KR20140122735A - Ｈｉｖ 백신접종용 면역원 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 AIDS 및 그에 관련된 기회감염성 질병의 예방 및 치료에 유용한 중복 펩타이드들 (OLPs) 및 그로부터 유도된 펩타이드에 기초한 신규 면역원에 관한 것이다. 본 발명은 이들 면역원을 발현하는 핵산, 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 면역원을 포함하는 백신에도 관한 것이다.

Description

ＨＩＶ 백신접종용 면역원{IMMUNOGENS FOR HIV VACCINATION}
본 발명은 중복 펩타이드들 (OLPs: overlapping peptides) 및 그로부터 유도된 펩타이드에 기초한 신규 면역원에 관한 것이다. 본 발명은 이들 면역원을 발현하는 분리된 핵산 및 그러한 핵산을 포함하는 세포에도 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 특히 AIDS 및 그에 관련된 기회감염성 질병(opportunistic disease)의 예방 및 치료에 백신으로서 유용하다.
HIV 감염은 강하고 광범위하게 뻗어나가는(directed), 관련 생체 내 제어에 관련된 특정 에피토프 및 제한 HLA 대립유전자에 대한 HLA 클래스 I 제한된 T 세포 반응을 유도한다. Brander C, 등, Current Opinion Immunol. 2006; 18:1~8 참조. 대부분의 항-바이러스성 CTL 반응은 HLA-B 제한되는 것으로 나타나지만, 타겟된 바이러스 영역 및 제한 HLA 분자의 이들 반응의 효과에 대한 상대적인 기여는 불분명하게 남아있다. Kiepiela P, 등, Nature 2004; 432:769~775 및 Ngumbela K, 등, AIDS Res. Hum. Retroviruses 2008; 24:72~82 참조.
또한, HIV 서열 다양성이 바이러스-특이적 T 세포 면역의 생체 내 관련성에서 하는 역할은 불명확한데, 이는 이탈 변형체 (escape variant)의 기능적 제한들, 개별적인 단백질 위치에서의 코돈-이용성 (codon-usage), T 세포 수용체 (TCR) 가소성 및 기능적 결합활성 (avidity) 및 교차-반응성능 모두가 특이적 T 세포 반응의 전체 유효성에 모두 기여할 수 있기 때문이다. Brockman M, 등, J. Virol. 2007; 81: 12608~12618 및 Yerly D, 등, J. Virol. 2008; 82:3147~3153 참조. 중요하게는, HIV Gag에 대한 T 세포 반응은 가장 일관되게 HIV 클래드 (clade) B 및 클래드 C 감염된 집단 모두에서 감소된 바이러스 부하에 관련된다. Zuniga R, 등, J. Virol. 2006; 80:3122~3125 및 Kiepiela P, 등, Nat. Med. 2007; 13:46~53 참조.
그러나, 이들 분석들 중 어떤 것도, 특히 효과적인 반응을 유도할 수 있는 타겟된 단백질(들)의 보다 짧은 영역에 대한 반응의 역할을 평가한 것은 없다. 또한, Gag의 상대적인 이득이 이 단백질의 임의의 다른 특성, 예컨대 발현 수준, 아미노산 조성 및 내재적으로 더욱 큰 면역원성으로 인한 것인지의 여부는 불명확하다. 따라서, i) HIV 제어기 (controller)에서 현저하게 나타나는 반응들을 유도하고, 그리고 ii) 효과적인 바이러스 제어와 이미 관련된 대립유전자를 발현하는 개인들에 제한되지 않고, 다양한 HLA 유형들의 개인들에서 탐지가능할 수 있는, 이들 특이적 짧은 에피토프-풍부 영역 내, Gag 외부에 존재하는 단백질 서브유닛이 확인될 수 있음이 가능하다.
보다 초기의 연구들 일부에서는 "양호한" HLA 클래스 I 대립유전자 상에 제시된 Gag-유도된 에피토프의 잠재적인 과잉-대표(over-representation)를 실제로 제어하였지만, 순전히 Gag-계의 HIV 백신은 유리한 HLA 유전자형을 갖는 사람들에게 주로 유익할 것이고, Gag 외부의 잠재적으로 유익한 타겟들은 이용하지 않을 것이라는 염려가 남아있다. Kiepiela, 2007, 상기 참조, 및 Honeyborne I, 등, J. Virol. 2007; 81:3667~3672 참조. 또한, CTL 이탈 및 바이러스성 적합성 (fitness) 연구는 대체로, HLA-B57 및 -B27과 같은 상대적으로 보호성 HLA 대립유전자 상황에서 제시되는 Gag-유도된 에피토프에 제한된다. Schneidewind A, 등, J. Virol. 2007; 81:12382~12393 및 Leslie A, 등, Nat. Med. 2004; 10:282~289, 참조. 따라서, 이용가능한 정보는 인간 숙주 개체군의 유전적으로 다양한 대다수를 보호하기 위하여 설계된 면역원 서열에 대한 관련 정보를 제공할 수 없다.
나아가, 생체 내 바이러스 제어에서 부차적으로-우세한 (sub-dominant) 반응들의 결정적인 기여를 증명하는 HIV 및 SIV 감염에서의 최근 일부 연구들 [이들 중 타겟은 Gag의 외부에 위치함]에도 불구하고, 많은 연구들이 면역우세한 타겟에만 중점을 두고 있다. Frahm N, 등, Nat. Immunol. 2006; 7:173~178 및 Friedrich T, 등, J. Virol. 2007; 81:3465~3476 참조. 이와 함께, HIV에 대한 보호성 세포 면역 반응을 구성할 수 있는 것이 무엇인가에 대한 현재 전망은, 따라서 면역우세 반응에 대한 및 우월한 질병 결과와 관련된 HLA 대립유전자 및 빈번한 HLA 클래스 I 대립유전자에 의하여 제한된 반응에 대한 촛점에 편향되기 쉽다. 따라서, HIV 백신의 개발은 부분적으로는 광범위한 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원의 결핍에 의하여 제한된다. 본 발명은 그러한 면역원의 설계에 관한 것이다.
발명의 개요
첫번째 측면에서, 본 발명은 서열번호 1~16의 서열 또는 상기 서열번호 1~16의 변형을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 변형은 각각 8 개 이상의 아미노산 길이를 가지며, 단 상기 아미노산 서열은 임의의 서열번호 1~16 또는 그의 변형에 따른 아미노산 서열 외의 8 개 이상의 아미노산 길이의 HIV 지놈으로부터 유도된 임의의 서열 구간 (stretches)을 포함하지 않는다.
제 2 측면에서, 본 발명은 서열번호 1~16 또는 그의 변형으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 변형은 8개 이상의 아미노산을 가지며, 단:
i) 상기 면역원성 아미노산 서열은, 임의의 서열번호 1~16 또는 그의 변형에 따른 아미노산 서열 외의 8 개 이상의 길이의 HIV 지놈으로부터 유도된 임의의 서열 구간을 포함하지 않고; 그리고
ii) 면역원이 서열번호 1~16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 단지 하나의 서열만을 포함하는 경우, 이 서열은 서열번호 3, 5, 6 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이 아니다.
추가의 측면에서, 본 발명은 제 1 측면 및 제 2 측면의 면역원을 암호화하는 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 발현 카세트, 벡터, 바이러스 및 세포에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 제 1 항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 폴리펩타이드 및 하나 이상의 보조제를 포함하는 백신에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 의약에서의 이용을 위한 면역원성 폴리펩타이드 면역원성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 제 3 측면의 바이러스 또는 세포, 또는 조성물 백신에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HIV 감염 또는 HIV 감염과 관련된 질병의 예방 또는 치료에서의 이용을 위한 면역원성 폴리펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 제 3 측면의 바이러스 또는 세포, 또는 조성물 백신에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 제 1 및/또는 제 2 측면의 면역원, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 제 3 측면의 바이러스 또는 세포, 또는 제 4 측면의 조성물의 면역원을 포함하는 키트에 관한 것이다.
미생물 기탁
플라스미드 298H GMCSF-HIVACAT DNA를 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen [Inhoffenstraβe 7 B, D-38124 Braunschweig, 독일]에 접수 번호 DSM 25555 하에 2012년 1월 13일 기탁하였다.
도 1. 발현 벡터 내에 포함된 유전자의 도식적 표현. 점들은 개시 및 종결 코돈을 나타낸다.
도 2. 풀화된(pooled) 지라세포 중에서 유세포 (flow cytometric) 분석에 의하여 분석된 세포 면역 반응. (a)에서는 그룹들 (Gr) 중 총 Gag, Pol, 및 Nef-Tat-Vif 특이적 인터페론 감마 반응의 빈도를, 그리고 (b)에서 CD4 및 CD8 반응의 분포를 나타내었다.
도 3. 쥐과 지라세포 중 인터페론 감마 ELISpot에 의하여 측정된 Gag, Pol, NTV 및 HIVACAT T 세포 면역원 서열에 대한 반응. 각 마우스들을 완전한 Gag, Pol 및 Nef-Tat-Vif 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드를 이용하여 면역화하였다. 총 인터페론 감마 Gag-Pol-NTV 특이적 반응에 대한 HIVACAT T 세포 면역원 내에 포함된 영역을 타겟화하는 반응의 기여를 나타내었다.
도 4. 면역화된 마우스에서 HIVACAT T 세포 면역원을 타겟하는 인터페론 감마의, (a)에서 폭, 및 (b)에서 크기의 비교. 대상은 전장 단백질 또는 최소 T 세포 서열을 암호화하는 플라스미드 중 어느 하나를 이용하여 처리되었다.
도 5. 전체 Gag, Pol에 더하여 Nef-Tat-Vif 폴리펩타이드 및 HIVACAT T 세포 면역원을 암호화하는 플라스미드 20㎍로 면역화된 마우스들의 경우 Gag, Pol, Vif 또는 Nef에 대한 인터페론 감마 반응의 균형. 전체 단백질로 면역화된 마우스에 대한 패널 (a)에 나타낸 Gag-특이적 반응의 우세함에 반하여, HIVACAT T 세포 면역원으로 면역화된 마우스에 대한 패널 (b)에 나타낸 추가의 균형 레퍼터리 (repertoire).
도 6. 1mg의 gag 및 12% SDS-Page 상에서 분리된 gag-pol 발현 벡터 (p55 gag, 및 가공된 p24, p37 및 p55 gag 서브유닛을 나타냄)를 이용하여 형질감염된 HEK 293 세포로부터의 세포 추출물을 이용하고, 상기 막을 a) HIV-감염된 환자의 인간 혈청, b) 고투약량의 면역원으로 면역화된 마우스들로부터의 풀화된 혈청, 및 c) 저투약량의 면역원을 이용하여 면역화된 마우스들로부터의 풀화된 혈청 (모두 1:100 희석)을 이용하여 탐침함에 의한 웨스턴 면역블롯에 의하여 검출된 p24, p37 및 p55에 대한 결합 항체.
도 7. a) 처리된 마우스들로부터의 Gag-p24 특이적 결합 항체의 종말점 역가. 개별적인 일련의 4-배 희석된 풀화된 혈청 샘플들로부터의 ELISA에 의하여 측정을 수행하였다. b) HIV-1IIIB pr55 Gag 재조합 단백질 (카탈로그 번호 3276, NIH Reagent Program [Bethesda, MD, US 소재])을 이용한 인 하우스 (in house) 개발된 gag p55 ELISA. 1:100 희석의 각 마우스 혈청에서 측정을 수행하였다.
도 8. a) 마우스 면역화의 도식적 표현. 6개 C57BL/6 마우스의 그룹을 이용하여, 근육내 주사에 의하여 100㎍의 pDNA-HIVACAT 또는 10^6 pfu의 MVA-HIVACAT 중 하나를 이용하여 상이한 이종성 조합물들 (2xDNA 프라임 대 3xDNA 프라임 이후 1xMVA 부스트(boost))의 면역원성을 비교하는데 사용하였다. b) 각각의 면역화된 마우스들에서 Gag, Pol,Vif 및 Nef 특이적 반응들의 분포. c) 각각의 면역화된 마우스들에서 반응의 분포. d) 상이한 면역화 그룹들에서 HIVACAT T 세포 면역원 (Gag p17, Gag p24, Gag p2p7p1p6, Pol-프로테아제, Pol-RT, Pol-인테그라아제, Vif 및 Nef)에 포함된 8 개의 단백질 서브유닛들 중의 분포를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 광범위한 대상에서 HIV에 대한 높은 면역 반응을 유도하는데 효과적인 몇몇 면역원성 화합물들을 개시한다. 특히, 주요 HIV-암호화된 에피토프에 대한 HIV-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응이 이들 화합물을 이용하여 수득되었다.
1. 일반 용어 및 표현의 정의
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "보조제 (adjuvant)"라는 용어는, 면역원의 효과를 변경하면서, 단독으로 투여된 경우, 있다면 몇몇 직접적인 효과를 갖는 면역학적 약제를 의미하는 것이다. 이는, 감염된 외래 물질을 최소로 유지하는 한편, 공급된 항원에 대한 수령자의 면역 반응을 증진시키기 위하여 백신에 종종 포함된다. 보조제는 타겟 항원에 대한 면역계의 반응을 자극하기 위하여 백신에 첨가되지만, 그 자체로는 면역력을 부여하지는 않는다. 유용한 보조제의 비제한적인 예로는 광물염, 폴리뉴클레오타이드, 폴리아르기닌, ISCOM (면역자극복합체: immune stimulating complex), 사포닌, 모노포스포릴 지질 A, 이미퀴모드 (imiquimod), CCR-5 저해제, 독소, 폴리포스파젠, 시토카인, 면역조절 단백질, 면역자극 융합 단백질, 공-자극 분자, 및 그의 조합이 포함된다. 광물염에는, 이에 제한되지 않지만, AIK(SO4)2. AlNa(SO4)2, AlNH(SO4)2, 실리카, 명반, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, 고령토, 또는 탄소가 포함된다. 유용한 면역자극 폴리뉴클레오타이드로는, 이에 제한되지는 않지만, 면역 자극 복합체 (ISCOM)를 갖거나 또는 갖지 않는 CpG 올리고뉴클레오타이드, 폴리아르기닌을 갖거나 또는 갖지 않는 CpG 올리고뉴클레오타이드, 폴리 IC 또는 폴리 AU 산이 포함된다. 독소는 콜레라 독소를 포함한다. 사포닌은, 이에 제한되지는 않지만, QS21, QS17 또는 QS7을 포함한다. 유용한 면역자극 융합 단백질의 예는 면역글로불린의 Fc 단편 (fragment)과 IL-2의 융합 단백질이다. 유용한 면역조절 분자는, 이에 제한되지는 않지만, CD40L 및 CD1a 리간드를 포함한다. 보조제로서 유용한 시토카인은, 이에 제한되지는 않지만, IL-1, IL-2, IL-4, GMCSF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-α, IFN-β 및 인터페론 감마를 포함한다. 또한, 예로 무라밀 다이펩타이드, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민 (thr-DMP), N-아세틸-노르누라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민 (CGP 11687, 노르-MDP로서도 언급됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (CGP 19835A, MTP-PE로도 지칭됨), 2 퍼센트 스쿠알렌/TWEEN® 80 에멀션 중 RIBI (MPL+TDM+CWS), 리포폴리사카라이드 및 지질 A를 포함하는 그의 각종 유도체, 완전 프로인드 보조제 (Freund's Complete Adjuvant: FCA), 불완전 프로인드 보조제, 머크 보조제 (Merck Adjuvant) 65, 폴리뉴클레오타이드 (예로서, 폴리 IC 및 폴리 AU 산), 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)으로부터의 왁스 D, 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum), 백일해균 (보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis)) 및 브루셀라 (Brucella) 속의 원들에서 발견되는 성분들, 타이터맥스 (Titermax), 퀼 A (Quil A), ALUN, 지질 A 유도체, 콜레라독소 유도체, HSP 유도체, LPS 유도체, 합성 펩타이드 매트릭스 또는 GMDP, 몬타나이드 (Montanide) ISA-51 및 QS-21, CpG 올리고뉴클레오타이드, 폴리 I:C, 및 GMCSF가 있다. Osol A., Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1980, pp. 1324~1341), Hunter R, US 5,554,372, and Jager E, Knuth A, WO1997028816 참조. 보조제들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "AIDS"는 HIV 감염의 증상적인 시기를 지칭하며, 후천성 면역 결핍증 (흔히 AIDS로 알려짐) 및 "ARC" 또는 "AIDS-관련 복합체를 모두 포함한다. Adler M, 등, Brit. Med. J. 1987; 294: 1145~1147 참고. AIDS의 면역학적 및 임상적 표명은 당 기술 분야에서 공지이며, 예로서 면역 결핍 결과 초래되는 기회감염성 감염 및 암을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "아미노산 연결기 (linker)"는 천연 단백질 중 특정 위치에 나타나는 것들 외의 아미노산 서열을 지칭하며, 일반적으로 유연성이거나 또는 두 단백질 부분 사이에 α-나선과 같은 구조물이 끼도록 설계된다. 연결기는 스페이서 (spacer)로도 지칭된다. 연결기는 전형적으로 비-항원성이며, 본질적으로 임의의 길이 (예로서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 이 이상의 아미노산)일 수 있다. 연결기는, 세포 항원 가공 기구가 유력한 (poent) T 세포 에피토프를 파괴시키지 않으면서, 면역원성 폴리펩타이드의 분해를 개시할 수 있는 위치 또는 서열일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리"는, 돌연변이된 경우, 항레트로바이러스제에 내성을 부여하는 자리에 관한 것이다. 그러한 자리는, 예로서 특이적 돌연변이를 갖는 바이러스로부터의 서열 및 처리 또는 선택된 돌연변이를 갖는 분리물에 대한 약물 감수성 데이터가 검색될 수 있는, 스탠포드 대학 HIV 약물 내성 데이터베이스와 같이 알려진 데이터베이스 마이닝 (mining)에 의해 확인될 수 있다. HIV의 약물 내성 시험 분석은 당 기술 분야에 알려져 있다. 문헌 [Dong J, US 20040106136 및 Shafer R, Assay for 항레트로바이러스 내성, HIV InSite Knowledge Base Chapter (http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-02-02-03, 2012년 1월)] 참조. 이미 알려진 HIV 내 항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리는 세계 보건기구 (WHO)에 의해 또는 국제 항바이러스 학회-USA (International Antiviral Society-USA)에 의해 정기적으로 발표된다 (예로서, Johnson V, 등, ISA-USA Topics Antiviral Med. 2011; 19(4): 153~164).
본 명세서에서 사용된 것과 같은 표현, "세포 면역 반응"은 T 세포 및 그의 분비 생산물에 의하여 매개된 외래 항원(들)에 대한 면역 반응을 설명한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "계통수 중심 서열 (center-of-tree sequence)" 또는 "COT"는, 그로부터 관련 변형 서열의 계통발생도의 각 말단까지의 평균 진화 거리가 최소화된 서열을 지칭한다. Nickle D, 등, Science 2003; 299, 1515~1517 참조.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "최적화된 코돈"은 발현을 개선시키기 위하여 DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드의 변경없이 숙주 생물의 전형적인 코돈 이용을 반영하는 핵산 분자 내 코돈의 변경에 관한 것이다. 코돈 최적화를 위한 과도한 방법 및 소프트웨어 도구들은 이전에 보고되어 왔다. 문헌 [Narum D, 등, Infect. Immun. 2001; 69(12):7250~7253, Outchkourov N, 등, Protein Expr. Purif. 2002; 24(1):18~24, Feng L, 등, Biochemistry 2000; 39(50):15399~15409, and Humphreys D, 등, Protein Expr. Purif. 2000; 20(2):252~2] 참조.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "포함하는" 또는 "포함하다"는 일반적으로 허용되는 특허 실시에 따라 "이루어지는"도 개시하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 표현, "HIV 감염 관련 질병"은 대상에서 AIDS가 발생된 상태를 포함하지만, HIV에 감염된 대상이 그 질병의 임의의 징후 또는 증상은 나타내지 않는 상태도 포함한다. 따라서, 감염의 임상적 징후를 갖지 않는 대상에 투여된 경우, 본 발명의 백신은 질병의 개시를 방지할 수 있기 때문에 예방 활성을 가질 수 있다. 면역원성 조성물은 그러한 대상에서 감염 및 건강한 CD4+ T 세포의 파괴를 방지하거나 또는 느리게 할 수 있다. 이는 극히 낮은 CD4+ T 세포 수 및 마이코박테리아 종 (Mycobacteria spp.), 주폐포자충 (Pneumocystis carinii), 및 폐포자충 크립토코커스 (Pneumocystis cryptococcus)과 같은 기회감염성 병원균에 의한 반복된 감염과 같은, 후천성 면역결핍 질병의 증상의 개시를 방지 및 느리게 하는 것도 의미한다. 유익하거나 또는 바람직한 임상적 결과들로는, 이에 제한되지는 않지만, 절대 나이브 (naive) CD4+ T 세포 수에서의 증가 (10~3520 범위), 총 순환 면역 세포에 대한 CD4+ T 세포의 백분율에서의 증가 (1~50 퍼센트), 및/또는 감염되지 않은 대상에서 정상의 CD4+ T 세포 수의 백분율로서 CD4+ T 세포 수에서의 증가 (1~161 퍼센트 범위)가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "변형" 또는 "단편"은 개별적인 서열번호의 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 말단 아미노산의 결실에 의하여, 서열번호 1~16 중 임의의 것으로부터 유도된 폴리펩타이드를 지칭한다. 변형 또는 단편은 바람직하게는 그의 각 서열번호 중, 8 개 이상의 아미노산 길이를 갖거나, 또는 10% 이하, 20% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 50% 이하, 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하, 또는 99% 이하를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "HIV 지놈"은 HIV 캡시드에 의하여 둘러싸이고, 유전자 gag, pol, env, tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, vpx, 및 임의로, tev를 암호화하는 약 8749 개의 뉴클레오타이드 길이의 RNA 서열을 지칭한다. HIV 지놈 서열은 높은 변이성의 기초가 되는데, 이러한 이유로, 본 발명에서 지칭되는 HIV 지놈은 임의의 특이적 서열에 제한되지 않는다. 바람직한 서열들로는 HIV 유형의 것들 및 본 명세서에서 언급된 하위유형이 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "인간 면역결핍 바이러스" 또는 "HIV"는 유전적으로 인간 면역결핍 바이러스를 지칭하며, HIV 유형 1 ("HIV-1"), HIV 유형 2 ("HIV-2") 또는 기타 HIV 바이러스들을 포함하며, 이들은 예로서 HIV-1, HIV-2, 새로 생긴 (emerging) HIV 및 기타 HIV 하위유형 및 HIV 변형체, 예컨대 광범위하게 분산된 또는 지리학적으로 분리된 변형체들 및 원숭이 면역결핍 바이러스 ("SIV")를 포함한다. 예로서, 원형 (ancestral) 바이러스 유전자 서열은 HIV-1의 env 및 gag 유전자에 대하여, 예로서 HIV-1 하위유형 A, B, C, D, E, F, G, H, J 및 K, 및 하위유형간 재조합물, 예컨대 AG, AGI, 및 그룹 M, N, O 또는 HIV-2 바이러스 또는 HIV-2 하위유형 A 또는 B에 대하여 결정될 수 있다. HIV-1, HIV-2 및 SIV는 이에 제한되지는 않지만, 세포외 바이러스 입자 및 개별적인 감염된 세포들과 관련된 바이러스들의 형태들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "체액성 면역 반응"은 B 세포에 의하여 생산된 항체에 의해 매개된 외래 항원(들)에 대한 면역 반응을 설명한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "면역원성 조성물"은 항체를 생산하는 면역 반응 또는 특정 면역원에 대하여 세포-매개된 면역 반응을 이끌어내는 조성물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "면역원성 폴리펩타이드" 또는 "면역원"은, 단독으로 또는 보조제와 함께 주사된 경우, 적응성 면역 반응 (즉, 체액성 또는 세포-매개된 면역 반응)을 유도할 수 있는 폴리펩타이드 항원을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "키트"는 공정, 방법 또는 적용을 용이하게 하는 물품의 조합을 지칭한다. 이들 키트는 본 발명에 설명된 적용을 실시하는데 필요한 재료를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "작동적으로 연결된"은, 관심 대상의 뉴클레오타이드 서열이 그 뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결된 것을 의미하고자 하는 것이다 (예로서, 시험관 내 전사/번역 시스템 내 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입된 경우 숙주 세포 내). Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41~43 참조.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "펩타이드 태그" 또는 "태그"는, 상기 면역원의 분리 또는 정제에 사용될 수 있는 펩타이드 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 따라서, 상기 태그는 하나 이상의 리간드, 예로서 크로마토그래피 지지체 또는 비드와 같은 친화성 매트릭스의 하나 이상의 리간드에 고친화성으로 결합가능하다. 단백질을 분리 또는 정제하는데 유용한 태그의 예시적이고, 비제한적인 예로는, Arg-태그, FLAG-태그, His-태그, 또는 Strep-태그; 항체에 의하여 인식될 수 있는 에피토프, 예컨대 c-myc-태그 (항-c-myc 항체에 의해 인식됨), SBP-태그, S-태그, 칼모듈린 (calmodulin) 결합 펩타이드, 셀룰로오스 결합 도메인, 키틴 결합 도메인, 글루타티온 S-트랜스퍼라아제-태그, 말토오스 결합 단백질, NusA, TrxA, DsbA 또는 Avi-태그; 아미노산 서열, 예컨대 AHGHRP (서열번호 53), PIHDHDHPHLVIHS (서열번호 54), 또는 GMTCXXC (서열번호 55); 또는 β-갈락토시다아제가 포함된다. Terpe K, 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003; 60:523~525 참조.
본 명세에서 상호교환가능하게 사용된 것과 같은 용어들, "약학적으로 허용가능한 담체", "약학적으로 허용가능한 희석제" 또는 "약학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약학적으로 허용가능한 비히클"은, 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 재료 또는 임의의 통상의 유형에 보조적인 제제를 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 수령자에게 본질적으로 비독성이고, 제제의 다른 성분들과 혼화성이다. 예로서, 폴리펩타이드를 포함하는 제제용 담체는 산화제 및 폴리펩타이드에 유해한 것으로 알려진 기타 화합물들을 정상적으로는 포함하지 않을 것이다. 적합한 담체로는, 이에 제한되지 않지만, 물, 덱스트로스, 글리세롤, 식염수, 에탄올, 및 그의 조합을 포함한다. 담체는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 제제의 효능을 증진시키는 보조제와 같은 첨가제들을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "예방하다", "예방하는", 및 "예방"은 동물에서 질병의 개시를 억제 또는 발생을 감소시키는 것을 지칭한다. 예방은 완전할 수 있다 (예로서, 일정 대상에서 병리학적 세포들의 완전한 부재). 예방은 부분적일 수도 있는데, 예로서 일정 대상에서 병리학적 세포들의 발생이 본 발명 없이 발생할 수 있던 것보다는 적게된다. 예방은 임상적 조건에 대해 감소된 감수성을 지칭하기도 한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "분비 신호 펩타이드"는, 그가 기능하는 세포 위치에 도달하기 위해 반드시 막을 통해 통과하여야만 하는 단백질의 고도로 소수성인 아미노산 서열 (예로서, 바람직하게는 15 내지 60 개의 아미노산 길이)를 지칭한다. 신호 인식 입자들에 결합함으로써, 이들 서열은 발생기의 (nascent) 단백질-리보솜 복합체를 번역 동안 단백질이 삽입된 막으로 보낸다. 신호 펩타이드는 각종 막에 의한 단백질의 직접 번역 흡수를 지시한다 (예로서, 소포체, 미토콘드리아, 엽록체, 페록시솜). 비-막 단백질 상의 리더 신호 서열은 특정 펩티다제에 의하여 궁극적으로 제거된다. 사용된 일부 신호 펩타이드는 항원 제시 세포의 분비 및 유인을 촉진하기 위한, MCP-3 케모카인 (chemokine); 증가된 프로테아좀성 분해를 위한 카테닌(CATE)-유래 펩타이드; 및 MHC II 구획의 타게팅을 위한, 라이소좀 결합 단백질, LAMP1을 포함한다. Rosati M, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106:15831~15836, 참조.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 표현 "순차 투여"는 투여가 동시적이지 않고, 첫번째 투여가 수행되고 그 후 하나 이상의 연속적인 투여가 뒤따른다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "면역원성 폴리펩타이드의 면역학적 능력을 실질적으로 보존한다"는, 변형체가 단독으로 또는 보조제와 함께 주사된 경우, 적응성 (adaptive) 면역반응 (즉, 체액성 또는 세포-매개 면역 반응)을 유도하기 위한 면역원성 폴리펩타이드 능력의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100%를 유지하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "치료하다" 또는 "치료"는, 임상적 징후가 나타나기 전 또는 나타난 후에 그 질병의 진행을 제어하기 위하여 본 발명의 면역원성 조성물 또는 그를 포함하는 의약의 투여를 지칭한다. 질병 진행의 제어는 유리하거나 또는 바람직한 임상적 결과를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 이에 제한되지는 않지만, 증상의 감소, 질병 기간의 감소, 병리학적 상태의 안정화 (특히 추가적인 악화를 회피), 질병의 진행의 지연, 병리학적 상태의 개선 및 완화 (부분적 및 전체 모두)를 포함한다. 질병 진행의 제어는, 치료가 적용되지 않은 경우 예측되는 생존에 비한, 생존의 연장도 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "백신"은 면역학적 기억을 포함하는 적응성 면역반응을 유도함으로써 특정 질병에 대한 면역을 수립 또는 개선시키는 성분 또는 조성물을 지칭한다. 백신은 질병-유발 미생물 또는 그의 일부 (예로서, 폴리펩타이드)를 닮은 약제를 전형적으로 포함한다. 백신은 예방적 또는 치료적일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어, "변형체"는 치환, 바람직하게는 보존성 치환, 삽입 또는 비-말단 결실을 포함하는, 하나 이상의 아미노산에 영향을 미치고, 면역원성 폴리펩타이드의 면역원성 능력은 실질적으로 보존하는 변경 또는 돌연변이에 의하여, 서열번호 1~16 중 어느 하나로부터 유도된 모든 아미노산을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어 "벡터"는 관심 대상의 숙주 세포 내에서 그의 자율증식 (autonomous replication)을 제공하는 추가의 절편에 작동적으로 연결된 관심 대상의 핵산에 따른 절편 또는 관심 대상의 발현 카세트에 따른 절편을 포함하는 선형 또는 원형의 핵산 분자를 지칭한다.
2. 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드
제 1 측면에서, 본 발명은 서열번호 1~16의 서열 또는 상기 서열번호 1~16의 변형을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 변형들 각각은 8 개 이상의 아미노산 길이를 갖고, 단 상기 아미노산 서열은 서열번호 1~16 또는 그의 변형들 중 임의의 것에 따른 아미노산 서열 외의 8 개 이상의 길이의 HIV 지놈으로부터 유도된 임의의 서열 구간을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 제 1 측면의 면역원성 폴리펩타이드는 서열번호 49를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
제 2 측면에서, 본 발명은 서열번호 1~16 또는 그의 변형 또는 그의 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 아미노산을 갖는 면역원성 폴리펩타이드에 관한 것으로, 상기 단편은 8 개 이상의 아미노산 길이를 갖고, 단,
i) 상기 아미노산 서열은 서열번호 1~16 또는 그의 변형 또는 그의 단편 중 임의의 것에 따른 아미노산 서열 외의 8 개 이상의 길이의 HIV 지놈으로부터 유도된 임의의 서열 구간을 포함하지 않으며, 그리고
ii) 면역원이 서열번호 1~16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나의 서열만을 포함하는 경우, 이 서열은 서열번호 3, 5, 6 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이 아니다.
바람직하게는, 제 1 및 제 2 측면에 따른 변형은 그의 관련 서열에 균등하고, 상이한 HIV 균주로부터 유래되거나 또는 인공 HIV 서열이다. 이 측면에서 균등하다는 것은 하나 이상의 아미노산 잔기에서 상이하지만, 동일한 서열에 대응되는 것을 의미한다 (예로서, 지놈 또는 서열 유사성에서의 위치에 의해 결정됨). 즉, 바람직한 실시양태에서, 상기 변형은 "자연 발생적인 변형"으로, 이는 현재 또는 이전에 순환하는 바이러스의 서열의 HIV 지놈으로부터 유래된 핵산 서열을 지칭하며, 기존 데이터베이스 (예로서, GenBank 및 Los Alamos 서열 데이터베이스)로부터 확인될 수 있다. 순환 바이러스의 서열은 분자 생물학적 방법에 의하여 결정될 수도 있다. 문헌 [Brown T, "Gene Cloning" (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, 등, "Recombinant DNA", 2판. (Scientific American Books, New York, NY, US, 1992); Sambrook J, 등, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989)] 참조. 바람직하게는, 서열번호 1~16 중 임의의 변형은 그의 대응물 (즉, 서열번호 1~16)에 대하여 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성 백분율 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있다. 문헌 [Altschul S, 등, Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389~3402 및 Altschul S, 등, J. Mol. Biol. 1990; 215:403~410] 참조. 상기 BLAST 및 BLAST 2.0 프로그램이 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 서열 동일성 백분율을 결정하는데 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information의 웹페이지로부터 공개적으로 입수가능하다. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi, 2012년 1월 참조.
변형들은 하나 이상의 변경된 아미노산 잔기 (예로서, 치환기의 부착에 의해 변경된 잔기) 또는 베타 아미노산과 같은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수도 있다.
세포 반응의 정도를 결정하기 위한 방법은 본 기술분야에 알려져 있다. Ag에 반응하는 T 세포의 자극을 평가하는데 적합한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 아래 설명된 절차는 적합한 방법들의 몇가지 예를 제공한다:
1) 효소결합 면역스팟 (Enzyme-linked immunospot: ELISpot): 예비-배양물로부터의 비-부착(non-adherent) 세포들을, 원하는 항-시토카인 포획 항체로 코팅된, (Abs: 예로서, 항-IFN, 항-IFN, -IL-10, -IL-2, -IL-4) 플레이트로 옮긴다. 표명은 비오티닐화된 제 2 Abs를 이용하여 실시하고 표준 비색성 또는 형광측정 검출 방법, 예컨대 스트렙트아비딘-알칼리 포스파타아제 및 NBT-BCIP를 이용하여 실시하고, 스팟들을 계수한다. ELISpot 판독값은 스팟-형성 세포 (SFC)/ 106 투입 세포로서 표시된다.
2) 상등액 시토카인 분석: 배양 상등액 중에 방출된 시토카인을 상이한 기술, 예컨대 효소결합 면역흡수 분석 (ELISA), BD 세포계측 비드 어레이, Biorad Bio-Plex 분석 및 기타에 의하여 측정된다.
3) HLA 클래스 I 4량체: 이 절차를 이용하여, 특정 펩타이드 에피토프를 인식하는 Ag-반응성 T 세포가, 상업적으로 구매가능한 시약 (예로서, MHC 클래스 I Dexamers, Immudex, Copenhagen, DK) 또는 인-하우스(in-house) 생성된 시약 (예로서, Novak E, 등, J. Clin. Invest. 1999; 104:R63~R67) 중 어느 하나를 이용하여 검출된다.
4) HLA 클래스 II 4량체: 이 절차를 이용하여, 특정 펩타이드 에피토프를 인식하는 Ag-반응성 T 세포가, 상업적으로 구매가능한 시약 (예로서, MHC 클래스 II Ultimers™, ProImmune Ltd, Oxford, GB) 또는 인-하우스 생성된 시약 (예로서, Novak, 1991, 상기 참조) 중 어느 하나를 이용하여 검출된다.
5) 활성화 마커의 상향조절 (예로서, CD69, CD25, CD137): 이 절차를 이용하여, Ag-특이적 T 세포 반응이, Ag-인식 후 막 상에 노출된 활성화 마커의 차등 발현에 의하여 검출된다.
6) 시토카인 포획 분석: 이 시스템은 시토카인 반응에 따른 Ag-특이적 T 세포의 가시화를 위한, ELISpot에 대한 유효한 대안이다 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, DE). 추가적으로, 이는 관심대상의 T 세포의 직접적인 분류 및 클로닝을 가능하게 한다.
7) CD154 분석: 이 절차는 Ag-특이적 CD4+ T 세포의 검출에 제한된다. 문헌 [Chattopadhyay P, 등, Nat. Med. 2005; 11:1113~11117 및 Frentsch M, 등, Nat. Med. 2005; 11:1118~1124] 참조.
8) CD107 분석: 이 절차는 세포독성능을 이용하여 Ag-특이적 CD8+ T 세포의 가시화를 가능하게 한다. Betts M, 등, J. Immunol. Methods 2003; 281:65~78 참조.
9) CFSE 희석 분석: 이 절차는 Ag-특이적 T 세포 (CD4+ 및 CD8+)를, Ag 인식 후 그들의 증식에 따라 검출한다. Mannering S, 등, J. Immunol. Methods 2003; 283:173~183 참조.
변형체의 체액성 반응 정도 결정 방법은 당 기술분야에 알려져 있다. Ag에 반응하는 T 세포의 자극 평가에 적합한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법의 예로는 이에 제한되지 않지만, 면역원성 폴리펩타이드 또는 변형체로 처리된 대상의 혈청 중 항원성제 또는 면역원성제를 특이적으로 인식하는, 항체의 상대적인 양을, 처리되지 않은 대상에서의 항체의 양에 비교하여 검출 또는 정량하는 것을 포함한다. 항체 역가는 면역흡수 분석 (ELISA), 일원방사 면역확산법 (SRID), 또는 효소 면역분석 (ETA)과 같은 표준 분석을 이용하여 결정될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 임의의 서열번호 1~16의 변형은 상기 서열(들)의 단편이다.
특정 실시양태에서, 원형 바이러스 서열은 HIV-1 하위유형 B 또는 C의 env 유전자, 또는 하위유형 B 또는 C의 gag 유전자에 대해 결정된다. 다른 실시양태에서, 원형 바이러스 서열은 기타 HIV 유전자 또는 폴리펩타이드, 예컨대 pol 또는 보조 유전자 또는 폴리펩타이드에 대해 결정된다. 또다른 실시양태에서, 바이러스 서열은 컨센서스 또는 계통수 중심 기술에 의하여 결정된다.
바람직한 실시양태에서, HIV는 M 그룹 HIV이다. M 그룹은 주요 순환 HIV-1 그룹이다. 이는 문자로 표시되는 하위유형들, 및 숫자로 표시되는 하위유형들로 나뉘어진다. 하위유형 A1, A2, A3, A4, B, C, D, E, F1, F2, G, H, J 및 K가 현재 인식된다. HIV-1 하위유형은 클래드로도 명명되며, 서로 거의 동일한 유전적 거리에 있는 HIV-1의 계통발생적으로 연결된 균주이다; 일부 경우들에서, 하위유형은 지리적으로 또는 유행병학적으로도 연결되었다. 하위유형 내 유전적 변이는 15 내지 20 퍼센트 이상일 수 있는 반면, 하위유형들 또는 동일한 하위유형 중 다른 구성요소 (divergent member) 간의 변이는 대개 25 내지 35 퍼센트이다. HIV의 전체-지놈 서열분석에서의 진전은 순환 및 독특한 재조합 형태 (각각, CRFs 및 URFs)의 확인을 이끌었다. 이들은 이중 감염된 사람 내의 하위유형들 간의 재조합 결과로, 상기 이중 감염된 사람으로부터의 재조합 형태는 그 후 다른 사람들에게로 전달된다. 재조합 자손은, 직접적인 유행병학적 관련성이 없는 3 명 이상의 사람들에서 확인되는 경우, 순환 재조합 형태로서 분류되며; 그렇지 않은 경우, 이들은 독특한 재조합 형태로서 기재된다.
한 실시양태에서, 상기 면역원은 서열번호 1~16 또는 그의 변형으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 여기에서 상기 단서 ii)는: 면역원이 서열번호 1~16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나의 서열만을 포함하는 경우, 이 서열은 서열번호 1~16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이 아니다.
바람직한 실시양태에서, 상기 면역원은 서열번호 1~16 또는 그의 변형들로 이루어지는 군으로부터 선택된 2 개 이상, 3 개 이상, 또는 4 개 이상의 서열을 포함하며, 여기에서 상기 단서 ii)는: 면역원이 서열번호 1~16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2, 3, 또는 4개의 서열들만을 포함하는 경우, 이들 서열 모두가 서열번호 3, 5, 6 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것은 아니다. 또다른 실시양태에서, 상기 면역원은 서열번호 1~16 또는 그의 변형들로 이루어지는 군으로부터 선택된 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 여기에서 상기 단서 ii)는: 면역원이 서열번호 1~16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 서열들만을 포함하는 경우, 이들 서열 모두가 서열번호 1~16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것은 아니다.
바람직한 실시양태에서, 제 1 측면에 따른 면역원은 서열번호 1~16 또는 그의 변형들에 따른 서열들을 1~16의 순서대로 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제 1 측면에 따른 면역원에 관한 것으로, 여기에서 2 이상의 서열들은 아미노산 연결기에 의해 인접된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제 2 측면에 따른 면역원에 관한 것으로, 여기에서 상기 면역원이 서열번호 1~16 또는 그의 변형들로 이루어지는 군으로부터 선택된 2 이상의 서열을 포함하는 경우, 상기 서열들은 아미노산 연결기에 의해 인접된다.
제 1 및 제 2 측면의 면역원의 바람직한 실시양태에서, 연결기는 아미노산 서열 A, AA 또는 AAA를 갖는다. 또다른 실시양태에서, 연결기에 대하여 N-말단에 위치한 서열의 C-말단 잔기 또는 C-말단에 위치한 서열의 N-말단 잔기가 알라닌 잔기인 경우, 연결기는 짧아져서 인접 서열들 간의 접합 영역에서 AAA 서열이 형성될 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 연결기에 대하여 N-말단에 위치한 서열의 C-말단 잔기가 알라닌이거나 또는 연결기에 대하여 C-말단에 위치한 서열의 N-말단 잔기가 알라닌인 경우, 연결기는 AA 서열을 갖는다. 또다른 실시양태에서, 연결기에 대하여 N-말단에 위치한 서열의 C-말단 잔기 및 연결기에 대하여 C-말단에 위치한 서열의 N-말단 잔기가 모두 알라닌인 경우, 연결기는 A 서열을 갖는다.
또다른 실시양태에서, 상기 면역원은 N-말단에서 분비 신호 펩타이드를 더 포함하며, 여기에서 상기 신호 펩타이드는 바람직하게는 상기 면역원을 발현하는 세포들로부터 면역원의 분비를 증진시킨다. 바람직한 분비 신호 펩타이드는 GMCSF (과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자)로부터 유도되고, 이후 바람직하게는 안정성을 증가시키기 위하여 발린에 의해 유도된다. GMCSF 신호 펩타이드의 서열은 바람직하게는: MWLQSLLLLGTVACSIS (서열번호 46) 또는 MWLQSLLLLGTVACSISV (서열번호 47).
또다른 실시양태에서, 상기 면역원은 선택적으로 펩타이드 태그를 더 포함한다. 펩타이드 태그는 신호 펩타이드와 면역원성 폴리펩타이드 사이에서 N-말단에 위치할 수 있거나, 또는 바람직하게는 종결 코돈 전에 C-말단에 위치될 수 있다.
바람직하게는, 상기 태그는 FLAG 펩타이드이다. FLAG 시스템은, 관심 대상의 재조합 단백질에 융합되는, 짧은, 친수성 8-아미노산 펩타이드를 이용한다. FLAG 펩타이드는 일부 고도로 특이적인 ANTI-FLAG 모노클로날 항체 (M1, M2, M5; Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US)에 대한 결합 자리를 포함하며, 이는 형질감염된 세포들로부터의 재료 상에서 관심 대상의 단백질의 발현을 평가하는데 사용될 수 있다. FLAG 펩타이드 태그의 작은 크기로 인하여, 이는 일반적으로 다른 에피토프, 도메인을 차단하지 않거나, 또는 융합 단백질의 기능, 분비 또는 이동을 변경하지 않는다. 바람직하게는, 상기 FLAG 펩타이드는 서열 DYKDDDDKL (서열번호 48)를 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 상기 태그는 단지 면역원의 발현 분석 및 정제를 위한 것으로, 면역 반응을 이끌어내기 위하여 사용 전에 제거된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 면역원에 관한 것으로, 상기 아미노산 서열은 하나 이상의 항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리를 포함한다.
돌연변이는 바이러스 지놈 내 임의의 자리에서 일어날 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 인테그라아제, 프로테아제 또는 역전사제 유전자를 암호화하는 영역에서 일어난다.
인테그라아제 저해제에 대한 내성을 부여하는 인테그라아제 내 돌연변형체로는, 이에 제한되지 않지만, 서열번호 1 내 T66, E92, F121, E138, G140, Y143, S147, Q148, S153, N155, E157 및 R263 및 그의 조합이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 인테그라아제 단백질 내 E92Q, G 140S, G 140A 및 Y143R 돌연변이 및 그의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
프로테아제 저해제 (PI) 내성과 관련된 프로테아제 내 돌연변형체는 주 프로테아제, 보조 프로테아제, 및 프로테아제 분할 자리 돌연변이를 포함한다. Shafer R, 등, AIDS Rev. 2008; 10(2):67~84 참조. 17 개의 주로 비-다형성 위치는 가장 임상적으로 유의한 것으로, L231, L241, D30N, V321, L33F, M461/L, 147/V/A, G48V/M, 150L/V, F53L, 154V/T/A/L/M, G73S/T, L76V, V82A/T/F/S, 184V/A/C, N88D/S, L90M가 포함된다. 보조 프로테아제 돌연변이는 다형성 돌연변이 L101/V, 113V, K20R/M/I, M36I, D60E, I62V, L63P, A71V/T, V77I, 및 193L를 포함하고, 비-다형성 돌연변이는 L10F/R, V111, E34Q, E35G, K43T, K45I, K55R, Q58E, A71I/L, T74P/A/S, V751, N83D, P79A/S, 185V, L89V, T91 S, Q92K 및 C95F를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리는 역전사제 내에 위치되어, 뉴클레오사이드 역전사제 저해제 (NRTI) 또는 비-뉴클레오사이드 역전사제 저해제 (NNRTI)에 대한 내성을 결과로서 생성한다. 상기 NRTI 내성 돌연변이는 M184V, 티미딘 유사체 돌연변이 (TAMs), 티미딘 유사체 결여 체제에 의하여 선택된 돌연변이 (Non-TAMs), 및 다중-뉴클레오사이드 내성 돌연변이 (Multi-NRTI 돌연변이) 및 최근 설명된 많은 비-다형성 보조 돌연변이를 포함한다. 결국, M184V, K65R 및 L74V과 같은 비-티미딘-유사체-관련 돌연변이, 및 다중-뉴클레오사이드 내성 돌연변이 Q151M는 NRTI 혼입을 감소시킴으로써 작용한다. 티미딘 유사체 돌연변이, 다중-뉴클레오사이드 내성과 관련된 T69 삽입, 및 다수의 보조 돌연변이는 프라이머 해제 (unblocking)를 용이하게 한다. Shafer, 20008, 상동 참조. M184V는 가장 흔하게 발생하는 NRTI 내성 돌연변이이다. 가장 흔한 약물-내성 아미노산 돌연변이는 M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F 및 K219QE이다. 비-티미딘 유사체를 포함하는 NRTI 골격 (Non-TAMs)을 수령하는 동안, 바이러스학적 실패 (virologic failure)를 발생하는 환자에서 가장 흔한 돌연변이로는 M184V 단독 또는 K65R 또는 L74V와 조합된 M184V가 포함된다. 기타 Non-TAMs 돌연변이로는 K65N, K70E/G, L741, V75T/M, Y115F가 포함된다. 코돈 69에서 아미노산 삽입물은 일반적으로 다수의 TAM 존재 하에서 발생하며, 이 설정에서 3TC 및 FTC에 대한 중간 내성 및 잔류하는 NRTI 각각에 대해 높은 수준의 내성과 관련된다. Q151 M은 2-bp 돌연변이로 (CAG.fwdarw.ATG), 이는 일반적으로 하기 돌연변이들 중 2 개 이상이 수반된다: A62V, V751, F77L 및 F116Y. Q151M 복합체는 ZDV, d4T, ddI, 및 ABC에 대해 높은 내성을, 그리고 TDF, 3TC 및 FTC에 대해 중간 내성을 유발한다. Shafer R, 등, AIDS Rev. 2008; 10(2):67~84, 참조.
NNTRI 내성 돌연변이는, 이에 제한되지는 않지만, 일차 NNRTI 내성 돌연변이 (K103N/S, V106A/M, Y181C/I/V, Y188L/C/H, 및 G190A/S/E), NNRTI 내성 2차 돌연변이 (L1001, K101P, P225H, F227L, M230L, 및 K238T) 및 속도 돌연변이 (V179F, F227C 및 L2341)를 포함한다.
경미한 (minor) 비-다형성 돌연변이--A98G, K101 E, V 1081, 및 V 179D/E는, 네비라핀 (nevirapine) 및 에파비렌즈 (efavirenz)에 대한 감수성을 약 2배 내지 5배 감소시키는 흔한 NNRTI 내성 돌연변이이다.
기타 여러가지 비-뉴클레오사이드 역전사제 저해제 내성 돌연변이, 예컨대 K101Q, 1135T/M, V1791, 및 L2831은 네비라핀 및 에파비렌즈에 대한 감수성을 약 2배 감소시키고, 일차 NNRTI 내성 돌연변이와 상승작용적으로 작용할 수 있다. L74V, H221Y, K223E/Q, L228H/R, 및 N3481과 같은 기타 돌연변이는 NRTI에 의하여 NRTI에 의해 일차적으로 선택되지만, NNRTI 감수성에서의 미약한 감소도 유발한다.
바람직하게는, 상기 항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리는 임의의 서열번호 9~11 중에 위치된다. 더욱 바람직하게는, 상기 항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리는 서열번호 9의 아미노산 잔기 8이고, 여기에서 아미노산 Leu는 아미노산 Met에 의해 치환된다.
또다른 실시양태에서, 변형 또는 단편은 8 내지 40 개의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 1 내지 27 개의 아미노산 길이를 갖는다. 바람직하게는, 상기 변형 또는 단편은 임의의 서열번호 1~16에 인접하는 아미노산 연결기를 포함하지 않는다. 나아가, 상기 변형 또는 단편의 C-말단 아미노산은 G, P, E, D, Q, N, T, S, 또는 C가 아닌 것이 바람직한데, 이는 이들 잔기들이 HLA 클래스 I 제한된 T 세포 에피토프에 대한 C 말단 앵커 (anchor)를 일반적으로 형성하지 않기 때문이다.
가장 바람직한 실시양태에서, 상기 변형 또는 단편은 서열번호 17~45에 따른 펩타이드들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
나아가, 상기 변형 또는 단편은 열충격 단백질 (heat shock protein)과 조합 또는 융합된다는 것이 예상된다. 본 발명은 상기 변형 또는 단편 및 열충격 단백질을 포함하는 융합 단백질에도 관한 것이다. 바람직한 열충격 단백질은 Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96, 또는 Hsp100 이다.
또다른 실시양태에서, 상기 변형 또는 단편은, 제 1 및 제 2 측면에 따른 변형 또는 단편이다. 바람직하게는, 상기 변형 또는 단편은 임의의 서열번호 1~16에 인접하는 아미노산 연결기를 포함하지 않는다. 나아가, 상기 변형 또는 단편의 C-말단 아미노산은 G, P, E, D, Q, N, T, S도 또는 C 도 아닌 것이 바람직한데, 이는 이들 잔기들이 HLA 클래스 I 제한된 T 세포 에피토프를 일반적으로 형성하지 않기 때문이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 변형 또는 단편은 서열번호 17~45에 따른 펩타이드들로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
나아가, 상기 변형체 또는 단편은 열충격 단백질과 조합 또는 융합된다는 것이 예상된다. 본 발명은 상기 변형 또는 단편 및 열충격 단백질을 포함하는 융합 단백질에도 관한 것이다. 바람직한 열충격 단백질은 Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96, 또는 Hsp100 이다.
3. 발명의 핵산, 벡터, 바이러스 및 세포
제 3 측면에서, 본 발명은 제 1 측면의 면역원을 암호화하는 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 발현 카세트, 벡터, 바이러스 및 세포에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 핵산은 폴리뉴클레오타이드로, 뉴클레오타이드 단량체의 단일-가닥 또는 이중-가닥 중합체 (핵산)를 의미하며, 이에 제한되지는 않지만, 인터뉴클레오타이드 포스포다이에스테르 결합 연결에 의하여 연결된 2'-데옥시리보뉴클레오타이드 (DNA) 및 리보뉴클레오타이드 (RNA)를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 HIV 지놈의 부가적인 영역을 실질적으로 포함하지 않는 본 발명의 면역원을 암호화한다.
한 실시양태에서, 상기 핵산은 코돈 최적화된다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 인간에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다. 본 발명에 따른 이용을 위한 코돈-최적화된 핵산은, 면역원을 암호화하는 핵산의 코돈을 "인간화된" 코돈 (즉, 코돈은 고도로 발현된 인간 유전자에서 빈번하게 나타나는 것들이다)을 대체함으로써 제조될 수 있다. Andre S, 등, J. Virol. 1998; 72:1497~1503 참조. 바람직한 실시양태에서, 상기 코돈-최적화된 핵산은 서열번호 50에 따른 서열을 갖는다.
제 3 측면의 핵산은 그를 제한 효소로 절단하여 벡터 내로 결찰하는 것을 필요로 할 수 있다. 이 절차는 각종 말단 뉴클레오타이드들 (예로서, 1, 2, 또는 3)의 제거를 수반할 수 있다. 그와 같이, 한 실시양태에서, 본 발명은 제한 효소를 이용하여 각 말단이 절단된 상기 핵산에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제 3 측면의 핵산, 프로모터 서열 및 3'-UTR 및 선택적으로 선발 마커를 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 바람직하게는, 프로모터 서열은 인간 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터 또는 초기-후반 (early-late) p7.5 프로모터 서열이다. 바람직하게는, 3'-UTR은 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리-A이다. 선택적인 선발 마커는 바람직하게는 항생제 내성 유전자 (예로서, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 스펙티노마이신)이다.
그러나, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 제 3 측면의 핵산 또는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 따라서, 본 발명에 따른 적합한 벡터는 하기를 포함한다: 원핵성 벡터, 예컨대 pUC18, pUC19, 및 블루스크립트 (Bluescript) 플라스미드 및 그의 유도체, 예컨대 mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCRl 및 RP4 플라스미드; 파지 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28 벡터; 효모 내 발현 벡터, 예컨대 2-미크론 플라스미드형 벡터; 통합 벡터; YEP 벡터; 동원체 (centromeric) 플라스미드 및 유사체; 곤충 세포 내 발현 벡터, 예컨대 pAC 시리즈 및 pVL 시리즈의 벡터; 식물 내 발현 벡터, 예컨대 pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE 시리즈 및 유사체; 및 바이러스성 벡터 (예로서, MVA, 아데노바이러스, 아데노바이러스에 결합된 바이러스, 레트로바이러스 및 렌티바이러스) 및 비-바이러스성 벡터, 예컨대 pSilencer 4.1-CMV (Ambion®, Life Technologies Corp. [Carslbad, CA, US 참조]), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL 및 pKSV-10, pBPV-1, pML2d 및 pTDTl 벡터.
특정 실시양태에서, 발현 벡터는 포유동물 프로모터 및 폴리아데닐화 자리를 포함하는 포유동물 발현 벡터이다. 바람직하게는, 프로모터는 인간 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터이다. 바람직하게는, 폴리아데닐화 자리는 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 자리이다. 포유동물 발현 벡터는 박테리아 내에서 벡터 복제를 최적화하기 위하여 변형될 수 있다. 포유동물 발현 벡터는 선발 유전자, 예로서 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 카나마이신 내성 유전자를 포함한다.
기타 특정 실시양태에서, 발현 벡터는 바이러스성 벡터, 바람직하게는 변형 백신 앙카라 (Modified Vaccine Ankara: MVA) 바이러스 벡터이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제 3 측면의 핵산을 포함하는 바이러스에 관한 것이다. 적합한 바이러스는 안전하고, 낮은 독성을 갖고, 유전적으로 안정적이다. 비제한적인 실시예는 레트로바이러스, 특히 폭스바이러스 (poxvirus), 예컨대 MVA, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-결합된 바이러스 (AAVs)이다.
특히 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자 구축물을 포함하는 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라 (MVA: Modified Vaccinia virus Ankara)에 관한 것이다. 변형 백시니아 앙카라 (MVA) 바이러스는, 폭스바이러스과 내 진성두창바이러스(orthopoxvirus) 속의 한 원인, 백시니아 바이러스에 관련된다. MVA는 앙카라 균주의 백시니아 바이러스의 닭 배아 섬유아세포 (CVA)상에서의 516의 연속 계대배양에 의해 생성되어 왔다. Mayr A, 등, Infection 1975; 3:6~14 및 Sutter G, 등, US 6,440,422 및 CH 568,392 참조. MVA 바이러스는 공개적으로 이용가능하다 (예로서, ATCC 접수 번호 VR-1508). MVA는 양호한 면역원성 및 조류 세포에서 감염성 비리온을 복제 및 생산하는 완전한 능력을 유지하는 한편, 그의 감쇠 (예로서, 감소된 병독성 및 특정 포유동물 세포에서 감염성 비리온들을 재생하는 제한된 능력)에 의하여 구분된다. 적합한 MVA 균주는 증진된 안전성을 갖는 균주를 포함하는데, 이는 하기 i)~iii)으로 인한 것이다: i) 인간 각질세포주 HaCaT, 인간 배아 신장 세포주 293, 인간 뼈 골육종 세포주 143B, 및 인간 자궁경부 선암종 세포주 HeLa에서와 같이, 인간 세포주 내 재생성 복제능은 아닌, 닭 배아 섬유아세포 (chicken embryo fibroblasts: CEF)에서의 시험관 내 재생성 복제능; ii) 성숙한 B 및 T 세포를 생산할 수 없는 마우스 모델에서 복제 불능 및 그러한 것들은 엄격하게 면역 반응이 발휘되지 못하며 복제 바이러스에 고도로 민감함; 및 iii) DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 체제에 비교시, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 체제에서 특이적 면역 반응의 적어도 동일한 수준의 유도. 균주 내 적합한 감쇠된 MVA 균주은 MVA-BN로서 지칭된다. Chaplin P, 등, WO2002042480, ECACC 접수 번호 V00083008 참조.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제 3 측면의 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 또는 바이러스를 포함하는 세포에 관한 것이다. 사용되는 세포는 임의의 세포 유형일 수 있으며, 진핵 세포 및 원핵 세포를 모두 포함한다. 바람직하게는, 세포는 원핵 세포, 효모 세포, 또는 포유동물 세포를 포함한다. 포유동물 세포의 바람직한 예로는, COS 세포, HeLa 세포, HEK 293T 세포 또는 환자 (예로서, HIV 환자)로부터 분리된 세포가 있다.
4. 본 발명의 조성물
제 4 측면에서, 본 발명은 제 1 및 제 2 측면에 따른 변형체 또는 단편 및 열충격 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 면역원성 조성물은, 예로서 액체 용액, 현탁액 및 에멀션과 같은 주사가능한 것들로서 제조될 수 있다. 바람직한 열충격 단백질은 Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96, 또는 Hsp100 이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역원, 핵산, 발현 카세트, 벡터 또는 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 약학 조성물 및 제 4 측면의 조성물은, 하기 펼쳐지는 바과 같이, 백신으로서 사용될 수 있다.
5. 본 발명의 백신
또다른 측면에서, 본 발명은 제 1 및 제 2 측면의 면역원, 제 3 측면의 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스 또는 세포 또는 제 4 측면의 조성물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 백신은 세포성 및 체액성 반응을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 백신은 세포독성 T 세포 반응을 생성한다. 세포독성 T 세포 또는 세포독성 T 림프구 (CTL) 분석은, 상동성 및 이종성 HIV 균주에 대항하는 바이러스 서열을 이용하여 서브지놈성 (subgenomic) 면역화 후에 이어, 세포성 면역 반응을 감독하는데 사용될 수 있다. 문헌 [Burke S, 등, J. Inf. Dis. 1994; 170:1110~1119 및 Tigges M, 등, J. Immunol, 1996; 156:3901~3910] 참조. T 세포 반응을 검출하기 위해 사용된 통상의 분석은, 예로서 증식 분석, 림포카인 분비 분석, 직접 세포독성 분석 및 제한 희석 분석을 포함한다. 예로서, 펩타이드와 함께 인큐베이션된 항원-제시 세포는 반응자 세포 개체군 내에서 CTL 반응을 유도하는 그의 능력에 대해 분석될 수 있다. 항원-제시 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs) 또는 수지상 세포 (DCs)와 같은 세포들일 수 있다. 다르게는, 내부적으로 가공된 펩타이드를 갖는 MHC 클래스 I 분자를 부하하는 능력이 결핍되고, 적절한 인간 MHC 클래스 I 유전자로 형질감염된, 돌연변형체 비-인간 포유동물 세포주가, 관심 대상의 펩타이드가 시험관 내에서 일차적인 CTL 반응을 유도하는 능력을 시험하는데 사용될 수 있다. PBMCs는 CTL 전구체의 반응자 세포원으로서 사용될 수 있다. 적절한 항원-제시 세포는 펩타이드와 함께 인큐베이션되고, 그 후, 단백질-부하된 항원-제시 세포들은 최적화된 배양 조건 하에서 반응자 세포 개체군과 인큐베이션된다. 양성 CTL 활성화는, 모두 특정 펩타이드-펄스된 타겟 및 펩타이드 서열이 그로부터 유도된 항원의 내생적으로 가공된 형태를 발현하는 타겟 세포인, 방사성동위원소표지된 (radiolabeled) 타겟 세포들을 죽이는 CTL의 존재에 대해, 배양물을 분석함으로써 결정될 수 있다. 예로서, 상기 타겟 세포는 51Cr 로 방사성동위원소 표지될 수 있으며, 세포독성 활성은 타겟 세포로부터 방출된 방사성으로부터 계산될 수 있다. 또다른 적당한 방법은 형광-표지된 HLA 4량체 복합체로 염색함으로써 항원-특이적 T 세포의 직접적인 정량을 가능하게 한다. 문헌 [Altman J, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:10330~10334 및 Altman J, 등, Science 1996; 274:94~96] 참조. 비교적 최근의 다른 기술적 발전들에는 세포내 림포카인에 대한 염색 및 인터페론 방출 분석 또는 ELISpot 분석이 포함된다.
한 실시양태에서, 제 4 측면의 백신은 하나 이상의 보조제 또는 열충격 단백질을 더 포함한다.
보조제는 상기 정의된 바와 같다. 바람직한 열충격 단백질은 Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, gp96 또는 Hsp100 이다.
4. 치료 방법
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 면역원성 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 발현 벡터, 본 발명의 바이러스, 본 발명의 세포 또는 본 발명에 따른 백신은 HIV 감염 또는 HIV 감염과 연관된 질병의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 HIV 감염 또는 HIV 감염 관련 질병의 예방 또는 치료에서의 용도를 위한, 본 발명에 따른 면역원성 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 발현 벡터, 본 발명의 바이러스, 본 발명의 세포 또는 본 발명에 따른 백신에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 HIV 감염 또는 HIV 감염 관련 질병의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따른 면역원성 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 발현 벡터, 본 발명의 바이러스, 본 발명의 세포 또는 본 발명에 따른 백신의 용도에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 HIV 감염 또는 HIV 감염 관련 질병의 예방 또는 치료 방법에 관한 것으로, HIV 감염 또는 HIV 감염 관련 질병의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 면역원성 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산, 본 발명의 발현 카세트, 본 발명의 발현 벡터, 본 발명의 바이러스, 본 발명의 세포 또는 본 발명에 따른 백신을 상기 대상에 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도를 위한 면역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신은, 하기 i) 및 ii)의 순차 투여를 포함한다:
i) 제 1의, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원성 펩타이드, 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산, 제 15항의 발현 카세트, 제 16항의 발현 벡터, 제 17항 또는 제 18항의 바이러스, 제 19항의 세포 또는 제 20항의 백신, 및
ii) 제 2의, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원성 펩타이드, 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산, 제 15항의 발현 카세트, 제 16항의 발현 벡터, 제 17항 또는 제 18항의 바이러스, 제 19항의 세포 또는 제 20항의 백신.
특정 실시양태에서, 제 1의 면역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신은 제 2의 면역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신과 상이하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 발현 벡터를 먼저 투여하고, 이어서 본 발명에 따른 변형 백시니아 앙카라 바이러스를 투여한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 제 1 발현 벡터는 2회 이상, 바람직하게는 3회 이상 투여된다.
HIV 감염 또는 AIDS 증후군에 대한 백신의 유리한 예방 또는 치료 효과는, 예로서 다음을 포함한다: HIV에 노출된 개인의 초기 감염의 방지 또는 지연; HIV로 감염된 개인에서 바이러스 부담을 감소; HIV 감염의 비증상 시기의 연장; HIV 감염된 환자; 바이러스 수준이 항-레트로바이러스 치료 (ART)를 거쳐 낮추어진 상태의 HIV 감염된 환자에서 낮은 바이러스 부하를 유지; 약물 치료를 받지 않은 환자 및 ART 처리된 환자에서, HIV-1 특이적 및 비-특이적 모두의, CD4 T 세포 수준의 증가 또는 CD4 T 세포 감소의 줄어듬, HIV 특이적 CTL의 폭, 크기, 결합활성 및 작용성의 증가, AIDS가 있는 개인에서의 전체적인 건강 또는 생활의 질의 증가; 및 AIDS가 있는 개인의 예상 수명의 증가. 임상의는 면역화 효과를 치료 전 환자의 상태와, 또는 치료되지 않은 환자의 예상 상태와 비교하여, 치료가 AIDS 억제에 효과적인지 아닌지의 여부를 결정할 수 있다.
바람직하게는, 상기 질병은 AIDS, ARC 또는 HIV 기회감염성 질병이다. HIV 기회감염성 질병의 비제한적인 예로는 버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma), 기관지, 기도, 폐 또는 식도에서의 칸디다증, 자궁경부암, 콕시디오이도진균증 (coccidioidomycosis) (산재성 또는 폐 외측), 크립토코커스증 (cryptococcosis) (폐 외측), 크립토스포리디움증 (cryptosporidiosis) (내장에서 1달 이상 지속), 거대세포바이러스 감염 (간, 지라 또는 림프절 외측), 거대세포바이러스 망막염 (실명), HIV 뇌병증, 한 달 이상 지속되는 단순 포진 병변, 기관지, 폐, 또는 식도 내 단순 포진 병변, 히스토플라즈마증 (histoplasmosis) (산재성 또는 폐 외측), 면역모세포 림프종 (immunoblastic lymphoma), 침윤성 (invasive) 자궁경부 암종 (암), 한 달 이상 지속되는 장 내 포자충증 (isosporiasis), 카포시 육종 (Kaposi's sarcoma), 림프종 (주로 뇌 내), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium) 복합체 (산재성 또는 폐 외측), 마이코박테리움 칸사시 (Mycobacterium kansasii) (산재성 또는 폐 외측), 결핵균 (산재성 또는 폐 외측), 주폐포자충성 폐렴, 페렴 (12 달 기간 내 재발), 진행성 다병소성 백질뇌증 (progressive multifocal leukoencephalopathy: PML), 살모넬라 패혈증 (재발성), 톡소플라스마증 (toxoplasmosis) (뇌 내), 소모성 (wasting) 증후군 및 HIV-감염 환자에서 제대로 발휘되지 못하는 (compromised) 면역계에 의해 촉진된 감염으로부터의 결과인 임의의 기타 질병이 있다.
본 발명의 백신은 HIV-1 감염의 치료에 유용할 수 있다. HIV-1을 앓을 수 있는 모든 동물들 또는 그의 균등체들은 이 방식으로 치료될 수 있지만 (예로서, 침팬지, 마카크 (macaque), 개코원숭이 (baboon) 또는 인간), 본 발명의 면역원성 조성물은 특히 인간에서의 치료 용도를 위한 것이다. 종종, 원하는 치료 효과를 일으키기 위하여 1회 이상의 투여가 필요할 수 있다; 정확한 프로토콜 (투약량 및 빈도)은 표준 임상 절차에 의해 수립될 수 있다.
본 발명은 나아가, HIV 감염과 관련된 증상들의 예방 또는 감소에 관한 것이다. 이들은 HIV 감염의 경미한 증상기와 관련된 증상들을 포함하며, 이들은 예로서, 대상포진, 피부 발진 및 손톱 감염, 구내 염증 (mouth sores), 재발성 코 및 인후 감염 및 체중 손실을 포함한다. 추가적으로, HIV 감염의 주요 증상기와 관련된 추가적인 증상으로는, 예로서 아구창 및 질염 (칸디다증), 지속성 설사, 체중 손실, 지속성 기침 및 재활성화된 결핵 또는 재발성 헤르페스 감염, 예컨대 구순포진 (단순포진)이 포함된다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 완전히-발달한 AIDS의 기타 증상에는 예로서, 설사, 오심 및 구토, 칸디다증 및 구강 염증, 지속성, 재발성 질 감염 및 자궁경부암, 지속성 전신성 임파절종창 (persistent generalized lymphadenopathy: PGL), 심각한 피부 감염, 사마귀 및 백선, 호흡기 감염, 폐렴, 특히 주폐포자충 폐렴 (PCP), 헤르페스 조스터 (herpes zoster) (또는 대상포진), 신경계 문제, 예컨대 손발에서의 통증, 무감각 또는 "저림", 신경학적 이상, 카포시 육종, 림프종, 결핵 또는 기타 유사한 기회감염성 감염이 포함된다. 본 발명의 유익한 효과는 예로서, HIV에 감염된 개인의 초기 감염의 예방 또는 지연, HIV로 감염된 개인에서 바이러스성 부담의 감소, HIV 감염의 비증상 시기의 연장, 그의 바이러스 수준이 항-레트로바이러스 치료 (ART)를 통해 저하된 HIV 감염된 환자에서 낮은 바이러스 부하 유지, 약물 치료를 받지 않은 환자 및 ART 처리된 환자에서, HIV-1 특이적 및 비-특이적 모두의, 약물 CD4 T 세포 수준의 증가 또는 CD4 T 세포에서의 감소의 줄어듬, HIV 특이적 CTL의 폭, 크기, 결합활성 및 작용성의 증가, AIDS가 있는 개인에서의 전체적인 건강 또는 생활의 질의 증가; 및 AIDS가 있는 개인의 예상 수명의 증가가 포함된다. 임상의는 면역화 효과를 치료 전 환자의 상태와, 또는 치료되지 않은 환자의 예상 상태와 또는 백신 처리된 및 치료되지 않은 개인들의 임상 시험에서 비교하여, 치료가 AIDS 억제에 효과적인지 아닌지의 여부를 결정할 수 있다.
면역원성 조성물은 핵산 또는 발현 벡터를 작용의 바람직한 자리로 도입시키고, 그를 적절하고 제어가능한 속도로 방출하도록 설계될 수 있다. 지효성 (controlled-release) 제형의 제조 방법은 본 기술분야에 알려져 있다. 예로서, 지효성 제제는 중합체의 이용에 의하여 면역원 또는 면역원성 조성물을 착화 또는 흡수하여 생산될 수 있다. 지효성 제형은 바람직한 제어된 방출 특성 또는 방출 프로파일을 제공하는 것으로 알려진 적절한 거대분자 (예로서, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐, 피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 또는 프로타민 설페이트)를 이용하여 제조될 수 있다. 지효성 제제에 의하여 작용 기간을 제어하는 또다른 가능한 방법은, 유효 성분을 중합체성 재료 (예로서, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리락트산, 폴리글라이콜산, 이들 산들의 공중합체, 또는 에틸렌 비닐아세테이트 공중합체)의 입자 내로 통합시키는 것이다. 다르게는, 이들 유효 성분들을 중합체성 입자 내로 통합시키는 대신, 이들 재료를 콜로이드성 약물 전달계 (예로서, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀션, 나노입자, 나노캡슐) 또는 거대에멀션 내에서, 예로서 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의하여 또는 계면 중합에 의하여, 예로서 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 의하여 제조된 마이크로캡슐 내로 이들 재료를 트랩하는 것이 가능하다. 문헌 [Voller A, 등, Eds., "New Trends and Developments in Vaccines (University Park Press, Baltimore, MD, US, 1978) 및 Gennaro A, Ed., "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1990)] 참조.
본 발명의 면역원성 조성물 중 본 발명의 핵산 및 발현 벡터 (집합적으로, 면역원)의 적합한 투여량 (dosage)은 본 기술 분야의 당업자에 의하여 쉽게 결정될 수 있다. 예로서, 면역원의 투여량은 투여 경로 및 대상의 크기에 따라 변화될 수 있다. 적합한 투약량은 당업자에 의하여, 예로서 대상, 예컨대 실험실 동물의 면역 반응을 통상의 면역학적 기술을 이용하여 측정하고, 투여량을 적절하게 조절하여 결정할 수 있다. 대상의 면역 반응 측정을 위한 이러한 기술은 이에 제한되지는 않지만, 크롬 방출 분석, 4량체 결합 분석, IFN ELISPOT 분석, IL-2 ELISPOT 분석, 세포내 시토카인 분석, 및 기타 면역학적 검출 분석을 포함한다. Harlow E, Lane D, "Antibodies: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1988) 참조.
면역원성 조성물은, 이에 제한되지는 않지만, 근육내, 정맥내, 피부내, 경피성, 비강내, 점막내 (예로서, 직장내, 질내, 구강), 및 국소 전달을 포함하는 임의의 적합한 전달 방법을 이용하여 투여될 수 있다. 이러한 기술은 당 기술분야에서 공지이다. 전달 방법의 더욱 특이적인 예로는 근육내 주사, 근육내 주사, 및 피하 주사이다. 그러나, 전달은 주사 방법에 제한되지 않는다. 또한, DNA의 동물 조직으로의 전달은 네이키드 (naked) DNA의 양이온성 리포솜 직접 주입에 의하여 또는 "유전자 총" 또는 엘렉트로포레이션 기술을 이용하여 DNA의 피부내 주사에 의해 달성되었다. 문헌 [Watanabe M, 등, Mol. Reprod. Dev. 1994; 38:268~274, Charnock-Jones D, 등, WO1996020013, Robinson H, 등, Vaccine 1993: 11:957~960, Hoffman S, 등, Vaccine 1994; 12(16):1529~1533; Xiang Z, 등, Virology 1994; 199:132~140, Webster R, 등, Vaccine 1994; 12:1495~1498, Davis H, 등, Vaccine 1994; 12: 1503~1509, Davis H, 등, Hum. Mol. Gen. 1993; 2:1847~1851, 및 Johnston S, 등, Meth. Cell Biol. 1994; 43:353~365] 참조. 전달은 항문, 질 또는 구강 점막과 같은 점막 표면을 통하여 달성될 수 있다.
7. 본 발명의 키트
또다른 측면에서, 본 발명은 제 1 측면의 면역원, 제 2 측면의 펩타이드 또는 변형체, 제 4 측면의 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스 또는 세포, 또는 제 4 측면의 백신을 포함하는 키트에 관한 것이다. 이들 키트는 본 발명에 설명된 적용을 실시하는데 필요한 재료를 제공한다. 키트는 패치 형태일 수도 있다.
추가적으로, 키트는, 정해진 경계 내에서 시약을 유지하는 것을 가능하게 하는 포장을 포함할 수 있다. 그러한 포장재를 제조하기 위한 적합한 재료로는 유리, 플라스틱 (예로서, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트), 병, 바이알, 종이, 또는 사쉐 (sachet)가 포함된다. 본 발명의 키트는 그 안에 포함된 성분들, 특히 본 발명의 지혈 패치를 구성하는 것들의 이용에 대한 지시사항을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 지시사항은 인쇄물 형태 또는 개인이 읽을 수 있도록 지시사항을 저장할 수 있는 전자 보조물 형태로 있을 수 있으며, 예컨대 전자 저장 매체 (예로서, 자석 디스크, 테이프), 또는 광학 매체 (예로서, CD-ROM, DVD)가 있다. 매체는 추가적으로 또는 대안적으로 상기 지시사항을 제공하는 인터넷 웹사이트를 포함할 수 있다.
일반 절차
1. T 세포 면역원 설계
본 발명의 HIV OLPs의 설계를 위해 하기 방법을 따랐다.
컨센서스 클래드 B 펩타이드 세트를 이용하여 232 HIV 감염된 치료되지 않은 개인의 실험 (인터페론 감마 ELISpot) 스크리닝은, 뛰어난 HIV 제어를 갖는 대상에 의하여 두드러지게 타겟된 바이러스 프로테옴 (proteome)의 영역을 밝혔다. 문헌 [Frahm N, 등, J. Virol. 2004; 78:2187~2200; Mothe B, 등, J. Transl. Med. 2011; 9(1):208] 참조. 전체 시험 펩타이드 세트는 전체 바이러스 프로테옴에 걸쳐 있는 410개의 18량체 중복 펩타이드로 이루어졌다. 이들 중, 26 OLP가 확인되었으며, 여기에서 OLP 반응자의 그룹은, OLP 비-반응자 (즉, 인터페론 감마 분석에서 이들 OLPs ELISpot에 반응하지 않은 개인들)의 그룹에 비하여, 유의하게 (p<0.05, 다중 비교에 대해 보정되지 않음) 감소된 바이러스 부하를 가졌다. 이들 유리한 OLPs는 보호비 (protective ratio) (1 초과 (>1)의 PR)를 가졌으며, 바이러스 중 HIV Gag 단백질 (n= 10), Pol (n=12), 및 Vif (n=3)과 Nef (n=1) 단백질에 위치하였다. 26개 OLP 중, 15개는 부분적으로 중복되었다. 표 1 참조.
Figure pct00001
Figure pct00002
* 굵은 글씨체의 PR 값은 PR > 1, 즉 감소된 바이러스 부하를 갖는 개인에서 더욱 빈번하게 나타난 OLP-반응임을 나타낸다.
연속 면역원 서열을 구축하기 위하여, 26 개의 OLP를 배열하고, 11~78 개 길이의 아미노산 범위의, 총 16 절편으로 조립하였다. 이들 절편들의 정확한 시작 및 종료 위치는 확인된 26 개의 OLP 중 업스트림 및 다운스트림에서의 잔기 분석에 기초하였으며, 상이한 측면근접 (flanking) 자리에 적용된 많은 고려사항들에 기초하였다. 이들 고려사항들은 다음을 포함하였다:
1) OLP 면역원성 데이터
2) 보존 영역 반응성 데이터
3) 양호하거나 또는 좋지 않은 알려진 에피토프들의 삽입/배제를 위한 연장 또는 세절 절편
4) CD4 에피토프 커버리지 (coverage)
5) HLA 커버리지
6) 서열 가변성 (2010 컨센서스 및 HBX2 정의된 에피토프)
7) 다변량 OLP 분석
8) 신규 에피토프/자가 에피토프의 창출
9) 유익한 OLP에는 포함하지 않지만, 천연 서열의 유지
10) 에피토프 인식을 회피하기 위한 변화의 유도, 및
11) 금지된 잔기 (G,P,E,D,Q,N,T,S 또는 C) 회피
이 프로토콜 결과 잠재적인 면역원으로서 서열번호 1 내지 서열번호 16의 설계를 하였다.
2. 벡터
서열번호 1 내지 서열번호 16의 서열들을, 최적 가공을 보장하고, 미성숙 에피토프 분해를 회피하기 위하여 절편들 사이에서 단일, 이중 또는 삼중 알라닌 아미노산과 연결하였다.
그 후, 연결된 절편들을 DNA 및 MVA 벡터 내 삽입을 위하여 HIV T 세포 면역원으로서 사용하였다. 가용성 펩타이드를 단독으로 이용하거나 또는 열 충격 단백질과 조합하여 이용하는 면역원의 전달을 위하여, 3중 AAA 연결기는 포함시키지 않고, 16 개 절편에 걸친 보다 짧은 중복 펩타이드 (중앙값 길이 23 잔기)를 설계하였다. 이들 OLP는 C-말단의 말단에서 금지된 잔기를 피하는 것을 돕는 방식으로 생성되었다 (HLA 클래스 I 분자 상에서의 최적 에피토프 제시에 중요함. 서열번호 17 내지 서열번호 45, http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/PEPTGEN/peptgen.html, 2012년 1월 참조). 이들 중복 펩타이드는 11~27 개 길이의 아미노산 범위이다.
3. T 세포 면역원
T 세포 면역원은 폴리펩타이드로서 설계되었으며, 3중 알라닌 연결기에 의하여 통합된 다양한 크기 (11 내지 78 개의 아미노산)의 HIV-1 지놈 16 개 절편으로부터 조립되었다. 영역의 설명은 다음을 포함하였다:
Figure pct00003
총 길이: 529 (A, AA 또는 AAA 연결기 포함)
4. 리더 서열의 혼입
신호 펩타이드는, 그들의 기능하는 세포 위치에 도달하기 위해서 막을 통과하여야만 하는, 단백질 중 일반적으로 고도로 소수성인 아미노산 서열들이다 (15 내지 60 개 아미노산 길이). 신호 인식 입자들에 결합함으로써, 이들 서열은 발생기 (nascent) 단백질-리보솜 복합체를 막으로 향하도록 하며, 번역동안 단백질이 상기 막에 삽입된다. 신호 펩타이드는 각종 막 (예로서, 소포체, 마이토콘드리아, 엽록소, 페록시좀)에 의하여 단백질의 번역 흡수를 지시한다. 비-막단백질 상에서의 신호 서열은 궁극적으로 특정 펩티다아제에 의하여 제거된다.
사용된 일부 신호 펩타이드는, 항원 제시 세포의 분비 및 유인을 촉진하기 위한, MCP-3 케모카인; 증가된 프로테아좀성 분해를 위한 카테닌 (CATE)-유도된 펩타이드; 및 MHC II 구획을 타겟하기 위한 라이소좀성 연관 단백질, LAMP1를 포함한다. Rosati M, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106:15831~15836 참조.
본 발명의 설계에서, 발현 세포들로부터 면역원의 분비를 증진시키기 위하여, GMCSF (과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자)로부터의 신호 펩타이드를 면역원의 아미노-말단에 도입시키고, 이후 안정성을 증가시키기 위하여 발린을 도입시켰다. GMCSF 신호 펩타이드의 서열은 다음과 같았다:
MWLQSLLLLGTVACSIS (서열번호 46).
5. 시험관 내 발현 실험을 위한 태그의 혼입
형질감염된 세포 내 발현을 평가하기 위한 목적으로, 종결 코돈 전에, C-말단 영역 상에서 FLAG 펩타이드에 포함된 면역원 서열은 다음과 같았다:
DYKDDDDKL (서열번호 48).
FLAG 시스템은, 관심 대상의 재조합 단백질과 융합되는, 짧고, 친수성인 8개-아미노산 펩타이드를 이용한다. FLAG 펩타이드는 몇몇 매우 특이적인 ANTI-FLAG 모노클로날 항체 (M1, M2, M5; Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US)에 대한 결합 자리를 포함하며, 이는 형질감염된 세포로부터의 재료 상에서 관심 대상의 단백질의 발현을 평가하는데 사용될 수 있다.
FLAG 펩타이드 태그의 작은 크기로 인하여, 이는 다른 에피토프, 도메인을 차단하지 않거나, 또는 융합 단백질의 기능, 분비, 또는 이동을 변경시키지 않는다. 이 서열은 마우스 면역원성 분석을 위하여 이후 제거되었다. FLAG 태그는 면역화 전에 최종 면역원 (298H)으로부터 제거되었다.
6. T 세포 면역원의 설명
T 세포 면역원은 하기 서열을 갖는다 (서열번호 49):
Figure pct00004
상기에서,
GMCSF 신호 펩타이드는 밑줄을 그어 나타내었으며, 신호 서열 직후의 발린은 하이라이트 표시하였으며, 이중 또는 삼중 A (AAA) 연결기는 굵은 글씨로 나타내었으며, FLAG 에피토프 (생체 내 연구를 위한 최종 구축물 내에 제거됨)는 이탤릭체로 나타내었고, 상이한 절편들은 괄호 안에 나타내었으며, 하기와 같다:
Figure pct00005
7. 뉴클레오타이드 서열 코돈 최적화
T 세포 면역원 서열을, 발현 및 분비를 증진시키기 위하여, RNA/코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열로 번역시켰다 (Mr. Gene GmbH, Regensburg, DE). 코돈 최적화는, 암호화된 단백질에 영향 없이, mRNA 내에서 이전에 확인된 RNA 가공, 저해 및 불안정성 서열을 파괴하기 위하여 다중 뉴클레오타이드 변화를 도입시키는 것에 기초하였다. Schwartz S, 등, J. Virol. 1992; 66(12): 7176~7182 참조. 이러한 가공은 스플라이싱 가능성을 최소화하기 위하여, 적절한 코돈 변화에 의해 코딩 서열로부터 예측된 스플라이스 자리 (점수 > 0.4)의 제거를 포함할 수도 있다.
상기 나타낸 뉴클레오타이드 변화의 결과로서, T 세포 면역원의 최종 GC-함량은 63% 였다. 면역원의 완전한 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은 (서열번호 50)이다:
Figure pct00006
Figure pct00007
상기에서, 서열 암호화 GMCSF 신호 펩타이드는 밑줄을 그어 나타내었으며, 신호 서열을 암호화하는 서열의 다운스트림 직후의 발린은 하이라이트 표시하였으며, 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 표준 문자로 나타내었고, Flag 태그를 암호화하는 서열은 이탤릭체로 나타내었으며, tga 및 taa 종결 코돈은 소문자로 나타내었다
8. 클로닝 전략
코돈-최적화된 T 세포 면역원을, 인간 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 자리 및 Xho 자리는 결여한 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 박테리아 내 성장에 대해 최적화된 변형 CMV 기본 플라스미드 기본 골격으로 이루어지는, 포유동물 발현 플라스미드 BV5 내로 클로닝시켰다. 클로닝 단계는 하기와 같았다:
1) 제 1 단계에서, Leu에서 Meth로의 아미노산 변경이 합성된 T 세포 면역원 내로 도입되었다 - 주요 항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리 중 하나를 커버하기 위하여 하나는 RT 41 위치 (절편 9)에서 FLG 에피토프를 포함함. T 세포 면역원 유전자 (출발 벡터)를 스펙토마이신 내성 포함 플라스미드 내로 클로닝시켰다. RT M41 변화를 커버하는 PCR-생성된 절편을 SpeI/HindIII으로서 T 세포 면역원 내로 삽입하였다. 적격 세포 (competent cell) DH108B를 형질전환에 사용하였으며, LB-스펙토마이신 매질 상에서 배양하였다. 결과의 플라스미드를 HIVACAT RT M41로 명명하였다. 점 돌연변이의 삽입은 절편 9 개 서열을 커버하는 센스와 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 서열에 의해 확인되었다.
2) 제 2 단계에서, HIVACAT RT M41 유전자를 카나마이신 내성 유전자 내 Xho 자리를 결여한 BV5 플라스미드 내로, 벡터 및 겔 정제된 분해된 HIVACAT RT M41 단편의 결찰에 의하여, SalI/EcoRI로서 삽입하였다. 적격 세포 DH108B를 형질전환에 사용하였으며, LB-Kan 매질 상에서 배양하였다. 결과의 플라스미드의 이름은 297H (GMCSF-HIVACAT-FLAG)로 명명하였다. 유전자의 삽입은 제한 분해 및 센스 (CMV 프로모터) 및 안티센스 프라이머 (폴리A BGH 영역으로부터)를 이용하여 PCR 서열에 의하여 확인되었다.
3) 제 3 단계에서, FLAG 태그에 대한 에피토프는 BstEII-EcoRI 분해에 의하여 297H 플라스미드로부터 어닐링된 프라이머 298H Plus 및 298H Minus에 의하여 제거되었다:
298HPlus
GTCACCGGGCGGCTGCATGGCTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGAGGTGGGCTTCtgataaG (서열번호 51)
298H Minus
aattCttatcaGAAGCCCACCTCCTCCTCCTCCTGAGCCTCCAGCCATGCAGCCGCCCG (서열번호 52)
결과의 플라스미드는 298H GMCSF-HIVACAT로 명명하였으며, 접수번호는 DSM 25555)이었다. 도 1 참조. 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 서열에 의해 FLAG 태그의 제거를 확인하였다 (polyA BGH 영역으로부터).
실시예 1
시험관 내 발현 연구
몇몇 임시 형질감염을 수행하여, HIVACAT T 세포 면역원의 발현, 국소화 및 안정성을 평가하였다.
간략하게는, 완전한 DMEM + 10% 소태아혈청 (FBS) 중 1×106 인간 293 세포를 60mm 조직 배양 접시 상에 도말하고, 하룻밤 동안 부착되도록 두었다. HEK 293 세포를 총 7㎍의 DNA (Bluescript DNA와 함께, 100ng 또는 250ng의 297H GMCSF-HIVACAT-FLAG 플라스미드 DNA, 50ng의 GFP 발현 플라스미드 pFRED143를 7㎍까지 올림)와 함께 CaPhosphate DNA 공침전에 의하여 형질감염시켰다.
형질감염한지 6 시간 후, 매질을 2%의 FCS로 보충된 3ml의 DMEM으로 대체하였다. 24 시간 및 48 시간 후, 세포 및 상등액을 0.5X RIPA 내에 채집하였다.
단백질 발현을 웨스턴 면역블롯에 의해 분석하였다. 전체 세포 추출물 및 상등액의 1/250을 부하하였다. 단백질을 10% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동에 의해 분해하고 (Nu-Page Bis-Tris, NuPAGE, Invitrogen, Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, US) 나이트로셀룰로오스 막 상으로 이동시켰다.
단백질을 10% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 상 전기영동에 의해 분해하고, 나이트로셀룰로오스 막 상으로 이동시켰다.
1:3.000 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제-공액된 항-FLAG 모노클로날 항체 (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US)를 이용하여 막을 탐침하여, 297H 플라스미드가 검출되었다.
ECL을 이용하여 밴드들을 가시화하였다. 막을 ChemiDoc XRS + 상에서 이미지화하였다.
양성 대조구를 사용하였으며, FLAG 태그도 품은, 클래드 B p55 Gag를 인코딩하는 플라스미드 DNA가 포함되었다.
298H 플라스미드 (FLAG-태그 없이 HIVACAT T 세포 면역원을 인코딩)를 이용한 임시 형질감염으로부터의 세포 추출물을, 1:3.000 희석된 HIV-1 감염된 대상으로부터 인간 혈청에 이어 1:10.000 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제-공액된 인간 항-IgG를 이용하여 탐침하였다.
297H 및 298H 플라스미드는 안정하게 (24h 및 48h에서 동일하게 평가된 양) HIVACAT T 세포 면역원 구축물을 발현하였으며, 이는 세포 추출물 구획에서 가시화되었다. 구축물의 분비 증거는 없었다.
실시예 2
마우스들 내 세포 반응
1ml (2mg/ml)의 298H GMCSF-HIVACAT DNA의 스톡을 마우스들 내에서 생체 내 연구를 위해 엔도프리 (endofree) 제조하였다.
HIVACAT T 세포 면역원의 면역원성을 6~8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스 (Charles River Labs, Inc., Frederick, MD, US)에서 평가하였다.
왼쪽 및 오른쪽의 대퇴사두근에 Inovio 시스템 (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA, US)을 이용하여, 0주 및 4주에 20㎍ 및 5㎍의 DNA를 엘렉트로포레이션에 의해 근육내 전달하였다 (투약량 당 20㎍/50㎕, 자리 당 25㎕). 마우스들을 최종 면역화한지 2주 후에 희생시켰다. 면역원성 연구를 위하여 마우스 지라세포 및 혈청을 수확하였다. 사용된 대조구 DNA는 하기와 같았다:
1) 114H p55 gag 클래드 B: 전체 gag 단백질을 발현;
2) 132H NTV: nef, tat 및 vif의 키메라성 단백질을 발현;
3) 133H pol: 전체 pol 단백질을 발현; 및
4) BV4 CMV-kan-Basic: SHAM 대조구, 임의의 발현된 이식유전자 없이 유사한 DNA 플라스미드 골격.
35 마리의 마우스들을 실험에 사용하였으며, 한 그룹 당 5 마리로 구성하였다. 그룹 당 면역화 분포는 하기와 같았다:
Figure pct00008
세포성 면역 반응은 제 1 단계 상에서 풀화된 지라세포 (그룹에 속한 5 마리 마우스들로부터의 세포) 내에 세포 내 시토카인 염색 (ICS)을 이용하고, 모든 gag, pol, nef, tat 및 vif 단백질을 커버하는 중복 펩타이드의 풀을 이용하여 특징되었다.
간략하게는, 마우스들의 각 그룹으로부터 풀화된 독립된 마우스 지라세포를 1ml의 공배양물 내에서 2×106 세포/ml의 밀도로, 하룻밤 동안, 펩타이드 풀 존재하에 (15-머, 클래드 B gag, 컨센서스 B pol 및 NL43 nef, tat 및 vif 서열을 커버하는 11aa에 의해 중복, 1 ㎍/ml 각 펩타이드, 총 약 12 시간, 시토카인 분비를 방지하기 위한 골지 (Golgi) 정지 없이 1 시간) 인큐베이션하였다. 표면 면역염색을 CD3- 알로파이코시아닌-Cy7, CD4-PerCP, CD8-퍼시픽 블루 (CD8-Pacific Blue) (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, US)를 이용하여 수행하였다. 침투성화 (permeabilization) 후, 세포내 시토카인 염색을 인터페론 감마-FITC 항체 (BD Biosciences, Inc., Franklin Lakes, NJ, US) 를 이용하여 수행하였다.
첫번째 면역원성 분석으로부터, C57BL/6마리 마우스 중에서 20㎍ 및 5㎍의 DNA가 전체 gag, pol 및 nef-tat-vif 펩타이드 풀에 대하여 검출가능한 인터페론 감마 -+ 반응을 생성하였다. 도 2a 참조. CD4+ 및 CD8+ 반응의 분포를 나타내었다. 도 2b 참조.
개별적인 마우스 수준에서, 인터페론 감마 ELISpot 분석에서 면역원에 포함된 단백질 서브유닛을 커버하기 위하여 펩타이드의 8 개 풀로 자극된 동결 지라세포를 이용하여, 반응은 데컨벌루션되었다(deconvoluted).
제조자 설명에 경미한 변경을 하여 그를 따라 마우스 인터페론 감마 ELISpot 키트 (ALP) (Mabtech AB, Stockholm, SE)로 ELISpot 분석을 수행하였다. 모든 분석에서, 마우스 지라세포를 96-웰 폴리비닐리덴 플레이트 (Millipore Corp., Bedford, MA, US) 내에, 10% 소 태아 혈청을 갖는 140㎕의 로즈웰 파크 기념 연구소 배지 (Rosewell Park Memorial Institute medium) 1640 중에 4×105 세포/웰의 투입 세포 수로, 단독으로 또는 HIV-1-특이적 펩타이드 풀 (각 펩타이드에 대해 14㎍/ml 최종 농도)과 함께 5% CO2 중 37℃에서 16 시간 동안 첨가하였다. 각각 2001 컨센서스-B 서열 상에 기초한 18 개 아미노산의 2 내지 12 개의 펩타이드를 포함하는, 펩타이드의 8개 풀은, HIVACAT T 세포 면역원 내에 포함된 절편에 걸친 상이한 단백질 서브유닛들 (gag-p17, gag-p24, gag-p2p7p1p6, pol-RT, pol-프로테아제, pol-인테그라아제, vif 및 nef)로 풀화되었다. http://hiv-web.lanl.gov/content/hiv-db/CONSENSUS/M_GROUP/Consensus.html, 2012년 1월, 참조. 전체 gag, pol, nef, tat 및 vif 단백질을 발현하는 DNA로 면역화된 마우스들에서 사용된 HIV 펩타이드 풀은 18머 펩타이드로 이루어졌으며, 이는 완전한 gag (6 풀, 각 하나 당 11 펩타이드), pol (8 풀, 각 하나 당 16 또는 17), nef (2 풀, 각 하나 당 13 또는 14 펩타이드), tat (1 풀, 12 펩타이드) 및 vif (2 풀, 각 하나 당 12 펩타이드) 단백질에 걸친 11개 잔기의 중복을 가졌다.
5 mg/ml의 콘카발린 A (Concavalin A) (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US)가 양성 대조구로서 사용되었다. 플레이트를 1 단계 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨 (BCIP/NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, US)을 이용하여 전개시켰다. 플레이트 상의 스팟들을, ImmunoSpot 소프트웨어를 이용하여 자동화된 ELISPOT 판독기 시스템 (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, US)을 이용하여 계수하고, 반응의 규모는 투입 지라세포 백만개 당 스팟 형성 세포 (SFC)로서 나타내었다. 양성 반응의 역치는 웰 당 5 개 이상의 스팟 및 "음성 대조구 웰 내 스팟의 평균 수 + 음성 대조구 웰의 3 표준편차"와 "음성 대조구 웰의 평균의 3배" 중 더 높은 것을 초과하는 반응으로서 정의되었다.
1) 전체 gag, pol, nef, tat 및 vif 단백질을 암호화하는 플라스미드를 이용하여 면역화된 마우스들에서 발생된 인터페론 감마 반응들의 우세함은 HIVACAT T 세포 면역원으로 커버된 절편 외부의 영역 쪽이었으며 (HIVACAT 면역원 영역을 타겟팅하는 반응/총 gag+pol+nef+tat+vif의 중앙값 비는 0.26 (0.17~0.42 범위)였다), 높은 투약량 (20 ㎍) 또는 낮은 투약량 (5 ㎍)의 DNA로 면역화된 그룹들 간에서 상이하지 않았다. 도 3 참조.
2) HIVACAT T 세포 면역원 서열 내에 포함된 단백질 서브유닛들에 대한 반응들의 중앙값 폭은, 20㎍의 HIVACAT로 면역화된 마우스들에서 4 (2~5의 범위)인 한편, 전체 단백질 (ns)를 암호화하는 플라스미드 20㎍로 면역화된 마우스들에서 2 (1~3의 범위)였으며, 반응의 규모에서 유의차는 없었다. 8개 아미노산 서브유닛들 중 6 개는 HIVACAT T 세포 면역원으로 면역화된 마우스 내에서 1회 이상 타겟되었다. 도 4 참조.
Figure pct00009
4) gag, pol, nef, tat 및 vif의 전체 단백질을 암호화하는 플라스미드로 면역화된 마우스들에서 반응의 우세함은 주로 gag 방향으로 89% 몰렸으며, 한편 높은 투약량의 HIVACAT T 세포 면역원으로 면역화된 마우스들에서는 면역원 내 포함된 모든 단백질 성분들 (gag, pol, vif 및 nef)에 대해 더욱 균형잡혔다. 도 5 참조.
실시예 3
마우스들에서 체액성 면역반응
체액성 면역반응을 먼저 풀화된 마우스 혈청에서 분석하였다. p24, p37 및 p55에 대한 결합 항체들이, 12% SDS-Page 상에서 분리된 1mg의 gag 발현 벡터를 이용하여 형질감염된 HEK 293세포들로부터의 세포 추출물을 이용하고, 마우스로부터의 풀화된 혈청들을 (1:100 희석) 이용하여 막을 탐침함으로써 웨스턴 면역블롯에 의하여 검출되었다. gag p24에 대한 항체 역가를 ELISA에 의해 측정하였다. 풀화된 혈청 샘플들의 일련의 4배 희석물들을 평가하고, 450nm에서의 흡광도를 결정하였다 (Advanced BioScience Lab, Inc., Kensington, MD, US). 결합 역가는, SHAM DNA로 면역화된 마우스들로부터의 대조구 혈청을 이용하여 수득된 평균 + 3 표준편차보다 더 높은 값을 갖는 양의 최고 희석 점수로서 보고하였다.
a) 첫번째 체액성 면역원성 분석으로부터, HIVACAT T 세포 면역원은 20㎍로 면역화된 마우스들의 그룹 내에서 웨스턴 블롯에 의하여 검출가능한 p55, p37 및 p24에 대한 결합 항체 반응을 유도하였다. 도 6 참조.
b) p24에 대한 결합 항체를 ELISA에 의해 정량하였다. 설명된 플라스미드를 수령한 마우스들로부터의 gag-p24 특이적 결합 항체의 종말점 역가를, 개별적인 일련의 4-배 희석된 풀화된 혈청 샘플로부터 ELISA에 의해 결정하였다. 고투약량 그룹의 마우스들은, 전체 gag 구축물로 면역화된 마우스들에서 검출된 역가보다 낮은 1:4,000의 역가로 HIVACAT T 세포 면역원으로 면역화되었다. p24에 대한 결합 항체는 저투약량 그룹에서 측정가능하지 않았다. 도 7a 참조. 개별적인 마우스 수준에서, HIV-1IIIB pr55 gag 재조합 단백질 (카탈로그 번호 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, US)을 이용하여 인하우스 개발된 gag p55 ELISA를, 마우스 혈청을 1:100으로 희석하여 사용하였다. 항체의 낮은 수준이 고투약량 면역원으로 면역화된 3 마리 마우스들 중 2 마리에서 검출되었다. 도 7b 참조.
실시예 4
쥐들에서 이형 프라임/부스트 생체 내 면역원성
재료 및 방법
pDNA-HIVACAT 및 MVA-HIVACAT 백신의 제조
코돈-최적화된 T 세포 면역원을, 인간 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 자리 및 Xho 자리는 결여한 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 박테리아 내 성장에 대해 최적화된 변형 CMV 기본 플라스미드 기본 골격으로 이루어지는, 포유동물 발현 플라스미드 BV5 내로 클로닝시켰다. 마우스 면역화를 위한 플라스미드 DNA를, Endo-Free Megaprep (Qiagen)을 이용하여 제조하고, 사용할때까지 -80℃에서 저장하였다.
HIVACAT 유전자를 발현하는 재조합 MVA를 상기 설명한 바와 같이 제조하였다 {Letourneau, 2007 #235; Nkolola, 2004 #321}. 간략하게는, 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 및 글루타민으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM 10)에서 성장시킨 닭 배아 섬유아세포 (CEF)를 MOI 1에서 부모 MVA로 감염시키고, β-갈락토시다아제 유전자를 마커로서 포함하는 pDNA-HIVACAT 3ug으로, Superfectin (Quiagen)을 이용하여 형질감염시켰다. 이틀 후, 전체 바이러스를 수확하고, CEF 세포들을 재감염시키는데 사용하였다. MVA를 5회의 플라크 정제에 투입하고, 그 후 마스터 바이러스 스톡을 배양하고, 36% 수크로오스 쿠션 상에서 정제하고, 역가측정하고 사용할때까지 -80℃에서 저장하였다.
C57BL/6 마우스들 에서 생체 내 면역원성.
마우스들에서 비상동 프라임/부스트 생체 내 면역원성 실험을 위해, 6-주령 내지 8-주령의 암컷 C57BL/6 (Harlan Laboratories Ltd., Barcelona, Spain)의 그룹들을 사용하였다. 마우스들을 100㎍의 pDNA-HIVACAT (2 또는 3 회 백신접종)에 이어서 106 pfu의 MVA-HIVACAT 부스트 (그룹: 각각 2×DNA 3×DNA, 2×DNA +1MVA 및 3×DNA + 1MVA)로 근육내 프라임화하였다. 모든 백신접종은 3주 간격으로 분리되었다.
모든 마우스들을 각 실험에서의 최종 백신접종한지 2주 후 희생시켰다. 면역원성 연구를 위해 마우스 지라세포 및 혈청을 수확하였다. 지라를 제거하고, 5-ml 주사기 고무 플런저 (plunger)를 이용하여 세포 거름망 (Falcon)을 통하여 개별적으로 가압하였다. 적혈구 용해 (rbc lysis) 후, 지라세포를 세척하고, 10% FCS, 페니실린/스트렙토마이신 (R10)으로 보충된 RPMI 1640 내에 재현탁시키고, 사용할때까지 동결시켰다.
모든 동물 실험절차 및 관리는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았다.
중복 펩타이드 및 펩타이드 풀의 분포
비상동성 체제의 면역원성의 평가하기 위하여, HIVACAT T-세포 면역원만을 발현하는 pDNA 또는 MVA, 그리고 잠재적인 접합부 에피토프의 면역원성을 배제하기 위하여 전체 HIVACAT T-세포 면역원 (리더 서열 및 링커 영역 포함)에 걸친, 길이 15 개의 아미노산의 147개 펩타이드의 중폭 펩타이드 세트 (11 개 잔기 중복)를 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)- 화학을 이용하여 새롭게 합성하였다. 펩타이드를, 면역원의 단백질 서브유닛 및 절편에 따라 (신호 펩타이드 서열에 대해 1 개의 풀, n=4 펩타이드; Gag에 대해 7 개의 풀, n=8~11 펩타이드/개; Pol에 대해 7 개의 풀, n=5~11 펩타이드/개; Vif에 대해 2 개의 풀, n=6~8 펩타이드/개 및 Nef에 대해 1 개의 풀, n=2 개의 펩타이드), 18 개의 상이한 풀로 분포시켰다. 면역원의 단백질 서브유닛 및 절편에 따라, 펩타이드는 18 개의 상이한 풀 내에 분포시켰다. 결과는 8개 단백질 서브유닛에 특이적인 IFNγ 반응에 의해 그룹화하여 나타내었다 (Gag p17, Gag p24, Gag p2p7p1p6, Pol-프로테아제, Pol-RT, Pol-인테그라아제, Vif 및 Nef).
쥣과 INFγ ELISPOT 분석
제조자 설명에 경미한 변경을 하여 그를 따라, ELISpot 분석은 마우스 IFNγ ELISpot 키트 (ALP) (Mabtech AB, Stockholm, SE)를 이용하여 수행하였다. 모든 분석에서, 동결 마우스 지라세포를 먼저 해동시키고, 사용 전 R10 내 37℃에서 5시간 휴지시켰다. 세포를 96-웰 폴리비닐리덴 플레이트 (Millipore Corp., Bedford, MA, US) 중 140㎕의 R10에서 투입 세포 수 4×105 세포/웰로, 단독으로 또는 HIV-1- 특이적 펩타이드 풀 (각 펩타이드에 대해 14㎍/ml 최종 농도)과 함께 5% CO2 중 37℃에서 16시간 동안 첨가하였다. 5 mg/ml의 콘카발린 A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO, US)를 대조구로 사용하였다. 플레이트를 한 단계의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨 (BCIP/NBT, Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA, US)으로 전개시켰다. 플레이트 상의 스팟들을, ImmunoSpot 소프트웨어를 이용하여 자동화된 ELISPOT 판독기 시스템 (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH, US)을 이용하여 계수하고, 반응의 규모는 투입 지라세포 백만개 당 스팟 형성 세포 (SFC)로서 나타내었다. 양성 반응의 역치는 웰 당 5 개 이상의 스팟 및 "음성 대조구 웰 내 스팟의 평균 수 + 음성 대조구 웰의 3 표준편차"와 "음성 대조구 웰의 평균의 3배" 중 더 높은 것을 초과하는 반응으로서 정의되었다.
결과
이들 실험에서, 어떤 마우스들도 전체 단백질을 암호화하는 플라스미드를 이용하여 면역화되지 않았으므로, 정확한 면역원 서열에 맞는 중복 펩타이드의 제 2 세트를 합성하고, 면역원성 비교를 위해 이용하였다. 100㎍의 pDNA-HIVACAT를 이용한 3 개의 근육내 (i.m.) 면역화는, 엘렉트로포레이션 Inovio 시스템을 이용한 면역화에 의해 유도된 반응된 IFNγ의 빈도에 필적된 모든 마우스들에서의 IFNγ 반응을 유도할 수 있었다. 그러나, 2 개의 pDNA i.m. 백신접종은 3 개의 pDNA i.m. 면역화 후 반응을 유도하는 동물 100%에 비하여 단지 3 마리 동물 (60%)에서만 면역원성인 것으로 발견되었다. 흥미롭게도, MVA-HIVACAT 백신은 분석된 2 개 그룹에서 폭과 크기 모두에서 반응을 부스트할 수 있었으나 (도 8B), 마우스들이 pDNA-HIVACAT의 3회 투약량으로 미리 프라임화된 경우 반응의 규모는 현저히 증가하였다 (도 8B 및 도 8C). 이전의 EP 실험에서 알 수 있는 바와 같이, 면역원 내 포함된 모든 단백질-서브유닛의 대부분에 균형되고 넓은 반응이, 그들 중 명확한 양상의 우세함 없이, 모든 동물들에서 관찰되었다. nef 또는 gag-p15 특이적 반응은 연구된 마우스들에서 검출되지 않았다 (도 8D).
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본 발명은 명료함 및 이해의 목적을 위하여 상세하게 기재되었으나, 당업자는 본 개시내용을 읽음으로부터, 본 발명의 진정한 범주 및 첨부된 특허청구범위로부터 벗어나지 않고 그 형태 및 상세 내용에서의 다양한 변화가 만들어질 수 있음을 이해할 것이다.
상기 본 명세서에서 언급된 모든 간행물들은 그 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Laboratorios del Dr. Esteve, S.A. 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ccacggggtg 1200 tactacgacc cctctaagga cctgatcgcg gagatccaga agcaggggca gggtcagtgg 1260 acctaccaga tctacgcagc agcaaccaag gagctgcaga agcagatcac gaagatccag 1320 aacttccgcg tatactaccg cgactcgcgg gaccccctgt ggaagggccc tgcgaagctt 1380 ctctgggcag ccgcgaagat catccgggac tacggcaagc agatggcggg cgacgactgc 1440 gtggccgcag cggtgaagca ccatatgtac atctcgaaga aggcgaaggg ctggttctac 1500 agacaccact acgagtccac ccaccccagg gcagctgcgg tgacgaagct gacggaggac 1560 cggtggaaca agccccagaa gacgaagggt caccgggcgg ctgcatggct ggaggctcag 1620 gaggaggagg aggtgggctt cgattacaag gacgatgacg acaagctgtg ataa 1674 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 198HPlus primer <400> 51 gtcaccgggc ggctgcatgg ctggaggctc aggaggagga ggaggtgggc ttctgataag 60 <210> 52 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 298HMinus primer <400> 52 aattcttatc agaagcccac ctcctcctcc tcctgagcct ccagccatgc agccgcccg 59 <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 53 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 1 5 10 15 His Ile <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 54 Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu 1 5 10 15 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 55 Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys 1 5 10 15 Arg <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 56 Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu 1 5 10 15 Tyr <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 57 Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile 1 5 10 15 Glu Val <210> 58 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 58 Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly 1 5 10 15 Ala <210> 59 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 59 Ile Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala 1 5 10 15 <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 60 Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile 1 5 10 15 Pro Val <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 61 Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala 1 5 10 15 Glu Ala <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 62 Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln 1 5 10 15 Ser Arg <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 63 Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro 1 5 10 15 Gln Val <210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 64 Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr 1 5 10 15 Tyr Lys <210> 65 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 65 Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp 1 5 10 15 Cys Phe <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 66 Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Phe Lys Leu Val Pro Val 1 5 10 15 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 67 Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Lys Glu Val Leu Val Trp Lys 1 5 10 15 Phe <210> 68 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 68 Lys Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp 1 5 10 15 Gln Ile <210> 69 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 69 Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly 1 5 10 15 His Lys <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 70 Gln Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu 1 5 10 15 Val <210> 71 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 71 Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Leu Leu Thr 1 5 10 15 Gln Ile <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 72 Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Ser Lys 1 5 10 15 Ile <210> 73 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 73 Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Lys Asp Phe 1 5 10 15 Arg Lys <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 74 Leu Arg Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro 1 5 10 15 Pro Phe <210> 75 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 75 Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu 1 5 10 15 Leu His <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 76 Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 77 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 77 Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Pro Ile Val 1 5 10 15 Gly Ala <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 78 Ile His Leu Ala Leu Gln Asp Ser Gly Leu Glu Val Asn Ile Val 1 5 10 15 <210> 79 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 79 Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala His Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu 1 5 10 15 Gln Val <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 80 Ser Ala Gly Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala 1 5 10 15 <210> 81 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 81 Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val 1 5 10 15 Tyr Tyr <210> 82 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 82 Thr Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro 1 5 10 15 Leu Trp <210> 83 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 83 Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro Leu Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu 1 5 10 15 Leu Trp <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 84 Lys Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Asp Asp Cys Val 1 5 10 15 Ala <210> 85 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 85 Gly Pro Gln Arg Glu Pro Tyr Asn Glu Trp Thr Leu Glu Leu Leu Glu 1 5 10 15 Glu Leu <210> 86 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 86 Asp Leu Asn Asn Asn Thr Asn Thr Thr Ser Ser Ser Gly Glu Lys Met 1 5 10 15 Glu Lys <210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 87 Ile Arg Asp Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Leu Phe Tyr Lys Leu Asp 1 5 10 15 Val Val <210> 88 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 88 Tyr Arg Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro 1 5 10 15 Lys Val <210> 89 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 89 Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro 1 5 10 15 Ile His <210> 90 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 90 Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val 1 5 10 15 <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 91 Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg 1 5 10 15 Ala Val <210> 92 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 92 Val Ile Glu Val Val Gln Arg Ala Cys Arg Ala Ile Leu His Ile Pro 1 5 10 15 Arg Arg <210> 93 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 93 Val Lys His His Met Tyr Ile Ser Gly Lys Ala Lys Gly Trp Phe Tyr 1 5 10 15 Arg His <210> 94 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 94 Gly Lys Ala Lys Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Thr His 1 5 10 15 Pro Arg <210> 95 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OLP clade B consensus sequence <400> 95 Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys Pro Gln Lys Thr Lys Gly 1 5 10 15 His Arg <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tag sequence <400> 96 Ala His Gly His Arg Pro 1 5 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tag sequence <400> 97 Pro Ile His Asp His Asp His Pro His Leu Val Ile His Ser 1 5 10 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tag sequence <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 98 Gly Met Thr Cys Xaa Xaa Cys 1 5

Claims (27)

  1. 서열번호 1~16의 서열 또는 상기 서열번호 1~16의 변형을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드로서, 상기 각 변형은 8 개 이상의 아미노산 길이를 갖고, 단, 상기 아미노산 서열은 임의의 서열번호 1~16 또는 그의 변형에 따른 아미노산 서열 외의 8 개 이상의 길이의 HIV 지놈으로부터 유도된 임의의 서열 구간을 포함하지 않는 면역원성 폴리펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서, 2 이상의 서열이 아미노산 연결기에 의해 연결되고, 상기 연결기는 인접서열들 간의 접합 영역 내 AAA 서열 영역의 형성을 결과로서 일으키는 면역원성 폴리펩타이드.
  3. 제 1항 또는 제 2 항에 있어서, 서열번호 49를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드.
  4. 서열번호 1~16 또는 그의 변형으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩타이드로서, 상기 변형은 8개 이상의 아미노산 길이를 가지며, 단:
    i) 상기 아미노산 서열은, 임의의 서열번호 1~16 또는 그의 변형에 따른 아미노산 서열 외의 8 개 이상의 길이의 HIV 지놈으로부터 유도된 임의의 서열 구간을 포함하지 않고; 그리고
    ii) 면역원이 서열번호 1~16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 단지 하나의 서열만을 포함하는 경우, 이 서열은 서열번호 3, 5, 6 및 16으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것이 아닌, 면역원성 폴리펩타이드.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 면역원이 서열번호 1~16 또는 그의 변형으로 이루어지는 군으로부터 선택된 둘 이상의 서열을 포함하는 경우, 상기 서열들은 아미노산 연결기에 의해 연결되고, 상기 연결기는 인접서열들 간의 접합 영역 내 AAA 서열 영역의 형성을 결과로서 일으키는 면역원성 폴리펩타이드.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 하나 이상의 항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리를 포함하고, 그리고 바람직하게는, 상기 항레트로바이러스 내성 돌연변이 자리는 서열번호 9~11 중 임의의 것에 위치되는 것인 면역원.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단에서 단일 펩타이드를 더 포함하는 면역원.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 8 내지 40 개의 아미노산 길이를 갖고, 더욱 바람직하게는, 11 내지 27 개의 아미노산 길이를 갖는 면역원.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형의 상기 C-말단 아미노산은 G, P, E, D, Q, N, T, S도 아니고 C도 아닌 면역원.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 서열번호 17~45에 따른 펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역원.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형은 열 충격 단백질에 융합된 면역원.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원을 암호화하는 핵산.
  13. 제 12항에 있어서, 인간 세포 내 발현에 최적화된 코돈인 핵산.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 50에 따른 서열을 갖는 핵산.
  15. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산, 프로모터 서열, 3'-UTR 및 선택적으로 선발 마커를 포함하는 발현 카세트.
  16. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산 및 제 15항의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.
  17. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 바이러스.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 바이러스는 변형 백신 앙카라 바이러스인 바이러스.
  19. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산, 제 15항의 발현 카세트, 제 16항의 발현 벡터, 또는 제 17항 또는 제 18항의 바이러스를 포함하는 세포.
  20. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 폴리펩타이드 및 하나 이상의 보조제를 포함하는 백신.
  21. 의약에서의 용도를 위한, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원성 펩타이드, 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산, 제 15항의 발현 카세트, 제 16항의 발현 벡터, 제 17항 또는 제 18항의 바이러스, 제 19항의 세포 또는 제 20항에 따른 백신.
  22. HIV 감염 또는 HIV 감염 관련 질병의 예방 또는 치료에서의 용도를 위한, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원성 펩타이드, 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산, 제 15항의 발현 카세트, 제 16항의 발현 벡터, 제 17항 또는 제 18항의 바이러스, 제 19항의 세포 또는 제 20항에 따른 백신.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 용도는, 다음 i) 및 ii)의 순차 투여를 포함하는, 상기 용도를 위한 면역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신:
    i) 제 1의, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원성 펩타이드, 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산, 제 15항의 발현 카세트, 제 16항의 발현 벡터, 제 17항 또는 제 18항의 바이러스, 제 19항의 세포 또는 제 20항의 백신, 및
    ii) 제 2의, 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원성 펩타이드, 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 핵산, 제 15항의 발현 카세트, 제 16항의 발현 벡터, 제 17항 또는 제 18항의 바이러스, 제 19항의 세포 또는 제 20항의 백신.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 제 1의 면역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신은, 제 2의 역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신과 상이한, 상기 용도를 위한 면역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신.
  25. 제 24항에 있어서, 제 16항에 따른 발현 벡터가 투여되고, 이어서 제 18항에 따른 변형 백시니아 앙카라 바이러스가 투여되는 것인, 상기 용도를 위한 면역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신.
  26. 제 25항에 있어서, 제 16항에 따른 발현 벡터는 2회 이상 투여되는 것인, 상기 용도를 위한 면역원성 펩타이드, 핵산, 발현 카세트, 발현 벡터, 바이러스, 세포 또는 백신.
  27. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 면역원, 제 12항 내지 제 14항의 핵산, 제 15항의 발현 카세트, 제 16항의 발현 벡터, 제 17항 또는 제 18항의 바이러스, 제 19항의 세포 또는 제 20항의 백신을 포함하는 키트.
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