KR20140120944A - Ｐｃｖ2 면역 조성물 및 이들 조성물의 생산 방법 - Google Patents

Ｐｃｖ2 면역 조성물 및 이들 조성물의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

돼지 서코바이러스(porcine circovirus) 2형으로부터 오픈 리딩 프레임 2에 의해 발현되는 단백질을 회수하는 개선된 방법이 제시된다. 상기 방법은 전반적으로, 성장 배지 내에 내포된 세포 내로, 오픈 리딩 프레임 2 코딩 서열을 보유하는 재조합 바이러스를 형질감염시키고, 상기 바이러스가 오픈 리딩 프레임 2를 발현하도록 유도하고, 상층액 내에서 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 이러한 회수는 충분한 양의 재조합 단백질이 발현되고 상기 세포로부터 성장 배지 내로 분비되도록 하기 위하여, 이들 세포의 감염이후 대략 5일 시점부터 시작된다. 이들 방법은 세포 내로부터 재조합 단백질을 분리하고 회수하는데 요구되는, 비용과 시간이 많이 소모되는 추출 절차를 회피한다.

Description

ＰＣＶ2 면역 조성물 및 이들 조성물의 생산 방법{PCV2 IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND METHODS OF PRODUCING SUCH COMPOSITIONS}
관련된 출원
본 출원은 2004년 12월 30일자로 제출된 가출원 60/640,510 및 2005년 1월 13일자로 제출된 출원 11/034,737에 우선권을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 종이 양식과 컴퓨터 판독가능 양식으로, 서열 목록을 포함한다.
본 발명의 한 측면은 돼지 서코바이러스 2형(PCV2)의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2)에 의해 발현되는 단백질의 회수에 관계한다. 더욱 구체적으로, 단백질은 돼지 서코바이러스 2형, 오픈 리딩 프레임 2에 대한 재조합 코딩 서열을 보유하는 형질감염된 바이러스에 의해 발현되는 재조합 단백질이다. 이보다 더욱 구체적으로, 형질감염된 바이러스는 성장 배지 내에서 세포를 감염시키고, 오픈 리딩 프레임 2에 의해 발현되는 단백질은 세포 내에서 보다는 상층액 내에서 회수된다. 이보다 더욱 구체적으로, 상기 방법은 돼지 서코바이러스 2형으로부터 오픈 리딩 프레임 2 유전자를 증폭하고, 증폭된 부분을 첫 번째 벡터 내로 클로닝하고, 상기 첫 번째 벡터로부터 오픈 리딩 프레임 2 부분을 절단하고 이를 전달 벡터 내로 클로닝하며, 상기 전달 벡터를 바이러스 벡터와 함께, 성장 배지에서 세포 내에 동시형질감염시키고, 이들 세포가 바이러스 벡터에 의해 감염되도록 하여 오픈 리딩 프레임 2를 발현하고, 오픈 리딩 프레임 2에 의해 코딩되는 발현된 재조합 단백질을 상층액 내에서 회수하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하는데 효과적인 면역 조성물 및 이들 면역 조성물을 생산하는 방법에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 면역 반응을 제공하는데 효과적인 면역 조성물에 관계하는데, 상기 조성물은 이러한 조성물이 투여되는 동물을 보호하고, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 감소시키거나 완화시킨다. 이보다 더욱 구체적으로, 본 발명은 PCV2에 의한 감염에 대한 효과적인 보호를 공여하는 단백질-기초된 면역 조성물에 관계한다. 이보다 더욱 구체적으로, 본 발명은 PCV2의 ORF2를 포함하는 면역 조성물에 관계하는데, 여기서 PCV2-ORF2의 투여는 PCV2에 의한 감염에 대한 보호를 유도한다. 가장 구체적으로, 본 발명은 이러한 면역 조성물이 투여되는 돼지에 효과적인 면역을 제공하는 면역 조성물에 관계하는데, 여기서 상기 조성물은 PCV2의 ORF2에 의해 발현되는 단백질을 함유한다.
돼지 서코바이러스 2형(PCV2)은 소형(17-22 ㎚ 직경)의 다면체형 비-외피 DNA 바이러스인데, 이는 단일-가닥 원형 게놈을 보유한다. PCV2는 돼지 서코바이러스 1형(PCV1)과 대략 80% 서열 동일성(sequence identity)을 공유한다. 하지만, 일반적으로 비-독력인 PCV1과 대조적으로, PCV2로 감염된 돼지는 이유후 전신 소모성 증후군(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS)라고 하는 공통적인 증상을 보인다. PMWS는 임상적으로, 소모(wasting), 피부의 창백함(paleness), 수척(unthriftiness), 호흡 곤란(respiratory distress), 설사, 황달(icterus), 황달(jaundice)로 특성화된다. 일부 병든 돼지에서는 모든 증상의 조합이 나타나는 반면, 다른 돼지에서는 이들 증상 중에서 한두 가지만 나타난다. 괴사 동안, 현미경적 병소와 거시적 병소 역시 복수의 조직과 장기에서 나타나는데, 림프계 장기(lymphoid organ)가 병소의 가장 공통적인 부위이다. PCV2 핵산 또는 항원의 양과 현미경적 림프계 병소의 심각도 사이에 강한 상관관계가 관찰되었다. PCV2로 감염된 돼지에 대한 치사율(mortality rate)은 80%에 육박할 수 있다. PMWS 이외에, PCV2는 가성 광견병(pseudorabies), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS), 글래서씨병(Glasser's disease), 연쇄구균성 수막염(streptococcal meningitis), 살모넬라증(salmonellosis), 이유후 대장균증(postweaning colibacillosis), 식이요법성 간증(dietetic hepatosis), 화농성 기관지폐렴(suppurative bronchopneumonia)을 비롯한 여러 다른 감염과 연관하였다.
SDS-PAGE 겔에서 이동시키는 경우에 대략 30 kDa의 분자량을 보유하는 PCV2의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2) 단백질은 과거에, PCV2용 백신에서 항원 성분으로 이용되었다. 이들 백신에 사용되는 ORF2를 획득하는 전형적인 방법은 전반적으로, ORF2를 코딩하는 PCV2 DNA를 증폭시키고, 바이러스 벡터를 ORF2 DNA로 형질감염시키고, 세포를 ORF2 DNA를 보유하는 바이러스 벡터로 세포를 감염시키고, 상기 바이러스가 세포 내에서 ORF2 단백질을 발현하도록 유도하고, 세포 용해(cell lysis)를 통하여 상기 세포로부터 ORF2 단백질을 추출하는 단계로 구성된다. 이들 절차는 일반적으로, 바이러스 벡터에 의한 세포의 감염이후 대략 4일이 소요된다. 하지만, 이들 절차는 많은 비용과 시간이 소모되는 추출 절차가 요구되는 단점이 있다. 부가적으로, 이들 세포로부터 회수되는 ORF2의 양이 그다지 많지 않다; 결과적으로, 백신 등에 사용할 만큼 충분한 양의 발현된 재조합 단백질을 획득하기 위하여, 다수의 세포가 다수의 바이러스 벡터에 의해 감염되어야 한다.
PCV2 면역화를 위한 현재의 접근법에는 DNA-기초된 백신이 포함된다(참조: U.S. Patent No. 6,703,023). 하지만, 이들 백신은 PCV2 감염 및 이와 연관된 임상적 징후에 대한 효과적인 면역을 제공하는데 무효하였다.
따라서, 감염된 세포 내로부터 ORF2 단백질의 추출을 필요로 하지 않는, ORF2 단백질을 획득하는 방법이 당분야에서 요구된다. 또한, 백신 조성물을 효과적으로 제조할 만큼 충분한 양으로 재조합 ORF2 단백질을 획득하는 방법이 요구된다. 또한, 현재의 ORF2 단백질 추출 프로토콜에 의해 요구되는 복잡하고 노동-집약적인 방법을 필요로 하지 않는, ORF2 단백질을 획득하는 방법이 요구된다. 최종적으로, 조성물과 관련하여, PCV2 감염에 대한 보호 면역을 제공하고, 이와 관련된 임상 징후의 심각도를 완화하거나 이들 징후를 예방하는 면역 조성물이 당분야에서 요구된다.
이들 백신에 사용되는 ORF2를 획득하는 전형적인 방법은 전반적으로, ORF2를 코딩하는 PCV2 DNA를 증폭시키고, 바이러스 벡터를 ORF2 DNA로 형질감염시키고, 세포를 ORF2 DNA를 보유하는 바이러스 벡터로 세포를 감염시키고, 상기 바이러스가 세포 내에서 ORF2 단백질을 발현하도록 유도하고, 세포 용해(cell lysis)를 통하여 상기 세포로부터 ORF2 단백질을 추출하는 단계로 구성된다. 이들 절차는 일반적으로, 바이러스 벡터에 의한 세포의 감염이후 대략 4일이 소요된다. 하지만, 이들 절차는 많은 비용과 시간이 소모되는 추출 절차가 요구되는 단점이 있다. 부가적으로, 이들 세포로부터 회수되는 ORF2의 양이 그다지 많지 않다; 결과적으로, 백신 등에 사용할 만큼 충분한 양의 발현된 재조합 단백질을 획득하기 위하여, 다수의 세포가 다수의 바이러스 벡터에 의해 감염되어야 한다.
PCV2 면역화를 위한 현재의 접근법에는 DNA-기초된 백신이 포함된다(참조: U.S. Patent No. 6,703,023). 하지만, 이들 백신은 PCV2 감염 및 이와 연관된 임상적 징후에 대한 효과적인 면역을 제공하는데 무효하였다.
본 발명은 당분야에 내재된 이들 문제점을 극복하고 명백한 최신의 진전을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 한 측면은 i) PCV2 ORF2 DNA 코딩 서열을 보유하는 재조합 바이러스 벡터로, 배양액 내에서 감수성 세포를 감염시키고, 여기서 ORF2 단백질은 상기 재조합 바이러스 벡터에 의해 발현되고, ii) 상층액 내에서, ORF2를 회수함으로써, 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 생산하고 및/또는 회수하는 개선된 방법을 제시한다. 예상치 않게, ORF2는 감염된 세포의 감염과 후속 배양이 세포 내로부터 PCV2 ORF2를 추출하는 전형적인 기존의 PCV 2 ORF2 회수 과정을 넘어 진전될 수 있으면, 상층액 내에서 다량으로 방출되는 것으로 밝혀졌다. 더 나아가, 놀랍게도, PCV ORF2 단백질은 이들 생산 세포의 외부에서 기본형 파괴(prototypical degradation)에 강하게 저항하는 것으로 밝혀졌다. 종합하면, 이들 발견은 PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터로 감염된 세포 배양액의 상층액으로부터 다량의 PCV2 ORF2 단백질의 회수를 가능하게 한다. 다량의 PCV2 ORF2 단백질은 대략 20 ㎍/㎖ 이상, 바람직하게는, 대략 25 ㎍/㎖ 이상, 더욱 바람직하게는, 대략 30 ㎍/㎖ 이상, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 40 ㎍/㎖ 이상, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 50 ㎍/㎖ 이상, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 60 ㎍/㎖ 이상, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 80 ㎍/㎖ 이상, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 100 ㎍/㎖ 이상, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 150 ㎍/㎖ 이상, 가장 바람직하게는, 대략 190 ㎍/㎖ 이상이다. 이들 발현 비율은 예로써, 실시예 1 내지 3에 기술된 방법으로 달성될 수도 있다.
바람직한 세포 배양액은 대략 0.3 - 2.0 x 106개 세포/㎖, 더욱 바람직하게는, 대략 0.35 - 1.9 x 106개 세포/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.4 - 1.8 x 106개 세포/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.45 - 1.7 x 106개 세포/㎖, 가장 바람직하게는, 대략 0.5 - 1.5 x 106개 세포/㎖의 세포 수를 보유한다. 바람직한 세포는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 세포는 PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 적절한 재조합 바이러스 벡터로 감염될 수 있는 세포이다. 적절하게는, 이들 세포는 곤충 세포, 더욱 바람직하게는, 상표 Sf+ 곤충 세포로 판매되는 곤충 세포(Protein Sciences Corporation, Meriden, CT)이다.
바람직한 성장 배지 역시 당업자에 의해 결정될 수 있는데, 바람직한 성장 배지는 Excell 420(JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) 등과 같은 혈청-없는 곤충 세포 배지이다. 바람직한 바이러스 벡터는 특히, 생산 세포가 곤충 세포인 경우에, BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)와 같은 바쿨로바이러스이다. 바쿨로바이러스 발현계가 바람직하긴 하지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 다른 발현계 역시 본 발명의 목적, 다시 말하면, 세포 배양액의 상층액 내에서 PCV2 ORF2의 발현을 수행하는데 이용될 수 있다. 이런 다른 발현계는 배지 내로 ORF2 발현을 유도하기 위하여 신호 서열의 이용을 필요로 한다. 놀랍게도, ORF2가 바쿨로바이러스 발현계에 의해 생산되는 경우에, 이는 배지 내로 ORF2의 발현을 유도하기 위한 임의의 신호 서열 또는 추가적인 변형을 필요로 하지 않는다. 상기 단백질은 독립적으로, 바이러스-유사 입자를 형성할 수 있고(Journal of General Virology Vol. 81, pp. 2281-2287 (2000)), 배양 상층액 내로 분비될 수 있다. 적절하게는, PCV2 ORF2 DNA 서열을 보유하는 재조합 바이러스 벡터는 민감한 세포의 감염에 이용되는 경우에, 대략 0.03 - 1.5, 더욱 바람직하게는, 대략 0.05 - 1.3, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.09 - 1.1, 가장 바람직하게는, 대략 0.1 - 1.0의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOl)를 보유한다. 적절하게는, 앞서 언급된 MOI는 1 ㎖의 세포 배양액에 관계한다. 적절하게는, 본 명세서에 기술된 방법은 PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF 단백질을 발현하며 대략 0.03 - 1.5, 더욱 바람직하게는, 대략 0.05 - 1.3, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.09 - 1.1, 가장 바람직하게는, 대략 0.1 - 1.0의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOl)를 보유하는 재조합 바이러스 벡터로 0.35 - 1.9 x 106개 세포/㎖, 바람직하게는, 대략 0.4 - 1.8 x 106개 세포/㎖, 더욱 바람직하게는, 대략 0.45 - 1.7 x 106개 세포/㎖, 가장 바람직하게는, 대략 0.5 - 1.5 x 106개 세포/㎖의 감염을 포함한다.
이후, 감염된 세포는 최대 10일, 바람직하게는, 대략 2일 내지 10일, 더욱 바람직하게는, 4일 내지 9일, 가장 바람직하게는, 대략 5일 내지 8일의 기간 동안 배양된다. 바람직한 배양 조건은 대략 22 - 32℃, 바람직하게는, 대략 24 - 30℃, 더욱 바람직하게는, 대략 25 - 29℃, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 26 - 28℃, 가장 바람직하게는, 대략 27℃이다. 적절하게는, Sf+ 세포는 접종이후 특징적인 바쿨로바이러스-유도된 변화가 관찰된다. 이런 관찰에는 감염후 기간 동안 세포 밀도 추세 및 생존능 감소의 모니터링이 포함된다. 피크 바이러스 역가(peak viral titer)는 감염이후 3-5일 시점에 관찰되고, 세포로부터 상층액 내로 피크 ORF2 방출은 5일과 8일 사이에 및/또는 세포 생존능(cell viability)이 10% 이하로 감소할 때 관찰되는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 i) 앞서 정의된 MOI를 갖는 재조합 바이러스 벡터로 배양중인 다수의 민감한 세포의 감염을 가능하게 하고, ii) 상기 재조합 바이러스 벡터로 PCV2 ORF2 단백질을 발현하고, iii) 이후, 감염이후 5일 내지 8일 사이에 및/또는 세포 생존능이 10% 이하로 감소할 때 획득된 세포의 상층액 내에서 PCV2 ORF2를 회수함으로써 가급적, 앞서 기술된 양으로 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 생산 및/또는 회수하는 개선된 방법을 제시한다. 적절하게는, 상기 재조합 바이러스 벡터는 PCV2 ORF2 DNA 코딩 서열을 보유하는 재조합 바쿨로바이러스이고, 상기 세포는 Sf+ 세포이다. 부가적으로, 배양액은 감염후 기간 동안, 거시적/현미경적 증거 또는 세포 형태에서 변칙적인 변화를 주기적으로 검사하는 것이 바람직하다. 오염된 배양액은 폐기된다. 적절하게는, 발현된 ORF2 재조합 단백질은 이들 세포에 의해, 세포 생존능을 유지시키는 주변 성장 배지 내로 분비된다. 이후, ORF2는 세포 자체가 아닌 이들 세포를 둘러싸는 상층액 내에서 회수된다.
적절하게는, 회수 과정은 분리 단계에서 배지 내에서, 발현된 ORF2로부터 세포 잔해의 분리로 시작된다. 바람직한 분리 단계에는 여과, 최대 20,000xg 속도에서 원심분리, 연속 흐름 원심분리(continuous flow centrifugation), 이온 교환 또는 겔 여과를 이용한 크로마토그래피 분리, 통상적인 면역친화성 방법이 포함된다. 이들 방법은 예로써, Harris and Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL press Oxford 1995)에 의해 당업자에게 공지되어 있다. 가장 바람직한 분리 방법은 최대 20,000xg 속도에서 원심분리와 여과이다. 바람직한 여과 방법에는 전량 마이크로여과(dead-end microfiltration) 및 중공 섬유 여과(hollow fiber filtration)를 비롯한 수형회전류(tangential flow)(또는 횡류(cross flow)) 여과가 포함된다. 이들 중에서, 전량 마이크로여과가 선호된다. 전량 마이크로여과를 위한 바람직한 구멍 크기는 대략 0.30 - 1.35 ㎛, 더욱 바람직하게는, 대략 0.35 - 1.25 ㎛, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.40 - 1.10 ㎛, 가장 바람직하게는, 대략 0.45 - 1.0 ㎛이다. 통상적인 여과 막이 본 발명의 목적을 수행하는데 이용될 수 있긴 하지만, 폴리에테르설폰 막이 바람직하다. 여과 단계 동안, 임의의 저분자량 핵산 화학종이 제거된다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 i) 앞서 정의된 MOI를 갖는 재조합 바이러스 벡터로 배양중인 다수의 민감한 세포의 감염을 가능하게 하고, ii) 상기 재조합 바이러스 벡터로 PCV2 ORF2 단백질을 발현하고, iii) 감염이후 5일 내지 8일 사이에 및/또는 세포 생존능이 10% 이하로 감소할 때 획득된 세포의 상층액 내에서 PCV2 ORF2를 회수하고, iv) 분리 단계를 통하여, 발현된 PCV2 ORF2로부터 세포 잔해를 분리함으로써 가급적, 앞서 기술된 양으로 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 생산 및/또는 회수하는 개선된 방법을 제시한다. 적절하게는, 상기 재조합 바이러스 벡터는 ORF2 DNA 코딩 서열을 보유하는 바쿨로바이러스이고, 상기 세포는 Sf+ 세포이다. 바람직한 분리 단계는 앞서 기술된 것들이다. 가장 바람직한 분리 단계는 대략 0.30 - 1.35 ㎛, 더욱 바람직하게는, 대략 0.35 - 1.25 ㎛, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.40 - 1.10 ㎛, 가장 바람직하게는, 대략 0.45 - 1.0 ㎛의 구멍 크기를 갖는 막을 이용한 전량 마이크로여과이다.
백신과 같은 면역 조성물에 사용되는 PCV2 ORF2의 회수를 위하여, 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화 단계의 포함이 바람직하다. “면역” 조성물은 호스트 내에서, 목적하는 조성물이나 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개된 면역 반응을 유도하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 물질의 조성물을 의미한다. 일반적으로, “면역 반응”에는 아래의 효과 중에서 하나이상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: 목적하는 조성물이나 백신 내에 포함된 항원에 대해 특이적인 항체, B 세포, 보조 T 세포, 억제자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 yd T 세포의 생산이나 활성화.
적절하게는, 호스트는 새로운 감염에 대한 저항이 강화되고 및/또는 질병의 임상적 심각도가 감소되도록 치료 또는 보호 면역 반응을 나타낸다. 이런 보호는 감염된 호스트에 의해 통상적으로 전시되는 증상의 감소 또는 부재, 더욱 신속한 회복 시간 및/또는 감염된 호스트 내에서 감소된 바이러스 역가에 의해 입증된다. 따라서, 본 발명은 i) 앞서 정의된 MOI를 갖는 재조합 바이러스 벡터로 배양중인 다수의 민감한 세포의 감염을 가능하게 하고, ii) 상기 재조합 바이러스 벡터로 PCV2 ORF2 단백질을 발현하고, iii) 감염이후 5일 내지 8일 사이에 및/또는 세포 생존능이 10% 이하로 감소할 때 획득된 세포의 상층액 내에서 PCV2 ORF2를 회수하고, iv) 분리 단계를 통하여, 발현된 PCV2 ORF2로부터 세포 잔해를 분리하고, v) 상기 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시킴으로써 가급적, 앞서 기술된 양으로 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 생산 및/또는 회수하는 개선된 방법에 관계한다.
적절하게는, 이러한 불활성화는 여과 단계 직전이나 직후에 수행되는데, 여과 단계이후가 불활성화에 적합한 시간이다. 본 발명의 목적을 위하여 임의의 통상적인 불활성화 방법이 이용될 수 있다. 따라서, 불활성화는 화학적 및/또는 물리적 처리에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 형태에서, 수거액(harvest fluid)의 부피는 결정되고, 온도는 대략 32 - 42℃, 더욱 바람직하게는, 대략 34 - 40℃, 가장 바람직하게는, 대략 35 - 39℃로 조정된다. 바람직한 불활성화 방법은 바람직하게는, 대략 1 내지 대략 20 mM, 더욱 바람직하게는, 대략 2 내지 대략 10 mM, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 2 내지 대략 8 mM, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 3 내지 대략 7 mM, 가장 바람직하게는, 대략 5 mM의 농도로, 고리화된 이원 에틸렌이민(BEI)의 추가이다. 가령, 불활성화는 가급적, 대략 0.4M의 2-브로모에틸렌아민 브롬화수소산염의 용액의 추가를 수반하는데, 상기 용액은 대략 5mM BEI의 최종 농도를 제공하기 위하여 0.3N NaOH 내에서 0.2M 이원 에틸렌이민(BEI)으로 고리화된다. 적절하게는, 상기 액체는 72 - 96시간동안 연속적으로 교반되고, 상기 불활성화된 수거액은 -40℃ 이하, 또는 대략 1 - 7℃에서 동결 보관될 수 있다. 불활성화가 완결된 이후, 가급적, 1.OM에서 티오황산나트륨 용액을 첨가하여 임의의 잔류하는 BEI를 중화시킨다. 적절하게는, 티오황산나트륨은 불활성화 이전에 추가된 BEI와 비교하여 동등한 양으로 추가된다. 가령, BEI가 5 mM의 최종 농도로 추가되는 경우에, 임의의 잔류하는 BEI를 중화시키는 5 mM의 최종 최소 농도를 제공하기 위하여 1.OM 티오황산나트륨 용액이 추가된다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 i) 앞서 정의된 MOI를 갖는 재조합 바이러스 벡터로 배양중인 다수의 민감한 세포의 감염을 가능하게 하고, ii) 상기 재조합 바이러스 벡터로 PCV2 ORF2 단백질을 발현하고, iii) 감염이후 5일 내지 8일 사이에 및/또는 세포 생존능이 10% 이하로 감소할 때 획득된 세포의 상층액 내에서 PCV2 ORF2를 회수하고, iv) 분리 단계를 통하여, 발현된 PCV2 ORF2로부터 세포 잔해를 분리하고, v) 상기 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시킴으로써 가급적, 앞서 기술된 양으로 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 생산하는 방법에 관계한다. 적절하게는, 상기 재조합 바이러스 벡터는 ORF2 DNA 코딩 서열을 보유하는 바쿨로바이러스이고, 상기 세포는 Sf+ 세포이다. 바람직한 분리 단계는 앞서 기술된 것들, 가장 바람직하게는, 여과 단계이다. 바람직한 불활성화 단계는 앞서 기술된 것들이다. 적절하게는, 불활성화는 2 내지 8 mM BEI, 더욱 바람직하게는, 대략 5 mM BEI의 존재에서 대략 35 - 39℃ 사이에서 수행된다. 놀랍게도, 더욱 높은 농도의 BEI가 PCV2 ORF2 단백질에 부정적인 영향을 주는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 다른 측면에서, 앞서 기술된 방법은 단계 v) 이후에 중화 단계를 포함한다. 이러한 단계 vi)는 용액 내에서 불활성화제(inactivation agent)를 중화시키는 동등량의 약제의 추가를 포함한다. 적절하게는, 불활성화제가 BEI이면, 동등량으로 티오황산나트륨의 추가가 바람직하다. 따라서, 다른 측면에서, 단계 vi)는 불활성화제가 BEI인 경우에, 대략 1 내지 대략 20 mM, 바람직하게는, 대략 2 내지 대략 10 mM, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 2 내지 대략 8 mM, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 3 내지 대략 7 mM, 가장 바람직하게는, 대략 5 mM의 티오황산나트륨 용액의 추가를 포함한다.
바람직한 형태, 구체적으로, 백신과 같은 면역 조성물 내에 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 이용하는 형태에서, 각각의 수확된 ORF2는 부착 의존성(anchorage dependent) 바쿨로바이러스 민감한 Sf+ 세포 내에서 계대배양(passage)에 의한 불활성화가 검사된다. 이러한 검사의 바람직한 형태에서, 150 ㎠의 적절한 세포 배양 단층은 1.0 ㎖의 불활성화된 PCV2 액체로 접종되고 14일동안 25 - 29℃에서 유지되며 적어도 2회 계대배양된다. 유지 기간의 종결 시점에서, 이들 세포 단층은 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스의 전형적인 세포변성 효과(CPE)가 검사된다. 적절하게는, 양성 바이러스 대조 역시 이용된다. 이들 대조는 비-불활성화된 참고 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스로 접종된 Sf+ 세포의 한 배양액 및 접종되지 않은 Sf+ 세포의 한 플라스크로 구성될 수 있다. 접종과 계대배양이후, BEI 처리된 바이러스 액체 내에서 바이러스-감염된 세포의 부재는 만족스런 불화성화 검사를 성립한다. 참고 바이러스로 접종된 대조 세포는 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스의 전형적인 CPE를 나타내고, 접종되지 않은 플라스크는 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스 CPE의 증거를 나타내지 않는다. 대안으로, 유지 기간의 종결 시점에서, 상층액 샘플은 수집되고 Sf+ 96 웰 평판 상에 접종되며, 이는 Sf+ 세포로 적하되고, 이후 25 - 29℃에서 5 - 6시간동안 유지된다. 그 다음, 상기 평판은 고정되고 FITC에 공액된 항-PCV2 ORF2 항체로 염색된다. BEI 처리된 바이러스 액체 내에서 IFA 검경에 의해 검출되는, CPE와 ORF2 발현의 부재는 만족스런 불활성화 검사를 성립한다. 참고 바이러스로 접종된 대조 세포는 CPE와 IFA 활성을 나타내고, 접종되지 않은 플라스크는 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스 CPE의 증거를 나타내지 않고 IFA 활성을 보유하지 않는다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 재조합 바이러스 벡터의 불활성화의 효능을 결정하기 위한 불활성화 검사에 관계하는데, 상기 방법은 i) 재조합 바이러스 벡터를 보유하는 배양액의 적어도 일부분을 가급적, 앞서 기술된 불활성화제와 접촉시키고, ii) 중화제를 추가하여 가급적, 앞서 기술된 불활성화제를 중화시키고, iii) 앞서 기술된 검사법으로 잔여 감염도(residual infectivity)를 결정하는 단계를 포함한다.
불활성화이후, 샘플 내에서 재조합 PCV2 ORF2 단백질의 상대적인 양은 다양한 방법으로 결정할 수 있다. 바람직한 정량 방법에는 SDS-PAGE 농도계(densitometry), ELISA, 공지된 양의 백신과 임상적 결과를 상관시키는 동물 백신접종 연구(혈청반응검사 등)가 포함된다. 정량에 SDS-PAGE가 이용되는 경우에, 미지량의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 샘플 물질은 상이한 공지된 양의 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 포함하는 샘플과 함께, 겔에서 이동된다. 이후, 공지된 샘플에 기초하여 표준 곡선(standard curve)이 산출될 수 있는데, 미지 샘플 내에서 재조합 PCV2 ORF2의 양은 이러한 표준 곡선과의 비교로 결정될 수 있다. ELISA는 일반적으로, 항원 정량을 위한 산업 표준으로서 인식되기 때문에, 정량에 선호된다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 재조합 PCV2 ORF2 단백질의 정량을 위한 ELISA에 관계한다. 본 명세서에서 바람직한 ELISA는 일반적으로, 코팅 완충액 내에서 포획 항체(capture antibody)를 1:6000 또는 적절한 작업 희석도(working dilution)로 희석하는 것으로 시작된다. 바람직한 포획 항체는 정제된 Swine 항-PCV2 PAb Prot. G이고, 바람직한 코팅 완충액은 0.05M 탄산염 완충액인데, 이는 2.93 g NaHCO3(Sigma Cat. No. S-6014, 또는 등가물)과 1.59 g NaCO3(Sigma Cat. No. S-6139, 또는 등가물)을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 상기 혼합물은 9.6± 0.1의 pH에서 1 ℓ를 만들기 위하여, 희석된 물 또는 등가물과 혼합된다. 이후, 포획 항체는 코팅 완충액 내에서 1:6000 또는 임의의 다른 적절한 작업 희석도로 희석된다. 가령, 4개의 평판을 위하여, 42 ㎖의 코팅 완충액과 7 ㎕의 포획 항체를 필요로 한다. 역 피펫팅(reverse pipetting) 방법을 이용하여, 100 ㎕의 희석된 포획 항체를 모든 웰에 추가하였다. 균등한 코팅을 달성하기 위하여, 각 평판의 측면은 가볍게 두드린다. 이후, 이들 평판은 겹쳐 쌓고 쌓아올린 더미를 빈 96-웰 평판으로 표면을 덮기에 앞서, 평판 봉합제(sealer)로 밀봉한다. 이들 평판은 35-39℃에서 하룻밤(14-24 시간) 동안 배양한다. 그 다음, 각 평판은 250 ㎕/세척(wash)으로 설정된 울트라워시(ultrawash) + 마이크로역가 평판 세척기(3회 세척, 적심 시간(soak time) 없음)를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척한다. 최종 세척이후, 이들 평판은 종이 타월에 가볍게 두드린다. 다시, 역 피펫팅 기술을 이용하여, 250 ㎕의 차단 용액(blocking solution)을 모든 웰에 추가한다. 검사 평판은 밀봉하고 35-37℃에서 대략 1시간(± 5분)동안 배양한다. 적절하게는, 이들 평판은 상기 단계이후 겹쳐 쌓여지지 않는다. 차단 단계 동안, 모든 검사 샘플은 뽑혀지고 실온에서 해동된다. 그 다음, A열과 H열, 1-3번 줄을 제외한 모든 웰에 200 ㎕의 희석 용액을 추가함으로써 4개의 독립된 희석 평판을 준비한다. 이후, 6개의 검사 튜브는 아래와 같이 표지된다: 낮은 역가, 중간 역가, 높은 역가, 불활성화된/여과된(1:240), 불활성화된/여과된(1:480), 내부 대조(internal control). 지정된 튜브 내에서, 아래의 검사 샘플에 대한 적절한 희석액이 제조된다. 해동된 검사 샘플은 사용에 앞서 와동된다. 4개의 평판에서, 아래의 희석액이 제조된다: A) 낮은 역가는 사전에 희석되지 않는다: 3.0 ㎖의 낮은 역가; B) 1:30 희석도에서 음성 대조(negative control)(SF+ 세포): 3.77 ㎖의 희석액 + 130 ㎕의 음성 대조; C) 1:30 희석도에서 중간 역가(8 ㎍/㎖): 3.77 ㎖의 희석액 + 130 ㎕의 중간 역가; D) 1:90 희석도에서 높은 역가(16 ㎍/㎖): 2.967 ㎖의 희석액 + 33 ㎕의 높은 역가; E) 1:240 희석도에서 불활성화된/여과된: 2.39 ㎖의 희석액 + 10 ㎕의 불활성화된/여과된 샘플; F) 상기 E 샘플로부터 제조된 1:480 희석도에서 불활성화된/여과된: 1.0 ㎖의 희석액 + 1.0 ㎖의 불활성화된/여과된(1:240) 샘플; G) 1:30 희석도에서 내부 대조: 3.77 ㎖의 희석액 + 130 ㎕의 내부 대조. 이후, 300 ㎕의 이들 제조된 샘플을 희석 평판(평판 1 내지 4) 내에 상응하는 빈 웰에 추가한다. 그 다음, 다채널 피펫터(pipettor)를 100 ㎕로 설정하고, A열에서 내용물은 적어도 5회 위 아래로 피펫팅(pipetting)함으로써 혼합하고, 이후 100 ㎕를 역 피펫팅 기술을 이용하여 B열로 옮긴다. 팁(tip)을 교체하고, 이러한 동일한 절차를 상기 평판 내에서 G열까지 수행한다. 이들 희석 평판 내에서 샘플은 검사 평판이 울트라워시(ultrawash) + 마이크로역가 평판 세척기(250 ㎕/세척(wash)으로 설정됨, 3회 세척, 적심 시간(soak time) 없음)를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척되면, 이들 검사 평판으로 이전된다. 최종 세척이후, 이들 평판은 종이 타월에 가볍게 두드린다. 그 다음, 희석 평판의 내용물은 단일 이전 절차를 이용하여 검사 평판으로 이전된다. 더욱 구체적으로, 역 피펫팅 기술을 이용하여, H열에서부터 100 ㎕/웰이 희석 평판으로부터 검사 평판의 상응하는 웰로 이전된다. 각 이전이후, 피펫 첨단은 교체된다. 역 피펫팅 기술을 이용하여, G열에서부터 100 ㎕/웰이 희석 평판으로부터 검사 평판의 상응하는 웰로 이전된다. 피펫 첨단의 동일한 세트가 나머지 이전에 이용될 수 있다. 이전을 위한 균질한 용액을 담보하기 위하여, 용액은 이전에 앞서 적어도 3회 위 아래로 피펫팅된다. 그 다음, 검사 평판은 밀봉되고 37℃± 2.0℃에서 1.0시간± 5분 동안 배양된다. 이번에도, 이들 평판은 겹쳐 쌓지 않는 것이 바람직하다. 이후, 이들 평판은 울트라워시(ultrawash) + 마이크로역가 평판 세척기(250 ㎕/세척(wash)으로 설정됨, 3회 세척, 적심 시간(soak time) 없음)를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척된다. 최종 세척이후, 이들 평판은 종이 타월에 가볍게 두드린다. 역 피펫팅 기술을 이용하여, 희석액 내에서 1:300 또는 적절한 작업 희석도로 희석된 100 ㎕의 검출 항체는 검사 평판의 모든 웰에 추가한다. 가령, 4개의 평판 각각은 42 ㎖의 희석 용액과 140 ㎕의 포획 항체를 필요로 한다. 그 다음, 이들 검사 평판은 밀봉되고 37℃± 2.0℃에서 1.0시간± 5분 동안 배양된다. 이번에도, 이들 평판은 울트라워시(ultrawash) + 마이크로역가 평판 세척기(250 ㎕/세척(wash)으로 설정됨, 3회 세척, 적심 시간(soak time) 없음)를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척된다. 최종 세척이후, 이들 평판은 종이 타월에 가볍게 두드린다. 그 다음, 1% 정상 토끼 혈청을 희석액에 추가함으로써 공액 희석액(conjugate diluent)을 제조한다. 가령, 4개의 평판을 위하여, 420 ㎕의 정상 토끼 혈청을 42 ㎖의 희석액에 추가한다. 공액 항체(conjugate antibody)는 새로 제조된 공액 희석액 용액 내에서 1:10,000, 또는 임의의 다른 적절한 작업 희석도로 희석하여 검사 평판의 모든 웰에 추가한다. 역 피펫팅 기술을 이용하여, 100 ㎕의 이러한 희석된 공액 항체를 모든 웰에 추가한다. 이들 검사 평판은 밀봉되고 37℃± 2.0℃에서 45± 5분 동안 배양된다. 이번에도, 이들 평판은 겹쳐 쌓여지지 않는다. 이후, 이들 평판은 울트라워시(ultrawash) + 마이크로역가 평판 세척기(250 ㎕/세척(wash)으로 설정됨, 3회 세척, 적심 시간(soak time) 없음)를 이용하여 세척 완충액으로 3회 세척된다. 최종 세척이후, 이들 평판은 종이 타월에 가볍게 두드린다. 그 다음, 동등 부피의 TMB 과산화효소 기질(반응물 A)과 과산화효소 용액 B(반응물 B)는 사용 직전에 혼합한다. 혼합된 양은 평판의 양에 좌우되지만, 각 평판은 10 ㎖/평판 + 2 ㎖를 필요로 한다. 이런 이유로, 4개의 평판을 위하여, 21 ㎖의 반응물 A + 21 ㎖의 반응물 B가 요구된다. 역 피펫팅 기술을 이용하여, 100 ㎕의 기질을 검사 평판의 모든 웰에 추가한다. 이후, 이들 평판은 실온에서 15분± 15초간 배양한다. 반응은 역 피펫팅 기술을 이용한 100 ㎕의 1N HCl 용액의 추가로 중단된다. 그 다음, ELISA 평판 판독기를 작동시키고 통상적인 방식으로 진단과 검사 단계를 진행시킨다.
본 발명의 다른 측면은 PCV2 ORF2 DNA를 보유하고, 민감한 세포 내로 감염되면 PCV2 ORF2 단백질을 다량으로 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 방법에 관계한다. 놀랍게도, 본 명세서에 제시된 재조합 바이러스 벡터는 민감한 세포를 감염시킨 이후, 앞서 정의된 다량의 PCV2 ORF2를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 이런 이유로, 본 발명은 PCV2 ORF2 단백질을 생산 및/또는 회수하는 개선된 방법에 관계하는데, 상기 방법은 가급적, PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 바이러스 벡터는 재조합 바쿨로바이러스이다. 본 명세서에 제시된, PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 방법의 상세는 아래에 기술된다: 바람직한 형태에서, 세포를 감염시키는데 이용되는, PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터는 ORF2 유전자가 클론된 전달 벡터를 바이러스 벡터 내로 형질감염시킴으로써 생성된다. 적절하게는, ORF2 DNA를 보유하는 전달 벡터의 일부분만 바이러스 벡터 내로 형질감염된다.
“바이러스 벡터 내로 형질감염”은 바이러스 벡터, 예를 들면, 바쿨로바이러스 벡터 내로 이질성 DNA의 “도입” 또는 “클로닝”과 동의어이다. 적절하게는, 바이러스 벡터는 바쿨로바이러스이지만 반드시 그러할 필요는 없다.
따라서, 본 발명의 다른 측면에서, 재조합 바이러스 벡터는 이종성 PCV2 ORF2 DNA를 보유하는 전달 벡터 및 바이러스 벡터, 바람직하게는, 바쿨로바이러스, 이보다 더욱 바람직하게는, 선형화된 복제-결함성 바쿨로바이러스(가령, Baculo Gold DNA) 사이에 재조합에 의해 산출된다. “전달 벡터”는 적어도 하나의 복제 기점(origin of replication); 이종성 유전자(본 출원의 경우에, PCV2 ORF2); 이종성 유전자의 바이러스 벡터 내로의 클로닝을 가능하게 DNA 서열을 보유하는 DNA 분자를 의미한다. 적절하게는, 이종성 유전자의 바이러스 벡터 내로의 클로닝을 가능하게 서열은 상기 이종성 유전자의 측면에 위치한다. 더욱 적절하게는, 이들 측면에 위치하는 서열은 바이러스 벡터의 서열과 적어도 부분적으로 상동하다. 이러한 서열 상동성(sequence homology)은 양쪽 분자(즉, 바이러스 벡터와 전달 벡터)의 재조합을 가능하게 하여 이종성 유전자를 보유하는 재조합 바이러스 벡터를 산출한다. 이와 같은 바람직한 전달 벡터는 선호되는 Sf+ 세포주(cell line) 내로 Baculo Gold DNA로 동시-형질감염(co-transfection)용으로 설계된 pVL1392 벡터(BD Biosciences Pharmingen)이다. 적절하게는, 상기 전달 벡터는 PCV2 ORF2 DNA를 포함한다. 동시-형질감염된 구조체는 대략 10,387개 염기쌍(base pair) 길이를 갖는다.
더욱 바람직한 형태에서, 본 발명의 방법은 PCV2 ORF2 DNA의 분리로 시작된다. 일반적으로, 이는 공지의 또는 미지의 균주로부터 유래될 수 있는데, 그 이유는 ORF2 DNA가 상이한 분리물 사이에 적어도 95% 서열 동일성(sequence identity)으로 고도로 보존되는 것으로 생각되기 때문이다. 당분야에 공지된 임의의 PCV2 ORF2 유전자가 본 발명에 이용될 수 있는데, 그 이유는 상기 유전자가 상층액 내로 발현되기 때문이다. PCV ORF2 DNA는 바람직하게는, PCR 방법, 더욱 바람직하게는, 5' 측면 Kozak 일치 서열(CCGCCAUG)(SEQ ID NO 1) 및/또는 3' 측면 EcoRl 부위(GAATTC)(SEQ ID NO 2)의 도입과 공동으로 PCR 방법을 이용하여 증폭된다. 적절하게는, 5' Kozak 일치 서열의 이런 도입은 PCV2 ORF2의 자연 발생 개시 코돈(start codon) AUG를 제거한다. 적절하게는, 3' EcoRl 부위는 PCV2 ORF2의 종결 코돈(stop codon)의 하류에 도입된다. 더욱 적절하게는, 이는 자체적으로, PCV2 ORF2 종결 코돈의 하류에 위치하는 폴리 A 전사 종결 서열(transcription termination sequence)의 하류에 도입된다. 특히, 앞서 기술된 바와 같은 Kozak 일치 서열의 이용은 차후 PCV2 ORF2 단백질의 발현 수준을 증가시킨다. 이들 부가적인 서열을 포함하는 증폭된 PCV2 ORF2 DNA는 벡터 내로 클론된다. 이러한 최초 클로닝 단계에 적합한 벡터는 pGEM-T-Easy 벡터(Promega, Madison, WI)이다. 적절하게는, 일부 pGEM 벡터 서열(SEQ ID NO: 7)을 보유하는 PCV2 ORF2 DNA는 Not1 제한 부위에서 벡터로부터 절단된다. 생성된 DNA는 전달 벡터 내로 클론된다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서, PCV2 ORF2 DNA를 보유하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 방법이 제시된다. 이러한 방법은 i) 재조합 PCV2 ORF2를 전달 벡터 내로 클로닝하고; ii) 재조합 PCV2 ORF2를 보유하는 전달 벡터 또는 이의 일부분을 바이러스 벡터 내로 형질감염시켜 재조합 바이러스 벡터를 산출하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 전달 벡터는 앞서 기술되거나, 앞서 기술된 바와 같이 작제되거나, 또는 도 1에 예시된다. 따라서, 다른 측면에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 재조합 바이러스 벡터의 작제에 이용되는 전달 벡터는 SEQ ID NO: 7의 서열을 보유한다.
다른 측면에서, 이러한 방법은 단계 i)에 앞서, 아래의 단계를 더욱 포함한다: PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭하고, 여기서 PCV2 ORF2 DNA의 측면 서열은 앞서 기술된 바와 같이 변형된다. PCV2 ORF2 DNA를 증폭하고 측면 서열을 변형하며, 시험관내 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 내로 클로닝하는 시험관내 방법 및 적절한 전달 벡터는 앞서 기술되거나, 도 1에 예시되거나, 또는 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터를 작제하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 i) PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭하고, 여기서 PCV2 ORF2 DNA의 측면 서열은 변형되고; ii) 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 내로 클로닝하고; iii) 재조합 PCV2 ORF2 DNA를 보유하는 전달 벡터 또는 이의 일부분을 바이러스 벡터 내로 형질감염시켜 재조합 바이러스 벡터를 산출하는 단계를 포함한다. 적절하게는, PCV2 ORF2 DNA의 측면 서열의 변형은 앞서 기술된 바와 같이, 예를 들면, 5' Kozak 서열 및/또는 EcoR1 부위를 도입함으로써 수행된다.
다른 측면에서, PCV2의 오픈 리딩 프레임 2에 의해 발현되는 재조합 단백질을 생산 및/또는 회수하는 방법이 제시된다. 전반적으로, 상기 방법은 i) 재조합 PCV2 ORF2를 전달 벡터 내로 클로닝하고; ii) 재조합 PCV2 ORF2를 보유하는 전달 벡터 또는 이의 일부분을 바이러스 내로 형질감염시키고; iii) 배지 내에 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키고; iv) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하도록 유도하고; v) 세포를 상층액으로부터 분리하고; vi) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상층액으로부터 회수하는 단계를 포함한다.
재조합 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 내로 클론하는 방법은 전술된다. 적절하게는, 전달 벡터는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7의 서열을 보유한다. 하지만, 재조합 바이러스 벡터 내로 형질감염된 PCV2 ORF2 DNA가 세포 배양액 내에서 발현된다면, 전달 벡터는 변형되거나 변형되지 않은 임의의 PCV2 ORF2 DNA를 보유할 수 있다. 적절하게는, 재조합 바이러스 벡터는 SEQ ID NO:8의 서열을 포함한다. 게다가, 세포를 감염시키는 방법, 바람직하게는, PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 한정된 수의 재조합 바쿨로바이러스로 세포를 감염시키는 방법은 상세하게 전술된다. 더 나아가, 상층액으로부터 세포를 분리하는 단계 및 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 회수하는 단계 역시 상세하게 전술된다. 본 명세서에 기술된 이들 특이적인 처리 단계는 앞서 기술된 바와 같이 PCV2의 오픈 리딩 프레임 2에 의해 발현되는 재조합 단백질을 생산 및/또는 회수하는 방법의 일부이다. 적절하게는, 세포는 SF+ 세포이다. 더욱 적절하게는, 세포 배양액은 대략 0.3 - 2.0 x 106개 세포/㎖, 더욱 바람직하게는, 대략 0.35 - 1.9 x 106개 세포/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.4 - 1.8 x 106개 세포/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.45 - 1.7 x 106개 세포/㎖, 가장 바람직하게는, 대략 0.5 - 1.5 x 106개 세포/㎖의 세포 수를 보유한다. 적절하게는, PCV2 ORF2 DNA를 보유하는 재조합 바이러스 벡터는 민감한 세포의 감염에 이용되는 경우에, 대략 0.03 - 1.5, 더욱 바람직하게는, 대략 0.05 - 1.3, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.09 - 1.1, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.1 - 1.0, 가장 바람직하게는, 대략 0.5의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOl)를 보유한다. 적절하게는, 감염이후 5일 내지 8일 사이에 및/또는 세포 생존능이 10% 이하로 감소할 때 획득된 세포의 상층액 내에서 PCV2 ORF2 단백질의 회수. 적절하게는, PCV2 ORF2 단백질을 생산하는 경우에, 세포는 25 내지 29℃에서 배양된다. 적절하게는, 분리 단계는 원심분리 또는 여과 단계이다.
선택적으로, 상기 방법은 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 내로 클로닝하기에 앞서 PCV2의 균주로부터 PCV2 ORF2 DNA를 증폭하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 형태에서, 5' Kozak 서열, 3' EcoRl 부위, 이들의 조합은 가급적, 증폭 이전에 또는 증폭 동안, 증폭된 서열에 추가될 수 있다. 바람직한 5 Kozak 서열은 SEQ ID NO: 1을 포함한다. 바람직한 3' EcoRl 부위는 SEQ ID NO: 2를 포함한다. 바람직한 PCV2 ORF2 DNA는 뉴클레오티드 서열 Genbank Accession No. AF086834(SEQ ID NO: 3)과 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 바람직한 재조합 PCV2 ORF2 단백질은 SEQ 1D NO: 3(Genbank Accession No. AF086834)에 의해 인코딩되는 단백질인 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열 및 SEQ ID NO: 4에 의해 인코딩되는 단백질인 SEQ ID No: 6의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 배지는 혈청-없는 곤충 세포 배지, 더욱 바람직하게는, Excell 420 배지를 포함한다. 선택적 증폭 단계가 수행되는 경우에, 증폭된 오픈 리딩 프레임 2를 첫 번째 벡터 내로 먼저 클론하고, 첫 번째 벡터로부터 오픈 리딩 프레임 2를 절단하고, 전달 벡터 내로 클로닝을 위한 절단된 오픈 리딩 프레임을 이용하는 것이 바람직하다. 동시-형질감염에 적합한 세포주는 SF+ 세포주이다. 동시-형질감염에 적합한 바이러스는 바쿨로바이러스이다. 이러한 방법의 바람직한 형태에서, 전달 벡터의 형질감염된 부분은 SEQ ID NO: 8을 포함한다. 최종적으로, 이러한 방법에서, 세포를 바이러스로 감염시킨 이후 적어도 5일 시점에 세포 배양 상층액 내에서 PCV2 오픈 리딩 프레임 2(ORF2) 단백질을 회수하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 PCV2 오픈 리딩 프레임 2를 생산 및/또는 회수하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 i) 가급적, 5' Kozak 서열을 추가하고 및/또는 3' EcoRl 제한 부위를 추가함으로써, PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭하고, ii) 증폭된 PCV2 ORF2를 전달 벡터 내로 클로닝하고; iii) 재조합 PCV2 ORF2를 보유하는 전달 벡터 또는 이의 일부분을 바이러스 내로 형질감염시키고; iv) 배지 내에 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키고; v) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하도록 유도하고; vi) 세포를 상층액으로부터 분리하고; vii) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상층액으로부터 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 PCV2 ORF2 단백질 및 불활성화된 바이러스 벡터를 함유하는 조성물을 제조하는 방법에 관계한다. 상기 방법은 i) 증폭된 PCV2 ORF2를 전달 벡터 내로 클로닝하고; ii) 재조합 PCV2 ORF2를 보유하는 전달 벡터 또는 이의 일부분을 바이러스 내로 형질감염시키고; iii) 배지 내에 세포를 형질감염된 바이러스 벡터로 감염시키고; iv) 형질감염된 바이러스 벡터가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하도록 유도하고; v) 세포를 상층액으로부터 분리하고; vi) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상층액으로부터 회수하고; vii) 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 적절하게는, 재조합 바이러스 벡터는 ORF2 DNA 코딩 서열을 보유하는 바쿨로바이러스이고, 세포는 SF+ 세포이다. 바람직한 분리 단계는 앞서 기술된 것들이고, 가장 바람직하게는, 여과 단계이다. 바람직한 불활성화 단계는 앞서 기술된 것들이다. 적절하게는, 불활성화는 대략 35 - 39℃에서 2 내지 8 mM BEI, 더욱 바람직하게는, 대략 5 mM BEI의 존재에서 수행된다. 놀랍게도, 더욱 높은 농도의 BEI는 PCV2 ORF2 단백질에 부정적인 영향을 주고, 더욱 낮은 농도의 BEI는 24시간 내지 72시간 이내에 바이러스 벡터를 불활성화시키지 못하는 것으로 밝혀졌다.
다른 측면에서, 앞서 기술된 바와 같이, PCV2 ORF2 단백질 및 불활성화된 바이러스 벡터를 함유하는 조성물을 제조하는 방법은 단계 vii) 이후 중화 단계를 포함한다. 상기 단계 viii)는 용액 내에서 불활성화제를 중화시키는 동등량의 작용제를 추가한다. 적절하게는, 불활성화제가 BEI이면, 동등량으로 티오황산나트륨의 추가가 바람직하다. 따라서, 다른 측면에서, 단계 viii)는 불활성화제가 BEI이면, 대략 1 내지 대략 20 mM, 바람직하게는, 대략 2 내지 대략 10 mM, 더욱 바람직하게는, 대략 2 내지 대략 8 mM, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 3 내지 대략 7 mM, 가장 바람직하게는, 대략 5 mM의 최종 농도로 티오황산나트륨 용액을 추가한다.
다른 측면에서, 앞서 기술된 바와 같이, PCV2 ORF2 단백질 및 불활성화된 바이러스 벡터를 함유하는 조성물을 제조하는 방법은 단계 i)에 앞서 아래의 단계를 포함한다: PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭하고, 여기서 PCV2 ORF2 DNA의 측면 서열은 앞서 기술된 바와 같이 변형된다. PCV2 ORF2 DNA를 증폭하고 이들 측면 서열을 증폭하며, 시험관내 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 내로 클로닝하는 시험관내 방법 및 적절한 전달 벡터는 앞서 기술되거나, 도 1에 예시되거나, 또는 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 다른 측면에서, 상기 방법은 i) PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭하고, 여기서 PCV2 ORF2 DNA의 측면 서열은 변형되고; ii) 증폭된 PCV2 ORF2를 전달 벡터 내로 클로닝하고; iii) 재조합 PCV2 ORF2를 보유하는 전달 벡터 또는 이의 일부분을 바이러스 내로 형질감염시켜 재조합 바이러스 벡터를 산출하고; iv) 배지 내에 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키고; v) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하도록 유도하고; vi) 세포를 상층액으로부터 분리하고; vii) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상층액으로부터 회수하고; viii) 가급적, 대략 1 내지 대략 20 mM BEI, 가장 바람직하게는, 대략 5 mM BEI의 존재에서 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키고; ix) 용액 내에서 불활성화제를 중화시키는 동등량의 작용제를 추가하는, 바람직하게는, 불활성화제가 BEI이면, 대략 1 내지 대략 20 mM, 바람직하게는, 대략 5 mM의 최종 농도로 티오황산나트륨 용액을 추가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에서, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물, 바람직하게는, 항원성 조성물, 예를 들면, 백신을 제조하는 방법이 제시된다. 전반적으로, 이러한 방법은 구조체를 바이러스 내로 형질감염시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 구조체는 i) PCV2의 ORF2로부터 재조합 DNA를 증폭하고; ii) 성장 배지 내에 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키고; iii) 상기 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하도록 유도하고; iv) 발현된 ORF2 단백질을 상층액으로부터 회수하고; v) 회수된 단백질을 적절한 어쥬번트 및/또는 다른 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서, “어쥬번트”에는 수산화알루미늄(aluminum hydroxide)과 인산알루미늄(aluminum phosphate), 사포닌(saponin)(가령, Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 유중수(water-in-oil) 에멀젼, 수중유(oil-in-water) 에멀젼, 수중유중수(water-in-oil-in-water) 에멀젼이 포함될 수 있다. 에멀젼은 특히, 경질 유동(light liquid) 파라핀 오일(European Pharmacopea type); 이소프레노이드 오일(isoprenoid oil), 예를 들면, 스쿠알란(squalane) 또는 스쿠알렌; 알켄, 특히, 이소부텐(isobutene) 또는 데센(decene)의 올리고머화(oligomerization)로부터 생성되는 오일; 선형 알킬기를 보유하는 산이나 알코올의 에스테르, 더욱 구체적으로, 식물 오일, 에틸 올레이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레이트; 가지화된 지방산이나 알코올의 에스테르, 특히, 이소스테아르산 에스테르에 기초될 수 있다. 이러한 오일은 에멀젼을 형성하기 위하여 유화제와 공동으로 사용된다. 적절하게는, 유화제는 비이온성 계면활성제, 특히, 소르비탄(sorbitan)의 에스테르, 만니드(mannide)의 에스테르(가령, 안하이드로만니톨 올레이트(anhydromannitol oleate)), 글리콜의 에스테르, 폴리글리세롤의 에스테르, 프로필렌 글리콜의 에스테르, 올레산, 이소스테아르산, 리시놀산 또는 하이드록시스테아르산의 에스테르(이들은 선택적으로, 에톡실화된다), 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히, Pluronic 제품, 구체적으로, L121이다(참조: Hunter et al, The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995); Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)).
가령, "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995의 147 페이지와 183 페이지에 기술된 SPT 에멀젼을 이용하는 것이 가능하다.
어쥬번트의 다른 실례는 아크릴산이나 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이다. 바람직한 어쥬번트 화합물은 특히, 당이나 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르로 가교-연결된 아크릴산이나 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)로 알려져 있다(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). 또한, 당업자는 적어도 3개, 바람직하게는, 8개 이하의 하이드록실기(hydroxyl group)를 보유하는 폴리하이드록실화된 화합물로 가교-연결된 아크릴산 중합체를 기술하는 U.S. Patent No. 2,909,462를 참조할 수 있는데, 적어도 3개의 하이드록실 중에서 수소 원자는 적어도 2개의 탄소 원자를 보유하는 포화되지 않은 지방족 라디칼로 대체된다. 바람직한 라디칼은 2개 내지 4개의 탄소 원자를 보유하는 라디칼, 예를 들면, 비닐(vinyl), 알릴(allyl) 및 다른 에틸렌 불포화된 기이다. 이들 불포화된 라디칼은 자체적으로, 메틸과 같은 다른 치환기를 보유한다. 상품명 카르보폴(Carbopol)로 판매되는 제품(BF Goodrich, Ohio, USA)이 특히 적합하다. 이들은 알릴 수크로오스(allyl sucrose) 또는 알릴 펜타에리트리톨(allyl pentaerythritol)로 가교-연결된다. 예로써, 카르보폴 974P, 934P, 971P가 사용된다. 가장 바람직하게는, 카르보폴 971P가 사용된다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에서, 공중합체 EMA(Monsanto)는 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체이다.
물 내에서 이들 중합체의 용해는 가급적, 생리 pH로 중화되어 어쥬번트 용액을 제공하는 산성 용액을 발생시키는데, 상기 어쥬번트 용액 내로 면역 조성물 또는 백신 조성물 자체가 통합된다.
다른 적절한 어쥬번트에는 특히, RIBI 어쥬번트 시스템(Ribi Inc.), 블록 공중합체(CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, 아비리딘 지질-아민 어쥬번트, 대장균(E. coli)으로부터 열-불안정성 엔테로톡신(enterotoxin)(재조합 또는 기타), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
적절하게는, 어쥬번트는 1회 분량당 대략 100 ㎍ 내지 대략 10 ㎎의 양으로 추가된다. 더욱 적절하게는, 어쥬번트는 1회 분량당 대략 100 ㎍ 내지 대략 10 ㎎의 양으로 추가된다. 이보다 더욱 적절하게는, 어쥬번트는 1회 분량당 대략 500 ㎍ 내지 대략 5 ㎎의 양으로 추가된다. 이보다 더욱 적절하게는, 어쥬번트는 1회 분량당 대략 750 ㎍ 내지 대략 2.5 ㎎의 양으로 추가된다. 가장 바람직하게는, 어쥬번트는 1회 분량당 대략 1 ㎎의 양으로 추가된다.
따라서, 다른 측면에서, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하는 항원 조성물, 예를 들면, 백신을 제조하는 방법은 i) PCV2 ORF2 단백질을 제조하고 회수하며, ii) 이를 적절한 어쥬번트와 혼합하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 어쥬번트는 카르보폴 971P이다. 더욱 적절하게는, 카르보폴 971P는 1회 분량당 대략 500 ㎍ 내지 대략 5 ㎎의 양, 더욱 바람직하게는, 1회 분량당 대략 750 ㎍ 내지 대략 2.5 ㎎의 양, 가장 바람직하게는, 1회 분량당 대략 1 ㎎의 양으로 추가된다. 적절하게는, 단계 i)는 PCV2 ORF2의 제조와 회수를 위한 앞서 기술된 단계를 포함한다. 가령, 이러한 방법의 바람직한 형태에서, PCV2 ORF2 DNA를 포함하는 구조체는 전달 벡터 내에서 획득된다. 적절한 전달 벡터 및 이들을 제조하는 방법은 앞서 기술된다. 선택적으로, 이러한 방법은 ORF2를 전달 벡터 내로 클로닝하기에 앞서, PCR을 통하여 PCV2의 균주로부터 ORF2를 증폭하는 단계를 포함한다. 바람직한 오픈 리딩 프레임 서열, Kozak 서열, 3' EcoRl 부위 서열, 재조합 단백질 서열, 형질감염된 구조체 서열, 배지, 세포, 바이러스는 상기한 방법에서 기술된 바와 동일하다. 이러한 방법에 대한 다른 선택적 단계는 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 첫 번째 벡터 내로 클로닝하고, 상기 첫 번째 벡터로부터 ORF2 DNA를 절단하고, 전달 벡터 내로의 클로닝을 위한 상기 절단된 PCV2 ORF2 DNA를 이용하는 과정을 포함한다. 다른 방법에서처럼, 상층액으로부터 재조합 ORF2 단백질의 회수에 앞서, 형질감염된 바쿨로바이러스에 의한 세포의 감염이후 적어도 5일간 기다리는 것이 바람직하다. 적절하게는, 이러한 방법의 회수 단계에는 세포와 세포 잔해로부터 배지를 분리하는 단계 역시 포함된다. 이는 다양한 방법으로 수행될 수 있긴 하지만, 편의를 위하여, 대략 0.45 μM 내지 대략 1.0 μM 크기의 구멍을 보유하는 필터를 통하여 세포, 세포 잔해, 성장 배지를 여과하는 것이 바람직하다. 최종적으로, 이러한 방법을 위하여, 회수된 재조합 PCV2 ORF2 단백질을 조성물 내에 혼합하기에 앞서, 바이러스 불활성화 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 이는 다양한 방법으로 수행될 수 있긴 하지만, BEI를 이용하는 것이 바람직하다.
따라서, 다른 측면에서, 이러한 방법은 i) PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭하고, 여기서 PCV2 ORF2 DNA의 측면 서열은 변형되고; ii) 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 내로 클로닝하고; iii) 재조합 PCV2 ORF2 DNA를 보유하는 전달 벡터 또는 이의 일부분을 바이러스 내로 형질감염시켜 재조합 바이러스 벡터를 산출하고; iv) 배지 내에 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키고; v) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하도록 유도하고; vi) 세포를 상층액으로부터 분리하고; vii) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상층액으로부터 회수하고; viii) 가급적, 대략 1 내지 대략 20 mM BEI, 가장 바람직하게는, 대략 5 mM BEI의 존재에서 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키고; ix) 용액 내에서 불활성화제를 중화시키는 동등량의 작용제를 추가하고, 바람직하게는, 불활성화제가 BEI이면, 대략 1 내지 대략 20 mM, 바람직하게는, 대략 5 mM의 최종 농도로 티오황산나트륨 용액을 추가하고; x) 적절한 양의 어쥬번트, 바람직하게는, 앞서 기술된 양(가령, 1회 분량당 대략 500 ㎍ 내지 대략 5 ㎎, 더욱 바람직하게는, 1회 분량당 대략 750 ㎍ 내지 대략 2.5 ㎎, 가장 바람직하게는, 1회 분량당 대략 1 ㎎)으로 카르보폴, 바람직하게는, 카르보폴 971P를 추가하는 단계를 포함한다.
부가적으로, 조성물은 한가지이상의 제약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 명세서에서, “제약학적으로 허용되는 담체”에는 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 어쥬번트, 안정화제, 희석액, 보존제, 항균제와 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등이 포함된다. 가장 적절하게는, 본 발명의 조성물은 시험관내 배양된 세포의 상층액으로부터 회수된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는데, 여기서 상기 세포는 PCV2 ORF2 DNA를 보유하고 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 벡터로 감염되고, 상기 세포 배양액은 상기 바이러스 벡터를 불활성화시키는 대략 2 내지 대략 8 mM BEI, 바람직하게는, 대략 5 mM BEI; 대략 2 내지 대략 8 mM, 바람직하게는, 대략 5 mM의 최종 농도로 동등한 농도의 중화제, 바람직하게는, 티오황산나트륨 용액; 1회 분량당 대략 500 ㎍ 내지 대략 5 ㎎, 더욱 바람직하게는, 1회 분량당 대략 750 ㎍ 내지 대략 2.5 ㎎, 가장 바람직하게는, 1회 분량당 대략 1 ㎎의 양으로 카르보폴, 바람직하게는, 카르보폴 971P; 대략 50 내지 대략 90% (v/v), 더욱 바람직하게는, 대략 60 내지 80% (v/v), 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 70% (v/v)의 양으로 생리 염수로 처리되었다.
따라서, 다른 측면은 PCV2에 대한 면역 반응을 유도하는 항원 조성물, 예를 들면, 백신을 제조하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 i) PCV2 ORF2 DNA를 시험관내에서 증폭하고, 여기서 PCV2 ORF2 DNA의 측면 서열은 변형되고; ii) 증폭된 PCV2 ORF2 DNA를 전달 벡터 내로 클로닝하고; iii) 재조합 PCV2 ORF2 DNA를 보유하는 전달 벡터 또는 이의 일부분을 바이러스 내로 형질감염시켜 재조합 바이러스 벡터를 산출하고; iv) 배지 내에 세포를 형질감염된 바이러스로 감염시키고; v) 형질감염된 바이러스가 PCV2 ORF2로부터 재조합 단백질을 발현하도록 유도하고; vi) 세포를 상층액으로부터 분리하고; vii) 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 상층액으로부터 회수하고; viii) 가급적, 대략 2 내지 대략 20 mM BEI, 가장 바람직하게는, 대략 5 mM BEI의 존재에서 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키고; ix) 용액 내에서 불활성화제를 중화시키는 동등량의 작용제를 추가하고, 바람직하게는, 불활성화제가 BEI이면, 대략 0.5 내지 대략 20 mM, 바람직하게는, 대략 5 mM의 최종 농도로 티오황산나트륨 용액을 추가하고; x) 적절한 양의 어쥬번트, 바람직하게는, 앞서 기술된 양(가령, 1회 분량당 대략 500 ㎍ 내지 대략 5 ㎎, 더욱 바람직하게는, 1회 분량당 대략 750 ㎍ 내지 대략 2.5 ㎎, 가장 바람직하게는, 1회 분량당 대략 1 ㎎)으로 카르보폴, 바람직하게는, 카르보폴 971P를 추가하고; xi) 대략 50 내지 대략 90% (v/v), 더욱 바람직하게는, 대략 60 내지 80% (v/v), 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 70% (v/v)의 양으로 생리 염수를 추가하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 이러한 방법은 보호제의 추가를 포함할 수도 있다. 본 명세서에서, 보호제는 항균 활성제, 예를 들면, 젠타마이신(Gentamycin), 메르티올레이트(Merthiolate) 등을 의미한다. 특히, 보호제의 추가는 다회 투약(multi-dose) 조성물의 제조에 바람직하다. 이들 항균 활성제는 목적하는 조성물 내에서 임의의 미생물학적 오염을 예방하거나 임의의 미생물학적 성장을 저해하는데 효과적인 농도로 추가된다.
게다가, 이러한 방법은 산물 반감기를 증가 및/또는 유지하기 위하여 임의의 안정화제(stabilizing agent), 예를 들면, 당류, 트레할로스, 만니톨, 사카로오스(saccharose) 등의 추가를 포함할 수도 있다. 하지만, 놀랍게도, 생성된 제제는 임의의 다른 안정화제의 추가 없이, 적어도 24개월 동안 면역학적으로 유효한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 다른 측면은 앞서 기술된 방법으로부터 생성되는 산물에 관계한다. 특히, 본 발명은 재조합 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 물질의 조성물에 관계한다. 또한, 본 발명은 곤충 세포 배양액의 상층액으로부터 회수된, 재조합 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 물질의 조성물에 관계한다. 더 나아가, 본 발명은 곤충 세포 배양액의 상층액으로부터 회수된, 재조합 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 물질의 조성물에 관계한다. 적절하게는, 이러한 조성물은 바이러스 벡터의 불활성화에 적합한 작용제를 더욱 함유한다. 게다가, 본 발명은 곤충 세포 배양액의 상층액으로부터 회수된, 재조합 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하고, 바이러스 벡터의 불활성화에 적합한 작용제, 바람직하게는, BEI 및 상기 불활성화제의 중화를 위한 중화제를 함유하는 물질의 조성물에 관계한다. 적절하게는, BEI가 불활성화제로서 사용되면, 중화제는 티오황산나트륨이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 면역 반응, 더욱 바람직하게는, PCV2 감염의 임상 징후에 대한 보호 면역을 공여하는 면역 조성물이 제시된다. 일반적으로, 이러한 조성물은 PCV2의 오픈 리딩 프레임 2(ORF2)에 의해 발현되는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 조성물의 항원 성분을 함유한다.
이들 조성물의 제조를 위한 본 명세서에 제시된 공정에서 사용되는 PCV2 ORF2 DNA와 단백질은 PCV2 분리물 내에서 고도로 보존된 도메인이고, 따라서, 임의의 PCV2 ORF2가 본 발명에서 PCV ORF2 DNA 및/또는 폴리펩티드의 공급원으로서 유효하다. 바람직한 PCV2 ORF2 단백질은 SEQ ID NO. 11의 단백질이다. 바람직한 PCV ORF2 폴리펩티드는 본 발명에서 SEQ ID NO. 5로서 제시되지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 상기 서열은 서열 상동성(sequence homology)에서 6-10% 변하면서도 면역 조성물 내에서 이를 유용하게 하는 항원성을 여전히 유지한다. 면역 조성물의 항원성은 예로써, 실시예 4에 제시된 공격접종(challenge) 실험으로 평가될 수 있다. 더 나아가, 변형된 항원의 항원성은 변형된 항원이 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 PCV2 ORF 2 단백질과 비교하여 적어도 70%, 바람직하게는, 80%, 더욱 바람직하게는, 90%의 보호 면역(protective immunity)을 공여하는 경우에, 여전히 유지된다. 본 명세서에서, “면역 조성물”은 PCV2 ORF2 단백질에 대한 세포 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 호스트 내에서 “면역 반응”을 유도하는 PCV2 ORF2 단백질을 의미한다. 적절하게는, 이러한 면역 조성물은 PCV2 감염 및 이와 연관된 임상 징후에 대한 보호 면역을 공여할 수 있다. 일부 형태에서, PCV2 ORF2 단백질의 면역원성 부분은 조성물 내에서 항원 성분으로서 사용된다. 본 명세서에서, “면역원성 부분”은 각각, PCV2 ORF2 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드의 절두된 및/또는 치환된 형태, 또는 단편을 의미한다. 적절하게는, 이런 절두된 및/또는 치환된 형태, 또는 단편은 전장 ORF2 폴리펩티드로부터 적어도 6개의 연속 아미노산을 포함한다. 더욱 적절하게는, 절두되거나 치환된 형태, 또는 단편은 전장 ORF2 폴리펩티드로부터 적어도 10개, 바람직하게는, 적어도 15개, 더욱 바람직하게는, 적어도 19개 연속 아미노산을 보유한다. 이러한 측면에서 바람직한 2개의 서열은 본 명세서에서 SEQ ID NO 9와 10으로서 제시된다. 이들 서열은 더욱 큰 단편이나 절두된 형태의 일부일 수도 있다. 본 명세서에 제시된 더욱 바람직한 PCV2 ORF2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 하지만, 당업자가 인지하는 바와 같이, 상기 서열은 서열 상동성(sequence homology)에서 6-20% 변하면서도 면역 조성물 내에서 이를 유용하게 하는 항원성을 여전히 유지한다. 일부 형태에서, ORF2의 절두되거나 치환된 형태, 또는 단편은 조성물 내에서 항원 성분으로서 사용된다. 적절하게는, 절두되거나 치환된 형태, 또는 단편은 전장 ORF2 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4로부터 적어도 18개 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 더욱 적절하게는, 절두되거나 치환된 형태, 또는 단편은 전장 ORF2 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4로부터 적어도 30개, 더욱 바람직하게는, 적어도 45개, 이보다 더욱 바람직하게는, 적어도 57개 연속 뉴클레오티드를 보유한다.
“서열 동일성(sequence identity)”은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 다시 말하면, 참고 서열 및 상기 참고 서열과 비교되는 일정한 서열 사이에 상관관계를 의미한다. 서열 동일성은 일정한 서열과 참고 서열을 최적으로 정렬하여 이들 서열의 가닥 사이에 정합(match)으로 결정되는 최대 서열 유사성을 도출한 이후, 상기 일정한 서열과 상기 참고 서열을 비교함으로써 결정된다. 이런 정렬이후, 서열 동일성은 위치별 기초(position-by-position basis)에서 확인된다, 예를 들면, 이들 서열은 특정 위치에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 일치하는 경우에, 상기 위치에서 “일치한다”. 이런 위치 일치(position identity)의 총수는 참고 서열 내에 뉴클레오티드 또는 잔기의 총수로 나눗셈함으로써 % 서열 동일성을 얻는다. 서열 동일성은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)에 기술된 공지된 방법으로 용이하게 산정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하는 바람직한 방법은 검사된 서열 사이에 최대 정합을 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 일정한 서열 사이에 서열 동일성을 결정하는 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 이런 프로그램의 실례에는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI 및 다른 출처(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)로부터 공개적으로 입수가능하다. 이들 프로그램은 일정한 서열과 참고 서열 사이에 최대 수준의 서열 동일성을 달성하기 위하여 디폴트 갭 가중(default gap weight)을 이용하여 서열을 최적으로 정렬한다. 예시로써, 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도 85%, 바람직하게는, 90%, 더욱 바람직하게는, 95% “서열 동일성”을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드에 의해, 일정한 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 상기 일정한 폴리뉴클레오티드 서열이 참고 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드당 최대 15개, 바람직하게는, 최대 10개, 더욱 바람직하게는, 최대 5개 점 돌연변이(point mutation)를 보유하는 경우를 제외하고, 상기 참고 서열에 일치한다. 다시 말하면, 참고 뉴클레오티드 서열과 비교하여 적어도 85%, 바람직하게는, 90%, 더욱 바람직하게는, 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드 내에서, 참고 서열에서 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게는, 10%, 더욱 바람직하게는, 5%가 결실되거나 다른 뉴클레오티드로 치환되고, 또는 참고 서열 내에서 전체 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게는, 10%, 더욱 바람직하게는, 5%의 뉴클레오티드가 상기 참고 서열 내로 삽입된다. 참고 서열의 이들 돌연변이는 참고 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치, 또는 이들 말단 위치 사이에 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열 내에 뉴클레오티드 사이에 또는 상기 참고 서열 내에서 하나이상의 연속 기 내에 개별적으로 산재된다. 유사하게, 참고 아미노산 서열에 적어도 85%, 바람직하게는, 90%, 더욱 바람직하게는, 95% “서열 동일성”을 갖는 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드에 의해, 일정한 폴리펩티드의 아미노산 서열은 상기 일정한 폴리펩티드 서열이 참고 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산당 최대 15개, 바람직하게는, 최대 10개, 더욱 바람직하게는, 최대 5개 아미노산 변이를 보유하는 경우를 제외하고, 상기 참고 서열에 일치한다. 다시 말하면, 참고 아미노산 서열과 적어도 85%, 바람직하게는, 90%, 더욱 바람직하게는, 95% 서열 동일성을 갖는 일정한 폴리펩티드 서열을 획득하기 위하여, 참고 서열 내에서 아미노산 잔기의 최대 15%, 바람직하게는, 10%, 더욱 바람직하게는, 5%가 결실되거나 다른 아미노산으로 치환되고, 또는 참고 서열 내에서 전체 아미노산 잔기의 최대 15%, 바람직하게는, 10%, 더욱 바람직하게는, 5%의 아미노산이 상기 참고 서열 내로 삽입된다. 참고 서열의 이들 변이는 참고 참고 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치, 또는 이들 말단 위치 사이에 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열 내에 잔기 사이에 또는 상기 참고 서열 내에서 하나이상의 연속 기 내에 개별적으로 산재된다. 하지만, 보존성 치환은 서열 동일성을 결정할 때, 정합으로서 포함되지 않는다.
본 명세서에서, “서열 상동성”은 두 서열의 관련성(relatedness)을 결정하는 방법을 의미한다. 서열 상동성을 결정하기 위하여, 2개 이상의 서열은 최적으로 정렬되고, 필요한 경우에 갭(gap)이 도입된다. 하지만, “서열 동일성”과 대조적으로, 서열 상동성을 결정하는 경우에는 보존성 아미노산 치환이 정합으로서 계산된다. 다시 말하면, 참고 서열과 95% 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위하여, 참고 서열 내에서 85%, 바람직하게는, 90%, 더욱 바람직하게는, 95%의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 정합하거나 다른 아미노산 또는 뉴클레오티드로 보존성 치환을 포함하고, 또는 참고 서열 내에서, 보존성 치환을 배제하고 전체 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 최대 15%, 바람직하게는, 최대 10%, 더욱 바람직하게는, 최대 5%의 아미노산 또는 뉴클레오티드가 상기 참고 서열 내로 삽입된다. 적절하게는, 동족체(homolog) 서열은 적어도 50개, 바람직하게는, 100개, 더욱 바람직하게는, 250개, 이보다 더욱 바람직하게는, 500개의 뉴클레오티드를 포함한다.
“보존성 치환”은 전체 기능성(functionality)이 현저하게 변화되지 않도록 유사한 특징이나 특성(가령, 크기, 소수성 등)을 갖는 다른 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드로 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 치환을 의미한다.
“분리된”은 자연 상태로부터 “인간의 손에 의해” 변화되었음을 의미한다, 다시 말하면, 최초 환경으로부터 변화되거나 이전되었음 의미한다. 가령, 살아있는 생물체 내에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 “분리된”것이 아닌 반면, 자연 상태의 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 “분리된” 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 감소시키는데 효과적인, PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 면역 조성물에 관계한다. 적절하게는, PCV2 ORF2 단백질은 앞서 기술된 것들 중에서 한가지이다. 적절하게는, 상기 PCV2 ORF2 단백질은
i) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1O 또는 SEQ ID NO: 11의 서열을 포함하는 폴리펩티드;
ii) i)의 폴리펩티드에 적어도 80% 상동한 폴리펩티드;
iii) i) 및/또는 ii)의 폴리펩티드의 면역원성 부분;
iv) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 1O 또는 SEQ ID NO: 11의 서열에 내포된 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는, iii)의 면역원성 부분;
v) SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 DNA에 의해 인코딩되는 폴리펩티드;
vi) v)의 폴리뉴클레오티드에 적어도 80% 상동한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드;
vii) v) 및/또는 vi)의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 면역원성 부분;
viii) vii)의 면역원성 부분, 여기서 상기 면역원성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO: 4의 서열에 내포된 적어도 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
적절하게는, SEQ ID No: 3 또는 SEQ ID No: 4의 서열에 의해 인코딩되는 PCV2 ORF2 단백질의 면역 특징을 갖는 이들 면역원성 부분 중에서 한가지이다.
다른 측면에서, PCV2 ORF2 단백질은 원하는 면역 반응을 유도하는, 다시 말하면, PCV2 감염에 기인하는 임상적 증상의 발생률을 감소시키거나 심각도를 완화시키는데 효과적인 항원 포함 수준(antigen inclusion level)에서 면역 조성물 내에 제공된다. 적절하게는, PCV2 ORF2 단백질 포함 수준은 최종 면역 조성물 ㎖당 적어도 0.2 ㎍ 항원(㎍/㎖), 바람직하게는, 대략 0.2 내지 대략 400 ㎍/㎖, 더욱 바람직하게는, 대략 0.3 내지 대략 200 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.35 내지 대략 100 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.4 내지 대략 50 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.45 내지 대략 30 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.6 내지 대략 15 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.75 내지 대략 8 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.0 내지 대략 6 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.3 내지 대략 3.0 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.4 내지 대략 2.5 ㎍/㎖, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.5 내지 대략 2.0 ㎍/㎖, 가장 바람직하게는, 대략 1.6 ㎍/㎖이다.
다른 측면에서, ORF2 항원 포함 수준은 최종 항원 조성물의 1회 분량당 적어도 0.2 ㎍의 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질(㎍/1회 분량), 바람직하게는, 대략 0.2 내지 대략 400 ㎍/1회 분량, 더욱 바람직하게는, 대략 0.3 내지 대략 200 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.35 내지 대략 100 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.4 내지 대략 50 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.45 내지 대략 30 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.6 내지 대략 15 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 0.75 내지 대략 8 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.0 내지 대략 6 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.3 내지 대략 3.0 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.4 내지 대략 2.5 ㎍/1회 분량, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 1.5 내지 대략 2.0 ㎍/1회 분량, 가장 바람직하게는, 대략 1.6 ㎍/1회 분량이다.
본 발명에 따른 면역 조성물 내에 사용되는 PCV2 ORF2 폴리펩티드는 PCV2 ORF2의 분리와 정제, 표준 단백질 합성, 재조합 방법을 비롯한 임의의 방식으로 유래될 수 있다. PCV2 ORF2 폴리펩티드를 획득하는 바람직한 방법은 앞서 기술되고, U.S. Patent Application Serial No. 11/034,797에 의해서도 제공된다. 간단히 말하면, 민감한 세포는 PCV2 ORF2 DNA 코딩 서열을 보유하는 재조합 바이러스 벡터로 감염시키고, PCV2 ORF2 폴리펩티드는 상기 재조합 바이러스로 발현시키고, 발현된 PCV2 ORF2 폴리펩티드는 여과로 상층액으로부터 회수하고, 가급적 이원 에틸렌이민(binary ethylenimine)을 이용한 통상적인 방법으로 불활성화시키고, 이후, 중화시켜 불활성화 과정을 중단시킨다.
따라서, 다른 측면에서, 면역 조성물은 i) 가급적, 앞서 기술된 농도로, 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질 중에서 한가지 및 ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는, 재조합 바쿨로바이러스의 적어도 일부분을 함유한다. 더 나아가, 다른 측면에서, 면역 조성물은 i) 가급적, 앞서 기술된 농도로, 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질 중에서 한가지, ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는, 재조합 바쿨로바이러스의 적어도 일부분, iii) 세포 배양 상층액의 일부분을 함유한다.
PCV2 ORF2 단백질에 대한 생산과 회수 공정의 특정 구체예에서, 세포 배양 상층액은 구멍 크기, 바람직하게는, 대략 0.45 내지 1 ㎛의 구멍 크기를 갖는 막을 통하여 여과된다. 따라서, 다른 측면은 i) 가급적, 앞서 기술된 농도로, 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질 중에서 한가지, ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터, 바람직하게는, 재조합 바쿨로바이러스의 적어도 일부분, iii) 세포 배양액의 일부분을 함유하는 면역 조성물에 관계하는데, 여기서 이들 성분의 대략 90%는 1 ㎛보다 작은 크기를 갖는다.
다른 측면에서, 본 발명은 i) 가급적, 앞서 기술된 농도로, 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질 중에서 한가지, ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii) 세포 배양액의 일부분, iv) 상기 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게는, BEI를 함유하는 면역 조성물에 관계하는데, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 대략 90%는 1 ㎛보다 작은 크기를 갖는다. 적절하게는, BEI는 바쿨로바이러스를 불활성화시킬 만큼 충분한 농도로 존재한다. 효과적인 농도는 앞서 기술된다.
다른 측면에서, 본 발명은 i) 가급적, 앞서 기술된 농도로, 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질 중에서 한가지, ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii) 세포 배양액의 일부분, iv) 상기 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게는, BEI, v) 상기 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 중단시키는 중화제를 함유하는 면역 조성물에 관계하는데, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 대략 90%는 1 ㎛보다 작은 크기를 갖는다. 적절하게는, 불활성제가 BEI이면, 상기 조성물은 BEI에 동등한 양으로 티오황산나트륨을 함유한다.
이러한 폴리펩티드는 PCV2 감염에 민감한 동물에 투여될 수 있는 조성물 내로 통합된다. 바람직한 형태에서, 조성물은 당업자에게 공지된 보조 성분을 함유할 수도 있다(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18th ed. Mack Publ., Easton). 부가적으로, 조성물은 한가지이상의 수의학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 본 명세서에서, “수의학적으로 허용되는 담체”에는 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 어쥬번트, 안정화제, 희석액, 보존제, 항균제와 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등이 포함된다.
바람직한 구체예에서, 면역 조성물은 항원 성분으로서, 가급적, 앞서 기술된 농도로, 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는데, 상기 단백질은 어쥬번트, 바람직하게는, 카르보폴 및 생리 염수와 혼합된다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 생리학적으로 허용되는 공지된 주사가능 염수 용액을 통합한다. 비경구 주사 또는 주입을 위한 즉석(ready-to-use) 용액을 제조하기 위하여, 수용성 등장 용액, 예를 들면, 염수 또는 상응하는 혈장 단백질 용액은 용이하게 구입가능하다. 이에 더하여, 본 발명의 면역 조성물과 백신 조성물은 희석액, 등장제, 안정화제, 또는 어쥬번트를 함유할 수 있다. 희석액에는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등이 포함될 수 있다. 등장제에는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 락토오스 등이 포함될 수 있다. 안정화제에는 알부민, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylendiamintetracetic acid)의 알칼리 염 등이 포함될 수 있다. 적절한 어쥬번트는 앞서 기술된다. 가장 적절하게는, 가급적 앞서 기술된 양(가령, 1회 분량당 대략 500 ㎍ 내지 대략 5 ㎎, 더욱 바람직하게는, 1회 분량당 대략 750 ㎍ 내지 대략 2.5 ㎎, 가장 바람직하게는, 1회 분량당 대략 1 ㎎)으로 카르보폴, 바람직하게는, 카르보폴 971P가 사용된다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 i) 가급적, 앞서 기술된 농도로, 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질 중에서 한가지, ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii) 세포 배양액의 일부분, iv) 상기 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게는, BEI, v) 상기 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 중단시키는 중화제, 바람직하게는, BEI에 동등한 양으로 티오황산나트륨, vi) 적절한 어쥬번트, 바람직하게는, 앞서 기술된 양으로 카르보폴 971P를 함유하는 면역 조성물에 관계하는데, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 대략 90%는 1 ㎛보다 작은 크기를 갖는다. 다른 측면에서, 이러한 면역 조성물은 제약학적으로 허용되는 염, 바람직하게는, 생리학적으로 허용되는 농도에서 인산염을 더욱 함유한다. 적절하게는, 상기 면역 조성물의 pH는 생리 pH, 다시 말하면, 대략 6.5 내지 7.5의 pH로 조정된다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 1 ㎖당 i) 앞서 기술된 적어도 1.6 ㎍의 PCV2 ORF2 단백질, ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바쿨로바이러스의 적어도 일부분, iii) 세포 배양액의 일부분, iv) 대략 2 내지 8 mM BEI, v) BEI에 동등한 양으로 티오황산나트륨, vi) 대략 1 ㎎ 카르보폴 971P, vii) 생리학적으로 허용되는 농도에서 인산염을 함유하는 면역 조성물에 관계하는데, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 대략 90%는 1 ㎛보다 작은 크기를 갖고, 상기 면역 조성물의 pH는 대략 6.5 내지 7.5로 조정된다.
면역 조성물은 인터루킨, 인터페론 또는 다른 사이토킨과 같은 한가지이상의 다른 면역조절제를 더욱 함유할 수 있다. 면역 조성물은 젠타마이신과 메르티올레이트를 또한 함유할 수 있다. 본 발명의 배경에서 유용한 어쥬번트와 첨가제의 양과 농도가 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있긴 하지만, 본 발명에서는 대략 50 ㎍ 내지 대략 2000 ㎍의 어쥬번트 및 바람직하게는, 대략 250 ㎍/㎖ 용량의 백신 조성물을 함유하는 조성물을 고려한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 대략 l ㎍/㎖ 내지 대략 60 ㎍/㎖의 항균 활성제, 더욱 바람직하게는, 대략 30 ㎍/㎖ 이하의 항균 활성제를 함유하는 백신 조성물을 고려한다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 i) 가급적, 앞서 기술된 농도로, 앞서 기술된 PCV2 ORF2 단백질 중에서 한가지, ii) 상기 PCV2 ORF2 단백질을 발현하는 바이러스 벡터의 적어도 일부분, iii) 세포 배양액의 일부분, iv) 상기 재조합 바이러스 벡터를 불활성화시키는 불활성화제, 바람직하게는, BEI, v) 상기 불활성화제에 의해 매개되는 불활성화를 중단시키는 중화제, 바람직하게는, BEI에 동등한 양으로 티오황산나트륨, vi) 적절한 어쥬번트, 바람직하게는, 앞서 기술된 양으로 카르보폴 971P, vii) 제약학적으로 허용되는 농도의 염수 완충액, 바람직하게는, 인산염, viii) 항균 활성제를 함유하는 면역 조성물에 관계하는데, 여기서 성분 i) 내지 iii)의 대략 90%는 1 ㎛보다 작은 크기를 갖는다.
놀랍게도, 본 발명의 면역 조성물은 24개월 동안 매우 안정한 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 본 발명의 면역 조성물은 PCV2 감염과 연관된 임상적 증상을 감소시키는데 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, 본 발명의 재조합 바쿨로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 본 발명의 면역 조성물은 활성화된 형태에서 전체 PCV2 바이러스, 또는 분리된 바이러스 PCV2 ORF2 항원을 함유하는 면역 조성물보다 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다. 특히, 놀랍게도, 재조합 바쿨로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질은 매우 낮은 농도에서 효과적인데, 이는 농도에서 0.25 ㎍/1회 분량을 의미한다. PCV2 ORF2 단백질의 이런 예상치 않게 높은 면역 잠재력(immunogenic potential)은 카르보폴의 추가로 더욱 증가될 수 있다.
다른 측면은 본 발명의 PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 적어도 1회 분량을 보유하는 용기에 관계하는데, 여기서 1회 분량은 적어도 2 ㎍ PCV2 ORF2 단백질, 바람직하게는, 2 내지 16 ㎍ PCV2 ORF2 단백질을 함유한다. 상기 용기는 1 내지 250회 분량의 면역 조성물, 바람직하게는, PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 또는 250회 분량을 보유한다. 적절하게는, PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 1회 이상의 분량을 보유하는 각 용기는 항균 활성제를 더욱 포함한다. 이들 약제는 예로써, 젠타마이신과 메르티올레이트를 비롯한 항생제 등이다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 1 내지 250회 분량을 보유하는 용기에 관계하는데, 여기서 1회 분량은 적어도 2 ㎍ PCV2 ORF2 단백질 및 대략 1 ㎍/㎖ 내지 대략 60 ㎍/㎖, 바람직하게는 30 ㎍/㎖ 이하의 항생제, 바람직하게는, 젠타마이신 및/또는 메르티올레이트를 함유한다.
다른 측면은 앞서 기술된 용기 및 PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키기 위하여 새끼 돼지 내로 PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 적어도 1회 분량의 근육내 적용을 위한 정보를 위한 사용설명서를 포함하는 키트에 관계한다. 더 나아가, 다른 측면에서, 상기 사용설명서는 PCV2 ORF2의 면역 조성물의 적어도 1회 분량의 2차 또는 추가 투여에 관한 정보를 포함하는데, 여기서 이러한 2차 또는 추가 투여는 최초 또는 이전 투여이후 적어도 14일 시점에 수행된다. 적절하게는, 상기 사용설명서는 면역 촉진제(immune stimulant)를 투여하기 위한 정보를 포함한다. 적절하게는, 상기 면역 촉진제는 적어도 2회 제공된다. 적절하게는, 면역 촉진제의 1차와 2차 또는 추가 투여 사이에 적어도 3일, 더욱 바람직하게는, 적어도 5일, 이보다 더욱 바람직하게는, 적어도 7일 이격된다. 적절하게는, 면역 촉진제는 PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 최초 투여이후 적어도 10일, 바람직하게는, 15일, 이보다 더욱 바람직하게는, 20일, 이보다 더욱 바람직하게는, 적어도 22일 시점에 투여된다. 바람직한 면역 촉진제는 예로써, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 바람직하게는, 불완전 Freund 어쥬번트로 유화된 KLH(KLH/ICFA)이다. 하지만, 당업자에게 공지된 임의의 다른 면역 촉진제 역시 사용될 수 있다. 본 명세서에서, “면역 촉진제”는 가급적, 특정 면역 반응, 예를 들면, 특정 병원균에 대한 면역 반응을 개시하거 증가시키지 않으면서 면역 반응을 유인할 수 있는 임의의 작용제 또는 조성물을 의미한다. 이러한 면역 촉진제는 적절한 양으로 투여된다. 더 나아가, 이러한 키트는 면역 촉진제의 적어도 1회 분량, 바람직하게는, KLH 또는 KLH/ICFA의 1회 분량을 보유하는 용기를 포함한다.
게다가, 놀랍게도, 재조합 바쿨로바이러스 발현된 PCV2 ORF2 단백질을 함유하고, 바람직하게는, 카르보폴을 공동으로 함유하는 면역 조성물의 면역 잠재력은 IngelVac PRRS MLV 백신의 투여에 의해 더욱 강화될 수 있다(실시예 5 참조). PCV2 임상 징후와 질병 현시(disease manifestation)는 PRRS 감염이 존재할 때, 훨씬 확대된다. 하지만, 본 발명의 면역 조성물과 백신접종 전략은 예상보다 현저하게 이런 효과를 완화시킨다. 다시 말하면, 동물, 바람직하게는, 돼지를 본 발명의 PCV2 ORF2 면역 조성물 및 Ingelvac PRRS MLV 백신(Boehringer Ingelheim)으로 처리하는 경우에, 예상치 않은 상승적 효과가 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 본 발명의 PCV2 ORF2의 면역 조성물 및 사용설명서를 포함하는, 앞서 기술된 키트에 관계하는데, 여기서 상기 사용설명서는 PRRS 항원, 바람직하게는, 보조 PRRS 항원을 함유하는 면역 조성물과 함께, PCV2 ORF2 면역 조성물을 투여하기 위한 정보를 더욱 포함한다. 적절하게는, PRRS 항원은 IngelVacMLV(Boehringer Ingelheim)이다.
본 발명의 다른 측면은 i) 본 발명의 PCV2 ORF2의 면역 조성물의 적어도 1회 분량을 보유하는 용기, ii) PRRS 항원, 바람직하게는, 보조 PRRS 항원을 함유하는 면역 조성물을 보유하는 용기를 포함하는 키트에 관계한다. PRRS 항원은 IngelVacMLV(Boehringer Ingelheim)이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 키트는 양쪽 제약학적 조성물을 투여하기 위한 정보를 비롯한 사용설명서를 더욱 포함한다. 적절하게는, 상기 키트는 PCV2 ORF2 함유 조성물이 PRRS 함유 조성물에 앞서, 일시적으로 투여되는 정보를 포함한다.
다른 측면은 약제로서, 바람직하게는, 동물용 약제로서, 더욱 바람직하게는, 백신으로서 본 발명의 조성물의 용도에 관계한다. 더 나아가, 본 발명은 PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키기 위한 약제의 제조에서, 본 발명의 조성물의 용도에 관계한다. 적절하게는, 이러한 약제는 가급적, 새끼 돼지에서 PCV2 감염의 예방에 사용된다.
다른 측면은 (i) 감염 또는 PCV2로 재감염의 예방, 또는 (ii) 개체 내에서 PCV2에 의해 유발된 임상적 증상의 감소 또는 제거를 위한 방법에 관계하는데, 상기 방법은 본 발명의 면역 조성물을 병든 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 개체는 돼지이다. 적절하게는, 면역 조성물은 근육내 투여된다. 적절하게는, 1회 분량 또는 2회 분량의 면역 조성물이 투여되는데, 여기서 1회 분량은 바람직하게는, 적어도 대략 2 ㎍ PCV2 ORF2 단백질, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 2 내지 대략 16 ㎍, 적어도 대략 0.1 내지 대략 5 ㎎ 카르보폴, 바람직하게는, 대략 1 ㎎ 카르보폴을 함유한다. 다른 측면은 앞서 기술된 치료 방법에 관계하는데, 여기서 면역 조성물이 2차 투여된다. 적절하게는, 2차 투여는 동일한 면역 조성물, 바람직하게는, 동일한 양의 PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 동일한 면역 조성물로 수행된다. 적절하게는, 2차 투여는 근육내 제공된다. 적절하게는, 2차 투여는 최초 투여이후 적어도 14일 시점, 더욱 바람직하게는, 최초 투여이후 적어도 4주 시점에 수행된다.
다른 측면에서, 이러한 치료 방법은 면역 촉진제의 투여를 포함한다. 적절하게는, 상기 면역 촉진제는 적어도 2회 투여된다. 적절하게는, 면역 촉진제의 1차와 2차 또는 추가 투여 사이에 적어도 3일, 더욱 바람직하게는, 적어도 5일, 이보다 더욱 바람직하게는, 적어도 7일 이격된다. 적절하게는, 면역 촉진제는 PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 최초 투여이후 적어도 10일, 바람직하게는, 15일, 이보다 더욱 바람직하게는, 20일, 이보다 더욱 바람직하게는, 적어도 22일 시점에 투여된다. 바람직한 면역 촉진제는 예로써, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH), 바람직하게는, 불완전 Freund 어쥬번트로 유화된 KLH(KLH/ICFA)이다. 하지만, 당업자에게 공지된 임의의 다른 면역 촉진제 역시 사용될 수 있다. 적절한 양으로 면역 촉진제를 투여하는 것은 당업자의 평균적인 지식에 속한다.
다른 측면에서, 앞서 기술된 치료 방법은 PRRS 항원의 투여를 포함한다. 적절하게는, PRRS 항원은 IngelVacMLV(Boehringer Ingelheim)이다. 적절하게는, 상기 PRRS 항원은 PCV2 ORF2 단백질의 면역 조성물의 투여이후에 일시적으로 투여된다.
고찰
본 실시예에서는 7개의 PCV2 백신을 평가하였는데, 여기에는 2회 투여되는, IMS 1314로 보조된 높은 용량(16 ㎍)의 rORF2 항원; 돼지의 한 군에 1회 투여되고 돼지의 두 번째 군에 2회 투여되는, 카르보폴로 보조된 높은 용량(16 ㎍)의 vORF2 항원; 2회 투여되는, 카르보폴로 보조된 높은 용량(16 ㎍)의 rORF2 항원; 2회 투여되는, 카르보폴로 보조된 4 ㎍ 용량의 rORF2 항원; 2회 투여되는, 카르보폴로 보조된 1 ㎍ 용량의 rORF2 항원; 2회 투여되는, 카르보폴로 보조된 낮은 용량(0.25 ㎍)의 rORF2 항원; 카르보폴로 보조된 높은 용량(> 8 로그)의 사멸된 전체 세포 PCV2 백신이 포함되었다. 전체적으로, 2회 분량의 16 ㎍ rORF2 - IMS 1314가 투여된 1 군은 카르보폴로 보조된 다양한 수준의 vORF2 또는 rORF2 항원을 함유하는 백신이 투여된 2 내지 7 군보다 약간 우수하였고, 2회 분량의 사멸된 전체 세포 PCV2 백신이 투여된 8 군보다 훨씬 우수하였다. 1 군은 세 번째로 높은 ADWG(1.80± 0.30 lbs/day), 비정상적 행동의 가장 낮은 발생률(0%), 비정상적 호흡의 가장 낮은 발생률(0%), 기침의 낮은 발생률(7.1%), 전체 임상적 증상의 낮은 발생률(7.1%), 다른 3개 군에 필적하는 가장 낮은 치사율(0%), 평균% 폐 병소의 두 번째로 낮은 비율(0.15± 0.34%), 폐렴의 두 번째로 낮은 비율(21.4%), 양성 IHC 조직에 대한 가장 낮은 발생률(0%)을 보인다. 하지만, 1 군은 2차 백신접종후 1일 시점에, 백신접종을 맞은 개체 중에서 50%에서 주사 부위 반응이 유일하게 관찰되었다. 2 내지 7 군에 투여된 다른 백신은 사멸된 백신보다 우수하였고, 1 군에 투여된 백신에 거의 필적하였다.
카르보폴로 보조된 2회 분량의 사멸된 PCV2 백신이 투여된 8 군은 다른 백신 군보다 결과가 불량하였다. 8 군은 가장 낮은 ADWG(0.93± 0.33 lbs/day), 비정상적 행동의 두 번째로 높은 발생률(6.7%), 비정상적 호흡의 가장 높은 발생률(6.7%), 다른 3개 군에 필적하는 임상적 증상의 가장 높은 전체 발생률(13.3%), 가장 높은 치사율(20%), 가장 높은 양성 IHC 비율(80%)을 보였다. 사멸된 전체 세포 PCV2 백신이 8 군에 투여에 앞서, 완전하게 불활성화되지 않을 수도 있다는 우려가 있었는데, 이는 상기 군의 불량한 결과를 설명한다. 불행하게도, 한정된 데이터는 이러한 우려를 확증하지 못하였다. 전체적으로, 본 실시예의 배경에서, 통상의 사멸된 PCV2 백신은 PCV2 연관된 질환의 감소에 도움이 되지 않았다.
앞서 언급된 바와 같이, IMS 1314로 보조된 백신을 제외하고, 검사 백신과 연관된 부작용이 관찰되지 않았다. 주사 부위 반응은 IMS 1314로 조제된 백신으로 2차 백신접종이후 1일 시점에 돼지의 50% 및 2차 백신 접종이후 2일 시점에 돼지의 28.6%에서 관찰되었다. 카르보폴 보조된 백신이 투여된 돼지에서는 어떤 반응도 관찰되지 않았다. 돼지에서 주사 부위 반응을 면밀하게 검토하기 위하여, IMS 1314 보조된 백신으로 예방접종된 돼지와 관련된 추가적인 연구가 요구된다.
모든 돼지는 -3일에 PCV2에 대해 혈청음성이었고, 14일에 2 군만 100 초과의 역가를 보였다. 25일(공격접종일)에, 8 군이 가장 높은 PCV2 항체 역가(4619)를 보였고, 2 군(2507)이 그 뒤를 이었다. 7, 9, 10 군을 제외하고, 모든 군은 32일까지 강한 항체 반응을 나타냈다. 50일까지, 7, 9, 10 군을 비롯한 모든 군이 강한 항체 반응을 나타냈다.
후기 단계 PCV2 감염 및 후속 PMWS 발달의 특징 중의 하나는 이유된 돼지에서 성장 지체(growth retardation)이고, 심한 경우에, 체중 감소가 관찰된다. 군별 평균 일일 체중 증가는 성장 지체 또는 체중 감소를 입증하는 정량적 방법이다. 본 실시예에서, 군 사이에 ADWG의 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 8 군은 0.88± 0.29 lbs/day의 가장 낮은 ADWG를 보이는 반면, 4 군은 1.16± 0.26 lb/day의 가장 높은 ADWG를 보였다. 본 연구의 배경에서, 차후 백신 효능을 ADWG에 기초할 만큼 충분한 차이가 군 사이에 존재하지 않았다.
체중 감소 이외에, 호흡 곤란(dyspnea), 무기력(lethargy), 창백한 피부 및 때때로 황달이 PMWS와 연관된 임상적 증상이다. 본 실시예에서, 각 군에서 비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침은 드물게 관찰되었다. 본 연구에서 입증된 바와 같이, 이러한 공격 모형과 공격 균주는 압도적인 임상적 증상을 유도하지 못하기 때문에, 백신 효능의 기초가 되는 강한 파리미터가 되지 못한다.
전체적으로, 본 실시예에서 치사율은 높지 않고, 공격접종 대조군에서 높은 치사율의 부재는 백신 효능의 기초로서 이러한 파라미터를 제약한다. 46일 이전에, 4 군과 7 군은 15마리 돼지 중에서 1마리씩 폐사하고, 9 군은 14마리 돼지 중에서 2마리가 폐사하고, 8 군은 15마리 돼지 중에서 3마리가 폐사하였다. 공격접종 대조군인 9 군이 PCV2 임상적 증상을 나타내지 않고 46일까지 단지 2마리만 폐사한다는 사실로 인하여, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) MLV 백신이 46일에 모든 돼지에 투여되었다. 기존 연구에서는 PCV2-연관된 PMWS 질환을 격화시키기 위한 면역촉진제로서 INGELVACMLV를 이용하였는데, 이들 기존 연구에서 치사율이 더욱 높았다. 46일에 PRRS 백신을 투여한 직후에 2마리가 폐사하였다 - 4 군은 46일에 1마리가 폐사하고 7 군은 47일에 1마리가 폐사하였는데, 이는 아마도, PRRS 백신의 투여와 연관하지 않았다. 50일까지, 2회 분량의 사멸된 백신이 투여된 8 군은 가장 높은 치사율(20%)을 보였고, 9 군(공격접종 대조)과 7 군(0.25 ㎍ rORF2 - 카르보폴)이 각각, 14.3%와 13.3%의 치사율로 그 뒤를 이었다. 전체적으로, 본 실시예의 공격접종이후 관찰 단계에서 후기에, 이러한 공격접종 모형에 PRRS 백신의 투여는 치사율을 별로 증가시키지 않았다.
PCV2 감염에 부차적인 PMWS를 앓는 돼지에서 육안적 병소는 전형적으로, 한가지이상의 하기 증상과 함께, 전신 림프절병증(generalized lymphadenopathy)으로 구성된다: (1) 소엽사이 부종(interlobular edema)과 함께 간질성 폐렴(interstitial pneumonia), (2) 창백한 피부(cutaneous pallor) 또는 황달(icterus), (3) 얼룩덜룩한 위축성 간(mottled atrophic liver), (4) 위궤양(gastric ulcers), (5) 신장염(nephritis). 부검(50일)에서, 어떤 군에서도 황달, 간염, 신장염이 관찰되지 않았다. 위궤양은 7 군 돼지에서 관찰되었지만, 림프절병증은 특정하게 검사되지 않았다. PCV2 감염과 일치하는 병소의 존재에 기초하여, 3개 군은 적어도 1마리의 돼지가 PCV2(PMWS)로 시험적으로 진단되었다. 2회 분량의 사멸된 백신이 투여된 8 군은 20%가 PCV2로 시험적으로 진단된 반면, 7 군과 4 군은 각각, 13.3%와 6.7%가 PCV2로 시험적으로 진단되었다. 부검에서, 평균% 폐 병소 스코어는 군마다 상이하였다. 1, 2, 3, 4, 6, 10 군은 0.11± 0.38% 내지 0. 90± 0.15% 범위의 낮은 평균% 폐 병소 스코어를 보였다. 예상된 바와 같이, 공격접종 대조군인 9 군은 가장 높은 평균% 폐 병소 스코어(10.81± 23.27%)를 보였다. 4개 군에서, 평균% 폐 병소 스코어는 각 군에서, 매우 높은 폐 병소 스코어를 보이는 1 내지 3마리의 돼지로 인하여 상승되었다. 이들 폐 병소는 적색/자색으로 보고되었고 굳어졌다. 전형적으로, PMWS와 연관된 폐 병소는 황갈색으로 보고되고 소엽사이 부종(interlobular edema)으로 접혀지지 않는다. 본 연구에서 관찰된 폐 병소는 PCV2 감염과 무관하거나, 또는 이차적인 폐 감염성 병원균이 존재했던 것으로 생각된다. 본 연구의 배경에서, % 폐 병소 스코어는 아마도, PCV2에 기인한 폐 감염의 진실한 크기를 반영하지 못한다. 유사하게, 폐렴의 시험적 진단 역시 과용되었던 것으로 생각된다. 0.10% 정도의 폐 병소를 보이는 돼지는 폐렴의 시험적 진단에 포함되었다. 본 실시예에서, 백신 효능의 기초가 되는 육안적 병소와 % 폐 병소와 관련하여, 군 사이에 충분한 차이가 관찰되지 않았다.
IHC 결과는 군 사이에 최대 차이를 보였다. 1 군(16 ㎍ rORF2 - IMS 1314)은 PCV2 항원에 대한 가장 낮은 양성 IHC 결과(0%)를 보였다; 반면, 9 군과 10 군은 각각, 100%와 93.3%의 발생률로 가장 높은 양성 IHC 결과를 보였다. 각각, 카르보폴로 보조된 16, 4, 1 또는 0.25 ㎍의 rORF2 항원이 투여된 3, 5, 6, 7 군은 각각, 20%, 20%, 40%, 46.7%의 IHC 양성 발생률을 보였다. 카르보폴로 보조된 2회 분량의 16 ㎍ vORF2가 투여된 2 군은 6.7%의 IHC 양성 발생률을 보이는 반면, 동일 백신의 1회 분량이 투여된 4 군은 13.3%의 IHC 양성 발생률을 보였다. 본 연구의 객관적인 특성 및 IHC 결과가 예측된 결과와 상관한다는 사실로 인하여, IHC 결과는 아마도, 백신 효능의 기초가 되는 최고의 파라미터 중의 하나이다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서, PCV2가 공격접종되는 CDCD 돼지 모형 내에서 카르보폴로 보조된 PCV2 rORF2 항원의 최소 보호 용량(Minimum Portective Dosage, MPD)을 결정한다. 3, 5, 6, 7 군은 각각, 카르보폴로 보조된 2회 분량의 rORF2 항원이 투여되었지만, rORF2 항원의 수준이 각 군마다 상이하였다. 3, 5, 6, 7 군은 각각, 16, 4, 1 또는 0.25 ㎍의 rORF2 항원이 투여되었다. 전체적으로, rORF2 항원의 수준이 감소함에 따라, PCV2 항체 역가가 감소하고 치사율, 평균% 폐 병소, IHC 양성 조직의 발생률이 증가하였다. 다양한 수준의 rORF2 - 카르보폴이 투여된 4개의 군 중에서, 2회 분량의 16 또는 4 ㎍의 rORF2 항원이 투여된 3 군과 5 군은 각각, 20%의 IHC 양성 발생률 및 유사한 항체 역가를 보였다. 전체적으로, IHC 양성 결과에 기초하여, 2회 투여되는 rORF2 항원의 최소 보호 용량은 대략 4 ㎍이다.
본 발명의 다른 측면에서, 재조합(rORF2)과 VIDO R-1(vORF2) PCV2 항원의 항원성을 평가하였다. 2 군은 2회 분량의 16 ㎍ vORF2가 투여되었고, 3 군은 2회 분량의 16 ㎍ rORF2가 투여되었다. 양쪽 백신 모두 카르보폴로 보조되었다. 양쪽 백신 모두 안전한 것으로 밝혀졌고 0% 치사율을 보였다. 2 군은 25일에 2507의 PCV2 항체 역가를 보이는 반면, 3 군은 1503의 PCV2 항체 역가를 보였다. 3 군은 2군보다 낮은 평균% 폐 병소 스코어(0.11± 0.38% vs. 0.90± 0.15%)를 보이지만, 2 군은 3 군보다 낮은 IHC 양성 발생률(6.7% vs. 20%)을 보였다. 전체적으로, 양쪽 백신은 유사한 항원성을 나타내지만, vORF2가 근소하게 나은 IHC 결과와 연관하였다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 2가지 상이한 어쥬번트(카르보폴과 IMS 1314)의 적합성을 결정하였다. 1 군과 3 군은 둘 모두 16 ㎍ rORF2 항원을 함유하는 2회 분량의 백신이 투여되지만, 1 군은 IMS 1314로 보조된 항원이 투여된 반면, 3 군은 카르보폴로 보조된 항원이 투여되었다. 양쪽 군은 본질적으로 동일한 ADWG, 공격접종이후 임상적 증상의 본질적으로 동일한 발생률, 동일한 치사율, 본질적으로 동일한 평균% 폐 병소를 보였다; 하지만, 1 군은 0%의 IHC 양성 발생률을 보이는 반면, 3 군은 20%의 IHC 양성 발생률을 보였다. 25, 32, 50일에, 카르보폴로 보조된 백신이 투여된 3 군은 IMS 1314로 보조된 백신이 투여된 1 군보다 높은 IFAT PCV2 역가를 보였다. 전체적으로, IMS 1314로 보조된 PCV2 백신이 더욱 우수한 IHC 결과를 제공하긴 하지만, 상기 백신은 PCV2 감염으로부터 압도적으로 우수한 보호를 제공하지 못하고 주사 부위 반응을 유발하였다. 반면에, 카르보폴로 보조된 PCV2 백신은 IMS 1314 보조된 백신에 거의 필적하면서도 임의의 부작용과 연관하지 않았다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 1 ㎖, 1회 분량 산물로서 PCV2 ORF2의 실현가능성을 결정하였다. 2 군과 4 군 둘 모두 0일에, 카르보폴로 보조된 16 ㎍ vORF2 백신이 투여되었지만, 2 군은 14일에 2차 투여되었다. 4 군은 2 군보다 근소하게 높은 ADWG와 더욱 낮은 평균% 폐 병소를 보이지만, 2 군은 25, 32, 50일에 더욱 높은 IFAT PCV2 역가와 IHC 양성 조직의 근소하게 낮은 발생률을 보였다. 이들 두 군에 대한 모든 다른 결과는 유사하였다. 전체적으로, 카르보폴로 보조된 1회 분량의 vORF2는 2회 분량의 동일 백신과 유사하게 기능하였다.
도 1은 PCV2 ORF2 재조합 바쿨로바이러스의 작제(construction)의 개략적 흐름도이다.
도 2a와 2b는 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 방법의 개략적 흐름도이다.
아래의 실시예에서는 본 발명에 따른 바람직한 물질과 절차를 열거한다. 하지만, 이들 실시예는 예시를 목적으로 제공되고, 본 발명의 전체 범위를 결코 한정하지 않는다.
실시예 1
본 실시예에서는 본 발명의 방법을 이용한 ORF2의 상대적인 수율과 당분야에 공지된 방법을 이용하여 획득된 수율을 비교한다. 4000 ㎖ 스피너 플라스크(spinner flask) 각각은 300㎖의 곤충 혈청-없는 배지, Excell 420(JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) 내에서 대략 l.0x106개 Sf+ 세포/㎖로 접종하였다. 마스터 세포 배양액은 SF+(파밤 나방(Spodoptera frugiperda)) Master Cell Stock, passage 19, Lot#N1 12-095W이었다. 상기 SF+ Master Cell Stock을 발생시키는데 이용되는 세포는 Protein Sciences Corporation, Inc.,(Meriden, CT)로부터 입수하였다. 본 실시예를 위한 SF+ 세포주는 19회와 59회 계대배양 사이로 한정하였다. 다른 계대배양이 본 발명의 목적을 충족시키긴 하지만, 대규모 생산을 위한 규모 확대를 위하여, 적어도 19회 계대배양이 필요하고, 59회를 초과하는 계대배양은 입증된 것은 아니지만 발현에 영향을 주는 것으로 생각된다. 더욱 구체적으로, 액체 질소 저장액으로부터 최초 SF+ 세포 배양액은 일정하게 교반하면서 무균 스피너 플라스크 내에서 Excell 420 배지에서 현탁 상태로 성장시켰다. 이들 배양액은 25 내지 150 ㎖의 Excell 420 혈청-없는 배지를 보유하는 100 ㎖ 내지 250 ㎖ 스피너 플라스크 내에서 성장시켰다. 세포가 1.0 - 8.0 x 106개 세포/㎖의 세포 밀도(cell density)로 증폭되면, 이들은 0.5 - 1.5 x 106개 세포/㎖의 식재 밀도(planting density)로 새로운 용기에 분할하였다. 후속 확장 배양액은 25 - 29℃에서 2-7일 동안 최대 36 리터 크기의 스피너 플라스크 또는 최대 300 리터의 스테인리스 스틸 생물반응기 내에서 성장시켰다.
접종이후, 플라스크는 4시간동안 27℃에서 배양하였다. 이후, 각 플라스크는 PCV2 ORF2 유전자(SEQ ID NO: 4)를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스로 접종하였다. PCV2 ORF2 유전자를 보유하는 재조합 바쿨로바이러스는 아래와 같이 발생시켰다: PCV2의 North American 균주로부터 PCV2 ORF2 유전자는 5' Kozak 서열(SEQ ID NO: 1)과 3' EcoRl 부위(SEQ ID NO: 2)를 보유하도록 PCR 증폭하고, pGEM-T-Easy 벡터(Promega, Madison, WI) 내로 클론하였다. 이후, 이는 절단하고, 전달 벡터 pVLl392(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) 내로 서브클론하였다. 상기, 서브클론된 부분은 SEQ ID NO: 7로서 표시된다. PCV2 ORF2 유전자를 보유하는 pVLl392 플라스미드는 N47-064Y로 명명하고, 이후 바쿨로Gold(BD Biosciences Pharmingen) 바쿨로바이러스 DNA로 Sf+ 곤충 세포(Protein Sciences, Meriden, CT) 내로 동시-형질감염시켜 PCV2 ORF2 유전자를 보유하는 재조합 바쿨로바이러스를 발생시켰다. 이러한 새로운 구조체는 SEQ ID NO: 8로서 제시된다. PCV2 ORF2 유전자를 보유하는 상기 재조합 바쿨로바이러스는 플라크-정제(plaque-purification)하고, 종균 바이러스(master seed virus, MSV)는 SF+ 세포주에서 증식시키고, 분량하고, -70℃에서 보관하였다. 상기 MSV는 바쿨로바이러스 특이적 프라이머를 이용한 PCR-RFLP에 의해 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스로서 양성으로 확인되었다. MSV 또는 제조용 균주(working seed) 바이러스를 발생시키기 위하여 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스로 감염된 곤충 세포는 간접 형광 항체 검사(indirect fluorescent antibody assay)에서 다클론 혈청 또는 단클론 항체에 의해 검출되는 바와 같이, PCV2 ORF2 항원을 발현한다. 부가적으로, PCV2 ORF2 바쿨로바이러스의 동일성은 N-말단 아미노산 서열분석(sequencing)으로 확증하였다. 또한, PCV2 ORF2 바쿨로바이러스 MSV는 9 C.F.R. 113.27 (c), 113.28, 113.55에 따라 순도를 검사하였다. 스피너 플라스크 내로 접종된 각 재조합 바쿨로바이러스는 다양한 감염 다중도(MOI)를 나타냈다. 플라스크 1은 7.52㎖의 0.088 MOl 균주로 접종하였다; 플라스크 2는 3.Ol㎖의 0.36M0I 균주로 접종하였다; 플라스크 3은 1.5㎖의 0.1 8MOI 균주로 접종하였다; 플라스크 4는 0.75㎖의 0.09M01 균주로 접종하였다. PCV2 ORF2 재조합 바쿨로바이러스를 작제하는데 이용되는 기본 단계를 예시하는 개략적 흐름도는 도 1에 제시된다.
바쿨로바이러스로 접종한 이후, 이들 플라스크는 100rpm에서 교반하면서 27± 2℃에서 7일동안 배양하였다. 사용된 이들 플라스크는 뚜껑을 환기시켜 공기 흐름을 가능하게 하였다. 각 플라스크로부터 샘플은 다음 7일동안 24시간마다 채취하였다. 추출이후, 각 샘플은 원심분리하고, 펠릿과 상층액은 분리하고, 이후 0.45-1.0 ㎛ 구멍 크기 막을 통하여 미세여과하였다.
생성된 샘플은 그들 내에 존재하는 ORF2의 양을 ELISA 검사를 통하여 정량하였다. ELISA 검사는 0.05M 탄산염 완충액(pH 9.6) 내에서 1:6000으로 희석된 정제된(PBS에서 1:250 희석됨) 포획 항체(capture antibody) Swine 항-PCV2 Pab IgG Prot. G로 수행하였다. 이후, 100 ㎕의 항체를 마이크로역가 평판의 웰에 위치시키고, 밀봉하고, 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 그 다음, 상기 평판은 0.5㎖의 Tween 20(Sigma, St. Louis, MO), 100㎖의 l0X D-PBS(Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA), 899.5㎖의 증류수로 구성되는 세척 용액으로 3회 세척하였다. 이후, 250 ㎕의 차단 용액(blocking solution)(1O㎖의 D-PBS QS 내에서 증류수로 100㎖까지 5g 담홍색 탈지분유(Nestle, Glendale, CA)를 각 웰에 추가하였다. 그 다음, 검사 평판을 세척하고 미리-희석된 항원을 추가하였다. 미리-희석된 항원은 희석 평판 상에서 각 웰에 200 ㎕의 희석 용액(999.5㎖ D-PBS 내에서 0.5㎖ Tween 20)을 추가함으로써 생산하였다. 이후, 샘플은 1:240 비율과 1:480 비율에서 희석하고, 100 ㎕의 이들 희석된 샘플 각각은 희석 평판 상에서 상부 웰 중의 하나에 추가하였다(즉, 한 상부 웰은 100 ㎕의 1:240 희석된 샘플을 수용하고, 다른 상부 웰은 100 ㎕의 1:480 희석된 샘플을 수용하였다). 각 연속 웰로부터 100 ㎕를 채취하고 이를 평판 상에서 다음 웰에 이전함으로써 상기 평판의 나머지 부분에서 연속 희석을 수행하였다. 각 웰은 다음 이전을 수행하기에 앞서, 혼합하였다. 검사 평판 세척은 세척 완충액으로 평판을 3회 세척하는 단계를 포함하였다. 이후, 평판은 밀봉하고, 세척 완충액으로 3회 추가로 세척하기에 앞서, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이용된 검출 항체(detection antibody)는 PCV ORF2에 단클론 항체이었다. 이는 희석 용액 내에서 1:300으로 희석하고, 100 ㎕의 희석된 검출 항체는 이들 웰에 추가하였다. 그 다음, 평판은 밀봉하고, 세척 완충액으로 3회 세척하기에 앞서, 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 공액 희석액(conjugate diluent)은 정상 토끼 혈청(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)을 1% 농도로 희석 용액에 추가함으로써 제조하였다. 공액 항체(conjugate antibody) 염소 항-생쥐(H+l)-HRP(Jackson Immunoresearch)는 공액 희석액 내에서 1:10,000 희석하였다. 100 ㎕의 희석된 공액 항체는 각 웰에 추가하였다. 그 다음, 평판은 밀봉하고, 세척 완충액으로 3회 세척하기에 앞서, 37℃에서 45분동안 배양하였다. 동등 부피의 과산화효소 기질 B(KPL)와 혼합된 100 ㎕의 기질(TMB 과산화효소 기질, Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL), Gaithersberg, MD)을 각 웰에 추가하였다. 평판은 실온에서 15분동안 배양하였다. 이후, 100 ㎕의 1N HCl 용액을 모든 웰에 추가하여 반응을 중단시켰다. 그 다음, 평판은 ELISA 판독기에서 정사하였다. 이 검사의 결과는 하기 표 1에 제공된다.
일자 플라스크 펠릿 내에 ORF2(㎍) 상층액 내에 ORF2(㎍)
3 1 47.53 12
3 2 57.46 22
3 3 53.44 14
3 4 58.64 12
4 1 43.01 44
4 2 65.61 62
4 3 70.56 32
4 4 64.97 24
5 1 31.74 100
5 2 34.93 142
5 3 47.84 90
5 4 55.14 86
6 1 14.7 158
6 2 18.13 182
6 3 34.78 140
6 4 36.88 146
7 1 6.54 176
7 2 12.09 190
7 3 15.84 158
7 4 15.19 152
이들 결과는 배양 시간이 연장되면, 원심분리된 세포와 배지의 상층액 내에서 ORF2의 발현이 원심분리된 세포와 배지의 펠릿 내에서 발현보다 크다는 것을 암시한다. 따라서, 5일 미만으로 발현시키고 세포로부터 ORF2를 회수하는 것보다는 ORF2를 적어도 5일동안 발현시키고 상층액 내에서 이를 회수하는 것이 ORF2 수율에서 높은 증가 및 기존 방법에 비하여 현저한 개선을 제공한다.
실시예 2
본 실시예에서는 본 발명의 효능에 관한 데이터를 제공한다. l000㎖ 스피너 플라스크는 300㎖의 Excell 420 배지 내에서 대략 1.0x106개 Sf+ 세포/㎖로 접종하였다. 이후, 상기 플라스크는 27℃에서 배양하고 100rpm에서 교반하였다. 그 다음, 상기 플라스크는 24시간 배양이후, 0.1 MOI를 갖는 10 ㎖의 PCV2 ORF2/Bac p+6(Sf9 곤충 세포에서 6회 추가로 계대배양된 PCV2 ORF2 유전자를 보유하는 재조합 바쿨로바이러스) 바이러스 균주로 접종하였다.
이후, 상기 플라스크는 27℃에서 총 6일동안 배양하였다. 배양이후, 상기 플라스크는 원심분리하고, 생성된 상층액의 3개 샘플을 수거하고 불활성화시켰다. 상층액은 온도를 37± 2℃로 조정함으로써 불활성화시켰다. 첫 번째 샘플에, 0.3N NaOH 내에서 0.2M 이원 에틸렌이민(BEI)으로 환화된 2-브로모에틸렌아민 하이드로브로마이드의 0.4M 용액을 상기 상층액에 추가하여 5mM의 BEI의 최종 농도를 제공하였다. 두 번째 샘플의 경우에, 10mM BEI를 상층액에 추가하였다. 세 번째 샘플의 경우에, BEI를 상층액에 추가하지 않았다. 이들 샘플은 48시간동안 연속으로 교반하였다. 5 mM의 최종 최소 농도를 제공하는 1.0 M 티오황산나트륨 용액을 추가하여 임의의 잔류하는 BEI를 중화시켰다. 각 샘플 내에서 ORF2의 양은 실시예 1에 기술된 바와 동일한 ELISA 검사 절차를 이용하여 정량하였다. 이의 결과는 하기 표 2에 제공된다.
샘플 상층액 내에서 ORF2(㎍)
1 78.71
2 68.75
3 83.33
본 실시예에서는 BEI로 중화가 재조합 PCV2 ORF2 단백질 산물을 현저하게 제거하거나 파괴하지 않는다는 것을 입증한다. 이는 상층액 내에서 BEI 또는 상승된 온도에 기인한 ORF2의 대규모 손실이 나타나지 않는다는 사실에 의해 뒷받침된다. 당업자는 회수된 ORF2가 안정한 단백질 산물임을 인지할 것이다.
실시예 3
본 실시예에서는 본 발명이 재조합 PCV2 ORF2의 소규모 생산에서 재조합 PCV2 ORF2의 대규모 생산으로 규모 확대가 가능함을 입증한다. 7000㎖의 ExCell 420 배지 내에서 5.0 x 105개 세포/㎖의 SF+ 세포/㎖는 20000㎖ Applikon 생물반응기 내에 이식하였다. 상기 배지와 세포는 27℃에서 배양하고 차후 68시간동안 100RPM에서 교반하였다. 68시 시점에, 41.3㎖의 PCV2 ORF2 바쿨로바이러스 MSV+3을 7000㎖의 ExCell 420 배지에 추가하였다. 이후, 생성 혼합물은 생물반응기에 추가하였다. 차후 7일동안, 혼합물은 27℃에서 배양하고 100RPM에서 교반하였다. 생물반응기로부터 샘플은 감염후 4일 시점부터 매 24시간 마다 추출하고, 각 샘플은 원심분리하였다. 이들 샘플의 상층액은 보존하고, SDS-PAGE 농도계(densitometry)를 이용하여 ORF2를 정량하였다. 이의 결과는 하기 표 3에서 확인할 수 있다:
감염후 일자 상층액 내에서 ORF2(㎍/㎖)
4 29.33
5 41.33
6 31.33
7 60.67
실시예 4
본 실시예에서는 7개의 PCV2 후보 백신의 효능을 검사하고, PCV2의 독력 균주에 노출이후, 효능 파라미터를 더욱 정의한다. 9-14일령의 108마리의 CDCD(Caesarean Derived Colostrum Deprived) 새끼 돼지는 동등한 크기의 9개 군으로 무작위 분할하였다. 표 4에서는 본 실시예에 대한 전반적인 연구 설계를 열거한다.
군 돼지
개체수		 처리 처리
일자		 21일과 27일에 KLH/ICFA 24일에 독력 PCV2로 공격접종 49일에 부검
1 12 PCV2 Vaccine No. 1
- (vORF2 16 ㎍)		 0 + + +
2 12 PCV2 Vaccine No. 2
- (vORF2 8 ㎍)		 0 + + +
3 12 PCV2 Vaccine No. 3
- (vORF2 4 ㎍)		 0 + + +
4 12 PCV2 Vaccine No.4
- (rORF2 16 ㎍)		 0 + + +
5 12 PCV2 Vaccine No. 5
- (rORF2 8 ㎍)		 0 + + +
6 12 PCV2 Vaccine No. 6
- (rORF2 4 ㎍)		 0 + + +
7 12 PCV2 Vaccine No. 7
- (사멸된 전체 세포 바이러스)		 0 + + +
8 12 처리 없음 -
공격접종 대조 		N/A + + +
9 12 처리 없음 -
엄격한 음성 대조군 		N/A + - +
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
7개 군(군 1 - 7)은 PCV2 ORF2 폴리펩티드가 투여되고, 한 군은 공격접종 대조로서 기능하고 PCV2 ORF2가 투여되지 않았으며, 다른 한 군은 엄격한 음성 대조군으로서 기능하고 PCV2 ORF2가 투여되지 않았다. 0일에, 1 내지 7 군은 지정된 백신으로 처리하였다. 7 군의 새끼 돼지는 14일에 부스터 처리(booster treatment)를 제공하였다. 새끼 돼지들은 백신접종이후 부작용과 주사 부위 반응을 관찰하고, 19일에, 2차 연구 장소로 이전하였다. 2차 연구 장소에서, 1-8 군은 한 건물 내에서 집단 사육하고, 9 군은 독립된 건물에서 사육하였다. 모든 돼지는 21일과 27일에 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)/불완전 Freund 어쥬번트(ICFA)를 투여하고, 1-8 군은 24일에, 독력 PCV2로 공격접종하였다.
공격접종 전후에, PCV2 혈청반응검사(serology)를 위하여 혈액 샘플을 수집하였다. 공격접종후, 평균 일일 체중 증가(average daily weight gain, ADWG)와 임상적 증상의 결정을 위한 체중 데이터 및 PCV2의 코흘림(nasal shedding)을 결정하기 위한 비강 면봉 샘플을 수집하였다. 49일에, 생존하는 모든 돼지는 부검하고, 폐는 병소를 기록하고, 선별된 조직은 후기 일자에 면역조직화학(IHC) 검사를 위하여 포르말린에 담아 보관하였다.
재료와 방법
이는 0일에 9 내지 14일령의 CDCD 돼지에서 수행된 부분 맹검 백신접종-공격접종 실현성 연구이다. 본 연구에 포함되는 암퇘지의 PCV2 IFA 역가는 ≤ 1:1000이었다. 부가적으로, 암퇘지의 혈청학적 상태는 공지된 PRRS-음성 무리로부터 얻었다. 28마리의 암퇘지는 PCV2 혈청학적 상태를 검사하였다. 14마리의 암퇘지는 ≤ 1000의 PCV2 역가를 보였고, 1차 연구 장소로 이전되었다. 110마리의 새끼 돼지가 제왕절개 수술에 의해 출산되었고, -4일에 본 연구에 이용가능하였다. -3일에, 1차 연구 장소에서 108마리의 CDCD 돼지는 칭량하고, 귀 태그를 부착하고, 중량으로 블록하고, 상기 표 4에 열거된 바와 같이, 9개 군 중에서 하나에 무작위로 지정하였다. 포함 기준(inclusion criteria)을 충족하는 임의의 검사 동물이 본 연구에 등록되었다가 차후에 어떤 이유로 배제되는 경우에, 연구원과 감독자가 협의하여 최종 분석에서 상기 동물로부터 수집된 데이터를 이용할 지를 결정하였다. 등록된 새끼 돼지가 배제된 일자 및 배제 이유를 문서로서 기록하였다. 초기에, 암퇘지 중에서 1마리도 배제되지 않았다. 가용한 110마리의 돼지 중에서 총 108마리가 -3일에 9개 군 중에서 하나에 무작위로 지정되었다. 2마리의 가장 작은 돼지(No. 17과 19)는 특정 군으로 지정하지 않고, 필요한 경우에, 여분으로서 이용하였다. 연구 과정 동안, 여러 마리의 동물이 제거되었다. -1일에 돼지 82(9 군), 3일에 돼지 56(6 군), 4일에 돼지 53(9 군), 8일에 돼지 28(8 군), 7일에 돼지 69(8 군), 9일에 돼지 93(4 군)은 공격접종에 앞서, 폐사한 것으로 밝혀졌다. 이들 6마리 돼지는 최종 연구 결과에 포함되지 않았다. 돼지 17(여분의 돼지 중의 하나)은 9 군으로 지정하였다. 남아있는 여분의 돼지 19는 본 연구로부터 배제하였다.
각 군에 제공된 제제는 아래와 같다: 1 군은 16 ㎍ vORF2/㎖를 보유하는 1 ㎖의 바이러스 ORF2(vORF2)가 투여되도록 설계되었다. 이는 10.24 ㎖의 바이러스 ORF2(256 ㎍/25 ㎍/㎖ = 10.24 ㎖ vORF2)를 3.2 ㎖의 0.5% 카르보폴과 2.56 ㎖의 인산염 완충된 염수, pH 7.4와 혼합함으로서 달성되었다. 이는 1 군을 위한 16 ㎖의 제제를 생산하였다. 2 군은 8 ㎍ vORF2/㎖를 보유하는 1 ㎖의 vORF2가 투여되도록 설계되었다. 이는 5.12 ㎖의 vORF2(128 ㎍/25 ㎍/㎖ = 5.12 ㎖ vORF2)를 3.2 ㎖의 0.5% 카르보폴과 7.68 ㎖의 인산염 완충된 염수, pH 7.4와 혼합함으로서 달성되었다. 이는 2 군을 위한 16 ㎖의 제제를 생산하였다. 3 군은 4 ㎍ vORF2/㎖를 보유하는 1 ㎖의 vORF2가 투여되도록 설계되었다. 이는 2.56 ㎖의 vORF2(64 ㎍/25 ㎍/㎖ = 2.56 ㎖ vORF2)를 3.2 ㎖의 0.5% 카르보폴과 10.24 ㎖의 인산염 완충된 염수, pH 7.4와 혼합함으로서 달성되었다. 이는 3 군을 위한 16 ㎖의 제제를 생산하였다. 4 군은 16 ㎍ rORF2/㎖를 보유하는 1 ㎖의 재조합 ORF2(rORF2)가 투여되도록 설계되었다. 이는 2.23 ㎖의 rORF2(512 ㎍/230 ㎍/㎖ = 2.23 ㎖ rORF2)를 6.4 ㎖의 0.5% 카르보폴과 23.37 ㎖의 인산염 완충된 염수, pH 7.4와 혼합함으로서 달성되었다. 이는 4 군을 위한 32 ㎖의 제제를 생산하였다. 5 군은 8 ㎍ rORF2/㎖를 보유하는 1 ㎖의 rORF2가 투여되도록 설계되었다. 이는 1.11 ㎖의 rORF2(256 ㎍/230 ㎍/㎖ = 1.11 ㎖ rORF2)를 6.4 ㎖의 0.5% 카르보폴과 24.49 ㎖의 인산염 완충된 염수, pH 7.4와 혼합함으로서 달성되었다. 이는 5 군을 위한 32 ㎖의 제제를 생산하였다. 6 군은 8 ㎍ rORF2/㎖를 보유하는 1 ㎖의 rORF2가 투여되도록 설계되었다. 이는 0.56 ㎖의 rORF2(128 ㎍/230 ㎍/㎖ = 0.56 ㎖ rORF2)를 6.4 ㎖의 0.5% 카르보폴과 25.04 ㎖의 인산염 완충된 염수, pH 7.4와 혼합함으로서 달성되었다. 이는 6 군을 위한 32 ㎖의 제제를 생산하였다. 7 군은 MAX PCV2 KV를 보유하는 2㎖의 PCV2 사멸된 전체 세포 백신(PCV2 KV)이 투여되도록 설계되었다. 이는 56 ㎖의 PCV2 KV를 14 ㎖의 0.5% 카르보폴과 혼합함으로써 달성되었다. 이는 7 군을 위한 70 ㎖의 제제를 생산하였다. 최종적으로, 8 군은 2 ㎖ 용량당 0.5 ㎍/㎖ 또는 1.0 ㎍/㎖의 KLH가 투여되도록 설계되었다. 이는 40.71 ㎖의 KLH(0.5 ㎍/㎖에서 7.0 ㎍ 단백질/㎖ = 570 ㎖(7.0 ㎍/㎖)(x) = (0.5)(570 ㎖)), 244.29 ㎖의 인산염 완충된 염수, pH 7.4, 285 ㎖의 Freund 어쥬번트를 혼합함으로써 달성되었다. 표 5에서는 본 실시예의 핵심적인 활동에 대한 시간 구성을 기술한다.
연구 활동
연구 일자 연구 활동
-4, 0 내지 49 전체 건강과 임상적 증상에 대한 전반적인 관찰
-3 칭량; 특정 군에 무작위로 지정; 모든 돼지로부터 혈액 샘플 수집
0 건강 검사; 1-7 군에 각각, IVP No. 1-7 투여
0-7 돼지에서 주사 부위 반응 관찰
14 7 군에 PCV2 Vaccine No. 7 추가 주사; 모든 돼지로부터 혈액 샘플 수집
14-21 7 군에서 주사 부위 반응 관찰
16-19 모든 돼지를 항생제로 처리(데이터 없음)
19 1차 검사 장소에서 2차 검사 장소로 돼지 이동
21 1-9 군을 KLH/ICFA로 처리
24 모든 돼지로부터 혈액과 비강 면봉 샘플 수집; 모든 돼지 칭량; 1-8 군을 PCV2 공격 물질로 공격접종
25, 27,
29, 31,
33, 35,
37, 39,
41, 43,
45, 47		 모든 돼지로부터 비강 면봉 샘플 수거
27 1-9 군을 KLH/ICFA로 처리
31 모든 돼지로부터 혈액 샘플 수집
49 모든 돼지로부터 혈액과 비강 면봉 샘플 수집; 모든 돼지 칭량; 모든 돼지 부검; 황달(icterus)과 위궤양(gastric ulcer)을 중심으로, 육안적 병소의 관찰; 폐에서 병소 평가; 포르말린 고정된 새로운 조직 샘플 보관; 본 연구의 생존 단계(in-life phase) 완결
본 연구의 생존 단계의 완결이후, 포르말린 고정된 조직은 면역조직화학(IHC)으로, 병리학자에 의한 PCV2 항원의 검출을 검사하고, 혈액 샘플은 PCV2 혈청반응을 평가하고, 비강 면봉 샘플은 PCV2 코흘림을 평가하고, 평균 일일 체중 증가(ADWG)는 24일에서부터 49일까지 측정하였다.
동물은 출생이후 대략 11일령(대략 연구 0일)까지 1차 연구 장소에서 5개의 방에 개별 우리에서 사육하였다. 각 방은 배치가 동일하고, 가열되고 여과된 공기가 각 분리 단위(isolation unit)에 개별적으로 공급되는 겹쳐 쌓인 개별 스테인리스 스틸 우리로 구성되었다. 각 방은 개별적으로 난방과 환기 장치가 구비되어, 방 사이에 공기의 교차-오염(cross-contamination)을 예방하였다. 동물은 2차 연구 장소에서 2개의 상이한 건물 내에 사육하였다. 9 군(엄격한 음성 대조군)은 개조된 완성자 건물(finisher building)에서 개별적으로 사육되고 1-8 군은 개조된 보육 건물(nursery building)에서 사육되었다. 각 군은 별개의 우리(우리당 11-12마리 돼지)에서 사육하였는데, 각 우리는 돼지 1마리당 대략 3.0 평방피트(square feet)를 제공하였다. 각 우리는 플라스틱 슬레이트 마루를 보유하는 상승된 덱(deck) 상에 위치하였다. 우리 아래 구멍은 배설물과 폐기물에 대한 홀딩 탱크(holding tank)로서 기능하였다. 각 건물은 독립적인 난방과 환기 장치를 구비하고, 따라서 건물 사이에 공기의 교차-오염의 가능성을 예방하였다.
1차 연구 장소에서, 새끼 돼지들은 출생에서부터 대략 3주령까지, 특별히 조제된 이유식이 공급되었다. 모든 새끼 돼지는 19일까지(대략 4½ 주령), 고형의 특별히 조제된 혼합식을 소비하였다. 2차 연구 장소에서, 모든 새끼 돼지는 연령과 체중에 적합하게 맞춤된 통상의 혼합식이 공급되었고, 물은 양쪽 연구 장소에서 모두 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
모든 검사 돼지는 -2일에 비타민 E로 처리하고. -1일에 철 주입으로 처리하고, 16, 17, 18, 19일에 NAXCEL(1.0 ㎖, IM, 오금에 교대로)로 처리하였다. 이에 더하여, 여러 건강상의 문제로, 돼지 52(9 군)는 3일에 철 주입으로 처리하고, 돼지 45(6 군)는 11일에 철 주입으로 처리하고, 돼지 69(8 군)는 6일에 NAXCEL로 처리하고, 돼지 74(3 군)는 14일에 덱사메타존(dexamethazone)과 페니실린(penicillin)으로 처리하고, 돼지 51(1 군)은 13일에 덱사메타존과 페니실린 및 14일에 NAXCEL로 처리하였다.
양쪽 연구 장소에서, 돼지는 수의사의 보호를 받았다. 0일에 동물 건강 검사를 수행하고 건강 검사 보고서 양식에 기록하였다. 모든 동물은 0일에 관찰에 의한 결정에서, 건강 상태와 영양 상태가 우수하였다. 모든 검사 동물은 공격접종에 앞서, 건강 상태와 영양 상태가 우수한 것으로 관찰되었다. 동물 사체와 조직은 렌더링(rendering)으로 처분하였다. 연구 동물의 최종 처분은 동물 처분 보고서에 기록하였다.
0일에, 1-6 군으로 지정된 돼지는 각각, 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x ½" 바늘을 이용하여 왼쪽 목 부위에, 각각 1.0 ㎖의 PCV2 백신 1-6을 IM 투여하였다. 7 군으로 지정된 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x ½" 바늘을 이용하여 왼쪽 목 부위에, 2.0 ㎖의 PCV2 백신 7을 IM 투여하였다. 14일에, 7 군으로 지정된 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x ½" 바늘을 이용하여 오른쪽 목 부위에, 2.0 ㎖의 PCV2 백신 7을 IM 투여하였다.
21일에, 모든 검사 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x 1" 바늘을 이용하여 오른쪽 오금 부위에, 2.0 ㎖의 KLH/ICFA를 IM 투여하였다. 27일에, 모든 검사 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x 1" 바늘을 이용하여 왼쪽 오금 부위에, 2.0 ㎖의 KLH/ICFA를 IM 투여하였다.
24일에, 1-8 군으로 지정된 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x 1" 바늘을 이용하여 왼쪽 목 부위에, 1.0 ㎖의 PCV2 ISUVDL 공격 물질(5.11 log10 TCID50/㎖)을 IM 투여하였다. 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기와 비강 캐뉼러를 이용하여 각 동물에 1.0 ㎖의 동일 물질(콧구멍당 0.5 ㎖)을 추가로 투여하였다.
검사 돼지는 전체 건강을 매일 관찰하고, -4일 및 0일에서부터 19일까지 부작용을 관찰하였다. 관찰 결과는 임상 관찰 보고서에 기록하였다. 모든 검사 돼지는 0일에서부터 7일까지 주사 부위 반응을 관찰하고, 7 군은 14일에서부터 21일까지 추가로 관찰하였다. 평균 일일 체중 증가는 -3일, 24일, 49일, 또는 공격접종이후 돼지가 폐사한 일자에, 보정된 스케일(calibrated scale)에서 각 돼지를 칭량함으로써 결정하였다. 체중은 체중 양식에 기록하였다. -3일 체중을 이용하여 무작위화에 앞서 돼지를 블록하였다. 24일과 49일 체중 데이터를 이용하여 이들 시점 동안 각 돼지에 대한 평균 일일 체중 증가(ADWG)를 결정하였다. 공격접종이후 및 49일 이전에 폐사한 돼지의 경우에, ADWG는 24일에서부터 폐사일까지 ADWG를 나타내도록 조정하였다.
PCV2 혈청반응을 결정하기 위하여, -3일과 14일에 각 새끼 돼지의 안와 정맥동(orbital venous sinus)으로부터 정맥 전혈(venous whole blood)을 수집하였다. 각 돼지 새끼에서, 무균 모세관 튜브를 한쪽 눈의 비측 안각(medial canthus) 내로 삽입하고 대략 3.0 ㎖의 전혈을 4.0 ㎖의 혈청 분리기 튜브(Serum Separator Tube, SST) 내로 배출함으로써 안와 정맥동으로부터 수집하였다. 24일, 31일, 49일에, 무균 18g x 1½ " Vacutainer 바늘(Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey), Vacutainer 바늘 홀더, 13 ㎖ SST를 이용하여 각 돼지의 전방 대정맥(anterior vena cava)으로부터 정맥 전혈을 수집하였다. 각 시점에서 혈액 수집은 샘플 수집 보고서에 기록하였다. 각 SST 내에서 혈액은 응고시키고, 이후, 각 SST는 스핀 다운시키고 혈청을 수거하였다. 수거된 혈청은 무균 스냅 튜브(snap tube)로 이전하고 후기 일자에 검사 때까지 -70± 10℃에서 보관하였다. 혈청 샘플은 BIVI-R&D 인력으로 PCV2 항체의 존재를 검사하였다.
돼지는 20일에서부터 49일까지 매일 임상적 증상을 관찰하고, 관찰 결과는 임상적 관찰 보고서에 기록하였다.
24일, 25일 및 최대 49일까지 홀수 연구일에 PCV2 코흘림을 검사하기 위하여, 무균 데이크론(dacron) 면봉을 가능한 무균으로, 각 돼지(돼지당 1개의 면봉)의 왼쪽이나 오른쪽 콧구멍 내로 비강내 삽입하고, 몇초간 휘돌리고, 제거하였다. 이후, 각 면봉은 2% IFBS, 500 단위/㎖의 페니실린, 500 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 2.5 ㎍/㎖ of Fungizone을 포함하는 1.0 ㎖의 EMEM 배지를 보유하는 단일 무균 스냅-캡 튜브(snap-cap tube) 내에 위치시켰다. 상기 면봉은 튜브 내에서 부러뜨리고, 상기 스냅 튜브는 밀봉하고 동물 번호, 연구 번호, 수집 일자, 연구일, “비강 면봉”으로 적절하게 표지하였다. 밀봉된 스냅 튜브는 얼음에 담겨 BWI-St. Joseph로 하룻밤동안 수송될 때까지 -40± 10℃에서 보관하였다. 비강 면봉 수집은 비강 면봉 샘플 수집 양식에 기록하였다. BIVI-R&D에서는 비강 면봉 샘플에서 PCV2에 대한 정량적 바이러스 분리(VI) 검사를 수행하였다. 결과는 log10 수치로 표시되었다. 1.3 로그(log) 또는 그 이하의 수치는 음성(negative)으로 간주되었고, 1.3 로그를 초과하는 수치는 양성(positive)으로 간주되었다.
1차 연구 장소에서 폐시한 돼지(No. 28, 52, 56, 69, 82, 93)는 진단을 확정하는데 필요한 수준까지 부검하였다. 육안적 병소는 기록하고, 이들 돼지로부터 조직은 존속시키지 않았다. 2차 연구 장소에서, 49일 이전에 폐사한 돼지(No. 45. 23, 58, 35), 안락사에 앞서 49일 시점에 폐사한 돼지(No. 2, 43), 49일에 안락사된 돼지는 부검하였다. 임의의 육안적 병소는 관찰하고, 병소가 존재하는 폐엽(lung lobe)의 비율은 부검 보고서 양식에 기록하였다.
2차 연구 장소에서 부검된 103마리의 돼지 각각으로부터, 편도선, 폐, 심장, 간, 장간막 림프절(mesenteric lymph node), 신장, 사타구니 림프절(inguinal lymph node)의 조직 샘플은 완충된 10% 포르말린을 보유하는 단일 용기 내에 위치시키고, 앞서 언급된 동일한 장기로부터 다른 조직 샘플은 Whirl-pak(M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, UK) 내에 위치시키고, 각 Whirl-pak은 얼음 위에 위치시켰다. 각 용기는 적절히 표지하였다. 샘플 수집은 부검 보고서 양식에 기록하였다. 이후, IHC 검사를 위하여, 포르말린-고정된 조직 샘플과 진단 요청서 양식을 제출하였다. IHC 검사는 샘플 접수, 샘플과 슬라이드 제조, 염색을 위한 표준 ISU 실험실 절차에 따라 수행하였다. Whirl-paks 내에 새로운 조직은 보관(-70± 10℃) 및 차후 이용을 위하여 얼음 팩과 함께 연구 감독자에게 전달하였다. 포르말린-고정된 조직은 병리학자에 의해 IHC로 PCV2의 검출을 검사하고, 아래의 스코어링 체계(scoring system)를 이용하여 스코어를 기록하였다: 0 = 없음; 1 = 불충분한 양성 염색, 극히 일부 부위; 2 = 중간 양성 염색, 복수 부위; 3 = 충분한 양성 염색, 조직 전체에 확산. 병리학자가 사타구니 LN을 장간막 LN으로부터 양성적으로 구별할 수 없다는 사실로 인하여, 이들 조직에 대한 결과는 단순히 림프절로서 분류되고, 상기 스코어는 동물당 2개의 조직 각각에 대한 최대 스코어로서 제공된다.
결과
본 실시예의 결과는 아래에 제공된다. 9 군으로부터 1마리 돼지는 0일 이전에 폐사하였고, 백신접종이후 5마리가 추가로 폐사하였다(4 군으로부터 1마리 돼지; 6 군으로부터 1마리 돼지; 8 군으로부터 2마리 돼지; 9 군으로부터 1마리 돼지). 사후(post-mortem) 검사에서 이들 6마리 돼지 모두 예방접종 또는 PMWS와 무관한 기초 감염으로 인하여 폐사한 것으로 밝혀졌다. 부가적으로, 어떤 군에서도 부작용 또는 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다.
평균 일일 체중 증가(ADWG) 결과는 하기 표 6에 제공된다. 엄격한 음성 대조군인 9 군이 가장 높은 ADWG(1.06± 0.17 lbs/day)를 보였고, 8 ㎍의 rORF2의 1회 분량이 투여된 5 군(0.94± 0.22 lbs/day)이 그 뒤를 이었다. 4 ㎍의 vORF2의 1회 분량이 투여된 3 군은 가장 낮은 ADWG(0.49± 0.21 lbs/day)를 보였고, 2회 분량의 사멸된 백신이 투여된 7 군(0.50± 0.15 lbs/day)이 그 뒤를 이었다.
군별 평균 일일 체중 증가(ADWG)의 요약
군 처리 N (24일 내지 49일) 또는 29일 이전에 폐사된 돼지에 대하여 조정된 ADWG - lbs/day
1 vORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 12 0.87± 0.29 lbs/day
2 vORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 0.70± 0.32 lbs/day
3 vORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 12 0.49± 0.21 lbs/day
4 rORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 11 0.84± 0.30 lbs/day
5 rORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 0.94± 0.22 lbs/day
6 rORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 11 0.72± 0.25 lbs/day
7 KV(2회 분량) 12 0.50± 0.15 lbs/day
8 공격접종 대조 10 0.76± 0.19 lbs/day
9 엄격한 음성 대조 11 1.06± 0.17 lbs/day
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스PCV2
혈청반응 결과는 하기 표 7에 제공된다. 9개 군 모두 -3일에 PCV2에 대하여 혈청음성(seronegative)이었다. 14일에, vORF2 백신이 투여되는 군들은 187.5에서 529.2까지 최대 역가를 나타냈다. 사멸된 바이러스 백신이 투여되는 돼지는 두 번째로 높은 역가를 나타내고, rORF2 백신이 투여되는 군이 그 뒤를 이었다. 8과 9 군은 이 시점에 여전히 혈청음성이었다. 24일과 31일에, vORF2 백신이 투여되는 돼지는 강한 혈청 반응을 지속적으로 나타내고, 2회 분량의 사멸된 바이러스 백신이 투여되는 군이 그 뒤를 바짝 뒤따랐다. rORF2 백신이 투여되는 돼지는 훨씬 느린 혈청 반응을 나타내고, 8과 9 군은 여전히 혈청음성이었다. 49일에, vORF2 백신, 2회 분량의 사멸된 바이러스 백신, 최소 용량의 rORF2가 투여되는 돼지들은 가장 강한 혈청 반응을 나타냈다. 16 ㎍과 8 ㎍의 rORF2 백신이 투여되는 돼지는 공격접종 대조보다 약간 높은 IFA 역가를 보였다. 49일에 9 군은 강한 혈청 반응을 나타냈다.
군별 PCV2 IFA 역가의 요약
군 처리 -3일 14일 24일 31일** 49일***
1 vORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 50.0 529.2 4400.0 7866.7 11054.5
2 vORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 50.0 500.0 3466.7 6800.0 10181.8
3 vORF2 - 4㎍(1회 분량) 50.0 187.5 1133.3 5733.3 9333.3
4 rORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 50.0 95.5 1550.0 3090.9 8000.0
5 rORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 50.0 75.0 887.5 2266.7 7416.7
6 rORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 50.0 50.0 550.0 3118.2 10570.0
7 KV(2회 분량) 50.0 204.2 3087.5 4620.8 8680.0
8 공격접종 대조 50.0 55.0 50.0 50.0 5433.3
9 엄격한 음성 대조 50.0 59.1 59.1 54.5 6136.4
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
*계산 목적으로, ≤100 IFA 역가는 “50”의 역가로서 표시되었다; ≥6400 IFA 역가는 “12,800”의 역가로서 표시되었다.
**공격접종 일자
***부검 일자
공격접종이후 임상적 관찰로부터 결과는 하기 표 8에 제공된다. 이러한 요약된 결과는 비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침, 설사에 대한 관찰 결과를 포함하다. 표 9에서는 임상적 증상의 군별 전체 발생률의 요약으로부터 결과를 포함하고, 표 10에서는 공격접종이후 군별 치사율의 요약으로부터 결과를 포함한다. 본 연구에서 관찰되는 가장 일반적인 임상적 증상은 비정상적 행동이었는데, 이는 경등도 내지 중증도 무기력(lethargy)으로서 기록되었다. 2가지 낮은 용량의 vORF2가 투여되는 돼지, 16 ㎍의 rORF2가 투여되는 돼지, 2회 분량의 KV 백신이 투여되는 돼지는 ≥27.3%의 발생률을 보였다. 8 ㎍의 rORF2가 투여되는 돼지와 엄격한 음성 대조군은 비정상적 행동을 나타내지 않았다. 본 연구에서 어떤 돼지도 비정상적 호흡을 나타내지 않았다. 기침은 모든 군(0 내지 25%)에서 빈번하게 관찰되었고, 설사(0-20%) 역시 그러하였다. 관찰된 어떤 임상적 증상도 PMWS에 특유(pathognomic)하지 않았다.
임상적 증상의 전체 발생률은 군마다 상이하였다. vORF2 백신이 투여되는 군, 16 ㎍의 rORF2가 투여되는 군, 2회 분량의 KV 백신이 투여되는 군, 공격접종 대조군은 전체 임상적 증상의 최대 발생률(≥36.4%)을 보였다. 엄격한 음성 대조군, 8 ㎍의 rORF2가 투여되는 군, 4 ㎍의 rORF2가 투여되는 군은 각각, 0%, 8.3%, 9.1%의 전체 발생률을 보였다.
전체 치사율 역시 군마다 상이하였다. 2회 분량의 KV 백신이 투여되는 군은 최대 치사율(16.7%)을 보였다; 반면, 4 ㎍의 vORF2, 16 ㎍의 rORF2, 또는 8 ㎍의 rORF2가 투여되는 군과 엄격한 음성 대조군 모두 0% 치사율을 보였다.
비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침, 설사에 대한 군별 관찰 결과의 요약
군 처리 N 비정상적
행동1 		비정상적
행동2 		기침3 설사4
1 vORF2 - 16㎍(1회 분량) 12 2/12(16.7%) 0/12(0%) 3/12(25%) 2/12(16/7%)
2 vORF2 - 8㎍(1회 분량) 12 4/12(33.3%) 0/12(0%) 1/12(8.3%) 1/12(8.3%)
3 vORF2 - 4㎍(1회 분량) 12 8/12(66.7%) 0/12(0%) 2/12(16.7%) 1/12(8.3%)
4 rORF2 - 16㎍(1회 분량) 11 3/11(27.3%) 0/11(0%) 0/11(0%) 2/11(18.2%)
5 rORF2 - 8㎍(1회 분량) 12 0/12(0%) 0/12(0%) 1/12(8.3%) 0/12(0%)
6 rORF2 - 4㎍(1회 분량) 11 1/11(9.1%) 0/11(0%) 0/11(0%) 0/12(0%)
7 KV(2회 분량) 12 7/12(58.3) 0/12(0%) 0/12(0%) 1/12(8.3%)
8 공격접종 대조 10 1/10(10%) 0/10(0%) 2/10(20%) 2/10(20%)
9 엄격한 음성 대조 11 0/11(0%) 0/11(0%) 0/11(0%) 0/11(0%)
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
1각 군에서, 적어도 1일동안 비정상적 행동을 나타내는 돼지의 전체 개체수
2각 군에서, 적어도 1일동안 비정상적 호흡을 나타내는 돼지의 전체 개체수
3각 군에서, 적어도 1일동안 기침을 나타내는 돼지의 전체 개체수
4각 군에서, 적어도 1일동안 설사를 나타내는 돼지의 전체 개체수
임상적 증상의 군별 전체 발생률의 요약
군 처리 N 임상적 증상을 나타내는 돼지의 빈도1 발생률
1 vORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 12 5 41.7%
2 vORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 5 41.7%
3 vORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 12 8 66.7%
4 rORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 11 4 36.4%
5 rORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 1 8.3%
6 rORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 11 1 9.1%
7 KV(2회 분량) 12 7 58.3%
8 공격접종 대조 10 4 40%
9 엄격한 음성 대조 11 0 0%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
1각 군에서, 적어도 1일동안 임의의 임상적 증상을 나타내는 돼지의 전체 개체수
공격접종이후 군별 치사율의 요약
군 처리 N 공격접종이후 폐사 치사율
1 vORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 12 1 8.3%
2 vORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 1 8.3%
3 vORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 12 0 0%
4 rORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 11 0 0%
5 rORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 0 0%
6 rORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 11 1 9.1%
7 KV(2회 분량) 12 2 16.7%
8 공격접종 대조 10 1 10%
9 엄격한 음성 대조 11 0 0%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
PCV2 코흘림(nasal shedding) 결과는 하기 표 11에 제공된다. 24일에 공격접종이후, 7 군의 돼지는 27일에 PCV2를 흘리기 시작하였다. 다른 군은 33일까지 코흘림을 나타내지 않았다. 대부분의 코흘림은 35일에서부터 45일까지 관찰되었다. 3가지 vORF2 백신이 투여되는 군과 4 또는 8 ㎍의 rORF2가 투여되는 군은 PCV2의 코흘림의 가장 낮은 발생률(≤9.l%)을 보였다. 공격접종 대조군(8 군)은 가장 높은 발생률(80%)을 보였고, 엄격한 음성 대조군(9 군)이 63.6%의 발생률로 그 뒤를 이었다.
PCV2의 코흘림의 군별 발생률의 요약
군 처리 N 적어도 1일동안 코흘림을
나타내는 돼지의 개체수		 발생률
1 vORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 12 1 8.3%
2 vORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 1 8.3%
3 vORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 12 1 8.3%
4 rORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 11 2 18.2%
5 rORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 1 8.3%
6 rORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 11 1 9.1%
7 KV(2회 분량) 12 5 41.7%
8 공격접종 대조 10 8 80%
9 엄격한 음성 대조 11 7 63.6%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
황달의 군별 발생률, 위궤양의 군별 발생률, 군별 평균 폐 병소 스코어, 폐 병소의 군별 발생률의 요약은 하기 표 12에 제공된다. 6마리의 돼지는 본 연구의 백신접종이후 단계 동안 1차 검사 장소에서 폐사하였다(4 군, N=1; 6 군, N=1; 8 군, N=2; 9 군, N=2). 6마리 돼지 중에서 4마리는 하나이상의 신체 강에서 피브린 병소를 나타냈고, 1마리 돼지(6 군)는 클로스트리디움병(clostridial disease)에 일치하는 병소를 나타냈고, 1마리 돼지(9 군)는 육안적 병소를 나타내지 않았다. 본 연구의 백신접종이후 단계 동안 폐사한 돼지 중에서 어떤 돼지도 PMWS와 일치하는 병소를 나타내지 않았다.
공격접종이후 폐사한 돼지와 49일에 안락사된 돼지를 부검하였다. 부검에서, 어떤 군에서도 황달과 위궤양이 관찰되지 않았다. 평균% 폐 병소와 관련하여, 9 군은 가장 낮은 평균% 폐 병소(0%)를 보이고, 0.40± 0.50%의 1군과 0.68± 1.15%의 5 군이 그 뒤를 이었다. 2, 3, 7, 8 군은 최대 평균% 폐 병소(≥7.27%)를 보였다. 이들 4개의 군에는 ≥71.5%의 폐 병소를 보이는 돼지가 1마리씩 포함되었는데, 이는 이들 4개 군에 대한 결과가 더욱 높아지도록 왜곡하였다. 0% 폐 병소가 관찰된 9 군을 제외하고, 나머지 8개 군은 ≤36% 폐 병소를 보였다. 관찰된 거의 모든 폐 병소는 적색/자색으로 보고되었고 굳어졌다.
황달의 군별 발생률, 위궤양의 군별 발생률, 군별 평균% 폐 병소 스코어, 폐 병소의 군별 발생률의 요약
군 처리 황달 위궤양 평균% 폐
병소		 관찰된 폐 병소의 발생률
1 vORF2 - 16 ㎍
(1회 분량) 		0/12(0%) 0/12(0%) 0.40± 0.50% 10/12(83%)
2 vORF2 - 8 ㎍
(1회 분량) 		0/12(0%) 0/12(0%) 7.41± 20.2% 10/12(83%)
3 vORF2 - 4 ㎍
(1회 분량) 		0/12(0%) 0/12(0%) 9.20± 20.9% 10/12(83%)
4 rORF2 - l6 ㎍
(1회 분량) 		0/11(0%) 0/11(0%) 1.5± 4.74% 4/11(36%)
5 rORF2 - 8 ㎍
(1회 분량) 		0/12(0%) 0/12(0%) 0.68± 1.15% 9/12(75%)
6 rORF2-4 ㎍
(1회 분량) 		0/11(0%) 0/11(0%) 2.95± 5.12% 7/11(64%)
7 KV(2회 분량) 0/12(0%) 0/12(0%) 7.27± 22.9% 9/12(75%)
8 공격접종 대조 0/10(0%) 0/10(0%) 9.88± 29.2% 8/10(80%)
9 엄격한 음성 대조 0/11(0%) 0/11(0%) 0/11(0%) 0/11(0%)
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
군별 IHC 양성 발생률 결과의 요약은 하기 표 13에 제공된다. 1 군(vORF2 - 16 ㎍)과 5 군(rORF2 - 8 ㎍)은 가장 낮은 비율의 IHC 양성 결과(16.7%)를 보였다. 8 군(공격접종 대조)과 9 군(엄격한 음성 대조)은 각각, 90%와 90.9%의 최대 비율의 IHC 양성 결과를 보였다.
군별 IHC 양성 발생률 결과의 요약
군 처리 N PCV2에 대한 적어도 하나의 양성 조직을 보유하는
돼지의 개체수		 발생률
1 vORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 12 2 16.7%
2 vORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 3 25.0%
3 vORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 12 8 66.7%
4 rORF2 - 16 ㎍(1회 분량) 11 4 36.3%
5 rORF2 - 8 ㎍(1회 분량) 12 2 16.7%
6 rORF2 - 4 ㎍(1회 분량) 11 4 36.4%
7 KV(2회 분량) 12 5 41.7%
8 공격접종 대조 10 9 90.0%
9 엄격한 음성 대조 11 10 90.9%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
공격접종후, 8 ㎍의 rORF2 항원의 1회 분량이 투여된 5 군은 다른 6개 백신 군을 능가하였다. 5 군은 가장 높은 ADWG(0.94± 0.22 lbs/day), 비정상적 행동의 가장 낮은 발생률(0%), 기침의 두 번째로 낮은 발생률(8.3%), 전반적인 임상적 증상의 가장 낮은 발생률(8.3%), 가장 낮은 치사율(0%), PCV2의 코흘림의 가장 낮은 비율(8.3%), 평균% 폐 병소에 대한 두 번째로 낮은 비율(0.68± 1.15%), 양성 IHC 조직에 대한 가장 낮은 발생률(16.7%)을 보였다. 다양한 수준의 rORF2 항원이 투여되는 군은 다양한 수준의 vORF2가 투여되는 군을 능가하였고, 2회 분량의 사멸된 전체 세포 PCV2 백신이 투여되는 군은 효능이 가장 불량하였다. 표 14와 15에서는 군별 공격접종이후 데이터의 요약을 제공한다.
군별 공격접종이후 데이터의 요약 - 파트 1
군 N 처리 ADWG
(lbs/day) 		비정상적
행동		 기침 임상적 증상의 전체 발생률
1 12 vORF2 - 16 ㎍
(1회 분량) 		0.87± 0.29 2/12(16.7%) 3/12(25%) 41.7%
2 12 vORF2 - 8 ㎍
(1회 분량) 		0.70± 0.32 4/12(33.3%) 1/12(8.3%) 41.7%
3 12 vORF2 - 4 ㎍
(1회 분량) 		0.49± 0.21 8/12(66.7%) 2/12(16.7%) 66.7%
4 11 rORF2 - 16 ㎍
(1회 분량) 		0.84± 0.30 3/11(27.3%) 0/11(0%) 36.4%
5 12 rORF2 - 8 ㎍
(1회 분량) 		0.94± 0.22 0/12(0%) 1/12(8.3%) 8.3%
6 11 rORF2 - 4 ㎍
(1회 분량) 		0.72± 0.25 1/11(9.1%) 0/11(0%) 9.1%
7 12 KV(2회 분량) 0.50± 0.15 7/12(58.3) 0/12(0%) 58.3%
8 10 공격접종 대조 0.76± 0.19 1/10(10%) 2/10(20%) 40%
9 11 엄격한 음성 대조 1.06± 0.17 0/11(0%) 0/11(0%) 0%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
군별 공격접종이후 데이터의 요약 - 파트 2
군 N 처리 치사율 코흘림 평균% 폐
병소		 PCV2에 대한 적어도 하나의 양성 조직 IHC의 발생률
1 12 vORF2 - 16 ㎍
(1회 분량) 		8.3% 8.3% 0.40±
0.50%		 16.7%
2 12 vORF2 - 8 ㎍
(1회 분량) 		8.3% 8.3% 7.41±
20.2%		 25.0%
3 12 vORF2 - 4 ㎍
(1회 분량) 		0% 8.3% 9.20±
20.9%		 66.7%
4 11 rORF2 - 16 ㎍
(1회 분량) 		0% 18.2% 1.50±
4.74%		 36.3%
5 12 rORF2 - 8 ㎍
(1회 분량) 		0% 8.3% 0.68±
1.15%		 16.7%
6 11 rORF2 - 4 ㎍
(1회 분량) 		9.1% 9.1% 2.95±
5.12%		 36.4%
7 12 KV(2회 분량) 16.7% 41.7% 7.27±
22.9%		 41.7%
8 10 공격접종 대조 10% 80% 9.88±
29.2%		 90.0%
9 11 엄격한 음성
대조 		0% 63.6% 0/11
(0%)		 90.9%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
본 연구의 결과는 앞으로의 모든 백신 노력이 rORF2 백신에 집중되어야 한다는 것을 암시한다. 전체적으로, PCV2의 코흘림은 공격접종이후 검출되었고, PCV2 백신으로 백신접종은 코흘림의 감소를 유도하였다. 선별된 림프계 조직의 면역조직화학 역시 백신 효능에서 중요한 파라미터로서 기능한 반면, 군 사이에 ADWG, 임상적 증상, 육안적 병소에서 현저한 차이는 검출되지 않았다. 본 연구는 엄격한 음성 대조군인 9 군에서 PCV2의 코흘림, PCV2 혈청전환(seroconversion), 양성 IHC 조직에 의해 입증되는 바와 같이, 외래의 PCV2가 연구 과정 동안 일정 시점에 도입된다는 사실에 의해 복잡해졌다.
고찰
본 연구에서 7개의 PCV2 백신을 평가하였는데, 여기에는 0일에 1회 투여된 3가지 상이한 용량 수준의 vORF2, 0일에 1회 투여된 3가지 상이한 용량 수준의 rORF2 항원, 0일과 14일에 투여된 1가지 용량 수준의 사멸된 전체 세포 PCV2 백신이 포함되었다. 전체적으로, 8 ㎍의 rORF2 항원을 함유하는 1회 분량의 백신이 투여된 5 군이 최고의 결과를 보였다. 5 군은 가장 높은 ADWG, 비정상적 행동의 가장 낮은 발생률, 비정상적 호흡의 가장 낮은 발생률, 기침의 두 번째로 낮은 발생률, 전반적인 임상적 증상의 가장 낮은 발생률, 가장 낮은 치사율, PCV2의 코흘림의 가장 낮은 비율, 평균% 폐 병소에 대한 두 번째로 낮은 비율, 양성 조직에 대한 가장 낮은 발생률을 보였다.
흥미롭게도, 5 군에서보다 높은 용량의 rORF2 항원이 투여된 4 군은 5 군보다 뛰어난 결과를 나타내지 않았다. 4 군은 5 군보다 약간 낮은 ADWG, 비정상적 행동의 더욱 높은 발생률, 전반적인 임상적 증상의 더욱 높은 발생률, PCV2의 코흘림의 더욱 높은 비율, 더욱 높은 평균% 폐 병소, 양성 조직에 대한 더욱 높은 발생률을 보였다. 이들 두 군 사이에 차이가 통계학적으로 유의하지 않음을 지시할 수도 있는 통계학적 분석이 이들 데이터에서 수행되진 않았지만, 4 군이 5 군만큼 뛰어난 결과를 나타내지 못하는 경향이 관찰되었다.
백신접종이후, 1차 연구 장소에서 6마리 돼지가 폐사하였다. 이들 6마리 돼지 중에서 4마리는 백신이 투여되지 않은 8 군 또는 9 군에서 나왔다. 이들 6마리 돼지 중에서 어떤 개체도 PMWS와 일치하는 병소를 나타내지 않았고, 부작용은 보고되지 않았으며, 7개의 백신 모두 대략 11일령의 돼지에 투여되는 경우에 안전한 것으로 나타났다. 본 연구의 백신접종이후 단계 동안, 3가지 용량 수준의 vORF2 백신 또는 사멸된 전체 세포 백신이 투여된 돼지는 가장 높은 IFAT 수준을 보이는 반면, 5 군은 공격접종 직전에, 백신 군 중에서 가장 낮은 IFAT 수준을 보였다.
공식적으로 입증되지는 않았지만, 이유(weaning) 직후에 PCV2의 어린 돼지로의 전염의 주도적 경로는 입코사이(oronasal) 직접 접촉인 것으로 생각되는데, 생산 시설에서 PCV2의 코흘림을 감소시키는 효과적인 백신은 감염의 확산을 통제하는데 도움이 될 것이다. 3가지 vORF2 항원 수준 중에서 하나가 투여된 군과 8 ㎍의 rORF2가 투여된 군은 PCV2의 코흘림의 가장 낮은 발생률(8.3%)을 보였다. 예상된 바와 같이, 공격접종 대조군은 코흘림의 가장 높은 발생률(80%)을 보였다.
PCV2 감염에 부차적인 PMWS를 앓는 돼지에서 육안적 병소는 전형적으로, 한가지이상의 하기 증상과 함께, 전신 림프절병증(generalized lymphadenopathy)으로 구성된다: (1) 소엽사이 부종(interlobular edema)과 함께 간질성 폐렴(interstitial pneumonia), (2) 창백한 피부(cutaneous pallor) 또는 황달(icterus), (3) 얼룩덜룩한 위축성 간(mottled atrophic liver), (4) 위궤양(gastric ulcers), (5) 신장염(nephritis).
부검에서, 어떤 군에서도 황달, 간염, 신장염, 위궤양이 관찰되지 않았다. 림프절병증은 특정하게 검사되지 않았다. 평균% 폐 병소는 군마다 상이하였다. 16 ㎍의 vORF2 항원이 투여된 군은 가장 낮은 평균% 폐 병소 스코어(0.40± 0.50%)를 보였고, 8 ㎍의 rORF2가 투여된 군(0.68± 1.15%)이 그 뒤를 이었다. 예상된 바와 같이, 공격접종 대조군은 가장 높은 평균% 폐 병소 스코어(9.88± 29.2%)를 보였다. 이들 4개 군에서, 평균% 폐 병소 스코어는 각 군에서, 매우 높은 폐 병소 스코어를 보이는 1마리의 돼지로 인하여 상승되었다. 대부분의 폐 병소는 적색/자색으로 보고되었고 굳어졌다. 전형적으로, PMWS와 연관된 폐 병소는 황갈색으로 보고되고 소엽사이 부종(interlobular edema)으로 접혀지지 않는다. 본 연구에서 관찰된 폐 병소는 PCV2 감염과 무관하거나, 또는 이차적인 폐 감염성 병원균이 존재했던 것으로 생각된다. 본 연구의 배경에서, % 폐 병소 스코어는 아마도, PCV2에 기인한 폐 감염의 진실한 크기를 반영하지 못한다.
다른 연구자들은 IHC에 의한 PCV2 항원의 존재와 조직병리 사이에 직접적인 상관관계를 입증하였다. 선별된 조직에서 조직병리는 본 연구에서 수행되지 않았다. 1 군(16 ㎍의 vORF2)과 5 군(8 ㎍의 rORF2)은 PCV2 항원에 양성인 돼지의 가장 낮은 발생률(8.3%)을 보이는 반면, 9 군(엄격한 음성 대조군 - 90.9%)과 8 군(공격접종 대조군 - 90.0%)은 PCV2 항원에 양성인 돼지의 가장 높은 발생률을 보였다. 본 연구의 객관적인 특성으로 인하여, IHC 결과는 아마도, 백신 효능을 판단하는 최고의 파라미터 중의 하나이다.
따라서, 본 발명의 한 측면에서, PCV2가 공격접종되는 CDCD 돼지 모형 내에서 추출된 PCV2 ORF2(rORF2) 항원을 함유하는 1 ㎖/1회 분량 재조합 산물의 최소 보호 용량(Minimum Portective Dosage, MPD)을 결정하였다. 변하는 수준의 rORF2 항원이 투여된 3개의 군 중에서, 5 군(8 ㎍의 rORF2 항원)은 명백하게, 가장 높은 수준의 보호를 보였다. 5 군은 검사된 모든 파라미터와 관련하여 최고의 결과를 보이거나, 또는 가장 긍정적인 결과에 필적하였다. 공격접종이후 다른 6개의 백신 군과 5 군을 비교하는 경우에, 5 군은 가장 높은 ADWG(0.94± 0.22 lbs/day), 비정상적 행동의 가장 낮은 발생률(0%), 기침의 두 번째로 낮은 발생률(8.3%), 전반적인 임상적 증상의 가장 낮은 발생률(8.3%), 가장 낮은 치사율(0%), PCV2의 코흘림의 가장 낮은 비율(8.3%), 평균% 폐 병소에 대한 두 번째로 낮은 비율(0.68± 1.15%), 양성 IHC 조직에 대한 가장 낮은 발생률(16.7%)을 보였다.
본 발명의 다른 측면에서, PCV2가 공격접종되는 CDCD 돼지 모형 내에서 부분적으로 정제된 PCV2 ORF2(vORF2) 항원인 1 ㎖/1회 분량 통상적 산물의 MPD를 결정하였다. 변하는 수준의 vORF2 항원이 투여된 3개의 군 중에서, 1 군(16 ㎍의 vORF2 항원)은 가장 높은 수준의 보호를 보였다. 1 군은 ADWG, 평균% 폐 병소, IHC와 관련하여 2 군과 3 군을 능가하였다. 1 군과 2 군(8 ㎍의 vORF2 항원)은 임상적 증상의 전체 발생률과 관련하여 동등하게 기능하였고, 3 군(4 ㎍의 vORF2 항원)은 가장 낮은 치사율을 보였고, 3개 군 모두 코흘림과 관련하여 동등하게 기능하였다. 전체적으로, vORF 백신은 rORF 백신만큼 뛰어난 결과를 나타내지 못하였다.
본 발명의 또 다른 측면에서, PCV2가 공격접종되는 CDCD 돼지 모형 내에서 2 ㎖/2회 분량 통상의 사멸된 PCV2 백신의 최대 용량의 효능을 결정하였다. 본 연구에서 평가된 7개의 백신 중에서, 사멸된 전체 세포 PCV2 백신은 효능이 가장 불량하였다. 2회 분량의 사멸된 전체 세포 PCV2 백신이 투여된 새끼 돼지는 가장 낮은 ADWG, 비정상적 행동의 두 번째로 높은 발생률(58.3%), 임상적 증상의 두 번째로 높은 전체 발생률(58.3%), 가장 높은 치사율(16.7%), 코흘림의 두 번째로 높은 발생률(41.7%), 가장 높은 평균% 폐 병소(9.88± 29.2%), 관찰된 폐 병소의 높은 발생률(75%), 조직 내에서 중간 정도의 IHC 발생률(41.7%)을 보였다. 하지만, 이는 면역 반응을 유도하는데 여전히 유도하였다.
본 발명의 또 다른 측면에서, PCV2의 코흘림을 효능 파라미터로서 평가하고, 이전 연구로부터 이전 PCV2 효능 파라미터를 재확인하였다. 본 연구로부터 결과는 PCV2의 코흘림이 비강내 공격접종이후 발생하고, PCV2 백신이 공격접종이후 PCV2의 코흘림을 감소시킨다는 것을 암시한다. 더 나아가, 본 연구로부터 결과 및 기존 문헌에서 보고는 IHC가 차후의 PCV2 백신 시험에서 계속 평가되어야 한다는 것을 지시한다.
본 연구로부터 도출되는 일부 부가적인 결론은 림프절병증이 PMWS의 특징 중의 하나라는 것이다. PMWS의 다른 특징은 림프계 고갈(lymphoid depletion)과 다핵화/거대 조직구(multinucleated/giant histiocyte)이다. 부가적으로, 7개의 PCV2 백신 모두 부작용 또는 주사 부위 반응이 관찰되지 않았고, 어린 돼지에 투여되는 경우에 안전한 것으로 나타났다.
실시예 5
본 실시예에서는 8개의 PCV2 후보 백신의 효능을 검사하고, PCV2의 독력 균주에 노출이후, 상기한 공격접종 연구로부터 PCV2 공격접종 파라미터를 재확인한다. 6-16일령의 150마리의 CDCD(Caesarean Derived Colostrum Deprived) 새끼 돼지는 중량으로 블록하고, 동등한 크기의 10개 군으로 무작위 분할하였다. 표 16에서는 본 실시예에 대한 전반적인 연구 설계를 열거한다.
군 돼지
개체수		 처리 처리
일자		 22일과 28일에 KLH/ICFA 25일에 독력 PCV2로 공격접종 46일에
PRRSV
MLV		 50일에
부검
1 15 PCV2 Vaccine 1
16 ㎍
rORF2-IMS 1314		 0 &
14		 + + + +
2 15 PCV2 Vaccine 2
16 ㎍
vORF2-카르보폴		 0 &
14 		+ + + +
3 15 PCV2 Vaccine 3
16 ㎍
rORF2-카르보폴		 0 &
14 		+ + + +
4 15 PCV2 Vaccine 2
16 ㎍
vORF2-카르보폴		 0 + + + +
5 15 PCV2 Vaccine 3
4 ㎍
rORF2-카르보폴		 0 &
14 		+ + + +
6 15 PCV2 Vaccine 3
1 ㎍
rORF2-카르보폴		 0 &
14 		+ + + +
7 15 PCV2 Vaccine 3
0.25 ㎍
rORF2-카르보폴		 0 &
14 		+ + + +
8 15 PCV2 Vaccine 4
>8.0 log
KV-카르보폴		 0 &
14		 + + + +
9 15 공격접종 대조 N/A + + + +
10 15 처리 없음 - 엄격한
음성 대조군 		N/A + - + +
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
각 군에 제공된 백신 제제는 아래와 같다. 1 군에 1 x 2 ㎖ 용량으로 투여된 PCV2 백신 1은 IMS 1314로 보조된 높은 용량(16 ㎍/2 ㎖ 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원(16 ㎍ rORF2 - IMS 1314)이었다. 2 군에 1 x 2 ㎖ 용량으로 투여된 PCV2 백신 2는 카르보폴로 보조된 높은 용량(16 ㎍/2 ㎖ 용량)의 부분적으로 정제된 VIDO R-1 발생된 PCV2 ORF2 항원(16 ㎍ vORF2 - 카르보폴)이었다. 3 군에 1 x 2 ㎖ 용량으로 투여된 PCV2 백신 3은 카르보폴로 보조된 높은 용량(16 ㎍/2 ㎖ 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원(16 ㎍ rORF2 - 카르보폴)이었다. 4 군에 1 x 1 ㎖ 용량으로 투여된 PCV2 백신 4는 카르보폴로 보조된 높은 용량(16 ㎍/1 ㎖ 용량)의 부분적으로 정제된 VIDO R-1 발생된 PCV2 ORF2 항원(16 ㎍ vORF2 - 카르보폴)이었다. 5 군에 1 x 2 ㎖ 용량으로 투여된 PCV2 백신 5는 카르보폴로 보조된 4 ㎍/2 ㎖ 용량의 불활성화된 재조합 ORF2 항원(4 ㎍ rORF2 - 카르보폴)이었다. 6 군에 1 x 2 ㎖ 용량으로 투여된 PCV2 백신 6은 카르보폴로 보조된 1 ㎍/2 ㎖ 용량의 불활성화된 재조합 ORF2 항원(1 ㎍ rORF2 - 카르보폴)이었다. 7 군에 1 x 2 ㎖ 용량으로 투여된 PCV2 백신 7은 카르보폴로 보조된 낮은 용량(0.25 ㎍/2 ㎖ 용량)의 불활성화된 재조합 ORF2 항원(0.25 ㎍ rORF2 - 카르보폴)이었다. 8 군에 1 x 2 ㎖ 용량으로 투여된 PCV2 백신 8은 카르보폴로 보조된 높은 용량(불활성화이전 역가 > 8.0 로그/2 ㎖ 용량)의 불활성화된 통상의 사멸된 VIDO R-1 발생된 PCV2 Struve 항원(>8.0 log KV - 카르보폴)이었다. 0일에, 1-8 군은 지정된 백신으로 처리하였다. 1-3 군과 5-8 군은 14일에 그들의 개별 백신을 추가로 투여하였다. 단일 분량의 16 ㎍의 vORF2 - 카르보폴의 효능은 14일에 백신이 추가로 투여되지 않은 4 군에서 검사하였다. 새끼 돼지들은 백신접종이후 부작용과 주사 부위 반응을 관찰하였다. 21일에, 이들 새끼 돼지들은 2차 연구 장소로 이전하였는데, 여기서 1-9 군은 한 건물 내에서 집단 사육하고, 10 군은 독립된 건물에서 사육하였다. 모든 돼지는 22일과 28일에 불완전 Freund 어쥬번트로 유화된 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH/ICFA)을 투여하였다. 25일에, 1-9 군은 대략 4 로그의 독력 PCV2 바이러스로 공격접종하였다. 46일까지, 공격접종 대조군 내에서 폐사가 거의 발생하지 않았다. 돼지를 면역촉진하고 PCV2 공격 물질의 독력을 증가시키기 위하여, 46일에 모든 군을 INGELVACPRRSV MLV(돼지 생식기 및 호흡기 백신, 변형된 생존 바이러스)로 처리하였다.
공격접종 전후에, PCV2 혈청반응검사(serology)를 위하여 혈액 샘플을 수집하였다. 공격접종후, 평균 일일 체중 증가(average daily weight gain, ADWG)의 결정과 임상적 증상의 관찰을 위한 체중 데이터를 수집하였다. 50일에, 생존하는 모든 돼지는 부검하고, 육안적 병소는 기록하고, 폐는 병리를 기록하고, 선별된 조직은 후기 일자에 PCV2 항원의 검출을 위한 면역조직화학(IHC) 검사를 위하여 포르말린에 담아 보관하였다.
재료와 방법
이는 0일에 6 내지 16일령의 CDCD 돼지에서 수행된 부분 맹검 백신접종-공격접종 실현성 연구이다. 본 연구에 포함되는 암퇘지의 PCV2 IFA 역가는 ≤ 1:1000이었다. 부가적으로, 암퇘지의 혈청학적 상태는 공지된 PRRS-음성 무리로부터 얻었다. 16마리의 암퇘지는 PCV2 혈청학적 상태를 검사하였는데, 16마리 모두 ≤ 1000의 PCV2 역가를 보였고, 1차 연구 장소로 이전되었다. 150마리의 새끼 돼지가 제왕절개 수술에 의해 출산되었고, -3일에 본 연구에 이용가능하였다. -3일에, 1차 연구 장소에서 150마리의 CDCD 돼지는 칭량하고, 귀 태그를 부착하고, 중량으로 블록하고, 상기 표 16에 열거된 바와 같이, 10개 군 중에서 하나에 무작위로 지정하였다. 모든 돼지로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 포함 기준(inclusion criteria)을 충족하는 임의의 검사 동물이 본 연구에 등록되었다가 차후에 어떤 이유로 배제되는 경우에, 연구원과 감독자가 협의하여 최종 분석에서 상기 동물로부터 수집된 데이터를 이용할 지를 결정하였다. 등록된 새끼 돼지가 배제된 일자 및 배제 이유를 문서로서 기록하였다. 본 연구에 선택되고 1차 연구 장소로 이전된, 포함 기준을 충족하는 암퇘지 중에서 1마리도 배제되지 않았다. 새끼 돼지 중에서 1마리도 본 연구로부터 배제되지 않았고, 어떤 검사 동물도 종결 이전에 본 연구로부터 제거되지 않았다. 표 17에서는 본 실시예의 핵심적인 활동에 대한 시간 구성을 기술한다.
연구 활동
연구
일자		 실제 일자 연구 활동
-3 4-04-03 돼지 칭량; 건강 검사; 특정 군에 무작위로 지정; 혈액 샘플 수집
-3,
0-21 		4-04-03
4-07-03 내지
5-27-03		 백신접종이후 전체 건강과 부작용 관찰
0 4-07-03 1-8 군에 개별 IVP 투여
0-7 4-07-03 내지
4-14-03		 돼지에서 주사 부위 반응 관찰
14 4-21-03 1-3, 5-8 군에 개별 IVP 추가 주사; 모든 돼지로부터 혈액 샘플 수집
14-21 4-21-03 내지
4-28-03		 돼지에서 주사 부위 반응 관찰
19-21 4-26-03 내지
4-28-03		 모든 돼지를 항생제로 처리
21 4-28-03 Struve Labs에서 Veterinary Resources, Inc.(VRI)로 돼지 이동
22-50 4-28-03 내지
5-27-03		 돼지에서 공격접종이후 임상적 징후 관찰
22 4-29-03 1-10 군을 KLH/ICFA로 처리
25 5-02-03 모든 돼지로부터 혈액 샘플 수집; 모든 돼지 칭량; 1-9 군을 PCV2 공격 물질로 공격접종
28 5-05-03 1-10 군을 KLH/ICFA로 처리
32 5-09-03 모든 돼지로부터 혈액 샘플 수집
46 5-23-03 모든 군에 INGELVACPRRSV MLV 투여
50 5-27-03 모든 돼지로부터 혈액 샘플 수집, 칭량, 부검; 육안적 병소 기록; 폐에서 병소 평가; 포르말린 고정된 새로운 조직 샘플 보관; 본 연구의 생존 단계(in-life phase) 완결
본 연구의 생존 단계의 완결이후, 포르말린 고정된 조직은 면역조직화학(IHC)으로, 병리학자에 의한 PCV2 항원의 검출을 검사하고, 혈액 샘플은 PCV2 혈청반응을 평가하고, 평균 일일 체중 증가(ADWG)는 25일에서부터 50일까지 측정하였다.
동물은 출생이후 대략 11일령(대략 연구 0일)까지 1차 연구 장소에서 7개의 방에 개별 우리에서 사육하였다. 각 방은 배치가 동일하고, 가열되고 여과된 공기가 각 분리 단위(isolation unit)에 개별적으로 공급되는 겹쳐 쌓인 개별 스테인리스 스틸 우리로 구성되었다. 각 방은 개별적으로 난방과 환기 장치가 구비되어, 방 사이에 공기의 교차-오염(cross-contamination)을 예방하였다. 동물은 2차 연구 장소에서 2개의 상이한 건물 내에 사육하였다. 10 군(엄격한 음성 대조군)은 개조된 보육 건물에서 사육되고, 1-9 군은 개조된 분만 건물에서 개별적으로 사육되었다. 각 군은 별개의 우리(우리당 14-15마리 돼지)에서 사육하였는데, 각 우리는 돼지 1마리당 대략 2.3 평방피트(square feet)를 제공하였다. 2, 4, 8 군은 통로의 한쪽에 3개의 인접하는 우리에서 사육되고, 1, 3, 5, 6, 7, 9 군은 통로의 반대쪽에 6개의 인접하는 우리에서 사육되었다. 이러한 군 분리는 2, 4, 8 군에 투여된 백신이 완전하게 불활성화되지 않았다는 연구 감독자의 우려에 따른 것이었다. 각 우리는 플라스틱 슬레이트 마루를 보유하는 상승된 덱(deck) 상에 위치하였다. 우리 아래 구멍은 배설물과 폐기물에 대한 홀딩 탱크(holding tank)로서 기능하였다. 각 건물은 독립적인 난방과 환기 장치를 구비하고, 따라서 건물 사이에 공기의 교차-오염의 가능성을 예방하였다.
1차 연구 장소에서, 새끼 돼지들은 출생에서부터 대략 3주령까지, 특별히 조제된 이유식이 공급되었다. 모든 새끼 돼지는 21일까지(대략 4½ 주령), 고형의 특별히 조제된 혼합식을 소비하였다. 2차 연구 장소에서, 모든 새끼 돼지는 연령과 체중에 적합하게 맞춤된 통상의 혼합식이 공급되었고, 물은 양쪽 연구 장소에서 모두 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
모든 검사 돼지는 19, 20, 21일에 1.0 ㎖의 NAXCEL을 오금에 교대로 IM 처리하였다. 이에 더하여, 여러 건강상의 문제로, 돼지 11(1 군)은 10일에 0.5 ㎖의 NAXCEL로 IM 처리하고, 돼지 13(10 군)은 10일에 1 ㎖의 페니실린과 1 ㎖의 PREDEF2X로 처리하고, 돼지 4(9 군)는 11일에 1 ㎖의 NAXCEL로 IM 처리하고, 돼지 1(1 군), 4, 11은 각각, 14일에 1 ㎖의 NAXCEL로 처리하였다.
양쪽 연구 장소에서, 돼지는 수의사의 보호를 받았다. -3일에 동물 건강 검사를 수행하고 건강 검사 보고서 양식에 기록하였다. 모든 동물은 0일에 관찰에 의한 결정에서, 건강 상태와 영양 상태가 우수하였다. 모든 검사 동물은 공격접종에 앞서, 건강 상태와 영양 상태가 우수한 것으로 관찰되었다. 동물 사체와 조직은 렌더링(rendering)으로 처분하였다. 연구 동물의 최종 처분은 동물 처분 보고서에 기록하였다.
0일과 14에, 1-3과 5-8 군으로 지정된 돼지는 각각, 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x ½" 바늘을 이용하여 오른쪽과 왼쪽 목 부위에, 각각 2.0 ㎖의 PCV2 백신 1-4를 IM 투여하였다. 4 군으로 지정된 돼지는 0일에만, 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x ½" 바늘을 이용하여 오른쪽 목 부위에, 1.0 ㎖의 PCV2 백신 2를 IM 투여하였다.
22일에, 모든 검사 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x 1" 바늘을 이용하여 왼쪽 목 부위에, 2.0 ㎖의 KLH/ICFA를 IM 투여하였다. 28일에, 모든 검사 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x 1" 바늘을 이용하여 오른쪽 오금 부위에, 2.0 ㎖의 KLH/ICFA를 투여하였다.
25일에, 1-9 군으로 지정된 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x 1" 바늘을 이용하여 오른쪽 목 부위에, 1.0 ㎖의 PCV2 ISUVDL 공격 물질(3.98 log10 TCID50/㎖)을 IM 투여하였다. 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기와 비강 캐뉼러를 이용하여 각 동물에 1.0 ㎖의 동일 물질(콧구멍당 0.5 ㎖)을 추가로 투여하였다.
46일에, 모든 검사 돼지는 무균 3.0 ㎖ 루어-락 주사기(Luer-lock syringe)와 무균 20g x 1" 바늘을 이용하여 오른쪽 목 부위에 2.0 ㎖의 NGELVACPRRS MLV를 IM 투여하였다. PRRSV MLV는 PCV2 공격 물질의 독력을 증가시키기 위하여 투여되었다.
검사 돼지는 전체 건강을 매일 관찰하고, -3일 및 0일에서부터 21일까지 부작용을 관찰하였다. 각 돼지는 정상적인 또는 비정상적인 행동, 호흡 또는 기침에 대한 스코어를 기록하였다. 관찰 결과는 임상 관찰 보고서에 기록하였다. 모든 검사 돼지는 0일에서부터 7일까지 주사 부위 반응을 관찰하고, 7 군은 14일에서부터 21일까지 추가로 관찰하였다. 평균 일일 체중 증가는 -3일, 25일, 50일, 또는 공격접종이후 돼지가 폐사한 일자에, 보정된 스케일(calibrated scale)에서 각 돼지를 칭량함으로써 결정하였다. 체중은 체중 양식에 기록하였다. -3일 체중을 이용하여 무작위화에 앞서 돼지를 블록하였다. 25일과 50일 체중 데이터를 이용하여 이들 시점 동안 각 돼지에 대한 평균 일일 체중 증가(ADWG)를 결정하였다. 공격접종이후 및 50일 이전에 폐사한 돼지의 경우에, ADWG는 25일에서부터 폐사일까지 ADWG를 나타내도록 조정하였다.
PCV2 혈청반응을 결정하기 위하여, -3일과 14일에 각 새끼 돼지의 안와 정맥동(orbital venous sinus)으로부터 정맥 전혈(venous whole blood)을 수집하였다. 각 돼지 새끼에서, 무균 모세관 튜브를 한쪽 눈의 비측 안각(medial canthus) 내로 삽입하고 대략 3.0 ㎖의 전혈을 4.0 ㎖의 혈청 분리기 튜브(Serum Separator Tube, SST) 내로 배출함으로써 안와 정맥동으로부터 수집하였다. 25일, 32일, 50일에, 무균 18g x 1½ " Vacutainer 바늘(Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey), Vacutainer 바늘 홀더, 13 ㎖ SST를 이용하여 각 돼지의 전방 대정맥(anterior vena cava)으로부터 정맥 전혈을 수집하였다. 각 시점에서 혈액 수집은 샘플 수집 보고서에 기록하였다. 각 SST 내에서 혈액은 응고시키고, 이후, 각 SST는 스핀 다운시키고 혈청을 수거하였다. 수거된 혈청은 무균 스냅 튜브(snap tube)로 이전하고 후기 일자에 검사 때까지 -70± 10℃에서 보관하였다. 혈청 샘플은 BIVI-R&D 인력으로 PCV2 항체의 존재를 검사하였다.
돼지는 22일에서부터 50일까지 매일 임상적 증상을 관찰하고 정상적인 또는 비정상적인 행동, 호흡 또는 기침에 대한 스코어를 기록하였다. 관찰 결과는 임상적 관찰 보고서에 기록하였다.
1차 연구 장소에서 돼지 46(1 군)과 98(9 군)이 폐사하였다. 이들 폐사는 출혈성 폐사로 분류되었고, 이들 2마리 돼지는 부검하지 않았다. 2차 연구 장소에서, 공격접종이후 50일 이전에 폐사한 돼지와 50일에 안락사된 돼지는 부검하였다. 임의의 육안적 병소는 관찰하고, 병소가 존재하는 폐엽(lung lobe)의 비율은 부검 보고서 양식에 기록하였다.
2차 연구 장소에서 부검된 돼지 각각으로부터, 편도선, 폐, 심장, 간, 장간막 림프절(mesenteric lymph node)의 조직 샘플은 완충된 10% 포르말린을 보유하는 단일 용기 내에 위치시키고, 앞서 언급된 동일한 장기로부터 다른 조직 샘플은 Whirl-pak(M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, UK) 내에 위치시키고, 각 Whirl-pak은 얼음 위에 위치시켰다. 각 용기는 적절히 표지하였다. 샘플 수집은 부검 보고서 양식에 기록하였다. 이후, IHC 검사를 위하여, 포르말린-고정된 조직 샘플과 진단 요청서 양식을 제출하였다. IHC 검사는 샘플 접수, 샘플과 슬라이드 제조, 염색을 위한 표준 실험실 절차에 따라 수행하였다. Whirl-paks내에 새로운 조직은 보관(-70± 10℃) 및 차후 이용을 위하여 얼음 팩과 함께 연구 감독자에게 전달하였다.
포르말린-고정된 조직은 병리학자에 의해 IHC로 PCV2의 검출을 검사하고, 아래의 스코어링 체계(scoring system)를 이용하여 스코어를 기록하였다: 0 = 없음; 1 = 불충분한 양성 염색, 극히 일부 부위; 2 = 중간 양성 염색, 복수 부위; 3 = 충분한 양성 염색, 조직 전체에 확산. 분석 목적으로, 0의 스코어는 “음성”으로 간주되었고, 0 초과의 스코어는 “양성”으로 간주되었다.
결과
본 실시예의 결과는 아래에 제시된다. 돼지 46과 98은 각각, 14일과 25일에 폐사하였다. 이들 폐사는 출혈성 폐사로 분류되었다. 돼지 11(1 군)은 15일에 빠른 호흡으로 숨을 헐떡거렸다. 이들 이외에, 모든 돼지는 관찰 기간 동안 행동, 호흡, 기침이 정상이었고 어떤 군에서도 전신 부작용이 관찰되지 않았다. 0일에 백신접종이후 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다. 14일에 백신접종이후, 14마리의 1 군 돼지 중에서 7마리(50.0%)가 15일에 “2”의 스코어를 갖는 부종을 나타냈다. 14 마리의 1 군 돼지 중에서 4 마리(28.6%)가 16일에 “2”의 부종을 나타냈다. 다른 군에서는 백신접종이후 주사 부위 반응이 관찰되지 않았다.
평균 일일 체중 증가(ADWG) 결과는 하기 표 18에 제공된다. 출혈로 인하여 폐사한 돼지 46과 98은 군별 결과로부터 배제되었다. 16 ㎍의 vORF2-카르보폴의 1회 분량이 투여된 4 군이 가장 높은 ADWG(1.16± 0.26 lbs/day)를 보였고, 1.07± 0.23 lbs/day 내지 1.11± 0.26 lbs/day 범위의 ADWG를 보이는 1, 2, 3, 5, 6, 10 군이 그 뒤를 이었다. 9 군이 가장 낮은 ADWG(0.88± 0.29 lbs/day)를 보였고, 각각, 0.93± 0.33 lbs/day과 0.99± 0.44 lbs/day의 ADWG를 보이는 8 군과 7 군이 그 뒤를 이었다.
군별 평균 일일 체중 증가(ADWG)의 요약
군 처리 N (25일 내지 50일) 또는 50일 이전에 폐사된 돼지에 대하여 조정된 ADWG - lbs/day
1 rORF2 - 16 ㎍ -
IMS 1314(2회 분량)		 14 1.08± 0.30 lbs/day
2 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 1.11± 0.16 lbs/day
3 rORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 1.07± 0.21 lbs/day
4 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 1.16± 0.26 lbs/day
5 rORF2 - 4 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 1.07± 0.26 lbs/day
6 rORF2 - 1 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 1.11± 0.26 lbs/day
7 rORF2 - 0.25 ㎍ -
카르보폴(2회 분량)		 15 0.99± 0.44 lbs/day
8 KV > 8.0 로그 -
카르보폴(2회 분량)		 15 0.93± 0.33 lbs/day
9 공격접종 대조 14 0.88± 0.29 lbs/day
10 엄격한 음성 대조 15 1.07± 0.23 lbs/day
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스PCV2
PCV2 혈청반응 결과는 하기 표 19에 제공된다. 10개 군 모두 -3일에 PCV2에 대하여 혈청음성(seronegative)이었다. 14일에, 10개 군 모두에서 PCV2 역가는 여전히 낮았다(50-113 범위). 25일에, 사멸된 전체 세포 바이러스 백신이 투여되는 8 군은 최대 PCV2 역가(4617)를 보였고, 16 ㎍ vORF2 - 카르보폴이 투여된 2 군, 16 ㎍ vORF2 - 카르보폴의 단일 분량이 투여된 4 군, 16 ㎍ rORF2 - 카르보폴이 투여된 3 군이 각각, 2507, 1920, 1503의 역가로 그 뒤를 이었다. 32일(공격접종이후 1주일 시점)에, 1-6 군과 8 군에 대한 역가는 2360 내지 7619이었다; 반면, 7 군(0.25 ㎍ rORF2 - 카르보폴), 9 군(공격접종 대조), 10 군(엄격한 음성 대조)는 각각, 382, 129, 78의 역가를 보였다. 50일(부검일)에, 10개 군 모두 높은 PCV2 역가(≥1257)를 보였다.
25일, 32일, 50일에, 16 ㎍ rORF2 - 카르보폴의 2회 분량이 투여된 3 군은 16 ㎍ rORF2 - IMS 1314의 2회 분량이 투여된 1 군보다 높은 항체 역가를 보였다. 25일, 32일, 50일에, 16 ㎍ vORF2의 2회 분량이 투여된 2 군은 동일한 백신의 1회 분량만 투여된 4 군보다 높은 역가를 보였다. 각각, 16, 4, 1, 0.25 ㎍의 감소하는 수준의 rORF2 - 카르보폴이 투여된 3, 5, 6, 7 군은 25일과 32일에, 상응하게 감소하는 항체 역가를 보였다.
군별 PCV2 IFA 역가의 요약
군 처리 -3일 14일** 25일*** 32일 50일****
1 rORF2 - 16 ㎍ -
IMS 1314(2회 분량)		 50 64 646 3326 4314
2 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		50 110 2507 5627 4005
3 rORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		50 80 1503 5120 6720
4 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		50 113 1920 3720 1257
5 rORF2 - 4 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		50 61 1867 3933 4533
6 rORF2 - 1 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		50 70 490 2360 5740
7 rORF2 - 0.25 ㎍ -
카르보폴(2회 분량)		 50 73 63 382 5819
8 KV > 8.0 로그 -
카르보폴(2회 분량)		 50 97 4617 7619 10817
9 공격접종 대조 50 53 50 129 4288
10 엄격한 음성 대조 50 50 50 78 11205
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
*계산 목적으로, ≤100 IFA 역가는 “50”의 역가로서 표시되었다; ≥6400 IFA 역가는 “12,800”의 역가로서 표시되었다.
**공격접종 일자
***부검 일자
공격접종이후 임상적 관찰로부터 결과는 하기 표 20에 제공된다. 이러한 요약된 결과는 비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침에 대한 관찰 결과를 포함하다. 표 21에서는 임상적 증상의 군별 전체 발생률의 요약으로부터 결과를 포함하고, 표 22에서는 공격접종이후 군별 치사율의 요약으로부터 결과를 포함한다. 공격접종이후 비정상적 행동, 호흡, 기침의 발생률은 16 ㎍ rORF2-IMS 1314(1 군), 16 ㎍ rORF2-카르보폴(3 군), 1 ㎍ rORF2-카르보폴(6 군), 0.25 ㎍ rORF2-카르보폴(7 군)이 투여된 돼지 및 공격접종 대조군(9 군)의 돼지에서 낮았다. 16 ㎍ vORF2-카르보폴(2 군), 단일 분량의 l6 ㎍ vORF2-카르보폴(4 군), 4 ㎍ rORF2-카르보폴(5 군), > 8 로그 KV-카르보폴(8 군)이 투여된 돼지 및 엄격한 음성 대조군(10 군)의 돼지에서 공격접종이후 비정상적 행동, 호흡, 기침의 발생률은 0이었다.
임상적 증상의 전체 발생률은 군마다 상이하였다. 16 ㎍ vORF2-카르보폴(2 군), 단일 분량의 16 ㎍ vORF2-카르보폴(4 군)이 투여된 돼지 및 엄격한 음성 대조군(10 군)의 돼지는 0%의 발생률을 보였다; 16 ㎍ rORF2-카르보폴(3 군)과 1 ㎍ rORF2-카르보폴(6 군)이 투여된 돼지는 6.7%의 발생률을 보였다; 16 ㎍ rORF2-IMS 1314(1 군)가 투여된 돼지는 7.1%의 전체 발생률을 보였다; 4 ㎍ rORF2-카르보폴(5 군), 0.25 ㎍ rORF2-카르보폴(7 군), >8 로그 KV 백신이 투여된 돼지는 13.3%의 발생률을 보였다; 공격접종 대조군(9 군)의 돼지는 14.3%의 발생률을 보였다.
전체 치사율 역시 군마다 상이하였다. 2회 분량의 KV 백신이 투여된 8 군이 20.0%의 최대 치사율을 보였다; 공격접종 대조군인 9 군 및 0.25 ㎍ rORF2-카르보폴이 투여된 7 군은 각각, 14.3%와 13.3%의 치사율을 보였다. 1회 분량의 16 ㎍ vORF2-카르보폴이 투여된 4 군은 6.7% 치사율을 보였다. 모든 다른 군: 1, 2, 3, 5, 6, 10 군은 0% 치사율을 보였다.
공격접종이후 비정상적 행동, 비정상적 호흡, 기침에 대한 군별 관찰 결과의 요약
군 처리 N 비정상적
행동1 		비정상적
행동2 		기침3
1 rORF2 - 16 ㎍ -
IMS 1314(2회 분량)		 14 0/14(0%) 0/14(0%) 1/14(7.1%)
2 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 0/15(0%) 0/15(0%) 0/15(0%)
3 rORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 0/15(0%) 0/15(0%) 1/15(6.7%)
4 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 0/15(0%) 0/15(0%) 0/15(0%)
5 rORF2 - 4 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 1/15(6.7%) 1/15(6.7%) 0/15(0%)
6 rORF2 - 1 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 0/15(0%) 0/15(0%) 1/15(6.7%)
7 rORF2 - 0.25 ㎍ -
카르보폴(2회 분량)		 15 0/15(0%) 1/15(6.7%) 1/15(6.7%)
8 KV > 8.0 로그 -
카르보폴(2회 분량)		 15 1/15(6.7%) 1/15(6.7%) 0/15(0%)
9 공격접종 대조 14 1/14(7.1%) 1/14(7.1%) 2/14(14.3%)
10 엄격한 음성 대조 15 0/15(0%) 0/15(0%) 0/15(0%)
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
1각 군에서, 적어도 1일동안 비정상적 행동을 나타내는 돼지의 전체 개체수
2각 군에서, 적어도 1일동안 비정상적 호흡을 나타내는 돼지의 전체 개체수
3각 군에서, 적어도 1일동안 기침을 나타내는 돼지의 전체 개체수
공격접종이후 임상적 증상의 군별 전체 발생률의 요약
군 처리 N 임상적 증상을 나타내는 돼지의 빈도1 발생률
1 rORF2 - 16 ㎍ -
IMS 1314(2회 분량)		 14 1 7.1%
2 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 0 0.0%
3 rORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 1 6.7%
4 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 0 0.0%
5 rORF2 - 4 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 2 13.3%
6 rORF2 - 1 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 1 6.7%
7 rORF2 - 0.25 ㎍ -
카르보폴(2회 분량)		 15 2 13.3%
8 KV > 8.0 로그 -
카르보폴(2회 분량)		 15 2 13.3%
9 공격접종 대조 14 2 14.3%
10 엄격한 음성 대조 15 0 0.0%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
1각 군에서, 적어도 1일동안 임의의 임상적 증상을 나타내는 돼지의 전체 개체수
공격접종이후 군별 치사율의 요약
군 처리 N 공격접종이후 폐사 치사율
1 rORF2 - 16 ㎍ -
IMS 1314(2회 분량)		 14 0 0.0%
2 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 0 0.0%
3 rORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 0 0.0%
4 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 1 6.7%
5 rORF2 - 4 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 0 0.0%
6 rORF2 - 1 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 0 0.0%
7 rORF2 - 0.25 ㎍ -
카르보폴(2회 분량)		 15 2 13.3%
8 KV > 8.0 로그 -
카르보폴(2회 분량)		 15 3 20.0%
9 공격접종 대조 14 2 14.3%
10 엄격한 음성 대조 15 0 0.0%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
군별 평균% 폐 병소와 시험적 진단에서, 공격접종 대조군인 9군은 10.81± 23.27%의 평균으로 가장 높은 평균% 폐 병소를 보였고, 0.25 ㎍ rORF2-카르보폴이 투여된 7 군, 4 ㎍ rORF2-카르보폴이 투여된 5 군, KV 백신이 투여된 8 군이 각각, 6.57± 24.74%, 2.88± 8.88%, 2.01± 4.98%의 평균% 폐 병소로 그 뒤를 이었다.
나머지 6개 군은 0.11± 0.38% 내지 0.90± 0.15% 범위의 더욱 낮은 평균% 폐 병소를 보였다.
폐렴의 시험적 진단은 군마다 상이하였다. 2회 분량의 16 ㎍ rORF2-카르보폴이 투여된 3 군은 13.3%로 폐렴의 가장 낮은 시험적 진단을 보였다. 공격접종 대조군인 9 군은 50%가 폐렴으로 시험적으로 진단되었고, 엄격한 음성 대조군인 10 군 및 2회 분량의 16 ㎍ vORF2-카르보폴이 투여된 2 군은 각각, 46.7%와 40%가 폐렴으로 시험적으로 진단되었다.
1, 2, 3, 5, 9, 10 군은 0%가 PCV2에 감염된 것으로 시험적으로 진단되었다; 반면, 2회 분량의 KV 백신이 투여된 8 군은 20%의 최대 비율이 PCV2에 감염된 것으로 시험적으로 진단되었다. 2회 분량의 0.25 ㎍ rORF2-카르보폴이 투여된 7 군 및 1회 분량의 16 ㎍ vORF2-카르보폴이 투여된 4 군은 각각, 13.3%와 6.7%가 PCV2에 감염된 것으로 시험적으로 진단되었다.
위궤양은 7 군에서 1마리(6.7%) 돼지에서만 진단되었다; 다른 9개 군은 위궤양이 관찰되지 않았다.
군별 IHC 양성 발생률 결과의 요약은 하기 표 23에 제공된다. 1 군(16 ㎍ rORF2 - IMS 1314)은 PCV2에 대한 0%의 양성 돼지로 가장 낮은 IHC 양성 발생률을 보이고, 2 군(16 ㎍ vORF2 - 카르보폴)과 4 군(단일 분량 16 ㎍ vORF2 - 카르보폴)이 각각, 6.7%와 13.3%의 IHC 발생률로 그 뒤를 이었다. 공격접종 대조군인 9 군은 PCV2에 대한 100%의 양성 돼지로 가장 높은 IHC 양성 발생률을 보이고, 엄격한 음성 대조군인 10 군과 8 군(KV 백신)이 각각, PCV2에 대한 93.3%와 80%의 양성 돼지로 그 뒤를 이었다.
군별 IHC 양성 발생률의 요약
군 처리 N PCV2에 대한 적어도 하나의 양성 조직을 보유하는
돼지의 개체수		 발생률
1 rORF2 - 16 ㎍ -
IMS 1314(2회 분량)		 14 0 0%
2 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 1 6.7%
3 rORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 3 20.0%
4 vORF2 - 16 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 2 13.3%
5 rORF2 - 4 ㎍ -
카르보폴(1회 분량) 		15 3 20.0%
6 rORF2 - 1 ㎍ -
카르보폴(2회 분량) 		15 6 40.0%
7 rORF2 - 0.25 ㎍ -
카르보폴(2회 분량)		 15 7 46.7%
8 KV > 8.0 로그 -
카르보폴(2회 분량)		 15 12 80%
9 공격접종 대조 14 14 100.0%
10 엄격한 음성 대조 15 14 93.3%
vORF2 = 분리된 바이러스 ORF2; rORF2 = 재조합 바쿨로바이러스 발현된 ORF2; KV 또는 사멸된 전체 세포 바이러스 = 적절한 세포 배양액 내에서 성장된 PCV2 바이러스
SEQUENCE LISTING <110> Eichmeyer, Mark Nitzel, Greg Schaeffer, Merrill <120> PCV2 IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AND METHODS OF PRODUCING SUCH COMPOSITIONS <130> 34816-CIP1 <140> UNKNOWN <141> 2005-01-10 <150> Unknown <151> 2004-12-30 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is a modified Kozak's sequence <400> 1 ccgccatg 8 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is a recombinant Eco R1 sequence. <400> 2 gaattc 6 <210> 3 <211> 713 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 3 cagctatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtggaga 180 aggaaaaatg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttaa accctaaatg aat 713 <210> 4 <211> 713 <212> DNA <213> Porcine circovirus <400> 4 ccgccatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg 180 ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc 713 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 5 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 6 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro 225 230 <210> 7 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This sequence is from porcine circovirus type 2, open reading frame 2, together with a portion from the pGEM T-easy vector. <400> 7 gcggccgcgg gaattcgatc cgccatgacg tatccaagga ggcgttaccg cagaagaaga 60 caccgccccc gcagccatct tggccagatc ctccgccgcc gcccctggct cgtccacccc 120 cgccaccgct accgttggag aaggaaaaat ggcatcttca acacccgcct ctcccgcacc 180 ttcggatata ctgtcaaggc taccacagtc acaacgccct cctgggcggt ggacatgatg 240 agatttaata ttgacgactt tgttcccccg ggagggggga ccaacaaaat ctctataccc 300 tttgaatact acagaataag aaaggttaag gttgaattct ggccctgctc ccccatcacc 360 cagggtgata ggggagtggg ctccactgct gttattctag atgataactt tgtaacaaag 420 gccacagccc taacctatga cccatatgta aactactcct cccgccatac aatcccccaa 480 cccttctcct accactcccg ttacttcaca cccaaacctg ttcttgactc cactattgat 540 tacttccaac caaataacaa aaggaatcag ctttggctga ggctacaaac ctctagaaat 600 gtggaccacg taggcctcgg cactgcgttc gaaaacagta aatacgacca ggactacaat 660 atccgtgtaa ccatgtatgt acaattcaga gaatttaatc ttaaagaccc cccacttgaa 720 ccctaagaat tctatcacta gtgaattcgc ggccgc 756 <210> 8 <211> 10387 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is the porcine circovirus type 2, ORF2 construct, which includes baculovirus and pGEM T-easy coding sequences. <400> 8 aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60 gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120 ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180 gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240 ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300 gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360 gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420 ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480 cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540 aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600 tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660 tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720 gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780 ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840 cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900 ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960 tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020 tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080 actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140 tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200 gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260 gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320 cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380 cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440 tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500 ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560 cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620 tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680 tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740 ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800 tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860 atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920 cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980 cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040 ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100 cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160 tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220 atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280 gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340 aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400 acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg 2460 atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520 tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580 atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640 tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700 agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760 aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820 ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880 aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940 aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000 aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060 aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120 gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180 atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240 ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300 aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360 catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420 aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480 tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540 aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600 tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660 tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720 aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780 acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840 ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900 ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960 atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020 gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080 aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcagatctg 4140 cagcggccgc gggaattcga tccgccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa 4200 gacaccgccc ccgcagccat cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc 4260 cccgccaccg ctaccgttgg agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca 4320 ccttcggata tactgtcaag gctaccacag tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga 4380 tgagatttaa tattgacgac tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac 4440 cctttgaata ctacagaata agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tcccccatca 4500 cccagggtga taggggagtg ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa 4560 aggccacagc cctaacctat gacccatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc 4620 aacccttctc ctaccactcc cgttacttca cacccaaacc tgttcttgac tccactattg 4680 attacttcca accaaataac aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa 4740 atgtggacca cgtaggcctc ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caggactaca 4800 atatccgtgt aaccatgtat gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccacttg 4860 aaccctaaga attctatcac tagtgaattc gcggccgccg gccgctccag aattctagaa 4920 ggtacccggg atcctttcct gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa 4980 atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc 5040 tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa 5100 gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa 5160 ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg 5220 atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag 5280 ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc 5340 atcgatcgtg tcatctggga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct 5400 gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca 5460 ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac 5520 atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt 5580 aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt 5640 tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt 5700 cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt 5760 tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc 5820 gtttgtgttt tgttttgtaa taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta 5880 tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct 5940 tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa 6000 ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta 6060 attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct 6120 gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac 6180 acgttagaaa gcgatggtgc aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc 6240 ggcggtggtg gagctgatga taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc 6300 ggaggcggag gcggaggtgg tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct 6360 ttaggcaaca cagtcggcac ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg 6420 accggtctga gacgagtgcg atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg 6480 tcgtctaaag gtgcagcggg ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca 6540 gacatcgatg gtggtggtgg tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt 6600 ggcggcggtg ccgccggtat aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc 6660 accggcgcag gcgccgctgg ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg 6720 ggtggtggca attcaatatt ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt 6780 gtaatttcgc tatcgtttac cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta 6840 ttgtaaagag attgtctcaa gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta 6900 cagcattgta gtggcgagac acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa 6960 aaacgtcgtt ggcaagcttt aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt 7020 tgtcgtaaat gttgtttttg ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt 7080 gatgcgcatc aattttgttg ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc 7140 tacgattcgt catggccacc acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa 7200 actgcaaaaa cgtcaaaact cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta 7260 ttttatcgca caagcccact agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt 7320 ttaacgctga cgaaataaaa gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa 7380 tctattttaa tcacggttcc atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc 7440 ccgatttatt tgaaacacta caaattaaag gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata 7500 ttattagaca gctgtgtgaa gcgctcaacg atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg 7560 acataaaact cgaaaatgtc ttatatttcg aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt 7620 acggattgtg caaacacgaa aactcactta gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta 7680 gtccggaaaa aattcgacac acaactatgc acgtttcgtt tgactggtac gcggcgtgtt 7740 aacatacaag ttgctaacgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 7800 gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 7860 atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 7920 cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 7980 tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 8040 agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 8100 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 8160 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 8220 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 8280 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 8340 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 8400 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 8460 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 8520 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 8580 gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 8640 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 8700 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 8760 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 8820 gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 8880 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 8940 aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 9000 ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 9060 gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 9120 aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 9180 ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 9240 tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 9300 ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 9360 cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 9420 agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 9480 gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 9540 gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 9600 acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 9660 acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 9720 agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 9780 aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 9840 gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 9900 tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa 9960 aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 10020 ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 10080 acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc 10140 ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 10200 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 10260 agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 10320 aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc 10380 cagtgcc 10387 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 9 Ser Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His His Pro Pro Ser 1 5 10 15 His Leu Gly Gln 20 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Porcine circovirus <400> 10 Pro Arg His His Tyr Arg Pro Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr 1 5 10 15 Thr Leu Ser <210> 11 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> This is an amino acid sequence for porcine circovirus type 2, open reading frame 2. <400> 11 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230

Claims (53)

  1. PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질을 회수하는 방법에 있어서:
    A) PCV2로부터 재조합 개방 해독 틀 2를 전달 벡터 내로 클로닝하고;
    B) 재조합 개방 해독 틀 2를 보유하는 전달 벡터의 부분을 바이러스 내로 형질감염시키고;
    C) 배지 내에 세포를 상기 바이러스로 감염시키고;
    D) 상기 개방 해독 틀 2로부터 상기 단백질이 발현되도록 상기 바이러스를 유도하고;
    E) 상기 벡터로부터 세포를 상층액으로부터 분리하고;
    F) 상기 상층액 내에서, 발현된 개방 해독 틀 2 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 전달 벡터 내로 개방 해독 틀을 클로닝 하기에 앞서, PCV2 균주로부터 개방 해독 틀을 증폭하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 재조합 개방 해독 틀 2는 5' Kozak 서열, 3' EcoRl 부위, 이들의 조합에서 선택되는 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 5' Kozak 서열은 SEQ D NO: 1을 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  5. 청구항 3에 있어서, 3' EcoRl 부위는 SEQ ID NO: 2를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, PCV2 개방 해독 틀은 SEQ ID NO: 4를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 재조합 단백질은 SEQ ID No: 6을 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 배지는 혈청-없는 곤충 세포 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    i) 단계 A에 앞서, 증폭된 개방 해독 틀 2를 첫 번째 벡터 내로 클로닝하고;
    ii) 상기 첫 번째 벡터로부터 상기 개방 해독 틀 2를 절단하고;
    iii) 단계 A에서, 상기 절단된 개방 해독 틀 2를 이용하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 세포는 SF+ 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 바이러스는 바쿨로바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 형질감염된 부분은 SEQ ID NO: 4를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 개방 해독 틀 2 단백질은 바이러스로 세포를 감염시킨 이후 적어도 5일 시점에 상층액 내에서 회수되는 것을 특징으로 하는, PCV2의 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 재조합 단백질의 회수 방법.
  14. PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물을 제조하는 방법에 있어서,
    i) 구조체를 바이러스 내로 형질감염시키고, 상기 구조체는 PCV2의 개방 해독 틀 2로부터 재조합 DNA를 포함하고;
    ii) 상기 형질감염된 바이러스로 세포를 감염시키고, 상기 세포는 성장 배지 내에 존재하고;
    iii) 상기 개방 해독 틀 2로부터 재조합 단백질이 발현되도록 상기 바이러스를 유도하고;
    iv) 상기 상층액 내에서, 발현된 개방 해독 틀 2 단백질을 회수하고;
    v) 상기 회수된 단백질을 적절한 어쥬번트, 또는 다른 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 전달 벡터로부터 구조체를 획득하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법 .
  16. 청구항 14에 있어서, 개방 해독 틀 2를 전달 벡터 내로 클로닝하기에 앞서, PCV2의 균주로부터 개방 해독 틀 2를 증폭시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  17. 청구항 14에 있어서, 재조합 개방 해독 틀 2는 5' Kozak 서열, 3' EcoRl 부위, 이들의 조합에서 선택되는 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 5' Kozak 서열은 SEQ D NO: 1을 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 3' EcoRl 부위는 SEQ ID NO: 2를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  20. 청구항 14에 있어서, PCV2 개방 해독 틀은 SEQ ID NO: 4를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  21. 청구항 14에 있어서, 재조합 단백질은 SEQ ID No: 6을 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  22. 청구항 14에 있어서, 배지는 혈청-없는 곤충 세포 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  23. 청구항 16에 있어서,
    i) 증폭된 개방 해독 틀 2를 첫 번째 벡터 내로 클로닝하고;
    ii) 상기 첫 번째 벡터로부터 상기 개방 해독 틀 2를 절단하고;
    iii) 전달 벡터 내로 클로닝을 위하여 상기 절단된 개방 해독 틀 2를 이용하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  24. 청구항 14에 있어서, 세포는 SF+ 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  25. 청구항 14에 있어서, 바이러스는 바쿨로바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  26. 청구항 14에 있어서, 형질감염된 구조체는 SEQ ID NO: 4를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  27. 청구항 14에 있어서, 개방 해독 틀 2 단백질은 바이러스로 세포를 감염시킨 이후 적어도 5일 시점에 회수되는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  28. 청구항 14에 있어서, 회수 단계는 세포와 세포 잔해로부터 배지를 분리하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 분리 단계는 0.45 μM 내지 1.0 μM 크기 범위의 구멍을 보유하는 필터를 통하여 세포, 세포 잔해, 성장 배지를 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  30. 청구항 14에 있어서, 회수된 단백질을 적절한 어쥬번트와 결합시키기에 앞서, 바이러스를 불활성화시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물의 제조 방법.
  31. PCV2로부터 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 단백질을 회수하는 방법에 있어서,
    I) 개방 해독 틀 2를 보유하는 재조합 바이러스 벡터로 성장 배지 내에 세포를 감염시키고;
    iii) 상층액 내에서, 발현된 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, PCV2로부터 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 단백질을 회수하는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 회수는 바이러스 벡터로 세포의 감염이후 적어도 5일 시점에 수행되는 것을 특징으로 하는, PCV2로부터 개방 해독 틀 2에 의해 발현되는 단백질을 회수하는 방법.
  33. 청구항 1, 14, 31에서 선택되는 방법, 또는 이들의 조합으로 획득된 물질의 조성물.
  34. 약제로서 청구항 33에 따른 조성물의 용도.
  35. PCV2 감염의 예방을 약제의 제조에서 청구항 33에 따른 조성물의 용도.
  36. 샘플 내에서 PCV2 감염의 검출을 위한 진단 키트를 생산하는 방법에 있어서,
    i) 청구항 1, 14, 31에서 선택되는 방법, 또는 이들의 조합을 이용하여 재조합 단백질을 생산하고;
    ii) 상기 재조합 단백질을 적절한 용기 내로 포장하는 것을 특징으로 하는, 샘플 내에서 PCV2 감염의 검출을 위한 진단 키트를 생산하는 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 재조합 단백질을 포장하는 용기에 사용설명서를 첨부하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, 샘플 내에서 PCV2 감염의 검출을 위한 진단 키트를 생산하는 방법.
  38. PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물에 있어서, PCV2 ORF2 단백질, 또는 이의 면역원성 부분을 함유하고, 상기 면역원성 부분은 PCV2 ORF2 단백질로부터 적어도 10개의 연속 아미노산을 보유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서, PCV2 ORF2 단백질은 아래의 서열에서 선택되는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물:
    i) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO:11에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    ii) i)의 폴리펩티드에 적어도 80% 상동한 폴리펩티드;
    iii) i) 또는 ii)의 폴리펩티드의 면역원성 부분;
    iv) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10 또는 SEQ ID No: 11의 서열 내에 내포된 적어도 10개의 연속 아미노산을 포함하는, iii)의 면역원성 부분;
    v) SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 서열을 포함하는 DNA에 의해 인코딩되는 폴리펩티드;
    vi) v)의 폴리뉴클레오티드에 적어도 80% 상동한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드;
    vii) v) 또는 vi)의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 면역원성 부분;
    viii) vii)의 면역원성 부분, 여기서 상기 면역원성 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No: 3, 또는 SEQ ID No: 4의 서열 내에 내포된 적어도 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
  40. 청구항 38에 있어서, 불활성화된 바이러스 벡터와 세포 배양 상층액을 더욱 함유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  41. 청구항 40에 있어서, 불활성화된 바이러스 벡터는 PCV2 ORF2 단백질을 코딩하는 재조합 바쿨로바이러스인 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  42. 청구항 40에 있어서, 조성물은 BEI를 함유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  43. 청구항 42에 있어서, 조성물은 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)을 함유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  44. 청구항 39에 있어서, 담체, 어쥬번트, 배지, 바이러스 불활성인자, 희석액, 등장제, 면역조절제, 항생제, 이들의 조합에서 선택되는 부가적인 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  45. 청구항 44에 있어서, 어쥬번트, 바람직하게는, 카르보폴을 함유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  46. 청구항 45에 있어서, 조성물은 제약학적으로 허용되는 염, 바람직하게는, 염수를 함유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  47. 청구항 38에 있어서, 적어도 0.2 mcg/㎖ PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  48. 청구항 38에 있어서, 적어도 2 ㎍ PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는, PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키는데 효과적인 면역 조성물.
  49. 청구항 38의 면역 조성물의 적어도 1회 분량을 포함하는 용기에 있어서, 상기 1회 분량은 적어도 2 ㎍ PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 용기.
  50. 청구항 38의 면역 조성물의 10회 내지 250회 분량을 포함하는 용기에 있어서, 상기 1회 분량은 적어도 2 ㎍ PCV2 ORF2 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 용기.
  51. 청구항 49에 있어서, 항균 활성제를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 용기.
  52. 청구항 49의 용기 및 PCV2 감염과 연관된 임상적 증상의 심각도를 완화시키기 위하여 적어도 1회 분량의 면역 조성물의 새끼 돼지내로 근육내 적용을 위한 사용설명서를 포함하는 키트.
  53. 청구항 52에 있어서, 사용설명서는 적어도 1회 분량의 면역 조성물의 2차 또는 추가 투여에 관한 정보를 포함하고, 이러한 2차 또는 추가 투여는 최종 투여이후 적어도 14일 시점에 수행되는 것을 특징으로 하는 키트.
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