KR20140096104A - 분석물 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은,
(a) 샘플을 펩타이드 핵산 (PNA) 프로브와 접촉하는 단계;
(b) 상기 샘플에 대해 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS) 측정을 수행하는 단계;
(c) 상기 EIS 측정으로 분석물의 존재, 부재, 양 및/또는 실체를 결정하는 단계를 포함하며,
상기 분석물이 핵산을 포함하며;
상기 샘플을 취했을 때 샘플내 분석물의 양이, 상기 샘플에 대해 EIS 측정을 수행했을 때 샘플내 분석물의 양과 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는, 샘플에서 분석물을 검출하는 방법을 제공한다.
(a) 샘플을 펩타이드 핵산 (PNA) 프로브와 접촉하는 단계;
(b) 상기 샘플에 대해 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS) 측정을 수행하는 단계;
(c) 상기 EIS 측정으로 분석물의 존재, 부재, 양 및/또는 실체를 결정하는 단계를 포함하며,
상기 분석물이 핵산을 포함하며;
상기 샘플을 취했을 때 샘플내 분석물의 양이, 상기 샘플에 대해 EIS 측정을 수행했을 때 샘플내 분석물의 양과 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는, 샘플에서 분석물을 검출하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 핵산 분석물에 대한 데이타를 수득하기 위한 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS: electrochemical impedance spectroscopy) 기법을 이용한 분석물 검출 방법에 관한 것이다. 본 방법은 핵산 분석물을 증폭시키지 않고도 수행할 수 있어 유용하다. 이로 인해 공정이 단순화되어, 공지된 분석 방법들 보다 속도를 높일 수 있으며, 그에 따라 결과 수득 시간 (TTR: time to result)을 개선시키고 환자 근접 상황에서의 이러한 분석법의 개발을 용이하게 할 수 있다. 본 방법은 상처, 특히 감염성 상처에서 병원체를 분석하는데 특히 유익하다.
분석물 검출 방법들은 생화학 분석 분야에서 널리 알려져 있다. 전통적인 방법에서는, 분석물을 동정하기 위해, 분석물을 통상적으로 예를 들어 형광 검출에 의해 검출할 수 있는 형광 표지로 표지한다.
과거 수년간 DNA 검출 분야에서는, 나노입자가 표지물로서 사용되고 있다. 이들 표지물은 표지가능하며 결합을 수반하는 임의 시스템에서 잠재적으로 사용가능할 것이므로, 살아있는 세포 시스템 뿐만 아니라 단백질 및 핵산에서 유용할 수 있다. 나노입자는 비용, 사용 용이성, 민감성 및 선택성 등의, 전통적인 다수 형광 표지물들이 가지는 여러가지 한계들을 해결하는 것으로 확인되고 있다 (Fritzsche W, Taton T A, Nanotechnology 14 (2003) R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection"). 나노입자는 광학 검출, 전기적 검출, 전기화학적 검출 및 중량 측정에 의한 검출을 비롯한 여러가지 다수의 DNA 검출 방법들에 사용되고 있다 (Fritzsche W, Taton T A, Nanotechnology 14 (2003) R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection"). 콜로이드형 금 테그 (tag)의 전기화학적 스트립핑 검출 (electrochemical stripping detection)에 기초한 DNA 혼성화 검출에서 금 나노입자의 사용은 성공을 거두었다 (Wang J, Xu D, Kawde A, Poslky R, Analytical Chemistry (2001), 73, 5576-5581 "Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA hybridization"). 양자점 (quantum dot)으로도 지칭되는 반도체 나노결정과, 금 나노입자의 사용 역시 DNA 혼성화 실험에서 형광 표지물로서 성공적으로 사용되고 있다 (West J, Halas N, Annual Review of Biomedical Engineering, 2003, 5: 285-292 "Engineered Nanomaterials for Biophotonics Applications: Improving Sensing, Imaging and Therapeutics").
DNA 검출 방법에서 기존의 형광 표지물 대신 나노입자를 사용함으로써 확인되는 이점에도 불구하고, 여전히 검출 방법의 민감성, 선택성, 특히 속도에 개선이 요구되고 있다. 각 검출 방법이 어느 정도의 민감성과 선택성을 가지고 있지만, 그 각각이 여러가지 한계들을 가지고 있으며, 다양한 부정확성을 발생시키며, 그 각각은, 특히 결과를 수득하는데 소요되는 시간이 짧아야 하는 (예, 약 10분) 환자 근접 상황에서의 검사시, 원하는 만큼 신속하지 않다.
이러한 방법들 외에도, 나노입자 표지화는 DNA 검출에서 전기영동과 조합되어 사용된다 (WO 2009/112537 참조). 전기영동은 DNA가 전극 표면 상의 상보성 프로브에 결합하는 속도를 높이기 위해 사용된다. 이 방법은, 공지된 분석 방법에 비해 우수한 속도 및 민감성을 나타낼 수 있어, 유익하다.
이 외에도, 특히 환자 근접 상황에서 저렴하고 단순한 DNA 검출 방법들에 대한 요구가 증가하고 있다. 비용을 절감하고, 방법을 단순화하고, 검출 속도를 개선시키기 위해, 표지화를 하지 않는 방법들이 알려지게 되었다. 표지물을 사용하지 않는 검출 방법이 이런 이점을 가질 순 있지만, 표지물이 제공하는 검출의 융통성과 민감성에 도달하는 것이 과제이다.
과거, 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS) 기법들은 표지물을 사용하거나 또는 사용하지 않고도 분석물에 대한 데이타를 수득하기 위한 방법으로 고려되었다. 아래 참조문헌들은 자세한 백그라운드를 제공한다;
바이오센싱에 EIS의 적용에 대한 리뷰 - Daniels, J.S., Pourmanda, N., "Label-Free Impedance Biosensors: Opportunities and Challenges", Electroanalysis, 19, 2007, 1239 - 1257.
바이오센싱에 EIS의 적용에 대한 리뷰 - Katz, E., Willner, I., "Probing Biomolecular Interactions at Conductive and Semiconductive Surfaces by Impedance Spectroscopy: Routes to Impedimetric Immunosensors, DNA-Sensors, and Enzyme Biosensors", Electroanalysis 15, 2003, 913-947.
KCl 용액 중에서 다양한 크기의 나노스케일 전극의 임피던스 스펙트럼 특정화 - Laureyn, W., Van Gerwen, P., Suls, J., Jacobs, P., Maes, G., Electroanalysis, 13, 2001, 204-211.
효소 활성을 검출하기 위한 AC 임피던스 및 스펙트로스코피 - Laureyn, W., Van Gerwen, P., Suls, J., Jacobs, P., Maes, G., Electroanalysis, 13, 2001, 204-211.
AC 임피던스와 IDE의 통합 시스템 - Zou, Z., Kai, J., Rust, M.J., Han, J., Ahn, C.H., "Functionalized nano interdigitated electrodes arrays on polymer with integrated microfluidics for direct bio-affinity sensing using impedimetric measurement." Sens. Acts. A, 136, 2007, 518-526.
"In situ hybridization of PNA/DNA studied label-free by electrochemical impedance spectroscopy", J Liu, S. Tian, P. Nielsen, W. Knoll, Chem. Commun., 2005, 2969-2971.
이로부터, AC 임피던스 측정법 (종종 전기화학적 임피던스 분광법 또는 EIS로도 지칭됨)에서는, 전형적으로, 2개의 전극 간에 사이누스형 (sinusoidal small amplitude)의 작은 진폭 (~10 mV)을 가진 AC 전압 섭동을 적용하고 이들 전극 사이에 형성된 전류를 AC 주파수의 함수로서 측정하며, 이로부터 주파수의 함수로서 임피던스를 계산할 수 있음을 알 수 있다. 이러한 임피던스 스펙트럼의 변화는, 특히 교차 미세전극 (IMF) 또는 교차 나노전극 (INE)과 같은 교차 전극 (IDE)을 이용하는 경우에, 전극 상의 특정 표면 막에 프로브-타겟 결합에 대해 감응성 표지를 사용하지 않는 측정 방법을 제공하는 것으로 확인되었다. 그러나, 이런 측정법은, 층에 결합된 타겟의 양을 측정하기 때문에, 통상적으로, 전극 또는 전극에 부착된 프로브에 대한 분석물의 결합 평형화에 의존한다. 따라서, EIS 반응은 평형 열역학 (equilibrium thermodynamics)을 따를 것이다. 이 과정에는, 장기간, 종종 수시간 동안, 때로는 측정하기 전에 완전한 프로브-타겟 조합을 보장하기 위해, 승온된 온도에서의 평형화가 요구된다. 이는 결과 수득 시간 (time to result: TTR) 단축을 어렵게 한다.
아울러, IDE의 임피던스 반응은 이론적으로 고려되어 왔으며, 분석은 전형적으로 적절한 전기적 등가 회로 (equivalent circuit)를 이용하여 수행되며, 광범위한 주파수 전 범위에서 반응에 피팅함으로써, 전기화학적 반응의 변화를 표시하는 특징적인 물리적 파라미터들 (예, 확산 계수, 농도, 층 두께)을 추출할 수 있는, 등가 전기 회로 요소들 (레지스터, 커패시터, 바르부르크 요소 (Warburg element) 등)에 대한 파라미터들을 제공해준다. 아울러, 통상적으로 각 주파수에서 순차적인 측정이 이루어진다. 이러한 요소들은 동시에 분석 및 측정 시간을 연장시키기 때문에, 상기에서 언급한 상대적으로 긴 결과 수득 시간을 연장시킨다.
따라서, 공지된 EIS 방법, 특히 표지물 무사용 방법은 전형적으로 느리며, 본 발명에서 요구되는 환자 인접 환경 조건에서 사용하는데 만족스러운 결과 수득 시간을 제공해 주지 않는다. US 2010/0133118은 EIS를 이용한 핵산 검출에서 핵산 프로브의 사용을 개시하고 있다. PNA 프로브가 바람직하지만, DNA 프로브도 사용할 수 있다. 샘플 증폭을 수행하지 않으며, 대신 신호를 샘플내 분석물의 농도에 의해 부스팅한다. 이 기법은 검출 민감도에는 도움이 되지만, 농축 단계가 일반적으로 길고 복잡한 화학적 방법들이 추가로 수반되므로, 이는 증폭 단계와 동일한 문제점을 가진다는 것을 의미한다. 특히, 이는 결과 수득 시간이 매우 중요한 환자 근접 환경에서의 분석에는 적합하지 않다.
WO 2009/122159는 특히 핵산을 검출하는 바이오센서를 개시한다. 여기서는 전형적으로 mRNA 및 cDNA를 검출하기 위해 PNA 프로브를 사용한다. 하지만, 이 방법 역시 EIS를 이용하여 분석하기 전에 증폭 단계를 수반한다. 따라서, 본원에 기술된 다른 공지 방법들과 동일한 문제점을 가진다.
지금까지 본원에 언급된 기존 방법들 모두, 민감성이 높은 EIS와 표지물 무사용 검출을 채택한 경우에도, 검출하기 전에 샘플에서 (농축 또는 증폭에 의해) 핵산의 양을 증가시켜야 한다. 그러나, 시사된 바와 같이, 증폭 기법 등은 상당한 시간과 별도의 화학적 및 물리적 자원 (반응 물질, 반응 단계, 장치 등)을 필요로 한다. 따라서, 핵산 검출은 속도와 민감도가 중요할 경우에 특히 문제가 된다.
본 발명의 과제는 전술한 종래 기술 분야에서의 문제점들을 극복하는 것이다. 특히, 본 발명의 과제는, 속도와 결과 수득 시간을 개선시키며 수행하기 저렴하고 단순하며, 민감성과 선택성이 양호한 핵산 분석물의 검출 방법을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명은,
(a) 샘플을 펩타이드 핵산 (PNA) 프로브와 접촉하는 단계;
(b) 상기 샘플에 대해 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS) 측정을 수행하는 단계;
(c) 상기 EIS 측정으로 분석물의 존재, 부재, 양 및/또는 실체를 결정하는 단계를 포함하며,
상기 분석물은 핵산을 포함하며, 상기 샘플을 취했을 때 샘플내 분석물의 양 또는 농도가 샘플을 EIS 측정으로 수행하였을 때의 샘플내 분석물의 양 및/또는 농도와 실질적으로 동일한, 샘플에서 분석물을 검출하는 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, "샘플을 취했을 때 샘플내 분석물의 양 또는 농도가 샘플을 EIS 측정으로 수행하였을 때의 샘플내 분석물의 양 및/또는 농도와 실질적으로 동일한"은, 간단하게, 핵산 증폭 단계를 수행하지 않는다는 것을 의미할 수 있다. 이에, 본 발명은, 하기 단계를 포함하며, 분석물이 핵산을 포함하며, 샘플에 대해 EIS 측정을 수행하기 전에 핵산 증폭 단계를 수행하지 않는, 샘플에서 분석물을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 샘플을 펩타이드 핵산 (PNA) 프로브와 접촉하는 단계;
(b) 상기 샘플에 대해 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS) 측정을 수행하는 단계;
(c) 상기 EIS 측정으로 분석물의 존재, 부재, 양 및/또는 실체를 결정하는 단계.
다른 구현예에서, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 핵산을 포함하는 분석물의 검출 방법을 제공한다:
(a) 샘플에 대해, 핵산을 단편화하기 위한 샘플 준비 공정을 수행하는 단계;
(b) 상기 샘플을 펩타이드 핵산 (PNA) 프로브와 접촉하는 단계;
(c) 상기 샘플에 대해 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS) 측정을 수행하는 단계;
(d) 상기 EIS 측정으로 분석물의 존재, 부재, 양 및/또는 실체를 결정하는 단계.
전형적으로, 샘플 준비 공정은 핵산을 단편화하기 위한 열처리, 초음파처리 또는 샘플에 제한효소를 사용하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 열처리 또는 초음파처리를 이용하여, 제한효소를 사용하는 시간, 비용 및 별도의 시약 사용을 방지한다. 바람직한 구현예에서, 열처리 또는 그 외 방법에 의한 샘플 준비는, 수득되는 핵산 서열의 평균 길이 또는 최소 길이가 1000 bp 이하 (bp = 염기쌍), 900 bp 이하, 800 bp 이하, 700 bp 이하, 600 bp 이하, 500 bp 이하, 20 bp 이상, 30 bp 이상, 40 bp 이상, 50 bp 이상 60 bp 이상 70 bp 이상, 80 bp 이상, 90 bp 이상, 100 bp 이상, 110 bp 이상, 120 bp 이상, 130 bp 이상, 140 bp 이상 또는 150 bp 이상, 20-1000 bp, 30-900 bp, 40-800 bp, 50-700 bp, 60-600 bp, 70-600 bp, 80-600 bp, 90-600 bp, 100-600 bp, 100-500 bp, 100-400 bp, 100-300 bp, 110-200 bp, 및 약 120 bp이도록, 핵산을 단편화한다. 본 구현예에서, 전형적으로, 샘플을 취했을 때의 샘플내 분석물의 양 또는 농도는 샘플에 대해 EIS 측정을 수행하였을 때의 샘플내 분석물의 양 또는 농도와 실질적으로 동일하다. 이는, 전형적으로, 핵산 증폭 단계가 수행되지 않는다는 것을 의미한다.
본 발명의 이러한 측면에서, 샘플 준비 공정에서 수행되는 프로세스는 특별히 한정되지 않으나, 단, 핵산을 단편화한다. 전형적으로, 이는 핵산의 평균 길이 또는 최소 길이를 전술한 바람직한 범위내에 있도록 만든다. 전형적으로, 그러나, 비제한적으로, 프로세스는 핵산의 단편화를 유발하기 위한 열처리 단계이다. 이는, 특히, 게놈 DNA (gDNA) 또는 리보좀 RNA (rRNA)와 같은 거대 핵산을 포함하는 경우에 바람직하다. 전형적으로, 이러한 거대 핵산의 열처리는 1000 bp 이하의 서열로 만드는 단편화를 유발한다. 정상 PCR은 전형적으로 핵산을 변성 (복제가 가능하게 하기 위해 이중 가닥 핵산을 단일 가닥 핵산으로 변환)시키기 위한 열처리 단계를 수반하지만, DNA 샘플의 분해를 방지하기 위해 단편화는 피할려고 한다. 이는, 논문 "Effect of heat denaturation of target DNA on the PCR amplification", Gene., 1993, 123(2), pp 241-4에서 확인되었으며, 여기서 Gustafson 등은,
PCR 반응을 시작하기 전에 종종 적용되는, pH 7.0-8.0에서 주형 DNA의 1-7분의 긴 변성 시간이, 주형에 상당한 분해를 발생시킨다는 것을 확인하였다. 이는, 500 bp 보다 긴 PCR 산물들의 수율을 최대 99%까지 상당히 감소시킬 수 있다. 이러한 생산 산물의 감소는 증폭 전 변성 (PAD)의 결과로서 주형 또는 타겟 DNA의 분해 증가가 원인인 것으로 보인다. 이에, 큰 조각의 DNA를 증폭시킬 때, 주형 용액의 출발 pH와는 무관하게, 주형 DNA를 PCR 반응 전에 PAD에 노출시키지 말 것을 권고한다.
따라서, 게놈 DNA 등과 같은 큰 핵산을 다루는 경우, 단편화를 유발할 수 있는 처리 (예, 열 처리)는 매우 유해하므로 금지되어 왔다. 그러나, 본 발명자들은, 본 발명의 방법에서 단편화가 바람직하다는 것을 놀랍게도 확인하게 되었으며, 본 발명자들은, 단편화가, 분석 결과에 부정적으로 간섭하는 대신, EIS 신호를 향상시킬 수 있으며, 따라서 아울러 PCR에 의해서와 같이 분석물의 증폭 필요성을 생략하는데 유용할 수 있다는 것을 확인하였다.
열처리 시간과 적용되는 온도는 조사 대상인 샘플의 특성에 의해 결정될 것이며, 또한 주변 매질의 화학적 특성 (pH, 완충액의 존재, 염, 촉매 등)에도 의존할 것이다. 이는, 적절한 단편화가 달성되는 한, 특별히 한정되지 않는다. 전형적으로, 10초 - 1시간의 시간이 사용되며, 바람직하게는 30초 - 30분, 1분 - 20분, 2분 - 15분 및 3분 - 10분이 사용된다. 전형적으로 약 5분이 바람직하다. 온도는, 전형적으로, 60-100℃, 70-99℃, 80-99℃, 90-99℃ 및 전형적으로 약 95℃일 것이다.
도 20에서, 게놈 DNA를 5분간 95℃에서 2x SSC 중에서 변성시키면 DNA 단편화와 임피던스 신호 증가가 동시에 이루어짐을 볼 수 있다. DNA 단편화의 역할은 혼성화 시간을 길게 하여 유리 마이크로어레이에서 조사된 바는 있지만, 게놈 DNA 결합에 대한 임피던스 검출에서는 조사된 바 없다. 상기에서 강조한 바와 같이, 95℃와 같은 높은 온도에서 DNA를 인큐베이션하면 긴 DNA 가닥이 단편화되어 PCR 효율이 떨어지는 것으로 공지되어 있다. 열에 의한 DNA 단편화는 가닥을 800 bp 미만 길이로 만드는 것으로 확인되었다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, EIS 신호가 DNA를 95℃에서 5분간 인큐베이션한 이후에 최대라는 관찰 사실에 대한 가장 가능성있는 설명은, 좀더 짧은 단편들이 전극 표면에 매우 인접하게 위치한 프로브 서열에 대해 접근성과 결합성이 좋을 수 있다는 것이다. EIS 기반의 핵산 혼성화를 감지하기 위해서는, 단편 크기와 신호 증가 간의 균형이 존재할 것이다. 단편이 길수록, 용액내에서 레독스 프로브에 대한 이의 정전기학적 영향이 증가되고, 감지층을 통한 턴널링 전류의 차단이 커지게 되므로, 보다 큰폭의 신호 증가를 유도하여야 하지만; 긴 단편의 혼성화 효율은 전극 표면에서의 입체 장애 효과와 이차 구조 형성 가능성으로 인해 감소될 것이다. 본원에 제시된 예들에서, 타겟 단편화 시간 데이타에 따르면, 프로브 길이, 단편 길이 및 EIS 신호 간에 상관성이 존재하는 것으로 보인다. 단편화 데이타는 길이가 약 120 bp인 타겟 가닥이 EIS 신호의 증가를 야기하며, 따라서 증폭없이도 핵산 검출력에 도움이 될 수 있음을 시사한다. 이와는 반대로, EIS 기반의 핵산 검출에 대한 다수의 문헌들은 짧은 (20 bp) 인공 올리고뉴클레오티드를 이용하여 수득한 결과들을 발표하고 있다.
본 발명의 문맥에서, 샘플은, 일부 구현예들에서, 전형적으로, 분석물을 농축하기 위한 방식으로 복수의 샘플들을 증폭 또는 조합하는 것을 하지 않거나, 또는 예를 들어 액체 매질을 제거함으로써 샘플을 농축하는 것을 하지 않으므로써와 같이, 샘플내 분석물의 양 또는 농도를 증가시키지 않으면서, EIS를 수행한다. 즉, 샘플을 취할 때의 샘플내 분석물의 양 및/또는 농도가, 샘플로 EIS 단계를 수행할 때의 샘플내 분석물의 양 및/또는 농도와 실질적으로 동일하다. 이 경우, 양 또는 농도가 절대적으로 동일할 필요는 없으며, 실제, 표준 샘플 준비 기법들이 때때로 양 또는 농도를 소폭 변화시킬 수 있기 때문에, 항상 가능한 것은 아니다. 따라서, 실질적으로 동일하다는 것은, 핵산 분석용 표준 샘플 준비 기법에서 허용되는 가능한 정도로 동일한 것을 의미한다. 이러한 표준 샘플 준비 기법들은 세포 용혈 단계, 샘플 세척 단계 등을 포함할 수 있다. 또한, 농도 또는 증폭을 유도하지 않는 한, (예, 분석을 방해할 수 있는 종들이 샘플에서 제거된다면) 어떤 정제도 가능할 수 있다. 일부 구현예들에서, 샘플은 샘플 준비를 거의 또는 전혀하지 않은 미가공 형태 (crude form)로 PNA 프로브에 도입될 수 있다.
이에, 일부 구현예들에서, 본 발명은 EIS 측정 전에 증폭 단계와 농축 단계를 사용하지 않는다. 따라서, 이들 구현예들에서, 종래 방법들과는 달리, PCR 단계 또는 RTPCR 단계를 사용하지 않는다.
분석물은, 이것이 핵산인 한, 특별히 한정되지 않는다. 모든 핵산을 분석할 수 있지만, 전형적인 구현예로, 핵산 분석물은, 리보좀 RNA 및/또는 게놈 DNA (rRNA 및 gDNA) 등의 거대 핵산을 포함한다. 분석물이 강력한 EIS 신호를 제공하는 타입인 것이 특히 바람직하다. 따라서, 일부 구현예들에서, 분석 핵산은 1000 bases (1 kb) 이상, 더 바람직하게는 10 kb 이상, 100 kb 이상, 1 Mb 이상 및 5 Mb 이상을 포함한다. 언급된 바와 같이, 전형적으로, 게놈 DNA는 프로세스를 돕기 위해, 단편화되거나 또는 작은 섹션으로 절단될 수 있으며; 이로써 gDNA 분석물은 크기가 1 Mb 이상, 2 Mb 이상, 3 Mb 이상, 4 Mb 이상, 또는 5 Mb 이상일 수 있다. 일부 구현예들에서, 리보좀 RNA는, 카피들이 다수개로 존재하여 보다 우수한 EIS 신호를 제공할 것이므로, 게놈 DNA에 비해 크기가 더 작을 수 있다. 전형적으로, rRNA 분석물은 1.0 kb 이상, 1.1 kb 이상, 1.2 kb 이상, 1.3 kb 이상, 1.4 kb 이상 및 1.5 kb 이상일 수 있다. 다른 예로, rRNA 분석물은 1.6 kb 이상, 1.7 kb 이상, 1.8 kb 이상, 1.9 kb 이상, 2.0 kb 이상 또는 2.5 kb 이상일 수 있다. 또 다른 예로, rRNA 분석물은 3.0 kb 이상, 3.5 kb 이상, 4.0 kb 이상, 또는 4.5 kb 이상일 수 있다. 언급된 바와 같이, 본 샘플은, 핵산 서열의 평균 길이가 20 bp 이상, 30 bp 이상, 40 bp 이상, 50 bp 이상 60 bp 이상 70 bp 이상, 80 bp 이상, 90 bp 이상, 100 bp 이상, 110 bp 이상, 120 bp 이상, 130 bp 이상, 140 bp 이상 또는 150 bp 이상이도록 처리되는 것이 또한 바람직하다. 전형적으로, 처리 후, 핵산 서열의 평균 길이는 1000 bp 이하, 900 bp 이하, 800 bp 이하, 700 bp 이하, 600 bp 이하 또는 500 bp 이하일 것이며, 바람직한 길이는 30-1000 bp, 40-900 bp, 50-800 bp, 55-600 bp, 60-500 bp, 70-400 bp, 80-300 bp, 90-200 bp, 90-180 bp, 90-150 bp, 100-140 bp, 110-130 bp, 및 약 120 bp이다.
PNA 프로브는, 대상 분석물을 검출하는데 적합한 한, 특별히 한정되지 않는다. PNA 프로브는, EIS에 의한 검출 시 민감도를 개선시킬 수 있는 역량 때문에 바람직할 수 있다 (도 9 및 도 10 참조). 적합한 PNA 프로브는 타겟 분석물에 결합하는 것으로 선택된다.
전형적으로, 그러나 비제한적으로, PNA 프로브는 스페이서를 추가로 포함하며, 프로브는 스페이서 영역과 PNA 영역을 포함한다. 스페이서 영역은 전극 표면으로부터 프로브의 PNA 영역이 떨어져 있게 하기 위해, 전극 표면에 선호적으로 부착되게 의도된다. 이는 PNA 프로브의 혼성화 효율을 향상시킬 수 있다.
스페이서의 특성은, 이것이 PNA의 혼성화 효율을 부정적으로 간섭하지 않는 한, 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 일부 구현예들에서, 스페이서는 다음과 같은 기를 하나 이상 포함하는 유기 분자를 포함할 수 있다: 표면에 부착할 수 있는 말단 기 - 바람직하게는 말단 아민 기 (1차, 2차 또는 3차 아민 기일 수 있음), 말단 하이드록시 기 또는 말단 티올 기; 알칸 기; 알켄 기; 알킨 기; 에테르 기; 및/또는 카르보닐 기. 스페이서 기의 골격의 원자 수 (원자는 전극과 PNA 부분 사이에 직접 놓여짐)는 혼성화 효율을 개선시키기 위한 충분한 스페이스가 제공되는 한, 특별히 한정되지 않는다. 전형적인 구현예에서, 골격에는 3개 이상의 원자, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상 또는 12개 이상이 존재할 수 있다. 보다 전형적으로, 골격에 5-30개의 원자, 6-25개의 원자, 7-24개의 원자 또는 8-23개의 원자가 존재할 수 있다. 보다 전형적으로, 골격의 원자 수는 9-23, 10-23, 3-18, 5-15, 5-13 및 5-10개의 원자 수 일 수 있다.
바람직한 스페이서의 예로는 하기 식의 화합물을 포함한다:
상기에서, T는 표면에 부착할 수 있는 말단 기이고; R1, R2, R3 R4, R5 및 R6는 각각 독립적으로 유기 기들이고; w는 0 또는 1의 정수이고; x는 0-15의 정수이고; y는 0-15의 정수이고; z는 0 또는 1의 정수이고; n은 0-10의 정수이고; m은 0-15의 정수이고; [n.m+w+x+y+z]는 3 이상의 정수이다. 상기 식에서, 스페이서 골격의 원자 수는 w, x, y, z, n 및 m에 의해 결정되며, 간략하게는 [n.m+w+x+y+z]이다.
T는, 프로브의 스페이서 영역을 전극 표면 등의 표면에 부착시킬 수 있는 기인 한, 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 전형적으로 T는 -NH2, -NHR7, -NR7R8, -SH, -SR9, -OH, -OR10으로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 스페이서는 상기 식에서 x가 0인 하기 식을 가질 수 있다:
상기 식에서, 모든 변수들은 이미 앞에서 정의한 바와 동일한 의미를 가진다.
전형적으로, 스페이서는 하기 식들 중 어느 하나의 화합물일 수 있다:
상기 식들에서, 모든 변수들은 이미 앞에서 정의한 바와 동일한 의미를 가지며, R7, R8, R9 및 R10은 각각 독립적으로 유기 기이다.
언급한 바와 같이, R1, R2, R3, R4, R5, R6 R7, R8, R9 및 R10은 각각 독립적으로 유기 기이다. 본 발명과 관련하여 언급된 모든 구현예들에서, 상기 및 하기에서, 유기 기들은 특별히 한정되지 않으며, 임의의 관능성 기 또는 임의의 원자, 특히 H 원자를 비롯하여 유기 화학에서 일반적인 임의의 관능기 또는 원자일 수 있다. 즉, 유기 기는 하기 의미들 중 임의의 의미를 가질 수 있다. 유기 기는 주기율표에서 IIIA, IVA, VA, VIA 또는 VIIA 족의 임의의 그룹의 한가지 이상의 원자, 예컨대 B, Si, N, P, O 또는 S 원자 (예, OH, OR, NH2, NHR, NR2, SH, SR, SO3H, PO4H2 등) 또는 할로겐 원자 (예, F, Cl, Br 또는 I)를 포함할 수 있으며, 여기서 R은 저급 탄화수소 (1-6개의 C 원자) 또는 고급 탄화수소 (7개 이상의 C 원자, 예컨대 7-40개의 C 원자)이다.
유기 기는, 바람직하게는, 탄화수소 기를 포함한다. 탄화수소 기는 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 기를 포함할 수 있다. 독립적으로, 탄화수소 기는 지방족 또는 방향족 기를 포함할 수 있다. 또한, 독립적으로 탄화수소 기는 포화 또는 불포화된 기를 포함할 수 있다.
탄화수소가 불포화 기를 포함하는 경우, 이는 하나 이상의 알켄 관능기 및/또는 하나 이상의 알킨 관능기를 포함할 수 있다. 탄화수소가 직쇄 또는 분지쇄 기를 포함하는 경우, 이는 하나 이상의 1차, 2차 및/또는 3차 알킬 기를 포함할 수 있다. 탄화수소가 사이클릭 기를 포함하는 경우, 이는 방향족 고리, 지방족 고리, 헤테로사이클릭 기 및/또는 이들 기들의 융합된 고리 유도체를 포함할 수 있다. 사이클릭 기는 따라서 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 인덴, 플루오렌, 피리딘, 퀴놀린, 티오펜, 벤조티오펜, 푸란, 벤조푸란, 피롤, 인돌, 이미다졸, 티아졸, 및/또는옥사졸 기 뿐만 아니라 상기 기들의 위치이성질체를 포함할 수 있다.
탄화수소 기에서 탄소 원자의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 탄화수소 기는 1-40개의 C 원자를 포함한다. 탄화수소 기는 따라서 저급 탄화수소 (1-6개의 C 원자) 또는 고급 탄화수소 (7개 이상의 C 원자, 예컨대 7-40개의 C 원자)일 수 있다. 저급 탄화수소는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실 기이거나, 이들의 위치이성질체, 예컨대 이소프로필, 이소부틸, tert-부틸 등일 수 있다. 사이클릭 기의 고리에서 원자의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 사이클릭 기의 고리는 3-10개의 원자, 예컨대 3, 4, 5, 6 또는 7개의 원자를 포함한다.
전술한 이종원자를 포함하는 기 뿐만 아니라 전술한 다른 임의의 기들은, 주기율표의 IIIA, IVA, VA, VIA 또는 VIIA 족 중 임의의 족으로부터 선택된 하나 이상의 이종 원자, 예컨대 B, Si, N, P, O 또는 S 원자 또는 할로겐 원자 (예, F, Cl, Br 또는 I)를 포함할 수 있다. 즉, 유기 기는 하이드록시 기, 카르복시산 기, 에스테르 기, 에테르 기, 알데하이드 기, 케톤 기, 아민 기, 아미드 기, 이민 기, 티올 기, 티오에테르 기, 설페이트 기, 설폰산 기, 및 포스페이트 기 등과 같은 유기 화학에서 통상적인 관능기들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 유기 기는 이들 기의 유도체, 예컨대 카르복시산 안하이드라이드 및 카르복시산 할라이드를 포함할 수 있다.
아울러, 임의의 유기 기는 상기에서 정의된 유기 기 및/또는 관능기의 2 이상의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구현예들에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 R7, R8, R9 및 R10 모두 저급 알킬 기이며, 가장 전형적으로는, 이들은 모두 H 원자이다.
전형적으로, x+y는 1 이상이다. 전형적으로, w는 1이다. 전형적으로, z는 1이다. 가장 전형적으로, w와 z 둘다 1이다.
전형적으로, 다양한 n과 m은, 원자의 수가 전술한 바와 같도록, 골격의 바람직한 원자 수를 달성하도록 조절된다 ([n.m+w+x+y+z] 값을 조절하는 일부임). 전형적으로, n은 1-3의 정수이고, 가장 전형적으로 n은 2이다. 일부 구현예들에서, m은 1 내지 5의 정수이고, 가장 전형적으로 m은 2 또는 3이다.
일부 보다 전형적인 스페이서는 하기 식들의 화합물들로부터 선택되며, 이때 w=1, n=2, y=1, z=1이고, 바람직하게는, x=0이다:
상기에서, 변수들은 이미 앞에서 정의된 바와 동일한 의미를 가지며; m은 1-7, 1-6, 1-5, 1-4 또는 1-3의 정수, 예컨대 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7이고; x는 1-15, 1-13, 1-11, 3-15, 3-13, 3-11, 5-15, 5-13 또는 5-11의 정수이고; R3 및 R3' 은 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는 R3 및 R3'은 동일하며, R4 및 R4'은 동일하다. 더 바람직하게는, R3, R3', R4 및 R4' 모두 동일하다. 전형적으로, R3, R3', R4 및 R4' 모두 H이다.
대부분의 구현예들에서, R1 내지 R10 모두 저급 알킬 기 또는 H이며, 가장 전형적인 구현예들에서, R1 내지 R10은 모두 H 원자이다. 가장 바람직한 스페이서의 일부는 골격에 각각 7, 9, 12 및 23개의 원자를 가지는 하기 식을 가진다:
상기 식들 전체에서, 웨이브 선은 스페이서와 PNA의 결합을 표시한다. 전형적으로, 스페이서는 말단기를 통해 전극 표면에 부착된다.
EIS 방법은, 분석물의 존재, 부재, 실체 및/또는 양을 결정하는데 충분한 한, 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 바람직하게는, EIS 단계는 하기 서브-단계를 포함한다:
i) 교류 전압을 분석물에 인가하는 단계로, 상기 교류 전압은 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS)을 통해 분석물의 존재를 식별하기에 충분한 복수의 중첩 주파수(superimposed frequency)를 포함하는 것인 단계; 및
ii) EIS 데이타로부터 분석물의 존재, 부재, 실체 및/또는 양을 결정하는 단계.
본 발명의 이러한 측면은, 바람직하게는, 단계 (i)에서 중첩되며 인가되는 주파수 세트를 결정하기 위해 통계 분석을 활용한다. 이런 방식으로 주파수들을 결정하는 통계 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 당업자는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 주파수 세트를 결정하기 위해 임의의 공지 방법을 채택할 수 있다. 이런 방법들은, 예를 들어, "Statistical methods in Experimental physics" (2nd Edition) by World Scientific Publications Co. Pte. Ltd. Singapore. Ed. By F. James (2006) ISBN 981-256795에서 찾아 볼 수 있다.
주파수 세트를 결정하기 위한 다른 방법들도 적절하다면 채택할 수 있다. 예를 들어, 특정 시스템의 경우 (예, 특정 전극/용액/분석물 조합), 특정 시스템에 대한 표준으로서 충분한 주파수 세트를 찾기 위해 미리 실증적인 방법을 이용할 수 있다. 그런 후, 방법이 수행되는 매 경우에 필요한 주파수들을 계산하지 않고도, 상기 표준을 그 시스템에 사용할 수 있다. 또한, 임의의 다른 방법도 실시간으로 또는 미리 사용될 수 있으되, 단 이는 이용하기 위한 실행가능한 주파수 세트를 제공해주며 TTR에 유해하게 작용하지 않아야 한다.
주파수 세트를 결정하기 위해 어떤 방법이 사용되는지는 상관없이, 상기 세트는 EIS를 이용한 분석물 존재를 식별하기에 충분한, 필수적인 최소 갯수 이상의 주파수를 포함하여야 한다. 적절한 경우, 물론 최소 갯수에 부가적인 주파수들도 사용될 수 있다.
본 방법은, 일부 구현예들에서, 주파수 세트 외에도 또는 주파수 세트 대신, 그 자체로 주파수 세트를 규정하여 분석물의 존재 및/또는 양 검출을 달성하는데 도움이 되는, 다른 파라미터(들)를 결정하는 단계도 포함할 수 있다. 각 경우에, 주파수 및/또는 파라미터는 데이타 분석을 통해 가장 빠른 결과 수득 시간을 제공하는 측면에서 선정된다.
전형적으로, 주파수 세트 및/또는 파라미터는 분석물의 존재 또는 부재를 구분하는데 충분하다. 주파수 세트의 항목은 구체적으로 한정되지 않으며, 특정 개개 주파수들의 세트, 범위내에 속하는 주파수들의 세트 및/또는 세트에서 추가적인 주파수를 정의하는, 일정하게 떨어져 있는 단일 주파수로서 정의될 수 있다.
중첩 주파수를 이용한 EIS 측정 결과 분석은 바람직하게는 통계이며, 등가 회로 분석 방법을 채택할 필요가 없어, 전형적으로 보다 신속하게 식별할 수 있다. 그러나, 등가 회로 방법 및 임의의 다른 방법도, TTR에 부정적으로 작용하지 않는 한, 배제되는 것은 아니다. 고속 푸리에 변환 (Fast Fourier transform: FFT) 분석을 이용하여 필요한 EIS 데이타를 추출할 수 있으며, 이 정보를 사용하여 분석물 정보를 제공할 수 있다. 이러한 FFT 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 당업자라면 본 발명에 필요에 따라 이러한 임의의 기법을 적용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 바람직하게는, 분석 존재 또는 부재에 대한 정보는 EIS 데이타로부터 수득할 수 있으며, 더 바람직하게는 존재하는 분석물의 양도 결정할 수 있다.
본 발명은, EIS 바이오센싱 (biosensing) 및 식별이 제한된 주파수 범위에서 적은 수의 포인트 (실시예 1 (하기 참조)에서, 10종의 주파수에서 7포인트)를 이용함으로 달성할 수 있으므로, 필수 주파수들을 포함한 멀티웨이프 형태 (실시예 1에서, 멀티사인 (multisine))의 EIS 교란과 필요한 정보를 추출하기 위해 사용되는 고속 푸리에 변환 (FFT)의 동시 적용이 가능하다는 것을 입증한다. 이러한 과정은 수초내에 상업적으로 입수가능한 장치를 이용한 측정 및 분석이 가능해져, 빠르고 확실한 검정을 위한 현실적인 타임스케일로 EIS 측정이 가능하다.
임의의 핵산 분석물을 본 발명에서 검출할 수 있으며, 검출 방법은 이용되는 분석물의 타입에 따라 결정될 것이다. 본 발명에 사용되는 주파수 세트는 조사 중인 각각의 특정 시스템에서 이루어지는 결합 타입 뿐만 아니라 시스템 자체의 물리적인 특성 (전극 타입, 전극 조성, 전극 크기, 분석물 조성, 용매/액체 매질 타입, 전해질 등)에 따라 결정될 것이다. 유사한 시스템들의 경우, 표준 주파수 세트들이 사용될 수 있으며, 새로운 시스템이나 분석물의 경우에는, 실시간 통계적 계산이 앞서 예시한 바와 같이 적용될 수 있다.
본원에 언급된 바와 같이, EIS 단계는 특별히 한정되지 않는다. 즉, 대안적으로, EIS 단계는 하기 서브-단계들을 포함할 수 있다:
i) 분석물에 교류 전압을 인가하는 단계;
ii) 상기 분석물 전역에서 EIS 측정값의 변화율을 확인하는 단계;
iii) 변화율 데이타로부터 상기 분석물의 존재, 부재, 실체 및/또는 양을 결정하는 단계.
본 발명의 이러한 측면에서, 특히 바람직하게는, EIS 측정값은 전기 이동 저항 (electron transfer resistance), 즉 Ret 값이다. 실시간으로 행해지는 전형적인 EIS 측정에서, 한가지 파라미터는 특히 프로브 필름 형성에 민감하며, 프로브 타겟 혼성화는 시스템에 존재하는 레독스 커플 (예, [Fe(CN)6]3-/4-)의 전자 이동 저항, Ret이다. 이 파라미터는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, EIS 스펙트럼의 극좌표선도 (Nyquist plot)에서 반원 형태의 폭으로부터 계산할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면은, 전극 표면에 대한 분석물의 결합 또는 프로브-분석물의 혼성화를 통한 EIS 반응을 인 시츄 동역학적으로 측정할 수 있기 위한 IDE 측정 프로토콜을 제공한다. 복수의 중첩 주파수들을 채택하는 경우와 마찬가지로, EIS 측정 시간이 훨씬 짧아지게 된다. 또한, 제1 측면과 마찬가지로, 모든 분석물을 검출할 수 있으며, 검출 방법의 구체적인 내용은 참여하는 분석물의 타입에 따라 결정될 것이다. 일부 분석물들은 전극에 직접 결합할 수 있지만, 다른 것들은 전극 표면 상의 프로브 또는 상보적인 분자에 결합할 수 있다. Ret 데이타의 실제 특성은 조사 중인 각각의 개별 시스템에서 예상되는 결합 타입에 좌우될 것이다.
상기에서 암시된 바와 같이, 본 발명의 이러한 측면에서, 레독스 프로브 (예, 페리시아니드 및 페로시아니드)의 산화 상태들 모두 용액 중에서 제시되는 것이 바람직하다. 이는, IDE에서의 DC 전위가, 외부 기준 전극을 사용하지 않고도 2개의 IDE 간에 전위를 적용할 수 있는 모든 방법 및 수단들에서, 레독스 프로브의 환원 전위에 의해 고정됨을 분명히 한다. 이러한 측정 방법은 EIS 반응을 용액에 노출된 시간과 함께 측정할 수 있다.
언급된 바와 같이, 현재 공지된 EIS 프로토콜은 전극/분석물의 결합 평형 근사치 (approach)를 측정한다. 이로써, EIS 신호 변화는 고정된 값으로 나타나며, 이는 평형을 의미한다. 이 경우, 측정이 용액 중에서 이루어지기 때문에, 평형화 시간과 평형 EIS 신호는 실시간으로 확인되며, 최적의 평형이 측정된다. 그러나, 결과를 측정할 수 있기 전에 완전한 평형이 이루어져야 하며, 이는 분석물의 결합 및 해리 속도에 의해 조절되는 종종 지루한 프로세스이므로, 결과 수득 시간은 길어진다. 본 발명의 이러한 측면에서, 전술한 바와 같이, EIS 신호 증가율을 이용하며, 전극/분석물의 결합 (또는 프로브/분석물 결합)이 동역학적으로 측정되므로, 이를 분석함으로써 용액내 분석물의 농도를 결정한다. 이는, 수분 이하의 훨씬 빠른 TTR을 달성할 수 있으며, 완전한 평형에 도달하지 않아도 된다.
본 발명에서, EIS 데이타는 바람직하게는 복소 임피던스 (x + iy)로부터 유래되는 데이타 파라미터들을 포함한다. 이들 파라미터는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 하기 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다:
● 실수부 (real component) (x)
● 허수부 (imaginary component) (y)
● 계수 또는 절대값 [r = |z| = (x2 + y2)½]
● 각도 [θ = tan-1(y/x)]
● 주 성분 (Principal component) 1
● 주 성분 2
본 발명에서 사용되는 중첩 주파수의 갯수는, 분석물의 실체 및/또는 양을 요구되는 정확도로 제공하기 위해 EIS를 이용한 분석에 적합한 한, 특별히 한정되지 않는다. 전형적으로 중첩 주파수의 최소 갯수는 2-20이다. 더 바람직하게는, 중첩 주파수의 최소 갯수는 적어도 3-10, 즉, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10개이다. 가장 바람직하게는, 중첩 주파수의 갯수는 약 7개이다.
언급한 바와 같이, 본 발명의 방법은 액체 매질에서 이루어지는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 액체 매질은 프로세스를 돕도록 선택된다. 매질은, 본 방법을 방해하지 않는 한, 특별히 한정되지 않으며, 산성 매질 또는 염기성 매질이 사용될 수 있다.
본 발명은 첨부된 도면들을 참조하여 보다 상세하게 기술될 것이다:
도 1은 마크로 금 (낮은 Z 값) 및 IME (interdigitated micro electrode)로부터 수득한 EIS 데이타의 전형적인 극좌표선도이다.
도 2는 양성 대조군과 마크로 및 교차 전극 (interdigitated electrode)들에서의 고정 프로브의 주파수 데이타에 대한, 실수부 (x), 허수부 (y), 계수 (r), 각도 (θ), 주 성분 1 및 주성분 2 플롯들을 도시한다.
도 3은 약 23초의 동시적인 FFT 분석을 이용한 정상 싱글 사인의 연속적인 EIS 측정에 따른 단백질 마크로 금 전극 (6700 pM 항체)의 EIS 반응을 도시한다 (검정 - 2분 이상의 기록 시간; 적색 - 9초 이상 5 멀티사인 EIS 측정; 청색 - 9초 마다 15 멀티사인 EIS 측정).
도 4는 69 mer HCV DNA 프로브로 변형시키고 1 mM MCH (◇)로 차단한 금 전극과 1 μM 상보적인 타겟 (ITI 025) (□)과의 혼성화시, 극좌표선도들을 비교하여 도시한다. 임피던스 측정은 IDE 쌍의 전극 간에 dc 전위 0 V를 적용하여 10 mM [Fe(CN)6]3- 및 10 mM [Fe(CN)6]4- (+ 프로브 또는 타겟)이 첨가된 2x SSC에서 수행하였다.
도 5는 69 mer HCV DNA 프로브로 변형되고 1 mM MCH (◇)로 차단된 경우, 1 μM 비-상보적인 타겟 (ITI 012) (□)과의 혼성화시, 1 nM (△) 및 50 nM (○) 상보적인 타겟 (ITI 025)과의 혼성화시, 금 전극의 극좌표선도들을 비교하여 도시한다. 임피던스 측정은 IDE 쌍의 전극 간에 dc 전위 0 V를 적용하여 10 mM [Fe(CN)6]3- 및 10 mM [Fe(CN)6]4- (+ 프로브 또는 타겟)이 첨가된 2x SSC에서 수행하였다.
도 6은 프로브 (티올-DNA) 층 형성 (◇), MCH로 차단 후 (□), 1 μM 상보적인 타겟과의 혼성화시 (△) 및 혼성화 후 세척 시 (○), 시간에 따른 Ret로 EIS를 측정하여 도시한 것이다.
도 7은 상보적인 타겟 (50 nM) 결합 및 20 nM QD 인큐베이션시 EIS를 측정한 다음 형광을 측정한 것으로, PMT는 180으로 세팅하였다.
도 8은 4개의 디바이스 칩, 정렬 마크 및 리프트 오프 프로세스를 빠르게 하기 위한 더미 금속 라인을 비롯한, 교차형 금 미세전극 구조체의 마스크 레이아웃을 도시한 것이다. 각 전극에서 디지트 (digit)의 갯수 (N)는 바람직하게는 5 - 10개이다. 각 디지트의 길이(L)는 바람직하게는 75 - 150 ㎛이다. 각 디지트의 폭 (W)과 각 디지트 간의 갭 폭 (G)은 각각 바람직하게는 1.5 - 10 ㎛이고, W와 G는 바람직하게는 동일하다.
도 9는 1 μM 타겟과 혼성화 전 및 혼성화 후 DNA 프로브를 이용한 EIS 반응 (전자 이동 저항 값 (Rct))을 도시한 것이며, 도 10은 1 μM 타겟과 혼성화 전 및 이후의 PNA 프로브들의 EIS 반응 (Rct)을 도시한 것이다. PNA 프로브와 DNA 프로브의 감도에 있어 이러한 큰 차이는, PNA가 DNA 분자의 음으로 하전된 포스페이트 골격이 없는 중성 분자이기 때문에 발생한다. 음으로 하전된 핵산의 혼성화는 전극 표면의 총 전하 (overall charge)에 큰 변화를 유발한다. 이는, 패러데이 EIS 검출에 사용되는 음으로 하전된 전기 활성 종들 (페릭/페로시아니드)의 높은 수준의 반발력을 유발하며, 그래서 전자 이동 저항 값 (Rct)을 크게 증가시킨다.
도 11은 사전 증폭없이, 여러가지 농도의 E. coli 16S rRNA와 혼성화하는 E. coli 특이 PNA 프로브 (P51)를 이용하여 E. coli 종들을 임피던스 측정으로 동정하기 위한 농도 반응 곡선을 도시한다.
도 12는 MWF 및 완충액 대조군 (2x SSC) 배양물에 접종한, 다양한 함량의 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스 (MRSA) 세포 (105 - 108 세포/ml MWF (mock wound fluid))와 대조군으로서 메티실린 감수성 S. 아우레우스 (MSSA)로부터 추출한 게놈 DNA에 대한, 혼성화 전 및 혼성화 이후의 EIS 반응 (전자 전달 저항 값 (Rct))을 도시한다.
도 13은 MRSA로부터 회수한 DNA 주형에 대해 수행한 qPCR 검사 결과를 도시한다. 그래프는 WF의 세포/mL 농도 vs 사이클 역치를 나타낸다.
도 14는 상처 체액 (wound fluid)내 108 세포/mL MRSA로부터 추출하였을 때 gDNA 수율 변화를 보여주는 qPCR 데이타이다.
도 15는 (A) 프로토타입 정전위기 (prototype potentiostat)와, (B) 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드 (1 μM) 23 bp를 도입하기 전과 도입한 지 10분 경과 시의, 극좌표선도를 도시한다.
도 16 A, B & C는 95℃에서 각각 0, 1 및 5분간 열 처리한 이후의 MRSA gDNA에 대한 바이오분석 데이타를 도시한다.
도 17은 열처리 무, 95℃에서 1분, 95℃에서 5분 열처리한 후 MRSA 샘플의 아가로스 겔 전기영동 결과를 보여준다.
도 18은 107 세포/mL의 현탁물로부터 추출한 MRSA gDNA와 혼성화하기 전과 혼성화한 이후의, PNA 변형된 금 전극과 랜들스 회로 (Randles circuit)를 이용하여 수행한 EIS 측정의 극좌표선도를 도시한다 - RS = 용액 저항, CDL = 이중 층 커패시턴스, RCT = 전하 이동 저항 및 ZW = 와버그 분산 인자 (Warburg diffusion element).
도 19는 4종의 다른 스페이서를 가진 프로브들과, 107 세포/mL 농도의 세포 현탁물로부터 추출한 MRSA 게놈 DNA를 인큐베이션한 바에 따른 신호 증가율을 도시한 것으로, n=3이고, 오차 막대 = 표준 편차이다.
도 20은 EIS 신호에 대한 타겟의 크기 영향을 도시한다: (A) 추출한 MRSA gDNA 및 (B) MRSA gDNA를 DNA 12000 키트를 이용하여 2x SSC 중에서 95℃에서 5분간 인큐베이션하였을 때 관찰가능한 DNA 단편화에 대한 애질런트 바이오분석기 분석 결과; (C) 0, 1 또는 5분간 95℃에서 2x SSC 중에서 변성한 후 MRSA gDNA와 인큐베이션하였을 때 EIS 반응으로; n=3이고, 오차 막대 = 표준 편차이다.
도 21은 (A) MRSA 게놈 DNA에 대한 농도 반응 (n=5 및 오차 막대 = 표준 편차; 라인 = 0 MRSA 세포/mL + 3 표준 편차); (B) MSSA, E. coli 및 MRSA에서의 특이 및 비-특이 신호 변화 (n=3, 오차 막대 = 표준 편차)를 도시한다.
도 22는 인간 상처 체액에 접종한 MRSA 세포 및 무접종 인간 상처 체액으로부터 추출한 gDNA와의 인큐베이션하였을 때 나타나는 신호 증가율을 도시한 것으로; 신호 증가율은 샘플을 첨가한 후 10분 동안 측정하며; n=3이고, 오차 막대 = 표준 편차이다.
도 23은 106 세포/mL의 세포 현탁물로부터 추출한 후 MRSA 및 E. coli gDNA에 노출하였을 때의 센서 거동을 도시한 것으로; n=3이고, 오차 막대 = 표준 편차이다.
도 1은 마크로 금 (낮은 Z 값) 및 IME (interdigitated micro electrode)로부터 수득한 EIS 데이타의 전형적인 극좌표선도이다.
도 2는 양성 대조군과 마크로 및 교차 전극 (interdigitated electrode)들에서의 고정 프로브의 주파수 데이타에 대한, 실수부 (x), 허수부 (y), 계수 (r), 각도 (θ), 주 성분 1 및 주성분 2 플롯들을 도시한다.
도 3은 약 23초의 동시적인 FFT 분석을 이용한 정상 싱글 사인의 연속적인 EIS 측정에 따른 단백질 마크로 금 전극 (6700 pM 항체)의 EIS 반응을 도시한다 (검정 - 2분 이상의 기록 시간; 적색 - 9초 이상 5 멀티사인 EIS 측정; 청색 - 9초 마다 15 멀티사인 EIS 측정).
도 4는 69 mer HCV DNA 프로브로 변형시키고 1 mM MCH (◇)로 차단한 금 전극과 1 μM 상보적인 타겟 (ITI 025) (□)과의 혼성화시, 극좌표선도들을 비교하여 도시한다. 임피던스 측정은 IDE 쌍의 전극 간에 dc 전위 0 V를 적용하여 10 mM [Fe(CN)6]3- 및 10 mM [Fe(CN)6]4- (+ 프로브 또는 타겟)이 첨가된 2x SSC에서 수행하였다.
도 5는 69 mer HCV DNA 프로브로 변형되고 1 mM MCH (◇)로 차단된 경우, 1 μM 비-상보적인 타겟 (ITI 012) (□)과의 혼성화시, 1 nM (△) 및 50 nM (○) 상보적인 타겟 (ITI 025)과의 혼성화시, 금 전극의 극좌표선도들을 비교하여 도시한다. 임피던스 측정은 IDE 쌍의 전극 간에 dc 전위 0 V를 적용하여 10 mM [Fe(CN)6]3- 및 10 mM [Fe(CN)6]4- (+ 프로브 또는 타겟)이 첨가된 2x SSC에서 수행하였다.
도 6은 프로브 (티올-DNA) 층 형성 (◇), MCH로 차단 후 (□), 1 μM 상보적인 타겟과의 혼성화시 (△) 및 혼성화 후 세척 시 (○), 시간에 따른 Ret로 EIS를 측정하여 도시한 것이다.
도 7은 상보적인 타겟 (50 nM) 결합 및 20 nM QD 인큐베이션시 EIS를 측정한 다음 형광을 측정한 것으로, PMT는 180으로 세팅하였다.
도 8은 4개의 디바이스 칩, 정렬 마크 및 리프트 오프 프로세스를 빠르게 하기 위한 더미 금속 라인을 비롯한, 교차형 금 미세전극 구조체의 마스크 레이아웃을 도시한 것이다. 각 전극에서 디지트 (digit)의 갯수 (N)는 바람직하게는 5 - 10개이다. 각 디지트의 길이(L)는 바람직하게는 75 - 150 ㎛이다. 각 디지트의 폭 (W)과 각 디지트 간의 갭 폭 (G)은 각각 바람직하게는 1.5 - 10 ㎛이고, W와 G는 바람직하게는 동일하다.
도 9는 1 μM 타겟과 혼성화 전 및 혼성화 후 DNA 프로브를 이용한 EIS 반응 (전자 이동 저항 값 (Rct))을 도시한 것이며, 도 10은 1 μM 타겟과 혼성화 전 및 이후의 PNA 프로브들의 EIS 반응 (Rct)을 도시한 것이다. PNA 프로브와 DNA 프로브의 감도에 있어 이러한 큰 차이는, PNA가 DNA 분자의 음으로 하전된 포스페이트 골격이 없는 중성 분자이기 때문에 발생한다. 음으로 하전된 핵산의 혼성화는 전극 표면의 총 전하 (overall charge)에 큰 변화를 유발한다. 이는, 패러데이 EIS 검출에 사용되는 음으로 하전된 전기 활성 종들 (페릭/페로시아니드)의 높은 수준의 반발력을 유발하며, 그래서 전자 이동 저항 값 (Rct)을 크게 증가시킨다.
도 11은 사전 증폭없이, 여러가지 농도의 E. coli 16S rRNA와 혼성화하는 E. coli 특이 PNA 프로브 (P51)를 이용하여 E. coli 종들을 임피던스 측정으로 동정하기 위한 농도 반응 곡선을 도시한다.
도 12는 MWF 및 완충액 대조군 (2x SSC) 배양물에 접종한, 다양한 함량의 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스 (MRSA) 세포 (105 - 108 세포/ml MWF (mock wound fluid))와 대조군으로서 메티실린 감수성 S. 아우레우스 (MSSA)로부터 추출한 게놈 DNA에 대한, 혼성화 전 및 혼성화 이후의 EIS 반응 (전자 전달 저항 값 (Rct))을 도시한다.
도 13은 MRSA로부터 회수한 DNA 주형에 대해 수행한 qPCR 검사 결과를 도시한다. 그래프는 WF의 세포/mL 농도 vs 사이클 역치를 나타낸다.
도 14는 상처 체액 (wound fluid)내 108 세포/mL MRSA로부터 추출하였을 때 gDNA 수율 변화를 보여주는 qPCR 데이타이다.
도 15는 (A) 프로토타입 정전위기 (prototype potentiostat)와, (B) 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드 (1 μM) 23 bp를 도입하기 전과 도입한 지 10분 경과 시의, 극좌표선도를 도시한다.
도 16 A, B & C는 95℃에서 각각 0, 1 및 5분간 열 처리한 이후의 MRSA gDNA에 대한 바이오분석 데이타를 도시한다.
도 17은 열처리 무, 95℃에서 1분, 95℃에서 5분 열처리한 후 MRSA 샘플의 아가로스 겔 전기영동 결과를 보여준다.
도 18은 107 세포/mL의 현탁물로부터 추출한 MRSA gDNA와 혼성화하기 전과 혼성화한 이후의, PNA 변형된 금 전극과 랜들스 회로 (Randles circuit)를 이용하여 수행한 EIS 측정의 극좌표선도를 도시한다 - RS = 용액 저항, CDL = 이중 층 커패시턴스, RCT = 전하 이동 저항 및 ZW = 와버그 분산 인자 (Warburg diffusion element).
도 19는 4종의 다른 스페이서를 가진 프로브들과, 107 세포/mL 농도의 세포 현탁물로부터 추출한 MRSA 게놈 DNA를 인큐베이션한 바에 따른 신호 증가율을 도시한 것으로, n=3이고, 오차 막대 = 표준 편차이다.
도 20은 EIS 신호에 대한 타겟의 크기 영향을 도시한다: (A) 추출한 MRSA gDNA 및 (B) MRSA gDNA를 DNA 12000 키트를 이용하여 2x SSC 중에서 95℃에서 5분간 인큐베이션하였을 때 관찰가능한 DNA 단편화에 대한 애질런트 바이오분석기 분석 결과; (C) 0, 1 또는 5분간 95℃에서 2x SSC 중에서 변성한 후 MRSA gDNA와 인큐베이션하였을 때 EIS 반응으로; n=3이고, 오차 막대 = 표준 편차이다.
도 21은 (A) MRSA 게놈 DNA에 대한 농도 반응 (n=5 및 오차 막대 = 표준 편차; 라인 = 0 MRSA 세포/mL + 3 표준 편차); (B) MSSA, E. coli 및 MRSA에서의 특이 및 비-특이 신호 변화 (n=3, 오차 막대 = 표준 편차)를 도시한다.
도 22는 인간 상처 체액에 접종한 MRSA 세포 및 무접종 인간 상처 체액으로부터 추출한 gDNA와의 인큐베이션하였을 때 나타나는 신호 증가율을 도시한 것으로; 신호 증가율은 샘플을 첨가한 후 10분 동안 측정하며; n=3이고, 오차 막대 = 표준 편차이다.
도 23은 106 세포/mL의 세포 현탁물로부터 추출한 후 MRSA 및 E. coli gDNA에 노출하였을 때의 센서 거동을 도시한 것으로; n=3이고, 오차 막대 = 표준 편차이다.
본 발명의 모든 측면들에 따른 방법들은 공지된 방법들에 비해 특별한 여러가지 이점을 가진다: 환자 근처 요건에 부합되는 수초 내지 수분 이내의 신속한 결과 수득 시간 (TTR); 여러가지 프로브-타겟 시스템에 접근가능한 광범위한 적용가능성; 데이타 콜렉션 강화를 위한 빠른 멀티사인 EIS와의 혼용성; 전자 조절 및 측정과 EIS 검출의 혼용성; 및 표지 무사용 검출.
본 발명의 방법을 이용하여 단일 분석물 또는 복수의 여러가지 분석물들을 동시에 검출할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 표지물을 사용하지 않는 방법으로서, 즉, 검출을 보조하기 위해 분석물을 표지할 필요가 없다. 그러나, 일부 경우에서는, 표지물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 방법을 이용하여 여러가지 복수의 분석물들을 동시에 검출하는 경우, 여러가지 분석물 각각을 분석물에 상응하는 하나 이상의 다른 표지물로 표지할 수 있다. 다른 예로, 표면 상에 분석물에 대한 프로브 세트를 정렬하는 것과 같이, 공간적 분리에 의해 복수의 분석물들을 검출할 수 있다. 또한, 여러가지 복수의 분석물들을 검출하는 방법은 다중화 (multiplexing)로 공지되어 있다.
본 발명의 전기화학적 검출 방법에서, 분석물은 용액 중에 또는 액체 매질 중의 현탁물로 분석된다. 액체 매질은, EIS를 이용한 분석에 적합한 한, 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 액체 매질은 EIS 측정을 용이하게 하기 위해 전해질을 포함한다. 전해질은 용매이거나, 또는 불활성 이온을 함유한 완충액, 예컨대 PBS이며; 전형적으로 레독스 활성 종들이 매우 낮은 농도로 첨가된다. 전해질은 특별히 한정되지 않지만, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 전해질을 포함할 수 있다. 그러나, 전이 금속 레독스 시스템을 함유한 전해질, 예컨대 Fe(II)/Fe(III) 전해질 시스템이 바람직하다. 특히 [Fe(CN)6]3-/4-이 바람직하다.
여러가지 분석물들을 표지하기 위해 여러가지 복수의 표지물들을 사용한다면, 이들은 바이오틴화된 검출 프로브로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 각 표지물은 전기화학적 검출 방법에서 다른 산화 전위를 가지므로, 수득되는 데이타에 여러가지 신호 피크들이 발생한다. 예를 들어, 금속 나노입자가 여러가지 분석물들에 대한 표지물로서 사용된다면 (하기 참조), 상이한 산화 전위를 가진 상이한 금속들이 각 분석물에 대해 사용될 수 있다.
바람직한 구현에에서, 전극에 적용되는 교류 전위는 특별히 한정되지 않으며, 사용되는 매질에 따라 결정된다. 즉, 실제, EIS에서 가능한 최대 진폭은 용매 제한에 의해 고정된다 (물의 경우, 약 2 V, 약 1-2 V의 rms 진폭을 제공함). 이에, 수성 매질의 경우, 전위는 +1.0 내지 +2.0 V, 바람직하게는 +1.2 V 내지 +1.8 V일 수 있다. 시스템에 레독스 종을 이용하는 경우, 산화 종 및 환원 종 둘다 존재하며, 이는 전형적으로 250 mV 미만의 진폭을 이용하게 된다. 보다 바람직한 구현예에서, 전극 간에 적용되는 교류 전압은 진폭이 약 10 mV rms (root mean squared)이다. 이로써 반응을 예를 들어 등가 회로 분석을 위해 선형화할 수 있다. 진폭이 보다 큰 반응을 사용할 수 있다 (특징적인 신호를 추출하기 위해 통계학적 방법들을 사용하는 경우, 이 방법들은 상이하거나/유용할 수 있다).
바람직한 구현예에서, 전기적 검출 방법은 칩 상에서 수행된다. 광학 검출에 표지물(들)을 사용하는 본 발명의 다중화 구현예에서, 분석물(들)을 여러가지 표지물들을 이용하여 동시에 표시하였을 경우, 광학 검출 및 전기적 검출은 하나의 칩 상에서 이루어질 수 있다. 다른 예로, 분석물(들)이 2개의 분액으로 분할되고 별도로 표지되는 경우, 하나의 칩에서 광학 및 전기적 검출을 위해 표지한 후 조합할 수 있거나, 또는 2개의 분리된 칩에서 광학 및 전기적 검출을 각각 수행할 수 있다.
EIS를 이용하여, 존재하는 분석물의 양을 정량할 수 있다. 정량 데이타는 적분하여 신호 피크에서, 즉 발생된 각 단일 피크의 그래프 하 면적을 결정함으로써 입수할 수 있다.
표지물을 이용하는 구현예들
본 발명의 일부 바람직한 구현예들에서, 특히 다중화가 바람직할 경우에는 표지물이 사용된다. 언급되는 표지물은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 나노입자, 단일 분자, 특이적인 뉴클레오티드 또는 아미노산 등의 타겟의 진성 성분 (intrinsic component) 및 화학발광 효소로부터 선택된다. 적합한 화학발광 효소로는 HRP와 알칼리 포스파타제를 포함한다. 표지물의 광학 검출은 본 발명의 전기화학적 방법과 쉽게 조합가능하기 때문에, 형광 표지물이 특히 바람직하다.
바람직하게는, 표지물은 나노입자이다. 나노입자는 전기적 검출 방법에서 성공적으로 작동하기 때문에, 본 발명의 이러한 구현예들에서 특히 유익하다. 표면에 대한 나노입자의 근접성이 특별히 중요한 것은 아니므로, 분석이 보다 유연해진다. 바람직한 구현예에서, 분자들의 콜렉션이 단일 분자를 사용하는 경우 보다 광학 및 전기적 검출 방법들에서 더 강한 신호를 발생시키기 때문에, 나노입자는 분자들의 콜렉션을 포함한다.
바람직하게는, 나노입자는 금속, 금속 나노셀, 금속 바이너리 화합물 및 양자 점 (quantum dot)으로부터 선택된다. 바람직한 금속 또는 그외 요소의 예로는, 금, 은, 구리, 카드뮴, 셀레늄, 팔라듐 및 백금이 있다. 바람직한 금속 바이너리 화합물 및 그외 화합물의 예로는 CdSe, ZnS, CdTe, CdS, PbS, PbSe, HgI, ZnTe, GaAs, HgS, CdAs, CdP, ZnP, AgS, InP, GaP, GaInP 및 InGaN을 포함한다.
금속 나노셀은 코어 나노입자가 얇은 금속 셀로 둘러싸인 구형의 나노입자이다. 금속 나노셀의 예로는 금 황화물 또는 실리카 코어가 얇은 금 셀로 둘러싸인 것이 있다.
양자점은 반도체 나노결정으로서, 빛 흡광성이 좋은 발광 나노입자이다 (West J, Halas N, Annual Review of Biomedical Engineering, 2003, 5: 285-292 "Engineered Nanomaterials for Biophotonics Applications: Improving Sensing, Imaging and Therapeutics"). 양자점의 예로는 CdSe, ZnS, CdTe, CdS, PbS, PbSe, HgI, ZnTe, GaAs, HgS, CdAs, CdP, ZnP, AgS, InP, GaP, GaInP, 및 InGaN 나노결정을 포함한다.
상기 임의의 표지물들은 항체에 결합될 수 있다.
표지물의 크기는 바람직하게는 직경이 200 nm 미만이며, 더 바람직하게는 직경이 100 mn 미만이며, 보다 더 바람직하게는 직경이 2-50 nm, 보다 더 바람직하게는 직경이 5-50 nm, 보다 더 바람직하게는 직경이 10-30 nm, 가장 바람직하게는 15-25 nm이다.
본 발명의 방법이 복수의 분석물을 검출하기 위한 것인 경우, 각각의 다른 분석물은 분석물과 결부시킬 수 있는 하나 이상의 다른 표지물들로 표지된다. 본 발명의 이러한 측면에서, 표지물들은 이의 구성 및/또는 타입이 상이할 수 있다. 예를 들어, 표지물이 나노입자인 경우, 표지물은 여러가지 금속 나노입자일 수 있다. 나노입자가 금속 나노셀인 경우, 코어 층과 셀 층의 크기가 다변화되어 상이한 표지물들이 만들어질 수 있다. 다른 예로 또는 아울러, 표지물은 여러가지 물성, 예컨대 크기, 형태 및 표면 거칠기를 가진다. 일 구현예에서, 표지물은 동일한 구성 및/또는 타입을 가지거나, 다른 물성을 가질 수 있다.
상이한 분석물들에 대해 상이한 표지물들은, 바람직하게는, 광학 검출 방법 및 전기적 검출 방법으로 서로 구분가능하다. 예를 들어, 표지물은 상이한 방출 주파수, 상이한 산란 신호 및 상이한 산화 전위를 가질 수 있다.
다중화 (multiplexing)와 같이 표지물을 사용하는 본 발명의 구현예에서, 본 방법은, 전형적으로 분석물을 하나 이상의 표지물로 표지하여 표지된 분석물을 형성하는 초기 단계를 추가로 포함한다.
분석물을 표지하기 위한 수단은 구체적으로 한정되지 않으며, 다수의 적절한 방법들이 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 분석물이 DNA 또는 RNA인 경우, 이는 리간드 또는 반응부에서 혼성화 이후의 표지화에 의해, 또는 비표지화된 타겟과 표지-올리고뉴클레오티드 접합체 프로브의 "샌드위치" 혼성화에 의해 표지될 수 있다 (Fritzsche W, Taton T A, Nanotechnology 14 (2003) R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection").
올리고뉴클레오티드를 나노입자에 접합하기 위한 다수의 여러가지 방법들, 예를 들어, 티올-변형된 및 이황화-변형된 올리고뉴클레오티드를 자발적으로 금 나노입자의 표면에 결합하여, 디- 및 트리-설파이드 변형된 접합체, 올리고티올-나노입자 접합체 및 나노프로브의 포스핀-변형된 나노입자로부터 유래된 올리고뉴클레오티드 접합체를 형성하는 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다 (Fritzsche W, Taton T A, Nanotechnology 14 (2003) R63-R73 "Metal nanoparticles as labels for heterogeneous, chip-based DNA detection"의 도 2).
일 구현예에서, DNA 가닥 또는 RNA 가닥이 바이오틴화될 수 있다. 바이오틴화된 타겟 가닥은 올리고뉴클레오티드 프로브-코팅된 자기 비드에 혼성화될 수 있다. 이후 스트렙타비딘-코팅된 금 나노입자가 포획된 타겟 가닥에 결합할 수 있다 (Wang J, Xu D, Kawde A, Poslky R, Analytical Chemistry (2001), 73, 5576-5581 "Metal Nanoparticle-Based Electrochemical Stripping Potentiometric Detection of DNA hybridization"). 자기 비드는 비-혼성화된 DNA를 자기로 제거가능케 한다.
EIS 공정을 수행하기 위해서는 한쌍의 전극을 사용하여야 한다. 전극은 특별히 한정되지 않지만, 전형적인 구현예로, 이는 스크린 인쇄 전극 또는 마크로 금 전극이거나, 또는 다른 예로 교차 전극 (IED)이다. 전극의 물질은, 핵산 분석물이 전극 표면 상에서 PNA 프로브에 결합할 때 발생하는 화학적 프로세스를 간섭하지 않는 한, 특별히 한정되지 않는다. 전형적으로, 전극은 금과 같은 불활성 금속으로부터 제조된다. 4개의 디바이스 칩, 정렬 표시 및 리프트-오프 프로세스를 빠르게 하기 위한 더미 금속 라인을 포함하는, 금 교차 미세전극 구조체들의 마스크 레이아웃을 도 8에 나타낸다. 각 전극에서 디지트의 갯수 (N)은 바람직하게는 5 - 10개이다. 각 디지트의 길이 (L)는 바람직하게는 75 - 150 ㎛이다. 각 디지트의 폭 (W)과 각 디지트 간의 갭 폭 (G)은 각각 바람직하게는 1.5 - 10 ㎛이고, W와 G는 바람직하게는 동일하다.
본 발명은 단순 예를 들어 추가로 설명하다.
실시예들
실시예 1 - 다중 주파수 분석을 위한 EIS 파라미터 조사
본 발명의 일 측면에 따른 방법에 사용하기 위한 최적의 파라미터를 조사하기 위해, 임의의 EIS 셋-업을 사용할 수 있다. 그러나, 전형적으로, 파라미터가 가능한 최적에 가깝게 하도록, 최종 분석에 사용될 수 있는 전극, 전해질, 액체 매질, 분석물 (및 이들이 사용된다면 프로브)이 채택될 것이다.
본 실시예에서, Abtech 사의 시판 교차 금 전극 (IDE)에서 프로브-타겟 혼성화를 실험하였다. 전기화학적 클리닝 사이클을 이용하여, IDE 쌍의 전극 양쪽에 50 mM H2SO4 수용액 중에서 Ag/AgCl에 대해 -0.6 V 내지 +1.65 V의 선형 전위 스윕 (potential sweep)을 스윕 속도 50 mV로 30-40회의 전체 사이클 동안, 클린 금 전극의 안정적인 순환 전압전류도 (CV) 특징이 확인될 때까지 적용하였다. DNA (69 mer ITI 021) 용액을 준비하기 전에, 다이설파이드 보호된 뉴클레오티드를 TCEP 5 mM 용액으로 절단한 후, MicroSpinTM G-25 컬럼 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)을 통과시켜, DNA 프로브를 정제하였다.
마크로 금 전극 및 교차 금 (IME) 전극 둘다에서, EIS를 측정하면서 넓은 주파수 범위의 극좌표선도를 작성하였으며, 이를 도 1에 나타내었고, 각각은 상보적인 타겟 결합에 대한 개별 신호를 보여준다.
양성 대조군 (상보적인 타겟이 결합된 프로브)과 음성 대조군 (프로브 단독 또는 비-상보적인 타겟이 결합된 프로브) 간의 차이는, x + iy (i = (-1)½)로 기재될 수 있는 복소 임피던스 (complex impedance)로부터 파생된 파라미터들에 대해 비교하였다. 이는 다음과 같다:
● 실수부 (x)
● 허수부 (y)
● 계수 또는 절대값 [r = |z| = (x2 + y2)½]
● 각도 [θ = tan-1(y/x)]
● 주 성분 1
● 주 성분 2
이들의 차이는 주파수 로그로 이를 작성함으로써, 이들 각각의 양에 대해 조사하였다 (도 2 참조).
도 2는, 큰 (마크로) 전극과 소형 (교차 마이크로) 전극 둘다에서, 실수와 계수는 유사한 정보를 제시하며, 특히 주파수 범위의 하한에서 양성 대조군과 고정된 프로브로부터 유래된 EIS 신호를 가장 잘 구별한다는 것을 보여준다. 허수부는 주파수 범위의 중간 영역에서 EIS 신호를 가장 잘 구별한다.
결과 수득 시간 (TTR)을 최적화하기 위해, 본 발명에서는 모든 실험 조건들에서 여러가지 EIS 데이타를 가장 잘 구별하는 가능성 있는 유용 주파수 범위와 최소 측정 회차를 선정하지만, 등가 회로 등의 피팅 모델을 이용할 필요가 없다. 본 실시예에서 통계 분석을 통해, 마크로 금 전극과 교차 마이크로 전극 (IME) 둘다에서 양성 대조군 및 고정된 프로브의 EIS 신호들 간의 배수 변화를 이용하여 7-포인트 최적 주파수 범위를 결정하였다.
결과를 표 1에 요약 개시한다.
표 1: 타겟 비교없이, 고정된 프로브 대비, 상보적인 혼성화를 기반으로 한 마크로 전극 및 교차 마이크로 전극에 대한 7-포인트 최적 주파수 범위 (Hz) 결과 요약.
| 신호 타입 | 포인트 번호 | 마크로 전극에 대한 최적 범위 | IME 전극에 대한 최적 범위 |
| 계수 | 7 | [4, 44] | [3, 30] |
| 실수부 | 7 | [3, 44] | [3, 30] |
| 허수부 | 7 | [30, 338] | [13, 150] |
주목하게도, 2가지 전극 타입들 모두, 계수 데이타와 실수부에서 EIS 측정을 위한 매우 유사한 최적 주파수 범위를 제시하였으며, 이는 주파수 10종 (a decade of frequency)에 걸쳐있다. 양 타입의 전극들에서, 허수부는 실수부와 계수 데이타 보다는 약간 높은 주파수에서 최적의 신호를 제시하며, 이 또한 주파수 10종에 걸쳐있다. 마크로에서 IME로의 가장 현저한 전극의 크기 변화는 측정을 위한 최적 주파수 범위에는 거의 영향을 미치지 않으므로, 반응은 전극 면적과는 거의 독립적으로 일치하며, EIS 측정을 단순화한다. 배수-변화를 이용하여 모의 혼성화 대비 상보적인 혼성화를 차별적으로 분석하여, 상보적인 혼성화 대 고정된 프로브 신호의 주파수 범위와 비슷한 최적의 주파수 범위가 제시되었으며, 이는 동일한 측정 범위를 사용할 수 있음을 검증해준다.
표 2: 상보적인 혼성화 대 모의 혼성화 비교를 기반으로 한 마크로 금 전극에 대한 Hz의 7-포인트 최적 주파수 범위
| 신호 타입 | 포인트 수 | 최적 범위 |
| 계수 | 7 | [4, 44] |
| 실수부 | 7 | [3, 30] |
| 허수부 | 7 | [20, 255] |
이들 데이타를 신속하게 수득할 수 있도록 하기 위해, 멀티사인 기법을 채택하여, 필요한 다중 주파수들을 동시에 FFT를 이용하여 적용함으로써, 결과를 분석하고, 이들 데이타를 추출하였다. 도 3은, 기존에 사용된 단일 사인들의 순차적인 적용 방법에 대한 EIS 극좌표선도를, 단백질 마크로전극 실험 시스템에서 5 멀티사인 (10 주파수) 및 15 멀티사인 (20 주파수) EIS 측정 시의 측정된 반응과 비교하여 도시한다. 순차적인 적용을 위해 수 분간, 5 사인의 경우 약 7초, 15 사인의 경우에는 약 23초간, 실험 데이타 수집, 분석 및 디스플레이를 PC 상에서 달성하였다. 이 멀티사인 실험의 구성 주파수는 통계적 분석을 통해 결정된 주파수 범위에 걸쳐 있도록 선정되었으며, 이는 도시된 EIS 극좌표선도에서 반구형의 전하 전이 특징을 포괄한다. 전체 데이타의 매우 엄밀한 일치 (전형적으로 0.05% 이내)는, 멀티사인 EIS 방식이, 측정 정확성을 떨어뜨리지 않고도, EIS 측정 및 분석에 호환가능한 EIS 파라미터를 (즉, TTR을) 수초내에 매우 신속하게 추출한다는 것을 의미한다.
실시예 2 - EIS를 이용한 실시간 카이네틱스 측정에 대한 연구
본 실시예에서는, Abtech 사의 시판 금 IDE에서 프로브-타겟 혼성화에 대한 동역학을 조사하였다. 전기화학적 클리닝 사이클을 이용하여, IDE 쌍의 전극 양쪽에, 50 mM H2SO4 수용액 중에서 Ag/AgCl에 대해 -0.6 V 내지 +1.65 V의 선형 전위 스윕을 스윕 속도 50 mV로 30-40 전체 사이클 동안, 클린 금 전극의 안정적인 순환 전압전류도 (CV) 특징이 확인될 때까지 적용하였다. DNA (69 mer ITI 021) 용액을 준비하기 전에, 다이설파이드 보호된 뉴클레오티드를 TCEP 5 mM 용액으로 절단한 후, MicroSpinTM G-25 컬럼 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)에 통과시켜, DNA 프로브를 정제하였다.
클리닝 직후, 티올-DNA 프로브 층을, 2x SSC 완충액 중의 10 μM DNA 용액과, [Fe(CN)6]3- 및 [Fe(CN)6]4- (10 mM [Fe(CN)6]3-/4-) 각 10 mM에 실온에서 침지하였다. 전극을 DNA 용액에 침지 즉시 EIS 측정을 시작하였으며, 3-4시간 동안 반응되게 두었다. 앞서와 같이, [Fe(CN)6]3-와 [Fe(CN)6]4-가 동일 농도로 존재하는 것은 각 전극의 DC 전위가 [Fe(CN)6]3-/4-의 환원 전위로 고정되게 하므로, 실험 전반적으로, IDE 쌍의 전극들 간에 10 mV RMS 진폭의 시누소이드 전압을 DC 전압 0 V로 적용하였다. 그런 후, 변형된 표면을 수 분간 2x SSC로 헹군 다음 30분간 수중 MCH 1 mM로 실온에서 차단하였다. 2x SSC 완충액으로 10-20분간 헹군 후, 전극의 EIS 신호를 다시 10 mM [Fe(CN)6]3-/4- 2x SSC 완충액에서 측정하여, 차단 공정 이후의 변화를 확인하였다. 그 후, 전극을, 2x SSC에 용해되고 10 mM [Fe(CN)6]3-/4-가 첨가된 타겟 (상보적인 또는 비-상보적인) DNA 용액에 침지하여, 다시 0 V DC에서 EIS를 측정하였다.
도 4는 상보적인 타겟 (ITI 025) 1 mM과의 혼성화 전과 후에, 이들 69-mer 티올-DNA로 변형된 프로브 전극의 전형적인 임피던스 그래프를 보여준다. 고 주파수 반원은 마크로 전극과 IDE 전극 둘다에서 일반적인 특성이며, 전극 표면에서 프로브 필름 층을 통한 전하 전이에 대한 정보를 제공해준다. 상보적인 타겟을 1 μM로 첨가한 후, 이 고 주파수의 반원의 직경은 예상한 바와 같이, 프로브 층에서의 상보적인 타겟-프로브 결합으로 인해 증가하는 반면, 저 주파수 분포 특징은 기본적으로 변화가 없었는데, 이는 (예상한 바와 같이) 전극들 간의 전파에는 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
도 5는 동일한 방식으로 준비한 IDE의 다른 예를 보여준다. 이 사례에서, 차단 후, 음성 대조군을 수행하였으며, 수 시간 동안 EIS를 비-상보적인 (ITI 012) 타겟 1 μM과 10 mM [Fe(CN)6]3-/4-이 첨가된 2x SSC 용액에서 모니터링하였다. 예상대로, 임피던스 신호에서는 변화가 관찰되지 않아, 비-상보적인 타겟과 프로브가 결합하지 않은 것으로 확인되었다. 이 후, 전극을 2x SSC 완충액으로 헹구고, 2x SSC 중의 1 nM 상보적인 타겟 DNA 및 10 mM [Fe(CN)6]3-/4- 용액에서 반응을 측정하였다. 1시간 후, 반응이 안정되었을 때, 전극을 50 nM 타겟 용액에 침지하여, 밤새 측정하였다. 프로브와 1 nM 타겟 간의 차이는 작지만 유의한 반면, 50 nM에서는 쉽게 확인된다. 따라서, EIS는 평형화되길 기다리는 확립된 방법을 이용하여 상보적인 타겟 결합을 탐침한다.
도 6은 실시간으로 행해진 전형적인 EIS 측정 결과를 보여주는 것으로, 프로브 필름 형성 및 프로브-타겟 혼성화에 민감한 파라미터는 [Fe(CN)6]3-/4-의 경우 전자 이동 저항, Ret이며, 이는 EIS 스펙트럼 각각의 극좌표선도의 반구 피처의 폭으로부터 계산된다. 이는 도 6에서 시간에 따라 그래프로 작성되었다 (전자 이동에 대한 Ret로서).
이들 데이타에는 많은 정보들이 담겨 있으며, 프로브 필름 (◇), 차단 및 세척 (□), 그리고 프로브-타겟 혼성화 카이네틱스 (△)의 확립을 보여준다. 금 전극이 프로브 필름 용액 (◇)에 노출되면, Ret 값은 프로브 필름 형성으로 인해 처음 한 시간 정도 동안 증가한 다음, 3-4시간 후에는 정상 상태 값(steady-state value)까지 감소하는데, 이는 안정적인 표면 필름을 시사한다. 프로브 용액을 제거하고 헹구었으나, 관찰 값에는 거의 변화가 없었으므로, 상기한 사실이 검증되었다. 또한 임의의 남아있는 금 표면을 차단하기 위해 머캅토헥사놀 (MCH)을 첨가하면, [Fe(CN)6]3-/4-가 첨가된 완충액에서 경시적으로 저항을 측정한 것과 같이, 저항은 거의 변화가 없었는데 (□), 이 역시 안정적인 프로브 필름을 시사한다. 안정적인 프로브 필름이 확인되면, 카이네틱 기법을 이용하여 상보적인 타겟과 페릭/페로시아니드가 첨가된 용액 중에서 프로브-타겟 결합을 모니터링한다. 프로브 필름이 상기 용액에 노출되면 (△), 상보적인 타겟과 프로브의 결합으로 인해 Ret의 즉각적인 증가가 관찰된다. 초기 반응은 즉각적이며, 제1 포인트는 Ret 증가를 나타내며, 처음 한시간 이내에 그 값이 2배 이상으로 증가한다. 이 방법은, 수 초마다 동역학적으로 EIS 반응을 측정할 수 있다 (멀티사인 IDF 참조). 프로브-타겟의 결합 증가율은 전형적으로 타겟 농도에 일차적 (그리고 확실히 의존적)일 것으로 예상되며; 따라서, EIS 증가율 분석으로 수초 내지 수분의 시간대에 타겟 농도를 제시할 수 있다. 임피던스는 이후, 평형 측정의 TTR을 제한하는 장시간의 평형 반응에 도달하는 방식을 나타내는, 수 시간에 걸쳐 보다 천천히 증가한다는 점에서 만족스럽다. 타겟 용액을 제거하고, 세척 및 측정시, [Fe(CN)6]3-/4-이 첨가된 완충액에서 반응을 측정하면 (○), Ret의 일시적인 변화 후, 앞서 관찰된 수치로 다시 회복되는데, 이는 반응이 프로브-타겟의 결합을 표시한다는 것을 보여준다.
프로브 층 형성 및 혼성화가 금 전극 상에서 이루어진 것인지를 검증하기 위해, 바이오틴-표지된 타겟을 이용하였고, 이를 스트렙타비딘-표지된 Qdots (QD 완충액 중의 20 nM)와 함께 인큐베이션하였다.
수득한 형광 이미지 (도 7)에서, 예상한 바와 같이, 최고 형광 세기 영역이 IDE의 금 핑거 위라는 것이 명확하게 확인된다. 이는, 혼성화 이후에 관찰되는 Ret 강화가 금 IDE 표면 상의 필름에서의 프로브-타겟의 혼성화가 원인이라는 것을 재확인시켜 준다.
실시예 3 - DNA 프로브와 PNA 프로브의 비교
DNA 프로브에 대한 EIS 프로토콜 (도 9)
금 마크로디스크 전극을 세척한 후, 1 M NaCl + 5 mM MgCl2 + 1 mM EDTA 중의 200 nM 티올-변형된 올리고뉴클레오티드 용액 + 800 mM 머캅토헥사놀 용액과 함께 16시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 티올-변형된 올리고뉴클레오티드는 머캅토에틸 보호기를 가진 다이설파이드로서 제조사로부터 제공받았다. 이 머캅토에틸 보호기는, 고정화 이전에, 30분간 5 mM TCEP와 함께 인큐베이션한 후, Illustra 스핀 G-25 마이크로 컬럼 (GE Healthcare)을 이용한 겔 추출 클린-업을 수행하여, 제거하였다. 프로브가 고정된 전극을 1 mM 머캅토헥사놀 수용액으로 30℃에서 1시간 동안 차단하였다. 그런 후, 전극을 고정화 완충액 (1 M NaCl + 5 mM MgCl2 + 1 mM EDTA), 1 x PBS 및 1x PBS + 10 mM EDTA로 각각 10분씩 세척하였다.
Autolab potentiostat (Metrohm, Runcorn, UK)가 연결된 Ag/AgCl 기준 전극과 백금 와이어 카운터 전극 (둘다 Metrohm (Runcorn, UK)에서 구입함)을 이용한 3 전극 시스템으로, 혼성화 전과 후에 EIS 측정을 수행하였다. EIS 측정은 0.24 V에서 진폭 10 mV, 주파수 범위 100,000 Hz-0.1 Hz (주파수 15종)로, 1 mM K3[Fe(CN)6] + 60 mM KCl 중에서 수행하였다. 전극을 2x SSC 중에서 1 μM 상보적인 인공 타겟 (20 mer 올리고뉴클레오티드)과 2시간 동안 50℃에서 혼성화하거나, 타겟 없이 혼성화 완충액만 첨가하여 (음성 대조군) 각각 혼성화하였다. 혼성화 후, 전극을 2x SSC, 0.2x SSC 용액 및 EIS 측정 완충액으로 각각 10분씩 헹구었다.
PNA 프로브용 EIS 프로토콜 (도 10)
금 마크로디스크 전극을 세척한 후, 30℃에서 10분간 인큐베이션한 후, 50% (v/v) DMSO 중의 1.5 μM 티올-변형된 PNA 용액 + 30 μM 머캅토헥사놀 용액과 함께, 16시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 전극을 50% (v/v) DMSO로 헹구고, 50% (v/v) DMSO 중의 1 mM 머캅토헥사놀에서 1시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 전극을 50% (v/v) DMSO와 EIS 측정 완충액 (0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 10 mM 포스페이트 완충액으로 각각 10분씩 헹구었다.
Autolab potentiostat (Metrohm, Runcorn, UK)가 연결된 Ag/AgCl 기준 전극과 백금 와이어 카운터 전극 (둘다 Metrohm (Runcorn, UK)에서 구입함)을 이용한 3 전극 시스템으로, 혼성화 전과 후에 EIS 측정을 수행하였다. EIS 측정은 0.24 V에서 진폭 10 mV, 주파수 범위 100,000 Hz-0.1 Hz (주파수 15종)로, 0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 10 mM 포스페이트 완충액 중에서 수행하였다.
전극을 2x SSC 중에서 1 μM 상보적인 인공 타겟 (20 mer 올리고뉴클레오티드) 및 1 μM 비-상보적인 인공 타겟 (20 mer 올리고뉴클레오티드)과 2시간 동안 50℃에서 혼성화하거나, 타겟 없이 혼성화 완충액만 첨가하여 (음성 대조군) 각각 혼성화하였다. 혼성화 후, 전극을 2x SSC, 0.2x SSC 용액 및 EIS 측정 완충액으로 각각 10분씩 헹구었다.
실시예 4 - E. coli rRNA 검출 (도 11)
PNA 프로브를 이용한 RNA 검출을 위한 EIS 프로토콜
금 마크로디스크 전극을 세척한 후, 30℃에서 10분간 인큐베이션한 후, 50% (v/v) DMSO 중의 1.5 μM 티올-변형된 PNA 용액 + 30 μM 머캅토헥사놀 용액과 함께, 16시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 전극을 50% (v/v) DMSO로 헹구고, 50% (v/v) DMSO 중의 1 mM 머캅토헥사놀에서 1시간 동안 30℃에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 전극을 50% (v/v) DMSO와 EIS 측정 완충액 (0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 10 mM 포스페이트 완충액으로 각각 10분씩 헹구었다.
Autolab potentiostat (Metrohm, Runcorn, UK)가 연결된 Ag/AgCl 기준 전극과 백금 와이어 카운터 전극 (둘다 Metrohm (Runcorn, UK)에서 구입함)을 이용한 3 전극 시스템으로, 혼성화 전과 후에 EIS 측정을 수행하였다. EIS 측정은 0.24 V에서 진폭 10 mV, 주파수 범위 100,000 Hz-0.1 Hz (주파수 15종)로, 0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 10 mM 포스페이트 완충액 중에서 수행하였다.
전극을 2x SSC 중에서 핵산 타겟 용액과 2시간 동안 50℃에서 혼성화하였다. E. coli에서 추출한 리보좀 16S RNA를 전장 rRNA로 적용하였다. 혼성화 후, 전극을 2x SSC, 0.2x SSC 용액 및 EIS 측정 완충액으로 각각 10분씩 헹구었다.
RNA 추출 프로토콜
● 2.5 mL 루리아-베타니 (LB: Luria-Bertani) 배지 (10 g/L 박토-트립톤, 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L NaCl)에 LB 아가 플레이트에서 취한 E. coli DH10β 콜로니를 접종하여, 교반 배양기에서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
● 15 mg/ml 라이소자임이 함유된 TE 완충액을 제조한다.
● RNA 프로텍트 박테리아 시약 2 부피를 박테리아 배양물 1 부피에 첨가하여, 즉시 볼텍싱한 다음, 실온에서 5분간 인큐베이션한다.
● 10분간 13,500 rpm에서 원심분리하고, 상층물을 제거한다.
● 10-20 ㎕의 QIAGEN 프로테아제 K를, 라이소자임이 첨가된 TE 완충액 200 ㎕에 첨가하고, 피펫팅으로 펠렛을 재현탁한다.
● 롤러 믹서에서 30분간 실온에서 인큐베이션한다.
● 완충액 RLT를 700 ㎕ 첨가하여, 왕성하게 볼텍싱한다. 백색 침전물이 있으면, 13,500 rpm에서 원심분리하여 상층물을 다음 단계에 사용한다.
● 100% 에탄올 500 ㎕를 첨가하여, 왕성하게 교반한다.
● 라이세이트 700 ㎕를 2 ml 콜렉션 튜브 안의 RNeasy 미니 스핀 컬럼으로 이동시켜, 30초간 13,500 rpm으로 원심분리한다. 플로우 스루 (flow through)는 버리고, 나머지 샘플을 첨가하여 다시 원심분리한다. 플로우 스루를 제거한다.
● RW1 350 ㎕를 스핀 컬럼에 넣고, 30초간 13,500 rpm에서 원심분리하고, 플로우 스루는 제거한다.
● DNase I 스톡 용액 10 ㎕, 완충액 RDD 70 ㎕을 혼합하여, 뒤집어 스핀 다운한다. 이 용액 80 ㎕를 바로 컬럼에 넣고, 실온에서 15분간 인큐베이션한다.
● 완충액 RW1 350 ㎕를 RNeasy 스핀 컬럼에 넣고, 다시 5분간 인큐베이션한다.
● 30초간 13,500 rpm으로 원심분리하고, 플로우-스루를 버린다.
● 컬럼을 2 ml 튜브로 옮기고, RPE 완충액 500 ㎕을 이 컬럼에 첨가한다. 이를 30초간 13,500 rpm으로 원심분리한다.
● 이 단계를 반복하고, 2분간 13,500 rpm으로 원심분리한다.
● 탈이온수 30 ㎕로 rRNA를 용출시켜, 나노드롭(nanodrop)으로 정량한다.
실시예 5 - 본 발명의 방법을 이용한 MRSA gDNA의 검출 (도 12)
금 전극을 백금 카운터 및 은/은클로라이드 기준 전극을 이용한 3 전극 시스템에 사용하였다. 금 전극 표면을 순환 전압전류법으로 0.1 M H2SO4 중에서 세척하고, 전위 0 - 1.6 V에서 10회, 전위 0 - 1.3 V에서 10회 0.1 V/s의 스캔 속도로 스캔하였다. 금 마크로 전극의 경우에는, 추가적인 클리닝 단계를 순화 전압전류법 앞으로 프로토콜에 포함시켰으며, 이 단계는 1) 알루미나 슬러리를 이용한 전극 폴리싱 및 2) 10분간 피라냐 용액에 전극 침지이다.
세척 후, 금 전극을 50% (v/v) DMSO 중의 1.5 μM 티올-변형된 PNA 용액 + 30 μM 머캅토헥사놀 용액과 함께, 16시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 1시간 동안 1 mM 머캅토헥사놀 중에서 인큐베이션하여 차단을 수행하였다. 차단 완료 후, 전극을 50% (v/v) DMSO에서 2시간, 그리고 EIS 측정 완충액 (0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 0.1 mM K4[Fe(CN)6] + pH 7.0 10 mM 포스페이트 완충액)으로 헹구었다.
메티실린 내성의 스타필로코커스 아우레우스 (MRSA)와 메티실린 감수성 스타필로코커스 아우레우스 (MSSA)의 gDNA를 수득하기 위해, 박테리아를 콜롬비아 혈액 아가에서 서브배양하고, CO2 분위기에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 식염수에 접종하고, 광학 밀도를 Densicheck (bioMerieux)로 측정하였다. 이는 현탁물내 박테리아의 세포 농도에 비례하는 McFarland 단위로 값을 나타낸다. 대략 108 세포/mL의 식염수내 박테리아 세포 현탁물 또는 모의 상처액 (MWF: mock wound fluid)을 이런 방식으로 준비하고, 이 현탁물로부터 102 세포/mL까지 희석한 10배수 희석물을 제작하였다.
상기 현탁물 1 mL을 10분 간 5000x g로 원심분리하여, 박테리아 세포를 펠렛화하였다. 상층액은 버리고, 박테리아 펠렛을 효소적 세포용혈 완충액 (2 x TE 완충액, 1.2% Triton X, 50 ㎍/mL 리소스타핀) 200 ㎕에 재현탁한 다음 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 박테리아 용혈물 200 ㎕를 프로테아제 K 20 ㎕에 첨가하고, bioMerieux NucliSens easyMAG 자동 플랫폼을 이용하여 DNA를 추출하였다. 세포용혈 완충액에서, 세포 물질로부터 핵산을 정제하고 추출하는 경우에 단백질 변성제로서 작용하는 구아니딘 티오시아네이트는 카오트로픽 활성 염 (active chaotropic agent)이었다. 정제한 핵산 용액을 자기 실리카 펠렛은 둔 상태로 바셀에서 취하여, 물 100 ㎕에 DNA를 용리시켰다.
EIS 측정은 0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 0.1 mM K4[Fe(CN)6] + 10 mM 포스페이트 완충액 중에서, DC 전위 0.24 V, 진폭 10 mV rms, 주파수 범위 100,000 Hz-0.1 Hz (주파수 15종)를 이용하여 수행하였다. MRSA gDNA 샘플은, 샘플 45 ㎕를 20x SSC 5 ㎕과 혼합한 후 95℃에서 5분간 열처리한 다음 얼음 위에서 2분 둔 후 다시 25℃에서 5분간 열처리함으로써, 준비하였다. 전극을 샘플과 함께 55℃에서 2시간 동안 교반 (650 rpm)하면서 인큐베이션하였다. 샘플과 인큐베이션한 후, 전극을 2x SSC, 0.2x SSC 및 EIS 측정 완충액으로 각각 10분씩 세척하였다. EIS 측정은 혼성화 전과 후에 수행하였다.
모의 상처 체액 (MWF)의 준비
링거 (Krebs) 용액:
● 118.4 mM NaCl (mwt 58.44 ~ 6.91g/l)
● 4.7 mM KCl (mwt 74.56 ~ 0.350g/l)
● 2.52 mM CaCl2 (mwt 147.02 ~ 0.370g/l)
● 1.18 mM MgSO4 (mwt 246.5 ~ 0.290g/l)
● 1.18 mM KH2PO4 (mwt 136.09 ~ 0.160g/l)
● 25 mM NaHCO3 (mwt 84.01 ~ 2.10g/l)
● pH 7.4
구성 성분들을 모두 탈이온수 900 ml에 용해하고, 용액의 pH를 7.4로 조정한다. 탈이온수로 총 부피 1 L로 맞춘 다음, 사용하기 전에 pH를 재확인한다. 링거액을 소 태아 혈청 (Gibco ref 16000-036)과 1:1로 혼합하여, 모의 상처 체액을 제조한다.
실시예 6 - 온라인 EIS 실험
전극 준비 및 측정 정보
온라인 검출을 위해, 스크린이 인쇄된 금 전극 (작업 전극 직경 1.6 mm)을 DropSens (Oviedo, Spain)에서 구입하였다. 각 전극을 0.1 M H2SO4에서의 순환 전압전류법을 통해 미리-헹구었다. 전극 전위는 20회의 사이클 동안에 0 - 1.6 V에서 스캔하였으며, 표면에 형성되는 거품들은 모두 파이펫으로 제거하는데 주의를 기울였다. 2번째 라운드의 0.1 M H2SO4에서의 세척을 수행하였으며, 이때 순환 전압전률법을 다시 수행하였으며, 전극은 20회 사이클 동안 0 - 1.3 V의 전위에서 스캔하였다. 마지막으로, 전극을 탈이온수로 충분히 헹군 다음 질소 기류 하에 건조하였다. 세척 후, 스크린 인쇄 전극을 50% (v/v) DMSO 중의 1.5 μM 티올-변형된 PNA 용액 + 30 μM 머캅토헥사놀 용액과 함께 습한 챔버 안에서 16시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 표면을 차단하기 위해, 전극을 50% (v/v) DMSO로 헹군 다음, 50% (v/v) DMSO 중의 1 mM 머캅토헥사놀에서 습한 챔버 안에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 끝으로, 전극을 50% (v/v) DMSO 및 EIS 측정 완충액 (0.1 mM K4[Fe(CN)6] + 0.1 mM K3[Fe(CN)6] + pH 7.0 10 mM 포스페이트 완충액로 헹구었다. 온라인 EIS 측정은 Autolab potentiostat가 연결된 스크린 인쇄 전극 (WE - Au, CE - Pt, RE - Ag)으로 수행하였다. EIS 측정은 0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 0.1 mM K4[Fe(CN)6] + pH 7.0 10 mM 포스페이트 완충액 중에서, DC 전위 0.03 V, 진폭 10 mV rms, 주파수 범위 100,000 Hz-0.1 Hz (주파수 15종)를 이용하여 수행하였다.
DNA 단편화 실험
사전 열 처리 후 DNA 샘플의 거동을 분석하였다. 이는, 샘플 단편화가 EIS결과에 영향을 미치는 지를 보기 위해 행하였다. 본 실험들은 Agilent 2100 Expert Bioanalyzer (Agilent Technologies; Palo Alto, CA, USA)에서 수행하였다. 분리된 박테리아 gDNA 샘플은, 순수물과 2x SSC를 비롯한 다양한 용액 중에서 0, 1 또는 5분간 95℃로 열처리함으로써 준비하였다. 처리 후, 샘플 1 ㎕를 DNA 500 Labchip kit (Agilent Technologies; Palo Alto, CA, USA) 상의 각 웰에 주입하였다. 각 칩에는 웰이 12개가 포함되어 있으며, 전기영동하기 전에 필요에 따라 주입하였다. 자동 전기영동 프로그램이 종료되면, 결과를 전용 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 이로써 각 피크들의 분석 및 위치를 확인할 수 있었으며, 또한 피크 면적을 구하기 위해 적분하여 DNA를 정량화하였다.
스페이서 분자의 화학 구조
전극 표면에서의 혼성화 효율을 개선하기 위해 PNA 프로브에 스페이서 분자를 병합하였다. AEEA (프로브 01) 및 AEEEA (프로브 02) 에틸렌 글리콜 링커들의 화학 구조는 다음과 같다:
AEEA 링커 -1.3 nm & 원자 9개
AEEEA 링커 -1.8 nm & 원자 12개
결과
gDNA 샘플의 qPCR 및 정량화
게놈 DNA 샘플은 2 단계로 준비하였다:
1) 상처 체액에 접종한 108 세포/mL (1 McFarland standard)의 MRSA 샘플로부터 gDNA를 추출하였다. 그런 후, 수득한 DNA를 108 - 102 세포/mL의 농도 범위에 해당되도록 1:10으로 연속 희석하였다.
2) MRSA를 상처 체액에서 108 세포/mL로 배양한 다음, 상처 체액에서 1:10으로 연속 희석하여 108 - 102 세포/mL 범위의 조제물들을 제공하였다. DNA 추출 공정을 각 농도의 MRSA에서 수행하였다.
그 후, qPCR을 2가지 방법을 이용하여 준비한 샘플에 대해 수행하였으며, 방법 1을 이용하여 준비한 샘플에서 사이클 역치가 더 낮았으며 높은 수준의 직선성이 확인되었다. 이는, 108 세포/mL의 배양물로부터 추출한 gDNA의 희석이, MRSA 배양물을 희석한 후 DNA 추출한 것에 비해 보다 신뢰성있는 희석 연속물이 제작된다는 것을 의미한다. 그 결과는 도 13에 나타낸다.
EIS 데이타에서 관찰되는 모든 변화들을 더 잘 이해하기 위해, 게놈 DNA 추출물을 나노드롭 스펙트로포토미터를 이용하여 정량하였다. (표 3 참조). MRSA 게놈 DNA의 수율은 인간 상처 체액에서만 회수한 수준에서는 상당한 편차가 있다는 것을 알 수 있다. DNA 추출 공정의 이질적인 특성이 EIS 데이타에서 관찰되는 편차의 원인인 것으로 보인다. 데이타의 양호한 재현성을 확보하기 위한 노력들이 이루어졌다. 도 14 (도 14는 상처 체액의 108 세포/mL MRSA로부터 추출시 gDNA 수율 편차를 입증해주는 qPCR 데이타를 도시함)에 나타낸 바와 같이, 재현성은 상처 체액의 단일 배치에서 양호하였다. 배치별 편차가 높았으며, 이는 인간 상처 체액의 가변성 특성과 MRSA 세포 벽을 리소타핀으로 효소적으로 분해하는 공정에 내재된 MRSA 집합체 및 가변성 등의 다른 실험적인 인자로 인한 것일 수 있다.
표 3: 나노드롭을 이용한 MRSA의 총 DNA의 정량
현장현시검사를 위한 프로토타입 정전위기
현장현시검사를 고려하면서, 프로토타입 정전위기를 설계 및 조립하였다. 정전위기는 총 US$200 미만을 들여 부품들을 조립하였으며, 주파수 범위 100,000 - 0.1 Hz에서의 위상 및 규모 변화를 측정할 수 있었다. 이 시스템을 먼저 충분히 상보적인 짧은 인공 타겟을 이용하여 평가하였으며, 타겟을 투입한 후 전하 이동 저항 증가가 관찰가능하다는 것을 확인하였다. 도 15는 (A) 프로토타입 정전위기 사진과, (B) 23 bp의 충분히 상보적인 올리고뉴클레오티드 (1 μM)를 도입하기 전과 도입한지 10분째의 극좌표선도를 도시한다.
DNA 단편화
도 16 A, B & C는 95℃에서 각각 0, 1 및 5분간 열 처리한 후 MRSA gDNA에 대한 바이오분석 데이타를 도시한다. 열 변성 시간이 보다 짧은 DNA 단편의 생산과 부합함을 알 수 있다. 또한, 비슷한 샘플들을 겔 전기영동으로 분석하였으나 (도 17), DNA 단편화가 열 처리한 단편들에서 관찰되었지만 크기 순 배열은 샘플의 스미어링으로 인해 불가능하였다.
실시예 7 - 추가적인 EIS 실험
재료 및 방법
DNA 올리고뉴클레오티드는 Metabion (Martinsried, Germany)에서 구입하였다. PNA 올리고뉴클레오티드는 Panagene (Daejeon, South Korea) 사에서 Cambridge Research Biochemicals (Cleveland, UK)을 통해 주문하였다. PCR 키트와 DNeasy 혈액 및 조직 키트는 Qiagen (Crawley, UK) 사에서 구입하였다. 포타슘 페리시아니드, 포타슘 페로시아니드, 소듐 식염수 (saline) 사이트레이트 (SSC), 모노소듐 포스페이트, 다이소듐 포스페이트 및 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)는 Sigma Aldrich (Poole, UK)에서 구입하였다. 람다 엑소뉴클레아제 (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) 탈이온수를 실험 전체에서 사용하였다 (>18 MΩ).
표 4. 실험에서 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열 및 구조
| 올리고 명 | 타입 | 3' 변형 | 5' 변형 | 서열 5'-3' | |
| 1 | P48 mecA | DNA | - | 티올-C6 | ACTAGGTGTTGGTGAAGATATACC |
| 2 | mecA 프라이머 1 | DNA | - | - | AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC |
| 3 | mecA 프라이머 2 | DNA | - | - | AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC |
| 4 | PNA48 | PNA | - | 0.6 nm 티올-C6 | ACTAGGTGTTGGTGAAGATATAC |
| 5 | PNA 48_01 | PNA | - | 1.6 nm - 티올 - C6- AEEA | ACTAGGTGTTGGTGAAGATATAC |
| 5 | PNA 48_02 | PNA | - | 3.8 nm - 티올-C11-AEEEA | ACTAGGTGTTGGTGAAGATATAC |
| 6 | PNA 48_02 | PNA | - | 2 nm -티올-(His)6 | ACTAGGTGTTGGTGAAGATATAC |
스타필로코커스 아우레우스로부터 DNA 추출
박테리아를 콜롬비아 혈액 아가에서 서브배양하고, CO2 분위기에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 식염수에 접종하고, 광학 밀도를 Densicheck (bioMerieux)로 측정하였다. 이는 현탁물내 박테리아의 세포 농도에 비례하는 McFarland 단위로 값을 제시한다. 대략 108 세포/mL의 박테리아 세포 현탁물을 이런 방식으로 준비하고, 이 현탁물로부터 102 세포/mL까지 희석한 10배 희석물을 제작하였다. 실시간 PCR을 수행하여 희석 연속물들로부터 DNA 수율을 특정화하였다.
상기 현탁물 1 mL을 10분간 5000 x g에서 원심분리하여, 박테리아 세포를 펠렛화하였다. 상층액은 버리고, 박테리아 펠렛을 효소적 세포용혈 완충액 (2 x TE 완충액, 1.2% Triton X, 50 ㎍/mL 리소스타핀) 200 ㎕에 재현탁한 다음 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 박테리아 용혈물 200 ㎕를 프로테아제 K 20 ㎕에 첨가하고, bioMerieux NucliSens easyMAG 자동 플랫폼을 이용하여 DNA를 추출하였다. 세포용혈 완충액에서, 세포 물질로부터 핵산을 정제하고 추출하는 경우에 단백질 변성제로서 작용하는 구아니딘 티오시아네이트는 카오트로픽 활성 염 (active chaotropic agent)이었다. 정제한 핵산 용액을 자기 실리카 펠렛은 둔 상태로 바셀에서 취하여, 물 100 ㎕에 DNA를 용리시켰다.
전기화학적 임피던스 분광측정 (EIS)
금 디스크 전극 (2 mm diameter)은 IJ Cambria Scientific (Carms, UK) 사에서 구입하였다. 각각의 고체 금 작업 전극을, 0.05 ㎛ 알루미나 분말 (IJ Cambria Scientific (Carms, UK)을 이용하여 1분간 기계적으로 연마한 후, (임의의 남아있는 알루미나를 제거하기 위해) 물로 헹구고 1분간 초음파 수조에 침지한 다음, 피라냐 용액 (6 mL 진한 H2SO4 + 2 mL 30% (v/v) H2O2 용액)으로 헹궈, 충분히 미리 세정하였다. 그런 후, 전극을 물로 충분히 헹구고, 질소 기류 하에 건조하였다. 세정 후, 금 디스크 전극을 50% (v/v) DMSO 중의 1.5 μM 티올-변형된 PNA 용액 + 30 μM 머캅토헥사놀 용액과 함께, 30℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 전극을 50% (v/v) DMSO에서 헹구고, 50% (v/v) DMSO 중의 1 mM 머캅토헥사놀에서 1시간 30℃로 인큐베이션하였다. 그런 후, 전극을 50% (v/v) DMSO, 그리고 EIS 측정 완충액 (0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 0.1 mM K4[Fe(CN)6] + 10 mM 포스페이트 완충액)으로 각각 2시간 및 1시간 헹구었다.
배치 엔드 포인트 분석에서 EIS 측정은, FRA 소프트웨어 (Metrohm, Runcorn, UK)를 운영하는 Autolab potentiostat에 연결된 Ag/AgCl 기준 전극과 백금 와이어 카운터 전극 (둘다 Metrohm (Runcorn, UK)에서 구입함)을 이용한 3 전극 시스템으로 수행하였다. EIS 측정은 DC 전위 0.24 V에서 진폭 10 mV, 주파수 범위 100,000 Hz-0.1 Hz (주파수 15종)로, 0.1 mM K3[Fe(CN)6] + 0.1 mM K4[Fe(CN)6] + 10 mM 포스페이트 완충액 중에서 수행하였다. DNA 샘플은, 샘플 45 ㎕를 20x SSC 5 ㎕과 혼합한 후 95℃에서 5분간 열처리한 다음 얼음 위에서 2분 둔 후 다시 30℃에서 5분간 열처리함으로써, 준비하였다. 전극을 샘플과 함께 55℃에서 2시간 동안 교반 (650 rpm)하면서 인큐베이션하였다. 샘플과 인큐베이션한 후, 전극을 2x SSC, 0.2x SSC 및 EIS 측정 완충액으로 각각 10분씩 세척하였다. EIS 측정은 혼성화 전과 후에 수행하였다.
온라인 분석은 스크린 인쇄 전극을 이용하여 연속적인 EIS 측정값을 기록함으로써 수행하였다. Schott Nexterion의 16웰의 자가-부착성 슈퍼구조체 (Stafford, UK)에서 하나의 웰을 오려내, EIS 측정 완충액 50 ㎕이 존재하는 전극 주위에 장착하였다. 웰을 Schott Nexterion 상의 16웰 자가-부착성 슈퍼구조체 키트 (Stafford, UK)의 부착 뚜껑으로 밀폐하였다. 샘플 45 ㎕를 10x EIS 측정 완충액 5 ㎕와 혼합하고, 95℃에서 5분간 열처리한 다음 얼음 위에서 2분 둔 후 다시 30℃에서 5분간 열처리함으로써, 사전-처리하였다. 샘플이 준비되면, 전극 표면에서 EIS 측정 완충액을 제거하고, 50 ㎕ 샘플 + 측정 완충액으로 교체하였다. 부착 뚜껑을 다시 밀봉하고, EIS 측정을 계속하였다.
결과 및 고찰
예비 실험에서, mecA 유전자에 대한 프로브 서열을 동정하여, 550 bp mecA PCR 산물을 임피던스로 검출하기 위해 최적화하였다. 프로브 (P48)가, 마이크로어레이 시스템에서 DNA 형태로 또는 EIS 측정을 위한 PNA 형태에서 5' 배위로 mecA 서열에 결합하는데 가장 효과적인 것으로 확인되었다.
배치 엔드 포인트 분석 포맷에서 MRSA로부터 게놈 DNA의 직접 검출
EIS 측정은 전하 이동 저항 (RCT) 값을 수득하기 위해, 혼성화 전과 후에 수행하여, 극좌표선도 형태로 기록하였다 (도 18). 107 세포/mL 현탁물에서 추출한 MRSA gDNA와 인큐베이션한 후, RCT에 유의한 증가가 명확하게 확인되었다 (도 18). RCT 값을 구하기 위해, 데이타를 랜들스 회로 (도의 상단)를 이용하여 피팅하고, FRA Autolab 소프트웨어에서 피팅 기능을 수행하였다. RCT 피팅과 관련된 불확실성은 기록한 실험들에서 6-12% 범위였다. 특정 농도의 gDNA의 경우, 혼성화 후 수득한 RCT 값을 혼성화 전에 수득한 값으로 나누었다. 이는 RCT 출발 값의 편차를 보정하는 신호 증가의 척도로서 제시된 데이타를 표시한다. 이런 데이타를 나타낸 플롯은 y-축에 "신호 증가율"을 표시한다. 혼성화로 유발된 임피던스 증가를 나타내기 위한 비슷한 방법들이 저널 간행물들에서 사용되어 왔다. 적용 시, 표준 편차 (S.D)는 분산의 제곱근으로 정의된다.
혼성화 효율 - 프로브 서열내 여러가지 스페이서의 병합 효과
마이크로어레이 및 다른 표면을 이용한 DNA 검출 기법들에서, DNA 혼성화 동역학은, 표면 프로브의 용액 중에서 종들에 대한 접근성을 강화함으로써, 개선시킬 수 있다. 혼성화 동역학은 전극 표면에 매우 가깝게 위치한 프로브 서열에 의해 간섭받을 가능성이 있으므로, 오리지날 (P48)과 서열은 동일하지만 부가적인 스페이서 구성을 포함하는 프로브 3종 (01, 02 & 03)을 대상으로, 107 세포/mL 농도의 MRSA gDNA와 혼성화한 후 이의 반응을 테스트하였다. 프로브 스페이서의 상세 내용은 표 4에 나타낸다. 약어 AEEA는 에틸렌 글리콜 단위 2개를 포함하는 링커를 표시하며, 약어 AEEEA는 에틸렌 글리콜 단위 3개를 포함하는 링커를 표시한다. 스페이서 분자들의 화학 구조는 상기에 이미 기술되어 있다.
도 19는, 테스트한 프로브 4종 중 프로브 P48_02가 샘플과 인큐베이션한 후 최고 신호 증가율을 보였음을 나타낸다. C11 스페이서 (골격에 C 원자 11개를 가진 스페이서)는, 고체-액체 계면에서 DNA 결합 동역학을 개선하기 위해 시도하였을 때, 본 실험에서 가장 효과적인 것으로 입증되었다. C11 스페이서를 이용한 DNA 결합 동역학 강화는 훨씬 밀집하게 팩킹되고 더욱 질서정연하게 혼합된 필름 형성으로 인한 것이며, 가능성 있는 설명은 C11 스페이서에 의한 반 데르 발스 힘 증가가 원인인 것으로 생각된다. 또한, C11 스페이서와 조합하여 긴 PEG 분자를 사용하면, 프로브 분자의 유연성이 양호해지며, 프로브 서열이 전극 표면을 피복하는 알칸티올 필름 위로 확실히 돌출시킨다. 나머지 실험에서, 프로브 P48_02를 전극 표면 상의 인지 요소로서 사용하였다.
혼성화 효율 - 분석 성능에 대한 DNA 단편화 역할
본 실험에서, 107 세포/mL로 배양한 박테리아로부터 수득한 샘플을 전극과 2시간 인큐베이션한 다음 세척 및 측정하였다. 수반되는 겔 전기영동 실험을 수행하여, 샘플이 변성되는 동안의 DNA 단편화 정도를 평가하였다. 이는 0, 1 및 5분의 시간 동안, 75 또는 95℃의 온도에서 순수 물 또는 2x SSC 중에서, MRSA gDNA (107 세포/mL) 샘플을 열처리함으로써, 수행하였다. 샘플을 2x SSC에서 5분간 95℃로 열처리하였을 때, 관찰가능한 정도의 단편화가 발생되는 것으로 확인되었다 (도 20A & 20B). MRSA 게놈은 대략 2.8 Mb이다. MRSA로부터 추출한 무처리 gDNA에는 1000 - 15000 bp 범위의 큰 단편들이 포함되어 있었으며, 5분간 열 변성한 후 관찰되는 단편들은 평균적으로 약 120 bp인 것으로 확인되었다.
도 20에서, 게놈 DNA를 2x SSC에서 5분간 95℃에서 변성시키면 DNA 단편화 증가와 임피던스 신호 증가가 동시에 발생함을 알 수 있다. DNA 단편화 규칙은 혼성화 시간이 긴 유리 마이크로어레이에서 평가된 바 있지만, 게놈 DNA 결합에 대한 임피던스 검출은 조사된 바 없다. 95℃와 같은 고온에서의 DNA 인큐베이션이 긴 DNA 가닥의 단편화를 유발하며 PCR 효율을 낮춘다는 것은 공지되어 있다. 열에 의한 DNA 단편화는 가닥을 800 bp 미만으로 만드는 것으로 확인된 바 있다. 본 테스트에서 열 변성 후 수득되는 DNA는 단일 가닥일 수 있으며, 따라서, 전기영동 후 크기를 측정하였을 때 더 짧게 보인다. 95℃에서의 인큐베이션이 고분자량의 MRSA gDNA를 단편화하고, 그 결과 임피던스 신호를 향상시키는 것으로 여겨진다. 스페이서 선정 및 DNA 단편화의 역할에 대한 이해와 DNA 타겟에 대해 대략적인 크기를 알려주는 모세관 겔 전기영동 측정을 통해, MRSA gDNA에 대한 분석을 고안하고 평가하였다.
MRSA gDNA에 대한 배치 엔드 포인트 분석 개발
MRSA 배치 엔드 포인트 분석을 개발하였다. E. coil gDNA의 단편화와 비-특이적인 서열을 수득하기 위해, DNA 변성 시간 5분을 사용하였으며, 또한, 메티실린 감수성 스타필로코커스 아우레우스 (MSSA)도 테스트하여, 분석 특이도를 평가할 수 있었다. 테스트한 MRSA 농도는 103-108 세포/mL의 범위였다.
도 21A는 식염수에 접종한 MRSA 세포로부터 추출한 DNA로 MRSA gDNA 혼성화를 검출가능하다는 것을 보여준다. MRSA 세포/mL을 인큐베이션한 경우의 신호 증가율 0 + 표준편차 3인 정의를 이용하면, L.O.D는 106 세포/mL이었다. 이 결과의 유의성은, 추출한 DNA에 대해 PCR을 수행하지 않고도 mecA 유전자의 혼성화를 검출가능하다는 점이다. 106 세포/mL을 접종하고 추출한 샘플 유래의 최대 mecA 유전자 농도는 ~ 500 fM이었다.
MRSA gDNA에 대한 분석 특이도를 검증하기 위해, E. coli gDNA와, MRSA 검사에 상응하는 농도의 MSSA gDNA가 존재하는 조건에서 프로브 변형된 전극과 인큐베이션하였다. 도 21(B)는 이런 인큐베이션을 통해 신호 증가가 발생함을 보여주며, 이러한 신호 증가가 E. coli 및 MSSA gDNA 존재 시에는 관찰되지 않았음을 알 수 있다. 농도 3-6 pM은 107 세포/mL의 박테리아 현탁물로부터 추출한 DNA 수율에 해당하였다.
인간 상처 체액에 접종한 샘플에 대한 온라인 MRSA gDNA 검출 및 특이도 검사
gDNA의 결합을 실시간으로 그리고 간섭형 매트릭스의 존재 하에서도 검출하는 능력은 현장 진단 (point-of-care) 검사 측면에서 상당한 이점이 될 것이다. 이를 고려하여, 본 분석을 금 마크로디스크 전극에서 샘플 도입이 실온에서 작은 부피로 이루어질 수 있는 스크린 인쇄 전극으로 이동하였다. 스크린 인쇄 전극의 추가적인 이점은 이의 단가 (각 < $3)로, 현장 진단 검사에 매우 적합하다. 본 실험에서, EIS 측정은 연속적인 양상으로 수행하여, 대략 2분 마다 전체 극좌표선도를 수득하였다. EIS 측정 완충액 100 ㎕를 전극 상에서 인큐베이션하고, 일련의 베이스라인 측정 이후에, 미리 열 변성된 MRSA gDNA (5분간 95℃) 또는 상처 체액 조제물로부터 추출한 비슷하게 처리된 인간 DNA 100 ㎕로 교체하였다. 전하 이동 저항은 시간 대비로 그래프를 작성하였으며, 샘플 첨가 후 다양한 시간대에 신호 증가율을 측정하는 것이 가능하였으며 (도 22), 따라서 DNA 혼성화 공정과 관련된 결합 등온선을 수득할 수 있었다 (도 23).
도 22에서, 인간 상처 체액에 접종하여 회수한 MRSA gDNA는 인간 상처 체액의 연속 희석물들에서 추출한 DNA 샘플들에 비해 임피던스 신호를 훨씬 크게 증가시키는 것을 알 수 있다. 즉, 이러한 포맷에서, 추출한 인간 DNA에 의해 유발되는 백그라운드 신호 보다 높은 MRSA gDNA 혼성화를 측정할 수 있다. 도 23은 MRSA 및 E. coli gDNA를 동량으로 센서에 첨가하였을 때, 이 경우 특이적인 결합과 비-특이 결합을 식별할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 결과의 유의성은 MRSA 검출이 검출 시간이 훨씬 짧은 온라인 검사에서 가능한 것으로 확인된다는 점이다. 예를 들어, 도 22의 데이타는 샘플 첨가 후 10분간의 신호 증가를 나타내며, 도 23은 MRSA 및 E. coli 107 세포/mL 첨가 후 결합 곡선들의 갈라짐이 샘플 첨가 후 약 5분만에 식별됨을 보여준다.
보다 넓은 측면에서, 이러한 결과들은, MRSA gDNA 검출이 나노구조 또는 폴리머 층을 사용함으로써 전극의 변형 없이도 가능함을 보여준다. 부가적으로, 금 나노입자 및 단백질 G 등의 신호 강화 전략들이 EIS에 의한 PCR 산물 혼성화를 검출하는데 가능한 방법으로서 사용되고 있다. 본원에 상세하게 기술된 상대적으로 단순한 전극 준비 공정과 단백질 또는 나노입자 기반의 신호 증폭 단계 생략은 다른 다수의 전기화학적 검출 방법들에 비해 우월한 이점을 가진다.
스페이서 선정 및 타겟 단편화 시간에 대한 데이타는, 프로브 길이, 단편 길이 및 EIS 신호 간의 상관성이 존재함을 보여준다. 단편화 데이타는, 약 120 bp 길의 타겟 가닥 길이가 EIS 신호 증가를 유발하는 것으로 제시한다. EIS 기반의 핵산 검출에 대한 많은 문헌들에서는 짧은 (~20 bp) 인공적인 올리고뉴클레오티드를 이용하여 수득한 결과들을 보고하고 있다.
현 검출 방법의 상대적인 단순성 (및 프로토타입의 휴대용 정전위기가 벤치 탑 정전위기와의 등가성이 우수하며, 스크린 인쇄 전극과 함께 사용할 수 있으며, 비용이 US $200 미만이라는 점)은 이미 확인되었으며, 즉, 본 분석은 현장진단 시나리오를 구현하는데 매우 적합하다.
결론
MRSA를 표지물을 사용하지 않고도 검출하는 민감하고 특이적인 바이오센서가 입증되었다. PNA 프로브 서열을 사용함으로써 MRSA 게놈 DNA를 민감하게 검출할 수 있으며, 본 분석은 PCR 증폭 단계를 필요로하지 않는다. DNA 단편화와 전극 표면에서 프로브 서열까지의 거리는 분석 성능에 주요 인자인 것으로 확인된다. 단편들은 길이가 약 120 bp인 것으로 확인되었으며, 이는 EIS 실험들에서 전형적으로 보고된 DNA 서열들 보다 더 길다. MRSA gDNA의 검출은 마크로 금 전극에서의 배치 분석과 스크린 인쇄 전극들에서의 온라인 포맷에서 가능한 것으로 확인되었다. 또한, 인간 상처 체액 등의 간섭 매트릭스로부터 DNA를 추출할 경우에도 검출이 가능하였다.
Claims (45)
- 샘플에서 분석물을 검출하는 방법으로서,
상기 방법은,
(a) 샘플을 펩타이드 핵산 (PNA) 프로브와 접촉하는 단계;
(b) 상기 샘플에 대해 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS) 측정을 수행하는 단계;
(c) 상기 EIS 측정으로 분석물의 존재, 부재, 양 및/또는 실체(identity)를 결정하는 단계를 포함하며,
상기 분석물이 핵산을 포함하며;
상기 샘플을 취했을 때 샘플내 분석물의 양이, 상기 샘플에 대해 EIS 측정을 수행했을 때 샘플내 분석물의 양과 실질적으로 동일한 것을 특징으로 하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 단계 (b) 이전에, 상기 샘플에 대한 증폭 단계 및/또는 농축 단계가 수행되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분석물이 리보좀 RNA 및/또는 게놈 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 분석물 핵산이 1000 base (1 kb) 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (b) 이전에 PCR 단계가 수행되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (b) 이전에 RTPCR 단계가 수행되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
상기 단계 (b)가
(i) 분석물에 교류 전압을 인가하는 단계;
(ii) 상기 분석물 전체에서 EIS 측정값의 변화율을 확인하는 단계;
(iii) 상기 변화율 데이타로부터 상기 분석물의 존재, 부재, 실체 및/또는 양을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제7항에 있어서, 상기 EIS 측정값이 전자 이동 저항 (electron transfer resistance; Ret)의 측정값인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 EIS 측정값이 극좌표선도 (Nyquist plot)에서 반원 형상의 폭 확인을 통해 계산되는 측정값인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서,
상기 단계 (b)가
(i) 분석물에 교류 전압을 인가하는 단계로서, 상기 교류 전압이 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS)을 통해 상기 분석물의 존재를 구별하는데 충분한 복수의 중첩 주파수 (superimposed frequencies)들을 포함하는 것인, 단계; 및
(ii) EIS 데이타로부터 상기 분석물의 존재, 부재, 실체 및/또는 양을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제10항에 있어서,
EIS 데이타가 복수 임피던스 (x + iy)로부터 유래되는 데이타 파라미터들을 포함하며,
상기 파라미터들이 하기 파라미터들 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
● 실수부 (real component) (x)
● 허수부 (imaginary component) (y)
● 계수 또는 절대값 [r = |z| = (x2 + y2)½]
● 각도 [θ = tan-1(y/x)]
● 주 성분 (Principal component) 1
● 주 성분 2 - 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 복수의 주파수들이 단계 (a) 이전에 통계 분석 및/또는 실험적인 방법을 통해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 중첩 주파수들의 최소 갯수가 2-20개인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 중첩 주파수들의 갯수가 적어도 3-10개인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 중첩 주파수의 갯수가 7개 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (b)가 EIS 데이타에 대해 푸리에 변환 (Fourier transform)을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서, EIS 측정시 보조제 (aid)로서 시스템에 전해질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 전해질이 전이 금속 착물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 전이 금속 착물이 [Fe(CN)6]3-/4- 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한항에 있어서, EIS 측정시 보조제로서 시스템에 액체 매질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 액체 매질이 산성 또는 염기성 매질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한항에 있어서,
상기 방법이 2종 이상의 분석물을 분석하기 위한 것이며, 하나 이상의 표지물로 각각의 분석물을 표지하여 그 표지물을 통해 서로 구별가능하게 표지된 분석물을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 표지물이 광학 검출 및/또는 전기적 검출에 적합한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 표지물이 나노입자, 단일 분자, 화학발광성 효소 및 형광단 (fluorophore)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 표지물이 분자 및/또는 원자의 콜렉션을 포함하는 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 나노입자가 금속, 금속 나노셀, 금속 바이너리 화합물, 양자점으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항 내지 제26항 중 어느 한항에 있어서, 상기 광학 검출이 발광 검출 (optical emission detection), 흡광 검출 (optical absorbance detection), 광 산란 검출 (optical scattering detection), 스펙트럼 쉬프트 검출 (spectral shift detection), 표면 플라스몬 공명 이미징 (surface plasmon resonance imaging) 및 흡착 염료로부터 표면-강화성 라만 산란 (surface-enhanced Raman scattering from adsorbed dyes)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항 내지 제27항 중 어느 한항에 있어서,
상기 광학 검출이 발광 검출이며,
상기 표지된 분석물에 표지물을 여기시킬 수 있는 광을 조사하는 단계 및 상기 표지물로부터 광 방출 주파수와 강도를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제28항에 있어서, 상기 광이 레이저 광인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 광이 적외선 광, 가시광 및 UV 광으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 광이 백색 광인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한항에 있어서, 상기 PNA 프로브가 스페이서 영역과 PNA 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 스페이서 영역이 상기 스페이서를 표면에 부착시킬 수 있는 말단 기; 알킬 기; 에테르 기; 및 카르보닐 기로부터 선택되는 2 이상의 기를 포함하거나, 및/또는 상기 스페이서 영역이 그 골격(backbone)에 3개 이상의 원자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 스페이서 영역이 하기 식을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
상기 식에서,
T는 표면에 부착할 수 있는 말단 기이고;
R1, R2, R3 R4, R5 및 R6는 각각 독립적으로 유기 기들이고;
w는 0 또는 1의 정수이고;
x는 0-15의 정수이고;
y는 0-15의 정수이고;
z는 0 또는 1의 정수이고;
n은 0-10의 정수이고;
m은 0-15의 정수이되,
[n.m+w+x+y+z]는 3 이상임. - 제1항 내지 제34항 중 어느 한항에 있어서,
상기 방법은, 상기 단계 (a) 이전에 상기 샘플에 대해 샘플 준비 공정을 수행하는 단계를 더 포함하며,
상기 샘플 준비 공정은 상기 핵산의 단편화를 포함하며, 바람직하게는, 상기 샘플 준비 공정은 상기 샘플을 열처리하거나 및/또는 상기 샘플을 초음파처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제35항에 있어서, 상기 샘플 준비 공정은, 상기 핵산 서열의 평균 길이가 1000 bp (bp = 염기쌍) 이하, 800 bp 이하, 500 bp 이하, 20 bp 이상, 30 bp 이상, 40 bp 이상, 50 bp 이상 60 bp 이상 70 bp 이상, 80 bp 이상, 90 bp 이상, 100 bp 이상, 110 bp 이상, 120 bp 이상, 130 bp 이상, 140 bp 이상 또는 150 bp 이상, 20-800 bp, 30-600 bp, 40-500 bp, 50-400 bp, 60-350 bp, 70-300 bp, 80-250 bp, 90-200 bp, 100-180 bp, 또는 약 120 bp가 되도록, 상기 샘플내 상기 핵산을 단편화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 핵산을 포함하는 샘플에서 분석물을 검출하는 방법으로서,
상기 방법은
(a) 샘플에 대해, 핵산 단편화를 위한 샘플 준비 공정을 수행하는 단계;
(b) 상기 샘플을 펩타이드 핵산 (PNA) 프로브와 접촉하는 단계;
(c) 상기 샘플에 대해 전기화학적 임피던스 분광법 (EIS) 측정을 수행하는 단계;
(d) 상기 EIS 측정으로 분석물의 존재, 부재, 양 및/또는 실체를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제37항에 있어서, 상기 핵산은 거대 핵산, gDNA 또는 rRNA와 같은 1000 bp 이상의 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 샘플 준비 공정은 상기 샘플을 열처리하거나 및/또는 상기 샘플을 초음파처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한항에 있어서, 상기 샘플 준비 공정은, 제조되는 핵산 서열의 평균 길이가 1000 bp (bp = 염기쌍) 이하, 800 bp 이하, 500 bp 이하, 20 bp 이상, 30 bp 이상, 40 bp 이상, 50 bp 이상 60 bp 이상 70 bp 이상, 80 bp 이상, 90 bp 이상, 100 bp 이상, 110 bp 이상, 120 bp 이상, 130 bp 이상, 140 bp 이상 또는 150 bp 이상, 20-800 bp, 30-600 bp, 40-500 bp, 50-400 bp, 60-350 bp, 70-300 bp, 80-250 bp, 90-200 bp, 100-180 bp, 또는 약 120 bp가 되도록, 상기 핵산을 단편화하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 개체의 상처에서 병원체를 검출하는 방법으로서,
상기 방법은 제1항 내지 제40항 중 어느 한항에 따른 방법을 수행함으로써, 상기 병원체의 핵산 특성을 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법. - 제41항에 있어서, 상기 샘플이 상기 개체의 상처로부터 취한 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제41항 내지 제43항 중 어느 한항에 있어서, 상기 병원체가 치료에 내성을 나타내는 병원체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제41항 내지 제44항 중 어느 한항에 있어서, 상기 병원체가 E coli 및 MRSA로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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| PA0105 | International application |
Patent event date: 20140603 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
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