KR20160054597A

KR20160054597A - 신규 항체 정제 방법 및 그로부터 얻어지는 항체, 및 양이온 교환기를 사용한 신규 항체 정제법 및 그로부터 얻어지는 항체

Info

Publication number: KR20160054597A
Application number: KR1020167009648A
Authority: KR
Inventors: 가즈노부 미나쿠치
Original assignee: 가부시키가이샤 가네카
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2014-09-16
Publication date: 2016-05-16
Also published as: EP3048109A4; US10519195B2; EP3048109A1; WO2015041218A1; US20160237113A1; CN105555795A; JP2019034963A; SG11201602061YA; JPWO2015041218A1

Abstract

본 발명(제1 형태)은, 항체 또는 항체 유래 물질에 대한 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 사용해서 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 또는 항체 유래 물질의 흡착 및 용출을 행하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 유래 물질의 정제 방법이고, 본 발명(제2 형태)은, pKa가 4.0 이상인 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체에 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하한 후, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 양이온 교환기를 갖는 담체의 사용 방법이다.

Description

신규 항체 정제 방법 및 그로부터 얻어지는 항체, 및 양이온 교환기를 사용한 신규 항체 정제법 및 그로부터 얻어지는 항체{NOVEL ANTIBODY PURIFICATION METHOD AND ANTIBODY OBTAINED THEREFROM, AND NOVEL ANTIBODY PURIFICATION METHOD USING CATION EXCHANGER AND ANTIBODY OBTAINED THEREFROM}

본 발명(제1 형태)은, 표적 분자(예를 들어 항체 또는 항체 유래 물질. 이하, 이들을 통합해서 항체 등으로 칭하는 경우가 있음)를 특이적으로 정제하기 위한 어피니티 리간드를 갖는 담체, 및 양이온 교환기를 갖는 담체를 일체로서 사용해서 항체 등을 정제하는 방법이며, 어피니티 크로마토그래피 정제와 양이온 교환 크로마토그래피 정제를 1 크로마토그래피 스텝으로 실시하는 신규 항체 정제 방법 및 그것으로부터 얻어지는 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명(제2 형태)은, 양이온 교환기(이하, 양이온 교환기를 갖는 담체, 양이온 교환 담체라고도 함)를 사용한 항체 등(항체 또는 항체 유래 물질)의 신규 정제법이며, 통상 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체의 사용 pH로서 선택되지 않은 pH4.0 이하에서의 항체 등의 정제 방법 및 그것으로부터 얻어지는 항체에도 관한 것이다.

항체를 주약으로 하는 항체 의약품의 주성분인 모노클로날 항체는, 주로 포유류 배양 세포 등을 사용해서 재조합 단백질로서 배양액 중에 발현하고, 여러 단계의 크로마토그래피나 막 공정에 의해 고순도로 정제된 후에 제제화된다. 항체 의약품에는, 면역 글로불린 G 및 그의 유연 물질(analog)이고, 일반적으로 항체라고 칭해지는 분자 외에, 면역 글로불린 분자의 정상 영역인 Fc 영역과 다른 기능성 단백질 또는 펩티드를 융합해서 이루어지는 Fc 융합 단백질(Fc 함유 분자)이 포함된다. 나아가, Fab, scFv 및 diabody 등의 저분자화 항체가 포함된다. 또한, 이들 항체 의약품에는, 미생물을 숙주로 하고, 그의 배양 상청에 분비 발현되는 것, 균체 내 또는 균체 외벽과 균체 세포막의 사이에 축적 발현되어, 정제되고, 제제화되는 것도 포함된다.

이 배양, 정제, 제제화의 공정에서 형성 또는 잔류하는 응집체(2량체 이상의 다량체)가 부작용의 주요 원인이 되기 때문에, 그의 저감이 항체 의약품 생산의 중요 과제가 되고 있다. 여기서 단량체란, 예를 들어 항체의 경우, 정상 영역인 Fc 영역과 가변 영역을 포함하는 중쇄(H쇄) 2분자와, 가변 영역을 포함하는 경쇄(L쇄) 2분자를 포함하는 4량체 구조의 항체를 1분자 단위로 하여 정의된다. 이 단위 분자의 다량체가 응집체로 되고, 항체 의약품의 부작용 주요인으로 되고 있다.

응집체의 생성 억제나 그의 제거는 배양, 정제, 제제화의 공정에서, 복잡한 관리 방법이나 첨가제의 사용에 의해 제어하는 시도가 이루어져 왔다. 특히 정제 공정에서는, 응집체의 생성을 억제하는 것 외에 그의 제거가 중요하다. 따라서, 정제 공정에서는, 간편하고 효율적인 응집체 제거 기술의 개발이 요구되고 있다.

항체 의약품의 정제 공정은, 특정한 단위 조작의 조합에 의한 정제 방법의 패턴화(플랫폼화)가 진행되고, 그의 초기 정제 공정(회수 공정)에서는, 리간드로서 프로테인 A가 수불용성 담체에 고정화된, 항체 어피니티 분리 매트릭스(프로테인 A 담체)가 널리 이용되고 있다. 중성 조건하에서 항체를 프로테인 A 담체에 흡착시켜, 산성 조건하에서 항체를 용출시키는 방법이 일반적으로 사용되고 있지만, 일반적으로는, 3 스텝의 크로마토그래피 정제에 의해 고순도화되어, 프로테인 A 크로마토그래피 공정의 후단에서 이온 교환 크로마토그래피나 소수성 상호 작용 크로마토그래피 등의 조합에 의해, 응집체 등의 불순물이 제거되고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2, 비특허문헌 3, 특허문헌 5).

어피니티 리간드는, 특정한 분자에 특이적으로 결합하는 기능을 갖고 있으며, 해당 리간드를 수불용성 담체에 고정화해서 이루어지는 어피니티 분리 매트릭스(어피니티 크로마토그래피 담체, 어피니티 담체라고도 함)는, 생체 성분이나 재조합체를 포함하는 미생물 및 포유류 배양 세포로부터, 유용 물질의 효율적인 분리 정제에 이용되고 있다. 실제로 산업적으로 이용되고 있는 항체 어피니티 리간드로서, 예를 들어 프로테인 A나 프로테인 G, 프로테인 L 등의 미생물 유래 또는 그들을 재조합하여 발현시켜서 얻어지는 기능적 개변체(유연 물질)를 포함하는 펩티드성 또는 단백질성 리간드나, 낙타 단일 가닥 항체나 항체의 Fc 리셉터 등의 재조합 단백질성 리간드 및 티아졸 유도체 등의 화학 합성성 리간드를 들 수 있고, 항체 의약품 등의 정제에 사용되고 있다. 항체 의약품은, 화학 약품에 대하여 보다 낮은 독성에서, 더 높은 특이성을 나타내는 점에서, 이상적인 의약품으로서 그의 수요가 높아져 오고 있다.

어피니티 담체에 의한 분리 정제에 있어서는, 항체의 응집체나, 숙주 유래 불순물, 항체의 분해물 등(이하, 응집체 등)의 제거가 과제가 된다.

예를 들어, 어피니티 담체의 일례로서, 프로테인 A 크로마토그래피 공정에서는, 통상, 산성 용출이 행해지지만, 항체마다 용출 pH가 상이하고 프로세스 설계에 시간이 필요하기 때문에, 또한 용출 pH가 낮을수록, 응집체가 형성되는 리스크가 높아지기 때문에, pH3 전후의 낮은 pH 용출이 필요한 항체도 pH3.5 내지 4 부근에서 용출할 수 있도록 프로테인 A 리간드에 단백질 공학적으로 개변을 가하는 시도가 행해지고 있다(특허문헌 1).

또한, 프로테인 A 크로마토그래피 공정 후에 응집체 함량이 많은 경우에는, 후단의 불순물 제거 공정에 있어서, 목적으로 하는 단량체(모노머)의 수율 저하에 연결되는 점에서, 프로테인 A 크로마토그래피 공정에서의 응집체 형성을 억제하려는 시도 외에, 추가로, 당해 크로마토그래피 공정에서의 응집체를 제거하는 시도가 이루어져 있다.

또한, 프로테인 A 크로마토그래피 공정의 사용 중에서, 응집체 등의 불순물을 저감하는 시도가 이루어져 왔다. 즉, 용출시의 pH나 이온 강도의 최적화, 나아가 용출 피크의 전반 부분과 후반 부분을 분획하는 등의 방법이 제안되고 있다. 구체적으로는, 프로테인 A 담체의 특성으로서 다량체화한 항체 분자가, 다량체화하고 있지 않은 항체 분자보다도 높은 확률로 프로테인 A 리간드와 접촉하기 때문에, 해리상수가 약간 낮아지는 것이나, 소수성의 미묘한 조절에 기초하는 분리 기구를 이용한 방법이다(특허문헌 2, 특허문헌 3, 특허문헌 4). 그러나, 이들 방법은 엄밀한 제어가 곤란한데다 분리능이 낮아 일반적인 분리 방법으로서는 사용되고 있지 않고, 후단의 공정에서 불순물 제거를 행할 필요가 있었다.

프로테인 A 크로마토그래피로 대표되는 어피니티 크로마토그래피는, 산성 pH에서 용출이 실시되지만, 후단의 이온 교환 크로마토그래피나 소수성 상호 작용 크로마토그래피 등은, 통상 pH5 이상의 pH에서 처리되기 때문에, pH나 이온 강도 조정이 필요하였다.

한편으로, 통상, 양이온 교환 담체는, 그의 리간드의 pKa보다도 높은 pH에서 사용된다. 또한, 양이온 교환 담체에서 정제되는 표적 단백질에 대하여, 단백질의 등전점(pI)보다도 낮은 pH에서의 흡탈착이 행해진다. 예를 들어, pI가 8인 항체의 정제에는, pKa가 2 부근인 술폰기나 pKa가 3 내지 5 부근인 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체가, pH5 내지 6의 완충액을 사용해서 흡탈착되어 정제된다. 완충액의 pH는, 리간드의 pKa와 표적 단백질의 pI의 사이로 설정되지만, 사용 pH가 pI보다도 낮을수록, 단백질의 플러스 전하가 커져, 용출 이온 강도를 높게 설정할 필요가 있고, 회수율이 낮아지는 경향이 있다. 용출액의 이온 강도가 높은 경우에는, 후단의 프로세스 구축에 있어서 이온 강도를 저감해야 하는 등의 제한이 있었다. 또한, 사용 pH가 양이온 교환 리간드의 pKa에 가까운, 또는 낮은 경우에는 리간드의 마이너스 전하가 프로톤화되어, 결합 용량이 저하된다고 여겨져, 통상 선택되지 않았다. 따라서, 양이온 교환 담체를 사용한 항체의 정제에는, pKa2 내지 5의 양이온 교환 담체에 대하여 pH5 내지 6의 완충액이 사용되어 왔다.

어피니티 크로마토그래피 공정 후에 음이온 교환 크로마토그래피 공정이나 소수적 상호 작용 크로마토그래피 공정이 사용되는 경우(특허문헌 8), 양이온 교환 크로마토그래피 공정 후에 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 행하는 경우(특허문헌 7) 또는 양이온 교환 크로마토그래피 공정에서 복수의 표적 물질을 회수하는 경우(특허문헌 6)도 마찬가지로, pH나 이온 강도 조정이 필요하였다.

상기와 같이 항체 등을 어피니티 크로마토그래피 정제하고, 후단의 프로세스에서 고도 정제하기 위해서는, 산성 pH 용출액의 pH나 이온 강도 조정이 필요해지고, 연속하는 초기 크로마토그래피의 효율화에는 한계가 있었다. 이에 더하여, 어피니티 크로마토그래피 정제의 방법을 채용하지 않는 이온 교환 크로마토그래피 공정과 소수성 전하 유도 크로마토그래피 공정을 행하는 경우에도, 각각의 공정을 독립하여 행할 필요가 있고, 연속해서 항체 등을 정제할 수는 없고, 효율화를 도모하는 데에는 한계가 있었다(특허문헌 9).

또한, 항체 어피니티 분리 매트릭스는, 항체에 높은 특이성을 나타내고 고순도화가 가능하지만, 사용 방법을 엄밀하게 설정해도 단량체(모노머)와 응집체 등의 분리능이 낮기 때문에, 응집체 등의 제거 공정으로서는 한계가 있었다.

일본 특허 제4391830호 공보 WO2008/085988 일본 특허 공표 제2010-507583호 공보 WO2010/019493 WO2010/141039 일본 특허 공개 (평)05-202098호 공보 일본 특허 공개 (평)06-228200호 공보 일본 특허 공표 제2010-510963호 공보 일본 특허 공표 제2008-535913호 공보

Hober S.외 저, 「J.Chromatogr.B」, 2007년, 848권, 40-47면 Low D.외 저, 「J.Chromatogr.B」, 2007년, 848권, 48-63면 Roque A.C.A.외 저, 「J.Chromatogr.A」, 2007년, 1160권, 44-55면

본 발명(제1 형태)의 목적은, 항체 또는 Fc 함유 분자 또는 Fab, scFv 등의 저분자화 항체 등의 항체 유래 물질의 정제 공정의 제1 크로마토그래피 공정에 있어서, 어피니티 정제의 주요 목적인 항체 자체의 고순도화와 함께, 단량체의 선택적 분리 특성을 향상시켜, 응집체 등의 제거에 관해 후단의 불순물 제거 공정에의 부하를 저감 또는 생략할 수 있는 신규 항체 정제 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명(제2 형태)의 목적은, 항체 등의 정제에 있어서, 어피니티 크로마토그래피 정제를 회수 크로마토그래피 공정으로 하고, 후단의 프로세스에서 고도로 정제할 때에 필요한, 산성 pH 용출액의 pH나 이온 강도 조정이 필요하지 않는 효율화된 항체 정제법을 제공하는 데 있다.

본 발명자는, 상기 과제를 감안하여 예의 검토를 행한 결과, 항체 또는 항체 유래 물질에 대한 어피니티 리간드를 갖는 담체와 양이온 교환기를 갖는 담체 양쪽을 동일 컬럼 내 또는 연결 컬럼 내에 충전하고, 양쪽 크로마토그래피를 동시적으로 실시함으로써, 특이적인 흡착능과 우수한 응집체 등의 제거능을 겸비한 신규 분리 방법을 발견하여, 본 발명(제1 형태)을 완성시키기에 이르렀다.

또한, 본 발명자는, 상기 과제를 감안하여 예의 검토를 행한 결과, 항체 어피니티 담체를 용출하는 산성 pH에서 양이온 교환 담체에의 항체 등의 흡탈착을 행하여, 항체의 응집체 등의 불순물이 저감된 화분을 얻는 양이온 교환 담체의 신규 분리 방법을 발견하여, 본 발명(제2 형태)을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명(제1 형태)의 요지는, 이하와 같다:

[1] 항체 또는 항체 유래 물질에 대한 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 사용해서 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 또는 항체 유래 물질의 흡착 및 용출을 행하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 유래 물질의 정제 방법.

[2] 상기 항체 또는 항체 유래 물질에 대한 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 사용한 항체 또는 항체 유래 물질의 정제 방법이고,

상기 담체 1을 충전한 컬럼의 하류측에 상기 담체 2를 충전한 컬럼을 직결한 일체형 컬럼 또는 상기 담체 1과 담체 2의 양쪽 혼합물이 충전된 혼합형 컬럼에, 항체 또는 항체 유래 물질 함유액을 통액시켜 항체 또는 항체 유래 물질을 컬럼에 부하하고,

계속해서 용출액을 통액시킴으로써 부하한 항체 또는 항체 유래 물질을 용출시키는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 유래 물질의 정제 방법.

[3] 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 구배로 행하는 [1] 또는 [2]에 기재된 정제 방법.

[4] 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 계단식으로 행하는 [1] 또는 [2]에 기재된 정제 방법.

[5] 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키는 [2] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[6] 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액과 동일하거나 또는 보다 높은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키고, 계속해서 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키는 [2] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[7] 상기 어피니티 리간드를 갖는 담체 1이 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L 또는 그들의 유연 물질을 리간드로 하는 담체인 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[8] 상기 어피니티 리간드를 갖는 담체 1이 프로테인 A 또는 그들의 유연 물질을 리간드로 하는 담체인 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[9] 상기 항체 또는 항체 유래 물질이 면역 글로불린 G, 면역 글로불린 G 유도체 또는 Fc 함유 분자인 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[10] 상기 항체 또는 항체 유래 물질이 Fab, scFv, diabody 또는 항원 결합 부위 함유 분자인 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[11] 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2가 카르복실기를 리간드로 하는 담체인 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[12] 상기 카르복실기가 산성 아미노산에서 유래하는 [11]에 기재된 정제 방법.

[13] 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출 pH가 5.0 미만인 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[14] 상기 담체 1의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC가 1mg/mL 이상 100mg/mL 이하인 [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[15] 상기 담체 2의 이온 교환 용량이 0.001mmol/mL 이상 0.5mmol/mL 이하인 [1] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[16] 상기 담체 1의 체적 평균 입경이 1㎛ 이상 1000㎛ 이하이고, 상기 담체 2의 체적 평균 입경이 1㎛ 이상 1000㎛ 이하인 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[17] pKa가 4.0 이상인 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체 2에 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하한 후, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 [1] 내지 [16] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[18] 상기 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체 2의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC가 1mg/mL 이상 200mg/mL 이하인 [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[19] 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 충전한 컬럼 앞에 어피니티 리간드를 갖는 담체 1을 충전한 컬럼을 연결해서 일체형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 상기 일체형 컬럼에 부하한 후에, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 [2] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[20] 상기 일체형 컬럼을 구성하는 담체 1과 담체 2의 비율이 체적 기준으로 1/20 이상 20/1 이하인 [2] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[21] 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 함께 혼합 상태로 갖는 혼합형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하여 pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 [2] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[22] 상기 혼합형 컬럼을 구성하는 담체 1과 담체 2의 비율이 체적 기준으로, 1/20 이상 20/1 이하인 [2] 내지 [18] 및 [21] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[23] 흡착 조건하에서의 담체 1의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC에 대한, 담체 2의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC가 1/10배 이상 10배 이하인 [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.

[24] [1] 내지 [23] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법으로 정제된 항체 또는 항체 유래 물질.

본 발명(제2 형태)의 요지는, 이하와 같다:

[1] pKa가 4.0 이상인 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체 2에 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하한 후, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 양이온 교환기를 갖는 담체의 사용 방법.

[2] 상기 카르복실기 함유 리간드가 산성 아미노산에서 유래하는 [1]에 기재된 사용 방법.

[3] 상기 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체 2의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC가 1mg/mL 이상 200mg/mL 이하인 [1] 또는 [2]에 기재된 사용 방법.

[4] 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2의 이온 교환 용량이 0.001mmol/mL 이상 0.5mmol/mL 이하인 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 사용 방법.

[5] 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2의 체적 평균 입경이 1㎛ 이상 1000㎛ 이하인 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 사용 방법.

[6] 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 충전한 컬럼 앞에 어피니티 리간드를 갖는 담체 1을 충전한 컬럼을 연결해서 일체형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 상기 일체형 컬럼에 부하한 후에, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 사용 방법.

[7] 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 함께 혼합 상태로 갖는 혼합형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하해서 pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 사용 방법.

[8] 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키는 [6] 또는 [7]에 기재된 사용 방법.

[9] 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액과 동일하거나 또는 보다 높은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키고, 계속해서 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키는 [6] 또는 [7]에 기재된 사용 방법.

[10] 상기 항체 또는 항체 유래 물질이 면역 글로불린 G, 면역 글로불린 G 유도체, Fc 함유 분자, 또는 Fab, scFv, diabody 또는 항원 결합 부위 함유 분자인 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 사용 방법.

[11] 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 구배로 행하는 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 사용 방법.

[12] 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 계단식으로 행하는 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 사용 방법.

[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 사용 방법으로 정제된 항체 또는 항체 유래 물질.

본 발명(제1 형태)에 의하면, 항체 또는 Fc 함유 분자 또는 Fab, scFv 등의 저분자화 항체 등의 항체 유래 물질의 정제 공정의 제1 공정인 어피니티 크로마토그래피 공정에 있어서, 어피니티 정제의 주요 목적인 항체 자체의 고순도화와 함께, 단량체의 선택적 분리 특성을 향상시켜, 후단의 불순물 제거 공정에 대한 부하를 경감시킬 수 있다.

본 발명(제2 형태)에 의하면, 항체 등의 정제 공정의 제1 공정인 어피니티 크로마토그래피 공정 후에, 그의 용출액을 그대로 양이온 교환 크로마토그래피에서 처리 가능하고, 또한 어피니티 담체의 산성 용출 pH와 동일한 pH에서 양이온 교환 담체에의 항체 등의 흡탈착이 가능한 점에서, 어피니티 크로마토그래피 정제와 양이온 교환 크로마토그래피 정제를 일체 처리 가능하고 효율적인 프로세스 구축이 가능하다. 또한, 본 발명(제2 형태)에 의하면, 정제 후의 단량체 항체가 높은 함량(순도)으로 얻어진다. 또한, 이하의 도면의 간단한 설명에 있어서, 제1 형태에서는 도 1 내지 10, 12 내지 16, 제2 형태에서는 도 1 내지 16이 참조된다.

도 1은, 프로테인 A 어피니티 크로마토그래피 공정, 바이러스 불활성화 공정 및 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 이 순서로 행하는 종래의 플로우를 나타내는 도면이다.
도 2는, 본 발명의 일례를 나타내는 흐름도이고, 프로테인 A 어피니티 크로마토그래피 공정 및 양이온 교환 크로마토그래피 공정을 동시에 행한 후, 바이러스 불활성화 공정을 행하는 플로우를 나타내는 도면이다.
도 3은, pH3.7, pH4.2, pH4.7에서의 각 양이온 교환기를 갖는 담체의 10％ 누출 DBC를 나타내는 도면이다.
도 4는, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 A)를 충전한 컬럼을 사용한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 비율(％), 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 5는, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 B)를 충전한 컬럼을 사용한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 비율(％), 우 종축은 이온 강도(mM)을 나타냄).
도 6은, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 C)를 충전한 컬럼을 사용한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 비율(％), 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 7은, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 D)를 충전한 컬럼을 사용한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 비율(％), 우 종축은 이온 강도(mM)을 나타냄).
도 8은, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)를 충전한 컬럼을 사용하여, 항체 부하량이 10mg인 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 9는, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)를 충전한 컬럼을 사용하여, 항체 부하량이 30mg인 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 10은, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)를 충전한 컬럼을 사용하여, 항체 부하량이 40mg인 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 11은, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)를 충전한 컬럼의 바로 아래에, 양이온 교환기를 갖는 담체(SP-세파로스 패스트 플로우(세파로스 Fast Flow), 양이온 교환 담체 A)를 충전한 컬럼을 연결한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 12는, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)를 충전한 컬럼의 바로 아래에, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 A)를 충전한 컬럼을 연결한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 13은, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)를 충전한 컬럼의 바로 아래에, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 B)를 충전한 컬럼을 연결한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 14는, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)를 충전한 컬럼의 바로 아래에, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 C)를 충전한 컬럼을 연결한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 15는, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)를 충전한 컬럼의 바로 아래에, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 D)를 충전한 컬럼을 연결한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).
도 16은, 프로테인 A 어피니티 리간드를 갖는 담체(프로테인 A 담체)와, 양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체 D)를 동일 컬럼에 혼합한 경우의 단량체 항체(백색 컬럼) 및 응집체 항체(사선)의 용출을 나타내는 도면이다(횡축은 용출 체적(mL), 좌 종축은 피크 면적 값, 우 종축은 이온 강도(mM)를 나타냄).

본 발명(제1 형태)의 항체 등(항체 또는 항체 유래 물질)의 신규 정제 방법은, 항체 등에 대한 어피니티 리간드를 갖는 담체와 양이온 교환기를 갖는 담체를 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 등의 흡착 및 용출을 행하는 것을 특징으로 하고 있다(본 발명(제1 형태)에 있어서, 연결 컬럼, 혼합 컬럼은, 각각 일체형 컬럼, 혼합형 컬럼으로 칭하는 경우가 있고, 「흡착」이란, 「부하」를 말하는 경우가 있음).

예를 들어, 본 발명(제1 형태)의 정제 방법은, 상기 항체 등에 대한 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 사용한 항체 등의 정제 방법이고, 상기 담체 1을 충전한 컬럼의 하류측에 상기 담체 2를 충전한 컬럼을 직결한 일체형 컬럼 또는 상기 담체 1과 담체 2 양쪽의 혼합물이 충전된 혼합형 컬럼에, 항체 등 함유액을 통액시켜 항체 등을 컬럼에 부하하고, 계속해서 용출액을 통액시킴으로써 부하한 항체 등을 용출시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 또한, 본 발명(제1 형태)에 있어서, 어피니티 리간드를 갖는 담체 1은, 바람직하게는 양이온 교환기를 포함하지 않고, 양이온 교환기를 갖는 담체 2는, 바람직하게는 어피니티 리간드를 포함하지 않는다.

본 발명(제2 형태)은, 어피니티 담체로부터 표적 분자(항체 등)의 용출을 행하는 산성 용출 pH에서 양이온 교환 담체로부터의 항체 등의 분리를 행하는 것, 또는 어피니티 담체와 양이온 교환 담체를 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 등의 흡착 및 용출을 행하는 것을 특징으로 하고 있다(본 발명에 있어서, 연결 컬럼, 혼합 컬럼은 각각 일체형 컬럼, 혼합형 컬럼으로 칭하는 경우가 있고, 「흡착」이란, 「부하」를 말하는 경우가 있음). 즉, 본 발명(제2 형태)의 양이온 교환기를 갖는 담체의 사용 방법은, pKa 4.0 이상인 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체에 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하한 후, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명(제2 형태)에 있어서, 어피니티 리간드를 갖는 담체 1은, 바람직하게는 양이온 교환기를 포함하지 않고, 양이온 교환기를 갖는 담체 2는, 바람직하게는 어피니티 리간드를 포함하지 않는다. 이들 제2 형태의 특징은, 제1 형태에서 사용될 수도 있고, 제1 형태의 구성 요건으로 될 수도 있다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)은, 항체 어피니티 크로마토그래피 정제와 양이온 교환 크로마토그래피 정제를 일체로 한 컬럼을 조작함으로써 실시할 수 있다. 즉, 2 크로마토그래피 공정(도 1 참조, 종래형의 플로우)을 1 크로마토그래피 공정(도 2 참조, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 정제 플로우)에서 실시할 수 있는 것으로부터, 공정수를 생략할 수 있고, 각 공정에서 필요한 용액을 사용하지 않아, 생산 효율을 높일 수 있다. 게다가, 항체 단량체가 높은 함량(높은 순도)을 실현할 수도 있다.

이하에, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)에 있어서의 양이온 교환 담체 및 항체 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 1 크로마토그래피화에 대해서 상세하게 설명한다.

어피니티 리간드를 갖는 담체(어피니티 담체)

본 발명(제1 형태, 제2 형태)에 있어서의, 「어피니티 리간드를 갖는 담체」(이하, 어피니티 리간드를 갖는 담체 1, 어피니티 담체 또는 어피니티 담체 1로 칭하는 경우가 있음)란, 항원과 항체의 결합으로 대표되는, 특이적인 분자 간의 친화력에 기초하여, 어떤 분자의 집합으로부터 표적(목적)의 분자를 선택적으로 포집(결합)하는 물질이 리간드로서 수불용성 담체에 고정화된 것을 나타낸다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)에 사용할 수 있는 어피니티 리간드는, 표적 분자로서 항체 등에 특이적으로 결합할 수 있는 특징을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 펩티드성 리간드, 단백질성 리간드, 또는 화학 합성성 리간드(합성 화합물)가 바람직하다. 표적 분자에 대한 특이성의 시점으로부터 펩티드성 또는 단백질성 리간드가 더욱 바람직하고, 그 중, 항체 등에 대한 어피니티 리간드가 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 프로테인 H, 프로테인 D, 프로테인 Arp, 프로테인 FcγR, 항체 결합성 합성 펩티드 리간드 및 그들의 유연 물질인 것이 특히 바람직하다. 제1 및 제 2 형태에 있어서, 특히 제1 형태에 있어서, 상기 어피니티 리간드로서는 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L 또는 그들의 유연 물질이 보다 바람직하고, 프로테인 A 또는 그들의 유연 물질이 가장 바람직하다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 상기 어피니티 리간드는, 표적 분자 결합 도메인(단량체 펩티드 또는 단백질, 단일 도메인)을 갖고 있으면 특별히 제한되지 않지만, 2개 이상의 도메인이 연결된 다량체 펩티드 또는 단백질(복 도메인)이 바람직하고, 2 내지 10개가 보다 바람직하고, 2 내지 8개, 또한 2 내지 6개의 도메인이 연결된 다량체 단백질인 것이 바람직하다. 이 다량체 단백질은, 단일의 표적 분자 결합 도메인의 연결체인 호모 다이머, 호모 트리머 등의 호모 폴리머일 수도 있고, 표적 분자가 동일하면, 복수 종류의 표적 분자 결합 도메인의 연결체인 헤테로 다이머, 헤테로 트리머 등의 헤테로 폴리머일 수도 있다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 상기 어피니티 리간드의 표적 분자 결합 도메인을 연결하는 방법으로서는, 다량체 단백질에 3차원 입체 구조를 불안정화하지 않는 방법이 바람직하고, 예를 들어 도메인 배열의 말단 아미노산을 개재하는 연결 방법, 도메인 배열의 아미노산 잔기를 통하지 않고 연결하는 방법, 또는 1개 또는 복수의 도메인 배열 이외의 아미노산 잔기로 연결하는 방법을 들 수 있고, 이들 방법으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 상기 어피니티 리간드로서는, 다량체 단백질을 1개의 구성 성분으로서, 기능이 상이한 다른 단백질과 융합시킨 융합 단백질을 바람직하게 사용할 수 있다. 융합 단백질로서는, 알부민이나 GST(글루타티온S-트랜스페라제)가 융합한 단백질이나 DNA 앱타머 등의 핵산, 항생 물질 등의 약물, PEG(폴리에틸렌글리콜) 등의 고분자가 융합되어 있는 단백질 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

제1 형태에 있어서, 어피니티 담체 1의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC는, 통상 1mg/mL 이상 100mg/mL 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10mg/mL 이상, 더욱 바람직하게는 15mg/mL 이상, 또한 보다 바람직하게는 20mg/mL 이상, 특히 바람직하게는 30mg/mL 이상이다.

이러한 10％ DBC는, 예를 들어 이하의 식에 의해 구할 수 있다.

DBC_10％=(V_10％-V_d)C₀/V_c(식 중, V_10％는 IgG가 10％ 누출했을 때의 용액 체적, V_d는 배관 내 체적(예를 들어, 인젝션에서 컬럼 입구까지의 배관 내 체적 및 컬럼 출구에서 검출기까지의 배관 내 체적을 포함함), C₀는 부하액의 항체 농도(mg/mL), V_c는 컬럼 체적). DBC_10％를 측정하는 경우, 소정의 유속, 즉 소정의 체류 시간(예를 들어 1분 내지 10분, 적합하게는 3 내지 6분)에서 행하는 것이 적합하다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 상기 어피니티 담체의 체적 평균 입경은, 예를 들어 1㎛ 이상 1000㎛ 이하이고, 5㎛ 이상 500㎛ 이하인 것이 바람직하고, 10㎛ 이상 200㎛ 이하인 것이 보다 바람직하고, 150㎛ 이하가 더욱 바람직하고, 120㎛ 이하가 더욱 보다 바람직하고, 100㎛ 이하가 특히 바람직하다.

양이온 교환기를 갖는 담체(양이온 교환 담체)

본 발명(제1 형태, 제2 형태)에 있어서의, 「양이온 교환기를 갖는 담체」(이하, 양이온 교환기를 갖는 담체 2, 양이온 교환 담체 또는 양이온 교환 담체 2라고 칭하는 경우가 있음)는 어피니티 리간드로부터 표적 분자인 항체 등이 용출(탈리)하는 조건하에서 양이온 교환기로서 기능하고 표적 분자를 포착할 수 있음과 함께, 나트륨 이온, 칼륨 이온 등의 카운터 이온에 의해, 해당 표적 분자의 단량체(모노머), 응집체의 순서로 이온 강도 의존적으로 용출(탈리)할 수 있는 양이온 교환기가 수불용성 담체 상에 고정화되어 있는 것일 수 있다. 어피니티 리간드로부터의 표적 분자의 용출 pH인 산성 pH 영역에 있어서, 80％ 이상의 회수율로 표적 분자를 회수하기 위해서, 양이온 교환기로서, 약산성기인 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환기(카르복실기 함유 리간드)의 이용이 바람직하다. 또한, 상기 카르복실기 함유 리간드는, 산성 아미노산에서 유래되는 것이 가능하고, 보다 바람직하게는 글루탐산에서 유래되는 것이다. 통상, 어피니티 담체로부터의 용출에는 pH4.0 이하의 산성 pH가 사용되는 점에서, 당해 pH에서 높은 회수율을 얻기 위해서는, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 양이온 교환 리간드인 카르복실기 함유 리간드의 pKa는 4.0 이상이다. 상기 카르복실기 함유 리간드의 pKa는, 바람직하게는 4.05 이상 6.5 이하, 보다 바람직하게는 4.10 이상 6.45 이하이다. pKa가 낮으면, 항체 수율이 저하될 우려가 있다.

제1 형태에 있어서, 그의 바람직한 형태에서는, 양이온 교환기가 카르복실기, 술폰기 등인 것이 권장된다. 그 중에서도, 카르복실기가 바람직하고, pKa가 4.0 이상인 카르복실기가 보다 바람직하다. 또한, 상기 카르복실기는, 산성 아미노산에서 유래되는 것이 가능하고, 보다 바람직하게는 글루탐산에서 유래되는 것이다. 또한, 어피니티 리간드로부터의 표적 분자의 용출 pH 영역에 있어서, 국소적인 산성 환경의 형성을 피하는 것이 바람직하고, 약산성기인 것이 바람직하다. 예를 들어, 프로테인 A를 어피니티 리간드로 하는 담체를 사용하는 경우에는, 양이온 교환기로서 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환기의 이용이 바람직하다.

제1 형태에 있어서, 상기 양이온 교환기의 pKa는, 3.5 이상 6.5 이하인 것이 적합하고, 보다 바람직하게는 4.0 이상 6.0 이하, 더욱 바람직하게는 4.1 이상 5.5 이하이다. pKa가 낮으면, 항체 수율이 저하될 우려가 있다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)에 있어서, 양이온 교환기를 갖는 담체와 어피니티 담체를 연결형 컬럼 또는 혼합형 컬럼에 사용하는 경우, 양이온 교환기의 pKa와 용출 pH는, 양이온 교환기 pKa≥용출 pH의 관계를 만족하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 양이온 교환기 pKa>용출 pH의 관계를 만족한다.

종래에는, 양이온 교환기를 갖는 담체를 단독으로 사용할 때, 양이온 교환기 pKa<용출 pH의 조건에서 행해져 있던 바, 양이온 교환기를 갖는 담체와 어피니티 담체를 병용하기 위한 적합한 조건을 본 발명에서 발견한 것이다. 상기 관계를 충족하는 한, 용출시에 표적 단백질(항체 등)의 전하가 플러스측으로 크게 대전하는 것에 대해서, 양이온 교환기의 리간드가 마이너스로부터 플러스측으로의 전화가 비교적 억제되기 때문에, 플러스의 전하를 더욱 띤 응집 항체 등을 회수할 수 있어, 항체 단량체가 정제되기 쉬워진다고 생각된다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 상기 양이온 교환 담체의 체적 평균 입경은, 예를 들어 1㎛ 이상 1000㎛ 이하이고, 5㎛ 이상 500㎛ 이하인 것이 바람직하고, 10㎛ 이상 200㎛ 이하인 것이 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 150㎛ 이하, 또한 보다 바람직하게는 120㎛ 이하, 특히 바람직하게는 100㎛ 이하이다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 상기 양이온 교환 담체의 이온 교환 용량은, 0.001mmol/mL 이상 0.5mmol/mL 이하인 것이 바람직하다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 상기 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체(상기 양이온 교환 담체 2)의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC는, 1mg/mL 이상 200mg/mL 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10mg/mL 이상, 더욱 바람직하게는 15mg/mL 이상, 더욱 보다 바람직하게는 20mg/mL 이상, 특히 바람직하게는 30mg/mL 이상이다. 또한, 이러한 10％ DBC는, 예를 들어 이하의 식에 의해 구할 수 있다.

DBC_10％=(V_10％-V_d)C₀/V_c(식 중, V_10％는 IgG가 10％ 누출했을 때의 용액 체적, V_d는 배관 내 체적(예를 들어, 인젝션에서 컬럼 입구까지의 배관 내 체적 및 컬럼 출구에서 검출기까지의 배관 내 체적을 포함함), C₀는 부하액의 항체 농도(mg/mL), V_c는 컬럼 체적). DBC_10％를 측정하는 경우, 소정의 유속, 즉 소정의 체류 시간(예를 들어 1분 내지 10분, 적합하게는 3 내지 6분), 소정 pH(예를 들어 3 내지 5, 특히 4)에서 행하는 것이 적합하다.

수불용성 담체(담체)

본 발명(제1 형태, 제2 형태)에 사용할 수 있는 「수불용성 담체」는, 물에 불용인 기재이며, 항체 어피니티 리간드와 양이온 교환기를 고정화할 수 있으면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 글래스 비즈, 실리카 겔 등의 무기 담체, 가교 폴리비닐알코올, 가교 폴리아크릴레이트, 가교 폴리아크릴아미드, 가교 폴리스티렌 등의 합성 고분자나, 결정성 셀룰로오스, 가교 셀룰로오스, 가교 아가로오스, 가교 덱스트란 등의 다당류를 포함하는 유기 담체, 나아가 이들의 조합에 의해 얻어지는 유기-유기, 유기-무기 등의 복합 담체 등을 들 수 있다. 시판품으로서는, 다공질 셀룰로오스 겔인 GCL2000, 알릴덱스트란과 메틸렌비스아크릴아미드를 공유 결합으로 가교한 세파크릴(Sephacryl) S-1000, 아크릴레이트계의 담체인 도요펄(TOYOPEARL), 아가로오스계의 가교 담체인 세파로스(Sepharose) CL4B, 래피드 런 아가로오스 비즈(Rapid Run Agarose Beads), 및 셀룰로오스계의 가교 담체인 셀루핀(Cellufine) 등을 예시할 수 있다.

또한, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)에서 사용하는 수불용성 담체는, 단위 시간당의 처리 용량의 관점에서, 표면적이 큰 것이 바람직하고, 적당한 크기의 세공을 다수 갖는 다공질인 것이 바람직하다. 담체의 형태로서는, 비즈상, 모노리스상, 섬유상, 막상(중공섬유를 포함함) 등 모두 가능하고, 임의의 형태를 선택할 수 있다. 수불용성 담체 상에 배치된 항체 어피니티 리간드와 양이온 교환기가 협주적으로 기능하기 위해서, 그의 물리적 거리가 근접하고, 일정한 체류 시간이 얻어지는 것이 당해 분리 매트릭스의 기능을 효과적으로 발휘할 수 있다는 점에서, 다공질 비즈가 바람직하다. 양이온 교환기를 항체 어피니티 리간드가 고정화된 담체에 고정화하는 경우, 다당류를 포함하는, 또는 단당 또는 다당류로 수식된 담체는, 항체 어피니티 리간드 도입의 용이함의 면에서 바람직하다. 구체적으로는, 아가로오스나 셀룰로오스 담체가 바람직하지만, 특히 이것으로 제한되는 것은 아니다.

제1 형태에 있어서, 어피니티 리간드를 수불용성 담체, 분리 매트릭스에 고정화하는 방법으로서는, 일반적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체 어피니티 리간드의 아미노기가 담체 상에 도입된 포르밀기를 개재해서 담체에 결합할 수도 있고, 항체 어피니티 리간드의 아미노기가 담체 상의 활성화된 카르복실기를 개재해서 담체에 결합할 수도 있다.

또한, 이들의 수불용성 담체는, 항체 어피니티 리간드 도입 전에 리간드가 담체에 공유 결합할 수 있도록 활성화되지만, 시판되고 있는 활성화 담체를 사용할 수도 있고, 스스로 활성화를 행할 수도 있다.

제1 형태에 있어서, 활성화에 의해 수불용성 담체에 도입되는 관능기로서는, 어피니티 리간드와 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 에폭시기(에피클로로히드린), 브롬화시안, N,N-디숙신이미딜탄산염(DSC) 등으로 활성화되는 히드록시기, 알데히드기 또는 활성화 카르복실산기(예를 들어, N-히드록시숙신이미드(NHS)에스테르, 카르보닐디이미다졸(CDI) 활성화 에스테르) 등의 반응성 관능기(「활성화기」) 등을 들 수 있다(문헌 [Hermanson G.T. 외 저, 「Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press」, 1992년], 미국 특허 제5,874,165호, 미국 특허 제3,932,557호, 미국 특허 제4,772,653호, 미국 특허 제4,210,723호, 미국 특허 제5,250,6123호, 유럽 특허 공개 제1352957호, WO2004/074471). 이들 중에는, 어피니티 리간드가 담체에 직접 공유 결합하는 것과, 직쇄, 분지쇄 또는 환상의 링커 또는 스페이서가 사용되는 것이 포함된다. 또한, 항체 어피니티 리간드가 도입된 담체를 활성화하는 경우에는, 항체 어피니티 리간드와 직접 반응하지 않는 활성화 방법이 바람직하다.

제1 형태에 있어서, 어피니티 리간드 내, 단백질성 리간드를 담체에 고정화하는 방법은, 단백질의 관능기의 일부와 담체의 관능기의 일부를 반응시키는 방법을 사용할 수 있지만, 그의 반응에 이용할 수 있는 단백질측의 주된 관능기(활성기)는 N 말단 아미노산 및 리신(Lys) 측쇄의 아미노기, 또는 시스테인(Cys) 측쇄의 티올기, 또는 C 말단 아미노산 및 글루탐산(Glu) 측쇄 및 아스파라긴산(Asp) 측쇄의 카르복실기 등을 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

제1 형태에 있어서, 또한, 리간드의 배향성을 제어하여 단백질성 항체 어피니티 리간드를 수불용성 담체에 고정화하는 방법으로서, C 말단에 시스테인을 갖는 프로테인 A를 이용하는 방법이 제안되어 있다(미국 특허 제6,399,750호, 문헌 [Ljungquist C.외 저, 「Eur. J. Biochem.」, 1989년, 186권, 557-561면]).

링커를 이용하는 고정화 기술로서는, 담체와 리간드의 거리를 확보하고, 입체 장해를 배제해서 고성능화를 도모하는 방법 외에, 링커 또는 스페이서 중에 관능기(예를 들어, 대전 아민)를 부여, 형성시키는 방법 등을 들 수 있다. 항체 어피니티 리간드의 고정화시에 링커 또는 스페이서 부분에 리간드를 효과적으로 집적하고, 고정화 수율의 향상에 의한 분리 성능의 향상이 검토되어 오고 있다. 예를 들어, 링커 암의 일부로서 NHS 활성화된 카르복실산에서 유도체화된 아가로오스 담체에의 단백질성 리간드의 고정화 기술을 들 수 있다(미국 특허 제5,260,373호, 일본 특허 공개 제2010-133733, 일본 특허 공개 제2010-133734).

또한, 링커나 스페이서와는 별도로 담체에 회합성기를 이용하고, 항체 어피니티 리간드를 담체에 집적한 후에, 회합성기와 항체 어피니티 리간드의 사이에 공유 결합을 형성시키지 않고, 수불용성 담체 상에 항체 어피니티 리간드를 개별로 고정화하는 방법도 제안되어 있다(일본 특허 공개 제2011-256176).

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 양이온 교환기를 수불용성 담체에 고정화 또는 도입하는 방법으로서, 통상 양이온 교환기의 제작에 사용되는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 당 골격에 카르복시메틸기를 도입하는 방법으로서, 알칼리 조건하에서 모노클로로아세트산을 반응시키는 방법이나, 황산기를 도입하는 방법으로서, 알칼리 조건하에서 황산을 반응시키는 방법이 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 수불용성 담체에 아미노기와 반응하는 활성기를 도입한 후에, 아미노산의 아미노기를 개재하여 아미노산을 고정화함으로써 카르복실기를 도입할 수도 있다. 또한, 수불용성 담체 상에 존재 또는 도입된 디올기에 대하여 과요오드산나트륨을 반응시켜 담체를 활성화하여 알데히드기를 도입하고, 아미노기와 양이온 교환기를 동일 분자 내에 갖는 분자를 첨가하고, 이민 형성 후에 환원 처리함으로써, 담체 상의 알데히드기와 아미노기를 환원적 아미노화법에 의해 공유 결합시켜 양이온 교환기를 도입할 수 있는 양이온 교환기는, 직접, 수불용성 담체에 고정화되어 있을 수도 있고, 스페이서, 링커 등을 개재해서 고정화되어 있을 수도 있다. 또한, 어피니티 담체로부터 표적 분자가 용출(탈리)하는 산성 pH 조건하에서 양이온 교환기로서 기능할 수 있으면, 양이온 교환기, 스페이서나 링커가 다른 기능을 갖는 관능기를 포함하고 있을 수도 있고, 그들의 분자 형상도 특별히 제한되지 않는다. 아미노산의 카르복실기를 도입하는 방법은, 리간드가 탈리한 경우의 독성의 관점에서도, 항체 정제용 분리 매트릭스의 재료로서 바람직하다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)은, 어피니티 담체로부터 표적 분자의 용출을 행하는 산성 용출 pH에서 양이온 교환 담체로부터의 항체 등의 분리를 행하는 것, 또는, 어피니티 담체와 양이온 교환 담체를 사용해서 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 등의 흡착 및 용출을 행하는 것을 특징으로 하고 있다.

항체 의약품의 정제 플랫폼 프로세스에 이용되는 제1 크로마토그래피와 제2 크로마토그래피의 대표예로서, 예를 들어 프로테인 A 크로마토그래피와 양이온 크로마토그래피의 조합이 사용된다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 제1 크로마토그래피의 프로테인 A 크로마토그래피는, 단량체와 응집체의 분리능이 낮고, 분리의 안정성에서도 부족하다는 점에서, 통상 표적 분자인 항체 또는 Fc 함유 분자의 변성이나 응집을 최소한으로 억제하면서 높은 회수율이 얻어지는 용출 조건이 선정되고, 응집체 등의 제거는 후단 프로세스가 담당한다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 제2 크로마토그래피로서 양이온 교환 크로마토그래피가 선정되는 경우에는, 일반적으로 흡탈착 모드에서 응집체나 다른 협잡물의 제거가 행해지지만, 프로테인 A 리간드를 갖는 담체(이하, 프로테인 A 담체라고도 함)로부터의 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피의 흡착에 적합한 pH 및 이온 강도로 조정할 필요가 있다. 따라서, 프로테인 A 크로마토그래피 공정의 조건을 설정한 후에, 양이온 교환 크로마토그래피 공정의 조건을 설정할 필요가 있고, 또한 다종의 제한 인자가 있는 한편으로 효율적인 응집체 등의 분리가 가능하다고는 단언할 수 없다.

한편, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 방법을 사용하는 경우, 어피니티 담체와 양이온 교환 담체를 사용해서 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 등의 흡착 및 용출을 행함으로써, 2 공정의 크로마토그래피 조작을 1 공정으로 단축 가능하고, 사용하는 완충액의 종류 및 사용량, 추가로 작업 시간의 단축을 기대할 수 있다.

또한, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 신규 항체 정제법은, 어피니티 리간드로부터의 표적 분자가 용출되는 좁은 pH 영역에서, 이온 강도 등의 설정에 의해 단량체 함량이 높은 용출 화분을 얻는 것이 가능하다. 특히 모노클로날 항체의 정제에 있어서는, 당해 용출 pH는 표적 분자의 등전점으로부터 크게 이격되어 있기 때문에, 항체마다 용출 이온 강도의 폭에 큰 차이가 없고, 좁은 범위에서 각종 표적 분자의 사용 조건의 설정이 가능한 것을 기대할 수 있다. 또한, 어피니티 리간드로서, 개변 프로테인 A 리간드를 사용하는 경우, 용출 pH 영역을 더욱 좁게 설정 가능한 것 이외에, 알칼리 CIP(cleaning in place; 정치 세정)의 사용에 의해, 효과적인 세정도 가능하기 때문에, 안정적인 프로세스 구축의 관점에서는 개변 프로테인 A의 이용이 바람직하다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 어피니티 담체를 사용하지 않고 다른 크로마토그래피 담체를 연결 또는 혼합 컬럼으로서 사용한 경우, 예를 들어 이온 교환 담체와 소수 크로마토그래피 담체를 연결 또는 혼합해서 사용하는 경우, 가령 표적 분자가 모노클로날 항체이어도, 소수성 및 등전점의 상이 등에 의해 표적 분자마다 사용 조건의 설정이 다른 것 외에, 특이성도 낮고, 회수 공정으로서 플랫폼화는 곤란하다고 생각된다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼은, 흡착시에 항체 어피니티 리간드에 의해, 높은 특이성을 발휘할 수 있는 것 외에, 어피니티 리간드의 용출 조건 범위 내에서 이온 강도의 설정에 의해 용이하게 그의 사용 조건이 설정 가능한 점에서, 어피니티 담체 1을 사용하지 않은 다른 담체의 조합보다도 우수하다.

일단 프로테인 A 크로마토그래피 컬럼에 흡착·용출시킨 항체를 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 전량 완전히 포착시킨 후에, pH5.0-9.0의 완충액으로 용출함으로써, 프로테인 A 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피 사이의 홀딩 탱크를 없애는 방법이 개시되어 있지만, 양이온 교환 담체로부터의 용출 pH로서, 어피니티 담체로부터의 용출 pH보다도 높은 pH를 사용함으로써 본 발명(제2 형태)과 구별된다. 또한, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)은 어피니티 담체와 양이온 교환 담체를 연결 또는 혼합 컬럼으로서 일체의 컬럼으로 사용 가능하고, 단일 용출 조작으로 용출을 행하는 과정에서 표적 물질을 분획할 수 있는 점, 및 그의 용출 pH가 5.0 미만이나 4.0 이하이고, 어피니티 담체의 용출 pH인채로 양이온 교환 담체의 용출을 행하는 점에서, 본질적으로 다른 기술 영역이다(WO2011/017514).

보다 구체적으로는, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼의 사용 방법에 관한 것이고, 중성 부근에서 항체 등의 표적 분자를 흡착시키는 경우, 양이온 교환기의 카운터 이온을 일정 농도 이상 첨가해서 사용하는 것이 바람직하고, 당해 조건에서는 양이온 교환기 기능은 작용하지 않고, 또한 작용해도 더욱 높은 이온 강도의 세정으로 그 양이온 교환기에서 유래하는 비특이적인 흡착물은 세정 제거할 수 있다. 한편, 이온 강도는 어피니티 리간드의 흡착을 저해하지 않고, 높은 특이성을 갖고 목적 물질을 흡착할 수 있는 것 외에, 고이온 강도의 세정액의 사용에 의해, 기재, 링커, 스페이서, 리간드 및 표적 분자에 비특이적으로 흡착하는 분자를 효과적으로 세정 제거할 수 있다.

통상, 재조합 모노클로날 항체를 발현시킨 배양 상청은, 인간 등의 체액에 가까운 이온 강도를 갖는 점에서 직접 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 연결 또는 혼합 컬럼에 제공해도 높은 특이성을 유지할 수 있는 것 외에, 더 높은 이온 강도의 세정액에 의해 협잡물을 더욱 저감시킬 수 있다. 어피니티 담체로부터 표적 분자를 포함하는 조성물을 용출시키기 전에, 이온 교환기의 기능을 발휘할 수 있도록 이온 강도가 낮은 완충액의 통액 후에, 어피니티 리간드로부터의 낮은 pH 용출과 연동해서 양이온 교환기의 이온 강도 의존적 용출을 행하는 것이 바람직하다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)에 있어서, 어피니티 담체를 충전한 컬럼 A와 양이온 교환 담체를 충전한 컬럼 B를 연결하는 경우, 상기 컬럼 A의 바로 아래에 상기 컬럼 B를 연결하는 것이 적합하고, 연결 부분은 도중에 분기 밸브를 설치하지 않고 직관으로 연결되는 것이 바람직하지만, 유로로서 직결 가능한 한, 도중에 분기 밸브를 삽입할 수도 있다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼은, 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 비율에 의해 그의 기능이 조절 가능하다. 어피니티 담체의 중성 조건 하에서의 표적 물질의 결합 용량이 어피니티 담체로부터의 산성 용출 pH에서의 양이온 교환 담체의 결합 용량보다도 큰 경우에는, 산성 용출시에 저이온 강도에서도 표적 물질이 컬럼으로부터 용출되는 경향이 있고, 어피니티 담체의 결합 용량이 양이온 교환 담체의 결합 용량과 동일 정도 또는 낮은 경우에는, 저이온 강도에서는 어피니티 담체로부터 용출된 항체가 양이온 교환 담체로 완전히 이행되기 때문에, 더 높은 회수율을 얻기 위해서는 용출 이온 강도를 높게 설정할 필요가 있다. 어떠한 경우도, 이온 강도 및/또는 pH의 조절에 의해 회수율, 및 그의 단량체 비율의 제어가 가능하다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 어피니티 담체의 결합 용량(예를 들어 10％ DBC)과 양이온 교환 담체의 결합 용량(예를 들어 10％ DBC)의 비율에 특별히 제한을 두지 않지만, 흡착 조건하에서의 어피니티 담체의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 결합 용량에 대한, 양이온 교환 담체의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 결합 용량이 10배 이하인 것이 바람직하고, 5배 이하인 것이 보다 바람직하다. 또한, 하한은 1/10배 이상인 것이 바람직하고, 1/5배 이상인 것이 보다 바람직하다. 상기 결합 용량의 비율은, 예를 들어 어피니티 담체, 양이온 교환 담체 각각의 10％ DBC 값으로부터 얻어지는 비율일 수도 있다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 상기 일체형 컬럼 또는 상기 혼합형 컬럼을 구성하는 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 비율(어피니티 담체/양이온 교환 담체)은 체적 기준으로 1/20 이상 20/1 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1/5 이상 5/1 이하이다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼에 의해 정제되는 표적 분자는, 항체 등(면역 글로불린 G 및 그의 유연 물질)이고, 일반적으로 항체라고 칭해지는 분자 외에, 면역 글로불린 분자의 정상 영역인 Fc 영역과 다른 기능성 단백질 또는 펩티드를 융합해서 이루어지는 Fc 융합 단백질(Fc 함유 분자), 및 저분자화 항체가 포함되고, 항체 의약품의 원료로서 이용된다. 구체적으로, 항체 등은, 면역 글로불린 G, 면역 글로불린 G 유도체, Fc 함유 분자, 나아가 Fab, scFv 및 diabody 등의 저분자화 항체를 포함하는 것이 바람직하다.

이하에, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼을 일체로서 항체 등의 흡착 및 용출을 행하는 사용 방법의 상세한 설명을, 표적 분자가 면역 글로불린 G인 경우에 대해서 예시하지만, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)은 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)에 있어서의 적합한 사용 방법은, 예를 들어 (1) 상기 양이온 교환 담체를 충전한 컬럼 앞에 어피니티 담체를 충전한 컬럼을 연결해서 일체형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건(예를 들어 pH6 이상 9 이하)에서 항체 등 함유 용액을 상기 일체형 컬럼에 부하한 후에, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 등을 용출하는 방법, (2) 상기 양이온 교환 담체를 어피니티 담체와 함께 혼합 상태로 갖는 혼합형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 등 함유 용액을 부하해서 pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 등을 용출하는 방법 등이다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼을 사용한 표적 분자(항체)의 정제는, 크고, 흡착 공정, 세정 공정, 이온 강도 조절 공정, 용출 공정의 4공정으로 구성되는 것 이외에, 그 후의 재생 공정 및/또는 CIP 공정, 재평형화 공정 등의 재이용을 위한 공정을 포함하고 있을 수도 있다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 흡착 공정에서는, 일반적인 어피니티 컬럼 크로마토그래피 정제 방법을 사용할 수 있다. 즉, 그의 일례에 있어서, 항체 등(예를 들어, 면역 글로불린 G)을 포함하는 단백질 용액의 pH가 중성 부근이 되도록 조정한 후, 해당 용액을 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 어피니티 담체와 양이온 교환기(양이온 교환 담체)의 연결 또는 혼합 컬럼에 통액시키고, 어피니티 담체가 충전된 컬럼 또는 어피니티 담체에 항체 등(예를 들어, 면역 글로불린 G)을 특이적으로 흡착시킨다. 예를 들어, 프로테인 A 담체를 어피니티 담체로 하는 경우, 그의 부하 pH는 6 이상이 바람직하고, 6.3 이상 9 이하가 보다 바람직하고, 6.5 이상 8.5 이하가 더욱 바람직하다. 포유류 배양 세포에 의해 생산되는 면역 글로불린 G의 정제에 있어서, 특히 이온 강도의 조정을 필요로 하지 않는 것 이외에, 미리 이온 강도를 올려서 더욱 비특이 흡착을 억제할 수도 있다. 흡착 공정에 있어서, 소정 농도의 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 담체에 흡착시키지만, 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액의 용매로서, 예를 들어 PBS(약 10mM 인산, 약 150mM NaCl 등)를 사용할 수도 있다. 또한, 흡착 공정 전에, 평형화 공정도를 행할 수도 있지만, 평형화 용액의 용매로서, 예를 들어 PBS(약 10mM 인산, 약 150mM NaCl 등)를 사용할 수도 있다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 세정 공정에서는, 어피니티 리간드가 기능하는 조건 범위의 완충액을 적당량 통과시켜, 컬럼 내부를 세정한다. 즉, pH의 바람직한 범위는 상기 부하시와 동일한 범위(중성 부근의 pH)일 수도 있고, 예를 들어 6 이상이 바람직하다. 이 시점에서는 표적 분자인 항체 등(예를 들어, 면역 글로불린 G)은 어피니티 담체에 흡착되어 있다. 이때, 중성 부근의 pH에서 이온 강도나 조성물의 최적화에 의해, 불순물을 효과적으로 제거할 수 있는 경우가 있다. 부하, 세정시에 있어서, 양이온 교환 담체가 기능하지 않는 조건이 바람직하고, 즉, 중성 부근의 pH로 함과 함께 일정 이상의 고이온 강도의 세정액의 이용이 바람직하고, 이 과정에서 양쪽 분리 매트릭스 및/또는, 면역 글로불린 G를 개재해서 비특이적으로 컬럼에 잔류하는 불순물을 세정할 수 있다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 항체 등 함유 용액을 부하해서 하기의 용출을 개시하기 전에, 세정 공정을 행하지만, 세정 공정의 횟수는, 예를 들어 적어도 1회 이상, 바람직하게는 2회 이상이다. 세정 공정의 적합예는, 예를 들어 이하의 예를 들 수 있지만, 이하의 예로 한정되는 것은 아니다.

(1) 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액(제2 세정액)을 통액시키는 것이 바람직하고, (2) 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액과 동일하거나 또는 보다 높은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액(제1 세정액)을 통액시키고, 계속해서 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액(제2 세정액)을 통액시키는 것도 바람직하다. 상기 (1) 및 (2)의 방법은, 통상의 프로테인 A 크로마토그래피에서 사용되는 세정 방법을, 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼에도 적용하는 것이고, 프로테인 A 담체에 비특이적으로 흡착한 불순물을 씻어 낼 수 있고, 양이온 교환 담체에 흡착한 불순물도 씻어 낼 수 있다. 또한, 상기 (1)은, 예를 들어 정제 순도가 높은 항체에 대하여 행해지는 것이 적합하고, 상기 (2)는, 예를 들어 배양 상청에 대하여 행해지는 것이 적합하다. 상기 (1) 및 (2)에서 사용되는 제2 세정액은, 예를 들어 10mM Tris/HCl pH7 등의 용액이고, 상기 (2)에서 사용되는 제1 세정액은, 예를 들어 10mM Tris 1M NaCl pH7, 10mM Tris pH7 등의 용액이다. 또한, 상기 (1) 및 (2) 전에, 평형화 용액과 동일한 이온 강도 및 pH의 용액(예를 들어, PBS)으로 전(前) 세정할 수도 있다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 이온 강도 조절 공정에서는, 중성 부근에서 이온 강도가 낮은 완충액으로 컬럼을 치환하고, 용출시의 양이온 교환 담체에 의한 이온 강도 의존적 용출 기능의 발현에 구비한다. 이온 강도는, 용출액의 이온 강도보다도 낮은 것이, 더욱 바람직하다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 용출 공정에서는, 산성 pH, 이온 강도의 조합에 의해, 어피니티 담체로부터의 용출시에 양이온 교환 분리 모드를 기능시켜, 단량체 함량이 높은 화분을 저이온 강도 용출 화분에 회수할 수 있다. 용출액의 pH는 어피니티 담체로부터의 항체 등(예를 들어, 면역 글로불린 G)의 용출 pH를 적용할 수 있다. 당해 pH는, 어피니티 담체와 항체 등(예를 들어, 면역 글로불린 G)의 종류에 의해 결정되는 분리 조건을 중심으로 결정되는 점에서, 특별한 조건 설정을 필요로 하지 않지만, 응집체 등의 생성 억제의 관점에서, 어피니티 담체로부터의 용출이 가능한 범위에서 보다 높은 pH가 바람직하다. 제1 형태, 제2 형태에 있어서, 항체 등의 용출 pH는 4.0 이하이고, 바람직하게는 3.95 이하, 보다 바람직하게는 3.9 이하, 더욱 바람직하게는 3.8 이하이다. 또한 용출 pH는, 예를 들어 3.0 이상, 바람직하게는 3.2 이상, 보다 바람직하게는 3.5 이상일 수도 있다.

제1 형태의 다른 형태에 있어서, 항체 등의 용출 pH는 5.0 미만인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 4.5 이하, 더욱 바람직하게는 4.0 이하이다. 또한 용출 pH는, 예를 들어 3.0 이상, 바람직하게는 3.2 이상, 보다 바람직하게는 3.5 이상일 수도 있다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 어피니티 담체가 프로테인 A 담체인 경우에는, 용출액 pH는 예를 들어 pH는 5.0 미만 2 이상, 4.0 이하 2 이상의 사이에 설정된다. 단, 표적 분자의 산 변성을 피하는 목적에서, pH3.0 이상이 보다 바람직하고, pH3.5 이상이 특히 바람직하다. 용출액 pH의 상한값은 상기와 동일한 것이 바람직하다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 알칼리 내성형의 개변형 프로테인 A 담체를 사용하는 경우에는, 일반적으로 그의 용출 pH는 3.5 내지 4.0의 사이를 중심으로 설정되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 용출 이온 강도는, 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 비율에 의존하는 것 이외에, 단위 체적당의 항체 등(예를 들어, 면역 글로불린 G)의 부하량에도 의존하지만, 구배 실험이나 계단식 용출 실험에 의해 최적화 포인트를 용이하게 설정할 수 있다.

본 발명(제2 형태)의 양이온 교환 담체의 용출 조건 또는 본 발명(제1 형태)의 용출 조건은, 염 농도 구배 용출에도 계단식 용출에서도 적용 가능하지만, 조작의 단순화를 위해서는, 계단식 용출에 의한 항체의 회수와 고 단량체 함량화를 달성할 수 있는 조건 설정이 바람직하지만, 구배 용출은 조건 설정이 보다 용이하다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 예를 들어 항체 등의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 구배로 행할 수도 있고, 항체 등의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 계단식으로 행할 수도 있다. 또한, 세정 공정의 이온 강도와 산성 용출 pH의 조합에서도 응집체 등이 컬럼에 잔류하여 용출 화분에 혼입되지 않는 경우에는, 이온 강도 조절 공정을 생략할 수 있다.

제1 형태, 제2 형태에 있어서, 용출을 개시할 때, 용출액의 pH를 일정하게 하여, 용출액의 이온 강도가 연속적 또는 단계적으로 증대하도록 하는 것이 적합하다. 용출액은, 통상 사용되는 것일 수 있고, 예를 들어 아세트산, 시트르산 등이다. 용출액의 pH는, 3 이상 4.0 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 3.1 이상 3.95 이하, 더욱 바람직하게는 3.2 이상 3.90 이하이다. 특히 제1 형태에 있어서, 용출액의 pH는, 3 이상 5 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 3.1 내지 4.5, 더욱 바람직하게는 3.2 내지 4.0이다. 제1 형태, 제2 형태에 있어서, 이온 강도는, 0.1mM 이상 2000mM 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.5mM 이상 1000mM 이하, 더욱 바람직하게는 1mM 이상 500mM 이하의 범위에서 연속적으로 또는 단계적으로 증대시킨다.

본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼을 사용해서 정제된 항체 등(예를 들어 면역 글로불린 G)은 단일의 분리 모드에 기초하는 항체 어피니티 분리 매트릭스보다도 높은 단량체 선택성을 나타내고, 그의 용출액 중의 단량체 함량이 높다.

단일 분리 모드에 기초하는 어피니티 담체를 사용한 경우에도, 용출 pH 및 이온 강도 등의 최적화에 의해, 단량체 함량을 어느 정도 높이는 것은 가능하지만, 그의 효과가 낮고, 효과 발현에는 보다 큰 회수율의 저하를 수반한다. 본 발명(제 일 형태, 제2 형태)의 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼을 사용함으로써, 특이성이 높은 어피니티 정제와, 주로 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 달성할 수 있는 모노머 함량의 향상을, 단일 크로마토그래피 조작으로 효율적으로 달성 가능한 점에서, 후단 프로세스에의 부하의 저감이 가능하게 되고, 프로세스 전체의 수율 향상과 단량체 함량의 향상에 공헌할 수 있다. 즉, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)의 어피니티 담체와 양이온 교환 담체의 연결 또는 혼합 컬럼으로 사용하는 신규 항체 정제법에 의해, 항체 의약품의 제조 프로세스의 생산성 향상과 고순도화에 기여할 수 있다.

본원은, 2013년 9월 17일에 출원된 일본 특허 출원 제2013-192378호 및 2013년 9월 17일에 출원된 일본 특허 출원 제2013-192379호에 기초하는 우선권의 이익을 주장하는 것이다. 2013년 9월 17일에 출원된 일본 특허 출원 제2013-192378호 및 2013년 9월 17일에 출원된 일본 특허 출원 제2013-192379호의 명세서의 전체 내용이, 본원에 참고를 위해 원용된다.

실시예

이하에 실시예에 기초하여 본 발명(제1 형태, 제2 형태)을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명(제1 형태, 제2 형태)은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

(양이온 교환 담체의 제조예)

카르복실기 도입 담체의 제조(제조예 1)

4％ 아가로오스 비즈로서 냉수로 치환한 저 밀도 글리옥살 4 래피드 런(Low density Glyoxal 4 Rapid Run)(ABT사)를 습윤 체적으로서 4mL를 반응 용기에 취하고, 냉각시킨 1M 글루탐산(pH6)으로 5회 세정하여, 회수 후에 슬러리의 액량을 7mL로 하였다. 크로마토챔버 내에서 2시간 전도 교반한 후에, 1M의 디메틸아민보란 수용액을 0.5mL 추가 투입하고, 크로마토챔버 내에서 1시간 30분 교반하였다. 또한, 밤새 실온에서 전도 교반하였다. 원심하여 담체를 침강시킨 후에 액면이 6mL가 되도록 상청을 제거한 중에, 20mg의 수소화붕소나트륨을 직접 첨가하고, 실온에서 추가로 2시간 전도 교반하였다. 물, 0.1M 시트르산, 0.1M 수산화나트륨 및 0.5M의 NaCl을 첨가한 PBS로 충분히 세정하고, 글루탐산의 아미노기를 개재하여 환원적 아미노화법으로 알데히드기에 카르복실기를 도입한 아가로오스 담체를 얻었다. 본 양이온 교환 담체를 글리옥살(Glyoxal)-COOH로 하였다.

(양이온 교환 담체(카르복실기 함유 리간드)의 pKa 및 이온 교환 용량의 측정)

카르복실기 도입 양이온 교환 담체로서, CM-세파로스 패스트 플로우(GE 헬스케어; 양이온 교환 담체 A), 도요펄 CM-650M(도소; 양이온 교환 담체 B), 프락토겔(FRACTOGEL) COO(M)(메르크; 양이온 교환 담체 C), 글리옥살-COOH(제조예 1; 양이온 교환 담체 D)를 1M KCl(pH2)로 치환하고, 0.1M NaOH로 적정해서 pKa와 이온 교환 용량을 구하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

(양이온 교환 담체의 산성 pH에서의 결합 용량의 측정)

카르복실기 도입 양이온 교환 담체로서, CM-세파로스 패스트 플로우(GE 헬스케어), 도요펄 CM-650M(도소), 프락토겔 COO(M)(메르크), 글리옥살-COOH(제조예 1)을 옴니피트(Omnifit)사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 0.5mg/mL로 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 이하의 크로마토그래피 조건에서 결합 용량을 측정하였다. 부하액의 pH를 3.7, 4.2, 또는 4.7로서, 각각의 결합 용량을 10％ 누출의 동적 결합 용량(10％ DBC)으로서 측정하였다.

양이온 교환 담체의 10％ DBC 측정에 사용한 크로마토그래피 조건

컬럼: ID 0.66cm×높이 7cm, 2.4mL 용량(옴니피트사제)

유속: 0.4mL/분(체류 시간: 6분)

폴리크로날 항체(IgG): 감마글로불린·니찌야쿠(니혼 세이야꾸)

부하액: 0.5mg-IgG/mL(5mM 시트르산: pH3.7, 4.2, 또는 4.7)

평형화액: 5mM 시트르산(pH3.7, 4.2, 또는 4.7)

용출액: 50mM 시트르산, 0.5M 염화나트륨(pH3.7)

CIP액: 0.1M 수산화나트륨, 1M 염화나트륨

중화·재평형화액: 5mM 시트르산(pH3.7, 4.2, 또는 4.7)

각 담체의 결합 용량(10％ DBC)을 도 3에 나타내었다. 그 결과, 카르복실기를 리간드로 하는 각종 양이온 교환 담체의 결합 용량에 큰 차이는 확인되지 않았다. 또한, 표 1의 이온 교환 용량과 결합 용량의 사이에는, 상관관계는 확인되지 않았다. pKa가 낮을수록, 결합 용량의 pH 의존성이 큰 경향이 있었다.

(모노머 함량의 측정)

각 크로마토그래피 용출액을 겔 여과에 제공하고, 응집체와 모노머를 분획하고, 그의 에어리어 값의 비교로부터 모노머 함량을 구하였다. 이하에 겔 여과 조건을 나타내었다.

겔 여과 크로마토그래피 조건

컬럼: 슈퍼덱스(Superdex) 200 10/300 GL(ID 1cm×높이 30cm)(GE 헬스케어)

유속: 0.5mL/분

검출 파장: 214nm

부하액: 100μL/인젝션(Injection)(흡광도 값이 1을 초과하지 않는 범위로 희석)

용리액: PBS(pH7.4)

(비교예 1)

양이온 교환 담체를 사용한 pH5 완충액 중에서의 항체의 분리

양이온 교환 담체로서, CM-세파로스 패스트 플로우(GE 헬스케어), 도요펄 CM-650M(도소), 프락토겔 COO(M)(메르크), 글리옥살-COOH(제조예 1)을 옴니피트사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 0.5mg/mL로 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 이하의 크로마토그래피 조건에서 분리를 행하였다. 용출 프랙션에는, 최종 농도로서 50-100mM의 아르기닌을 첨가하고, pH5 내지 6으로서 겔 여과 크로마토그래피에서 모노머 함량의 측정을 행하였다. 또한, 그의 에어리어 값 분석으로부터 각 분획의 모노머 및 응집체량을 구하였다.

양이온 교환 크로마토그래피 조건

컬럼: ID 0.66cm×높이 7cm, 2.4mL 용량(옴니피트사제)

유속: 0.4mL/분(체류 시간: 6분), 단, CIP 이후는 0.8mL/분

부하액: 0.5mg-IgG/mL(10mM 시트르산, pH5)

평형화(5 컬럼 체적): 10mM 시트르산, pH5

부하(30mg)

세정(5 컬럼 체적): 10mM 시트르산, pH5

용출 구배(40 컬럼 체적): A→B 리니어 구배

A액: 10mM 시트르산, pH5

B액: 250mM 시트르산, pH5

재생(4 컬럼 체적): 50mM 시트르산, 250mM 염화나트륨, pH5

CIP(4 컬럼 체적): 0.1M 수산화나트륨, 1M 염화나트륨

중화·재평형화(4 컬럼 체적): 10mM 시트르산, pH5

프랙션: 1 컬럼 체적

각 담체의 크로마토그래피 결과로서, CIP 화분까지의 전체 용출 화분 중의 모노머 및 응집체량의 총합을 100으로 하고, 모노머 및 응집체의 분리를 도 4 내지 7에 나타내었다. 그 결과, 부하한 항체는 용출 화분에 회수되고, 응집체의 피크 톱이 모노머의 피크 톱보다 약간 어긋나, 완만한 분리가 확인되었다.

(비교예 2)

프로테인 A 담체를 사용한 항체의 분리

프로테인 A 담체로서, 마브셀렉트(MabSelect) SuRe(GE 헬스케어)를 옴니피트사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 2.5mg/mL로 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 이하의 크로마토그래피 조건에서 분리를 행하였다. 용출액에는, 최종 농도로서 50-100mM의 아르기닌을 첨가하고, pH5 내지 6으로서 겔 여과 크로마토그래피에서 모노머 함량의 측정을 행하였다. 또한, 그의 에어리어 값 분석으로부터 각 분획의 모노머 및 응집체량을 구하였다.

프로테인 A 크로마토그래피 조건

컬럼: ID 0.66cm×높이 7cm, 2.4mL 용량(옴니피트사제)

유속: 0.4mL/분(체류 시간: 6분), 단, CIP 이후는 0.8mL/분

부하액: 2.5mg-IgG/mL(PBS, pH7.4)

평형화(5 컬럼 체적): PBS, pH7.4

부하(10mg, 30mg 또는 40mg)

세정(5 컬럼 체적): PBS, pH7.4

세정 2(4 컬럼 체적): 10mM Tris/HCl, pH7

용출 구배(40 컬럼 체적): A→B 리니어 구배

A액: 1mM 시트르산, pH3.7

B액: 250mM 시트르산, pH3.7

재생(4 컬럼 체적): 50mM 시트르산, 250mM 염화나트륨, pH3.7

CIP(4 컬럼 체적): 0.1M 수산화나트륨, 1M 염화나트륨

중화·재평형화(4 컬럼 체적): PBS, pH7.4

각 크로마토그래피의 결과로서, CIP 화분까지의 각 분획의 모노머 및 응집체의 에어리어 값을 도 8 내지 10에 나타내었다. 그 결과, 부하한 항체는 용출 화분에 회수되었지만, 응집체의 피크 톱이 모노머 피크와 함께 초기에 용출하고, 어느 것의 부하량에서도 응집체의 분리는 확인할 수 없었다. 또한, 당해 프로테인 A 담체의 결합 용량(10％ DBC)은 약 50.3mg/mL 정도였다.

(비교예 3)

프로테인 A 담체를 충전한 컬럼과 술포프로필기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체(SP-세파로스 패스트 플로우)를 충전한 컬럼을 연결한 일체형 컬럼을 사용한 항체의 분리

프로테인 A 담체로서 마브셀렉트 SuRe(GE 헬스케어)를, 양이온 교환 담체로서 SP-세파로스 패스트 플로우(GE 헬스케어)를 각각 옴니피트사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 2개의 컬럼을 프로테인 A 담체를 충전한 컬럼, 양이온 교환 담체를 충전한 컬럼의 순서로 연결하고, 1체의 컬럼으로서 크로마토그래피 조작을 실시하였다. 2.5mg/mL에 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 이하의 크로마토그래피 조건에서 분리를 행하였다. 또한, 1 컬럼 체적은, 1개분의 2.4mL로 조작하였다. 용출액에는, 최종 농도로서 50-100mM의 아르기닌을 첨가하고, pH5 내지 6으로서 겔 여과 크로마토그래피에서 모노머 함량의 측정을 행하였다. 또한, 그의 에어리어 값 분석으로부터 각 분획의 모노머 및 응집체량을 구하였다.

연결 컬럼 크로마토그래피 조건

컬럼: ID 0.66cm×높이 7cm, 2.4mL 용량(옴니피트사제)의 연결체

유속: 0.4mL/분(체류 시간: 6분), 단, CIP 이후는 0.8mL/분

부하액: 2.5mg-IgG/mL(PBS, pH7.4; 10mM 인산, 150mM NaCl 등)

평형화(5 컬럼 체적): PBS, pH7.4

부하(40mg)

세정(5 컬럼 체적): PBS, pH7.4

세정 2(4 컬럼 체적): 10mM Tris/HCl, pH7

용출 구배(40 컬럼 체적): A→B 리니어 구배

A액: 1mM 시트르산, pH3.7

B액: 250mM 시트르산, pH3.7

재생(4 컬럼 체적): 50mM 시트르산, 250mM 염화나트륨, pH3.7

CIP(4 컬럼 체적): 0.1M 수산화나트륨, 1M 염화나트륨

중화·재평형화(4 컬럼 체적): PBS, pH7.4

크로마토그래피의 결과로서, CIP 화분까지의 각 분획의 모노머 및 응집체의 에어리어 값을 도 11에 나타내었다. 이때, 비교예 2의 40mg 항체 부하 시험의 용출 화분 중의 모노머량을 100으로 한 경우, 비교예 3에서 재생 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 21.0％이고, 또한 모노머 함량은 94.1％였다. CIP 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 22.9％이고, 술포프로필기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체를 충전한 컬럼을 프로테인 A 담체를 충전한 컬럼에 연결해서 사용한 경우, 이온 강도 용출 가능한 모노머 회수율이 나빴다.

(참고예 1)

프로테인 A 담체를 충전한 컬럼과 pKa가 4.0 미만의 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체 A(CM-세파로스 패스트 플로우)를 충전한 컬럼을 연결한 일체형 컬럼을 사용한 항체의 분리

프로테인 A 담체로서 마브셀렉트 SuRe(GE 헬스케어)를 양이온 교환 담체 A로서 CM-세파로스 패스트 플로우(GE 헬스케어)를 각각 옴니피트사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 2개의 컬럼을 프로테인 A 담체를 충전한 컬럼, 양이온 교환 담체 A를 충전한 컬럼의 순서로 연결하고, 1체의 컬럼으로서 크로마토그래피 조작을 실시하였다. 2.5mg/mL로 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 비교예 3의 크로마토그래피 조건에서 분리를 행하였다. 또한, 1 컬럼 체적은, 1개분의 2.4mL로 조작하였다. 용출액에는, 최종 농도로서 50-100mM의 아르기닌을 첨가하고, pH5 내지 6으로서 겔 여과 크로마토그래피에서 모노머 함량의 측정을 행하였다. 또한, 그의 에어리어 값 분석으로부터 각 분획의 모노머 및 응집체량을 구하였다.

연결 컬럼 크로마토그래피 조건

컬럼: ID 0.66cm×높이 7cm, 2.4mL 용량(옴니피트사제)의 연결체

유속: 0.4mL/분(체류 시간: 6분), 단, CIP 이후는 0.8mL/분

폴리크로날 항체(IgG): 감마글로불린·니찌야꾸(니혼 세이야꾸)

부하액: 2.5mg-IgG/mL(PBS, pH7.4; 10mM 인산, 150mM NaCl 등)

평형화(5 컬럼 체적): PBS, pH7.4

부하(40mg)

세정(5 컬럼 체적): PBS, pH7.4

세정 2(4 컬럼 체적): 10mM Tris/HCl, pH7

용출 구배(40 컬럼 체적): A→B 리니어 구배

A액: 1mM 시트르산, pH3.7

B액: 250mM 시트르산, pH3.7

재생(4 컬럼 체적): 50mM 시트르산, 250mM 염화나트륨, pH3.7

CIP(4 컬럼 체적): 0.1M 수산화나트륨, 1M 염화나트륨

중화·재평형화(4 컬럼 체적): PBS, pH7.4

크로마토그래피의 결과로서, CIP 화분까지의 각 분획의 모노머 및 응집체의 에어리어 값을 도 12에 나타내었다. 이때, 비교예 2의 40mg 항체 부하 시험의 용출 화분 중의 모노머량을 100으로 한 경우, 참고예 1에서 재생 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 21.2％이고, 또한 모노머 함량은 99.0％였다. CIP 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 73.7％이고, 모노머 함량은 83.3％였다. pKa가 4.0 미만의 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체 A를 충전한 컬럼을 프로테인 A 담체를 충전한 컬럼에 연결해서 사용한 경우, 이온 강도 용출 가능한 모노머 회수율이 나빴다.

(실시예 1)

프로테인 A 담체를 충전한 컬럼과 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체 B(도요펄 CM-650M)를 충전한 컬럼을 연결한 일체형 컬럼을 사용한 항체의 분리

프로테인 A 담체로서 마브셀렉트 SuRe(GE 헬스케어)를 양이온 교환 담체 B로서 도요펄 CM-650M(도소)을 각각 옴니피트사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 2개의 컬럼을 프로테인 A 담체를 충전한 컬럼, 양이온 교환 담체 B를 충전한 컬럼의 순서대로 연결하고, 1체의 컬럼으로서 크로마토그래피 조작을 실시하였다. 2.5mg/mL에 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 비교예 3의 크로마토그래피 조건에서 분리를 행하였다. 또한, 1 컬럼 체적은, 1개분의 2.4mL로 조작하였다. 용출액에는, 최종 농도로서 50-100mM의 아르기닌을 첨가하고, pH5 내지 6으로서 겔 여과 크로마토그래피에서 모노머 함량의 측정을 행하였다. 또한, 그의 에어리어 값 분석으로부터 각 분획의 모노머 및 응집체량을 구하였다.

크로마토그래피의 결과로서, CIP 화분까지의 각 분획의 모노머 및 응집체의 에어리어 값을 도 13에 나타내었다. 이때, 동일 부하량의 비교예 2의 40mg 항체 부하 시험의 용출 화분 중의 모노머량을 100으로 한 경우, 실시예 1에서 재생 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 91.6％이고, 또한 모노머 함량은 96.7％였다.

표 2의 각 연결 컬럼의 평가 결과에 대해서, 재생 화분까지의 모노머 회수율, 재생 화분까지의 혼합액 중의 모노머 함량, 모노머 회수율 80％까지의 용출액 혼합액 중의 모노머 함량을 비교예 2와 비교해서 나타내었다. 비교예 2의 재생 화분까지의 CIP화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 99.9％이고, 모노머 함량은 93.5％였다. 모노머 회수율이 80％의 시점에서 비교해도, 비교예 2의 모노머 함량이 93.4％인 것에 대해, 실시예 1의 모노머 함량은 97.1％이고, 모노머 함량이 향상되었다.

(실시예 2)

프로테인 A 담체를 충전한 컬럼과 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체 C(프락토겔 COO(M))를 충전한 컬럼을 연결한 일체형 컬럼을 사용한 항체의 분리

프로테인 A 담체로서 마브셀렉트 SuRe(GE 헬스케어)를 양이온 교환 담체 C로서 프락토겔 COO(M)(메르크)를 각각 옴니피트사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 2개의 컬럼을 프로테인 A 담체를 충전한 컬럼, 양이온 교환 담체 C를 충전한 컬럼의 순서로 연결하고, 1체의 컬럼으로서 크로마토그래피 조작을 실시하였다. 2.5mg/mL에 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 비교예 3의 크로마토그래피 조건에서 분리를 행하였다. 또한, 1 컬럼 체적은, 1개분의 2.4mL로 조작하였다. 용출액에는, 최종 농도로서 50-100mM의 아르기닌을 첨가하고, pH5 내지 6으로서 겔 여과 크로마토그래피에서 모노머 함량의 측정을 행하였다. 또한, 그의 에어리어 값 분석으로부터 각 분획의 모노머 및 응집체량을 구하였다.

크로마토그래피의 결과로서, CIP 화분까지의 각 분획의 모노머 및 응집체의 에어리어 값을 도 14에 나타내었다. 이때, 동일 부하량의 비교예 2의 40mg 항체 부하 시험의 용출 화분 중의 모노머량을 100으로 한 경우, 실시예 2에서 재생 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 86.7％이고, 또한 모노머 함량은 99.2％였다.

표 2의 각 연결 컬럼의 평가 결과에 대해서, 재생 화분까지의 모노머 회수율, 재생 화분까지의 혼합액 중의 모노머 함량, 모노머 회수율 80％까지의 용출액 혼합액 중의 모노머 함량을 비교예 2와 비교해서 나타내었다. 비교예 2의 재생 화분까지의 CIP 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 99.9％이고, 모노머 함량은 93.5％였다. 모노머 회수율이 80％인 시점에서 비교해도, 비교예 2의 모노머 함량이 93.4％인 것에 대해, 실시예 2의 모노머 함량은 99.2％이고, 모노머 함량이 향상되었다.

(실시예 3)

프로테인 A 담체를 충전한 컬럼과 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체 D(글리옥살-COOH)를 충전한 컬럼을 연결한 컬럼을 사용한 항체의 분리

프로테인 A 담체로서 마브셀렉트 SuRe(GE 헬스케어)를 양이온 교환 담체 D로서 글리옥살-COOH를 각각 옴니피트사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 2개의 컬럼을 프로테인 A 담체를 충전한 컬럼, 양이온 교환 담체 D를 충전한 컬럼의 순서로 연결하고, 1체의 컬럼으로서 크로마토그래피 조작을 실시하였다. 2.5mg/mL로 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 비교예 3의 크로마토그래피 조건에서 분리를 행하였다. 또한, 1 컬럼 체적은, 1개분의 2.4mL로 조작하였다. 용출액에는, 최종 농도로서 50-100mM의 아르기닌을 첨가하고, pH5 내지 6으로서 겔 여과 크로마토그래피에서 모노머 함량의 측정을 행하였다. 또한, 그의 에어리어 값 분석으로부터 각 분획의 모노머 및 응집체량을 구하였다.

크로마토그래피의 결과로서, CIP 화분까지의 각 분획의 모노머 및 응집체의 에어리어 값을 도 15에 나타내었다. 이때, 동일 부하량의 비교예 2의 40mg 항체 부하 시험의 용출 화분 중의 모노머량을 100으로 한 경우, 실시예 3에서 재생 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 102.0％이고, 또한 모노머 함량은 96.7％였다. 회수율이 100％를 초과한 것은, 겔 여과시의 인젝션량의 오차라고 생각되었지만, 도 15의 모노머와 응집체의 분리 거동으로부터 비교예와의 모노머 함량의 비교에는 영향을 미치지 않는다고 판단할 수 있었다.

표 2의 각 연결 컬럼의 평가 결과에 대해서, 재생 화분까지의 모노머 회수율, 재생 화분까지의 혼합액 중의 모노머 함량, 모노머 회수율 80％까지의 용출액 혼합액 중의 모노머 함량을 비교예 2와 비교해서 나타내었다. 비교예 2의 재생 화분까지의 CIP 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 99.9％이고, 모노머 함량은 93.5％였다. 모노머 회수율이 80％인 시점에서 비교해도, 비교예 2의 모노머 함량이 93.4％인 것에 대해, 실시예 3의 모노머 함량은 99.1％이고, 모노머 함량이 향상되었다.

(실시예 4)

프로테인 A 담체와 카르복실기를 리간드로 하는 양이온 교환 담체 D(글리옥살-COOH)를 1개의 컬럼 내에 혼합 충전한 혼합형 컬럼을 사용한 항체의 분리

프로테인 A 담체로서 마브셀렉트 SuRe(GE 헬스케어)를 양이온 교환 담체 D로서 글리옥살-COOH를 각각 4:1(체적비)로 혼합해서 옴니피트사제의 컬럼(ID 0.66cm×높이 7cm)에 충전하고, 2.5mg/mL로 제조한 인간 폴리크로날 항체(감마글로불린·니찌야쿠: 니혼 세이야꾸)를 부하액으로서, 비교예 2의 크로마토그래피 조건에서 분리를 행하였다. 항체 부하량은, 10mg으로 하였다. 또한, 1 컬럼 체적은, 1개분의 2.4mL로 조작하였다. 용출액에는, 최종 농도로서 50-100mM의 아르기닌을 첨가하고, pH5 내지 6으로서 겔 여과 크로마토그래피로 모노머 함량의 측정을 행하였다. 또한, 그의 에어리어 값 분석으로부터 각 분획의 모노머 및 응집체량을 구하였다.

크로마토그래피의 결과로서, CIP 화분까지의 각 분획의 모노머 및 응집체의 에어리어 값을 도 16에 나타내었다. 이때, 동일 부하량의 비교예 2의 10mg 항체 부하 시험의 용출 화분 중의 모노머량을 100으로 한 경우, 실시예 4에서 재생 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 103.0％이고, 또한 모노머 함량은 97.3％였다. 회수율이 100％를 초과한 것은, 겔 여과시의 인젝션량의 오차라고 생각되었지만, 도 16의 모노머와 응집체의 분리 거동으로부터 비교예와의 모노머 함량의 비교에는 영향을 미치지 않는다고 판단할 수 있었다.

표 3의 각 연결 컬럼의 평가 결과에 대해서, 재생 화분까지의 모노머 회수율, 재생 화분까지의 혼합액 중의 모노머 함량, 모노머 회수율 80％까지의 용출액 혼합액 중의 모노머 함량을 비교예 2와 비교해서 나타내었다. 비교예 2의 재생 화분까지의 CIP 화분까지 회수할 수 있었던 모노머는 99.9％이고, 모노머 함량은 96.5％였다. 모노머 회수율이 80％의 시점에서 비교해도, 비교예 2의 모노머 함량이 97.1％인 것에 대해, 실시예 4의 모노머 함량은 99.1％이고, 모노머 함량이 향상되었다.

이상, 본 발명(제1 형태)에 의해, 어피니티 담체와 양이온 교환 담체를 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 등의 흡착 및 용출을 행하는 항체 등의 정제 방법에 있어서, 80％ 이상인 높은 회수율에서 또는 80％ 이상의 회수율이 아니어도, 모노머(단량체) 함량을 향상시킬 수 있는 신규 분리 모드 및 사용 방법이 제공되고, 항체 의약품의 제조 프로세스의 생산성 향상과 고순도화에 기여할 수 있다.

이에 더하여, 본 발명(제2 형태)에 의해, pKa가 4.0 이상인 양이온 교환 담체를 어피니티 크로마토그래피 용출에 사용되는 pH4.0 이하의 산성 용액 중에서 이온 강도 의존적 용출을 행한 경우, 항체 회수율로서 80％ 이상으로, 모노머 함량을 향상시킬 수 있었다. 또한, 본 발명(제2 형태)에 따르면, 프로테인 A 담체의 용출액을 일단 회수할 필요는 없고, 어피니티 담체에 양이온 교환 담체를 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 등의 흡착 및 용출을 행할 수 있다.

즉, 본 발명(제2 형태)의 사용 방법을 사용함으로써, 어피니티 담체로부터 표적 분자의 용출을 행하는 산성 용출 pH에서 양이온 교환 담체로부터의 항체 등의 분리를 행하는 것, 또는 어피니티 담체와 양이온 교환 담체를 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 등의 흡착 및 용출을 행함으로써, 항체 의약품의 제조 프로세스의 생산성 향상과 고순도화에 기여할 수 있다.

Claims

항체 또는 항체 유래 물질에 대한 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 사용해서 연결 또는 혼합 컬럼으로 하고, 일체로서 항체 또는 항체 유래 물질의 흡착 및 용출을 행하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 유래 물질의 정제 방법.
항체 또는 항체 유래 물질에 대한 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 사용한 항체 또는 항체 유래 물질의 정제 방법이고,
상기 담체 1을 충전한 컬럼의 하류측에 상기 담체 2를 충전한 컬럼을 직결한 일체형 컬럼 또는 상기 담체 1과 담체 2의 양쪽 혼합물이 충전된 혼합형 컬럼에, 항체 또는 항체 유래 물질 함유액을 통액시켜 항체 또는 항체 유래 물질을 컬럼에 부하하고,
계속해서 용출액을 통액시킴으로써 부하한 항체 또는 항체 유래 물질을 용출시키는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체 유래 물질의 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 구배로 행하는 정제 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 계단식으로 행하는 정제 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키는 정제 방법.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액과 동일하거나 또는 보다 높은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키고, 계속해서 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키는 정제 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어피니티 리간드를 갖는 담체 1이 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L 또는 그들의 유연 물질(analog)을 리간드로 하는 담체인 정제 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어피니티 리간드를 갖는 담체 1이 프로테인 A 또는 그들의 유연 물질을 리간드로 하는 담체인 정제 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유래 물질이 면역 글로불린 G, 면역 글로불린 G 유도체 또는 Fc 함유 분자인 정제 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유래 물질이 Fab, scFv, diabody 또는 항원 결합 부위 함유 분자인 정제 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2가 카르복실기를 리간드로 하는 담체인 정제 방법.
제11항에 있어서, 상기 카르복실기가 산성 아미노산에서 유래하는 정제 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출 pH가 5.0 미만인 정제 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 1의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC가 1mg/mL 이상 100mg/mL 이하인 정제 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 2의 이온 교환 용량이 0.001mmol/mL 이상 0.5mmol/mL 이하인 정제 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 1의 체적 평균 입경이 1㎛ 이상 1000㎛ 이하이고, 상기 담체 2의 체적 평균 입경이 1㎛ 이상 1000㎛ 이하인 정제 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, pKa가 4.0 이상인 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체 2에 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하한 후, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 정제 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체 2의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC가 1mg/mL 이상 200mg/mL 이하인 정제 방법.
제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 충전한 컬럼 앞에 어피니티 리간드를 갖는 담체 1을 충전한 컬럼을 연결해서 일체형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 상기 일체형 컬럼에 부하한 후에, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 정제 방법.
제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일체형 컬럼을 구성하는 담체 1과 담체 2의 비율이 체적 기준으로 1/20 이상 20/1 이하인 정제 방법.
제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 함께 혼합 상태로 갖는 혼합형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하여 pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 정제 방법.
제2항 내지 제18항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합형 컬럼을 구성하는 담체 1과 담체 2의 비율이 체적 기준으로 1/20 이상 20/1 이하인 정제 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 흡착 조건하에서의 담체 1의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC에 대한, 담체 2의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC가 1/10배 이상 10배 이하인 정제 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 정제 방법으로 정제된 항체 또는 항체 유래 물질.
pKa가 4.0 이상인 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체 2에 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하한 후, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 양이온 교환기를 갖는 담체의 사용 방법.
제25항에 있어서, 상기 카르복실기 함유 리간드가 산성 아미노산에서 유래하는 사용 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 카르복실기 함유 리간드를 갖는 양이온 교환기를 갖는 담체 2의 IgG에 대한 체류 시간 6분에서의 10％ DBC가 1mg/mL 이상 200mg/mL 이하인 사용 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2의 이온 교환 용량이 0.001mmol/mL 이상 0.5mmol/mL 이하인 사용 방법.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2의 체적 평균 입경이 1㎛ 이상 1000㎛ 이하인 사용 방법.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 충전한 컬럼 앞에 어피니티 리간드를 갖는 담체 1을 충전한 컬럼을 연결해서 일체형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 상기 일체형 컬럼에 부하한 후에, pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 사용 방법.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온 교환기를 갖는 담체 2를 어피니티 리간드를 갖는 담체 1과 함께 혼합 상태로 갖는 혼합형 컬럼을 제작하고, 중성 pH 조건에서 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하해서 pH4.0 이하의 산성 버퍼를 사용해서 항체 또는 항체 유래 물질을 용출하는 사용 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키는 사용 방법.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 일체형 컬럼 또는 혼합형 컬럼을 평형화 용액으로 평형화하고, 상기 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액을 부하하고, 이 부하 후 용출 개시 전에 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액과 동일하거나 또는 보다 높은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키고, 계속해서 평형화 용액 및 항체 또는 항체 유래 물질 함유 용액보다도 낮은 이온 강도의, 또한 용출액보다도 높은 pH의 세정액을 통액시키는 사용 방법.
제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유래 물질이 면역 글로불린 G, 면역 글로불린 G 유도체, Fc 함유 분자, 또는 Fab, scFv, diabody 또는 항원 결합 부위 함유 분자인 사용 방법.
제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 구배로 행하는 사용 방법.
제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 유래 물질의 용출을 산성 pH에서 및 이온 강도의 계단식으로 행하는 사용 방법.
제25항 내지 제36항 중 어느 한 항에 기재된 사용 방법으로 정제된 항체 또는 항체 유래 물질.