역의 C-말단에 부착된 dAb가 하나 이상의 CDR 서열 SEQ ID No. 117, 118 및 119를 포함하는 항원 결합 작제물.
  20. 항체의 단일쇄 Fc 영역에 부착된 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물로서, 에피토프 결합 도메인이 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 dAb이고, 추가로 에피토프 결합 도메인이 VEGF에 결합할 수 있는 항원 결합 작제물.
  21. 항체의 단일쇄 Fc 영역에 부착된 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물로서, 에피토프 결합 도메인이 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255의 서열과 적어도 97% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 dAb이고, 추가로 에피토프 결합 도메인이 VEGF에 결합할 수 있는 항원 결합 작제물.
  22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, dAb가 DT02-K-044-085, DT02-K-044-251, DT02-K-044-232, DT02-K-044-236 또는 DT02-K-044-255인 항원 결합 작제물.
  23. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, dAb가,
    vi) CDR 서열 SEQ ID No. 117, 118 및 119 중 하나 이상;
    vii) CDR 서열 SEQ ID No. 120, 121 및 122 중 하나 이상;
    viii) CDR 서열 SEQ ID No. 123, 124 및 125 중 하나 이상;
    ix) CDR 서열 SEQ ID No. 126, 127 및 128 중 하나 이상; 또는
    x) CDR 서열 SEQ ID No. 129, 130 및 131 중 하나 이상을 포함하는 항원 결합 작제물.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG4PE; 또는 이의 단편 또는 변이체인 항원 결합 작제물.
  25. 제 24항에 있어서, Fc 영역이 CH1, CH2 및 CH3 불변 영역 항체 도메인 중 하나 이상과, 임의로 힌지 영역 (즉, CH1 및 CH2 사이에)을 포함하는 항원 결합 작제물.
  26. 제 25항에 있어서, Fc 영역이 CH2 및 CH3 불변 영역 항체 도메인을 포함하는 항원 결합 작제물.
  27. 제 24항에 있어서, Fc 영역이 SEQ ID No. 110의 IgG1 서열인 항원 결합 작제물.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 둘 모두의 에피토프 결합 도메인(들)이 링커를 통해 Fc 영역에 부착되는 항원 결합 작제물.
  29. 제 28항에 있어서, 각각의 링커가 독립적으로 선택되고, 1 내지 150개의 아미노산을 포함하는 항원 결합 작제물.
  30. 제 29항에 있어서, 각각의 링커가 독립적으로 선택되고, 7개 초과의 아미노산을 포함하는 항원 결합 작제물.
  31. 제 28항에 있어서, 각각의 링커가 IgG1 힌지, AS, 피브로넥틴 x 3, 피브로넥틴 x 4, 및 나선형 링커로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 항원 결합 작제물.
  32. 제 31항에 있어서, 링커가 IgG1 힌지, AS 또는 Fib-3이고, 이를 통해 에피토프 결합 도메인이 Fc 영역의 N-말단에 부착되는 항원 결합 작제물.
  33. 제 32항에 있어서, 링커가 IgG1 힌지 또는 AS이고, 이를 통해 에피토프 결합 도메인이 Fc 영역의 N-말단에 부착되는 항원 결합 작제물.
  34. 제 31항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 링커가 Fib-4 또는 나선형 링커이고, 이를 통해 에피토프 결합 도메인이 Fc 영역의 C-말단에 부착되는 항원 결합 작제물.
  35. 제 34항에 있어서, 링커가 Fib-4이고, 이를 통해 에피토프 결합 도메인이 Fc 영역의 C-말단에 부착되는 항원 결합 작제물.
  36. 제 1항에 있어서,
    (a) DOM 15-26-597 - AS - Fc (SEQ ID No. 110) - 피브로넥틴 x 4 - DT02-K-044-085; 또는
    (b) DOM 15-26-597 - IgG1 힌지 - Fc (SEQ ID No. 110) - 피브로넥틴 x 4 - DT02-K-044-085; 또는
    h) (c) 전체 서열에 걸쳐 적어도 97%의 아미노산 동일성을 지니는 (a) 또는 (b)의 변이체; 또는
    i) (d) 각각의 dAb 서열이 특수한 dAb의 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 지니는 (a) 또는 (b)의 변이체인 항원 결합 작제물.
  37. 제 2항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 dAb가,
    a) 서열 VTVS(S)nX [VH dAb의 경우] 또는 VEIKpRqX [VL dAb의 경우]로 구성된 C-말단 서열; 및 또한 임의로,
    b) 인간 생식세포 프레임워크 서열에 비해 위치 14, 41, 108, 110, 또는 112에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항원 결합 작제물:
    상기 식에서,
    n은 0 또는 1에서 독립적으로 선택된 정수이고;
    p 및 q는, p가 1일 때, q가 0 또는 1일 수 있게 하고, p가 0일 때, q도 0이 되도록 하는, 각각 0 또는 1이며;
    X는 존재하거나 부재할 수 있고, 존재하는 경우, 1 내지 8개 아미노산 잔기의 아미노산 연장을 나타내며;
    X가 부재하는 경우가 추가 조건부이다.
  38. 제 37항에 있어서, VL dAb의 경우, C-말단 서열이 VEIKpRqX이고, p가 1이고, q가 0이고, X가 부재하는 항원 결합 작제물.
  39. 제 37항에 있어서, VL dAb의 경우, C-말단 서열이 VEIKpRqX이고, p가 1이고, q가 1이고, X가 A, AAA 또는 T인 항원 결합 작제물.
  40. 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 따른 2개의 항원 결합 작제물을 포함하는 이합체.
  41. 제 40항에 있어서, 이합체가 이종이합체 또는 동종이합체인 이합체.
  42. 제 40항 또는 제 41항에 따른 이합체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체(들)를 포함하는 약학적 조성물.
  43. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 약제에 사용하기 위한 이합체.
  44. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, VEGF 신호전달과 관련된 질환, 예컨대 암 및/또는 안질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종(DME), 습식 노인성 황반 변성(Wet AMD), 당뇨 망막병증, 망막 정맥 폐쇄(RVO), 및 각막 신혈관형성을 치료하는데 사용하기 위한 이합체.
  45. VEGF 신호전달과 관련된 질환, 예컨대 암 및/또는 안질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종(DME), 습식 노인성 황반 변성(Wet AMD), 당뇨 망막병증, 망막 정맥 폐쇄(RVO), 및 각막 신혈관형성을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제 40항 또는 제 41항에 따른 이합체의 용도.
  46. 치료량의 제 40항 또는 제 41항에 따른 이합체를 투여하는 것을 포함하는, VEGF 신호전달과 관련된 질환, 예컨대 암 및 안질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종(DME), 습식 노인성 황반 변성(Wet AMD), 당뇨 망막병증, 망막 정맥 폐쇄(RVO), 및 각막 신혈관형성에 걸린 환자를 치료하는 방법.
  47. 인간 환자의 치료 또는 예방에서 제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 이합체.
  48. 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 작제물을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열.
  49. 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 작제물을 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포.
  50. 제 39항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항원 결합 작제물을 분리시키는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 작제물을 생산하는 방법.
  51. 제 50항의 방법에 의해 생산된 항원 결합 작제물.
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