KR20170020720A - 배양 세포의 분화 촉진 방법 및 배양 세포 분화 촉진제 - Google Patents

배양 세포의 분화 촉진 방법 및 배양 세포 분화 촉진제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배양 세포의 분화를 촉진할 수 있는 방법, 및, 이 방법에 호적하게 사용되는 배양 세포 분화 촉진제이다. 배양되어 있는 세포에, 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시킴으로써, 세포의 분화가 유도된다.

Description

배양 세포의 분화 촉진 방법 및 배양 세포 분화 촉진제{CULTURED CELL DIFFERENTIATION PROMOTION METHOD AND CULTURED CELL DIFFERENTIATION PROMOTER}
본 발명은, 배양 세포의 분화 촉진 방법, 및 배양 세포 분화 촉진제에 관한 것이다.
근년, ES 세포, iPS 세포 등의 만능 세포나 줄기세포를 이용한 재생 의료가 주목을 끌고 있다. 만능 세포나 줄기세포는, 분화가 진행되지 않은 미분화 상태의 세포라 일컬어진다. 재생 의료에 있어서는, 이들 미분화 상태의 세포를 목적하는 장기, 조직, 세포로 분화시키고, 얻어진 장기, 조직, 세포를 사용하여 환자의 치료가 행하여진다. 예를 들어, 환자의 피부의 표피 조직으로부터 채취한 줄기세포를 사용한 피부의 재생 의료나 미용 행위가 실현되고 있다.
피부의 표피는, 진피측에서부터 피부 표면측의 방향으로, 기저 세포, 유극 세포, 과립 세포, 및 각질 세포를 갖고, 기저 세포는, 유극 세포, 과립 세포, 각질 세포로 분화되면서 상층으로 이행하고, 최종적으로는 때로 되어 떨어져나간다.
피부의 재생 의료에 있어서는, 피험자의 피부의 최표면의 표피 조직으로부터, 기저 세포나 유극 세포를 채취하고, 이들 세포를 배양 용기 내에서 배양하여 층상으로 증식시키면서, 층의 최외측의 세포가 과립 세포로 분화되고, 이어서 각질 세포로 분화되도록 분화 유도 처리를 실시한다. 그리고, 이 분화 유도 처리에 의해, 기저 세포, 유극 세포, 과립 세포, 각질 세포의 순으로 층상으로 증식한 세포군(배양 표피)을 피험자의 피부에 이식한다.
상기의 분화 유도 조작에 있어서, 배양 용기로는, 일반적으로, 친수화 처리가 된 폴리스티렌제의 디쉬나 플라스크 등이 범용되어 왔다.
표피를 구성하는 세포 중, 기저 세포나 유극 세포는, 칼슘의 농도가 증가하는 환경에서, 과립 세포, 각질 세포로 분화되는 것이 알려져 있다.
또한, 과립 세포가 각질 세포로 분화되는 도중에 있어서, 케라틴, 인볼루크린, 로리크린 등의, 각질 세포를 구성하는 단백질이 생합성된다. 따라서, 배양 표피를 제작할 때는, 배양 세포 중에서 이들 단백질이 생합성되는 것이 중요하다. 한편, 배양 세포 내에서 이들 단백질이 생합성되고 있는 것은, 각 단백질에 대응하는 mRNA를 검출함으로써 행할 수 있다.
상기와 같이, 피부의 재생 의료 기술은 진보해 왔지만, 종래의 배양 표피의 제작 방법은, 수고뿐만 아니라, 시간도 필요로 하는 것이었기 때문에, 배양 표피가 이식 수술 시간에 대지 못하는 일이 있거나, 배양 표피의 제작에 필요로 하는 수고나 시간에 비례하여 고액의 비용이 발생하거나 한다는 문제가 있었다.
따라서, 배양 세포의 분화를 보다 촉진할 수 있는 방법이 요망되고 있었다.
각질 세포로의 분화를 촉진하는 방법으로는, 유산균의 유(乳)발효물을 사용하는 것이 알려져 있다. 특허문헌 1에는, 유산균 락토바실러스 헬베티쿠스를 사용하여 얻어진 유발효물을 인간 정상 표피 세포의 배양 배지에 첨가함으로써, 표피 세포의 분화 마커인 케라틴의 mRNA가 증가하는 것이 개시되어 있다. 또한, 이 유발효물을 경구 섭취함으로써 피부 표피의 각질화가 촉진되는 것이 제시되어 있다.
그러나, 이 유발효물에는 유산균이 포함되기 때문에, 재생 의료용의 세포를 배양할 때에 사용하는 배양 배지에 이 유발효물을 혼입시키는 것은 현실적이지는 않다.
또한, 버찌 추출물을 사용하여, 표피 세포의 분화를 촉진하는 방법이 알려져 있다. 특허문헌 2에는, 버찌 추출물을 표피 세포에 부여함으로써, 분화 과정에서 중요한 성분인 케라틴 10과 프로필라그린의 mRNA 생산이 항진되는 것이 제시되어 있다. 그러나, 케라틴 10과 프로필라그린은 표피 세포의 분화 과정의 초기부터 중기에 해당하는 유극 세포 내에서 합성되는 것이고, 버찌 추출물은 각질 세포로의 분화를 촉진하는 것은 아니다. 또한, 특허문헌 2에 기재된 기술은, 화장품 등의 외용제를 목적으로 하는 것으로, 이 지견을 즉시 재생 의료용의 표피 세포의 분화 촉진에 적용하는 것은 어렵다.
국제특허 WO2006/137513호(US2010/0166877) 일본 공개특허공보 제2012-167048호
본 발명은, 이러한 종래 기술의 실정을 감안하여 이루어진 것으로서, 배양 세포의 분화를 보다 촉진할 수 있는 방법, 및 배양 세포 분화 촉진제를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 분화의 대상인 세포를, 지환 구조 함유 중합체와 접촉시키면서 배양하면, 분화 마커인 mRNA가 증가하는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
이렇게 하여 본 발명에 의하면, 하기 (1)~(2)의 배양 세포의 분화 촉진 방법, 및 (3)의 배양 세포 분화 촉진제가 제공된다.
(1) 배양되어 있는 세포에, 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 배양 세포의 분화 촉진 방법.
(2) 배양되어 있는 세포가 표피 세포인 (1)에 기재된 배양 세포의 분화 촉진 방법.
(3) 지환 구조 함유 중합체 성형체로 이루어지는 배양 세포 분화 촉진제.
본 발명에 의하면, 배양 세포의 분화를 촉진할 수 있는 방법, 및, 이 방법에 호적하게 사용되는 배양 세포 분화 촉진제가 제공된다.
도 1은 로리크린 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 2는 GATA3 발현량을 나타내는 그래프이다.
본 발명에 사용하는 세포는, 분화 가능한 세포이면 특별히 제한되지 않는다. 분화 가능한 세포로는, 만능 세포; 간엽계 줄기세포 등의 각종 줄기세포; 각종 전구 세포; 외배엽, 중배엽 또는 내배엽으로부터 분화된 세포로서, 종말 분화 상태가 아닌 세포; 등을 들 수 있다. 이러한 분화 가능한 세포로서, 피부의 표피 재생을 위한 표피 세포는 바람직한 예로서 들 수 있다. 표피 세포는, 진피에 접하고 있는 표피의 기저 세포, 기저의 피부 표면측에 있는 유극 세포, 유극 세포의 피부 표면측에 있는 과립 세포의 어느 것이라도 좋다. 표피 세포는, 피부 치료의 대상이 되는 환자로부터 채취한 것이 바람직하다.
세포를 배양할 때에는, 통상, 액체 배지가 사용된다.
액체 배지로는, 통상, pH 완충 작용이 있고, 삼투압이 세포에 호적한 것이며, 세포의 영양 성분을 포함하고, 또한, 세포에 대하여 독성이 없는 것이 사용된다.
pH 완충 작용을 나타내는 성분으로는, 트리스염산염, 각종 인산염, 각종 탄산염 등을 들 수 있다.
액체 배지의 삼투압 조정은, 통상, 세포의 삼투압과 대략 동일해지도록, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 칼슘 이온, 글루코스 등의 농도를 조정한 수용액을 사용하여 행하여진다. 이러한 수용액으로는, 구체적으로는, 인산 완충 생리 식염수, 트리스 완충 생리 식염수, HEPES 완충 생리 식염수 등의 생리 식염수; 락트산 링거액, 아세트산 링거액, 중탄산 링거액 등의 링거액; 등을 들 수 있다.
세포의 영양 성분으로는, 아미노산, 핵산, 비타민류, 미네랄류 등을 들 수 있다.
액체 배지로는, RPMI-1640, HAM, α-MEM, DMEM, EMEM, F-12, F-10, M-199 등의 각종 시판품을 이용할 수 있다.
액체 배지에는, 첨가제를 배합할 수도 있다. 첨가제로는, 단백질 등의 유도 인자, 분화 유도 활성을 갖는 저분자 화합물, 미네랄, 금속, 비타민 성분 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 분화 유도하기 위한 첨가제를 배합하는 것이 바람직하다.
분화 유도하기 위한 첨가제로는, 세포 표면의 수용체에 작용하는 리간드, 아고니스트, 안타고니스트; 핵 내 수용체의 리간드, 아고니스트, 안타고니스트; 콜라겐이나 파이브넥틴 등의 세포 외 매트릭스; 세포 외 매트릭스의 일부분 혹은, 모사한 화합물; 세포 내의 정보 전달 경로에 관련된 단백질에 작용하는 성분; 세포 내의 1차 대사 또는 2차 대사의 효소에 작용하는 성분; 세포 내의 핵 내 또는 미토콘드리아 내의 유전자의 발현에 영향을 미치는 성분; 바이러스 벡터 등과 조합시켜 세포 내에 도입할 수 있는 DNA나 RNA; 등을 들 수 있다.
이들 첨가제는, 1종 단독으로, 혹은 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
세포의 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 사용하는 세포나 목적에 따라 임의 결정할 수 있다.
예를 들어, 이산화탄소 농도가 5% 정도이고, 온도가 20℃~37℃의 범위에서 일정하게 유지된, 가습된 항온기를 사용하여 세포를 배양할 수 있다.
본 발명에 사용하는 지환 구조 함유 중합체 성형체는, 지환 구조 함유 중합체를 임의의 형상으로 성형하여 이루어지는 것이다.
지환 구조 함유 중합체는, 주쇄 및/또는 측쇄에 지환 구조를 갖는 수지이며, 기계적 강도, 내열성 등의 관점에서, 주쇄에 지환 구조를 함유하는 것이 바람직하다.
지환 구조로는, 포화 고리형 탄화수소(시클로알칸) 구조, 불포화 고리형 탄화수소(시클로알켄) 구조 등을 들 수 있으나, 기계적 강도, 내열성 등의 관점에서, 시클로알칸 구조나 시클로알켄 구조가 바람직하고, 그 중에서도 시클로알칸 구조를 갖는 것이 가장 바람직하다.
지환 구조를 구성하는 탄소 원자수는, 특별한 제한은 없지만, 통상 4~30개, 바람직하게는 5~20개, 보다 바람직하게는 5~15개이다. 지환 구조를 구성하는 탄소 원자수가 이 범위 내일 때에, 기계적 강도, 내열성, 및 성형성의 특성이 고도로 밸런스되어 호적하다.
지환 구조 함유 중합체 중의 지환 구조를 갖는 반복 단위의 비율은, 사용 목적에 따라 임의 선택되면 되는데, 통상 30 중량% 이상, 바람직하게는 50 중량% 이상, 보다 바람직하게는 70 중량%이다. 지환 구조 함유 중합체 중의 지환 구조를 갖는 반복 단위의 비율이 과도하게 적으면 내열성이 떨어져 바람직하지 않다. 지환 구조 함유 중합체 중의 지환 구조를 갖는 반복 단위 이외의 잔부는, 특별한 한정은 없고, 사용 목적에 따라 임의 선택된다.
지환 구조 함유 중합체의 구체예로는, (1) 노르보르넨계 중합체, (2) 단환의 고리형 올레핀계 중합체, (3) 고리형 공액 디엔계 중합체, (4) 비닐 지환식 탄화수소계 중합체, 및 (1)~(4)의 수소화물 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 내열성, 기계적 강도 등의 관점에서, 노르보르넨계 중합체 및 그 수소화물이 바람직하다.
(1) 노르보르넨계 중합체
노르보르넨계 중합체는, 노르보르넨 골격을 갖는 단량체인 노르보르넨계 단량체를 중합하여 이루어지는 것이며, 개환 중합에 의해 얻어지는 것과, 부가 중합에 의해 얻어지는 것으로 대별된다.
개환 중합에 의해 얻어지는 것으로는, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 및 노르보르넨계 단량체와 이것과 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 개환 중합체, 그리고 이들의 수소화물 등을 들 수 있다. 부가 중합에 의해 얻어지는 것으로는, 노르보르넨계 단량체의 부가 중합체 및 노르보르넨계 단량체와 이것과 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 부가 중합체 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물이 내열성, 기계적 강도 등의 관점에서 바람직하다.
노르보르넨계 단량체로는, 비시클로[2.2.1]헵타-2-엔(관용명 노르보르넨), 5-메틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5,5-디메틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-에틸-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-에틸리덴-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-비닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-프로페닐비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-메톡시카르보닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-시아노비시클로[2.2.1]헵타-2-엔, 5-메틸-5-메톡시카르보닐-비시클로[2.2.1]헵타-2-엔 등의 2환식 단량체;
트리시클로[4.3.01,6.12,5]데카-3,7-디엔(관용명 디시클로펜타디엔), 2-메틸디시클로펜타디엔, 2,3-디메틸디시클로펜타디엔, 2,3-디하이드록시디시클로펜타디엔 등의 3환식 단량체;
테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센(테트라시클로도데센), 테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸리덴테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8,9-디메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸-9-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-에틸리덴-9-메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 8-메틸-8-카르복시메틸테트라시클로[4.4.0.12,5.17,10]-3-도데센, 7,8-벤조트리시클로[4.3.0.12,5]데카-3-엔(관용명 메타노테트라하이드로플루오렌: 1,4-메타노-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌이라고도 한다), 1,4-메타노-8-메틸-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌, 1,4-메타노-8-클로로-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌, 1,4-메타노-8-브로모-1,4,4a,9a-테트라하이드로플루오렌 등의 4환식 단량체; 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체와 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체로는, 시클로헥센, 시클로헵텐, 시클로옥텐, 1,4-시클로헥사디엔, 1,5-시클로옥타디엔, 1,5-시클로데카디엔, 1,5,9-시클로도데카트리엔, 1,5,9,13-시클로헥사데카테트라엔 등의 단환의 시클로올레핀계 단량체를 들 수 있다.
이들 단량체는, 치환기를 1종 또는 2종 이상 갖고 있어도 된다. 치환기로는, 알킬기, 알킬렌기, 아릴기, 실릴기, 알콕시카르보닐기, 알킬리덴기 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체와 부가 공중합 가능한 그 밖의 단량체로는, 에틸렌, 프로필렌, 1-부텐, 1-펜텐, 1-헥센 등의 탄소수 2~20의 α-올레핀계 단량체; 시클로부텐, 시클로펜텐, 시클로헥센, 시클로옥텐, 테트라시클로[9.2.1.02,10.03,8]테트라데카-3,5,7,12-테트라엔(3a,5,6,7a-테트라하이드로-4,7-메타노-1H-인덴이라고도 한다) 등의 시클로올레핀계 단량체; 1,4-헥사디엔, 4-메틸-1,4-헥사디엔, 5-메틸-1,4-헥사디엔, 1,7-옥타디엔 등의 비공액 디엔계 단량체; 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, α-올레핀계 단량체가 바람직하고, 에틸렌이 보다 바람직하다.
이들 단량체는, 치환기를 1종 또는 2종 이상 갖고 있어도 된다. 치환기로는, 알킬기, 알킬렌기, 아릴기, 실릴기, 알콕시카르보닐기, 알킬리덴기 등을 들 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 개환 중합체, 또는 노르보르넨계 단량체와 이것과 개환 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 개환 중합체는, 단량체 성분을, 공지의 개환 중합 촉매의 존재 하에서 중합하여 얻을 수 있다. 개환 중합 촉매로는, 예를 들어, 루테늄, 오스뮴 등의 금속의 할로겐화물과, 질산염 또는 아세틸아세톤 화합물, 및 환원제로 이루어지는 촉매, 혹은, 티탄, 지르코늄, 텅스텐, 몰리브덴 등의 금속의 할로겐화물 또는 아세틸아세톤 화합물과, 유기 알루미늄 화합물로 이루어지는 촉매를 사용할 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 개환 중합체 수소화물은, 통상, 상기 개환 중합체의 중합 용액에, 니켈, 팔라듐 등의 천이 금속을 포함하는 공지의 수소화 촉매를 첨가하고, 탄소-탄소 불포화 결합을 수소화함으로써 얻을 수 있다.
노르보르넨계 단량체의 부가 중합체, 또는 노르보르넨계 단량체와 이것과 공중합 가능한 그 밖의 단량체의 부가 중합체는, 단량체 성분을, 공지의 부가 중합 촉매의 존재 하에서 중합하여 얻을 수 있다. 부가 중합 촉매로는, 예를 들어, 티탄, 지르코늄 또는 바나듐 화합물과 유기 알루미늄 화합물로 이루어지는 촉매를 사용할 수 있다.
(2) 단환의 고리형 올레핀계 중합체
단환의 고리형 올레핀계 중합체로는, 예를 들어, 시클로헥센, 시클로헵텐, 시클로옥텐 등의, 단환의 고리형 올레핀계 단량체의 부가 중합체를 사용할 수 있다.
(3) 고리형 공액 디엔계 중합체
고리형 공액 디엔계 중합체로는, 예를 들어, 시클로펜타디엔, 시클로헥사디엔 등의 고리형 공액 디엔계 단량체를 1,2- 또는 1,4- 부가 중합한 중합체 및 그 수소화물 등을 사용할 수 있다.
(4) 비닐 지환식 탄화수소 중합체
비닐 지환식 탄화수소 중합체로는, 예를 들어, 비닐시클로헥센, 비닐시클로헥산 등의 비닐 지환식 탄화수소계 단량체의 중합체 및 그 수소화물; 스티렌, α-메틸스티렌 등의 비닐 방향족계 단량체의 중합체의 방향고리 부분의 수소화물; 등을 들 수 있다. 비닐 지환식 탄화수소 중합체는, 이들 단량체와 공중합 가능한 다른 단량체와의 공중합체여도 된다.
지환 구조 함유 중합체의 분자량에 특별한 제한은 없지만, 시클로헥산 용액(중합체가 용해되지 않는 경우에는 톨루엔 용액)의 겔·퍼미에이션·크로마토그래피로 측정한 폴리스티렌 환산의 중량 평균 분자량은, 통상 5,000 이상이고, 바람직하게는 5,000~500,000, 보다 바람직하게는 8,000~200,000, 특히 바람직하게는 10,000~100,000이다. 중량 평균 분자량이 이 범위 내일 때에, 기계적 강도와 성형 가공성이 고도로 밸런스되어 호적하다.
지환 구조 함유 중합체의 유리 전이 온도는, 사용 목적에 따라 임의 선택되면 되는데, 통상 50~300℃, 바람직하게는 100~280℃, 특히 바람직하게는 115~250℃, 더욱 바람직하게는 130~200℃이다. 유리 전이 온도가 이 범위 내일 때에, 내열성과 성형 가공성이 고도로 밸런스되어 호적하다.
본 발명에 있어서, 유리 전이 온도는 JIS K 7121에 기초하여 측정된 것이다.
이들 지환 구조 함유 중합체는 각각 단독으로, 혹은 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 지환 구조 함유 중합체에는, 열가소성 수지 재료에서 통상 사용되고 있는 배합제, 예를 들어, 연질 중합체, 산화 방지제, 자외선 흡수제, 광안정제, 근적외선 흡수제, 이형제, 염료나 안료 등의 착색제, 가소제, 대전 방지제, 형광 증백제 등의 배합제를, 통상 채용되는 양, 첨가할 수 있다.
또한, 지환 구조 함유 중합체에는, 연질 중합체 이외의 그 밖의 중합체(이하, 간단히 「그 밖의 중합체」라고 한다)를 혼합해도 된다. 지환 구조 함유 중합체에 혼합되는 그 밖의 중합체의 양은, 지환 구조 함유 중합체 100 중량부에 대하여, 통상 200 중량부 이하, 바람직하게는 150 중량부 이하, 보다 바람직하게는 100 중량부 이하이다.
지환 구조 함유 중합체에 대하여 배합하는 각종 배합제나 그 밖의 중합체의 비율이 지나치게 많으면, 세포의 분화 촉진성이 저하되기 때문에, 모두 지환 구조 함유 중합체의 성질을 손상하지 않는 범위에서 배합하는 것이 바람직하다.
배합제나 그 밖의 중합체와의 혼합 방법은, 폴리머 중에 배합제가 충분히 분산되는 방법이면, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 배합의 순서에 특별한 제한은 없다. 배합 방법으로는, 예를 들어, 믹서, 1축 혼련기, 2축 혼련기, 롤, 브라벤더, 압출기 등을 사용하여 수지를 용융 상태에서 혼련하는 방법, 적당한 용제에 용해하여 분산시킨 후, 응고법, 캐스트법, 또는 직접 건조법에 의해 용제를 제거하는 방법 등을 들 수 있다.
2축 혼련기를 사용하는 경우, 혼련 후에는, 통상은 용융 상태에서 봉상으로 압출하고, 스트랜드 커터로 적당한 길이로 잘라, 펠릿화하여 사용되는 경우가 많다.
지환 구조 함유 중합체의 성형 방법은, 세포와 접촉시킬 때에 사용하는 지환 구조 함유 중합체 성형체의 형상에 따라 임의로 선택할 수 있다. 성형 방법으로는, 예를 들어, 사출 성형법, 압출 성형법, 캐스트 성형법, 인플레이션 성형법, 블로우 성형법, 진공 성형법, 프레스 성형법, 압축 성형법, 회전 성형법, 캘린더 성형법, 압연 성형법, 절삭 성형법, 방사 등을 들 수 있고, 이들 성형법을 조합하거나, 성형 후 필요에 따라 연신 등의 후처리를 할 수도 있다.
이렇게 하여 얻어지는 성형체가, 본 발명의 배양 세포 분화 촉진제이다.
지환 구조 함유 중합체 성형체의 형상에 특별한 제한은 없고, 판상, 가루상, 입자상, 끈상, 시트상, 기타 어떠한 형상이어도 된다. 또한, 그 표면은 평평해도 되고, 요철 형상을 갖고 있어도 되며, 중공상의 성형체여도 된다. 또한 상이한 형상의 성형체를, 접착제 등을 개재하거나 또는 개재하지 않고 조합하여 별도의 성형체로 할 수도 있다.
또한, 세포와 접촉할 수 있는 한에 있어서, 디쉬, 플레이트, 백, 튜브, 스캐폴드, 컵, 자 퍼멘터 등의 배양 용기; 교반 날개, 교반자, 배플, 연결 튜브 등 배양 장치의 부품; 피펫, 교반 소자, 필터, 셀 스크레이퍼 등의 배양 조작에 사용하는 배양 기구; 등의 일부 또는 전부를 구성하는 부재여도 된다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양 중의 세포는, 그것이 접착형 세포여도 부유 세포여도, 배지 중에 부유 상태로 생존하는 경향이 있다. 따라서, 지환 구조 함유 중합체 성형체와 세포의 접촉 방법의 선택지는 넓다.
본 발명에 있어서는, 성형체를 배양 세포와 접촉시킴에 있어서, 성형체를 멸균 처리하는 것이 바람직하다. 멸균 처리의 방법에 특별한 제한은 없고, 고압 증기법이나 건열법 등의 가열법; γ선이나 전자선 등의 방사선을 조사하는 방사선법이나 고주파를 조사하는 조사법; 산화에틸렌 가스(EOG) 등의 가스를 접촉시키는 가스법; 멸균 필터를 사용하는 여과법; 등, 의료 분야에서 일반적으로 채용되는 방법에서, 성형체의 형상이나 사용하는 세포에 따라 선택할 수 있다.
또한, 이들 성형체 표면은, 플라즈마 처리, 코로나 방전 처리, 오존 처리, 자외선 조사 처리 등 배양 용기에 대하여 일반적으로 실시하는, 멸균 목적 이외의 처리를 행할 수도 있다.
배양 세포와 본 발명의 배양 세포 분화 촉진제인 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시키는 방법은, 배양 세포 분화 촉진제의 형상에 따라 임의의 방법을 채용하면 된다. 예를 들어, 세포 분화 촉진제인 지환 구조 함유 중합체 성형체를 혼합한 배지 중에서 세포를 배양하는 방법; 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 성형된 배양 용기 내에서 세포를 배양하는 방법; 지환 구조 함유 중합체를 사용하여 성형된 배양 기구를 사용하여 배양 조작을 행하는 방법; 등을 들 수 있고, 이들을 조합할 수도 있다.
한편, 세포에는, 정보 전달능이 있기 때문에, 배양 중의 모든 배양 세포가 지환 구조 함유 중합체 성형체에 접촉할 필요는 없고, 또한, 배양 기간 전체에 걸쳐 양자가 접촉하고 있을 필요도 없다. 단, 접촉에 의한 효과는 경시적으로 저하되기 때문에, 접촉 시간은 긴 편이 바람직하다.
배양 세포와, 지환 구조 함유 중합체 성형체의 접촉 온도는 세포가 증식할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않는다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〔제조예 1〕
지환 구조 함유 중합체〔노르보르넨계 중합체(닛폰 제온사 제조, 「제오넥스(등록상표) 790R」; 노르보르넨계 개환 중합체 수소화물)〕를 사용한 배양 기구로서, 저면 직경이 3 cm인 배양용 디쉬(이하, 「790R제 디쉬」라고 한다)를 이하의 방법에 의해 제작하였다.
먼저, 사출 성형법에 의해 디쉬를 성형한 후, EOG(에틸렌옥사이드 가스)를 사용한 가스법에 의해, 790R제 디쉬의 멸균 처리를 행하였다.
〔실시예 1〕
재팬·티슈·엔지니어링사 제조의 3차원 피부 재생 키트에 사용되고 있는 인간 표피 각화 세포(인간 표피 모델 제작용)를 1.25 × 104 cells/cm2의 세포 밀도로, 790R제 디쉬에 파종하여, CO2 인큐베이터 내에서 6일간 배양을 행하였다. 이하, 이 시료를 「790R제 디쉬 시료」라고 한다.
〔비교예 1〕
실시예 1에 있어서, 790R제 디쉬 대신에, 코닝사 제조의 세포 배양용 디쉬〔팔콘(등록상표)(모델 번호 353001)〕(이하, 「폴리스티렌제 디쉬」라고 한다)를 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여, 세포를 배양하였다. 이하, 이 시료를 「폴리스티렌제 디쉬 시료」라고 한다.
〔비교예 2〕
실시예 1, 비교예 1과 동시에, 분화 유도를 이하의 조건으로 실시하여 세포의 배양을 행하였다.
먼저, 표피 세포를 1.25 × 104 cells/cm2의 세포 밀도로, 폴리스티렌제 디쉬에 파종하여, CO2 인큐베이터 내에서, 상술한 배양 시료와 병행하여 배양을 개시하고, 배양 경과 1일째에, 칼슘제로서 염화칼슘을 첨가하고, 또 5일간 배양을 행하였다. 이 시료를 「칼슘 첨가 폴리스티렌제 디쉬 시료」라고 한다.
〔세포의 분화 상태의 평가〕
실시예 1, 비교예 1, 2에 있어서, 세포의 분화 상태를 평가하기 위하여, 세포 내에 발현되어 있는 분화 마커의 분석을 이하와 같이 행하였다. 분화 마커로는, 표피 세포의 종말 분화 상태의 세포인 각질 세포의 구성 단백질인 로리크린을 지표로 하였다.
배양 기간 경과 후에, 각 시료로부터 세포를 회수하여, 세포 내에 포함되는 로리크린 mRNA의 양을 이하와 같이 실시간(Real Time) PCR법에 의해 정량하였다. 내부 표준으로는, GAPDH의 mRNA를 사용하였다.
세포로부터의 RNA 추출은, Quick Gene RNA cultured cell kit S(쿠라보사 제조)를 사용하였다. RNA로부터 DNA로의 변환은, PrimerScript RTase(타카라 바이오사 제조)를 사용하는 역전사 반응에 의해 행하였다. 역전사 반응으로 조제한 DNA를 주형으로 한 실시간 PCR은, PCR-CFX96(BioRad사 제조) 시스템을 사용하여 행하였다.
배양 실험은 2회 반복하고, 로리크린 mRNA의 발현량의 평균값을 이용하여, 칼슘 첨가 폴리스티렌제 디쉬 시료(비교예 2)의 로리크린 mRNA량을 1.0으로 한 경우의, 790R제 디쉬 시료(실시예 1)의 로리크린 mRNA의 값과 폴리스티렌제 디쉬 시료(비교예 1)의 로리크린 mRNA의 값을 구하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00001
비교예 1과 2의 비교로부터, 칼슘제를 첨가함으로써 세포의 분화가 촉진되어, 로리크린 mRNA량이 대폭 증가하는 것을 알 수 있다.
한편, 790R제 디쉬 시료(실시예 1)에서는, 세포의 분화를 촉진하는 칼슘제가 첨가되어 있지 않으나, 그 로리크린 mRNA는, 칼슘제를 첨가한 스티렌제 디쉬 시료(비교예 2)의 로리크린 mRNA량과 동량 이상이 되는 점에서, 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시킴으로써, 배양 세포의 분화가 촉진되는 것을 알 수 있다.
〔실시예 2〕
칼슘제 존재 하에서 세포를 배양하는 경우에 있어서의, 본 발명의 배양 기구(배양 세포 분화 촉진제)의 효과를 평가하기 위하여, 배양 개시 1일째에 배지에 칼슘제를 첨가한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 세포를 배양하고, 분화 마커의 로리크린의 mRNA의 발현량을 정량하였다.
그 결과, 칼슘 첨가 폴리스티렌제 디쉬 시료(비교예 2)의 로리크린 mRNA량을 1.0으로 한 경우의, 칼슘 첨가 790R제 디쉬 시료(실시예 2)의 로리크린 mRNA량은 2.379로, 실시예 2에 있어서, 로리크린 mRNA량이 비약적으로 증가하고 있는 것을 알 수 있었다.
이들 결과로부터, 세포가 지환 구조 함유 중합체 성형체에 접촉함으로써, 분화되기 위하여 필요한 세포 내 성분을, 종래의 방법보다 많이 분비시킬 수 있기 때문에, 분화 유도 조작에 필요한 시간을 단축할 수 있는 것을 기대할 수 있다.
또한, 로리크린은, 각질층의 주요한 구성 요소로서, 각질 세포와 지질의 다층 구조를 유지하는 역할을 담당한다. 로리크린이 충분히 발현되면, 표피는 보다 매끄럽게 되는 것이 기대된다.
〔제조예 2~11〕
제조예 1에 있어서, 제오넥스(등록상표) 790R 대신에, 미츠이 화학사 제조 「아펠(등록상표) APL6013T」(노르보르넨계 중합체), 폴리플라스틱스사 제조 「토파스(등록상표) 6013」(노르보르넨계 중합체), JSR사 제조 「아톤(등록상표) D4540」(노르보르넨계 중합체), 폴리카보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 및 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET)를 사용한 것 이외에는, 제조예 1과 동일하게 하여 저면 직경이 3 cm인 배양용 디쉬를 제작하였다. 얻어진 디쉬를, 각각 「아펠제 디쉬」, 「토파스제 디쉬」, 「아톤제 디쉬」, 「폴리카보네이트제 디쉬」, 「PMMA제 디쉬」, 「폴리스티렌제 디쉬」, 「폴리에틸렌제 디쉬」, 「폴리프로필렌제 디쉬」, 「PET제 디쉬」라고 한다.
또한, 제오넥스(등록상표) 790R제의 디쉬에 플라즈마 처리를 실시하여, 플라즈마 표면 처리 완료 790R제 디쉬를 제작하였다.
〔실시예 3〕
790R제 디쉬에, 인간 표피 각화 세포(인간 표피 모델 제작용)를, 세포 밀도 1.25 × 104 cells/cm2로 파종하고(시료 반복 N = 1), 37℃에서 6일간, 5% CO2 분위기에서 배양을 행하였다.
〔실시예 4~7〕
실시예 3에 있어서, 790R제 디쉬 대신에, 각각 플라즈마 표면 처리 완료 790R제 디쉬, 아펠제 디쉬, 토파스제 디쉬, 아톤제 디쉬를 사용한 것 이외에는, 실시예 3과 동일하게 하여 세포 배양을 행하였다.
〔비교예 3~9〕
실시예 3에 있어서, 790R제 디쉬 대신에, 각각 벡턴 디킨슨사 제조 디쉬 〔FALCON(등록상표), 폴리스티렌제 디쉬, 플라즈마 처리품〕, 폴리카보네이트제 디쉬, PMMA제 디쉬, 폴리스티렌제 디쉬, 폴리에틸렌제 디쉬, 폴리프로필렌제 디쉬, PET제 디쉬를 사용한 것 이외에는, 실시예 3과 동일하게 하여 세포 배양을 행하였다.
실시예 3~7, 비교예 3~9에 있어서, 실시예 1과 동일한 방법에 의해, 세포로부터의 RNA 추출, RNA로부터 DNA로의 변환, mRNA의 발현의 분석을 행하였다.
한편, 정량 대상의 유전자는 로리크린 유전자로 하고, 내부 표준의 유전자로는 GAPDH 유전자를 사용하여, 로리크린 유전자의 증폭 신호를, GAPDH 유전자의 증폭 신호로 나눔으로써 표준화하였다.
비교예 3의 FALCON(등록상표) 디쉬에서 배양한 세포 시료에서의 로리크린 유전자의 발현량을 1로 하였을 때의, 각 예에 있어서의 로리크린 유전자의 발현량을 도 1에 나타낸다.
이 결과로부터, 제오넥스(등록상표) 790R 이외의 지환 구조 함유 중합체로 만들어진 디쉬에서도, FALCON(등록상표) 디쉬에 비하여 약 6배의 로리크린 유전자가 발현되어 있는 한편, 지환 구조 함유 중합체 이외의 재료로부터 얻어진 디쉬에서의 발현량은 FALCON(등록상표) 디쉬에 비하여 겨우 2배 내지 3배로, 지환 구조 함유 중합체는 각화 세포의 분화 유도를 촉진하는 효과가 있는 것을 알 수 있다.
각화 세포로의 분화 유도를 행하는 배양 조건에서의 각화 세포에 있어서의 분화 유도 유전자의 발현 상태의 차이를 평가하기 위하여, 실시예 3~7, 비교예 3~9에서 배양한 세포를 사용하여, 각화 세포로의 분화를 진척시키는 유전자인 GATA3의 발현의 차이를 비교하였다.
정량 대상의 유전자는, GATA3 유전자로 하고, 내부 표준의 유전자로는 GAPDH 유전자를 사용하여, GATA3 유전자의 증폭 신호를, GAPDH 유전자의 증폭 신호로 나눔으로써 표준화하였다.
비교예 3의 FALCON(등록상표) 디쉬에서 배양한 세포 시료에서의 GATA3 유전자의 발현량을 1로 하였을 때의, 각 예에 있어서의 GATA 유전자의 발현량을 도 2에 나타낸다.
이 결과로부터, 폴리카보네이트제 디쉬, PMMA제 디쉬, 및 폴리프로필렌제 디쉬를 사용한 경우의 발현량은 FALCON(등록상표) 디쉬의 것과 동등하고, 폴리스티렌제 디쉬, 폴리에틸렌제 디쉬, 및 PET제 디쉬를 사용한 경우의 발현량은 FALCON(등록상표) 디쉬보다 적어, 분화 유도가 억제되어 있는 것을 알 수 있다.
한편, 지환 구조 함유 중합체로 만들어진 디쉬에서는, FALCON(등록상표) 디쉬에 비하여, 1.3~1.5배의 GATA3 유전자가 발현되어 있다.
790제 디쉬에 대해서는, 플라즈마 표면 처리의 유무에 상관 없이, FALCON(등록상표) 디쉬와 비교하여 1.3배 이상의 GATA3 유전자가 증가하고 있는 점에서, 지환 구조 함유 중합체는 각화 세포의 분화 유도를 촉진하는 효과가 있는 것을 알 수 있다.

Claims (3)

  1. 배양되어 있는 세포에, 지환 구조 함유 중합체 성형체를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 배양 세포의 분화 촉진 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    배양되어 있는 세포가 표피 세포인 배양 세포의 분화 촉진 방법.
  3. 지환 구조 함유 중합체 성형체로 이루어지는 배양 세포 분화 촉진제.
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