KR20170015513A - 면역글로불린 단일 가변 도메인을 이용한 ttp의 치료 방법 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 vWF(von Willebrand Factor)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 인간 TTP 환자에게 투여가 반응까지의 시간을 상당히 감소시킨다는 발견에 기초한다. 본 발명은 vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그를 치료하는데 사용하기 위한 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 TTP를 치료하기 위한 투여 단위 형태, 키트 및 의료 용도에 관한 것이다.

Description

면역글로불린 단일 가변 도메인을 이용한 TTP의 치료 방법 및 그의 용도{METHODS OF TREATING TTP WITH IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF}

1. 발명의 분야

본 발명은 vWF에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 인간 TTP 환자에게 투여가 반응까지의 시간을 상당히 감소시키고 더 적은 합병증을 제공한다는 발견에 기초한다. 본 발명은 vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그를 치료하는데 사용하기 위한 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD: immunoglobulin single variable domain)을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 TTP 치료를 위한 투여 단위 형태, 키트 및 의료 용도에 관한 것이다.

2. 발명의 배경

2.1 혈소판 응집에서 vWF의 역할

다량체 혈장 단백질 폰 빌레브란트 인자(vWF)는 혈관 손상 시 손상된 혈관벽에 순환하는 혈소판을 동원하는데 필수적이다. 이러한 동원은 혈소판 수용체 당단백질 GPIb-IX-V와 vWF A1-도메인의 결합을 통해 매개된다.

내피세포에 의해 발현될 때, vWF는 초대형 다량체 또는 초대형 vWF(ULvWF: ultra-large vWF)로서 순환계로 분비된다. 이들 다량체는 ADAMTS13에 의한 효소 절단을 거쳐 보통 크기의 더 작은 다량체로 프로세싱된다. 이들 보통 크기의 vWF 다량체에서, A1 도메인 내 GPIb-IX-V 혈소판 수용체 결합 부위는 잠재되어 있어서 혈소판과 자발적으로 반응하지 못한다. A1 도메인 내 GPIb-IX-V 혈소판 수용체 결합 부위의 입체 형태적 활성화가 고정화에 의해서 또는 전단 스트레스의 조건하에서 유발되어 결과적으로 혈소판 부착에 이어 혈전 형성을 일으킨다.

2.2 TTP의 병태생리학에서 vWF 및 vWF 프로세싱의 역할

혈전성 혈소판 감소성 자반증("TTP")은 생명을 위협하는 혈액 응고 체계의 희귀 질환으로, ULvWF 다량체의 축적이 관련되어 과도한 혈소판 응집으로 인한 소혈관에서 혈전 형성의 위험을 증가시킨다. 병태는 미세 순환에서의 전신성 혈소판 응집으로 많은 기관에서 파동성 허혈증을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이것이 지속되는 경우, 극심한 혈소판 감소증 및 적혈구 분절과 연관된 조직 경색을 일으킬 수 있다.

ULvWF 다량체는 본래 혈소판 수용체 GPIb-IX-V와 자발적으로 상호작용할 수 있다. 건강한 피험체에서, 이들 ULvWF 다량체는 vWF 프로테아제 ADAMTS13에 의한 절단을 통해 보통 크기의 vWF 다량체로 즉시 프로세싱된다. 그러나 ADAMTS13 활성은 유전성 TTP 및 후천적 특발성 TTP에서 심각하게 결핍되어 있다는 것이 발견되었다. 대부분의 TTP 환자는 ADAMTS13에 대한 자가 항체를 가져, 결과적으로 ULvWF 다량체의 프로세싱에 장애를 가져온다. 결과적으로, ULvWF의 A1 도메인은 구성적으로 활성을 가지며 GPIb-IX-V 혈소판 수용체와 용이하게 상호작용을 한다. 이것은 결국 TTP 환자 집단에서 발견되는 특징적인 혈병 형성을 일으킨다.

혈장 교환(plasma exchange: 본원에서 "PE" 또는 "PEX"로 축약됨) 및 수혈을 이용한 TTP의 현치료법은 대체 ADAMTS13을 제공하고 효소에 대한 항체를 제거하여, 점진적으로 ULvWF 프로세싱을 정상화시킨다. 그러나 상기 치료법은 수일에 걸친 수차례의 교환 및 수혈을 요구하며, 그 과정에서 ULvWF 매개 혈소판 응집의 활성 과정에 직접적인 약리학적 표적화는 존재하지 않는다.

PE 및 수혈의 도입이 지난 30년간 사망률을 상당히 감소시켰지만, 병태는 여전히 사망과 이환의 상당한 위험을 지닌다. 현치료법으로 관리 받는 환자에서 급성 특발성 TTP의 급성 발작으로 인한 사망률은 대략 10% 내지 30%이다(Vesely et al. Blood 2003; 102: 60-68; Allford et al. Br.J.Haematol. 2003; 120: 556-573; Sadler et al. Hematology. Am.Soc.Hematol.Educ.Program. 2004; 407-423). 속발성 TTP의 경우, PE 및 수혈은 효과가 떨어지는 것으로 인정되고 사망률은 상당히 더 높아진다. PE가 상당히 효과적인 것으로 생각되는 경우로 임신으로 인해 질환이 속발되는 경우, TTP의 급성 발작으로 인한 사망률은 대략 25%이고, 동시에 발생하는 전자간증의 사례에서는 40% 이상으로 증가한다(Martin et al. Am.J.Obstet.Gynecol. 2008; 199: 98-104). 그러나 예를 들어 기저의 악성종양 또는 골수 이식에 속발되는 경우 상기 치료 요법을 이용하는데도 불구하고 사망률은 40% 내지 60%에 머무른다(Sadler et al. 2004 상기 문헌; Elliott et al. Mayo Clin.Proc. 2003; 78: 421-430; Kremer Hovinga and Meyer Curr.Opin.Hematol. 2008; 15: 445-450.)

TTP로 인해 상당한 수준의 사망률이 계속되고 PE 및 수혈로 인한 합병증이 관찰되고 있기 때문에, 상기 치료 방법을 보완하거나 가능하게는 그에 대한 요구를 감소시키기 위한 추가적인 치료 접근법의 개발이 명백하게 요구된다.

지난 30년에 걸쳐 TTP에 수행된 연구는 질환의 병태생리학에 대한 이해를 향상시켰으며 이로써 기저 질환 과정을 표적화하는 신규 제제의 개발을 가능하게 하였다. 그럼에도, 현재 인정받는 TTP의 치료법은 존재하지 않으며, 더 새로운 치료법이 현재 평가되는 중이라고는 하지만, 가능한 이들 치료법에 대한 연구는 비교적 초기 단계에 있다.

vWF에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)은 예를 들어 WO2004/015425호, WO2004/062551호, WO2006/074947호, WO2006/122825호, WO2009/115614호 및 WO2011/067160호에 기재되었다.

vWF에 대한 ISVD(예를 들어, ALX 0081)는 다량체 vWF에 강하게 결합함으로써, GPIb-IX-V 혈소판 수용체와 임의 크기의 활성화 단계의 다량체 vWF의 상호작용을 차단한다는 것이 밝혀졌다. ALX 0081은 vWF와 매우 특이적으로 상호작용하고, 인간 혈액 세포 또는 혈소판과는 상호작용하지 않는다. 게다가, 그는 vWF A1 도메인의 결합을 통해 혈소판 GPIb-IX-V 수용체를 선택적으로 방해하며, vWF가 원섬유 콜라겐 또는 콜라겐 VI형과 상호작용하는 능력에 영향을 주지 않는다. 또한, vWF에 대한 ISVD(예를 들어, ALX 0081)는 (남아있는) vWF-프로테아제 ADAMTS13의 활성에 영향을 주지 않으며, 그들은 vWF에 FVIII의 결합을 방해하지도 않는다는 것이 증명되었다.

I상 연구에서, ALX 0081은 안전하며 건강한 지원자에서 우수한 용인성을 보인다는 것이 증명되었다.

그러나 건강한 인간 지원자에서는 TTP 환자의 근본적인 병리학에 있어 일반적으로 vWF에 대한 ISVD 또는 구체적으로 ALX 0081의 효능에 대해 예측되지 않는다. vWF는 TTP 환자에서 양적으로나 질적으로 비정상적이다. ULvWF가 TTP 환자에서 지혈에 정상적으로 기능을 하지 못하는 것으로 받아들여 지지만, 근본적인 기전은 이해되지 않고 있다. TTP 환자에서, 급성 에피소드에서 더 높은 vWF 수준이 예상된다(Lotta et al. 2011 J Thromb Haemost 9: 1744-51; Stufano et al. 2012 J Thromb Haemost 10:728-730).

적절한 동물 모델의 부재로 인해 ALX 0081이 ULvWF를 중화시키는 생체 내 효능은 증명되지 않았다.

따라서, ALX 0081과 같은 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드가 TTP 환자에서 유익한지, ALX 0081과 같은 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드가 PE보다 긍정적인 효과를 보이는지, 그리고 어떤 효과적인 치료법 및 용량 요법이 있을 지가 설명되지 않은 채로 남아 있다.

TTP 환자를 위한 개선된 치료법이 요구된다.

3. 발명의 요약

본 발명은 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드의 인간 TTP 환자에게 투여가 혈소판 ≥ 150,000/㎕의 회복으로 구체화되는 반응까지의 시간을 2일 감소시킨다는 예상 밖의 발견에 기초한다. 혈소판 수의 증가는 병리학적 혈소판 응집이 감소하여 상기 질환의 특징인 혈소판-vWF 복합체에 의해 개시되는 혈전 형성과정을 감소시킨다는 신호이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 플라세보의 위험률("HR": Hazard Ratio)은 95% CI(1.28, 3.78), p = 0.013일 때 2.2로 놀라웠다. 상기 반응은 반응까지의 시간 후 48시간까지 확인되었다. 이런 이유로, 본 발명의 폴리펩티드의 개념 증명은 혈소판 반응 확인까지의 시간의 통계적으로 유의하고 임상적으로 의미 있는 감소로 입증되었다. 게다가, 플라세보 군에서 11명에서 치료 군에서 3명으로 악화 횟수가 감소하였다. 플라세보 군에서 2명의 사망자에 비해 치료 군에서는 사망자가 존재하지 않았다.

게다가, TTP 환자의 본 임상 연구는 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, ALX 0081)가 우수한 용인 제제(tolerated agent)라는 것과, 특히 출혈 위험 가능성이 존재하지만 낮고 관리 가능해 보임을 또한 증명한다. 그러므로 현 시점의 데이터는 PE와 수혈 및 그와 관련된 합병증에서의 감소가 본 발명의 폴리펩티드 자체의 사용으로 심각한 부작용 없이 달성된다는 것을 증명한다. 이것은 TTP 환자 치료에 본 발명의 폴리펩티드를 사용하는데 확실한 안전 효과를 나타낸다.

이러한 이유에서, vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드의 인간 TTP 환자에게 투여는 반응까지의 시간의 예상 외의 감소, 지속 및 지연 효과, 악화 감소, 입원 감소, 이환율 감소, 사망 감소 및/또는 PE 횟수의 감소를 제공한다.

PE 및 수혈을 이용한 TTP의 현치료법은 대체 ADAMTS13을 제공하고 효소에 대한 항체를 제거하여, 점진적으로 ULvWF 프로세싱을 정상화시킨다. 그러나 상기 치료법은 수일에 걸쳐 수차례의 교환 및 수혈을 요구하며, 그 과정에서 ULvWF 매개 혈소판 응집의 활성 과정에 직접적인 약리학적 표적화는 존재하지 않는다.

게다가 예상치 못하게 본 발명의 폴리펩티드가 혈장 수혈로 대체된 효소를 방해하지 않는다는 것을 확인하였다. 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, ALX 0081)를 PE 및 수혈과 함께 이용하여, 미세혈관계에서 소혈전의 계속적인 형성 및 혈소판의 소비를 직접적으로 억제할 수 있다는 것을 증명하였다. 이는 허혈성 및 출혈성 합병증의 수준 감소 덕분에 기저의 혈전 과정 및 수반되는 혈소판 소비의 더 신속한 조절을 가능하게 해준다. 또한, PE 및 수혈의 기간을 단축하고 그 횟수를 감소시켜 더 신속한 임상적 회복과 더 낮은 이환율을 가져온다. 실제로, 특정의 임상적으로 적절한 기관 손상 생물지표 LDH, 트로포닌 T 또는 I 및 크레아티닌에 대한 분석은 더 신속하게 감소하는 미세혈관 조직 허혈증이 임상적으로 유익할 것으로 기대될 수 있다는 것을 시사하였다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, ALX 0081)에 의한 ULvWF 매개 혈소판 상호작용의 억제가 증명되고 항혈전 효과가 관찰되어 환자가 TTP의 급성 발작에서 회복된 후 질환의 재발을 예방하기 위하여 더 긴 기간 사용될 가능성을 제기한다. TTP의 급성 발작의 빈도 감소는 TTP와 관련된 사망률 및 이환률의 감소 및 환자 평생에 걸친 PE 및 수혈의 필요성에 있어 추가적인 감소에 대한 가능성으로 상당히 유익하다는 것을 나타낸다.

TTP로부터 더 신속한 회복 및 악화와 재발의 감소는 치료 효능 측면에서 명백하게 임상적으로 유익하면서, PE와 수혈의 기간 및 빈도의 감소도 환자의 안전성 측면에서 추가적인 이점을 제공한다. PE 및 수혈은 현재 TTP 관리에 있어 표준 치료법으로 생각되지만(Scully et al. Br.J.Haem. 2012; 158:323-335), 절차는 상당한 합병증의 위험을 지닌다. PE 절차는 중심 정맥 이중 내강 혈액투석 카테터의 사용에 필수적인 높은 체액량과 높은 유속을 요구한다. 절차로 인한 합병증은 카테터 삽입으로 인한 출혈, 패혈증, 카테터 혈전증, 기흉, 체액량 과부하증, 저산소증 및 저혈압을 포함한다(Fontana et al. Semin.Hematol. 2004; 41: 48-59; George J.Intensive Care Med. 2007; 22: 82-91; Howard et al. Transfusion 2006; 46: 154-156; Rizvi et al. Transfusion 2000; 40: 896-901; Nguyen et al. Transfusion 2009; 49: 392-394). 유사 아나필락시스 반응은 절차의 0.25% 내지 0.5%를 악화시킨다(Allford et al 2003 상기 문헌; George 2007 상기 문헌). 또한, 혈액 산물을 포함하는 혈장의 주입은 비전염성의 TRALI(수혈 관련 급성 폐 장애)를 일으킬 수 있다. 상기 병태는 수혈 관련 사망자의 가장 빈번한 원인 중 하나로 인정되는데, 발병률은 일일 평균 17 혈장 단위로 혈장 포함 단위당 0.02% 내지 0.05%로 추정되고, 일일 위험도는 0.34% 내지 0.85% 범위로 계산될 수 있다. 대부분의 TTP 환자는 수차례의 PE 및 수혈을 필요로 한다. 급성 특발성 TTP 환자는 매일 치료를 필요로 하고, 완화를 달성하는데 평균 대략 16회 치료가 요구된다(Allford et al. 2003 상기 문헌). 난치성일 경우에, 치료 빈도는 1일 2회로 증가시킬 수 있다(Allford et al. 2003 상기 문헌). 가족성 TTP 환자 경우, 2 내지 3주 간격으로 규칙적인 예방 혈장 주입이 권장된다(Lammle et al. J.Thromb.Haemost. 2005; 3: 1663-1675). 따라서, 아나필락시스 및 TRALI는 치료법이 이러한 빈도의 규칙적인 PE 및 수혈을 요구하는 TTP 환자에게 확실한 위험을 나타낸다. 신선 동결 혈장 대신에 용매/계면활성제(S/D) 처리된 혈장을 사용하는 경우 상기 위험도는 더 낮아질 수 있다고 생각되지만, 대용량의 S/D 혈장 사용은 정맥 혈전 색전증의 위험도 증가와 관련될 수 있다(Allford et al. 2003 상기 문헌; Fontana et al. 2004 상기 문헌). 종합적으로, 환자의 대략 30% 내지 40%는 PE 및 수혈의 부작용을 경험하며, 그 절차로 인한 사망률은 대략 2% 내지 3%로 추정된다(George et al. Semin.Hematol. 2004; 41: 60-67; George 2007 상기 문헌). 이러한 이유로, PE 및 수혈의 기간 및 빈도의 감소도 역시 환자의 안전성 측면에서 추가적인 이점을 제공한다.

TTP 발작에서 회복된 후, 많은 환자는 수년간 인지 이상을 기술하고 기억, 집중, 기력 감소 및 피로에 고질적인 문제를 보고한다. 상기 증상은 환자의 일상생활의 질에 부정적인 영향을 준다. 게다가, 삶의 질에 있어 이러한 결핍은 병인 및 중증도에 관계없이 모든 TTP 환자에서 발생할 수 있다(Lewis et al. Transfusion 2009; 49: 118-124). 상기 증상은 조직 허혈증의 잔류 효과를 반영하는 것일 수 있다고 생각된다. 이것을 근거로, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 제공하는 TTP로부터 더 신속한 회복 및 미세혈관계에서 혈전 형성의 제한이 삶의 질의 면에서 환자에게 향상된 장기간 성과를 가져온다는 것이 당연히 제안될 수 있다.

따라서, 본 발명은 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드를 피험체에게 투여함으로써 피험체에서 vWF 관련 질환의 치료 또는 완화 방법으로서, 상기 폴리펩티드의 투여량이 반응까지의 시간 감소, 악화 감소, 입원 감소, 허혈 감소, 사망자 감소 및/또는 PE가 요구되는 횟수의 감소에 효과적인 것인 방법을 제공한다. 본 발명은 vWF 관련 질환에 한 가지 이상의 상기 효과를 가져오는 본 발명의 폴리펩티드의 구체적인 용량 범위 및 투여 일정을 제공한다. 특히, 본 발명은 PE를 더 낮은 빈도로 제공하기 위한 요건을 포함하여 당 업계에 현재 사용되고/거나 당 업계에 공지된 제제, 조성물, 방법 및/또는 투여 일정과 비교하여, 확실한 장점을 보이는 약학적 활성제, 조성물, 방법 및/또는 투여 일정을 제공한다. 이러한 장점은 하기 추가 설명에서 명백할 것이다.

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그를 치료하는데 사용하기 위한 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 치료가 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg의 1차 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 폴리펩티드의 상기 투여 후 5분 내지 8시간(h) 이내에 1차 혈장 교환(PE)을 실시하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 1차 용량의 상기 투여 전에 선행 혈장 교환(PE)을 실시하며, 바람직하게는 상기 1차 PE의 36h 이내에, 예를 들어 32h, 30h, 28h, 26h, 24h, 22h, 20h, 18h, 16h, 14h, 12h, 10h, 8h 이내에, 예를 들어 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분 이내에 실시하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 1차 PE 후에 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg의 2차 용량의 상기 폴리펩티드를, 바람직하게는 피하 주사에 의해, 바람직하게는 상기 1차 PE의 1-60분 이내에, 더 바람직하게는 30분 이내에 투여하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 선행 PE가 상기 1차 PE의 36h 이내에, 바람직하게는 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 또는 16h, 바람직하게는 약 24h 이내에 실시되는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 폴리펩티드가 비경구, 바람직하게는 피하, 복강 내, 정맥 내 또는 근육 내 주사에 의해, 바람직하게는 정맥 내(i.v.) 볼러스 일시적(push) 주사에 의해 투여되는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 폴리펩티드의 상기 투여 후 5분 내지 8h 이내에, 예를 들어 10분 내지 6 h 또는 15분 내지 4h 이내에, 예를 들어 8h, 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분 이내에 PE를 실시하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 vWF 관련 질환의 상기 치료가

(ⅰ) PE를 실시하는 단계; 및 (이후에)

(ⅱ) 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 단계(ⅰ)의 상기 PE 후 5분 내지 4h에 투여하는 단계; 및

(ⅲ) 선택적으로 상기 환자의 혈소판 수 및/또는 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계를 더 포함하고,

상기 단계 (ⅰ) 및 단계 (ⅱ)는 바람직하게는 상기 환자의 혈소판 수가 ≥150,000/㎕이고/거나 상기 ADAMTS13 활성이 ADAMTS13 기준 활성의 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45% 또는 심지어 50%일 때까지 1일 1회 반복되는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 환자의 혈소판 수가 최초로 ≥150,000/㎕가 된 후 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 60, 90 또는 심지어 120일 동안 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 1일 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 인간이 완화(관해)에 들어갈 때까지 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 1일 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 ADAMTS13 활성이 ADAMTS13 기준 활성의 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45% 또는 심지어 50%가 될 때까지 상기 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 용량이 약 1-80 mg, 또는 5-40 mg, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 또는 80 mg, 바람직하게는 약 10 mg의 상기 폴리펩티드인 본원에서 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 인간이 TTP의 급성 에피소드, TTP의 악화 또는 TTP의 재발을 겪는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

바람직한 측면에서, 본 발명은 vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료에 사용하기 위한 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드로서,

(1) 선택적으로 선행 혈장 교환(PE)을 실시하는 단계;

(2) 상기 인간에게 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg의 1차 용량의 상기 폴리펩티드를, 단계 (1)이 실시되는 경우, 단계 (1)(의 종료)의 바람직하게는 36h 이내에, 예를 들어 32h, 30h, 28h, 26h, 24h, 22h, 20h, 18h, 16h, 14h, 12h, 10h, 8h 이내에, 예를 들어 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분 이내에 투여하는 단계;

(3) 혈장 교환(PE)을 실시하는 단계, 선택적으로 단계 (2)의 5분 내지 8h 이내에, 예를 들어 10분 내지 6 h 또는 15분 내지 4h 이내에, 예를 들어 8h, 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분 이내에 혈장 교환(PE)을 실시하는 단계;

(4) 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg의 추가 용량의 상기 폴리펩티드를 바람직하게는 단계 (3)(의 종료)의 5분 내지 8h 이내에, 예를 들어 10분 내지 6 h 또는 15분 내지 4h 이내에, 예를 들어 8h, 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분 이내에 투여하는 단계;

(5) 단계 (3) 및 단계 (4)를 1일 1회 반복하는 단계, 선택적으로 상기 환자의 혈소판 수가 ≥150,000/㎕이 되고/거나 상기 ADAMTS13 활성이 ADAMTS13 기준 활성의 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45% 또는 심지어 50%가 될 때까지, 단계 (3) 및 단계 (4)를 1일 1회 반복하는 단계;

(6) 선택적으로 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 환자의 혈소판 수가 최초로 ≥150,000/㎕이 된 후 또는 상기 ADAMTS13 활성이 ADAMTS13 기준 활성의 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45% 또는 심지어 50%가 될 때까지 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90 또는 심지어 120일 동안 1일 1회 투여하는 단계

를 포함하는 것인 폴리펩티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 2개의 항-인간 vWF ISVD를 포함하는 폴리펩티드로서, 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 인간에게 투여하는 단계에 의해 인간에서 vWF 관련 질환의 재발(의 증상)을 예방하는데 사용하기 위한 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 상기 ISVD가 서열 번호 20에 결합하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인를 포함하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 상기 ISVD가 통상적인 4쇄 항체로부터 유래한 중쇄 가변 도메인 또는 중쇄 항체로부터 유래한 중쇄 가변 도메인 또는 나노바디를 포함하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 나노바디가 VHH인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 상기 ISVD가 4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어지며,

a) CDR1이

- 아미노산 서열 YNPMG; 또는

- 아미노산 서열 YNPMG와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지고;

b) CDR2가

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG; 또는

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지고;

c) CDR3이

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; 또는

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은

a) CDR1이 YNPMG (서열 번호 20)이고;

b) CDR2가 AISRTGGSTYYPDSVEG (서열 번호 21)이고;

c) CDR3이 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF (서열 번호 22)인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 ISVD가 서열 번호 19(12A02H1)로 나타낸 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 vWF에 대한 적어도 2개의 ISVD의 각 ISVD가 4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어지며,

a) CDR1이

- 아미노산 서열 YNPMG; 또는

- 아미노산 서열 YNPMG와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지고;

b) CDR2가

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG; 또는

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지고;

c) CDR3이

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; 또는

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 각각의 ISVD가 4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어지며,

a) CDR1이 YNPMG (서열 번호 20)이고;

b) CDR2가 AISRTGGSTYYPDSVEG (서열 번호 21)이고;

c) CDR3이 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF (서열 번호 22)인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 폴리펩티드가 서열 번호 1-19, 바람직하게는 서열 번호 19를 포함하거나 이로 이루어진 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 상기 ISVD가 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 단쇄 폴리펩티드인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 상기 ISVD가 1가 또는 다가인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 상기 ISVD가 단일 특이적 또는 다중 특이적인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 CDR 이식, 인간화, 낙타화, 탈면역화되거나, 또는 파아지 디스플레이에 의해 선택된 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF에 대한 상기 ISVD가 서열 번호 1과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 2개의 항-인간 vWF 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD) 및 항-인간 혈청 알부민(HSA) ISVD를 포함하는 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 폴리펩티드가 약학적으로 허용 가능한 제제로 제제화된 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 제제가 5.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는 시트르산염 또는 인산염 완충제를 포함하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 제제가 비경구 투여, 예를 들어 정맥 내 주사, 피하 주사, 근육 내 주사 또는 복강 내 주사로부터 선택된 한 가지 이상에 적합한 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 상기 제제가 액상, 동결건조, 분무 건조, 재구성된 동결건조 또는 동결 형태인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 제제를 포함하는 용기, 및 사용 설명서를 포함하는 키트 또는 제조 물품을 제공한다.

본 발명은 제제가 바이알 또는 주사용 주사기에 존재하는 것인 본원에 기재된 키트 또는 제조 물품을 제공한다.

본 발명은 제제가 사전 충전된 주사용 주사기에 존재하는 것인 본원에 기재된 키트 또는 제조 물품을 제공한다.

본 발명은 주사기 또는 바이알이 유리, 플라스틱, 또는 시클릭 올레핀 중합체 또는 공중합체로부터 선택된 중합 재료로 구성되는 것인 본원에 기재된 키트 또는 제조 물품을 제공한다.

본 발명은

(a) 약 0.1 mg/mL 내지 약 80 mg/mL 농도의 vWF 결합제;

(b) 약 1% 내지 약 15%(w/v) 농도의 슈크로스, 글리신, 만니톨, 트레할로스 또는 NaCl로부터 선택된 부형제;

(c) 약 0.001% 내지 0.5%(v/v) 농도의 트윈(Tween)-80; 및

(d) 제제의 pH 약 6.0 내지 7.0이 되도록 하는 약 5 mM 내지 약 200 mM 농도의 시트르산염 완충제 및 제제의 pH 약 6.5 내지 7.5가 되도록 하는 약 10 mM 내지 약 50 mM 농도의 인산염 완충제로부터 선택된 완충제

를 포함하며, vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료에 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg 용량, 바람직하게는 10 mg의 상기 폴리펩티드를 인간에게 투여하여 사용하기 위한 제제로서, 상기 용량 후 5분 내지 8 h, 예를 들어 15분 내지 4 h 이내에 1차 혈장 교환(PE)을 실시하는 것인 제제를 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 제제를 포함하는, 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 비경구 투여하기에 적합한 약학 단위 제형을 제공한다.

본 발명은 상기 vWF 관련 질환이 급성 관상 증후군(ACS: acute coronary syndrome), 일과성 뇌 허혈 발작, 불안정형 또는 안정형 협심증, 뇌졸중, 심근경색 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)으로부터 선택되는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 vWF 관련 질환의 특징을 갖는 질환에 걸리기 쉽거나 그로 진단받은 인간 환자의 치료방법으로서, 유효량의 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 치료 또는 예방 방법으로서, 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 인간에게 투여함으로써, vWF 관련 질환과 관련된 한 가지 이상의 증상을 감소시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드의 상기 투여 후에 5분 내지 8 h, 예를 들어 15분 내지 4 h 이내에 1차 혈장 교환(PE)을 실시하는 것인 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드의 상기 투여 전에 선행 혈장 교환(PE)을 실시하며, 상기 1차 PE의 36h, 바람직하게는 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 또는 16h, 바람직하게는 약 24h 이내에 실시하는 것인 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은 상기 1차 PE 후에 1-80 mg, 예를 들어 5 - 40 mg, 바람직하게는 10 mg의 2차 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드를 5분 내지 8h 이내에, 예를 들어 10분 내지 6 h 또는 15분 내지 4h 이내에, 예를 들어 8h, 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분 이내에 투여하는 것인, 예를 들어 상기 2차 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 1차 PE의 1-60분, 예를 들어 30분 이내에 바람직하게는 피하 주사에 의해 투여하는 것인 치료법을 제공한다.

본 발명은

(ⅰ) PE를 실시하는 단계; 및 (이후에)

(ⅱ) 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드를 단계 (ⅰ)의 상기 PE 후 15분 내지 4h에 투여하는 단계; 및

(ⅲ) 선택적으로 상기 환자의 혈소판 수 및/또는 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계를 더 포함하는 치료법으로서,

상기 단계 (ⅰ) 및 단계 (ⅱ)를 선택적으로 상기 환자의 혈소판 수가 ≥150,000/㎕이 되고/거나 ADAMTS13 활성이 ADAMTS13 기준 활성의 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45% 또는 심지어 50%가 될 때까지 1일 1회 반복하는 것인 치료법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 환자의 혈소판 수가 ≥150,000/㎕가 된 후 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 또는 심지어 30일 동안 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드를 1일 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은 상기 인간이 완화에 들어갈 때까지 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드를 1일 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은 ADAMTS13 활성이 ADAMTS13 기준 활성의 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45% 또는 심지어 50%가 될 때까지 상기 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 vWF 관련 질환의 급성 에피소드의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 인간에서 그러한 예방 및/또는 감소 방법으로서, (i) 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하거나 그로 이루어진 방법으로서, 상기 폴리펩티드의 투여가 vWF 관련 질환의 급성 에피소드를 예방하고/거나 이의 위험도를 감소시키는 것인 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 위험도는 계수(factor) 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소된다. 바람직하게는, 상기 위험도는 10% 또는 그 이상 예를 들어 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 그 이상, 예를 들어 80% 또는 심지어 100% 감소된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회, 또는 심지어 10회 이상, 예를 들어 20회, 바람직하게는 30회 이상 또는 그 이상 반복하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일, 또는 10일 이상, 예를 들어 20일, 바람직하게는 30일 이상, 예를 들어 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 동안 반복하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 용량이 1일 1회 또는 1일 2회 투여되는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은

(ⅱ) 상기 환자의 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계;

(ⅲ) 상기 ADAMTS13 활성을 기준 ADAMTS13 활성과 비교하는 단계; 및

(ⅳ) 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 30% 미만, 예를 들어 20%, 15% 또는 10%일 경우, 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 반복하는 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 환자의 상기 ADAMTS13 활성을 매일, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일마다, 바람직하게는 매주 적어도 1회 측정하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 적어도 10%, 15%, 예를 들어 20%, 또는 심지어 30% 이상이 될 때까지 반복하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 ADAMTS13 활성이 적어도 연속 2회 측정시 상기 기준 ADAMTS13 활성의 적어도 10%, 15%, 예를 들어 20% 또는 30%가 될 때까지 단계 (ⅰ)을 반복하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 연속 2회 측정은 적어도 24h, 더 바람직하게는 48h 간격, 예를 들어 적어도 3일 간격, 또는 그 이상 예를 들어, 4, 5, 6, 또는 심지어 7일 간격, 바람직하게는 1주일 간격이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 상기 ADAMTS13 활성이 적어도 2회 연속 측정 시 상기 기준 활성의 적어도 10% 또는 15%, 예를 들어 20% 또는 30%가 된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안, 또는 10일 이상, 예를 들어 20일 이상, 바람직하게는 30일 이상 또는 그 이상 동안 반복하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은

- 상기 환자의 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계;

- 상기 ADAMTS13 활성을 기준 ADAMTS13 활성과 비교하는 단계; 및

- 상기 ADAMTS13 활성이 기준 ADAMTS13 활성의 ≥ 10%, 예를 들어 15% 초과, 또는 20% 또는 30% 초과일 경우, 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 최대 30일, 예를 들어 최대 20일, 또는 심지어 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 또는 심지어 1일 반복하는 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 vWF 관련 질환의 급성 에피소드의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 인간에서 그러한 예방 및/또는 감소 방법으로서, 적어도 하기 단계:

(ⅰ) 상기 환자의 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계;

(ⅱ) 상기 ADAMTS13 활성을 기준 ADAMTS13 활성과 비교하는 단계; 및

(ⅲ) 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 30%, 20%, 15% 또는 10%보다 낮을 경우, 5-40 mg 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은

- 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성의 위험도가 10%, 20%, 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 감소되고/거나;

- 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성의 위험도가 계수 1.2. 1.3, 1.4, 1.5, 1.75, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되고/거나;

- 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성이 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 감소되고/거나;

- 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성이 계수 2 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되고/거나;

- 장기 손상 지표, 예를 들어 LDH 수준, 트로포닌 T, 트로포닌 I 수준, 및/또는 크레아티닌 수준이 정상 수준의 적어도 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 회복되고/거나;

- 장기 손상 지표, 예를 들어 LDH 수준, 트로포닌 T, 트로포닌 I 수준, 및/또는 크레아티닌 수준이 정상 수준의 적어도 20%, 예를 들어 30% 이상, 예를 들어 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 향상되고, 바람직하게는, 상기 장기 손상 지표, 예를 들어 LDH 수준, 트로포닌 T, 트로포닌 I 수준, 및/또는 크레아티닌 수준이 치료 30일 이내에, 바람직하게는, 치료 20일 이내에, 예를 들어, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 이내에 또는 심지어 1일 이내에 향상되고/거나,

- 혈소판 수가 ≥ 150,000/㎕로 유지되고/거나,

- 악화의 위험도가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 감소되고/거나;

- 악화의 위험도가 계수 2 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되고/거나;

- 상기 vWF 관련 질환으로 인한 사망률이 10%, 20%, 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 감소되고/거나;

- 상기 vWF 관련 질환으로 인한 사망률이 계수 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 혈소판 수를 측정하는 단계; 상기 혈소판 수가 150,000/㎕보다 낮을 경우, 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 반복하는 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 환자의 상기 혈소판 수가 매일, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 마다, 바람직하게는 적어도 매주 측정되는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 단계 (ⅰ)을 상기 혈소판 수가 적어도 150,000/㎕가 될 때까지 반복하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 단계 (ⅰ)을 상기 혈소판 수가 적어도 2회 연속 측정 시 적어도 150,000/㎕가 될 때까지 반복하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 2회 연속 측정은 적어도 24h, 더 바람직하게는 48h 간격, 예를 들어 적어도 3일 간격, 또는 그 이상 예를 들어, 4, 5, 6, 또는 심지어 7일 간격, 바람직하게는 1주일 간격이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 상기 혈소판 수가 적어도 2회 연속 측정 시 적어도 150,000/㎕가 된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일, 또는 10일 초과, 예를 들어 20일, 바람직하게는 30일 이상 또는 그 이상 동안 반복하는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 2회 연속 측정은 적어도 24h, 더 바람직하게는 48h 간격, 예를 들어 적어도 3일 간격, 또는 그 이상 예를 들어, 4, 5, 6, 또는 심지어 7일 간격, 바람직하게는 1주일 간격이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 환자의 혈소판 수를 측정하는 단계; 상기 혈소판 수 ≥ 150,000/㎕일 경우, 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 최대 30일, 예를 들어 최대 20일, 또는 심지어 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 또는 심지어 1일 동안 반복하는 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 vWF 관련 질환의 급성 에피소드의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 인간에서 그러한 예방 및/또는 감소 방법으로서, 적어도 하기 단계:

(ⅰ) 상기 환자의 혈소판 수를 측정하는 단계; 및

(ⅱ) 상기 혈소판 수가 150,000/㎕보다 낮을 경우, 5-40 mg 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩티드의 투여가 vWF 관련 질환의 급성 에피소드를 예방하고/거나 위험도를 감소시키는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 적어도 하기 단계:

(ⅰ) 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg의 1차 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계;

(ⅱ) 1차 혈장 교환(PE)을 바람직하게는 단계 (ⅰ)의 5분 내지 8h 이내에 실행하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 기재된 바와 같이, vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 단계 (ⅰ), 즉, 본 발명의 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계 전에 선행 PE를, 바람직하게는 단계 (ⅱ), 즉 1차 PE를 수행하는 단계의 24h 이내에 실시하는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 적어도 하기 단계: (ⅰ) 혈장 교환(PE)을 실시하는 단계; (ⅱ) 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 단계 (ⅰ), 즉 PE를 수행하는 단계, 및 상기 단계 (ⅱ), 즉 본 발명의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 동안 1일 1회 또는 2회 반복하는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 단계 (ⅱ) 즉, 본 발명의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 단계 (ⅰ), 즉 PE를 실시하는 단계의 15분 내지 4h 이내에 실시하는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 상기 인간의 혈소판 수를, 바람직하게는 단계 (ⅱ) 즉, 본 발명의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계 후에, 측정하는 단계; 및 상기 혈소판 수가 < 150,000/㎕일 경우, 상기 단계 (ⅰ), 즉 PE를 실시하는 단계 및 상기 단계 (ⅱ) 즉, 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 상기 인간의 혈소판 수를 [바람직하게는 단계 (ⅱ) 즉, 본 발명의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계 후에] 측정하는 단계; 및 상기 혈소판 수가 적어도 연속 2회 측정 시 적어도 150,000/㎕가 될 때까지 단계 (ⅰ), 즉 PE를 실시하는 단계, 및 단계 (ⅱ) 즉, 상기 폴리펩티드를 상기 인간에 [1일 1회/2회] 투여하는 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 연속 2회 측정은 적어도 24h, 더 바람직하게는 48h 간격, 예를 들어 적어도 3일 간격, 또는 그 이상 예를 들어, 4, 5, 6, 또는 심지어 7일 간격, 바람직하게는 1주일 간격이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 인간의 혈소판 수가 최초로 ≥150,000/㎕이 되고 난 후 적어도 1-30일 동안 1일 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 상기 인간의 ADAMTS13 활성을, 바람직하게는 단계 (ⅱ) 즉, 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계 후에 측정하는 단계를 더 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료 방법으로서, 단계 (ⅰ), 즉 PE를 실시하는 단계, 및 단계 (ⅱ) 즉, 본 발명의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 ADMTS13 활성이 [최초로] 기준 ADAMTS13 활성의 15% 또는 20%, 또는 심지어 30% 이상이 될 때까지 반복하는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 [vWF 관련 질환에 의해 유발될 수 있는] 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 환자에서 그러한 예방 및/또는 감소 방법으로서, 적어도 하기 단계:

(ⅰ) 5-40 mg/일, 바람직하게는 10 mg/일 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 폴리펩티드의 투여가 10%, 20%, 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성을 예방하고/거나 위험도를 감소시키는 것인 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드의 투여가 계수 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성을 예방하고/거나 위험도를 감소시킨다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 또는 그 이상 예를 들어 1주, 2주, 3주, 또는 그 이상 예를 들어 1개월 또는 심지어 2개월 동안 반복하는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 환자의 ADAMTS13 활성을, 바람직하게는 주 1회 측정하는 단계를 더 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 ADAMTS13 활성이 [최초로] 기준 ADAMTS13 활성의 ≥ 10%, 예를 들어 15% 이상, 또는 심지어 20% 이상일 때 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 또는 그 이상 예를 들어 1주, 2주, 3주, 그 이상 예를 들어 1개월 또는 심지어 2개월 동안 반복하는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP에 걸린 인간에서 상기 질환의 증상의 치료 방법으로서, 본 발명의 폴리펩티드를 vWF 관련 질환에 걸린 인간에서 상기 질환의 증상의 치료에 효과적인 양으로 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 인간에서 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 개시 및 진행의 억제 방법으로서, 억제가 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드의 vWF에 대한 결합에 의해 달성되며, 미리 정해진 간격으로 억제 유효량의 상기 폴리펩티드를 인간에게 투여하는 단계를 포함하며, 폴리펩티드의 각각의 투여가 인간 체중 kg당 0.1 mg 내지 25 mg을 인간에게 전달함으로써 인간에서 상기 질환의 개시 또는 진행을 억제하는 것인 방법에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 vWF 관련 질환에 의한 인간 수축 허혈성 장기 손상의 가능성을 감소시키는 방법으로서, 미리 정해진 용량의 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 인간에게 투여하는 단계를 포함하고, 항체의 각각의 투여가 인간 체중 kg당 0.1 mg 내지 25 mg을 인간에게 전달함으로써 인간 수축 허혈성 장기 손상의 가능성을 감소시키는 것인 방법에 관한 것이다.

4. 도면 설명
[도 1] 치료 흐름도
[도 2] 최초 LDH 정상화(정규화)까지 시간 곡선(ITT 집단 = 기저치에서 비정상적으로 높은 수준을 갖는 피험자)
[도 3] 치료의도 집단에서 기저치에서 비정상적으로 높은 수준을 갖는 피험자에 대한 트로포닌 T 또는 I 정상화까지 시간 곡선
[도 4] 치료의도 집단에서 기저치에서 비정상적으로 높은 수준을 갖는 피험자에 대한 크레아티닌 정상화까지 시간 곡선
[도 5] TTP 환자에서 vWF 수준: 플라세보 처리 환자를 포함하여, 1일 용량 수준의 함수로서 기간 2의 종료시 유리(free) vWF 수준의 기저치로부터 모델 예측된 감소율. 평균(중앙), 25번째 및 75번째 백분위 점수를 나타낸다.
[도 6] 카플라시주맙 및 유리, 전체 및 복합체 형성된 vWF의 PK/PD-모델: (A) 기간 1 및 기간 2 동안 매일 s.c. 투여 후 모델 예측된 카플라시주맙 농도 프로파일(동시에 매일 PE가 수반되거나 수반되지 않음). (B) 카플라시주맙의 매일 10 mg s.c. 투여 동안 및 치료 기간 후 모델 예측된 유리 vWF 수준. (C) 카플라시주맙의 매일 10 mg s.c. 투여 동안 및 치료 기간 후 추정된 복합체 카플라시주맙-vWF 수준. (D) 카플라시주맙의 매일 10 mg s.c. 투여 동안 및 치료 기간 후 모델 예측된 전체 vWF 수준. 평균 프로파일, 5번째 및 95번째 백분위 점수를 나타낸다.

5. 상세한 설명

달리 명시하지 않는다면, 상세하게 구체적으로 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 조작은 숙련자에게 명백하듯이 그 자체로 공지된 방법으로 실시될 수 있으며 실시되었다. 예를 들어 본원에 언급된 표준 안내서 및 일반적인 배경 기술 및 그 안에 인용된 추가의 참고문헌, 및 예를 들어 하기 리뷰(Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43)를 또한 참고한다. 상기 리뷰는 단백질 공학 기술, 예를 들어 면역글로불린과 같은 단백질의 특이성 및 기타 바라는 특성을 향상시키기 위한 친화도 성숙 및 기타 기술을 기재한다.

본원에서 사용되는 단수 형태 하나("a", "an", 및 "the")는 문맥에 달리 명백하게 명시되지 않는다면 복수 지시어를 포함하는 것을 주지해야 한다. 따라서, 예를 들어, "시약"의 언급은 한 가지 이상의 상기 다양한 시약을 포함하고 "방법"의 언급은 변형될 수 있거나 본원에 기재된 방법을 대체할 수 있는 당 업자에게 공지된 등가의 단계 및 방법의 언급을 포함한다.

달리 명시되지 않는다면, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 연속물 중에 모든 요소를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 당 업자는 단지 통상적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물들을 본 발명에 포함시키고자 한다.

본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어로 연결된 요소의 전부 또는 임의의 기타 조합"의 의미를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 15% 이내, 더 바람직하게는 10% 이내, 가장 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.

뒤따르는 본 명세서 및 청구항 전반에, 문맥에 달리 요구하지 않는다면, 용어 "포함하다(comprise)", 및 변형 예를 들어 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 포함하지만 임의의 기타 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않는다는 것을 나타내는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용될 때 용어 "포함하는"은 용어 "포함하는("containing" 또는 "including")"으로 대체될 수 있거나 때때로 본원에서 사용될 때 용어 "갖는"으로 대체될 수 있다.

TTP 환경에서 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 치료 가능성은 유동 챔버 실험에서 TTP 환자의 혈장을 이용하는 시험관 내 실험에 의해 증명되었다. 상기 실험에서, 내피세포를 그들의 표면에 ULvWF 스트링을 생산하도록 자극하였다(실시예 7.2 참조). 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081은 혈소판-vWF 상호작용, 특히 시험관 내에서 ULvWF 매개 혈소판 상호작용을 억제할 수 있었다는 것과 또한 ADAMTS13 기능에 영향을 주지 않는 것으로 보였다는 것이 증명되었다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081은 그의 활성(즉, 정상 크기의 다량체로서와 초대형 다량체로서 GPIb-IX-V와 상호작용하는데 기능적인) 단계와 그의 불활성 단계(A1 도메인의 입체 형태 변화에 전에 정상 크기의 다량체) 모두에서 vWF와 상호작용할 수 있다는 것이 증명되었다. 연구는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 TTP 환자 치료에 사용될 수 있다는 개념 증명을 입증하였다. 또한, 연구는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081은 ADAMTS13 활성을 방해하지 않는다는 것을 입증한다.

본 발명은 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드("본 발명의 폴리펩티드(들)"로도 언급됨)의 인간 TTP 환자에게 투여가 반응까지의 시간에 있어 예상 외의 2일 감소를 제공한다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 반응까지의 시간은 혈소판 회복이 ≥ 150,000/㎕이 되는데 필요한 시간으로 구체화되었다. 또한, 본 발명은 예상 외의 지속 및 지연 효과, 악화 감소, 입원 감소, 이환율 감소, 필요한 PE 횟수의 감소, 허혈증 감소, 장기 손상 감소 및 사망률 감소를 제공한다.

따라서, 본 발명은 가속된 혈소판 회복으로 증명되는 반응까지의 시간에서 예상 외의 큰 감소에 의해 환자에서 vWF 관련 질환을 치료 또는 개선하기 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 환자에서 예상 외로 연장된 기간에 혈소판 회복을 여전히 유지하면서 더 낮은 빈도의 PE를 제공한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 환자에게 투여하여 인간 환자에서 반응까지의 시간을 감소시키기 위한 방법으로서, 폴리펩티드의 투여량이 TTP의 한 가지 이상의 질환 지표, 예를 들어 혈소판 수, 혈소판 감소증, 신경인지 기능, 트롬보스폰딘 반복 13(ADAMTS13) 수준을 갖는 디스인테그린 유사 및 메탈로프로테아제 수준 및 항-ADAMTS13 항체 역가, ADAMTS13 활성 수준, 심장 지표(트로포닌 T 또는 트로포닌 I), BNP(뇌 나트륨 이뇨펩티드) 또는 N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨펩티드(NT proBNP), 및 뇌 손상 지표(예를 들어 NSE(neuron specific enolase: 뉴런 특이적 에놀라아제) 및 Sβ100 (S100베타)), 우선적으로 혈소판 수의 증가를 변화시키는데 효과적인 것인 방법을 제공한다.

또한, 인간 TTP 환자에게 투여될 때 본 발명의 폴리펩티드는 안전성 실험실 지표, 예를 들어 RICO, vWF 및 FVIII 색소유전자에 의해 검사된 바와 같이 안전하였다. 출혈 위험의 증가 가능성이 있었지만, 이것은 완전히 관리 가능하였다.

지표는 숙련자에게 공지되고 그들에 의해 이용되는 표준 방법, 예를 들어 효소 결합면역흡착측정법(ELISA; 효소 면역분석법(EIA)으로도 공지됨), 방사선 면역측정법 또는 면역효소측정법을 포함한 다양한 면역 기반 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. 또한, 적합한 경우 화학, 비색 및 효소 기반 분석법이 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 5-40 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 인간에게 투여함으로써 vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 vWF 관련 질환을 치료하는데 사용하기 위한 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 용량 후 15분 내지 4h 이내에 1차 혈장 교환(PE)이 뒤따르는 것인 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 vWF 관련 질환, 예를 들어, TTP를 치료 또는 예방하기 위한(예를 들어, 이와 관련된 한 가지 이상의 증상을 감소 또는 개선하기 위한) PE 절차에 대해 특정 시간에 보조 치료법으로서 투여된다.

용어 "치료"는 질환과 관련된 병태, 증상 또는 파라미터를 개선하거나 질환의 진행을 예방하는데 효과적인 양, 방법 및/또는 방식으로 치료법을 통계적으로 유의한 정도 또는 당업자에게 확인 가능한 정도까지 투여하는 것을 언급한다. 치료 용도의 경우, 치료는 피험체에서 질환 또는 병태를 개선, 치유, 유지하거나 그의 기간을 감소시킬 수 있다. 치료 용도에 있어, 피험체는 증상의 부분적 또는 완전한 징후를 가질 수 있다. 전형적인 경우에, 치료는 임상의에 의해 확인 가능한 정도로 피험체의 질환 또는 병태를 개선하거나 질환 또는 병태의 악화를 예방한다. 예를 들어, 표 1에 나타내거나 TTP 치료 가이드라인에 제공된 TTP에서의 급성 에피소드에서 임상적 특징 및 징후가 개선된다(Scully et al. 2012 상기 문헌). 예를 들어, 치료로 인해, 혈소판 수는 정상화되고 ADAMTS13 자가 항체 역가는 감소하고/거나 ADAMTS13 활성은 증가하며, 이들 모두는 당 업계에 공지되고 본원에 추가로 상세하게 설명된 바와 같다(하기 문헌 참조). 효과적인 양, 방법, 또는 방식은 피험체에 따라 달라질 수 있으며 피험체에 맞게 조정될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "예방한다"는 언급된 장애의 증상을 완화시킨다는 것을 의미한다. 특히, 상기 용어는 vWF 관련 장애, 예를 들어 TTP, 및 그의 증상의 감소, 완화 및 경감을 포함하여 본 발명의 폴리펩티드의 피험체에게 투여의 치료적으로 긍정적인 효과의 전체 범위를 포함한다. 용어 "예방"은 질환 발생의 예방 또는 연기, 증상 발생의 예방 또는 연기 및/또는 발생할 것이거나 발생할 것으로 예상되는 상기 증상의 중증도의 감소를 포함한다. 또한, 이들은 기존 증상의 개선, 추가적인 증상의 예방 또는 증상의 기저 원인의 개선 또는 예방을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "피험체(피험자)" 및 "환자"는 호환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 용어 "피험체" 및 "피험체들"은 동물, 예를 들어 비영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 당나귀, 염소, 낙타, 고양이, 개, 기니피그, 쥐, 생쥐, 양) 및 영장류(예를 들어, 원숭이, 예를 들어 필리핀 원숭이, 고릴라, 침팬지 및 인간)를 포함한 포유동물을 언급한다. "환자"는 바람직하게는 인간을 언급한다. 상기 환자는 모든 나이의 노인, 성인, 청소년, 및 어린이, 예를 들어 2세 내지 12세 미만의 어린이, 12세 내지 18세 미만의 청소년, 18세 내지 65세 미만의 성인, 및 65세 이상의 노인을 포함할 수 있다.

치료될 수 있는 vWF 관련 질환의 비제한적인 예는 예를 들어, 급성 관상 증후군(ACS), 일과성 뇌 허혈 발작, 불안정형 또는 안정형 협심증, 뇌졸중, 심근경색, 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP) 및 업쇼-슐만 증후군을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 TTP이다.

vWF 관련 질환, 예를 들어, TTP를 치료 또는 예방하는 PE 절차는 TTP 및 기타 혈전 미세혈관병증의 진단 및 관리에 대한 가이드라인에 기재되었으며(Scully et al. 2012 상기 문헌), 이는 본원에 참고에 명백하게 포함되어 있다. 완전 완화는 정상 혈소판 수, 즉, ≥ 150,000/㎕, 선택적으로 악화의 부재로서 정의된다( Scully et al. 2012, 상기 문헌 참조).

본원에 사용되는 "반응까지의 시간"은 급성 TTP 에피소드를 갖는 환자의 최초 치료와 혈소판 수 ≥ 150,000/㎕ 사이의 시간이며, 상기에서 최초 치료는 더 이르기만 한다면, PE 또는 본 발명의 폴리펩티드의 투여, 또는 둘 다된다.

용어 "혈장 교환"("PE")은 혈장의 대량 제거를 통해 TTP를 포함한 다양한 질환을 치료하는데 이용되는 치료 절차, 즉, 다량의 혈장, 대개 1-1.5 혈장 부피가 제거되고 대체액으로 대체되는 절차를 언급한다(Winters 2012 Hematology ASH Education Book 1:7-22). 혈장의 대량 제거 및 대체를 통해, PE는 ADAMTS13 및 ULvWF에 대한 자가 항체와 같은 병리 물질뿐 아니라 약간의 혈소판을 제거한다. 혈장은 혈전성 혈소판 감소성 자반증을 치료할 때 ADAMTS13을 대체하는 대체액으로서 사용된다(McLeod Best Pract Res Clin Haematol. 2006; 19:157-167). 또한, 혈장의 대량 제거 및 대체는 실험실 시험에 영향을 주며, 환자 시험을 복잡하게 만든다.

PE는 혈장의 대량 제거를 수반하기 때문에, 혈장에 순환하는 모든 것이 제거될 것이다. 이로 인해서, 이 절차는 정상 및 병리학적인 혈장 구성성분 모두뿐만 아니라 PE 전에 투여된 TTP를 치료하는 모든 약제를 비선택적으로 제거한다.

당업자는 혈소판 수를 결정하는 것을 잘 알고 있다. 혈소판 카운트는 당 업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 혈구 계산기를 수동적으로 사용하거나 자동화된 분석기, 예를 들어 전자 카운팅을 이용하여 행해질 수 있다. 또한, 혈액 도말 검사에서 수가 추정될 수 있다. 현미경 방법은 혈구 계산기 슬라이드 위 혈액을 보는 위상차 현미경을 이용한다. 혈소판의 전자 카운팅이 가장 보편적인 방법이다. 두 가지 유형의 전자 카운팅, 전압 펄스 및 전자광학 카운팅 시스템이 있다. 예를 들어, ADVIA 혈액 분석기를 사용하여 혈소판 수를 얻을 수 있으며 라이트(Wright)의 염색 혈액 도말에서 수를 추산하여 얻어진 수를 확인한다. ADVIA는 광 산란의 원리를 기초로 하는 유세포 분석에 의해 혈소판을 측정한다. 예를 들어, 혈소판은 그들의 크기(< 30 FL, 저각도 광 산란) 및 굴절률(n = 1.35 내지 n = 1.40 또는 고각도 광 산란)로 확인된다.

TPP의 급성 에피소드를 따르는 여러 환자에서, vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, ALX 0081은 상기 환자가 PE("선행 PE"; 본 발명의 폴리펩티드의 1차 용량의 투여에 선행하는 PE)를 받은 후에 투여되었다. 선행 PE("무작위배정 전 1회 PEX"로도 나타냄)를 받은 피험자 군에서, 반응까지의 평균 시간이 플라세보 군의 경우 4.31일에서 치료 군의 경우 2.44일로 예상 외로 2일 감소되었다는 것이 확인되었다: 43% 감소(표 5; 무작위배정 전 PEX = 예).

따라서, 본 발명은 PE(선행 PE)를 필요로 하는 환자, 예를 들어, TTP의 급성 에피소드를 가진 환자에서 PE를 실시하는 단계, 이후에 상기 선행 PE의 24h 이내에 다음 PE를 실시하는 단계, 및 상기 다음 PE 시작하기 전 약 8h, 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분에, 예를 들어 상기 다음 PE("1차 PE")를 시작하기 전 6h 내지 15분에 본 발명의 폴리펩티드("1차 용량")를 투여하는 단계에 관한 것이다. 본 발명에서, 용어 "1차 용량"은 본 발명의 폴리펩티드를 필요로 하는 환자에서, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드 또는 모든 급성 에피소드 후 본 발명의 폴리펩티드의 최초 투여를 의미한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 환자에게 투여, 바람직하게는 1차 용량 후 5분 내지 8h 이내에, 예를 들어 10분 내지 6 h 이내에 또는 15분 내지 4h 이내에, 예를 들어 8h, 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분 이내에 PE가 뒤따른다.

본 발명에서, 용어 "1차 PE"는 1차 용량의 본 발명의 폴리펩티드를 환자에게 투여한 후에(또는 어떤 경우에는 그와 동시에) 실시되는 최초 PE를 의미한다.

본 발명의 폴리펩티드는 용액 형태(예를 들어, 주사액 및 주입액)로 투여될 수 있거나 투여에 사용될 수 있다. 상기 조성물은 비경구 방식(예를 들어, 피하, 복강내, 또는 근육 내 주사)에 의해, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"은 통상적으로 주사에 의해 장관 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며 피하(s.c.) 또는 근육 내 투여뿐만 아니라 정맥 내(i.v.), 피막 내, 안와 내, 심장 내, 피내, 복강 내, 경기관 내, 피하, 피막하, 지주막하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함한다. 바람직하게는 2차 또는 추가 용량의 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩티드는 피하 투여된다.

바람직하게는, TTP의 급성 에피소드 후에 1차 용량의 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 예를 들어, 1 또는 2분의 기간에 걸쳐 일시에 투여되는 폴리펩티드를 정맥 내 주사선을 통해 전달하는 정맥 내 볼러스 주사이다. 더욱더 바람직하게는, TTP의 급성 에피소드 후 1차 용량의 본 발명의 폴리펩티드의 투여는 예를 들어, 약 30초 이하의 기간에 걸쳐 일시에 투여되는 폴리펩티드를 정맥 내 주사선을 통해 전달하는 정맥 내 일시적 주사이다.

놀랍게도, ULvWF 매개 혈소판 응집의 활성 과정의 직접적인 약리학적 표적화가 존재하지 않고 폴리펩티드를 제거하는 것으로 예상될 수 있는 때인 PE 전에(선행 PE 없이) 투여된 본 발명의 폴리펩티드가 반응까지의 평균 시간을 플라세보 군의 경우 4.92일에서 카플라시주맙 군의 경우 3.00일로 2일의 예상 밖의 큰 감소량으로 여전히 감소시킬 수 있다는 것이 확인되었다: 39% 감소(표 5; 무작위배정 전 PEX = 아니오).

건강한 지원자의 이전 연구 및 TTP 환자를 이용한 본 연구(실시예 7.5.3. 참조)에서 TTP, 특히 TTP의 급성 발작이 진단하기 어려울 수 있다는 것과 치료 개시 전에 소실된 시간이 결과적으로 어려움을 가져올 것이라고 증명된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드가 사용하기에 안전하다고 생각하는 본 발명자들은 상기 발견이 본 발명의 폴리펩티드를 이용한 치료가 적시에, 심지어 환자가 입원하기 전에, 예를 들어 구급차에서 이미 시작될 수 있는 이점을 가진다고 결론지었다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081은 정맥 내 일시적 주사에 의해 투여되는데, 이것은 병원 밖에서 용이하게 실시될 수 있고, 이로써 소중한 시간을 절약할 수 있기 때문이다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 필요로 하는 환자, 예를 들어, TTP의 급성 에피소드(급성 발작) 환자에게 PE를 시작하기 전 약 8h, 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분에 예를 들어 PE를 시작하기 전 6h 내지 15분에 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것에 관한 것이다("1차 용량").

한 실시양태에서, TTP의 급성 에피소드에 이어 1차 용량의 본 발명의 폴리펩티드의 투여 후 PE("1차 PE")가 뒤따른다. 선행 PE가 선행하거나 선행하지 않든지 상기 1차 PE 후에 2차 또는 추가 용량의 본 발명의 폴리펩티드("2차 용량" 또는 "추가 용량")의 투여가 뒤따른다. 바람직하게는, 2차 용량 또는 추가 용량은 1차 PE 후 120, 90 또는 60분 이내에, 예를 들어 1 - 60분 이내에, 예를 들어, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 또는 심지어 1분 이내에 투여된다. 어떤 경우에는, 대체액, 예를 들어 PE의 혈장과 함께 또는 동시에 2차 또는 추가 용량을 투여하는 것이 유리할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 1차 용량, 2차 용량 또는 추가 용량의 본 발명의 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 또는 40, 50, 60, 70 또는 80 mg, 바람직하게는 5-40 mg 더욱더 바람직하게는 10 mg이고, 이는 그를 필요로 하는 환자에게, 바람직하게는 하루에 투여될 수 있다. 청소년 환자, 예를 들어 어린이 및 청소년에게 투여하는 경우, 용량은 환자의 체중에 따라 조정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 용량은 약 0.01, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.12, 0.14, 0.15, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.24 또는 0.25 mg/kg, 바람직하게는 70 kg 성인에 10 mg 용량에 해당하는 0.143 mg/kg이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 약 5 내지 40 mg, 바람직하게는 10 mg의 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, ALX 0081을 PE 절차, 예를 들어 1차 PE, 2차 PE 또는 추가의 PE 후 1-60분 이내에 투여하는 것에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, ALX 0081은 그를 필요로 하는 TTP 환자, 바람직하게는 100,000/㎕ 혈장 미만의 혈소판 수를 가진 환자 및/또는 ADAMTS13 활성 < 10% 예를 들어 < 5%인 환자에게 1일 1회 또는 2회 투여된다.

또 다른 실시양태에서, 그를 필요로 하는 TTP 환자는

(ⅰ) PE; 및

(ⅱ) 단계 (ⅰ)의 상기 PE 후 60분 내지 1분에 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드로 치료받으며,

상기 단계 (ⅰ) 및 단계 (ⅱ)를 상기 환자의 혈소판 수가 적어도 50,000/㎕ 혈장, 예를 들어 75,000, 100,000, 125,000 또는 심지어 150,000/㎕ 혈장이 될 때까지 1일 1회 또는 2회 반복한다.

어떤 경우에는, 완전 완화(혈소판 수 ≥150,000/㎕ 혈장) 후 최소 2일 동안 단계 (ⅰ) 및 단계 (ⅱ)를 반복하는 것이 유리할 수 있다.

한 실시양태에서, 5-40 mg의 본 발명의 폴리펩티드는 상기 환자의 혈소판 수가 ≥150,000/㎕ 혈장이 된 후, 특히 상기 환자의 ADAMTS13 활성이 < 10% 예를 들어 < 5%가 될 때, 또는 마지막 PE 후 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 60, 90 또는 심지어 120일 동안 매일 또는 1일 2회 투여된다.

층화에 따라 데이터를 평가할 때(무작위 배정 전 1 PEX: 예 & 아니오), 전체 집단의 전체 위험률은 p 값 = 0.013일 때 2.197이다. 상기 위험률은 언제라도, 본 발명의 폴리펩티드를 받은 피험자가 플라세보 피험자와 비교하여 혈소판 회복 확인의 1차 종점을 달성하는 속도가 두 배 이상이라는 것을 의미한다. 또한, 상기 혈소판 회복은 치료 군에서 2일 더 빨리 달성된다.

따라서, TTP의 급성 에피소드 후 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 인간 TTP 환자에게 투여는 상기 폴리펩티드의 투여와 상기 PE의 순서에 무관하게, 예를 들어 PE가 1차 용량의 본 발명의 폴리펩티드의 투여 전 또는 후에 실시되든지, 반응까지의 시간을 예상 외로 감소시킨다.

또한, 놀랍게도 악화 횟수가 플라세보 군에서 11명에서 카플라시주맙 군에서 3명으로 감소하였다는 것이 확인되었다. 따라서, 치료 군(즉, PE 및 본 발명의 폴리펩티드를 받은 TTP 환자; 또한 카플라시주맙 군으로 나타냄)에 비해서 플라세보 군(즉, PE 및 본 발명의 폴리펩티드 대신에 플라세보를 받은 TTP 환자)에서 악화가 3배 더 많다. 본원에서 사용되는 용어 "악화"는 혈소판 반응 확인 후 재발성 혈소판 감소증 및 마지막 PE 후 ≥1일 그러나 ≤ 30일 후에 매일 PE 치료의 재개를 요구하는 것을 언급한다.

이것은 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 TTP(의 증상)를 치료하고/거나 완화시키는데 단독으로 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TPP의 치료를 필요로 하는 인간에서 그를 치료하는데 사용하기 위한 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081로서, 상기 치료가 1-80 mg 또는 5-40 mg, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 또는 80 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 인간에게 투여에 의한 것인 상기 폴리펩티드에 관한 것이다.

상기 놀라운 발견을 기초로 하여, 본 발명자들은 최적화된 추가의 치료 프로토콜을 설계하였으며, 이는 본질적으로, 혈소판 반응 확인까지 시간의 분포가 플라세보 군과 비교하여 CAP 군에서 더 짧고, 기울지 않고, 우측으로(반응까지의 시간이 길어질수록) 치우친다는 이해를 근거로 하였다. 또 다른 최적화된 치료 프로토콜에서, 모든 피험자는 3-5일, 예를 들어 3일 또는 4일 또는 5일, 바람직하게는 3일로 설정된 고정된 PE 치료 기간으로 치료받는다. 이 경우에, PE 치료 기간은 혈소판 회복(≥ 150,000/㎕)과 무관할 수 있다. 최적화된 또 다른 치료 프로토콜에서, 환자의 부담과 비용이 감소된다.

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그를 치료하는데 사용하기 위한 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081로서, 상기 치료가 (ⅰ) PE를 실시하는 단계; 및 (ⅱ) 5-40 mg, 예를 들어 10 mg 용량의 본 발명의 폴리펩티드를 단계 (ⅰ)의 상기 PE 후 15분 내지 4 h에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 단계 (ⅰ) 및 단계 (ⅱ)를 3-5일, 예를 들어 3일, 4일 또는 5일, 바람직하게는 3일 동안 1일 1회 반복한 후 5-40 mg, 예를 들어 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 환자의 혈소판 수가 최초로 ≥150,000/㎕이 된 후 적어도 10일, 예를 들어 적어도 20일 또는 적어도 30일 동안 1일 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 연구에서, 최대 1년 동안 TTP 환자를 완화에 대해 추적조사하였다. 본원에서 사용되는 용어 "완화"는 혈소판 반응 확인 및 악화의 부재를 언급한다. 본원에서 사용되는 용어 "혈소판 반응 확인"은 혈소판 ≥ 150,000/㎕의 회복으로 정의된 치료의 반응까지의 시간을 언급하며, 이 반응은 혈소판 ≥ 150,000/㎕의 드 노보(de novo) 측정, 바람직하게는 LDH ≤ 2 X ULN에 의해 150,000/㎕를 초과하는 혈소판 회복을 최초 보고한 후 48시간에 확정되어야 한다.

본원에서 증명된 바와 같이(실시예 7.5.5; 표 8), 플라세보 군 중 18명의 환자와 비교하여 치료 군 중 총 29명 환자가 완화에 들어갔다. 따라서, 치료 군은 플라세보 군에 비해 완전 완화된 1.6x 더 많은 피험자를 나타낸다.

상기에 언급된 바와 같이, 혈소판 수는 완화를 평가하기 위한 주요 수단이다. 전형적인 TTP 이력을 가진 환자에서 ADAMTS13 활성의 측정이 중요한데 그 이유는 낮은 수준이 재발을 예측하는 것으로 확인되었기 때문이다. 그러나 ADAMTS13에 대한 억제 항체 역가가 유의한지, 즉 낮은 역가를 가진 개인보다 높은 역가의 항-ADAMTS13를 가진 개인이 재발할 가능성이 큰 지에 관하여 현재(데이터가 상충하고 있는)로는 확실하지 않다. 당업자는 ADAMTS13의 현재 검사가 정적인 조건하에서 실시되고 생체 내에서 일어나는 생리학적 변화를 항상 정확하게 반영하는 것은 아니라는 것을 인식한다(http://practical-haemostasis.com/Miscellaneous/Miscellaneous%20Tests/adamts13_assays.html).

이제 본 발명자들은 치료를 시작할 때, 예를 들어 1차 용량의 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081을 투여할 때 낮은 기저치의 ADAMTS13 활성(즉. 10% 미만, 예를 들어 5% 미만)을 갖는 피험자의 부분집단에서 완화가 더 확연한 것으로 보인다는 것을 예상외로 발견하였다(실시예 7.5.8 참조).

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그를 치료하는데 사용하기 위한 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 치료가 상기 인간의 혈소판 수가 ≥150,000/㎕가 될 때까지 1-40 mg, 바람직하게는 10 mg의 1차 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여에 의한 것인 상기 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직한 측면에서, 상기 인간은 상기 폴리펩티드를 투여할 때 10% 미만, 예를 들어 5% 미만의 ADAMTS13 활성을 갖는다.

본 연구에서, 최대 1년 동안 TTP 환자를 재발에 대해 추적조사하였다. 본원에서 사용되는 용어 "재발"은 마지막 매일 PE 후 30일 이내, 예를 들어, TTP 환자가 완전 완화를 나타낸 후 0-2일에 일어나는 TTP의 드 노보 사건을 언급한다. "30일 이후" 날짜는 본 연구에서 본 발명의 폴리펩티드의 마지막 투여와 동시에 일어난다.

본 발명의 폴리펩티드가 더이상 투여되지 않았지만, 카플라시주맙 군에서 재발 횟수는 플라세보 군에서 재발 횟수와 동일하였다는 것이 확인되었다(실시예 7.5.4에 표 7 참조).

발명자들은 두 치료 군 모두에서 비록 ADAMTS13 활성이 환자의 부분집단에서만 이용 가능하였지만 재발은 기저치 ADAMTS13 활성이 <10%, 예를 들어 < 5%인 환자에서 더 현저하다는 것을 발견하였다. 발명자들은 이것이 기저치 ADAMTS13 활성이 <10%, 예를 들어 < 5%인 환자가 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 투여를 정지시킬 때 재발할(또는 악화될) 경향이 더 크다는 것을 나타낼 수 있다고 (어떤 이론에 얽매이지 않고) 가설을 세웠다.

특히, 데이터는 TTP의 재발에 대한 예측 지표로서, ADAMTS13 활성의 용도, 및 치료 결정을 위한 그의 가능성을 뒷받침한다. ADAMTS13 활성은 카플라시주맙 치료를 정지시킨 후 바로 발생하는 재발을 예측할 수 있다. 이러한 재발은 존재하는 TTP 에피소드(계속하여 낮은 ADAMTS13 활성에 근거한 해결되지 않은 질환 활성)의 재발로서 간주 된다. 카플라시주맙을 이용한 (PE 후) 30일 치료 기간은 악화 횟수에 상당한 영향을 증명하였다. 이러한 이유로, 재발의 위험에 있는 환자(즉, ADAMTS13 활성에 기초한 기저 질환 활성을 가짐)에 카플라시주맙 치료 기간을 연장하는 것은 기저 질환이 적절하게 치료되고 해결될 때까지 카플라시주맙의 보호 효과를 유지할 것이다. 반대로, 카플라시주맙을 이용한 예방 치료는 TTP의 새로운 급성 에피소드의 위험을 감소시킬 것이다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081을 이용한 치료는 더 높은 활성을 가진 환자에 비해 더 긴 기간 지속해야 한다. 본 발명의 폴리펩티드는 ADAMTS13 활성이 정상 또는 기준 활성과 비교하여 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 심지어 50%가 될 때까지 재발(들)의 위험도를 감소시키고/거나 재발(들)의 가능성을 예방하기 위해 TTP 환자에게 투여되어야 한다.

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어, TTP의 급성 에피소드의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 인간에서 그러한 예방 및/또는 감소에 사용하기 위한 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드로서, (ⅰ): 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 상기 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 위험도는 적어도 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100의 계수(배) 만큼 감소된다. 바람직하게는 상기 위험도는 10% 또는 그 이상 예를 들어 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 이상, 예를 들어 80% 또는 심지어 100% 감소된다.

따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회, 또는 심지어 10회 이상, 예를 들어 20회, 바람직하게는 30회 이상 또는 그 이상 반복하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드에 관한 것이다.

제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안, 또는 10일 이상, 예를 들어 20일, 바람직하게는 30일 이상, 예를 들어 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 그 이상 반복하는 것인 방법.

따라서, 본 발명은 상기 용량을 1일 1회 또는 1일 2회 투여하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은

(ⅱ) 상기 환자의 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계;

(ⅲ) 상기 ADAMTS13 활성을 기준 ADAMTS13 활성과 비교하는 단계; 및

(ⅳ) 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 30% 미만, 예를 들어 20%, 15%, 10% 또는 5%일 경우, 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 반복하는 단계를 더 포함하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 상기 환자의 상기 ADAMTS13 활성을 매일, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일마다, 바람직하게는 적어도 매주 1회 측정하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 단계 (ⅰ)을 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 적어도 5%, 10%, 15%, 예를 들어 20%, 또는 심지어 30% 이상이 될 때까지 반복하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 상기 ADAMTS13 활성이 적어도 연속 2회 측정시 상기 기준 ADAMTS13 활성의 적어도 5%, 10%, 15%, 예를 들어 20% 또는 30%가 될 때까지 반복하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 연속 2회 측정은 적어도 24h, 더 바람직하게는 48h 간격, 예를 들어 적어도 3일 간격, 또는 그 이상 예를 들어, 4, 5, 6, 또는 심지어 7일 간격, 바람직하게는 1주일 간격이다.

따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 적어도 상기 ADAMTS13 활성이 적어도 2회 연속 측정 시 상기 기준 활성의 적어도 5%, 적어도 10% 또는 적어도 15%, 예를 들어 20% 또는 적어도 30%가 된 후 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 동안, 또는 10일 이상, 예를 들어 20일 이상, 바람직하게는 30일 이상 또는 그 이상 동안 반복하는 것인 본원에 기재된 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어, TTP의 급성 에피소드의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 인간에서 그러한 예방 및/또는 감소에 사용하기 위한 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드로서, (ⅰ): 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하고,

- 상기 환자의 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계;

- 상기 ADAMTS13 활성을 기준 ADAMTS13 활성과 비교하는 단계; 및

- 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 ≥ 5%, 예를 들어 ≥ 10%, 심지어 ≥ 15%, 또는 20% 또는 30% 이상일 경우, 상기 단계 (ⅰ)을 최대 30일, 예를 들어 최대 20일, 또는 심지어 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 또는 심지어 1일까지 반복하는 단계를 더 포함하는 것인 상기 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 인간에서 그러한 예방 및/또는 감소에 사용하기 위한 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드로서, 적어도 하기 단계:

(ⅰ) 상기 환자의 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계;

(ⅱ) 상기 ADAMTS13 활성을 기준 ADAMTS13 활성과 비교하는 단계; 및

(ⅲ) 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5%보다 낮을 경우, 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 위험도 또는 발병률의 감소는 해당, 예를 들어, 미치료 대조군 집단, 또는 본 발명에 따른 치료 전에 동일한 피험체와 비교하여 피험체에 대한 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과의 확률 또는 발병률을 감소시키는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과는 장기 손상, 허혈성 손상, 미세혈전 형성, 악화, 사망률, 재발을 포함한다. vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 한 가지 이상의 질환 지표는 혈소판 수, 혈소판 감소증, 신경인지 기능, ADAMTS13 수준 및 항-ADAMTS13 항체 역가, ADAMTS13 활성 수준, 심장 지표(트로포닌 T 또는 트로포닌 I), BNP(뇌 나트륨 이뇨펩티드) 또는 N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨펩티드(NT proBNP), 크레아티닌, 및 뇌 손상 지표(예를 들어 NSE(뉴런 특이적 에놀라아제) 및 Sβ100(S100베타)), 우선적으로 장기 손상 지표, 예를 들어 LDH 수준, 트로포닌 T 및/또는 트로포닌 I 수준, 및/또는 크레아티닌 수준을 포함한다.

위험도 또는 발병률의 감소는 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과의 개시의 지연 또는 예방을 포함할 수 있다. 또한, 위험도 또는 발병률은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과의 중증도가 임상적으로 관련되지 않는 수준으로 감소되는 경우 감소될 수 있다. 즉, vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과는 존재하지만 피험체의 생활, 활동 및/또는 건강을 위협하지 않는 수준에 있을 수 있다. 어떤 경우에는, vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 발생은 피험체가 치료 기간 중 및/또는 후에 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징후가 전혀 나타내지 않는 정도로 감소된다.

치료가 제공되는 경우 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과가 발생하는지, 또는 상기 치료가 없는 경우보다 더 빠르게 발생하는지를 말할 수 없기 때문에 개인의 위험도 감소의 실제 증거를 얻을 수 없다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 위험도의 개념 및 위험도의 증가 또는 감소는 단지 통계 수치를 나타낸다. 게다가, vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과의 위험도 감소는 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과의 중증도의 감소뿐만 아니라 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과의 관찰 부재 또는 관찰 지연으로 반영될 수 있다.

vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드를 예방하고/거나 위험도를 감소시킨다는 것이 인정될 것이다. 따라서, vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 징조, 증상 또는 결과도 감소된다. ULvWF 스트링이 미세혈전 형성 시 혈소판을 소비하는 후천적 TTP의 병태생리학이 제공되어, 혈소판 수의 회복은 추가의 미세혈전 형성의 예방의 간접적인 척도가 된다고 판단하였다. 후천적 TTP와 관련된 이환율 및 급성 사망률은 상기 미세혈전의 결과이다.

실제로, 상기 추론은 장기 손상 지표의 정상화에 의해 뒷받침된다. 특히, 결과는 장기 손상 지표, 예를 들어 트로포닌 I 및 T, LDH 및 크레아티닌이 플라세보를 받은 피험자에서보다 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, ALX 0081을 받은 피험자에서 더 빠르게 정상 수준으로 회복된다는 것을 나타낸다(실시예 7.5.7 참조).

따라서, 결과는 상기 장기 손상 지표의 더 신속한 정상화 속도는 더 우수한 임상적 성과, 즉 미세혈전에 의해 유발된 조직 허혈증으로 인한 위험도 감소 및 장기 손상 감소와 연결된다는 것을 시사한다.

따라서, 본 발명은

- 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성의 위험도가 10%, 20%, 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%(예를 들어, vWF 관련 질환으로 인한 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성 없음)까지 감소되고/거나;

- 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성의 위험도가 계수 1.2. 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되고/거나;

- 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성이 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 감소되고/거나;

- 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성이 계수 1.2. 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되고/거나;

- 장기 손상 지표, 예를 들어 LDH 수준, 트로포닌 T, 트로포닌 I 수준, 및/또는 크레아티닌 수준이 정상 수준의 적어도 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 회복되고/거나;

- 장기 손상 지표, 예를 들어 LDH 수준, 트로포닌 T, 트로포닌 I 수준, 및/또는 크레아티닌 수준이 정상 수준의 적어도 20%, 예를 들어 30% 이상, 예를 들어 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 향상되고, 바람직하게는, 상기 장기 손상 지표, 예를 들어 LDH 수준, 트로포닌 T, 트로포닌 I 수준, 및/또는 크레아티닌 수준이 치료 30일 이내에, 바람직하게는, 치료 20일 이내에, 예를 들어, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 이내에 또는 심지어 1일 이내에 향상되고/거나,

- 혈소판 수가 ≥ 150,000/㎕로 유지되고/거나,

- 혈소판 정상화(≥ 150,000/㎕)까지 시간이 적어도 10%, 20%, 30%, 35%, 39%, 바람직하게는 적어도 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80% 감소되고/거나,

- 악화의 위험도가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 감소되고/거나;

- 악화의 위험도가 계수 2 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되고/거나;

- 상기 vWF 관련 질환으로 인한 사망률이 10%, 20%, 30%, 바람직하게는 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 감소되고/거나;

- 상기 vWF 관련 질환으로 인한 사망률이 계수 2 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되고/거나,

- 완화가 계수 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 증가되는 것인 본원에 기재된 방법에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "기준 활성"은 실시된 분석에서 5명의 건강 피험체의 평균 ADAMTS13 활성을 언급하며, 이는 100%로 설정된다. 예를 들어, FRETS-vWF73 분석에서, 정상 인간 혈장 풀을 이용하여 캘리브레이션 곡선을 생성하고, 여기서 회귀 곡선의 기울기를 각 캘리브레이션 시료에 대해 계산하고 캘리브레이션 곡선을 생성하는데 사용한다(추세선: y = ax + b; x = ADAMTS13(%)이고, y = ΔRFU/Δ시간). 이어서, 시료의 ADAMTS13 활성(%)은 (y - b) x 1/a로 계산한다. 실제로, 일반적으로 재발하지 않은 환자보다 재발한 환자가 더 낮은 ADAMTS13 활성을 보였다.

따라서, 본 발명은 예를 들어 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP에 의해 유도되는 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 인간에서 그러한 예방 및/또는 감소를 위한 폴리펩티드로서, 적어도 단계 (ⅰ) 5-40 mg/일, 바람직하게는 10 mg/일 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩티드의 투여가 적어도 10%, 20%, 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 또는 심지어 적어도 50%, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%까지 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성을 예방하고/거나 위험도를 감소시키는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드의 투여는 계수 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성을 예방하고/거나 위험도를 감소시킨다.

따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 또는 그 이상 예를 들어 1주, 2주, 3주, 그 이상 예를 들어 1개월 또는 심지어 2개월 동안 반복하는 것인 본원에 기재된 바와 같이 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성을 예방하고/거나 위험도를 감소시키기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 상기 환자의 ADAMTS13 활성을, 바람직하게는 주 1회 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 본원에 기재된 바와 같이 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성을 예방하고/거나 위험도를 감소시키기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 투여하는 상기 단계 (ⅰ)을 ADAMTS13 활성이 [최초로] 기준 ADAMTS13 활성의 ≥5%, 예를 들어 ≥10%, 또는 심지어 ≥15% 일 때 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 또는 그 이상 예를 들어 1주, 2주, 3주, 또는 그 이상 예를 들어 1개월 또는 심지어 2개월 동안 반복하는 것인 본원에 기재된 바와 같이 허혈성 손상, 장기 손상 및/또는 미세혈전 형성을 예방하고/거나 위험도를 감소시키기 위한 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP에 걸린 인간에서 상기 질환의 증상을 치료하기 위한 본 발명의 폴리펩티드로서, 상기 치료가 vWF 관련 질환에 걸린 인간에서 본 발명의 폴리펩티드를 상기 질환의 증상의 치료 유효량으로 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명 인간에서 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 개시 및 진행을 억제하기 위한 폴리펩티드로서, 억제가 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드의 vWF에 대한 결합에 의해 달성되며, 억제 유효량의 상기 폴리펩티드를 미리 정해진 간격을 두고 인간에게 투여하는 단계를 포함하며, 항체의 각각의 투여가 인간 체중 kg당 0.1 mg 내지 25 mg을 인간에게 전달함으로써 인간에서 상기 질환의 개시 또는 진행을 억제하는 것인 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 vWF 관련 질환에 의한 인간 수축 허혈성 장기 손상의 가능성을 감소시키기 위한 폴리펩티드로서, 상기 감소가 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 미리 정해진 용량으로 인간에게 투여하는 단계를 포함하고, 항체의 각각의 투여가 인간 체중 kg당 0.1 mg 내지 25 mg을 인간에게 전달함으로써 인간 수축 허혈성 장기 손상의 가능성을 감소시키는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.

이러한 결과를 기초로 한 모델링은 연장된 시간 동안 본 발명의 폴리펩티드투여를 유지하는 것이 급성 에피소드를 예방하는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 이러한 유리한 프로파일은 결과적으로 건강의 위험을 감소시킨다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드가 재발을 방지한다고 결론지을 수 있다.

따라서, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 심지어 2, 4, 6, 또는 8주 마다 1-80 mg, 예를 들어 5-40 mg 범위의 용량으로, 바람직하게는 TTP의 급성 에피소드를 예방하는데 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것에 관한 것이다. 구체적인 유효량은 10-20 mg이다. 특정 실시양태에서, 용량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 또는 80 mg, 바람직하게는 10 mg의 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 TTP 환자에서 재발을 방지하는 방법으로서,

(1) TTP 환자의 ADAMTS13 활성을 분석법, 예를 들어 직접 또는 간접 분석법에 의해 측정하는 단계;

(2) 단계 (1)의 상기 활성을 기준 값(정상 값)과 비교하는 단계; 및

(3) 단계 (1)의 ADAMTS13 활성이 기준 값의 15% 미만, 예를 들어 10% 미만 및 5% 미만일 경우, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, ALX 008를 투여함으로써 재발을 방지하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

예비 결과는 1차 PE 전에 1차 용량의 본 발명의 폴리펩티드의 투여가 이미 혈소판 수의 증가를 가져온다는 것을 시사한다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 그를 필요로 하는 환자, 예를 들어, TTP의 급성 에피소드를 경험하는 환자에게 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70 또는 80 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의, vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081을 투여하는 것에 관한 것이다.

vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, ALX 0081은 vWF 관련 질환, 예를 들어, TTP를 치료 또는 예방하기 위해(예를 들어, vWF 관련 질환과 연관된 한 가지 이상의 증상을 감소 또는 개선하기 위해) 단독 또는 제2 제제, 예를 들어, 제2 치료적 또는 약리학적 활성제와 함께 피험체(예를 들어, 인간 피험체)에 투여될 수 있다.

vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, ALX 0081과 함께 제제화될 수 있는 제제의 비제한적인 예는 예를 들어 보조 면역억제 치료(예를 들어, 코르티코스테로이드 예를 들어 (메틸)프레드니솔론 또는 (메틸)-프레드니손; 또는 리툭시맙), 항혈소판제 (예를 들어, 아스피린), 적혈구 수혈 또는 엽산 보충을 이용한 지지요법, 빈크리스틴 또는 시클로스포린을 이용한 치료, 항-자가ADAMTS13 항체, 또는 ADAMTS13을 포함한다. 상기 병용 요법은 유리하게는 투여되는 치료제의 더 낮은 투여량을 이용할 수 있어서 여러 가지 단일 요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 면역억제 치료, 특히 TTP 환자에서 재발을 효율적으로 방지하는 리툭시맙과 함께 본 발명의 폴리펩티드의 병용 요법에 관한 것이다. 바람직하게는, 병용요법은 ADAMTS13 활성이 정상 활성의 적어도 ≥ 5%, 예를 들어 ≥ 10%, ≥15%, ≥20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 심지어 정상화 예를 들어 ≥50%이 될 때까지 제공된다.

TTP는 여전히 임상 이력, 환자 검사 및 혈액 도말 표본을 기초로 하여 진단된다. ADAMTS13 분석은 진단을 확정하고 질환 과정 및 추가 치료의 가능한 필요성을 모니터하는 것을 돕니다. TTP의 급성 에피소드는 표 1과, 예를 들어, 스컬리 연구자들(Scully et al.)(2012 상기 문헌)의 가이드라인에 따라 진단될 수 있다.

<표 1>

본 발명의 임의의 특정 폴리펩티드의 효능 또는 투약 요법은 당업자에게 이용 가능한 방법에 의해 결정될 수 있다. 간략하게, 임상 시험 과정에서, 환자는 의료인에 의해 관찰될 수 있으며 질환 상태는 기준의 임의의 조합에 의해 평가된다. 환자 질환 상태의 개선은 여러 시점에서 이들 기준을 기초로 하여 결정되고 환자 집단에 대한 이들 결정의 조합을 플롯팅하여 치료 효능을 평가한다.

대표적인 실시양태에서, 효능 평가는 하기에 개시된 임의의 또는 모든 기준에 의해 측정될 수 있다:

* 혈소판 회복 ≥ 150,000/㎕에 의해 정의되는 치료 반응까지의 시간. 이 반응은 혈소판 ≥ 150,000/㎕의 드 노보 측정에 의해, 바람직하게는 LDH ≤ 2 X ULN에 의해 150,000/㎕를 초과하는 혈소판 회복을 최초 보고한 후 48시간에 확정되어야 한다.

* 완전 완화된 피험체의 수

* TTP 악화(된 피험체) 수 및 TTP 최초 악화까지의 시간. 악화는 반응에 따르는 재발된 혈소판 감소증 및 마지막 매일 PE 후 ≥1일 그러나 ≤30일 후에 매일 PE 치료의 재개를 요구하는 것으로 정의된다.

* 최대 1년 동안 (마지막 매일 PE 후 30일 이내에 발생하는 TTP의 드 노보 사건으로 정의된) TTP가 재발한 피험체의 수, 및 TTP의 최초 재발까지의 시간

* 매일 PE 치료와 관련된 중대 이상 반응(SAE)을 포함하는 매일 PE 데이터

* 완전 완화 및 1년 추적 시 신경인지 검사 배터리에 의해 측정된 신경인지 기능. 피험체의 의식 상태를 측정하는 글래스고 혼수 점수(Glasgow Coma Score)가 본 검사에 선행될 것이다.

* 장기 기능장애의 개선 및 TTP 관련 징후 및 증상의 개선

* 매일 PE 치료 기간 내 및 후속 연구 약물치료 기간(점감 요법 포함) 내 전체 사망률

* 트롬보스폰딘 반복 13을 갖는 디스인테그린 유사 및 메탈로프로테아제(ADAMTS13) 수준 및 항-ADAMTS13 항체 역가를 포함하는 이에 제한되지 않는 TTP 생물지표의 결정.

당 업자는 효능을 결정하는 것을 잘 안다.

예를 들어, ADAMTS13 활성은 프로테아제에 의해 미절단된 초대형 다량체를 검출하기 위해 vWF 다량체의 전기영동을 이용하여 평가될 수 있다(Moake et al. (1982) The New England journal of medicine 307, 1432-1435; Furlan, et al. (1997) Blood 89, 3097-3103 7, 8). ADAMTS13 활성은 ADAMTS13에 의해 절단될 때 형광을 방출하도록 화학적으로 변형된 vWF의 단편, FRETS-vWF73을 이용하여 검사될 수 있다. 분석에서, FRETS-vWF73을 환자 혈장의 시료에 첨가하고, 형광도의 변화를 시간에 따라 측정하여 ADAMTS13 활성을 결정한다. 억제제가 존재하는 경우, 이는 대개는 ADAMTS13에 대한 중화 IgG 항체이며, 이는 ELISA에 의해 측정될 수 있다(Kokame et al. (2005) British journal of haematology 129, 93-100). 별법으로 또는 추가적으로, ADAMTS13 활성은 예를 들어 문헌(Vesely et al. (2003, 상기 문헌), Fontana et al.(2004, 상기 문헌) 또는 Remuzzi et al.(Blood 2002; 100: 778-7852002))에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 예를 들어, 간접적인 ADAMTS13 활성 분석은 전장 VWF 분자 또는 vWF의 A2 도메인에 ADAMTS13 절단 부위를 포함하는 vWF 단편의 산물의 절단을 검출하는 단계를 수반한다. (1) 콜라겐 결합 분석. 정상 혈장 또는 정제된 VWF를 BaCl2 및 vWF를 변성시키는 1.5M 요소의 존재하에서 검사 혈장 시료와 인큐베이션한다. VWF는 ADAMTS13에 의해 절단되고 잔여 VWF는 콜라겐 III형에 대한 그의 결합에 의해 측정한다. 결합된 VWF는 접합된 항-VWF 항체를 이용한 ELISA 분석을 이용하여 정량한다. (2) 리스토세틴 유도 응집. 이는 상기 콜라겐 결합 분석과 유사하지만 잔여 VWF는 혈소판 응집측정기를 이용하여 리스토세틴 유도 혈소판 응집에 의해 측정한다. (3) 기능 ELISA 분석. 이 분석에서는, 재조합 VWF 단편을 VWF 상의 태그에 대한 항체를 이용하여 ELISA 플레이트 위에 고정한다. VWF 단편은 A2 도메인 및 Tyr1605-Met1606에서의 ADAMTS13 절단 부위를 코딩하고 S-트랜스퍼라제 [GST]-히스티딘 [GST-VWF73-His]으로 태그된다. 혈장을 고정된 GST-VWF73-His 단편에 첨가하고 고정된 단편의 절단이 ADAMTS13 절단 부위에서 일어난다. 잔여의 절단된 VWF 단편은 절단된 VWF 단편만을 인식하고 상호작용 단편은 인식하지 않는 제2 단클론 항체를 이용하여 측정한다. 따라서, ADAMTS13 활성은 잔여 기질 농도와 반비례한다. 이 방법은 테크노자임(TECHNOZYM)® ADAMTS13 활성 ELISA에 대한 기초를 형성한다.

당 업자는 ADAMTS13에 대한 자가 항체를 결정하는 것을 잘 안다, 예를 들어, 항-ADAMTS13 자가 항체는 ELISA, 예를 들어 테크노자임® ADAMTS13 INH ELISA(Technoclone)에 의해 결정될 수 있다.

당업자는 인간 시료에서 리스토세틴 보조인자 활성을 결정하는 것을 잘 안다. 예를 들어 리스토세틴 보조인자는 응집측정기 PAP-8E 분석기(Bio/Data corp.)에서 vW 셀렉트(Select)(Bio/Data corp)에 의해 결정될 수 있다.

당업자는, 예를 들어 STA-R 이볼루션(evolution) 분석기(Diagnostica Stago)에서 코아매틱 팩터 VIII(Coamatic Factor VIII)(Chromogenix)을 이용하여, 인간 시료에서 인자 VIII을 결정하는 것을 잘 안다.

당업자는 예를 들어 STA-R 이볼루션 분석기(Diagnostica Stago)에서 면역 비탁법을 이용하여(예를 들어 STA Lia 검사 vWF:Ag를 이용하여) 인간 시료에서 폰 빌레브란트 인자 항원을 결정하는 것을 잘 안다.

당업자는 LDH 수준을 결정하는 것을 잘 안다. 대부분의 방법은 분광광도계에서 락테이트 디히드로게나제 기반 효소 분석에 기초한다. 간편한 리뷰는 문헌(Medbø et al. (2000) "Examination of four different instruments for measuring blood lactate concentration". Scand J Clin Lab Invest 60:367-380)에 제공된다. 여러 회사는 분석법, 예를 들어 락테이트와 피루베이트의 상호전환의 LDH에 의한 촉매를 측정하는 압노바(Abnova)(제품번호 KA1653), 즉 NADH 결합된 효소 반응에서 테트라졸륨 염 MTT의 565nm에서 최대 흡광도를 나타내는 MTT의 환원된 형태로의 환원에 기반한 비방사선 비색 LDH 분석법을 제공한다. 형성된 보라색 세기는 효소 활성과 직접적으로 비례한다. 유사하게 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 키트(MAK066-1KT)에서, LDH는 NAD를 NADH로 환원시키고, 이것은 비색(450 nm) 분석에 의해 특이적으로 검출된다. 정상 값은 하기 표 1.1에 제공한다.

당업자는 트로포닌 I 및 T를 결정하는 것을 잘 안다. 일반적으로, 트로포닌 T 및 I은 면역분석법에 의해 측정되는데, 이들은 많은 다양한 면역분석 플랫폼(예를 들어 DPC Immulite, Abbott AxSYM, Bayer ACS:Centaur, Ortho Vitros, Roche Elecsys, third generation)에서 이용 가능하다. 간편한 리뷰는 문헌(by Wu et al. (1999) National Academy of Clinical Biochemistry Standards of Laboratory Practice: recommendations for the use of cardiac markers in coronary artery diseases. Clin Chem. Jul 1999;45(7):1104-21)에 제공된다. 정상 값은 하기 표 1.1에 제공된다.

당업자는 크레아틴을 결정하는 것을 잘 안다. 간편한 리뷰는 문헌(Peake and Whiting "Measurement of Serum Creatinine - Current Status and Future Goals" Clin Biochem Rev. 2006 Nov; 27(4): 173-184)에 제공된다. 예를 들어, 크레아티닌 수준은 앱캠(Abcam) 크레아티닌 분석 키트(ab65340) 또는 바이오비전(BioVision)의 크레아티닌 분석 키트에 의해 결정될 수 있다. 분석법에서, 크레아티닌은 크레아티니나제에 의해 크레아틴으로 전환되고, 크레아티닌은 사코신으로 전환되고, 이것은 특이적으로 산화되어 빨강색(λmax = 570 nm) 및 형광(Ex/Em = 538/587 nm)을 생성하는 프로브와 반응하는 산물을 생산한다. 정상 값은 하기 표 1.1에 제공된다. 혈액 내 크레아티닌의 양은 근육량에 따라 증가하기 때문에, 대개 남성이 여성보다 더 높은 크레아티닌 수준을 보인다.

<표 1.1>

표 1.1에 제공된 정상값은 실험실에 따라, 남녀 사이에, 연령에 따라 달라질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그럼에도, 당업자는 이용된 분석법에 따라 제조사가 제공하는 정상값이 보통 기준으로 사용될 수 있거나, 별법으로 특정 설정에서 임상의에 의해 평가된 정상값이 사용될 수 있다는 것을 고려할 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 전형적으로 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함한다. 본 발명의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 vWF에 결합하고/거나 그에 친화도를 갖는다. 본 발명의 문맥에서, "vWF"는 필리핀 원숭이, 개코원숭이, 돼지, 기니피그, 생쥐, 및/또는 인간 vWF 및 대부분 바람직한 인간 vWF, 즉, 서열 번호 20 또는 젠뱅크(GenBank) 번호: NP_000543을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

바람직하게는, vWF에 대한 ISVD는 4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어지며, 상기에서,

a) CDR1은

- 아미노산 서열 YNPMG; 또는

- 아미노산 서열 YNPMG와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지고;

b) CDR2는

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG; 또는

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

- 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지고;

c) CDR3은

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; 또는

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는

- 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열

을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진다.

더욱더 바람직하게는, vWF에 대한 ISVD는 4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어지며, 상기에서,

a) CDR1은 YNPMG (서열 번호 20)이고;

b) CDR2는 AISRTGGSTYYPDSVEG (서열 번호 21)이고;

c) CDR3은 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF (서열 번호 22)이다.

더욱더 바람직하게는, vWF에 대한 ISVD는 서열 번호 19(12A02H1)로 나타낸다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 vWF에 대한 적어도 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어진다.

더욱더 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 1-18로 정의된 vWF에 대한 2개의 ISVD를 포함하거나 이로 이루어지며, 가장 바람직하게는 서열 번호 1(ALX 0081: 국제 일반명(INN) 카플라시주맙)이다. ALX 0081은 vWF를 표적화하는 2개의 동일한 1가 빌딩 블록으로 이루어진 2가 나노바디이다.

vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 서열 번호 1-19는 vWF 관련 질환, 특히 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)의 치료에 사용될 수 있다.

용어 "폴리펩티드" 및 "아미노산 서열"은 본원에서 호환적으로 사용된다.

따라서, 예를 들어, 본 발명에 사용하기에 적합한 폴리펩티드는 표 A-1의 화합물, 예를 들어, 서열 번호 1-19 또는 20-22, 또는 표 A-1의 화합물과 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 갖는 화합물을 포함할 수 있다("서열 동일성"에 대한 정의 부분 참조).

바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드에 사용하기 위한 vWF에 대한 ISVD는 12A02H1 유사 화합물이다. 본 설명을 위해, 12A02H1 유사 화합물은 12A02H1(즉, 서열 번호 19) 또는 12A02H1(서열 번호 19)과 80% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 가장 바람직하게는 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 아미노산 서열 동일성을 갖는 화합물이다. vWF에 대한 2개의 ISVD를 포함하는 특히 바람직한 폴리펩티드는 ALX 0081(서열 번호 1)이다.

면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어 낙타과 VHH 도메인, 낙타화 VH 도메인 또는 인간화 VHH 도메인은 신속하게 성장하고 있는 치료제 부류를 대표한다. 예를 들어 vWF에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 WO2004/015425호, WO2004/062551호, WO2006/074947호, WO2006/122825호, WO2009/115614호, 및 WO2011/067160호에 기재되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 사용하기 위한 추가의 바람직한 면역글로불린 단일 가변 도메인은 WO06/122825호에 기재된 개선된 나노바디를 포함한다.

달리 명시하지 않는다면, 용어 "면역글로불린 서열" - 본원에서 중쇄 항체 또는 통상적인 4쇄 항체를 언급하는데 사용되든지- 둘 다 전장의 항체, 그들의 각각의 쇄, 및 그들의 모든 부분, 도메인 또는 단편(항원 결합 도메인 또는 단편, 예를 들어 각각 VHH 도메인 또는 VH/VL 도메인을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 포함하는 일반적인 용어로 사용된다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "서열"(예를 들어 "면역글로불린 서열", "항체 서열", "가변 도메인 서열", "VHH 서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어에서)은 문맥에서 더 제한된 해석을 요구하지 않는다면, 일반적으로 해당 아미노산 서열 및 상기를 코딩하는 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"단일 가변 도메인"과 호환적으로 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"("ISVD")은 항원 결합 부위가 단일 면역글로불린 도메인에 존재하거나 그에 의해 형성되는 분자를 정의한다. 이는 "통상적인" 면역글로불린 또는 그들의 단편외에도 면역글로불린 단일 가변 도메인을 지정하며, 여기서 2개의 면역글로불린 도메인. 특히 2개의 가변 도메인은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 전형적으로, 통상적인 면역글로불린에서, 중쇄 가변 도메인 도메인(VH)과 경쇄 가변 도메인(VL)은 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성한다. 이 경우, VH와 VL 모두의 상보성 결정 영역(CDR)은 항원 결합 부위에 기여할 것이다. 즉, 총 6개의 CDR이 항원 결합 부위 형성에 관여할 것이다.

대조적으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 결합 부위는 단일 VH 또는 VL 도메인에 의해 형성된다. 이로 인해 면역글로불린 단일 가변 도메인의 항원 결합 부위는 단지 3개의 CDR에 의해 형성된다.

용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 따라서 항원 결합 부위의 형성을 위해 적어도 2개의 가변 도메인의 상호작용을 요구하는 통상적인 면역글로불린 또는 그들의 단편을 포함하지 않는다. 이는 또한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 "포함하는(comprise 또는 contain)" 본 발명의 실시양태의 경우이다. 본 발명의 문맥에서, 이러한 실시양태는 통상의 면역글로불린 또는 그들의 단편을 배제한다. 따라서, 면역글로불린 단일 가변 도메인을 "포함하는(comrise 또는 contain)" 폴리펩티드 또는 조성물은 예를 들어 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 구조물에 관한 것일 수 있다. 별법으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인 이외의 추가의 구성성분, 예를 들어, 다양한 종류의 보조제, 단백질 태그, 착색제, 염료 등이 있을 수 있다. 그러나 이들 용어는 항원 결합 부위가 단일 가변 도메인에 의해 형성되는 통상적인 면역글로불린의 단편을 포함한다.

일반적으로, 단일 가변 도메인은 4개의 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어진 아미노산 서열일 것이다. 이러한 단일 가변 도메인 및 단편은 가장 바람직하게는 그들이 면역글로불린 접힘을 포함하거나 적합한 조건하에서 면역글로불린 접힘을 형성할 수 있는 것이다. 이와 같이, 단일 가변 도메인은 예를 들어 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VL-서열) 또는 그들의 적합한 단편; 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VH-서열 또는 VHH 서열) 또는 그의 적합한 단편을 포함할 수 있다. 단, 단일 가변 도메인이 단일 항원 결합 단위(즉, 예를 들어 기능적 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 또 다른 가변 도메인과 - 예를 들어, VH/VL 상호작용을 통해 - 상호작용해야 하는, 예를 들어, 통상적인 항체 및 scFv 단편에 존재하는 가변 도메인 경우와 같이, 단일 항원 결합 도메인이 기능적 항원 결합 단위를 형성하기 위해 또 다른 가변 도메인과 상호작용할 필요가 없도록 단일 가변 도메인으로 필수적으로 이루어진 기능적 항원 결합 단위)를 형성할 수 있기만 한다면.

본 발명의 한 실시양태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VL-서열), 또는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VH-서열)이고 더 구체적으로, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 통상적인 4쇄 항체로부터 유래할 수 있는 중쇄 가변 도메인 서열 또는 중쇄 항체로부터 유래하는 중쇄 가변 도메인 서열(예를 들어, VHH)일 수 있다.

중쇄 항체 및 그의 가변 도메인의 일반적인 설명에 대해, 그중에서도 본원에 인용된 선행 기술뿐만 아니라 WO 08/020079호의 59면에 언급된 선행 문헌 및 국제 출원 WO 06/040153호의 41-43면에 언급된 참고 목록을 참고하며, 이들 선행기술 및 참고문헌은 본원에서 참고에 포함된다. 이들 참고에 기재된 바와 같이 나노바디(특히 VHH 서열 및 부분적인 인간화 나노바디)는 특히 하나 이상의 골격 서열에 하나 이상의 "특징(Hallmark) 잔기"의 존재로 특징지어질 수 있다. 나노바디의 인간화 및/또는 낙타화, 및 기타 변형, 부분 또는 단편, 유도체 또는 "나노바디 융합", 다가 구조물(링커 서열의 일부 비제한적인 예를 포함) 및 나노바디의 반감기를 증가시키는 다양한 변형 및 그들의 제조를 포함한 나노바디에 대한 추가 설명은 예를 들어, WO 08/101985호 및 WO 08/142164호에서 찾아볼 수 있다.

예를 들어, 단일 가변 도메인 또는 면역글로불린 단일 가변 도메인(또는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 사용하기에 적합한 아미노산 서열)은 (단일) 도메인 항체(또는 (단일) 도메인 항체로 사용하기에 적합한 아미노산 서열), "dAb" 또는 dAb(또는 dAb로 사용하기에 적합한 아미노산 서열) 또는 나노바디(본원에서 정의된 바와 같으며 VHH 서열을 포함하나 이에 제한되지 않음); 기타 단일 가변 도메인, 또는 그들의 임의의 것의 임의의 적합한 단편일 수 있다. (단일) 도메인 항체의 일반적인 설명에 대해, 또한 본원에 인용된 선행 기술, 및 EP 0 368 684호를 참고한다. 용어 "dAb"의 경우, 예를 들어 문헌(Ward et al. 1989 (Nature 341 (6242): 544-6), Holt et al. 2003 (Trends Biotechnol. 21(11): 484-490); 및 예를 들어 WO 04/068820호, WO 06/030220호, WO 06/003388호 및 도만티스(Domantis Ltd.)의 기타 공개 특허 출원을 참고한다. 또한, 포유동물 기원이 아니기 때문에 본 발명의 문맥에서 덜 바람직하지만, 단일 가변 도메인은 상어의 특정 종(예를 들어 소위 "IgNAR 도메인", 예를 들어 WO 05/18629호 참조)으로부터 유래할 수 있다는 것에 주지해야 한다.

특히, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 나노바디(Nanobody)® (본원에 정의됨) 또는 그의 적합한 단편일 수 있다[주의: 나노바디®, 나노바디스(Nanobodies)® 및 나노클론(Nanoclone)® 는 아블린쓰 엔. 브이.(Ablynx N.V.)의 등록상표이다]. 나노바디에 대한 일반적인 설명은 하기에 추가 설명, 및 본원에 인용된 선행 기술, 예를 들어 WO 08/020079호(16면)에 기재된 선행 기술을 참고한다.

면역글로불린 서열, 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인의 아미노산 서열 및 구조는 각각 "골격 영역 1" 또는 "FR1"; "골격 영역 2" 또는 "FR2"; "골격 영역 3" 또는 "FR3"; 및 "골격 영역 4" 또는 "FR4"로 당 업계 및 본원에서 언급되는 4개의 골격 영역 또는 "FR"로 구성되는 것으로 생각된다- 그러나 그에 제한되지 않음. 상기 골격 영역은 각각 "상보성 결정 영역 1" 또는 "CDR1"; "상보성 결정 영역 2" 또는 "CDR2"; 및 "상보성 결정 영역 3" 또는 "CDR3"으로 당 업계에서 언급되는 3개의 상보성 결정 영역 또는 "CDR"에 의해 단속적이다.

면역글로불린 단일 가변 도메인 내 아미노산 잔기의 총 개수는 약 110-120개 범위일 수 있으며, 바람직하게는 112-115개, 가장 바람직하게는 113개이다. 그러나 면역글로불린 단일 가변 도메인의 일부, 단편, 유사체 또는 유도체는 상기 일부, 단편, 유사체 또는 유도체가 본원에 개략적으로 나타낸 추가 요건을 충족시키고 또한 바람직하게는 본원에 기재된 목적에 적합하기만 한다면 그들의 길이 및/또는 크기에 관하여 특별히 제한되지 않는다는 것을 주지해야 한다.

따라서, 본 발명의 의미에서, 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인" 또는 "단일 가변 도메인"은 비인간 기원, 바람직하게는 낙타과, 바람직하게는 낙타 중쇄 항체로부터 유래한 펩티드를 포함한다. 그들은 예를 들어, WO 08/101985호 및 WO 08/142164호에 앞서 기재된 바와 같이 인간화될 수 있다. 게다가, 용어는 예를 들어, WO 08/101985호 및 WO 08/142164호에 앞서 기재된 바와 같이 "낙타화된" 비낙타과 기원, 예를 들어, 생쥐 또는 인간으로부터 유래한 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 생쥐, 쥐, 토끼, 당나귀, 인간 및 낙타과 면역글로불린 서열을 포함한 다양한 기원의 면역글로불린 서열을 포함한다. 또한, 완전 인간, 인간화 또는 키메라 면역글로불린 서열을 포함한다. 예를 들어 이는 낙타과 면역글로불린 서열 및 인간화 낙타과 면역글로불린 서열, 또는 낙타화 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어, 문헌(Ward et al)(예를 들어 WO 94/04678호 및 문헌(Davies and Riechmann 1994, Febs Lett. 339: 285 및 1996, Protein Engineering 9: 531) 참조)에 기재된 낙타화 dAb를 포함한다.

상기에 언급된 vWF에 대한 모든 ISVD(또는 vWF 결합제)는 문헌으로부터 잘 이해된다. 이는 그들의 제조(특히 예를 들어, WO2006/122825호뿐만 아니라 WO2004/062551호도 참조)를 포함한다. 예를 들어, ALX 0081은 예를 들어, WO2006/122825호 또는 WO2009/115614호에 기재된 바와 같이 제조된다.

본 발명에 의해 제공되는 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게는 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어질 수 있고 선택적으로 하나 이상의 추가의 아미노산 서열(모두는 하나 이상의 적합한 링커를 통해 선택적으로 연결됨)을 더 포함할 수 있는 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 단리된 형태 또는 본질적으로 단리된 형태, 또는 형태의 일부분이다. 예를 들어, 제한 없이, 하나 이상의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기 단백질 또는 폴리펩티드에서 결합 단위로 사용될 수 있으며, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 모두 본원에서 기재되는 본 발명의 1가, 다가 또는 다중 특이적 폴리펩티드를 각각 제공하기 위해 결합 단위(즉, 세포 관련 항원 이외에 하나 이상의 기타 표적에 대한)로서 역할을 할 수 있는 하나 이상의 추가의 아미노산을 선택적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 단백질 또는 폴리펩티드는 단리되거나 본질적으로 단리된 형태일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 상기에 개략적으로 나타낸 바와 같이 단일 도메인의 형태로 2개 이상의 항원 결합 단위를 포함하는 구조물을 포함한다. 예를 들어, 동일하거나 상이한 항원 특이성을 갖는 2개 (이상의) 면역글로불린 단일 가변 도메인이 결합되어 예를 들어 2가, 3가 또는 다가 구조물을 형성할 수 있다. 두 가지 이상의 특이성의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 합하여, 2중 특이적, 3중 특이적 등의 구조물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 표적 A에 대한 2개의 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 표적 B에 대한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하여 A에 대해 2가 B에 대해 1가를 만들 수 있다. 숙련자가 쉽게 예상할 수 있는 이러한 구조물 및 그들의 변형은 모두 본 발명에 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 동일한 표적 항원 내에 상이한 에피토프에 대한 적어도 2개의 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 이중 파라토프 구조물에 관한 것이다.

또한, 상기 모든 분자는 "본 발명의 폴리펩티드"로 언급되며, 이는 본 발명의 "면역글로불린 서열" 또는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동의어이다.

또한, 본원에서 사용되는 용어 "서열"(예를 들어 "면역글로불린 서열", "항체 서열", "가변 도메인 서열", "V_HH-서열" 또는 "단백질 서열"과 같은 용어에서)은 문맥이 추가의 제한된 해석을 요구하지 않는다면, 일반적으로 해당 아미노산 서열 및 상기를 코딩하는 핵산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 비제한적인 한 실시양태에 따르면, 본 발명의 면역글로불린 서열, 나노바디® 또는 폴리펩티드는 글리코실화된다. 본 발명의 비제한적인 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 면역글로불린 서열, 나노바디® 또는 폴리펩티드는 글리코실화되지 않는다.

상기 문헌에 언급된 바와 같이, 본 발명은 전형적으로 vWF에 대한 적어도 하나, 예를 들어 2개 이상의 ISVD, 즉, 본원에 정의된 항원, 예를 들어, 폰 빌레브란트 인자(vWF) 바람직하게는 인간 vWF(서열 번호 20)에 결합하고/또는 그에 친화도를 갖는 ISVD를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 문맥에서, 어떤 항체"에 결합하고/거나 그에 대한 친화도를 갖는"은 예를 들어 항체 및 그들의 각각의 항원의 문맥에서 이해되는 기술에서 통상적인 의미를 갖는다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 용어 "에 결합하고/거나 ~대한 친화도를 갖는"은 면역글로불린 서열이 항원과 특이적으로 상호작용한다는 것을 의미하며 상기 항원"에 대한" 면역글로불린 서열과 호환적으로 사용된다.

용어 "특이성"은 특정 면역글로불린 서열, 항원 결합 분자 또는 항원 결합 단백질(예를 들어 나노바디® 또는 본 발명의 폴리펩티드)이 결합할 수 있는 다양한 유형의 항원 또는 항원 결정인자의 수를 언급한다. 항원 결합 단백질의 특이성은 친화도 및/또는 결합활성을 기초로 하여 결정될 수 있다. 항원 결합 단백질과 항원의 해리 평형 상수(KD)로 나타내는 친화도는 항원 결정인자와 항원 결합 단백질 상의 항원-결합 부위 사이의 결합 세기의 척도이다: KD 값이 작을 수록 항원 결정인자와 항원-결합 분자 사이의 결합 세기가 더 강해진다(별법으로, 친화도는 1/KD인 친화도 상수(KA)로서 표현될 수 있다). 숙련자에게 명백하듯이(예를 들어 본원의 추가의 개시 내용을 기초로 하여) 친화도는 관심의 특정 항원에 따라 그 자체로 공지된 방법으로 결정될 수 있다. 결합활성은 항원 결합 분자(예를 들어 나노바디® 또는 본 발명의 폴리펩티드)와 해당 항원 사이의 결합 세기의 척도이다. 결합활성은 항원 결정인자와 항원 결합 분자 상의 그의 항원 결합 부위 사이의 친화도와 항원 결합 분자에 존재하는 해당 결합 부위의 수 모두와 관련된다.

전형적으로, 본 발명의 면역글로불린 서열(예를 들어 아미노산 서열, 나노바디스® 및/또는 본 발명의 폴리펩티드)은 해리 상수 (KD) 10^-5 내지 10^-12 몰/L 이하, 바람직하게는 10^-7 내지 10^-12 몰/L 이하 더 바람직하게는 10^-8 내지 10^-12 몰/L(즉, 결합 상수(KA) 10⁵ 내지 10¹² L/몰 이상, 바람직하게는 10⁷ 내지 10¹² L/몰 이상 더 바람직하게는 10⁸ 내지 10¹² L/몰)로 그들의 항원에 결합하고/거나, k_{온 - 레이트} 10² M^-1s^-1 내지 약 10⁷ M^-1s^-1 사이, 바람직하게는 10³ M^-1s^-1와 10⁷ M^-1s^-1 사이, 더 바람직하게는 10⁴ M^-1s^{- 1}와 10⁷ M^-1s^-1 사이, 예를 들어 10⁵ M^-1s^-1와 10⁷ M^-1s^-1 사이로 본원에 정의된 세포 관련 항원에 결합하고/거나; k_{오프 - 레이트} 1s^{- 1}(t1/2=0.69 s)와 10^-6 s^-1 사이(단, 여러 날의 t1/2을 갖는 거의 불가역 복합체), 바람직하게는 10^-2 s^{- 1}와 10^-6 s^-1 사이, 더 바람직하게는 10^-3 s^-1 와 10^-6 s^-1 사이, 예를 들어 10^-4 s^{- 1}와 10^-6 s^-1 사이로 본원에 정의된 세포 관련 항원에 결합할 것이다.

10^-4 M보다 큰 임의의 KD 값(또는 10⁴ M^-1보다 낮은 임의의 KA 값)은 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다.

바람직하게는, 본 발명의 1가 면역글로불린 서열은 500 nM 미만, 바람직하게는 200 nM 미만, 더 바람직하게는 10 nM 미만, 예를 들어 500 pM 미만의 친화도로 바라는 항원에 결합할 것이다.

항원 또는 항원 결정인자에 항원 결합 단백질의 특이적 결합은 예를 들어, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁 결합 분석법, 예를 들어 방사선 면역측정법(RIA), 효소 면역측정법(EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석법, 및 당 업계에 그 자체로 공지된 그들의 다양한 변이 방법; 게다가 본원에 언급된 기타 기술을 포함하여 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다.

해리 상수(KD)는 숙련자에게 명백하듯이 실제 또는 겉보기 해리 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하는 방법은 숙련자에게 자명할 것이며, 예를 들어 본원에 언급된 기술을 포함한다. 이와 관련하여, 10^-4 몰/L 또는 10^-3 몰/L(예를 들어, 10^-2 몰/L) 이상의 해리 상수를 측정하는 것은 가능하지 않을 수 있다는 것은 명백할 것이다. 선택적으로, 또한 숙련자에 자명하듯이, (실제 또는 겉보기) 해리 상수는 관계식 [KD = 1/KA]에 의해 (실제 또는 겉보기) 결합 상수(KA)를 기초로 하여 계산될 수 있다.

친화도는 분자의 상호작용의 세기 또는 안정성을 나타낸다. 친화도는 통상적으로 몰/L(또는 M) 단위를 갖는 KD 또는 해리 상수로 나타낸다. 또한, 친화도는 1/KD와 같으며, (몰/L)^-1(또는 M^-1) 단위를 갖는 결합 상수, KA로 나타낼 수 있다. 본 명세서에서, 두 분자(예를 들어 본 발명의 아미노산 서열, 면역글로불린 서열, 나노바디® 또는 폴리펩티드와 그의 의도된 표적) 사이의 상호작용의 안정성은 주로 그들의 상호작용의 KD 값의 측면에서 표현될 것이다; 관계식 KA =1/KD의 측면에서, 그의 KD 값으로 분자의 상호작용의 세기를 명시하는 것은 상응하는 KA 값을 계산하는데도 이용될 수 있다는 것은 숙련자에게 자명하다. KD 값은 잘 알려진 관계식 DG=RT.ln(KD)(동등하게 DG=-RT.ln(KA))에 의해 결합의 자유 에너지(DG)와 관련되기 때문에 열역학적 의미에서도 분자 상호작용의 세기를 특징짓는다. 상기 식에서, R은 기체 상수이고, T는 절대 온도이고 ln은 자연로그를 나타낸다.

의미 있다고(예를 들어, 특이적으로) 생각되는, 생물학적 상호작용, 예를 들어 본원에 정의된 세포 관련 항원에 본 발명의 면역글로불린 서열의 결합에 대한 KD는 전형적으로 10^-10 M (0.1 nM) 내지 10^-5 M(10000 nM) 범위이다. 상호작용이 강할 수록, 그 KD는 더 낮다.

또한, KD는 kon으로 나타내는 복합체의 결합 속도에 대한 koff로 나타내는 복합체의 해리 속도 상수의 비율로서 나타낼 수 있다(결과 KD =koff/kon이고 KA = kon/koff). 오프-레이트 Koff는 단위가 s^-1이다(여기서, s는 초의 SI 단위 표기법). 온-레이트 kon은 단위가 M^-1s^-1이다.

본 발명의 면역글로불린 서열과 관련하여, 온-레이트는 10² M^-1s^-1 내지 약 10⁷ M^-1s^-1 사이에서 변할 수 있으며, 생물분자의 상호작용에 대한 확산-제한 결합 속도 상수에 근접한다. 오프-레이트는 관계식 t1/2=ln(2)/koff에 의해 주어진 분자의 상호작용의 반감기와 관련된다. 본 발명의 면역글로불린 서열의 오프-레이트는 10^-6 s^-1(여러 날의 t1/2을 갖는 거의 비가역성 복합체) 내지 1 s^-1(t1/2=0.69 s) 사이에서 변할 수 있다.

두 분자 사이의 분자 상호작용의 친화도는 그 자체로 공지된 다양한 기술, 예를 들어 잘 알려진 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서 기술(예를 들어 문헌(Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001) 참조)에 의해 측정될 수 있으며, 상기 기술에서 한 분자는 바이오센서 칩에 고정되고 다른 분자는 유동 조건 하에서 고정된 분자 위로 통과하여 kon, koff 측정 값과 그에 따른 KD(또는 KA) 값을 얻는다. 이것은 예를 들어 잘 알려진 바이아코어(Biacore) 장치를 이용하여 수행될 수 있다.

또한, 측정 과정이 예를 들어 한 분자의 바이오센서 위 코팅과 관련된 인공물에 의해, 내재된 분자의 고유한 결합 친화도에 다소 영향을 주는 경우, 측정된 KD는 겉보기 KD와 일치할 수 있다는 것은 숙련자에게 자명할 것이다. 또한, 겉보기 KD는 한 분자가 다른 분자에 대해 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 경우, 측정될 수 있다. 이러한 상황에서, 측정된 친화도는 두 분자에 의한 상호작용의 결합활성에 의해 영향을 받을 수 있다.

친화도를 평가하는데 사용될 수 있는 또 다른 접근법은 문헌(Friguet et al. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985))의 2-단계 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: 효소 결합면역흡착측정법) 방법이다. 이 방법은 용액 상 결합 평형 측정법을 확립하며 플라스틱과 같은 지지체 위 분자 중 하나의 흡착과 관련하여 가능한 인공물을 방지한다.

그러나 KD의 정확한 측정은 꽤 노동집약적이어서, 결과적으로 대개 겉보기 KD 값을 결정하여 두 분자의 결합 세기를 평가한다. 모든 측정이 일관된 방법으로 실시되기만 한다면(예를 들어, 분석 조건을 변하지 않게 유지하면서) 겉보기 KD 측정값은 실제 KD의 근사치로서 사용될 수 있으며, 따라서 본 문서에서 KD 및 겉보기 KD는 똑같이 중요하고 적절하게 처리되어야 한다는 것을 주지해야 한다.

마지막으로, 많은 상황에서 경험이 풍부한 과학자는 일부 기준 분자에 비교하여 결합 친화도를 결정하는 것이 용이하다는 것을 판단할 수 있다는 것을 주지해야 한다. 예를 들어, 분자 A와 B 사이에 결합 세기를 평가하기 위해서, B에 결합한다고 공지되고 ELISA 또는 FACS(Fluorescent activated cell sorting) 또는 기타 형식(형광 검출을 위한 형광단, 광흡수 검출을 위해 발색단, 스트렙타비딘 매개 ELISA를 위한 비오틴)에서 용이한 검출을 위한 형광단 또는 발색단 기 또는 기타 화학 잔기, 예를 들어 비오틴으로 적합하게 표지된 기준 분자 C를 이용할 수 있다. 전형적으로 기준 분자 C는 고정 농도로 유지하고 A의 농도는 B의 주어진 농도 또는 B의 양에 따라 변한다. 결과적으로, A가 없는 경우 C에 대해 측정된 신호가 반이 되는 A 농도에 해당하는 IC50 값을 얻는다. 기준 분자의 KD인 KD ref 및 기준 분자의 전체 농도 cref를 알고 있다면, 상호작용 A-B에 대한 겉보기 KD는 다음 식으로부터 얻을 수 있다: KD =IC50/(1+cref/ KD ref). cref << KD ref 일 경우, KD

IC50이라는 것을 주지한다. IC50의 측정이 비교되는 결합제에 대해 일관된 방법으로 실시되기만 한다면(예를 들어, cref를 고정되게 유지하면서) 분자 상호작용의 세기 또는 안정성은 IC50에 의해 평가될 수 있으며, 이 측정값은 이 본문 전반에서 KD 또는 겉보기 KD와 등가로 판단된다.

본 발명은 모두 본 출원인 명의의 WO2004/015425호, WO2004/062551호, WO2006/074947호, WO2006/122825호, WO2009/115614호 또는 WO2011/067160호에 기재되거나 상기 문헌에 개시된 방법에 의해 얻을 수 있는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 상기 아미노산 서열의 최적화된 변이체를 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 아미노산 서열의 "최적화된 변이체"는 효능(예를 들어, WO2006/122825호의 실험 부분에 기재된 효능 평가에 의해 측정된)이 여전히 야생형 12A02(WO2006/122825호에 정의됨)과 비슷하거나(즉, 10% 편차 내), 역시 WO2006/122825호에 정의된 변이체 12A02H1(서열 번호 19)와 비슷하면서 i) "인간화"의 정도, ii) 화학적 안정성, 및/또는 iii) 발현 수준을 증가시키는 치환과 같은 한 가지 이상의 유익한 치환을 포함하는 변이체이다. 바람직하게는, 12A02의 야생형 서열과 비교하여, 본 발명의 아미노산 서열은 적어도 하나의 상기 치환, 바람직하게는 적어도 2개의 상기 치환, 바람직하게는 적어도 3개의 인간화 치환, 바람직하게는 적어도 10개의 상기 인간화 치환을 포함한다.

특정 측면에서, 본 발명의 아미노산 서열은 야생형 서열 12A02와 비교하여 총 1 내지 15개, 바람직하게는 2 내지 14개, 예를 들어 9 내지 13개, 예를 들어, 10, 11 또는 12개 아미노산 치환을 포함한다. 언급된 바와 같이, 이들 차이는 바람직하게는 1개, 바람직하게는 적어도 2개, 예를 들어, 3, 4, 또는 5 또는 10개의 인간화 치환을 적어도 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가의 치환(예를 들어 본원에 언급된 추가의 치환 (a) 내지 (c) 중 어느 하나, 또는 그들 중 임의의 2 이상의 임의의 적합한 조합)을 포함할 수 있다. 또한, 본원의 개시 내용을 기초로 하여, 그리고 선택적으로 제한된 정도의 시행착오 후에, 숙련자는 하나 이상의 상기 적합한 인간화 및/또는 추가의 치환(의 적합한 조합)을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명은 본원에 제공된 임의의 특정 예 또는 상기 참고에 의해 정의된 임의의 특정 예와 매우 유사한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 매우 유사하다는 것은 적어도 90%, 예를 들어, 95, 97, 98 또는 99%의 아미노산 동일성을 의미한다. 매우 유사한 폴리펩티드 서열은 그들이 유래한 서열과 동일한 기능을 가질 것이다. 즉, 그들은 vWF에 결합하고, 더 구체적으로 vWF에 결합하여 vWF와 혈소판의 상호작용을 억제할 것이다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 1-19 중 어느 하나, 특히 서열 번호 1과 매우 유사한 서열에 관한 것이다. 그러나 본 발명은 특히 본원에 정의된 제제에서 안정한 변이체 또는 매우 유사한 서열에 관한 것이 되도록 본원에 정의된 제제 내에서 각 변이 서열의 안정성은 평가되어야 한다.

본 발명의 폴리펩티드 서열의 생성 방법은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 재조합 발현 또는 합성을 포함한다. 숙련자는 적합한 발현 기술, 예를 들어 적합한 재조합 벡터 및 숙주 세포, 예를 들어 세균 또는 효모 숙주 세포에 대해 매우 잘 알고 있다. 또한, 숙련자는 적합한 정제 기술 및 프로토콜에 대해 매우 잘 알고 있다.

또한, 본 발명은 의약("본 발명의 약학 제제" 또는 "본 발명의 제제(들)"이라고도 불림)의 제조를 포함하여 약학 용도에 안정한, 바람직하게는 적합한 vWF에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 제제를 제공한다.

특정 실시양태에서, 제제는 서열 번호 1-19로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩티드, 바람직하게는 서열 번호 1을 포함한다.

용어 "약학 제제"는 활성 성분(본 발명의 폴리펩티드)의 생물학적 활성이 효과적이 되도록 하는 형태이며 제제가 투여되는 피험체에 허용 가능한 독성을 갖는 추가의 구성성분을 포함하지 않는 제제를 언급한다. 상기 제제는 멸균된다. "약학적으로 허용 가능한" 부형제(비히클, 첨가제)는 유효량의 이용되는 활성 성분을 제공하기 위해 피험체 포유동물에 타당하게 투여될 수 있는 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "부형제"는 제제에 유익한 물리적 특성을 부여하는 화합물을 위한 희석제, 비히클, 방부제, 동결건조 보호제, 계면활성제, 결합제, 단체, 또는 안정제로서 통상적으로 사용되는 불활성 성분을 언급한다. 숙련자는 동결건조 보호, 안정화, 방부 등과 같이 제제에서 특정 기능을 가질 수 있는 약학 용도에 적합한 부형제를 잘 안다.

"멸균" 제제는 무균성이거나 모든 살아있는 미생물 및 그들의 포자가 없거나 본질적으로 없다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.

"안정한" 제제는 그 안에 단백질이 저장 시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 보유하는 것이다. 바람직하게는, 제제는 저장 시 본질적으로 그의 물리적 화학적 안정성, 및 그의 생물학적 활성을 보유한다. 저장 기간은 일반적으로 제제의 의도하는 저장 수명을 기준으로 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 여러 분석 기술이 당 업계에 이용 가능하고 예를 들어 문헌(Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993))에 설명되어 있다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 40℃에서 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 또는 그 이상 안정하다. 게다가, 제제는 바람직하게는 제제의 냉동(예를 들어, -20℃ 또는 -70℃로) 및 해동 후, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 또는 5회 주기의 냉동 및 해동 후 안정하다. 안정성은 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 정성적 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 안정성 연구는 ALX 0081이 -20℃에서 적어도 3년간 안정하다는 것을 보였다.

제제는 수성 담체를 포함한다. 수성 담체는 특히 완충제이다.

본원에서 사용되는 "완충제(완충액)"은 그의 산-염기 컨쥬게이트 성분들의 작용에 의해 pH의 변화를 방지하는 완충 용액을 지칭한다. 본 발명의 제제는 시트르산염 또는 인산염 완충제 중 적어도 한 가지로부터 선택된 완충제, 바람직하게는 시트르산염 완충제를 포함한다. 앞서 결정된 바와 같이, 이들 완충제는 vWF 결합제의 안정성을 상승시킨다.

본 발명에 따른 제제는 5-200 mM, 바람직하게는 7.5-80 mM, 더욱더 바람직하게는 10-50, 예를 들어, 10, 15, 20, 25 또는 30 mM, 가장 바람직하게는 20 mM의 범위 농도의 시트르산염 완충제를 포함하며, 여기서 각 값은 선택적으로 ±5 mM 범위를 포함하는 것으로 이해된다. 별법으로, 본 발명에 따른 제제는 5-200 mM, 바람직하게는 5-80 mM, 더 바람직하게는 7.5-60 mM, 더욱더 바람직하게는 10-40, 예를 들어, 10, 15, 20, 25 또는 30 mM, 가장 바람직하게는 10 mM 범위 농도의 인산염 완충제를 포함할 수 있으며, 여기서 각 값은 선택적으로 ±5 mM 범위를 포함하는 것으로 이해된다. 더 낮은 농도의 완충제는 최종 삼투질농도에 영향을 주고, 상응하여, 첨가될 수 있는 추가의 용매에 영향을 준다고 이해될 것이다.

본 발명의 제제의 pH는 5.0 내지 7.5 범위이며, 여기서 각 값은 ±0.2의 범위를 포함하는 것으로 이해된다. 가장 유리한 pH는 제제 내에 포함된 완충제에 따라 결정될 것이다. 따라서, 본 발명은 특히 인산염 완충제를 포함하는 제제로서, 6.5 내지 7.5의 범위, 바람직하게는 6.9, 7.0, 7.1, 예를 들어, 7.1의 pH를 갖는 것인 제제에 관한 것이다. 시트르산염 완충제를 포함하는 제제가 저장 및 사용에 매우 적합하다는 것을 보였다. 따라서, 본 발명은 시트르산염 완충제를 포함하는 제제로서, 바람직하게는 6.0과 7.0 사이 범위, 더 바람직하게는 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8 또는 6.9, 예를 들어, 6.5의 pH를 갖는 것인 제제에 관한 것이며, 여기서 각 값은 선택적으로 ±0.2의 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 제제는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 vWF에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081을 환자에 사용하기 전에 희석용 저장액으로 사용되는 농도를 포함하는 임상 목적에 적합한 농도로 포함할 것이다. 향상된 안정화 이외에도, 본 발명의 제제는 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 높은 농도를 가능하게 한다.

본 발명의 제제 내에 활성제, 예를 들어, vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 전형적인 농도는 0.1 내지 150 mg/mL, 예를 들어 1-100 mg/mL, 5-80 mg/mL, 또는 10-40 mg/mL, 바람직하게는 10 mg/mL의 범위 농도의 비제한적인 예를 포함하며, 여기서 각 값은 선택적으로 ±20%의 범위를 포함하는 것으로 이해된다(예를 들어, 10의 값은 선택적으로 8 내지 12 mg/mL의 범위를 포함한다).

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 어떤 측면에 따른 제제는 세제 또는 계면 활성제를 더 포함할 수 있다.

본원에서, "계면활성제"는 표면 활성제, 바람직하게는 비이온계 계면활성제를 언급한다. 본원에서 계면활성제의 예는 폴리소르베이트; 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 도데실 설페이트(SDS); 소듐 라우릴 설레이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아라미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿠아트(MONAQUAT)® 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체(예를 들어, 플루로닉스(Pluronics), PF68 등) 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 바람직한 계면활성제는 폴리에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 예를 들어, 폴리소르베이트 -20, -40, -60, -65, -80 또는 -85를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리소르베이트의 보편적인 상표명은 알케스트(Alkest), 카나셀(Canarcel) 및 트윈을 포함한다. 숙련자는 계면활성제의 추가의 비제한적인 예, 예를 들어 WO2010/077422호에 열거된 것들을 안다. 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 비이온계 계면활성제이다. 더 구체적으로, 계면활성제는 이후로 트윈-80으로도 나타내는 폴리소르베이트-80이다. 숙련자는 본 발명의 제제에 적합한 계면활성제의 적합한 농도를 쉽게 결정할 수 있다. 전형적으로, 농도는 계면활성제의 유익한 효과, 예를 들어, 전단 응력, 예를 들어 제제화된 본 발명의 폴리펩티드의 응집을 감소시키는 교반 조건하에서 안정화 효과를 유지하면서 가능한 낮을 것이다. 대표적인 비제한적인 실시양태에서, 계면활성제의 농도는 0.001 내지 0.5% 범위, 예를 들어 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.01, 0.015, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 또는 0.5%, 바람직하게는 0.01과 0.05% 사이, 더 바람직하게는 0.01과 0.02% 사이, 예를 들어, 0.01%(v/v)일 수 있다.

본 발명의 제제는 방부제와 같은 부형제를 더 포함할 수 있다.

"방부제"는 예를 들어 세균 작용을 본질적으로 감소시켜 다회 사용 제제의 생산을 용이하게 하기 위해서, 제제에 선택적으로 포함될 수 있는 화합물이다. 가능한 방부제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 염화헥사메토늄, 염화벤잘코늄(알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸 암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 염화벤제토늄을 포함한다. 기타 유형의 방부제는 방향족 알코올, 예를 들어 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀, 및 m-크레솔을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서 방부제는 벤질 알코올이다.

본 발명의 제제는 폴리올과 같은 안정제를 더 포함할 수 있다.

"폴리올"은 여러 개의 히드록실 기를 갖는 물질로 당(환원 및 비환원 당), 당 알코올 및 당산을 포함한다. 폴리올은 예를 들어 안정성을 향상시키기 위해, 제제 내에 선택적으로 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 폴리올은 약 600 kD 미만인 분자량을 갖는다(예를 들어, 약 120 내지 약 400 kD 범위). "환원당"은 금속 이온을 환원시키거나 단백질 내 리신 및 기타 아미노기와 공유적으로 반응하는 헤미-아세탈 기를 포함하는 것이며, "비환원당"은 환원당의 이러한 특성을 갖지 않는 것이다. 환원당의 예는 프럭토스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스 및 글루코스이다. 비환원당은 슈크로스, 트레할로스, 소르보스, 멜레지토스 및 라피노스를 포함한다. 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소르비톨 및 글리세롤은 당 알코올의 예이다. 당산에 관해서는, 이들은 L-글루코네이트 및 그의 금속염을 포함한다. 제제가 냉동-해동에 안정한 것이 바람직한 경우, 폴리올은 바람직하게는 제제 내 항체를 불안정하게 만드는 냉동 온도(예를 들어 -20℃)에서 결정화되지 않는 것이다. 특정 실시양태에서, 슈크로스 및 트레할로스와 같은 비환원당은 폴리올의 예이며, 트레할로스의 용액 안정성에도 불구하고 슈크로스가 바람직하다.

본 발명에 따라 사용되는 본 발명의 치료 화합물은 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 바라는 순도를 갖는 폴리펩티드(들)을 선택적인 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합하여 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이다. 따라서, 본 발명에 따른 제제는 또한 선택적으로 한 가지 이상의 부형제를 포함할 수 있다.

통상적으로 사용되는 안정제 및 방부제는 숙련자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, WO2010/077422호 참조). 이들 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체는 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 인산염과 같은 완충 물질, 글리신, 소르브산, 소르빈산칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 프로타민 황산염, 인산이수소나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드 규산, 삼규산마그네슘, 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 젤라틴, 폴리에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지, 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질; 및 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 유리한 실시양태에서, 부형제는 NaCl, 트레할로스, 슈크로스, 만니톨 또는 글리신으로 이루어진 목록으로부터 선택된 한 가지 이상일 수 있다.

또한, 활성 성분은 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로 캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀전, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀전에 포획(entrap)될 수 있다. 상기 기술은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에 개시되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 임의의 약학적으로 허용 가능한 제제로 제제화될 수 있다. 제제는 액상 또는 건조 상태일 수 있다. 제제는 혼합, 건조, 동결건조, 진공 건조, 또는 약학 조성물을 제제화하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 제제는 인산염 완충제(pH 7.1)에 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081을 포함한다. 더욱더 바람직하게는, 본 발명의 제제는 인산염 완충제(pH 7.1), 글리신(0.2M) 및 폴리소르베이트 80(0.02% v/v)에 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 PCT/EP14/060107호에 기재된 바와 같이 추가로 제제화될 수 있다.

바람직한 제제는 하기를 포함한다.

(a) 약 0.1 mg/mL 내지 약 80 mg/mL 농도의 vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081;

(b) 약 1% 내지 약 15%(w/v) 농도의 슈크로스, 글리신, 만니톨, 트레할로스 또는 NaCl로부터 선택된 부형제;

(c) 약 0.001% 내지 0.5%(v/v) 농도의 트윈-80; 및

(d) 제제의 pH 약 6.0 내지 7.0이 되도록 하는 약 5 mM 내지 약 200 mM 농도의 시트르산염 완충제.

본 발명의 또 다른 바람직한 제제는 바람직하게는 10 mg/ml 농도의, vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081, 20 mM (pH 6.5) 농도의 시트르산염 완충제를 포함하고, 7% 슈크로스(w/v) 및 0.01%(v/v) 농도의 트윈-80을 더 포함한다.

일부 실시양태에서, 제제는 액체로 저장된다. 다른 실시양태에서, 제제는 액체로 제조된 후, 저장 전에 예를 들어 동결건조 또는 분무 건조에 의해 건조된다. 건조된 제제는 건조 화합물로서, 예를 들어 에어로졸 또는 분말로 사용되거나 예를 들어, 물, 완충제 또는 기타 적합한 액체를 이용하여 그의 본래 또는 또 다른 농도로 재구성될 수 있다.

또한, 본 발명은 12.5 mg 카플라시주맙 및 주사 용액을 위한 부형제를 포함하는 동결건조물로 충전된 바이알에 관한 것이다. 부형제(재구성된 용액 mL 당): 바이알 당 0.21 mg 시트르산, 5.58 mg 트리소듐 시트레이트 디하이드레이트, 70 mg 슈크로스, 0.11 mg 폴리소르베이트-80(pH 6.5 +/- 0.5). 1 mL 주사용 증류수(WFI)로 재구성 후 농도는 12.5 mg/mL 카플라시주맙(정상 투여량 10 mg)이다.

또한, 본 발명은 액상 제제의 추가 처리에 의해 얻어지는 산물, 예를 들어 냉동, 동결건조되거나 분무 건조된 산물을 포함한다. 재구성시, 상기 고상 산물은 본원에 기재된 바와 같이(그러나 이에 제한되지는 않음) 액상 제제가 될 수 있다. 따라서, 넓은 의미에서, 용어 "제제"는 액상 및 고상 제제 모두를 포함한다. 그러나, 고상 제제는 액상 제제로부터 유래될 수 있고(예를 들어, 냉동, 냉동 건조 또는 분무 건조에 의해), 따라서 본원에서 액상 제제에 대해 명시된 특성으로 정의된 여러 가지 특성을 갖는 것으로 이해된다. 본 발명은 예를 들어 냉동 건조 또는 분무 건조 전에 본래 조성물로부터 벗어나는 조성물을 유도하는 재구성을 배제하지 않는다. 따라서, 동결건조된 제제는 본래 냉동 건조된 액체 부피에 비해 동결건조물에 첨가된 물 또는 희석제의 양에 따라 본래 농도(즉, 동결건조 전)와 상이한 농도를 갖는 제제를 생성하도록 재구성될 수 있다. 적합한 제제는 항체 완전성의 한 가지 이상의 파라미터를 분석함으로써 확인될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 제제는 인간 혈액에 대해 등장성이다. 등장액은 혈액 혈장과 동일한 삼투압을 가지기 때문에, 피험체의 혈액 혈장의 삼투압을 변화시키지 않으면서 피험체에 정맥 내 주입될 수 있다. 긴장성은 삼투질농도의 측면에서 표현될 수 있으며, 이론적인 삽투질농도, 또는 바람직하게는 실험적으로 결정되는 삼투질농도일 수 있다. 전형적으로, 삼투질농도는 290 ± 60 mOsm/kg의 범위, 바람직하게는 290 ± 20 mOsm/kg 범위일 것이다.

또한, 본 발명의 제제는 동결 건조 과정에서 본 발명의 폴리펩티드를 보호하는데 특히 유용한 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 또한 동결건조 보호제로도 알려져 있으며, 숙련자에게 잘 알려져 있다. 구체적인 예는 슈크로스, 소르비톨 또는 트레할로스와 같은 당; 아미노산, 예를 들어 글루탐산, 특히 글루탐산 모노나트륨 또는 히스티딘; 베타인, 황산마그네슘, 당 알코올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명을 이해함으로써, 첨가될 상기 화합물의 필요량은 액체 형태이거나 동결 건조를 거칠 때 제제의 안정성을 고려하여 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 동결 건조에 특히 적합한 제제는 증량제를 더 포함할 수 있다. 적합한 제제는 숙련자에게 널리 알려져 있다. 슈크로스를 포함하는 제제는 예를 들어 저장 및 냉동-해동 과정에서 vWF 결합제의 물리적 안정성을 유지하는데 특히 적합할 뿐 아니라 동결건조 보호제로서도 적합하다.

개략적으로 나타낸 바와 같이, 상기 임의의 제제는 예를 들어, 동결건조, 분무 건조 또는 냉동, 예를 들어 벌크 냉동에 의해 추가로 처리될 수 있다. 생성된 처리 산물은 상기에 정의된 액상 출발 제제로부터 유래한 특성을 갖는다. 필요한 경우, 예를 들어 동결건조 보호제 등과 같은 추가의 제제가 추가 처리를 위해 포함될 수 있다.

본 발명의 제제는, 심지어 연장된 저장 후에도, 예를 들어, 상기에 정의된 기간 동안, -70℃와 +40℃ 사이의 온도에서, 본 발명의 폴리펩티드, 특히 ALX 0081의 화학적 물리적 완전성을 유지하면서 산물의 순도/불순물 프로파일이 본질적으로 변화하지 않는 동결건조 후에 효과를 갖는다. 예를 들어 동결건조 후 연장된 저장은 RP-HPLC, SE-HPLC 또는 cIEF 프로파일에 유의한 효과를 보이지 않았다.

본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 이용되는 임의의 방법에 의해 생산될 수있다. 전형적인 예는 적합한 숙주 시스템, 예를 들어 세균 또는 효모에서 재조합 발현을 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명에 따라 제제화되기 전에 적합한 정제법을 거칠 것이다.

일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 폴리펩티드를 생산하도록 유전적으로 조작된 살아있는 숙주 세포에 의해 생산된다. 단백질을 생산하도록 세포를 유전적으로 조작하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌(Ausubel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York))을 참조한다. 이러한 방법은 폴리펩티드를 코딩하고 그의 발현을 가능하게 하는 핵산을 살아있는 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 이러한 숙주는 세균 세포, 진균 세포, 또는 배지에서 배양된 동물 세포일 수 있다. 세균 숙주 세포는 에쉐리키아 콜 라이(Escherichia coli) 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 이. 콜라이(E. coli) 균주의 예는 HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, 및 외래 DNA를 절단하지 못하는 임의의 이. 콜라이 균주를 포함한다. 사용될 수 있는 진균 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지에 ( Saccharomyces cerevisiae ), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris ) 및 아스페르길루스( Aspergillus ) 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이용될 수 있는 동물 세포주의 몇몇 예는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, 및 WI38이다. 신규 동물 세포주는 당 업자에게 잘 알려진 방법(예를 들어 형질전환, 바이러스 감염, 및/또는 선별)을 이용하여 확립될 수 있다. 선택적으로, 폴리펩티드는 숙주 세포에 의해 배지로 분비될 수 있다.

일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 세균 세포, 예를 들어 이. 콜라이에서 생산될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드가 디스플레이 독립체와 박테리오파아지 단백질(또는 그의 단편) 사이에 억제 가능한 정지 코돈을 포함하는 파아지 디스플레이 벡터 내 서열에 의해 코딩되는 경우, 벡터 핵산은 정지 코돈을 억제할 수 없는 세균 세포로 전달될 수 있다. 이 경우에, 폴리펩티드는 유전자 III 단백질에 융합되지 않고 주변세포질 및/또는 배지로 분비된다.

또한, 폴리펩티드는 진핵 세포에서 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 효모 세포, 예를 들어 피키아(예를 들어, 문헌(Powers et al. J Immunol Methods 251:123-35 (2001)) 참조), 한세뉼라 ( Hansenula ), 또는 사카로마이세스에서 발현된다.

한 실시양태에서, 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 생산된다. 클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현하기 위한 전형적인 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO 세포)(dhfr - CHO 세포 포함, 이는 문헌(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220(1980)에 기재되었으며, 예를 들어, 문헌(Kaufman and Sharp, Mol. Biol. 159:601-621 (1982))에 기재된 DHFR 선별가능 지표와 함께 사용됨), 림프구 세포주, 예를 들어, NS0 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포, 및 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 포유동물 유래 세포를 포함한다. 예를 들어, 세포는 유방 상피 세포이다.

폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 이외에, 재조합 발현 벡터는 추가의 서열, 예를 들어 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어 복제 기점) 및 선별가능 지표 유전자를 포함할 수 있다. 선별가능 지표 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 해준다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호; 제4,634,665호; 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별가능 지표 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물 예를 들어 G418, 히그로마이신, 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다.

표준 분자 생물학 기술을 이용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양하고 배양 배지로부터 항체 분자를 회수할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 친화성 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 WO 10/056550호에 기재된 바와 같이 정제된다. 대표적인 실시양태에서, 폴리펩티드가 지지체에 결합 또는 흡착하도록 하는 조건하에서 폴리펩티드와 오염물(들)의 혼합물을 단백질 A-기반 지지체 및/또는 이온 교환 지지체와 접촉하는 단계; 폴리펩티드가 지지체에 계속해서 결합되도록 하는 조건하에서 결합된 지지체를 세척함으로써 한 가지 이상의 오염물을 제거하는 단계, 및 용리 완충제로 흡착된 폴리펩티드 분자를 용리시킴으로써 지지체로부터 폴리펩티드를 선택적으로 용리시키는 단계에 의해 폴리펩티드는 한 가지 이상의 오염물로부터 정제된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 형질전환 동물에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,849,992호는 형질전환 포유동물의 유선에서 항체를 발현하는 방법을 개시한다. 밀크 특이적 프로모터 및 항체 분자를 코딩하는 핵산 및 분비를 위한 신호 서열을 포함하는 전이유전자(transgene)가 제작된다. 상기 형질전환 포유동물의 암컷에 의해 생산된 밀크는 그 안에 분비된 관심의 단일 도메인을 포함한다. 항체 분자는 밀크로부터 정제될 수 있거나, 일부 용도에는 직접 사용된다.

본 발명은 본원에 정의된 제제의 제조 방법을 포함한다.

정제 및 제제화 단계는 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드가 본 발명에 따른 완충제를 이용하여 컬럼으로부터 용리될 때 동시에 일어날 수 있다. 별법으로, 본 발명의 제제는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 투석, 한외 여과 등과 같은 당 업게에 널리 이용되는 방법에 의해 완충제를 교환함으로써 제조될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제제의 제조 방법은 또한 예를 들어 물 또는 적합한 완충제(선택적으로 추가의 부형제를 포함할 수 있음)의 첨가에 의한 동결건조되거나 분무 건조된 제제의 재구성에 관한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 제제의 제조 방법은 추가의 단계, 예를 들어 밀봉된 용기와 같이 임상 용도에 적합한 바이알에 상기 제제를 충전하는 단계, 및/또는 상기 제제를 투여 단위 형태로 조제하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 방법은 추가의 단계, 예를 들어 분무 건조, 동결건조, 또는 냉동, 예를 들어 벌크 냉동을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 용기, 투여 단위 형태, 또는 본원에서 인용된 임의의 방법에 의해 얻을 수 있는 기타 산물을 포함한다.

본 발명의 제제는 본원에 기재된 바와 같이 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, vWF에 대한 적어도 하나의 ISVD를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081을 저장하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 정의된 제제의 용도의 특징을 갖는, 본원에 사용된 본 발명의 폴리펩티드의 저장 방법을 포함한다. 더 구체적으로, 본 발명은 저장을 위해 본 발명의 폴리펩티드의 안정화 방법으로서, 예를 들어, 본원에 기재된 제제의 제조를 포함하는 방법을 포함한다. 저장은 선택적으로 -70℃와 +40℃ 사이, 예를 들어 -70℃, -20℃, +5℃, +25℃ 또는 +40℃ 온도, 바람직하게는 -70℃와 +25℃ 사이 온도, 더 바람직하게는 -20℃와 +5℃ 사이 온도에서 1-36개월, 예를 들어 1, 1.5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 또는 36개월, 예를 들어, 적어도 12개월일 수 있다. 따라서, 저장은 냉동, 냉동 건조(동결건조) 및/또는 분무 건조를 포함할 수 있다. 저장 방법은 본원에 정의된 vWF 결합제의 물리적 화학적 완전성의 평가를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본원에 정의된 적어도 한 가지의 vWF 결합제를 포함하는 제제를 분석하는 방법에 관한 것이다. 제제는 본원에서 정의된 vWF 결합제의 화학적 또는 물리적 불안정성의 임의의 징후에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 제제는 분해 산물, 예를 들어 단백질 분해 단편과 같은 저분자량 유도체의 존재에 대해; 그리고/또는 화학 유도체, 예를 들어, 피로글루타메이트 변이체에 대해; 그리고/또는 응집체, 덩어리 등과 같은 고분자량 유도체 등의 존재에 대해 평가될 수 있다. 또한, 제제는 전체 단백질 함량 및/또는 효능에 대해 평가될 수 있다. 본원에서 언급된 다양한 분석법 각각은 본 발명의 분석 방법에 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 예를 들어 제조, 저장 및 사용 중 한 가지 이상의 과정 동안 제제의 성질 및/또는 안정성을 모니터 및/또는 평가하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 예를 들어 제제가 본원에 추가로 기재되는 제품의 규격서를 충족시키는 지를 평가하기 위해서 제제의 품질 관리 방법에 관한 것이다. 상기 임의의 측면에서 본 발명은 한 가지 이상의 기준 시료와 비교, 배치(batch) 사이의 변이의 분석, 및 생산 과정의 진행 중 모니터링으로부터 선택된 한 가지 이상을 포함한다.

본 발명은 예를 들어 어떤 제한 없이 본 발명의 제제를 포함함으로써 그들의 생산 또는 조제에 필수적임으로써 본 발명의 제제와 관련된 임의의 제품에 관한 것이다.

예를 들어, 본 발명은 본 발명에 따른 한 가지 이상의 제제를 포함하는 제조 물품, 예를 들어 밀봉된 용기에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 실시양태에 따른 한 가지 이상의 제제를 포함하는 약학적 단위 제형, 예를 들어 환자, 바람직하게는 인간 환자에 비경구 투여(예를 들어 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내 및 피하)에 적합한 제형에 관한 것이다.

투여 단위 형태는 예를 들어 사전 충전된 주사기, 앰플, 카트리지 또는 바이알의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 제제 및 사용 설명서, 예를 들어 의료 전문가에 의한 사용 설명서를 포함하는 키트 또는 제조 물품이 제공된다. 키트 또는 제조 물품은 본원에 기재된 본 발명의 제제를 포함하는 바이알 또는 주사기를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 바이알 또는 주사기는 유리, 플라스틱, 또는 시클릭 올레핀 중합체 또는 공중합체로부터 선택된 중합체 물질로 구성된다. 주사기, 앰플, 카트리지 또는 바이알은 임의의 적합한 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 제조될 수 있으며 고무 재료, 예를 들어 바이알용 고무마개 및 고무 플런저 및 주사기 및 카트리지용 고무 밀봉을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 한 가지 이상의 제제를 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는 사용 설명서 및/또는 임상 포장 인쇄물을 더 포함할 수 있다. 본원에 정의된 제품의 임의의 실시양태에서, 본 발명은 또한 예를 들어 규제 측면에 의해 요구되는 포장 재료, 사용 설명서, 및/또는 임상 포장 인쇄물의 존재를 포함한다.

2 이상의 아미노산 서열을 비교하기 위해서, 첫째 아미노산 서열과 둘째 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 퍼센트(본원에서 "아미노산 동일성"으로도 언급됨)는 [둘째 아미노산 서열에서 해당 위치에서 아미노산 잔기와 동일한 첫째 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 수]를 [첫째 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 전체 수]로 나누고 [100%]를 곱하여 계산될 수 있으며, 여기서 - 첫째 아미노산 서열에 비교하여 - 둘째 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 각 결실, 삽입, 치환 또는 첨가는 단일 아미노산 잔기(위치)에서 차이, 즉 본원에서 정의된 "아미노산 차이"로 간주된다.

별법으로, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성 정도는 역시 표준 설정을 이용하는 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성 정도를 결정하기 위한 상기에 언급된 것들을 이용하여 계산될 수 있다.

통상적으로, 상기에 개략적으로 설명된 계산 방법에 따라 2개의 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"의 퍼센트를 결정하기 위하여, 가장 많은 개수의 아미노산 잔기를 가진 아미노산 서열을 "첫째" 아미노산 서열로 정할 것이고 나머지 아미노산 서열을 "둘째" 아미노산 서열로 정할 것이다.

또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 서열 동일성 정도를 결정하는데 있어, 숙련자는 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 이것은 일반적으로 아미노산 잔기가 유사한 화학적 구조의 또 다른 아미노산으로 대체되고 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 기타 생물학적 특성에 대해 거의 또는 본질적으로 영향을 주지 않는 아미노산 치환으로 설명될 수 있다. 이러한 보존적 아미노산 치환은 예를 들어 WO 04/037999호, GB-A-3 357 768호, WO 98/49185호, WO 00/46383호 및 WO 01/09300호로부터 당업계에 잘 알려져 있으며; 이러한 치환의 (바람직한) 유형 및/또는 조합은 WO 04/037999호 및 WO 98/49185호 및 본원에 인용된 추가의 참고문헌으로부터 적절한 교시 내용을 기초로 하여 선택될 수 있다. 이러한 보존적 치환은 바람직하게는 하기 군 (a) - (e)가 동일한 군의 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다: (a) 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; (b) 극성, 음하전된 잔기 및 그들의 (비하전) 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; (c) 극성 양하전된 잔기: His, Arg 및 Lys; (d) 큰 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 (e) 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 특히 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Gly 또는 Ser으로; Arg에서 Lys으로; Asn에서 Gln 또는 His으로; Asp에서 Glu으로; Cys에서 Ser으로; Gln에서 Asn으로; Glu에서 Asp으로; Gly에서 Ala 또는 Pro으로; His에서 Asn 또는 Gln로; Ile에서 Leu 또는 Val으로; Leu에서 Ile 또는 Val로; Lys에서 Arg, Gln 또는 Glu으로; Met에서 Leu, Tyr 또는 Ile으로; Phe에서 Met, Leu 또는 Tyr으로; Ser에서 Thr으로; Thr에서 Ser으로; Trp에서 Tyr으로; Tyr에서 Trp으로; 그리고/또는 Phe에서 Val, Ile 또는 Leu으로. 본원에 기재된 폴리펩티드에 적용되는 임의의 아미노산 치환은 또한 문헌(Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978)에 의해 개발된 상이한 종의 상동 단백질 사이의 아미노산 변이의 빈도 분석, 문헌(Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 및 Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978)에 의해 개발된 구조 형성 포텐셜의 분석, 및 문헌(Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981, 및Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986)에 의해 개발된 단백질에서 소수성 양상의 분석을 기초로 할 수 있으며, 상기 모든 문헌은 그 전문으로 본원에 참고에 포함된다. 나노바디®의 1차, 2차 및 3차 구조에 대한 정보는 본원의 설명 및 상기에 인용된 일반적인 배경에 제공된다. 또한, 상기 목적을 위해, 라마의 V_HH 도메인의 결정 구조는 예를 들어 문헌(Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; 및 Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999))에 제공된다. 통상적인 V_H 도메인에서 V_H/V_L 계면을 형성하는 일부 아미노산 잔기 및 이들 위치에서 가능한 낙타화 치환에 대한 추가적인 정보는 상기에 인용된 선행 기술에서 찾아볼 수 있다.

또한, 본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어, 급성 관상 증후군(ACS), 일과성 뇌 허혈 발작, 불안정형 또는 안정형 협심증, 뇌졸중, 심근경색 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)의 치료 또는 예방 방법으로서, 본 발명의 제제를 포함하는 약학 조성물을 피험체에 투여함으로써, 상기 vWF 관련 질환과 관련된 한 가지 이상의 증상을 감소시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 vWF 관련 질환은 TTP이다.

또한, 본 발명은 vWF 관련 질환의 특징을 갖는 질환에 걸리기 쉽거나 그로 진단받은 인간 환자의 치료 방법으로서, 유효량의 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 치료 또는 예방 방법으로서, 5-40 mg 용량의, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드를 인간에게 투여함으로써 vWF 관련 질환과 관련된 한 가지 이상의 증상을 감소시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드의 상기 투여 단계 후 5분 내지 8 h 이내에 1차 혈장 교환(PE)을 수행하는 것인 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드의 상기 투여 단계 전에 선행 혈장 교환(PE)을 실시하며, 상기 1차 PE의 36h, 바람직하게는 32, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 또는 16h, 바람직하게는 약 24h 이내에 실시하는 것인 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은 상기 1차 PE 후 5분 내지 8h 이내에, 예를 들어 10분 내지 6 h 또는 15분 내지 4h 이내에, 예를 들어 8h, 7h, 6h, 5h, 4h, 3h, 3h, 1h, 45분, 30분, 20분, 15분, 10분 또는 심지어 5분 이내에 1-40 mg, 바람직하게는 10 mg의 2차 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드를 투여하는 것인, 예를 들어 상기 2차 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 1차 PE의 1-60분, 예를 들어 30분 이내에 바람직하게는 피하 주사에 의해 투여하는 것인 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은

(ⅰ) PE를 실시하는 단계; (이후에)

(ⅱ) 단계 (ⅰ)의 상기 PE 후 15분 내지 4h에 5-40 mg 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드를 투여하는 단계; 및

(ⅲ) 선택적으로 상기 환자의 혈소판 수 및/또는 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계를 더 포함하며,

상기 단계 (ⅰ) 및 단계 (ⅱ)를 상기 환자의 혈소판 수가 ≥150,000/㎕가 되고/거나 ADAMTS13 활성이 ADAMTS13 기준 활성의 적어도 10% 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45% 또는 심지어 50%가 될 때까지 1일에 1회 반복하는 것인 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 환자의 혈소판 수가 ≥150,000/㎕가 된 후 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 또는 심지어 30일 동안 5-40 mg 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드를 1일에 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은 상기 인간이 완화에 들어갈 때까지 5-40 mg 용량의 본원에 기재된 폴리펩티드를 1일 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명은 ADAMTS13 활성이 ADAMTS13 기준 활성의 적어도 10% 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 45% 또는 심지어 50%가 될 때까지 상기 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 치료법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기에 기재된 질환의 치료에 유용한 재료를 포함하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 포함물, 라벨 및 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 만들어질 수 있다. 용기는 병태를 치료하는데 효과적인 조성물을 담고 있으며 멸균 접속구를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 정맥 내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘로 관통되는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내 적어도 한 가지의 활성제는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이다. 용기 위에 또는 용기와 결합된 라벨은 조성물이 선택된 병태를 치료하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 제조 물품은 본원에 기재된 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 인산염 완충 식염수 또는 시트르산염 완충 식염수를 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 제조 물품은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 사용자 또는 상업적인 관점에서 바람직한 기타 재료를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 제제를 포함하는 용기 및 사용 설명서를 포함하는 키트 또는 제조 물품을 제공한다.

본 발명은 제제가 바이알 또는 주사기에 존재하는 것인 본원에 기재된 키트 또는 제조 물품을 제공한다.

본 발명은 제제가 사전 충전된 주사기에 존재하는 것인 본원에 기재된 키트 또는 제조 물품을 제공한다.

본 발명은 주사기 또는 바이알이 유리, 플라스틱, 시클릭 올레핀 중합체 또는 공중합체로부터 선택된 중합체 재료로 구성된 것인 본원에 기재된 키트 또는 제조 물품을 제공한다.

본 명세서에서 예시되고 논의된 실시양태는 단지 발명을 만들고 이용한 발명자들이 알고 있는 최선의 방법을 교시하고자 하는 것이다. 상기 교시 내용를 고려하여 당업자에게 인식되듯이 본 발명의 상기 기재된 실시양태의 변형 및 변이는 본 발명을 벗어나지 않으면서 가능하다. 따라서, 청구항 및 그들의 등가물의 범위 내에서, 달리 구체적으로 기재되지 않더라도 본 발명이 실시될 수 있다는 것으로 이해된다.

본 발명은 이제 하기 비제한적인 바람직한 측면, 실시예 및 도면에 의해 더 설명될 것이다.

본 출원 전반에 인용된 모든 참고문헌(문헌 참고, 공고 특허, 공개 특허 출원, 및 동시계속 특허 출원 포함)의 전체 내용은 특히 상기에 참고된 교시 내용에 대해 이로써 명백하게 참고에 포함된다.

6. 약어

AE 이상 반응

ACS 급성 관상 증후군

ADAMTS13 트롬보스폰딘 반복 13을 갖는 디스인테그린 유사 및 메탈로프로테아제

ALX 0081 카플라시주맙

AMI 급성 심근경색

BNP 뇌 나트륨 이뇨펩티드

BMI 체질량 지수

BU 베데스타 단위

CDR 상보성 결정 영역

cIEF 모세관 등전점 전기영동

dAb 단일 도메인 항체

ELISA 효소 결합면역흡착측정법

HR 위험률

ISVD 면역글로불린 단일 가변 도메인

ITT 치료 의도(Intent-to-treat)

i.v. 정맥 내

FR 골격 영역

KA 결합 상수

KD 해리 상수

LDH 락테이트 디히드로게나제

NSE 뉴런 특이적 에놀라아제

NT proBNP N-말단 프로 뇌 나트륨 이뇨펩티드

PE 또는 PEX 혈장 교환

PP 프로토콜 순응(per protocol)

RICO 리스토세틴 보조인자 활성

RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피

SAE 중대 이상 반응

s.c. 피하

scFv 단쇄 가변 단편

S/D 용매/세제(계면활성제)

SE-HPLC 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피

SPR 표면 플라스몬 공명

TnI 트로포닌 I

TnT 트로포닌 T

TRALI 수혈 관련된 급성 폐 손상

TTP 혈전성 혈소판 감소성 자반증

TTR 반응까지의 시간

ULN 정상 상한치

ULvWF 초대형 vWF

VH 중쇄 가변 도메인

VHH 중쇄 항체로부터 유래한 중쇄 가변 도메인 서열

VL 경쇄 가변 도메인

vWF 폰 빌레브란트 인자

7. 실시예

7.1 적용 규제

실시예 부분에서 사용된 모든 인간 시료는 판매처로부터 또는 인간 지원자로부터 얻었고(요구된 모든 동의 및 승인을 얻은 후에) 적용되는 법률 및 규제 요건(의료 비밀 및 환자 사생활과 관련한 것을 포함하여)에 따라 사용하였다.

임상 시험은 적용되는 법률과 규제(헬싱키 선언 및 의료 비밀 및 환자 사생활 보호의 원칙 포함)에 따르고 요구되는 모든 승인(해당 윤리 위원회의 승인을 포함) 및 동의(관련된 피험자의 사전 동의 포함)를 얻은 후 실시하였다.

본 임상 연구의 목적 및 내용뿐만 아니라 그 결과는 기밀로 취급하였고 제3자가 접근할 수 없도록 하였다. 본 연구에 참여하는 피고용인은 비밀 보장의 의무가 있었다. 미사용된 모든 약물은 출원인에게 반납하여 페기하였다.

7.2 내피세포 유래 ULvWF에 혈소판 부착 및 ADAMTS13의 활성에 대한 ALX 0081의 효과

목적: 본 연구의 목적은 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 ULvWF에 혈소판의 부착을 억제할 수 있는 지를 평가하는 것이었다. 그 후 이것은 급성 에피소드를 보이는 TTP 환자 치료를 위한 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX-081의 용도에 대한 개념 증명으로 역할을 할 수 있었다. 또한, 본 연구는 ADAMTS13 활성에 대한 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 효과를 결정한다.

방법: 유동 챔버 시험을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 문헌(Sixma et al. 1998 Thromb Res 92: S43-S46)에 따라 혈소판과 ULvWF 사이의 상호작용을 억제할 수 있는지를 시험하였다. 간략하게, 내피세포를 커버 슬립 위에서 배양하고 자극시켜 ULvWF를 분비시켰다. TTP 환자 혈장에 혈소판을 보충하고 자극된 세포에 관류시켰다. ULvWF에 부착하는 혈소판 스트링을 실시간 비디오 현미경으로 가시화하였다. 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 증가하는 농도의 존재하에서 실험을 반복하였다. ADAMTS13에 의한 ULvWF 절단에 대한 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 효과를 결정하기 위하여, 두 가지 유형의 실험을 이용하였다. 첫째 실험에서, ADAMTS13에 의한 혈소판 스트링의 절단을 본 발명의 과잉의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 없이 평가하였다. 둘째 실험에서, vWF의 A1-A2-A3 도메인으로 구성된 재조합 단편을 사용하여 ADAMTS13에 대한 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX0081의 억제 효과를 평가하였다.

결과: ALX 0081은 시험된 모든 농도에서 ULvWF에 혈소판 스트링 형성을 억제 하였고 ADAMTS13에 의한 혈소판 스트링 박리에 효과를 보이지 않았다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081은 ADAMTS13에 의한 vWF의 재조합 A1-A2-A3 도메인 단편의 절단에 효과를 보이지 않았다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081은 본 실험에서 이미 형성된 스트링으로부터 혈소판을 제거할 수 없었다.

결론: 본 연구는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 TTP 환자를 치료하는데 사용될 수 있다는 개념을 증명한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 ADAMTS13 활성을 방해(간섭)하지 않는다는 것을 입증한다.

7.3 자격 기준

환자는 연구 참여에 자격을 갖추기 위해 하기 모든 기준을 충족시켜야 했다:

포함 기준

1. 18세 이상

2. 허용 가능한 피임법을 수용할 의사가 있는 남성 또는 여성

3. TTP로 임상 진단된 환자

4. PE를 필요로 하는 피험자(연구에 무작위 배정 전 1회 단일 PE 기간 허용)

5. 추적 조사가 용이한 피험자

6. 서명과 날짜가 적힌 사전 동의서가 입수된 피험자

제외 기준

1.100,000/㎕ 이상의 혈소판 수

2. 패혈증으로 나타난 심각한 능동 감염(혈액 배양이 양성이거나 아니거나 승압제 요구)

3. 이. 콜라이 0157 또는 관련 유기체로 장내 감염의 임상 증거

4. 항-인지질 증후군

5. DIC의 진단

6. 임신 또는 모유 수유

7. 조혈 줄기세포 또는 골수 이식 관련 혈전성 미세 혈관증

8. 이미 알고 있는 선천성 TTP

9. 활동성 출혈 또는 출혈의 고위험도

10. 비조절성 동맥성 고혈압

11. 비타민 K 길항제, 헤파린 또는 LMWH, 및 비-아세틸 살리실산 비스테로이드 항염증 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는, 안전하게 정지될 수 없는 항응고 치료법을 이용한 공지된 만성 치료.

12. 시험 참여에 장애를 주는 TTP 이외의 심각하거나 생명을 위협하는 임상 상태

13. 악성 종양으로 인해 3개월 미만의 예상 수명을 가진 피험자

14. 골수 암증으로 이미 알고 있거나 의심되는 피험자

15. 연구 프로토콜 요건 및 절차를 준수할 수 없는 피험자

16. 연구 약물의 활성 성분 또는 부형제에 이미 알고 있는 과민성

17. CTCAE 등급으로 정의된 3등급 독성에 해당하는 심각한 간 손상. 핵심 간 손상 파라미터에 대해, 다음과 같이 정의된다:

* 빌리루빈 > 3 x ULN(용혈로 인한 간접적 빌리루빈의 단독 증가를 구분할 필요가 있으며, 이것은 제외 파라미터가 아니라 관련된 질환이다)

* ALT/AST > 5 x ULN

* AP > 5 x ULN

* 감마 글루타밀 트랜스펩티다제(GGT) > 5 x ULN

18. GFR < 30 mL/min으로 정의된 심각한 만성 신장 장애

7.4 연구 설계

본 연구는 II 상 다중심성, 단일 맹검, 평행 설계, 무작위 배정, 플라세보-대조 연구(Titan 시험)로 설계하였다. 연구 집단은 PE 치료를 요구하는 후천성 TTP의 급성 에피소드를 가진 증후성 환자였다. 연구 참여에 대한 자격을 확인한 후(실시예 7.3 참조), 환자를 1:1의 비율로 무작위 배정하여 PE의 보조 요법으로 ALX 0081 또는 플라세보를 받도록 하였다(도 1). 환자를 PE 치료 개시 전에 무작위 배정하였다. 그러나 예외적인 사례에(요구되는 모든 스크리닝 및/또는 기저치 연구 절차가 실시되도록 허용하지 않는 시간 프레임으로 PE를 개시할 필요가 있거나 개시할 수 있기 때문에), 환자를 선행하는 단일 PE 기간("선행 PE") 후에 그러나 다음 PE 기간("1차 PE") 개시 전에 무작위 배정하였다. 이 전체 다음 PE 기간은 선행PE 기간 종료 24시간 이내에 개시하였고 연구의 1차 PE("1차 PE")로 간주하였다.

환자는 본 연구 동안 여러 단계를 따랐다:

* 입원 후 스크리닝 및 기저치 측정

* 치료 단계

o 일시적 주입에 의해 투여되는 단일 i.v. 볼러스 연구 약물

o 매일 PE 보조 s.c. 치료 단계

o 매일 PE 후 s.c. 치료 단계(적용되는 경우 PE 점감 요법, 및 가장 마지막 PE 후 30일간 PE 후 연구 약물 포함)

* 추적 조사 단계

환자는 각 위치의 연구자에 의해서 그리고 TTP 치료 가이드라인에 따라 적절하다고 판단되는 최상의 의료 관리 및 치료를 받았다. 개별 연구 참여의 최대 총 기간은 최대 15개월이었다: 최대 90일의 치료 단계, 및 완화 후 또는 치료 90일 후, 어느 것이 먼저 오든, 최대 1년의 추적 조사 기간. 일반적으로, 환자는 마지막 매일 PE 후 적어도 1일간 입원하였다.

연구 약물은 PE 절차에 대해 특정 시간에 보조 치료제로서 투여하였다. 연구 약물은 10 mg의 카플라시주맙("치료 군") 또는 플라세보("플라세보 군")으로 1일 1회 또는 1일 2회로 이루어졌다.

7.4.1 1차 약물 투여

환자는 1차 PE 개시 전 15분 내지 6h에 일시적 주사에 의해 1차 i.v. 볼러스의 10 mg ALX 0081 또는 플라세보를 받았다. 이 1차 PE 후에 PE 절차 종료 후 30분 이내에 10 mg 연구 약물을 s.c. 투여받았다.

전체 PE 치료 기간(점감 요법 및 악화를 위해 제공된 PE 포함) 동안, 연구 약물은 s.c. 주사에 의해 매일 투여하였다.

1일당 1회 PE가 예정된 경우, 10 mg의 연구 약물은 PE 절차 종료 후 30분 이내에 투여하였다.

1일당 2회 PE가 예정된 경우, 10 mg의 연구 약물은 각 PE 절차 종료 후 30분 이내에 투여하였다. 따라서, 연구 약물의 최대 총 1일 용량은 20 mg이었다.

1일당 1회 미만의 PE가 예정된 경우(즉, 점감 요법 기간에), 10 mg의 연구 약물을 매일 투여하였다. PE 실시일에 연구 약물은 PE 절차 종료 후 30분 이내에 투여하였고, PE가 없는 날에는, 이전 투여 후 24 h(± 1 h)에 연구 약물을 투여하였다.

10 mg의 매일 s.c. 약물 투여는 가장 마지막 PE(점감 요법 포함) 후 30일간 지속하였다.

7.4.2 1차 종점

본 II 상 연구의 1차 종점은 하기 기준에 근거한 반응까지의 시간(TTR: time-to-response)이었다: 혈소판 ≥ 150,000/㎕의 회복. 종점을 충족시켰는 지를 검증하기 위해서, 반응은 혈소판 ≥ 150,000/㎕의 드 노보 측정값 및 락테이트 디히드로게나제(LDH) ≤ 2 x 정상 상한치(ULN)로 150,000/㎕ 이상의 혈소판 회복을 최초로 보고한 후 48시간에 확정되었다. 즉 "혈소판 반응 확인". 혈소판 수는 TTP 환자로 치료 결정을 내리기 위해 중심이 되는 실험 지표이다. 이것은 ULvWF-매개 혈소판 응집이 TTP 진단에 있어 주요 특징이 되는 심각한 혈소판 감소증 및 미세혈관병증 용혈 빈혈을 일으키는 TTP 배후의 보편적인 병태생리학적 기전이라는 사실에 기초한다(Scully et al. 상기 문헌).

7.4.3 ADAMTS13 활성의 결정

ADAMTS13 활성과 기능 억제제 활성은 FRETS-VWF73 기질을 이용하여 형광분석법에 의해 측정하였다(Kokame et al. 2005. Br J Haematol 129(1):93-100; Kremer Hovinga et al. 2006 J Thromb Haemost 4(5):1146-8).

간략하게, FRETS-VWF73 분석은 하기 변형을 이용하여 본질적으로 문헌(Kokame et al. 2005 상기 문헌)에 기재된 바와 같이 실시하였다: Pefabloc SC (Boehringer, Mannheim, Germany)을 최종 농도 1mmol/L로 분석 완충제에 첨가하였다(5 mmol/L Bis-Tris, 25 mmol/L CaCl2, 0.005% 트윈-20, pH 6.0). 분석 완충제 중에 1:25(100%)로 희석된 정상 인간 혈장 풀(NHP; Swiss Red Cross Blood Services, Bern, Switzerland)을 이용하여 분석 캘리브레이션을 얻었다. 추가의 캘리브레이션 시료는 열불활성화된 NHP 중에 3:4(75%), 1:2(50%), 1:4(25%), 1:10(10%), 1:20(5%), 1:50(2%) 및 1:100(1%)으로 사전에 연속 희석하여 얻고, 56℃에서 30분간 인큐베이션한 후 15 000 x g에서 15분간 원심분리하여, 더 낮은 활성 범위의 표준 곡선에서 혈장 기질 효과를 보정하였다. 상기 모든 표준 시료 및 열불활성화된 NHP(0% ADAMTS13 활성) 및 모든 시험 시료는 계속하여 분석 완충제에 1:25로 희석하였다. 다음, 각각의 희석된 표준 또는 환자 시료 25 ㎕를 384웰 백색 플레이트(NUNC, Roskilde, Denmark) 내 37℃에서 인큐베이션하였다. 10분 후에, 분석 완충제에 용해된 25 ㎕의 4 μmol/L FRETS-VWF73 펩티드 기질을 각 웰에 첨가하고 형광 방출을 340 nm 여기 필터(밴드 폭 35 nm) 및 450 nm 방출 필터(밴드 폭 25 nm)가 장착된 형광 마이크로플레이트 판독기(GENios, Tecan, Zurich, Switzerland)로 37℃에서 기록하였다. 형광 방출을 시간 경과에 따라(42주기 동안 5분 마다) 측정하였다. 반응 속도는 5(주기 2) 내지 60분(주기 13)까지 시간 경과에 따라 형광 방출의 선형 회귀 분석(패싱-밥록(Passing-Bablok)에 의해 계산하였다. 회귀 곡선의 기울기를 각 캘리브레이션 시료에 대해 계산하였고, 이것을 이용하여 캘리브레이션 곡선을 생성하였다(추세선: y = ax + b; 여기서 x = ADAMTS13 (%)이고 y = ΔRFU/Δ시간). 그 후, 시료의 ADAMTS13 활성(%)을 (y - b) x 1/a 로 계산하였다.

ADAMTS13 기능 억제제 활성은 열불활성화된(56℃에서 30분) 환자의 혈장과 37℃에서 2시간 1:1(v/v) 인큐베이션 후 정상 인간 혈장의 잔여 ADAMTS13 활성의 결정에 의한 동일한 형광 FRETS-VWF73 방법에 의해 측정하였다.

각각의 분석 배치에 대해, 분석 완충제 중에 1:25(100%)로 희석된 정상 인간 혈장 풀을 이용하여 캘리브레이션 곡선을 얻었다(NHP; Swiss Red Cross Blood Services, Bern, Switzerland). 추가의 캘리브레이션 시료는 열불활성화된 NHP 중에 1:2(50%), 1:4(25%), 1:10(10%), 1:20(5%), 1:50(2%) 및 1:100(1%)으로 사전에 연속 희석하여 얻었다. 모든 캘리브레이션 지점을 1회로 적용하였다. 허용 기준: (1) 표준 곡선의 최종 회귀의 기울기는 >6.0이어야 하고; (2) 최종 플롯의 회귀의 R²은 >0.98(또는 R >0.9899)이어야 한다. 그렇지 않을 경우, 분석은 거절하였다.

7.5 TTP 환자에서 결과

7.5.1 피험자 배치 및 집단 분석.

II 상 연구는 표 2에 개시한 바대로 무작위 배정된 75명 환자의 시료 크기를 포함하였다.

1차 분석 집단은 치료의도(ITT) 집단이었으며, 무작위 치료 배정에 따라 모두 무작위 배정된 피험자로 이루어졌다. 또한, 효능 분석에 프로토콜 순응 집단(PP)을 이용하였다. PP 집단은 ITT 집단의 부분집단이며, 모든 주요 프로토콜 편차 및 위반자를 제외하고, 무작위 치료 배정에 따라 모두 무작위 배정된 피험자로 이루어진다.

<표 2>

결론적으로, 두 가지 모든 치료 군, 즉 카플라시주맙을 받은 환자(치료 군) 및 플라세보를 받은 환자(플라세보 군)에 균등하게 분배하였다. 게다가 치료 군은 나이, 민족/인종 및 BMI에 따라 균형을 맞췄다.

여러 파라미터의 기저치 특징을 치료 군과 플라세보 군의 환자에서 평가하였다. 표 3에서, 기저치 혈소판 수 및 LDH를 나타낸다. LDH 수준증가는 용혈 및/조직 허혈증의 증가를 나타낸다.

<표 3>

카플라시주맙 군의 경우 평균 기저치 혈소판 수가 약간 더 낮다. 두 가지 군 모두에서, 평균 혈소판 수는 기저치에서 매우 낮았으며, 이것은 중증 질환 배경과 일치하지만, 존재하는 모든 피험자가 포함되도록 고려하였으며 덜 심각한 혈소판 감소성 피험자에 편향되지 않는다는 것을 또한 나타낸다.

LDH 평균은 두 가지 치료 군에서 비슷하다.

표 4에서 기저치 vWF:Ag 및 ADAMTS13 활성을 제시한다.

<표 4>

두 치료군 모두 vWF:AG 및 ADAMTS13 활성에 대해 균형을 잘 맞췄다. 절반 이상의 피험자가 <5% ADAMTS13 활성으로 나타난 바와 같이 특발성 TTP를 보인다.

7.5.2 연구 결과: 1차 종점

혈액 지표의 반응까지의 시간을 생존 환경에서 모니터하였다. 혈액 지표의 1차 종점 반응까지의 시간은 혈소판 ≥ 150,000/㎕의 회복을 포함하였다. 혈소판 수준은 TTP 질환 활성에 대해 신뢰할만한 대리 지표에 해당한다. 0에서 사건까지 기간을 30일로 정하였다.

결과를 도 5에 나타낸다.

데이터를 층화(무작위 배정 전 1회 PEX: 예 & 아니오)에 따라 평가하였으며, 이는 전체 ITT 집단에 p 값 = 0.013일 때 전체 ITT 집단의 전체 위험률 2.197로 집계된다. 위험률은 언제든 카플라시주맙을 받은 피험자가 플라세보 피험자에 비해 혈소판 회복 확인의 1차 종점을 달성하는데 두 배 이상의 속도를 보인다는 것을 의미한다.

혈소판 반응 확인(1차 종점)까지 시간 감소:

- 무작위 배정 전 PEX 없는 피험자 군에서, 플라세보 군의 평균 4.92일이 카플라시주맙 군의 3.00일로 감소하였다. 39% 감소(무작위 배정 전 PEX = 아니오)

- 무작위 배정 전 1회 PEX를 받은 피험자 군에서, 플라세보 군의 평균 4.31일이 카플라시주맙 군의 2.44일로 감소하였다, 43% 감소(무작위 배정 전 PEX = 예).

2계층의 플라세보(무작위 배정 전 1회 PEX: 예 & 아니오)의 평균 시간 4.31일 및 4.92일은 의학 문헌 및 연구자들의 데이터(6일; 문헌(Bandarenko et al. Journal of Clinical Apheresis 1998; 13: 133-141) 참조)에서 예상된 것보다 더 적다. 이것은 과거 데이터에 비해 개선된 표준 치료법을 이용한 경우에도, 카플라시주맙 치료가 우수하다는 것을 시사한다.

95% CI의 혈소판 반응 확인까지 시간은 플라세보 군에 비해 카플라시주맙 군의 경우 2 내지 3배 더 좁아진다. 이것은 질환 해결까지의 시간이 플라세보 군보다 카플라시주맙 치료 군에서 가변성이 낮다는 것을 시사한다.

<표 5>

7.5.3 연구 결과: 악화

ITT 집단 내에, 악화된 피험자의 비율을 결정하였다. 악화는 혈소판 반응 확인 후 재발성 혈소판 감소증 및 마지막 PE 후 ≥1일 그러나 ≤ 30일 후에 매일 PE 치료의 재개를 요구하는 것을 언급한다.

결과는 표 6에 나타낸다.

<표 6>

카플라시주맙 군에 비해 플라세보 군에서 3x 더 악화가 있다.

이것은 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081이 TTP(의 증상)를 치료하고/거나 완화시키는데 단독으로 책임질 수 있다는 결과를 확인해 준다.

7.5.4 연구 결과: 재발

TTP가 재발한 피험자 수를 평가하였다. TTP의 재발은 마지막 매일 PE 후 30일 이후에 발생한 TTP의 드 노보 사건으로서 정의된다. 표 7에서 ITT 집단에서 치료 종료 후 첫 달에 악화 및/또는 재발된 피험자의 비율을 나타낸다.

<표 7>

본 발명자들은 전체 수를 균등하게 나눈 플라세보(PLC) 군에 비해 카플라시주맙 군에서 더 많은 재발을 관찰한다.

카플라시주맙 군에서 재발은 대개 카플라시주맙 치료 종료의 수일 내에 일어난다. 이것은 재발이라기보다는 악화의 "연장" 가능성을 나타낸다. 따라서, 카플라시주맙(CAP) 치료는 아마도 일부 피험자에게는 너무 짧은 기간이 될 수 있다. 실제로, CAP 군에서 높은 횟수의 조기 재발은 보호 효과를 입증하고 일부 환자에서 더 긴 CAP 치료를 보장한다. 이것은 카플라시주맙 치료가 연장된 기간 동안 계속되어야 한다는 것을 시사한다.

두 치료 군 모두에서, ADAMTS13 활성이 단지 환자의 부분집단에서만 허용된다고 하더라도 재발이 < 5%의 기저치 ADAMTS13 활성을 가진 환자에서 더 현저하다는 것이 주목된다는 것이 흥미롭다. 이것은 < 5%의 기저치 ADAMTS13 활성을 가진 환자가 재발(또는 악화)되기 더 쉽다는 것과 카플라시주맙 치료가 더 높은 활성을 가진 환자와 비교하여 훨씬 더 긴 기간 동안 계속되어야 한다는 것을 나타낼 수 있다(실시예 7.5.8 참조).

7.5.5 연구 결과: 완전 완화

ITT 집단에서 완전 완화된 피험자 수를 평가하였다. 여기서 완전 완화는 혈소판 반응 확인 및 악화의 부재로 정의된다. 결과는 표 8에 나타낸다.

<표 8>

카플라시주맙 군은 플라세보 군에 비해 1.6x 더 많은 완전 완화된 피험자를 나타낸다. 혈소판 반응 확인까지 시간의 더 빠르고 더 좁은 분포와 결합된 완전 완화의 비율이 클수록 CAP 군에서 PE에 대한 환자 반응의 더 큰 예측 가능성을 뒷받침하고, PE의 일수에 반영된다. PE의 연속 일수는 점감 요법을 포함하여 투여된 전체 혈장 부피가 CAP 경우 (평균 ± 표준편차) 22.5 ± 15.9 리터 vs PLC 경우 28.4 ± 21.3 리터일 때 CAP 경우 6.6 ± 3.4일 vs PLC 경우 8.1 ± 6.5일이었다. 효과는 기저치 ADAMTS13 활성 데이터가 카플라시주맙 군에서 불완전하다고 하더라도 낮은 기저치 ADAMTS13 활성을 갖는 피험자의 부분집단에서 더 확연해 보인다(실시예 7.5.8 참조)

7.5.6 연구 결과: 안전성 평가

이상 반응(AE) 및 중대 이상 반응(SAE)의 발병률을 출혈 관련 SAE 및 면역 관련 SAE에 집중하여 평가하였다. SAE 평가는 카테터 삽입, 패혈증, 카테터 혈전증, 기흉, 체액량 과부하증, 저산소증, 저혈압, 유사 아나필락시스 반응 및 TRALI로 인한 출혈을 포함하였다. 중대 이상 반응의 횟수는 두 가지 치료 군 모두에서 유사하였다: 플라세보 군에서 51%에 비교하여 카플라시주맙에서 57%. 또한, 이상 반응의 횟수도 치료 군에서 유사하였다: 플라세보 군에서 100%에 비교하여 카플라시주맙에서 97%. 출혈 관련 AE를 보이는 피험자 수는 플라세보 군(38%)에 비해 카플라시주맙 군(54%)에서 약간 상승하였다.

현재 사용되는 비특이적 항혈전제의 가장 두드러진 위험은 출혈 경향 또는 외출혈의 상승이다. 어떤 예상외의 효과 외에도, 출혈은 또한 카플라시주맙에 가장 관련있는 안전성 문제에 해당한다. 이러한 맥락에서, 카플라시주맙을 임상전 외과적 출혈 모델에서 조사하였다. 본 연구에서, 카플라시주맙을 받은 동물에서 외과적 혈액 손실은 헤파린(Heparin)® 처리된 동물에서 혈액 손실과 비슷하였고, 플라빅스(Plavix)® 및 레오프로(ReoPro)® 처리된 동물보다 각각 2배와 4배 더 적은 혈액 손실이 있었다. 이것이 출혈 위험의 측면에서 카플라시주맙이 플라빅스® 및 레오프로®보다 더 안전할 수 있다는 것을 긍정적으로 나타내지만, 이것은 건강한 개인에서 평가되었다. 상기에 나타낸 바와 같이, TTP-환자는 vWF와 관련하여 건강한 개인과는 많은 측면에서 상이하다. 카플라시주맙으로 치료받은 4명 환자 및 플라세보로 처리된 2명 환자에서 이상 사건으로 인해 연구 치료를 중지하였다. 그러나 출혈 경향의 증가는 잘 관리되었다.

TTP는 잠재적으로 생명 위협적이다. 시험에서 2명의 사망자(5.4%)가 보고되었으며, 둘 다 플라세보 군이었다. 플라세보 군에서 사망자 수는 문헌에 기재된 것(10-30%)보다 낮다는 것이 주목된다. 이것은 더 효과적인 표준 치료(본 연구에서)로 인해 TTP의 성과가 향상되었다고 추론할 수 있다.

7.5.7 연구 결과: 추가의 최적화된 치료 프로토콜

본 발명자들은 혈소판 반응 확인까지 시간의 분포가 플라세보 군에 비해 CAP 군에서 더 짧고 기울지 않았으며 오른쪽으로 치우친다(반응까지 더 긴 시간)는 이해를 근거로 최적화된 추가의 치료 프로토콜을 설계하였다.

최적화된 추가의 치료 프로토콜에서, 모든 피험자는 하기 주요 변형을 제외하고 본질적으로 7.4 항목의 "연구 설계" 전에 개시 바와 같이 치료받는다: PE 치료 기간은 3-5일간, 예를 들어 3일 또는 4일 또는 5일, 바람직하게는 3일로 정한다. PE 치료 기간은 혈소판 회복(≥ 150,000/㎕)과 무관하다. 매일 s.c. 연구 약물 투여는 가장 마지막 PE 후 적어도 10일, 예를 들어 20일 또는 30일간, 그러나 바람직하게는 혈소판 ≥ 150,000/㎕의 회복 후 적어도 10일, 예를 들어 20일 또는 30일간 지속한다. 추가의 최적화된 치료 프로토콜을 평가할 때, 1차 종점은 상기 문헌에 정의된 악화 횟수가 될 것이다.

추가의 최적화된 치료 프로토콜에서, 환자의 부담 및 경비가 감소된다.

7.5.8 ADAMTS13 활성

치료 유익성을 유지하기 위하여, 기저 질환 활성의 지표로서 ADAMTS13 활성을 추가로 평가하고 카플라시주맙의 최적 치료 기간을 안내하기 위한 지표로서 ADAMTS13 활성을 평가하는 것을 개시하였다.

이 경우에, ADAMTS13 활성이 <10% 일 때 기저 질환 활성을 추정하였다. ≥10%의 ADAMTS13 활성은 기저 질환 활성이 없는 것으로 추정되었다.

악화 및 재발은 환자의 이용 가능한 ADAMTS13 활성 데이터와 관련이 있었다. 만약 치료 기간에 계속하여 낮은 ADAMTS13 (<10%) 후에 재발이 일어난다면, 그것은 현재 에피소드의 재발로 간주하였다. 치료 기간에 ADAMTS13 활성 ≥10% 후에 재발이 일어난다면, 이것은 드 노보 TTP 에피소드로 간주하였다. 분석에서 제외된 환자는 (ⅰ) 비-ADAMTS13 매개 질환(기저치에서 ≥10%)(n=3), 및 (ⅱ) 불충분한 데이터를 가진 환자(n=12)였다.

(ⅰ) 악화 또는 재발 없는 환자:

- 카플라시주맙: 13/16(81%)은 치료 종료 가까이에 ADAMST13 활성 값 ≥10%을 보였다.

- 플라세보: 14/16(88%)은 치료 종료 가까이에 ADAMST13 활성 값 ≥10%을 보였다.

따라서, 악화 또는 재발이 없는 대부분의 환자에서, ADAMTS13 활성은 10% 초과 수준으로 회복하였고, 이는 현재 TTP 에피소드의 해결을 시사한다.

(ⅱ) 악화된 환자

- 카플라시주맙: 2/3(67%)는 그들의 악화에 근접하여 ADAMTS13 활성 <10%을 보였다

- 플라세보: 7/8(88%)은 그들의 악화에 근접하여 ADAMTS13 활성 <10%을 보였다.

따라서, TTP의 악화를 보인 대부분의 환자에서, ADAMTS13 활성은 10% 미만이었고, 이는 악화를 일으키는 해결되지 않은 질환 활성을 시사한다.

(ⅲ) 현재 TTP 에피소드의 재발을 가진 환자

- 카플라시주맙: 7/7(100%)은 치료 종료에 가까이에 ADAMST13 활성 값 <10%을 보였다; 재발은 치료 종료 후 10일 이내에 발생하였다.

- 플라세보: N/A - 모두 "드 노보" 재발이었다.

따라서, 치료 종료 후 곧 재발이 발생한 카플라시주맙 군의 모든 피험자는 진행중인 질환을 나타내는 지속적으로 낮은 ADAMTS13 활성(<10%)을 보였다.

(ⅳ) 드 노보 재발 에피소드를 가진 환자

- 카플라시주맙: 4/4(100%)는 치료 종료 가까이에 ADAMST13 활성 값≥10%을 보였다; 치료 종료 후 ≥30일 이내(범위: 30 -167일)에 재발이 발생하였다. 4명 환자 모두 재발 시에 다시 ADAMTS13 활성 <10%을 보였다.

- 플라세보: 2/3(67%)는 치료 종료 가까이에 ADAMST13 활성 값 ≥10%을 보였다; 치료 종료 후 ≥30일 이내(범위: 30 -167일)에 재발이 발생하였다. 재발 시기 주변에 이용 가능한 데이터가 없었다.

따라서, 드 노보 재발 에피소드를 가진 대부분의 환자에서, ADAMTS13 활성은 치료 종료 가까이에 10% 초과 수준으로 회복하였으며, 이는 현재 TTP 에피소드의 해결을 시사한다; 값은 재발 시기에 다시 낮았으며(<10%), 이것은 신규 TTP 에피소드를 나타낸다.

(ⅴ) 결론

데이터는 TTP의 재발의 예측 지표로서 ADAMTS13 활성의 용도 및 치료 결정을 위한 그의 가능성을 뒷받침 해준다.

ADAMTS13 활성은 카플라시주맙 치료를 정지한 후 바로 발생하는 재발을 예측할 수 있다.

이러한 재발은 현재 TTP 에피소드의 재발로서 간주된다(지속적으로 낮은 ADAMTS13 활성을 근거로 한 해결되지 않은 질환 활성).

카플라시주맙으로 (PE 후) 30일 치료 기간은 악화 횟수에 상당한 영향을 증명하였다.

재발의 위험에 있는(즉, ADAMTS13 활성을 근거로 한 기저 질환 활성을 가진) 환자에 대한 카플라시주맙 치료 기간의 연장은 기저 질환이 적절하게 치료되거나 해결될 때까지 카플라시주맙의 보호 효과를 유지할 것이다.

반대로, 카플라시주맙을 이용한 예방 치료는 TTP의 급성 에피소드의 위험도를 감소시킬 것이다.

7.5.9 연구 결과: 장기 손상 지표

TTP 환자에서 특징적인 미세혈관 폐색은 뇌, 심장, 보다 적게는 신장을 포함한 신체 전반에 장기(organ) 허혈(증)을 유발할 수 있다.

급성 심근경색(AMI)은 AMI의 임상적 진단(Patschan et al. 2006 Nephrology, dialysis, transplantation 21: p.1549-54) 및 부검 소견(Hosler et al. Archives of pathology & laboratory medicine, 2003. 127(7): p.834-9) 모두를 근거로 하여 TTP의 조기 합병증으로 보고되었다. 높은 혈청 락테이트 디히드로게나제(LDH) 및 트로포닌 I(TnI) 상승을 근거로 하여, 임상적으로 의심받는 TTP 환자가 AMI 발생 위험이 높다는 것이 증명되었다. 상승된 트로포닌 T 수준은 사망률 및 급성 이환율과 연관되었다. 사망한 피험자는 더 높은 트로포닌 T 수준을 보였지만, 정상 트로포닌 T 수준의 군에서 사망자는 없었다. 조직학적 검사는 사망한 피험자에서 광범위한 심근 미세혈관 혈전증을 확인하였다(Hughes et al. 2009 J.Thromb.Haemost. 7: p.529-536). 이들 결과는 현재 TTP 에피소드의, 예를 들어 트로포닌에 의해 측정된 추가의 미세혈관 심장 허혈증의 더 신속한 감소가 임상적 성과에 유익할 것으로, 예를 들어 장기 손상, 예를 들어 뇌, 심장 및 신장에 위험을 감소시킬 것으로 예상될 수 있다는 것을 시사한다. 기타 후향성 보고는 심근경색(Wahla et al. 2008 Eur. J. Haem. 81: p.311-6) 및 경색증, 부정맥, 심장성 쇼크 및 급성 심장사(Hawkins et al. 2008 Transfusion 48: p.382-92)와 같은 기타 심장 사건을 포함하여 TTP 환자에서 급성 및 장기 심장 병발에 대해 유사한 결과를 확인하였다.

후향성 연구에서, 제시된 높은 수준의 LDH는 중증의 여러 장기 병발을 반영하는 더 나쁜 장기간 성과(사망률)와 연관되었다(Benhamou, et al. 2012 Haematologica 97: p.1181-6). 따라서, 용혈 및 허혈성 장기 손상의 지표로서 LDH의 신속한 정상화는 또한 장기간 임상적 성과에 유익하고 장기 손상의 위험을 감소시킬 수 있다.

허혈성 손상은 급성 합병증뿐만 아니라 더 좋지 못한 장기간 성과 모두를 일으키기 때문에, LDH, 트로포닌 T 또는 I 및 크레아티닌의 특이적이고 임상적으로 적절한 장기 손상 생물지표에 대해 분석을 실시하였다. 심장 트로포닌(I 또는 T)은 심근 손상에 특이적인 지표이고, 크레아티닌은 신장 기능에 대한 생물지표이고, LDH는 용혈의 지표이며 이 질환에서 장기 손상의 훨씬 주된 지표라고 간주되었다. TTP 환자에서, 이들 생물지표의 일부에서 높은 기저치 수준 또는 더 느린 정상화는 더 나쁜 임상적 성과와 연관되었다(예를 들어, 사망률, 난치병).

데이터는 장기 손상 생물지표에 의해 측정된 미세혈관 조직 허혈증의 더 신속한 감소는 임상적 성과에 유익한 것으로, 예를 들어 장기 손상에 대한 위험도 감소에 대해 유익한 것으로 예상된다는 것을 시사한다. 그러나 장기 손상 지표 결과가 어느 정도까지는 매일 혈장 교환의 희석 효과에 의해 혼동된다는 것에 주의해야 한다(환자 및 플라세보 군에서 모두).

(ⅰ) 락테이트 디히드로게나제

LDH는 비특이적 조직 허혈증의 중요한 지표이다. ITT 집단에서 피험자 수를 기준으로 비율을 계산하였다. LDH 값 ≤2　x　ULN을 갖는 ITT 집단에서 피험자의 수 및 비율을 처음 5일의 연구일 동안 계획된 치료에 따라 요약하였다. 결과 요약은 표 9에 제공한다. 연구일에 따라 평균 LDH/ULN 비율은 표 10에 제공한다.

제1일에, ALX-0081 치료 군에서 11명 피험자(30.6%)와 플라세보 군에서 9명 피험자(23.1%)가 LDH 값 ≤2xULN을 보였다. 피험자의 비율은 플라세보 군과 비교하여 ALX-0081 치료 군에서 제2일에(각각 28명 피험자　[77.8%] 및 20명 피험자[51.3%]) 및 제3일에(각각 33명 피험자 [91.7%] 및 29명 피험자[74.4%]) 더 높았다. 제4일 및 제5일에, LDH 값 ≤2　x　ULN을 갖는 피험자 비율은 두 군 사이에 유사하였다.

LDH/ULN의 평균 비는 제1일에 ALX 0081과 플라세보 치료 군 사이에 비슷하고(각각 3.93 및 3.98) 포함된 모든 기타 시점에서 플라세보 군에서 더 높았다.

<표 9>

<표 10>

계획된 치료에 따라 LDH 값의 정상화까지의 시간을 비교하기 위해 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석을 실시하였다. LDH 정상화까지의 시간 곡선을 [도 2]에 제공한다.

카플란-마이어 분석으로부터, 플라세보를 받은 피험자에 비해 ALX 0081을 받은 피험자가 LDH의 정상 수준으로 더 빠른 회복을 나타낸다.

(ⅱ) 트로포닌

계획된 치료에 따라 트로포닌　T 또는 트로포닌 I 값의 정상화까지의 시간을 비교하기 위해 카플란-마이어 분석을 실시하였다. 상기에 언급된 바와 같이, TnT와 TnI 모두 심장 세포 손상의 적절한 생물지표이다. 트로포닌 T 또는 I 정상화까지의 시간 곡선을 [도 3]에 제공한다.

카플란-마이어 분석으로부터, 플라세보를 받은 피험자에 비해 ALX 0081을 받은 피험자가 트로포닌 T 또는 I의 정상 수준으로 더 빠른 회복을 나타낸다.

(ⅲ) 크레아티닌

또한, 이 경우에도, 계획된 치료에 따라 크레아틴 값의 정상화까지의 시간을 비교하기 위해 카플란-마이어 분석을 실시하였다. 크레아틴 정상화까지의 시간 곡선을 [도 4]에 제공한다.

크레아티닌의 경우, 카플란-마이어 분석에서 플라세보를 받은 피험자에 비해ALX 0081을 받은 피험자가 크레아티닌의 정상 수준으로 더 빠른 회복을 나타낸다.

(ⅳ) 고찰

ULvWF 스트링이 미세혈전 형성에서 혈소판을 소비하는 선천성 TTP의 병태생리학이 제공되기 때문에, 혈소판 수의 회복은 추가의 미세혈전 형성을 예방하는 간접적인 척도가 된다고 판단되었다. 선천성 TTP와 관련된 이환율 및 급성 사망률은 상기 미세혈전의 결과이다.

실제로, 이러한 추론은 장기 손상 지표에 의해 뒷받침된다. 특히, 결과는 장기 손상 지표 트로포닌 I 및 T, LDH 및 크레아티닌이 플라세보를 받은 피험자보다 ALX 0081을 받은 피험자에서 더 빠르게 정상수준으로 회복된다는 것을 나타낸다.

따라서, 결과는 상기 장기 손상 지표의 더 빠른 정상화 속도가 더 우수한 임상적 성과, 즉, 미세혈전에 의해 유발된 장기 허혈로 인한 장기 손상의 위험도 감소 및 장기 손상의 감소와 연관된다는 것을 시사한다.

7.5.10 용량 선택 근거

카플라시주맙의 약리학은 두 가지이다. 카플라시주맙은 vWF의 기능성에 영향을 주어 vWF가 혈소판에 결합할 수 없게 만든다. 또한, vWF의 배치에 영향을 주어 치료 기간에 전체 vWF:Ag 수준의 일시적인 감소를 가져온다.

모의실험을 통해 가상의 TTP 환자 집단에서 다양한 투여 시나리오의 전체, 유리 및 복합체 형성된 vWF 수준에 대해 예상되는 노출 및 해당 효과를 평가하기 위해 PK/PD 모델을 이용하였다. TITAN 연구 집단에 기초한 특징을 갖는 TTP 환자의 가상 집단(n=500)을 TITAN 시험의 TTP 집단에서 체중(평균 81.9 kg ±22.6 SD, 범위 47.5-150 kg)의 절단 분포 및 모델 추정된 기저치 vWF뿐만 아니라 성별 분포(M:F 40:60)를 표본 조사하여 생성하였다.

모의실험된 시나리오는 2.5, 5, 10, 20 mg의 용량으로 각 PE의 종료 후 1h에 카플라시주맙의 동시 s.c. 매일 투여와 함께 초기 8일의 매일 PE 절차를 포함하였다(기간 1). 계속하여, 카플라시주맙을 어떤 기타 PE 절차 없이 추가 30일 동안 동일한 용량 수준/요법으로 투여되도록 하였다(기간 2).

기저치로부터 유리 vWF의 % 변화는 용량에 따라 증가하지만 용량 비례적인 것보다는 작다. 연구 시작 당시 표적 발현(vWF)의 큰 다양성과 주로 연관된 개인 간 큰 다양성은 모든 용량 수준에서 예측된다. 두 가지 더 낮은 용량(2.5 및 5　mg 1일 1회)은 차선의 표적 억제를 일으키지만, TITAN 연구에서 시험된 것보다 더 높은 1일 용량의 카플라시주맙(20 mg)은 모의실험된 전체 TTP 집단에 실질적으로 유익하지 않다. [도 5]는 플라세보로 처리받은 환자를 포함하여 용량 수준의 함수로서 기간 2의 종료시 유리 vWF:Ag 수준의 기저치로부터 모델 추정된 % 감소를 나타낸다.

10 mg 1일 1회 용량에 대한 약물, 유리, 복합체 및 전체 vWF 수준의 모의실험된 혈장 프로파일은 [도 6]에 나타낸다.

표적 중화의 지표로서 유리 vWF의 수준의 변화 다음에, 출혈 위험의 지표로서 전체 vWF 수준 변화를 평가하였다. 폰 빌레브란트 병 I형에서 발견되는 최고의 vWF 수준과 연관된 역치 0.4 IU/mL(또는 16 nM)를 사용하였다. 상기 수준의 vWF에서, 충분한 수준의 FVIII이 여전히 이용 가능한 것으로 생각된다. 패널 D는 10 mg 1일 1회의 제안된 용량에 대해 전체 vWF는 출혈 사건의 위험을 고려한 상기 역치보다 여전히 높다는 것을 보여준다.

효능(유리 vWF)과 안전성에 대하여 앞선 시험관 내 시험 결과 및 모델 예측된 수준의 생물지표(전체 vWF)를 기초로 하여, 본원에서 사용되는 투약 요법(1일 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg)은 출혈 사건은 최소이며 적어도 조절 가능하면서 TTP 환자에서 (UL)vWF의 혈소판 결합 성능의 바라는 억제에 도달하는데 적합한 것으로 생각된다.

7.6 결론

연구 시작 당시 표적 발현(vWF)의 개인 간 큰 다양성이 존재한다. 그렇지만, 사용된 투여량은 최적의 표적 억제를 가져왔으며, 이는 실질적으로 치료받은 전체 TTP 집단에 유익하였다.

따라서, ALX 0081은 TTP 치료에 새로운 접근법에 해당하며 TTP 환자에게 효능, 안전성 및 삶의 질의 측면에서 상당한 유익성을 제공한다.

카플라시주맙의 개념 증명은 혈소판 반응 확인까지의 시간의 통계적으로 유의하고 임상적으로 의미있는 감소로 입증되었다. 혈소판 반응 확인까지 평균 일수는 카플라시주맙의 경우 3일 vs 플라세보의 경우 4.9일이었다. 95% CI(1.28, 3.78), p = 0.013일때 HR(카플라시주맙에 대한 플라세보) 2.2.

플라세보 군에서 11명에서 카플라시주맙 군에서 3명으로 악화 횟수가 감소 되었다. 이것은 카플라시주맙 치료의 보호 효과를 강조한다.

플라세보 군에서 2명의 사망자와 비교하여 카플라시주맙에서 사망자가 없었다.

AE 및 SAE는 심각한, 잠재적으로 생명을 위협하는 병태와 일치한다. 플라세보 군의 경우 2명의 피험자에서 2건 SAE에 비해 카플라시주맙 군의 경우 2명의 피험자에서 단지 5건 SAE가 있었지만, 플라세보 군(35건)에 비해 카플라시주맙 군(66건)에서 거의 두 배 많은 출혈 사건이 있었다.

종합적으로, 후천성 TTP 환자에 대해 유익성 위험도 평가는 매우 긍정적이다.

본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081의 ULvWF 매개 혈소판 응집의 억제 및 그 결과 항혈전 효과는 PE 및 수혈과 함께 사용될 때 TTP의 급성 발작의 더 신속한 조절을 가능하게 한다. 이것은 명백하게 장기 허혈증의 위험을 감소시킨다. 또한 혈소판 수의 더 신속한 정상화는 출혈성 합병증의 위험을 감소시킨다. 또한, 그의 사용은 질환으로 인한 사망률이 여전히 높은 속발성 TTP 환자를 포함하여 저조한 반응성 환자에서 향상된 성과를 가져온다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 ALX 0081은 급성 에피소드로부터 회복 후 재발을 예방하는데 가치가 있다.

<표 A-1>

<표 A-2>

SEQUENCE LISTING <110> Ablynx N.V. <120> Methods of treating TTP with immunoglobulin single variable domains and uses thereof <130> 182 258 <140> NL 2013007 <141> 2014-06-16 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12A02H1-3a- 12A02H1 <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn 20 25 30 Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro 100 105 110 Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg 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Gly Ser Glu Val 145 150 155 160 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ala Leu 165 170 175 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met 180 185 190 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Leu Val Ala Ala 195 200 205 Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly 210 215 220 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln 225 230 235 240 Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 245 250 255 Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu 260 265 270 Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 275 280 285 <210> 5 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12A05-3a-12A05 <400> 5 Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Leu Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser Ile Gly 20 25 30 Ala Met Gly Met Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Pro 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Gly Gly Pro 1745 1750 1755 Ser Gln Ile Gly Asp Ala Leu Gly Phe Ala Val Arg Tyr Leu Thr 1760 1765 1770 Ser Glu Met His Gly Ala Arg Pro Gly Ala Ser Lys Ala Val Val 1775 1780 1785 Ile Leu Val Thr Asp Val Ser Val Asp Ser Val Asp Ala Ala Ala 1790 1795 1800 Asp Ala Ala Arg Ser Asn Arg Val Thr Val Phe Pro Ile Gly Ile 1805 1810 1815 Gly Asp Arg Tyr Asp Ala Ala Gln Leu Arg Ile Leu Ala Gly Pro 1820 1825 1830 Ala Gly Asp Ser Asn Val Val Lys Leu Gln Arg Ile Glu Asp Leu 1835 1840 1845 Pro Thr Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe Leu His Lys Leu Cys 1850 1855 1860 Ser Gly Phe Val Arg Ile Cys Met Asp Glu Asp Gly Asn Glu Lys 1865 1870 1875 Arg Pro Gly Asp Val Trp Thr Leu Pro Asp Gln Cys His Thr Val 1880 1885 1890 Thr Cys Gln Pro Asp Gly Gln Thr Leu Leu Lys Ser His Arg Val 1895 1900 1905 Asn Cys Asp Arg Gly Leu Arg Pro Ser Cys Pro Asn Ser Gln Ser 1910 1915 1920 Pro Val Lys Val Glu Glu Thr Cys Gly Cys Arg Trp Thr Cys Pro 1925 1930 1935 Cys Val Cys Thr Gly Ser Ser Thr Arg His Ile Val Thr Phe Asp 1940 1945 1950 Gly Gln Asn Phe Lys Leu Thr Gly Ser Cys Ser Tyr Val Leu Phe 1955 1960 1965 Gln Asn Lys Glu Gln Asp Leu Glu Val Ile Leu His Asn Gly Ala 1970 1975 1980 Cys Ser Pro Gly Ala Arg Gln Gly Cys Met Lys Ser Ile Glu Val 1985 1990 1995 Lys His Ser Ala Leu Ser Val Glu Leu His Ser Asp Met Glu Val 2000 2005 2010 Thr Val Asn Gly Arg Leu Val Ser Val Pro Tyr Val Gly Gly Asn 2015 2020 2025 Met Glu Val Asn Val Tyr Gly Ala Ile Met His Glu Val Arg Phe 2030 2035 2040 Asn His Leu Gly His Ile Phe Thr Phe Thr Pro Gln Asn Asn Glu 2045 2050 2055 Phe Gln Leu Gln Leu Ser Pro Lys Thr Phe Ala Ser Lys Thr Tyr 2060 2065 2070 Gly Leu Cys Gly Ile Cys Asp Glu Asn Gly Ala Asn Asp Phe Met 2075 2080 2085 Leu Arg Asp Gly Thr Val Thr Thr Asp Trp Lys Thr Leu Val Gln 2090 2095 2100 Glu Trp Thr Val Gln Arg Pro Gly Gln Thr Cys Gln Pro Ile Leu 2105 2110 2115 Glu Glu Gln Cys Leu Val Pro Asp Ser Ser His Cys Gln Val Leu 2120 2125 2130 Leu Leu Pro Leu Phe Ala Glu Cys His Lys Val Leu Ala Pro Ala 2135 2140 2145 Thr Phe Tyr Ala Ile Cys Gln Gln Asp Ser Cys His Gln Glu Gln 2150 2155 2160 Val Cys Glu Val Ile Ala Ser Tyr Ala His Leu Cys Arg Thr Asn 2165 2170 2175 Gly Val Cys Val Asp Trp Arg Thr Pro Asp Phe Cys Ala Met Ser 2180 2185 2190 Cys Pro Pro Ser Leu Val Tyr Asn His Cys Glu His Gly Cys Pro 2195 2200 2205 Arg His Cys Asp Gly Asn Val Ser Ser Cys Gly Asp His Pro Ser 2210 2215 2220 Glu Gly Cys Phe Cys Pro Pro Asp Lys Val Met Leu Glu Gly Ser 2225 2230 2235 Cys Val Pro Glu Glu Ala Cys Thr Gln Cys Ile Gly Glu Asp Gly 2240 2245 2250 Val Gln His Gln Phe Leu Glu Ala Trp Val Pro Asp His Gln Pro 2255 2260 2265 Cys Gln Ile Cys Thr Cys Leu Ser Gly Arg Lys Val Asn Cys Thr 2270 2275 2280 Thr Gln Pro Cys Pro Thr Ala Lys Ala Pro Thr Cys Gly Leu Cys 2285 2290 2295 Glu Val Ala Arg Leu Arg Gln Asn Ala Asp Gln Cys Cys Pro Glu 2300 2305 2310 Tyr Glu Cys Val Cys Asp Pro Val Ser Cys Asp Leu Pro Pro Val 2315 2320 2325 Pro His Cys Glu Arg Gly Leu Gln Pro Thr Leu Thr Asn Pro Gly 2330 2335 2340 Glu Cys Arg Pro Asn Phe Thr Cys Ala Cys Arg Lys Glu Glu Cys 2345 2350 2355 Lys Arg Val Ser Pro Pro Ser Cys Pro Pro His Arg Leu Pro Thr 2360 2365 2370 Leu Arg Lys Thr Gln Cys Cys Asp Glu Tyr Glu Cys Ala Cys Asn 2375 2380 2385 Cys Val Asn Ser Thr Val Ser Cys Pro Leu Gly Tyr Leu Ala Ser 2390 2395 2400 Thr Ala Thr Asn Asp Cys Gly Cys Thr Thr Thr Thr Cys Leu Pro 2405 2410 2415 Asp Lys Val Cys Val His Arg Ser Thr Ile Tyr Pro Val Gly Gln 2420 2425 2430 Phe Trp Glu Glu Gly Cys Asp Val Cys Thr Cys Thr Asp Met Glu 2435 2440 2445 Asp Ala Val Met Gly Leu Arg Val Ala Gln Cys Ser Gln Lys Pro 2450 2455 2460 Cys Glu Asp Ser Cys Arg Ser Gly Phe Thr Tyr Val Leu His Glu 2465 2470 2475 Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Ser Ala Cys Glu Val Val 2480 2485 2490 Thr Gly Ser Pro Arg Gly Asp Ser Gln Ser Ser Trp Lys Ser Val 2495 2500 2505 Gly Ser Gln Trp Ala Ser Pro Glu Asn Pro Cys Leu Ile Asn Glu 2510 2515 2520 Cys Val Arg Val Lys Glu Glu Val Phe Ile Gln Gln Arg Asn Val 2525 2530 2535 Ser Cys Pro Gln Leu Glu Val Pro Val Cys Pro Ser Gly Phe Gln 2540 2545 2550 Leu Ser Cys Lys Thr Ser Ala Cys Cys Pro Ser Cys Arg Cys Glu 2555 2560 2565 Arg Met Glu Ala Cys Met Leu Asn Gly Thr Val Ile Gly Pro Gly 2570 2575 2580 Lys Thr Val Met Ile Asp Val Cys Thr Thr Cys Arg Cys Met Val 2585 2590 2595 Gln Val Gly Val Ile Ser Gly Phe Lys Leu Glu Cys Arg Lys Thr 2600 2605 2610 Thr Cys Asn Pro Cys Pro Leu Gly Tyr Lys Glu Glu Asn Asn Thr 2615 2620 2625 Gly Glu Cys Cys Gly Arg Cys Leu Pro Thr Ala Cys Thr Ile Gln 2630 2635 2640 Leu Arg Gly Gly Gln Ile Met Thr Leu Lys Arg Asp Glu Thr Leu 2645 2650 2655 Gln Asp Gly Cys Asp Thr His Phe Cys Lys Val Asn Glu Arg Gly 2660 2665 2670 Glu Tyr Phe Trp Glu Lys Arg Val Thr Gly Cys Pro Pro Phe Asp 2675 2680 2685 Glu His Lys Cys Leu Ala Glu Gly Gly Lys Ile Met Lys Ile Pro 2690 2695 2700 Gly Thr Cys Cys Asp Thr Cys Glu Glu Pro Glu Cys Asn Asp Ile 2705 2710 2715 Thr Ala Arg Leu Gln Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Lys Ser Glu 2720 2725 2730 Val Glu Val Asp Ile His Tyr Cys Gln Gly Lys Cys Ala Ser Lys 2735 2740 2745 Ala Met Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Asp Val Gln Asp Gln Cys Ser 2750 2755 2760 Cys Cys Ser Pro Thr Arg Thr Glu Pro Met Gln Val Ala Leu His 2765 2770 2775 Cys Thr Asn Gly Ser Val Val Tyr His Glu Val Leu Asn Ala Met 2780 2785 2790 Glu Cys Lys Cys Ser Pro Arg Lys Cys Ser Lys 2795 2800 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12A02H1 CDR1 <400> 21 Tyr Asn Pro Met Gly 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12A02H1 CDR2 <400> 22 Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 12A02H1 CDR3 <400> 23 Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu 1 5 10 15 Tyr Thr Phe

Claims (18)

1. 폰 빌레브란트 인자(vWF: von Willebrand Factor) 관련 질환의 급성 에피소드의 예방 및/또는 이의 위험도 감소를 필요로 하는 인간에서 그러한 예방 및/또는 감소에 사용하기 위한, vWF에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD: immunoglobulin single variable domain)을 포함하는 폴리펩티드로서,
   (ⅰ) 5-40 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계
   를 포함하는 것인 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,
   (ⅱ) 상기 환자의 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계;
   (ⅲ) 상기 ADAMTS13 활성을 기준 ADAMTS13 활성과 비교하는 단계; 및
   (ⅳ) 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 30% 미만, 예를 들어 20%, 15%, 10% 또는 5%이면, 상기 단계 (ⅰ)을 반복하는 단계
   를 더 포함하는 것인 폴리펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, vWF 관련 질환, 예를 들어 TTP의 급성 에피소드의 상기 위험도가 적어도 1.2의 계수 만큼 감소되는 것인 폴리펩티드.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 장기 손상, 허혈성 손상 및/또는 미세혈전 형성의 위험도가 계수 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.75, 1.8, 2 또는 그 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 심지어 10, 또는 그 이상 예를 들어 20, 50 또는 심지어 100 만큼 감소되는 것인 폴리펩티드.
5. 제1항에 있어서,
   - 혈소판 수를 측정하는 단계; 및
   - 상기 혈소판 수가 150,000/㎕보다 낮다면, 상기 단계 (ⅰ)을 반복하는 단계
   를 더 포함하는 것인 폴리펩티드.
6. 폰 빌레브란트 인자(vWF) 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료에 사용하기 위한, vWF에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드로서, 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg의 1차 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 폴리펩티드.
7. 제6항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 상기 투여 후 5분 내지 8시간 이내에 1차 혈장 교환(PE: Plasma Exchange)을 실시하는 것인 폴리펩티드.
8. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 상기 투여 전에 선행 혈장 교환(PE)을 실시하며, 바람직하게는 상기 1차 PE의 24시간 이내에 실시하는 것인 폴리펩티드.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 PE 후에 10 mg의 2차 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 1차 PE의 30분 이내에 투여하는 것인 폴리펩티드.
10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, vWF 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 vWF 관련 질환의 상기 치료는
    (ⅰ) PE를 실시하는 단계; 및
    (ⅱ) 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 단계 (ⅰ)의 상기 PE 후 15분 내지 4시간에 투여하는 단계
    를 더 포함하며,
    단계 (ⅰ) 및 단계 (ⅱ)는 상기 환자의 혈소판 수가 ≥150000/㎕일 때까지 1일 1회 반복되는 것인 폴리펩티드.
11. 제10항에 있어서, 상기 환자의 혈소판 수가 최초로 ≥150.000/㎕가 된 후 적어도 30일 동안 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 1일 1회 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 폴리펩티드.
12. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, ADAMTS13 활성이 기준 ADAMTS13 활성의 적어도 5%, 예를 들어 10% 또는 심지어 15%일 때까지 상기 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 폴리펩티드.
13. 제6항에 있어서, 폰 빌레브란트 인자(vWF) 관련 질환의 치료를 필요로 하는 인간에서 그러한 치료에 사용하기 위한, vWF에 대한 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISVD)을 포함하는 폴리펩티드로서, 적어도 하기 단계:
    (ⅰ) 혈장 교환(PE)을 실시하는 단계;
    (ⅱ) 5-40 mg, 바람직하게는 10 mg 용량의 상기 폴리펩티드를 상기 인간에게 투여하는 단계
    를 포함하고;
    상기 단계 (ⅰ) 및 상기 단계 (ⅱ)는 1일 1회 또는 2회 반복되는 것인 폴리펩티드.
14. 제13항에 있어서, 상기 단계 (ⅰ) 및 상기 단계 (ⅱ)는 최대 7일, 예를 들어 최대 6일, 5일, 4일, 3일, 또는 2일 동안 1일 1회 또는 2회 반복되는 것인 폴리펩티드.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    (ⅲ) 상기 환자의 ADAMTS13 활성을 측정하는 단계;
    (ⅳ) 상기 ADAMTS13 활성을 기준 ADAMTS13 활성과 비교하는 단계; 및
    (ⅴ) 상기 ADAMTS13 활성이 상기 기준 ADAMTS13 활성의 30% 미만, 예를 들어 20%, 15%, 10% 또는 5%이면, 상기 단계 (ⅱ) 및 선택적으로 단계 (ⅰ)을 반복하는 단계
    를 더 포함하는 것인 폴리펩티드.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 vWF에 대한 상기 ISVD가 4개 골격 영역(각각, FR1 내지 FR4) 및 3개의 상보성 결정 영역(각각, CDR1 내지 CDR3)으로 필수적으로 이루어지고, 여기서
    a) CDR1이
    - 아미노산 서열 YNPMG; 또는
    - 아미노산 서열 YNPMG와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열
    을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지고;
    b) CDR2가
    - 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG; 또는
    - 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    - 아미노산 서열 AISRTGGSTYYPDSVEG와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열
    을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지고;
    c) CDR3이
    - 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF; 또는
    - 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    - 아미노산 서열 AGVRAEDGRVRTLPSEYTF와 2개 또는 단지 1개의 아미노산 차이(들)를 갖는 아미노산 서열
    을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어진 것인 폴리펩티드.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 서열 번호 1-19를 포함하거나 이로 이루어진 것인 폴리펩티드.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 함유하는 용기, 및 사용 설명서를 포함하는 키트 또는 제조 물품.

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