KR20160094848A - 이미노당을 사용한 당지질 억제 - Google Patents

이미노당을 사용한 당지질 억제 Download PDF

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KR20160094848A
KR20160094848A KR1020157033398A KR20157033398A KR20160094848A KR 20160094848 A KR20160094848 A KR 20160094848A KR 1020157033398 A KR1020157033398 A KR 1020157033398A KR 20157033398 A KR20157033398 A KR 20157033398A KR 20160094848 A KR20160094848 A KR 20160094848A
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피터 라잉
레이몬드 에이. 드웨크
스테파니 폴로크
니콜 지츠만
테리 버터스
도미니크 앨론지
존 키아페스
어번 램스테트
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더 챈슬러 마스터즈 앤드 스칼라스 오브 더 유니버시티 오브 옥스포드
유니터 바이롤로지, 엘엘씨
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Abstract

본원은 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제에 대한 높은 활성 및 특이성을 갖는 이미노당을 제공한다.
[대표도]
도 1a, 도 1b

Description

이미노당을 사용한 당지질 억제{GLYCOLIPID INHIBITION USING IMINOSUGARS}
관련 출원에 대한 교차-참조
본원은 2013년 5월 2일자로 출원된 미국 가출원 제61/818,621호 및 2014년 1월 21일자로 출원된 미국 가출원 제61/929,704호를 우선권주장으로 하며, 이들 출원의 내용은 본 개시내용에 그 전문이 참조로 포함된다.
분야
본원은 이미노당 및 그의 당지질 억제제로서의 용도뿐 아니라, 당지질 억제가 이점을 제공하는 상태 및 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
한 실시양태는 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소 방법이다.
또 다른 실시양태는 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소 방법이다:
<화학식 I>
Figure pct00001
(상기 화학식에서, R은
Figure pct00002
이며, R1은 치환 또는 비치환된 알킬 기이고; W1-4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기이고; X1 -5는 H, NO2, N3 또는 NH2로부터 독립적으로 선택되고; Y는 존재하지 않거나 또는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기이고; Z는 결합 또는 NH로부터 선택되며,
단 Z가 결합인 경우, Y는 존재하지 않고,
단 Z가 NH인 경우, Y는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기임).
또 다른 실시양태는 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소 방법이다:
<화학식 II>
Figure pct00003
(상기 화학식에서, R은
Figure pct00004
이며, R'는 치환 또는 비치환된 알킬 기이고; W1-4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고; X1 -5는 H, NO2, 할로겐, 알킬 또는 할로겐화 알킬로부터 독립적으로 선택됨).
또 다른 실시양태는 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 화학식
Figure pct00005
의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소 방법이다.
그리고, 또 다른 실시양태는 당지질을 생성할 수 있는 세포를 당지질 억제 유효량의 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 처리하는 것을 포함하는, 상기 세포에서의 당지질 생합성의 억제 방법이다.
또 다른 실시양태는 당지질을 생성할 수 있는 세포를 당지질 억제 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 처리하는 것을 포함하는, 상기 세포에서의 당지질 생합성의 억제 방법이다:
<화학식 I>
Figure pct00006
(상기 화학식에서, R은
Figure pct00007
이며, R1은 치환 또는 비치환된 알킬 기이고; W1-4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고; X1 -5는 H, NO2, N3 또는 NH2로부터 독립적으로 선택되고; Y는 존재하지 않거나 또는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기이고; Z는 결합 또는 NH로부터 선택되며, 단 Z가 결합인 경우, Y는 존재하지 않고, 단 Z가 NH인 경우, Y는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기임).
또 다른 실시양태는 당지질을 생성할 수 있는 세포를 당지질 억제 유효량의 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 처리하는 것을 포함하는, 상기 세포에서의 당지질 생합성의 억제 방법이다:
<화학식 II>
Figure pct00008
(상기 화학식에서, R은
Figure pct00009
이고, R'는 치환 또는 비치환된 알킬 기이고; W1-4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고; X1 -5는 H, NO2, 할로겐, 알킬 또는 할로겐화 알킬로부터 독립적으로 선택됨).
또 다른 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물이다:
<화학식 II>
Figure pct00010
(상기 화학식에서, R은
Figure pct00011
이고, R'는 치환 또는 비치환된 알킬 기이고; W1-4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고; X1 -5는 H, NO2, 할로겐, 알킬 또는 할로겐화 알킬로부터 독립적으로 선택됨).
도 1a-b는 NB-DNJ (도 1a) 및 UV-4 (도 1b)에 대한 HL60 세포에서의 GM3 합성의 투여량 반응 억제의 힐(Hill) 플롯을 도시한다. 세포의 화합물 투여 후, GSL을 추출하고, 올리고당이 분해되며, 2-AA로 표지하고, NP-HPLC에 의하여 분리하였다. GM3으로부터 유래하는 올리고당의 피크 면적을 정량화하고, 미처치 세포에 대하여 나타냈다. 4개의 파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 IC50 값을 계산하였다.
도 2는 기질 감소 치료법 (SRT)의 세포성 표적을 도시한다.
리소솜 축적 장애 (LSD)의 치료로서 글루코- 및 갈락토-입체화학의 N-알킬화 이미노 당에 의한 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT) 억제. 우리딘 디포스페이트 글루코스 (UDP-글루코스) 세라미드 글루코실트랜스퍼라제는 글리코스핑고지질 생합성에서 제1의 글리코실화 단계를 촉매화한다. 생성물인 글루코실세라미드는 300개 초과의 GSL의 핵심 구조이다. 도 2가 N-알킬 이미노당을 언급하기는 하였으나, 도 2에 예시된 기전은 N-알킬 이미노당뿐 아니라, 기타 N-치환된 이미노당, 도 3 및 도 12에 제시된 이미노당을 적용할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
도 3은 실험에 사용된 이미노당의 화학식을 제공한다.
도 4는 HL60 세포의 GSL 프로파일을 도시한다. HL60 세포를 72 시간 동안 다양한 농도의 이미노당으로 처리하였다. 지질을 HL60 세포 펠릿으로부터 추출하고, 2AA 및 NP-HPLC 분석으로 표지하여 특징화하였다. GSL 표준 배출은 효소 배출 및 형광 표지에 대한 양성 대조군이다. GM3 수준은 IC50 계산을 위하여 측정되었다.
도 5는 GM3 세포성 감소 검정으로부터의 대표적인 힐 플롯을 도시한다.
GM3 피크 면적의 측정은 GSL 생합성의 억제를 측정하는데 사용하였다. 실험은 3회 실시하였으며, 에러 바아는 표준 편차를 나타낸다.
도 6a-b는 시험관내 β-글루코세레브로시다제 검정으로부터 대표적인 힐 플롯을 도시한다.
인간 태반 β-글루코세레브로시다제 억제의 측정. 실험을 3회 실시하였으며, 에러 바아는 표준 편차를 나타낸다.
도 7a-b는 샤페론 처리시 효소 향상을 나타내는 데이타를 제공한다.
고셔 N370S 섬유모세포를 10 μM 이하의 이미노 당의 비-세포독성 수준으로 3 일 동안 처치한 후 수거하고, 미처치 돌연변이 섬유모세포와 비교한 효소 수준을 검정한다.
도 8은 UV 6.2를 생성하기 위한 합성 반응식을 제공한다.
도 9는 UV 6.4를 생성하기 위한 합성 반응식을 제공한다.
도 10은 UV 6.8를 생성하기 위한 합성 반응식을 제공한다.
도 11은 ToP-DNJ에 대한 HL60 세포에서의 GM3 합성의 투여량 반응 억제의 힐 플롯을 도시한다. 도 11에서의 데이타를 얻기 위한 방법은 도 1 및 5에 대하여서와 동일하였다.
도 12는 ToP-DNJ에 대한 화학식을 제공한다.
도 13은 ToP-DNJ가 사실상 ER 글루코시다제 억제 활성이 없는 것으로 입증된 UV-4 및 ToP-DNJ에 대한 유리 올리고당 분석 (ER 알파 글루코시다제 억제의 측정)에 대한 결과를 제공한다. 유리 글루코실 올리고당은 (Alonzi et al., Biochem . J. (2008) 409, 571-580)에 의하여 측정하였다.
도 14는 ToP-DNJ의 10 μM 농도에서 이러한 경로의 거의 완전한 억제를 나타내는, 인간 간암 세포에서 세포성 글루코실세라미드 및 그의 하류 생성물인 락토실세라미드 (강글리오시드 생합성에서 중간체)에 대한 ToP-DNJ의 효과를 도시한다. 글리코스핑고지질 (GlcCer 및 LacCer 포함)은 (Wolf, C. and Quinn, P.J. Progress in lipid research (2008) 47, 15-36)에 의하여 측정하였다. 간략하게는, 세포성 지질의 클로로포름-메탄올 추출물을 HPLC로 처리하여 글리코스핑고지질 종을 기타 세포성 지질로부터 분리한 후, 내부 표준물질을 사용한 2-차원 질량 분석법으로 처리하여 특정한 글리코스핑고지질 종을 정량화하였다.
반대 의미로 명시하지 않는다면, "단수 형태"는 "1개 이상"을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "GCS"는 또한 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 EC 2.4.1.80으로서 또는 UDP-글루코스-세라미드 글루코실트랜스퍼라제 또는 글루코실세라미드 신타제로서 공지된 세라미드 글루코실트랜스퍼라제를 의미한다.
용어 "질환" 또는 "상태"는 대개는 병리학적 상태 또는 기능으로서 간주되며, 그 자체가 특정한 징후, 증상 및/또는 기능부전의 형태로 나타날 수 있는 장애 및/또는 이상을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 질환 또는 상태 및/또는 그와 관련된 증상의 제거, 감소 또는 개선을 지칭한다. 질환 또는 상태를 배제시키지는 않더라도 이를 치료한다는 것은 이와 관련된 질환, 상태 또는 증상을 완전하게 제거하는 것을 요구하지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료" 등은 질환 또는 상태를 갖고 있지는 않지만, 그의 재발생 또는 그의 재발의 우려가 있거나 또는 이에 민감한 대상체에서 질환 또는 상태의 재발생 또는 이미 사전에-조절된 질환 또는 상태의 재발의 가능성이 감소된 것을 지칭하는 "예방적 치료"를 포함할 수 있다. 용어 "치료하다" 및 동의어는 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 고려한다. 상기 대상체는 온혈 동물, 예컨대 포유동물일 수 있다. 다수의 실시양태에서, 대상체는 인간일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효 투여량"은 치료를 필요로 하는 개체에게 관심 상태 또는 질환의 치료를 위하여 본 발명의 방법에 의하여 투여시 활성제(들), 예컨대 이미노당을 효율적으로 전달하기에 충분한 활성제(들), 예컨대 이미노당의 양을 지칭한다. 리소솜 축적 장애의 경우, 치료적 유효량의 약물은 원치않는 당지질 축적을 감소 (즉, 어느 정도로 지연, 바람직하게는 중지)시킬 수 있으며 및/또는 어느 정도로 장애와 관련된 증상 중 하나 이상을 완화시킬 수 있다. 바람직하게는, 유효량은 의학적으로 이롭지만, 그의 사용을 수반하는 이점보다 더한 독성 효과를 나타내지 않는다.
IC50 또는 IC90 (억제 농도 50 또는 90)은 특정한 글리코스핑고지질의 50% 또는 90% 감소를 달성하는데 사용되는 글리코스핑고지질 생합성 억제 약물, 예컨대 이미노당의 농도일 수 있다.
본 발명자들은 특정한 이미노당이 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 유효한 억제제일 수 있으며 및/또는 락토실세라미드로부터 유래하는 글루코실세라미드, 락토실세라미드 및 강글리오시드의 세포 농도를 감소시키는데 있어서 높은 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 특히, 이들 이미노당은 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 억제 활성 및/또는, 상기 활성에 대하여 공지된 화합물인 N-부틸 데옥시노지리마이신 (NB-DNJ)보다 놀랍게도 더 높은 락토실세라미드로부터 유래한 글루코실세라미드, 락토실세라미드 및 강글리오시드의 세포 농도를 감소시키는데 있어서의 활성을 가지며, 예를 들면 US 특허 제5,472,969호 및 제5,525,616호를 참조한다. 다수의 GCS 및 글리코스핑고지질 억제제는 예를 들면 U.S. 특허 번호 5,302,609; 5,472,969; 5.525,616; 5,916,911; 5,945,442; 5,952,370; 6,030,995; 6,051,598; 6,255,336; 6,569,889; 6,610,703; 6,660,794; 6,855,830; 6,916,802; 7,253,185; 7,196,205; 및 7,615,573에 개시되어 있다. 추가의 GCS 억제제 및 치료는 WO 2008/150486; WO 2009/117150; 및 WO 2010/014554에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신 (UV-4) 또는 그의 제약상 허용되는 염일 수 있다. N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신 및 그의 제조 방법은 예를 들면 US 특허 출원 공개 번호 2010/0222384, 2011/0065754, 2011/0065753 및 2011/065752에서와 같이 US 특허 번호 8,450,345 및 8,426,445에 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 US 특허 출원 공개 번호 2007/0275998에 개시된 화합물일 수 있다. 예를 들면, 이미노당은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염일 수 있다:
<화학식 I>
Figure pct00012
(상기 화학식에서,
R은
Figure pct00013
이며,
R1은 치환 또는 비치환된 알킬 기이고;
W1 -4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고;
X1 -5는 H, NO2, N3 또는 NH2로부터 독립적으로 선택되고;
Y는 존재하지 않거나 또는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기이고;
Z는 결합 또는 NH로부터 선택되며,
단 Z가 결합인 경우, Y는 존재하지 않고,
단 Z가 NH인 경우, Y는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기임). 화학 기의 정의는 US 2007/0275998과 동일할 수 있다.
일부 실시양태에서, R1은 치환 또는 비치환된 C1-C12 알킬 기, 즉 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 치환 또는 비치환된 알킬 기일 수 있다. 예를 들면, R1은 치환 또는 비치환된 C1-C10 알킬 기 또는 치환 또는 비치환된 C3-C9 알킬 기 또는 치환 또는 비치환된 C5-C8 알킬 기일 수 있다. 일부 실시양태에서, D1은 치환 또는 비치환된 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 또는 옥틸 기일 수 있다.
다수의 실시양태에서, Z는 NH인 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우에서, Y는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기이다.
일부 실시양태에서, X1 -5의 1개 이상 또는 2개 이상은 NO2, N3 및 NH2로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, X1 -5의 1개 이상 또는 2개 이상은 NO2 및 N3으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, X1 -5의 1개 이상 또는 2개 이상은 NO2 및 NH2로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, X1 -5의 1개 이상 또는 2개 이상은 NH2 및 N3으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 데옥시노지리마이신 유도체, 즉 하기 화학식 Ia의 화합물일 수 있다:
<화학식 Ia>
Figure pct00014
DNJ 유도체의 예로는 N-(N'-{4'-아지도-2'-니트로페닐)-6-아미노헥실)-데옥시노지리마이신 (NAP-DNJ 또는 UV-5) 및 N-(N'-{2,4-디니트로페닐)-6-아미노헥실)-데옥시노지리마이신 (NDP-DNJ)을 들 수 있다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염일 수 있다:
<화학식 II>
Figure pct00015
(상기 화학식에서, R은
Figure pct00016
이고,
R'는 치환 또는 비치환된 알킬 기이고;
W1 -4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고; X1 -5는 H, NO2, 할로겐, 알킬 또는 할로겐화 알킬로부터 독립적으로 선택됨). 용어 치환된은 US 2007/0275998과 동일한 의미를 가질 수 있다. 화학식 II의 화합물은 예를 들면 도 8 내지 도 10에 도시된 것과 유사한 합성 반응식을 실시하여 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, R'는 치환 또는 비치환된 C1-C12 알킬 기 또는 치환 또는 비치환된 C2-C10 알킬 기 또는 치환 또는 비치환된 C3-C9 알킬 기 또는 치환 또는 비치환된 C5-C8 알킬 기일 수 있다. 일부 실시양태에서, R'는 비치환 C1-C12 알킬 기 또는 C2-C10 알킬 기 또는 C3-C9 알킬 기 또는 C5-C8 알킬 기일 수 있다. 일부 실시양태에서, R'는 1 내지 3개의 산소 원자로 치환된 알킬 기, 예컨대 C1-C12 또는 C2-C10 또는 C3-C9 또는 C5-C8 알킬 기일 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, R'는 (CH2)n-O-(CH2)m일 수 있으며, 여기서 n은 3-10 또는 5-8이며, m은 0-4이다. 일부 실시양태에서, R'는 아미노-치환된 알킬 기, 즉 아미노기로 치환된 알킬 기, 예컨대 C1-C12 또는 C2-C10 또는 C3-C9 또는 C5-C8 알킬 기일 수 있다. 예를 들면, R'는 (CH2)p-NH-(CH2)q일 수 있으며, 여기서 n은 3-10 또는 5-8이며, q는 0-2 또는 0-4이다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물에서 X1 -5의 1개 이상 또는 2개 이상은 할로겐, 예컨대 F, Cl 또는 Br 또는 할로겐화 알킬일 수 있다. 할로겐화 알킬은 C1 할로겐화 알킬, 예컨대 CHCl2, CHF2, CH2Cl, CH2F, CF3 또는 CCl3일 수 있다.
일부 실시양태에서, X3 및 X5 중 하나 이상은 할로겐, NO2 또는 할로겐화 알킬이며, X1, X2 및 X4는 H이다.
일부 실시양태에서, X3 및 X5 중 하나 이상은 F 또는 Cl이다.
다수의 실시양태에서, W1, W2, W3 및 W4는 각각 수소일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학식 II의 화합물은 데옥시노지리마이신 유도체, 즉 하기 화학식 IIa의 화합물일 수 있다:
<화학식 IIa>
Figure pct00017
상기 화합물의 예로는 도 3에 도시된 UV-6.2, UV 6.4, UV 6.5 및 UV 6.8이다.
일부 실시양태에서, 화학식 II 또는 IIa의 화합물은
Figure pct00018
중 하나인 R을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 본원에 참조로 그 전문이 포함된 US 특허 출원 번호 2013/0331578에 개시된 화합물일 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 이미노당은 하기 화학식 I'의 화합물일 수 있다:
<화학식 I'>
Figure pct00019
(상기 화학식에서,
R1은 C2-C6 알킬 또는 옥사알킬 기이고;
Y는 O 또는 CH2이며;
Z는 (CH2)3-O-CH2; (CH2)5;
Figure pct00020
; 및
Figure pct00021
으로부터 선택되고; R2는 a) Z가
Figure pct00022
인 경우 직쇄 또는 분지쇄 C10-C16 알킬 또는 알킬렌 기 및 H이며, b) Z가 (CH2)3-O-CH2; (CH2)5 또는
Figure pct00023
인 경우 직쇄 또는 분지쇄 C10-C20 알킬 또는 알킬렌 기임).
W1 -4는 각각 H 또는 알콜 보호기로부터 독립적으로 선택되고; X1 -4는 각각 H 또는 C1 -2 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 화학식 I'의 화합물은 하기 화학식 II'를 가질 수 있다:
<화학식 II'>
Figure pct00024
일부 실시양태에서, R1은 C5 알킬일 수 있다. 일부 실시양태에서, -Z-Y-는
Figure pct00025
이며, 각각의 X1-4는 H 또는 메틸로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, X4는 메틸이며, R2-Z-Y-는
Figure pct00026
이다. 일부 실시양태에서, X1-4는 각각 메틸이며, R1은 C5 알킬이다. 일부 실시양태에서, W1-4는 각각 H이다. 일부 실시양태에서, R2는
Figure pct00027
이다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 하기 화학식
Figure pct00028
의 화합물 (토코페릴-펜틸 데옥시노지리마이신, TOP-DNJ) 또는 그의 제약상 허용되는 염일 수 있다.
세라미드 글루코실트랜스퍼라제 및/또는 GSL 억제제로서 상기 논의된 이미노당은 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 글리코스핑고지질 농도의 감소가 이로울 수 있는 다수의 질환 또는 상태의 치료에 사용될 수 있다. 상기 질환 또는 상태의 예로는 고셔병 (제I형, 제II형 및 제III형 고셔병 포함), 파브리병, 샌드호프병, 타이-작스병, 파킨슨병, 제II형 당뇨병, 당뇨병성 신병증과 관련된 비대증 또는 증식증, 상승된 혈액 글루코스 수준, 상승된 당화 헤모글로빈 수준, 사구체 질환 및, 전신 홍반성 루푸스를 비롯한 루푸스를 들 수 있다. 사구체 질환의 예로는 혈관간세포 증식 사구체신염, 허탈성 사구체병증, 증식성 낭창 신염, 초승달 사구체신염 및 막성 신장병을 들 수 있다.
일부 실시양태에서, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 글리코스핑고지질 농도의 감소가 유용할 수 있는 질환 또는 상태는 리소솜 글리코스핑고지질 축적 질환 (LSD), 예컨대 고셔 (제I형, 제II형 및 제III형) 질환, 파브리병, 샌드호프병, 타이-작스병, GM1 강글리오시드증 및 C형 니만-픽병일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 글리코스핑고지질 농도의 감소가 유용할 수 있는 질환 또는 상태는 다발성 골수종일 수 있다. 다수의 상기 개시된 이미노당은 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 억제제인 것 이외에 글루코시다제 억제제이다. 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 억제제 및 글루코시다제 억제제인 약물, 예컨대 이미노당을 사용한 다발성 골수종과 관련된 파골세포형성의 억제 및/또는 파골세포 활성화 감소는 US 2011/0136868에 개시되어 있다. US 2011/0136868에는 또한 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 억제제 및 글루코시다제 억제제인 약물, 예컨대 이미노당을 사용한 골용해성 활성 및/또는 골 손실의 감소 또는 예방이 개시되어 있다.
일부 실시양태에서, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 글리코스핑고지질 농도의 감소가 유용할 수 있는 질환 또는 상태는 골다공증 또는 골관절염일 수 있다. 이들 장애와 관련된 파골세포형성의 억제 및/또는 파골세포 활성화의 감소는 골 흡수를 예방할 것이다.
일부 실시양태에서, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 글리코스핑고지질 농도의 감소가 유용할 수 있는 질환 또는 상태는 다낭성 신장 질환의 상염색체 우성 또는 열성 형태를 비롯한 다낭성 신장 질환일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 글리코스핑고지질 농도의 감소가 유용할 수 있는 질환 또는 상태는 당뇨병 환자에서의 아테롬성동맥경화증 또는 신장 비대증일 수 있다.
일부 실시양태에서, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 글리코스핑고지질 농도의 감소가 유용할 수 있는 질환 또는 상태는 제II형 당뇨병 및/또는 그의 관련 질환 또는 상태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 질환 또는 상태는 대사 증후군 및 제II형 당뇨병의 결과인 비-알콜성 지방 간 질환일 수 있다. 일부 실시양태에서, 관련 질환 또는 상태는 제II형 당뇨병 및/또는 아테롬성동맥경화증의 전조 증상일 수 있는 대사 증후군 및/또는 관련 이상지질혈증일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 이미노당은 제II형 당뇨병 및/또는 그의 관련 질환 또는 상태의 예방을 위하여 예방적으로 사용될 수 있다. 본 발명이 임의의 이론에 의하여 한정되지는 않지만, 본 발명자들은 제II형 당뇨병 및/또는 그의 관련 질환 또는 상태의 치료 및/또는 예방에 대한 근거가 글루코실세라미드의 농도를 감소시킬 수 있으며, 또한 강글리오시드, 특히 GM3의 발현을 감소시켜 인슐린 수용체가 지질 래프트에 참여하여 수용체 불활성화 및 내재화를 야기하여 인슐린 내성을 초래할 수 있는 이미노당일 수 있는 것으로 추정한다. 그러므로, 상기 이미노당은 표면 GM3의 세포를 고갈시키며, 세포를 인슐린에 대하여 민감하게 하여 예를 들면, 대사 증후군, 제II형 당뇨병, 비알콜성 간 질환 및 아테롬성동맥경화증의 발생에 중심이 될 수 있는 인슐린 내성의 치료에 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 논의된 이미노당은 글리코스핑고지질 또는 강글리오시드를 통하여 또는 이에 결합되는, 독소에 의하여 야기되는 세균성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들면, 콜레라는 B-서브유닛에 의하여 강글리오시드 GM1에 결합하는 독소 (콜레라 독소)에 의하여 야기된다. 콜레라 환자의 경구 이미노당 치료에 의하여 또는 이미노당을 사용한 결장 세척에 의하여 장 상피에서의 감수성 세포에 의한 GM1 표적의 발현이 폐지되거나 또는 실질적으로 감소될 수 있어서 독소의 효과를 감소시켜 해당 치료적 효과를 갖는다. 세균성 독소를 포함한 또 다른 질환은 강글리오시드 글로보트리아오실세라미드 (Gb3)에 결합되는 시가 독소 2형을 생성하는 이. 콜리(E. coli) 세균의 특정한 균주와 공통적으로 관련되어 있는 설사후 용혈성 요독 증후군이다. 콜레라 요법에 대하여 상기 기재된 시나리오와 유사하게, 상기 이미노당을 사용하여 (Gb3의 경우) 독소의 강글리오시드 표적의 세포성 발현을 감소시켜 이. 콜리-관련된 장애를 치료할 수 있다. 시가 독소-2는 장출혈 질환을 야기하는 것으로 공지된 이. 콜리의 균주인 이. 콜리 O157:H7에 의하여 공통으로 발현된다. 그러므로, 상기 이미노당은 O157과 관련된 장출혈 질환뿐 아니라, 시가 독소-2를 발현시키는 기타 세균에 의하여 야기되는 장출혈 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 장의 감염성 또는 염증성 질환의 치료의 경우, 이미노당의 헤드 기 및 '꼬리 기'의 성질은 모두 중요할 수 있다. 본원에 기재된 화합물은 수크라제-이소말타제 (의도하지 않거나/바람직하지 않음)의 억제에 비하여, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 (의도한 표적)에 대한 활성의 바람직한 비를 가질 수 있으나, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제를 표적으로 하는 요법을 위하여, 일반적으로 (그리고 특히 장 장애에 대하여) 수크라제-이소말타제 억제 활성이 결핍된 이미노당 화합물이 바람직한 것으로 보일 수 있다. 그래서, US 특허 출원 공보 번호 2013/0331578에 개시된 화합물, 예컨대 토코페릴-펜틸-DNJ는 (글루코스 타입 헤드 기를 갖더라도) 일부 기타 DNJ계 이미노당과 달리, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제에 대하여서는 높은 활성을 유지하면서 수크라제-이소말타제에 대하여 매우 낮은 활성을 가질 수 있으므로 특히 바람직할 수 있다. 마찬가지로, (DNJ 대신에) 갈락토스형 또는 이도스형 이미노당 헤드 기를 갖는 화합물은 이들 헤드 기가 수크라제-이소말타제의 억제 및 투여량-제한 설사에 대한 가능성을 피할 수 있으므로 특히 바람직할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 논의된 이미노당은 β-글루코세레브로시다제 EC 3.2.1.45 (또한 D-글루코실-N-아실스핑고신 글루코히드롤라제 또는 산 베타-글루코시다제로 공지됨)를 억제할 수 있다. β-글루코세레브로시다제는 그의 특징적인 리소솜 축적 병리학을 야기하는 고셔병에서 변이된, 강글리오시드를 포함한 GSL의 리소솜 이화대사의 원인이 되는 효소이다. β-글루코세레브로시다제는 또한 고셔 변이의 "매개체"에서 발견되는 변이가 발생하는 경향이 있는 파킨슨병의 일부 경우에서 변이 (이형접합)된다. β-글루코세레브로시다제의 억제가 자연적으로 치료 목적이 아닐 수 있는 한편, 우연하게도, 이러한 효소의 활성-부위 유도 억제제인 화합물은 효소의 특정한 돌연변이 형태의 적절한 폴딩을 샤페로닝시킬 수 있으며, 그렇지 않다면 자연적으로 미스-폴딩되기 쉬워서 고셔 표현형의 낮은 기초 수준 특징으로부터 그의 촉매 활성을 역설적으로 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 상기 논의된 이미노당은 그의 활성을 증가시키기 위하여 β-글루코세레브로시다제 향상 또는 샤페로닝을 제공할 수 있다. 이러한 성질은 고셔병, 특히 제I형뿐 아니라, 제II형 및 제III형 고셔병 (즉 신경세포병 형태)의 치료에 유용할 수 있다. 마찬가지로, β-글루코세레브로시다제 변이가 파킨슨병의 위험성을 강화시키는 정확한 기전이 공지되어 있지는 않지만, 상기 이미노당의 샤페론 효과는 일부 경우에서 β-글루코세레브로시다제의 적절한 폴딩 및 그의 효소 활성의 완전 발현을 허용하여 파킨슨병에서의 상기 변이의 병리학적 효과를 무효로 한다. 게다가, 이미노당 처치는 카베올리-매개된 내재화에 의한 D1-도파민 수용체 탈민감화를 방지하여 파킨슨병에서 병리학적으로 영향을 받은 도파민 경로를 강화시킨다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 GM3 합성의 억제 및/또는 GM3 농도의 감소가 이로울 수 있는 다수의 질환 또는 상태의 치료에 사용될 수 있다. 그러한 질환 또는 상태의 예로는 제I형 고셔병을 들 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 논의된 이미노당은 세포 (강글리오시드 축적 장애를 위한 기질 감소 치료법), 예컨대 포유동물 세포, 예를 들면 인간 세포를 당지질 억제 유효량의 이미노당 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 처리하여 당지질을 생성할 수 있는, 상기 세포에서의 당지질 생합성을 억제하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "당지질"은 당지질계 분자, 예컨대 강글리오시드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 당지질은 글리코스핑고지질, 예를 들면 글루코세라미드계 글리코스핑고지질일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 당지질은 강글리오시드, 예컨대 GM1, GM2, GM3, GD1a, GD1b, GD2, GD3, GT1b 및 GQ1 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 처리는 시험관내에서 수행될 수 있다. 일부 기타 실시양태에서, 세포의 처리는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 당지질 억제 유효 양 또는 농도의 이미노당 또는 그의 제약상 허용되는 염을 당지질 생합성의 억제가 유용할 수 있는 질환 또는 상태를 갖는 대상체에게 투여할 수 있다. 상기 대상체는 온혈 동물, 예를 들면 포유동물, 예컨대 인간일 수 있다. 상기 질환 또는 상태의 예로는 고셔병 (제I형, 제II형 및 제III형 고셔병 포함), 파브리병, 샌드호프병, 타이-작스병, GMI 강글리오시드증, C형 니만-픽병, 홍반성 루푸스, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 다낭성 신장 질환, 다발성 골수종, 길랑-바레 증후군을 들 수 있다. 용어 "당지질 억제 유효량"은 이미노당 사용의 이점보다 더 할 수 있는 독성 효과를 야기하지 않으면서 1종 이상의 당지질의 생성을 억제하는, 이미노당의 양 또는 농도를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 이미노당은 무기 또는 유기 산으로부터 유래한 염의 형태일 수 있다. 제약상 허용되는 염 및, 염 형태의 제조 방법은 예를 들면 (Berge et al., J. Pharm . Sci . 66:1-18, 1977)에 개시되어 있다. 적절한 염의 예로는 하기의 염: 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 디글루코네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 메실레이트 및 운데카노에이트를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 이미노당 또는 그의 제약상 허용되는 염은 제약상 허용되는 담체 및/또는 조성물을 동물에게 전달하기에 유용한 성분을 추가로 포함하는 조성물의 일부로서 사용될 수 있다. 조성물을 인간에게 전달하기에 유용한 다수의 제약상 허용되는 담체 및, 조성물을 기타 동물, 예컨대 소에게 전달하기에 유용한 성분은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 그러한 담체 및 성분을 본 발명의 조성물에 첨가하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 수준에 포함된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 이미노당 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 본질적으로 이루어질 수 있으며, 이는 이미노당 또는 그의 제약상 허용되는 염이 조성물 중의 유일한 활성 성분이라는 것을 의미할 수 있다.
일부 실시양태에서, 이미노당 또는 그의 제약상 허용되는 염은 리포솜 조성물, 예컨대 US 공보 번호 2008/0138351, 2009/0252785 및 2010/0266678에 개시된 것에 사용될 수 있다.
제약 조성물 중의 활성 성분, 예컨대 이미노당의 실제의 투여량 수준은 특정 환자에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 화합물(들)의 양을 투여하도록 변경될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 투여 경로, 치료되는 상태의 경중도 및, 치료되는 환자의 이전 의학적 이력에 의존할 수 있다. 그러나, 원하는 치료적 효과를 달성하는데 필요한 것보다 낮은 수준에서 이미노당의 투여를 개시하고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술내에 포함된다. 필요할 경우, 효과적인 1일 투여량은 투여를 위하여 복수회의 투여량으로, 예를 들면 1일 2 내지 4회 투여량으로 분할될 수 있다. 그러나, 임의의 특정한 환자에 대한 구체적인 투여량 수준은 체중, 일반적인 건강, 식이, 투여의 시간 및 경로 및 기타 치료제와의 병용 및 치료되는 상태 또는 질환의 경중도를 비롯한 다양한 요인에 의존할 수 있다. 성인의 1일 투여량은 체중 10 ㎏당 이미노당 약 1 ㎍ 내지 약 1 g 또는 약 10 ㎎ 내지 100 ㎎ 범위내일 수 있다. 일부 실시양태에서, 총 1일 투여량은 체중 1 ㎏당 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎ 또는 체중 1 ㎏당 1 ㎎ 내지 60 ㎎ 또는 체중 1 ㎏당 2 ㎎ 내지 50 ㎎ 또는 체중 1 ㎏당 3 ㎎ 내지 30 ㎎일 수 있다. 1일 투여량은 1일에 걸쳐 1회 이상 투여 사례에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 1일 투여량은 1일 2회 (BID) 투여 사례, 1일 3회 투여 사례 (TID) 또는 4회 투여 사례 (QID)로 분포될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 체중 1 ㎏당 1 ㎎ 내지 10 ㎎ 범위내의 1회 투여 사례는 체중 1 ㎏당 2 ㎎ 내지 20 ㎎ 또는 체중 1 ㎏당 3 ㎎ 내지 30 ㎎의 총 1일 투여량을 생성하도록 인간에게 BID 또는 TID 투여될 수 있다. 물론, 세포 또는 동물에게 투여되어야 하는 이미노당의 양은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 다수의 요인, 예컨대 이미노당의 분자량 및 투여 경로에 의존할 수 있다.
본 발명의 방법에서 유용한 제약 조성물은 경구 고체 제제로 전신, 눈, 좌제, 에어로졸, 국소 또는 기타 유사 제제로 투여될 수 있다. 예를 들면, 분말, 정제, 캡슐, 로젠지, 겔, 액제, 현탁액, 시럽 등의 물리적 형태로 존재할 수 있다. 이미노당 이외에, 상기 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 및 약물 투여를 강화 및 촉진시키는 것으로 공지된 기타 성분을 함유할 수 있다. 기타 가능한 제제, 예컨대 나노입자, 리포좀, 재봉인된 적혈구 및 면역에 기초한 시스템도 또한 이미노당을 투여하는데 사용될 수 있다. 상기 제약 조성물은 다수의 경로에 의하여 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"로는 피하, 정맥내, 동맥내, 수막강내 및 주사 및 주입 기법을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 제약 조성물은 경구, 국소, 비경구, 전신 또는 폐 경로에 의하여 투여될 수 있다.
본원에 기재된 실시양태는 하기 작동 실시예에 의하여 추가로 예시되지만, 이에 한정되지 않는다.
실시예 1
물질 및 방법
당지질 생합성의 억제
세포계 검정에서 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 활성의 억제를 측정하기 위하여, HL60 세포를 다양한 농도 (0-500 μM)의 화합물 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신 (UV-4) 및 N-부틸-데옥시노지리마이신 (NB-DNJ)의 존재하에서 3 일 동안 융합될 때까지 3회 배양시켰다. 세포를 수거하고, 물 중에서의 재현탁 및 다운스 균질화 이전에 인산염 완충 염수 (PBS)로 세정하였다. 이러한 균질액의 분획을 단백질 검정을 위하여 취하였다. 나머지는 4:8:3 (v/v/v) 클로로포름:메탄올:물로 만들어 (Neville 2004, 정확한 인용을 위하여 본 실시예 종반의 참고문헌 부분을 참조함)에 기재된 바와 같이 당지질을 추출하였다. 추출된 당지질을 밤새 37℃에서 1 ㎎/㎖ 나트륨 타우로데옥시콜레이트를 함유하는 20 ㎕의 50 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0 중의 세라미드 글리카나제 (히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 하우스내에서 정제함)의 제제를 사용하여 가수분해시켰다. 당지질-유래 올리고당은 물을 사용하여 30 ㎕로 만들고, 하기 기재된 바와 같이 안트라닐산 (2-AA)으로 표지하였다. 표지된 올리고당은 하기 (Neville 2004, Neville 2009)에 기재된 바와 같이 NP-HPLC에 의하여 분석하였다.
탄수화물 형광 표지
당지질 유래 올리고당을 상기 기재된 바와 같이 안트라닐산으로 표지하였다 (Neville 2004). 간략하게, 안트라닐산 (30 ㎎/㎖)을 메탄올 중의 아세트산나트륨 삼수화물 (4%, w/v) 및 붕산 (2% w/v)의 용액 중에 용해시켰다. 이러한 용액을 시아노붕수소화나트륨 (최종 농도 45 ㎎/㎖)에 첨가하고, 혼합하여 최종 표지 혼합물을 얻었다. 2-AA 표지 혼합물 (80 ㎕)을 FOS 샘플 (30 ㎕ 물) 또는 당지질-유래 올리고당에 첨가한 후, 80℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 반응을 실온으로 냉각되도록 하고, 1 ㎖ 아세토니트릴/물 (97:3, v/v)을 첨가하고, 혼합물을 볼텍싱하였다. 표지된 올리고당을 스피드(Speed) 아미드 2 컬럼 (애플라이드 세퍼레이션즈(Applied Separations), 미국 알렌타운 소재)을 통한 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 컬럼을 2×1 ㎖ 아세토니트릴, 2×1 ㎖ 물에 이어서 2×1 ㎖ 아세토니트릴로 사전-평형화시켰다. 샘플을 중력 흐름을 사용하여 로딩시키고, 컬럼을 통하여 적하되도록 하였다. 컬럼을 2×1 ㎖ 아세토니트릴/물 (95:5, v/v)로 세정하고, 2×0.75 ㎖ 물로 용출시킨 올리고당을 표지시켰다.
순상 고 성능 액체 크로마토그래피 ( NP - HPLC )에 의한 탄수화물 분석
형광 표지된 당지질 유래 올리고당은 사전에 공개된 방법 (Alonzi 2008, Neville 2004, 2009)에 의하여 4.6×250 mM TSKgel® 아미드-80 컬럼 (시그마(Sigma), 영국 소재)을 사용한 NP-HPLC에 의하여 분리하였다. 크로마토그래피 시스템은 Exλ 360 ㎚ 및 Emλ 425 ㎚에서 설정된 인-라인 워터즈(Waters) 474 형광 검출기 및 워터스 앨라이언스(Waters Alliance) 2695 분리 모듈을 포함하였다. 모든 크로마토그래피를 30℃에서 수행하였다. 용매 A는 아세토니트릴이었다. 용매 B는 밀리-큐(Milli-Q) 물이었다. 용매 C는 100 mM 수산화암모늄으로 이루어졌으며, 밀리-큐 물 중의 아세트산을 사용하여 pH 3.85로 적정하고, 표준 5.0 N 수산화암모늄 용액 (시그마, 영국 소재)을 사용하여 생성하였다. 구배 조건은 하기와 같았다: 시간=0 min (t=0), 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1); t=6, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1); t=6, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1); t=40, 52% A, 28% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1); t=41, 23% A, 57% B, 20% C (1.0 ㎖ min-1); t=43, 23% A, 57% B, 20% C (1.0 ㎖ min-1); t=44, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (1.2 ㎖ min-1); t=59, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (1.2 ㎖ min-1); t=60, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1). 샘플 (< 50 ㎕)을 밀리-큐 물/아세토니트릴 (1:1, v/v) 중에 주입하였다.
GSL 억제의 분석의 경우, 억제 구속을 생성하는 억제제 처리에 반응하여 모노시알릴-강글리오시드 GM3에 해당하는 피크 면적을 측정하였다 (Li et al., 2008). 억제 구속 (IC50)은 4개의 파라미터 로지스틱 핏 (힐 플롯, 프리즘(Prism) 소프트웨어)을 사용하여 계산하였다.
결과
세라미드 글루코실트랜스퍼라제 억제
글리코스핑고지질의 생합성에서의 핵심 효소인 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 세포성 억제를 평가하기 위하여 (Butters 2000), 화합물을 HL60 세포에 3 일 동안 투여하였다. 지질 추출, 올리고당 헤드 기의 효소 배출 및 형광 표지 후, 순상 HPLC을 사용하여 생합성의 억제 효과를 분석하였다. HL60 세포는 당지질의 단순 레퍼토리를 가지며, 우세한 종은 모노-시알릴화된 강글리오시드, GM3이다 (Mellor 2004). 이미노 당 UV-4 및 NB-DNJ에 의한 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제는 HPLC 분리 후 측정한 GM3의 감소를 초래하였다. 억제의 결과로서 GM3 감소량을 분석하여 IC50 값을 얻었다 (도 1 참조). 이미노 당 UV-4는 고셔 환자에서 생합성을 감소시켜 GSL 축적을 수정하는데 사용되는 공지의 GSL 억제제인 NB-DNJ (제베스카(Zavesca))보다 세포에서 약 100 시간 더 유효하였다.
참조 문헌
Figure pct00029
실시예 2
세라미드 글루코실 트랜스퍼라제의 억제제 및 β- 글루코시다제의 샤페론
DNJ 헤드 기의 주위에 기초한 다수의 이미노당은 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 세포성 표적에 대한 승인된 약물인 제베스카™ (N-부틸 데옥시노지리마이신, NB-DNJ)에 대한 놀라운 개선된 효능을 나타냈다. 이는 글리코스핑고지질 (GSL) 결핍의 감소에 의한 이들 이미노당에 대한 치료적 적용예를 제공할 수 있다. 이는 예를 들면 항바이러스 기전으로서 결합되는 바이러스성 수용체를 감소시키며; 제베스카가 공지의 치료제인 당지질 리소솜 축적 장애 (LSD), 예컨대 고셔병의 숙주에 대한 기질 감소 치료법 (도 2에 도시된 SRT)뿐 아니라, 세포 표면에서 GSL의 결핍에 의한 자가면역 질환인 전신 홍반성 루푸스 (루푸스)의 치료를 제공한다. 이들 이미노당은 또한 다수의 경우에서 서브-마이크로몰 범위내로 세포질 세망 관련 분해 경로에 의하여 정상적으로 분해되는, 돌연변이 효소의 샤페론으로서 제2의 치료 기전이 허용되는 인간 β-글루코세레브로시다제의 억제제일 수 있다.
GSL의 리소솜 분해는 글리코시다제에 의하여 촉매화되며, 리소솜 효소를 암호화하는 유전자에서의 변이로 인하여 리소솜 효소 활성의 결핍이 리소솜에서의 GSL의 축적을 초래하는 인간에서 다수의 유전 질환이 나타난다 (Butters et al., 2000a; Vellodi, 2005, 이들 및 기타 인용의 경우, 하기 참조 문헌 부문을 참조한다). 10에 대하여 40+ 리소솜 축적 장애는 스핑고지질 분해 결함으로 인한 것이며, 예를 들면 고셔, 파브리병, 타이-작스병, 샌드호프병, GM1 강글리오시드증이 있다 (Futerman & van Meer, 2004; Meikle et al., 1999). SRT는 LSD에 대한 약리학적 인터벤션이며, 효소 대체 요법 (ERT)에 대한 대안이다 (Lachmann, 2010). SRT의 치료 전략은 부분 생합성 억제에 의한 GSL 기질 유입을 감소시키는 것이다. 이는 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT)의 억제 결과이며, 리소솜에서의 돌연변이 이화대사 효소가 축적 부담을 제거하도록 하며, 궁극적으로 청소를 초래한다.
효과적인 억제를 위한 화학적 성질은 시험관내 검정 및 세포성 실험에 의하여 결정될 수 있다 (Butters et al., 2000b; Platt et al., 1994a; Platt et al., 1994b). 세포 실험은 효소가 세포 중에서 작용한다는 문맥에서 유지 이외의 세포독성 및 세포 이용가능성 모두를 고려하여 화합물 억제 가능성을 규명하도록 하므로 효능의 최대 표시를 제공할 수 있다. 그래서, 본 실험은 세포성 검정에서 하기 기재된 다수의 이미노당에 대한 CGT에 대하여 개선된 효능을 입증한다.
샤페론 매개 요법은 특정한 새로이 합성된 변이-담지 단백질이 불안정하며, 미스폴딩되기 쉬우므로 효소 활성은 리소솜에서 결핍될 수 있을 때 안정화제로서 작용하는 억제제에 의존하는 전략일 수 있다. 이들 구조적 결손 단백질은 세포질 세망에서의 품질 제어계에 의하여 검출되는 것으로 여겨지며, 그후 분해의 세포성 경로로 우회된다. 이들 리소솜 효소의 일부에 대한 경쟁적 억제제는 부억제 농도로 '샤페론'으로서 작용하며, 돌연변이 단백질을 구조하여 리소솜내에서 그의 가수분해 활성의 재구성을 초래할 수 있다 (Fan, 2003).
비-억제 수준에서의 이미노당과 돌연변이 효소의 상호작용은 품질 제어계에 의한 분해 이전에 ER에서 발생할 수 있으며, ER 루멘 효소 기질과 달리 커다란 축적된 양으로 존재하여 낮은 pH 환경에 커플링되어 소 분자 억제제의 해리를 초래하며, 리소솜 효소 활성을 증가시키는 리소솜에 대한 가수분해 활성을 보유하는 돌연변이 효소의 트래픽킹(trafficking)을 가능케 한다.
효소 대체 요법에 비하여, 소 분자 억제제/샤페론을 사용한 타당한 이점은 경구 투여의 용이성, 면역원성의 결핍 및 혈액-뇌 장벽을 가로지른 전달의 가능성; 및 그에 따른 신경변성 임상적 변형체를 치료하는 가능성 중 하나 이상으로부터 유래할 수 있다.
세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제에 의한 세포 표면에서의 GSL 수준 감소는 또한 SLE의 치료에서 치료적 역할을 가질 수 있다. SLE는 광범위한 염증, 자가항체 생성 및 면역 복합체 침착을 특징으로 하는 자가면역 질환이다. SLE는 체내에서 거의 모든 기관계에 영향을 미친다. SLE의 근본 원인은 알려져 있지는 않지만, B 및 T 세포 모두에서의 이상은 자가-내성의 손실, 자가항체의 생성 및, 신장과 기타 표적 조직에서의 면역 복합체의 침착에 기여하는 것으로 생각된다. 이러한 이상은 (가능하게는 글리코스핑고지질 대사의 조절을 통한 루푸스 T 세포 활성화 및 IL-4 생성을 조절하는 전사 인자 FLI1의 발현의 결과로서, 구체적으로 조기 질환 중에 뉴라미다제 (Neu1) 발현 및/또는 NEU 활성의 제어를 통한 분해 경로를 매개하여) Gb3에서의 증가를 비롯한 세포 막 지질의 성질을 변경시켜 활성화를 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 한다 (Richard et al., 2013). 게다가, 림프구의 세포 막에서의 GSL의 증가된 축적은 산화 스트레스 및 반응성 산소종의 형성을 증가시키며, 이들 두 요인은 반응에 영향을 미치며, SLE 환자에서의 증가된 심혈관 위험에 기여한다 (Nandagudi et al., 2013).
하기 화합물 (도 3 및 도 12 참조)은 글리코스핑고지질 생합성 경로 효소 (세라미드 글루코실 트랜스퍼라제, CGT)에 대한 및/또는 β-글루코세레브로시다제의 억제제 (및 그 후에는 샤페론)로서 개선된 효능을 갖는 것으로 나타났다. 승인된 약물인 제베스카 (NB-DNJ/UV-1)는 양성 대조군으로서 나타난다.
방법:
세포 배양
HL60 세포 및 고셔 림프모세포 (N370S)를 10% 또는 15% (v/v) 소 태아 혈청, 각각 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640 배지 중에서 37℃에서 5% CO2에서 배양하였다.
당지질 생합성의 억제
세포계 검정에서 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 활성의 억제를 측정하기 위하여, HL60 세포를 다양한 농도 (0-100 mM)의 화합물의 존재하에서 융합될 때까지 3 일 동안 배양하였다. 세포를 수거하고, 물 중에서의 재현탁 및 다운스 균질화 이전에 인산염 완충 염수 (PBS)로 세정하였다. 이러한 균질액의 분획을 단백질 검정을 위하여 취하였다. 나머지는 4:8:3 (v/v/v) 클로로포름:메탄올:물로 만들어 (Neville 2004)에 기재된 바와 같이 당지질을 추출하였다. 추출된 당지질을 밤새 37℃에서 1 ㎎ ㎖-1 나트륨 타우로데옥시콜레이트를 함유하는 20 ㎖의 50 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0 중의 세라미드 글리카나제 (히루도 메디시날리스로부터 하우스내에서 정제함)의 제제를 사용하여 가수분해 처리하였다. 당지질-유래 올리고당은 물을 사용하여 30 ㎖로 만들고, 하기 기재된 바와 같이 안트라닐산 (2-AA)으로 표지하였다. 표지된 올리고당은 하기에 기재된 바와 같이 NP-HPLC에 의하여 분석하였다.
탄수화물 형광 표지
유리 올리고당 (FOS) 및 당지질 유래 올리고당을 상기 기재된 바와 같이 안트라닐산으로 표지하였다 (Neville et al., 2004). 간략하게, 안트라닐산 (30 ㎎ ㎖-1)을 메탄올 중의 아세트산나트륨 삼수화물 (4%, w/v) 및 붕산 (2% w/v)의 용액 중에 용해시켰다. 이러한 용액을 시아노붕수소화나트륨 (최종 농도 45 ㎎ ㎖-1)에 첨가하고, 혼합하여 최종 표지 혼합물을 얻었다. 2-AA 표지 혼합물 (80 ㎖)을 FOS 샘플 (30 ㎖ 물) 또는 당지질-유래 올리고당에 첨가한 후, 80℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 반응을 실온으로 냉각되도록 하고, 1 ㎖ 아세토니트릴/물 (97:3, v/v)을 첨가하고, 혼합물을 볼텍싱하였다. 표지된 올리고당을 스피드 아미드 2 컬럼 (애플라이드 세퍼레이션즈, 미국 알렌타운 소재)을 통한 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 컬럼을 2×1 ㎖ 아세토니트릴, 2×1 ㎖ 물에 이어서 2×1 ㎖ 아세토니트릴로 사전-평형화시켰다. 샘플을 중력 흐름을 사용하여 로딩시키고, 컬럼을 통하여 적하되도록 하였다. 컬럼을 2×1 ㎖ 아세토니트릴/물 (95:5, v/v)로 세정하고, 2×0.75 ㎖ 물로 용출시킨 올리고당을 표지시켰다.
순상 고 성능 액체 크로마토그래피 (NP-HPLC)에 의한 탄수화물 분석
당지질-유래 올리고당은 사전에 공개된 방법에 의한 4.6×250 mM TSKgel 아미드-80 컬럼 (시그마, 영국 소재)을 사용한 NP-HPLC에 의하여 분리하였다. 크로마토그래피 시스템은 Exλ 360 ㎚ 및 Emλ 425 ㎚에서 설정된 인-라인 워터즈 474 형광 검출기 및 워터스 앨라이언스 2695 분리 모듈로 이루어졌다. 모든 크로마토그래피를 30℃에서 수행하였다. 용매 A는 아세토니트릴이었다. 용매 B는 밀리-큐® 물이었다. 용매 C는 100 mM 수산화암모늄으로 이루어졌으며, 밀리-큐 물 중의 아세트산을 사용하여 pH 3.85로 적정하고, 표준 5.0 N 수산화암모늄 용액 (시그마, 영국 소재)을 사용하여 생성하였다. 구배 조건은 하기와 같았다: 시간=0 min (t=0), 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1); t=6, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1); t=6, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1); t=40, 52% A, 28% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1); t=41, 23% A, 57% B, 20% C (1.0 ㎖ min-1); t=43, 23% A, 57% B, 20% C (1.0 ㎖ min-1); t=44, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (1.2 ㎖ min-1); t=59, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (1.2 ㎖ min-1); t=60, 71.6% A, 8.4% B, 20% C (0.8 ㎖ min-1). 샘플 (< 50 ㎖)을 밀리-큐® 물/아세토니트릴 (1:1, v/v) 중에 주입하였다.
GSL의 분석의 경우, 억제 구속을 생성하는 억제제 처리에 반응하여 모노시알릴-강글리오시드 GM3에 해당하는 피크 면적을 측정하였다.
β-글루코세레브로시다제 억제 검정
인간 태반 β-글루코세레브로시다제를 (Furbish et al., Proc . Nat. Acad . Sci. (1977) 74 (8) 3560-3]의 변형된 절차에 의하여 분리 및 정제하였다. 효소 활성은 0.25% 나트륨 타우로콜레이트, 0.1% TX100를 함유하는 0.1 M 시트르산염 인산염 완충액, pH 5.2 중의 5 mM 4-메틸움벨리페릴-β-글루코시드 (4-MU-b-글루코시드) 50 ㎖에서 37℃에서 15-60 분 동안 측정하였다. 200 ㎖ 0.5 M 탄산나트륨을 첨가하여 반응을 중지시키고, ex 350 ㎚, em 460 ㎚에서 형광을 측정하였다. 0.5 mM 기질 농도를 사용하여 태반 β-글루코세레브로시다제 (4-MU-β-글루코시드에 대한 Km, 1.9±0.3 mM)에 대하여 억제 구속 (IC50)을 생성하였다. 측정은 3회 실시하였다. 힐 슬로프(Hill Slope) 플롯 (프리즘 소프트웨어)을 사용하여 데이타를 핏팅시키고, 각각의 IC50 값에 대하여 대칭 표준 오차를 구하였다.
β-글루코세레브로시다제 활성화 검정
고셔 림프모세포 (N370S)를 다양한 농도의 억제제 (0-50 μM)의 존재하에서 3 일 동안 배양시킨 후, β-글루코세레브로시다제 활성을 측정하였다. 세포를 인산염 완충 염수 중에서 2회 세정하고, 작은 다운스 균질화기를 사용하여 물 중에서 균질화시키고, 800 g에서 5 분 동안 원심분리하고, 상청액을 단백질 및 β-글루코세레브로시다제 활성에 대하여 취하였다. 단백질 농도는 제조업자의 지시사항에 따라 BCA 검정 (피어스(Pierce), 영국 소재)을 사용하여 구하였다. 상기 기재된 바와 같이 0.25% 나트륨 타우로콜레이트, 0.1% TX100을 함유하는 0.1 M 시트르산염 인산염 완충액, pH 5.2 중의 균질화물 및 5 mM 4-메틸움벨리페릴-β-글루코시드의 분획을 사용하여 모든 효소 활성화 측정을 실시하였다. 브로모콘두리톨 (500 μM-2.5 mM)을 일부 효소 활성 측정에 첨가하여 β-글루코세레브로시다제에 의한 기질의 특이성 가수분해를 확인하였다. 효소 활성화는 미처치 세포에 대한 처치된 세포 중의 효소 활성 (U/㎎ 단백질)에서의 증가 배수로서 정의된다.
결과:
세라미드 글루코실트랜스퍼라제 억제
글리코스핑고지질의 생합성에서 핵심 효소인 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 세포성 억제를 평가하기 위하여, 화합물을 비-독성 농도에서 HL60 세포에 3 일 동안 투여하였다. 지질 추출, 올리고당 헤드 기의 효소 배출 및 형광 표지 후, 순상 HPLC (NP-HPLC)를 사용하여 생합성의 억제 효과를 분석하였다. HL60 세포는 당지질의 단순 레퍼토리를 가지며, 우세한 종은 모노-시알릴화된 강글리오시드, GM3이다. 이미노 당에 의한 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제는 HPLC 분리후 측정한 GM3의 감소를 초래하였다 (도 4). 하기 표 1은 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 세포성 검정 데이타를 나타낸다. IC50 값은 힐 플롯, 예컨대 도 5에서의 것을 사용하여 계산하였다.
<표 1>
세라미드 글루코실트랜스퍼라제 세포성 검정 데이타
NB-DNJ (UV1)과 비교한 HL60 세포에서의 세라미드 글루코실트랜스퍼라제 활성의 50% 억제를 초래하는 이미노당 UV1-5, UV6.2 및 UV 6.8의 농도
Figure pct00030
상기 표 1의 데이타는 일부 경우에서 100 배가 넘는 개선된 활성을 명백하게 나타낸다. 시험관내 데이타가 활성의 우수한 표시를 제공하기는 하나, 이러한 데이타는 화합물의 접근 및 보유에서의 임의의 세포성 차이가 고려되도록 하므로 중요하다. 접근으로 인한 임의의 변동은 이미노당으로 자유로이 접근 가능한 CGT의 세포 위치로 인하여 제한될 수 있다. 시토솔 중의 화합물의 농도가 세포외 농도와 평형 상태를 이루도록 이미노당은 형질막이 신속하게 그리고 효율적으로 가로지를 수 있다. N-알킬화 DNJ 유사체는 세포에 신속하게 유입될 수 있으며, 여기서 시스 골지(Golgi)의 시토솔쪽에서의 세라미드 글루코실트랜스퍼라제와 직접 상호작용할 수 있다.
β-글루코세레브로시다제 억제
실험한 화합물 모두는 4-메틸움벨리페릴-β-글루코시드를 사용한 형광원 검정에 의하여 측정시 NB-DNJ에 비하여 인간 태반 β-글루코세레브로시다제에 대한 개선된 억제 효능을 나타냈다 (표 2). 하기 표 2에서의 IC50 값은 힐 플롯, 예컨대 도 6에서의 것을 사용하여 계산하였다.
<표 2>
인간 태반 β-글루코세레브로시다제에 대한 시험관내 데이타
NB-DNJ (UV1)과 비교하여 β-글루코세레브로시다제 활성의 50% 억제를 초래하는 이미노당 UV1-5, UV6.2, UV6.4, UV6.5 및 UV6.8의 농도
Figure pct00031
표 2에서의 시험관내 데이타는 실험한 화합물이 UV1 (제베스카)에 비하여 놀랍게도 더 높은 β-글루코세레브로시다제 억제 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 이러한 데이타는 실험한 화합물이 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있으며, ER에서의 돌연변이 효소에 결합될 수 있으며, 분해로부터 보호할 수 있는 정도로 단백질을 안정화시킨다는 것을 시사한다.
β-글루코세레브로시다제 를 샤페로닝하는 능력
가장 흔한 N370S 변이를 갖는 돌연변이 고셔 림프모세포에서 화합물의 세트의 샤페론 활성을 하기 표 3에 보고한다. 이러한 데이타는 미처치 세포에 비하여 β-글루코세레브로시다제 활성에서의 증가 배수를 나타낸다. 전체 투여량-반응 관계는 도 7에 기재한다.
<표 3>
고셔 섬유모세포에서의 β-글루코세레브로시다제의 향상 수준
Figure pct00032
한 번 더, 실험한 이미노당은 UV1에 비하여 효능에서의 놀라운 향상을 나타낸다. 또한, SRT를 제공하는 화합물의 사용시 리소솜에서의 증가된 활성이 질환과 관련된 임의의 GSL 축적 문제를 증가/제거할 수 있으므로, 2-배 증가는 잠재적 처치와 관련하여 상당한 것이다.
개요
실험한 이미노당은 제베스카 (UV1)에 비하여 세포성 표적에 대한 놀랍게도 더 높은 효능을 나타냈다. 세라미드 글루코실트랜스퍼라제는 상기 기재된 바와 같은 다수의 질환, 예컨대 리소솜 축적 질환 (LSD), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 특히 LSD (고셔병 포함)의 치료에서 치료 표적이 된다. (상기 정의된 기질 감소 치료법 다음으로) 고셔병의 치료에 대한 작용의 제2의 기전은 돌연변이 β-글루코세레브로시다제의 적절한 폴딩을 촉진하는 소 분자를 사용한 고셔병의 샤페론-매개된 요법이다. 이미노당은 β-글루코세레브로시다제의 이와 같은 특정한 돌연변이 형태의 적절한 폴딩을 촉진하는 것으로 나타났으므로, 제2의 기전은 미스폴딩된 변이 N370S로 인하여 고셔병을 갖는 환자에게만 효과적일 수 있다. GBA 유전자에서의 300개 초과의 변이, 아슈케나지 쥬스(Ashkenazi Jews)에서 가장 흔한 변이 5개 중 3개 ― N370S, 84GG 및 V394L가 보고되었다 (Fares et al., 2008). 매20개의 아슈케나지 쥬스에서 약 1개가 N370S 변이의 복제물을 지닌다. 매334개에서 약 1개가 84GG 변이의 복제물을 지닌다. V394L 변이는 매1,112개의 아슈케나지 쥬스에서 약 1개에서 발견된다. N370S 변이는 오직 일반적으로 신경계 증상이 결여되어 있는 1형 고셔병과 관련되어 있다 (Elstein et al., 2001). N370S 변이는 샤페론 요법으로 처리할 수 있으므로, 본 발명의 화합물은 제I형 고셔병의 N370S 변이의 경우에서 부분적으로 기질 환원 (세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제)에 의하여 그리고, 부분적으로 샤페론 효과 (β-글루코세레브로시다제의 폴딩의 촉진)에 의하여 매개되는 작용의 2중 기전을 갖는다는 것을 알 수 있다. 이러한 변이는 돌연변이 효소의 샤페론-매개된 폴딩을 허용하며, 이를 ER에서 ERAD 수송체에 의한 박멸로부터 보호하며, 추가로 적절하게 폴딩된 효소를 그의 적절한 도착 소기관인 리소솜으로 정확히 트래픽킹하는 것을 허용한다. 이미노당으로 뚜렷하게 접근 가능할 수 있는 골지 장치의 세포질 면에서 CGT가 발견되는 한편, ER (샤페로닝 효과가 발생함)은 이미노당으로의 접근 가능성이 훨씬 더 적을 수 있으므로, 이들 2종의 표적 효소 (β-글루코세레브로시다제 및 CGT)의 세포성 위치가 또한 중요할 수 있다. 그러나, 화합물의 부억제 수준은 샤페론 효과를 발휘하는데 필요할 수 있으므로, 이러한 성질은 본 발명의 화합물의 이로운 특징이 될 수 있다.
참조 문헌:
Figure pct00033
실시예 3
Huh7.5 세포 배양액 (도 14): 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 1x MEM 및 10% FBS가 보충된 DMEM 중에서 Huh7.5 세포를 성장시켰다. 모든 배양은 37℃/5% CO2에서 이루어졌다. 세포성 지질 프로파일에 대한 이미노당 처치의 효과는 이미노당의 존재 또는 부재하에서 4 일 동안 배양후 세포 중에서 측정하며, 이 시점에서 트립신/EDTA를 사용하여 수거하고, 저온 PBS 중에서 3회 세정하고, 트리판 블루 염색을 사용하여 계수하고, 최종 세포 펠릿을 메탄올:아세톤 (vol 1:1) 중에서 재현탁시킨 후, 지질 프로파일 처리하였다. 소 부피의 각각의 샘플을 브래드포드(Bradford) 단백질 검정 (바이오-래드(Bio-Rad))을 사용한 총 단백질 추정에 사용하였다.
GlcCer 및 LacCer 의 측정 (도 14):
글루코실 세라미드 (MS 방법론이 갈락토실 모이어티로부터 글루코실을 구분할 수 없으므로 '글리코실 세라미드'의 측정으로부터 측정 및 추론함) 및 락토실세라미드 (LacCer)의 명백한 측정은 하기와 같이 세포성 지질의 포괄적인 리피도믹(lipidomic) 분석의 일부로서 실시하였다. 방법론은 상기에서 상세하게 기재하였다 (Wolf, C., Quinn, P. J., Lipidomics: Practical aspects and applications. Progress in Lipid Research 2008, 47, 15-36: Quinn, P. J., Rainteau, D., Wolf, C., Lipidomics of the red cell in diagnosis of human disorders. Methods Mol Biol 2009, 579, 127-159). 배양된 간암 Huh7.5 세포의 펠릿을 Bligh & Dyer의 방법을 사용하여 클로로포름으로 추출하였다 (Bligh, E. G., Dyer, W. J., A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 1959, 37, 911-917). 클로로포름 추출물을 폴리비닐-알콜 작용화된 실리카 컬럼 (PVASil, YMC, ID 4 ㎜, 길이 250 ㎜, 인터킴(Interchim), 프랑스 몽뜰뤼쏭 03100 소재)에서의 HPLC (아질런트(Agilent) 1200 시리즈)로 처리하여 다양한 지질 유형을 분리하였다. 덜 극성인 지질 (트리글리세리드, 디글리세리드, 콜레스테롤 에스테르, 세라미드, 글루코실- 및 락토실세라미드)을 용매계 헥산/이소프로판올/물 아세트산암모늄 10 mM (40/58/2 vol/vol)에 의하여 5 내지 15 분 사이에 용출시켰다. 그 후, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 리소포스파티딜콜린의 기재된 순서로 15 내지 60 분 사이에서의 증가되는 극성에 대하여 용매 헥산/이소프로판올/물 아세트산암모늄 10 mM (40/50/10 vol/vol)에 의하여 인지질을 용출시켰다. 분광계 (터보아이언(TurboIon), 미국 매사츄세츠주 01701 프레이밍햄 소재)의 전기분무 계면으로 용출된 지질을 채널링시켰다. 지질 이온화는 M+NH4 + 및 M+H+ 검출에 대하여 양성 모드로 실시하였다. 연속적으로 용출된 지질 유형의 특징적 조각 이온을 모니터하기 위한 "충돌 유도된 분해" 모드 (또는 "전구체" 모드)로 실시하는 삼중 4극 질량 분광계 (API3000, ABSciex, 캐나다 토론토 소재)에 소스를 커플링시켰다. 특징적 조각 이온의 전구체 분자 종은 배양된 간암 세포에 대하여 생성된 라이브러리내에서 소프트웨어 LIMSA를 사용하여 확인하였다 (Haimi, P., Chaithanya, K., Kainu, V., Hermansson, M., Somerharju, P., Instrument-independent software tools for the analysis of MS-MS and LC-MS lipidomics data. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2009, 580). 복수의 반응 모니터링 (MRM)에 의한 정량화를 위하여 이온쌍 (전구체/생성물 이온)의 리스트로 확인된 지질의 분자 종을 생성하였다. 해당 MRM 피크는 시간-적분하였다. 유형에서의 모든 분자 종의 고른(even) 반응 계수를 추정하여 적절한 지질 유형 표준물질에 대하여 지질의 양을 게산하였다.
프로파일을 비교하는 통계적 절차는 소프트웨어 XLStat® (버젼 2011. 2; 애딘소프트(Addinsoft), 프랑스)를 사용하여 수행하였다. 파라미터 테스트, 다변수 분석, 상관관계 테스트 및 회귀 절차는 (Golmard, J. L., 2012, Analyse Statistique des Donnees , Edition Ellipses, Paris 75740 Cedex 15, France)에 기재된 바와 같이 적용하였다
* * *
상기에서 특정한 바람직한 실시양태를 언급하였으나, 본 발명은 그와 같이 한정되지 않는 것으로 이해될 것이다. 다양한 수정예가 개시된 실시양태로 이루어질 수 있으며, 그러한 수정예는 본 발명의 범주내에 포함시키고자 한다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 발생될 것이다.
본 명세서에서 인용한 모든 공보, 특허 출원 및 특허는 본원에 참조로 그 전문이 포함된다.

Claims (42)

  1. 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소 방법.
  2. 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00034

    상기 화학식에서, R은
    Figure pct00035
    이고;
    R1은 치환 또는 비치환된 알킬 기이고;
    W1-4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고;
    X1 -5는 H, NO2, N3 또는 NH2로부터 독립적으로 선택되고;
    Y는 존재하지 않거나 또는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기이고;
    Z는 결합 또는 NH로부터 선택되며,
    단 Z가 결합인 경우, Y는 존재하지 않고,
    단 Z가 NH인 경우, Y는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기이다.
  3. 제2항에 있어서, R1이 치환 또는 비치환된 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸 또는 옥틸 기인 방법.
  4. 제2항에 있어서, Z가 NH인 방법.
  5. 제2항에 있어서, X1-5 중 하나 이상이 NO2, N3 또는 NH2로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 하기 화학식 IA의 화합물의 구조를 갖는 것인 방법.
    <화학식 IA>
    Figure pct00036
  7. 제6항에 있어서,
    R1이 -(CH2)5-이고;
    W1-4가 H이고;
    X1이 NO2이고;
    X3이 N3이고;
    X2, X4 및 X5가 H이고;
    Y가 -(CH2)-이고;
    Z가 NH인 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    R1이 -(CH2)5-이고;
    W1 -4는 H이고;
    X1 및 X3이 NO2이고;
    X2, X4 및 X5가 H이고;
    Y가 -(CH2)-이고;
    Z가 NH인 방법.
  9. 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소 방법.
    <화학식 II>
    Figure pct00037

    상기 화학식에서, R이
    Figure pct00038
    이고;
    R'는 치환 또는 비치환된 알킬 기이고;
    W1 -4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고;
    X1-5는 H, NO2, 할로겐, 알킬 또는 할로겐화 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
  10. 제9항에 있어서, R'가 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 비치환 또는 치환된 알킬 기인 방법.
  11. 제10항에 있어서, R'가 1 내지 3개의 산소 원자로 치환된 알킬 기인 방법.
  12. 제11항에 있어서, R'가 (CH2)n-O-(CH2)m이며, 여기서 n은 5-8이고, m은 0-4인 방법.
  13. 제10항에 있어서, R'가 아미노-치환된 알킬 기인 방법.
  14. 제13항에 있어서, R'가 (CH2)p-NH-(CH2)q이며, 여기서 p는 5-8이고, q는 0-2인 방법.
  15. 제9항에 있어서, X1 -5 중 하나 이상이 할로겐 또는 할로겐화 알킬인 방법.
  16. 제9항에 있어서, 화학식 II의 화합물이 하기 화학식 IIa를 갖는 것인 방법.
    <화학식 IIa>
    Figure pct00039
  17. 제16항에 있어서, R이
    Figure pct00040

    로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 하기 화학식:
    Figure pct00041
    의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소 방법.
  19. 제1항, 제2항, 제9항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 세라미드 글루코실트랜스퍼라제의 억제 및/또는 당지질 농도의 감소가 이로운 질환 또는 상태를 갖는 대상체이며, 상기 투여로 상기 질환 또는 상태를 치료되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 질환 또는 상태가 고셔병, 파브리병, 샌드호프병, 타이-작스병, GM1 강글리오시드증, C형 니만-픽병, 제2형 당뇨병, 당뇨병성 신병증과 관련된 비대증 또는 증식증, 상승된 혈액 글루코스 수준, 상승된 당화 헤모글로빈 수준, 사구체 질환 또는 루푸스인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 질환 또는 상태가 제I형, 제II형 또는 제III형 고셔병인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 투여가 β-글루코세레브로시다제 활성의 샤페로닝을 발생시키는 것인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 질환 또는 상태가 전신 홍반성 루푸스인 방법.
  24. 제1항, 제2항, 제9항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  25. 당지질을 생성할 수 있는 세포를 당지질 억제 유효량의 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 처리하는 것을 포함하는, 상기 세포에서의 당지질 생합성의 억제 방법.
  26. 당지질을 생성할 수 있는 세포를 당지질 억제 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 처리하는 것을 포함하는, 상기 세포에서의 당지질 생합성의 억제 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00042

    상기 화학식에서, R은
    Figure pct00043
    이고;
    R1은 치환 또는 비치환된 알킬 기이고;
    W1 -4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고;
    X1 -5는 H, NO2, N3 또는 NH2로부터 독립적으로 선택되고;
    Y는 존재하지 않거나 또는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기이고;
    Z는 결합 또는 NH로부터 선택되며,
    단 Z가 결합인 경우, Y는 존재하지 않고,
    단 Z가 NH인 경우, Y는 카르보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C1-알킬 기이다.
  27. 당지질을 생성할 수 있는 세포를 당지질 억제 유효량의 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 처리하는 것을 포함하는, 상기 세포에서의 당지질 생합성의 억제 방법.
    <화학식 II>
    Figure pct00044

    상기 화학식에서, R은
    Figure pct00045
    이고;
    R'는 치환 또는 비치환된 알킬 기이고;
    W1 -4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고;
    X1-5는 H, NO2, 할로겐, 알킬 또는 할로겐화 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처리가 시험관내에서 수행되는 것인 방법.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 당지질이 글루코세라미드계 글리코스핑고지질을 포함하는 것인 방법.
  30. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 당지질이 GM3을 포함하는 것인 방법.
  31. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 인간 세포인 방법.
  32. 하기 화학식 I의 화합물.
    <화학식 II>
    Figure pct00046

    상기 화학식에서, R은
    Figure pct00047
    이고;
    R'는 치환 또는 비치환된 알킬 기이고;
    W1 -4는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬 기, 치환 또는 비치환된 할로알킬 기, 치환 또는 비치환된 알카노일 기, 치환 또는 비치환된 아로일 기 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일 기로부터 독립적으로 선택되고;
    X1-5는 H, NO2, 할로겐, 알킬 또는 할로겐화 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
  33. 제32항에 있어서, R'가 1 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 비치환 또는 치환된 알킬 기인 화합물.
  34. 제32항에 있어서, R'가 1 내지 3개의 산소 원자로 치환된 알킬 기인 화합물.
  35. 제32항에 있어서, R'가 (CH2)n-O-(CH2)m이며, 여기서 n은 5-8이며, m은 0-4인 화합물.
  36. 제32항에 있어서, R'가 아미노-치환된 알킬 기인 화합물.
  37. 제32항에 있어서, R'가 (CH2)p-NH-(CH2)q이며, 여기서 p는 5-8이며, q는 0-2인 화합물.
  38. 제32항에 있어서, X1 -5 중 하나 이상이 할로겐 또는 할로겐화 알킬인 화합물.
  39. 제32항에 있어서, X3 및 X5 중 하나 이상이 할로겐, NO2 또는 할로겐화 알킬이며, X1, X2 및 X4가 수소인 화합물.
  40. 제32항에 있어서, X3 및 X5 중 하나 이상이 F 또는 Cl인 화합물.
  41. 제32항에 있어서, 하기 화학식 IIa를 갖는 화합물.
    <화학식 IIa>
    Figure pct00048
  42. 제32항에 있어서, R이
    Figure pct00049

    로부터 선택되는 것인 화합물.
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