TWI669397B - 培養細胞的分化促進方法及培養細胞分化促進劑 - Google Patents

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Abstract

本發明係能促進培養細胞之分化的方法、及此方法適合使用的培養細胞分化促進劑。係使培養的細胞和含脂環結構之聚合物成形體接觸以誘導細胞的分化。

Description

培養細胞的分化促進方法及培養細胞分化促進劑
本發明係關於培養細胞之分化促進方法、及培養細胞分化促進劑。
近年來，利用ES細胞、iPS細胞等萬能細胞、幹細胞之再生醫療受人重視。萬能細胞、幹細胞等是指未進行分化之未分化狀態的細胞。在再生醫療，係使該等未分化狀態之細胞分化成目的之臟器、組織、細胞，並使用獲得之臟器、組織、細胞進行患者之治療。例如，已實現使用從患者皮膚表皮組織收集的幹細胞進行皮膚之再生醫療、美容等行為。
皮膚的表皮從真皮側向皮膚表面側之方向具有基底細胞、鱗狀細胞、顆粒細胞、及角質細胞，基底細胞邊分化為鱗狀細胞、顆粒細胞、角質細胞邊向上層移動，最終成為污垢而剝落。
於皮膚之再生醫療，係從受試者皮膚最表面的表皮組織收集基底細胞、鱗狀細胞等，將該等細胞於培養容器內培養並使其增殖成層狀，於此狀態，施以如下的分化誘導處理：使最外側層的細胞分化為顆粒細胞，然後分化為角質細胞。然後，利用此分化誘導處理，將已按基底細胞、鱗狀細胞、顆粒細胞、角質細胞的順序增殖成層狀的細胞群(培養表皮)移 植到受試者的皮膚。
上述分化誘導操作中，培養容器一般廣泛使用已施行親水化處理的聚苯乙烯製的培養皿、燒瓶等。
在構成表皮的細胞當中，已知基底細胞、鱗狀細胞等於鈣濃度增加的環境會分化為顆粒細胞、角質細胞。
又，顆粒細胞在分化為角質細胞的中途，會生合成角蛋白、退化素(involucrin)、兜甲蛋白(loricrin)等構成角質細胞的蛋白質。因此當製作培養表皮時，該等蛋白質在培養細胞中生合成係為重要。又，該等蛋白質在培養細胞內生合成的現象可利用檢測對應於各蛋白質的mRNA以了解。
如上述，皮膚之再生醫療技術雖有進步，但以往的培養表皮的製作方法不僅麻煩，也耗費時間，會有培養表皮來不及用在移植手術、因應培養表皮之製作所費程序、時間等成比例而發生高額費用的問題。
因此希望有能更促進培養細胞分化的方法。
作為促進分化為角質細胞之方法已知有使用乳酸菌之乳發酵物的方法。專利文獻1中揭示，藉由將使用乳酸菌Lactobacillus helveticus獲得之乳發酵物添加到人正常表皮細胞的培養基，為表皮細胞之分化標記的角蛋白的mRNA增加。又，顯示藉由經口攝取此乳發酵物，皮膚表皮之角質化受到促進。
但是由於此乳發酵物含有乳酸菌，故實際上不能使此乳發酵物混入到培養再生醫療用細胞時使用之培養基。
又，已知有使用櫻桃萃取物促進表皮細胞之分化 的方法。專利文獻2中揭示，藉由對於表皮細胞給予櫻桃萃取物，於分化過程為重要之成分的角蛋白10與絲聚蛋白原(profilaggrin)之mRNA產生會亢進。但是角蛋白10與絲聚蛋白原係在表皮細胞之分化過程之初期至中期時於鱗狀細胞內合成的，櫻桃萃取物並不會促進分化為角質細胞。又，專利文獻2記載的技術係以化粧品等外用劑作為目的，難以直接將此知識應用在再生醫療用之表皮細胞之分化的促進。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際專利WO2006/137513號(US2010/0166877)
[專利文獻2]日本特開第2012-167048號公報
本發明有鑑於該習知技術之實際情況，課題為提供能更促進培養細胞之分化的方法、及培養細胞分化促進劑。
本案發明人等為了解決上述課題而努力研究，結果發現，若將分化之對象細胞以和含脂環結構之聚合物接觸的狀態培養，則為分化標記的mRNA會增加，乃完成本發明。
從而依照本發明，提供下列(1)~(2)之培養細胞之分化促進方法、及(3)之培養細胞分化促進劑。
(1)一種培養細胞之分化促進方法，其特徵為：使培養的細胞 和含脂環結構之聚合物成形體接觸。
(2)如(1)中記載之培養細胞之分化促進方法，其中，該培養的細胞為表皮細胞。
(3)一種培養細胞分化促進劑，係由含脂環結構之聚合物成形體構成。
依照本發明，提供能促進培養細胞之分化的方法、及適合使用在此方法之培養細胞分化促進劑。
第1圖係顯示之圖表。
第2圖係顯示GATA3表現量之圖表。
本發明使用之細胞只要是能分化的細胞即可，無特殊限制。能分化的細胞可列舉萬能細胞；間葉系幹細胞等各種幹細胞；各種前驅細胞；從外胚層、中胚層或內胚層分化且不是最終分化狀態的細胞；等。作為如此的能分化的細胞，可列舉用以皮膚之表皮再生之表皮細胞為理想例。表皮細胞可為接觸真皮之表皮的基底細胞、位於基底之皮膚表面側的鱗狀細胞、位於鱗狀細胞之皮膚表面側的顆粒細胞中之任一者。表皮細胞係為從成為皮膚治療之對象的患者收集者較佳。
培養細胞時通常使用液體培養基。
液體培養基通常使用有pH緩衝作用，且滲透壓適合細胞，包括細胞的營養成分且對於細胞沒有毒性者。
作為顯示pH緩衝作用的成分，可以列舉三(羥甲基)胺基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、各種磷酸鹽、各種碳酸鹽等。
液體培養基之滲透壓調整，通常係使用已調整了鉀離子、鈉離子、鈣離子、葡萄糖等之濃度的水溶液，使和細胞之滲透壓大致相同。該水溶液具體而言可以列舉磷酸緩衝生理食鹽水、三(羥甲基)胺基甲烷緩衝生理食鹽水、HEPES緩衝生理食鹽水等生理食鹽水；乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、重碳酸林格氏液等林格氏液；等。
作為細胞的營養成分可列舉胺基酸、核酸、維生素類、礦物質類等。
作為液體培養基可以利用RPMI-1640、HAM、α-MEM、DMEM、EMEM、F-12、F-10、M-199等各種市售品。
液體培養基中也可以摻合添加劑。作為添加劑可以列舉蛋白質等誘導因子、有分化誘導活性之低分子化合物、礦物質、金屬、維生素成分等。該等之中，宜摻合用以分化誘導之添加劑較佳。
作為用以分化誘導之添加劑，可以列舉，作用於細胞表面之受體的配體、致效劑、拮抗劑；核內受體之配體、致效劑、拮抗劑；膠原蛋白、纖網蛋白(fibronectin)等細胞外基質；細胞外基質之一部分或模擬的化合物；作用於涉及細胞內之資訊傳遞路徑的蛋白質的成分；作用於細胞內之1次代謝或2次代謝之酵素的成分；對細胞內之核內或粒線體內之基因表現給予影響的成分；能和病毒載體等組合而導入到細胞內的DNA、RNA；等。
該等添加劑可單獨使用一種或組合使用二種以上。
細胞的培養條件不特別限定，可因應使用的細胞、目的等適當決定。
例如可使用固定維持二氧化碳濃度為約5%、溫度為20℃~37℃之範圍內並加濕的恆溫器進行細胞培養。
本發明使用之含脂環結構之聚合物成形體係將含脂環結構之聚合物成形為任意形狀而成者。
含脂環結構之聚合物是於主鏈及/或側鏈具脂環結構之樹脂，考量機械強度、耐熱性等觀點，宜為主鏈含有脂環結構者較佳。
脂環結構可以列舉飽和環狀烴(環烷)結構、不飽和環狀烴(環烯)結構等，考量機械強度、耐熱性等觀點，宜為環烷結構、環烯結構等，其中，有環烷結構者最理想。
構成脂環結構之碳原子數無特殊限制，通常為4~30個，較佳為5~20個，更佳為5~15個。當構成脂環結構之碳原子數為此範圍內時，機械強度、耐熱性、及成形性之特性能高度地取得均衡性，為較理想。
含脂環結構之聚合物中之具脂環結構之重複單元之比例可因應使用目的適當選擇，通常為30重量%以上，較佳為50重量%以上，更佳為70重量%。含脂環結構之聚合物中之具脂環結構之重複單元之比例若過少，則耐熱性差，不理想。含脂環結構之聚合物中之具脂環結構之重複單元以外的其餘部分無特殊限定，可以因應使用目的適當選擇。
含脂環結構之聚合物，就具體例可列舉(1)降冰片 烯(norbornene)系聚合物、(2)單環之環狀烯烴系聚合物、(3)環狀共軛二烯系聚合物、(4)乙烯基脂環族烴系聚合物、及(1)~(4)之氫化物等。該等之中，考量耐熱性、機械強度等觀點，降冰片烯系聚合物及其氫化物為較佳。
(1)降冰片烯系聚合物
降冰片烯系聚合物係將具有降冰片烯骨架之單體即降冰片烯系單體聚合而成者，可大致分成，利用開環聚合而得者，以及利用加成聚合而得者。
作為利用開環聚合而得者，可以列舉，降冰片烯系單體之開環聚合物及降冰片烯系單體和能與其進行開環共聚合之其他單體的開環聚合物、及該等之氫化物等。作為利用加成聚合而得者，可以列舉，降冰片烯系單體之加成聚合物及降冰片烯系單體和能與其進行共聚合之其他單體的加成聚合物等。該等之中，考量耐熱性、機械強度等觀點，降冰片烯系單體之開環聚合物氫化物較理想。
降冰片烯系單體可以列舉雙環[2.2.1]庚-2-烯(慣用名降冰片烯)、5-甲基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5,5-二甲基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-乙基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-亞乙基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-乙烯基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-丙烯基雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-甲氧基羰基-雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-氰基雙環[2.2.1]庚-2-烯、5-甲基-5-甲氧基羰基-雙環[2.2.1]庚-2-烯等2環族單體；三環[4.3.01,6.12,5]癸-3,7-二烯(慣用名二環戊二烯)、2-甲基二環戊二烯、2,3-二甲基二環戊二烯、2,3-二羥基二環戊二烯等3 環族單體；四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯(四環十二烯)、四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯、8-甲基四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯、8-乙基四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯、8-亞乙基四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯、8,9-二甲基四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯、8-乙基-9-甲基四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯、8-亞乙基-9-甲基四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯、8-甲基-8-羧基甲基四環[4.4.0.12,5.17,10]-3-十二烯、7,8-苯并三環[4.3.0.12,5]癸-3-烯(慣用名甲橋四氫茀：也稱為1,4-甲橋-1,4,4a,9a-四氫茀)、1,4-甲橋-8-甲基-1,4,4a,9a-四氫茀、1,4-甲橋-8-氯-1,4,4a,9a-四氫茀、1,4-甲橋-8-溴-1,4,4a,9a-四氫茀等4環族單體；等。
作為能和降冰片烯系單體進行開環共聚合之其他單體，可列舉環己烯、環庚烯、環辛烯、1,4-環己二烯、1,5-環辛二烯、1,5-環癸二烯、1,5,9-環十二碳三烯、1,5,9,13-環十六碳四烯等單環之環烯烴系單體。
該等單體也可有1種或2種以上取代基。作為取代基可列舉烷基、伸烷基、芳基、矽烷基、烷氧基羰基、亞烷基等。
作為能和降冰片烯系單體進行加成共聚合之其他單體，可以列舉乙烯、丙烯、1-丁烯、1-戊烯、1-己烯等碳數2~20之α-烯烴系單體；環丁烯、環戊烯、環己烯、環辛烯、四環[9.2.1.02,10.03,8]十四碳-3,5,7,12-四烯(也稱為3a,5,6,7a-四氫-4,7-甲橋-1H-茚)等環烯烴系單體；1,4-己二烯、4-甲基-1,4-己二烯、5-甲基-1,4-己二烯、1,7-辛二烯等非共軛二烯系 單體；等。
該等之中，α-烯烴系單體較理想，乙烯更理想。
該等單體也可以有1種或2種以上取代基。作為取代基可列舉烷基、伸烷基、芳基、矽烷基、烷氧基羰基、亞烷基等。
降冰片烯系單體之開環聚合物、或降冰片烯系單體與能和其進行開環共聚合之其他單體之開環聚合物，可利用使單體成分於公知之開環聚合觸媒之存在下聚合而得。作為開環聚合觸媒，可使用例如，由釕、鋨等金屬之鹵化物、硝酸鹽或乙醯基丙酮化合物、與還原劑構成之觸媒，或由鈦、鋯、鎢、鉬等金屬之鹵化物或乙醯基丙酮化合物、與有機鋁化合物構成的觸媒。
降冰片烯系單體之開環聚合物氫化物，通常可藉由在上述開環聚合物之聚合溶液添加包括鎳、鈀等過渡金屬之公知之氫化觸媒，並將碳-碳不飽和鍵予以氫化而得。
降冰片烯系單體之加成聚合物、或降冰片烯系單體和能與其進行共聚合之其他單體之加成聚合物，可藉由使單體成分於公知之加成聚合觸媒之存在下聚合而得。加成聚合觸媒可使用例如由鈦、鋯或釩化合物與有機鋁化合物構成的觸媒。
(2)單環之環狀烯烴系聚合物
作為單環之環狀烯烴系聚合物，可使用例如，環己烯、環庚烯、環辛烯等單環之環狀烯烴系單體之加成聚合物。
(3)環狀共軛二烯系聚合物
作為環狀共軛二烯系聚合物，例如可使用將環戊二烯、環 己二烯等環狀共軛二烯系單體進行1,2-或1,4-加成聚合而得之聚合物及其氫化物等。
(4)乙烯基脂環族烴聚合物
作為乙烯基脂環族烴聚合物，可列舉例如，乙烯基環己烯、乙烯基環己烷等乙烯基脂環族烴系單體之聚合物及其氫化物；苯乙烯、α-甲基苯乙烯等乙烯基芳香族系單體之聚合物之芳香環部分之氫化物；等。乙烯基脂環族烴聚合物也可為和能與該等單體共聚合之其他單體之共聚物。
含脂環結構之聚合物之分子量無特殊限制，以環己烷溶液(聚合物不溶解時，則採用甲苯溶液)之凝膠滲透層析測得之以聚苯乙烯換算之重量平均分子量通常為5,000以上，較佳為5,000~500,000，更佳為8,000~200,000，尤佳為10,000~100,000。重量平均分子量若為此範圍內，則機械強度與成形加工性達成高度的均衡性，為較理想。
含脂環結構之聚合物之玻璃轉移溫度可因應使用目的適當選擇，通常為50~300℃，較佳為100~280℃，尤佳為115~250℃，又更佳為130~200℃。玻璃轉移溫度為此範圍內時，耐熱性與成形加工性達成高度的均衡性，為較理想。
本發明中，玻璃轉移溫度係依據JIS K 7121進行測定。
該等含脂環結構之聚合物可以分別單獨使用，或組合使用2種以上。
又，在含脂環結構之聚合物中也可以通常採用的量添加熱塑性樹脂材料通常使用的摻合劑、例如，軟質聚合物、抗氧化劑、紫外線吸收劑、光安定劑、近紅外線吸收劑、脫模劑、染 料、顏料等著色劑、塑化劑、抗靜電劑、螢光增白劑等摻合劑。
又，在含脂環結構之聚合物中也可以混合軟質聚合物以外的其他聚合物(以下簡稱為「其他聚合物」)。在含脂環結構之聚合物混合的其他聚合物的量，相對於含脂環結構之聚合物100重量份通常為200重量份以下，較佳為150重量份以下，更佳為100重量份以下。
對於含脂環結構之聚合物摻合之各種摻合劑、其他聚合物之比例若過多，則細胞之分化促進性降低，所以皆宜於無損含脂環結構之聚合物之性質的範圍內摻合較佳。
和摻合劑、其他聚合物混合的方法，只要是能將摻合劑充分分散在聚合物之方法即可，無特殊限定。又，摻合順序無特殊限制。摻合方法，可列舉例如，使用混合機、單軸混練機、雙軸混練機、輥、塑譜儀(brabender)、擠壓機等將樹脂於熔融狀態混練之方法、溶於適當溶劑使其分散後再利用凝固法、鑄塑法、或直接乾燥法去除溶劑之方法等。
使用雙軸混練機時，常於混練後，通常以熔融狀態擠製成棒狀，並以股線裁切器切成適當長度並造粒後使用。
含脂環結構之聚合物之成形方法，可因應和細胞接觸時使用之含脂環結構之聚合物成形體之形狀而任意選擇。成形方法，例如，射出成形法、擠壓成形法、鑄塑成形法、膨發成形法、吹塑成形法、真空成形法、壓製成形法、壓縮成形法、旋轉成形法、壓延成形法、壓延成形法、切削成形法、紡紗等，也可組合該等成形法、或於成形後視需要實施延伸等後處理。
如此獲得之成形體係本發明之培養細胞分化促進劑。
含脂環結構之聚合物成形體之形狀無特殊限制，可以為板狀、粉狀、粒狀、帶狀、片狀、其他各種形狀。又，其表面可為平坦也可以有凹凸形狀，也可以為中空狀之成形體。又，也可以將不同形狀的成形體介由或不介由黏著劑等組合成為其他的成形體。
又，只是要能和細胞接觸，可以為構成培養皿、板、袋、管、支架、杯、缸式發酵槽等培養容器；攪拌葉、攪拌子、擋板、連結管等培養裝置的零件；移液管、攪拌元件、濾器、細胞刮棒等培養操作使用之培養器具；等的一部分或全部的構件。
本發明之方法中，培養中之細胞不論是黏著型細胞還是浮游細胞均有在培養基中以浮游狀態生存的傾向。因此含脂環結構之聚合物成形體與細胞之接觸方法的選項廣。
本發明中，當使成形體和培養細胞接觸時，宜將成形體進行滅菌處理較佳。滅菌處理之方法無特殊限制，可以因應成形體之形狀、使用之細胞從高壓蒸氣法、乾熱法等加熱法；照射γ射線、電子束等放射線之放射線法、照射高頻波之照射法等；使和環氧乙烷氣體(EOG)等氣體接觸之氣體法；使用滅菌濾器之過濾法；等在醫療領域一般採用的方法中選擇。
又，該等成形體表面也可實施電漿處理、電暈放電處理、臭氧處理、紫外線照射處理等對於培養容器一般實施之滅菌目的以外之處理。
使培養細胞和為本發明之培養細胞分化促進劑之 含脂環結構之聚合物成形體接觸之方法，可以因應培養細胞分化促進劑之形狀而採用任意方法。例如，在已混合為細胞分化促進劑之含脂環結構之聚合物成形體之培養基中培養細胞之方法；在使用含脂環結構之聚合物成形之培養容器內培養細胞之方法；採用使用含脂環結構之聚合物成形之培養器具進行培養操作之方法；等，也可組合此等方法。
又，細胞有資訊傳達能力，所以不須使培養中的全部培養細胞接觸含脂環結構之聚合物成形體，而且無須在培養的整個期間使兩者接觸。惟接觸的效果會隨時間降低，所以接觸時間宜長為較佳。
培養細胞與含脂環結構之聚合物成形體之接觸溫度只要是細胞能增殖之溫度即可，無特殊限制。
【實施例】
以下舉實施例對於本發明具體說明，但是本發明不限定於該等實施例。
[製造例1]
依以下方法製作底面直徑3cm之培養用培養皿(以下稱為「790R製培養皿」)，以作為使用含脂環結構之聚合物[降冰片烯系聚合物(日本Zeon公司製，「Zeonex(註冊商標)790R」；降冰片烯系開環聚合物氫化物)]之培養器具。
首先，利用射出成形法將培養皿成形後，依使用EOG(環氧乙烷氣體)之氣體法進行790R製培養皿之滅菌處理。
[實施例1]
將Japan Tissue engineering公司製之3維皮膚再生套組使 用的人表皮角化細胞(人表皮模型製作用)以1.25×104細胞/cm2的細胞密度接種在790R製培養皿，於CO2培養箱內培養6日。以下將此試樣稱為「790R製培養皿試樣」。
[比較例1]
實施例1中，將790R製培養皿換成使用康寧公司製之細胞培養用培養皿[Falcon(註冊商標)(型號353001])(以下稱為「聚苯乙烯製培養皿」)，除此以外和實施例1同樣實施，培養細胞。以下將此試樣稱為「聚苯乙烯製培養皿試樣」。
[比較例2]
和實施例1、比較例1同時以下列條件施行分化誘導並進行細胞培養。
首先將表皮細胞以1.25×104細胞/cm2的細胞密度接種在聚苯乙烯製培養皿，於CO2培養箱內和上述培養試樣並行開始培養，於培養經過第1天，添加氯化鈣作為鈣劑，再培養5日。將此試樣稱為「鈣添加聚苯乙烯製培養皿試樣」。
[細胞之分化狀態之評價]
為了評價在實施例1、比較例1、2中之細胞之分化狀態，依以下方式實施細胞內表現之分化標記之分析。分化標記係將表皮細胞之最終分化狀態之細胞角質細胞之構成蛋白質即兜甲蛋白作為指標。
於培養期間經過後從各試樣將細胞回收，利用以下方式利用Real Time PCR法定量細胞內含有的兜甲蛋白mRNA的量。內部標準使用GAPDH之mRNA。
來自細胞之RNA之萃取使用Quick Gene RNA cultured cell kit S(Kurabo公司製)。從RNA變換為DNA係利用使用PrimerScript RTase(Takarabio製)之反轉錄反應進行。使用在反轉錄反應製備的DNA作為模板的Real Time PCR為PCR-CFX96(BioRad公司製)系統進行。
重複2次培養實驗，使用兜甲蛋白mRNA之表現量之平均值，求出當令鈣添加聚苯乙烯製培養皿試樣(比較例2)之兜甲蛋白mRNA量為1.0時之790R製培養皿試樣(實施例1)之兜甲蛋白mRNA之值與聚苯乙烯製培養皿試樣(比較例1)之兜甲蛋白mRNA之值。結果示於表1。
從比較例1與2之比較可知，藉由添加鈣劑會促進細胞之分化，兜甲蛋白mRNA量大幅增加。
另一方面，790R製培養皿試樣(實施例1)中未添加促進細胞分化之鈣劑，但其兜甲蛋白mRNA和添加了鈣劑的苯乙烯製培養皿試樣(比較例2)的兜甲蛋白mRNA量成為同量以上，由此可知藉由和含脂環結構之聚合物成形體接觸會促進培養細胞之分化。
[實施例2]
為了評價當於鈣劑存在下培養細胞時之本發明之培養器 具(培養細胞分化促進劑)之效果，從培養開始第1日於培養基中添加鈣劑，除此以外和實施例1同樣培養細胞並定量為分化標記之兜甲蛋白之mRNA之表現量。
其結果，當令鈣添加聚苯乙烯製培養皿試樣(比較例2)之兜甲蛋白mRNA量為1.0時，鈣添加790R製培養皿試樣(實施例2)之兜甲蛋白mRNA量為2.379，可知實施例2中的兜甲蛋白mRNA量有大幅增加。
由該等結果可知，細胞藉由和含脂環結構之聚合物成形體接觸，能分泌比習知方法更多的對於分化為必要的細胞內成分，所以能期待縮短分化誘導操作須費的時間。
又，兜甲蛋白為角質層之主要構成要素，擔任維持角質細胞與脂質之多層結構的作用。兜甲蛋白若充分表現，能期待表皮更細緻。
[製造例2~11]
將製造例1中之Zeonex(註冊商標)790R換成三井化學公司製「Apel(註冊商標)APL6013T」(降冰片烯系聚合物)、Polyplastics公司製「Topas(註冊商標)6013」(降冰片烯系聚合物)、JSR公司製「Arton(註冊商標)D4540」(降冰片烯系聚合物)、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、及聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)，除此以外和製造例1同樣製作底面直徑3cm之培養用培養皿。將獲得之培養皿分別稱為「Apel製培養皿」、「Topas製培養皿」、「Arton製培養皿」、「聚碳酸酯製培養皿」、「PMMA製培養皿」、「聚苯乙烯製培養皿」、「聚乙烯製培養皿」、「聚丙烯製培養皿」、「PET 製培養皿」。
又，對於Zeonex(註冊商標)790R製之培養皿施以電漿處理，製成經電漿表面處理的790R製培養皿。
[實施例3]
於790R製培養皿以細胞密度1.25×104細胞/cm2接種人表皮角化細胞(人表皮模型製作用)(試樣重複N=1)，於37℃於5%CO2氣體環境培養6日。
[實施例4~7]
將實施例3中的790R製培養皿分別換成經電漿表面處理的790R製培養皿、Apel製培養皿、Topas製培養皿、Arton製培養皿，除此以外和實施例3同樣實施細胞培養。
[比較例3~9]
將實施例3中的790R製培養皿分別換成Becton Dickinson公司製培養皿[FALCON(註冊商標)、聚苯乙烯製培養皿、電漿處理品]、聚碳酸酯製培養皿、PMMA製培養皿、聚苯乙烯製培養皿、聚乙烯製培養皿、聚丙烯製培養皿、PET製培養皿，除此以外和實施例3同樣實施細胞培養。
依和實施例1同樣的方法，在實施例3~7、比較例3~9實施從細胞進行RNA萃取、RNA變換為DNA、mRNA之表現之分析的操作。
又，定量對象之基因使用兜甲蛋白基因，內部標準之基因使用GAPDH基因，並將兜甲蛋白基因之放大信號除以GAPDH基因之放大信號以進行標準化。
令比較例3之以FALCON(註冊商標)培養皿培養之細胞試 樣中的兜甲蛋白基因的表現量為1時，各例之兜甲蛋白基因之表現量如第1圖所示。
從此結果可知，Neonex(註冊商標)790R以外之含脂環結構之聚合物製之培養皿，比起FALCON(註冊商標)培養皿有約6倍之兜甲蛋白基因表現，另一方面在由含脂環結構之聚合物以外之材料獲得之培養皿中的表現量，比起在FALCON(註冊商標)培養皿中的表現量，頂多是2倍至3倍，可知含脂環結構之聚合物有促進角化細胞之分化誘導之效果。
為了評價在誘導分化為角化細胞之培養條件下，角化細胞中之分化誘導基因之表現狀態之差異，使用實施例3~7、比較例3~9培養之細胞來比較促進向角化細胞分化之基因GATA3之表現之差異。
定量對象之基因使用GATA3基因，內部標準之基因使用GAPDH基因，並將GATA3基因之放大信號除以GAPDH基因之放大信號以進行標準化。
令比較例3之以FALCON(註冊商標)培養皿培養的細胞試樣中的GATA3基因的表現量為1時，各例之GATA基因之表現量示於第2圖。
由此結果，使用聚碳酸酯製培養皿、PMMA製培養皿、及聚丙烯製培養皿時的表現量和FALCON(註冊商標)培養皿為同等，使用聚苯乙烯製培養皿、聚乙烯製培養皿、及PET製培養皿時之表現量比FALCON(註冊商標)培養皿還少，可知分化誘導受抑制。
另一方面，在含脂環結構之聚合物製之培養皿中，比起在 FALCON(註冊商標)培養皿有1.3~1.5倍之GATA3基因表現。
針對790製培養皿，無論有無電漿表面處理，和FALCON(註冊商標)培養皿比較有1.3倍以上之GATA3基因增加，可知含脂環結構之聚合物有促進角化細胞之分化誘導之效果。

Claims (3)

  1. 一種培養細胞之分化促進方法，其特徵為：使降冰片烯系單體之開環聚合物氫化物之成形體和培養的細胞接觸。
  2. 如申請專利範圍第1項之培養細胞之分化促進方法，其中，培養的細胞為表皮細胞。
  3. 一種降冰片烯系單體之開環聚合物氫化物之成形體作為培養細胞分化促進劑的用途。
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