KR20160054475A

KR20160054475A - 흡연의 해로운 영향을 감소시키는 신규의 수단

Info

Publication number: KR20160054475A
Application number: KR1020167005909A
Authority: KR
Inventors: 제라드 뵈르만; 프리소 마르테인 뵈르만
Original assignee: 제라드 뵈르만
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2016-05-16
Also published as: US20160177285A1; CN105592854A; WO2015018840A2; EP3030254A2; EA201690335A1; AU2014304578A1; JP2016528234A; CA2920452A1; US20190359963A1; WO2015018840A3

Abstract

본 발명은 엘라스타제 억제제의 사용, 바람직하게는 폐기종, COPD와 폐암의 치료 또는 예방을 위한 파신(fahsin)에 관한 것이다. 엘라스타제 억제제는 흡입을 통해, 바람직하게는 담배연기의 흡입을 통해 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한 이러한 엘라스타제 억제제를 포함하는 흡연물품을 포함한다.

Description

흡연의 해로운 영향을 감소시키는 신규의 수단 {Novel means to decrease the negative effects of smoking}

본 발명은 건강 및 의학 분야, 더욱 특히 만성폐쇄성폐질환(COPD), 폐기종 및 폐암 등의 폐질환을 예방하거나 또는 치료하는 분야, 및 대안적으로 흡연에 의한 문제를 극복하는 분야, 더욱 구체적으로 연기 흡입의 해로운 영향을 줄이기 위한 궐련, 담배 및 다른 흡연재료에 관한 것이다.

흡연은 당신의 건강에 나쁘다. 1970년대 이후로, 흡연, 특히 궐련 흡연 뿐만 아니라 다른 형태의 흡연이 흡연자 및 금연 방관자의 건강에 해로운 영향을 미치는 것에 대하여 더 많은 증거들이 수집되었다. 담배 연기는 폐 구조, 예를 들면 기관, 기관지, 세기관지 및 폐포 시스템에서 엘라스틴 함량의 감소에 중요한 역할을 한다는 것이 널리 알려져 있고 많은 임상실험을 통해 입증되었다. 더욱 구체적으로, 폐기종은 국소적인 결함이나 폐포벽의 파괴이다.

폐포벽내의 모세 혈관은 가장 중요한 해부학적 특징이다. 그들은 얽힌 네트워크를 형성하고 탄성과 레티큘린 섬유가 풍부한 섬세한 섬유 기질에 의해 지지된다. 대식세포는 폐포 공간 내에서 발생하고, 침입 세균에 대한 첫 번째 순서의 방어 메커니즘을 형성한다. "엘라스타제 : 안티 엘라스타제" 가설에 따르면, 담배 연기는 그의 자연 억제제를 초과하여 폐에 염증과 단백질 분해효소의 후속 방출을 야기한다. 정상 복구가 없는 경우, 단백질 분해는 조직 파괴와 공간 확대를 유도한다. 이 엘라스타제 : 안티 엘라스타제 가설은 거의 40년 동안 COPD 연구를 지배하여 왔다. 1963 년, 로렐과 에릭손 (Laurell CB, Eriksson S. Scand J Clin Invest 1963, 15:132-140)은 호중구 엘라스타제(NE)의 주요 억제제인 α-1 안티트립신(α1 AT)이 전혀 생성되지 않거나 불충분한 량으로 생성된 환자들은 발병초기 폐기종으로 발전했다는 관찰을 보고하였다. 그 후 곧바로 그로스 등(Gross P et al. Arch Environ Health 1965, 11:50-58)은 파파인, 엘라스타제를 래트 폐에 주입하여, 폐기종을 생기게 하였다. 그 후, 연구자들은 실험 동물의 기도 내에 인간의 호중구 엘라스타 제를 포함한 다른 엘라스틴 분해 효소를 주입하여 폐기종을 유발시킬 수 있었다 (Senior RM et al. J Clin Invest 1980, 66:859-862; Janoff A et al. Am Rev Respir Dis 1977, 115:461-478; Snider GL et al. Am Rev Respir Dis 1984, 129:155-160). 아울러, 이들 관찰은 폐기종의 조직 파괴를 가장 담당할 수 있는 단백질분해 효소로서 NE를 확고하게 입증하였다. 담배 흡연과의 관계는 샤피로 등에 의해 확고하게 입증되었다 (Shapiro S et al. Am J Pathol. 2003 163(6):2329-2335).

폐암의 발생은, 많은 연구에서 나타난 바와 같이, 확실히 흡연과 관련되어 있다. 단일 형태의 폐암은 없으며, 기관지 암, 폐포 세포암, 기관지 선종 및 간엽 종양으로 이루어질 수 있다. 특히 기관지 암은 (담배) 흡연과 관련이 있다. 이 암에서 보이는 해부학적 변화는 모세포의 상실, 기저 세포 증식, 편평세포 상피종 및 이형 세포 구조 등의 상피로 변화된다. 엘라스타제 억제가 담배 연기에 존재하거나 발암성인 것으로 입증되는 다환 방향족 탄화수소와 같은 화합물의 발암 활성에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았지만, 엘라스타제 억제가 암의 면역 성분의 영향과 같은 발암을 동반하는 사건의 연쇄에 영향을 미칠 수 있다고 가정된다.

엘라스타제 억제제가 폐기종의 치료을 위해 제안되었지만 (예를 들어, Koraki, T. et al., 2002, Am. J. Resp. Crit. Care med. 166:496-500; Wright, J. et al., 2003, Eur. Resp. J. 22:77-81), 지금까지 폐기종의 분야에서 이들 화합물의 상업적 이용은 달성되지 않았다.

또한 엘라스타제, 트립신, 키모트립신, 카텝신 G, 등과 같은 특정 프로테아제에 대한 특이성을 가진 새로운 프로테이나제 억제제에 대한 필요성이 있다.

본 발명자는 파신(fahsin)이 폐기종, 만성폐쇄성폐질환(COPD) 및 폐암의 군으로부터 선택된 폐 질환의 예방에 사용할 수 있다는 것을 발견했다. 폐 질환, 특히 폐기종의 치료 또는 예방에 있어서 그러한 사용은 바람직하게는 흡입을 통해, 구체적으로 연기, 더욱 특히 담배 (예를 들면, 궐련) 연기를 통해 행할 수 있다.

본 발명은 또한 폐기종의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 전자 담배, 파이프 담배, 여송연 또는 조인트(joint)를 포함하는 담배 등의 흡연 물품을 포함한다. 바람직하게, 상기 흡연 물품은, 바람직하게는 파신(fahsin), 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin), 및 제6의 시스테인 잔기 이후에 류신 잔기를 포함하는 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin)의 돌연변이체의 그룹으로부터 선택되는, 엘라스타제 억제제를 포함한다. 또한, 바람직하게는 상기 엘라스타제 억제제는 담배 또는 대마초 중에 블렌드(blend)로서, 또는 상기 담배 또는 대마초에 의해 발현되는 단백질로서 포함된다. 대안적으로, 담배는 필터 담배 또는 전자 담배이며 또한 엘라스타제 억제제는 필터내에 존재한다. 또한 대체적으로, 흡연 물품은 담배 또는 조인트(joint)이며, 엘라스타제 억제제는 담배용지 중에 존재한다.

추가의 실시형태에서, 엘라스타제 억제제는 재조합으로 생성된 파신이다.

본 발명에는 또한 엘라스타제 억제제, 바람직하게는 파신을 포함하는 형질전환 담배 또는 대마초이다. 따라서, 본 발명은 이러한 형질전환 담배 또는 대마초를 포함하는 궐련을 포함한다.

본 발명의 추가 부분은 본 발명에 따른 흡연 물품을 흡연함을 포함하는 폐기종, COPD 또는 폐암을 예방하거나 또는 감소시키는 방법이다.

또한 본 발명의 일 실시형태는 엘라스타제 억제제, 바람직하게는 파신, 더욱 바람직하게는 재조합 파신을 흡입함을 포함하는 폐기종, COPD 또는 폐암을 예방하거나 또는 감소시키는 방법이다.

본 발명은 또한 엘라스타제 억제제의 투여에 의해, 바람직하게는 흡입에 의한 상기 억제제의 투여에 의해, 흡연자의 폐기능을 개선하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 방법에서, 상기 흡연은 연기의 흡입이며, 여기서 상기 연기는 상기 억제제를 포함한다.

추가의 실시형태에서, 본 발명은 파신, 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin)의 새로운 돌연변이체를 제공한다.

도 1: 5개의 상이한 안티스타신 타입 세린 프로테아제 억제제의 1차 아미노산 서열의 정렬. 단백질 내에 유사하게 간격을 갖는 시스테인 잔기는 굵은 글씨로 표시된다. 억제제의 특이성을 반영하는 반응성 부위(P1) 아미노산 잔기는 밑줄로 표시된다.
도 2: 거마린의 상이한 변이체에 의한 인간 호중구 엘라스타제의 억제. X 축은 P1 위치에서 변이체의 잔기을 나타냄 (met는 야생형임). blanco는 단지 기질이며 max는 기질+엘라스타제이다. 기둥은 배양 시작 후 시간을 나타낸다. Y 축은 측정된 A405-A540 차를 나타낸다.
도 3. 상이한 농도에서 파신의 돌연변이체에 의한 카텝신 G 억제의 억제. 도 2에서와 유사한 Y-축 및 돌연변이체의 표시.
도 4. 거마린의 돌연변이체에 의한 다양한 프로테아제의 억제. A: 카텝신 G,B: 키모트립신, C: 엘라스타제, D: 트립신, E:플라스민, F: 프롬빈.

최근에 발견된 엘라스타제 억제제의 하나는 파신(fahsin)이며, 이는 Nile leech Limnatis nilotica로부터 유래된다(De Bruin, E. et al., FEMS Yeast Res. 5:1069-1077, 2005; WO 96/13585). 이 문헌에는 파신이 인간 호중구 엘라스타제 (hNE)에 특이적이며 또한 플라스민, 트롬빈, tPA, 접촉되지 않은 응고인자 VIIa, Xa, XIa 및 XIIa 등의 다른 중요한 혈액 유도성 세린 프로테아제를 남기는 포로테아제이다.

또한 파신은 펩타이드 화합물이지만, 재조합 기술의 도움으로 생산하기 용이하며, 또한 매우 안정한 것으로 입증되었다. 아미노산 서열 (GenBank DQ097891.1) 및 상기 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(GenBank AAY85799.1)이 도 1에 제공되어 있다. De Bruin 등에 나타낸 바와 같이, (supra)파신은 특정의 거리에서 10개의 시스테인 잔기와 공통서열을 갖는 다른 안티스타신-타입 프로테아제와 유사하다.

C (X₄) CS (X₄) C (X₄) CXC (X₄) C L (X₃) C (X₆) DXNGC (X₃) CXC

여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있으며, 또한 C, L, N, G 및 C은 아미노산의 명명법에서 보통의 의미를 가진다.

NE의 특이성은 제6 시스테인 잔기 뒤의 류신 잔기에 기인한다. 상기 공통 서열을 갖는 펩티드는 본 발명에서 사용될 수 있으며 또한 NE 억제 효과를 가질 것으로 제시되고 있다. 또한 파신 다음에 다른 안티스타신 타입 세린 프로테아제(NE) 억제제가 본 발명에서 사용될 수 있다. 그의 예로서 거머린, 피거머린, 히루스타신 및 브델라스타신이 있다. 이들 화합물의 아미노산 서열은 다음과 같다:

거머린(Hirudo nipponia): vdenaedthg lcgektcspa qvclnnecac taircmifcp ngfkvdengc eypctca

피거머린 (Hirudo nipponia): tdcggktcse aqvckdgkcv cvigqcrkyc pngfkkdeng ctfpctca

히루스타신 (Hirudo medicinalis): tqgntcgget csaaqvclkg kcvcnevhcr irckyglkkd engceypcsc akasq

브델라스타신 (Hirudo medicinalis: fdvnshttpc gpvtcsgaqm cevdkcvcsd lhckvkcehg fkkddngcey acicadapq

파신에 대한 이들 대체물 중에서, 제6의 시스테인 잔기 이후에 메티오닌잔기가 류신으로 변화된 돌연변이 거머린이다: vdenaedthg lcgektcspa qvclnnecac tairclifcp ngfkvdengc eypctca. 이러한 돌연변이체 거머린은 화학적 및 생물학적 산화에 모두 민감하지 않은 것으로 나타났으며 (결과는 나타내지 않음), 또한 추가로 이러한 돌연변이된 단백질은 야생형 분자 같은 NE의 강력한 억제제인 것으로 나타났다. 상기 언급된 다른 분자에서 아르기닌 잔기 (피거머린 및 히루스타신) 또는 라이신 잔기 (브델라스타신)인 이러한 특이적 잔기 (도 1 참조)를 류신 잔기로 변화시키면 또한 NE에 대해 개선된 반응성을 가지며 또한 야생형 단백질보다 더 안정한 돌연변이체 단백질을 제공하는 것으로 생각된다.

따라서 제6의 시스테인 잔기 이후에 류신 잔기를 갖는 돌연변이체 단백질도 또한 본 발명의 일부를 구성한다.

본 발명에서 적용가능한 돌연변이체를 연구하면서 만들어진 다른 돌연변이체는 다수개의 파신 돌연변이체를 포함하며, 여기서 P1 부위 (즉 제6의 시스테인 잔기 이후의 잔기)는 변화된다. 여러 돌연변이체는 P1 = Arg, P1 = Ile, P1 = Met 및 P1 = Val에서 만들어졌다. 이들 돌연변이체는 특정 부위의 돌연변이 유발에 의해 만들어졌다. Fahsin-Ile (즉, 제6의 시스테인 잔기 이후의 잔기는 Ile임)는 엘라스타제의 매우 특이적인 억제제이며 키모트립신, 카텝신 G 및 프로테아나제를 억제하지 않는 것으로 나타났다. 이것은 이 돌연변이체가 구체적으로 엘라스타제가 원인인자, 예컨대 폐기종 및 건선인 질환에 매우 적합하는 것을 의미한다. 또한 이 돌연변이체는 효소 인간 호중구 엘라스타제(HNE)에 의해 기인하는 조직 파괴와 관련하는 관절염, 치은염, 치주염, 및 기타 염증성 증상에 매주 적합할 수 있었다. 따라서 본 발명은 또한 특히 호중구 엘라스타제와 관련된 염증성 질환의 치료, 특히 폐기종, 치주염, 관절염 등의 치료를 위한 화합물로서 Fahsin-Ile 돌연변이체의 사용을 포함한다. 폐기종 및 치주염의 치료에 있어서 상기 투여는 바람직하게는 경구적인 것으로 제시된다. 폐기종 치료의 경우 투여는 임의 형태의 흡입기에 의해, 그러나 유리하게는 본 명세서에 기술된 바와 같이 전자 담배를 통해 제공될 수 있다. 치주염의 경우, 또한 전자 담배 공급이 사용될 수 있지만, 상기 화합물은 또한 경구 캐비티에서 화합물의 방출을 위해 제공되는 치약, 츄잉검 또는 다른 투여 형태로 제공될 수 있다.

또한 Fahsin-Val 및 Fahsin-Met 돌연변이체는 비록 그의 효과는 Fahsin-Ile 돌연변이체 및 야생형 파신보다 덜 특이적이지만 Fhasin-Ile에 대해 상술한 바와 같은 방식으로 엘라스타제 억제제로서 사용될 수 있다.

제2의 매우 유용한 파신 돌연변이체는 Fahsin-Arg이다. 이 화합물은, 비록 이것이 하나의 아미노산에서 야생형 파신과 다르다고 할지라도, 특이적으로 엘라스타제를 억제하지는 않지만, 놀랍게도 트립신의 우수한 억제제이다 (또한 이것은 응고인자 Xa, XIa 및 XIIa를 억제한다). 이들 효과 때문에, Fahsin-Arg은 응고 및 섬유소 용해의 억제를 위해 적합한 것으로 생각된다. 또한 Fahsin-Arg는 췌장염의 치료에 사용할 수 있다. Fahsin-Arg는 또한 다른 파신 돌연변이체보다 더 강력한 카텝신 G 억제제이다. 이것은 카텝신 G 억제제로서 사용될 수 있으며 따라서 염증(특히 여기서 염증은 부종임)을 치료 또는 예방하고, 광피부 노화를 치료 또는 예방하는데 유용하다는 것을 의미한다.

거마린의 경우, 상술한 Leu 돌연변이체 다음에, 다른 돌연변이체도 또한 P1 위치에서 Ile, Arg,, Lys 또는 Val로 변화되었다 (도 1 참조). 상기 검토한 바와 같이, Leu 돌연변이체는 인간 호중구 엘라스타제의 억제에 가장 효과적인 반면, 야생형 (P1위치에서 Met를 가짐)은 약간의 효과를 나타냈다. 다른 3개의 돌연변이체는 덜 효과적이엇다. 그러나, Arg 돌연변이체는 키모트립신의 최고 억제제이며 Leu 돌연변이체가 두번째인 것으로 보였다. 이들 두 가지는 또한 카텝신 G의 가장 좋은 억제제이었다. 그러나 Lys 돌연변이체는 트립신 및 플라스민의 특이적 억제제인 것으로 입증되었으며, 여기서 다른 돌연변이체의 경우, 단지 거마린-Arg는 약간의 효과를 나타낼 수 있었다. 트롬빈은 돌연변이체의 어느 것에 의해서도 거의 억제되지 않았다.

또한 COPD 및 폐기종 등의 폐암 분야에서 엘라스타제 억제제의 이전에 고려된 적용은 폐기종이 이미 확립된 후에 용도에 촛점을 맞추었다. 담배에서 엘라스타제 억제제의 적용은 폐기종의 발병을 억제하거나 또는 폐기종의 추가 진행을 억제하는 것을 의미한다. 따라서 본 발명은 폐기종의 예방 또는 파신에 의해 폐기종의 진행의 예방을 제공한다.

이러한 적용은 흡연, 특히 권련을 흡연하는 해로운 영향을 방지하거나 감소시키는데 특히 유용하다. 더욱이, 흡연자의 폐에서 엘라스타제 억제제의 섭취는 비흡연자에 의한 섭취에 대하여 증가할 수 있으며, 이것은 흡연의 해로운 영향에 대항하기 위해 이러한 요법을 매우 적합하게 만드는데 도움이 된다 (Kozumi, F. et al., 1999, Clin. Pharmacol. Ther, 66:501-508).

본 발명에 대한 NE억제제는 COPD, 폐기종 및 폐암 등의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 흡입자에게 사용할 수 있다. 또한 NE억제제의 투여는 폐가 막혀있거나 장기간 기능이 다른 수단으로 인해 손상되는 증상을 개선하거나 완화하는데 사용할 수 있다. 이러한 증상은 천식, 박테리아 또는 다른 미생물에 의해 기인하는 폐렴, 예를 들면 폐렴구균종(Pneumococcus sp.), 스타필로코커스 에스피 (Staphylococcus sp.), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 모락셀라 카타라리스(Moraxella catharalis), 마이코플라스마 에스피(Mycoplasma sp.), 클라미도필라 뉴모니아( Chlamydophilia pneumonia), 레이오넬라 뉴모필라(legionella pneumophila), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory Syncitial Virus, RSV), 아데노바이러스(adenovirus), 클라미디아 에스피피(Chlamydia spp), 아스퍼길루스 에스피(Aspergillus sp.), 감기, 석면폐에 의한 폐조직의 파괴 또는 손상 등을 포함한다. 이상적으로, 파신 등의 NE 억제제의 흡입은 흡입을 통하여, 특히 흡입자를 통한 흡입에 의해 또는 전자 담배(e-cigarette)를 통한 흡입에 의해 공급될 수 있다. 흡연자의 경우, 본 발명에 따른 NE 억제제, 특히 파신, 및 특히 재조합 파신은 임의의 인식가능한 방법으로 흡연 물품 중에 포함될 수 있다. 무엇보다 먼저, 담배 또는 담배에 함유되는 다른 식물 재료 (대마초)중에 펩타이드가 재조합으로 발현되는 것이 가능하다. 이러한 재조합 생산에서, 피카이 파스토리스(Pichia pastoris)에서 재조합 발현을 얻기 위한 실시예에서 사용되었던 바와 같은 유사한 발현 구조물이 사용될 수 있지만, 물론 다음에 식물에서 발현에 적합할 수 있다.

재조합 핵산이 예를 들면 아그로박테리움 매개성 형질전환 등 식물세포에 전달될 수 있는 여러 가지 방법이 있다. 그러나, 아그로박테리움 감염 외에도, 누군가가 본 발명을 실시하고자 하는 경우에 DNA를 레시피언트(recipient) 식물세포에 효과적으로 전달하는 다른 수단이 있다. DNA를 식물세포에 전달하기 위한 적합한 방법은 실질적으로 DNA가 세포내에 도입될 수 있는 임의의 방법, 예를 들면 DNA의 직접 전달에 의해, 예컨대 프로토플라스트의 PEG 매개성 형질전환, 건조/억제-DNA 섭취(Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199:183-188, 1985), 전기천공법 (미국특허 제5,384,253호), 탄화규소 섬유에 의한 교반 (Kaeppler 등, 1990; 미국특허 제5,302,523호; 및 미국특허 제5,464,765호), 및 DNA 코팅 입자의 촉진 (미국특허 제5,550,318호; 미국특허 제5,538,877호; 및 미국특허 제5,538,880호)에 의한 방법 등을 포함하는 것으로 생각된다. 이들 방법과 같은 기술의 적용을 통하여, 실질적으로 임의 식물 종으로부터의 세포는 안정하게 형질전환될 수 있으며 또한 이들 세포는 형질전환 식물로 발전할 수 있다.

아그로박테리움 매개성 전달이 사용되는 경우에는, 균주 A281, 또는 그의 유도성 균주, 또는 당업계에서 이용가능한 다른 악성 균주로 예시된 바와 같은, 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 등의 실질적으로 악성 아그로박테리움 숙주 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 이들 아그로박테리움 균주는 virB, virC 및 virG 유전자를 함유하는 Ti 플라스미드 pTiBo542의 병원성 영역으로부터 기인하는 DNA 영역을 가진다. 에이. 투메파시엔스의 병원성(vir) 유전자 생성물은 T-DNA의 처리 및 식물 세포내에 그의 전달을 조정한다. Vir 유전자 발현은 virA 및 virG에 의해 조절되며, 따라서 유도성 신호의 인지시 virA은 인산화 반응에 의해 virG을 활성화한다. 다음에 VirG는 virB,C,D,E.의 발현을 유도한다. 이들 단백질용 유전자 코드는 DNA의 이동에 관여한다. pTiBo542의 독성 증가는 Ti 플라스미드상의 높은 독성 virG 유전자에 기인하는 것으로 생각된다 (Chen et al. Mol. Gen. Genet 230: 302-309, 1991).

핵산을 식물 또는 식물 세포에 이동시킨 후, 어떠한 식물 또는 식물 세포가 상기 핵산과 함께 제공되었는지를 결정해야 한다. 이것은 예를 들면 선택 마커 또는 리포터 유전자를 사용하여 달성된다. 선택 마커 또는 식물 형질전환에서 가장 널리 사용되는 선택 유전자 중에는, EP131623에서 제안된, 선택제 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 박테리아 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (nptI, nptII 및 nptIII 유전자), 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 EP186425에서 제안된 박테리아 aphIV 유전자가 있다. EP 275957는 제초제 포스피노트리신( phosphinotricin)에 대한 내성을 부여하는 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터 아세틸 전이효소 유전자의 사용을 기술하고 있다. 제초제 글리포사트에 대한 상대적 내성을 부여하는 식물 유전자는 EP218571에 제안되어 있다. 상기 내성은 N-포스포메틸글리신에 대해 비교적 내성이 있는 유전자 인코딩 5-에놀시키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)의 발현을 기반으로 한다. 특정의 아미노산 예컨대 라이신, 트레오닌, 또는 라이신 유도체 아미노 에틸 시스테인(AEC) 및 5-메틸 트립토판 같은 트립토판 유사체도 또한 고농도로 적용하는 경우 세포성장을 억제할 수 있는 이들의 능력 때문에 선택제로서 사용될 수 있다. 이러한 선택 시스템에서, 선택 마커의 발현은 형질전환이 선택중에 성장시키는 형질전환 세포에 의해 아미노산의 과잉생성을 초래한다. 리포터 유전자의 적절한 예로는 베타-글루쿠로니다제(GUS), 베타-칼라토시다제, 루시페라제 및 녹색형광 단백질(GFP)이 있다.

대안적으로, 형질전환체는 핵산 코딩 파신 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현된 파신 단백질을 평가하여 검출할 수 있다.

아그로박테리윰 형질전환에 대한 대체로서, Koscianska 및 Wypijewski (2001, Acta Biochim. Polon. 48-3:657-661)는 리포터 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 플라스미드의 발현에 의해 예시되는 바와 같은 온전한 BY-2 담배 배양 세포의 전기천공법을 나타냈다. 전기천공 과정은 30㎍의 플라스미스의 존재하에 pH 6.8에서 5 mM CaCl₂, 10 mM NaCl, 8.7% 글리세롤, 0.4M 수크로오스 및 10 mM 파이프 버퍼를 함유하는 버퍼 시스템에서 세포의 원형질 분리를 15 내지 20 분 동안 유도하는 것으로 구성된다. 다음에, 세포들은 진공에 제공하고 2kV/cm에서 펄스를 적용하여 20 μs 지속되는 전기천공을 행하기 전에 얼음 위에서 배양하였다.

전기 펄스 후 세포들을 다시 실온에서 10분 동안 얼음 위에서 배양하였고, 그 후 세포들은 수크로오스 없이 BY 배지를 첨가하여 수크로오스 농도를 3 단계로 0.4M 에서 0.05M로 감소시켜 원형질 분리회복하였다. 다음에 원형질 분리회복된 세포는 BY 배지에 옮기고 GFP 발현은 다음 날에 모니터링하였다. 트랜스펙션 효율은 50%인 것으로 결정되었으며, 반면 세포의 활력은 전기천공 후 70%이었지만, 다음 날에는 감소하였다. 따라서,이 절차에서 DNA를 도입하는 처리는 세포의 활력 및 재생 능력에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보인다.

더욱 고상한 방법은 녹두의 온전한 뿌리 및 콩 뿌리에서 GFP 단백질 및 GFP 발현 벡터의 전달을 위한 폴리-아르기닌 기반 펩타이드를 사용하여 첸, C.-P. 등 (2007, FEBS Lett. 581:1891-1897)에 의해 제안되었다. 이 실시예에서는, 노나-Arg 펩타이드는 캐리어로서 제조하고, 10μg을 37℃에서 30 분 동안 50μl의 PBS의 총 용량으로 10μg의 플라스미드로 미리-배양하였다. 다음에 녹두와 콩의 뿌리는 DNA 펩타이드 용액중에 30 분간 침지한 후 세척했다. GFP의 발현을 모니터링하고 전체 뿌리를 통해 처리후 24 시간 내지 28시간 발생하는 것으로 나타났다.

본 발명에 따른 엘라스타제 억제제를 코딩하는 핵산을 발현하기 위한 추가의 대체 방법이 사용될 수 있다.

파신이 담배 또는 대마초에 재조합으로 생산되는 경우, 이 담배 또는 대마초는 이를 다른 담배와 블렌딩하거나 이를 그와같이 사용하여 궐련 중에 포함될 수 있다. 이것은 또한 엘라스타제 억제제의 용액중에 담배를 흠뻑 적신 다음 담배를 건조시켜 담배 또는 다른 흡연재료에 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 파신, 또는 임의의 다른 엘라스타제 억제제는 궐련을 롤링하는데 사용되는 담배용지에 포함될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 담배용지는 파신, 예를 들면 형질전환 쌀을 발현할 수 있는 재조합 식물으로부터 펄프로부터 생산할 수 있거나, 또는 파신은 담배 용지를 제조하는 과정에서 펄프에 첨가할 수 있다. 대안적으로, 파신은 생산 후 및 궐련의 롤링 전에 담배용지 상에 코팅할 수 있다.

또한 엘라스타제 억제제는 상기 재료의 제조 중에 흡연 재료에 첨가할 수 있다. 무엇보다 먼저, 이것은 단백질 분말로서 담배와 블렌드 될 수 있거나 또는 캐리어 재료에서 캡슐화될 수 있다.

또한, 이것은 필터 궐련중에 필터 재료에 첨가될 수 있다. 실험 부문에서, 궐련의 필터 내에 아크릴레이트 비드를 함유하는 rFahsin의 삽입은 시험 대상의 폐 기능의 현저한 개선을 초래하는 것으로 나타났다. 또한, 엘라스타제 억제제는 억제제의 용액중에 상기 재료를 흠뻑 적신 다음 이것을 궐련 필터의 생산 전에 건조시켜 필터 재료내에 포함시킬 수 있다.

마지막으로, 엘라스타제 억제제는 억제제가 방출되는 재료 또는 파이프를 통하여 상기 연기를 흡입하면 (궐련)연기와 함께 부수적으로 흡입할 수 있다. 이것은 추가적인 필터 재료일 수 있지만, 이것은 또한 사용자에 의해, 예를들면 흡연 시작 전에 궐련 파이프 중에 적용되는 엘라스타제 억제제를 서서히 방출하는 캐리어 재료일 수 있다.

물론 엘라스타제 억제제가 포함된 흡연재료는 임의의 흡연물질, 예를 들여, 궐련, 여송연, 가는 담배, 파이프, 조인트, 워터 파이프, 또는 임의의 다른 흡연재료일 수 있다. 바람직하게는, 흡연재료는 궐련인데, 그 이유는 그것이 주로 사용되고 또한 폐질환을 위해 가장 관련이 있는 고려되기 때문이다.

흡연 재료에 사용되는 엘라스타제 억제제는 바람직하게는 파신, 더욱 바람직하게는 재조합 파신이다. 파신은 극히 열안정성이 있으므로 뜨거운 연기에 의해 악화되는 않는다는 주요 이점을 갖는다. 하나의 시험에서 파신은 용융 커브의 나타남 없이 123℃로 가열하였다. 이러한 고온 처리 후에, 단백질은 활력을 상실하지 않았다. 엘라스타제 억제제는 흡연물질 0.001 내지 100 mg/kg의 농도로, 그러나 바람직하게는 흡연물질 0.001 내지 50 mg/kg의 농도로 상기 흡연 물품 중에 존재할 수 있다. 우리의 실험으로부터 최소 억제농도(MIC)는 15분 당 4㎍/100만인 것으로 나타났다. 그러나, MIC는 주로 질환 중력에 주로 의존하기 때문에, 상이한 량의 엘라스타제 억제제를 갖는 흡연재료를 사용할 수 있다. 이렇게 하여, 여러 등급의 흡연 재료 (경-중-강)가 제공될 수 있으며, 이들 모두는 담배 연기의 영향을 치료하거나 예방하는데 충분한 적절한 량의 엘라스타제 억제제를 갖는다.

엘라스타제 억제제는 또한 연기의 흡입 없이, 예를 들면 기관지, 세기관지 또는 페포에 약제학적 화합물의 투여를 위해 통상적으로 사용되는 표준 흡입기 또는 증발기를 사용하여 적용할 수 있다. 이 정도로, 엘라스타제 억제제, 바람직하게는 파신 또는 거머린-Leu는 상기 흡입기 중에 임의의 약제학적 제형, 예를 들면 건조 분말, 또는 용액으로 존재할 수 있다. 특히 엘라스타제 억제제를 함유하는 용액 또는 현탁액이 에어로졸을 형성할 수 있는 용액인 증발기를 포함하는 흡입기가 바람직하다. 전신 치료효과를 생기게 하는 효율적인 에어로졸 전달을 위한 중요한 파라미터는 에어로졸 구름 중에 입자크기 분포이다. 제형이 현탁액 형태일 때, 구름의 입자크기는 현탁된 약물의 입자 크기에 의해 지배된다. 제형이 용액 형태일 때, 현탁된 용액입자의 용적 기여가 없으며, 또한 용액 중에 약물 농도에 의해 주로 한정되는 훨씬 더 미세한 액적이 발생된다. 약물이 모세관내에 유도되도록 에어로졸 흡입기를 통하여 폐에 전달되는 경우, 입자는 폐에 전달되어 흡입시 혈류 내에 흡수되기에 충분히 적어야 하며, 즉 크기는 유리하게는 약 0.5㎛ 내지 2.5㎛를 포함한다. 0.5㎛ 이하의 입자는 이들이 다시 흡입되기 때문에 치료학적으로 유용하지 않다. 당업자는 흡입 또는 증발기 장치에서 사용하기 위한 본 발명의 엘라스타제 억제제로서 유효한 약제학적 제형을 생산할 수 있는 것으로 제시되어 있다.

이들 다소의 의학적 흡입기 및 증발기 다음에, 본 발명의 엘라스타제 억제제는 또한 공기를 습윤시키거나 향기를 공기 중에 이동시키는데 사용되는 증발기에 포함될 수 있다. 이러한 경우에, 엘라스타제 억제제의 농도는 낮을 수 있다. 다음에 집에 공기를 계속 신선하게 하면 공기중에 소량의 엘라스타제 억제제의 일정한 존재를 가능하게 하므로 집의 거주자에게 일정한 흡입 용량을 허용한다. 물론, 이러한 사용은 집에 한정되지 않지만, 자동차, 가게, 사무실, 공공건물 등에도 또한 적용될 수 있다.

흡입기의 한가지 구체적인 형태는 전자 담배 또는 e-시거렛이다. e-시거렛 또는 개인용 증발기(PV)는 연기와 비슷한 에어로졸을 생성하여 담배 흡연을 자극하는 전기 전원충전 증발기이다. 일반적으로 이것은 전자 액체로 알려진 액상 용액을 증발시키는 가열 부재를 이용한다. 전자-액체는 일반적으로 프로필렌 글리콜, 식물성 글리세린, 니코틴 및 향료의 혼합물을 함유하는 반면, 다른 것은 니코틴 없이 향함유 증기를 배출한다. 본 발명의 경우, 전자담배는 엘라스타제 억제제가 전자-액체 중에 녹을 수 있기 때문에 매우 유리하게 사용되며, 따라서 흡입을 위해 생성되는 에어로졸 중에 함유한다. 용액은 흔히 병 또는 미리 충전된 일회용 카트리지, 또는 소비자가 그들 자신의 전자-액체를 만드는 키트로서 판매되고 있다. 성분들은 또한 개별적으로 이용가능하며 또한 소비자들은 그들의 향, 니코틴 강도, 또는 농도를 다양한 공급물로 변형하거나 촉진시키기 위해 선택할 수 있다.

개인용 증발기에서 분무 시스템은 전자-액체 보유자로서 작용하는 액체 담금 폴리-기포로 둘러싸인 분무기로 구성된 소위 카토마이저(cartomizer) 형태로 나타낼 수 있다. 카토마이저는 스스로 사용될 수 있거나 더욱 전자-액체 용량을 허용하는 탱크와 연관하여 사용될 수 있다.

탱크에서 사용하였을 때, 카토마이저는 플라스틱, 유리 또는 금속 튜브중에 삽입되며 또한 구멍 또는 투입구는 카토마이저 쪽에 구멍을 뚫어 액체가 코일에 도달하게 해야 한다. 클리어로마이저(clearomizer) 또는 "클레아로스(clearos)"은 카토탱크(cartotank)와 다르지 않게 분무기가 삽입되는 클리어 탱크를 사용한다. 그러나, 카토탱그와 달리, 폴리-폼 재료는 그들에서 발견할 수 없다. 코일을 넘치게하지 않고 심지(wick)의 좋은 가습을 보장하기 위해 클리어로마이저(clearomizer) 내부에서 사용되는 다른 위킹시스템이 많이 있다. 일부는 심지와 코일 어셈블리 (예를 들어 바닥 코일 클리어로마이저)에 의존하는 반면, 다른 것은 모세관 작용에 의존하며 또한 어느 정도는 사용자가 클리어로마이저 (톱 코일 클리어로마이저)를 다루면서 전자액체를 교반한다. 재구성 가능한 분무기 또는 RBA은 사용자가 심지 및 코일을 재고 분무기 "헤드"로 대체하는 대신에 않고 이들 자체를 조립하거나 "구성하는" 것을 가능하게 하는 분무기이다. 이들은 또한 임의의 원하는 분무기를 전자 내성으로 구성시킨다. 분무기를 "재구성"하는데 필요한 재료는 통상 클리어로마이저로 정해질 통상의 조립식 대체가능한 윅 및 코일 어셈블리보다 훨씬 더 저렴하다. 이들 재구성 가능한 분무기는 두개의 주요 부류, 즉 재구성 가능한 탱크 분무기 (RTA's) 및 재구성 가능한 드리핑 분무기(RDA's)로 분류된다.

재구성 가능한 탱크 분무기 또는 RTA는 이들이 액체를 코일에 보유 및 가져오기 위해 탱크 도는 용기를 사용한다는 점에서 클리어로마이저와 유사한다.

다른 한편 재구성 가능한 드리핑 분무기 또는 RDA's은 용기 부분이 없고 RTA's에 비하여 매우 적은 액체를 보유하지만, 통상 많이 더 작다. 이들은 통상 하나 이상의 코일 및 "톱 캡(top cap)"을 마우스 피스가 부착될 수 있는 코일에 포함하는 것을 허용할 수 있는 분무기 "빌딩 덱(building deck)"만으로 구성된다. 사용자는 베어 윅 및 코일 어셈블리 상에 액체를 드립핑하여 분무기를 수동으로 습윤시킬 필요가 있다.

실시예 1

재조합 파신의 생산 및 특성화

분무기를 파신의 제조 및 정제는 De Bruin, E. et al., FEMS Yeast Res. 5:1069-1077, 2005에 기술되어 있다. 요컨대, 합성 파신 유전자는 4개의 오버랩 신장 PCR에 의해 구축되며, 코돈 사용은 숙주 피치아 파스토리스에 최적이다:

FA-1:5'-

GGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGACGACAACTGTGGTGGTAAGGTTTGTTCTAAGGGTCAA-3'

FA-2:5'-

AATCAAACATCTAATTGAGTACACTCACAGTGACCGGTCGTGACACAATTGACCCTTAGAACAAAC-3'

FA-3:"-CCAATTAGATGTTTGATTTTCTGTCCAAACGGTTTCGCTGTTGACGAGAACGGTTGTGAG-3'

FA-4:5'-

GCTGGCGGCCGCTCATTGGTGCTTACAAGAACATGGCAACTCACAACCGTTCTCGTC-3'

pGEMT-이지 클로닝 키트를 사용하여 PCR 생성물을 클로닝한 다음 DNA 서열결정을 한 후, 적절한 유전자는 XhoI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 피치아 벡터 pPIC9로 클로닝하였다 (인비트로겐, Carlsbad, CA, USA).

피. 파스토리스(P. pastoris) GS115 (his4, 참조: Cregg, J. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385, 1985)는 전기천공에 의해 변형하였다. 변형 전에, 플라스미드 pPIC9Fahsin는 SalI (인비트로겐)로 직선화하였다. 30℃에서 선택 플레이트 상에 3일간 성장 후에, 여러 가지 콜로니를 벡터 프라이머 5AOX1 및 3AOX1 (인비트로겐)을 사용하여 PCR 확인을 위해 선택하였다.

피.파스토리스 형질전환체의 선택 후에, 발효는 0.2% (v/v) PTM₁-미량 염(인비트로겐)으로 보충된 최소 기저염 배지에서 5 리터 BioFlo 3000 발효기 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA)로 수행하였다. 메탄올 유가형 발효 (Potter, K. et al., Protein Expr. Purif. 19:393-402, 2000)를 수행하고 rFahsin은 20 mM 트리스-버퍼, pH 8.0에 대하여 하룻밤 투석을 이용하여 발효 브로스로부터 정제하였다. rFahsin은 SP 세파로스 FF 칼럼 상의 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 분리하고 Akta 익스플로러(GE Healthcare)상에 시트레이트 버퍼 (20 mM, pH 4.0)중 1M NaCl을 사용하여 용출하였다. 색소생성 분석의 경우, NE에 대한 rFahsin 함유 분획의 활성을 결정하고 활성 분획을 풀링한 다음, 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0에 대하여 투석하여 NaCl를 제거하였다. Q-세파로스 패스트 플로우 또는 Q-세파로스 고성능에 대한 마지막 음이온 교환 크로마토그래피에서,HPLC (C8 역상)의 결정시 실질적으로 순도 (>90%)가 얻어졌다.

rFahsin의 여러가지 특성을 측정하였다:

위장 통과 중에서 부딛치는 증상과 유사하게 0.32% (w/v) 펩신 및 10 mM HCl (pH 2.0)의 용액에 의한 rFahsin의 배양은 rFahsin이 완전히 비활성화된 것으로 나타났다.

10 mM HCl (pH 2.0)만에 의한 rFahsin의 배양은 활성에 영향을 미치지 않았다. 따라서 비활성화는 펩신에 의해 원인이 되었으며, 이것은 rFahsin을 10배 더 낮은 투여량에서 완전하게 비활성화할 수 있었다.

- rFahsin은 매우 열 안정성이 있다. 123℃에서 1시간 동안 가열한 후에, rFahsin은 그의 NE 억제 활성을 상실하지 않았다. 이러한 특징은 (담배) 연기에 의한 전달에 매우 적합하게 만든다.

- pH 안정성. pH 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 또는 10.0에서 60℃에서 48 시간 동안 배양한 후에, 특이적 활성은 상실한 것으로 나타나지 않았다.

- 등몰 농도의 DDT에 의한 rFahsin의 배양은 rFahsin의 특이적 활성을 약화시켰다.

- rFahsin은 NE의 자연 인간 길항제, α1-안티트립신(AAT)과 같이, rFahsin-NE 복합체를 형성함으로써 NE를 억제한다. 그러나, AAT-NE 복합체와 대조적으로, rFahsin-NE 복합체는 염증유발 활성을 나타내지 않으며 또한 아마도 몸으로부터 신속하게 제거되지 않는다.

- rFahsin은, AAT와 대조적으로, 화학적 및 생물학적 산화에 대해 내성이 있다. 이것은 COPD와 함께 발생하는 것과 같이, 만성 염증 이후로 중요한 이점이다. 많은 활성화 호중구가 존재하여 반응성 산소종(ROS)의 형성의 원인이 된다. 또한 rFahsin은 연기중에 산소 또는 활성 화합물로 인한 화학적 산화에 의해 영향을 받지 않는다.

- rFahsin은 f-MLP (N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌)에 의한 호중구의 자극으로 인하여 방출되는 인간 NE를 중화할 수 있다. rFahsin은 또한 탈체 즉 환자의 치육 액체중에 엘라스타제 활성을 중화할 수 있다. 또한 rFahsin은 이러한 육즙 액체 중에 72시간까지 안정한 것으로 나타났다.

실시예 2

정제된 파신에 의한 생체외 세포독성 시험

L-929 마우스 섬유아세포(BioWhittaker, #3C0840)는 액체 질소 중에 냉동 저장 배양물로서 저장하였다. 실험에서 이들은 비동화 송아지 혈청 (10% v/v), ㅂ비필수 아미노산(1% v/v), L-글루타민(2 mM) 및 게타마이신 (50 ㎍/ml)로 보충된 둘베코 변형 이들 배지(DMEM)에서 성장시켰다. 세포들은 37℃에서 가습 배양기에서 일상적으로 배양하였다.

니어-컨를루언트(Near-confluent) L-929 세포 배양물은 트립신 처리에 의해 수거하여 배양 배지에 재현탁시켰다. 세포의 수는 Burker-Turk 카운팅 챔버를 사용하여 계수하였다.

재조합 생성된 단백질의 4개의 시험 샘플 (rFahsin의 두가지 형태, 둘 다 두개의 상이한 방법으로 정제함)을 동결건조하고 사용전에 500㎕ 배양 배지에서 녹여서, 약 1.59 내지 3.64 mg/ml의 농도를 얻고, 멸균처리하고 단계 희석하였다.

세포독성의 결정은 MTT 시험에 의해 수행하였다(Mosmann, T., J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983). 이 시험은 MTT를 그의 대응 MTT-포르마잔으로 저감하는 대사능력을 분석하여 세포의 생존율을 결정한다. 간략하게, 세포들은 0.5 mg MTT/ml 함유 100㎕ 배양 배지로 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 MTT 배지는 조심스럽게 제거하고 MTT-포르마잔 생성물은 1ml DMSO을 사용하여 적어도 1시간 동안 추출한다. 흡광도는 비오라드 멀티-웰 플레이트 리더를 사용하여 540 nm 의 파장 및 655 nm의 기준 파장에서 측정한다. rFahsin 불함유 음성 대조군 배양 배지를 사용하였으며, 반면 양성 대조군으로서 0.1% SDS의 용액을 적용하였다.

4개의 시험 샘플 및 대조군의 결과는 재조합 파신 샘플의 어느 것도 세포독성 효과를 유발하지 않는 것으로 나타났다 (표 1에서 최고 농도의 파신만 나타냄). 또한 L-929 세포의 형태변화는 관찰되지 않았다.

재조합 파신의 세포독성 효과

샘플	농도 [g/ml]	상대 MTT 전환율(%)
rFahsin-1a	3640	143.2
rFahsin-1b	2580	129.5
rFahsin-2a	2230	104.3
rFahsin-2b	1590	171.8
배지	0	100.0
SDS	0.1%	0.3

실시예 3

폐기능에 대한 파신의 흡연 영향

14명의 사람 (44-71세 8명 남성 및 44-69 세 6명 여성)을 파신을 함유하는 궐련을 흡연시키면서 추적하였다. 이 시험에서 파신 함유 궐련은 재조합 파신을 물에 녹인 다음 이 용액을 아크릴 비드 중에 포장하여 제조하였다. 다음에 아크릴 비드는 미니 외과용 메스 및 포셉을 사용하여 정상 궐련의 필터 재료내에 손으로 삽입하였다. 이것은 0,04 ㎍/시가렛의 궐련 당 파신 함량을 생성하였다 (10배 MIC, 1200 궐련/kg 흡연재료).

실험 대상의 흡연 습관은 1일 약 10 내지 약 25개 궐련으로 변화시켰다. 참여자들의 폐기능은 실험의 시작에서 및 실험 시작 후 4, 6 및l 12주에 FEV1 시험 (Donahue, J.F., COPD 2:111-124, 2005)으로 시험하였다. 이 FEV1는 천식 감시장치(Asma-1, Vitalograph, Buckingham, UK)로 측정하였다. 모든 대상들은 실험 시작 전에 여러 해동안 흡연시키고 이들의 폐 기능은 비교할 만한 나이 및 성의 사람들에게 정상으로 생각되는 것보다 더 적은 것으로 이미 나타났다. 표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, FEV1 값은 일반적으로 파신 함유 궐련을 흡연할 때 경시적으로 개선되었으며 16%의 평균증가가 발견되었다.

실험은 또한 파신이 담배 연기에 의해 가열된 후에 아직도 활성인 것을 나타낸다.

성별	나이	베이스 라인	4 주	6 주	12 주	12주 후 차이

M	46	2.45	2.55	2.90	3.05	+24%
F	44	3.10	3.20	3.20	3.15	+ 2%
F	51	2.10	2.10	2.05	2.65	+26%
F	56	2.60	2.85	2.90	3.15	+21%
M	57	3.35	3.65	3.60	3.80	+13%
M	45	3.00	2.95	3.45	3.25	+ 8%
M	63	2.00	2.10	2.30	2.75	+38%
M	71	1.80	2.00	2.30	2.45	+36%
M	69	1.90	1.95	2.20	2.15	+13%
F	69	1.70	1.80	1.85	2.05	+19%
F	46	3.30	3.20	3.35	3.25	- 2%
M	47	3.60	3.80	3.85	3.75	+ 4%
F	61	2.40	2.40	2.75	2.80	+16%
M	64	2.65	2.55	2.65	2.90	+ 9%

실시예 4

파신 돌연변이체

P1 위치에서 상이한 아미노산 (즉 제6의 시스테인 잔기 이후의 Leu 잔기)를 갖는 파신 돌연변이체는 재조합 파신 (실시예 1, P. pastoris GS115)를 생산하기 위해 사용되는 계통균주에서 부위 특이적 돌연변이를 통하여 만들었다. 이들은 다른 (세린) 프로테이나제에 대한 활성을 시험하기 위해 여러 단백질 분석으로 시험하였다. 일 예로써 카텝신G에 대한 이들 돌연변이체의 영향은 도 3에 도시된다.

실시예 5

거마린 돌연변이체

효모균주를 발현하는 거마린 및 거마린 돌연변이체는 파신과 동일한 방법으로 만들었다. 거마린 Lys 돌연변이체는 엘라스타제를 강력하게 억제하는 것으로 나타났다 (도 2 및 도 4C). 도 4에서 6개의 상이한 프로테이나제에 대한 거마린 및 그의 돌연변이체의 억제 효과가 요약되어 있다.

이들 분석에서 동일 용매중에 PBS/0.2% 트윈 20 또는 그의 희석액중에 25㎕의 돌연변이체 샘플을 37℃에서 60분 동안 25㎕의 프로테아제로 전배양하였다. 다음에 적절한 기질을 첨가하고 (50 ㎕) 혼합물을 37℃에서 1시간 (엘라스타제, 트립신), 2 시간 (카텝신 G, 키모트립신, 트롬빈) 또는 4 시간 (플라스민) 동안 측정하고, 이들 값의 차이를 도 4A-F에 플롯하였다.

Claims

폐기종, 만성폐쇄성폐질환 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폐 질환 예방용 파신.
제1항에 있어서, 구체적으로 연기, 더욱 특별하게 담배 연기의 흡입으로 인한 폐 질환, 특히 폐기종의 치료 또는 예방용 파신.
폐기종의 치료 또는 예방용으로 사용하기 위한, 전자 담배, 파이프 담배, 여송연 또는 조인트(joint)를 포함하는 담배와 같은 흡연 물품.
제3항에 있어서,
상기 흡연 물품이, 바람직하게는 파신(fahsin), 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin), 및 제6의 시스테인 잔기 뒤에 류신 잔기를 포함하는 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin)의 돌연변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 엘라스타제 억제제를 포함하는 흡연 물품.
제4항에 있어서,
상기 엘라스타제 억제제가 담배 또는 대마초 중에 블렌드(blend)로서, 또는 상기 담배 또는 대마초에 의해 발현되는 단백질로서 포함되는 흡연 물품.
제4항에 있어서, 상기 담배가 필터 담배 또는 전자 담배이며, 상기 엘라스타제 억제제가 필터 내에 존재하는 흡연 물품.
제4항에 있어서,
상기 흡연 물품이 담배 또는 조인트(joint)이며, 상기 엘라스타제 억제제가 담배용지에 존재하는 흡연 물품.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엘라스타제 억제제가 재조합으로 생성된 파신인 흡연 물품.
엘라스타제 억제제, 바람직하게는 파신을 포함하는 형질전환 담배 또는 대마초.
제9항에 따른 담배 또는 대마초를 포함하는 궐련.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 흡연 물품을 흡연함을 포함하는 폐기종, 만성폐쇄성폐질환 또는 폐암을 예방하거나 또는 감소시키거나 또는 폐의 증상을 개선하기 위한 방법.
바람직하게는 파신(fahsin), 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin), 및 6번째 시스테인 잔기 뒤에 류신 잔기를 포함하는 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin)의 돌연변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 더욱 바람직하게는 파신인, 엘라스타제 억제제를 흡연함을 포함하는 폐기종, 만성폐쇄성폐질환 또는 폐암을 예방하거나 또는 감소시키거나 또는 폐의 증상을 개선하기 위한 방법.
엘라스타제 억제제의 투여에 의해, 바람직하게는 상기 억제제의 흡입에 의한 투여에 의해, 흡연자의 폐기능을 개선하는 방법.
제13항에 있어서,
상기 흡입이 상기 연기의 흡입이고, 상기 연기가 상기 억제제를 포함하는 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서,
상기 흡입이 전자 담배를 통한 흡입이거나, 또는 상기 연기가 전자 담배에 의해 발생되는 것인, 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엘라스타제 억제제가 파신(fahsin), 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin), 및 6번째 시스테인 잔기 뒤에 류신 잔기를 포함하는 거머린(guamerin), 피거머린(piguamerin), 히루스타신, 브델라스타신(bdellastasin)의 돌연변이체의 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
6번째 시스테인 잔기 이후에 류신, 아르기닌, 이소류신, 라이신 또는 발린 잔기를 포함하는 거머린의 돌연변이체.
6번째 시스테인 잔기 이후에 류신, 이소류신, 메티오닌, 라이신 또는 발린 잔기를 포함하는 피거머린의 돌연변이체.
6번째 시스테인 잔기 이후에 류신, 이소류신, 메티오닌, 라이신 또는 발린 잔기를 포함하는 히루스타신의 돌연변이체.
6번째 시스테인 잔기 이후에 류신, 아르기닌, 이소류신, 메티오닌 또는 발린 잔기를 포함하는 브델라스타신의 돌연변이체.
6번째 시스테인 잔기 이후에 아르기닌, 이소류신, 메티오닌, 라이신 또는 발린 잔기를 포함하는 파신의 돌연변이체이며, 바람직하게는 상기 돌연변이체가 아르기닌 잔기를 포함하는 것인, 파신의 돌연변이체.
제21항에 있어서,
치료법에 사용하기 위한, 바람직하게는 췌장염, 염증, 부종, 광노화 또는 혈전증의 치료 또는 예방을 위한, 파신의 돌연변이체.