KR20160077211A - FcRn에 특이적인 항체 - Google Patents

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Abstract

본원은 FcRn에 특이적인 항체, 이를 포함하는 제제, 요법에서 각각의 용도, 상기 항체를 발현시키고 경우에 따라 제제화하는 방법, 항체를 코딩하는 DNA 및 상기 DNA를 포함하는 숙주에 관한 것이다.

Description

FcRn에 특이적인 항체{ANTIBODIES SPECIFIC TO FcRn}
본원은 FcRn에 특이적인 항체, 이를 포함하는 제제, 요법에서 각각의 용도, 상기 항체를 발현시키고 경우에 따라 제제화하는 방법, 항체를 코딩하는 DNA 및 상기 DNA를 포함하는 숙주에 관한 것이다.
FcRn는 막 단백질 FcRn α 사슬 및 β2 마이크로글로불린(β2Μ)의 비공유적 복합체이다. 성인 포유동물에서, FcRn은 IgG 이소타입의 항체에 결합하여 구조하는 수용체로 작용하여서 혈청 항체 수준을 유지시키는데 핵심 역할을 한다. IgG 분자는 내피 세포에 의해 세포내이입되고, FcRn에 결합하면, 예를 들어 순환계로 재순환되어 통과세포외배출된다. 대조적으로, FcRn에 결합하지 않은 IgG 분자는 세포로 들어가서 그들이 분해되는 리소솜 경로를 표적으로 삼는다. His435가 알라닌으로 돌연변이된 변이체 IgG1은 FcRn 결합의 선택적 손실을 일으키고 혈청 반감기를 상당히 감소시킨다(Firan et al. 2001, International Immunology 13:993).
FcRn은 적어도 부분적으로 자가항체에 의해 야기되는 일부 자가면역 질병에 대한 잠재적인 치료 표적으로 가정된다. 일부 이러한 질병에 대한 현생 치료법은 혈장반출법을 포함한다. 때때로 혈장반출법은 질환의 장기간 관리를 위해 면역억제 요법과 함께 적용된다. 혈장 교환은 유해한 자가 항체에 대해 가장 신속한 단기 해결책을 제공한다. 그러나, 예를 들어 약물 예컨대 프레드니손, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 마이코페놀레이트 모페틸, 리툭시맙 또는 이들의 혼합물의 사용에 의해 면역계에 의한 자가항체 생성을 억제하는 것이 바람직할 수 있다.
혈장반출법으로 치료할 수 있는 질환의 예에는 길랭-바레 증후군; 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증; 굿파스처 증후군; 과점성 증후군; 저온글로불린혈증; 이상단백혈증; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 중증 근무력증; 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)/용혈성 요독성 증후군; 베게너 육아종증; 램버트-이튼 증후군; 항인지질 항체 증후군(APS 또는 APLS); 현미경적 다발혈관염; 이식 신장에서 재발적 국소성 분절성 사구체경화증; HELLP 증후군; PANDAS 증후군; 레프섬 질환; 베체트 증후군; HIV-관련 신경병증; 유아 및 신생아의 그레이브스 병; 심상성 천포창; 다발성 경화증, 횡문근변성증 및 동종면역 질환을 포함한다.
혈장반출법은 때때로 예를 들어 심각한 부작용을 감소시켜야하는 비상시에, Fc 함유 치료제의 제거를 위한 구제 요법으로서 사용된다.
혈장반출법이 일정 의료 상황에서 도움이 되지만 요법과 연관된 잠재적인 위험성 및 합병증은 존재한다. 상당히 큰 정맥내 카테터의 삽입은 출혈, 폐 천공(카테터 삽입 부위에 따름)을 초래할 수 있고, 카테터가 너무 오래 남아있으면, 정맥에 감염 및/또는 손상을 야기하여서 그러한 시술을 반복할 기회가 제한된다.
이러한 시술은 이와 연관된 추가의 합병증을 가지며, 예를 들어 환자의 혈액이 혈장반출 장비를 통해 체외로 흐르는 경우, 혈액이 응고되는 경향이 있다. 이러한 경향을 줄이기 위해, 일반적인 프로토콜에서는, 혈액이 회로를 통해 흐르게하면서 시트레이트를 주입한다. 시트레이트는 혈액내 칼슘에 결합하는데, 칼슘은 혈액이 응고되는데 필수적이다. 시트레이트는 혈액 응고를 방지하는데 매우 효과적이지만, 그의 사용은 생명을 위협할만큼의 저칼슘 농도를 초래할 수 있다. 이는 크브스테크 징후 또는 트루소 징후를 사용해 탐지할 수 있다. 이러한 합병증을 방지하기 위해서, 환자에게 혈장반출법을 실시하면서 칼슘을 정맥내에 주입하고, 또한, 입을 통해 칼슘 보충제를 제공할 수 있다.
이러한 시술의 다른 합병증은 수혈 부작용 또는 수혈 전파 질환의 위험성, 환자의 면역계 억제 및 바늘 배치에 의한 출혈 또는 혈종의 위험성과 함께, 혈액 제제에 대한 잠재적인 노출, 저혈압을 포함한다.
부가적으로 혈장반출법을 제공하는 설비들은 제한적이고 이러한 시술은 매우 고가이다.
혈장반출법에 대한 대안은 정맥내 면역글로불린(IVIG)인데, 이는 천명 이상의 혈액 도너의 혈장에서 추출하여 수집한 다클론 IgG를 함유한 혈액 제제이다. 이 요법은 정맥내로 투여되고 2주 내지 3개월간 지속된다.
IVIG 치료의 합병증은 두통, 피부염, 치료 산물의 오염에 의한 바이러스 감염, 예를 들면 HIV 또는 간염, 폐부종, 알레르기 반응, 급성 신부전증, 정맥 혈전증 및 무균성 수막염을 포함한다.
따라서 침습성이 덜하고 의료 합병증에 환자를 덜 노출시키는 자가면역 질병의 치료에 대한 상당히 충족치 못한 요구가 존재한다.
따라서 침습성이 덜하고 환자를 의료 합병증에 덜 노출시키는 면역학적 질병 및/또는 자가면역 질병의 치료에 대한 상당히 충족치 못한 요구가 존재한다.
따라서 FcRn에 대한 IgG의 결합을 차단하거나 또는 감소시키는 제제가 이러한 자가면역 및 염증성 질환의 치료 또는 예방에 유용할 수 있다. 항-FcRn 항체는 이전에 WO2009/131702, WO2007/087289 및 WO2006/118772에 설명되어 있다.
그러나, 개선된 항-FcRn 항체에 대한 요구가 존재한다.
따라서 일 측면에서 가변 영역을 갖는 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 가변 영역은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3에서 독립적으로 선택된 1, 2, 또는 3 개의 CDR을 포함하고, 예를 들어 CDR H1은 서열번호 1이고/이거나, CDR H2는 서열번호 2이고/이거나, CDR H3은 서열번호 3이다.
따라서, 일 측면에서 CDR H1은 서열번호 1이고 CDR H2는 서열번호 2이거나, 또는 CDR H1은 서열번호 1이고 CDR H3은 서열번호 3이거나, 또는 CDR H2는 서열번호 2이고 CDR H3은 서열번호 3이다.
다른 측면에서, 본원에 정의된 바와 같은 서열 또는 서열들의 조합, 예를 들어 동족 쌍 가변 영역을 포함하는 항체 또는 단편을 제공한다.
본원의 항체는 FcRn에 대한 IgG의 결합을 차단하고 순환 항체의 반감기 감소를 포함하여, FcRn의 1 이상의 생물학적 기능을 감수시키는데 유용한 것으로 여겨진다. 이는 환자가 보다 신속하게 항체, 예컨대 자가항체를 제거할 수 있게 한다는 점에서 유용하다. 따라서, 본원의 항체는 FcRn에 대한 IgG의 결합을 감소시킨다.
중요한 것은 본원의 항체가 비교할만한 높은 결합 친화성으로, 예를 들어 pH 6 및 pH 7.4 둘 다에서, 인간 FcRn에 결합할 수 있다는 것이다. 따라서, 유리하게, 항체는 엔도솜에서도 FcRn에 계속 결합할 수 있어서, IgG에 대한 FcRn의 결합 차단이 최대화된다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 결합 단편은 예를 들어 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 7 및 서열번호 6에서 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3 CDR을 포함하는, 가변 영역을 갖는 경쇄 또는 경쇄 단편을 포함하고, 구체적으로 여기서 CDR L1은 서열번호 4이고, CDR L2는 서열번호 5이거나 또는 서열번호 7이고 CDR L3은 서열번호 6이다.
따라서, 일 실시양태에서 CDR L1은 서열번호 4이고 CDR L2는 서열번호 5 또는 서열번호 7이거나, 또는 CDR L1은 서열번호 1이고 CDR L3은 서열번호 6이거나, 또는 CDR L2는 서열번호 5 또는 서열번호 7이고 CDR L3은 서열번호 6이다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 결합 단편은 서열번호 1 내지 7에서 선택된 CDR 서열을 포함하고, 예를 들어 여기서 CDR H1은 서열번호 1이고, CDR H2는 서열번호 2이며, CDR H3은 서열번호 3이고, CDR L1은 서열번호 4이고, CDR L2는 서열번호 5 또는 서열번호 7이고 CDR L3은 서열번호 6이다.
본원은 또한 명백하게 본원에 개시된 항체 또는 결합 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 결합 단편을 제공한다. 따라서, 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 잔기 E115, W131, P132, 및 E133으로 이루어진 군에서 선택된 1, 2, 3, 또는 4 아미노산을 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하고, 여기서 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편은 A81, G83, G84, K85, G86, P87, N113, L135, A136, 및 Q139로 이루어진 군에서 선택된 1 이상(예컨대 모든)의 잔기에 더 결합하고 경우에 따라서 L82, Y88, L112 및 D130으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 잔기에 더 결합한다.
일 실시양태에서, 인간 FcRn에 대해 본원에 명백하게 개시된 항체 또는 결합 단편을 교차 차단(cross-blocking)하거나, 또는 상기 항체에 의한 인간 FcRn 결합으로부터 교차 차단되는 항체 또는 결합 단편을 제공한다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 및 결합 단편은 인간 FcRn에 대한 인간 IgG의 결합을 차단한다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 및 결합 단편은 β2 마이크로글로불린에 결합하지 않는다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 및 결합 단편은 인간 β2 마이크로글로불린에 결합하지 않는다.
일례에서, 본원의 항체 및 결합 단편은 순환 알부민 수준을 50%가 넘게, 바람직하게는 25%가 넘게 감소시키지 않는다.
일례에서, 본원의 항체 및 결합 단편은 순환 알부민 수준을 감소시키지 않는다.
본원은 또한 폴리뉴클레오티드, 예컨대 본원에 기술된 항체 또는 단편을 코딩하는 DNA로 확대되고, 예를 들어 여기서 DNA는 벡터에 도입된다.
본원은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
항체 또는 단편을 발현시키는 방법과 중합체, 예컨대 PEG에 항체 또는 단편을 접합시키는 방법을 제공한다.
본원은 또한 상기 항체 및 단편을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체, 단편 또는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본원은 또한 치료, 특히 면역학적 및/또는 자가면역 질병의 치료에서 사용하기 위한, 본원에 따른 항체, 단편 또는 조성물로 확대된다.
따라서 본원은 IgG를 이화시키기 위한 신체의 천연 기전을 가속화시켜서 달성되는, 병원성 IgG의 제거를 위한 항체, 이의 단편 및 방법을 제공한다.
본질적으로 본원에 따른 항체 및 단편은 신체 내에서 IgG를 재활용하는 시스템을 차단한다.
본원의 요법은 혈장반출법이 환자에게 유리한, 요법 또는 IVIG 요법인 일정 질환에 대해 대체법 또는 보충법을 제공하는 듯하다.
도 1은 LC-MS/MS에 의해 결정된 형질전환 마우스에서 %hIgG를 도시한 도면이다.
도 1a는 인간 FcRn-형질전환 마우스의 인간 IVIg 혈청 농도에 대한 1638 IgG4P 형태의 효과를 도시한 도면이다.
도 1b는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 인간 IVIg의 농도에 대한 1638 FabFv 및 Fab'PEG 형태의 효과를 도시한 도면이다.
도 1c는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 1638 IgG4P 형태의 약력학을 도시한 도면이다.
도 1d는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 1638 FabFv 및 Fab'PEG 형태의 약력학을 도시한 도면이다.
도 1e는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 혈청 알부민 농도에 대한 1638 FabFv 및 Fab'PEG 형태의 효과를 도시한 도면이다.
도 1f는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 혈청 알부민 농도에 대한 1638 IgG4P 형태의 효과를 도시한 도면이다.
도 2는 CA170_1638.g49 IgG4에 대한 대표적인 결합 곡선을 도시한 도면이다. 평균 KD 값(n = 3)은 각각 중성 완충액 중 0.20 nM & 산성 완충액 중 0.22 nM이었다.
도 3은 CA170_1638.g49 IgG4가 MDCK II 클론 15 세포에서 IgG 재활용을 억제함을 도시한 도면이다.
도 4는 CA170_1638.g49 IgG4가 MDCK II 클론 15 세포에서 IgG 투과세포외배출을 억제함을 도시한 도면이다.
도 5는 CA170_1638.g49 FabFv가 MDCK II 클론 15 세포에서 IgG 투과세포외배출을 억제함을 도시한 도면이다.
도 6은 CA170_1638.g49 IgG4에 대한 대표적인 결합 곡선을 도시한 도면이다. 평균 KD 값(n = 3)은 각각 중성 완충액 중 0.3, 및 산성 완충액 중 0.43이었다(표 2 참조).
도 7은 CA170 1638 CDR 서열을 도시한 도면이다.
도 8은 본원에 따른 항체 서열을 도시한 도면이다.
도 9a는 항체 1638.g49의 인간화를 도시한 도면이다.
도 9b는 항체 1638.g49의 인간화를 도시한 도면이다.
본원에서 적용되는 바와 같은 FcRn은 그 아미노산 서열이 수탁번호 P55899 하에 UniProt에 존재하고, 세포외 도메인이 도 8(서열번호 48)에 제공된 신생 Fc 수용체라고도 알려진, 인간 IgG 수용체 알파 사슬과, 그 아미노산 서열이 수탁번호 P61769(신호 펩티드있게 제공(서열번호 50), 신호 펩티드없이 제공(서열번호 72)) 하에 P61769에 존재하는 인간 β2 마이크로글로불린(β2Μ)과의 비공유 복합체이다.
본원에서 적용되는 항체 분자는 항체 또는 이의 결합 단편을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 '항체'는 대체로 즉 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 성분을 포함하는, 온전한(전체) 항체를 의미한다. 항체는 예를 들어 WO 2007/024715에 개시된 바와 같이 분자 DVD-Ig, 또는 WO2011/030107에 기술된(FabFv)2Fc에 따른 추가적인 결합 도메인을 더 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 적용된 항체는 2가, 3가 또는 4가 전장 항체를 포함한다.
항체의 결합 단편은 단쇄 항체(즉, 전장 중쇄 및 경쇄); Fab, 개질된 Fab, Fab', 개질된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, dsscFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리바디, 트리아바디, 테트라바디 및 임의의 상기의 에피토프 결합 단편을 포함한다(예를 들어, 다음 문헌들을 참조함: Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). 이들 항체 단편을 생성하고 제작하는 방법은 당분야에 잘알려져 있다(예를 들어, [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181]를 참조함). Fab-Fv 형태는 WO2009/040562에 처음 개시되었었고, 이의 디설피드 안정화 형태, Fab-dsFv는 WO2010/035012에 처음 개시되었다. 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 공개 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기술된 Fab 및 Fab'을 포함한다. 다가 항체는 다수 특이성, 예를 들어 이특이성을 포함하거나, 또는 단일특이성(예를 들어, W092/22583 및 WO05/113605)일 수 있다. 후자의 일례는 W092/22583에 기술된 트리-Fab(또는 TFM)이다.
일 실시양태에서, Fab 단편이 제공된다.
일 실시양태에서, Fab' 단편이 제공된다.
전형적인 Fab' 분자는 중쇄가 가변 영역 VH, 불변 도메인 CH1 및 천연 또는 개질 힌지 영역을 포함하고, 경쇄가 가변 영역 VL 및 불변 도메인 CL을 포함하는 중쇄 및 경쇄 쌍을 포함한다.
일 실시양태에서, F(ab')2를 생성하기 위해 본원에 따라 Fab'의 이량체를 제공하고 예를 들어 이량체화는 힌지를 통해서일 수 있다.
일 실시양태에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 결합 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 대체로 6 CDR을 포함하는데, 중쇄로부터 3개이고 경쇄로부터 3개이다. 일 실시양태에서, CDR은 프레임워크에 존재하고 함께 가변 영역을 형성한다. 따라서, 일 실시양태에서, 항체 또는 결합 단편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
FcRn에 결합하는 항체의 능력을 유의하게 변경시키지 않으면서 CDR 또는 본원에서 제공하는 다른 서열(예를 들여, 가변 도메인)에 1 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 만들 수 있음을 이해한다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 효과는 예를 들어, 본원, 구체적으로 실시예에 FcRn 결합/차단을 측정하기 위해 기술된 방법들을 사용하여, 당분야의 숙련가에 의해 쉽게 시험될 수 있다.
본원에 의해 제공되는 항체 또는 단편에 적용되는 프레임워크 영역에 1 이상(예를 들어 1, 2, 3 또는 4)의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실을 만들 수 있고 이때 FcRn에 대한 결합 친화성은 유지되거나 또는 증가된다.
항체 가변 도메인의 잔기는 통상적으로, 카밧 등에 의해 고안된 체계에 따라 번호가 매겨진다. 이러한 체계는 [Kabat et al, 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA](이하 "Kabat et al. {상동}")에 기재되어 있다. 이러한 번호매김 체계가 달리 언급하는 경우를 제외하고 본원에서 사용된다.
카밧 잔기 지정은 아미노산 잔기의 선형 번호매김과 항상 직접적으로 상응하지 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은 프레임워크 또는 상보성 결정 영역(CDR)이건간에, 기본 가변 도메인 구조의 구조 성분의 단축, 또는 그로의 삽입에 상응하는 엄격한 카밧 번호매김에서 보다는 소수이거나 또는 부가적인 아미노산을 함유할 수도 있다. 잔기의 올바른 카밧 번호매김은 "표준" 카밧 번호매김 서열과 항체 서열의 상동성 잔기의 정렬에 의해 소정 항체에 대해 결정된다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카밧 번호매김 체계에 따라서 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 초티아(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol, 196, 901-917(1987))에 따라서, CDR-H1와 동등한 루프는 잔기 26에서 잔기 32로 확장된다. 따라서 달리 언급하지 않으면, 본원에서 적용하는 'CDR-H1'은 카밧 번호매김 체계 및 초티아의 위상학적 루프 정의의 조합으로 정의되는 잔기 26 내지 35를 의미하고자 한다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카밧 번호매김 체계에 따라서 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.
본원의 항체 및 단편은 FcRn을 차단하고 따라서 IgG의 재활용에서의 그 기능을 방지한다. 본원에서 적용하는 차단은 물리적인 차단 예컨대 수용체를 폐쇄하는 것을 의미하지만 또한 항체 또는 단편이 에피토프에 결합하여 수용체에 대한 천연 리간드가 더이상 결합하지 않음을 의미하는, 예를 들어 입체형태 변화를 야기하는 경우도 포함한다. 본원의 항체 분자는 FcRn에 결합하여서 IgG 불변 영역에 대한 FcRn 결합을 감소시키거나 또는 방지(예를 들어, 억제)한다.
일 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 IgG에 대해 경쟁적으로 FcRn에 결합한다.
일례에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 인간 IgG에 대한 인간 FcRn 결합의 경쟁적 억제제로서 기능한다. 일례에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 FcRn 상의 IgG 결합 부위에 결합한다. 일례에서 항체는 IgG 결합 부위를 차단한다. 일례에서 항체 또는 이의 결합 단편은 β2Μ에 결합하지 않는다.
본원에서 사용하기 위한 항체는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 얻을 수 있다. 융합 단백질을 포함한 FcRn 폴리펩티드/단백질, 폴리펩티드를(재조합적으로 또는 천연적으로) 발현하는 세포(예컨대 활성화된 T 세포)를 사용하여 단독으로 또는 β2Μ과 조합하여 FcRn을 특이적으로 인식하는 항체를 생성시킬 수 있다. 폴리펩티드는 '성숙한' 폴리펩티드이거나 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체일 수 있다. 인간 단백질은 Swiss-Prot에 수탁번호 P55899로 등록되었다. 인간 FcRn 알파 사슬의 세포외 도메인은 서열번호 48로 제공된다. 성숙한 인간 β2Μ의 서열은 서열번호 72로 제공된다.
일 실시양태에서, 항원은 FcRn이 세포로 내입된 경우 동적 프로세싱이 없거나 또는 거의 없도록, 세포의 표면 상에 FcRn을 제시하도록 조작된 FcRn의 돌연변이체 형태이고, 예를 들어 이는 FcRn 알파 사슬의 세포질 꼬리부에 돌연변이를 일으켜 얻을 수 있으며, [Ober et al 2001 Int. Immunol. 13, 1551-1559]에 설명된 바와 같이 2-류신을 2-알라닌으로 돌연변이시킨다.
숙주를 면역화시키는데 사용하기 위한 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전자 조작된 숙주 세포로부터 당분야에 공지된 방법을 통해 제조하거나 또는 천연 생물학적 공급원에서 회수할 수 있다. 본 출원에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 이들은 달리 특정하지 않으면 상호교환적으로 사용된다. FcRn 폴리펩티드는 일부 예에서 보다 큰 단백질 예컨대 예를 들어 친화성 태그에 융합된 융합 단백질 또는 그 유사물의 일부일 수 있다.
FcRn 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 동물의 면역화가 필수적인 경우, 당분야에 공지되고 일반적인 프로토콜을 사용하여, 동물, 바람직하게는 인간이외의 동물에 폴리펩티드를 투여하여 얻을 수 있으며, 예를 들어 [Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir(ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986)]를 참조한다. 많은 온혈 동물, 예컨대 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지를 면역화시킬 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.
단일클론 항체는 당분야에 공지된 임의의 방법 예컨대 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 항체는 또한 [Babcook, J. et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481]; WO92/02551; WO2004/051268 및 국제 공개 특허 출원 WO2004/106377에 기술된 방법에 의해 특이적 항체의 생성을 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성시킨 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시키는 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 생성시킬 수 있다.
항체에 대한 스크리닝은 인간 FcRn에 대한 결합을 측정하는 어세이 및/또는 수용체에 대한 IgG 결합을 차단하는 능력을 측정하는 어세이를 사용해 수행할 수 있다. 결합 어세이의 예에는 구체적으로 플레이트 상에 고정된 인간 FcRn 및 인간 Fc의 융합 단백질을 사용하고, 융합 단백질에 결합된 항-FcRn 항체를 검출하는 2차 항체를 적용하는 ELISA이다. 적합한 길항 및 차단 어세이의 예는 이하 본원에서 설명한다.
본원에서 적용하는 그것이 특이적인 항체만을 인식하는 항체 또는 비특이적인 항원에 대한 결합과 비교하여 특이적인 항원에 대한 결합 친화성이 유의하게 높은, 예를 들어, 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10배 높은 친화성을 갖는 항체를 의미하고자 한다. 결합 친화성은 이하 본원에서 설명하는 바와 같은 예컨대 BIAcore 등의 기술에 의해 측정할 수 있다. 일례에서, 본 발명의 항체는 β2 마이크로글로불린(β2Μ)에 결합하지 않는다. 일례에서, 본 발명의 항체는 사이노몰거스 FcRn에 결합한다. 일례에서 본 발명의 항체는 래트 또는 마우스 FcRn에 결합하지 않는다.
본원에 따른 일정 항체의 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명에서 제공하고 본 발명의 일 측면을 형성한다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 결합 단편은 예를 들어 파지 라이브러리 또는 유사물에서 제조된 완전 인간형이다.
일례에서, 항체는 설치류 예컨대 래트 유래이고 서열번호 8로 제공되는 경쇄 가변 도메인 서열 및 서열번호 12로 제공되는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 단편은 인간화된다.
인간화 항체(CDR-그라프트된 항체 포함)는 비인간 종 유래의 1 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자 유래 프레임워크 영역을 갖는 항체 분자이다(예를 들어, US5,585,089; W091/09967 참조함). 전체 CDR 보다는 CDR의 특이성 결정 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있음을 이해한다(예를 들어, [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34]를 참조함). 인간화 항체는 경우에 따라 CDR이 유래된 비인간 종에서 유래된 1 이상의 프레임워크 잔기를 더 포함할 수 있다. 후자는 흔히 도너 잔기라고 한다.
따라서, 일 실시양태에서, 본원에서 사용하는 용어 '인간화 항체 분자'는 중쇄 및/또는 경쇄가 CDR이 유래된 비인간 종에서 유래된 1 이상의 프레임워크 잔기(도너 잔기)를 경우에 따라 더 포함하는 억셉터 항체(예를 들어, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크에 그라프트된 도너 항체(예를 들어, 인간외 항체 예컨대 쥣과동물 단일클론 항체)에서 유래된 1 이상의 CDR(바람직하다면, 1 이상의 개질된 CDR을 포함)을 포함하는 항체 분자를 의미한다. 예를 들어, 다음의 문헌을 참조한다: Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. 일 실시양태에서, 전체 CDR을 전달하기 보다는, 상기 본원에 기술된 CDR 중 임의의 하나에서 유래된 특이성 결정 잔기 중 1 이상만을 인간 항체 프레임워크에 전달한다(예를 들어, [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34]를 참조함). 일 실시양태에서, 상기 본원에 기술한 CDR 중 1 이상에서 유래된 특이성 결정 잔기만을 인간 항체 프레임워크에 전달한다. 다른 실시양태에서 상기 본원에 기술된 CDR 각각에서 유래된 특이성 결정 잔기만을 인간 항체 프레임워크에 전달한다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기가 그라프트되는 경우, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 포함하여, CDR이 유래되는 도너 항체의 부류/유형에 대해 가지는 임의의 적절한 억셉터 가변 영역 프레임워크 서열이 사용될 수 있다.
적합하게, 본 발명에 따른 인간화 항체는 본원에서 특별하게 제공하는 1 이상의 CDR을 비롯하여 인간 억셉터 프레임워크 영역을 포함하는 가변 도메인을 갖는다. 따라서, 일 실시양태에서, 가변 도메인이 인간 억셉터 프레임워크 영역 및 비인간 도너 CDR을 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 차단 인간화 항체를 제공한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 인간 프레임워크의 예에는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM(Kabat et al, 상동)이 있다. 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 사용할 수 있고, REI는 경쇄에 사용할 수 있으며 LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 다에 사용할 수 있다. 대안적으로, 인간 배선 서열이 사용될 수 있고, 이들은 http://www.imgt.org/에서 입수할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체에서, 억셉터 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없고, 바람직하다면 상이한 사슬에서 유래된 프레임워크 영역을 갖는 복합 사슬을 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체의 중쇄에 대해 이러한 적합한 프레임워크 영역은 JH3과 함께 인간 아군 VH3 서열 IGHV3-7(서열번호 46 및 47)에서 유래된다.
따라서, 일례에서, CDR-H1에 대해 서열번호 1로 제공되는 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 2로 제공되는 서열 및 CDRH3에 대해 서열번호 3으로 제공되는 서열을 포함하는 인간화 항체를 제공하고, 여기서 중쇄 프레임워크 영역은 JH3과 함께 인간 아군 VH3 서열 IGHV3-7에서 유래된다.
인간 JH3의 서열은 다음과 같다:(DAFDV)WGQGTMVTVS(서열번호 69).
DAFDV(서열번호 70) 모티프는 CDR-H3의 일부이고 프레임워크 4의 일부는 아니다(Ravetch, JV. et al, 1981, Cell, 27, 583-591).
일례에서, 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열번호 25 또는 59로 제공되는 서열, 예컨대 25를 포함한다.
본 발명의 인간화 항체의 경쇄에 대해 적합한 프레임워크 영역은 JK4와 함께 인간 아군 VK1 서열 IGKVl-27 서열(서열번호 44 및 45)에서 유래된다.
따라서, 일례에서, CDR-L1에 대해 서열번호 4로 제공되는 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 5 또는 서열번호 7로 제공되는 서열 및 CDRL3에 대해 서열번호 6으로 제공되는 서열을 포함하는 인간화 항체를 제공하고, 여기서 경쇄 프레임워크 영역은 JK4와 함께 인간 아군 VKl 서열 IGKVl-27에서 유래된다.
JK4 서열을 다음과 같다:(LT)FGGGTKVEIK(서열번호 71). LT 모티프는 CDR-L3의 일부이고 프레임워크 4의 일부는 아니다(Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).
일례에서, 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열번호 16 또는 51로 제공되는 서열, 예컨대 16을 포함한다.
본 발명의 인간화 항체에서, 프레임워크 영역은 억셉터 항체와 정확하게 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 일반적이지 않은 잔기를 억셉터 사슬 부류 또는 유형에 대해 보다 빈번하게 발생되는 잔기로 변화시킬 수 있다.
대안적으로, 억셉터 프레임워크 영역에서 선택된 잔기는 그들이 도너 항체의 동일 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변화될 수 있다(see Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). 이러한 변화는 도너 항체의 친화성을 회수하는데 필요한 최소로 유지되어야 한다. 변화가 필요한 억셉터 프레임워크 영역의 잔기를 선택하는 프로토콜은 W091/09967에 기재되어 있다.
따라서 일 실시양태에서, 프레임워크의 1, 2, 3, 4, 또는 5 잔기를 대안적인 아미노산 잔기로 치환한다.
따라서, 일례에서, 인간화된 항체를 제공하고, 여기서 중쇄의 가변 도메인의 적어도 위치 48 및 78의 각각에서의 잔기(카밧 번호매김)가 도너 잔기이고, 예를 들어 서열번호 25로 제공된 서열을 참조한다.
일 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기 48은 대안적인 아미노산, 예를 들어 발린으로 치환된다.
일 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기 78은 대안적인 아미노산, 예를 들어 류신으로 치환된다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 인간화 중쇄 가변 영역에서 잔기 48은 발린이고 잔기 78은 류신이다.
따라서, 일례에서, 인간화 항체를 제공하고, 여기서 경쇄의 가변 도메인의 적어도 위치 70 및 71의 각각에서의 잔기(카밧 번호매김)는 도너 잔기이고, 예를 들어 서열번호 16으로 제공된 서열을 참조한다.
일 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 70은 대안적인 아미노산, 예를 들어 아스파르트산으로 치환된다.
일 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 71은 대안적인 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌으로 치환된다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 인간화 경쇄 가변 영역에서 잔기 70은 아스파르트산이고 잔기 71은 페닐알라닌이다.
일 실시양태에서, 본원은 본원에 개시된 서열과 80%, 예를 들어 관련 서열의 일부 또는 전부, 예를 들어 가변 도메인 서열, CDR 서열 또는 CDR을 제외한 가변 도메인 서열에 대해서 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 또는 동일한 항체 서열을 제공한다. 일 실시양태에서, 관련 서열은 서열번호 16 또는 51이다. 일 실시양태에서, 관련 서열은 서열번호 25 또는 59이다.
일 실시양태에서, 본 발명은 중쇄를 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하고, 여기서 중쇄의 가변 도메인은 본원의 서열, 예를 들어 서열번호 25 또는 59로 제공된 서열, 예컨대 25에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 경쇄를 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하고, 여기서 경쇄의 가변 도메인은 서열번호 16 또는 51에 제공된 서열, 예컨대 16에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하고 여기서 항체는 본원에서 제공하는 서열, 예를 들어 서열번호 25로 제공된 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 또는 동일한 중쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 분자는 CDR-H1에 대해 서열번호 1로 제공된 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 2로 제공된 서열 및 CDR-H3에 대해 서열번호 3으로 제공된 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하고 여기서 항체는 본원에 제공된 서열, 예를 들어 서열번호 16의 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 또는 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 분자는 CDR-L1에 대해 서열번호 4로 제공된 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 5 또는 서열번호 7로 제공되는 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 6으로 제공된 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, 본 발명은 인간 FcRn에 결합하는 항체 분자를 제공하고 여기서 항체는 본원에서 제공하는 서열, 예를 들어 서열번호 25로 제공하는 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 또는 동일한 중쇄 가변 도메인, 및 본원에서 제공하는 서열, 예를 들어 서열번호 16으로 제공하는 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 또는 동일한 경쇄 가변 도메인을 갖지만, 항체 분자는 CDR-H1에 대해 서열번호 1로 제공되는 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 2로 제공되는 서열, CDR-H3에 대해 서열번호 3으로 제공되는 서열, CDR-L1에 대해 서열번호 4로 제공되는 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 5 또는 서열번호 7로 제공되는 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 6으로 제공되는 서열을 갖는다.
본원에서 사용하는 "동일성"은 정렬된 서열의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열 간에 동일한 것을 의미한다. 본원에서 사용하는 "유사성"은 정렬된 서열의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열 간에 유사한 유형임을 의미한다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린으로 치환될 수 있다. 종종 서로에 대해 치환될 수 있는 다른 아미노산은 다음을 포함하지만, 이에 제한되는 것이 아니다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황-함유 측쇄를 갖는 아미노산). 동일성 및 유사성 정도는 쉽게 산출할 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; NCBI에서 입수할 수 있는 BLAST™ 소프트웨어(Altschul, S.F. et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410); Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al, 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편을 포함하지만, 제한없이, Fab, 개질된 Fab, Fab', 개질된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, dsscFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 상기 중 임의의 에피토프 결합 단편일 수 있다(예를 들어, 다음의 문헌들을 참조한다: Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). 이들 단편을 생성시키고 제작하는 방법은 당분야에서 잘 알려져 있다(예를 들어, [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181]를 참조한다). 본 발명에서 사용하기 위한 다른 항체 단편은 국제 공개 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기술된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다수 특이성, 예를 들어 이특이성을 포함하거나 또는 단일특이성일 수 있다(예를 들어, WO 92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 및 WO2010/035012를 참조한다).
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해 서열번호 16 및 25로 나타낸 가변 영역을 포함하는 항체 Fab 단편이다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 서열번호 20으로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29로 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해서, 서열번호 51 및 59로 나타낸 가변 영역을 포함하는 항체 Fab 단편이다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해서, 서열번호 16 및 25로 나타낸 가변 영역을 포함하는 항체 Fab 또는 Fab' 단편이다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 서열번호 20으로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 29(Fab) 또는 서열번호 33(Fab')으로 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해서 서열번호 51 및 59로 나타낸 가변 영역을 포함하는 항체 Fab' 단편이다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 서열번호 55로 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 63으로 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해서, 서열번호 16 및 25로 제공된 가변 영역을 포함하는 전장 IgG1 항체이다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 서열번호 20으로 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 73으로 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 서열번호 51 및 59로 나타낸 가변 영역을 포함하는 전장 IgG1이다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해서, 서열번호 16 및 25로 나타낸 가변 영역을 포함하는 전장 IgG4 형태이다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 서열번호 20으로 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 25로 제공된 가변 영역 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해서, 서열번호 51 및 59로 나타낸 가변 영역을 포함하는 전장 IgG4 형태이다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 서열번호 55로 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 59로 제공된 가변 영역 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해서, 서열번호 16 및 25로 나타낸 가변 영역을 포함하는 전장 IgG4P 형태이다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 서열번호 20으로 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 37 또는 서열번호 39로 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 분자는 예를 들어 각각 경쇄 및 중쇄에 대해서, 서열번호 51 및 59로 나타낸 가변 영역을 포함하는 전장 IgG4P 형태이다. 일 실시양태에서, 항체 분자는 서열번호 55로 제공된 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 59로 제공된 가변 영역 서열을 포함하는 중쇄를 갖는다.
본원에서 적용하는 IgG4P는 아미노산 241이 프롤린으로 치환된 야생형 IgG4 이소타입의 돌연변이이며, 예를 들어, [Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30(1), 105-108]에 기술된 바와 같이 위치 241의 세린이 프롤린으로 변화된 경우를 참조한다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체는 참조하여 본원에 모두 편입되는 WO2009/040562, WO2010035012, WO2011/030107, WO2011/061492 및 WO2011/086091에 기술된 바와 같이, 면역글로불린 모이어티, 예를 들어 Fab 또는 Fab' 단편, 및 이에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 1 또는 2 단일 도메인 항체(dAb)를 포함하는 FcRn 결합 항체 융합 단백질로서 제공된다.
일 실시양태에서, 융합 단백질은 경우에 따라 디설피드 결합에 의해 연결되는, 예를 들어 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 쌍으로서 2개 도메인 항체를 포함한다.
일 실시양태에서, 융합 단백질의 Fab 또는 Fab' 성분은 단일 도메인 항체 또는 항체들에 대해 동일하거나 또는 유사한 특이성을 갖는다. 일 실시양태에서, Fab 또는 Fab'은 단일 도메인 항체 또는 항체들에 대해서 상이한 특이성을 가지며, 다시 말해서 융합 단백질은 다가이다. 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 다가 융합 단백질은 알부민 결합 부위를 가지며, 예를 들어 본원의 VH/VL 쌍은 알부민 결합 부위를 제공한다. 이러한 일 실시양태에서, 중쇄는 서열번호 42로 제공되는 서열을 포함하고 경쇄는 서열번호 40으로 제공되는 서열을 포함한다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 Fab 또는 Fab'은 PEG 분자 또는 인간 혈청 알부민에 접합된다.
CA170_01638g49 및 1638.g49는 본원에서 상호교환적으로 적용되며 수많은 다른 형태로 사용될 수 있는 항체 가변 영역의 특이적 쌍을 의미하는데 사용된다. 이들 가변 영역은 서열번호 25로 제공되는 중쇄 서열 및 서열번호 16으로 제공되는 경쇄 서열이다.
CA170_01638g28 및 1638.g28은 본원에서 상호교환적으로 적용되고 수많은 상이한 형태로 사용될 수 있는 항체 가변 영역의 특이적 쌍을 의미하는데 사용된다. 이들 가변 영역은 서열번호 59로 제공되는 중쇄 서열 및 서열번호 51로 제공되는 경쇄 서열이다.
본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은, 존재하면, 항체 분자의 제안된 기능에 대해서, 구체적으로 요구되는 이펙터 기능에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 구체적으로, 항체 분자가 치료 용도로 의도되고 항체 이펙터 기능이 요구되는 경우, 특히 IgG1 및 IgG3 이소타입의 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있다.
대안적으로, IgG2 및 IgG4 이소타입은 항체 분자가 치료 목적으로 의도되고 항체 이펙터 기능은 요구되지 않는 경우에 사용될 수 있다. 이들 불변 영역 도메인의 서열 변이체가 사용될 수도 있음을 이해한다. 예를 들어 [Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30(1), 105-108]에 기술된 바와 같이 위치 241의 세린이 프롤린으로 변화된 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 항체가 다양한 번역후 개질을 겪을 수 있음을 역시 당분야의 숙련가는 이해한다. 이들 개질의 유형 및 정도는 종종 배양 조건뿐만 아니라 항체를 발현하는데 사용되는 숙주 세포주에 따라 좌우된다. 이러한 개질은 당화의 변이, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화를 포함할 수 있다. 빈번한 개질은 카르복시펩티다아제의 작용에 의한 카르복시-말단 염기성 잔기(예컨대 리신 또는 아르기닌)의 손실이다([Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995]에 설명된 바와 같음). 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 리신이 없을 수 있다.
일 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고 항체 경쇄는 카파 또는 람다의 CL 도메인을 포함한다.
일 실시양태에서, 경쇄는 서열번호 20으로 제공되는 서열을 가지며 중쇄는 서열번호 29로 제공되는 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, 경쇄는 서열번호 20으로 제공되는 서열을 가지며 중쇄는 서열번호 33으로 제공되는 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, 경쇄는 서열번호 20으로 제공되는 서열을 가지며 중쇄는 서열번호 37로 제공되는 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, 경쇄는 서열번호 20으로 제공되는 서열을 가지며 중쇄는 서열번호 74로 제공되는 서열을 갖는다.
일 실시양태에서, 항체 분자의 C-말단 아미노산은 번역 후 개질 동안 절단된다.
일 실시양태에서, 항체 분자의 N-말단 아미노산은 번역 후 개질 동안 절단된다.
본 발명은 또한 본 발명에서 제공되는 항체, 구체적으로 중쇄 서열 gH33(서열번호 25) 및/또는 경쇄 서열 gL7(서열번호 16)을 포함하는 항체 또는 중쇄 서열 gH2(서열번호 59) 및 경쇄 서열 gL2(서열번호 51)를 포함하는 항체에 의해 결합되는 인간 FcRn의 특이적 영역 또는 에피토프를 제공한다.
인간 FcRn 폴리펩티드의 특이적 영역 또는 에피토프는 본 발명에 의해 제공되는 항체 중 어느 하나와 조합하여 당분야에 공지된 임의의 적합한 에피토프 맵핑 방법으로 동정할 수 있다. 이러한 방법의 예에는 항체에 의해 인식되는 에피토프의 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 최소 단편으로 본 발명의 항체와의 결합에 대해 FcRn에서 유래된 다양한 길이의 펩티드를 스크리닝하는 것을 포함한다. FcRn 펩티드는 합성적으로 또는 FcRn 폴리펩티드의 단백질가수분해적 분해에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합하는 펩티드는, 예를 들어 질량 분광분석법으로 동정할 수 있다. 다른 예에서, NMR 분광법 또는 X-선 결정학을 사용하여 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프를 동정할 수 있다. X-선 결정학이 사용되는 일례에서, 에피토프는 항체의 4Å 내에 존재하는 FcRn 폴리펩티드 상의 잔기들로서 결정된다. 일례에서, 에피토프는 항체의 5Å 내인 FcRn 폴리펩티드 상의 잔기들로서 결정된다. 동정되면, 본 발명의 항체가 결합하는 에피토프 단편은 필요하다면, 동일 에피토프에 결합하는 추가 항체를 획득하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본원의 항체는 하기에 나타낸 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 서열에 결합한다:
Figure pct00001
밑줄친 잔기는 인간 IgG의 Fc 영역과 인간 FcRn의 상호작용에 결정적인 것으로 알려진 것들이다. 굵은 글씨의 잔기는 서열번호 25로 제공된 중쇄 서열 및 서열번호 16으로 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체와의 결합에 관여하는 인간 FcRn 폴리펩티드의 잔기이며, 즉 이들은 X-선 결정학으로 결정시 항체의 4Å 내에 있다. 이탤릭체 잔기는 5Å에서 동일 항체와의 결합에 관여하는 것들이다.
본 발명의 일 측면에서, 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 잔기 E115, W131, P132, 및 E133으로 이루어진 군에서 선택된 1, 2, 3, 또는 4 아미노산을 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하고, 여기서 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편은 A81, G83, G84, K85, G86, P87, N113, L135, A136, 및 Q139로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 잔기, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 잔기에 더 결합하고, 경우에 따라서 L82, Y88, L112 및 D130으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 잔기에 더 결합한다.
따라서, 일례에서, 잔기 E115, W131, P132, 및 E133로 이루어진 군에서 선택된 1, 2, 3, 또는 4 아미노산, 및 A81, G83, G84, K85, G86, P87, N113, L135, A136, 및 Q139로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1 잔기, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공하고, 여기서 상기 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편은 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 L82, Y88, L112 및 D130으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 잔기, 예를 들어 적어도 2, 3 또는 4 잔기에 더 결합한다.
일례에서 본 발명의 이러한 측면에 따른 항체는 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 V105, P106, T107, A108 및 K109에 결합하지 않는다.
일례에서 본 발명의 이러한 측면에 따른 항체는 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128 및 G129에 결합하지 않는다.
일례에서, 본 발명의 이러한 측면에 따른 항체는 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 V105, P106, T107, A108, K109, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, 및 G129에 결합하지 않는다.
일례에서, 잔기 E115, W131, P132, 및 E133으로 이루어진 군에서 선택된 1, 2, 3, 또는 4 아미노산, 및 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87 및 Y88로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 잔기, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
일례에서 잔기 E115, W131, P132, 및 E133으로 이루어진 군에서 선택된 1, 2, 3 또는 4 아미노산 및 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 L112, N113, D130, L135, A136, 및 Q139로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 잔기, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
일례에서 잔기 E115, W131, P132, 및 E133으로 이루어진 군에서 선택된 1, 2, 3 또는 4 아미노산, 및 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, D130, L135, A136, 및 Q139로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
일례에서, 잔기 E115, W131, P132, 및 E133, 및 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, D130, L135, A136, 및 Q139로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
일례에서, 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 잔기 A81, G83, G84, K85, G86, P87, Nl 13, El 15, W131, P132, E133, L135, A136, 및 Q139를 포함하거나 또는 이로 이루어진 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
일례에서, 본 발명은 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의 잔기 A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, E115, D130, W131, P132, E133, L135, A136, 및 Q139를 포함하거나 또는 이로 이루어진 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 상기 기술된 에피토프에 결합하는 항체는 완전 인간형이다. 일례에서, 그들은 150 pM 이하, 전형적으로 130 pM 이하의 인간 FcRn에 대한 친화성을 갖는다.
본 발명에 따른 항체 분자, 구체적으로 서열번호 25로 제공되는 중쇄 서열 및 서열번호 16으로 제공되는 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자의 결합을 교차 차단하는 항체는 FcRn 활성을 차단하는데 유사하게 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 인간 FcRn에 대한 상기 본원에 기솔된 항체 분자 중 어느 하나의 결합을 교차 차단하고/하거나 이들 항체 중 어느 하나에 의한 인간 FcRn과의 결합으로부터 교차 차단되는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다. 일 실시양태에서, 이러한 항체는 상기 본원에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 실시양태에서, 교차 차단 중화 항체는 상기 본원에 기술된 항체가 결합하는 에피토프와 중복되고/되거나 접하는 에피토프에 결합한다.
교차 차단 항체는 당분야의 임의의 적합한 방법, 예를 들어 인간 FcRn에 대한 교차 차단 항체의 결합이 본 발명의 항체의 결합을 방지하거나 또는 그 반대이기도 한 경쟁적 ELISA 또는 BIAcore를 사용하여 동정할 수 있다. 이러한 교차 차단 어세이는 단리된 천연 또는 재조합 FcRn 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 사용할 수 있다. 일례에서, 결합 및 교차 차단은 재조합 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)을 사용하여 측정한다. 일례에서 재조합 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인이 β2 마이크로글로불린(β2Μ)(서열번호 72)와의 복합체에서 사용된다.
일 실시양태에서, IgG에 대한 FcRn 결합을 차단하고 그 중쇄가 서열번호 25로 제공되는 서열을 포함하고 그 경쇄가 서열번호 16으로 제공되는 서열을 포함하는 항체의 인간 FcRn에 대한 결합을 교차 차단하는 항-FcRn 항체 분자를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명에서 제공하는 교차 차단 항체는 서열번호 25로 제공되는 중쇄 서열 및 서열번호 16으로 제공되는 경쇄 서열을 포함하는 항체의 결합을 80% 이상, 예를 들어 85% 이상, 예컨대 90% 이상, 구체적으로 95% 이상 억제한다.
일 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 완전 인간형이다. 일 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 인간화된다. 일 실시양태에서, 본 발명에서 제공되는 교차 차단 항체는 인간 FcRn에 대한 친화성이 150 pM 이하, 130 pM 이하 또는 100 pM 이하이다. 일 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공되는 교차 차단 항체는 인간 FcRn에 대한 친화성이 50 pM 이하이다. 친화성은 이하 본원에 기술된 방법을 사용해 측정할 수 있다.
생물학적 분자, 예컨대 항체 또는 단편은 산성 및/또는 염기성 작용기를 함유하여서, 분자에 순 양성 또는 순 음성 전하를 제공한다. 전체 "관찰" 전하의 양은 독립체의 절대적인 아미노산 서열, 3D 구조의 하전된 기의 국소 환경 및 분자의 환경 조건에 의존적이다. 등전점(pi)은 특정 분자 또는 이의 용매 접근가능한 표면이 순 전하를 보유하지 않는 pH이다. 일례에서, 본 발명의 FcRn 항체 및 단편은 적절한 등전점을 갖도록 조작될 수 있다. 이는 항체 및/또는 단편이 보다 강건한 특성, 특히 적절한 가용성 및/또는 안정한 프로파일 및/또는 개선된 정제 특징을 갖게할 수 있다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 원래 동정된 항체와는 상이한 등전점을 갖도록 조작된 인간화 FcRn을 제공한다. 항체는 예를 들어 아미노산 잔기를 치환 예컨대 산성 아미노산 잔기를 1 이상의 염기성 아미노산 잔기로 치환되게 조작할 수 있다. 대안적으로, 염기성 아미미노산 잔기가 도입되거나 또는 산성 아미노산 잔기가 제거될 수 있다. 대안적으로, 분자가 허용불가하게 높은 pi 값을 가지면 필요에 따라 pi를 낮추기 위해 산성 잔기가 도입될 수 있다. pi가 조작되는 경우, 항체 또는 단편의 바람직한 활성이 유지되도록 주의해야 함이 중요하다. 따라서, 일 실시양태에서, 조작된 항체 또는 단편은 "미개질된" 항체 또는 단편과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 활성을 갖는다.
프로그램 예컨대 ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html를 사용하여 항체 또는 단편의 등전점을 예측할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, pi는 임의의 적합한 표준 실험실 기술을 사용해 측정할 수 있다.
본 발명의 항체 분자는 적절하게 높은 결합 친화성, 구체적으로 나노몰 범위로 갖는다. 친화성은 단리된 천연 또는 재조합 FcRn 또는 적합한 융합 단백질 폴리펩티드를 사용하여, 본원의 실시예에 기술된 바와 같이, BIAcore를 포함하는, 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 측정할 수 있다. 일례에서, 친화성은 본원의 실시예에 기술된 바와 같이 재조합 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)을 사용해 측정된다. 일례에서, 친화성은 인간 β2 마이크로글로불린(β2Μ)(서열번호 72)과 회합된 재조합 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인(서열번호 48)을 사용해 측정된다. 적절하게 본 발명의 항체 분자는 단리된 인간 FcRn에 대한 결합 친화성이 약 1 nM 이하이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화성이 약 500 pM 이하(즉, 더 높은 친화성)이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화성이 약 250 pM 이하이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화성이 약 200 pM 이하이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 결합 친화성이 약 150 pM 이하이다. 일 실시양태에서, 본 발명은 결합 친화성이 약 100 pM 이하인 항-FcRn 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 결합 친화성이 약 100 pM 이하인 인간화 항-FcRn 항체를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 결합 친화성이 50 pM 이하인 항-FcRn 항체를 제공한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 비슷한 결합 친화성으로 pH 6 이하의 pH(구체적으로 pH 6) 및 pH 7.4 또는 그 이상의 pH(구체적으로 pH 7.4) 둘 다에서 인간 FcRn에 결합할 수 있다. 따라서 유리하게, 항체는 엔도솜 내에서도 FcRn에 계속 결합할 수 있어서, IgG에 대한 FcRn 결합 차단을 최대화할 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 pH 6 및 pH 7.4에서 측정시 150 pM 이하의 결합 친화성으로 인간 FcRn에 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 pH 6 및 pH 7.4에서 측정시 130 pM 이하의 결합 친화성으로 인간 FcRn에 결합할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 pH 6에서 측정시 130 pM 이하의 결합 친화성 및 pH 7.4에서 측정시 50 pM 이하의 결합 친화성으로 인간 FcRn에 결합할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 결합 단편의 친화성을 비롯하여, 결합제(예컨대 항체)가 결합을 억제하는 정도는 통상적인 기술, 예를 들어 [Scatchard et al.(Ann. KY. Acad. Sci. 51 :660-672(1949))]에 기술된 것들을 사용하거나 또는 BIAcore와 같은 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 당분야의 숙련가가 결정할 수 있다. 표면 플라스몬 공명의 경우, 표적 분자를 고체상 위에 고정시키고 흐르는 세포를 따라서 흐르는 이동상 중의 리간드에 노출시킨다. 교정된 표적에 대한 리간드 결합이 일어나면, 국소 굴절률이 변하여, SPR 각의 변화가 초래되고, 반사광의 강도 변화를 검출하여 실시간으로 모니터링할 수 있다. SPR 신호의 변화율은 결합 반응의 결합 및 해리층에 대한 겉보기 속도 상수를 산출하여 분석할 수 있다. 이들 값의 비율은 겉보기 평형 상수(친화성)를 제공한다(예를 들어, [Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65(1993)]를 참조함).
본 발명에서, 시험 항체 분자의 친화성은 전형적으로 다음과 같이 SPR을 사용해 결정한다. 시험 항체 분자는 고체 상에서 포획되고 인간 β2Μ와의 비공유 복합체 중의 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인은 이동 상의 포획된 항체 상에서 흘려서 인간 FcRn에 대한 시험 항체 분자의 친화성을 결정한다. 시험 항체 분자는 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예를 들어 항-Fc 또는 항 Fab' 특이적 포획제를 사용하여 고체상 칩 표면 상에서 포획될 수 있다. 일례에서, 친화성은 pH 6에서 결정된다. 일례에서, 친화성은 pH 7.4에서 결정된다.
본 발명에 의해 제공되는 항체의 친화성은 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 변경시킬 수 있음을 이해한다. 따라서 본 발명은 FcRn에 대한 개선된 친화성을 갖는, 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이다. 이러한 변이체는 CDR 돌연변이(Yang et al, J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), 이.콜라이의 돌연변이체 균주의 사용(Low et al., J. Mol. Biol, 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al, Curr. Opin. BiotechnoL, 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al, J. Mol. Biol, 256, 77-88, 1996) 및 섹슈얼 PCR(Crameri et al, Nature, 391 , 288-291, 1998)을 포함한 수많은 친화성 성숙화 프로토콜에 의해 얻을 수 있다. Vaughan 등(상동)은 이들 친화성 성숙화 방법을 설명하고 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 인간 FcRn 활성을 차단한다. FcRn을 차단하는 항체의 능력을 결정하는데 적합한 어세이는 본원의 실시예에서 설명한다. 시험관내에서 IgG 재활용을 차단하는 항체 분자의 능력을 결정하는데 적합한 어세이를 이하 본원에서 설명한다.
바람직하다면 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 1 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다. 이펙터 분자는 본 발명의 항체에 부착할 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 단일 이펙터 분자 또는 2 이상의 이러한 분자들을 포함할 수 있다. 이펙터 분자에 연결된 항체 단편을 얻는 것이 바람직한 경우에, 이들은 이펙터 분자에 커플링제를 통해서 또는 직접적으로 항체 단편을 연결시키는 표준 화학 또는 재조합 DNA 과정을 통해 제조될 수 있다. 항체를 이러한 이펙터 분자에 접합시키는 방법은 당분야에서 공지되어 있다(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62: 119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). 구체적인 화학적 과정은 예를 들어, WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03/031581에 기술된 것들을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질이거나 또는 폴리펩티드인 경우, 연결은 예를 들어 WO 86/01533 및 EP0392745에 기술된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 사용해 얻을 수 있다.
본원에서 사용하는 용어 이펙터 분자는 예를 들어 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천열 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들어 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오드, 방사성동위원소, 킬레이트화된 금속, 나노입자 및 리포터기 예컨대 형광발광성 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법으로 검출할 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예에는 세포에 유해한(예를 들어, 사멸시키는) 임의의 작용제를 포함한 세포독소 또는 세포독성제를 포함할 수 있다. 예에는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 마이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스텔린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈트리스틴, 빈블라스틴, 콜키신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-히디드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 상동체를 포함한다.
이펙트 분자는 또한 제한없이, 항대사산물(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 데카르바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플래티넘(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 다우노루비신(이전에 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(이전에 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 또는 두오카르마이신), 및 항유사분열제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함한다.
다른 이펙터 분자는 킬레이트화 방사성핵종 예컨대 111In 및 90Y, Lu177, 비스무쓰213, 칼리포늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 약물 예컨대 제한없이, 알킬포스포콜린, 토포이소머라아제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민을 포함한다.
다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심 효소는 제한없이, 단백질가수분해성 효소, 히드롤라아제, 리아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제를 포함한다.
관심 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 제한없이, 면역글로불린, 독소 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소, 단백질 예컨대 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성인자, 혈전제 또는 항혈관신생제, 예를 들어 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 반응 개질제 예컨대 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함한다.
다른 이펙터 분자는 예를 들어 진단에 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예에는 다양한 효소, 보결분자단, 형광발광성 물질, 발광성 물질, 생물발광성 물질, 방사능 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영에서 사용을 위함), 및 비방사능 상자성 금속 이온을 포함한다. 대체로 진단제로서 사용하기 위해 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스터라아제를 포함하고, 적합한 보결분자단은 스트렙타비딘, 아비딘 및 바이오틴을 포함하며, 적합한 형광발광성 물질은 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 파이코에리쓰린을 포함하며, 적합한 발광성 물질은 루미놀을 포함하고, 적합한 생물발광성 물질은 루시퍼라아제, 루시페린 및 애쿠오린을 포함하고, 적합한 방사능 핵종은 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
다른 예에서 이펙터 분자는 생체내 항체의 반감기를 증가시키고/시키거나, 항체의 면역원성을 감소시키고/시키거나 면역계로 상피 장벽을 건너 항체의 전달을 향상시킨다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예에는 중합체, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물 예컨대 WO05/117984에 기술된 것들이 포함된다.
일 실시양태에서, FcRn과 독립적인 이펙터 분자에 의해 제공되는 반감기가 유리하다.
이펙터 분자가 중합체인 경우, 대체로, 합성 또는 천연 발생 중합체, 예를 들어 임의 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형 다당류, 예를 들어 동종- 또는 이종-다당류를 포함한다.
상기 언급한 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 특이적인 선택적 치환기는 1 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 특정 예는 임의 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알콜) 또는 이의 유도체, 특히 임의 치환된 폴리(에틸렌글리콜) 예컨대 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체를 포함한다.
특정한 천연 발생 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이의 유도체를 포함한다.
일 실시양태에서, 중합체는 알부민 또는 이의 단편, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다.
본원에서 사용하는 "유도체"는 반응상 유도체, 예를 들어 티올-선택적 반응성 기 예컨대 말레이미드 등을 포함하고자 한다. 반응성 기는 직접적으로 또는 링커 절편을 통해서 중합체에 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔기는 일례에서 항체 단편과 중합체 간에 연결기로서 생성물의 일부를 형성하게 됨을 이해한다.
중합체의 크기는 바람직하다면 다양할 수 있지만, 일반적으로 평균 분자량이 500 Da 내지 50000 Da 범위, 예를 들어 5000 내지 40000 Da 예컨대 20000 내지 40000 Da 범위이다. 중합체의 크기는 구체적으로 생성물의 목적하는 용도, 예를 들어 일정 조직 예컨대 종양에 국재화하는 능력 또는 연장된 순환계 반감기를 기초로 선택될 수 있다(예를 들어, [Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545]를 참조한다). 따라서, 예를 들어, 생성물이 예를 들어 종양의 치료에 사용하기 위해, 순환계를 떠나 조직을 침투하고자 하는 경우, 예를 들어 분자량이 약 5000 Da인 소형 분자량 중합체를 사용하는 것이 유리하다. 생성물이 순환계에 잔존하는 용도의 경우, 예를 들어 분자량이 20000 Da 내지 40000 Da 범위인 고분자량 중합체를 사용하는 것이 유리하다.
적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) 또는, 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체, 특히 분자량이 약 15000 Da 내지 약 40000 Da 범위인 것을 포함한다.
일례에서, 본 발명에서 사용하기 위한 항체는 폴리(예틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 특정 일례에서 항체는 항체 단편이고 PEG 분자는 항체 단편에 존재하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 자유 아미노, 이미노, 티올, 히드록실 또는 카르복실 기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에 천연적으로 존재하거나 또는 재조합 DNA 방법을 사용해 단편내로 조작될 수 있다(예를 들어, US 5,219,996; US 5,667,425; W098/25971, WO2008/038024 참조함). 일례에서, 본 발명의 항체 분자는 개질된 Fab 단편이고 여기서 개질은 이펙터 분자의 부착이 가능하도록 1 이상의 아미노산을 그 중쇄의 C 말단에 부가하는 것이다. 적합하게, 부가적인 아미노산은 이펙터 분자가 부착하게되는 1 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 개질된 힌지 영역을 형성한다. 다수 부위를 사용하여 2 이상의 PEG 분자를 부착시킬 수 있다.
적합하게 PEG 분자는 항체 단편에 존재하는 적어도 하나의 시스테인 잔기의 티올기를 통해서 공유 연결된다. 개질된 항체 단편에 부착되는 각각의 중합체 분자는 단편에 존재하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유 연결될 수 있다. 공유 연결은 대체로 디설피드 결합이거나, 또는 구체적으로 황-탄소 결합이다. 티올 기가 부착 지점으로서 적절하게 활성화된 이펙터 분자를 사용하는 경우, 예를 들어 티올 선택적 유도체 예컨대 말레이미드 및 시스테인 유도체가 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 기술된 바와 같이 중합체-개질된 항체의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 작용성 기를 함유하는 임의의 중합체 예컨대 α-할로카르복실산 또는 에스테르, 예를 들어 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들어 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설피드일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로(예를 들어, Nektar, 이전에 Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) 얻거나 또는 통상의 화학적 방법을 사용해 시판되는 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 구체적인 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(Nektar, 이전에 Shearwater; Rapp Polymere; 및 SunBio에서 입수가능) 및 M-PEG-SPA(Nektar, 이전에 Shearwater에서 입수가능)를 포함한다.
일 실시양태에서, 항체는 PEG화, 즉 예를 들어, EP 0948544 또는 EP1090037에 따라서 공유 부착된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))을 갖는 개질된 Fab 단편, Fab' 단편 또는 diFab이다[또한 다음의 문헌들을 참조한다: "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris(ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky(eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. 일례에서 PEG는 힌지 영역 내 시스테인에 부착된다.
일례에서, PEG 개질된 Fab 단편은 개질된 힌지 영역에 단일 티올 기에 공유 연결된 말레이미드 기를 갖는다. 리신 잔기는 말레이미드 기에 공유 연결될 수 있고 리신 잔기 상의 아민 기 각각에 분자량이 대략 20,000 Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다.
Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 따라서 대략 40,000 Da이다.
구체적인 PEG 분자는 PEG2MAL40K(Nektar, 이전에 Shearwater에서 입수가능)라고도 알려진, N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000) 개질된 리신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함한다.
PEG 링커의 대안적인 공급원은 GL2-400MA3(이하 화학식에서 m은 5임) 및 GL2-400MA(m은 2임)를 공급하는 NOF를 포함하고 n은 대략 450이다:
Figure pct00002
m은 2 또는 5이다.
다시 말해서 각각의 PEG는 약 20,000 Da이다.
따라서, 일 실시양태에서, PEG는 SUNBRIGHT GL2-400MA3라고 알려진 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시}헥산(2개 팔 분지된 PEG, -CH2)3NHCO(CH2)5-MAL, Mw 40,000이다.
다음 유형의 추가의 대안적인 PEG 이펙터 분자는 Dr Reddy, NOF 및 Jenkem에서 입수할 수 있다:
Figure pct00003
일 실시양태에서, 사슬의 아미노산 232 또는 대략 아미노산 232, 예를 들어 중쇄의 아미노산 232(순차적 번호매김에 의함), 예를 들어 서열번호 33의 아미노산 232에서의 시스테인 아미노산 잔기를 통해 부착된, PEG화된(예를 들어, 본원에 기술된 PEG에 의함) 항체를 제공한다.
일 실시양태에서, 본원은 1 이상의 PEG 중합체, 예를 들어 1 또는 2 중합체 예컨대 40 kDa 중합체 또는 중합체들을 포함하는 Fab' PEG 분자를 제공한다.
본원에 따른 Fab'-PEG 분자는 그들이 반감기가 Fc 단편과는 독립적인 점에서 특히 유리할 수 있다. 일례에서, 본 발명은 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 인간 FcRn을 차단하여 완화되는 질환을 치료하는 방법을 제공하고 여기서 항체 또는 이의 결합 단편은 반감기가 FcRn에 대한 Fc 결합과는 독립적이다.
일 실시양태에서, 중합체, 예컨대 PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 접합된 Fab'를 제공한다.
일 실시양태에서, 중합체, 예컨대 PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 접합된 scFv를 제공한다.
일 실시양태에서, 항체 또는 단편은 전분 분자에 접합되어, 예를 들어 반감기가 증가된다. 전분을 단백질에 접합시키는 방법은 참조하여 본원에 편입되는 US 8,017,739에 기술된 바와 같다.
일 실시양태에서,
. 혈장 IgG 농도의 50-85% 감소, 예컨대 70% 감소를 야기,
. 혈장 알부민 농도의 25% 또는 20%를 넘지 않는 감소, 및/또는
. 저혈장 IgG 농도의 장기 유지를 달성하기 위한 반복 투약의 가능성
의 항-FcRn 결합 분자(즉, 항체 또는 이의 결합 단편)를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 적합하게, DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 본 발명의 DNA 서열은 예를 들어 화학적 프로세싱, cDNA, 게놈 DNA 또는 이의 임의 조합에 의해 생성된, 합성 DNA를 포함한다.
본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열은 당분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 결정된 DAN 서열로부터 바람직하다면 합성되거나 또는 상응하는 아미노산 서열을 기초로 합성될 수 있다.
억셉터 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA는 당분야의 숙련가가 광범위하게 입수할 수 있고 그들의 기지의 아미노산 서열을 기초로 쉽게 합성할 수 있다.
분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 준비할 수 있다. 바람직한 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용해 완벽하게 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 부위 지정 돌연변이유발법 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 적절하게 사용할 수 있다.
적합한 DNA 서열의 예가 본원에 제공된다.
1638.g49 경쇄 가변 영역을 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예는 서열번호 17, 서열번호 19 및 서열번호 21로 제공된다.
1638.g28 경쇄 가변 영역을 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예는 서열번호 52 및 서열번호 54로 제공된다.
1638.g49 중쇄 가변 영역을 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예는 서열번호 26 및 서열번호 28로 제공된다.
1638.g28 중쇄 가변 영역을 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예는 서열번호 60 및 62로 제공된다.
1638.g49 경쇄(가변 및 불변)를 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예는 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 24로 제공되고, 1638.g28 경쇄를 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예는 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호58로 제공되는 서열이며 1638.g28 중쇄에 대한 적합한 DNA 서열의 예는 서열번호 64 또는 서열번호 66으로 제공되는 서열이다.
1638.g49 중쇄(형태에 따라서, 가변 및 불변)를 코딩하는 적합한 DNA 서열의 예는 서열번호 30(Fab), 서열번호 34 또는 36(Fab'), 서열번호 38(IgG4P), 서열번호 43(FabFv) 및 서열번호74(IgGl)로 제공된다.
따라서, 일례에서 본 발명은 서열번호 30, 32, 34, 36, 64 또는 66으로 제공되는 서열을 포함하는 본 발명의 항체 Fab 또는 Fab' 단편의 중쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 또한 서열번호 21, 22 또는 56으로 제공되는 서열을 포함하는 본 발명의 항체 Fab 또는 Fab' 단편의 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
일례에서, 본 발명은 중쇄를 코딩하는 DNA가 서열번호 38로 제공되는 서열을 포함하고 경쇄를 코딩하는 DNA가 서열번호 22로 제공되는 서열을 포함하는 본 발명의 IgG4(P) 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
일례에서, 본 발명은 중쇄를 코딩하는 DNA가 서열번호 74로 제공되는 서열을 포함하고 경쇄를 코딩하는 DNA가 서열번호 22로 제공되는 서열을 포함하는 본 발명의 IgG1 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
일례에서, 본 발명은 중쇄를 코딩하는 DNA가 서열번호 43으로 제공되는 서열을 포함하고 경쇄를 코딩하는 DNA가 서열번호 41로 제공되는 서열을 포함하는 본 발명의 Fab-dsFv 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 1 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체를 코딩하는 1 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 적합하게, 클로닝 또는 발현 벡터는 각각 본 발명의 항체의 경쇄 및 중쇄 및 적합한 신호 서열을 코딩하는, 2 DNA 서열을 포함한다. 일례에서, 벡터는 중쇄 및 경쇄 사이에 유전자간 서열을 포함한다(WO03/048208을 참조함).
벡터가 제작되는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이러한 측면에서, ["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel(ed), Wiley Interscience, New York] 및 Cold Spring Harbor Publishing에서 제작한 Maniatis Manual을 참조한다.
또한 본 발명의 항체를 코딩하는 1 이상의 DNA 서열을 포함하는 1 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한
i) 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 DNA 서열, 및
ii) 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA 서열
을 포함하는 본 발명에 따른 항체의 발현을 위한 숙주 세포를 제공하며, 여기서 DNA 서열은 1 이상의 클로닝 또는 발현 벡터에 제공된다.
임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 이.콜라이 및 다른 미생물 시스템이 사용(특히 항체 단편의 발현을 위함)되거나 또는 진핵생물, 예를 들어 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템도 사용(특히 전장 항체의 발현을 위함)될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위해 적합한 유형의 중국 햄스터 난소(CHO 세포)는 DHFR 선별 마커와 사용할 수 있는, dhfr- CHO, 예컨대 CHO-DG44 세포 및 CHO-DXB11 세포를 포함하는 CHO 및 CHO-K1 세포, 또는 글루타민 합성효소 선밸 마커와 사용할 수 있는 CHOK1-SV 세포를 포함한다. 항체를 발현하는데 사용되는 다른 세포 유형은 림프구 세포주, 예를 들어 NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 야기시키는데 적합한 조건 하에서 본 발명의 벡터 또는 벡터들을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 항체 분자의 제조 방법을 제공한다.
항체 분자는 오직 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하며, 이러한 경우에 오직 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열을 숙주 세포를 형질감염시키는데 사용할 필요가 있다. 중쇄와 경쇄 둘 다를 포함하는 생성물의 제조를 위해서, 세포주는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터의 2개 벡터로 형질감염된다. 대안적으로 단일 벡터를 사용할 수 있는데, 이러한 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 및 단편은 숙주 세포로부터 양호한 수준으로 발현된다. 따라서, 항체 및/또는 단편의 성질은 상업적인 프로세싱에 도움이 된다.
따라서, 숙주 세포를 배양하고 항체 또는 이의 단편을 발현시키고, 후자를 단리하고 경우에 따라 정제하여 단리된 항체 또는 단편을 제공하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 이러한 방법은 단리된 항체 또는 단편에 이펙터 분자를 접합시키는 단계, 예를 들어 구체적으로 본원에 기술된 바와 같은 PEG 중합체에 접합시키는 단계를 더 포함한다.
일 실시양태에서, 불순물이 컬럼에 유지되고 항체는 용리되도록 비결합 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 항체(구체적으로 본원에 따른 항체 또는 단편)를 정제하는 방법을 제공한다.
일 실시양태에서, 정제는 FcRn 컬럼 상에서의 친화성 포획을 채택한다.
일 실시양태에서, 정제는 시바크론 블루 또는 알부민 융합 또는 접합 분자의 정제에 유사한 것을 채택한다.
이러한 방법에서 사용하기 적합한 이온 교환 수지는 Q.FF 수지(GE-Healthcare에서 공급)를 포함한다. 이 단계는 예를 들어 pH 약 8에서 수행될 수 있다.
방법은 예를 들어 약 4 내지 5, 예컨대 4.5의 pH에서 수행되는, 양이온 교환 크로마토그래피를 적용하는 초기 포획 단계를 더 포함할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들어 CaptoS 수지 또는 SP 세파로스 FF(GE-Healthcare에서 공급)와 같은 수지를 적용한다. 이어 항체 또는 단편은 예를 들어 200 mM 농도의 염화나트륨과 같은 이온성 염 용액을 적용하는 수지로부터 용리할 수 있다.
따라서, 크로마토그래피 단계 또는 단계들은 적절하다면, 1 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다.
정제 공정은 또한 1 이상의 여과 단계, 예컨대 투석여과 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 일 실시양태에서, 정제된 항-FcRn 항체 또는 단편, 예를 들어 인간화 항체 또는 단편, 구체적으로 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA로부터 실질적으로 정제되고, 구체적으로 그들이 없거나 또는 실질적으로 없는, 본 발명에 따른 항체 또는 단편을 제공한다.
상기 사용되는 바와 같은 정제형은 적어도 90% 순도, 예컨대 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w 또는 그 이상 순수한 것을 의미한다.
내독소가 실질적으로 없다는 것은 대체로 항체 생성물 1 mg 당 1 EU의 내독소 함량 이하 예컨대 생성물 1 mg 당 0.5 또는 0.1 EU를 의미하고자 한다.
숙주 세포 단백질 또는 DNA가 실질적으로 없다는 것은 대체로 항체 생성물 1 mg 당 400 ㎍의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량 이하, 예컨대 적절하다면, mg 당 100 ㎍ 이하, 구체적으로 mg 당 20 ㎍을 의미하고자 한다.
본 발명의 항체 분자는 또한, 진단, 예를 들어 FcRn을 함유하는 질환 상태의 생체내 진단 및 영상화에서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체가 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에서 유용하므로, 본 발명은 또한 약학적 허용 부형제, 희석제 또는 담체 중 1 이상과 조합하여 본 발명의 항체 분자를 포함하는 약학 또는 진단 조성물을 제공한다. 따라서, 약물의 제조에서 본 발명의 항체 분자의 용도를 제공한다. 조성물은 일반적으로 정상적으로 약학적 허용 담체를 포함하게 되는 멸균된, 약학 조성물의 일부로서 제공된다. 본 발명의 약학 조성물은 부가적으로 약학적 허용 부형제를 포함한다.
본 발명은 또한 약학적 허용 부형제, 희석제 또는 담체 중 1 이상과 함께 본 발명의 항체 분자를 부가 및 혼합하는 단계를 포함하는 약학 또는 진단 조성물의 제조 방법을 제공한다.
항체 분자는 약학 또는 진단 조성물 중 단독 활성 성분이거나 또는 다른 항체 성분 또는 비항체 성분 예컨대 스테로이드 또는 다른 약물 분자, 구체적으로 그 반감기가 FcRn 결합과는 독립적인 약물 분자를 포함하는 다른 활성 성분을 수반할 수 있다.
약학 조성물은 적합하게 본 발명의 항체의 치료 유효량을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 표적 질환 또는 병태를 치료하거나, 완화시키거나 또는 예방하거나, 또는 검출가능한 치료적 또는 에방적 효과를 나타내는데 필요한 치료제의 양을 의미한다. 임의의 항체의 경우, 치료 유효량은 초기에 세포 배양 어세이 또는 동물 모델, 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 측정할 수 있다. 동물 모델을 사용하여 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정할 수 있다. 이후에 이러한 정보는 인간에서 유용한 투여 경로 및 용량을 결정하는데 사용될 수 있다.
인간 피험체에 대한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 피험체의 일반적인 건강, 피험체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시기 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감수성 및 요법에 대한 내성/반응에 따라 좌우된다. 이러한 용량은 통상의 실험으로 결정할 수 있고 임상의의 판단에 의한다. 대체로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들어 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대 lOO mg/kg이다.
약학 조성물은 용량 당 본 발명의 활성제의 예정량을 함유하는 단위 제형으로 편리하게 준비할 수 있다.
본 발명에 따른 항체의 치료 용량은 생체내에서 명백한 독성을 보이지 않는다.
본 발명에 따른 항체 또는 단편의 일 실시양태에서, 단일 용량은 순환 IgG 수준에서 최대 70% 감소를 제공한다. 본 발명에 따른 항체 또는 단편의 일례에서, 단일 용량은 순환하는 IgG 수준에 최대 80% 감소를 제공한다. 본 발명에 따른 항체 또는 단편의 일례에서, 단일 용량은 순환하는 IgG 수준에 80% 보다 높은 감소를 제공한다.
순환하는 IgG의 최대 치료적 감소는 관련 치료 용량의 투여 후 약 1주에 관찰할 수 있다. IgG의 수준은 추가 치료 용량이 전달되지 않으면 투약 후 수주 동안 회복될 수 있다. 본원에서 사용하는 회복은 초기 투약 시작 전에 관찰된 것과 유사한 수준으로 복귀된 수준을 의미한다.
유리하게, 생체내 IgG 수준은 본원에 따른 항체 또는 단편의 순차적인 용량 투여에 의해 적절하게 낮은 수준으로 유지될 수 있다.
조성물을 개별적으로 환자에게 투여하거나 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합하여(예를 들어, 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로) 투여할 수 있다.
본원에서 사용되는 작용제는 투여시 생리학적 효과를 갖는 독립체를 의미한다.
본원에서 사용되는 치료 용량에서 약물은 적절한 생리학적 효과를 갖는 화학적 독립체를 의미한다.
일 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 단편은 면역 억제제 요법, 예컨대 스테로이드, 구체적으로 프레드니손과 함께 적용된다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 단편은 리툭시맙 또는 다른 B 세포 요법제와 함께 적용된다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 단편은 임의의 B 세포 또는 T 세포 조정제 또는 면역조정제와 함께 적용된다. 예에는 메토트렉세이트, 마이크로페니올레이트 및 아자티오프린이 포함된다.
본 발명의 항체 분자가 투여되는 용량은 치료하려는 병태의 성질, 존재하는 염증의 정도 및 항체 분자가 예방적으로 사용되는지 또는 존재하는 병태를 치료하기 위해 사용되는지 여부에 따라 좌우된다.
투약 빈도는 항체의 반감기, 그 표적-매개 성향, 그 효과의 지속기간, 및 항-약물 항체의 존재에 따라 좌우된다. 항체가 반감기가 짧거나(수 시간) 또는 활성이 제한되고/되거나, 소량의 약물(예를 들어, 피하 주사용)이 전달되는 것이 바람직하면, 1일 1회 또는 그 이상으로 빈번하게, 자주 투약하는 것이 필요할 수 있다. 다르게, 항체가 반감기가 길고, 활성의 지속기간이 길거나, 또는 대량(예컨대 주입)으로 투약할 수 있으면, 투약은 빈번하지 않게, 1일 1회, 또는 수일, 수주 또는 수개월 당 1회일 수 있다. 일 실시양태에서, 항-약물 항체 수준이 감소되도록 투약 간 충분한 시간을 허용한다.
본원에서 사용하는 반감기는 순환계, 예를 들어 혈청/혈장에서 분자의 지속기간을 의미하고자 한다.
본원에서 사용하는 약동학은 본원에 따른 분자의 생물학적 작용의 프로파일 및 구체적으로 지속기간을 의미한다.
약학적 허용 담체는 조성물을 투약받는 개체에 유해한 항체 생성을 그 자체로 유도해서는 안되고 유독해서는 안된다. 적합한 담체는 거대한, 서서히 대사되는 거대분자 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적 허용 염이 사용될 수 있으며, 예를 들어 미네랄 산염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트 등이 사용될 수 있다.
치료 조성물 중 약학적 허용 담체는 부가적으로 액체 예컨대 물, 염수, 그 ㄹ리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 부가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 약학 조성물을 환자에 의한 소화를 위해서, 정제, 알략, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로 제제화될 수 있게 한다.
투여에 적합한 형태는 예를 들어 주사 또는 주입, 예를 들어 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한, 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 유성 또는 수성 비히클 중 에멀션, 용액 또는 현탁제의 형태를 취할 수 있고 제제화제, 예컨대 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 다르게, 항체 분자는 적절한 멸균 액체와 사용하기 전에 재구성을 위한 건조 형태일 수 있다.
제제화되면, 본 발명의 조성물은 피험체에 직접 투여될 수 있다. 치료하려는 피험체는 동물일 수 있다. 그러나, 1 이상의 실시양태에서, 조성물은 인간 피험체에 투여되도록 적합화된다.
본원에 따른 제제에서, 적합하게, 최종 제제의 pH는 항체 또는 단편의 등전점 값과 유사하지 않으며, 예를 들어, 단백질의 pI가 8-9 또는 그 이상의 범위이면, 제제의 pH는 7이 적합하다. 이론에 국한되지 않고, 궁극적으로 안정성이 개선된 최종 제제를 제공하는 것을 고려하며, 예를 들어 항체 또는 단편이 용액으로 남아 있는다.
일례에서, pH가 4.0 내지 7.0 범위인 약학 제제는 1 내지 200 mg/mL의 본원에 따른 항체 분자, 1 내지 lOO mM의 완충제, 0.001 내지 1%의 계면활성제, a) 10 내지 500 mM의 안정화제, b) 10 내지 500 mM의 안정화제 및 5 내지 500 mM의 등장화제, 또는 c) 5 내지 500 mM의 등장화제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 제한없이, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피, 경피적(예를 들어, WO98/20734 참조), 피하, 복강내, 비내, 장관, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 수많은 경로로 투여될 수 있다. 하이포스프레이를 또한 사용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여할 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액제 또는 현탁제로서, 주사가능하게 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중 용액 또는 현탁제에 적합한 고체형이 또한 제조될 수 있다.
조성물의 직접 전달은 대체로 주사, 피사, 복강내, 정맥내, 근육내로 수행되거나 또는 조직의 간질 공간에 전달될 수 있다. 조성물은 또한 병변에 투여될 수 있다. 용량 치료는 단일 용량 스케쥴이거나 또는 다수 용량 스케쥴일 수 있다.
조성물 중 활성 성분은 항체 분자임을 이해한다. 이와 같이, 위장관에서 분해에 민감할 수 있다. 따라서 조성물을 위장관을 이용한 경로로 투여하고자 하면, 조성물은 항체를 분해로부터 보호하지만 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출하는 작용제를 함유하는 것이 필요하다.
약학적 허용 담체에 대한 전체적인 설명은 [Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 입수할 수 있다.
일 실시양태에서, 제제는 흡입을 포함한 국소 투여용 제제로 제공된다.
적합한 흡입가능한 조제물은 흡입가능한 분말, 추진제 가스를 함유한 계량 에어로졸 또는 추진제 가스가 없는 흡입가능 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 본원에 따른 흡입가능한 분말은 오직 상기 언급한 활성 물질로만 이루어지거나 또는 생리학적 허용 부형제와 함께 상기 언급한 물질의 혼합물로 이루어진다.
이들 흡입가능한 분말은 단당류(예를 들어, 포도당 또는 아라비노스), 이당류(예를 들어, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당 및 다당류(예를 들어, 덱스트란), 다가알콜(예를 들어, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들어, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 다당류가 적합하게 사용되고, 구체적으로 그들의 수화물 형태를 배제하지 않고, 락토스 또는 포도당이 사용된다.
폐에 침착을 위한 입자는 10 미크론 미만, 예컨대 1-9 미크론, 예를 들어 1 내지 5 ㎛의 입자 크기가 요구된다. 활성 성분(에컨대 항체 또는 단편)의 입자 크기가 특히 중요하다.
흡입가능한 에어로졸을 제조하는데 사용될 수 있는 추진제 가스는 당분야에 공지이다. 적합한 추진제 가스는 탄화수소 예컨대 n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소 예컨대 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 시클로프로판 또는 시클로부탄의 염화 및/또는 불화 유도체 중에서 선택된다. 상기 언급된 추진제 가스는 그들 자체로 또는 이들의 혼합물로 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진제 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택된 할로겐화 알칸 유도체이다. 상기 언급한 할로겐화 탄화수소 중에서, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이의 혼합물이 특히 적합하다.
추진제-가스-함유 흡입가능 에어로졸은 또한 다른 성분 예컨대 공용매, 안정화제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH 조정용 수단을 함유할 수 있다. 모든 이들 성분은 당분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 추진제-가스-함유 흡입가능 에어로졸은 최대 5 중량%의 활성 물질을 함유한다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들어, 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량% 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 성분을 함유할 수 있다.
다르게 폐에 국소 투여는 예를 들어 장치 예컨대 분무기, 예를 들어 압축기에 연결된 분무기(예를 들어, Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.가 제조한 Pari Master(R) 압축기에 연결된 Pari LC-Jet Plus(R) 분무기)를 적용하는, 액상 용액제 또는 현탁제 제제의 투여에 의할 수 있다.
본 발명의 항체는 예를 들어 용액제 또는 현탁제의 형태로, 용매에 분산되어 전달될 수 있다. 적절한 생리학적 용액, 예를 들어 염수 또는 다른 약학적 허용 용매 또는 완충 용액에 현탁할 수 있다. 당분야에 공지된 완충 용액의 예는 약 4.0 내지 5.0의 pH가 얻어지도록 1 mL의 물 당 0.05 mg 내지 0.15 mg의 디나트륨 에데테이트, 8.0 mg 내지 9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg의 폴리솔베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg의 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg의 나트륨 시트레이트를 함유한다. 현탁제는 예를 들어, 동결건조된 항체를 적용할 수 있다.
치료 현탁제 또는 용액 제제는 또한 1 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는 당분야에 공지이고 완충제(예를 들어, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 중탄산 완충제), 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들어, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 솔비톨, 및 글리세롤을 함유할 수 있다. 용액 또는 현탁제는 리포솜 또는 생분해성 미세구에 캡슐화될 수 있다. 제제는 대체로 멸균 제조 공정을 적용하는 실질적으로 멸균된 형태로 제공된다.
이는 제제, 멸균된 완충 용매 용액 중 항체의 무균 현탁제에 대해 사용된 완충된 용매/용액의 여과에 의한 생성 및 멸균, 및 당분야의 숙련가에게 친숙한 방법에 의해 멸균 용기에 제제의 분배를 포함한다.
본 발명에 따른 분무기 제제는 예를 들어 호일 엔벨로프에 포장된 단일 용량 단위(예를 들어, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공된다. 각 바이알은 예를 들어 2 mL의 용매/용액 완충액 부피의 단위 용량을 함유한다.
본원에 개시된 항체는 분무를 통한 전달에 적합하다.
본 발명의 항체는 유전자 요법의 사용을 통해 투여될 수 있음을 고려한다. 이를 달성하기 위해서, 적절한 DNA 성분의 제어 하에 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 환자에 도입하여서 항체 사슬이 DNA로부터 발현되어 인시츄에서 조립되게 한다.
본 발명은 또한 자가면역 질환, 예를 들어 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염, 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, ANCA-관련 혈관염, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신장염, 항인지질 증후군(APS), 자가면역 혈관부종, 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 자율신경장애, 자가면역 간염, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍증, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막증, 자가면역 혈소판 감소성 자반증(ATP), 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 담마진, 신경돌기 신경병증, 발로병, 베체트 병, 수포성 유천포창, 심근증, 캐슬맨병, 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 만성 재발성 다병소 골수염(CRMO), 추르그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창/양성 점성 유천포창, 크론병, 코간 증후군, 한랭 응집소병, 선천성 심장차단, 콕사키 심근염, CREST 병, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 탈수초성 신경병증, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경 척수염), 확장성 심근증, 원판성 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산성 혈관중심위 섬유증, 호산성 근막염, 결절성 홍반, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 에반스 증후군, 섬유성 폐포염, 거대세포 동맥염(측두 동맥염), 사구체신장염, 굿파스처 증후군, 베게너의 다발성 육아종증(GPA), 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐쇤라인 자반증, 임신성 포진, 저감마글로불린혈증, 특발성 저보체혈성 세뇨관간질성 신장염, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병증, IgG4-관련 질병, IgG4-관련 경화성 질병, 면역조절성 지단백증, 염증성 대동맥류, 염증성 가성종양, 봉입체 근육염, 인슐린 의존성 당뇨병증(1형), 간질성 방광염, 아동 관절염, 아동 당뇨병, 카와사키 증후군, 쿠트너 종양, 램버트-이튼 증후군, 백혈구파괴성 혈관염, 편평 태선, 경화선 태선, 목질 결막염, 선상 IgA 질환(LAD), 루푸스(SLE), 라임병, 만성, 종격 섬유증, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염, 미쿨리츠 증후군, 혼합 결합조직병(MCTD), 무렌 궤양, 무차-하버만 질병, 다병소 섬유경화증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시신경 척수염(데빅병), 호중구감소증, 시상 반흔성 유천포창, 시신경염, 올몬드병(후복막섬유증), 회귀성 류마티즘, PANDAS(스트렙토코커스 연관된 소아 자가면역 신경정신계 질병), 방종양성 소뇌 퇴행증, 파라단백혈증 다발성신경병증, 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 패리 롬버그 증후군, 파르소니지-터너 증후군, 평면부염(말초 포도막염), 심상성 천포창, 대동맥주위염, 동맥주위염, 말초 신경병증, 정맥주변 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, I형, II형, & III형 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 다발성근통, 다발성근염, 심근경색후 증후군, 프로게스테론성 피부염, 원발성 담즙성 간경화증, 원발성 경화성 담관염, 건선, 건선성 관절염, 원발성 폐섬유증, 괴저성 농피증, 순수 적혈구 무형성증, 레이노 현상, 반사성 교감신경 이영양증, 라이터 증후군, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군, 후복막섬유증(올몬드병), 류마티스성열, 류마티스성 관절염, 리델 갑상선염, 유육종증, 슈미츠 증후군, 공막염, 경피증, 쇠그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역증, 강직 인간 증후군, 아급성 세균성 심내막염(SBE), 수삭 증후군, 교감성 안염, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 혈전성, 혈소판 감소성 자반증(TTP), 톨로사-헌트 증후군, 횡단성 척수염, 궤양성 대장염, 미분화성 결합조직 질병(UCTD), 포도막염, 혈관염, 수포성 피부병, 백반증, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 온형 특발성 용혈성 빈혈 및 베게너 육아종증(이제는 다발성 육아종증(GPA)이라고 함)의 제어에 사용하기 위한 항체 분자(또는 이를 포함하는 조성물)를 제공한다.
추가적인 징후는 또한 과점성 증후군; 저온글로불린혈증; 체이식 신장에서 재발적 국소성 분절성 사구체경화증; HELLP 증후군; 레프섬 질환; HIV-관련 신경병증; 횡문근 용해 및 동종면역 질환을 포함한다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 단편은 간질 또는 발작의 치료 또는 예방에서 적용된다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 단편은 다발성 경화증의 치료 또는 예방에 적용된다.
일 실시양태에서, 본원에 따른 항체 또는 단편은 다음을 포함하는 동종면역 질환/징후에 적용된다:
. 항-HLA 항체로 인한 이식 도너 불일치
. 태아 및 신생아 동종면역 혈소판감소증, NAIT(또는 신생아 동종면역 혈소판감소증, NAITP 또는 NAIT 또는 NAT, 또는 태아-신생아 동종면역 혈소판감소증, FMAITP 또는 FMAIT).
추가적인 징후는 다른 요법-IVIg, 리툭산, 혈장반출법과 항-FcRn 요법의 조합 및 인간 환자로부터 Fc-함유 생물약제학적 약물의 신속한 제거를 포함한다. 예를 들어 항-FcRn 요법은 리툭산 요법 이후에 적용될 수 있다. 또한 항-FcRn 요법을 사용하여 조영제 예컨대 종양을 영상화하는데 사용된 방사선표지된 항체를 신속하게 제거할 수 있다.
일 실시양태에서, 본원의 항체 및 단편은 예컨대 다음의 신경학적 질병에 적용된다:
. 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP)
. 길랭-바레 증후군
. 파라단백혈증성 다발성신경병증
. 시신경 척수염(NMO, NMO 스펙트럼 질병 또는 NMO 스펙트럼 질환), 및
. 중증 근무력증.
일 실시양태에서, 본원의 항체 및 단편은 다음과 같은 피부학적 질병에 적용된다:
. 수포성 유천포창
. 심상성 천포창
. ANCA-관련 혈관염
. 확장성 심근증
일 실시양태에서, 본원의 항체 및 단편은 다음과 같은 면역학적, 혈액학적 질병에 적용된다:
. 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP)
. 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)
. 온형 특발성 용혈성 빈혈
. 굿파스처 증후군
. 항-HLA 항체로 인한 이식 도너 불일치
일 실시양태에서, 질병은 중증 근무력증, 시신경 척수염, CIDP, 길랭-바레 징후군, 파라단백혈증 다발성신경병증, 내화성 간질, ITP/TTP, 용혈성 빈혈, 굿파스처 증후군, ABO 불일치, 루푸스 신장염, 신장 혈관염, 경피증, 섬유성 폐포염, 확장성 심그증, 그레이브스병, 제1형 당뇨병, 자가면역 당뇨병, 수포창, 피부경화증, 루푸스, ANCA 혈관염, 피부-근염, 쇄그렌 질환 및 류마티스 관절염에서 선택된다.
일 실시양태에서, 질병은 제1형(APECED 뙤는 위테이커 증후군) 및 제2형(슈미츠 증후군) 자가면역 다선증후군 1형(APECED; 전신 탈모증; 근무력증 위기; 갑상샘 중독발장; 갑상샘 연관 안 질환; 갑상샘 안병증; 자가면역 당뇨병; 자가항체 연관 뇌염 및/또는 뇌병증; 낙엽성 천포창; 수포성 표피박리증; 포진성 피부염; 시드남 무도병; 급성 운동 축색돌기 신경병증(AMAN); 밀러-피셔 증후군; 다병소 운동 신경병증(MMN); 안구간대경련; 염증성 근육병증; 이삭 증후군(자가면역 신경근긴장증), 부종양 증후군 및 변연계 뇌염에서 선택된다.
본원에 따른 항체 및 단편은 치료 또는 예방에서 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편의 치료 유효 용량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 바람직하지 않은 항체의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 자가면역 질환과 같은 본원에 기술된 병리학적 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 본 발명에 따른 항체 분자의 용도를 더욱 제공한다.
일 실시양태에서, 본원은 예를 들어 리포터 분자에 접합된, 진단용 시약으로서 항체 또는 이의 단편의 용도를 포함한다. 따라서, 표지된 본원에 따른 항체 또는 단편을 제공한다. 일 측면에서, 본원에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 컬럼을 제공한다.
따라서, 다음과 같은 용도의 시약으로서 사용하기 위한 항-FcRn 항체 또는 결합 단편을 제공한다:
1) 매트릭스에 접합되고 친화성 컬럼으로, 또는 (항-FcRn의 개질형으로서) 침전제로서(예를 들어, 경우에 따라 항-Fc 시약에 의해 침전되는, Fc(또는 전장 IgG로서 생성됨)의 부가에 의해 개질될 수 있는, 다른 분자에 의해 인식되는 도메인으로 개질된 형태로서)사용되는, FcRn 단백질(또는 이의 단편)의 정제
2) 생존 또는 고정된, 세포 상에서 또는 세포 내에서(조직 또는 세포 섹션의 시험관 내 또는 생체내 세포) FcRn의 검출 및/또는 정량. 이에 대한 용도는 항-FcRn 치료의 효과를 후속하기 위한, 생체마커로서 FcRn의 정량을 포함할 수 있다. 이들 목적을 위해서, 후보물을 개질된 형태(예를 들어, 전장 IgG로서, Fc 도메인의 부가, 또는 유전적 융합 단백질 또는 화학적 접합체로서, 일부 다른 모이어티의 부가, 예컨대 검출 목적으로 사용되는 형광발광성 태그의 부가에 의함)로 사용할 수 있다.
3) (1) 및 (2)에 예시한 방식으로 개질된 후보물에 대한 결합에 의해 표지된 FcRn-보유 세포의 정제 또는 분류.
본 발명은 또한 예컨대 FcRn 활성을 차단하는 시험 분자 예컨대 항체 분자의 능력 및 구체적으로 IgG를 재활용하는 세포의 능력을 평가하기에 적합한 어세이를 제공한다. 이러한 어세이는 FcRn 활성의 억제제, 예컨대 항체 분자 또는 소형 분자를 동정하는데 유용할 수 있고, 이와 같이 또한 이러한 억제제의 생성에서 뱃치 방출 어세이로서 유용할 수 있다.
일 측면에서, 시험 분자 예컨대 항체 분자가 인간 FcRn 활성을 차단하는 능력 및 구체적으로, IgG를 재활용하는 인간 FcRn의 능력을 평가하는데 적합한 어세이를 제공하고, 여기서 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a) 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2Μ)을 재조합적으로 발현하는 비인간 포유동물 세포를 표면 상에 코팅시키는 단계,
b) 시험 분자 및 IgG 둘 다가 FcRn에 결합하기에 충분한 시간 기간 동안 약한 산성 조건 예컨대 약 pH 5.9 하에서 세포를 시험 분자 및 세포에 의해 재활용되는 IgG와 접촉시키는 단계로서, 경우에 따라 IgG가 재활용되기 전에 시험 분자를 부가하고 시험 분자가 FcRn에 결합하기에 충분한 시간동안 항온반응시키는 것인 단계,
c) 약한 산성 완충액으로 세척하는 단계, 및
d) 세포에 의해 내재화 및/또는 재활용되는 IgG의 양을 검출하는 단계.
일 측면에서, 본원은 인간 FcRn 활성을 차단하는 시험 분자 예컨대 항체 분자의 능력, 및 구체적으로 IgG를 재활용하는 인간 FcRn의 능력을 평가하는데 적합한 어세이를 제공하고, 여기서 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a) 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2Μ)을 재조합적으로 발현하는 비인간 포유동물 세포를 표면 상에 코팅시키는 단계,
b) 시험 항체 분자 및 IgG 둘 다가 FcRn에 결합하기에 충분한 시간 동안 약한 산성 조건 예컨대 약 pH 5.9 하에서 세포를 시험 항체 분자 및 IgG와 접촉시키는 단계로서, 경우에 따라 IgG가 재활용되기 전에 시험 항체 분자를 부가하고 시험 항체 분자가 FcRn에 결합하기에 충분한 기간 동안 항온반응시키는 것인 단계,
c) 미결합된 IgG 및 시험 항체 분자를 제거하기 위해 약한 산성 완충액으로 세척하는 단계, 및
d) 세포에 의해 재활용된 IgG의 양을 검출하는 단계.
일 측면에서, 인간 FcRn 활성을 차단하는 시험 분자 예컨대 항체 분자의 능력 및 구체적으로 IgG를 재활용하는 인간 FcRn의 능력을 평가하는데 적합한 어세이를 제공하고, 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a) 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2Μ)을 재조합적으로 발현하는 비인간 포유동물 세포를 표면에 코팅시키는 단계,
b) 시험 항체 및 IgG 둘 다가 FcRn에 결합하기에 충분한 시간 기간 동안 약한 산성 조건 예컨대 약 pH 5.9 하에서 세포를 시험 항체 분자 및 IgG와 접촉시키는 단계로서, 경우에 따라 IgG가 재활용되기 전에 시험 항체 분자를 부가하고, 시험 항체 분자가 FcRn에 결합하기에 충분한 시간 기간 동안 항온반응시키는 것인 단계,
c) 미결합된 IgG 및 시험 항체 분자를 제거하기 위해서 약한 산성 완충액으로 세척하는 단계,
d) 중성 완충액 예컨대 약 pH 7.3에서 세포를 항온반응시키는 단계,
e) 상등액으로 방출된 IgG의 양을 결정하기 위해서 세포에 의해 재활용된 IgG의 양을 검출하는 단계.
적합한 세포는 마딘-다비 개 신장(MDCK) II 세포를 포함한다. 인간 FcRn 알파 사슬 및 인간 β2 마이크로글로불린(β2Μ)으로 MDCKII 세포의 형질감염은 이전에 [Claypool et al., 2002, Journal of Biological Chemistry, 277, 31, 28038-28050]에 설명되어 있다. 이 논문은 또한 이들 형질감염된 세포에 의한 IgG의 재활용을 설명하고 있다.
시험 동안 세포를 지원해줄 배지는 MEM(Gibco #21090-022), 1 x 불필수 아미노산 (Gibco 11140-035), 1 x 피루브산나트륨(Gibco #11360-039), 및 L-글루타민(Gibco # 25030-024)을 포함하는 완전 배지를 포함한다.
산성 세척은 HBSS+(PAA #H15-008)를 사용해 준비하고 pH 5.9 +/- 0.5에 도달할때까지 1 M MES를 부가한다. 약 1%의 BSA를 또한 부가한다(Sigma # A9647).
중성 세척은 HBSS+(PAA #H15-008)를 사용해 준비하고 pH 7.2 +/- 0.5에 도달할 때까지 10 M Hepes를 부가한다. 약 1%의 BSA를 또한 부가한다(Sigma # A9647).
산성 완충액으로 세포의 세척은 결합되지 않은 시험 항체 및 미결합된 IgG를 제거하고 추가 분석을 수행할 수 있게 한다. 단계 (b)에서 사용된 산성 조건은 FcRn에 대한 IgG의 결합 이의 내재화 및 재활용을 돕는다.
오직 세포의 표면 상에서의 시험 항체 또는 단편 및 IgG의 양은 중성 세척으로 세포를 세척하고 시험 항체 또는 IgG의 양을 검출하기 위해 상등액/세척물을 분석하여 결정할 수 있다. 중요한 것은 용해 완충액은 적용하지 않는다. 세포에 의해 내재화된 IgG의 양을 결정하기 위해서, 항체는 먼저 중성 세척으로 세포 표면으로부터 제거되고 용해 완충액에 의해 세포를 용해시킨 후 내부 내용물을 분석하였다. 세포에 의해 재활용되는 IgG의 양을 결정하기 위해서, 세포를 충분한 시간 동안 중성 조건 하에서 항온반응시키고 주변 완충액을 IgG 함량에 대해 분석하였다. 세포의 표면 및 내부 항체 함량이 필요하면 세포를 산성 세척으로 세척하여서 세포 표면 상에 항체 존재를 유지시킨 후, 세포를 용해시키고 배합된 물질을 분석한다.
IgG의 재활용 및 내재화 둘 다를 측정하는 것이 바람직한 경우에, 샘플을 이중으로 러닝시키고 개별적으로 수행되는 내재화 및 재활용에 대해 시험한다.
적합한 용해 완충액은 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton-X 100을 포함하고, 각각 10 mL에 대해서 제조사의 가이드라인에 기술된 바와 같이 프로테아제 억제제/포스페이트 억제제를 부가한다.
전형적으로 재활용되는 IgG는 표지화되고, 일례에서 바이오틴화된 인간 IgG를 사용할 수 있다. IgG를 이후 0.2 ㎍/mL의 MSD 차단 완충액에 25 mL의 스트렙타비딘 설포-태그 검출 항체(예컨대 MSD # r32ad-5) 25 mL을 적용하여 검출할 수 있다.
차단 완충액은 500 mM Tris, pH 7.5. 1.5 M NaCl 및 0.2% Tween-20 및 1.5% BSA를 포함한다.
다르게, IgG는 형광단 또는 유사한 표지로 사전표지화될 수 있다.
일 실시양태에서, 적합한 표면은 플라스틱 플레이트 또는 웰 예컨대 96웰 플레이트 또는 유사한, 유리 슬라이드 또는 막이다. 일례에서, 세포는 단층이 형성되는 밀도로 표면 상에 코팅시킨다.
일 실시양태에서, 본원에 기술된 어세이는 그를 가로지르는 pH 구배, 예를 들어 막의 한면은 산성 조건이고 막의 아래면은 중성 조건인 막을 가로질러 위에서 아래로 항체의 통과세포외배출의 측정은 아니다.
일례에서 시험 항체 또는 단편 및 IgG는 약 1시간 동안 예를 들어 대기 온도에서 결합을 허용하는 산성 조건 하에 단계 (b)에서 세포와 항온반응될 수 있다.
일례에서 시험 항체 또는 단편은 약 1시간 동안 예를 들어 대기 온도에서 재활용되는 IgG의 부가 전에 결합이 허용되는 산성 조건 하에 단계 (b)에서 세포와 항온반응될 수 있다. 이후에, 세포에 의해 재활용되는 IgG는 약 1시간 동안 예를 들어 대기 온도에서 결합이 허용되는 산성 조건 하에 단계 (b)에서 세포와 항온반응될 수 있다.
중성 조건은 상등액으로 IgG의 방출을 촉진한다.
본 발명의 내용에 포함시킨다는 것은 내포시킨다는 의미를 의도한다.
기술적으로 적절한 경우 본 발명의 실시양태는 조합될 수 있다.
실시양태들은 일정 특징/성분들을 포함하여 본원에서 설명한다. 본원은 또한 상기 특징/성분들로 이루어지거나 또는 그로 실질적으로 이루어지는 개별 실시양태로 확장된다.
기술 참조 예컨대 특허 및 출원을 참조하여 본원에 편입시킨다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여, 이하의 실시예에서는 오직 예시의 방식으로 더욱 설명되며, 여기서
도 1은 LC-MS/MS에 의해 결정된 형질전환 마우스에서 %hIgG를 도시한다.
도 1a는 인간 FcRn-형질전환 마우스의 혈청 중 인간 IVIg의 농도에 대한 1638 IgG4P 형태의 효과를 도시한다.
도 1b는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 인간 IVIg의 농도에 대한 1638 FabFv 및 Fab'PEG 형태의 효과를 도시한다.
도 1c는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 1638 IgG4P 형태의 약력학을 도시한다.
도 1d는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 1638FabFv 및 Fab'PEG 형태의 약력학을 도시한다.
도 1e는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 혈청 알부민의 농도에 대한 1638 FabFv 및 Fab'PEG 형태의 효과를 도시한다.
도 1f는 인간 FcRn-형질전환 마우스에서 혈청 마우스의 농도에 대한 1638 IgG4P 형태의 효과를 도시한다.
도 2는 CA170_1638.g49 IgG4에 대한 대표적인 결합 곡선을 도시한다. 평균 KD 값(n = 3)은 각각 중성 완충액에서 0.20 nM이고, 산성 완충액에서 0.22 nM이었다.
도 3은 CA170_1638.g49 IgG4가 MDCK II 클론15 세포에서 IgG 재활용을 억제함을 도시한다.
도 4는 CA170_1638.g49 IgG4가 MDCK II 클론 15 세포에서 IgG 통과세포외배출을 억제함을 도시한다.
도 5는 CA170_1638.g49 FabFv가 MDCK II 클론 15 세포에서 IgG 통과세포외배출을 억제함을 도시한다.
도 6은 CA170_1638.g49 IgG4에 대한 대표적인 결합 곡선을 도시한다. 평균 KD 값(n = 3)은 각각 중성 완충액에서 0.3이고, 산성 완충액에서 0.43였다(표 2 참조).
도 7은 CA170 1638 CDR 서열을 도시한다.
도 8은 본원에 따른 항체 서열을 도시한다.
도 9a는 항체 1638.g49의 인간화를 도시한다.
도 9b는 항체 1638.g49의 인간화를 도시한다.
실시예
약어
℃ 온도, 섭씨도
ATR FTIR 약화된 총 반사율 퓨리에 전환 적외선 분광법
CH2 불변 중쇄 영역 2
cIEF 모세관 등전 포커싱
DSC 시차 주사 열량측정법
G0F 푸코실화 갈락토실 비안테너리 글리칸
H chain 중쇄
HPLC 고성능 액상 크로마토그래피
IgG 면역글로불린 G
L chain 경쇄
nLCMS 나노-액상 크로마토그래피 질량 분광법
PBS 포스페이트-완충된 염수 완충액
pI 등전점
SD 표준 편차
SEC 크기 배제 크로마토그래피
ToF 비행 시간
Tm 용융 온도
TCEP 트리스(2-카르복시에틸)포스핀
THP 트리스(히드록시프로필)포스핀
Tris 트리스(히드록시메틸)아미노메탄
다음의 면역화는 B 세포 배양 및 항체 스크리닝을 위한 물질을 생성시키기 위해 수행되었다:
스프라그 다우리 래트는 돌연변이체 인간 FcRn(L320A; L321A)(Ober et al., 2001 Int. Immunol. J_3, 1551-1559) 및 마우스 β2Μ을 공발현시키는 NIH3T3 마우스 섬유아세포의 3회 샷과 인간 FcRn 세포외 도메인의 4번째 최종 부스트로 면역화시켰다.
혈청은 HEK-293 세포 상의 돌연변이체 FcRn에 대한 결합과 Alexafluor 488-표지된 인간 IgG의 결합을 방해하는 그 능력 둘 다에 대해 모니터링하였다. 두 방법은 유세포측정법에 의해 수행하였다. 결합의 경우, 파이코에리쓰린(PE)-표지된 항 마우스 또는 래트 Fc 특이적 2차 시약을 사용해 혈청 중 IgG의 결합을 밝혔다.
B 세포 배양은 [Zubler et al.(1985)]가 기술한 것과 유사한 방법을 사용해 준비하였다. 간략하게, 웰 당 대략 5000 세포 밀도의 B 세포는 5% CO2 대기 중에 37℃에서 7일 동안 10% FCS(PAA laboratories ltd), 2% HEPES(Sigma Aldrich), 1% L-글루타민(Gibco BRL), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(Gibco BRL), 0.1% β-머캅토에탄올(Gibco BRL), 2-5% 활성화된 토끼 비장세포 배양 상등액 및 감마-조사된 EL-4-B5 쥣과동물 흉선종 세포(5x104/웰)가 보충된 200 ㎕/웰 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)에서 바코드된 96웰 조직 배양 플레이트에서 배양하였다.
B 세포 배양 상등액 중 FcRn-특이적 항체의 존재는 표적 항원의 공급원으로서 돌연변이체 FcRn(표면-안정화)으로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포를 사용한 동종 형광발광-기반 결합 어세이를 사용해 결정하였다. 매트릭스 플레이트메이트 액상 취급기를 사용하여 10 ㎕의 상등액을 바코드된 96웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 5000 형질감염된 HEK-293 세포를 함유하는 바코드된 384-웰 검은벽 어세이 플레이트로 옮겼다. 염소 항-래트 또는 마우스 IgG Feγ-특이적 Cy-5 접합체(Jackson)를 사용해 결합을 밝혔다. 플레이트는 Applied Biosystems 8200 세포 검출 시스템에서 판독하였다. 38종의 상이한 면역화 동물을 나타내는, 3800 x 96-웰 배양 플레이트로부터, 9800 항-인간 FcRn 결합제를 동정하였다. 이는 대략 2.5십억 B 세포의 스크리닝을 나타내는 것으로 추정되었다.
1차 스크리닝 후, 양성 상등액은 Abiso Onyx 히트-피킹 로봇 및 -80℃에 냉동시킨 세포 배양물 중 B-세포를 사용해 96웰 바코드된 마스터 플레이트 상에서 통합하였다. 마스터 플레이트는 이후에 고 친화성 항체를 함유하는 웰 및 FcRn에 대한 인간 IgG의 결합을 억제하는 것들을 동정하기 위해서 Biacore 어세이로 스크리닝하였다(이하 참조).
표면 플라스몬 공명 기술(SPR)을 사용하는 생체분자 상호작용 분석을 BIAcore T200 시스템(GE Healthcare) 상에서 수행하였다. lO mM NaAc, pH 5 완충액 중 염소 항-래트 IgG, Fc 감마(Chemicon International Inc.)는 러닝 완충액으로서 HBS-EP+를 사용하여 대략 19500 반응 유닛(RU)의 포획 수준까지 아민 커플링 화학법을 통해 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다. 50 mM 포스페이트, pH 6 + 150 mM NaCl을 친화성 및 차단 어세이용 러닝 완충액으로 사용하였다. B 세포 배양 상등액을 200 mM 포스페이트, pH 6 +150 mM NaCl 중에 1/5로 희석하였다. 희석된 B 세포 상등액의 600s 주사를 5 ㎕/분으로 고정된 항-래트 IgG, Fc에 의한 포획을 위해 사용하였다. 100 nM의 인간 FcRn은 30 ㎕/분으로 180s 동안 포획된 B 세포 상등액 상에 주사한 후, 360s 해리시켰다. 인간 IgG(Jackson ImmunoResearch)는 30 ㎕/분에서 180s 해리로 60s 동안 주사하였다.
항체의 친화성 상수(KD)를 결정하고 IgG 결합을 차단하는 것을 결정하기 위해서 T200 평가 소프트웨어(1.0 버젼)를 사용해 데이타를 분석하였다.
다른 어세이로서, 마스터 플레이트 상등액을 또한 세포 기반 인간 IgG 차단 어세이에서 스크리닝하였다. 마스터 플레이트로부터 25 ㎕의 B 세포 배양 상등액을 96웰 U-바닥 폴리프로필렌 플레이트에 부가하였다. 돌연변이체 hFcRn-형질감염된 HEK-293 세포(25 ㎕ PBS pH 6/1% FCS 중 웰당 50,000 세포)를 이후 각 웰에 부가하고 1시간 동안 4℃에서 항온반응하였다. 세포를 2회 150 ㎕의 PBS 배지로 세척하였다. 세포를 이후 7.5 ㎍/mL로 Alexafluor 488 또는 649로 표지된 인간 IgG를 함유하는 50 ㎕/웰 PBS/FCS 배지에 재현탁시키고 1시간 동안 4℃에서 항온반응시켰다. 세포를 이후 2회 150 ㎕의 배지로 세척한 후 고정제로서 1% 포름알데히드를 함유하는 35 ㎕/웰의 PBS/FCS 중에 재현탁하였다. 플레이트를 이후 FACS Canto 2 유세포측정법으로 판독하였다.
관심 웰의 선택물로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하기 위해서, B 세포의 이종 개체군을 함유하는 소정 웰에서 항원-특이적 B 세포를 동정할 수 있는 디컨볼루션 단계를 수행해야만 한다. 이는 형광발광성 증식소 방법을 사용해 달성하였다. 간략하게, 양성 웰로부터의 면역글로불린 분비 B 세포를 바이오틴화된 인간 FcRn으로 코팅된 스트렙타비딘 비드(New England Biolabs) 및 1:2000의 최종 희석비율의 염소 항-래트 또는 마우스 Feγ 단편-특이적 FITC 접합체(Jackson)와 혼합하였다. 1시간 동안 37℃에서 정치 항온반응 후, 항원-특이적 B 세포는 B 세포를 둘러싼 형광발광성 할로 존재에 의해 동정할 수 있었다. 올림푸스 현미경을 사용하여 동정된, 이들 개별 B 세포를 이후 에펜도르프 미세조작기로 찍어서 PCR 튜브에 넣었다. 형광발광성 증식소는 268 선택 웰에서 생성시켰다.
항체 가변 영역 유전자는 중쇄 및 경쇄 가변 영역-특이적 프라이머를 사용하는 역전사 중합효소 사슬 반응(RT)-PCR에 의해 단일 세포로부터 회수하였다. 마우스 γI IgG(VH) 또는 마우스 카파(Vl) 포유동물 발현 벡터에 가변 영역의 클로닝을 위해서 3' 및 5'에 제한효소 부위를 도입한 네스티드 2° PCR로, Aviso Onyx 액상 취급 로봇 상에서 2회 PCR을 수행하였다. 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄 구성체를 펙틴 293(Invitrogen)을 사용해 HEK-293 세포에 형질감염시키고 1 mL의 부피로 48-웰 플레이트에서 배양하였다. 5-7일 발현 후, 상등액을 회수하고 항체에 대해 추가 스크리닝을 수행하였다.
PCR은 선택된 웰의 156으로부터의 단일 B 세포에서 중쇄 및 경쇄 동종쌍을 성공적으로 회수하였다. 클로닝된 가변 영역 유전자의 DNA 서열분석은 다수의 고유한 재조합 항체 패밀리를 동정하였다. 발현 후, 일시적 상등액을 인간 IgG FACS 차단(상기 기술함) 및 IgG 재활용 어세이에서 검토하였다. 일부 경우에서, 정제된 마우스 γI IgG가 생성되었고 시험하였다(그에 따라 데이타를 표시함).
재활용 어세이는 96웰 플레이트의 웰 당 25,000세포를 플레이팅한 인간 FcRn 및 베타2 마이크로글로불린을 과발현하는 MDCK II 세포(이하 실시예 5, 6, 및 7에서 기술된 바와 같은 클론)를 사용하였다. 이들을 밤새 37℃에, 5% CO2에서 항온반응시켰다. 세포를 HBSS+ Ca/Mg pH 7.2+1% BSA로 세척하고 50 ㎕의 다양한 농도의 HEK-293 일시적 상등액 또는 정제된 항체와 1 시간 동안 37℃에, 5% C02에서 항온반응시켰다. 상등액을 제거하고 50 ㎕의 HBSS+ Ca/Mg pH 5.9 +1% BSA 중 500 ng/mL의 바이오틴화된 인간 IgG(Jackson)를 세포에 부가하고 1시간 동안 37℃에, 5% C02에서 항온반응시켰다. 이어 세포를 3회 HBSS+ Ca/Mg pH 5.9로 세척하고 100 ㎕의 HBSS+ Ca/Mg pH 7.2를 세포에 부가하고, 2시간 동안 37℃, 5% C02에서 항온반응시켰다. 상등액을 세포로부터 제거하고 항-인간 IgG 포획 항체(Jackson) 및 스트렙타비딘-설포 태그 폭로 항체(MSD)를 이용한 MSD 어세이를 사용해 총 IgG에 대해 분석하였다. 억제 곡선은 IC50 값을 결정하기 위해 비선형 회귀법으로 분석하였다.
이들 어세이의 수행을 기반으로 서열번호 1 내지 6으로 제공된 6 CDR을 포함하는 항체 패밀리를 선택하였다. 항체 CA170 01638은 최고 활성을 가졌고 인간화를 위해 선택하였다.
실시예 1 인간화 방법
항체 CA170 01638은 인간 배선 항체 V-영역 프레임워크 상에 래트 항체 V-영역으로부터의 CDR을 그라프트시켜서 인간화시켰다. 항체의 활성을 회복시키기 위해서, 래트 V-영역으로부터의 다수의 프레임워크 잔기를 또한 인간화 서열에서 유지시켰다. 이들 잔기는 [Adair et al.(1991)(Humanized antibody WO91/09967)]에 요약된 프로토콜을 사용해 선택하였다. 인간 배선(억셉터) V-영역 서열과 래트 항체(도너) V-영역 서열의 정렬을 지정된 인간화 서열과 함께 도 9A 및 B에 도시하였다. 도너로부터 억셉터 서열로 그라프트된 CDR은 카밧(Kabat et al., 1987)의 정의에 의하지만, 예외로 CDR-H1은 조합된 초티아/카밧 정의를 사용하였다(Adair et al., 1991 Humanised antibodies. WO91/09967). 인간 V-영역 IGKV1-27과 JK4 J-영역(http://www.imgt.org/)은 경쇄 CDR에 대한 억셉터로서 선택되었다. 인간 V-영역 IGHV3-7과 JH3 J-영역(http://www.imgt.org)은 중쇄 CDR에 대한 억셉터로서 선택되었다.
수많은 가변 중쇄 및 경쇄 V-영역 서열을 코딩하는 유전자는 Entelechon GmbH에 의해 자동화 합성 접근법으로 디자인 및 제작하였다. 중쇄 및 경쇄 V-영역의 추가 변이체는 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이유발법에 의해 VH 및 VK 유전자를 개질시켜서 생성시켰다. 이들 유전자를 다수의 벡터에 클로닝하여서 각각 이.콜라이 및 포유동물 세포에서 인간화 1638 Fab 또는 IgG4 항체를 발현시킬 수 있었다. 변이체 사슬, 및 이의 조합은 부모 항체 대비 그들의 역가, 그들의 생물리학적 특성 및 gL7 경쇄 그라프트 및 gH33 중쇄 그라프트의 선택을 야기하는, 하류 프로세싱에 대한 적합성에 대해 평가하였다. 최종적으로 선택된 gL7 및 gH33 그라프트 서열은 각각 도 9A 및 B에 도시하였다. 이러한 V-영역 쌍을 1638.g49라고 명명하였다.
그라프트 gL7의 경쇄 프레임워크 잔기는 모두 인간 배선 유전자로부터 유래하였지만, 잔기 70 및 71(카밧 번호매김)은 예외였으며, 각각 도너 잔기 히스티딘(H70) 및 티로신(T71)은 유지되었다. 이들 2 잔기의 체류는 인간화 항체 또는 Fab의 전체 역가에 중요하였다. gL7 그라프트의 CDRL2의 잔기 56은 아스파르트산(D56)에서 글루탐산(E56) 잔기로 돌연변이되어서, gL7 서열에서 잠재적인 아스파르트산 이성질체화 부위가 제거되었다. 그라프트 gH33의 중쇄 프레임워크 잔기는 모두 인간 배선 유전자로부터 유래하지만, 잔기 48 및 78(카밧 번호매김)은 예외적이며, 여기서 도너 잔기 류신(L48) 및 알라닌(A78)은 각각 유지되었다. 이들 2 잔기의 체류는 인간화된 항체 또는 Fab의 전체 역가에 필수적이었다.
이.콜라이에서 1638.g49 Fab의 발현을 위해서, 인간화 중쇄 및 경쇄 V-영역 유전자를 UCB 발현 벡터 pTTOD에 클로닝하였으며, 여기에는 인간 C-카파 불변 영역(Klm3 알로타입) 및 인간 감마-1 CH1 영역(힌지 영역 함유 또는 무함유)(Glm17 알로타입)을 코딩하는 DNA가 함유되어 있다.
포유동물 세포에서 1638.g49 IgG4의 발현을 위해서, 인간화 경쇄 V-영역 유전자를 인간 C-카파 불변 영역(Klm3 알로타입)을 코딩하는 DNA 서열에 연결하여 연속되는 경쇄 유전자를 생성시켰다. 인간화된 중쇄 V-영역은 힌지 안정화 돌연변이 S241P(Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30(1): 105-8)를 갖는 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA 서열에 연결시켜서, 연속되는 중쇄 유전자를 생성시켰다. 중쇄 및 경쇄 유전자를 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다.
다른 초기 그라프트, 1638.g28은 이하에 기술된 실시예 8A에서 사용하였고 이는 1638.g49 그라프트보다 중쇄(gH2)에 더 많은 도너 잔기(F24, L48, K71, T73, A78 및 V93)를 함유하였다. 이러한 항체의 경쇄(gL2)는 1638.g49에서 사용된 서열번호 7의 개질된 CDRL2 보다는 서열번호 5로 제공된 미개질 CDRL2를 함유하였다. 이들 2 항체 세트의 서열은 도 8에 제공하였다. 항체 1638.g28은 1638.g49에 대해 상기 기술한 바와 같은 Fab' 단편으로 발현시켰다.
실시예 2 1638.g49 Fab'-PEG 접합체의 제조
이.콜라이의 주변세포질에서 발현된 Fab'을 열 추출을 통해 세포로부터 추출하였다. Fab'은 산 용리를 사용해 단백질 G 친화성 정제에 의해 정제하였다. Fab'을 산화시키고 40 kDa PEG(SUNB RIGHT GL2-400MA3)로 PEG화시켰다. PEG는 항체 단편의 1 이상의 티올 기에 말레이미드 기를 통해 공유 연결시켰다. PEG화 효율은 SE-HPLC에 의해 확인하였다. Fab'PEG는 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 PEG화되지 않은 Fab' 및 디Fab'으로부터 분리시켰다. 분획은 SE-HPLC 및 SDS-PAGE로 분석하였다. 불순물 수준을 최소화시키기 위해서 풀링을 수행하였다. 최종 샘플을 농축시키고 원하는 완충액으로 투석여과시켰다.
실시예 3 hFcRn 결합에 대한 친화성
표면 플라스몬 공명 기술(SPR)을 사용한 생체분자 상호작용 분석을 Biacore T200 시스템(GE Healthcare) 상에서 수행하였고 인간 FcRn 세포외 도메인과의 결합을 측정하였다. 인간 FcRn 세포외 도메인은 인간 FcRn 알파 사슬 세포외 도메인(서열번호 48) 및 β2 마이크로글로불린(β2Μ)(서열번호 72) 간에 비공유 복합체로서 제공하였다. 10 mM NaAc, pH 5 완충액 중 50 ㎍/mL의 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fc 단편 특이적(IgG4 포획용)(Jackson ImmunoResearch Lab, Inc.)을 러닝 완충액으로서 HBS-EP+(GE Healthcare)를 사용하고 5000 - 6000 반응 유닛(RU) 사이의 포획 수준으로 아민 커플링 화학법을 통해 CM5 센서 칩 상에 고정시켰다.
50 mM 포스페이트, pH 6 + 150 mM NaCl + 0.05% P20 또는 HBS-P+, pH7.4(GE Healthcare)를 친화성 어세이용 러닝 완충액으로 사용하였다. 항체, 1638.g49 IgG4P를 러닝 완충액 중에 1 ㎍/mL로 희석하였다. 10 ㎕/분의 IgG4의 60s 주사를 고정된 항-인간 IgG에 의한 포획을 위해 사용하였다. 인간 FcRn 세포외 도메인은 30 ㎕/분에서 300s 동안 포획된 항-FcRn 항체(IgG4) 상에서 20 nM 내지 1.25 nM로 적정한 후 1200s 해리를 후속하였다. 표면은 pH 6의 러닝 완충액에 대해 10 ㎕/분으로 2 x 60s 50mM HC1에 의해 또는 pH 7.4의 러닝 완충액에 대해 60s 40 mM HC1 및 30s lO mM NaOH로 재생시켰다.
데이터는 국소 Rmax의 1:1 결합 모델을 사용하는 T200 평가 소프트웨어(1.0 버젼)을 이용해 분석하였다.
Figure pct00004
따라서, 1638.49g IgG4의 친화성은 pH 6.0에서 127 pM 및 pH 7.4에서 29 pM로 결정되었다.
실시예 4
1638.g49 가변 영역이 각 형태의 Fab 도메인에 도입된 IgG4P 전장 분자 및 Fab-dsFv 분자를 생화학적 온전성 및 생물리학적 안정성에 대해 분석하였다.
방법 및 결과
1. 서열 확인
i) 단백질 서열분석(에드만 화학법)
IgG4 및 Fab-dsFv 샘플 둘 다의 N-말단 아미노산 서열을 Applied Biosystems Procise 494 장비를 사용해 얻었다. 이는 장비 제조사의 추천에 의해 작동시켰다.대략 100 pmole의 각 샘플을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 디스크(Prosorb, 제조사 추천에 따라 사용함)에 도포하였고 2 블랭크 러닝 및 표준물을 포함한 18회 사이클을 수행하여서 중쇄 및 경쇄의 처음 15 아미노산 잔기를 분석하였다. SequencePro Data Analysis Application V2.0을 사용해 분석을 수행하였다.
각 샘플에 대해, 관찰된 서열은 각각 중쇄 및 경쇄 유전자 서열로부터 예상되는 N-말단 서열과 일치하는 2개의, 대략 균일하게-풍부한 서열, EVQLVESGGGLVQPG(서열번호 67) 및 DIQMTQSPSSLSASV(서열번호 68)의 혼합이었다. 대략적으로 균등한 풍부함은 유의한 N-말단 차단이 거의 없거나 또는 전혀 없이, 2개 사슬이 균등한 몰량임을 시사하였다.
ii) 질량 분광 분석법
a) 온전한 질량 분석
온전한 질량 분광 분석법은 1시간 동안 20 mM TCEP로 환원 후 IgG4 및 Fab-dsFv 분자의 2개 뱃치에 대해 수행하였다. 질량은 칩 큐브 경계면 및 C8 칩(43mm Zorbax 300 A C8 컬럼 + 43 nL 트랩)이 장착된 Agilent 6510 질량 분광기에서 측정하였다. 모든 샘플은 주사 전에 98% 물/2% 메탄올/0.3% 포름산(용매 A) 중에 1 mg/mL로 희석하였고 0.3 ㎕를 시스템 상에 적재하였다. 단백질은 300 nL/분으로 40% 아세토니트릴/0.1% 포름산의 구배를 사용해 칩에서 질량 분광기로 용리시켰다. ToF-MS 데이타는 500 내지 5000 m/z의 양성-이온 모드에서 수집하였고 Agilent MassHunter 소프트웨어를 사용해 처리하였다.
두 형태에 대한 경쇄 및 중쇄 둘 다에 대해 관찰된 질량을 이하에 나타내었다(표 2).
Figure pct00005
1 예상 질량은 IgG4: 2 L- 및 4 H- 사슬내 디설피드, G0F 당화 및 H-사슬로부터의 C-말단 Lys의 단축
FabFv: 3 L- 및 3 H- 사슬내 디설피드가 부가된 아미노산 서열로부터 산출하였다.
TCEP 환원된 IgG4의 온전한 질량 분석은 주로 GOF 당화를 갖고 재조합 IgG의 전형이 H-사슬 상에 C-말단 라이신이 단축(대략 90%)된 예상 서열과 일관되었다.
유사하게 Fab-dsFv의 온전한 질량 스 펙트럼은 서열 질량 및 예상되는 수의 디설피드와 일관되었다. TCEP에 의한 사슬내 디설피드의 부분 환원으로 인해 아마도 양쪽 사슬의 관찰 질량에 비균질성이 존재하였다. b) 디설피드 맵핑은 오직 IgG3에 대해 수행하였다.
IgG4(50 ㎍)를 15분간 50℃에서 Tris-HCl, pH 7.5 중 0.15% Rapigest로 처리하고 임의의 자유 시스테인은 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 트립신(1:25w/w)을 부가하고 단백질을 밤새 실온에서 가수분해한 후 반응은 포름산(5% v/v)을 부가해 급랭시키고 임의의 침전물은 원심분리에 의해 제거하였다. 샘플을 -20℃에서 저장하였고 LC-MS 시스템에 적재하기 전에 물로 1:1 희석하였다. 분취액(∼3-5 ㎍)은 0.2% 포름산을 함유하는 물로 평형화시킨 2.1 x 150 mm C18 컬럼(Waters BEH1.7u) 상에 적재하고 +ve-이온 MSE 모드로 작용되는 Waters Xevo 질량 분광기로 아세토니트릴/l-프로판올의 구배를 사용해 용리하였다. 데이타는 MassLynx 및 BioPharmaLynx 소프트웨어를 사용해 분석하였다.
결과는 단일 디설피드 결합을 갖고 낮은 강도에서만 관찰된 H-H 사슬간 펩티드 T19-SS-T19 종을 제외하고 모든 예상되는 디설피드-연결 펩티드가 관찰되었음을 시사한다. 임의의 스크램플된 디설피드 종 또는 카르바미도메틸화 시스테인 잔기에 대한 증거는 없었다.
2. 생화학적 분석
크기 배제 크로마토그래피 HPLC(SEC HPLC)
크기 배제 크로마토그래피는 단량체 및 올리고머 물질의 분석을 가능하게 하였다. Agilent 1100 시스템에 연결된 TSK G3000SW(7.7 mm I.Dx30.0cm L) 컬럼을 사용해 수행하였다. 샘플(25 ㎕/25 ㎍ 주사)은 30분간, 30℃에서 1.0 mL/분으로 0.2 M 인산나트륨, pH 7 중에서 등용매 용리하였다. 용리는 280 nm에서 흡광도로 모니터링하였다.
용리 프로파일은 IgG4 및 Fab-dsFv가 균질하고 SEC 표준물(BioRad 151-1901)로 판단시 예상되는 체류 시간에 용리되었음을 보여준다.
3. 분자 전하
모세관 등전 포커싱(cIEF)을 수행하여 pi 및 산성종 함량을 추정하였다.
IgG4 및 Fab-dsFv 샘플은 분석(비환원 조건)을 위해 HPLC 등급수 중 1 mg/mL로 희석하였다. 또산 샘플에 대해서 환원(2 mM THP/30분) 및 알킬화(20 mM 요오도아세트아미드/80분)를 가하여 시스테인 부가에 대해 분석하였다.
샘플은 다음과 같이 혼합하여 준비하였다: 30 ㎕ 단백질 샘플, 0.35% 메틸셀룰로스, 4% pH3-10 양성체(Pharmalyte), 1 ㎕의 각각의 합성 pi 마커(4.65 및 9.77) 및 100 ㎕의 최종 부피를 위한 HPLC 등급수. 이어서 혼합물은 iCE280 IEF 분석기(Convergent Biosciences)로 분석하고, 1분간 1500 V에서 사전포커싱한 후 6분간 3000 V에서 포커싱하였다. 보정된 일렉트로페로그램을 이후 Empower 소프트웨어(Waters)를 사용해 통합하였다.
pI는 주요 종(최대 피크)의 것으로 취하였다.
IgG4 형태의 경우, 주요 종은 pi가 7.3이었다. 이는 IgG 분자에 대해 이례적인 것이 아니라 단축된 부모 분자(질량 분광 분석법으로 확증된, C-말단 리신의 제거)인 것으로 추정되었다. 단축된 분자는 부모 분자(7.4에서 기본 피크)보다 더 산성일 수 있다. 환원 및 알킬화 전후 pi 프로파일에 변화가 없어서, 시스테인 부가물이 존재하지 않음을 시사하였다.
Fab-dsFv 형태의 경우, pi는 9.0인 주요 종(최대 피크)의 것으로 취하였다. 보다 산성인 종(pi 8.8)이 또한 명백하였는데 환원/알킬화 후에 덜 두드러져서 환원가능한 부가물의 존재를 시사하였다.
양쪽 형태의 경우, 산성(주요 피커의 좌측으로) 또는 염기성(주요 피크의 우측으로)인 소수 피크가 존재하였다. 이들 종은 주요 종의 유도체로 추정되었지만, 추가로 특징규명하지 않았다.
4. 열 안정성(T m )
가열되면, 단백질은 언폴딩되는 경향이 있고, 보다 안정하게 폴딩된 단백질 구조는, 열이 더 있으면 언폴딩이 요구된다. 따라서, 열 안정성(용융 온도, Tm으로측정됨)은 단백질 폴딩의 안정성, 또는 응집체 형성에 선행될 수 있는, 미폴딩(변성)에 대한 분자의 내성에 대한 척도이다. 정의된 조건의, 온도 구배에서, 분자의 50%가 언폴딩되는 온도가 Tm이다.
Tm 측정은 2가지 독립적인 방법에 의한다
i) 써모플루오르 어세이, 열 유도된 언폴딩시 노출되는 소수성 표면을 노출시키기 위해 형광발광성 염료(사이프로 오렌지)의 결합에 의한 50% 언폴딩의 측정, 및
ii) 시차주사 열량측정법(DSC).
2가지 기술에 의한 결과는 대체로 상호관련되고, 적용되는 방법이 상이하므로 절대값은 약간 상이하다.
i) 써모플루오르 어세이
샘플은 다음과 같이 제조하였다: 5 ㎕의 30x 사이프로 오렌지를 96웰 V-바닥 플레이트에 넣었다. 다음으로, 0.1 mg/mL의 단백질 샘플 45 ㎕를 부가하였다. 이 혼합물을 파이펫팅하여 10 ㎕ 네개 중복물로 하여, 384웰 플레이터에 넣었다. 384 웰 플레이트의 형태는 샘플 1: 웰 Al, Bl, A2, B2; 샘플 2: 웰 C1, Dl, C2, D2였다. 비관련 IgG4인 어세이간 대조군을 포함시켰다. 0.1 mg/mL(PBS pH 7.4 중에)인 이 대조군은 5 ㎕의 30x 농축 염료에 부가하고, 이 마스터 믹스 중 10 ㎕를 4중으로 384웰에 넣었다. 이 플레이트를 7900HT 신속 실시간 PCR 시스템에 넣고 1.1 ℃/분의 램프 속소를 사용해 20℃에서 99℃로 가열하였다; CCD 장치는 동시에 웰의 형광발광 변화를 모니터링한다. 개질된 XE 주형(IDBS)은 강도 데이타 처리 및 다수 전이를 고려하는데 사용한다.
IgG4 및 Fab-dsFv 분자 둘 다에 대해 2 언폴딩 전이가 명백하였다. 두 분자에 대한 Tm 2 값은 Fab 언폴딩 도메인을 나타내었고 IgG4 형식에 대해서는 약간 낮게 나타났다. Tm 1 값은 각각 IgG4 및 Fab-dsFv 분자의 CH2(불변 중쇄) 도메인 및 dsFv 도메인을 나타내었다. Fab-dsFv 형태는 PBS, pH 7.4에서 IgG 형태보다 열적으로 더 안정된 것으로 확인되었다.
Figure pct00006
ii) DSC 방법
DSC 분석은 오직 써모플루오르 데이타의 확증을 위하고 열 안정성에 대한 2개의 상이한 완충액(PBS pH7.4 및 50 mM 아세트산나트륨/125 mM 염화나트륨, pH 5.0)의 효과를 확인하기 위해 Fab-dsFv 분자에 대해 수행하였다.
개별 기준 완충액과 PBS pH 7.4 및 50 mM 아세트산나트륨/125 mM 염화나트륨, pH 5.0 중 1 mg/mL의 샘플을 MicroCal VP 모세관 DSC 장비에 삼중으로 적재하였다. 시스템 설정은 20℃에서 110℃의 온도 스캔 및 60℃/시의 스캔 속도를 포함한다. 최종 써모그램은 제조사의 설명서에 따라서 Origin 소프트웨어를 사용해 처리하였다. Tm은 소프트웨어의 자동화 Tm 검출 알고리즘(주요 전이에 대함)을 사용해 결정하였고 소프트웨어에 의해 자동으로 검출되지 않은 임의의 다른 전이에 대해서는 수동으로 피크를 선택하였다.
2개의 개별 전이를 시험된 2종의 완충액에서 관찰할 수 있었다.
낮은 언폴딩 전이(Tm 1)는 Fab-dsFv 분자의 dsFv 도메인을 나타내고 보다 높은 전이 온도(Tm 2)는 Fab 도메인을 나타낸다.
DSC 데이타는 써모플루오르 어세이에서 얻은 데이타와 양호하게 일치하였다. 이러한 기술은 써모플루오르 어세이보다 더 쉽게 2개의 언폴딩 도메인을 구별할 수 있게 하였다.
Fab-dsFv 분자는 50 mM 아세트산나트륨/125 mM 염화나트륨, pH 5 중에서 열 안정성을 약간 증가시키는 것으로 확인되었다.
Figure pct00007
5. 분자 구조: 약화된 총 반사율 퓨리에 전환 적외선 분광법(ATR FTIR)
이 기술은 분자 내 β-시트 간(P-시트내) 및 개별 분자간(P-시트간) 상호작용 정도를 비교하는데 사용되었다.
이러한 분석은 4cm-1의 해상도; 120 스캔; 조리개 설정 6 mm 및 20℃에서 20 ㎕ 샘플 부피를 사용하는 Bruker Tensor 27 FTIR 분광기 및 BIOATR II 세포 샘플링 악세서리를 이용해 수행되고 여기서 이하의 과정은 Fab-dsFv만의 분석을 위해 수행하였다.
1. 5 공기 배경 스펙트럼을 방법 BIOATR 10 06 10. xpm를 사용해 측정하였다.
2. 20 ㎕의 시그마 PBS pH 7.4를 세포에 부가한 후 제거하였다.
3. 20 ㎕의 시그마 PBS pH 7.4를 세포에 부가하고 스펙트럼을 취하였고, 완충액을 제거하고 신선한 완충액을 부가하고 스펙트럼을 얻었다(이중으로).
4. 20 ㎕의 샘플을 세포에 부가하고 스펙트럼을 얻고, 샘플을 이후 세포로부터 제거하였다.
5. 20 ㎕의 시그마 PBS pH 7.4를 세포에 부가하고 제거하였다.
6. 20 ㎕의 샘플을 세포에 부가하고 스펙트럼을 얻고, 이후 샘플을 세포로부터 제거하였다(이중으로).
7. 세포를 이어서 다음의 과정에 따라 세정하였다:
a. 20 ㎕ 1% SDS를 세포에 부가 + Q-팁으로 세정
b. 20 ㎕ 1% SDS를 세포에 부가 및 제거
c. 5회 20 ㎕ H20를 세포에 부가 및 제거
d. 20 ㎕ 완충액을 세포에 부가 및 제거
8. 다음의 방식으로 데이타를 분석하여 최종 데이타 형태를 얻었다.
a. 완충액 스펙트럼 1은 Fab-dsFv 스펙트럼 1에서 뺀 후 완충액 스펙트럼 2 및 Fab-ds Fv 스펙트럼 2로 반복하였다.
b. 데이타를 2200cm-1 내지 1000cm-1 까지 절삭하였다.
c. 이중 스펙트럼을 평균내었다.
d. 이후 25지점 평활화하여 2차 도함수를 얻었다. 이것이 도시된 최종 데이타 형태였다.
분석 결과는 Fab-dsFv가 항체 분자에 전형적인 베타 시트내 특징을 가짐을 보여주었다.
실시예 5 세포 기반 역가
세포 기반 어세이는 젠타마이신 선별 마커를 갖는 인간 FcRn 인간 B2M 이중 유전자 벡터로 안정하게 형질감염된 매디-다비 개 신장(MDCK) II 세포를 사용해 수행하였다. IgG를 재활용하고 통과세포외배출할 수 있는 안정한 세포 클론을 선택하였고 모든 후속 실험에서 사용하였다. 이것을 MDCK II 클론 15라고 한다.
인간 FcRn에 대한 CA170_1638.g49 IgG4의 세포 기반 친화성
정량적 유세포흐름 실험은 MDCK II 클론 15 세포 및 AlexaFluor 488-표지된 CA170_1638.g49 IgG4를 사용해 수행하였다. 다양한 항체 농도에 걸쳐 FcRn에 대한 항체의 특이적 결합을 사용해 KD를 결정하였다. 분석은 혈장(pH 7.4) 또는 엔도솜(pH 6)에서 존재하는 것과 비슷한 환경 pH가 항체 결합에 임의의 영향이 있는지 여부를 결정하기 위해 중성 및 산성 완충액으로 수행하였다.
도 2는 CA170_1638.g49 IgG4에 대한 대표적인 결합 곡선을 도시한다. 평균 KD 값(n = 3)은 각각 중성 완충액에서 0.20이었고, 산성 완충액에서는 0.22였다(표 4 참조).
Figure pct00008
도 2는 산성 및 중성 pH에서 MDCK II 클론 15 상의 CA170_1638.g49 IgG4 결합을 도시한다.
MDCK II 클론 15 세포는 pH 7.4 또는 pH 6인 Facs 완충액 중에서 1시간 동안 Alexa-fluor 488-표지된 CA170_1638.g49 IgG4를 부가하기 전에 30분간 Facs 완충액(0.2% w/v BSA, 0.09% w/v NaN3이 포함된 PBS) 중에 항온반응시켰다. 최종 항체 농도는 400 nM 내지 0.003 nM 범위였다. 세포는 얼음 냉각 Facs 완충액 중에서 세척시킨 후 Guava 유세포측정기(Millipore, UK)를 사용해 분석하였다. 적정 데이타 세트는 또한 비특이적 결합을 결정하기 위해 각 항체 형태에 대한 이소타입 대조군 항체에 대해 생성시켰다. 결합된 항체의 몰수는 상이한 양의 형광발광성 염료를 포함하는 비드로부터 생성시킨 표준 그래프로부터 내삽된 값을 사용해 계산하였다. 기하 평균 형광발광 값은 세포 및 비드의 유세포측정 분석으로 결정하였다. 비특이적 결합은 항-FcRn 항체 값으로부터 뺐고 생성된 특이적 결합 그래프는 KD를 결정하기 위해 원-사이트 결합 방정식(Graphpad Prism®)을 사용해 비선형 회귀법에 의해 분석하였다. 데이타는 3번의 실험을 대표한다.
CA170_1638.g49 IgG4는 산성 및 중성 pH 둘 다에서 세포 상에 발현된 인간 FcRn에 결합할 수 있다.
실시예 6 기능적 세포 기반 어세이
FcRn 발현은 주로 세포내(Borvak J et al. 1998, Int. Immunol., 10(9) 1289-98 and Cauza K et al. 2005, J. Invest. Dermatol., 124(1), 132-139)에서 일어나고, 엔도솜 및 리소솜 막과 연관된다. IgG의 Fc 부분은 산성 pH(<6.5)에서 FcRn에 결합하지만, 중성의 생리학적 pH(7.4)에서는 그렇지 않고(Rhagavan M et al. 1995), 이러한 pH-독립성으로 IgG의 재활용을 촉진한다.
음세포작용에 의해 섭취되고 산성 엔도솜으로 들어가면, FcRn에 결합된 IgG는 세포 표면으로 FcRn과 함께 재활용되는 반면, 생리학적 중성 pH에서 IgG는 방출된다(Ober RJ et al. 2004, The Journal of Immunology, 172, 2021-2029). FcRn에 결합하지 않은 임의의 IgG는 리소솜 분해 경로로 들어가게 된다.
시험관내 어세이는 FcRn의 IgG 재활용 능력을 억제하는 CA170_1638.g49 IgG4의 능력을 조사하기 위해 확립되었다. 간략하게, MDCK II 클론 15 세포는 FcRn의 결합을 허용하는 산성 완충액(pH 5.9) 하에 1638 IgG4의 존재 및 부재시에, 바이오틴화된 인간 IgG와 항온반응시켰다. 모든 과도한 항체를 제거하고 세포를 중성 pH 완충액(pH 7.2)에서 항온반응시켜서, 상등액으로 표면-노출, 결합되고 내재화된 IgG의 방출을 가능케하였다. FcRn의 억제는 재활용되어 상등액으로 방출된 IgG의 양을 검출하기 위한 MSD 어세이를 사용해 후속하였다.
도 3은 CA170_1638.g49 IgG4가 MDCK II 클론 15 세포에서 IgG 재활용을 억제함을 보여준다. MDCK II 클론 15 세포를 96웰 플레이트의 웰 당 15,000 세포로 플레이팅하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 항온반응시켰다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 HBSS+(Ca/Mg) pH 5.9 + 1% BSA 중 CA170_1638.g49 IgG4의 존재 및 부재 하에서 1 ㎍/mL의 바이오틴화된 인간 IgG(Jackson)와 항온반응시켰다. 세포를 HBSS+ pH 5.9로 세척하고, HBSS+ pH 7.2에서 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 항온반응시켰다. 상등액을 세포로부터 제거하고 MSD 어세이(항-인간 IgG 포획 항체(Jackson) 및 스트렙타비딘-설포 태그 폭로 항체(MSD))를 사용하여 총 IgG에 대해 분석하였다. 억제 곡선은 EC50을 결정하기 위해 비선형 회귀법(Graphpad Prism®)에 의해 분석하였다. 그래프는 3개 실험의 조합 데이타를 나타낸다. 도 3에 도시한 바와 같이, CA170_1638.g49 IgG4는 0.31 nM의 EC50 값(n = 3)으로 농도 의존적 방식으로 IgG 재활용을 억제한다.
CA170 1638.g49 IgG4 및 FabFv는 인간 IgG의 통과세포외배출을 억제한다
FcRn은 정점에서 기측부로 그리고 기측부에서 정접 방향 둘 다로 편극된 상피 세포를 거쳐서 IgG를 수송하므로 점막 장벽의 내강과 순환계 간에 이동하도록 IgG를 투과시키는데 중요한 역할을 한다(Claypool et al. 2004 Mol Biol Cell 15(4): 1746-59).
FcRn은 정점에서 기측부로 그리고 기측부에서 정점 방향 둘 다로 편극된 상피 세포를 거쳐서 IgG를 수송하므로 점막 장벽의 내강과 순환계 간에 이동하도록 IgG를 투과시키는데 중요한 역할을 한다(Claypool et al. 2004 Mol Biol Cell 15(4): 1746-59).
시험관내 어세이를 확립하여서 FcRn 의존적 IgG 통과세포외배출을 억제하는 CA170_1638.g49 IgG4 및 FabFv의 능력을 조사하였다. 간략하게, MDCK II 클론 15 세포를 24 웰 트랜스웰 플레이트에 플레이팅하고 3일간 단일층이 형성되도록 하였다. 이어서 세포를 CA170_1638.g49 IgG4 또는 FabFv의 존재 및 부재하에, 정점면 상에서, FcRn에 대한 결합을 촉진하는 산성 완충액 중 바이오틴화된 인간 IgG와 항온반응시켰다. 인간 IgG는 정점에서 기측부로 세포를 통해 통과세포외배출되어서 하부 챔버의 중성 완충액으로 방출되었다. 기측부 상의 IgG의 수준은 MSD 어세이로 측정하였다.
도 4 및 5는 CA170_1638.g49 IgG4 및 FabFv가 MDCK II 클론 15 세포에서 정점에서 기측부로 IgG 통과세포외배출을 억제함을 보여준다. MDCK II 클론 15 세포를 24웰 트랜스웰 플레이트의 웰 당 500,000 세포로 플레이팅하고, 단일층이 형성될 때까지 3일 간 37℃, 5% C02에서 항온반응시켰다. 정점 구획의 pH는 HBSS+(Ca/Mg) 완충액 + 1% BSA 중에서 5.9로 조정하였고, 기측부는 7.2로 조정하였다. 정점 구획 상의 세포는 37℃, 5% C02에서 4시간 동안 표시된 농도의 CA170_1638.g49 IgG4 또는 FabFv의 존재 및 부재 하에서 1 ㎍/mL의 바이오틴화 인간 IgG(Jackson)와 항온반응시켰다. 기측부 배지를 이어 회수하고 총 IgG는 MSD 어세이(항-인간 IgG 포획 항체(Jackson) 및 스트렙타비딘-설포 태그 폭로 항체(MSD)를 사용함)에 의해 측정하였다. 억제 곡선은 EC50을 결정하기 위해 비선형 회귀법(Graphpad Prism®)으로 분석하였다. 그래프는 3회 실험의 조합 데이타를 나타낸다.
요약하여 도 4 및 도 5는 CA170_1638.g49 IgG4 및 FabFv가 각각 2.4 및 0.42 nM의 EC50 값(n=3)을 가지고 농도 의존적 방식으로 인간 IgG의 정점에서 기측부로의 통과세포외배출을 억제할 수 있음을 보여준다.
CA170 1638.g49 IgG4 및 FabFv의 시험관내 효과의 요약
CA170_1638.g49 IgG4 및 FabFv는 IgG 재활용 및 통과세포외배출 둘 다를 억제한다. IgG 재활용 어세이에서 얻은 0.31 nM의 EC50은 중성 완충액에서 0.2 nM이고 산성 완충액에서 0.22 nM인 KD 값이 얻어진 세포 친화성 결합 데이타와 견줄만하다. IgG 통과세포외배출 어세이에서, 2.4 nM 및 0.42 nM의 EC50은 각각 CA170_1638.g49 IgG4 및 FabFv에 대해 얻었으며, IgG4와 FabFv 간 역가의 약간의 감소를 입증하였다. 그러나, 이러한 섹션의 데이타는 CA170_1638.g49 IgG4 및 FabFv가 인간 FcRn 기능을 억제할 수 있음을 분명히 보여주었다.
실시예 7 비인간 영장류 FcRn과 CA170_1638.g49 IgG4의 교차 반응성
비인간 영장류 PK/PD 실험 및 전임상 독성학에서 CA170_1638.g49 IgG4의 사용을 입증하기 위해서, 사이노몰거스 마카크 FcRn와 그의 상대적인 친화성을 조사하였다. 사이노몰거스 마카크 FcRn 및 B2M이 안정하게 형질전환된 MDCK II 세포(MDCKII(클론 40)를 인간 FCRn 및 B2M이 안정하게 형질전환된 이전에 기술한 MDCK II 세포(MDCK II 클론 15)와 함께, 세포 기반 어세이에서 사용하였다.
도 6은 산성 및 중성 pH에서 MDCK II 클론 40 세포 상에 CA170_1638.g49 IgG4 IgG4 결합을 보여준다. 다양한 항체 농도에 걸쳐 FcRn에 대한 항체의 특이적 결합을 사용해 KD를 결정하였다. 분석은 혈장(pH7.4) 또는 엔도솜(pH6)에서 확인되는 것과 비슷한 환경 pH가 항체 결합에 임의의 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 중성 및 산성 완충액 둘 다에서 수행하였다.
도 6은 CA170_1638.g49 IgG4에 대한 대표적인 결합 곡선을 나타낸다. 평균 KD 값(n = 3)은 각각 중성 완충액에서는 0.3이었고, 산성 완충액에서는 0.43이었다(표 5 참조).
Figure pct00009
실시예 8A 항-FcRn 치료는 hFcRn 형질전환 마우스의 생체내에서 hIgG의 제거를 강화시킨다
인간 IVIG의 제거에 대한 항-FcRn 분자(CA170_01519.g57 Fab'PEG(WO2014/019727에 기술됨) 및 CA170_01638.g28 Fab'PEG)의 효과를 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.Cg-Fcgrt tmlDcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, JAX 마우스)에서 확인하였다. 마우스에 500 mg/kg 인간 IgG(인간 Ig1 10% Gamunex-c, Talecris Biotherapeutics)를 정맥내 주입하였다. 24시간 후에 동물은 단일 용량(100 mg/kg)으로서 비히클 대조군(PBS) 또는 항-FcRn을 정맥내 투약받았다. 일련의 꼬리끝 혈액 샘플을 항-FcRn 치료에 대해 -24, 8, 24, 48, 72, 96, 144 및 192시간에 채취하였다. hFcRn 마우스에서 인간 IgG의 혈청 수준은 LC-MS/MS로 결정하였다. 도 1에 나타낸 결과는 치료군 당 5-6마리 마우스를 사용한 평균 ± SEM이다. 시험한 항-FcRn 분자 각각에 의한 hFcRn의 차단은 hIVIG의 가속적인 제거를 보였고 저농도의 총 IgG가 대조군 마우스와 비교하여 관찰되었다..
실시예 8B 항-FcRn 치료는 hFcRn 형질전환 마우스의 생체내에서 hIgG의 제거를 강화시킨다
항-인간 FcRn 항체는 인간 FcRn에 결합하여 인간 FcRn에 대한 인간 IgG의 결합을 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 쥣과동물 FcRn에는 결합하거나 또는 억제하지 않았다. 결과적으로, 인간 IVIg의 제거에 대한 IgG4P 형태(1638.g49), Fab'PEG 형태(1638.g28), 및 FabFv 형태의 항-FcRn 분자의 효과는 인간 FcRn 형질전환 마우스(B6.Cg-Fcgrt tmlDcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, JAX 마우스)에서 결정하였다. 마우스에게 500 mg/kg 인간 IgG(인간 IgI 10% Gamunex-c, Talecris Biotherapeutics)를 정맥내 주입하였다. 24시간 후에 동물은 단일 용량으로 비히클 대조군(PBS) 또는 항-FcRn을 정맥내 투약받았다. 투약, 샘플링 시기 및 복제 갯수는 도 1a 내지 1e에 표시하였다. 샘플은 일련의 꼬리끝 혈액 샘플이었다. 인간 IgG, 내생성 마우스 알부민 및 항-FcRn 분자 자체의 혈청 수준은 LC-MS/MS에 의해 결정하였고, 펩티드 서열의 검출 및 정량에 대해 각각의 분석물에 대해 고유하였다. 도 1a에 나타낸 데이타는 각각 기하 평균 및 95% 신뢰 구간이다.
시험된 3 항-FcRn 분자 각각에 의한 hFcRn 차단은 비히클 단독, 또는 대조군 Fab'PEG(1638 Fab'PEG처럼 40 kDa PEg에 접합되었지만, 항-FcRn은 아닌 A33)를 처치한 대조군 마우스와 비교하여 가속화된 hIVIg의 제거를 보였다 - 도 1a 및 1b를 참조한다. 그 효과는 용량-관련적이고, 많은 용량을 제공할수록, 자유 항-FcRn을 혈청에서 검출할 수 있는 기간이 길어졌고(도 1c 및 1d), 이는 마우스로부터 인간 IVIg의 보다 장기간, 보다 완전한 제거를 야기하였다. 1638 Fab'PEG는 대조군 A33 Fab'PEG보다 짧은 약력학(혈청 중 자유 용액에서 보다 신속하게 사라짐)을 나타내었고, 1638 Fab'PEG가 표적-매개 침착을 겪어서-FcRn 표적과의 결합에 의해 자유 용액으로부터 제거됨을 의미하였다.
마우스 IgG가 이들 형질전환 마우스에 존재하는 인간 FcRn에 결합하지 않지만, 내생성 마우스 알부민은 결합하여서 인간 FcRn에 의해 재활용되었다. 인간 Fcrn에 대한 항-인간 Fcrn의 결합이 시험관내 어세이에서 FcRn에 대한 알부민 결합을 차단하지 않았지만, 이러한 억제가 생체내에서 일어난다면, 내생성 마우스 알부민의 가속화된 제거가 초래될 수 있다. 도 1e에 데이타를 나타내었다. 혈청 중 알부민 농도는 어느정도 가변적(항-FcRn 약물 주사 전에, 30마리 군에서 16.6 내지 59.9 mg/mL)이었기 때문에, 그룹 결과의 보다 쉬운 비교를 위해서, 알부민 데이타는 도 1e에서 정규화하고 0시에서의 혈청 알부민 농도의 비율로 제공하였다. 혈장 알부민 농도에 대한 회복가능한 효과가 Fab'PEG 또는 FabFv 형태의 투약 후 일어났다. 변수 분석(ANOVA)은 처치 차이 및 시간 차이를 동시에 주시하면서, 반복 측정에 대해 수행하였다. Fab'PEG 또는 FabFv-처치 동물의 각 측정치를 동시에 동일 실험에서 대조군과 비교하였고, 대조군은 각각 비관련(비-FcRn-결합) Fab'PEG 또는 비히클 단독이었다. 이들 2가지 형태는 약물의 주사 후 대략 48 내지 72시간에 알부민 농도의 감소(데이타의 ANOVA 분석에서 5% 수준)를 나타내었고, 수준은 이후 용량전 수준으로 회복되었다. 혈장 알부민 농도의 최대 감소는 100 mg/kg의 Fab'PEG 형태 이후 약 10%(48시간에), 또는 250 mg/kg FabFv 이후 144시간에 약 25%였다. 유사한 ANOVA 분석을 혈장 알부민 수준에 대한 1638 IgG4P의 효과를 보여주는 데이타에 대해 수행하였다(도 1f에 도시함). 처치 동물과 대조군 동물 간에 유의한 차이가 없어서, 1638의 IgG4P 형태를 사용한 치료는 혈장 알부민 농도에 영향이 없는 것을 시사하였다.
실시예 9 1638.g49 Fab : FcRn 복합체의 결정 구조 및 분석
1638.g49 Fab를 hFcRn 알파 사슬 ECD 영역(서열번호 48) 및 인간 베타 2 마이크로글로불린(서열번호 72)과 공결정화시켰다. 단백질은 50 mM 아세트산나트륨, 125 mM NaCl pH 6.0 중에 존재하였고, 결정화 조건은 0.1 M Tris pH 8.5, 40% PEG400 및 0.2 M LiSO4.H2O이고 lO mg/mL의 단백질 농도 및 시팅 드롭에서 0.4 ㎕ 단백질 대 0.4 ㎕ 리저버의 드롭 부피 비율, 증발 확산 실험으로 하였다. 8-21일 동안 결정이 성장하게 한 후, 드롭으로부터 회수하고, 웰 완충액(이미 40% PEG400을 함유하므로)에 옮기고 10초간 액체 질소(-180℃)에서 급속 냉동시켰다. 진동 방법을 사용해, SOLEIL에서 X-선 데이타를 수집하였다. 결정의 셀 치수는 a=101.49Å, b=210.4 Å, c=101.49 Å; 알파 = 90도, 베타 = 90도 및 감마 = 90도였다. 공간 그룹은 P21212로 결정되었다. 분자 팩킹은 Phaser를 사용해 결정하였고, 30 내지 2.7Å 사이의 데이타를 사용하는, Refmac으로 정제를 수행하여서, 21.8%의 최종 F 인자 및 27.2%의 R 프리가 제공되었다. 그 결과를 하기에 도시하였다:
1638.49 Fab'과 상호작용하는 잔기는 모두 FcRn α 사슬(β2Μ은 아님)에 있고 FcRn 세포외 도메인 서열에서 이하에 굵게 표시하였다.
Figure pct00010
밑줄친 잔기는 인간 IgG의 Fc 영역과 인간 FcRn의 상호작용에 핵심적인 것으로 알려진 것들이다. 볼드체 잔기는 4Å에서 1638.49 Fab' 항체의 결합에 관여하는 잔기이다. 이탤릭체 잔기는 5Å에서 동일한 항체의 결합에 관여하는 것들이다.
4Å 보다 가까운 항체 잔기로 정의되는 에피토프는 A81, G83, G84, K85, G86, P87, N113, E115, W131, P132, E133, L135, A136, Q139였다.
5Å 보다 가까운 항체 잔기로 정의되는 에피토프는 A81, G83, G84, K85, G86, P87, N1 13, E115, W131, P132, E133, L135, A136, Q139, L82, Y88, L112, D130이었다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Biopharma SPRL <120> FcRn Antibody <130> G0191 <150> GB1320066.2 <151> 2013-11-13 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 2 Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn 1 5 10 15 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 3 Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 <400> 4 Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 <400> 5 Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 <400> 6 Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 VARIANT <400> 7 Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu 1 5 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat Ab 1638 VL region <400> 8 Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ile Ser Ile Glu Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat Ab 1638 VL region <400> 9 gacatcctga tgacacagtc tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactatctcc 60 atcgaatgtc gaacaagtga agacatttac actaatttag cgtggtacca gcagaagtca 120 gggaaatctc ctcaactcct gatctatgtt gcaaagacgt tgcaagatgg ggtcccatca 180 cggttcagtg gcagtggatc tggcacgcat tattctctca agatcagcgg catgcaacct 240 gaagatgaag gggattattt ctgtctgcag ggtttcaagt ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaactgaa a 321 <210> 10 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat Ab 1638 VL region with signal sequence underlined and italicised <400> 10 Met Asn Val Pro Thr Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr 1 5 10 15 Asp Gly Ile Cys Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Glu Thr Ile Ser Ile Glu Cys Arg Thr Ser Glu Asp 35 40 45 Ile Tyr Thr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Gln Leu Leu Ile Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Lys Ile Ser 85 90 95 Gly Met Gln Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Phe 100 105 110 Lys Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 11 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rat Ab 1638 VL region with signal sequence underlined and italicised <400> 11 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acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 660 gttgagccca aatcttgttc cggaggtggc ggttccggag gtggcggtac aggtggcggt 720 gggtccgaag tccagctgct tgaatccgga ggcggactcg tgcagcccgg aggcagtctt 780 cgcttgtcct gcgctgtatc tggaatcgac ctgagcaatt acgccatcaa ctgggtgaga 840 caggcacctg ggaaatgcct cgaatggatc ggcattatat gggctagtgg gacgaccttt 900 tatgctacat gggcgaaggg tagattcaca atctcacggg ataatagtaa gaacacagtg 960 tacctgcaga tgaactccct gcgagcagag gataccgccg tttactattg tgctcgcact 1020 gtcccaggtt atagcactgc accctacttt gatctgtggg ggcagggcac tctggtcacc 1080 gtctcgtcc 1089 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IGKV1-27 JK4 acceptor framework <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 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optimized for E. coli expression) <400> 56 gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60 attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca 120 ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggacgg tgtaccgtct 180 cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg 240 gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc 300 ggcacgaaag tggaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcac cagtaacaaa aagttttaat agaggggagt gt 642 <210> 57 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638 gL2 light chain (E. coli expression) <400> 57 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln 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tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg tgtactattg cgttcgcact 300 ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtcagggtac catggttacc 360 gtctcg 366 <210> 61 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638 gH2 V-region with signal sequence underlined and italicized (E. coli expression) <400> 61 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys 65 70 75 80 Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr 85 90 95 Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His 115 120 125 Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 130 135 140 <210> 62 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638 gH2 V-region with signal sequence underlined and italicized (E. coli expression) <400> 62 atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa 60 gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt 120 ctctcttgtg cattctccgg cttctctctg tctacctacg gcgttggtgt tggttgggta 180 cgtcaggctc caggtaaagg tctggaatgg ctcgcaaaca tctggtggga cgacgataaa 240 cgctacaacc cgtccctgga gaaccgcttc accattagca aagataccgc gaaaaactcc 300 gcgtatctcc agatgaactc cctgcgtgcc gaagacacgg ctgtgtacta ttgcgttcgc 360 actccggcgt actatggctc tcacccaccg tttgattact ggggtcaggg taccatggtt 420 accgtctcg 429 <210> 63 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638 gH2 Fab' heavy chain (V + human gamma-1 CH1 + hinge) <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ala Lys Asn Ser Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 225 230 <210> 64 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638 gH2 Fab' heavy chain (V + human gamma-1 CH1 + 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Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe 35 40 45 Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro 50 55 60 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys 65 70 75 80 Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr 85 90 95 Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 100 105 110 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His 115 120 125 Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 210 215 220 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 245 250 255 <210> 66 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638 gH2 Fab' heavy chain d (E. coli expression) <400> 66 atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa 60 gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt 120 ctctcttgtg cattctccgg cttctctctg tctacctacg gcgttggtgt tggttgggta 180 cgtcaggctc caggtaaagg tctggaatgg ctcgcaaaca tctggtggga cgacgataaa 240 cgctacaacc cgtccctgga gaaccgcttc accattagca aagataccgc gaaaaactcc 300 gcgtatctcc agatgaactc cctgcgtgcc gaagacacgg ctgtgtacta ttgcgttcgc 360 actccggcgt actatggctc tcacccaccg tttgattact ggggtcaggg taccatggtt 420 accgtctcga gcgcttctac aaagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 480 agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 600 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 660 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtcgacaag 720 aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcg ccgcg 765 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-termial sequence Heavy chain <400> 67 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence Light chain <400> 68 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human JH3 <400> 69 Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 1 5 10 15 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> part of CDR-H3 <400> 70 Asp Ala Phe Asp Val 1 5 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> JK4 sequence <400> 71 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 72 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human ?2-microglobulin <400> 72 Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 1 5 10 15 Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 20 25 30 Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 35 40 45 Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 50 55 60 Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 65 70 75 80 Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 85 90 95 Arg Asp Met <210> 73 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638gH33 IgG1 heavy chain (V + human gamma-1 constant) <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 74 <211> 1965 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1638gH33 IgG1 heavy chain (V + human gamma-1 constant, exons underlined) <400> 74 gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60 tcttgtgcag cgtccggctt ctctctgtct acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt 120 caggctccag gtaaaggtct ggaatggctc gcaaacatct ggtgggacga cgataaacgc 180 tacaacccgt ccctggagaa ccgcttcacc attagccgtg ataacgcgaa aaactccgcg 240 tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg tgtactattg cgcgcgcact 300 ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtcagggtac aatggttacc 360 gtctcgagcg cttctacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt cgacaagaaa 660 gttggtgaga ggccagcaca gggagggagg gtgtctgctg gaagccaggc tcagcgctcc 720 tgcctggacg catcccggct atgcagcccc agtccagggc agcaaggcag gccccgtctg 780 cctcttcacc cggaggcctc tgcccgcccc actcatgctc agggagaggg tcttctggct 840 ttttccccag gctctgggca ggcacaggct aggtgcccct aacccaggcc ctgcacacaa 900 aggggcaggt gctgggctca gacctgccaa gagccatatc cgggaggacc ctgcccctga 960 cctaagccca ccccaaaggc caaactctcc actccctcag ctcggacacc ttctctcctc 1020 ccagatctga gtaactccca atcttctctc tgcagagccc aaatcttgtg acaaaactca 1080 cacatgccca ccgtgcccag gtaagccagc ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga 1140 caggtgccct agagtagcct gcatccaggg acaggcccca gccgggtgct gacacgtcca 1200 cctccatctc ttcctcagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc 1260 caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1320 acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc 1380 ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg 1440 tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca 1500 acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt gggacccgtg 1560 gggtgcgagg gccacatgga cagaggccgg ctcggcccac cctctgccct gagagtgacc 1620 gctgtaccaa cctctgtccc tacagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1680 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1740 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1800 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1860 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1920 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa 1965

Claims (36)

  1. 가변 영역을 갖는 중쇄 또는 중쇄 단편을 포함하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 상기 가변 영역은 3개의 CDR을 포함하고, CDR H1은 서열번호 1로 제공되는 서열을 갖고, CDR H2는 서열번호 2로 제공되는 서열을 가지며, CDR H3은 서열번호 3으로 제공되는 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 항체 또는 결합 단편은 3개의 CDR을 포함하는 가변 영역을 갖는 경쇄 또는 이의 단편을 더 포함하고, 여기서 CDR L1은 서열번호 4로 제공되는 서열을 갖고, CDR L2는 서열번호 5 또는 서열번호 7로 제공되는 서열을 가지며, CDR L3은 서열번호 6으로 제공되는 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 12로 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 8로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체는 인간화된 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 25로 제공되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 16으로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열번호 59로 제공되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 51로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  7. 중쇄를 포함하는 인간 FcRn에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편으로서, 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 25로 제공되는 서열과의 동일성 또는 유사성이 80% 이상인 서열을 포함하고, 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 16으로 제공되는 서열과의 동일성 또는 유사성이 80% 이상인 서열을 포함하는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 항체 분자는 CDR-H1에 대해 서열번호 1로 제공되는 서열, CDR-H2에 대해 서열번호 2로 제공되는 서열, CDR-H3에 대해 서열번호 3으로 제공되는 서열, CDR-L1에 대해 서열번호 4로 제공되는 서열, CDR-L2에 대해 서열번호 5 또는 서열번호 7로 제공되는 서열 및 CDR-L3에 대해 서열번호 6으로 제공되는 서열을 갖는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 결합 단편은 scFv, Fv, Fab 또는 Fab' 단편인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 서열번호 33으로 제공되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 항-FcRn 항체 또는 Fab' 단편.
  11. 제6항에 있어서, 서열번호 63으로 제공되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 55로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 항-FcRn 항체 또는 Fab' 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 결합 단편은, 예를 들어 전분, 알부민 및 폴리에틸렌 글리콜에서 선택된, 중합체에 접합되는 것인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 중합체는, 예를 들어 5 ∼ 50 kDa 범위의 분자량을 갖는, PEG인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 전장 항체인 항-FcRn 항체.
  15. 제14항에 있어서, 전장 항체는 IgG1, IgG4 및 IgG4P로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항-FcRn 항체.
  16. 제5항, 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 37, 서열번호 39 또는 서열번호 73으로 제공되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 20으로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 것인 항-FcRn 항체.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 결합 단편은 서열번호 42로 제공되는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 40으로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 Fab-dsFv인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  18. 제5항, 제10항 및 제16항 중 어느 한 항의 항체와 동일한 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  19. 인간 FcRn 세포외 도메인(서열번호 48)의, 잔기 E115, W131, P132 및 E133으로 이루어진 군에서 선택된 1, 2, 3 또는 4 개의 아미노산, 및 A81, G83, G84, K85, G86, P87, N113, L135, A136 및 Q139로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 잔기를 포함하는 인간 FcRn의 에피토프에 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, L82, Y88, L112 및 D130으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 잔기에 더 결합하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 FcRn에 대한 제5항의 항체의 결합을 교차 차단(cross-blocking)하거나, 또는 제5항의 항체에 의한 인간 FcRn에 대한 결합으로부터 교차 차단되는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화되거나 또는 완전 인간형인 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, pH 6 및 pH 7.4 둘 다에서 인간 FcRn에 대한 결합 친화성 150 pM 이하를 갖는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 FcRn에 대한 인간 IgG의 결합을 차단하는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 β2 마이크로글로불린(서열번호 72)에 결합하지 않는 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 단리된 DNA 서열.
  27. 제26항에 따른 1 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 벡터는 (i) 서열번호 30, 32, 34 또는 36으로 제공되는 서열 및 서열번호 21 또는 24로 제공되는 서열, 또는 (ii) 서열번호 38로 제공되는 서열 및 서열번호 22로 제공되는 서열, 또는 (iii) 서열번호 74로 제공되는 서열 및 서열번호 22로 제공되는 서열, 또는 (iv) 서열번호 41로 제공되는 서열 및 서열번호 43으로 제공되는 서열을 포함하는 것인 벡터.
  29. 제27항 또는 제28항에 따른 1 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  30. 인간 FcRn에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 제조 방법으로서, 제29항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 그 항체를 단리하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  31. 약학적 허용 부형제, 희석제 또는 담체 중 1 이상과 조합하여 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에서 정의된 항-FcRn 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 약학 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 다른 활성 성분을 포함하는 약학 조성물.
  33. 요법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 제31항 또는 제32항에 정의된 조성물.
  34. 자가면역 질환, 예컨대 중증 근무력증, 심상성 천포창, 시신경 척수염, 길랭-바레 증후군, 루푸스, 특발성 혈소판 감소성 자반증 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 제31항 또는 제32항에 정의된 조성물.
  35. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 제31항 또는 제32항에 정의된 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서, 치료는 자가면역 질환, 예컨대 중증 근무력증, 심상성 천포창, 시신경 척수염, 길랭-바레 증후군, 루푸스, 특발성 혈소판 감소성 자반증 및 혈전성 혈소판 감소성 자반증을 위한 것인 치료 방법.
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