KR20160091602A - 신속한 베타-락탐계 항생제 내성 정량 분석법 및 이를 이용한 내성 평가 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신속한 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법에 관한 것이다.
현재 항생제 내성 평가 및 모니터링하는 방법은 항생제 감수성 테스트 중 최소억제농도(MIC)를 주로 이용한다. 상기 MIC는 단계적으로 희석된 농도별로 항생제를 첨가한 배지에 세균을 배양하여 세균의 증식 여부를 육안 등으로 판단해 증식억제 농도로 항생제 내성을 평가하는 방법이다.
상기 방법은 비교적 간단하지만, 내성 판정을 위해 최소 18~24 시간이 소요된다. 또한 육안으로 세균의 증식 여부를 판단하기 때문에, 정확한 내성도 측정 및 실험자간 오차가 많이 존재하는 단점이 있다.
또한, 항생제 내성 미생물에 의해 형성된 색상 변화를 이용하여 시험 시료 중에서의 미생물의 항생제에 대한 내성을 분석하는 방법이 개시되어 있으나 (한국공개특허 제10-1989-0010212호), 이는 정성적인 방법에 불과하여 항생제 내성을 정량적으로 분석하기에는 한계가 있다.
최근 국제 항생제내성학회, 세계질량분석학회 및 전문저널 등에 분석기기를 이용한 항생제 내성측정에 관련된 내용이 소개되고 있다. MALDI-TOF를 이용한 세균의 분리동정은 이미 상용화되었으며, 최근에는 항생제 내성을 측정하는 방법도 보고되고 있다.
이는 분석 기기를 이용하여 항생제 내성을 측정할 경우, 비교적 빠른 시간내에 결과를 확인할 수 있고, 고내성, 저내성 등 내성도의 크기를 분석할 수 있는 장점이 있기 때문이다.
상기 분석 기기를 이용하여 항생제 내성을 측정하는 방법에 대해서는 외국 저널(J. Clin. Microbiol. 2012, 50(5):1727. DOI:10.1128/JCM.00047-12)에 소개된바 있으나, 이는 항생제 및 내성균에 의해 가수분해된 항생제, 예컨대 페니실로산(penicilloic acid)에 대한 정량을 하지 않고, 단순히 LC-MS/MS 반응 크기로 내성을 평가하였는데, 이럴 경우 세균수, 항생제 농도, 특히 LC-MS/MS 기기에 따라 내성 평가값이 달라질 수 있는 문제점이 있다.
따라서, 좀 더 간편한 방법으로 국내 사용량, 잔류 위반율 및 내성 보고율이 높은 베타-락탐계 항생제 및 비활성화된 항생제를 동시에 정량 분석하여 내성을 측정하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 수행하여, 베타-락탐계 항생제에 내성을 나타내는 세균의 주요 메카니즘인 ß베타-락타메이즈(ß-lactamase)의 작용으로 비활성화된 항생제의 농도를 LC-MS/MS로 측정하여 베타-락탐계 항생제의 내성을 분석할 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 항생제 감수성 테스트인 MIC 등 종래의의 바이오 어세이(bioassay)법의 결과 판정의 모호함을 개선하고, 소요 시간(18~24시간)을 단축시키고자, 정밀 정량 분석기기인 LC-MS/MS를 이용한 ß-lactam계 항생제 내성의 측정방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 분석한 베타-락탐계 항생제 내성의 농도를 이용하여 종래의의 내성 평가법과 완벽히 상관 관계가 있는 내성 평가의 지표로 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, (a) 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분석한 베타-락탐계 항생제 내성의 농도를 베타-락탐계 항생제 내성 지표(antibiotic resistant index; ARI)로 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 정량 분석기기인 LC-MS/MS를 사용하여 베타-락탐계 내성 유도체를 측정함으로써, 항생제 내성을 정량화 할 수 있으며, 간단한 전처리법으로 2시간 이내로 내성을 측정할 수 있다.
또한, LC-MS/MS의 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring; MRM)을 이용하여 여러 가지 베타-락탐계 항생제의 내성 유무를 단 한 번의 분석(one single run)으로 판정할 수 있다.
한편, 종래의 항생제 내성 평가법과 완벽하게 상관 관계가 있는 항생제 내성 평가 지표(ARI)를 이용하여 세균별 내성의 순위를 평가할 수 있다.
도 1은 베타-락탐계 항생제 내성의 주요 기전인 베타-락타메이즈의 작용 원리를 나타낸 것이다.
도 2는 LC-MS/MS 분석을 위한 빠르고 간편한 전처리법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 베타-락탐계 항생제 내성을 분석하기 위한 액체크로마토그래피(LC)의 이동상(mobile phase) 및 매스 스펙트로미터/매스 스펙트로미터(MS/MS)의 분석 조건, 액체크로마토그래피(LC) 이동상의 농도구배(샘플당 10분) 조건 및 매스 크로마토그래피(mass chromatography)의 조건으로서, 다중 반응 검지법(MRM)의 조건을 나타낸 것이다.
도 4는 페니실린계 항생제인 페니실린(penicillin) G, 앰피실린(ampilcillin) 및 아목시실린(amoxicillin)과, 페니실린 G의 페니실로산, 앰피실린의 페니실로산 및 아목시실린의 페니실로산의 LC-MC/MC 동시다제 분석조건 및 LC-MS/MS 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5는 감수성(susceptible) 균주 및 내성(resistant) 균주의 항생제 내성 LC-MC/MC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 상기 항생제 내성 분석법 및 내성 지표를 이용하여 국내 농장에서 분리된 야외분리 균주의 항생제 내성 평가 및 종래의의 MIC 법과의 상관관계를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 LC-MS/MS 분석을 위한 빠르고 간편한 전처리법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 베타-락탐계 항생제 내성을 분석하기 위한 액체크로마토그래피(LC)의 이동상(mobile phase) 및 매스 스펙트로미터/매스 스펙트로미터(MS/MS)의 분석 조건, 액체크로마토그래피(LC) 이동상의 농도구배(샘플당 10분) 조건 및 매스 크로마토그래피(mass chromatography)의 조건으로서, 다중 반응 검지법(MRM)의 조건을 나타낸 것이다.
도 4는 페니실린계 항생제인 페니실린(penicillin) G, 앰피실린(ampilcillin) 및 아목시실린(amoxicillin)과, 페니실린 G의 페니실로산, 앰피실린의 페니실로산 및 아목시실린의 페니실로산의 LC-MC/MC 동시다제 분석조건 및 LC-MS/MS 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5는 감수성(susceptible) 균주 및 내성(resistant) 균주의 항생제 내성 LC-MC/MC 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 상기 항생제 내성 분석법 및 내성 지표를 이용하여 국내 농장에서 분리된 야외분리 균주의 항생제 내성 평가 및 종래의의 MIC 법과의 상관관계를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 (a) 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계, 및 (b) 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법에 관한 것이다.
베타-락탐계 항생제중 페니실린계(penicillin G, ampicillin, amoxicillin 등)는 가장 오래 사용되고 있으며, 현재까지도 국내에서 테트라싸이클린계 다음으로 많이 판매되고 있다 (국내 동물용항생제 판매량, 한국동물약품협회, 2013).
또한, 잔류 위반율 및 내성 발생율이 가장 높은 편이다 (국가잔류물질검사프로그램, 농림축산검역본부, 2013 및 항생제 사용 및 내성 모니터링, 농림축산검역본부, 2013).
이러한 페니실린계 항생제에 대한 내성의 발생은 Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Salmonella typhimurium 세균에서 주로 보고되고 있으며, 이들의 주요 내성 기전은 베타-락타메이즈(ß-lactamase)의 생성으로 인한 항생제의 비활성화이다.
도 1은 베타-락탐계 항생제 내성의 주요 기전인 베타-락타메이즈의 작용 원리, 즉 상기 베타-락탐계 중에서 페니실린계 주요 항생제인 페니실린 G, 앰피실린 및 아목시실린 구조와 내성 유도체인 베타-락타메이즈가 베타-락탐 구조를 가수분해하는 기전을 나타낸 것이다.
도 1에서 보는 바와 같이, 베타-락타메이즈는 항생제에 노출되었을 경우 이들 세균이 생성하는 효소로 항생제의 베타-락탐 고리(ß-lactam ring)를 파괴시켜 해당 항생제를 무력화시키는데, 이 과정에서 물분자(H2O)가 붙고, 이로 인해 항생제의 분자량이 18 amu 정도 늘어나게 된다.
본 발명에 의한 상기 분석방법은 이상기와 같은 원리를 이용하여 LC-MS/MS로 노출된 항생제 및 비활성화된 항생제의 농도를 측정함으로써, 항생제에 대한 내성을 분석할 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 배양은 사용한 각각의 균주 특성에 따라 공지의 방법에 의해 배양하는 것으로 족하므로, 상기 배양 방법에 대한 성세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 베양은 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 균수가 108 cfu/mL 내지 109 cfu/mL가 되도록 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계, 예컨대 페니실린계 항생제 10 ppm에 37℃의 온도에서 90분간 노출시킬 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 여과는 0.2㎛의 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 필터, 예컨대 폴리비닐리덴디플루오라이드 시린지리스 필터(PVDF syringeless filter)를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제는 베타-락타메이즈에 의해 베타-락탐 링이 파괴되어 항생 작용을 상실하는 항생제라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제는 페니실린계 항생제 또는 세팔로스포린계 항생제일 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 페니실린계 항생제로는 페니실린 G, 앰피실린, 아목시실린 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 세팔로스포린계 항생제로는 세프티오퍼, 세팔렉신, 세포퀴놈 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 균주는 베타락타메이즈를 생성하여 항생제를 무력화시킬 수 세균이라면 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 균주의 예로는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에쉐리치아 콜라이(Escherichia coli), 살로넬라 타이피무이움(Salmonella typhimurium) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 액체크로마토그래피의 이동상은, 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴로 구성되고, 상기 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수 25~90 중량% 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴 10~75 중량%로 구성될 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 액체크로마토그래피의 이동상의 조건은, 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수(A) 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴(B)로 구성되고, 상기 (A)와 (B)의 중량% 비율이 9분까지는 90:10 내지 40:60이고, 15분까지는 25:75이며, 15.1분까지 90:10이고, 20분까지는 90:10일 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring)의 조건은, 전구체 이온(precursor ion)에 대한 상기 베타-락탐계 항생제의 질량이 335.3 내지 384 m/z이고, 정량 이온(quantification ion)에 대한 상기 베타-락탐계 항생제의 질량이 106 내지 189 m/z이며, 확인 이온(confirmation ion)에 대한 상기 베타-락탐계 항생제의 질량이 160 내지 323 m/z일 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 모니터링법(MRM, multiple reaction monitoring)의 조건은 베타-락탐계 항생제의 전구 이온(precursor ion)의 분자량이 페니실린 G는 335.3이고, 페니실로산-페니실린G는 353.4이며, 앰피실린은 350.2이고, 페니실로산-앰피실린은 368.4이며, 아목시실린은 366.2이고, 페니실로산-아목시실린은 384.0 m/z일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 모니터링법(MRM, multiple reaction monitoring)의 조건은 정량 이온(quantification ion)의 분자량이 페니실린 G는 176이고, 페니실로산-페니실린G는 174이며, 앰피실린은 106이고, 페니실로산-앰피실린은 106이며, 아목시실린은 114이고, 페니실로산-아목시실린은189 m/z일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 모니터링법(MRM, multiple reaction monitoring)의 조건은 정성 이온(confirmation ion)의 분자량이 분자량이 페니실린 G는 160이고, 페니실로산-페니실린G는 309이며, 앰피실린은 160이고, 페니실로산-앰피실린은 309이며, 아목시실린은 349이고, 페니실로산-아목시실린은 323 m/z일 수 있다.
본 발명의 상기 분석방법에 있어서, 단위 “m/z”은 “질량/이온”을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 분석한 베타-락탐계 항생제의 농도를 이용하여 베타-락탐계 항생제의 내성 지표로 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 베타-락탐계 항생제의 내성 지표로 이용하는 방법에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제는 페니실린계 항생제 또는 세팔로스포린계 항생제일 수 있다.
본 발명의 상기 베타-락탐계 항생제의 내성 지표로 이용하는 방법은 상기 페니실린계 항생제의 노출 농도와 내성균에 의해 변화된 항생제인 페니실로산의 농도의 비로 내성의 경중을 평가하는 것일 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
<
실시예
1> 항생제 내성
LC
-
MS
/
MS
측정을 위한 전처리법 개발
도 2는 LC-MS/MS 분석을 위한 빠르고 간편한 전처리법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2에서 보는 바와 같이, 분석을 위한 전처리법은 각각의 세균 특성에 맞게 배양한 후, 상기 배양된 균주를 페니실린계 항생제(페니실린 G, 앰피실린 및 아목시실린) 10 ppm에 37°C의 온도에서 90분간 노출시켰다. 이때, 상기 배양된 각 균주의 균수는 약 109 cfu/mL이었다.
그 후, 0.2 PVDF syringeless filter로 여과하여 분석하였다.
상기 전처리법을 이용하면 항생제 내성 측정 시간은 세균배양 후 최대 2시간이 소요되며, 종래의의 MIC 등 바이오 어세이에 비해 최대 16~22 시간이 단축된다.
<
실시예
2> 페니실린계 항생제 및
페니실로산
폼의
LC
-
MS
/
MS
동시다제분석
조건 및
크로마토그램
페니실린 G, 앰피실린 및 아목시실린의 표준품(Sigma aldrich에서 구매) 및 베타-락타메이즈에 의한 가수분해된 페니실린 G의 페노실로산(penicilloic acid of penicillin), 앰피실린의 페노실로산(penicilloic acid of ampicillin) 및 아목시실린의 페노실로산(penicilloic acid of amoxicillin)의 표준품(LGC Standards)을 구매하여 LC-MS/MS를 이용한 최적의 LC 및 mass 조건을 개발하였다(도 3 및 도 4 참조).
이때, 사용된 분석 기기는 Waters사의 micromass 모델 기준으로 LC 및 MRM(multiple reaction monitoring) 분석 조건을 확립하였다.
LC 조건을 위한 이동상은 0.1% 포름산이 함유된 증류수와 아세토니트릴을 사용하였으며, 샘플당 20분의 구배(gradient) 조건으로 개발하였다.
컬럼은 본 실험에서 분리능이 우수하다고 판단되는 YMC사의 Triart C18(2.0x50 mm, 3)를 사용하였다. 검출기(detector)인 mass로 분석하기 위해 6개의 물질 각각의 전구체 이온 1개 및 프로덕트(product) 이온 2개씩을 찾는 등의 MRM 조건을 확립하였다(도 3 참조).
도 4는 페니실린계 항생제인 페니실린 G, 앰피실린 및 아목시실린과, 상기 페니실린 G의 페니실로산, 앰피실린의 페니실로산 및 아목시실린의 페니실로산의 LC-MC/MC 동시다제 분석조건 및 LC-MS/MS 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
<
실시예
3>
LC
-
MS
/
MS
를 이용한 항생제 내성 분석
페니실린 G에 내성이 보고된 Staphylococcus aureus 야외 균주 및 감수성 균주(negative control strain), 앰피실린 내성인 Escherichia coli 야외 균주 및 감수성 균주, 아목시실린 내성 야외 균주 Salmonella typhimurium 및 감수성 균주의 항생제 내성을 LC-MS/MS로 측정한 크로미터그램을 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, Staphylococcus aureus 균주의 페니실린 G 항생제 내성을 분석한 결과, 감수성 균주에서는 노출된 페니실린 G가 측정되었으나, 페노실로산은 거의 측정되지 않았다.
그러나, 내성 균주에서는 노출된 페니실린 G가 측정되지 않고 페노실로산만 측정되었다. Escherichia coli 균주에 대한 앰피실린 및 Salmonella typhimurium에 대한 아목시실린 항생제 내성 또한 도 5에 나타낸 바와 같은 결과를 나타내었다.
<
실시예
4> 항생제 내성 지표(
ARI
)의 개발
베타-락탐계 항생제중 페니실린계 항생제(penicillin G, ampicillin 및 amoxicillin) 내성을 LC-MS/MS로 측정해 보면, 항생제 감수성 균주일수록 노출된 항생제가 높게 측정되며 ß-lactamase에 의해 가수분해된 페노실로산 형태의 항생제는 낮게 측정된다. 이를 바탕으로 하기 수학식 1과 같은 항생제 내성도를 평가할 수 있는 새로운 내성 평가 지표를 개발하였다.
상기 식 1과 같은 항생제 내성 지표(ARI)로 평가할 경우, 균주에 따른 항생제 내성의 정도 증 내성도를 평가할 수 있는 장점이 있다. 종래의의 MIC 등과 같은 방법은 내성의 유무에 초점이 맞춰져 있으나, 본 발명의 상기 ARI 평가법을 이용하면 감수성에서 고내성까지 내성의 정도를 수치화하여 순위를 평가할 수 있다.
<
실시예
5> 항생제 내성 분석방법 및 종래의 분석방법의 비교
농림축산검역본부에서 국내 농장에서 분리된 도 6에 기재되어 있는 바와 같은 야외균주 23종을 분양받아, 항생제 내성을 평가하는 MIC법으로 감수성 및 내성유무를 판별한 결과, Staphylococcus aureus 8종 중에서, 4종이 페니실린 G 감수성 이었고, 4종이 페니실린 G 내성을 보였다.
또한, Escherichia coli 7종 중에서, 5종이 앰피실린 감수성, 2종이 앰피실린 내성을 보였고, Salmonella typhimurium 8종 중에서, 5종이 아목시실린 감수성, 3종이 아목시실린 내성을 보이는 것으로 판정되었다 (CLSI break point로 판정).
한편, 상기 실시예 1 내지 실시예 3에 의한 분석방법을 이용하여 상기 23종의 균주들에 대한 항생제 내성 및 상기 실시예 4에 의한 내성 지표로 평가한 결과, 감수성으로 판정된 Staphylococcus aureus, Escherichia coli 및 Salmonella typhimurium 14종 모두 ARI 1 이하로 나타났으며, 9종의 내성 균주들은 모두 1 이상으로 평가되었다(도 6 참조).
상기에서, ARI 1은 노출된 항생제의 농도와 페노실로산의 농도가 같아지는 지점으로 이론적인 내성 브레이크 포인트(break point)로 생각할 수 있기 때문에, ARI가 1 이하인 경우는 감수성, ARI가 1 이상인 경우는 내성으로 평가했을 때, 현재 사용되고 있는 MIC 방법의 내성 평가 결과와 100% 일치하였다.
또한, 도 6에서와 같이, Salmonella typhimurium 중 아목시실린의 내성도가 가장 높은 균주는 Salmonella typhimurium 202 이고, 가장 내성도가 낮은(감수성)은 Salmonella typhimurium V05-13-A03-001-009 이었다,
이와 같이, 본 발명에 의한 항생제 내성 분석방법 및 항생제 내성 지표(ARI)를 이용하며, 미지의 균주에 대한 감수성 혹은 내성 판정을 할 수 있고, 또는 감수성 및 내성 정도의 순위를 정할 수 있다.
이상에서 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 많은 변형이 가능함은 자명할 것이다.
본 발명의 LC-MS/MS를 이용한 베타-락탐계 항생제 내성 정량 분석법 및 내성지표를 이용한 내성 평가법은 빠르고 정확하게 내성의 유무 및 정도를 판정할 수 있기 때문에, 대규모 모니터링 사업 등에 유용하게 사용될 수 있다.
실제로 민관 검사기관 대부분이 LC-MS/MS를 보유하고 있어, 단시간에 수많은 데이터를 생산이 가능하다. 그리고 베타-락탐계 항생제 내성 생성에 대한 카키네틱(kinetic) 연구 등이 가능하기 때문에, 내성 연구에 기초 자료로 활용될 수 있다.
Claims (12)
- (a). 베타-락탐계 항생제에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 배양한 후, 상기 배양된 균주를 페니실린계 항생제에 노출시킨 다음, 여과하는 단계를 포함하는 전처리 단계; 및
(b). 액체크로마토그래피(LC)에 두 개의 매스 스펙트로미터(MS)가 연결되어 되어 있는 LC-MS/MS를 이용하여 상기 전처리된 균주의 베타-락탐계 항생제에 대한 내성을 측정하는 단계를 포함하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법. - 제1항에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제 10 ppm에 내성인 균주 및 상기 항생제에 감수성인 균주를 균수가 109 cfu/mL이 되도록 배양하는 것을 특징으로 하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배양된 균주를 베타-락탐계 항생제 10 ppm에 37℃의 온도에서 90분간 노출시키는 것을 특징으로 하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 여과는 0.2㎛의 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 시린지리스 필터(0.2㎛ PVDF syringeless filter)를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제는 페니실린계 항생제 또는 세팔로스포린계 항생제인 것을 특징으로 하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법.
- 제5항에 있어서, 상기 페니실린계 항생제는 페니실린 G, 앰피실린, 및 아목시실린으로 이루어진 군에서 선택되고, 상기 세팔로스포린계 항생제는 세프티오퍼, 세팔렉신 및 세포퀴놈으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에쉐리치아 콜라이(Escherichia coli) 및 살로넬라 타이피무이움(Salmonella typhimurium)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피의 이동상의 조건은, 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 증류수(A) 및 0.1%(w/w)의 포름산이 함유된 아세토니트릴(B)로 구성되고, 상기 (A)와 (B)의 중량% 비율이 9분까지는 90:10 내지 40:60이고, 15분까지는 25:75이며, 15.1분까지 90:10이고, 20분까지는 90:10인 것을 특징하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법.
- 제1항에 있어서, 상기 매스 스펙트로미터 분석을 위한 다중 반응 모니터링법(MRM, multiple reaction monitoring)의 조건은,
베타-락탐계 항생제의 전구 이온(precursor ion)의 분자량이 페니실린 G는 335.3이고, 페니실로산-페니실린G는 353.4이며, 앰피실린은 350.2이고, 페니실로산-앰피실린은 368.4이며, 아목시실린은 366.2이고, 페니실로산-아목시실린은 384.0 m/z이며,
정량 이온(quantification ion)의 분자량이 페니실린 G는 176이고, 페니실로산-페니실린G는 174이며, 앰피실린은 106이고, 페니실로산-앰피실린은 106이며, 아목시실린은 114이고, 페니실로산-아목시실린은189 m/z이며,
정성 이온(confirmation ion)의 분자량이 분자량이 페니실린 G는 160이고, 페니실로산-페니실린G는 309이며, 앰피실린은 160이고, 페니실로산-앰피실린은 309이며, 아목시실린은 349이고, 페니실로산-아목시실린은 323 m/z인 것을 특징으로 하는 베타-락탐계 항생제 내성의 분석방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분석한 베타-락탐계 항생제의 농도를 이용하여 베타-락탐계 항생제의 내성 지표로 이용하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 베타-락탐계 항생제가 페니실린계 항생제 또는 세팔로스포린계 항생제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 페니실린계 항생제의 노출 농도와 내성균에 의해 변화된 항생제인 페니실로산의 농도의 비로 내성의 경중을 평가하는 것을 특징으로 하는 방법.
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