KR20150119086A - 튜부리신 화합물, 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

하기 화학식 I의 튜부리신 화합물은 암의 치료에, 특히 표적화 모이어티에 접합될 때, 사용될 수 있는 항유사분열제이다.
<화학식 I>
Figure pct00077

상기 식에서, R1, R2, R3a, R3b, R4, R5, W, 및 n은 본원에 정의된 바와 같다.

Description

튜부리신 화합물, 그의 제조 및 사용 방법 {TUBULYSIN COMPOUNDS, METHODS OF MAKING AND USE}
본 발명은 튜부리신과 구조적으로 유사한 화합물, 그의 리간드와의 접합체, 이러한 화합물 및 접합체의 제조 및 사용 방법, 및 이러한 화합물 및 접합체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
튜부리신은 본래 믹소박테리아 아르칸기움 게피라(Archangium gephyra) 또는 안지오코쿠스 디시포르미스(Angiococcus disciformis)의 배양물로부터 단리된 세포독소로, 상기 각각의 유기체는 상이한 튜부리신 혼합물을 생산한다 (Sasse et al. 2000; Reichenbach et al. 1998). 이들의 결정 구조 및 생합성 경로는 알려져 있으며 (Steinmetz et al. 2004), 이들의 생합성 유전자의 서열도 결정되었다 (Hoefle et al. 2006b). 튜부리신의 생합성 전구체인 프리튜부리신이 또한 일부 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다 (Ullrich et al. 2009). (첫번째 저자 또는 발명자 및 연도에 의해 본원에 인용되는 문헌의 완전한 인용문은 본 명세서의 말미에 열거됨).
튜부리신은 포몹신, 돌라스타틴 및 크립토피신을 포함하는, 자연 발생 항유사분열 폴리펩티드 및 뎁시펩티드 군에 속한다 (Hamel 2002). 폴리펩티드 또는 뎁시펩티드 이외의 항유사분열제가 또한 존재하며, 예를 들어 파클리탁셀, 메이탄신 및 에포틸론이 있다. 유사분열 동안 세포의 미세관은 재조직되어 유사분열 방추를 형성하며, 이는 미세관 구성성분 단백질 α- 및 β-튜불린의 신속한 어셈블리 및 해체에 요구되는 과정이다. 항유사분열제는 이 과정을 차단하여, 세포가 유사분열을 거치지 못하도록 한다. 분자 수준에서, 정확한 차단 메카니즘은 항유사분열제마다 상이할 수 있다. 튜부리신은 튜불린이 미세관으로 어셈블리되는 것을 방지하고, 이러한 영향을 받은 세포가 G2/M 기에서 축적되고 아폽토시스를 거치도록 한다 (Khalil et al. 2006). 파클리탁셀은 미세관에 결합하여 그의 해체를 방지함으로써 동일한 최종 결과를 발생시킨다.
튜부리신은 화학식 A에 나타난 바와 같이 1개의 단백질생성 아미노산 서브유닛 및 3개의 비-단백질생성 아미노산 서브유닛으로 구축된 테트라펩티딜 스캐폴드를 갖는다: N-메틸피페콜린산 (Mep), 이소류신 (Ile), 튜부발린 (Tuv), 및 튜부페닐알라닌 (Tup, R' = H) 또는 튜부티로신 (Tut, R' = OH). 널리 공지된 자연 발생 튜부리신 (지정된 A, B 등) 사이에서, 구조적 변이 부위는 표 1에 나타난 바와 같이 화학식 A의 잔기 R', R" 및 R"'에 있다:
<화학식 A>
Figure pct00001
[표 1]
Figure pct00002
추가로, 다른 자연 발생 튜부리신이 확인되었다 (Chai et al. 2010).
문헌 [Kaur et al. 2006]에서, 튜부리신 A의 항증식 특성을 연구하였으며, 이것이 파클리탁셀 및 빈블라스틴과 같은 다른 항유사분열제보다 더 강력하며 이종이식편 검정에서 다양한 암 세포주에 대해 활성임을 발견하였다. 또한, 튜부리신 A는 정상 세포를 제외한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하였고, 시험관내 검정에서 유의한 잠재적 항혈관신생 특성을 나타내었다. 또한, 다른 튜부리신의 항유사분열 특성을 평가하였으며, 이는 일반적으로 비-튜부리신 항유사분열제보다 우수한 것으로 확인되었다 (예를 들어, 문헌 [Balasubramanian et al. 2009; Steinmetz et al. 2004; Wipf et al. 2004] 참조). 이러한 이유로, 튜부리신은 항암제로서 상당한 관심을 받고 있다 (예를 들어, 문헌 [Domling et al. 2005c; Hamel 2002] 참조).
하기 문헌을 비롯하여, 다수의 간행물이 튜부리신의 합성에 관련된 노력을 기재하고 있다: Balasubramanian et al. 2009; Domling et al. 2006; Hoefle et al. 2003; Neri et al. 2006; Peltier et al. 2006; Sani et al. 2007; Sasse et al. 2007; Shankar et al. 2009; Shibue et al. 2009 및 2010; 및 Wipf et al. 2004. 다른 간행물은 튜부리신 유사체 또는 유도체의 제조 및 평가를 통해, 구조-활성 관계 (SAR) 연구를 기재한다: Balasubramanian et al. 2008 및 2009; Chai et al. 2011; Domling 2006; Domling et al. 2005a; Ellman et al. 2013; Hoefle et al. 2001 & 2006a; Pando et al. 2011; Patterson et al. 2007 & 2008; Richter 2012a, 2012b, 및 2012c; Shankar et al. 2013; Shibue et al. 2011; Sreejith et al. 2011; Vlahov et al. 2010a; Wang et al. 2007; Wipf et al. 2007 및 2010; 및 Zanda et al. 2013. SAR 연구는 주로 Tuv 서브유닛의 Mep 고리, 잔기 R" 및 R"', 및 Tup/Tut 서브유닛의 방향족 고리 또는 지방족 탄소 쇄에서의 구조적 변이를 연구하였다.
문헌 [Domling et al. 2005]은 중합체 또는 생체분자로서 포괄적으로 기재된 파트너 분자와의 튜부리신의 접합체를 개시하고 있으나, 그 예는 파트너 분자로서의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 제한된다. 문헌 [Cheng et al. 2011]은 또한 접합체에 사용하기 적합한 튜부리신 유사체를 개시한다. 튜부리신의 접합체를 개시하는 다른 문헌은 문헌 [Boyd et al. 2008 및 2010; Jackson et al. 2013; Vlahov et al. 2008a, 2008b 및 2010b; Leamon et al. 2008 및 2010; Reddy et al. 2009; 및 Low et al. 2010]이다. 문헌 [Leung et al. 2002]은 생물활성 및 수용해도를 개선시키기 위해 약물 (튜부리신을 포함)에 접합될 수 있는 다가음이온성 폴리펩티드를 개시한다.
문헌 [Davis et al. 2008 및 Schluep et al. 2009]은 튜부리신이 Tup/Tut 카르복실 기에 결합된 히드라지드-디술피드 링커 모이어티를 통해 시클로덱스트린에 공유 부착된 시클로덱스트린 기재 제제를 개시한다.
Tuv 서브유닛의 탈아세틸화 (즉, 화학식 A 내의 R"이 아세틸 대신 히드록실임)는 보고에 의하면 생물학적 활성의 손실을 초래한다 (Domling et al. 2006). 튜부리신 U 및 V (전자는 아세틸화된 것이고, 후자는 탈아세틸화된 것이라는 점에서 상이함)의 연구에서, 튜부리신 V는 검정에 따라 약 200X 내지 600X만큼 덜 강력하다고 보고되었다 (Balasubramanian et al. 2009). 아세테이트 기가 쉽게 가수분해되기 때문에, R" 위치에서의 탈아세틸화가 제약 용도를 위한 튜부리신 유사체의 개발에 있어서 활성을 손실을 초래하는 잠재적 불안정성의 핵심으로서 관심을 받고 있다.
본 발명자들은 R" 위치의 아세테이트를 카르바메이트 기로 대체함으로써, 상기 논의된 바와 같은 탈아세틸화와 연관된 생물학적 활성의 손실을 방지하는 것이 가능함을 발견하였다. 본원에 기재된 바와 같은 카르바메이트 기는 생물학적 활성의 유의한 손실을 유발하지 않으며, 오히려 보다 안정하다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I에 의해 나타내어지는 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 I>
Figure pct00003
상기 식에서,
R1은 H, 비치환되거나 또는 치환된 C1-C10 알킬, 비치환되거나 또는 치환된 C2-C10 알케닐, 비치환되거나 또는 치환된 C2-C10 알키닐, 비치환되거나 또는 치환된 아릴, 비치환되거나 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C2-C10 알키닐), (CH2)1- 2OC(=O)(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1- 2OC(=O)(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2OC(=O)(C2-C10 알키닐), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C2-C10 알키닐), 비치환되거나 또는 치환된 시클로지방족, 비치환되거나 또는 치환된 헤테로시클로지방족, 비치환되거나 또는 치환된 아릴알킬, 또는 비치환되거나 또는 치환된 알킬아릴이고;
R2는 H, 비치환되거나 또는 치환된 C1-C10 알킬, 비치환되거나 또는 치환된 C2-C10 알케닐, 비치환되거나 또는 치환된 C2-C10 알키닐, 비치환되거나 또는 치환된 아릴, 비치환되거나 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C2-C10 알키닐), (CH2)1- 2OC(=O)(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1- 2OC(=O)(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2OC(=O)(C2-C10 알키닐), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C2-C10 알키닐), 비치환되거나 또는 치환된 시클로지방족, 비치환되거나 또는 치환된 헤테로시클로지방족, 비치환되거나 또는 치환된 아릴알킬, 비치환되거나 또는 치환된 알킬아릴, 또는
Figure pct00004
이고;
여기서 각각의 R2a는 독립적으로 H, NH2, NHMe, Cl, F, Me, Et, 또는 CN이고;
R3a 및 R3b는 독립적으로 H, C1-C5 알킬, CH2(C5-C6 시클로알킬), CH2C6H5, C6H5, 또는 CH2CH2OH이고;
R4는
Figure pct00005
이고;
여기서 R4a는 H 또는 C1-C3 알킬이고; Y는 H, OH, Cl, F, CN, Me, Et, NO2, 또는 NH2이고;
R5는 H, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐, CO(C1-C5 알킬), CO(C2-C5 알케닐), 또는 CO(C2-C5 알키닐)이고;
W는 O 또는 S (바람직하게는 O)이고;
n은 0, 1, 또는 2이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 바람직하게는 암 세포인 표적 세포 상의 화학 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티에 공유 연결된 화학식 I에 따른 화합물을 포함하는 접합체를 제공한다. 바람직하게는, 표적화 모이어티는 항체 - 보다 바람직하게는 모노클로날 항체, 보다 더 바람직하게는 인간 모노클로날 항체 - 또는 그의 항원-결합 부분이고, 화학 물질은 종양 연관 항원이다. 종양 연관 항원은 암 세포의 표면 상에 디스플레이되는 것 또는 암 세포에 의해 주변 세포외 공간으로 분비되는 것일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물, 및 표적화 모이어티에 대한 접합에 적합한 반응성 관능기를 갖는 링커 모이어티를 포함하는 물질의 조성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 그의 표적화 모이어티 (특히 항체)와의 접합체를 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 암을 앓고 있는 대상체에서 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 화합물, 또는 그의 표적화 모이어티 (특히 항체)와의 접합체의 용도가 제공된다. 암은 신장암, 위암, 폐암 또는 난소암일 수 있다.
도 1, 2a-2b, 및 3은 함께 화합물 (III-1)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 4는 화합물 (III-2)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 5는 화합물 (I-2) 및 (I-3)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 6a-6c는 함께 화합물 (III-4) 및 (III-5)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 7은 화합물 (I-1)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 8은 화합물 (I-4)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 9a 및 9b는 함께 화합물 (III-6)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 10 및 11은 본 발명의 화합물의 제조에 유용한 중간체의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 12는 본 발명의 추가의 화합물의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 13a-13d는 본 발명의 일부 화합물의 생물학적 활성을 보여준다.
도 14는 본 발명의 접합체의 시험관내 활성을 보여준다.
도 15는 본 발명의 접합체의 생체내 활성을 보여준다.
도 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 및 20은 본 발명의 접합체의 활성에 대한 추가의 생체내 데이터를 제시한다.
도 21 및 22는 본 발명의 추가의 화합물의 합성을 위한 반응식을 보여주며, 카르바메이트 기에서의 구조적 변이를 설명한다.
도 23은 "클릭(click)" 화학반응을 통한 접합에 적합한 본 발명의 화합물의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
도 24는 지방족 아민 기를 통한 접합에 적합한 본 발명의 화합물의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
정의
"항체"는 전체 항체, 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉 "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄 변이체를 의미한다. 전체 항체는 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL 또는 Vk) 및 하나의 단일 도메인 CL을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 보다 보존된 프레임워크 영역 (FR) 사이에 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 항체의 결합을 매개할 수 있다. 항체가 항원 X에 5 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 6 x 10-9 M 이하, 보다 바람직하게는 3 x 10-9 M 이하, 보다 더 바람직하게는 2 x 10-9 M 이하의 KD로 결합하는 경우에, 항체가 항원 X에 "특이적으로 결합한다"고 언급된다. 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 바람직하게는 인간 항체일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 글리코실화 유형 또는 정도에 영향을 미치기 위해, 항체 반감기를 연장시키기 위해, 이펙터 세포 또는 보체계와의 상호작용을 증진 또는 감소시키기 위해, 또는 일부 다른 특성을 조절하기 위해 조작될 수 있다. 조작은 하나 이상의 아미노산을 치환, 부가 또는 결실시키는 것에 의해, 또는 도메인을 또 다른 이뮤노글로불린 유형으로부터의 도메인으로 치환시키는 것에 의해, 또는 상기한 것의 조합에 의해 달성될 수 있다.
항체의 "항원 결합 단편" 및 "항원 결합 부분" (또는 간단히 "항체 부분" 또는 "항체 단편")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편을 의미한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편, 예컨대 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab인 Fab' 단편 (예를 들어, 문헌 [Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007] 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (v) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (vi) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (viii) 단일 가변 도메인 및 2개의 불변 도메인을 함유하는 중쇄 가변 영역인 나노바디에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 항원 결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', Fv, 및 Fd 단편이다. 또한, Fv 단편의 2개 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되더라도, 이들은 이들을 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가의 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로 만드는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다 (단일 쇄 Fv 또는 scFv로 알려져 있음) (예를 들어, 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 쇄 항체도 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄된다.
"단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미한다 (예를 들어, 항원 X에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 항원 X가 아닌 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, 항원 X에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터의 항원 X 분자에 대한 교차 반응성을 가질 수는 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 항체는 인간 항원 X에 특이적으로 결합하고, 다른 (비-인간) 항원 X 항원들과는 교차 반응하지 않는다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
"모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타내는, 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 의미한다.
"인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 (및 존재하는 경우, 불변 영역)이 둘 다 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체는 천연 또는 합성 변형을 비롯한 후기 변형을 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식되어 있는 항체는 포함하지 않는다.
"인간 모노클로날 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내고, 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
"지방족"은 명시된 개수의 탄소 원자를 갖거나 (예를 들어, "C3 지방족", "C1-C5 지방족" 또는 "C1 내지 C5 지방족"에서와 같고, 후자 2개의 어구는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 지방족 모이어티에 대한 동의어임) 또는 탄소 원자의 개수가 명확하게 명시되지 않은 경우에는 1 내지 4개의 탄소 원자 (불포화 지방족 모이어티의 경우에는 2 내지 4개의 탄소)를 갖는 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다.
"알킬"은 탄소 원자의 개수 지정에 대한 동일한 관례가 적용되는, 포화 지방족 모이어티를 의미한다. 예를 들어, C1-C4 알킬 모이어티는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, t-부틸, 1-부틸, 2-부틸 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "알킬렌"은 알킬 기의 2가 대응물, 예컨대 CH2CH2, CH2CH2CH2, 및 CH2CH2CH2CH2를 의미한다.
"알케닐"은 탄소 원자의 개수 지정에 대한 동일한 관례가 적용되는, 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미한다. 예를 들어, C2-C4 알케닐 모이어티는 에테닐 (비닐), 2-프로페닐 (알릴 또는 프로프-2-에닐), 시스-1-프로페닐, 트랜스-1-프로페닐, E- (또는 Z-) 2-부테닐, 3-부테닐, 1,3-부타디에닐 (부트-1,3-디에닐) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"알키닐"은 탄소 원자의 개수 지정에 대한 동일한 관례가 적용되는, 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 지방족 모이어티를 의미한다. 예를 들어, C2-C4 알키닐 기는 에티닐 (아세틸레닐), 프로파르길 (프로프-2-이닐), 1-프로피닐, 부트-2-이닐 등을 포함한다.
"시클로지방족"은 각각의 고리가 3 내지 8개 (바람직하게는 3 내지 6개)의 탄소 원자를 갖는 것인 1 내지 3개의 고리를 갖는 포화 또는 불포화, 비-방향족 탄화수소 모이어티를 의미한다. "시클로알킬"은 각각의 고리가 포화된 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알케닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 시클로지방족 모이어티를 의미한다. "시클로알키닐"은 적어도 1개의 고리가 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. 예를 들어, 시클로지방족 모이어티는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸 및 아다만틸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 시클로지방족 모이어티는 시클로알킬 모이어티, 특히 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이다. "시클로알킬렌"은 시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"헤테로시클로지방족"은 그의 적어도 1개의 고리에서 3개 이하 (바람직하게는 1 내지 2개)의 탄소가 N, O 또는 S로부터 독립적으로 선택된 헤테로원자로 치환되고, 여기서 N 및 S는 임의로 산화될 수 있고, N는 임의로 4급화될 수 있는 것인 시클로지방족 모이어티를 의미한다. 유사하게, "헤테로시클로알킬", "헤테로시클로알케닐" 및 "헤테로시클로알키닐"은 각각 그의 적어도 1개의 고리가 상기와 같이 변형된 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 시클로알키닐 모이어티를 의미한다. 예시적인 헤테로시클로지방족 모이어티는 아지리디닐, 아제티디닐, 1,3-디옥사닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸릴, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로티오피라닐 술폰, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티오모르폴리닐 술폭시드, 티오모르폴리닐 술폰, 1,3-디옥솔라닐, 테트라히드로-1,1-디옥소티에닐, 1,4-디옥사닐, 티에타닐 등을 포함한다. "헤테로시클로알킬렌"은 헤테로시클로알킬 기의 2가 대응물을 의미한다.
"알콕시", "아릴옥시", "알킬티오" 및 "아릴티오"는 각각 -O(알킬), -O(아릴), -S(알킬) 및 -S(아릴)을 의미한다. 예는 각각 메톡시, 페녹시, 메틸티오 및 페닐티오이다.
"할로겐" 또는 "할로"는 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘을 의미한다.
"아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 방향족인 모노-, 비- 또는 트리시클릭 고리계를 갖는 탄화수소 모이어티를 의미한다. 고리계에서의 고리는 서로 융합될 수 있거나 (나프틸에서와 같음) 또는 서로 결합될 수 있고 (비페닐에서와 같음), 비-방향족 고리에 융합 또는 결합될 수 있다 (인다닐 또는 시클로헥실페닐에서와 같음). 추가의 예로서, 아릴 모이어티는 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 인다닐, 비페닐, 페난트릴, 안트라세닐 및 아세나프틸을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "아릴렌"은 아릴 기의 2가 대응물, 예를 들어 1,2-페닐렌, 1,3-페닐렌 또는 1,4-페닐렌을 의미한다.
"헤테로아릴"은 각각의 고리가 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖고 적어도 1개의 고리가 N, O 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 방향족 고리이고, 여기서 N 및 S는 임의로 산화될 수 있고, N은 임의로 4급화될 수 있는 것인 모노-, 비- 또는 트리시클릭 고리계를 갖는 모이어티를 의미한다. 이러한 1개 이상의 헤테로원자를 함유하는 방향족 고리는 다른 유형의 고리에 융합될 수 있거나 (벤조푸라닐 또는 테트라히드로이소퀴놀릴에서와 같음) 또는 다른 유형의 고리에 직접 결합될 수 있다 (페닐피리딜 또는 2-시클로펜틸피리딜에서와 같음). 추가의 예로서, 헤테로아릴 모이어티는 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐 (티에닐), 이미다졸릴, 피라졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, N-옥소피리딜, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 퀴노잘리닐, 나프티리디닐, 벤조푸라닐, 인돌릴, 벤조티오페닐, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 페노티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 디벤조푸라닐, 카르바졸릴, 디벤조티오페닐, 아크리디닐 등을 포함한다. "헤테로아릴렌"은 아릴 기의 2가 대응물을 의미한다.
"비치환되거나 또는 치환된 C1-C5 알킬" 또는 "임의로 치환된 헤테로아릴"에서와 같이 어구 "비치환되거나 또는 치환된" 또는 "임의로 치환된"의 사용에 의해 모이어티가 치환될 수 있음을 나타낸 경우에, 이러한 모이어티는 1개 이상의 독립적으로 선택된 치환기, 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기를 가질 수 있다. 치환기 및 치환 패턴은, 화학적으로 안정하고 관련 기술분야에 공지된 기술 뿐만 아니라 본원에 제시된 방법에 의해 합성될 수 있는 화합물을 제공하기 위해, 치환기가 부착되는 모이어티를 고려하여 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.
"아릴알킬", "(헤테로시클로지방족)알킬", "아릴알케닐", "아릴알키닐", "비아릴알킬" 등은, 경우에 따라 아릴, 헤테로시클로지방족, 비아릴 등의 모이어티에 의해 치환되고, 경우에 따라 알킬, 알케닐 또는 알키닐 모이어티에서 개방 (포화되지 않은) 원자가를 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 모이어티를 의미하며, 예를 들어 벤질, 페네틸, N-이미다조일에틸, N-모르폴리노에틸 등에서와 같은 것이다. 반대로, "알킬아릴", "알케닐시클로알킬" 등은, 경우에 따라 알킬, 알케닐 등의 모이어티에 의해 치환된 아릴, 시클로알킬 등의 모이어티를 의미하며, 경우에 따라 예를 들어 메틸페닐 (톨릴) 또는 알릴시클로헥실에서와 같다. "히드록시알킬", "할로알킬", "알킬아릴", "시아노아릴" 등은, 경우에 따라 확인된 치환기 (경우에 따라 히드록실, 할로 등) 중 1개 이상으로 치환된 알킬, 아릴 등을 의미한다.
예를 들어, 허용되는 치환기는 알킬 (특히 메틸 또는 에틸), 알케닐 (특히 알릴), 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로 (특히 플루오로), 할로알킬 (특히 트리플루오로메틸), 히드록실, 히드록시알킬 (특히 히드록시에틸), 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬) (특히 -OCF3), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), -SO2N(알킬)2 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
치환될 모이어티가 지방족 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 아릴, 헤테로아릴, 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), -O(아릴), 알킬티오, 아릴티오, =O, =NH, =N(알킬), =NOH, =NO(알킬), -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(=O)알킬, -S(시클로알킬), -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 할로, 히드록실, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(아릴), =O, =NOH, =NO(알킬), -OC(=O)(알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, 및 -NHC(=NH)NH2이다. 특히 페닐, 시아노, 할로, 히드록실, 니트로, C1-C4알킬옥시, O(C2-C4 알킬렌)OH, 및 O(C2-C4 알킬렌)할로가 바람직하다.
치환될 모이어티가 시클로지방족, 헤테로시클로지방족, 아릴, 또는 헤테로아릴 모이어티인 경우에, 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -O(할로알킬), -O(아릴), -O(시클로알킬), -O(헤테로시클로알킬), 알킬티오, 아릴티오, -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, 아지도, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NH(히드록시알킬), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -OSO2(알킬), -SH, -S(알킬), -S(아릴), -S(시클로알킬), -S(=O)알킬, -SO2(알킬), -SO2NH2, -SO2NH(알킬), 및 -SO2N(알킬)2이다. 보다 바람직한 치환기는 알킬, 알케닐, 할로, 할로알킬, 히드록실, 히드록시알킬, 시아노, 니트로, 알콕시, -O(히드록시알킬), -C(=O)(알킬), -C(=O)H, -CO2H, -C(=O)NHOH, -C(=O)O(알킬), -C(=O)O(히드록시알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)NH(알킬), -C(=O)N(알킬)2, -OC(=O)(알킬), -OC(=O)(히드록시알킬), -OC(=O)O(알킬), -OC(=O)O(히드록시알킬), -OC(=O)NH2, -OC(=O)NH(알킬), -OC(=O)N(알킬)2, -NH2, -NH(알킬), -N(알킬)2, -NH(아릴), -NHC(=O)(알킬), -NHC(=O)H, -NHC(=O)NH2, -NHC(=O)NH(알킬), -NHC(=O)N(알킬)2, 및 -NHC(=NH)NH2이다. 특히 C1-C4 알킬, 시아노, 니트로, 할로, 및 C1-C4알콕시가 바람직하다.
"C1-C5 알킬" 또는 "5 내지 10%"에서와 같이 범위가 언급되는 경우에, 이러한 범위는 첫번째 경우에는 C1 및 C5, 두번째 경우에는 5% 및 10%와 같은, 범위의 종점을 포함한다.
특정한 입체이성질체를 구체적으로 (예를 들어, 구조 화학식의 관련 입체중심에서 굵은선 또는 파선 결합에 의해, 구조 화학식에서 E 또는 Z 배위를 갖는 것으로서의 이중 결합의 도시에 의해, 또는 입체화학-지정 명명법의 사용에 의해) 나타내지 않는 한, 모든 입체이성질체는 순수한 화합물 뿐만 아니라 그의 혼합물로서 본 발명의 범위에 포함된다. 달리 나타내지 않는 한, 개별 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 기하 이성질체, 및 그의 조합 및 혼합물은 모두 본 발명에 포괄된다.
통상의 기술자는 화합물이 본원에 사용된 구조 화학식에 도시된 것과 동등한 호변이성질체 형태 (예를 들어, 케토 및 엔올 형태), 공명 형태 및 쯔비터이온성 형태를 가질 수 있으며, 구조 화학식은 이러한 호변이성질체, 공명 또는 쯔비터이온성 형태를 포괄한다는 것을 인지할 것이다.
"제약상 허용되는 에스테르"는 생체내에서 (예를 들어, 인간 신체에서) 가수분해되어 모 화합물 또는 그의 염을 생성하거나, 또는 모 화합물의 것과 유사한 활성 그 자체를 갖는 에스테르를 의미한다. 적합한 에스테르는 C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐 또는 C2-C5 알키닐 에스테르, 특히 메틸, 에틸 또는 n-프로필을 포함한다.
"제약상 허용되는 염"은 제약 제제에 적합한 화합물의 염을 의미한다. 화합물이 1개 이상의 염기성 기를 갖는 경우에, 염은 술페이트, 히드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 말레에이트, 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트, 파모에이트 (엠보네이트), 히드로아이오다이드, 니트레이트, 히드로클로라이드, 락테이트, 메틸술페이트, 푸마레이트, 벤조에이트, 숙시네이트, 메실레이트, 락토비오네이트, 수베레이트, 토실레이트 등과 같은 산 부가염일 수 있다. 화합물이 1개 이상의 산성 기를 갖는 경우에, 염은 칼슘 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 메글루민 염, 암모늄 염, 아연 염, 피페라진 염, 트로메타민 염, 리튬 염, 콜린 염, 디에틸아민 염, 4-페닐시클로헥실아민 염, 벤자틴 염, 나트륨 염, 테트라메틸암모늄 염 등과 같은 염일 수 있다. 다형성 결정질 형태 및 용매화물이 또한 본 발명의 범위 내에 포괄된다.
조성물
화학식 I에서 (편의상 하기에서 반복됨),
<화학식 I>
Figure pct00006
기 R1은 바람직하게는 Me, Et, n-Pr, i-Pr, 또는
Figure pct00007
, 보다 바람직하게는 후자이다.
또한, 화학식 I에서, 기 R2는 바람직하게는 C1-C5 알킬, C1-C5 알케닐, C1-C5 알키닐, CH2OC(=O)C1-C5 알킬, CH2OC(=O)C1-C5 알케닐, CH2OC(=O)C1-C5 알키닐,
Figure pct00008
이다.
또한, 화학식 I에서, 바람직한 기 N(R3a)(R3b)는
Figure pct00009
이고, 특히 바람직하게는 R3a 및 R3b 중 하나가 H이고, 나머지는 Me이다. 다른 바람직한 실시양태에서, R3a 및 R3b는 둘 다 H이거나 또는 둘 다 Me이거나, 또는 R3a 및 R3b 중 하나가 H이고, 나머지는 C6H5이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, R3a 및 R3b는 독립적으로 H, C1-C5 알킬, CH2(C5-C6 시클로알킬), CH2C6H5, 또는 CH2CH2OH이다.
화학식 I 내의 R1 및 R2의 정의에서, 기가 비치환되거나 또는 치환되는 것으로 정의된 경우에, 이는 바람직하게는 비치환된다.
본 명세서의 화학식에서, 페닐 고리의 2개의 탄소 사이의 페닐 고리를 횡단하는 결합은 결합에 부착된 기가 페닐 고리의 오르토, 메타 또는 파라 위치 중 임의의 위치에 위치할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 화학식
Figure pct00010
는
Figure pct00011
을 나타낸다.
다양한 R2 및 R4 기를 갖는 튜부리신 Tuv 및 Tup 서브유닛의 대응물의 합성은 문헌 [Cheng et al. 2011]에 교시되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
화학식 I에 따른 화합물의 바람직한 실시양태에서, R1은
Figure pct00012
이고,
R2는 C1-C5 알킬 (특히 Me 또는 n-Pr), 또는
Figure pct00013
이고;
R3a 및 R3b 중 하나는 H이고, 나머지는 Me이고; R4는
Figure pct00014
이고,
여기서 Y는 H 또는 NO2이고, R4a는 H, Me, 또는 Et이고;
R5는 Me이고; W는 O이고, n은 1이다.
화학식 I에 따른 화합물의 또 다른 바람직한 실시양태에서, n은 1이고, W는 O이고, R4 내의 Y는 H 또는 NO2 (바람직하게는 H)이고, R2는
Figure pct00015
, 보다 바람직하게는
Figure pct00016
이다.
이러한 바람직한 실시양태에 따른 화합물은 하기 화학식 Ia에 의해 나타내어진 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 Ia>
Figure pct00017
상기 식에서, Y는 H 또는 NO2이고; R4a는 H, Me, 또는 Et이고; R3a 및 R3b는 독립적으로 H, C6H5, Me, 또는 Et이다.
보다 더 바람직하게는, 화합물은 하기 화학식 Ia'에 의해 나타내어지는 구조를 갖거나 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 Ia'>
Figure pct00018
상기 식에서, R4a는 H, Me, 또는 Et이고; R3a 및 R3b는 독립적으로 H, C6H5, Me, 또는 Et이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, W는 O이고, Y는 NH2이고, n은 1이고, R2 내의 기 R2a는 둘 다 NH2가 아니다. 이러한 실시양태에 따른 화합물은 하기 화학식 Ib에 의해 나타내어지는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 Ib>
Figure pct00019
상기 식에서, R4a는 H, Me, 또는 Et이고; R3a 및 R3b는 독립적으로 H, C6H5, Me, 및 Et이고; R6은 C1-C5 알킬, CH2OC(=O)C1-C5 알킬, 또는 (CH2)1-2C6H5이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 화합물은 하기 화학식 Ib'에 의해 나타내어진 구조를 갖거나 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 Ib'>
Figure pct00020
상기 식에서, R4a는 H, Me, 또는 Et (바람직하게는 H)이고, R6은 Me 또는 n-Pr이다.
바람직하게는, 화학식 Ia, Ia', 및 Ib에서, R3a 및 R3b 중 하나는 H이고, 나머지는 Me이다. 다른 바람직한 실시양태에서, R3a 및 R3b는 둘 다 H이거나 또는 둘 다 Me이거나, 또는 R3a 및 R3b 중 하나는 H이고, 나머지는 C6H5이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, R3a 및 R3b는 독립적으로 H, Me, 또는 Et이다.
본 발명의 화합물의 구체적 예는 바로 아래 제시된 화합물, 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00021
,
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
.
화합물 (I-2), (I-7), (I-8) 및 (I-9)가 바람직하다.
접합체
임의적으로, 본 발명의 화합물은 암 세포의 화학 물질에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티에 접합될 수 있다. 바람직하게는, 표적화 모이어티는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이고, 화학 물질은 종양 연관 항원이다. 적절하게는, 접합은 Tuv 또는 Tup 서브유닛 내의 관능기, 예컨대 아미노 기에 대한 화학 결합을 통해 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 하기 화학식 II에 의해 나타내어지는, 본 발명에 따른 세포독성 화합물 및 리간드를 포함하는 접합체가 제공된다.
<화학식 II>
Figure pct00025
상기 식에서, Z는 리간드이고; D는 본 발명에 따른 세포독성 화합물 (예를 들어, 화학식 I, Ia, Ia', 또는 Ib에 따른 화합물)이고; -(XD)aC(XZ)b-는 Z 및 D를 연결하기 때문에 총괄적으로 "링커 모이어티" 또는 "링커"로 지칭된다. 링커 내에서, C는 화합물 D의 의도되는 생물학적 작용 부위에서 또는 그 근처에서 절단되도록 설계된 절단가능한 기이고; XD 및 XZ는 각각 D 및 C 및 C 및 Z를 공간적으로 분리하기 때문에 스페이서 모이어티 (또는 "스페이서")로 지칭되고; 아래첨자 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고 (즉, XD 및/또는 XZ의 존재는 임의적임); 아래첨자 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 (바람직하게는 1, 2, 3, 또는 4)이다. D, XD, C, XZ 및 Z는 본원에서 하기에 보다 자세하게 기재된다.
리간드 Z - 예를 들어 항체 -는 표적화 기능을 제공한다. 리간드 Z는 표적 조직 또는 그의 항원 또는 수용체가 위치하는 세포에 결합함으로써 접합체를 그곳으로 유도한다. 바람직하게는, 표적 조직 또는 세포는 암 조직 또는 세포이며, 항원 또는 수용체는 종양-연관 항원, 즉 비-암성 세포와 비교하여 암성 세포에 의해 특유하게 발현되거나 또는 암 세포에 의해 과다발현되는 항원이다. 표적 조직 또는 세포에서 기 C의 절단으로 화합물 D가 방출되어 국부로 그의 세포독성 효과가 발휘된다. 일부 경우에, 접합체는 세포내이입에 의해 표적 세포 내로 내재화되고, 표적 세포 내에서 절단이 일어난다. 상기 방식으로, 의도된 작용 부위에서의 화합물 D의 정확한 전달이 달성되어 필요한 투여량이 감소된다. 또한, 화합물 D는 그의 접합된 상태에서는 일반적으로 생물학적으로 불활성 (또는 유의하게 덜 활성)이고, 이로써 비-표적 조직 또는 세포에 대한 바람직하지 않은 독성이 감소된다. 항암 약물은 일반적으로 세포에 대해 종종 고도로 독성이기 때문에, 이는 중요한 고려사항이다.
아래첨자 m에 의해 반영된 바와 같이, 리간드 Z의 각각의 분자는 접합에 이용가능한 리간드 Z 부위의 개수 및 사용된 실험 조건에 따라, 하나 초과의 화합물 D와 접합될 수 있다. 통상의 기술자는 리간드 Z의 각각의 개별 분자가 정수 개수의 화합물 D에 접합되지만, 접합체의 제조가 통계적 평균을 반영하여 비-정수 비의 화합물 D 대 리간드 Z에 대해 분석될 수 있음을 인지할 것이다. 이 비는 치환 비 (SR)로서, 또는 대안적으로 항체-약물 접합체의 경우에 약물-항체 비 (DAR)로서 지칭된다.
리간드 Z 및 그의 접합
바람직하게는, 리간드 Z는 항체이다. 편의성 및 간결성을 위해, 비제한적으로, 리간드 Z의 접합과 관련하여 본원에 후속되는 상세한 논의는 그것이 항체라는 맥락에서 기술될 것이지만, 통상의 기술자는 필요한 변경을 가하여 다른 유형의 리간드 Z도 접합될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 리간드로서 폴산을 갖는 접합체는 그의 표면 상에 폴레이트 수용체를 갖는 세포를 표적화할 수있다 (Vlahov et al. 2008; Leamon et al. 2008). 동일한 이유로, 하기 상세한 논의는 주로 1:1 비의 항체 Z 대 화합물 D (m = 1)의 관점에서 기술된다.
바람직하게는, 리간드 Z는 이러한 리간드 Z를 포함하는 접합체가 암 세포를 선택적으로 표적화하는 것을 가능하게 하는 종양 연관 항원에 대한 항체이다. 이러한 항원의 예는 메소텔린, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), CD19, CD22, CD30, CD70, B7H4 (또한 O8E로 공지됨), 단백질 티로신 키나제 7 (PTK7), 글리피칸-3, RG1, CTLA-4, 및 CD44를 포함한다. 항체는 동물 (예를 들어, 뮤린), 키메라, 인간화, 또는 바람직하게는 인간 항체일 수 있다. 항체는 바람직하게는 모노클로날, 특히 모노클로날 인간 항체이다. 상기 언급된 항원들 중 일부에 대한 인간 모노클로날 항체의 제조는 문헌 [Korman et al., US 2009/0074660 A1 (B7H4); Rao-Naik et al., 8,097,703 B2 (CD19); King et al., US 2010/0143368 A1 (CD22); Keler et al., US 7,387,776 B2 (2008) (CD30); Terrett et al., US 8,124,738 B2 (CD70); Korman et al., US 6,984,720 B1 (2006) (CTLA-4); Korman et al., US 8,008,449 B2 (2011) (PD-1); Huang et al., US 2009/0297438 A1 및 Cardarelli et al., US 7,875,278 B2 (PSMA); Terrett et al., US 2010/0034826 A1 (PTK7); Terrett et al., US 2010/0209432 (A1) (글리피칸-3); Harkins et al., US 7,335,748 B2 (2008) (RG1); Terrett et al., US 8,268,970 B2 (2012) (메소텔린); 및 Xu et al., US 2010/0092484 A1 (CD44)]에 개시되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
리간드 Z는 또한 항체 단편 또는 항체 모방체, 예컨대 아피바디, 도메인 항체 (dAb), 나노바디, 유니바디, DARPin, 안티칼린, 베르사바디, 듀오칼린, 리포칼린 또는 아비머일 수 있다.
리간드 Z 상의 몇몇 다양한 반응성 기 중 임의의 하나는 리신 잔기 내의 ε-아미노 기, 펜던트 탄수화물 모이어티, 카르복실산 기, 디술피드 기 및 티올 기를 비롯한 접합 부위일 수 있다. 각각의 유형의 반응성 기는 몇몇 이점 및 몇몇 단점을 갖는 균형을 나타낸다. 접합에 적합한 항체 반응성 기의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216 및 Dubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123]을 참조하고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
한 실시양태에서, 리간드 Z는 리신 ε-아미노 기를 통해 접합된다. 대부분의 항체는 여러 개의 노출된 리신 ε-아미노 기를 갖고, 이는 이종이관능성 작용제 (하기에 추가로 기재된 바와 같은 것)를 사용한 변형을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 아미드, 우레아, 티오우레아 또는 카르바메이트 결합을 통해 접합될 수 있다. 그러나, 접합체 제조에서 잠재적인 배치-대-배치 변동성이 유발되도록 어떤 ε-아미노 기를 얼마나 많이 반응시킬지 제어하는 것은 어렵다. 또한, 접합은 항체의 천연 입체형태를 유지하는데 중요한 양성자화 ε-아미노 기의 중화를 일으킬 수 있거나, 또는 항원 결합 부위 또는 그 근처에서의 리신에서 발생할 수 있으며, 이들 중 어느 것도 바람직한 경우는 아니다.
또 다른 실시양태에서, 다수의 항체가 글리코실화되는 것과 같이, 리간드 Z는 탄수화물 측쇄를 통해 접합될 수 있다. 탄수화물 측쇄는 퍼아이오데이트에 의해 산화되어 알데히드 기를 생성할 수 있고, 이는 다시 아민과 반응하여 세미카르바존, 옥심 또는 히드라존에서와 같이 이민 기를 형성할 수 있다. 원하는 경우에, 소듐 시아노보로히드라이드를 사용한 환원에 의해 이민 기를 보다 안정한 아민 기로 전환할 수 있다. 탄수화물 측쇄를 통한 접합에 대한 추가의 개시내용에 대해, 예를 들어 문헌 [Rodwell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986)]을 참조하고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 리신 ε-아미노 기에서와 같이, 접합 부위(들)의 위치의 재현성 및 화학량론에 관한 우려가 존재한다.
또 다른 실시양태에서, 리간드 Z는 카르복실산 기를 통해 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 말단 카르복실산 기는 관능화되어 카르보히드라지드를 생성하고, 이는 이어서 알데히드-보유 접합 모이어티와 반응한다. 문헌 [Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153]을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 항체 Z는 항체 Z 상의 시스테인 잔기 및 접합체의 다른 부분 상의 황을 가교하는 디술피드 기를 통해 접합될 수 있다. 일부 항체는 유리 티올 (술프히드릴) 기가 결여되어 있지만, 예를 들어 힌지 영역에 디술피드 기를 갖는다. 이러한 경우에, 유리 티올 기는 천연 디술피드 기의 환원에 의해 생성될 수 있다. 이렇게 생성된 티올 기는 이어서 접합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994); 및 Doronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003)]을 참조하고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 다시, 접합 부위 위치 및 화학량론 및 항체 천연 입체형태의 가능한 파괴에 관한 우려가 존재한다.
천연 디술피드 결합을 파괴하지 않으면서 항체에 유리 티올 기를 도입하기 위한 다수의 방법이 공지되어 있고, 이러한 방법은 본 발명의 리간드 Z로 수행할 수 있다. 사용하는 방법에 따라, 예정된 위치에 예측가능한 수의 유리 술프히드릴을 도입하는 것이 가능할 수 있다. 한가지 접근법에서는, 시스테인이 또 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이된 항체가 제조된다. 예를 들어, 문헌 [Eigenbrot et al., US 7,521,541 B2 (2009); Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Urnovitz et al., US 4,698,420 (1987); Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam et al., US 7,311,902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995)]을 참조한다. 또 다른 접근법에서는, 여분의 시스테인을 C-말단에 부가한다. 예를 들어, 문헌 [Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al., Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); 및 Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004)]을 참조한다. 유리 시스테인을 도입하기 위한 바람직한 방법은 WO 2009/026274 A1 (Liu et al.)에 교시되어 있으며, 여기서는 시스테인 보유 아미노산 서열을 항체 중쇄의 C-말단에 부가한다. 이 방법은 공지된 수의 시스테인 잔기 (중쇄당 1개)를 항원 결합 부위와 떨어진 공지된 위치에 도입한다. 본 단락에서 언급한 문헌의 개시내용은 모두 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 리신 ε-아미노 기를 2-이미노티올란 또는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-프로피오네이트 (SPDP)와 같은 이종이관능성 시약을 사용하여 변형시켜 ε-아미노 기를 티올 또는 디술피드 기로 전환시킴으로써 - 이를테면 시스테인 대용물을 생성할 수 있다. 그러나, 이 방법은 적절한 ε-아미노 기와 연관된 동일한 접합 위치 및 화학량론 제한으로 인해 곤란을 겪게 된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 리간드 Z는 티올 기의 친핵성 부가 생성물을 통해 수용자 모이어티에 접합된다. 바람직한 수용자 모이어티는 말레이미드 기이고, 그의 항체 티올 기와의 반응은 하기에 일반적으로 예시된다. 티올 기는 천연 티올 기 또는 상기에 기재된 바와 같이 도입된 티올 기일 수 있다.
Figure pct00026
리간드 Z는 또한 하기에 논의된 바와 같은 "클릭" 화학반응에 사용하기 적합한 관능기를 통해 접합될 수 있다.
링커 -(XD)aC(XZ)b-
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 접합체의 링커 일부는 최대 3가지 요소를 포함한다: 절단가능한 기 C 및 임의적인 스페이서 XZ 및 XD.
절단가능한 기 C는 생리학적 조건 하에 절단가능한 기이고, 바람직하게는 접합체가 혈장 내에서 일반적으로 순환되는 동안에는 상대적으로 안정하지만, 접합체가 의도된 그의 작용 부위, 즉 표적 세포 근처, 표적 세포 또는 표적 세포 내에 일단 도달하면 용이하게 절단되도록 선택된다. 바람직하게는, 접합체는 항체 Z가 표적 세포의 표면 상에 나타난 항원에 결합되었을 때 표적 세포에 의한 세포내이입에 의해 내재화된다. 후속적으로, 표적 세포의 소포성 소체 (초기 엔도솜, 후기 엔도솜 또는 특히 리소솜)에서 기 C의 절단이 발생한다.
한 실시양태에서, 기 C는 pH 민감성 기이다. 혈장 내 pH는 중성을 약간 초과하는 반면, 리소솜 내의 pH는 약 5로, 산성이다. 따라서, 절단이 산-촉매되는 기 C는 혈장 내에서의 속도에 비해 리소솜 내에서 10의 몇승의 배수만큼 더 빠른 속도로 절단될 것이다. 적합한 산-민감성 기의 예는 문헌 [Shen et al., US 4,631,190 (1986); Shen et al., US 5,144,011 (1992); Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981) 및 Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988)] (그의 개시내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 시스-아코니틸 아미드 및 히드라존을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 기 C는 디술피드이다. 디술피드는 티올-디술피드 교환 메카니즘에 의해 주위 티올 농도에 의존적인 속도로 절단될 수 있다. 글루타티온 및 다른 티올의 세포내 농도는 그의 혈청 농도보다 높기 때문에, 디술피드의 절단 속도는 세포내에서 더 높을 것이다. 또한, 티올-디술피드 교환 속도는 증진된 혈청 안정성 또는 특정한 절단 속도를 갖는 디술피드 연결의 설계를 가능하게 하는 디술피드의 입체 및 전자 특징의 조정 (예를 들어, 알킬-아릴 디술피드 대 알킬-알킬 디술피드; 아릴 고리 상에서의 치환 등)에 의해 조절될 수 있다. 접합체에서의 디술피드 절단가능한 기와 관련된 추가의 개시내용에 대해, 예를 들어 문헌 [Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi et al., US 7,541,530 B2 (2009); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; 및 Sufi et al., US 2010/0145036 A1]을 참조하고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
바람직한 기 C는, 혈청 내의 프로테아제에 의한 것과는 대조적으로, 의도된 작용 부위에서 프로테아제에 의해 우선적으로 절단되는 펩티드 결합을 포함한다. 전형적으로, 기 C는 1 내지 20개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 6개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산을 포함한다. 아미노산(들)은 천연 및/또는 비천연 α-아미노산일 수 있다. 천연 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것, 뿐만 아니라 그로부터 유래된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 시트룰린 및 O-포스포세린이다. 용어 아미노산은 또한 아미노산 유사체 및 모방체를 포함한다. 유사체는 R 기가 천연 아미노산 중에서 발견되는 것이 아님을 제외하고는, 천연 아미노산과 동일한 일반 H2N(R)CHCO2H 구조를 갖는 화합물이다. 유사체의 예는 호모세린, 노르류신, 메티오닌-술폭시드 및 메티오닌 메틸 술포늄을 포함한다. 아미노산 모방체는 α-아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 그와 유사한 방식으로 기능하는 화합물이다. 용어 "비천연 아미노산"은 "D" 입체화학적 형태를 나타내는 것으로 의도되며, 천연 아미노산은 "L" 형태의 것이다.
바람직하게는, 기 C는 프로테아제에 대한 절단 인식 서열인 아미노산 서열을 함유한다. 다수의 절단 인식 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); 및 Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995)]을 참조하고; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
세포에 의한 내재화가 의도되지 않는 접합체의 경우에는, 기 C가 표적 조직 부근의 세포외 매트릭스에 존재하는 프로테아제, 예를 들어 근처의 사멸되는 세포에 의해 방출된 프로테아제 또는 종양-연관 프로테아제에 의해 절단되도록 선택될 수 있다. 예시적인 세포외 종양-연관 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP), 티메트 올리고펩티다제 (TOP) 및 CD10이다.
세포에 의해 내재화되도록 설계된 접합체의 경우에는, 기 C가 바람직하게는 엔도솜 또는 리소솜 프로테아제, 특히 후자에 의해 절단되도록 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 프로테아제의 비제한적인 예는 카텝신 B, C, D, H, L 및 S, 특히 카텝신 B를 포함한다. 카텝신 B는 서열 -AA2-AA1- (여기서 AA1은 염기성 또는 강력한 수소 결합 아미노산 (예컨대, 리신, 아르기닌 또는 시트룰린)이고, AA2는 소수성 아미노산 (예컨대, 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신 또는 이소류신)임), 예를 들어 Val-Cit (여기서 Cit는 시트룰린을 나타냄) 또는 Val-Lys에서의 펩티드를 우선적으로 절단한다. (본원에서, 문맥상 달리 분명하게 나타내지 않는 한, 아미노산 서열은 H2N-AA2-AA1-CO2H에서와 같이 N에서 C 방향으로 기술됨). 카텝신-절단가능한 기에 관한 추가의 정보에 대해서는, 문헌 [Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998); 및 Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002)]을 참조하고, 그의 개시내용은 참조로 포함된다. 펩티딜 링커를 절단하는데 이용될 수 있는 또 다른 효소는 Ala-Ala-Asn에서 우선적으로 절단하는 리소솜 시스테인 프로테아제인 레구마인이다.
한 실시양태에서, 기 C는 2개의 아미노산 서열 -AA2-AA1-을 포함하는 펩티드이고, 여기서 AA1은 리신, 아르기닌 또는 시트룰린이고, AA2는 페닐알라닌, 발린, 알라닌, 류신 또는 이소류신이다. 또 다른 실시양태에서, C는 Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Ala-Asn, Lys, Cit, Ser, 및 Glu로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 아미노산 서열로 이루어진다.
단일 아미노산으로 이루어진 절단가능한 기 C의 제조 및 설계는 US 2010/0113476 A1 (Chen et al.)에 개시되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
기 C는 또한 광절단가능한 것, 예를 들어 광에 노출 시에 절단되는 니트로벤질 에테르일 수 있다.
기 C는 항체 Z 또는 화합물 D에 직접 결합될 수 있으며; 즉 경우에 따라 스페이서 XZ 및 XD가 부재할 수 있다. 예를 들어, 기 C가 디술피드인 경우에, 2개의 황 중 1개는 시스테인 잔기일 수 있거나 또는 항체 Z에 대한 그의 대용물일 수 있다. 또는, 기 C는 항체의 탄수화물 측쇄 상의 알데히드에 결합된 히드라존일 수 있다. 또는, 기 C는 항체 Z의 리신 ε-아미노 기와 함께 형성된 펩티드 결합일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 화합물 D는 화합물 D 내의 카르복실 또는 아민 기에 대한 펩티딜 결합을 통해 기 C에 직접 결합된다.
존재하는 경우에, 스페이서 XZ는 기 C와 항체 Z 사이에, 전자가 후자에 의한 항원 결합을 입체적으로 간섭하거나 또는 후자가 전자의 절단을 입체적으로 간섭하지 않도록 공간적 분리를 제공한다. 또한, 스페이서 XZ는 접합체에 증가된 용해도 또는 감소된 응집 특성을 부여하는데 사용될 수 있다. 스페이서 XZ는 하나 이상의 모듈화된 절편을 포함할 수 있고, 이는 임의의 수의 조합으로 어셈블리될 수 있다. 스페이서 XZ에 적합한 절편의 예는
Figure pct00027
및 그의 조합이며,
여기서 아래첨자 q는 0 또는 1이고, 아래첨자 r은 1 내지 24, 바람직하게는 2 내지 4이다. 이러한 절편은 하기 나타낸 바와 같이 조합될 수 있다.
Figure pct00028
스페이서 XD는, 존재하는 경우에, 기 C와 화합물 D 사이에, 후자가 전자의 절단을 입체적으로 또는 전자적으로 간섭하지 않도록 공간적 분리를 제공한다. 스페이서 XD는 또한 접합체에 부가적인 분자 질량 및 화학적 관능기를 도입하도록 작용할 수 있다. 일반적으로, 부가적인 질량 및 관능기는 접합체의 혈청 반감기 및 다른 특성에 영향을 미칠 것이다. 따라서, 스페이서 기의 신중한 선택을 통해 접합체의 혈청 반감기를 조절할 수 있다. 스페이서 XD는 또한 스페이서 XZ의 맥락에서 상기에 기재된 바와 같이 모듈화된 절편으로부터 어셈블리될 수 있다.
스페이서 XZ 및/또는 XD는, 존재하는 경우에, 바람직하게는 각각 Z 및 C 또는 D 및 C 사이에, 4 내지 25개 원자, 보다 바람직하게는 4 내지 20개 원자의 선형 분리를 제공한다.
스페이서 XZ 또는 XD 중 어느 하나, 또는 둘 다는 자기 희생 모이어티를 포함할 수 있다. 자기 희생 모이어티는 (1) 기 C 및 항체 Z 또는 세포독소 D 중 어느 하나에 결합되고 (2) 기 C로부터의 절단이, 자기 희생 모이어티가 그 자신을 항체 Z 또는 경우에 따라 세포독소 D로부터 결합분리시키게 하는 반응 순서를 개시하도록 하는 구조를 갖는 모이어티이다. 즉, 항체 Z 또는 세포독소 D로부터 떨어져 있는 부위에서의 반응 (기 C로부터의 절단)은 XZ-Z 또는 XD-D 결합의 파열도 야기한다. 자기 희생 모이어티의 존재는 스페이서 XD의 경우에 바람직하며, 이는 접합체의 절단 후 스페이서 XD 또는 그의 일부가 세포독소 D에 부착된 채로 유지되는 경우에, 후자의 생물학적 활성이 손상될 수 있기 때문이다. 자기 희생 모이어티의 사용은 절단가능한 기 C가 폴리펩티드인 경우에 특히 바람직하다.
파트너 분자 D 상의 히드록실 또는 아미노 기에 결합된 예시적인 자기 희생 모이어티 (i)-(v)가 하기에 제시된다.
Figure pct00029
자기 희생 모이어티는 점선 a 및 b 사이의 구조이고, 인접한 구조적 특징은 맥락을 제공하기 위해 나타냈다. 자기 희생 모이어티 (i) 및 (v)는 화합물 D-NH2 (즉, 화합물 D는 아미노 기를 통해 접합됨)에 결합하는 반면, 자기 희생 모이어티 (ii), (iii) 및 (iv)는 화합물 D-OH (즉, 화합물 D는 히드록실 또는 카르복실 기를 통해 접합됨)에 결합한다. 점선 b에서의 아미드 결합의 절단은 아미드 질소를 아민 질소로서 방출하여, 점선 a에서의 결합의 절단 및 D-OH 또는 경우에 따라 D-NH2의 결과적 방출을 발생시키는 반응 순서가 개시된다. 자기 희생 모이어티에 관한 추가의 개시내용에 대해, 문헌 [Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone et al., US 6,214,345 B1 (2001); Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941); Boyd et al., US 7,691,962 B2; Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Sufi et al., WO 2008/083312 A2; Feng, US 7,375,078 B2; 및 Senter et al., US 2003/0096743 A1]을 참조하고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 항체 표적화 모이어티 및 세포독성 화합물 D는 비-절단가능한 링커에 의해 연결된다. 항체의 분해는 결국 링커를 세포독성 화합물 D의 생물학적 활성을 간섭하지 않는 부가된 작은 모이어티로 감소시킨다.
화합물 D - 링커 조성물
본 발명의 접합체는 바람직하게는 먼저 화합물 D 및 링커 (XD)aC(XZ)b (식 중, XD, C, XZ, a, 및 b는 화학식 II에 대해 정의된 바와 같음)를 연결하여, 하기 화학식 III에 의해 나타내어지는 약물-링커 조성물을 형성함으로서 제조된다.
<화학식 III>
Figure pct00030
상기 식에서, R31은 항체 Z 상의 관능기와 반응하여 접합체를 형성하기에 적합한 관능기이다. 적합한 기 R31의 예는 아미노, 아지드, 시클로옥틴,
Figure pct00031
을 포함한다.
상기 식에서, R32는 Cl, Br, F, 메실레이트, 또는 토실레이트이고, R33은 Cl, Br, I, F, OH, -O-N-숙신이미딜, -O-(4-니트로페닐), -O-펜타플루오로페닐, 또는 -O-테트라플루오로페닐이다. 적합한 모이어티 D-(XD)aC(XZ)b-R31 의 제조에 일반적으로 이용가능한 화학반응은 문헌 [Ng et al., US 7,087,600 B2 (2006); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., US 7,129,261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1; Boyd et al., US 7,691,962 B2; Chen et al., US 7,517,903 B2 (2009); Gangwar et al., US 7,714,016 B2 (2010); Boyd et al., US 2008/0279868 A1; Gangwar et al., US 7,847,105 B2 (2010); Gangwar et al., US 7,968,586 B2 (2011); Sufi et al., US 2010/0145036 A1; 및 Chen et al., US 2010/0113476 A1]에 개시되어 있고; 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
바람직하게는 반응성 관능기 -R31은 -NH2, -OH, -CO2H, -SH, 말레이미도, 시클로옥틴, 아지도 (-N3), 히드록실아미노 (-ONH2) 또는 N-히드록시숙신이미도이다. 특히 바람직한 관능기 -R31은
Figure pct00032
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
-OH 기는 항체 상에서, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산 측쇄 상에서 카르복시 기로 에스테르화될 수 있다.
-CO2H 기는 항체 상에서 -OH 기로 에스테르화되거나 또는 아미노 기 (예를 들어, 리신 측쇄 상에서의 것)로 아미드화될 수 있다.
N-히드록시숙신이미드 기는 기능적으로 활성화된 카르복실 기이고, 아미노 기 (예를 들어, 리신으로부터의 것)와의 반응에 의해 편리하게 아미드화될 수 있다.
말레이미드 기는 마이클(Michael) 첨가 반응에서 항체 상에서의 -SH 기 (예를 들어, 시스테인, 또는 술프히드릴 관능기를 도입하기 위한 항체의 화학적 변형으로부터의 것)와 접합될 수 있다.
-SH 기는 상기 기재된 것의 "거울상"인 마이클 첨가 반응에서 항체가 그에 대해 말레이미드 기를 도입하도록 변형되는 접합에 특히 유용하다. 항체는 N-숙신이미딜 4-(말레이미도메틸)-시클로헥산카르복실레이트 (SMCC) 또는 그의 술폰화 변이체인 술포-SMCC (시약은 둘 다 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 입수가능함)를 사용하여 말레이미드 기를 갖도록 변형될 수 있다.
아지드 및 시클로옥틴은, 아지드를 시클로옥틴의 긴장된 알킨 결합을 가로질러 부가하여 1,2,3-트리아졸 고리를 형성하는, 소위 구리-무함유 "클릭 화학반응"을 통해 접합을 수행할 수 있는 상보적 관능기이다. 예를 들어, 문헌 [Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571-6584]을 참조한다. 아지드는 화학식 III 내의 반응성 관능기 R31일 수 있고, 시클로옥틴은 항체 또는 그의 항원 결합 부분 상에 위치할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 시클로옥틴 기는 DIBO 시약 (인비트로젠(Invitrogen)/몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) (오레곤주 유진)로부터 입수가능함)에 의해 제공될 수 있다.
반응성 관능기와의 접합을 위한 관능기를 제공하는 비천연 아미노산을 항체에 도입하는 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 비천연 아미노산인 p-아세틸페닐알라닌을, WO 2008/030612 A2 (2008) (Tian et al.)에 교시되어 있는 바와 같이 항체 또는 다른 폴리펩티드에 혼입시킬 수 있다. p-아세틸페닐알라닌에서의 케톤 기는 히드록실아미노 반응성 관능기와의 옥심 형성에 의한 접합 부위일 수 있다. 대안적으로, 비천연 아미노산 p-아지도페닐알라닌이 항체에 혼합되어 클릭 화학반응을 통해 접합을 위한 아지드 관능기를 제공할 수 있다. 비천연 아미노산은 또한, 문헌 [Goerke et al., US 2010/0093024 A1 (2010) 및 Goerke et al., Biotechnol. Bioeng. 2009, 102 (2), 400-416]에 교시된 바와 같이, 항체 또는 다른 폴리펩티드에 혼입될 수 있다.
아민 (NH2) 기는, 문헌 [Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995-9997]에 교시되어 있는 바와 같이 효소 트랜스글루타미나제를 사용하는 접합에 사용될 수 있다.
접합은, 문헌 [Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10; Ploegh et al., WO 2010/087994 A2 (2010); 및 Mao et al., WO 2005/051976 A2 (2005)]에 교시되어 있는 바와 같이 효소 소르타제 A를 사용하여 이루어질 수도 있다. 소르타제 A 인식 모티프 (전형적으로 LPXTG, 여기서 X는 임의의 천연 아미노산임)는 리간드 Z 상에 위치할 수 있고, 친핵성 수용자 모티프 (전형적으로 GGG)는 화학식 III 내의 기 R31일 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.
화학식 [D(XD)aC(XZ)b]mZ 및 D-(XD)aC(XZ)b-R31 내의 기 D는 바람직하게는 하기 화학식 D-a 또는 화학식 D-b에 따른 구조를 갖는다.
<화학식 D-a>
Figure pct00033
<화학식 D-b>
Figure pct00034
상기 식에서, Y는 H 또는 NO2이고; R4a는 H, Me, 또는 Et이고; R3a 및 R3b는 독립적으로 H, Me, 또는 Et이고; R6은 C1-C5 알킬, CH2OC(=O)C1-C5 알킬, 또는 (CH2)1-2C6H5이다.
이러한 기 D의 예는 하기를 포함한다.
Figure pct00035
상기 식에서, R7은 H, Me, 또는 Et이다.
화학식 D-(XD)aC(XZ)b-R31에 따른 조성물의 예는 바로 아래에 제시된 것, 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
바람직한 약물-링커 화합물은 하기 화학식 III-a에 의해 나타내어진 구조를 갖거나 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 III-a>
Figure pct00040
상기 식에서,
R3a 및 R3b는 독립적으로 H, Me, 또는 Et이고;
R6은 Me, Et, 또는 n-Pr이고;
AAa 및 각각의 AAb는 독립적으로 알라닌, β-알라닌, γ-아미노부티르산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
p는 1, 2, 3, 또는 4이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 (바람직하게는 2, 3, 또는 4)이고;
r은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
s는 0 또는 1이고;
R31은
Figure pct00041
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
화학식 III-a에서, -AAa-[AAb]p-는 길이가 p의 값에 의해 결정되는 폴리펩티드 (예를 들어, p가 1일 때 디펩티드, p가 3일 때 테트라펩티드 등)를 나타낸다. AAa는 폴리펩티드의 카르복시 말단에 있고, 그의 카르복실 기는 약물의 아닐리노 질소와 펩티드 (아미드) 결합을 형성한다. 반대로, 마지막 AAb는 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고, 그의 알파-아미노 기는 s가 1일 때
Figure pct00042
와, s가 0일 때는
Figure pct00043
와 펩티드 결합을 형성한다.
보다 바람직한 약물-링커 화합물은 하기 화학식 III-b에 의해 나타내어지는 구조를 갖거나 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 III-b>
Figure pct00044
상기 식에서,
R6은 Me 또는 n-Pr이고;
q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 (바람직하게는 2, 3, 또는 4)이고;
r은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
s는 0 또는 1이고;
R31은
Figure pct00045
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
접합체의 제조
다음은 상기 기재된 바와 같이 리신 ε-아미노 기를 2-이미노티올란과 반응시킨 후 말레이미드-함유 약물-링커 모이어티와 반응시킴으로써 항체에 유리 티올 기를 도입하는 것에 기반한 예시적인 절차이다. 먼저 항체를 50 mM NaCl 및 2 mM 디에틸렌 트리아민 펜타아세트산 (DTPA)을 함유하는 0.1 M 포스페이트 완충제 (pH 8.0)로 완충제 교환하고, 5-10 mg/mL로 농축시킨다. 2-이미노티올란을 항체에 첨가하는 것을 통해 티올화를 달성한다. 첨가하는 2-이미노티올란의 양은 예비 실험에 의해 결정될 수 있고, 항체마다 다르다. 예비 실험에서, 증가량의 2-이미노티올란의 적정액을 항체에 첨가하고, 항체와 RT (실온, 약 25℃)에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세파덱스(SEPHADEX)™ G-25 칼럼을 사용하여 50 mM pH 6.0 HEPES 완충제로 항체를 탈염시키고, 도입된 티올 기의 수를 디티오디피리딘 (DTDP)과의 반응에 의해 신속하게 결정한다. 티올기의 DTDP와의 반응은 티오피리딘을 유리시키고, 이는 324 nm에서 분광분석에 의해 모니터링할 수 있다. 전형적으로 0.5-1.0 mg/mL 단백질 농도의 샘플을 사용한다. 280 nm에서의 흡광도를 이용하여 샘플 내 단백질 농도를 정확하게 결정할 수 있고, 이어서 각 샘플의 분취액 (0.9 mL)을 0.1 mL DTDP (에탄올 중 5 mM 원액)와 함께 10분 동안 RT에서 인큐베이션한다. 블랭크 완충제 샘플 단독 및 DTDP를 또한 나란히 인큐베이션한다. 10분 후에, 324 nm에서의 흡광도를 측정하고, 티오피리딘에 대한 흡광 계수 19,800 M-1을 이용하여 티올 기의 수를 정량한다.
전형적으로, 항체당 약 3개의 티올 기의 티올화 수준이 바람직하다. 예를 들어, 일부 항체의 경우에, 이는 2-이미노티올란을 15배 몰 과량으로 첨가한 후 RT에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 달성될 수 있다. 이어서, 항체를 2-이미노티올란과 함께 목적하는 몰비로 인큐베이션한 다음, 접합 완충제 (5 mM 글리신 및 2 mM DTPA를 함유하는 50 mM pH 6.0 HEPES 완충제)로 탈염시킨다. 티올화 물질을 얼음 상에 유지시키면서 도입된 티올의 수를 상기에 기재된 바와 같이 정량화한다.
도입된 티올의 수를 검증한 후, 약물-링커 모이어티를 티올당 3배 몰 과량으로 첨가한다. 최종 농도 5%의 디메틸술폭시드 (DMSO) 또는 유사한 대안적 용매를 또한 함유하는 접합 완충제 중에서 접합 반응이 진행되도록 한다. 통상적으로, 약물-링커 원액을 100% DMSO 중에 용해시킨다. 최종 농도를 10%가 되도록 하기에 충분한 DMSO가 첨가된 티올화 항체에 원액을 직접 첨가하거나, 또는 최종 농도 10%의 DMSO를 함유하는 접합 완충제 중에 미리 희석시킨 후, 동등 부피의 티올화 항체를 첨가한다.
접합 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하면서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후에, 접합 반응 혼합물을 원심분리하고, 0.2 μm 필터를 통해 여과한다. 접합체의 정제는 다수의 방법을 사용하여 크로마토그래피를 통해 이루어질 수 있다. 한 가지 방법에서, 접합체는 5 mM 글리신 및 150 mM NaCl을 함유하는 50 mM pH 7.2 HEPES 완충제로 미리 평형화된 세파크릴(SEPHACRYL)™ S200 칼럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피를 이용하여 정제된다. 크로마토그래피는 28 cm/h의 선형 유량으로 수행한다. 접합체를 함유하는 분획을 수집하고, 모으고, 농축시킨다. 대안적 방법에서는, 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제를 달성할 수 있다. 조건은 항체마다 다르며, 각각의 경우에 최적화되어야 한다. 예를 들어, 항체-약물 접합체 반응 믹스를 5mM 글리신을 함유하는 50 mM pH 5.5 HEPES 중에서 미리 평형화된 SP-세파로스(SP-SEPHAROSE)™ 칼럼에 적용한다. 항체 접합체를 평형 완충제 중의 0-1 M NaCl 구배를 이용하여 pH 5.5에서 용리한다. 접합체를 함유하는 적절한 분획을 모으고, 제제 완충제 (5 mM 글리신 및 100 mM NaCl을 함유하는 50 mM pH 7.2 HEPES 완충제)에 대해 투석한다.
통상의 기술자는 상기 기재된 조건 및 방법론이 예시적이고 비제한적이며, 접합을 위한 다른 접근법이 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 발명에서 이용가능하다는 것을 이해할 것이다.
상기 기재된 절차에 의해 제조된 접합체는 화학식 II-1로 나타낸다. 이는 화합물 (III-1) 및 항-메소텔린 항체 6A4 (Terrett et al. 2012)의 접합체이다.
<화학식 II-1>
Figure pct00046
통상의 기술자는 이러한 접합체 제제가 다양한 치환 비, 전형적으로 1 내지 5 범위의 비로 모이어티를 가질 수 있으며, 이러한 제제가 화학식 II-1'로 표시될 수 있다는 것을 이해할 것이다:
<화학식 II-1'>
Figure pct00047
상기 식에서, R6은 Me 또는 n-Pr이고, Ab는 항체이다. 항체는 바람직하게는 항-CD70, 항-메소텔린, 또는 항-글리피칸-3 항체이다.
제약 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제제화된 본 발명의 화합물 또는 그의 접합체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이는 임의로 하나 이상의 추가의 제약 활성 성분, 예컨대 항체 또는 또 다른 약물을 함유할 수 있다. 제약 조성물은 또 다른 치료제, 특히 또 다른 항암제와 조합 요법으로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제는 담체, 표면 활성제, 증점제 또는 유화제, 고체 결합제, 분산 또는 현탁 보조제, 가용화제, 착색제, 향미제, 코팅, 붕해제, 윤활제, 감미제, 보존제, 등장화제 및 그의 조합을 포함한다. 적합한 부형제의 선택 및 사용은 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)]에 교시되어 있다.
바람직하게는, 제약 조성물은 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물은 산의 작용 및 그를 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 그를 보호하는 물질 내에 코팅될 수 있다. 어구 "비경구 투여"는 통상적으로 주사에 의한, 경장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식을 의미하며, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 대안적으로, 제약 조성물은 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내로, 경구로, 질로, 직장으로, 설하로 또는 국소로 투여될 수 있다.
제약 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액 형태일 수 있다. 이는 또한 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도를 달성하는데 적합한 다른 규칙적인 구조로 제제화될 수 있다. 조성물은 또한 투여 전에 물 중 재구성을 위해, 동결건조물 형태로 제공될 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료할 대상체 및 특정한 투여 방식에 따라 달라질 것이며, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로 100%를 기준으로, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합된 활성 성분의 약 0.01% 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 활성 성분의 약 1% 내지 약 30% 범위일 것이다.
투여 요법은 치료 반응이 제공되도록 조절된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수도 있고, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수도 있고, 용량이 상황의 긴급성에 따라 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수도 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. "투여 단위 형태"는 치료할 대상체에 대한 단위 투여량에 적합한 물리적인 이산 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 반응을 생성하도록 계산된 예정량의 활성 화합물을 함유한다.
투여량은 숙주 체중 1kg당 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 통상적으로는 0.01 내지 5 mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg (체중), 1 mg/kg (체중), 3 mg/kg (체중), 5 mg/kg (체중) 또는 10 mg/kg (체중)일 수 있거나, 또는 1-10 mg/kg 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월마다 1회, 3개월마다 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여이다. 바람직한 투여 요법은 하기 투여 스케줄: (i) 6회 투여에 대해 4주마다, 이어서 3개월마다; (ii) 3주마다; (iii) 3 mg/kg (체중)으로 1회, 이어서 3주마다 1 mg/kg (체중) 중 하나를 사용하여, 1 mg/kg (체중) 또는 3 mg/kg (체중)을 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 일부 방법에서, 투여량은 약 1-1000 μg/mL, 일부 방법에서는 약 25-300 μg/mL의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다.
"치료 유효량"의 본 발명의 화합물은 바람직하게는 질환 증상의 중증도를 감소시키거나, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간을 증가시키거나, 또는 질환 고통으로 인한 장애 또는 불능을 예방한다. 예를 들어, 종양-보유 대상체의 치료에서, "치료 유효량"은 바람직하게는 치료하지 않은 대상체에 비해 종양 성장을 적어도 약 20%, 보다 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80% 억제한다. 치료 유효량의 치료 화합물은 전형적으로는 인간이지만 또 다른 포유동물일 수도 있는 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나, 또는 달리 증상을 개선시킬 수 있다.
제약 조성물은 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한, 제어 또는 지속 방출 제제일 수 있다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료 조성물은 (1) 무바늘 피하 주사 장치 (예를 들어, US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 및 4,596,556); (2) 미세-주입 펌프 (US 4,487,603); (3) 경피 장치 (US 4,486,194); (4) 주입 장치 (US 4,447,233 및 4,447,224); 및 (5) 삼투 장치 (US 4,439,196 및 4,475,196)와 같은 의료 장치를 통해 투여될 수 있고; 이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 생체내에서 적절한 분포가 보장되도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 치료 화합물이 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 것을 보장하기 위해, 이들을 리포솜 내에 제제화할 수 있고, 리포솜은 특정 세포 또는 기관 내로의 선택적 수송을 증진시키는 표적화 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, US 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; 및 5,399,331; 문헌 [V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; 및 Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조한다.
용도
본 발명의 화합물 또는 그의 접합체는 질환, 예컨대 비제한적으로 과다증식성 질환, 예컨대 두부, 경부, 비강, 부비동, 비인두, 구강, 구인두, 후두, 하인두, 타액선 및 부신경절종의 종양을 포함하는 두경부암; 간 및 담도계의 암, 특히 간세포성 암종; 장암, 특히 결장직장암; 난소암; 소세포 및 비-소세포 폐암 (SCLC 및 NSCLC); 유방암 육종, 예컨대 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 배아성 횡문근육종, 평활근육종, 신경섬유육종, 골육종, 활막 육종, 지방육종 및 폐포 연부 육종; 백혈병, 예컨대 급성 전골수구성 백혈병 (APL), 급성 골수 백혈병 (AML), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 및 만성 골수 백혈병 (CML); 중추 신경계의 신생물, 특히 뇌암; 다발성 골수종 (MM), 림프종, 예컨대 호지킨 림프종, 림프형질세포양 림프종, 여포성 림프종, 점막-연관 림프성 조직 림프종, 외투 세포 림프종, B-계통 대세포 림프종, 버킷 림프종 및 T-세포 역형성 대세포 림프종을 치료하는데 사용될 수 있다. 임상적으로, 본원에 기재된 방법의 실시 및 조성물의 사용은 암성 성장의 크기 또는 수를 감소시키고/거나 연관된 증상 (적용가능한 경우)을 감소시킬 것이다. 병리학적으로, 본원에 기재된 방법의 실시 및 조성물의 사용은 병리학적 관련 반응, 예컨대 암 세포 증식의 억제, 암 또는 종양 크기의 감소, 추가 전이의 예방, 종양 혈관신생의 억제를 발생시킬 것이다. 이러한 질환의 치료 방법은 치료 유효량의 본 발명의 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 이 방법은 필요에 따라 반복될 수 있다. 특히, 암은 신장암, 폐암, 위암 또는 난소암일 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 그의 접합체는 항체, 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항대사물, DNA 절단제, DNA 가교제, DNA 삽입제, DNA 작은 홈 결합제, 에네디인, 열 쇼크 단백질 90 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 면역조절제, 미세관 안정화제, 뉴클레오시드 (퓨린 또는 피리미딘) 유사체, 핵 유출 억제제, 프로테아솜 억제제, 토포이소머라제 (I 또는 II) 억제제, 티로신 키나제 억제제 및 세린/트레오닌 키나제 억제제를 비롯한 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 특정 치료제는 아달리무맙, 안사미토신 P3, 아우리스타틴, 벤다무스틴, 베바시주맙, 비칼루타미드, 블레오마이신, 보르테조밉, 부술판, 칼리스타틴 A, 캄프토테신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 세툭시맙, 시스플라틴, 클라드리빈, 시타라빈, 크립토피신, 다카르바진, 다사티닙, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 두오카르마이신, 디네마이신 A, 에포틸론, 에토포시드, 플록수리딘, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 게피티닙, 겜시타빈, 이필리무맙, 히드록시우레아, 이마티닙, 인플릭시맙, 인터페론, 인터류킨, β-라파콘, 레날리도미드, 이리노테칸, 메이탄신, 메클로레타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 닐로티닙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 프로카르바진, 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), 6-티오구아니딘, 티오테파, 테니포시드, 토포테칸, 트라스투주맙, 트리코스타틴 A, 빈블라스틴, 빈크리스틴 및 빈데신을 포함한다.
실시예
본 발명의 실시는 또한 하기의 실시예를 참조하여 이해될 수 있으며, 이는 예시로서 제공되는 것으로, 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1 - 화합물 (III-1)
본 실시예는 화합물 (III-1)의 합성 (합한 도 1, 2a-2b, 및 3에 제시된 해당하는 반응식)을 설명한다.
화합물 2. 톨루엔 (150 mL) 중 화합물 1 (6 g, 16.6 mmol; 문헌 [Peltier et al. 2006]에 따라 제조됨) 및 파라포름알데히드 (9.94 g, 331 mmol)의 혼합물을 밀봉된 용기에서 24시간 동안 70℃에서 가열하였다. 박층 크로마토그래피 (TLC)는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 셀라이트(CELITE)™ 필터 매질을 통해 여과하고, 필터 케이크를 톨루엔으로 완전히 세척하였다. 용매를 증발시킨 후에, 조 생성물을 디클로로메탄 (DCM) 중 0-70% 에틸 아세테이트 (EtOAc)의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 4.76 g의 화합물 2를 담황색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 375.2 (M+1).
화합물 3. 염산 (1,4-디옥산 중 4.0 M, 12.24 mL, 50.8 mmol)을 지지체-결합된 시아노보로히드라이드 (MP-BH3CN) 수지 (4.85 g, 12.7 mmol)의 존재 하에 아세토니트릴 (62 mL) 및 메탄올 (6.8 mL) 중 화합물 2 (4.76 g, 12.7 mmol)의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온 (RT)에서 3시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 수지를 여과하고, 아세토니트릴-메탄올 혼합물로 세척하였다. 용매를 증발시킨 후에, 조 생성물을 1% NH4OH를 함유하는 DCM 중 0-10% 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 조 화합물 3을 수득하였다.
생성물 분획을 농축시키고, EtOAc로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 1회 세척하여 잉여량의 암모늄 염을 제거하였다. 수성 분획을 EtOAc로 1회 역추출하였다. 합한 유기 상을 건조시키고, 농축시켜 2.82 g의 화합물 3을 발포성 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 273.2 (M+1).
화합물 4. 중합체-결합된 N-벤질-N-시클로헥실카르보디이미드 (알드리치, 4.5 g, 5.21 mmol)를 DCM (48 mL) 중 화합물 3 (1.42 g, 5.21 mmol), t-부탄올 (0.72 g, 5.32 mmol) 및 Boc-보호된 이소류신 3a (1.27 g, 5.47 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 수지를 여과하고, DCM으로 세척하였다. 여과물을 농축시키고, EtOAc로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 1회 세척하였다. 수용액을 EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 1% NH4OH를 함유하는 DCM 중 0-10% 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 중간체 생성물 3b을 함유하는 분획을 수득하였다.
생성물-함유 분획을 합하고, 농축시키고, EtOAc로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 세척하여 잉여량의 암모늄 염을 제거하였다. 수성 분획을 EtOAc로 1회 역추출하였다. 합한 유기 상을 건조시키고, 농축시켜 중간체 생성물 3b를 백색 고체로 수득하였다.
톨루엔 (50 mL) 중 중간체 생성물 3b를 밀봉된 용기에서 밤새 교반하면서 90℃로 가열하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-100% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 1.3 g의 화합물 4를 담황색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 486.3 (M+1).
화합물 5. 트리플루오로아세트산 (TFA, 26 mL)을 DCM (26 mL) 중 화합물 4의 혼합물에 첨가하였다. RT에서 30분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용액을 농축시키고, EtOAc로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3으로 1회 세척하였다. 수용액을 EtOAc로 2회 역추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 1.03 g의 화합물 5를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 386.3 (M+1).
화합물 6. DCC (0.664 g, 3.22 mmol)를 DCM 중 화합물 5 (1.03 g, 2.68 mmol), (R)-1-메틸피페리딘-2-카르복실산 5a (0.4 g, 2.81 mmol; 문헌 [Peltier et al. 2006]에 따라 제조됨), 및 t-부탄올 (0.369 g, 2.73 mmol)의 혼합물에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 가온하고, RT에서 밤새 교반하였다. 고체를 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 포화 수성 NaHCO3으로 1회 세척하였다. 수용액을 EtOAc로 2회 역추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-20% 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 1.23 g의 화합물 6을 담황색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 511.4 (M+1).
화합물 7. N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 10 mL) 중 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA, 또한 DIPEA로 지칭됨, 0.972 mL, 5.58 mmol), 비스(4-니트로페닐) 카르보네이트 (BNPC, 1.698 g, 5.58 mmol) 및 화합물 6 (0.57 g, 1.116 mmol)의 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-20% 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 0.68 g의 화합물 7을 황색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 676.4 (M+1).
화합물 8. 메탄올 중 메틸아민 (2.0 M, 0.089 mL, 0.178 mmol)을 메탄올 (1 mL) 중 화합물 7 (0.1 g, 0.148 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켜 0.084 g의 화합물 8을 수득하였다. MS: (+) m/z 568.4 (M+1).
화합물 9. 물 (0.5 mL) 중 수산화리튬 (7.09 mg, 0.296 mmol)을 1,4-디옥산 (0.5 mL) 중 화합물 8 (0.084 g, 0.148 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-30% 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.075 g의 화합물 9를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 554.4 (M+1).
화합물 10. 트리에틸아민 (11.73 mL, 84 mmol)을 아세토니트릴 (300 mL) 중 디-t-부틸다카르보네이트 (BOC2O, 10.57 mL, 46.0 mmol) 및 (S)-메틸 2-아미노-3-(4-니트로페닐)프로파노에이트 히드로클로라이드 9a (10 g, 38.4 mmol)의 혼합물에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 가온하고, RT에서 밤새 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 농축시키고, 생성물을 200 mL의 디에틸 에테르에 재용해시켰다. 고체를 여과하고, 여과물을 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-50% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 11.3 g의 Boc 보호된 중간체를 백색 고체로 수득하였다.
Pd/C 촉매 (10 wt.%, 0.85 g, 7.99 mmol)를 MeOH (200 mL) 중 Boc 보호된 중간체 (15 g, 46.2 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 밤새 교반하였다. Pd/C 촉매를 여과하고, 여과물을 농축시켜 13.6 g의 화합물 10을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 195.2 (M+1-Boc).
화합물 11. 피리딘 (5.77 mL, 71.3 mmol)을 DCM (185 mL) 중 벤질 클로로포르메이트 (10.18 mL, 71.3 mmol) 및 화합물 10 (17.5 g, 59.5 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 가온하고, RT에서 밤새 교반하였다. 포화 수성 NaHCO3을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 염수로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-50% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 22.6 g의 화합물 11을 무색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 329.2 (M+1-Boc).
화합물 12. 헥산 (1M, 26.5 mL, 26.5 mmol) 중 디이소부틸알루미늄 히드라이드 (DIBAL-H)를 DCM (39 mL) 중 화합물 11 (5.17 g, 12.07 mmol)의 용액에 -78℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안 교반하였다. 아세트산 (24 mL) 및 톨루엔 (36 mL)을 -78℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 가온하였다. 타르타르산 (10% aq., 69 mL)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 수용액을 헥산 및 EtOAc (v/v 1:1) 혼합물로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-50% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 3.12 g의 화합물 12를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 299.2 (M+1-Boc).
화합물 13. 디부틸(((트리플루오로메틸)술포닐)옥시)보란 (Bu2BOTf, DCM 중 1M, 8.61 mL, 8.61 mmol) 및 DIEA (1.637 mL, 9.40 mmol)를 DCM (7.8 mL) 중 (S)-4-이소프로필-3-프로피오닐옥사졸리딘-2-온 12a (1.450 g, 7.83 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 45분 동안 교반하였다. DCM (7.8 mL) 중 화합물 12 (3.12 g, 7.83 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 -78℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT로 밤새 가온하였다. 인산나트륨 완충제 (pH 7, 29 mL)를 첨가하였다. 수용액을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다.
잔류물을 메탄올 (130 mL)에 재용해시키고, 0℃로 냉각시켰다. 수성 H2O2 (30%, 39.7 mL)를 반응 혼합물에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반하였다. 물 (39 mL)을 첨가하였다. 용매 (MeOH)의 일부를 증발시켰다. 수용액을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 5% NaHCO3 용액 및 염수로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-50% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 4.23 g의 화합물 13을 무색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 484.3 (M+1-Boc).
화합물 14. 디(1H-이미다졸-1-일)메탄티온 (1.5 g, 8.42 mmol)을 THF (20 mL) 중 화합물 13 (2.46 g, 4.21 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 환류시켰다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-50% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 1.25 g의 화합물 14를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 694.3 (M+1).
화합물 15. (E)-2,2'-(디아젠-1,2-디일)비스(2-메틸프로판니트릴) (AIBN, 0.016 g, 0.095 mmol)을 화합물 14 (1.78 g, 2.57 mmol) 및 트리부틸스탄난 (Bu3SnH, 1.380 mL, 5.13 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 환류시켰다 (142℃의 오일조 온도). 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-33% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.84 g의 화합물 15를 담황색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 468.3 (M+1-Boc).
화합물 16. 물 (3.7 mL) 중 LiOH (0.071 g, 2.96 mmol)를 테트라히드로푸란 (THF, 11.4 mL) 중 화합물 15 (0.84 g, 1.480 mmol)의 용액에 첨가하고, 이어서 30% 수성 H2O2 (0.271 mL, 8.88 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반한 후에, 20 mL의 1.33 M 수성 Na2SO3을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 염산 (1 M)을 첨가하여 pH를 2-3으로 조정하였다. 생성된 수성 용액을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-75% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.53 g의 화합물 16을 무색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 357.3 (M+1-Boc).
화합물 17. 진한 염산 (4 방울)을 메탄올 (17.7 mL) 중 2,2-디메톡시프로판 (3.53 mL, 28.7 mmol) 및 화합물 16 (0.53 g, 1.161 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. LCMS는 또한 일부 탈보호된 부산물 16a의 형성을 보여주었다. 용매를 증발시켰다.
트리에틸아민 (2.2 eq., 0.36 mL)을 아세토니트릴 중 상기 잔류물 및 BOC2O (1.2 eq., 304.3 mg)의 용액에 RT에서 첨가하여, 부산물 16a를 다시 보호하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 물 (7 mL)을 첨가하고, 수용액을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-50% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.3 g의 화합물 17을 무색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 371.3 (M+1-Boc).
화합물 18. 메탄올 (6 mL) 중 화합물 17 (0.223 g, 0.474 mmol) 및 Pd/C 10 wt% (20 mg, 0.474 mmol)의 혼합물을 H2 하에 밤새 교반하였다. Pd/C 촉매를 여과하고, 여과액을 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-50% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.112 g의 화합물 18을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 237.2 (M+1-Boc).
화합물 19. DMF (12.4 mL) 중 화합물 18 (0.204 g, 0.606 mmol), N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 0.174 g, 0.910 mmol), 및 Fmoc-보호된 시트룰린 18a (0.361 g, 0.910 mmol)의 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 포화 NH4Cl 용액 (20 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 수용액을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-30% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 0.25 g의 화합물 19를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 716.4 (M+1).
화합물 20. 피페리딘 (0.5 mL, 5.06 mmol)을 DMF (5 mL) 중 화합물 19 (0.25 g, 0.349 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, 용매를 증발시켜 Fmoc-탈보호된 중간체를 잔류물로 수득하였다.
DIEA를 DMF (2 mL) 중 (S)-2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-3-메틸부탄산 19a (0.142 g, 0.418 mmol) 및 N,N,N',N'-테트라메틸-O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU, 0.146 g, 0.383 mmol)의 용액에 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 5분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중 상기 잔류물 및 DIEA를 반응 혼합물에 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 15분 동안 교반한 후에, 8 mL의 0.1% TFA 물을 함유하는 20 mL의 물을 첨가하였다. 수용액을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-20% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.24 g의 화합물 20을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 815.4 (M+1).
화합물 21. 피페리딘 (0.3 mL)을 DMF (3 mL) 중 화합물 20의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다.
물 (2 mL) 중 수산화리튬 (0.028 g, 1.176 mmol)을 THF (4 mL) 중 상기 잔류물의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 4시간 동안 교반한 후에, 수성 HCl (0.1N)을 첨가하여 반응 혼합물을 산성화시켰다 (pH 2-3). 용매를 부분적으로증발시키고, 동결건조시켜 화합물 21을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 579.4 (M+1).
화합물 22. DIEA를 DMF (3 mL) 중 ε-말레이미도카프로산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 21a (도쿄 케미칼 인더스트리(Tokyo Chemical Industry), 64.7 mg, 0.210 mmol) 및 화합물 21 (81 mg, 0.14 mmol)의 혼합물에 pH 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후에, 아세토니트릴 및 0.1% TFA를 함유하는 물의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하였다. 생성물 22를 정제용 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제하였다. MS: (+) m/z 772.5 (M+1).
화합물 23. 2,2,2-트리플루오로아세트산 (0.7 mL, 0.013 mmol)을 DCM (1 mL) 중 화합물 22 (30 mg, 0.039 mmol)의 혼합물에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켜 화합물 23을 수득하였다. MS: (+) m/z 672.4 (M+1).
화합물 (III-1). DIEA를 DMF (1 mL) 중 화합물 9 (23.66 mg, 0.043 mmol) 및 HATU (14.77 mg, 0.039 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중 화합물 23 (26.1 mg, 0.039 mmol) 및 DIEA를 첨가하였다. 반응 용액의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 0.1% TFA를 함유하는 물 및 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 생성물 화합물 (III-1)을 정제용 HPLC에 의해 정제하였다. MS: (+) m/z 1207.7 (M+1).
말레이미도 기를 갖는 화합물, 예컨대 (III-1)은 항체 또는 다른 리간드 상의 술프히드릴 기와의 반응에 의해 접합체를 제조하는데 사용될 수 있다. 술프히드릴 기는 시스테인 잔기로부터의 것 또는 리신 잔기의 2-이미노티올란으로의 유도체화에 의해 수득된 것일 수 있다.
실시예 2 - 화합물 (III-2)
본 실시예는 도 4에 제시된 반응식에 해당하는, 화합물 (III-2)의 합성을 설명한다.
화합물 24. N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (0.556 mL, 3.19 mmol)을 DMF (5 mL) 중 글리신 tert-부틸 에스테르 히드로클로라이드 23a (0.209 g, 1.596 mmol), Fmoc-아민옥시아세트산 23b (0.5g, 1.596 mmol) 및 HATU (0.607 g, 1.596 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, 0.1% 수성 TFA (20 mL)를 첨가하였다. 수용액을 EtOAc로 추출하고, 합한 유기 층을 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-70% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.45 g의 화합물 24를 무색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 449.2 (M+23).
화합물 25. TFA (3 mL, 1.437 mmol)를 DCM (0.5 mL) 중 화합물 24 (0.45 g, 1.055 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-30% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.39 g의 화합물 25를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 371.1 (M+1).
화합물 26. N,N'-메탄디일리덴디시클로헥산아민 (DCC, 0.261 g, 1.267 mmol)을 DCM (6 mL) 중 화합물 25 및 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온 (0.146 g, 1.267 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반한 후에, 고체를 여과하였다. 이어서 여과물을 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-100% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.43 g의 화합물 26을 무색 오일로 수득하였다.
화합물 27. DIEA를 DMF 중 화합물 21 (50 mg, 0.086 mmol) 및 화합물 26 (60.6 mg, 0.130 mmol)의 용액에 RT에서 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 4시간 동안 교반한 후에, 0.1% 수성 TFA 및 아세토니트릴의 1:1 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 정제용 HPLC 정제에 의해 55 mg의 화합물 27을 백색 고체로 수득하였다: MS: (+) m/z 931.4 (M+1).
화합물 28. TFA (1 mL, 0.059 mmol)를 DCM (2 mL) 중 화합물 27 (55 mg, 0.059 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반하였다. 용매를 증발시켰다.
DIEA를 DMF (1 mL) 중 화합물 9 (32.7 mg, 0.059 mmol) 및 HATU (22.47 mg, 0.059 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, DMF (2 mL) 및 DIEA를 첨가하였다. 반응 용액의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 0.1% TFA를 함유하는 물 및 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물 20 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 정제용 HPLC 정제에 의해 70 mg의 화합물 28 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 684.1 (M/2+1).
화합물 (III-2). 피페리딘을 DMF (4 mL) 중 화합물 28 (70 mg, 0.051 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, 아세토니트릴 및 0.1% 수성 TFA (40 mL)의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 정제용 HPLC 정제에 의해 46 mg의 화합물 (III-2)를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 1144.6 (M+1).
히드록실아민 기를 갖는 화합물, 예컨대 (III-2)는, 예를 들어 비천연 아미노산 4-아세틸페닐알라닌의 혼입에 의해, 알데히드 또는 케톤 관능기를 갖는 항체 또는 다른 리간드와 접합체를 형성하는데 사용될 수 있다.
실시예 3 - 화합물 (I-2) 및 (I-3)
화합물 (I-2) 및 (I-3)의 합성이 도 5에 개략적으로 제시된다.
화합물 (I-3). DIEA를 DMF (0.3 mL) 중 화합물 9 (10 mg, 0.018 mmol) 및 HATU (6.87 mg, 0.018 mmol)의 용액에 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, DMF (0.5 mL) 중 화합물 29 (문헌 [Cheng et al. 2011]에 따라 제조됨, 실시예 17; 4.56 mg, 0.018 mmol) 및 DIEA를 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, 아세토니트릴 및 0.1% 수성 TFA의 1:1 혼합물 4 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 정제용 HPLC 정제에 의해 12 mg의 화합물 (I-3) (I-2)를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 788.4 (M+1).
화합물 (I-2). 메탄올 (0.5 mL) 중 화합물 (I-3) (12 mg, 0.015 mmol) 및 Pd/C, 10 wt% (4 mg, 0.015 mmol)의 혼합물 H2 분위기 하에 밤새 교반하였다. 촉매를 여과하고, 여과액을 농축시켰다. 정제용 HPLC 정제에 의해 8.1 mg의 화합물 (I-2)를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 758.4 (M+1).
화합물 (I-1)은 화합물 29를 알파-메틸 위치에 혼합된 입체화학을 갖는 화합물로 대체하여 유사하게 제조될 수 있다 (Cheng et al. 2011).
실시예 4 - 화합물 (III-4)
도 6a 내지 6c는 함께 화합물 (III-4)의 합성을 개략적으로 보여준다.
화합물 32. 화합물 30 (알드리치, 3.5g, 13.9 mmol)을 50 mL DCM에 용해시켰다. 이 용액에 데스-마르틴 퍼아이오디난 (11.8 g, 27.9 mmol)을 5℃에서 첨가하였다. 10분 후에, 혼합물을 RT로 가온하였다. 또 다른 시간 후에 포화 수성 NaHCO3 및 포화 수성 NaS2O3으로 반응을 켄칭하였다. 에테르로 추출한 후에, 에테르 추출물을 수성 NaHCO3 및 이어서 염수로 세척하고, 건조시키고, 증발시켜 점착성 오일을 수득하였다. 오일을 50 mL의 DCM에 용해시키고, 여기에 상업적으로 입수가능한 화합물 31 (5.05 g, 13.93 mmol)을 첨가하였다. 10분 후에, 반응 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 수성 NaHCO3 및 이어서 염수로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 칼럼 크로마토그래피 (EtOAc: 헥산, 0-20% 구배) 후에 화합물 32 (2.3 g, 6.90 mmol, 49.5 % 수율)를 백색 고체로 수득하였다. 이는 문헌 [Wipf et al. 2004a]과 일치하는 NMR 스펙트럼을 가졌다.
화합물 33. 염산 (7.80 mL, 31.2 mmol, 디옥산 중 4M)을 5℃에서 화합물 32 (5.2 g, 15.60 mmol)의 DCM 용액에 첨가하였다. 탈보호 반응이 완료된 후에, 반응 혼합물을 증발시키고, 화합물 33 (4.21 g, 15.60 mmol, 100 % 수율, 히드로클로라이드)을 백색 고체로 수득하였으며, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
화합물 35. 20 mL DMF 중 화합물 34 (문헌 [Sani et al. 2007]에 따라 제조됨, 4.00 g, 11.6 mmol)의 용액에 5℃에서 HATU (4.61 g, 12.12 mmol) 및 DIPEA (6 ml, 34.4 mmol)를 첨가하였다. 10분 후에, 화합물 33 (2.71 g, 11.60 mmol)을 첨가하였다. 또 다른 30분 후에, 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 이를 10% 수성 시트르산, 포화 수성NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 건조 및 여과 후에, 유기 상을 증발시켜 화합물 35 (6.49 g, 11.60 mmol, 100 % 수율, [M+Na]+, 계산치 582.3, 실측치 582.3)를 오일로 수득하였으며, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
화합물 36. NaBH4 (4.66 g, 123 mmol)를 화합물 35 (6.49 g, 11.6 mmol) 및 NiSO4(H2O)6 (6.48 g, 24.66 mmol)의 100 mL 메탄올 용액에 5℃에서 나누어 첨가하였다. (주의: 수소가 발생됨). 30분 후에, 포화 수성 NaHCO3을 첨가한 후에 EtOAc를 첨가하였다. 셀라이트™를 통해 여과한 후에, 유기 상을 수성 상으로부터 분리하고, 염수로 세척하고, 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 화합물 36 (5.6 g, 9.97 mmol, 81 % 수율, [M+1]+, 계산치 562.3, 실측치 562.4)을 수득하였으며, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
화합물 37. 화합물 36 (5.6 g, 9.97 mmol)을 30 mL 피리딘에 5℃에서 용해시켰다. 아세트산 무수물 (4 g, 39.2 mmol)을 이 용액에 첨가하였다. 10분 후에 혼합물을 RT로 가온하였다. 약 1시간 후에 반응 혼합물을 농축시켰다. 생성된 잔류물을 EtOAC에 녹이고, 유기 상을 10% 수성 시트르산, 포화 수성 NaHCO3, 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 화합물 37 (5.8 g, 9.61 mmol, 100 % 수율, [M+1]+, 계산치 604.3, 실측치 604.4)을 수득하였으며, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
화합물 38a 및 38b. 화합물 37 (0.8 g, 1.3 mmol)을 5 mL 메탄올에 -78℃에서 용해시켰다. 이 용액에 NaOMe (331 uL, 1.33 mmol, MeOH 중 4M)를 첨가하였다. 혼합물을 RT로 1시간에 걸쳐 가온하였다. 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 10% 수성 시트르산, 포화 수성 NaHCO3 용액, 및 염수로 세척하였다. 분리된 유기 상을 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 에틸 및 메틸 에스테르 (각각 화합물 38a 및 38b)의 혼합물을 수득하였다. 에스테르의 혼합물은 둘 다 이후의 단계에서 카르복실산으로 가수분해될 때까지 다음 몇 단계 동안 분리하지 않았다.
화합물 40a 및 40b. 상기 반응으로부터의 화합물 38a 및 38b의 혼합물을 20 mL DCM에 용해시켰다. 이 용액에 4-니트로페닐 카르보노클로리데이트 39 (524 mg, 2.6 mmol) 및 피리딘 (210 μl, 2.6 mmol)을 5℃에서 첨가하였다. 온도를 1시간 후에 실온으로 올리고, 메틸아민 (1.950 mL, 3.9 mmol, THF 중 2M)을 첨가하였다. 10분 후에, 용매를 증발시키고, 잔류물을 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시켜 화합물 40a 및 40b (각각 에틸 및 메틸 에스테르; 420 mg, 40a/40b 비 3:1 (HPLC), 2 단계에서 약 53% 수율, [M+1]+: 계산치 603.3, 실측치 603.4 (40a); 계산치 589.3, 실측치 589.4 (40b))의 혼합물을 수득하였다.
화합물 41a 및 41b. 화합물 40a 및 49b의 혼합물 (420 mg, 약 0.68 mmol)을 3 mL DCM에 용해시키고, 여기에 HCl (4.8 mmol, 1.2 mL, 디옥산 중 4N)을 첨가하였다. 1시간 후에 5℃에서 용매를 증발시키고, 화합물 41a (에틸 에스테르) 및 41b (메틸 에스테르)의 혼합물 (약 3:1 비)을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
화합물 43a 및 43b. 화합물 41a 및 41b의 혼합물 (400 mg,
Figure pct00048
0.72 mmol), 화합물 42 (아니켐(Anichem)으로부터 상업적으로 입수가능함, 170 mg, 0.721 mmol) 및 아세트산 (0.041 mL, 0.721 mmol)을 DCM 중에서 5℃에서 혼합하였다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (306 mg, 1.44 mmol)를 첨가하였다. 30분 후에 혼합물을 EtOAc에 녹였다. 7% 수성 K2CO3 및 염수로 세척한 후에, 유기 상을 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피 정제 (MeOH: DCM, 0-7% 구배) 후에, 화합물 43a (에틸 에스테르) 및 43b (메틸 에스테르)를 수득하였다 (310 mg, 대략 0.42 mmol, 대략 58.3 % 수율, 43a:43b 비 약 3:1, [M+1]+, 계산치 738.4, 실측치 738 (43a); 계산치 724.4, 실측치 724 (43b)).
화합물 45a 및 45b. 화합물 43a 및 43b의 혼합물 (310 mg, 대략 0.42 mmol)을 5 mL DCM에 RT에서 용해시켰다. 이 용액에 2,6-디-tert-부틸피리딘 (161 mg, 0.840 mmol) 및 화합물 44 (문헌 [Peltier et al. 2006]에 따라 제조됨, 73.8 mg, 0.420 mmol)의 2 mL DCM 용액을 첨가하였다. 30분 후에, Et3N (58.6 μl, 0.420 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 EtoAc에 녹이고, 이를 10% 수성 시트르산, 포화 수성 NaHCO3 용액 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피 정제 후에, 화합물 45a 및 45b를 점착성 오일로 수득하였다 (294 mg, 대략 0.334 mmol, 80 % 수율, 45a:45b 비 3:1, [M+1]+, 계산치 877.5, 실측치 877 (45a); 계산치 863.5 실측치 863 (45b)).
화합물 46a 및 46b. 화합물 45a 및 45b의 혼합물 (100 mg, 대략 0.114 mmol)을 20 mL MeOH 중 Pd/C (65 mg, 10%)의 현탁액에 첨가하였다. HCl (28.5 μL, 0.114 mmol, 디옥산 중 4M)을 첨가하였다. 플라스크를 탈기시키고, 다시 H2로 채우고, 이 과정을 3회 반복하였다. 2시간 후에 현탁액을 여과하고, 용매를 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 500 uL DMF 중 화합물 5a (19.59 mg, 0.137 mmol), HATU (43.4 mg, 0.114 mmol) 및 DIPEA (49.8 μl, 0.285 mmol)의 현탁액을 5℃에서 첨가하였다. 현탁액이 균질해진 후에, 상기 잔류물을 DMF (1 mL) 용액으로 첨가하였다. 보다 많은 DIPEA를 첨가하여 pH를 약 12로 조정하였다. 10분 후에 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 이를 10% 수성 시트르산, 포화 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 분리된 유기 상을 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 생성된 잔류물을 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시켜 화합물 46a 및 46b (각각 에틸 및 메틸 에스테르, 80 mg, 약 0.082 mmol, 71.9 % 수율, 46a:46b 비 3:1, [M+1]+, 계산치 976.5, 실측치 976.5 (46a); 계산치 962.5, 실측치 962.5 (46b))의 혼합물을 수득하였다.
화합물 47a 및 47b. HCl (256 μl, 1.024 mmol, 디옥산 중 4M)을 화합물 46a 및 46b (200 mg, 0.205 mmol)의 2 mL MeOH 용액에 5℃에서 첨가하였다. 1시간 후에 용액을 증발시키고, 고진공 상에서 밤새 건조시켜 점착성 오일을 수득하였다. 상기 점착성 오일, Fmoc-보호된 시트룰린 18a (81 mg, 0.205 mmol), 및 DIPEA (179 μl, 1.024 mmol)를 RT에서 2 mL DMF에 용해시켰다. 프로필포스폰산 무수물 (T3P, 178 μL, 0.410 mmol, EtOAc 중 2.3 M)을 첨가하였다. 1시간 후에 반응 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 이를 포화 수성 NaHCO3 용액 및 염수로 세척하였다. 분리, 건조 및 증발 후에, 생성된 잔류물을 크로마토그래피 칼럼 (MeOH: DCM, 0-10% 구배)을 통해 통과시켜 화합물 47a 및 47b (각각 에틸 및 메틸 에스테르, 150 mg, 대략 0.119 mmol, 약 58.3 % 수율, 47a:47b 비 3:1, [M+1]+, 계산치 1255.6, 실측치 1255.6 (47a); 계산치 1241.6, 실측치 1241.6 (47b))의 혼합물을 수득하였다.
화합물 49. 화합물 47a 및 47b의 혼합물 (200 mg, 약 0.165 mmol)을 5 mL의 DMF (5% 피페리딘 포함)에 실온에서 용해시켰다. 30분 후에 용액을 증발 건조시켰다. 생성된 잔류물을 Boc-보호된 발린 N-히드록시숙신이미드 에스테르 48 (61.9 mg, 0.198 mmol), 5 mL DMF 및 DIPEA (87 μL, 0.496 mmol)와 혼합하였다. 반응을 밤새 진행시킨 후에, 반응 혼합물을 증발 건조시켰다. 생성된 혼합물을 MeOH, THF 및 물의 혼합물 (1:1:1) 5 mL에 용해시켰다. NaOH를 첨가하였으며, 최종 용액의 pH는 14였다. 반응을 RT에서 밤새 진행시킨 후에, 혼합물을 HCl을 사용하여 pH 3으로 산성화시키고, 고진공하에 증발시켰다. 수득된 고체를 TFA로 처리하고, 10분 후에 혼합물을 증발시키고, 정제용 HPLC 정제 후에 화합물 49 (80 mg, 0.072 mmol, 43.8 % 수율, [M+1]+, 계산치 1104.6, 실측치 1104.6)를 수득하였다.
화합물 (III-4). 화합물 49 (80 mg, 0.072 mmol), 상업적으로 입수가능한 화합물 21a (알드리치, 26.6 mg, 0.087 mmol) 및 DIPEA (38.0 μl, 0.217 mmol)를 2 mL의 DMF에 용해시켰다. 반응을 밤새 진행시킨 후에, 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 주요 이성질체 (15 mg, 16% 수율, 1/2[M+2]2+, 계산치 649.3, 실측치 649.5) 및 부차 이성질체 (3.7 mg, 4% 수율, 1/2[M+2]2+, 계산치 649.3, 실측치 649.5))를 수득하였다. Tup 서브유닛의 알파-메틸에서 천연 튜부리신 입체화학을 갖는 주요 이성질체를 시험적으로 (III-4)로 지정하였으며, 이와 반대되는 입체화학을 갖는 부차 이성질체를 화합물 (III-5)로 지정하였다.
실시예 5 - 화합물 (I-5), (I-6), 및 (I-7)
화합물 46a 및 46b을 HCl로 처리하여 생성된 상기 기재된 점착성 오일의 작은 부분을 화합물 18a에 커플링시키지 않고, 대신 THF, MeOH 및 물의 혼합물 (1:1:1)에 용해시켰다. 반응 혼합물의 pH를 14로 조정하였다. 반응을 밤새 진행시킨 후에, 반응 혼합물의 절반을 증발시키고, 정제용 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 (I-5) (1 m; M+1, 876.6), (I-6) (1 mg; M+1, 862.5) 및 (I-7) (1 mg; M+1, 848.5)를 수득하였다.
실시예 6 - 화합물 (I-1)
화합물 (I-1)의 합성을 위한 반응식이 도 7에 제시된다.
화합물 51. HCl (6 N, 0.2 mL)을 MeOH (1 mL) 중 화합물 50 (Cheng et al. 2011; 50 mg, 0.198 mmol) 및 2,2-디메톡시프로판 (0.244 mL, 1.982 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반한 후에, 용매를 증발시켜 52.8 mg의 화합물 51을 수득하였다. MS: (+) m/z 267.2 (M+1).
화합물 52. MeOH (1 mL) 중 화합물 51 (52.8 mg, 0.198 mmol) 및 탄소상 팔라듐 (10 wt%, 8 mg)의 혼합물을 H2 분위기 하에 밤새 교반하였다. 이어서, 촉매를 여과하고, 용매를 증발시켜 46.9 mg의 화합물 52를 수득하였다. MS: (+) m/z 237.3 (M+1).
화합물 (I-1). DCM (0.5 mL) 중 펜타플루오로페놀 (2.493 mg, 0.014 mmol), 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (2.049 mg, 9.93 μmol), 및 화합물 9 (5 mg, 9.03 μmol)의 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 이어서, 용매를 증발시켰다.
DMF (0.2 mL) 중 생성된 잔류물 (6.50 mg, 9.03 μmol) 및 화합물 52 (4.27 mg, 18.06 μmol)의 용액에 DIEA (1 방울)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, 아세토니트릴 및 0.1% TFA를 함유하는 물의 1:1 혼합물 (4 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 정제용 HPLC 정제에 의해 2.5 mg의 화합물 (I-1)을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 772.5 (M+1).
실시예 6 - 화합물 (I-4)
도 8은 화합물 (I-4)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
DIEA를 DMF (0.3 mL) 중 화합물 9 (10.69 mg, 0.019 mmol) 및 HATU (7.34 mg, 0.019 mmol)의 용액에 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, DMF (0.5 mL) 중 화합물 53 (4 mg, 0.019 mmol; 문헌 [Sani et al. 2007]에 따라 제조됨) 및 DIEA를 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, 아세토니트릴 및 0.1% TFA를 함유하는 물의 1:1 혼합물 (4 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 정제용 HPLC 정제에 의해 12.5 mg의 화합물 (I-4)를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 743.4 (M+1).
실시예 7 - 티오카르바메이트
화학식 I에 따른 화합물 (여기서, W는 S임, 즉 티오카르바메이트)은 하기 도시된 바와 같이, 적합한 전구체, 예컨대 화합물 6 (도 1)을 수소화나트륨에 이어 티오이소시아네이트로 처리하여 제조될 수 있다.
Figure pct00049
실시예 8 - 화합물 (III-6)
화합물 56의 합성을 위한 반응식이 도 9a 및 9b에 제시된다.
화합물 56. 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 0.160 g, 0.778 mmol)를 DCM (5 mL) 중 tert-부틸 1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트 54 (콴타 바이오사이언시스(Quanta Biosciences), 0.25 g, 0.778 mmol) 및 2-(((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)옥시)아세트산 55 (켐-임펙스(Chem-Impex), 0.244 g, 0.778 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반한 후에, 침전물을 여과하였다. 이어서, 여과물을 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-10% 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.30 g의 화합물 56을 무색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 617.4 (M+1).
화합물 57. TFA (2 mL, 0.662 mmol) 중 화합물 56 (0.303 g, 0.491 mmol)의 용액을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 농축시킨 후에, 잔류물을 헥산으로 세척하여 0.28 g의 화합물 57을 수득하였다. MS: (+) m/z 561.3 (M+1).
화합물 58. DCC (0.199 g, 0.963 mmol)를 DCM (5 mL) 중 화합물 57 (0.27 g, 0.482 mmol) 및 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온 (또한, N-히드록시숙신이미드 또는 NHS로 알려져 있음, 0.111 g, 0.963 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반한 후에, 고체를 여과하였다. 이어서, 여과물을 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-100% 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.12 g의 화합물 58을 무색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 658.3 (M+1).
화합물 59. DIEA (2 방울)를 DMF (2 mL) 중 화합물 58 (0.12 g, 0.182 mmol) 및 화합물 21 (0.106 g, 0.182 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, 반응을 아세토니트릴 및 0.1% TFA를 함유하는 물의 혼합물을 첨가하여 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 0.12 g의 화합물 59를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 1121.6 (M+1).
화합물 60. TFA (0.5 mL)를 DCM (1 mL) 중 화합물 59 (20 mg, 0.018 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, 용액을 농축시켜 18.2 mg의 화합물 60을 수득하였다. MS: (+) m/z 1021.6 (M+1).
화합물 61. DIEA를 DMF (0.4 mL) 중 화합물 9 (9.87 mg, 0.018 mmol) 및 HATU (6.78 mg, 0.018 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중 화합물 60 (18.2 mg, 0.018 mmol) 및 DIEA를 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, 0.1% TFA를 함유하는 물 및 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 25 mg의 화합물 61을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 779.0 (M/2+1).
화합물 (III-6). 1 방울의 피페리딘을 DMF (1 mL) 중 화합물 61 (25 mg, 0.016 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, 아세토니트릴 및 0.1% TFA를 함유하는 물의 혼합물을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 20 mg의 화합물 (III-6)을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 668.0 (M/2+1). 화합물 (III-6)은 히드록실아민 기를 갖고, 이는 상기 논의된 바와 같이, 예를 들어 단백질에 도입된 p-아세틸페닐알라닌의 케톤 기와의, 옥심 형성을 통한 접합에 사용될 수 있다.
화합물 (III-6), 및 p-아세틸페닐알라닌 잔기를 함유하도록 변형된 항-메소텔린 항체의 접합체는 3H 티미딘 혼입 검정을 이용하여 N87 위암 세포에 대해 0.14의 EC50을 나타내었다.
한 실시양태에서, 본 발명은 화합물 (III-6), 및 케톤 기를 함유하도록 변형된 항-메소텔린 항체의 접합체를 제공한다. 바람직하게는, 변형은 p-아세틸페닐알라닌 잔기의 항체 폴리펩티드 쇄로의 혼입에 의한 것이다. 또한 바람직하게는, 이와 같이 변형된 항체는 6A4이다.
실시예 9 - 중간체 화합물 69
도 10은 본 발명의 화합물의 합성을 위한 중간체로 사용될 수 있는 화합물 69의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
화합물 63. 화합물 62 (켐-임펙스, 5 g, 23.8 mmol)를 20 mL MeOH 중 SOCl2 (3.47 mL, 47.6 mmol)의 용액에 5℃에서 첨가하였다. 반응을 밤새 진행시킨 후에, 반응 혼합물을 30분 동안 45℃에서 가열하였다. 휘발성 물질을 증발시키고, 잔류물을 20 mL DCM에 용해시켰다. Boc2O (7.8 g, 35.7 mmol)를 첨가하였다. Et3N을 사용하여 용액의 pH를 9로 조정하였다 (습윤 pH 시험지로 시험됨). 몇 시간 후에 반응 혼합물을 EtOAc에 녹였다. EtOAc 용액을 10% 시트르산 용액, 포화 수성 NaHCO3 용액 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고, 분리하고, 증발시켰다. 건조된 유기 상의 증발로부터의 최종 잔류물을 칼럼을 통해 통과시켜 화합물 63 (5 g, 65% 수율, [M+1-Boc]+, 계산치 225.1, 실측치 225.2)을 수득하였다.
화합물 65. 화합물 63 (2 g, 6.2 mmol)의 20 mL DCM 용액에 DIBAL-H (12.4 mL, 12.4 mmol, 1M in DCM)를 -78℃에서 첨가하였다. 30분 후에, MeOH를 이용하여 반응을 켄칭하였다. HCl을 사용하여 용액의 pH를 약 2로 조정하였다. 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 이를 10% 시트르산, 염수로 세척하고, 건조시키고, 분리하고, 증발시켰다. 잔류물을 30 mL의 DCM에 용해시켰다. 화합물 64 (2.4g, 6.2 mmol, US 4,894,386)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 1시간 후에 RT에서 증발시키고, 잔류물을 칼럼을 통해 통과시켜 화합물 65 (2 g, 79% 수율, [M+1-Boc]+, 계산치 307.2, 실측치 307.1)를 수득하였다.
화합물 66. 화합물 65 (600 mg, 1.48 mmol)를 75 mL EtOAc에 RT에서 용해시켰다. 용액을 N2 및 Pd/C (600 mg, 10%)를 채운 플라스크로 옮겼다. 플라스크를 탈기시키고, H2로 채우고, 이러한 사이클을 3회 반복하였다. 1시간 후에, 용액을 여과하고, 증발시켜 화합물 66 (560 mg, 100% 수율, [M+1]+, 계산치 379.3, 실측치 379.3)을 에피머의 혼합물로 수득하였다. 이 혼합물은 나중에까지 분리하지 않았다.
화합물 67. 화합물 66 (1.30 g, 3.43 mmol), Fmoc-보호된 시트룰린 18a (1.6 g, 4.12 mmol) 및 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린 (EEDQ, 1.06 g, 4.3 mmol)을 DCM 및 MeOH의 혼합물 (22 mL, 10:1)에 용해시켰다. 반응을 밤새 진행시킨 후에, 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 칼럼 (MeOH:DCM, 0-5% 구배)을 통해 통과시켜 화합물 67 ([M+1]+, 7계산치 758.4, 실측치 758.4)을 에피머의 혼합물로 (HPLC 분석으로부터
Figure pct00050
4:1) 수득하였다. 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
화합물 68a. 상기 반응으로부터의 화합물 67의 혼합물을 10 mL의 DMF (5% 피페리딘 포함)에 RT에서 용해시켰다. 30분 후에, 혼합물을 증발시키고, 고진공 펌프로 밤새 건조시켰다. 잔류물을 5 mL DMF 중 화합물 48 (1.5 g, 3.45 mmol)과 혼합하였다. Et3N을 사용하여 용액의 pH를 12로 조정하였다. 1시간 후에, 반응 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 이를 10% 시트르산, 포화 수성 NaHCO3 용액 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고, 여과하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 화합물 67의 탈보호와 동일한 방식으로 DMF 중 5% 피페리딘을 사용하여 탈보호시켰다. 이 단계에서 수득한 아민 및 화합물 21a (1 g, 3.27 mmol)를 10 mL의 DMF 중에서 혼합하였다. Et3N을 사용하여 RT에서 용액의 pH를 12로 조정하였다. 반응을 밤새 진행시킨 후에, 혼합물을 EtOAc에 녹이고, 이를 10% 시트르산, 포화 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 유기 상을 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 잔류물을 수득하였다. 잔류물을 레귤러 실리카 칼럼을 통해 통과시켜 화합물 68a 및 68b의 혼합물 (1g, 화합물 66으로부터 35% 수율, [M+1]+, 계산치 828.5, 실측치 828.5)을 수득하였다. 정제용 HPLC 칼럼 상에서 분리한 후에, 600 mg의 주요 에피머를 수득하였다 (시험적으로 화합물 68a로 지정된 구조, 화합물 68b는 부차 에피머로 지정됨).
화합물 69. 화합물 68a (600 mg, 0.72 mmol)를 DCM 및 TFA (1:1)의 5 mL 혼합물에 용해시켰다. 2시간 후에, 반응 혼합물을 증발시켜 화합물 69 (정량적 수율, [M+1], 계산치 672.4, 실측치 672.4)를 수득하였다.
실시예 10 - 중간체 화합물 75
도 11은 본 발명의 화합물의 합성에 사용될 수 있는 중간체 화합물 75의 합성을 위한 반응식을 설명한다.
화합물 71. 화합물 70 (Cheng et al. 2011, 25 mg, 0.044 mmol), N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC, 0.014 mL, 0.088 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 10.78 mg, 0.088 mmol) 및 MeOH (0.036 mL, 0.882 mmol)를 RT에서 혼합하였다. 1시간 후에, 반응 혼합물을 증발시키고, 칼럼을 통해 통과시켜 화합물 71 (10 mg, 39% 수율, M+1, 581.4)을 수득하였다.
화합물 72. 화합물 71 (122 mg, 0.210 mmol, 또 다른 합성 배치로부터 수득함)을 MeOH (2 mL)에 5℃에서 용해시켰다. NaOMe (0.441 mL, 0.221 mmol)를 첨가하였다. 0.5시간 후에 혼합물을 HCl (디옥산 중 4M)로 중화시키고, 증발시켜 화합물 72 (m+1, 539.4)를 수득하였으며, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
화합물 73. 화합물 72 (60 mg, 0.111 mmol)를 DCM (1.5 mL)에 5℃에서 용해시켰다. 0.5 mL DCM 중 피리딘 (0.045 mL, 0.557 mmol), 4-니트로페닐카르보노클로리데이트 72a (67.3 mg, 0.334 mmol, 알드리치)를 서서히 첨가하였다. 반응을 밤새 진행시킨 후에, 혼합물을 증발시키고, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 73 (42 mg, 0.060 mmol, 53.6 % 수율) (m+1, 704.4)을 수득하였다.
화합물 74. 화합물 73 (42 mg, 0.060 mmol)을 DCM (1 mL)에 5℃에서 용해시켰다. 메틸아민 (1.853 mg, 0.060 mmol)을 첨가하였다. 0.5시간 후에, 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 크로마토그래피 칼럼 (MeOH:DCM, 0-15% 구배, 생성물을 7-10%에서 용리함)을 통해 통과시켜 화합물 74 (35 mg, 0.059 mmol, 98 % 수율) (m+1, 596.4)를 수득하였다.
화합물 75. 화합물 74 (93 mg, 0.156 mmol)를 THF (1 mL)에 5℃에서 용해시시켰다. 0.34 mL 물 중 LiOH (7.47 mg, 0.94 mmol)를 첨가하였다. 반응이 종결된 후에, 반응 혼합물을 HCl (디옥산 중 4M)로 중화시키고, 고진공 상에서 건조시켜 화합물 75 (m+1, 582.3)를 수득하였으며, 이를 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다.
실시예 11 - 화합물 (III-7) 및 (III-8)
도 12는 화합물 (III-7) 및 (III-8)의 합성을 위한 반응식을 보여준다.
화합물 (III-7). 화합물 75 (11 mg, 0.019 mmol)를 DMF (0.5 mL) 중에서 HATU (6.83 mg, 0.018 mmol) 및 DIEA (14.86 μl, 0.085 mmol)로 활성화시켰다. 이어서, 화합물 69 (15.24 mg, 0.023 mmol)를 첨가하였다. 10분 후에, 반응 혼합물을 DMSO에 녹이고, 정제용 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 (III-7) (12 mg, 9.71 μmol, 51.4 % 수율) (m+1, 1235.7)을 수득하였다.
화합물 (III-8). 화합물 75 (10 mg, 0.017 mmol)를 DMF (0.5 mL) 중에서 HATU (6.21 mg, 0.016 mmol) 및 DIEA (0.014 mL, 0.077 mmol)로 활성화시켰다. 이어서, 화합물 23 (13.86 mg, 0.021 mmol)을 첨가하였다. 10분 후에, 반응 혼합물을 DMSO에 녹이고, 정제용 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 (III-8) (13 mg, 10.52 μmol, 61.2 % 수율) (m+1, 1235.7)을 수득하였다.
실시예 12 - 화합물 (I-8) 및 (I-9)
이론상, 화합물 (I-8) 및 (I-9)는 화합물 (III-7) 및 (III-8)을 각각 프로테아제 카텝신 B로 처리하여 수득할 수 있으며, 여기서 디펩티드 Val-Cit가 기질 모티프이다. 화합물 (III-7)는, 그의 오르토-아미노 기가, 절단에 대해 보다 큰 입체 장애를 겪을 수도 있다.
Figure pct00051
실시예 13 - 화합물의 생물학적 활성
도 13a 및 13b는 ATP 발광 검정을 이용하여 각각 H226 폐암 및 786-O 신암 세포에 대한 본 발명의 화합물 (I-4) 및 (I-2)의 생물학적 활성을 보여준다. 대조군으로, Tuv 서브유닛에 카르바메이트 기 대신에 아세테이트 기를 함유하는, 독소루비신 및 튜부리신 유사체 화합물 A가 사용되었다. 화합물 A는 문헌 [Cheng et al. 2011]의 교시에 따라 제조될 수 있다.
<화합물 A>
Figure pct00052
H226 세포에 대한 EC50 값은 다음과 같았다: 독소루비신, 115.4 nM; 화합물 A, 2.4 nM; 및 화합물 (I-4), 12.1 nM. 786-O 세포에 대한 EC50 값은 다음과 같았다: 독소루비신, 68.9 nM; 화합물 A, 1.2 nM, 및 화합물 (I-4), 7.1 nM.
도 13c 및 13d는 화합물 (I-5), (I-6), 및 (I-7)에 대한 유사한 유형의 데이터를 제시한다. 비교 화합물은 독소루비신 및 튜부리신 D였다. H226 세포에 대한 EC50 값은 다음과 같았다: 독소루비신, 115.4 nM; 튜부리신 D, 0.05 nM; 화합물 (I-5), 19.5 nM; 화합물 (I-6), 9.9 nM; 및 화합물 (I-7), 15.4 nM. 786-O 세포에 대한 EC50 값은 다음과 같았다: 독소루비신, 68.9 nM; 튜부리신 D, 0.02 nM; 화합물 (I-5), 22.9 nM; 화합물 (I-6), 22.8 nM; 및 화합물 (I-7), 12.5 nM.
종양 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC), (미국 VA 20108, 마나사스, P.O. Box 1549)으로부터 입수하고, ATCC 지침에 따라 배양하였다. ATP 검정을 위해 세포를 3시간 동안 96-웰 플레이트에 1.0 x 103개 세포/웰로 시딩하였다. 화합물의 1:3 연속 희석액을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 24 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다. ATP 플레이트에서의 ATP 수준을 셀타이터-글로(CELLTITER-GLO)® 발광 세포 생존율 키트를 제조업체의 매뉴얼에 따라 사용하여 측정하고, 글로맥스(GLOMAX)® 20/20 발광측정기 상에서 판독하였다 (둘 다 프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨). 프리즘(PRISM)™ 소프트웨어, 버전 4.0 (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software), 미국 캘리포니아주 라 졸라)을 사용하여 EC50 값 - 작용제가 세포 증식을 50%만큼 억제하거나 또는 감소시키는 농도 -을 결정하였다.
실시예 14 - 접합체의 시험관내 활성
도 14는 N87 위암 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC), 미국 VA 20108, 마나사스, P.O. Box 1549)에 대한, 접합체 (II-1)의 시험관내 활성을 보여준다.
3H 티미딘 검정을 위해 세포를 각각 3시간 동안 96-웰 플레이트에서 1.0 x 104개 세포/웰로 시딩하였다. 접합체 (II-1)의 연속의 희석액 (1:3)을 웰에 첨가하였다. 플레이트를 120시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 전체 인큐베이션 기간의 마지막 24시간 동안 웰당 1.0 μCi의 3H-티미딘으로 펄싱하고, 수거하고, 탑 카운트 신틸레이션 카운터(Top Count Scintillation Counter) (팩커드 인스트루먼츠(Packard Instruments), 코네티컷주 메리덴) 상에서 판독하였다. EC50 값 - 작용제가 세포 증식을 최대 억제의 50%만큼 억제하거나 또는 감소시키는 농도 -은 프리즘™ 소프트웨어, 버전 4.0 (그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 라 졸라)을 사용하여 0.2 nM로 결정되었다.
도 13a-13d 및 도 14로부터의 EC50 값을 비교하여 2가지 점을 설명한다. 첫번째는 접합체를 통한 세포독소의 표적화된 전달과 연관된 효력 증진, 및 이어서 접합체의 항체 구성성분의 그의 항원에 대한 결합에 의해 촉진되는 활성 내재화 메카니즘이다 (Schrama et al. 2006). 두번째로, 접합되지 않은 독소는 상대적으로 극성인 화합물이며, 이는 활성 내재화 메카니즘의 부재 하에 세포막을 가로지르는 확산에 어려움이 있어, 보다 높은 (보다 낮은 효력) 측정된 EC50 값을 나타낸다.
실시예 15 - 접합체의 생체내 활성
본 실시예에서, 접합체 (II-1)의 생체내 활성을, Tuv 서브유닛에 카르바메이트 대신 아세테이트를 갖는 것을 제외하고는 접합체 (II-1)과 구조적으로 동일한 접합체 B (Cheng et al. 2011)의 생체내 활성과 비교하였다.
접합체 B
Figure pct00053
0.1 mL 포스페이트 완충 염수 ("PBS") 및 0.1 mL 매트리겔에 재현탁된 5백만개 OVCAR3 난소암 세포를 SCID 마우스의 옆구리 영역에 피하로 이식하였다. 28일 후에 종양 측정을 시작하고, 마우스를 각각 종양의 LWH/2에 의해 추정된 60 mm3의 평균 종양 크기를 갖는 7마리 마우스의 군으로 무작위로 분류하였다. 종양 이식 29일 후에, 마우스에게 시험 화합물을 단독으로 복강내로 투여하였다. 도 15는, OVCAR3 이종이식편의 경우에, 접합체 (II-1)이 접합체 B보다 더 효과적으로 종양 성장을 억제한다는 것을 보여준다. 20일 이후의 차이가 특히 주목할만하다.
도 16a, 16b, 17a, 17b, 18a, 18b, 19a, 19b, 및 20은 필요한 변경을 가한 상기 기재된 프로토콜마다 생성되는, 본 발명의 접합체에 대한 추가의 생체내 효능 데이터를 제시한다.
도 16a는 화합물 (III-1)의 항-CD70 항체 1F4 또는 항-메소텔린 항체 6A4와의 일련의 접합체에 대한 OVCAR3 (난소암) 종양 부피 대 시간의 데이터를 보여준다. 범례는, 순서대로, DAR (예를 들어, "2.7") 및 투여량 (μmol/kg) (예를 들어, "0.1")을 제공한다. 각각의 경우에, 투여 방식은 복강내, 단일 투여 (SD)였으나, 예외로 마지막 데이터 세트 (◆)에서 접합체는 Q7Dx3 투여되었다. 도 16b는 동일한 실험에서의 체중 변화를 보여준다.
인간 모노클로날 항체 6A4의 제조 및 특성화는 문헌 [Terrett et al. 2012]에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 항체 6A4에 대한 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 VK CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열은 각각 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 및 서열 6으로 주어진다. 항체 6A4에 대한 가변 영역 VH 및 VK 서열은 각각 서열 7 및 서열 8로 제공된다.
인간 모노클로날 항체 1F4의 제조 및 특성화는 문헌 [Coccia et al. 2010]에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 항체 1F4에 대한 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 VK CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열이 각각 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 및 서열 14로 주어진다. 항체 1F4의 가변 영역 VH 및 VK 서열은 각각 서열 15 및 서열 16으로 제공된다.
도 17a 및 17b는 화합물 (III-8) 및 항-메소텔린 항체 6A4의 접합체를 사용하는 유사한 실험에 대한 결과를 제시한다. 각각의 경우에, 단일 용량은 복강내로 투여되었다.
H226 (폐암) 종양에 대한 화합물 (III-1) 및 항-메소텔린 항체 6A4의 접합체의 효능이 도 18a 및 18b에 제시되며, 여기서 DAR 및 투여량 정보는 범례에서 다시 확인할 수 있다. 각각의 경우에, 접합체는 단일 용량으로 복강내로 투여되었다.
도 19a 및 19b는 화합물 (III-8) 및 항-메소텔린 항체 6A4의 접합체에 대한 H226 데이터를 제시한다. 제1 데이터 세트 (●)에서 투여는 단일 용량이고, 마지막 2개의 데이터 세트 (▼ 및 ◆)에서 투여 요법은 Q7Dx3이었다.
도 20은 화합물 (III-1)의 항-메소텔린 항체 6A4 또는 항-CD70 항체 1F4와의 접합체의 N87 위암 종양에 대한 효능 데이터를 보여준다.
항체는, 특히 접합체에 사용되는 경우에, 천연 불변 영역, 또는 ADCC와 같은 이펙터 기능을 감소시키거나 또는 제거하도록 설계된 조작된 (변형된) 불변 영역을 가질 수 있다. 이러한 변형된 항체 불변 영역의 예는 서열 25 및 서열 26의 폴리펩티드에 의해 제공된다. 서열 25는 특정 아미노산 치환을 사용하여 변형된 IgG4 이소형의 불변 영역이다. 서열 26은 하이브리드 IgG1/IgG4 불변 영역이다. 서열 25 및 서열 26 둘 다에서 C-말단 리신의 존재는 임의적이다.
실시예 16 - 안정성 연구
본 실시예에서, 각각 카르바메이트 및 아세테이트 기를 갖는 접합체 (II-1) 및 접합체 B의 마우스 혈청 안정성을 비교하였다.
접합체를 마우스에 0.1 μmol/kg의 용량으로 주사하였다. 접합체 (II-1)의 경우에, 투여 농도는 3.4 mg/mL이었으며, 접합체는 4.2의 치환 비 (SR)를 가졌다. 접합체 B의 경우에, 투여 농도는 1.2 mg/mL이었고, SR은 2.3이었다. 분석을 위해 3마리 동물 각각으로부터 대략 100 uL의 혈청을 각각의 시점에서 채취하였다.
상이한 동물로부터의 혈청 샘플을 모아, 각각의 시점에서 200-300 uL를 만들었다. 모은 부피를 원심분리하여 고체를 제거하고, 상청액을 분석에 사용하였다. 접합체를 세파로스(SEPHAROSE)™ 비드에 커플링된 항-이디오타입 모노클로날 항체를 사용하는 면역-친화도 포획에 의해 혈청으로부터 단리하였다. 포획 후에, 접합체를 낮은 pH에 대한 노출에 의해 용리하고, 이어서 트리스 염기로 중화시켰다. 접합체 상에 존재하는 세포독소는 Cit-Val 펩티드 링커를 절단하도록 활성화된 카텝신 B의 첨가에 의해 방출되었다. 카텝신 B 소화를 37℃에서 3시간 동안 수행하고, 이어서 1 부피의 냉각된 메탄올을 첨가하였다. 용매-추출된 세포독소를 ESI-TOF MS를 이용하여 LC-MS에 이어 역상 크로마토그래피를 이용하는 UPLC (액퀴티(Acquity) HSS T3 2.1 X 50mm)에 의해 분석하였다.
접합체 (II-1)의 경우, 카르바메이트 기의 가수분해로부터의 히드록실 화합물의 존재가 240시간까지의 시점에 걸쳐 검출되지 않았다. 오직 카르바메이트 화합물이 검출되었다.
반대로, 접합체 B의 경우, 6시간 후에 가수분해 생성물이 검출가능하였으며, 72시간까지 약 50 퍼센트 가수분해가 발생하였다. 하기 표 2는 각각의 이중 하전된 이온에 대한 질량 스펙트럼 강도에 기초하여 아세테이트 및 히드록실 화합물의 상대량을 보여준다 (M[H2+] 372.2 Da 및 351.2 Da).
Figure pct00054
[표 2]
Figure pct00055
이러한 결과는 Tuv 서브유닛의 아세테이트 기의 대체 (그러나, 여전히 실질적인 생물학적 활성을 보유함)가 훨씬 더 안정한 화합물을 생성한다는 것을 보여준다.
실시예 17 - 화합물 72a, 72b, 및 72c
본 실시예는 카르바메이트 기에 구조적 변이를 갖는 본 발명의 화합물의 제조 및 특성을 설명한다. 합성 반응식에 대해 도 21을 참조한다.
화합물 70a. MeOH 중 암모니아 (2M, 0.089 mL, 0.178 mmol)를 MeOH (2 mL) 중 화합물 7 (0.1 g, 0.148 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-15% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 55 mg의 화합물 70a를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 554.3 (M+1).
화합물 71a. 물 (0.5 mL) 중 LiOH (4.41 mg, 0.184 mmol)를 THF (1 mL) 중 화합물 70a (51 mg, 0.092 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-30% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 47 mg의 화합물 71a를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 540.3 (M+1).
화합물 72a. DIEA (6.45 μL, 0.037 mmol)를 DMF (0.5 mL) 중 화합물 71a (20 mg, 0.037 mmol) 및 HATU (14.09 mg, 0.037 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중 화합물 23 (24.9 mg, 0.037 mmol) 및 DIEA (6.45 μL, 0.037 mmol)를 첨가하였다. 반응 용액의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 또 다른 20분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 0.1% TFA를 함유하는 물 및 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 35.2 mg의 화합물 72a를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 1193.6 (M+1). 화합물 72a는 또한 상기에서 화합물 (III-9)로 지칭된다.
화합물 72a 및 항-CD70 항체 1F4의 접합체는 786-O 신암 세포에 대해 0.19 nM의 EC50을 나타내었다. 화합물 72a 및 항-메소텔린 항체 6A4의 접합체는 N87 위암 세포에 대해 0.16 nM의 EC50을 나타내었다. 두 경우에, 3H-티미딘 혼입 검정이 이용되었다.
화합물 70b. DMF (1.8 mL) 중 화합물 7 (0.1 g, 0.148 mmol) 및 아닐린 (0.041 mL, 0.444 mmol)의 용액을 50℃에서 밤새 가열하였다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-15% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 58 mg의 화합물 5를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 630.4 (M+1).
화합물 71b. 물 (0.5 mL) 중 LiOH (4.03 mg, 0.168 mmol)를 THF (1 mL) 중 화합물 70b (53 mg, 0.084 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-30% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 43 mg의 화합물 71b를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 616.3 (M+1).
화합물 72b. DIEA (5.66 μL, 0.032 mmol)를 DMF (0.5 mL) 중 화합물 71b (20 mg, 0.032 mmol) 및 HATU (12.35 mg, 0.032 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중 화합물 23 (21.82 mg, 0.032 mmol) 및 DIEA (5.66 μL, 0.032 mmol)를 첨가하였다. 반응 용액의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 또 다른 20분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 0.1% TFA를 함유하는 물 및 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 35 mg의 화합물 72b를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 1269.7 (M+1). 화합물 72b는 또한 상기에서 화합물 (III-10)으로 지칭된다.
화합물 72b 및 항-CD70 항체 1F4의 접합체는 786-O 신암 세포에 대해 0.58 nM의 EC50을 나타내었다. 화합물 72b 및 항-메소텔린 항체 6A4의 접합체는 N87 위암 세포에 대해 0.47의 EC50을 나타내었다. 두 경우에 3H 티미딘 혼입 검정이 이용되었다.
화합물 70c. DMF 중 디메틸아민 (1 mL, 0.148 mmol)을 DMF (1 mL) 중 화합물 7 (0.1 g, 0.148 mmol)의 용액에 반응이 완료되기까지 RT에서 적가하였다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-15% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 56 mg의 화합물 70c를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 582.3 (M+1).
화합물 71c. 물 (0.5 mL) 중 LiOH (8.23 mg, 0.344 mmol)를 THF (1 mL) 중 화합물 70c (0.1 g, 0.172 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-30% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 50.8 mg의 화합물 71c를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 568.3 (M+1).
화합물 72c. DIEA (6.14 μL, 0.035 mmol)를 DMF (0.5 mL) 중 화합물 71c (20 mg, 0.035 mmol) 및 HATU (13.39 mg, 0.035 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중 화합물 23 (23.67 mg, 0.035 mmol) 및 DIEA (6.14 μL, 0.035 mmol)를 첨가하였다. 반응 용액의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 또 다른 20분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 0.1% TFA를 함유하는 물 및 0.1% TFA를 함유하는 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 23.8 mg의 화합물 72c를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 1221.6 (M+1). 화합물 72c는 또한 상기에서 화합물 (III-11)로 지칭된다.
화합물 72c 및 항-CD70 항체 1F4의 접합체는 786-O 신암 세포에 대해 0.32 nM의 EC50을 나타내었다. 화합물 72c 및 항-메소텔린 항체 6A4의 접합체는 N87 위암 세포에 대해 0.34 nM의 EC50을 나타내었다. 두 경우에 3H 티미딘 혼입 검정이 이용되었다.
실시예 18 - 화합물 75a, 75b, 및 75c
본 실시예는 부착된 링커 모이어티가 없는 이전 실시예의 튜부리신 유사체의 제조를 설명한다. 합성 반응식에 대해 도 22를 참조한다.
화합물 73. 물 (5 mL) 중 LiOH (0.071 g, 2.97 mmol)를 THF (5 mL) 중 화합물 18 (0.25 g, 0.743 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반한 후에, 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-20% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.22 g의 화합물 73을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 223.3 (M+1-Boc).
화합물 74. 1,4-디옥산 (4 mL, 0.620 mmol) 중 화합물 73 (0.2 g, 0.620 mmol) 및 4N HCl의 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 백색 고체 화합물 74를 헥산으로 2회 세척하였다. MS: (+) m/z 223.3 (M+1).
화합물 75a. DIEA (3.23 μL, 0.019 mmol)를 DMF (0.5 mL) 중 화합물 71a (10 mg, 0.019 mmol) 및 HATU (7.05 mg, 0.019 mmol)의 용액에 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, DMF (0.5 mL) 중 DIEA (3.23 μL, 0.019 mmol) 및 화합물 74 (5.35 mg, 0.024 mmol)를 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 아세토니트릴 및 0.1 % TFA를 함유하는 물의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 6.0 mg의 화합물 75a를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 744.4 (M+1). 화합물 75a는 또한 상기에서 화합물 (I-10)으로 지칭된다.
화합물 75a는 ATP 발광 검정을 이용하여, N87 위암 세포에 대해 75.8 nM의 EC50을 나타내었다.
화합물 75b. DIEA (2.83 μL, 0.016 mmol)를 DMF (0.5 mL) 중 화합물 71b (10 mg, 0.016 mmol) 및 HATU (6.17 mg, 0.016 mmol)의 용액에 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, DMF (0.5 mL) 중 DIEA (2.83 μL, 0.016 mmol) 및 화합물 74 (4.69 mg, 0.021 mmol)을 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 아세토니트릴 및 0.1 % TFA를 함유하는 물의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 7.6 mg의 화합물 75b를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 820.4 (M+1). 화합물 75b는 또한 상기에서 화합물 (I-11)로 지칭된다.
화합물 75b는 ATP 발광 검정을 이용하여, N87 위암 세포에 대해 0.39 nM의 EC50을 나타내었다.
화합물 75c. DIEA (3.07 μL, 0.018 mmol)를 DMF (0.5 mL) 중 화합물 71c (10 mg, 0.018 mmol) 및 HATU (6.70 mg, 0.018 mmol)의 용액에 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, DMF (0.5 mL) 중 DIEA (3.07 μL, 0.018 mmol) 및 화합물 74 (5.09 mg, 0.023 mmol)를 pH를 8-9로 조정하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 아세토니트릴 및 0.1 % TFA를 함유하는 물의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 7.6 mg의 화합물 75c를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 772.5 (M+1). 화합물 75c는 또한 상기에서 화합물 (I-12)로 지칭된다.
화합물 75c는 ATP 발광 검정을 이용하여, N87 위암 세포에 대해 5.4 nM의 EC50을 나타내었다.
실시예 19 - 화합물 80
본 실시예는 파트너 분자 내의 아지드 기와 반응할 수 있는 시클로옥틴 기를 갖는, "클릭" 화학반응을 통한 접합에 적합한 화합물 80의 합성을 설명한다. 해당하는 합성 반응식이 도 23에 제시된다.
화합물 77. DCC (22.40 mg, 0.109 mmol)를 DCM (1 mL) 중 DBCO-PEG4-산 76 (50 mg, 0.090 mmol, 클릭 케미스트리 툴스(Click Chemistry Tools) (아리조나주 스코츠데일)로부터 구입) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS, 20.83 mg, 0.181 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반하였다. 고체를 여과하고, 여과액을 농축시켜 화합물 77을 수득하였다. MS: (+) m/z 650.3 (M+1).
화합물 78. DIEA를 DMF (1 mL) 중 화합물 77 (58.8 mg, 0.091 mmol) 및 화합물 21 (57.6 mg, 0.100 mmol)의 용액에 pH를 8-9로 조정하면서 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 20 mg의 화합물 78을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 1113.6 (M+1).
화합물 79. TFA (0.5 mL, 6.53 mmol)를 DCM (1 mL) 중 화합물 78 (17.2 mg, 0.015 mmol)의 혼합물에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켜 화합물 79를 수득하였다. MS: (+) m/z 1013.5 (M+1).
화합물 80. DIEA (2.96 μL, 0.017 mmol)를 DMF (0.4 mL) 중 화합물 9 (8.55 mg, 0.015 mmol) 및 HATU (5.87 mg, 0.015 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중 화합물 79 (15.65 mg, 0.015 mmol) 및 DIEA (2.96 μL, 0.017 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 또 다른 20분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DMSO 1 mL에 재용해시키고, 정제용 HPLC에 의해 정제하여 화합물 80을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 775.0 (M/2+1). 화합물 80은 또한 상기에서 화합물 (III-12)로 지칭된다.
화합물 80, 및 다양한 위치에서 아지드 기를 갖도록 변형된 항-글리피칸 3 항체 4A6의 7개 변이체의 접합체는, 3H 티미딘 혼입 검정을 이용하여, N87 위암 세포에 대해 1.4, 0.17, 0.13, 0.22, 0.14, 0.064, 및 0.25 nM의 EC50을 나타내었다.
항체 4A6의 제조 및 특성화는 문헌 [Terrette et al. 2010]에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 항체 4A6에 대한 VH CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 VK CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열이 각각 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 및 서열 22로 주어진다. 가변 영역 VH 및 VK 서열을 각각 서열 23 및 서열 24로 제공된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 화합물 80, 및 아지드 기를 포함하도록 변형된 폴리펩티드 (바람직하게는, 항체)의 접합체를 제공한다.
실시예 20 - 화합물 88
본 실시예는 접합에 사용될 수 있는 알킬 1급 아민 관능기를 갖는 화합물 88의 합성을 설명한다. 도 24의 합성 반응식을 참조한다.
화합물 82. DMF (3 mL) 중 tert-부틸 1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트 54 (0.285 g, 0.888 mmol, VWR로부터 구입; 또한 실시예 8 참조) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 6-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)헥사노에이트 81 (0.4 g, 0.888 mmol, 켐-임펙스로부터 구입)의 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0-10% MeOH의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.4 g의 화합물 82를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 657.4 (M+1).
화합물 83. TFA (2 mL, 0.393 mmol) 중 화합물 82 (0.258 g, 0.393 mmol)의 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 화합물 83 (백색 고체)을 헥산으로 2회 세척하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계 반응에 사용하였다.
화합물 84. DCC (0.162 g, 0.786 mmol)를 DCM (5 mL) 중 화합물 83 (0.236 g, 0.393 mmol) 및 NHS (0.090 g, 0.786 mmol)의 혼합물에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 교반한 후에, 고체를 여과하고, 여과액을 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 중 0-100% EtOAc의 구배를 사용하는 실리카 겔로부터의 플래쉬 크로마토그래피 용리에 의해 정제하여 0.195 g의 화합물 84를 무색 오일로 수득하였다. MS: (+) m/z 698.3 (M+1).
화합물 85. DIEA를 DMF (1.5 mL) 중 화합물 21 (0.162 g, 0.279 mmol) 및 화합물 84 (0.195 g, 0.279 mmol)의 용액에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, 아세토니트릴 및 0.1% TFA를 함유하는 물의 1:1 혼합물 6 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 0.292 g의 화합물 85를 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 1161.6 (M+1).
화합물 86. TFA (0.5 mL)를 DCM (1 mL) 중 화합물 85 (22.1 mg, 0.019 mmol)의 혼합물에 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 20분 동안 교반한 후에, 용매를 증발시켜 화합물 86을 수득하였다. MS: (+) m/z 1061.6 (M+1).
화합물 87. DIEA를 DMF (0.4 mL) 중 화합물 9 (10.53 mg, 0.019 mmol) 및 HATU (7.23 mg, 0.019 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, DMF (1 mL) 중 화합물 86 (20.19 mg, 0.019 mmol) 및 DIEA를 첨가하였다. 반응 용액의 pH를 8-9로 조정하였다. 반응 혼합물을 RT에서 10분 동안 교반한 후에, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 물 (0.1% TFA) 및 아세토니트릴의 1:1 (v/v) 혼합물 10 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 27.3 mg의 화합물 87을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 799.1 (M/2+1).
화합물 88. 피페리딘을 DMF (2 mL) 중 화합물 87 (27.3mg, 0.017 mmol)의 용액에 pH를 9-10로 조정하면서 RT에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반한 후에, 아세토니트릴 및 0.1 % TFA를 함유하는 물의 1:1 혼합물 6 mL를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 조 생성물을 정제용 HPLC에 의해 정제하여 22.5 mg의 화합물 88을 백색 고체로 수득하였다. MS: (+) m/z 688.1 (M/2+1). 화합물 88은 또한 상기에서 화합물 (III-13)으로 지칭된다.
한 실시양태에서, 화합물 88의 알킬 1급 아민과 폴리펩티드 내의 아미노산 - 바람직하게는 글루탐산 -의 측쇄 잔기 상의 카르복실 기 사이의 아미드 형성을 통해, 화합물 88이 바람직하게는 항체인 폴리펩티드에 접합된 접합체가 제공된다. 본 발명은 또한 효소 트랜스글루타미나제의 존재 하에 화합물 88 및 폴리펩티드를 합하는 것을 포함하는 이러한 접합체의 제조 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정한 부분 또는 측면과 주로 또는 배타적으로 관련된 구절을 포함한다. 이는 명료성 및 편의성을 위한 것이고, 특정한 특징은 개시된 구절 이상으로 관련될 수 있으며, 본원의 개시내용은 상이한 구절에서 발견된 적절한 모든 정보의 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 유사하게, 본원의 다양한 도면 및 설명은 본 발명의 구체적 실시양태와 관련되어 있지만, 구체적인 특징이 특정한 도면 또는 실시양태의 맥락에서 개시되는 경우에, 이러한 특징은 또한 적절한 정도로, 또 다른 도면 또는 실시양태의 맥락에서, 또 다른 특징과 조합하여, 또는 일반적으로 본 발명에 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명은 특히 특정의 바람직한 실시양태와 관련하여 기재되어 있지만, 본 발명은 이러한 바람직한 실시양태로 제한되지는 않는다. 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 규정된다.
참고문헌
본 명세서에서 앞서 제1 저자 (또는 발명자) 및 날짜에 의해 요약된 방식으로 인용된 참고문헌에 대한 완전한 인용문이 하기 제공된다. 이들 참고문헌은 각각 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 하기 또는 본 명세서의 임의의 곳에서의 참고문헌의 인용이 이러한 참고문헌을 선행 기술로 승인하는 것은 아니다.
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
서열 목록
본원에 개시되는 핵산 및/또는 아미노산 서열을 포함하는, 서열 1 내지 서열 26을 포함하는 "SEQT_12026WOPCT.txt"로 명명된 서열 목록은 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 서열 목록은 EFS-Web를 통해 ASCII 텍스트 포맷으로 첨부 제출되었으며, 이에 따라 지면 및 그의 컴퓨터 판독가능한 형태들 둘 다 구성한다. 서열 목록은 2104년 1월 4일에 PatentIn 3.5를 이용하여 처음 생성되었으며, 대략 15 KB 크기이다.
하기 표 3은 본원에 개시된 서열의 설명을 요약한다.
[표 3]
Figure pct00059
SEQUENCE LISTING <110> Bristol-Myers Squibb Company <120> TUBULYSIN COMPOUNDS, METHODS OF MAKING AND USE <130> 12026-WO-PCT <150> US 61/764825 <151> 2013-02-14 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile Tyr Gly Met His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Arg Ile Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ile Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ser Tyr Trp Ile Ala 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Arg Ala Val Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr 1 5 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Arg Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Val Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Antibody Constant Region <400> 25 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 26 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Antibody Constant Region <400> 26 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Phe Asp Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 330

Claims (15)

  1. 하기 화학식 I에 의해 나타내어진 구조를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 I>
    Figure pct00060

    상기 식에서,
    R1은 H, 비치환되거나 또는 치환된 C1-C10 알킬, 비치환되거나 또는 치환된 C2-C10 알케닐, 비치환되거나 또는 치환된 C2-C10 알키닐, 비치환되거나 또는 치환된 아릴, 비치환되거나 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C2-C10 알키닐), (CH2)1- 2OC(=O)(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1- 2OC(=O)(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2OC(=O)(C2-C10 알키닐), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C2-C10 알키닐), 비치환되거나 또는 치환된 시클로지방족, 비치환되거나 또는 치환된 헤테로시클로지방족, 비치환되거나 또는 치환된 아릴알킬, 또는 비치환되거나 또는 치환된 알킬아릴이고;
    R2는 H, 비치환되거나 또는 치환된 C1-C10 알킬, 비치환되거나 또는 치환된 C2-C10 알케닐, 비치환되거나 또는 치환된 C2-C10 알키닐, 비치환되거나 또는 치환된 아릴, 비치환되거나 또는 치환된 헤테로아릴, 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2O(C2-C10 알키닐), (CH2)1- 2OC(=O)(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1- 2OC(=O)(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 (CH2)1-2OC(=O)(C2-C10 알키닐), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C1-C10 알킬), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C2-C10 알케닐), 비치환되거나 또는 치환된 C(=O)(C2-C10 알키닐), 비치환되거나 또는 치환된 시클로지방족, 비치환되거나 또는 치환된 헤테로시클로지방족, 비치환되거나 또는 치환된 아릴알킬, 비치환되거나 또는 치환된 알킬아릴, 또는
    Figure pct00061
    이고;
    여기서 각각의 R2a는 독립적으로 H, NH2, NHMe, Cl, F, Me, Et, 또는 CN이고;
    R3a 및 R3b는 독립적으로 H, C1-C5 알킬, CH2(C5-C6 시클로알킬), CH2C6H5, C6H5, 또는 CH2CH2OH이고;
    R4는
    Figure pct00062
    이고;
    여기서 R4a는 H 또는 C1-C3 알킬이고; Y는 H, OH, Cl, F, CN, Me, Et, NO2, 또는 NH2이고;
    R5는 H, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐, CO(C1-C5 알킬), CO(C2-C5 알케닐), 또는 CO(C2-C5 알키닐)이고;
    W는 O 또는 S이고;
    n은 0, 1, 또는 2이다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ia에 의해 나타내어진 구조를 갖는 화합물.
    <화학식 Ia>
    Figure pct00063

    상기 식에서, Y는 H 또는 NO2이고; R4a는 H, Me, 또는 Et이고; R3a 및 R3b는 독립적으로 H, Me, 또는 Et이다.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 Ib에 의해 나타내어진 구조를 갖는 화합물.
    <화학식 Ib>
    Figure pct00064

    상기 식에서, R4a는 H, Me, 또는 Et이고; R3a 및 R3b는 독립적으로 H, Me, 및 Et이고; R6은 C1-C5 알킬, CH2OC(=O)C1-C5 알킬, 또는 (CH2)1- 2C6H5이다.
  4. 제3항에 있어서, 하기 화학식 Ib'에 의해 나타내어진 구조를 갖는 화합물.
    <화학식 Ib'>
    Figure pct00065

    상기 식에서, R4a는 H, Me, 또는 Et이고, R6은 Me 또는 n-Pr이다.
  5. 종양 연관 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 표적화 모이어티에 공유 연결된 제1항에 따른 화합물을 포함하는 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 하기 화학식 II-1'에 의해 나타내어지는 구조를 갖는 접합체.
    <화학식 II-1'>
    Figure pct00066

    상기 식에서, R6은 Me 또는 n-Pr이고, Ab는 바람직하게는 항-CD70, 항-메소텔린, 또는 항-글리피칸 3 항체인 항체이다.
  7. 제5항에 있어서, 하기 화학식 II에 의해 나타내어지는 구조를 갖거나 또는 그의 제약상 허용되는 염인 접합체.
    <화학식 II>
    Figure pct00067

    상기 식에서,
    Z는 바람직하게는 항체인 표적화 모이어티이고;
    XD는 제1 스페이서 모이어티이고;
    XZ는 제2 스페이서 모이어티이고;
    C는 절단가능한 기이고;
    아래첨자 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고;
    아래첨자 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
    D는 하기 화학식 D-a 또는 화학식 D-b에 따르고;
    <화학식 D-a>
    Figure pct00068

    <화학식 D-b>
    Figure pct00069

    여기서, Y는 H 또는 NO2이고; R4a는 H, Me, 또는 Et이고; R3a 및 R3b는 독립적으로 H, Me, 또는 Et이고; R6은 C1-C5 알킬, CH2OC(=O)C1-C5 알킬, 또는 (CH2)1- 2C6H5이다.
  8. 하기 화학식 III에 따른 구조를 갖는 약물-링커 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 III>
    Figure pct00070

    상기 식에서,
    R31은 반응성 관능기이고;
    XD는 제1 스페이서 모이어티이고;
    XZ는 제2 스페이서 모이어티이고;
    C는 절단가능한 기이고;
    아래첨자 a 및 b는 독립적으로 0 또는 1이고;
    아래첨자 m은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
    D는 하기 화학식 D-a 또는 화학식 D-b에 따르고;
    <화학식 D-a>
    Figure pct00071

    <화학식 D-b>
    Figure pct00072

    여기서, Y는 H 또는 NO2이고; R4a는 H, Me, 또는 Et이고; R3a 및 R3b는 독립적으로 H, Me, 또는 Et이고; R6은 C1-C5 알킬, CH2OC(=O)C1-C5 알킬, 또는 (CH2)1- 2C6H5이다.
  9. 제8항에 있어서, 하기 화학식 III-a에 의해 나타내어지는 구조를 갖는 약물-링커 화합물.
    <화학식 III-a>
    Figure pct00073

    상기 식에서,
    R3a 및 R3b는 독립적으로 H, Me, 또는 Et이고;
    R6은 Me, Et, 또는 n-Pr이고;
    AAa 및 각각의 AAb는 독립적으로 알라닌, β-알라닌, γ-아미노부티르산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, γ-카르복시글루탐산, 시트룰린, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    p는 1, 2, 3, 또는 4이고;
    q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
    r은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
    s는 0 또는 1이고;
    R31은
    Figure pct00074
    로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  10. 제8항에 있어서, 하기 화학식 III-b에 의해 나타내어지는 구조를 갖는 약물-링커 화합물.
    <화학식 III-b>
    Figure pct00075

    상기 식에서,
    R6은 Me 또는 n-Pr이고;
    q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고;
    r은 1, 2, 3, 4, 또는 5이고;
    s는 0 또는 1이고;
    R31은
    Figure pct00076
    로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  11. 암을 앓고 있는 대상체에서 암의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서, 제1항에 따른 화합물, 또는 그의 표적화 모이어티와의 접합체의 용도.
  12. 제11항에 있어서, 화합물이, 암에 의해 과다발현되거나 또는 특유하게 발현되는 항원에 결합하는 항체인 표적화 모이어티에 접합되는 것인 용도.
  13. 제11항에 있어서, 암이 신장암, 폐암, 위암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  14. 제1항에 따른 화합물, 또는 그의 표적화 모이어티와의 접합체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 제1항에 따른 화합물이, 항체인 표적화 모이어티에 접합되는 것인 제약 조성물.
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