KR20170035954A - Ｃｄ79 및 ｃｄ22에 대해 특이성을 갖는 분자 - Google Patents

Ｃｄ79 및 ｃｄ22에 대해 특이성을 갖는 분자 Download PDF

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KR20170035954A
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케리 루이스 타이슨
헬렌 마가렛 피니
스티븐 에드워드 라펙키
마이클 존 라이트
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유씨비 바이오파마 에스피알엘
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Abstract

본 개시내용은 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인, 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자, 상기를 포함하는 조성물, 및 치료에서, 예를 들어, 자가면역 질환 치료에서의 상기 둘 모두의 용도에 관한 것이다.

Description

ＣＤ79 및 ＣＤ22에 대해 특이성을 갖는 분자 {MOLECULES WITH SPECIFICITY FOR CD79 AND CD22}
본 개시내용은 항원 CD22 및 CD79에 대하여 적어도 이중특이적인 분자, 상기 분자를 포함하는 제제, 및 치료에서 상기 중 어느 하나의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 상기 분자 및 상기 제제를 제조하는 방법으로 확대된다. 독립된 측면에서, 본 개시내용은 또한 본원에 기술된 신규한 항체 서열 및 단편으로 확대된다.
생체내 생물학적 기전은, 진실을 밝혀내고, 이해하기 어려운, 극도로 복잡한 신호 캐스케이드이다. 상기와 같은 신호전달의 예로는 B 세포를 활성화시키는 것이 요구되는 것이 있다. B 세포 항원 수용체(BCR: B cell antigen receptor)는 막 면역글로불린(mIg: membrane immunoglobulin) 분자 및 회합된 Igα/Igβ(CD79a/CD79b) 이종이량체(α/β)로 구성된다. mIg 서브유니트는 항원에 결합하여 수용체를 응집시키는 반면, α/β 서브유니트는 신호를 세포 내부로 전달한다. BCR 응집은 Src 패밀리 키나제인 Lyn, Blk, 및 Fyn 뿐만 아니라, Syk 및 Btk 티로신 키나제를 빠르게 활성화시킨다. 이는 BCR, 상기 언급된 티로신 키나제, 어댑터 단백질, 예컨대, CD19 및 BLNK, 및 신호전달 효소, 예컨대, PLCγ2, PI3K, 및 Vav로 구성된 '시그날로섬'의 형성을 개시시킨다.
시그날로섬으로부터 방출된 신호가 키나제, GTP아제, 및 전사 인자를 포함하는 다중 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. 이를 통해 세포 대사, 유전자 발현, 및 세포골격 조직화가 변하게 된다. BCR 신호전달이 복잡하기 때문에, 생존, 내성(아네르기) 또는 아폽토시스, 증식, 및 항체 생산 세포 또는 기억 B 세포로의 분화를 비롯한, 다수의 상이한 결과를 일으킬 수 있다. 상기 반응의 결과는 세포의 성숙화 상태, 항원의 성질, BCR 신호전달의 규모 및 지속 기간, 및 다른 수용체, 예컨대, CD40, IL-21 수용체, 및 BAFF-R로부터의 신호에 의해 측정된다. 그 중 일부는 수용체인 것인, 다수의 다른 막횡단 단백질이 BCR 신호전달의 특정 요소를 조절한다. 이중 몇몇은 CD45, CD19, CD22, PIR-B, 및 FcγRIIB1(CD32)을 포함한다. BCR 신호전달의 규모 및 지속 기간은 Lyn/CD22/SHP-1 경로, Cbp/Csk 경로, SHIP, Cbl, Dok-1, Dok-3, FcγRIIB1, PIR-B, 및 BCR의 내재화를 포함하는 것을 비롯한 음성 피드백 루프에 의해 제한된다. 생체내에서, B 세포는 대개 항원을 포획하고, 그의 세포 표면 상에 그를 제시하는 항원 제시 세포에 의해 활성화된다. 상기 막 회합 항원에 의한 B 세포 활성화는 BCR 유도성 세포골격 재조직화를 필요로 한다.
자가 반응성 B 세포는 자가면역 병태를 직접적으로 또는 간접적으로 유발할 수 있거나, 또는 그를 악화시킬 수 있는 병원성 자가 항체 생산을 담당한다. CD20 양성 B 세포를 고갈시키는 것이 다수의 자가면역 병태를 성공적으로 치료하는 데 사용되어 왔으며, 따라서, 결론적으로는 B 세포가 다수의 자가면역 질환을 유발하거나, 그를 유지시키는 데 있어서 중요한 역할을 한다는 것이 확립되었다. 비록 B 세포 고갈이 성공적인 치료학적 옵션이 되어 왔지만, B 세포 성장 및 활성화 상태 조절 또한 B 세포 기능을 조절하는 효과적인 방법이 될 수 있다는 것을 입증하는 증거 또한 존재한다. 그러므로, B 세포를 고갈시키지 않고, 일부 부작용과 연관이 있는 것으로 밝혀진 장기간의 B 세포 면역 억제 없이 B 세포를 제어할 수 있는 유연성을 제공하는 대안적인 전략법이 바람직할 것이다. 추가로, 모든 B 세포 반응 또는 활성이 유해한 것은 아니며, 증거는 조절성 B 세포 집단 유지가 보호성일 수 있다는 것을 제안한다. 상기 접근법은 부적절한 또는 과도한 BcR 신호전달에 의해 유발되는 비정상적인 B 세포 기능을 가진 질환에서 효과적이어야 한다. 예로는 염증, 자가면역 및 암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. BcR 신호전달을 위한 직접적인 요건을 가지거나, 또는 체액성 면역 반응의 억제 또는 자극을 필요로 하는 질환이 특히 관심의 대상이 된다.
이중특이적 항체는 차세대 생물학적 치료제에서 중요한 역할을 할 것으로 널리 기대된다(문헌 [D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798]). 이중특이적 항체는 더 많은 환자에서 우수하고, 장기간 지속되는 광범위한 효능을 전달할 수 있는 잠재능을 가진다. 이는 공통된 질환 경로 내에서 동시에 상이한 항원과 함께 공동으로 체결하여 중복을 감소시키거나; 또는 독립된 경로로부터 항원을 표적화하여 상가 또는 시너지 효과를 제공함으로써 달성될 수 있다.
현재까지 B 세포를 고갈시키지 않고, B 세포 기능을 억제시키는 전략법은 CD32b(FcγRIIB)에 의한 천연 조절 기전을 이용하는 것에 초점을 맞추어 왔다. 이는 CD79b/CD32b에 대한 이중특이적 항체(문헌 [Veri et al., Arthritis & Rheumatism 2010 62 1933-1943]), CD19/CD32b에 대한 이중특이적 항체(문헌 [Karnell et al., J.Immunol 2014 192 1480-1490]) 및 CD32b 결합이 증진된 Fc를 포함하는, CD19에 대한 항체(문헌 [Chu et al., Arthritis & Rheumatology 2014 66 1153-1164])를 포함한다.
천연적으로 신호전달을 조절하기 위해, 특히, 항원이 소형 면역 복합체의 항체에 결합할 때에 B 세포 수용체와 Fc 감마 수용체 IIb(CD32b)의 공동 라이게이션이 발생한다. 이어서, CD32b는 BcR 활성화를 길항시키는 포스파타제 SHP-1 및 SHIP-1을 동원한다. 비록 상기와 같은 천연 조절 기전이 B 세포 기능을 제어할 수는 있지만, CD32b의 단백질 서열의 변이에 의해 유발되는 CD32b 기능 파괴가 자가면역 질환을 일으킬 수 있고, 그의 수용체는 예컨대, SLE 사례에서와 같이 자가면역 질환에서 하향 조절될 수 있다. 그러므로, B 세포 활성을 차단시키는 대안적인 방법이 BcR 기능을 조절하는 비천연적인 대안 방법을 제공하는 바, 이 방법은 바람직할 수 있다. 천연 기전이 주어진 질환에서 기능상 문제가 있는 경우, 상기 대안적 기전은 가능하게는 특히 중요할 수도 있다.
이중특이적 항체는 예컨대,
1) 적절할 경우, 세포 상의 수용체와의 가교 결합,
2) 세포 매개 효과 유도,
3) 사이토카인을 세포로 국재화시켜 신호전달을 조절하거나, 또는 사이토카인 기능을 국소적으로 차단하는 것,
4) 다중 에피토프를 고용하여 동시에 "새로운 활성"을 생성시키고, 단일 모노클로날 항체, 또는 다른 항원에 대한 것의 혼합물을 비롯한, 비연결된 항체의 혼합물('다중-모노클로날') 보일 수 없는 기능 또는 특이성을 증가시키는 것과 같이, 신규한 생물학적 성질에의 접근을 용이하게 한다.
본 발명자들은 놀랍게도, 정상적인 생리 조건하에서는 복합체로부터 배제될 수 있는 음성 조절 분자 CD22에 BcR (CD79)을 커플링시키는 이중특이적 항체를 사용함으로 BcR 신호전달을 억제시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다. CD22는 항원 결합 부재하에서 BcR을 통한 긴장성 신호전달을 조절하는 것을 담당한다. 그러나, 항원 결합시, CD22는 보통 BcR 복합체로부터 배제된다. 본 발명자들은 이중특이적 항체의 사용을 통해 BcR을 CD22 신호전달과 물리적으로 연결시킴으로써 B 세포의 활성화를 억제시킬 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
이로써, 본 발명자들은 적어도 CD22 및 CD79에 대하여 이중특이적인 분자에 대한 시너지 기능을 확인하게 되었다. 이러한 기능은 단순히 예를 들어, 모노클로날 항체 또는 그의 결합 단편의 혼합물로서 제공되는 것과 달리, 주로 특이성이 조합된 결합 영역이 이중특이적 (다중특이적) 포맷으로 제공될 때에 검출가능할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 다중특이적 분자는 특정 질환, 예컨대, 자가면역 및 암과 연관된 비정상적인 B 세포 기능을 제어하는 데 유용하다.
따라서, 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인, 및 항원 CD79에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다.
이중특이적 포맷의 본 개시내용에 따른 조합은 시험관내 기능 검정법에서 관심의 대상이 되는 생물학적 활성, 예를 들어, B 세포 상의 CD86, CD71 및/또는 CD40 발현 억제 이외에도, 하기: Akt S473의 인산화 억제, P38의 인산화 억제, 및 IkB의 PLCγ2 Y759 억제 중 어느 하나에 의해 측정되는 바와 같은, B 세포 신호전달의 억제를 나타낸다. 개별 성분 단독, 또는 혼합물로 제공되는 성분에 대해서는 같은 수준의 활성이 나타나지 않는다. 그러나, 상기 활성은 CD22 및 CD79b에 대해 특이성을 가진 이중특이적 구성체를 제공하는 경우에 자명하다.
상기 검정법에서 관찰되는 억제는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인 및 CD79에 대해 특이적인 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 다중특이적 분자를 사용하여 B 세포 기능을 변경시키고, B 세포 고갈에 대한 치료학적 대안을 제공할 수 있다는 것을 시사하다.
B 세포 수용체 신호전달은 B 세포의 중요한 기능이고, B 세포의 항원 특이 활성화를 위한 요건이다. BcR 신호전달은 B 세포 발생의 조기 단계에서부터 기억 B 세포 반응의 활성화 및 발생에 이르기까지 중요하다. B 세포 수용체는 CD79a 및 CD79b의 이종이량체 복합체와 회합된 표면 면역글로불린(Ig) 분자로 구성되어 있다. 표면 Ig가 항원을 인식하게 되면, CD79a/b 복합체의 클러스터링이 이루어지고, 그 결과로 Src 패밀리 키나제 뿐만 아니라, Syk 및 Btk 티로신 키나제를 포함하는 즉각적인 신호전달 캐스케이드의 하류 활성화가 일어나는 것으로 여겨진다. 이어서, 상기 신호전달 복합체는 어댑터 단백질, 예컨대, CD19 및 BLNK를 동원할 수 있고, 그 결과로 PLCγ2 및 PI3K의 활성화가 이루어지게 되며, 이는 결국에는 예컨대, B 세포 성장, 생존 및 분화를 제어하는 것과 같은 추가의 하류 경로를 활성화시킬 수 있다. 상기 신호전달 복합체는 BAFF-R, IL-21R 및 CD40을 통한 신호전달을 통하여 다른 2차 신호에 의해 추가로 조절될 수 있고, 이는 또한 다른 신호전달 분자, 예컨대, 다른 여러 신호전달 분자들 중에서도 특히 CD19, CD21, CD83, CD22, CD32b 및 CD45에 의해 조절될 수 있다. BcR에 의한 항원 인식시, 활성화되는 1차 반응들 중 하나는 표면 수용체, 예컨대, 공동 자극성 분자, CD80 및 CD86의 상향조절이다. 이들 분자는 T 세포 상의 상응하는 수용체에 결합하여 추가 생존 및 활성화 신호를 전달함으로써 MHC 클래스 II와 관련하여 항원을 인식하는 T 세포를 생존 및 확장시킬 수 있다. 이러한 반응은 MHC 클래스 II와 관련하여 항원을 다시, 인자, 예컨대, IL-2 및 IL-21를 방출하는 T 세포에 제시할 수 있는 B 세포의 능력에 의해 추가로 증폭된다. 결국 이들 사이토카인은 B 세포 개수를 크게 확장시킨다. 따라서, 세포 표면 상의 CD86의 하향조절은 B 세포 신호전달이 억제되었음을 시사하는 것일 수 있다.
추가로, B 세포 수용체 신호전달의 억제는 하류 기능을 억제시킬 수 있다. 그러한 결과 중 하나는 공동 자극성 분자, 예컨대, CD86의 억제 (또는 상기 분자의 발현 감소)일 수 있고, 이는 T 세포 기능, 생존, 및 분화의 억제를 유도하게 될 것이다.
따라서, B 세포 수용체 신호전달을 억제시키는 것이 자가면역 및 암과 연관된 비정상적인 B 세포 기능을 제어하는 데 유익할 것이다. B 세포 수용체 신호전달은 자가면역 질환에서 B 세포 증식, 분화, 항원 제시 및 사이토카인 방출을 위해 요구된다. 따라서, BcR 활성을 억제시키는 것이 B 세포 기능, 예컨대, 면역글로불린 분비, T 세포 활성화를 조절할 수 있고, 예를 들어, 자가면역 병태와 연관된 부적절한 B 세포 활성을 제어할 수 있다. 추가로, B 세포 수용체 활성화의 억제에 의해 제어될 수 있는 것으로는 생존 및 성장을 위해 B 세포 수용체 신호전달을 필요로 하는 일부 B 세포 백혈병 및 림프종이 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 분자의 결합 도메인 또는 결합 도메인들은 각각 독립적으로 관련된 항원 (예컨대, CD22 또는 CD79, 또는 분자가 적어도 삼중특이적일 경우, 추가 항원)에 특이적인 1개 또는 2개(예컨대, 2개)의 항체 가변 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, CD79는 CD79a 및 CD79b로 구성된 복합체를 지칭한다. 따라서, CD79에 결합하는 항체 또는 결합 도메인은 CD79a 및/또는 CD79b에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, CD79a 및/또는 CD79b에 결합한다는 것은 CD79a에 특이적이거나, CD79b에 특이적이거나, CD79a 및 CD79b, 둘 모두에 특이적이거나(즉, CD79a 상의 에피토프를 인식하고, 같은 항체 또는 결합 도메인이 CD79b 상의 에피토프 또한 인식하거나, 즉, 범(pan) 특이적이거나), 또는 CD79a 및 CD79b의 복합체에 특이적이라는 것(즉, 복합체 형태의 CD79a 및 CD79b의 상호작용으로부터 형성되는 에피토프를 인식하고, 이는 상기 복합체를 개별 성분과 구별할 수 있다는 것)을 의미한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 항체 또는 그의 결합 단편은 CD79a에 대해 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 항체 또는 그의 결합 단편은 CD79b에 대해 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 항체 또는 그의 결합 단편은 CD79 복합체에 특이적이고, 즉, 복합체에 존재하는 에피토프를 인식하고, 그에 특이적이고, 예를 들어, CD79a 및 CD79b 사이의 상호작용을 포함하는 에피토프에 특이적이다.
한 실시양태에서, 심지어 결합 도메인이 CD79a 또는 CD79b에 특이적인 경우에도, 두 단백질이 천연적으로는 세포 표면 상에 공동 발현되기 때문에, 복합체 형태일 때, 결합 도메인은 여전히 바람직하게는 CD79a 또는 CD79b에 결합하게 된다는 것을 이해할 것이다.
결합 도메인 중 및/또는 각 결합 도메인 중에 2개의 가변 영역이 존재할 경우, 이때 상기 두 가변 영역은 일반적으로는 공동으로 작동적으로 작용하여 관련된 항원에 대한 특이성을 제공하게 될 것이며, 예를 들어, 동족 쌍이거나, 또는 상기 도메인이 특정 항원에 대해 특이성을 가지도록 적절한 친화도를 제공하기 위해 친화도 성숙이 이루어진다. 전형적으로, 이는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 쌍(VH/VL 쌍)이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 이중특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 삼중특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 CD79에 대해 단일특이적이고, CD22에 대해 단일특이적이며, 즉, 상기 분자는 오직 CD79에 결합하는 한 결합 도메인, 및 CD22에 결합하는 한 결합 도메인만을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자는 단일 쇄이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자는 중쇄, 및 경쇄 또한 포함한다. 한 예에서, 본원에서 사용되는 바, 중쇄 및 경쇄 쌍 형성이 이량체로서 지칭되지 않으며, 특히, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자가 다량체, 예컨대, 항체, 유니트/단편 또는 성분의 이량체를 포함하지 않는 경우에 그러하다.
한 측면에서,
a) 하기 화학식 (I)의 폴리펩티드 쇄;
b) 하기 화학식 (II)의 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 다중특이적 항체 분자를 제공한다:
<화학식 (I)>
V H -CH 1 -X-(V 1 ) p ;
<화학식 (II)>
V L -C L -Y-(V 2 ) q
상기 식에서,
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인, 예를 들어, 그의 도메인 1을 나타내고;
X는 결합 또는 링커, 예를 들어, 아미노산 링커를 나타내고;
Y는 결합 또는 링커, 예를 들어, 아미노산 링커를 나타내고;
V1은 dab, scFv, dsscFv 또는 dsFv를 나타내고;
VL은 가변 도메인, 예를 들어, 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 불변 영역으로부터의 도메인, 예를 들어, 경쇄 불변 영역 도메인, 예컨대, C카파를 나타내고;
V2는 dab, scFv, dsscFv 또는 dsFv를 나타내고;
p는 0 또는 1을 나타내고;
q는 0 또는 1을 나타내고;
p가 1일 때, q는 0 또는 1이고, q가 1일 때, p는 0 또는 1이고, 즉, p 및 q, 둘 모두가 0을 나타내지는 않는다.
한 실시양태에서, 분자는 CD22에 대한 1개 이하의 결합 도메인, 및 CD79에 대한 1개 이하의 결합 도메인을 포함한다.
상기 포맷은 특히 가변 영역의 조합을 스크리닝하는 데, 예를 들어, 보다 장기간의 검정법에서 스크리닝하는 데, 및 치료학적 용도로 유용하다.
한 실시양태에서, q는 0이고, p는 1이다.
한 실시양태에서, q는 1이고, p는 1이다.
한 실시양태에서, V1은 dab이고, V2는 dab이며, 이들은 함께 가변 영역의 공동 작동 쌍, 예컨대, 동족 VH/VL 쌍의 단일 결합 도메인을 형성한다.
한 실시양태에서, VH 및 VL은 CD79, 예를 들어, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD79, 예를 들어, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V2는 CD79, 예를 들어, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1 및 V2는 함께 (예컨대, 한 결합 도메인으로서) CD79, 예를 들어, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, VH 및 VL은 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V2는 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1 및 V2는 함께 (예컨대, 한 결합 도메인으로서) CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 단백질 단백질이거나, 또는 그를 포함한다.
한 실시양태에서, 화학식 A-X:Y-B를 가지는 이중특이적 단백질이며,
상기 식에서,
A-X는 제1 융합 단백질이고;
Y-B는 제2 융합 단백질이고;
X:Y는 이종이량체-테더이고;
A는 CD22 또는 CD79에 대해 특이적인 제1 결합 도메인을 포함하고;
B는 CD22 또는 CD79에 대해 특이적인 제2 결합 도메인을 포함하고;
X는 결합 쌍의 제1 결합 파트너이고;
Y는 결합 쌍의 제2 결합 파트너이고;
:는 X와 Y 사이의 상호작용(예컨대, 결합 상호작용)이고,
여기서, A 또는 B 중 적어도 하는 CD22에 특이적이고, 나머지 다른 하나는 CD79에 특이적인, 본 개시내용에 따른 다중특이적 분자를 제공한다.
상기 포멧은 예를 들어, 기능 검정법에서 시험관내 검사를 받을 수 있는 이중특이적 포맷을 조립하는 빠르고, 효율적인 방법을 제공하기 위해 편리한 포맷이다. 이는 가변 영역의 바람직한 쌍 선택을 촉진시킬 수 있고, 이어서, 이는 대안적인 치료학적 다중특이적 항체 포맷으로 도입될 수 있다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, CD79에 특이적인 다양한 가변 영역과 조합된 CD22에 특이적인 가변 영역의 상이한 순열이 생물학적 기능에 있어서 상이한 뉘앙스로의 접근을 허용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 다중특이적 분자에서 사용하기 위한, 또는 임의의 다른 적합한 항체 포맷 내로 도입하기 위한 신규한 CD22 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 다중특이적 분자에서 사용하기 위한, 또는 임의의 다른 적합한 항체 포맷 내로 도입하기 위한 신규한 CD79 항체를 제공한다.
도 1은 CD22 및 CD79b에 대해 특이성을 가지는 항체의 이중특이적 및 2가 조합에 대한 인산화된 Akt의 억제의 상대적인 효능에 관한 막대 차트이다.
도 2는 CD22 및 CD79b에 대해 특이성을 가지는 항체의 이중특이적 및 2가 조합에 대한 인산화된 PLCγ2의 억제의 상대적인 효능에 관한 막대 차트이다.
도 3은 CD22 및 CD79b에 대해 특이성을 가지는 항체의 이중특이적 및 2가 조합에 대한 CD86 발현의 억제의 상대적인 효능에 관한 막대 차트이다.
도 4는 CD22 및 CD79b에 대해 특이성을 가지는 항체의 이중특이적, 2가 또는 혼합물에 대한 인산화된 Akt의 억제의 상대적인 효능에 관한 막대 차트이다.
도 5는 CD22 및 CD79b에 대해 특이성을 가지는 항체의 이중특이적, 2가 또는 혼합물에 대한 인산화된 PLCγ2의 억제의 상대적인 효능에 관한 막대 차트이다.
도 6은 CD22 및 CD79b의 이중특이적 조합이 항IgM 자극을 받은 B 세포에서의 총 IkB 수준에 미치는 효과의 적정을 보여주는 그래프이다.
도 7은 CD22 및 CD79b의 이중특이적 조합이 항IgM 자극을 받은 B 세포 상의 CD86 발현에 미치는 효과의 적정을 보여주는 그래프이다.
도 8은 다른 V 영역을 가지는, CD22 및 CD79b에 대해 특이성을 가지는 이중특이적 단백질에 대한 인산화된 PLCγ2의 억제 그래프이다.
도 9a 및 9b는 특정 항체 포맷을 보여주는, 문헌 [Chan and Carter, Nature Reviews Immunology vol 10, May 2010,301]로부터의 발췌 내용이다.
도 10은 항원 그리드 교차 특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 항원 2=CD79b 및 항원 3=CD22. 값은 Syk의 인산화 억제율(%)(활성화에 대한 음성 값)이고, 평가되는 다중 V 영역 조합의 평균을 나타낸다.
도 11은 항원 그리드 교차 특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 항원 2=CD79b 및 항원 3=CD22. 값은 PLCγ2의 인산화 억제율(%)(활성화에 대한 음성 값)이고, 평가되는 다중 V 영역 조합의 평균을 나타낸다.
도 12는 항원 그리드 교차 특이성에 대한 데이터를 보여주는 표이다. 항원 2=CD79b 및 항원 3=CD22. 값은 AKT의 인산화 억제율(%)(활성화에 대한 음성 값)이고, 평가되는 다중 V 영역 조합의 평균을 나타낸다.
도 13은 Fab-Y에서의 CD22 특이성과 조합된 Fab-X에서의 CD79b 특이성에 대한 각 V 영역의 조합에 관한 Syk, PLCγ2 & AKT의 인산화 억제율(%)을 보여주는 그래프이다.
도 14는 Fab-Y에서의 CD79b 특이성과 조합된 Fab-X에서의 CD22 특이성에 대한 각 V 영역의 조합에 관한 Syk, PLCγ2 & AKT의 인산화 억제율(%)을 보여주는 그래프이다.
도 15는 CD79b 및 CD22 특이 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한 B 세포에서의 항IgM 유도성 인산화된 PLCγ2의 억제율(%)에 대한 데이터를 보여주는 것이다.
도 16은 CD79b 및 CD22 특이 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한 B 세포에서의 항IgM 유도성 인산화된 P38의 억제율(%)에 대한 데이터를 보여주는 것이다.
도 17은 CD79b 및 CD22 특이 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한 B 세포에서의 항IgM 유도성 인산화된 Akt의 억제율(%)에 대한 데이터를 보여주는 것이다.
도 18은 CD79b 및 CD22 특이 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한 B 세포 상에서의 항IgM 유도성 CD71 발현의 억제율(%)에 대한 데이터를 보여주는 것이다.
도 19는 CD79b 및 CD22 특이 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한 B 세포 상에서의 항IgM 유도성 CD40 발현의 억제율(%)에 대한 데이터를 보여주는 것이다.
도 20은 CD79b 및 CD22 특이 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe에 의한 B 세포 상에서의 항IgM 유도성 CD86 발현의 억제율(%)에 대한 데이터를 보여주는 것이다.
도 21은 CD79b 및 CD22 특이 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상에서의 CD27 발현의 억제를 보여주는 것이다.
도 22는 CD79b 및 CD22 특이 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상에서의 CD71 발현의 억제를 보여주는 것이다.
도 23은 CD79b 및 CD22 특이 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상의 CD86 발현의 억제를 보여주는 것이다.
도 24는 CD79b 및 CD22 특이 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상의 CD27 발현의 억제를 보여주는 것이다.
도 25는 CD79b 및 CD22 특이 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상의 CD71 발현의 억제를 보여주는 것이다.
도 26은 CD79b 및 CD22 특이 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의한 B 세포 상의 CD86 발현의 억제를 보여주는 것이다.
도 27은 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe 및 VR4447/VR4130 BYbe와 함께 배양된 PBMC로부터의 파상풍 톡소이드 IgG 생산 억제를 보여주는 것이다. 데이터는 3명의 기증자로부터의 풀링된 데이터를 나타내는 것이다.
도 28은 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe 및 VR4447/VR4130 BYbe와 함께 배양된 정제된 B 세포로부터의 파상풍 톡소이드 IgG 생산 억제를 보여주는 것이다. 데이터는 2명의 기증자로부터의 풀링된 데이터를 나타내는 것이다.
도 29는 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe, VR4447/VR4130 BYbe, VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민과 함께 배양된 PBMC 또는 정제된 B 세포로부터의 파상풍 톡소이드 IgG 생산 억제를 보여주는 것이다. 제시된 데이터는 1명의 기증자로부터 얻은 것이다.
도 30은 12명의 건강한 피험체 및 12명의 SLE 환자 샘플로부터 얻은 자극받지 않은 B 세포 중의 기준선에서의 인산화 수준을 보여주는 것이다.
도 31은 CD79b + CD22 특이 VR4447/VR4130 BYbe가 12명의 건강한 지원자(HV: Healthy Volunteer) 및 12명의 SLE 기증자로부터의 항IgM 유도성 B 세포 NFkB 인산화에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
도 32는 CD79b + CD22 특이 VR4447/VR4130 BYbe가 12명의 건강한 지원자(HV) 및 12명의 SLE 기증자로부터의 항IgM 유도성 B 세포 Akt 인산화에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
도 33은 CD79b + CD22 특이 VR4447/VR4130 BYbe가 12명의 건강한 지원자(HV) 및 12명의 SLE 기증자로부터의 항IgM 유도성 B 세포 Syk 인산화에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
도 34는 CD79b + CD22 특이 VR4447/VR4130 BYbe가 12명의 건강한 지원자(HV) 및 12명의 SLE 기증자로부터의 항IgM 유도성 B 세포 Erk 1 & 2 인산화에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
본원에서 사용되는 바, "다중특이적 분자"란, 2개 이상의 뚜렷이 다른 항원, 예를 들어, 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력이 있는 분자를 의미한다. 한 실시양태에서, 다중특이적 분자는 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 분자, 특히, 이중특이적 또는 삼중특이적 분자이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 적어도 CD22 및 CD79a에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이적 분자, 예컨대, 이중특이적 또는 삼중특이적 포맷의, CD22 및 CD79a에 특이적인 항체/그의 단편 또는 조합의 용도로까지 확장된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 적어도 CD22 및 CD79b에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이적 분자, 예컨대, 이중특이적 또는 삼중특이적 포맷의, CD22 및 CD79b에 특이적인 항체/그의 단편 또는 조합의 용도로까지 확장된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 적어도 CD22 및 CD79a/b 복합체에 특이적인 적합한 포맷의 분자, 및 다중특이적 분자, 예컨대, 이중특이적 또는 삼중특이적 포맷의, CD22 및 CD79a/b 복합체에 특이적인 항체/그의 단편 또는 조합의 용도로까지 확장된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 예를 들어, 제3 결합 도메인이 예를 들어, 혈청 캐리어 단백질 결합에 의해 분자의 반감기를 연장시킬 수 있는 것인, 삼중특이적 분자이다.
다양한 단백질이 혈장내 존재하며, 티록신 결합 단백질, 트렌스티레틴, α1-산 당단백질, 트랜스페린, 피브리노겐 및 알부민, 또는 상기 중 임의의 것의 단편을 포함한다(문헌 [Bartalena & Robbins, 1993, Clinics in Lab. Med. 13:583-598]; [Bree et al., 1986, Clin. Pharmacokin. 11:336-342]; [Gitlin et al. 1964, J. Clin. Invest. 10:1938-1951]; [Peters, 1985, Adv Protein Chem. 37:161-245]; [Waldeman & Strober, 1969, Progr. Allergy, 13:1-110]). 한 예에서 제3 결합 도메인은 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민에 특이적인 것이다.
다중특이적 분자 포맷
적합한 다중특이적 분자의 예는 예를 들어, 문헌 ["The coming of Age of Engineered Multivalent Antibodies, Nunez-Prado et al., Drug Discovery Today Vol 20 Number 5 Mar 2015, page 588-594, D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798], [Chan and Carter, Nature Reviews Immunology vol 10, May 2010, 301](상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)에 리뷰로 개시되어 있는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 다중특이적 포맷은 당업계에 공지되어 있는 것, 및 본원에 기술되어 있는 것, 예컨대, 분자 포맷이 하기를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 것을 포함한다:
· 탠덤 sdAb, 탠덤 sdAb-sdAb(3개의 sdAb);
· (scFv)2(이는 또한 탠덤 scFv로도 지칭됨), scFv-dsFv, dsscFv-dsFv(dsFv)2;
· 디아바디, ds디아바디, 디ds디아바디,
· sc디아바디, dssc디아바디, 디dssc디아바디;
· 다트(Dart) 항체, 즉, VL1 링커 VH2 링커 및 VH1 링커 VL2(VH1 및 VH2의 C 말단이 이황화 결합에 의해 연결된 것);
· BiTE®, dsBiTE, 디dsBiTE;
· 디-디아바디(문헌 [Nunez-Prado et al], 특히, 상기 문헌 도 1의 25번 분자 참조), ds디-디아바디, 디ds디-디아바디;
· 트리아바디, ds트리아바디, 디ds트리아바디, 트리ds트리아바디;
· ;
· 테트라바디, ds테트라바디, 디ds테트라바디, 트리ds테트라바디, 테트라ds테트라바디;
· tandab(문헌 [Nunez-Prado et al], 특히, 상기 문헌 도 1의 22번 분자 참조); dstandab, 디dstandab, 트리dstandab, 테트라dstandab;
· [sc(Fv)2]2(문헌 [Nunez-Prado et al], 특히, 상기 문헌 도 1의 22번 분자 참조), ds[sc(Fv)2]2, 디ds[sc(Fv)2]2, 트리ds[sc(Fv)2]2, 테트라ds[sc(Fv)2]2;
· 펜타바디(문헌 [Nunez-Prado et al], 특히, 상기 문헌 도 1의 27번 분자 참조);
· Fab-scFv(이는 또한 비바디로도 지칭됨), Fab'scFv, FabdsscFv(또한 BYbe), Fab'dsscFv;
· 트리바디, ds트리바디, 디ds트리바디(이는 또한 Fab디dsscFv 또는 TrYbe 또는 Fab-(dsscFv)2로도 지칭됨), Fab'디dsscFv;
· Fabdab, FabFv, Fab'dab, Fab'Fv;
· Fab 단일 링커 Fv(이는 또한 WO2014/096390에 개시된 바와 같이, 본원에서 FabdsFv로도 지칭됨), Fab' 단일 링커 Fv(이는 또한 본원에서 Fab'dsFv로도 지칭됨);
· FabscFv 단일 링커 Fv, Fab'scFv 단일 링커 Fv;
· FabdsscFv 단일 링커 Fv, Fab'dsscFv 단일 링커 Fv;
· FvFabFv, FvFab'Fv, dsFvFabFv, dsFvFab'Fv, FvFabdsFv, FvFab'dsFv, dsFvFabdsFv, dsFvFab'dsFv,
· FabFvFv, Fab'FvFv, FabdsFvFv, Fab'dsFvFv, FabFvdsFv, Fab'FvdsFv, FabdsFvdsFv, Fab'dsFvdsFv,
· 디Fab, 디Fab'(화학적으로 컨쥬게이션된 디Fab' 포함),
·(FabscFv)2,(Fab)2scFvdsFv,(Fab)2dsscFvdsFv,(FabdscFv)2,
·(Fab'scFv)2,(Fab')2scFvdsFv,(Fab')2dsscFvdsFv,(Fab'dscFv)2,
· VHHCK(문헌 [Nunez-Prado et al], 특히, 상기 문헌 도 1의 6번 분자 참조);
· 미니바디, ds미니바디, 디ds미니바디,
· 미니항체(ZIP)(문헌 [Nunez-Prado et al], 특히, 상기 문헌 도 1의 7번 분자 참조), ds미니항체(ZIP) 및 디ds미니항체(ZIP);
· 트리비-미니바디(문헌 [Nunez-Prado et al], 특히, 상기 문헌 도 1의 15번 분자 참조), ds트리비-미니바디, 디ds트리비-미니바디, 트리ds트리비-미니바디;
· 디아바디-CH3, ds디아바디-CH3, 디ds디아바디-CH3, sc디아바디-CH3, dssc디아바디-CH3, 디dssc디아바디-CH3,
· 탠덤scFv-CH3, 탠덤dsscFv-CH3, 탠덤디dsscFv-CH3, 탠덤트리dsscFv-CH3, 탠덤테트라dsscFv-CH3,
· scFv-Fc(이는 또한 WO2008/012543에 개시된 바와 같이, 본원에서 (scFvCH2CH3)2)로도 지칭됨), 및 그의 단일 쇄 버전, dsscFvscFv-Fc, dsscFv-Fc(이는 또한 본원에서 (dsscFvCH2CH3)2)로도 지칭됨), scFv-dsFv-Fc, dsscFv-dsFv-Fc, dsFv-Fc(이는 또한 본원에서 (dsFvCH2CH3)2로도 지칭됨),
· 스코피온 분자(트루비온(Trubion)), 즉, 결합 도메인, US8,409,577에 기술된 바와 같은, 링커-CH2CH3 결합 도메인;
· SMIP(트루비온), 즉, (scFv-CH2CH3)2;
· (dsFvCH2CH3)2, 탠덤 scFv-Fc, 탠덤 dsscFvscFv-Fc, 탠덤 dsscFv-Fc,
· scFv-Fc-scFv, dsscFv-Fc-scFv, scFv-Fc-dsscFv,
· 디아바디-Fc, ds디아바디-Fc, 디ds디아바디-Fc, 트리아바디-Fc, ds트리아바디-Fc, 디ds트리아바디-Fc, 트리ds트리아바디-Fc, 테트라바디-Fc, ds테트라바디-Fc, 디ds테트라바디-Fc, 트리ds테트라바디-Fc, 테트라ds테트라바디-Fc, ds테트라바디-Fc, 디ds테트라바디-Fc, 트리ds테트라바디-Fc, 테트라ds테트라바디-Fc, sc디아바디-Fc, dssc디아바디, 디dssc디아바디;
· 이기능성 또는 삼기능성 항체, 예를 들어, 상이한 중쇄 가변 영역 및 공통 경쇄를 포함하는 것, 예를 들어, 고정 서열의 공통 경쇄, 및 상이한 중쇄(상이한 CDR 포함) 및 상이한 중쇄의 이량체화를 유도하는 조작된 CH3 도메인을 포함하는 메루스(Merus) 이중특이적 항체 포맷(비클로닉스(Biclonics)®),
· 듀오바디(즉, 항체 중 전장의 쇄 하나가 항체 중 다른 전장의 쇄와 다른 상이한 특이성을 가지는 것);
· 이중특이적 포맷을 생성하기 위해 Fab 아암 교환이 사용된, 전장의 항체;
· 전장의 항체가 공통 중쇄 및 상이한 경쇄를 가지는, 이기능성 또는 삼기능성 항체(이는 또한 카파/람다 바디' 또는 'κ/λ-바디'로도 지칭됨, WO2012/023053 참조);
· 중쇄 또는 경쇄의 C 말단으로부터의 Ig-scFv 1, 2, 3 또는 4, 중쇄 또는 경쇄의 N 말단으로부터의 scFv-Ig 1, 2, 3 또는 4, 단일 링커 Ig-Fv, 중쇄 또는 경쇄의 C 말단으로부터의 Ig-dsscFv 1, 2, 3 또는 4(1, 2, 3 또는 4개의 이황화 결합 포함);
· 중쇄 또는 경쇄의 N 말단으로부터의 Ig-dsscFv 1, 2, 3 또는 4(1, 2, 3 또는 4개의 이황화 결합 포함),
· Ig 단일 링커 Fv(PCT/EP2015/064450 참조),
· Ig-dab, dab-Ig, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V,
· scFabFvFc, scFabdsFvFc(단일 링커 버전 scFavFv),(FabFvFc)2,(FabdsFvFc)2, scFab'FvFc, scFab'dsFvFc,(Fab'FvFc)2,(Fab'dsFvFc)2 및
· DVDIg(하기에서 더욱 상세하게 논의됨).
한 실시양태에서, 다중특이적 포맷은 당업계에 공지되어 있는 것, 및 본원에 기술되어 있는 것, 예컨대, 분자 포맷이 하기: 디아바디, sc디아바디, 트리아바디, 트리바디, 테트라바디, 탠덤 scFv, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab-(dsscFv)2, 디Fab, 디Fab', 탠덤 scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, 듀오바디 및 DVDIg(하기에서 더욱 상세하게 논의됨)를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 항체 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않고, 즉, CH2 및 CH3 도메인을 포함하지 않으며, 예를 들어, 상기 분자는 탠덤 scFv, scFv-dsFv, dsscFv-dsFv 디dsFv, 디아바디, ds디아바디, 디ds디아바디, sc디아바디(이는 또한 (scFv)2로도 지칭됨), dssc디아바디, 트리아바디, ds트리아바디, 디ds트리아바디, 트리ds트리아바디, 테트라바디, ds테트라바디, 디ds테트라바디, 트리ds테트라바디, 테트라ds테트라바디, 트리바디, ds트리바디, 디ds트리바디, Fabdab, FabFv, Fab'dab, Fab'Fv, Fab 단일 링커 Fv(WO2014/096390에 개시된 바와 같다), Fab' 단일 링커 Fv, FabdsFv, Fab'dsFv, Fab-scFv(이는 또한 비바디로도 지칭됨), Fab'scFv, FabdsscFv, Fab'dsscFv, Fab디dsscFv, Fab'디dsscFv, FabscFv 단일 링커 Fv, Fab'scFv 단일 링커 Fv, FabdsscFvs 단일 링커 Fv, Fab'dsscFv 단일 링커 Fv, FvFabFv, FvFab'Fv, dsFvFabFv, dsFvFab'Fv, FvFabdsFv, FvFab'dsFv, dsFvFabdsFv, dsFvFab'dsFv, FabFvFv, Fab'FvFv, FabdsFvFv, Fab'dsFvFv, FabFvdsFv, Fab'FvdsFv, FabdsFvdsFv, Fab'dsFvdsFv, 디Fab, 디Fab'(화학적으로 컨쥬게이션된 디Fab' 포함),(FabscFv)2,(Fab)2scFvdsFv,(Fab)2dsscFvdsFv,(FabdscFv)2, 미니바디, ds미니바디, 디ds미니바디, 디아바디-CH3, ds디아바디-CH3, 디ds디아바디-CH3, sc디아바디-CH3, dssc디아바디-CH3, 디dssc디아바디-CH3, 탠덤scFv-CH3, 탠덤dsscFv-CH3, 탠덤디dsscFv-CH3, 탠덤트리dsscFv-CH3 및 탠덤테트라dsscFv-CH3을 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 본원 하기에 기술되는 바와 같이 변경된 Fc 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, Fc 도메인은 문맥상 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 일반적으로 -(CH2CH3)2를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 -CH2CH3 단편을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 CH2 도메인을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자는 CH3 도메인을 포함하지 않는다.
본원에서 사용되는 분자는 생화학적 의미로 사용되며, 이는 일단 복합체가 형성되고 나면, 적절한 조건하에서 단일 엔티티로서 처리하는 데 적합한 복합체, 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩티드 쇄에 의해 형성된 복합체를 포함하는, 유기, 특히, 단백질성 물질을 형성하는 원자 군을 지칭한다.
분자 및 구성체는 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 구성체는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하는 데 더욱 자주 사용될 수 있고, 분자는 주로 아미노산 서열을 포함하는 엔티티를 지칭하는 데 더욱 자주 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 특이성(또는 특이적)이란, 상호작용시 파트너가 오직 서로만을 인식하거나, 또는 비파트너와 비교하였을 때, 서로에 대한 친화도가 유의적으로 더 높은, 예를 들어, 예컨대, 배경 결합 수준 또는 다른 비관련 단백질에의 결합보다 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상 친화도가 더 높은 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, '결합 도메인'은 예를 들어, 도메인이 항원에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 데 충분한 친화도로 표적 항원에 결합할 수 있는 결합 영역, 전형적으로, 폴리펩티드를 지칭한다.
임의의 적합한 결합 도메인은 본 발명의 다중특이적 분자에서 사용될 수 있다. 이들은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래된 것일 수 있다.
한 실시양태에서, 생체적합성 프레임워크 구조는 본 개시내용의 분자의 결합 도메인에 사용되며, 상기 구조는 면역글로불린 도메인 이외의 다른 단백질 스캐폴드 또는 골격에 기초한다. 예를 들어, 피브로넥틴, 안키린, 리포칼린, 네오카르지노스타틴, 시토크롬 b, CP1 아연 핑거, PST1, 꼬인 코일, LACI-D1, Z 도메인 및 텐드라미사트 도메인에 기초한 것이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Nygren and Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469] 참조).
본원에서 사용되는 바, '다중특이적 분자'라는 용어는 또한 에드넥틴, 애피바디, 달핀(Darpin), 필로머(Phylomer), 아비머(Avimer), 압타머, 안티칼린(Anticalin), 테트라넥틴, 마이크로바디, 애필린 및 쿠니츠(Kunitz) 도메인을 비롯한, 생물학적 스캐폴드에 기초한 결합 작용제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 분자는 전형적으로 다중특이적 항체 분자, 즉, 다중특이적 분자의 결합 도메인 중 적어도 하나 이상의 것이 항체 또는 그의 단편으로부터 유도된 것이다.
결합 도메인이 항체로부터 유도된 경우, 본원에서 사용되는 바, "결합 도메인 또는 부위"는 항원과 접촉하는 항체의 일부이다. 한 실시양태에서, 결합 도메인은 1개 이상의 가변 도메인 또는 그의 유도체, 예를 들어, 가변 도메인 또는 그의 유도체의 쌍, 예컨대, 가변 도메인 또는 그의 유도체의 쌍을 함유한다. 전형적으로, 이는 VH/VL 쌍이다.
가변 영역(이는 또한 본원에서 가변 도메인으로도 지칭됨)은 일반적으로 3개의 CDR 및 적합한 프레임워크를 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 도메인은 2개의 가변 영역, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이들 요소는 함께 항체 또는 결합 단편의 결합 상호작용의 특이성에 기여한다.
본원에서 사용되는 바, "동족 쌍"이란, 미리 형성된 커플로서, 숙주로부터 단리된 가변 도메인의 중쇄 및 경쇄 쌍(또는 그의 유도체, 예컨대, 그의 인간화 버전)을 지칭한다. 상기 정의는, 숙주로부터의 원래의 쌍 형성이 유지되지 않는 것인, 라이브러리로부터 단리된 가변 도메인은 포함하지 않는다. 동족 쌍은 대개 숙주에서 친화도 성숙화된 것이고, 따라서, 그가 특이성을 가지는 항원에 대하여 라이브러리, 예컨대, 파지 라이브러리로부터 선택된 가변 도메인 쌍의 조합보다 더 높은 친화도를 가질 수 있기 때문에 이로울 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "천연적으로 발생된 도메인의 유도체"란, 천연적으로 발생된 서열 중 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산이 예를 들어, 도메인의 특성을 최적화시키기 위해, 예컨대, 바람직하지 못한 특성은 제거함으로써 대체 또는 결실되었지만, 도메인의 특징적인 특성(들)은 유지되는 것을 지칭한다. 변형의 예로는 글리코실화 부위, GPI 앵커, 또는 용매 노출 리신을 제거하는 것이다. 이러한 변형은 관련된 아미노산 잔기를 보존적 아미노산 치환으로 대체함으로써 달성될 수 있다.
CDR에서의 변형은 예를 들어, 하나 이상의 시스테인을 예를 들어, 세린 잔기로 대체하는 것을 포함한다. Asn은 탈아미드화에 대한 기질일 수 있고, 이러한 경향은 Asn 및/또는 이웃 아미노산을 대체 아미노산으로 대체함으로써, 예컨대, 보존적 치환에 의해 감소될 수 있다. CDR에서 아미노산 Asp는 이성질체화될 수 있다. 후자는 Asp 또는 이웃 아미노산을 대체 아미노산으로 대체함으로써, 예컨대, 보존적 치환에 의해 최소화될 수 있다.
본 명세서와 관련하여 가변 영역의 인간화 버전은 또한 그의 유도체이다. 인간화는 인간 프레임워크 대신, 비인간 프레임워크로 대체하는 것, 및 임의적으로, 하나 이상의 잔기의 "도너 잔기"로의 역돌연변이를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 도너 잔기란, 숙주로부터 단리된 원래의 가변 영역에서 발견되는 잔기, 특히, 인간 프레임워크에서 주어진 아미노산을 도너 프레임워크 중의 상응하는 위치에 있는 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다.
한 실시양태에서, 결합 도메인 또는 각 결합 도메인은 항체 또는 항체 단편(에 포함 또는 그에 도입된) 부분이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 중의 결합 도메인은 면역글로불린/항체 분자 중에 있는 것이다.
본원에서 사용되는 바, "항체 분자"는 항체 및 그의 결합 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 한 실시양태에서, "항체"란, 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 1개 이상의 항원 인식 부위(이는 또한 본원에서 결합 부위 또는 결합 도메인로도 지칭됨)를 위해 표적 항원, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드, 펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "항체 단편"이란, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, Fv, 2가, 3가, 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 항체 결합 단편을 지칭한다(예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136]; [Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조).
본원에서 사용되는 바, "결합 단편"이란, 단편을 펩티드 또는 항원에 대해 특이적인 것으로서 특징화하는 데 충분한 친화도로 표적 펩티드 또는 항원에 결합할 수 있는 단편을 지칭한다.
상기 항체 단편을 생성 및 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181] 참조). 본 개시내용에서 사용하기 위한 다른 항체 단편으로는 WO05/003169, WO05/003170 및 WO05/003171에 기술된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중특이성, 예컨대, 이중특이적인 것을 포함할 수 있거나, 또는 단일특이적일 수 있다(예를 들어, WO92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 및 WO2010/035012 참조).
본원에서 사용되는 바, "Fab 단편"이라는 용어는 VL(경쇄 가변) 도메인 및 경쇄의 불변 도메인(CL), 및 VH(중쇄 가변) 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함하는 항체 단편을 지칭한다.
Fv는 2개의 가변 도메인, 예를 들어, 공동으로 작동하는 가변 도메인, 예컨대, 동족 쌍 또는 친화도 성숙된 가변 도메인, 즉, VH 및 VL 쌍을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 공동으로 작동하는 가변 도메인은 상보체가 서로 및/또는 그 둘 모두가 Fv(VH/VL 쌍)가 해당 항원에 대하여 특이적인 것이 되도록 항원 결합에 기여하는 것인 가변 도메인이다.
본원에서 사용되는 바, "단일 도메인 항체"(이는 또한 본원에서 dab 및 sdAb로도 지치됨)란, 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 단일 도메인 항체의 예로는 VH 또는 VL 또는 VHH를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 탠덤-sdAb란, 링커, 예를 들어, 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 도메인 항체로서, 특히, 도메인 항체는 상이한 항원에 대하여 특이성을 가지는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 탠덤-sdAb-sdAb란, 2개의 링커, 예를 들어, 펩티드 링커에 의해 연결된 3개의 도메인 항체로서, 특히, 도메인 항체는 상이한 항원에 대하여 특이성을 가지는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, dsFv란, 가변 부위내 이황화 결합을 가지는 Fv를 지칭한다. dsFv는 더 큰 분자의 성분일 수 있고, 예를 들어, 가변 도메인 중 하나는 예를 들어, 아미노산 링커를 통해 다른 항체 단편/성분에 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, (dsFv)2란, 한 도메인이 예를 들어, 펩티드 링커 또는 이황화 결합(예를 들어, 2개의 VH의 C 말단 사이의 것)을 통해 제2 dsFv 중의 도메인에 연결된 것인 dsFv를 지칭하고, 상기 포맷은 하기 기술되는 (scFv)2와 유사하지만, 가변 영역의 각 쌍은 가변 영역내 이황화 결합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 성분이란, 본 개시내용의 다중특이적 분자의 빌디 블록 또는 그의 일부를 지칭하고, 특히, 성분은 항체 단편, 예컨대, scFv, Fab 또는 다른 단편이고, 특히, 본원에 기술된 것과 같은 것이다.
본원에서 사용되는 바, 단일 쇄 Fv 또는 "scFv"((single chain scFv)의 약칭)란, (예를 들어, 펩티드 링커에 의해) 연결되어 단일 폴리펩티드 쇄를 형성하는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 본 포맷에서는 생락된다.
본원에서 사용되는 바, dsscFv란, 가변내 영역 이황화 결합을 가지는 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 탠덤 scFv(이는 또한 본원에서 discFv 또는 (scFv)2로도 지칭됨)란, 예를 들어, 도 9a의 b에 제시된 바와 같이, 단일의 Fv간 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 연결된 2개의 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 탠덤 dsscFv(이는 또한 본원에서 scFvdsscFv 또는 dsscFvscFv로도 지칭됨)란, 예를 들어, 도 9a의 b에 제시된 바와 같이, 단일의 Fv간 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 연결되어 있고, 여기서, scFv 중 하나는 가변 영역내 이황화 결합을 가지는 것인, 2개의 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 탠덤 디dsscFv(이는 또한 본원에서 디dsscFv로도 지칭됨)란, 예를 들어, 도 9a의 b에 제시된 바와 같이, 단일의 Fv간 링커가 존재하도록 단일 링커를 통해 연결되어 있고, 여기서, 각 scFv는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인, 2개의 scFv를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, scFv-dsFv는 예를 들어, 펩티드 링커에 의해, 이황화 결합을 통해 연결되어 dsFv를 형성하는 2개의 가변 도메인으로 구성된 Fv 도메인에 연결된 scFv이다. 이 포맷에서, scFv의 VH 또는 VL은 dsFv의 VH 또는 VL에 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, dsscFv-dsFv는 예를 들어, 펩티드 링커에 의해, 이황화 결합을 통해 연결되어 dsFv를 형성하는 2개의 가변 도메인으로 구성된 Fv 도메인에 연결된 dsscFv이다. 이 포맷에서, dsscFv의 VH 또는 VL은 dsFv의 VH 또는 VL에 연결될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 디아바디란, 2개의 Fv간 링커를 가지며, 이로써, 제1 Fv의 VH는 제2 Fv의 VL에 연결되어 있고, 제1 Fv의 VL은 제2 Fv의 VH에 연결되어 있는 것인, 2개의 Fv 쌍 VH/VL을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, ds디아바디란, 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디ds디아바디란, 2개의 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는, 즉, 각 가변 영역 쌍 사이에 하나의 ds를 포함하는 디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, Sc-디아바디란, Fv내 링커를 포함하며, 이로써, 분자는 3개의 링커를 포함하고, 2개의 일반 scFv, VH1링커VL1 링커 VH2 링커 VL2를 포함하는 것인, 디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, dssc-디아바디는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 sc-디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디dssc-디아바디란, 각 가변 영역 쌍 사이에 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 sc-디아바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 다트(Dart)는 VH1 및 VH2의 C 말단이 이황화 결합에 의해 연결되어 있는 것인 VL1 링커 VH2 링커 및 VH1 링커 VL2를 지칭한다(문헌 [Paul A. Moore et al., Blood, 2011; 117(17):4542-4551]).
본원에서 사용되는 바, Bite®는 하기 포맷으로: 쌍 1로부터의 도메인(예컨대, VH1)이 링커를 통해 쌍 2로부터의 도메인(예컨대, VH2 또는 VL2)에 연결되어 있고, 상기 제2 도메인은 링커를 통해 쌍 1로부터의 추가 도메인(예컨대, VL1)에 연결됨으로써, 최종적으로는 쌍 2로부터의 남은 도메인(즉, VL2 또는 VH2)에 연결되어 있는 것인, 2개의 가변 도메인 쌍을 포함하는 분자를 지칭한다.
디-디아바디는 문헌 [Nunez-Prado et al.], 특히, 상기 문헌 도 1의 분자 번호 25번을 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, Ds디-디아바디는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 디-디아바디이다.
본원에서 사용되는 바, 디ds디-디아바디는 각 가변 영역 쌍 사이에 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 디-디아바디이다.
본원에서 사용되는 바, 트리아바디란, 3개의 Fv 및 3개의 Fv간 링커를 포함하는 디아바디와 유사한 포맷을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, ds트리아바디란, 가변 도메인 쌍 중 하나 사이에 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 트리아바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디ds트리아바디란, 2개의 가변 영역내 이황화 결합, 즉, 2개의 각 가변 도메인 쌍 사이에 한 ds씩을 포함하는 트리아바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 트리ds트리아바디란, 3개의 가변 영역내 이황화 결합, 즉, 각 가변 영역 쌍 사이에 한 ds씩을 포함하는 트리아바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 테트라바디란, 4개의 Fv 및 4개의 Fv간 링커를 포함하는 디아바디와 유사한 포맷을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, ds테트라바디란, 가변 도메인 쌍 중 하나 사이에 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 테트라바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디ds테트라바디란, 2개의 가변 영역내 이황화 결합, 즉, 2개의 각 가변 도메인 쌍 사이에 한 ds씩을 포함하는 테트라바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 트리ds테트라바디란, 3개의 가변 영역내 이황화 결합, 즉, 각 가변 영역 쌍 사이에 한 ds씩을 포함하는 테트라바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 테트라ds테트라바디란, 4개의 가변 영역내 이황화 결합, 즉, 각 가변 영역 쌍 사이에 한 ds씩을 포함하는 테트라바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 트리바디(Fab(scFv)2로도 또한 지칭됨)란, 제1 scFv가 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 제2 scFv가 중쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, ds트리바디란, 두 위치 중 한 위치에 dsscFv를 포함하는 트리바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디ds트리바디 또는 TrYbe란, 2개의 dsscFv를 포함하는 트리바디를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, dsFab란, 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, dsFab'란, 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 Fab'를 지칭한다.
scFab는 단일 쇄 Fab 단편이다.
scFab'는 단일 쇄 Fab' 단편이다.
dsscFab는 단일 쇄로서의 dsFab이다.
dsscFab'는 단일 쇄로서의 dsFab'이다.
본원에서 사용되는 바, Fabdab란, 도메인 항체가 임의적으로, 링커를 통해 중쇄 또는 경쇄에 부착되어 있는 Fab 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, Fab'dab란, 도메인 항체가 임의적으로, 링커를 통해 중쇄 또는 경쇄에 부착되어 있는 Fab' 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FabFv란, 추가의 가변 영역이 하기, 중쇄의 CH1 및 경쇄의 CL, 각각의 C 말단에 부착되어 있는 Fab 단편을 지칭한다(예를 들어, WO2009/040562 참조). 상기 포맷은 그의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다(예를 들어, WO2011/061492 참조),
본원에서 사용되는 바, Fab'Fv는 FabFv와 유사하며, 여기서, Fab 부분이 Fab'에 의해 대체되어 있다. 상기 포맷은 그의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, FabdsFv란, Fv내 이황화 결합이 첨부된 C 말단 가변 영역을 안정화시키는 것인 FabFv를 지칭한다(예를 들어, WO2010/035012 참조). 상기 포맷은 그의 PEG화된 버전으로서 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, Fab 단일 링커 Fv 및 Fab' 단일 링커란, 예를 들어, 펩티드 링커에 의해 가변 도메인에 연결되어 있는 Fab 또는 Fab' 단편을 지칭하며, 상기 가변 도메인은 가변 도메인내 이황화 결합을 통해 제2 가변 도메인에 연결됨으로써 dsFv를 형성한다(예를 들어, WO2014/096390 참조).
본원에서 사용되는 바, Fab-scFv(이는 또한 비바디로도 지칭됨)는 scFv가 임의적으로 링커를 통해 경쇄 또는 중쇄의 C 말단에 부착되어 있는 Fab 분자이다.
본원에서 사용되는 바, Fab'-scFv는 scFv가 임의적으로 링커를 통해 경쇄 또는 중쇄의 C 말단에 부착되어 있는 Fab' 분자이다.
본원에서 사용되는 바, FabdsscFv 또는 BYbe는 단일 쇄 Fv의 가변 영역 사이에 이황화 결합을 포함하는 Fab-scFv이다.
본원에서 사용되는 바, Fab'dsscFv는 단일 쇄 Fv의 가변 영역 사이에 이황화 결합을 포함하는 Fab'scFv이다.
본원에서 사용되는 바, FabscFv-dab란, scFv가 한 쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 도메인 항체가 나머지 다른 쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, Fab'scFv-dab란, scFv가 한 쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 도메인 항체가 나머지 다른 쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FabdsscFv-dab란, dsscFv가 한 쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 도메인 항체가 나머지 다른 쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, Fab'dsscFv-dab란, dsscFv가 한 쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 도메인 항체가 나머지 다른 쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FabscFv 단일 링커란, Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 또는 경쇄에 연결되어 있고, scFv가 다른 Fab 쇄에 연결되어 있고, Fv의 도메인이 가변 영역내 이황화에 의해 연결되어 있는 것인, Fab 단일 링커 Fv를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FabdsscFv 단일 링커 Fv란, scFv가 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 FabscFv 단일 링커 Fv를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, Fab'scFv 단일 링커라, Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 또는 경쇄에 연결되어 있고, scFv가 다른 Fab 쇄에 연결되어 있고, Fv의 도메인이 가변 영역내 이황화에 의해 연결되어 있는 것인, Fab' 단일 링커 Fv를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, Fab'dsscFv 단일 링커 Fv란, scFv가 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab'scFv 단일 링커 Fv를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FvFabFv란, 제1 Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있고, 제2 Fv의 도메인이 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FvFab'Fv란, 제1 Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있고, 제2 Fv의 도메인이 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, dsFvFabFv란, 제1 Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있고, 여기서, 제1 Fv는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하고, 제2 Fv의 도메인은 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있는 것인 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FvFabdsFv란, 제1 Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있고, 제2 Fv의 도메인이 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 여기서, 제2 Fv는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, dsFvFab'Fv란, 제1 Fv의 도메인이 Fab'의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있고, 여기서, 제1 Fv는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하고, 제2 Fv의 도메인이 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FvFab'dsFv란, 제1 Fv의 도메인이 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있고, 제2 Fv의 도메인이 Fab'의 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 여기서, 제2 Fv는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, dsFvFabdsFv란, 제1 Fv의 도메인이 Fab의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있고, 여기서, 제1 Fv는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하고, 제2 Fv의 도메인이 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 제2 Fv 또한 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, dsFvFab'dsFv란, 제1 Fv의 도메인이 Fab'의 중쇄 및 경쇄의 N 말단에 부착되어 있고, 여기서, 제1 Fv는 가변 영역내 이황화 결합을 포함하고, 제2 Fv의 도메인이 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 제2 Fv 또한 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FabFvFv란, 2개의 Fv 쌍이 연속하여 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab 단편을 지칭한다(예를 들어, WO2011/086091 참조).
본원에서 사용되는 바, Fab'FvFv란, 2개의 Fv 쌍이 연속하여 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있는 것인 Fab' 단편을 지칭한다(예를 들어, WO2011/086091 참조).
본원에서 사용되는 바, FabdsFvFv란, 2개의 Fv 쌍이 연속하여 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, C 말단에 직접적으로 부착되어 있는 제1 Fv 쌍이 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab 단편을 지칭한다(예를 들어, WO2011/086091 참조).
본원에서 사용되는 바, Fab'dsFvFv란, 2개의 Fv 쌍이 연속하여 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, C 말단에 직접적으로 부착되어 있는 제1 Fv 쌍이 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab' 단편을 지칭한다(예를 들어, WO2011/086091 참조).
본원에서 사용되는 바, FabFvdsFv란, 2개의 Fv 쌍이 연속하여 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 여기서, 분자의 "C" 말단의 제2 Fv 쌍이 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, Fab'FvdsFv란, 2개의 Fv 쌍이 연속하여 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 여기서, 분자의 "C" 말단의 제2 Fv 쌍이 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab' 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, FabdsFvdsFv란, 2개의 Fv 쌍이 연속하여 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 여기서, 제1 및 제2 Fv 쌍이 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, Fab'dsFvdsFv란, 2개의 Fv 쌍이 연속하여 중쇄 및 경쇄의 C 말단에 부착되어 있고, 여기서, 제1 및 제2 Fv 쌍이 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인 Fab' 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디Fab란, 그의 중쇄의 C 말단을 통해 연결되어 있는 2개의 Fab 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디Fab'란, 그의 중쇄의 C 말단을 통해 연결되어 있는 2개의 Fab' 분자를 지칭한다.
디Fab 및 디Fab' 분자는 그의 화학적으로 컨쥬게이션된 형태를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, (FabscFv)2란, 2개의 scFv가 그에 부착되어 있는, 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄, 예컨대, 중쇄의 C 말단에 부착되어 있는 디Fab 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, (Fab'scFv)2란, 2개의 scFv가 그에 부착되어 있는, 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄, 예컨대, 중쇄의 C 말단에 부착되어 있는 디Fab' 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, (Fab)2scFvdsFv란, scFv 및 dsFv가 부착되어 있는, 예를 들어, 각 중쇄 C 말단으로부터의 것에 부착되어 있는 디Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, (Fab')2scFvdsFv란, scFv 및 dsFv가 부착되어 있는, 예를 들어, 각 중쇄 C 말단으로부터의 것에 부착되어 있는 디Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, (Fab)2dsscFvdsFv란, dsscFv 및 dsFv가 부착되어 있는, 예를 들어, 중쇄 C 말단으로부터의 것에 부착되어 있는 디Fab를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, (Fab')2dsscFvdsFv란, dsscFv 및 dsFv가 부착되어 있는, 예를 들어, 중쇄 C 말단으로부터의 것에 부착되어 있는 디Fab'를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 미니바디란 (VL/VH-CH3)2를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, ds미니바디란, 한 VL/VH가 가변 영역내 이황화 결합을 포함하는 것인, (VL/VH-CH3)2를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디ds미니바디란, (dsFv-CH3)2를 지칭한다.
카파/람다 소체' 또는 'κ/λ-소체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 가지는 일반 IgG의 포맷이며, 여기서, 2개의 경쇄는 서로 상이하고, 하나는 람다 경쇄(VL - CL)이고, 나머지 다른 하나는 카파 경쇄(VK-CK)이다.　WO2012/023053에 기술되어 있는 바와 같이, 중쇄는 심지어 CDR에서도 동일하다.　
본원에서 사용되는 바, scFv-Fc란, 예를 들어, 힌지를 통해 불변 영역 단편의 CH2 도메인의 N 말단에(-(CH2CH3)) 부착된 scFv를 지칭하며, 이로써, 상기 분자는 2개의 결합 도메인을 가지게 된다.
본원에서 사용되는 바, dsscFv-Fc란, dsscFv가 CH2 도메인의 N 말단에 부착되어 있고, scFv가 예를 들어, 힌지를 통해 불변 영역 단편의 제2 CH2 도메인의 N 말단에(-(CH2CH3)2) 부착되고 있고, 이로써, 상기 분자는 2개의 결합 도메인을 가지게 되는 것인 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 디dsscFv-Fc란, 예를 들어, 힌지를 통해 불변 영역 단편의 CH2 도메인의 N 말단에(-(CH2CH3)2) 부착된 scFv를 지칭하며, 이로써, 상기 분자는 2개의 결합 도메인을 가지게 된다.
본원에서 사용되는 바, 탠덤 scFv-Fc란, 각각의 탠덤 scFv가 예를 들어, 힌지를 통해 불변 영역 단편의 CH2 도메인의 N 말단(-(CH2CH3)2)에 연속하여 부착된 것인 2개의 탠덤 scFv를 지칭하며, 이로써, 상기 분자는 4개의 결합 도메인을 가지게 된다.
본원에서 사용되는 바, Sc디아바디-Fc는 각각의 sc디아바디가 예를 들어, 힌지를 통해 불변 영역 단편의 CH2 도메인의 N 말단(-CH2CH3)에 부착된 것인 2개의 sc디아바디이다.
본원에서 사용되는 바, ScFv-Fc-scFv란, scFv 각각이 -CH2CH3 단편의 중쇄 및 경쇄, 둘 모두의 N 말단 및 C 말단에 부착된 것인 4개의 scFv를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, Sc디아바디-CH3이란, 각각이 예를 들어, 힌지를 통해 CH3 도메인에 연결된 것인 2개의 sc디아바디 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, IgG-scFv는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C 말단 상에 scFv를 포함하는 전장의 항체이다.
본원에서 사용되는 바, scFv-IgG는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N 말단 상에 scFv를 포함하는 전장의 항체이다.
본원에서 사용되는 바, V-IgG는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 N 말단 상에 가변 도메인을 포함하는 전장의 항체이다.
본원에서 사용되는 바, IgG-V는 각각의 중쇄 또는 각각의 경쇄의 C 말단 상에 가변 도메인을 포함하는 전장의 항체이다.
DVD-Ig(이는 또한 이중 V 도메인 IgG로도 공지됨)는 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄의 N 말단 상에 하나씩 4개의 추가의 가변 도메인을 포함하는 전장의 항체이다.
본원에서 사용되는 바, 듀오바디 또는 'Fab-아암 익스체인지'란, 상이한 두 모노클로날 항체의 불변 도메인(전형적으로, CH3) 중의 매칭되고, 상보적인 조작된 아미노산 변이가 혼합시, 이종이량체 형성을 유도하는 것인, 이중특이적 IgG 포맷 항체이다. 잔기 조작 결과, 제1 항체로부터의 중쇄:경쇄 쌍은 제2 항체의 중쇄:경쇄 쌍과 회합하는 것을 선호하게 될 것이다. 예를 들어, WO2008/119353, WO2011/131746 및 WO2013/060867을 참조할 수 있다.
다중특이적 항체 분자 중 가변 영역의 하나 이상의 쌍이 VH와 VL 사이에 이황화 결합을 포함하는 경우, 이는 임의의 적합한 위치에, 예컨대, 하기 열거되는 잔기 중 둘 사이에 존재할 수 있다(문맥상 달리 명시되지 않는 한, 하기 목록에서 카바트(Kabat) 번호매김이 사용된다). 카바트 번호매김에 관해 언급하는 모든 경우에서 관련된 참고문헌은 문헌 [Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA]이다.
한 실시양태에서, 이황화 결합은
· VH37 + VL95C(예를 들어, 문헌 [Protein Science 6, 781-788 Zhu et al., (1997)] 참조);
· ΧH44 + VL100(예를 들어, 문헌 [Biochemistry 33 5451-5459 Reiter et al., (1994)]; 또는 [Journal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp.18327-18331 Reiter et al., (1994)]; 또는 [Protein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453-1459 Rajagopal et al., (1997)] 참조);
· ΧH44 + VL105(예를 들어, 문헌 [J Biochem. 118, 825-831 Luo et al., (1995)] 참조);
· ΧH45 + VL87(예를 들어, 문헌 [Protein Science 6, 781-788 Zhu et al., (1997)] 참조);
· ΧH55 + VL101(예를 들어, 문헌 [FEBS Letters 377 135-139 Young et al., (1995)] 참조);
· ΧH100 + VL50(예를 들어, 문헌 [Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al., (1990)] 참조);
· VH100b + VL49;
· ΧH98 + VL 46(예를 들어, 문헌 [Protein Science 6, 781-788 Zhu et al., (1997)] 참조);
· ΧH101 + VL46;
· ΧH105 + VL43(예를 들어, 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al., (1993)]; 또는 [Proteins 19, 35-47 Jung et al., (1994)] 참조);
· VH106 + VL57(예를 들어, 문헌 [FEBS Letters 377 135-139 Young et al., (1995)] 참조)을 포함하는 군으로부터 선택되는 위치; 및
상기 분자 중에 위치하는 가변 영역 쌍 중 그에 상응하는 위치에 존재한다.
한 실시양태에서, 이황화 결합은 위치 VH44와 VL100 사이에 형성된다.
본원에서 사용되는 바, "단일특이적"이란, 한번에 오직 단 하나의 표적 항원에 결합할 수 있는 능력을 의미한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 분자는 각 항원에 대하여 단일특이적이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다중특이적 분자의 결합 도메인은 단일특이적이다. 이는 일부 치료학적 적용에 있어서, 본 개시내용의 분자는 1회 초과로 표적 항원에 결합함으로써 항원과 교차 결합하지는 못하기 때문에 이롭다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 또는 다중특이적 분자는 예를 들어, 같은 세포 상의 또는 2개의 상이한 세포 상의 상이한 두 위치에서 동일한 표적에 2회 결합함으로써 교차 결합하지는 못한다.
특히, 같은 세포 상의 또는 상이한 세포 상의 CD79b와 관련하여 교차 결합은 생체내에서 신호를 발생시킬 수 있고, 예를 들어, 이는 표적 항원의 활성을 자극시킨다.
한 예에서, 본 발명의 다중특이적 분자는 CD22에 대하여 1개 이하의 결합 도메인 및 CD79에 대하여 1개 이하의 결합 도메인을 포함한다. 각 결합 도메인은 단일특이적이다.
그러므로, 한 예에서, 다중특이적 분자는 CD22에 대하여 1가이고, CD79에 대하여 1가이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자에서 사용되는 각 항체 또는 항체 단편은 1가이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자의 결합 도메인은 1가이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자의 결합 도메인은 1가이고, 단일특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자는 예를 들어, 본원 상기에서 기술된 바와 같이, 다중특이적 분자를 구성하기 위해 임의의 적합한 방식으로 조합 또는 연결된, 2개 이상의 단일특이적, 1가 결합 도메인, 예컨대, Fab, Fab', scFv, VH, VL, VHH, Fv, dsFv로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 본 개시내용의 분자가 3개 이상의 결합 도메인을 포함하는 경우, 이때 2개 또는 3개의 결합 도메인(예를 들어, 항체, 단편 또는 항체 및 단편의 조합)은 예를 들어, 3개의 상이한 표적 항원에의 결합과 같은, 상이한 항원 특이성을 가질 수 있다.
불변 영역
본 개시내용의 다중특이적 분자의 항체 불변 영역 도메인은 다중특이적 항체 분자의 제안된 기능을 고려하여, 및 특히, 요구될 수 있는 이펙터 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 인간 IgG 불변 영역 도메인이 사용될 수 있고, 특히, 항체 분자가 치료학적 용도로 의도되고, 항체 이펙터 기능이 필요한 경우에는 IgG1 및 IgG3 이소형의 것이 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료학적 용도로 의도되고, 항체 이펙터 기능이 요구되지 않는 경우에는 IgG2 및 IgG4 이소형이 사용될 수 있다.
상기 불변 영역 도메인의 서열 변이체 또한 사용될 수 있다는 것도 이해할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108]에 기술된 바와 같이, 241번 위치의 세린이 프롤린으로 변이된 IgG4 분자가 사용될 수 있다. 따라서, 항체가 IgG4 항체인 실시양태에서, 항체는 돌연변이 S241P를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 CL 도메인(카파 또는 람다)을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 CL 도메인(카파 또는 람다)을 포함한다.
4개의 인간 IgG 이소형이 활성화 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 억제성 FcγRIIb 수용체, 및 보체 제1 성분(C1q)과 상이한 친화도로 결합하여 매우 상이한 이펙터 기능을 발휘한다(문헌 [Bruhns P. et al., 2009. Specificity and affinity of human Fcgamma receptors and their polymorphic variants for human IgG subclasses. Blood. 113(16):3716-25])(문헌 [Jeffrey B. Stavenhagen, et al.　Cancer Research 2007 Sep 15; 67(18):8882-90] 또한 참조).
IgG의 FcγR 또는 C1q에의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치하는 잔기에 의존한다. CH2 도메인의 두 영역은 FcγR 및 C1q 결합에 중요하고, IgG2 및 IgG4에 독특한 서열을 가진다. IgG2의 233-236번 위치에서의, 및 IgG4의 327, 330 및 331번 위치에서의 인간 IgG1로의 치환은 ADCC 및 CDC를 크게 감소시키는 것으로 나타났다(문헌 [Armour KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 29(8):2613-24] 및 [Shields RL. et al., 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 276(9):6591-604]). 추가로, (Idusogie) 등은 K322를 비롯한, 상이한 위치에서의 알라닌 치환이 보체 활성화를 유의적으로 감소시켰다는 것을 입증하였다(문헌 [Idusogie EE. et al., 2000. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc. J Immunol. 164(8):4178-84]). 유사하게, 뮤린 IgG2A의 CH2 도메인에서의 돌연변이는 FcγRI, 및 C1q에의 결합을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol. 155(3):1165-74]).
한 실시양태에서, 사용된 Fc 영역은 돌연변이화된 것, 특히, 본원에 기술된 돌연변이이다. 한 실시양태에서, 돌연변이는 결합 및/또는 이펙터 기능을 제거하는 것이다.
한 실시양태에서, Fc 돌연변이는 Fc 영역의 결합을 제거하는 돌연변이, 이펙터 기능을 증가 또는 제거하는 돌연변이, 반감기를 증가시키는 돌연변이, 및 상기의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
pH 7.4가 아닌, pH 6.0에서 FcRn에 선택적으로 결합하는 일부 항체는 다양한 동물 모델에서 더 높은 반감기를 나타낸다. CH2와 CH3 도메인 사이의 경계부에 위치하는 수개의 돌연변이, 예컨대, T250Q/M428L(문헌 [Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279(8):6213-6]) 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F(문헌 [Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. Nat Biotechnol. 23(10):1283-8])는 시험관내에서 FcRn에의 결합 친화도 및 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
그러나, FcRn 결합 증가와 반감기 개선 사이에 항상 직접적인 관련이 있는 것은 아니다(문헌 [Datta-Mannan A. et al., 2007. Humanized IgG1 Variants with Differential Binding Properties to the Neonatal Fc Receptor: Relationship to Pharmacokinetics in Mice and Primates. Drug Metab. Dispos. 35: 86 - 94]).
IgG4 서브클래스는 감소된 Fc 수용체(FcγRIIIa) 결합을 보인다. 다른 IgG 서브클래스의 항체는 일반적으로 강한 결합을 보인다. 이들 다른 IgG 서브타입에서 감소된 수용체 결합은 예를 들어, Pro238, Aps265, Asp270, Asn270 (loss of Fc carbohydrate), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 변경, 예를 들어, 대체함으로써 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 분자는 Fc가 하기 위치, S228, L234 및/또는 D265 중 1, 2, 또는 그들 모두의 위치에서 돌연변이화된, S228, L234 및/또는 D265의 Fc를 가진다.
한 실시양태에서, Fc 영역의 돌연변이는 독립적으로 S228P, L234A, L235A, L235A, L235E 및 그의 조합으로부터 선택된다.
Fc 영역의 이펙터 기능을 감소 또는 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 이펙터 기능을 파기하면서, 세포 표면 분자, 특히, 면역 세포 상에 있는 것을 표적화하는 항체가 요구된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 자가면역 치료의 경우, 음성 Fc 수용체 결합(FcγRIIb 또는 CD32b)을 증가시킴으로써 면역 세포 상의 Fc 결합을 증진시키는 것이 바람직할 수 있다(문헌 [Stavenhagen JB, et al　　Advances in　Enzyme Regulation 2007 December 3 and Veri MC, et al. Arthritis Rheum, 2010 Mar 30;62(7):1933-43] 참조). 반대로, 종양학적 용도의 항체인 경우, 이펙터 기능을 증가시키면, 치료학적 활성은 개선될 수 있다.
인간 IgG1의 CH2 도메인에서 다수의 돌연변이화가 이루어질 수 있으며, 그가 ADCC 및 CDC에 미치는 효과가 시험관내에서 시험될 수 있다(문헌 [Idusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol. 166(4):2571-5). 특히, 333번 위치에서의 알라닌 치환이 ADCC 및 CDC, 둘 모두를 증가시키는 것으로 보고되었다. (Lazar) 등은 FcγRIIIa에 대하여 더 높은 친화도를 가지고, FcγRIIb에 대하여 더 낮은 친화도를 가짐으로써 증진된 ADCC를 보이는 삼중 돌연변이체(S239D/I332E/A330L)를 기술하였다(문헌 [Lazar GA. et al., 2006. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. PNAS 103(11): 4005-4010]). 같은 돌연변이를 사용하여 ADCC가 증가된 항체를 생성하였다(문헌 [Ryan MC. et al., 2007. Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells. Mol. Cancer Ther., 6: 3009 - 3018]). (Richards) 등은 FcγRIIIa 친화도가 개선되고, 대식세포에 의해 표적 세포의 증강된 포식작용을 매개하는 FcγRIIa/FcγRIIb 비를 연구하였다(문헌 [Optimization of antibody binding to Fcgamma RIIa enhances macrophage phagocytosis of tumor cells. Mol Cancer Ther. 7(8):2517-27]).
그의 이펙터 기능이 결여되어 있기 때문에, IgG4 항체는 세포 고갈 없이 수용체를 차단시키는 데 적합한 IgG 서브클래스임을 나타낸다. IgG4 분자는 Fab-아암 익스체인지로 명명되는, 동력학적 프로세스에서 분자 절반부를 교체할 수 있다. 이러한 현상은 치료학적 항체와 내인성 IgG4 사이에 발생할 수 있다. S228P 돌연변이는 이러한 재조합 프로세스를 방해함으로써 예측이 불가능한 치료학적 IgG4 항체를 더 소량으로 디자인할 수 있는 것으로 밝혀졌다(문헌 [Labrijn AF. et al., 2009. Therapeutic IgG4 antibodies engage in Fab-arm exchange with endogenous human IgG4 in vivo. Nat Biotechnol. 27(8):767-71]). 이 기술은 이중특이적 항체 분자를 생성하는 데 사용될 수 있다.
항체에서는 다양한 번역 후 변형이 이루어질 수 있다는 것 또한 당업제는 이해할 것이다. 이러한 변형의 유형 및 정도는 대개 항체를 발현시키는 데 사용되는 숙주 세포주 뿐만 아니라, 배양 조건에 의존한다. 상기 변형으로는 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변이를 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 (문헌 [Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기술되어 있는 바와 같이) 카복시펩티다제의 작용에 기인하는, 카복시 말단 염기성 잔기(예컨대, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다. 따라서, 항체 중쇄의 C 말단 리신은 존재하지 않을 수 있다.
친화도
본 발명의 다중특이적 분자는 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 결합 도메인은 CD22에 특이적인 것이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 결합 도메인은 CD79a에 특이적인 것이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 결합 도메인은 CD79b에 특이적인 것이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 결합 도메인은 CD79 복합체에 특이적인 것이며, 즉, 이는 복합체에 존재하고, 그에 특이적인 에피토프, 예를 들어, CD79a와 CD79b 사이의 상호작용을 포함하는 에피토프를 인식하다.
(분화 클러스터 22로도 공지되어 있는) CD22는 공지된 단백질이다. CD22는 B 세포 수용체(BCR: B cell receptor)의 억제성 공수용체이고, B 세포 활성화를 위한 신호전달 역치를 확립하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 인간 서열은 유니프로트(UniProt) 엔트리 번호 P20273(서열 번호: 161 및 신호 펩티드를 포함하지 않는 경우, 서열 번호: 161의 아미노산 20-847)에서 이용가능하다. 뮤린 버전은 유니프로트 엔트리 P35329이다. 본 개시내용은 임의 종, 특히, 인간으로부터의 모든 형태의 CD22 및 그의 천연 변이체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CD22는 인간 형태의 단백질을 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 CD22에 대한 결합 도메인의 친화도는 약 100 nM 또는 더 강력하고, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM 또는 더 강력하고, 특히, 결합 친화도는 50 pM 또는 더 강력하다.
CD79에 대한 결합 도메인은 CD79a 및/또는 CD79b에 결합할 수 있다.
(면역글로불린 알파 및 B 세포 항원 수용체 복합체 결합 단백질 알파 쇄로도 공지된) CD79a는 공지된 단백질이다. CD79a의 발현은 B 림프구로 제한된다. 인간 서열은 유니프로트에서 엔트리 P11912하에(서열 번호: 162 및 신호 서열이 없는 경우, 서열 번호: 162의 아미노산 33-226)에서 이용가능하다. 뮤린 버전은 유니프로트에서 엔트리 11911하에 이용가능하다. 본 개시내용은 임의 종, 특히, 인간으로부터의 모든 형태의 CD79a 및 그의 임의의 천연 변이체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CD79a는 인간 형태의 단백질을 지칭한다.
(면역글로불린 결합 베타 및 분화 클러스터 79B로도 공지된) CD79b는 공지된 단백질이다. CD79b의 발현은 B 림프구로 제한된다. 인간 서열은 유니프로트에서 엔트리 P40259하에(서열 번호: 163 및 신호 서열이 없는 경우, 서열 번호: 163의 아미노산 29-229)에서 이용가능하다. 뮤린 버전은 유니프로트에서 엔트리 P15530하에 이용가능하다. 본 개시내용은 임의 종, 특히, 인간으로부터의 모든 형태의 CD79b 및 그의 임의의 천연 변이체에 관한 것이다. 한 실시양태에서, CD79b는 인간 형태의 단백질을 지칭한다.
한 실시양태에서, CD79에 대해 특이적인 결합 도메인은 CD79a에 결합한다.
한 실시양태에서, CD79에 대해 특이적인 결합 도메인은 CD79b에 결합한다.
한 실시양태에서, CD79에 대해 특이적인 결합 도메인은 CD79a 및 CD79b의 복합체에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 CD79에 대한 결합 도메인의 친화도는 약 100 nM 또는 더 강력하고, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM 또는 더 강력하고, 특히, 결합 친화도는 50 pM 또는 더 강력하다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 CD79a에 대한 결합 도메인의 친화도는 약 100 nM 또는 더 강력하고, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM 또는 더 강력하고, 특히, 결합 친화도는 50 pM 또는 더 강력하다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 CD79b에 대한 결합 도메인의 친화도는 약 100 nM 또는 더 강력하고, 예컨대, 약 50 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 250 pM, 200 pM, 100 pM 또는 더 강력하고, 특히, 결합 친화도는 50 pM 또는 더 강력하다.
CD22에 대한 결합 도메인의 친화도는 CD79에 대한 결합 도메인의 친화도와 동일하거나, 또는 그와 상이할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 항체 분자 또는 그의 항체/단편 성분은 표적 항원 또는 항원들에 대한 친화도 개선을 위해 프로세싱된다. 상기 변이체는 CDR의 돌연변이화(문헌 [Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995]), 쇄 셔플링(문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992]), E. 콜라이(E. coli) 균주의 돌연변이 유발 유전자 이용(문헌 [Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996]), DNA 셔플링(문헌 [Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997]), 파지 디스플레이(문헌 [Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996]) 및 성적 PCR(문헌 [Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998])을 비롯한, 다수의 친화도 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다. (Vaughan) 등(상기 문헌 동일)은 이러한 친화도 성숙 방법을 논의하였다.
항체 & 항체 생성
본 발명에서 사용하기 위한 결합 도메인은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, CDR을 상업적으로 이용가능한 항체를 비롯한, 비인간 항체로부터 채취할 수 있고, 이를 인간 프레임워크 내로 이식시킬 수 있거나, 또는 대안적으로, 비인간 가변 영역 및 인간 불변 영역 등을 이용하여 키메라 항체를 제조할 수 있다.
전형적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 결합 도메인은 선택된 항원에 결합하는 항체, 예컨대, CD22, CD79a 및/또는 CD79b에 결합하는 항체로부터 유래된 결합 도메인이다.
CD22 및 CD79 항체의 예는 당업계에 공지되어 있고, 이는 본 발명의 분자에서 직접 사용될 수 있거나, 또는 본원에 기술된 방법을 사용하여 적합성에 대하여 스크리닝된 후, 이어서, 필요에 따라 변형될 수 있으며, 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 사용하여 인간화될 수 있다. 진료소에서의 CD22 항체의 예로는 에프라투주맙 및 이노투주맙을 포함한다. 예를 들어, US2003202975 및 WO14011520에 개시된 항CD22 항체, 및 WO14011521 및 WO15021089에 개시된 항CD79b 항체와 같이, 다른 치료학적 항체도 당업계에 기술되어 있다. 비인간 항CD22 항체로는 클론 SP104로부터의 토끼 모노클로날 항체 LS-C2210357(LS바이오(LSBio)), 클론 4C3으로부터의 마우스 모노클로날 LS-C174778, 마우스 모노클로날 LS-C4802, 클론 1B1로부터의 마우스 모노클로날 LS-B9996, 클론 2E6으로부터의 마우스 모노클로날 LS-C340404, 마우스 모노클로날 LS-C312263, 마우스 모노클로날 LS-C152867, 마우스 모노클로날 LS-C87523, 클론 FRB4로부터의 마우스 모노클로날 LS-C134333, 마우스 모노클로날 LS-C134336, 클론 HIB22로부터의 마우스 모노클로날 LS-C40961, 마우스 모노클로날 LS-C134332, 산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology)로부터의 하기 항체 sc-271579, sc-377304, sc-7032, sc-18909, sc-7932, sc-7323, sc-7307, sc-7031, sc-20053, sc-189000, sc-136440, sc-136507, sc-53031, sc-73363, sc-53032, 에이비캠(Abcam) 토끼 모노클로날 Ab33859(EP498Y), 마우스 모노클로날 항체 AA 1-687 카탈로그 번호 ABIN1999423, 클론 HIB22로부터의, 바이오레전드 워크샵 번호 V CD22.14로부터의 마우스 모노클로날을 포함한다.
상업적으로 이용가능한 항CD79a 항체로는 클론 HM57로부터의 마우스 모노클로날 LS-B4504(LS바이오), 마우스 모노클로날 LS-B8330, 마우스 모노클로날 LS-C44954, 토끼 모노클로날 LS-B9093, 클론 JCB117로부터의 마우스 모노클로날 LS-B8513, 클론 SP18로부터의 토끼 모노클로날 LS-C210607, 클론 5E2로부터의 마우스 모노클로날 LS-C175441, 클론 3D3으로부터의 마우스 모노클로날 LS-C338670, 클론 HM47/A9로부터의 마우스 모노클로날 LS-C88120, 마우스 모노클로날 LS-C191714, 마우스 모노클로날 LS-C87592, 마우스 모노클로날 LS-C44955, 마우스 모노클로날 LS-C95934, 마우스 모노클로날 LS-C121584, 마우스 모노클로날 LS-C121585, 마우스 모노클로날 LS-C204347, 마우스 모노클로날 LS-C88122, 에이비캠 마우스 모노클로날 ab3121[HM47/A9], 토끼 모노클로날 ab79414, 및 토끼 모노클로날 ab133483을 포함한다.
상업적으로 이용가능한 CD79b 항체로는 마우스 모노클로날 에이비캠 항체 ab33295, 래트 모노클로날 ab23826, 마우스 모노클로날 ab103422, 토끼 모노클로날 ab134103, 토끼 모노클로날 ab134147, 및 토끼 모노클로날 ab183343을 포함한다.
상기 상업적으로 이용가능한 항체는 추가의 치료학적 항체를 발견하는 데 있어서 유용한 도구가 될 수 있다.
당업자는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 본 발명의 다중특이적 분자에서 사용하기 위한 항체를 생성할 수 있다.
항체를 생성하는 데 사용하기 위한, 예를 들어, 숙주를 면역화시키는 데 사용하기 위한, 또는 예컨대, 파지 디스플레이에서의 패닝에서 사용하기 위한 항원 폴리펩티드는 당업계에 널리 공지된 프로세스에 의해 발현 시스템을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로부터 제조될 수 있거나, 또는 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. 본 출원에서, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 이들은 달리 언급되지 않는 한, 상호교환적으로 사용된다. 일부 경우에서, 항원 폴리펩티드는 더 큰 단백질, 예컨대, 융합 단백질, 예를 들어, 친화도 태그 등에 융합된 융합 단백질의 일부분일 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주는 세포, 예컨대, 섬유아세포로 면역화되거나, 관련된 단백질 또는 폴리펩티드로 형질감염되거나, 예를 들어, CD79a 및 CD79b로 공동 형질감염될 수 있다.
항원 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 동물의 면역화가 필요할 경우, 널리 공지된 통상의 프로토콜을 사용하여 폴리펩티드를 동물, 바람직하게, 비인간 동물에게 투여함으로써 수득될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986] 참조). 다수의 온혈 동물, 예컨대, 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지를 면역화시킬 수 있다. 그러나, 일반적으로는 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 가장 적합하다.
모노클로날 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대, 하이브리도마 기술(문헌 [Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]), 트리오마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술(문헌 [Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72]) 및 EBV-하이브리도마 기술(문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985])에 의해 제조될 수 있다.
항체는 또한 문헌 [Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-7848l]; WO92/02551; WO2004/051268 및 WO2004/106377에 기술된 것과 같은 방법에 의해 특이적인 항체 제조를 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝 및 발현시킴으로써 단일 림프구 항체 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
본 개시내용에서 사용하기 위한 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있고, 이는 (Brinkman) 등(문헌 [J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50]), (Ames) 등(문헌 [Immunol. Methods, 1995, 184:177-186]), (Kettleborough) 등(문헌 [Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958]), (Persic) 등(문헌 [Gene, 1997 187 9-18]), (Burton) 등(문헌 [Advances in Immunology, 1994, 57:191-280]) 및 WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 5,969,108, 및 WO20011/30305에 의해 개시된 방법을 포함한다.
한 예에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자는 완전한 인간 분자이고, 특히, 가변 도메인 중 하나 이상의 것은 완전한 인간 분자이다.
완전한 인간 분자는 중쇄 및 경쇄, 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역(존재할 경우) 모두 인간 기원의 것이거나, 또는 반드시 같은 항체로부터의 것일 필요는 없으며, 인간 기원의 서열과 실질적으로 동일한 것인 분자이다. 완전한 인간 분자의 예로는 예를 들어, 상기 기술된 파지 디스플레이 방법에 의해 제조된 항체, 및 뮤린 면역글로불린 가변 및 임의적으로 불변 영역 유전자가 그의 인간 카운터파트에 의해 대체된 것인, 마우스에 의해 제조된 항체, 예컨대, 일반 용어로 EP0546073, US5,545,806, US5,569,825, US5,625,126, US5,633,425, US5,661,016, US5,770,429, EP 0438474 및 EP0463151에 기술되어 있는 바와 같은 것을 포함할 수 있다.
한 예에서, 본 개시내용에 따른 다중특이적 분자의 결합 도메인은 인간화 결합 도메인이다.
본원에서 사용되는 바, (CDR-이식된 항체를 포함하는) 인간화 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 가지는 분자를 지칭한다(예컨대, US 5,585,089; WO91/09967 참조). 이는 단지 전체 CDR보다는 CDR의 특이성 결정 잔기를 전달하는 데에만 오직 필요할 수 있다는 것을 이해할 것이다(예를 들어, 문헌 [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 인간화 항체는 임의적으로 CDR의 유래 기점이 된 비인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "인간화 항체 분자"라는 용어는 중쇄 및/또는 경쇄가, 어셉터 항체(예컨대, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 프레임워크 내로 이식된, 도너 항체(예컨대, 뮤린 모노클로날 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(원하는 경우, 하나 이상의 변형된 CDR 포함)을 함유하는 것인, 항체 분자를 지칭한다. 리뷰를 위해, 문헌 [Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조할 수 있다. 한 실시양태에서, 전체 CDR을 전달하기보다는, 단지 본원 상기에서 기술된 CDR 중 어느 하나로부터의 특이성 결정 잔기 중 하나 이상의 것만을 인간 항체 프레임워크로 전달한다(예를 들어, 문헌 [Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34] 참조). 한 실시양태에서, 단지 본원 상기에서 기술된 CDR 중 하나 이상의 것으로부터의 특이성 결정 잔기만을 인간 항체 프레임워크로 전달한다. 또 다른 실시양태에서, 단지 본원 상기에서 기술된 각 CDR로부터의 특이성 결정 잔기만을 인간 항체 프레임워크로 전달한다.
CDR 또는 특이성 결정 잔기를 이식할 때, 마우스, 영장류 및 인간 프레임워크 영역을 비롯한, CDR 유래 기점이 되는 도너 항체의 부류/유형을 고려하여, 임의의 적절한 어셉터 가변 영역 프레임워크 서열이 사용될 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체는 인간 어셉터 프레임워크 영역 뿐만 아니라, 본원에서 제공하는 CDR 중 하나 이상의 것을 포함하는 가변 도메인을 가진다.
본 개시내용에서 사용될 수 있는 인간 프레임워크의 예로는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이 있다(문헌 [Kabat et al., 상기 문헌 동일]). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 대해 사용될 수 있고, REI는 경쇄에 대해 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄, 둘 모두에 대해 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식계열 서열이 사용될 수 있고; http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php에서 이용가능하다.
본 개시내용의 인간화 항체 분자에서, 어셉터 중쇄 및 경쇄는 반드시 같은 항체로부터 유래되어야 할 필요는 없고, 원하는 경우, 상이한 쇄로부터 유래된 프레임워크 영역을 가지는 복합 쇄를 포함할 수 있다.
프레임워크 영역이 어셉터 항체의 것과 정확하게 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 특이한 잔기는 상기 어셉터 쇄 부류 또는 유형에 대하여 더욱 빈번하게 존재하는 잔기로 변이될 수 있다. 대안적으로, 어셉터 프레임워크 영역 중의 선택된 잔기는 상기 잔기가 도너 항체 중의 같은 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 변이될 수 있다(문헌 [Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324] 참조). 상기 변이는 도너 항체의 친화도를 회복하는 데 필요한 정도로 최소한으로 유지되어야 한다. 변이시켜야 할 필요가 있을 수 있는 어셉터 프레임워크 영역 중의 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 WO91/09967에 기재되어 있다.
프레임워크의 유도체는 대체 아미노산, 예를 들어, 도너 잔기로 대체된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산을 포함할 수 있다.
도너 잔기는 도너 항체, 즉, CDR이 원래 유래된 것인 항체로부터의 잔기이고, 특히, 도너로부터의 상응하는 위치에 있는 잔기는 채용된다. 도너 잔기는 인간 어셉터 프레임워크로부터 유래된 적합한 잔기(어셉터 잔기)에 의해 대체될 수 있다.
항체 가변 도메인 중의 잔기는 통상 카바트 등에 의해 고안된 체계에 따라 번호매김된다. 이 체계는 문헌 [Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA](이하, 문헌 ["Kabat et al. (상기 문헌 동일)"])에 기재되어 있다. 상기 번호매김 체계는 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된다.
카바트 잔기 명명법이 항상 아미노산 잔기의 선형 번호매김과 직접적으로 상응하는 것은 아니다. 실제 선형 아미노산 서열은 프레임워크인지 또는 상보성 결정 영역(CDR)인지에 상관 없이, 기본 가변 도메인 구조의 구조 성분의 단축, 또는 그 안으로의 삽입에 상응하는, 카바트 번호매김에서보다 수개 더 적거나 또는 더 많은 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 정확한 카바트 번호매김은 항체의 서열에서 상동성인 잔기를 "표준" 카바트 번호매김된 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다.
중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 번호매김 체계에 따라 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 코티아(Chothia)에 따르면(문헌 [Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)]), CDR-H1과 등가인 루프는 잔기 26부터 잔기 32까지에 이른다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바, 'CDR-H1'은 카바트 번호매김 체계 및 코티아의 위상학적 루프 정의의 조합에 의해 기술된 바와 같이, 잔기 26 내지 35를 지칭하는 것으로 한다.
경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 번호매김 체계에 따라, 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 78에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 79에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 80에 제공된 서열을 가지는 것인, 중쇄 가변 영역(예를 들어, VH)을 포함하는 CD79에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대한 서열 번호: 88, CDRH2에 대한 서열 번호: 89, 및 CDRH3에 대한 서열 번호: 90인 것인 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, 중쇄 가변 영역(예를 들어, VH)을 포함하는 CD79에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열 번호: 75, CDRL2에 대한 서열 번호: 76, 및 CDRL3에 대한 서열 번호: 77인 것인 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(예를 들어, VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열 번호: 85, CDRL2에 대한 서열 번호: 86, 및 CDRL3에 대한 서열 번호: 87인 것인 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역(예를 들어, VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 78에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 79에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 80에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 75에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 76에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 77에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 88에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 89에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 90에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 85에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 86에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 87에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD79에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다중특이적 분자는 서열 번호: 98, 99, 100, 108, 109, 110, 118, 119, 120, 128, 129, 130, 138, 139, 140, 148, 149 및 150을 포함하는 군으로부터 선택되는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다중특이적 분자는 서열 번호: 95, 97, 97, 105, 106, 107, 115, 116, 117, 125, 126, 127, 136, 137, 138, 145, 146 및 147을 포함하는 군으로부터 선택되는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다중특이적 분자는 서열 번호: 98, 99, 100, 108, 109, 110, 118, 119, 120, 128, 129, 130, 138, 139, 140, 148, 149 및 150을 포함하는 군으로부터 선택되는 3개의 중쇄 CDR, 및 서열 번호: 95, 97, 97, 105, 106, 107, 115, 116, 117, 125, 126, 127, 136, 137, 138, 145, 146 및 147을 포함하는 군으로부터 선택되는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대한 서열 번호: 98, CDRH2에 대한 서열 번호: 99, 및 CDRH3에 대한 서열 번호: 100인 것인 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대한 서열 번호: 108, CDRH2에 대한 서열 번호: 109, 및 CDRH3에 대한 서열 번호: 110인 것인 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대한 서열 번호: 118, CDRH2에 대한 서열 번호: 119, 및 CDRH3에 대한 서열 번호: 120인 것인 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대한 서열 번호: 128, CDRH2에 대한 서열 번호: 129, 및 CDRH3에 대한 서열 번호: 130인 것인 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대한 서열 번호: 138, CDRH2에 대한 서열 번호: 139, 및 CDRH3에 대한 서열 번호: 140인 것인 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRH1에 대한 서열 번호: 148, CDRH2에 대한 서열 번호: 149, 및 CDRH3에 대한 서열 번호: 150인 것인 3개의 중쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열 번호: 95, CDRL2에 대한 서열 번호: 96, 및 CDRL3에 대한 서열 번호: 97인 것인 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열 번호: 105, CDRL2에 대한 서열 번호: 106, 및 CDRL3에 대한 서열 번호: 107인 것인 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열 번호: 115, CDRL2에 대한 서열 번호: 116, 및 CDRL3에 대한 서열 번호: 117인 것인 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열 번호: 125, CDRL2에 대한 서열 번호: 126, 및 CDRL3에 대한 서열 번호: 127인 것인 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열 번호: 135, CDRL2에 대한 서열 번호: 136, 및 CDRL3에 대한 서열 번호: 137인 것인 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, CDRL1에 대한 서열 번호: 145, CDRL2에 대한 서열 번호: 146, 및 CDRL3에 대한 서열 번호: 147인 것인 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, CD22에 특이적인, 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 98에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 99에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 100에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 95에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 96에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 97에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 108에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 109에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 110에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 105에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 106에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 107에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 118에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 119에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 120에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 115에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 116에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 117에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 128에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 129에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 130에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 125에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 126에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 127에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 138에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 139에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 140에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 135에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 136에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 137에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 148에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 149에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 150에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 145에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 146에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 147에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 본 발명은 항원 CD79에 대해 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자로서, 여기서, 상기 결합 도메인 쌍은 CD79 및 CD22 항체 쌍으로부터 6개의 CDR을 포함하고, 상기 항체 쌍은 하기 목록의 CD79 및 CD22 항체 쌍: 4447 및 4120, 4447 및 4126, 4447 및 4127, 4447 및 4128, 4447 및 4130, 4447 및 4132, 4450 및 4120, 4450 및 4126, 4450 및 4127, 4450 및 4128, 4450 및 4130, 및 4450 및 4132로부터 선택되는 것인, 다중특이적 분자를 제공한다.
VH, VL 및 CDR 서열을 비롯한, 이들 CD79 항체(항체 4447 및 항체 4450)의 서열은 본원 하기에서 제공된다. VH, VL 및 CDR 서열을 비롯한, 이들 CD22 항체(항체 4120, 4126, 4127, 4128, 4130, 4132)의 서열은 본원 하기에서 제공되며, 이는 본 발명의 분자에서 결합 도메인으로서 조합될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 항체 서열로 확장된다.
한 예에서, 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR H1은 서열 번호: 151에 제공된 서열을 가지고, CDR H2는 서열 번호: 152에 제공된 서열을 가지고, CDR H3은 서열 번호: 153에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH), 및 3개의 CDR을 포함하며, 여기서, CDR L1은 서열 번호: 154에 제공된 서열을 가지고, CDR L2는 서열 번호: 155에 제공된 서열을 가지고, CDR L3은 서열 번호: 156에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 알부민에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, 서열 번호: 157에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 159에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 알부민에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 실시양태에서, 서열 번호: 158에 제공된 서열을 가지는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 160에 제공된 서열을 가지는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 알부민에 특이적인 결합 도메인을 제공한다.
한 예에서, 결합 도메인은 인간화 결합 도메인이다.
한 예에서, 본원에서 제공하는 하나 이상의 CDR은 바람직하지 못한 잔기 또는 부위, 예컨대, 시스테인 잔기 또는 아스파르트산(D) 이성질체화 부위 또는 아스파라긴(N) 탈아미드화 부위를 제거하도록 변형될 수 있다.
예를 들어, CDR 내의 어느 하나에서의 하나 이상의 시스테인 잔기는 다른 아미노산, 예컨대, 세린으로 치환될 수 있다.
한 예에서, 아스파라긴 탈아미드화 부위는 아스파라긴 잔기(N) 및/또는 이웃 잔기를 임의의 다른 적합한 아미노산로 돌연변이화시킴으로써 하나 이상의 CDR로부터 제거될 수 있다. 한 예에서, 아스파라긴 탈아미드화 부위, 예컨대, NG 또는 NS는 예를 들어, NA 또는 NT로 돌연변이화될 수 있다.
한 예에서, 아스파르트산 이성질체화 부위는 아스파르트산 잔기(D) 및/또는 이웃 잔기를 임의의 다른 적합한 아미노산로 돌연변이화시킴으로써 하나 이상의 CDR로부터 제거될 수 있다. 한 예에서, 아스파르트산 이성질체화 부위, 예컨대, DG 또는 DS는 예를 들어, EG, DA 또는 DT로 돌연변이화될 수 있다.
한 예에서, N-글리코실화 부위, 예컨대, NLS는 아스파라긴 잔기(N)를 임의의 다른 적합한 아미노산, 예를 들어, SLS 또는 QLS로 돌연변이화시킴으로써 제거될 수 있다. 한 예에서, N-글리코실화 부위, 예컨대, NLS는 세린 잔기(S)를 임의의 다른 잔기로(단, 트리오닌(T)은 제외)로 돌연변이화시킴으로써 제거될 수 있다.
당업자는 임의의 적합한 검정법, 예컨대, 본원에 기술된 검정법으로 CDR 변이체 또는 인간화 서열을 시험하여 활성이 유지된다는 것을 확인할 수 있다.
항원에의 특이적인 결합은 예를 들어, ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 방법, 예컨대, BIA코어(BIAcore)를 비롯한, 항원(CD22 또는 CD79)에의 결합을 측정할 수 있는 임의의 적합한 검정법을 사용하여 시험될 수 있다. 상기 검정법은 단리된 천연 또는 재조합 CD22 또는 CD79(a 및/또는 b) 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 사용할 수 있다. 한 예에서, 결합은 재조합 CD22(예컨대, 서열 번호: 161에 제공된 서열, 또는 서열 번호: 161의 아미노산 20-847) 또는 CD79(예컨대, 서열 번호: 162 및 서열 번호: 163에 제공된 서열, 또는 서열 번호: 162의 아미노산 33-226 및 서열 번호: 163의 아미노산 29-229)를 사용하여 예를 들어, 표면 플라스몬 공명, 예컨대, BIA코어에 의해 측정된다. 대안적으로, 단백질은 세포, 예컨대, HEK 세포 상에서 발현될 수 있고, 친화도는 유세포 분석법 기반 친화도 측정을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 항체 서열은 추가 항체, 및 따라서, 본 발명의 다중특이적 분자에서의 사용에 적합한 결합 도메인을 확인하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 항체 분자, 특히, 서열 번호: 73에 제공된 중쇄 서열 및 서열 번호: 71에 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자 또는 서열 번호: 83에 제공된 중쇄 서열 및 서열 번호: 81에 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자의 CD79에의 결합을 교차 차단하는 항체는 CD79에의 결합에서 유사하게 유용하고, 그러므로, 본 발명의 다중특이적 분자에서 유사하게 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인, 및 항원 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자로서, 여기서, CD79b에 대한 결합 도메인은 본원 상기에 기술된 항체 분자 중 어느 하나의 CD79에의 결합을 교차 차단하고/거나, 상기 항체 중 어느 하나에 의해 CD79에 결합하지 못하도록 교차 차단되는 것인, 다중특이적 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 본원 상기에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 교차 차단 항체는 본원 상기에 기술된 항체가 결합하는 에피토프와 인접해 있고/거나, 그와 중복되는 에피토프에 결합한다.
유사하게, 본 발명에 따른 항체 분자, 특히, 서열 번호: 93에 제공된 중쇄 서열 및 서열 번호: 91에 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자, 또는 서열 번호: 103에 제공된 중쇄 서열 및 서열 번호: 101에 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자, 또는 서열 번호: 113에 제공된 중쇄 서열 및 서열 번호: 111에 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자, 또는 서열 번호: 123에 제공된 중쇄 서열 및 서열 번호: 121에 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자, 또는 서열 번호: 133에 제공된 중쇄 서열 및 서열 번호: 131에 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자, 또는 서열 번호: 143에 제공된 중쇄 서열 및 서열 번호: 141에 제공된 경쇄 서열을 포함하는 항체 분자에의 결합을 교차 차단하는 항체는 CD22에의 결합에서 유사하게 유용하고, 그러므로, 본 발명의 다중특이적 분자에서 유사하게 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인, 및 항원 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자로서, 여기서, CD22에 대한 결합 도메인은 본원 상기에 기술된 항체 분자 중 어느 하나의 CD22에의 결합을 교차 차단하고/거나, 상기 항체 중 어느 하나에 의해 CD22에 결합하지 못하도록 교차 차단되는 것인, 다중특이적 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 항체는 본원 상기에 기술된 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 교차 차단 항체는 본원 상기에 기술된 항체가 결합하는 에피토프와 인접해 있고/거나, 그와 중복되는 에피토프에 결합한다.
교차 차단 항체는 예를 들어, 교차 차단 항체의 항원(CD22 및/또는 CD79)에의 결합이 본 발명의 항체의 결합을 막거나, 또는 그 반대인 것인, 경쟁 ELISA 또는 BIA코어에 의해 당업계의 임의의 적합한 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 상기 교차 차단 검정법은 세포 발현된, 단리된 천연, 또는 재조합 CD22 또는 CD79(a 및/또는 b) 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 사용할 수 있다. 한 예에서, 결합 및 교차 차단은 재조합 CD22 또는 그의 적합한 단편 또는 천연 변이체(예컨대, 서열 번호: 161에 제공된 서열 또는 서열 번호: 161의 아미노산 20-847에 제공된 서열), 또는 CD79, 예컨대, 서열 번호: 162에 제공된 서열 또는 서열 번호: 162의 아미노산 33-226에 제공된 서열(CD79a) 및/또는 서열 번호: 163에 제공된 서열 또는 서열 번호: 163의 아미노산 29-229에 제공된 서열을 사용하여 측정된다.
대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 상기 측면에 따른 항체는 본원에 개시된 결합 도메인, 예를 들어, 서열 번호: 71 및 73, 81 및 83, 91 및 93, 101 및 103, 111 및 113, 121 및 123, 131 및 133, 및 141 및 143에 제공된 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열로부터 유래된 CDR을 포함하는 결합 도메인에 의해 항원(CD22 또는 CD79)에의 결합으로부터 교차 차단될 수 있다. 그러므로, 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자로서, 여기서, CD79b에 대한 결합 도메인은 80% 초과만큼, 예를 들어, 85% 초과만큼, 예컨대, 90% 초과만큼, 특히, 95% 초과만큼 본원 상기에 기술된 항체 분자 중 어느 하나의 CD79b에의 결합을 교차 차단하고/거나, 상기 항체 중 하나에 의해 CD79b에 결합하지 못하도록 교차 차단되고, 임의적으로, 여기서, CD22에 대한 결합 도메인은 80% 초과만큼, 예를 들어, 85% 초과만큼, 예컨대, 90% 초과만큼, 특히, 95% 초과만큼 본원 상기에 기술된 항체 분자 중 어느 하나의 CD22에의 결합을 교차 차단하고/거나, 상기 항체 중 하나에 의해 CD22에 결합하지 못하도록 교차 차단되는 것인, 다중특이적 분자 또한 제공한다.
한 측면에서,
a) 하기 화학식 (I)의 폴리펩티드 쇄;
b) 하기 화학식 (II)의 폴리펩티드 쇄를 포함하거나, 또는 그로 이루어진 다중특이적 항체 분자를 제공한다:
<화학식 (I)>
V H -CH 1 -X-(V 1 ) p ;
<화학식 (II)>
V L -C L -Y-(V 2 ) q
상기 식에서,
VH는 중쇄 가변 도메인을 나타내고;
CH1은 중쇄 불변 영역의 도메인, 예를 들어, 그의 도메인 1을 나타내고;
X는 결합 또는 링커, 예를 들어, 아미노산 링커를 나타내고;
Y는 결합 또는 링커, 예를 들어, 아미노산 링커를 나타내고;
V1은 dab, scFv, dsscFv 또는 dsFv를 나타내고;
VL은 가변 도메인, 예를 들어, 경쇄 가변 도메인을 나타내고;
CL은 불변 영역으로부터의 도메인, 예를 들어, 경쇄 불변 영역 도메인, 예컨대, C카파를 나타내고;
V2는 dab, scFv, dsscFv 또는 dsFv를 나타내고;
p는 0 또는 1을 나타내고;
q는 0 또는 1을 나타내고;
p가 1일 때, q는 0 또는 1이고, q가 1일 때, p는 0 또는 1이고, 즉, p 및 q, 둘 모두가 0을 나타내지는 않는다.
한 실시양태에서, 다중특이적 항체 분자는 1개 이하의 CD22에 대한 결합 도메인 및 1개 이하의 CD79에 대한 결합 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, q는 0이고, p는 1이다.
한 실시양태에서, q는 1이고, p는 1이다.
한 실시양태에서, V1은 dab이고, V2는 dab이고, 이들은 함께, 임의적으로 이황화 결합에 의해 연결된, 가변 영역의 공동 작동성 쌍, 예컨대, 동족 VH/VL 쌍의 단일 결합 도메인을 형성한다.
한 실시양태에서, VH 및 VL은 CD79, 예를 들어, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD79, 예를 들어, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V2는 CD79, 예를 들어, CD79a 또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1 및 V2는 함께(예컨대, 결합 도메인으로서) CD79, 예를 들어, CD79a 또는 CD79b에 특이적이고, VH 및 VL은 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V2는 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1 및 V2는 함께(예컨대, 결합 도메인으로서) CD22에 특이적이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD22에 특이적이고, V2는 알부민에 특이적이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 알부민에 특이적이고, V2는 CD22에 특이적이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD79에 특이적이고, V2는 알부민에 특이적이고, VH 및 VL은 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 알부민에 특이적이고, V2는 CD79에 특이적이고, VH 및 VL은 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD22에 특이적인 dsscFv이고, V2는 알부민에 특이적인 dsscFv이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 알부민에 특이적인 dsscFv이고, V2는 CD22에 특이적인 dscFv이고, VH 및 VL은 CD79에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 CD79에 특이적인 dsscFv이고, V2는 알부민에 특이적인 dsscFv이고, VH 및 VL은 CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, V1은 알부민에 특이적인 dsscFv이고, V2는 CD79에 특이적인 dsscFv이고, VH 및 VL은 CD22에 특이적이다.
상기 구성체에서 V1, V2, VH 및 VL은 각각 결합 도메인을 나타낼 수 있고, 이는 본원에서 제공되는 서열 중 임의의 것을 도입할 수 있다.
X 및 Y는 임의의 적합한 링커를 나타내고, 예를 들어, X 및 Y는 SGGGGSGGGGS(서열 번호: 17)일 수 있다.
한 실시양태에서, V1 및/또는 V2가 dab, dsFv 또는 dsscFv일 때, V1 및/또는 V2의 가변 도메인 VH와 VL 사이의 이황화 결합은 위치 VH44와 VL100 사이에서 형성된다.
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 신규한 폴리펩티드 서열, 및 그와 80% 이상 유사하거나, 또는 동일한, 예를 들어, 85% 이상, 상기 90% 이상, 특히, 95% 이상의 유사성 또는 동일성을 가지는 서열로 확장된다.
본원에서 사용되는 바, "동일성"이란, 정렬된 서열 중의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열 간에 동일하다는 것을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, "유사성"이란, 정렬된 서열 중의 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 서열 간에 유사한 유형이라는 것을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린 대신으로 치환될 수 있다. 자주 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산은 하기의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다:
- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 가지는 아미노산);
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 가지는 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 가지는 아미노산);
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 가지는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 가지는 아미노산).
동일성 및 유사성 정도는 쉽게 계산될 수 있다(문헌 [Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988]; [Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987], [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991], NCBI로부터 이용가능한 BLAST™ 소프트웨어(문헌 [Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272], [Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141]; [Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; [Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656])).
특히, 한 측면에서, 본 발명은 임의의 적합한 항체 포맷의 본원에 기술된 CD22 및 CD79 항체를 제공한다.
따라서 한 측면에서, 본 발명은 본원에서 및 서열 번호: 95, 96, 97, 98, 99 및 100(항체 4120) 또는 105, 106, 107, 108, 109 및 110(항체 4126) 또는 115, 116, 117, 118, 119 및 120(항체 4127) 또는 125, 126, 127, 128, 129 및 130(항체 4128) 또는 135, 136, 137, 138, 139 및 140(항체 4130) 또는 145, 146, 147, 148, 149 및 150(항체 4132)에 제공된 CDR을 포함하는, 본원 상기에 기술된 결합 도메인 중 하나 이상의 것을 함유하는 항CD22 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 본원에서 및 서열 번호: 75, 76, 77, 78, 79 및 80(항체 4447) 또는 서열 번호: 85, 86, 87, 88, 89 및 90(항체 4450)에 제공된 CDR을 포함하는, 본원 상기에 기술된 결합 도메인 중 하나 이상의 것을 함유하는 항CD79 항체 또는 그의 단편 또한 제공한다.
상기 CDR은 임의의 적합한 항체 프레임워크 내로, 및 임의의 적합한 항체 포맷으로 도입될 수 있다. 상기 항체는 전체 항체, 및 모노클로날, 인간화, 전체 인간 또는 키메라 항체일 수 있지만, 이에 제한되지 않는, 상기 전체 항체의 기능적으로 활성인 단편 또는 유도체를 포함한다. 따라서, 상기 항체는 전장의 중쇄 및 경쇄를 가지는 완전한 항체 분자 또는 그의 단편을 포함할 수 있고, Fab, 변형된 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, 2가, 3가, 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 상기 중 임의 것의 에피토프-결합 단편일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌 [Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136]; [Adair and Lawson, 2005, 약물 Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 상기 항체 단편을 생성 및 제조하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 다가 항체는 다중특이성을 포함할 수 있거나, 또는 단일특이적일 수 있다(예를 들어, WO 92/22853 및 WO05/113605 참조). 본 발명의 이러한 측면은 또한 본원 상기에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 이성질체화, 탈아미드화, 글리코실화 부위 또는 시스테인 잔기를 제거하도록 CDR 내의 아미노산이 돌연변이화된 것을 포함하는, 인간화 버전 및 변형된 버전을 비롯한, 상기 항CD22 및 CD79 항체의 변이체로 확장된다.
링커
한 맥락에서의 링커에 대한 본원의 교시는 링커가 사용되는 다른 맥락에서의, 예컨대, 본 발명의 임의의 다중특이적 분자에서의 링커에도 동일하게 적용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 링커는 길이가 아미노산 링커 50개 이하의 잔기 길이, 예를 들어, 서열 5 내지 70에 제시된 서열로부터 선택되는 것이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
강성 링커의 예로는 펩티드 서열 GAPAPAAPAPA(서열 번호: 69), PPPP(서열 번호: 70) 및 PPP를 포함한다.
다른 링커는 하기 표 3에 제시되어 있다:
Figure pct00004
이펙터 분자
본 발명에서 사용하는 데 바람직한 다중특이적 분자는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 컨쥬게이션될 수 있다. 이펙터 분자는 본 발명의 다중특이적 분자에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 단일 이펙터 분자 또는 둘 이상의 상기 분자를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이펙터 분자에 연결된 본 개시내용에 따른 항체 또는 다중특이적 분자를 수득하는 것이 바람직할 경우, 이는 항체 단편을 이펙터 분자에 직접 또는 커플링제를 통해 연결하는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 이펙터 분자를 항체에 컨쥬게이션시키는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌 [Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53]; [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58] 및 [Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123] 참조). 특정 화학 방법으로는 예를 들어, WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO 03/031581에 기술되어 있는 방법을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우, 연결은 예를 들어, WO 86/01533 및 EP0392745에 기술되어 있는 바와 같이 재조합 DNA 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자는 이펙터 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 이펙터 분자라는 용어는 예를 들어, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적으로 활성인 단백질, 예를 들어, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연적으로 발생된 중합체, 핵산 및 그의 단편, 예컨대, DNA, RNA 및 그의 단편, 방사성핵종, 특히, 방사성 아이오다이드, 방사성 동위 원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 리포터 기, 예컨대, 형광성 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.
이펙터 분자의 예로는 세포에 유해한 (예컨대, 세포를 사멸시키는) 임의의 작용제를 비롯한, 세포독소 또는 세포독성제를 포함한다. 예로는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탄시노이드, 스폰지스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스텔린, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 및 퓨로마이신 및 그의 유사체 또는 동족체를 포함한다.
이펙터 분자로는 또한 항대사물질(예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예컨대, 메클로레타민, 티오테파, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP), 시스플라틴), 안트라사이클린(예컨대, 다우노마이신(종전의 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(종전의 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리키아미신 또는 듀오카르마이신), 및 항유사분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 이펙터 분자로는 킬레이팅된 방사성핵종, 예컨대, 111In 및 90Y, Lu177, 비스무스213, 칼리포르늄252, 이리듐192 및 텅스텐188/레늄188; 또는 약물, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민을 포함한다.
다른 이펙터 분자로는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심의 대상이 되는 효소로는 단백질 분해 효소, 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제, 트랜스퍼라제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 관심의 대상이 되는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드로는 면역글로불린, 독소, 예컨대, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소, 단백질, 예컨대, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, 슈도모나스-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유리 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성인자, 혈전 용해제 또는 항혈관신생제, 예컨대, 안지오스타딘 또는 엔도스타딘, 또는, 생물 반응 개질제, 예컨대, 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte macrophage colony stimulating factor), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF: granulocyte colony stimulating factor), 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 이펙터 분자로는 예를 들어, 진단에서 유용한, 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 보결기, 형광성 물질, 발광성 물질, 생체발광성 물질, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영술용), 및 비방사성 상자성 금속 이온을 포함한다. 진단용으로 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 금속 이온에 대해서는 일반적으로 미극 특허 번호 4,741,900을 참조할 수 있다. 적합한 효소로는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제를 포함하고; 적합한 보결기로는 스트렙트아비딘, 아비딘 및 비오틴을 포함하고; 적합한 형광성 물질로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린을 포함하고; 적합한 발광성 물질로 루미놀을 포함하고; 적합한 생체발광성 물질로는 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고; 적합한 방사성 핵종으로는 125I, 131I, 111In 및 99Tc를 포함한다.
또 다른 예에서, 이펙터 분자는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시킬 수 있고/거나, 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있고/거나, 상피 장벽을 통한 면역계로의 항체의 전달을 증진시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예로는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대, WO05/117984에 기술되어 있는 것을 포함한다.
이펙터 분자가 중합체일 경우, 이는 일반적으로, 합성 또는 천연적으로 발생된 중합체, 예를 들어, 임의적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지형 또는 비분지형 다당류, 예컨대, 동종다당류 또는 이종다당류일 수 있다.
상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 임의적인 구체적 치환기로는 하나 이상의 하이드록시, 메틸, 또는 메톡시 기를 포함한다.
합성 중합체의 구체적인 예로는 임의적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알콜) 또는 그의 유도체, 특히, 임의적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜) 예컨대, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 그의 유도체를 포함한다.
기능 검정법 & 스크리닝 포맷
전형적으로, 본 발명에서 사용하는 데 적합한 결합 도메인은 기능 검정법으로 하나 이상의 결합 도메인 쌍을 시험함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자를 하나 이상의 기능 검정법으로 시험할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "기능 검정법"이란, 검정 조건을 조건으로 하여 단백질 복합체, 항체 복합체 또는 항체의 혼합물의 하나 이상의 원하는 특성 또는 활성을 측정하는 데 사용될 수 있는 검정법이다. 적합한 기능 검정법은 결합 검정법, 아폽토시스 검정법, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC: antibody-dependent cellular cytotoxicity) 검정법, 보체 의존성 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity) 검정법, 세포 성장 또는 증식 억제(세포 분열 억제 효과) 검정법, 세포 사멸(세포독성 효과) 검정법, 세포 신호전달 검정법, 사이토카인 생산 검정법, 항체 생산 및 이소형 전환, 및 세포 분화 검정법일 수 있다.
본 개시내용에 따른 다중특이적 항체의 효능을 당업계의 숙련가에게 일반적으로 알려져 있는 방법에 의해 상기 모델에서 개별 항체 또는 항체(또는 단편)의 혼합물과 비교할 수 있다.
결과의 신뢰도를 증강시키기 위해 수회에 걸쳐 기능 검정법을 반복 수행할 수 있다. 통계학상 유의적인 결과를 확인하고, 이로써, 생물학적 기능을 가진 다중특이적 분자를 확인하는 데 당업자에게 공지된 다양한 통계학적 검정이 사용될 수 있다.
적합한 기능 검정법의 예는 본원 실시예에 기술되어 있고, 이는 B 세포 활성화의 마커, 예컨대, 인산화된 Akt 발현, 인산화된 P38 발현, PLCγ 신호전달, CD40 발현, CD71 발현 및/또는 CD86 발현의 억제를 검출함으로써 측정되는 바, 항IgM으로 자극한 후, B 세포 활성화를 억제시킬 수 있는 능력을 측정하는 것을 포함한다.
스크리닝을 위한 기능 검정법을 확립하였을 때, 당업자는 확인된 활성이 "히트"인 것으로 간주되는 것보다 큰 적합한 역치를 설정할 수 있다. 1 초과의 기능 검정법을 사용할 때, 각 검정법에 대한 역치는 관리가능한 히트율을 확립하는 데 적합한 수준으로 설정될 수 있다. 한 예에서, 히트율은 3-5%일 수 있다. 한 예에서, 상기 및 본원 실시예에서 기술된 바와 같이, B 세포 기능을 억제시키는 결합 도메인 쌍 검색시 설정된 기준은 B 세포 활성화 검정법에서 2개 이상의 포스포-판독값을 30% 이상 억제시키는 것일 수 있다.
한 예에서, 항IgM 자극을 받은 B 세포에서 인산화된 P38의 억제를 위한 본 발명의 다중특이적 분자의 IC50은 1 nM 미만, 바람직하게, IC50은 0.5 nM 미만이다. 한 예에서, 본 검정법에서 다중특이적 분자의 IC50은 0.05 nM 미만이다.
한 예에서, 항IgM 자극을 받은 B 세포에서 인산화된 Akt의 억제를 위한 본 발명의 다중특이적 분자의 IC50은 1 nM 미만, 바람직하게, IC50은 0.1 nM 미만이다. 한 예에서, 본 검정법에서 다중특이적 분자의 IC50은 0.05 nM 미만이다.
한 예에서, 항IgM 자극을 받은 B 세포에서 인산화된 PLCγ2의 억제를 위한 본 발명의 다중특이적 분자의 IC50은 0.8 nM 미만이다. 한 예에서, 본 검정법에서 다중특이적 분자의 IC50은 0.05 nM 미만이다.
한 예에서, 항IgM 자극을 받은 B 세포에서 CD71 발현의 억제를 위한 본 발명의 다중특이적 분자의 IC50은 5 nM 미만, 바람직하게, IC50은 3 nM 미만이다. 한 예에서, 본 검정법에서 다중특이적 분자의 IC50은 0.5 nM 미만이다.
한 예에서, 항IgM 자극을 받은 B 세포에서 CD40 발현의 억제를 위한 본 발명의 다중특이적 분자의 IC50은 5 nM 미만이다. 한 예에서, 본 검정법에서 다중특이적 분자의 IC50은 0.5 nM 미만이다.
한 예에서, 항IgM 자극을 받은 B 세포에서 CD86 발현의 억제를 위한 본 발명의 다중특이적 분자의 IC50은 5 nM 미만, 바람직하게, IC50은 2 nM 미만이다. 한 예에서, 본 검정법에서 다중특이적 분자의 IC50은 0.5 nM 미만이다.
한 예에서, 항IgM 자극을 받은 B 세포에서 CD71, CD40 및 CD86 발현의 억제를 위한 본 발명의 다중특이적 분자의 IC50은 5 nM 미만이고/거나, 항IgM 자극을 받은 B 세포에서 인산화된 PLCγ2, P38 및 AKT의 억제를 위한 IC50은 1 nM 미만이다.
한 실시양태에서, 마우스 종양 모델, 자가면역 질환 모델, 바이러스 감염 또는 박테리아 감염 설치류 또는 영장류 모델 등을 비롯한, 동물 모델과 같은 생체내 검정법은 본 개시내용의 분자를 시험하는 데 사용될 수 있다.
결합 도메인의 스크리닝 및 발현을 위해 적합한 포맷의 예는 본원 하기에 기술된다.
본 발명에서 사용하기 위한 결합 도메인을 확인하기 위한 스크리닝은 이중특이적 단백질 복합체를 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "이중특이적 단백질 복합체"란, 이종이량체-테더에 의해 함께 유지되는 2개의 단백질(본원에서 이중특이적 성분으로 지칭된 A 및 B)을 포함하는 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 단백질 중 하나 또는 그 둘 모두는 결합 도메인을 가지고, 예를 들어, 단백질 중 하나 또는 그 둘 모두는 항체 또는 그의 단편이다.
전형적으로, 이중특이적 단백질 복합체는 화학식 A-X:Y-B를 가지며,
상기 식에서,
A-X는 제1 융합 단백질이고;
Y-B는 제2 융합 단백질이고;
X:Y는 이종이량체-테더이고;
A는 제1 결합 도메인을 포함하고;
B는 제2 결합 도메인을 포함하고;
X는 결합 쌍의 제1 결합 파트너이고;
Y는 결합 쌍의 제2 결합 파트너이고;
:는 X와 Y 사이의 상호작용(예컨대, 결합 상호작용)이다.
본원에서 사용되는 바, "융합 단백질"이란, (적절할 경우) 다른 엔티티, 예를 들어, 결합 파트너 X 또는 Y에 융합된 A 또는 B와 같은 단백질 성분을 지칭한다. 실시양태에서, 융합 단백질은 재조합 기술에 의해 유전적 구성체로부터 발현된, 예를 들어, 숙주에서 DNA 구성체로부터 발현된 번역 단백질이다.
테더 X:Y의 기능은 A 및 B의 시너지 기능이 실현될 수 있도록 단백질 A 및 B를 서로 인접하게 위치하도록 유지시키는 것이다.
본원에서 사용되는 바, "이종이량체-테더"란, 두 결합 파트너를 함께 유지시키는 데 충분한 전체적인 친화도를 가지는, 서로 간에 상호작용(예컨대, 결합)을 형성하는 상이한 두 결합 파트너 X 및 Y를 포함하는 테더를 지칭한다. 한 실시양태에서, X 및/또는 Y는 동종이량체를 형성하는 데 부적합하다.
이종이량체 방식으로 테더링된 및 이종이량체-테더는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "동종이량체를 형성하는 데 부적합"하다는 것은, 일단 형성되고 나면, X-Y의 이종이량체를 형성하는 것이 더 바람직하고, 예를 들어, 안정적이고, 예컨대, 열역학적으로 안정적이고/거나, 물리적으로 안정적이고(예를 들어, 응집이 일어나지 않는 것으로 입증된다).
한 실시양태에서, X-Y 상호작용이 X-X 또는 Y-Y 상호작용보다 더 바람직하다. 이는 융합 단백질 A-X 및 B-Y가 혼합되었을 때, 동종이량체 X-X 또는 Y-Y의 형성을 감소시킨다. 이로 인해 동종이량체의 제거 또한 비교적 간단하며, 예를 들어, 한 정제 단계, 예컨대, 칼럼 크로마토그래피가 본 개시내용에 따른, 실질적으로 순수한 융합 단백질 및/또는 이중특이적 단백질 복합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 융합 단백질의 발현 후, 정제 단계를 제공한다. 따라서, 한 실시양태에서, 시험관내 혼합 이전에 실질적으로 순수한 형태의 융합 단백질(들)을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, 실질적으로 순수한 형태란, 융합 단백질가 85% 내지 100% 범위, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로 단량체가 존재하는 것을 의미한다. .
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체 형성 후에는 정제가 요구되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 시험관내 혼합 단계에서 사용되는 융합 단백질의 비율은 A-X 대 B-Y는 0.8:1 내지 3:1, 예컨대, 1.5:1 또는 2:1이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 시험관내 혼합 단계에서 사용되는 융합 단백질의 비율은 B-Y 대 A-X는 0.8:1 내지 3:1, 예컨대, 1.5:1 또는 2:1이다.
한 실시양태에서, 비율은 1:1이다.
한 실시양태에서, 결합 파트너 중 하나(또는 적어도 하나)는 동종이량체를 형성할 수 없고, 예를 들어, 결합 파트너의 아미노산 서열은 동종이량체의 형성을 제거 또는 최소화하도록 돌연변이화된다.
한 실시양태에서, 결합 파트너, 둘 모두 동종이량체를 형성할 수 없고, 예를 들어, 결합 파트너 중 하나는 펩티드이고, 나머지 다른 한 결합 파트너는 상기 펩티드에 특이적인 VHH이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자에서 사용되는 scFv는 동종이량체를 형성할 수 없다.
본원에서 사용되는 바, 동종이량체를 형성할 수 없다는 것은 동종이량체를 형성할 수 있는 경향이 낮거나, 0이라는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 낮다는 것은 응집체가 5% 이하, 예컨대, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 이하라는 것을 의미한다.
융합 단백질 중 소량의 응집체 또는 이종이량체 방식으로 테더링된 이중특이적 단백질 복합체 중 잔류물은 일반적으로 본 개시내용의 방법에 최소한의 영향을 미친다.
한 실시양태에서, :은 결합 상호작용, 예를 들어, 인력, 예컨대, 반데르발스힘, 예컨대, 수소 결합 및 정전기 상호작용에 기반하는 것, 예를 들어, 항원, 예컨대, 펩티드에 대한 항체 특이성에 기반하는 것이다.
한 실시양태에서, :은 특이 화학적 상호작용, 예컨대, 클릭 화학으로부터 형성된 공유 결합이다.
한 실시양태에서, :은 공유 결합이 아니다.
본원에서 사용되는 바, "복합체를 형성한다"라는 것은, 복합체가 조립되고, 융합 단백질이 함께 그대로 유지되는 적절한 조건하에서 융합 단백질 성분 A-X 및 B-Y를 접촉시켰을 때, 충분히 특이적이고, 강력한 상호작용으로서, 결합 상호작용 또는 화학 반응을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "함께 그대로 유지되는"이라는 것은 성분(융합 단백질)이 서로 인접하게 그대로 유지됨에 따라, 결합 후에도 복합체는 마치 그가 한 분자인 것처럼 처리될 수 있고, 많은 경우에서 이는 단일 분자와 같은 반응을 보이고, 작용한다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 그대로 유지됨에 따라 복합체는 본원에 개시된 방법에서 사용하는 데 적합한 것이 되고, 즉, 1 이상의 기능 스크린에서 사용하는 데 적합한 것이 된다.
한 실시양태에서, 결합 상호작용은 가역적이다.
본원에서 사용되는 바, X 및 Y와 관련된 경우, 특이성이란, 상호작용시 결합 파트너 X 및 Y가 오직 그들 서로만을 인식하거나, 비파트너와 비교하였을 때, 서로에 대하여 유의적으로 더 높은 친화도, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상 더 높은 친화도를 가진다는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, X 및 Y 사이의 결합 상호작용은 낮은 해리 상수를 가진다.
낮은 해리 상수의 예로는 1-9x10-2s-1 이하, 예를 들어, 1-9x10-3s-1, 1-9x10-4s-1, 1-9x10-5s-1, 1-9x10-6s-1 또는 1-9x10-7s- 1를 포함한다. 특히, 적합한 해리 상수로는 1x10-4s-1 이하, 예를 들어, 1x10-5s-1, 1x10-6s-1 또는 1x10-7s-1을 포함한다.
이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 낮은 해리 상수(이는 또한 오프 속도로도 지칭됨)로 인해 분자는 충분히 안정적일 수 있으며, 이로써, 이중특이적 단백질 복합체는 특히 기능 스크리닝 검정법에서 유용해질 수 있다.
한 실시양태에서, 서로에 대한 X 및 Y의 친화도는 5 nM 또는 더 강력하고, 예를 들어, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM 또는 더 강력하다.
한 실시양태에서, 서로에 대한 X 및 Y의 친화도는 900 pM 또는 더 강력하고, 예컨대, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM 또는 50 pM 또는 더 강력하다.
또 다른 실시양태에서, 서로에 대한 X 및 Y의 친화도는 10 pM 또는 더 강력하고, 예를 들어, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM 또는 5 pM이다.
친화도는 상호작용의 온 및 오프 속도로부터 계산되는 값이다. 본원에서 사용되는 바, "친화도"라는 용어는 분자(예컨대, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예컨대, 펩티드) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 의미한다. 그의 결합 파트너에 대한 분자의 친화도는 일반적으로 평형 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것, 예컨대, 표면 플라스몬 공명 방법, 특히, BIA코어를 비롯한, 당업계에 공지된 일반 방법에 의해 측정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 다중 이중특이적 단백질 복합체는 동시에, 또는 본질적으로 동시에 시험된다.
본원에서 사용되는 바, 동시에란, 샘플/분자 복합체를 같은 분석에서, 예를 들어, 같은 "실행(run)"으로 분석하는 것을 의미한다.
한 실시양태에서, 동시에란, 신호 결과를 본질적으로 같은 시점에 장치에 의해 분석하는 공존 분석을 의미한다. 이 신호는 수득된 결과 해석을 위해 디콘볼루션을 필요로 할 수 있다.
이롭게는, 다중의 이중특이적 단백질 복합체를 시험하면, 다수의 이중특이적 단백질 복합체를 더욱 효율적으로 스크리닝할 수 있고, 새롭고, 흥미로운 관계를 확인할 수 있다. 관심의 대상이 되는 CD22 및 CD79의 표적 항원에 대한 확연히 다른 가변 영역을 통해 생물학적 기능에서의 미묘한 차이에 접근할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 정의된 바와 같은 멀티플렉스를 사용하고, 상기에 대하여 하나 이상의 기능 검정법을 수행함으로써 다중 이중특이적 단백질 복합체를 시험한다.
본원에서 사용되는 바, "생물학적 기능"이란, 시험되는 생물학적 엔티티에 대해 천연적, 또는 그의 목적인 활성, 예를 들어, 세포, 단백질 등의 자연적 활성을 의미한다. 이상적으로, 기능의 존재는 살아있는 포유동물 세포를 사용하는 검정법을 비롯한, 시험관내 기능 검정법을 사용하여 시험될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 자연적 기능은 비정상적인 기능, 예컨대, 암과 관련된 기능을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 관련된 "생물학적 비교군"이란, 임의의 변화 또는 신규한 활성 또는 기능이 존재하는지 여부를 확립하기 위해, 이중특이적 단백질 복합체에 대하여 사용된 것과 동일한 검정법에서 활성을 평가하는 데 적합한 엔티티를 의미한다. A-X:Y-B에 대한 적합한 비교군으로는 천연 형태이거나, 또는 이중특이적인 것과 같은 포맷으로 존재하는 정제된 단백질(재조합 단백질 포함), 즉, A 및 B가 같은 엔티티인 것, 예컨대, A-X:Y-A 또는 B-X:Y-B를 포함할 수 있다. 대안적으로, 비복합체 형태의 융합 단백질 A-X 또는 B-Y가 비교군으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 상이한 포맷의 다중 비교군(특히, 본원에 기술된 것과 같은 것)이 사용될 수 있다. 당업자는 문헌상에서 살펴볼 수 있는 통상의 일반적인 지식 또는 정보에 기초하여 적합한 대조군/비교군을 확인하고, 포함시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "시너지 기능"이란, 본 개시내용의 이중특이적 단백질 복합체의 제1 및 제2 단백질이 함께 사용되지 않았을 때에는 관찰되지 않거나, 또는 그때 관찰된 것보다 더 높은 생물학적 활성, 예를 들어, 오직 이중특이성 형태에서만 관찰되는 활성을 의미한다. 그러므로, "시너지성"은 신규한 생물학적 기능도 포함한다.
본 개시내용은 신규한 생물학적 기능과 함께, 적어도 CD22 및 CD79에 대한 특이성을 가지는 분자를 제공한다.
본원에서 사용되는 바, 신규한 생물학적 기능이란, (이중특이적 것 등인 것과 같이) 둘 이상의 시너지성 엔티티[단백질 A 및 단백질 B]가 함께 할 때까지는 자명하지도 않거나, 또는 존재하지 않는 기능, 또는 이전에는 확인되지 않은 기능을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 더 높다는 것은, 0으로부터의 증가를 비롯한, 활성의 증가, 비복합형의 개별 이중특이적 성분 또는 성분들이 관련된 기능 검정법에서는 어떤 활성도 가지지 않은 경우의 이중특이적인 것에서의 일부 활성, 즉, 신규 활성 또는 신규한 생물학적 기능을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 더 높다는 것은 또한 비복합형의 개별 이중특이적 성분 또는 2가 결합 도메인과 비교하였을 때, 관련된 기능 검정법에서 이중특이적인 것에서의 상가적 기능보다 크다는 것, 예를 들어, 관련된 활성의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% 이상의 증가를 포함한다.
한 실시양태에서, 신규한 시너지 기능은 더 높은 억제 활성이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 항체 분자는 단독으로 또는 혼합 형태로 제공되는 CD22에 대한 2가 결합 도메인 및 CD79a에 대한 2가 결합 도메인의 활성의 총합보다 억제 활성이 더 높다.
한 실시양태에서, 결합 쌍의 제1 결합 파트너인 X, 및 제2 결합 파트너인 Y 중 적어도 하나는 펩티드 및 단백질로부터 독립적으로 선택되고; 예를 들어, 제1 결합 파트너 또는 제2 결합 파트너는 펩티드이다.
적합한 펩티드는 GCN4, Fos/Jun(인간 및 뮤린 Fos는 각각 유니프로트 번호(Uniprot number) P01100 및 P01101을 가지고, 인간 및 뮤린 jun은 각각 유니프로트 번호 P05412 및 P05627을 가진다), 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(HA), 폴리히스티딘(His), 녹색 형광성 단백질(GFP: green fluorescent protein) 및 FLAG를 포함하는 군을 포함한다. 다른 펩티드 또한 본 개시내용에서 사용하는 데 적합한 것으로 고려되며, 특히, 적합한 펩티드는 단백질 정제를 위한 친화도 태그인데, 그 이유는 상기 펩티드는 그의 각 결합 파트너에 대하여 높은 친화도로 결합하는 경향이 있기 때문이다.
본원에서 사용되는 바, "펩티드"라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 짧은 중합체로서, 여기서, 펩티드는 2개 내지 100개 범위의 아미노산, 예를 들어, 5개 내지 99개, 예컨대, 6개 내지 98개, 7개 내지 97개 또는 8개 내지 96개의 아미노산을 함유하는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용에서 사용되는 펩티드는 50개 이하의 아미노산 잔기, 예를 들어, 40개, 30개, 10개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열이다. 본 개시내용에서 사용되는 펩티드는 목적에 맞는 충분한 길이의 것이며, 예를 들어, 펩티드가 링커인 경우, 그가 연결하는 단편이 그의 생물학적 기능을 수행할 수 있도록 적합하게 길어야 하고; 대안적으로, 펩티드가 결합 파트너일 경우, 다른 엔티티, 예컨대, 항체에 특이적으로 결합할 수 있어야 한다.
한 실시양태에서, 결합 쌍의 나머지 다른 한 결합 파트너(대안적 제1 또는 제2 결합 파트너)는 단백질이다.
본원에서 사용되는 바, 단백질이란, 100개 이상의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 의미한다. 한 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, "단백질"이란, 2차 또는 3차 구조를 가지는 아미노산 서열을 의미한다.
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체의 제1 단백질인 A, 및/또는 제2 단백질인 B는 항체 또는 항체 단편이다. 상기 이중특이적 단백질 복합체는 이중특이적 항체 복합체로도 지칭될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 항체 복합체에서 사용되는 각 항체 또는 단편은 하나의 결합 부위를 포함한다.
융합 단백질(A-X 또는 B-Y)에서 사용되는 전장의 항체 또는 항체 단편은 단일특이적, 다가 또는 이중특이적일 수 있다.
이롭게는, 2개의 이중특이적 항체 또는 항체 단편을 사용함으로써 본 개시내용의 분자, 예컨대, 본원에 기술된 이중특이적 항체 복합체는 잠재적으로는 최대 4개의 상이한 항원에 대하여 특이적일 수 있다(즉, 복합체는 사중특이적일 수 있다). 이를 통하여 결합활성 유형 효과를 조사할 수 있다 .
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제1 융합 단백질 A-X에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 단일특이적 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab', scFv 등이고, 특히, CD22에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제2 융합 단백질 B-Y에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 단일특이적 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, Fab, Fab', scFv 등이고, 특히, CD79a 및/또는 CD79b에 특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제2 융합 단백질 B-Y에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이고, 즉, 2개 이상의 결합 도메인을 가진다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제1 융합 단백질 A-X에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 1가이고, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제2 융합 단백질 B-X에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 1가이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자의 결합 도메인은 1가이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용의 다중특이적 분자의 결합 도메인은 1가 및 단일특이적이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제1 융합 단백질 A-X에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 1가이고, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제2 융합 단백질 B-Y에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제1 융합 단백질 A-X에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이고, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제2 융합 단백질 B-Y에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 1가이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제1 융합 단백질 A-X에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이고, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 제2 융합 단백질 B-Y에서 사용되는 항체 또는 항체 단편은 다가이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분, 예컨대, 이중특이적 항체 복합체의 제1 항체, 제2 항체, 또는 제1 및 제2 항체, 둘 모두는 IgG 포맷일 수 있고, 예를 들어, 항CD22 및/또는 항CD79 항체는 IgG 포맷으로 제공될 수 있다.
한 실시양태에서, 항체 단편은 단편 항원(Fab) 단편, 단일 쇄 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(sdAb)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 예컨대, scFv가 제1(A-X) 또는 제2 융합 단백질(B-Y)에서 사용된다. 이롭게는, scFv의 작은 크기가 이중특이적 항체 복합체의 올바른 폴딩을 촉진시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 항체 복합체의 제1(A), 제2 항체/단편(B) 또는 제1 및 제2 항체/단편, 둘 모두 Fab일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 항체 복합체의 제1, 제2 항체/단편, 또는 제1 및 제2 항체/단편, 둘 모두는 VHH이다.
본 개시내용의 이중특이적 복합체와 관련하여 사용되는 바, "융합 단백질"이란, 결합 파트너에 부착된 단백질, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편을 의미한다.
편의상, 본 개시내용의 이중특이적 단백질 복합체는 본원에서 A-X:Y-B로 지칭된다. 그러나, 본 발명자들의 실험에서는 결합 파트너 X 및 Y가 역전될 수 있다고, 즉, 본 방법에 어떤 불리한 영향도 미치치 않으면서 A-Y 및 B-X로 역전될 수 있는 것으로 나타난 바, 이에 상기와 같은 명명법이 융합 단백질 A-X 및 B-Y를 디자인하는 방법을 제한하는 것으로 의도되지는 않는다. 따라서, A 및 B, 및 X 및 Y는 본 기술의 설명을 돕기 위한 것으로 언급되는 명목상의 라벨이다.
본원에서 사용되는 바, "부착된"이란, 직접 또는 링커, 예컨대, 펩티드 링커를 통해 간접적으로 연결 또는 결합되는 것을 지칭하며, 상기 링커의 예는 하기에서 논의된다. 직접 연결되는 것은 함께 융합되거나(예를 들어, 펩티드 결합) 또는 화학적으로 컨쥬게이션되는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "결합 파트너"란, 결합 쌍의 한 성분 부분을 지칭한다.
한 실시양태에서, 결합 파트너의 친화도는 5 nM 또는 더 강력하고, 예컨대, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM 또는 더 강력하다.
본원에서 사용되는 바, "결합 쌍"이란, 서로 특이적으로 결합하는 두 결합 파트너를 지칭한다. 결합 쌍의 예로는 펩티드와 그에 특이적인 항체 또는 결합 단편, 또는 효소와 리간드, 또는 효소와 상기 효소의 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(X)는 전장의 항체, Fab, Fab', scFv, 펩티드 및 sdAb를 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서, sdAb의 예로는 VH 또는 VL 또는 VHH를 포함한다.
한 실시양태에서, 제2 파트너(Y)는 전장의 항체, Fab, Fab', scFv, 펩티드 및 sdAb를 포함하는 군으로부터 선택되고, 여기서, sdAb의 예로는 VH 또는 VL 또는 VHH를 포함한다.
한 실시양태에서, A가 항체 또는 그의 단편일 경우, 제1 결합 파트너(X)는 제1 항체 또는 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단에 부착되고, 예를 들어, 제1 결합 파트너는 제1 항체 또는 항체 단편의 중쇄의 C 말단에 부착된다.
또 다른 실시양태에서, B가 항체 또는 그의 단편일 경우, 제2 결합 파트너(Y)는 제2 항체 또는 항체 단편의 C 말단에 부착되고, 예를 들어, 제2 결합 파트너는 제2 항체 또는 항체 단편의 중쇄의 C 말단에 부착된다.
한 실시양태에서, X는 항체 또는 단편(단백질 A)의 중쇄의 C 말단에 부착되고, Y는 항체 또는 단편(단백질 B)의 C 말단에 부착된다.
한 실시양태에서, X는 링커(예컨대, ASGGGG 또는 ASGGGGSG)를 통해 항체 또는 단편(단백질 A)의 중쇄의 C 말단에 부착되고, Y는 링커(예컨대, ASGGGG 또는 ASGGGGSG)를 통해 항체 또는 단편(단백질 B)의 C 말단에 부착된다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 결합 파트너(X 또는 Y)는 펩티드이다.
적합한 결합 쌍의 예로는 GCN4(서열 번호: 1) 또는 그의 변이체와, GCN4에 특이적인 scFv인 것인, 52SR4(서열 번호: 3) 또는 그의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(명목상 X)는 GCN4(예를 들어, 서열 번호: 1에 제시된 것) 또는 그의 변이체(예를 들어, His 태그 비포함)이고, 제2 결합 파트너(명목상 Y)는 GCN4(예를 들어, 서열 번호: 3에 제시된 것) 또는 그의 변이체에 특이적인 scFv이다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(명목상 X)는 GCN4(예를 들어, 서열 번호: 3에 제시된 것) 또는 그의 변이체에 특이적인 scFv이고, 제2 결합 파트너(명목상 Y)는 GCN4(예를 들어, 서열 번호: 1에 제시된 것) 또는 그의 변이체이다.
GCN4 변이체는 서열 번호: 1과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97% 또는 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. GCN4 변이체는 또한 서열 번호: 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호: 2와 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서열에 대해 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상인 것을 가지는 아미노산을 포함한다.
GCN4에 특이적인 적합한 scFv는 52SR4(서열 번호: 3) 또는 그의 변이체이다. 52SR4의 변이체는 서열 번호: 3과 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 52SR4 변이체는 또한 서열 번호: 4의 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 조건하에서 서열 번호: 2와 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 서열에 대해 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98%, 또는 99% 이상인 것을 가지는 아미노산을 포함한다.
본 발명자들은 단일 쇄 항체 52SR4 및 펩티드 GCN4가 본 개시내용의 이중특이적 단백질 복합체에서 사용하는 데 결합한 결합 쌍이라는 것을 발견하게 되었다.
대안적으로, 임의의 적합한 항체/단편 및 항원(예컨대, 펩티드)이 X 및 Y로서 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(X) 및 제2 결합 파트너(Y)는 단백질이다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(X)는 효소 또는 그의 활성 단편이고, 제2 결합 파트너(Y)는 리간드인 경우이거나, 또는 그 반대의 경우이다.
한 실시양태에서, 제1 결합 파트너(X)는 효소 또는 그의 활성 단편이고, 제2 결합 파트너(Y)는 상기 효소의 억제제인 경우이거나, 또는 그 반대의 경우이다.
본원에서 사용되는 바, "활성 단편"이란, 엔티티를 위한 전체 아미노산 서열보다는 작고, 본질적으로 동일한 생물학적 활성 또는 관련된 생물학적 활성을, 예를 들어, 50% 초과의 활성, 예컨대, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 활성을 유지하는 아미노산 단편을 의미한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 결합 파트너 X는 글루타티온(GSH)이고, 제2 결합 파트너 Y는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)인 경우이거나, 또는 그 반대의 경우이다.
또 다른 실시양태에서, X는 Fos이고, Y는 Jun인 경우이거나, 또는 그 반대의 경우이다.
또 다른 실시양태에서, X는 His이고, Y는 항His인 경우이거나, 또는 그 반대의 경우이다.
또 다른 실시양태에서, 결합 쌍은 칼모듈린 결합 펩티드이고, Y는 칼모듈린인 경우이거나, 또는 그 반대의 경우이다.
또 다른 실시양태에서, X는 말토스-결합 단백질이고, Y는 항말토스 결합 단백질 또는 그의 단편인 경우이거나, 또는 그 반대의 경우이다.
다른 효소-리간드 조합 또한 결합 파트너로 사용하기 위한 것으로 고려된다. 당업계에 공지된 친화도 태그 또한 단백질 정제에 적합한데, 그 이유는 상기 친화도 태그가 그의 각 결합 파트너에 대하여 높은 친화도로 결합하는 경향이 있기 때문이다.
한 실시양태에서, 제1 또는 제2 결합 파트너(X 또는 Y)는 단백질 또는 펩티드이다.
한 실시양태에서, 제1 및 제2 융합 단백질은 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 링커는 융합 단백질에서 다양한 위치에 도입될 수 있다. 예를 들어, 링커는 결합 파트너와, 그에 부착된 단백질 사이에 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다.
본원에서 사용되는 바, "펩티드 링커"라는 용어는 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 지칭한다. 다양한 적합한 펩티드 링커가 당업자에게 공지될 것이다.
한 실시양태에서, 펩티드 링커는 합성 기원, 즉, 합성 화학 기법에 의해 제조된 것일 수 있다.
한 실시양태에서, 이중특이적 단백질 복합체의 결합 파트너는 펩티드 링커를 통해 그의 각 단백질에 연결된다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 융합 단백질의 발현 기점이 되는, 유전적 구성체를 포함하는 숙주 세포에서 발현된 융합 단백질인, 번역 융합물이다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 임의적으로 펩티드 링커를 통해 A를 X에, 또는 B를 Y에 컨쥬게이션시킴으로써 제조된다.
한 실시양태에서, 펩티드 링커의 길이는 50개 이하의 아미노산 길이, 예를 들어, 20개 이하의 아미노산 길이이다.
일반적으로, 융합 단백질을 재조합적으로 발현시키는 것이 더욱 효율적일 것이며, 따라서, 숙주 세포에 의해 발현될 수 있는 직접적인 펩티드 결합 또는 펩티드 링커가 이로울 수 있다.
한 측면에서,
(a) 결합 쌍의 제1 결합 파트너(X)에 부착된, CD22또는 CD79a 및/또는 CD79b에 대해 특이적인 결합 도메인(A)를 포함하는 제1 융합 단백질(A-X)을 제조하는 단계;
(b) 결합 쌍의 제2 결합 파트너(Y)에 부착된, CD22또는 CD79a 및/또는 CD79b에 대해 특이적인 결합 도메인(B)를 포함하는 제2 융합 단백질(B-Y)을 제조하는 단계로서,
여기서, 적어도 제1 융합 단백질 또는 제2 융합 단백질은 CD22에 대해 특이적인 결합 도메인을 포함하고, 남은 융합 단백질은 CD79a 및/또는 CD79b에 대해 특이적인 결합 도메인을 포함하는 것인 단계; 및
(c) 단계 a) 및 b)에서 제조된 제1 융합 단백질(A-X) 및 제2 융합 단백질(B-Y)을 함께 혼합하는 단계를 포함하는, 본 개시내용의 이중특이적 단백질 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
특히, 시험관내에서 A-X 및 B-Y를 혼합함으로써 이종이량체 방식으로 테더링된 이중특이적 단백질 복합체를 제조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 방법은 A-X 및 B-Y를 접촉시키는 시험관내 혼합 단계를 포함한다.
따라서, 일반적으로, 융합 단백질 A-X 및 B-Y는 같은 세포에서 공동 발현되지 않는다. 이는 예를 들어, 100개의 A-X 융합 단백질 및 100개의 A-Y 융합 단백질을 따로따로 발현시킬 수 있고, 임의적으로 정제할 수 있도록 허용하기 때문에 이롭고, 다양한 순열로 200개의 융합 단백질을 혼합하는 후속 혼합 단계를 통해 10,000개의 이종이량체 방식으로 테더링된 이중특이적 단백질 복합체를 제공할 수 있다.
그에 반해, 선행 기술의 방법에서는 이중특이적인 것을 공동 발현하여야 하고, 10,000개의 복합체의 경우, 10,000번의 형질감염, 발현 및 정제가 요구된다.
결합 파트너 X 및 Y는 서로에 대한 친화도를 가지며, 벨크로® 또는 막대 및 자기의 생물학적 등가물로서의 역할을 하고, 복합체를 함께 결합시킨다. 이롭게는, 이는 간단하게는 융합 단백질 A-X 및 Y-B을 함께 혼합함으로써 상기 융합 단백질을 이중특이적 단백질 복합체로 쉽게 조립할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 단백질 복합체는 예를 들어, 그리드 유사 방식으로 항원 특이성의 상이한 조합을 가진 이중특이적 단백질 복합체 순열의 큰 패널 생성을 위해 상이한 두 단백질이 쉽게 조립될 수 있도록 하는 모듈식 구조를 가진다. 이를 통해서 상가적, 시너지 또는 신규한 생물학적 기능 검출을 위한 다수의 이중특이적 단백질 복합체의 효율적이고 체계적인 스크리닝이 이루어질 수 있다.
단, X 및 Y가 서로에 대하여 특이적일 경우, 이는 동종이량체를 형성할 수 있는 능력을 유의적으로 감소시킨다. X 및 Y는 본원에서 총칭하여 결합 쌍 또는 결합 파트너로 지칭된다. 한 실시양태에서, X는 다른 X에 대해서는 높은 친화도를 가지지 않는다. 한 실시양태에서, Y는 다른 Y에 대해서는 높은 친화도를 가지지 않는다. 이롭게는, X 및 Y가 동종이량체를 형성하지 않을 때, 이는 원치않는 단일특이적 단백질 복합체의 형성을 막고, 원하는 이중특이적 단백질 복합체의 수율을 증가시키고, 단일특이적 단백질 복합체를 제거하기 위해 수행되어야 하는 번거로운 정제 단계의 필요성을 없애준다.
이러한 이중특이적 단백질 복합체의 신속한 조립, 수율 및/또는 순도 수준은 선행 기술의 방법으로는 효율적으로 얻을 수 없고, 특히, 선행 기술의 방법은 광범위한 정제 단계를 필요로 한다.
이롭게는, X 및 Y 성분을 통해 융합 단백질의 상이한 순열로 구성된 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 멀티플렉스는 쉽고 빠르게 조립될 수 있다.
한 실시양태에서, 단백질 A 및 B는 항체 또는 항체 단편이다. 항체 또는 항체 단편이 X 및 Y를 통하여 복합체로서 함꼐 결합될 때, 이는 이중특이적 항체 복합체를 형성한다.
혼합 단계는 일반적으로 X 및 Y가 상호작용할 수 있는 조건에서 수행된다. 한 실시양태에서, 융합 단백질을 세포 배양 조건하에 세포 배양 배지 중에서 인큐베이션시키고, 예를 들어, 융합 단백질을 37℃/5% CO2 환경에서 90분 동안 인큐베이션시킨다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질을 수성 환경에서 혼합하고, 예를 들어, 한 융합 단백질을 고체 표면, 예컨대, 비드 또는 플레이트에 결합시킬 수 있고, 나머지 다른 한 융합 단백질은 수용액/수성 현탁액 중에서 그에 도입시킬 수 있다. 고체상을 통해 과량의 성분 및 시약을 세척으로 쉽게 제거될 수 있다. 한 실시양태에서, 어떤 융합물도 고체상에 부착되지 않고, 액체/용액/배지 중에서 간단히 혼합될 수 있다.
이롭게는, 본 개시내용의 방법은 이종 쌍 사이에(즉, 제1 융합 단백질[A-X] 및 제2 융합 단백질[B-Y] 사이에) 형성되는 복합체를 제조하는 데 사용될 수 있고, 여기서, 동종 쌍 사이의(즉, 제1 융합 단백질[A-X] 및 제2 융합 단백질[B-Y] 사이의) 상호작용은 최소화된다. 따라서, 본 발명을 통하여 동종이량체 복합체는 최소로, 또는 그의 오염 없이, 다수의 이중특이적 단백질 복합체를 제조할 수 있다. 순도 및 수율 수준은 선행 기술의 방법을 사용하는 경우에 가능한 것은 아니다.
한 실시양태에서, 형성된 복합체는 추가의 정제 단계를 필요로 하지 않는다.
한 실시양태에서, 형성된 복합체는 한번의 정제 단계, 예를 들어, 칼럼 크로마토그래피를 필요로 한다.
한 실시양태에서, 본 방법은 예를 들어, 본 개시내용에 따라 융합 단백질의 발현 이후에, 1회 이상의 정제 단계를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "기능 검정법"은 검정 조건을 조건으로 하여 단백질 복합체, 항체 복합체 또는 항체의 혼합물의 하나 이상의 원하는 특성 또는 활성을 측정하는 데 사용될 수 있는 검정법이다. 적합한 기능 검정법은 결합 검정법, 아폽토시스 검정법, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC) 검정법, 보체 의존성 세포독성(CDC) 검정법, 세포 성장 또는 증식 억제(세포 분열 억제 효과) 검정법, 세포 사멸(세포독성 효과) 검정법, 세포 신호전달 검정법, 사이토카인 생산 검정법, 항체 생산 및 이소형 전환, 및 세포 분화 검정법일 수 있다. 한 실시양태에서, 마우스 종양 모델, 자가면역 질환 모델, 바이러스 감염 또는 박테리아 감염 설치류 또는 영장류 모델 등을 비롯한, 동물 모델과 같은 생체내 검정법은 본 개시내용의 분자를 시험하는 데 사용될 수 있다.
이중특이적 항체 복합체와 관련하여, 본 개시내용에 따른 이중특이적 항체 복합체의 효능을 당업계의 숙련가에게 일반적으로 알려져 있는 방법에 의해 상기 모델에서 개별 항체 또는 항체(또는 단편)의 혼합물과 비교할 수 있다.
결과의 신뢰도를 증강시키기 위해 필요에 따라 특정 이중특이적 항체 복합체의 상이한 샘플을 사용하거나 사용하지 않고, 수회에 걸쳐 기능 검정법을 반복 수행할 수 있다. 통계학상 유의적인 결과를 확인하고, 이로써, 생물학적 기능을 가진 이중특이적 항체 복합체를 확인하는 데, 및 특히, 본 발명의 다중특이적 분자에서의 사용을 위해 최적인 가변 영역을 확인하는 데 당업자에게 공지된 다양한 통계학적 검정이 사용될 수 있다.
조성물 및 의학적 용도
한 측면에서, 본 개시내용에 따른 분자, 또는 성분, 예컨대, 융합 단백질, 이종이량체 방식으로 테더링된 이중특이적 단백질 복합체, 본 발명의 분자를 포함하는 조성물(본원에서 정의된 것과 같은 융합 단백질 또는 상기 이중특이적 단백질 복합체, 멀티플렉스, 어레이, 라이브러리 포함)을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자, 예를 들어, 본원에 기술된 항체, 다중특이적 분자 및 이중특이적 단백질 복합체는 치료학적 적용을 위해 적합하고, 질환 치료를 위한 신규한 요법을 제공할 수 있다. 따라서, 추가 측면에서, 요법에서 사용하기 위한, 본 개시내용의 분자, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 이중특이적 단백질 복합체를 제공한다. 본원에 기술된 이중특이적 단백질 복합체를 포함하는 본 개시내용의 분자는 다양한 질환, 예컨대, 암을 치료하는 데 적합하다.
본원에 기술된 다중특이적 분자 및 이중특이적 단백질 복합체를 비롯한, 본 개시내용의 분자는 또한 각종 자가면역 질환에서 면역 및 자가면역 반응을 제어하기 위해 B 세포 기능을 억제시키는 데 특히 적합하다.
따라서, 본 개시내용은 치료적 유효량의, 본 개시내용의 분자, 예를 들어, 본 개시내용의 다중특이적 분자 또는 이중특이적 단백질 복합체를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 질환을 치료하는 방법으로 확장된다.
한 측면에서, 본 개시내용의 하나 이상의 분자, 예를 들어, 본 개시내용의 다중특이적 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 비롯한, 각종의 상이한 성분이 조성물에 포함될 수 있다. 조성물은 임의적으로, 본 발명의 다중특이적 분자 집단의 특징을 변경시킴으로써, 예를 들어, 항체의 기능을 감소, 안정화, 지연, 조절 및/또는 활성화시킬 수 있는 추가의 분자를 포함할 수 있다. 조성물은 고체, 또는 액체 형태일 수 있고, 특히, 분제, 정제, 또는 액제 또는 에어로졸 형태일 수 있다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상의 것과 조합된, 본 발명의 항체 분자 또는 다중특이적 분자를 포함하는 약학 조성물 또는 진단학적 조성물을 제공한다. 따라서, 치료에서 사용하기 위한, 병리학적 병태 또는 장애 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 다중특이적 분자의 용도를 제공한다.
병리학적 병태
병리학적 병태 또는 장애는 예를 들어, 감염(바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충 감염), 감염과 관련된 내독성 쇼크, 관절염, 예컨대, 류마티스 관절염, 천식, 예컨대, 중증 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease), 골반 염증성 질환, 알츠하이머병, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 결장염, 파이로니병, 만성 소화 장애, 담낭 질환, 모소성 질환, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, I형 당뇨병, 라임병, 수막뇌염, 자가면역 포도막염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개 염증성 장애, 예컨대, 다발성 경화증, 루프스(예컨대, 전신 홍반성 루프스) 및 길랭-바레 증후군, 아토피성 피부염, 자가면역 간염, 섬유성 폐포염, 그레이브스병, IgA 신장병증, 특발성 혈소판감소성 자반병, 메니에르병, 수포창, 원발성 담즙 간경변, 사르코이드증, 피부 경화증, 베게너 육아종증, 다른 자가면역 장애, 췌장염, 외상(수술), 이식편 대 숙주 질환, 이식 거부, 심장 질환, 예컨대, 허혈성 질환, 예컨대, 심근경색 뿐만 아니라, 아테롬성 동맥 경화증, 혈관내 응고, 골흡수, 골다공증, 골관절염, 치주염, 위산저하증 및 암, 예컨대, 유방암, 폐암, 위암, 난소암, 간세포암, 결장암, 췌장암, 식도암, 두부경부암, 신장암, 특히, 신장 세포 암종, 전립선암, 간암, 흑색종, 육종, 골수종, 신경아세포종, 태반성 융모막 암종, 자궁경부암, 및 갑상선암, 및 그의 전이성 형태로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
한 실시양태에서, 장애는 암, 예를 들어, 백혈병, 예컨대, 림프구성 백혈병, 예컨대, 급성 림프아구성 백혈병 또는 만성 림프구 백혈병; 또는 골수성 백혈병, 예컨대, 급성 골수성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병이다.
한 실시양태에서, 자가면역 질환으로는 급성 파종 뇌척수염(adem: Acute disseminated encephalomyelitis), 급성 괴사 출혈 백색질뇌염, 에디슨병, 부신기능 부전증, 코르티솔결핍증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 척추관절염, 스트럼펠-마리 병(Strumpell-marie disease), 항GBM/항TBM 신장염, 항인지질 증후군(aps: antiphospholipid syndrome), 자가면역 혈관부종, 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 자율 신경 장애, 자가면역 간염, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍증, 자가면역 내이 질환(AIED: autoimmune inner ear disease), 자가면역 림프세포증식 증후군(ALPS: autoimmune lymphoproliferative syndrome), 카날-스미스 증후군(Canale-Smith syndrome), 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 자가면역 췌장염(AIP: autoimmune pancreatitis), 자가면역 다선성 증후군(I, II & III형), 자가면역 망막증(AR: autoimmune retinopathy), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP: autoimmune thrombocytopenic purpura), 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 두드러기, 축삭돌기/신경세포성 신경병증, 발로병, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 캐슬만병, 만성 소화 장애, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP: chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 만성 재발성 다병소성 골수염(CRMO: chronic recurrent multifocal ostomyelitis), 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창/양성 점막 유천포창(CP), 크론병, 염증성 장 질환, 결장염, 장염, 회장염, 코간 증후군, 저온 응집병, 선천성 심블록, 콕스삭키 심근염, 능선 질환, 한랭글로불린혈증, 탈수초성 신경병증, 포진 피부염, 두링병, 피부근염, I형 당뇨병, 원판상 홍반성 루푸스(DLE: discoid lupus erythematosus), 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 수포성 표피박리증(EB: epidermolysis bullosa) 및 후천성 eb (EBA: eb acquisita), 호산성 위장염, 식도염, 호산성 근막염, 슐먼 증후군, 결절성 홍반, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 에반스 증후군, 섬유성 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두 동맥염), 거대 세포 심근염, 사구체신염(비증식성: 국소 분절 사구체경화증 및 막 사구체신염. 증식성: IgA 신장병증), 굿파스처 증후군, 다발혈관염 동반성 육아종증(GPA: granulomatosis with polyangiitis)(종래 베게너 육아종증으로 불림), 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 밀러 피셔 증후군, 급성 운동 축삭 신경병증, 급성 운동 감각 축삭 신경병증, 급성 범자율신경계 신경병증, 비커스태프 뇌간 뇌염, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반병, 임신성 포진, 저감마글로부민혈증, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP: idiopathic thrombocytopenic purpura), IgA 신장병증(IGAN), 버거 증후군, 후두염동반성 사구체신염, IgA 수포창, IgG4-관련 경화성 질환, 면역 조절 불임증, 봉입체 근염, 인슐린 의존성 당뇨병, 간질성 방광염, 아이작 증후군, 신경근 긴장증, 소아성 관절염, 소아성 근염, 가와사키 증후군, 람베르트-이튼 증후군, 백혈구 파괴성 혈관염, 편평태선, 경화성 태선, 목질 결막염, 선상 IgA 피부증(LAD: linear IgA dermatosis), 유천포창, 루프스(SLE), 라임병, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염(MPA: microscopic polyangiitis), 혼합형 결합 조직 질환 (MCTD: mixed connective tissue disease), 모노클로날 감마글로불린병증, 잠식성 각막 궤양, 무하-하버만 질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시각 신경척수염(데빅병), 신경근 긴장증, 아이작 증후군(후천성, 부신생물성, 유전성), 호중성 백혈구 감소증, 안구 반흔성 유천포창, 시신경염, 난소염, 안구간대경련-근간대경련 증후군, 고환염, 재발성 류마티즘, pandas(연쇄상구균 관련 소아 자가면역 신경 정신병성 장애: pediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcus), 부신생물성 자가면역 다기관 증후군(PAMS: paraneoplastic autoimmune multiorgan syndrome), 부신생물성 소뇌 변성, 부신생물성 수포창(PNP: paraneoplastic pemphigus), 발작성 야간 혈색뇨(PNH: paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 패리 롬버그 증후군, 파슨니지-터너 증후군(Parsonnage-Turner syndrome), 평면부염(말초 포도막염), 임신성 유천포창(PG: pemphigoid gestationis), 심상성 수포창(PV: pemphigus vulgaris), 낙엽성 수포창(PF: pemphigus foliaceus), 말초 신경병증, 정맥 주위 뇌척수염, 악성 빈혈, Poems 증후군, 결절성 다발동맥염(PAN: polyarteritis nodosa), 류마티스성 다발근육통증, 폴리근염, 심근경색 후 증후군, 심막절개술후 증후군, 면역프로게스테론 피부염, 원발성 담즙 간경변, 하노트 증후군, 원발성 경화성 담관염(PSC: primary sclerosing cholangitis), 경화성 담관염, 건선, 건선 관절염, 괴저성 농피증, 순수 적혈구 무형성증, 라스무센 뇌염, 만성 국소 뇌염(CFE: chronic focal encephalitis), 레이노 현상, 반응성 관절염, 라이터 증후군, 리코베린 관련 망막증(RAR: recoverin-associated retinopathy), 반사 교감 신경이상증, 라이터 증후군, 재발성 다발연골염, 하지 불안 증후군, 복막후 섬유증, 류마티스성 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 슈미트 증후군, 공막염, 피부 경화증, 전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 정자 & 고환 자가면역, 강직 인간 증후군, 아급성 박테리아 심장내막염(SBE: subacute bacterial endocarditis), 수삭 증후군, 교감성 안염, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 폐색성 혈전 혈관염, 버거스병, 혈소판감소성 자반병(TTP), 톨로사-헌트 증후군, 횡단 척수염, 궤양성 결장염, 미분화 결합 조직 질환(UCTD: undifferentiated connective tissue disease), 포도막염, 류마티스성 다발근육통증a, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염, 버거스병, 피부 혈관염, 가와사키병, 결절성 다발동맥염, 베체트 증후군, 처그-스트라우스 증후군, 피부 혈관염, 헤노흐-쇤라인 자반병, 현미경적 다발혈관염, 베게너 육아종증, 골퍼 혈관염, 대소수포성 피부병, 백반 베게너 육아종증(현재 다발혈관염 동반성 육아종증(GPA)으로 명명됨)을 포함한다.
한 실시양태에서, 자가면역 질환은 ANCA 혈관염, IgA 신장병증(버거스병), 심상성 수포창/수포성 유천포창, ITP, 원발성 담즙 간경변, 자가면역 갑상선염(그레이브스병), 하시모토 질환, 루푸스 신장염, 막 사구체신염(또는 막 신장병증), APS, 중증 근무력증, 시각 신경척수염, 원발성 쇼그렌, 자가면역 호중성 백혈구 감소증, 자가면역 췌장염, 피부근염, 자가면역 포도막염, 자가면역 망막증, 베체트벼, IPF, 전신 경화증, 간 섬유증, 자가면역 간염, 원발성 경화성 담관염, 백반, 굿파스처 증후군, 폐포 단백증, 만성 자가면역 두드러기, 건선, 류마티스 관절염, 건성 관절염, 축삭 척추관절염, 이식(GvHD 포함), 천식, COPD, 거대 세포 동맥염, 난치성 자가면역 혈구감소증, 에반스 증후군(자가면역 용혈성 빈혈), I형 당뇨병, 사르코이드증, 폴리근염, 궤양성 결장염, 크론병, 만성 소화 장애, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증, 국소 분절 사구체경화증, 만성 라임병(라임 보렐리아증), 편평태선, 강직 인간 증후군, 확장성 심근병증, 자가면역(림프구) 난소염, 후천성 수포성 표피박리증, 자가면역 위축성 위염, 악성 빈혈, 아토피성 피부염, 아테롬성 동맥 경화증, 다발성 경화증, 라스무센 뇌염, 길랭-바레 증후군, 후천성 신경근 긴장증, 뇌졸중을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 장애는 암, 예를 들어, 백혈병, 예를 들어, 림프구성 백혈병, 예컨대, 급성 림프아구성 백혈병 또는 만성 림프구 백혈병; 또는 골수성 백혈병, 예컨대, 급성 골수성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병; 또는 림프종, 예컨대, 미만성 큰 B 세포 림프종 또는 호지킨 또는 비호지킨 림프종이다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상의 것과 함께 조합하여 본 개시내용의 분자, 예컨대, 본원에 기술된 다중특이적 분자를 포함하는 약학 조성물 또는 진단학적 조성물을 제공한다. 따라서, 치료에서 및 의약 제조에서 사용하기 위한 본 개시내용의 분자, 예컨대, 본원에 기술된 다중특이적 분자의 용도를 기술한다.
조성물은 일반적으로는 보통 약학적으로 허용되는 담체를 포함하게 되는 멸균 약학 조성물의 일부로서 공급될 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용되는 애주번트를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 다중특이적 분자를 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상의 것과 함께 첨가하고, 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 조성물 또는 진단학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "약학적으로 허용되는 부형제"라는 용어는 본 개시내용의 조성물의 원하는 특징을 증진시키는 약학적으로 허용되는 제제 담체, 용액 또는 첨가제를 의미한다. 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있고, 이는 완충제(예컨대, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 비카보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예컨대, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨, 및 글리세롤을 포함한다. 액제 또는 현탁제는 리포솜 또는 생체분해성 미세구에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 멸균 제조 공정을 사용하여 실질적으로 멸균성인 형태로 제공될 것이다.
이는 제제화에 사용되는 완충처리된 용매/용액을 여과하고, 멸균 완충처리된 용매/용액 중에 항체를 무균 방식으로 현탁시키고, 당업계의 숙련가에게 익숙한 방법에 의해 상기 제제를 멸균 용기에 분배함으로써 생산 및 멸균화하는 것을 포함할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 그 자체가 조성물을 받는 개체에게 유해한 항체 생산을 유도하지 않아야 하고, 독성을 띠지 않아야 한다. 적합한 담체는 크고, 천천히 대사되는 거대분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 무기산 염, 예컨대, 하이드로클로라이드, 하이브로브로마이드, 포스페이트 및 술페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 사용될 수 있다.
치료학적 조성물 중의 약학적으로 허용되는 담체는 추가적으로 액체, 예컨대, 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 상기 담체를 통해 약학 조성물은 환자가 복용할 수 있는 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리 및 현탁제로서 제제화될 수 있다.
본 개시내용의 분자, 예컨대, 본원에 기술된 다중특이적 분자는 예컨대, 용액 또는 현탁액 형태로 용매 중에 분산되어 전달될 수 있다. 이는 적절한 생리학적 용액, 예컨대, 생리학적 염수, 약리학적으로 허용되는 용매 또는 완충처리된 용액 중에 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충처리된 용액은 pH 약 4.0 내지 5.0을 달성하기 위해 물 1 ml당 0.05 mg 내지 0.15 mg 디소듐 에데테이트, 8.0 mg 내지 9.0 mg NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg 소듐 시트레이트를 함유할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 현탁액은 예를 들어, 동결건조된 항체로부터 제조될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체에 관한 상세한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 이용가능하다.
본원에서 사용되는 바, "치료적 유효량"이라는 용어는 표적화된 질환 또는 병태를 치료, 호전, 또는 예방하는 데, 또는 검출가능한 치료학적 또는 예방학적 효과를 보이도록 하는 데 필요한 치료제의 양을 의미한다. 임의의 항체의 경우, 치료적 유효량은 초기에 세포 배양 검정법에서, 또는 동물 모델에서, 일반적으로, 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 예측될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는 데에도 사용될 수 있다. 이어서, 상기 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정할 수 있다.
인간 피험체에 대해 정확한 치료적 유효량은 질환 상태의 중증도, 피험체의 건강 상태, 피험체의 연령, 체중, 및 성별, 섭식, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감수성 및 요법에 대한 내성/반응에 의존하게 될 것이다. 이 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의의 판단 범위 내에 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg, 예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg일 것이다. 대안적으로, 용량은 1 mg/일 내지 500 mg/일, 예컨대, 10 mg/일 내지 100 mg/일, 200 mg/일, 300 mg/일 또는 400 mg/일일 수 있다. 약학 조성물은 편리하게 본 발명의 활성제를 미리 결정된 양으로 함유하는 단위 투약 형태로 제공될 수 있다.
조성물은 개별적으로 환자에게 투여될 수 있거나, 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합하여(예컨대, 동시에, 순차적으로 또는 별개로) 투여될 수 있다.
본 개시내용의 다중특이적 분자가 투여되는 용량은 치료하고자 하는 병태의 성질, 존재하는 염증의 정도, 및 항체가 예방학적으로 사용되는지 또는 현재 앓고 있는 병태를 치료하기 위한 것인지 여부에 의존하여 투여된다.
투약 빈도는 다중특이적 분자의 반감기 또는 그의 효과 지속 기간에 의존할 것이다. 다중특이적 분자의 반감기가 짧다면(예컨대, 2시간 내지 10시간), 1일 1회 이상 투약하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로 다중특이적 분자의 반감기가 길다면(예컨대, 2일 내지 15일), 단지 1일 1회, 주 1회, 또는 심지어는 매달 또는 격월마다 1회 투여량을 제공하는 것이 필요할 수 있다.
본 개시내용에서, 최종 제제의 pH는 다중특이적 분자의 등전점 값과 유사하지 않고, 제제의 pH가 7일 경우, 이때는 pI가 8-9 이상인 것이 적절할 수 있다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 궁극적으로는 안정성이 개선된 최종 제제, 예를 들어, 항체 또는 단편이 용액 중에서 그대로 유지되는 것을 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 관절내, 척수내, 경막내, 심실내, 경피적, 피부경유(예를 들어, WO98/20734 참조), 피하, 복강내, 비내, 장내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이 또한 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하로, 복강내로 또는 정맥내로 또는 근육내로의 주사에 의해 달성될 수 있거나, 조직의 간극 공간으로 전달될 수 있을 것이다. 조성물은 또한 관심의 대상이 되는 특정 조직으로 투여될 수 있다. 투여 치료는 단일 투약 스케줄 또는 다회 투약 스케줄일 수 있다.
생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 이는 오일성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 액제, 또는 에멀젼 형태를 취할 수 있고, 제제화 작용제, 예컨대, 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 다중특이적 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체로 재구성되는 건식 형태일 수 있다. 조성물이 위장관 경로를 사용하여 투여하고자 하는 것인 경우, 조성물은 항체가 분해되지 못하도록 그를 보호하지만, 일단 위장관으로부터 흡수되고 나면, 이중특이적 단백질 복합체를 유리시키는 것인 작용제를 함유하는 것을 필요로 할 것이다.
본 개시내용에 따른 분무가능한 제제는 예를 들어, 호일 인벨럽에 패킹된 단일 투약 단위(예컨대, 실링된 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각 바이알은 일정 부피로 단위 용량을, 예컨대, 2 ml의 용매/용액 완충제를 함유한다.
본원에서 사용되는 바, "변이체"라는 용어는 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 비교하였을 때, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 변경을 1개 이상 포함하는 펩티드 또는 단백질을 의미한다. 변이체는 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질과 80%, 또는 85%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 그러나, 단, 변이체가 그의 상응하는 야생형 펩티드 또는 단백질과 실질적으로 유사한 기능을 보인다면, 변이체는 80% 미만의 서열 동일성을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 구성체는 적어도 삼중특이적이다. 이러한 상황에서, 추가의 특이성은 관심의 대상이 되는 임의의 항원, 예를 들어, 반감기를 연장시키는 항원, 예컨대, 알부민, 또는 Fc 신생아 수용체(FcRn); 이펙터 기능에 대한 항원, 예컨대, Fc 수용체를 활성화 또는 억제시키는 것 또는 공동 자극 분자; 조직 또는 세포 표적화 항원; 또는 혈액/뇌 장벽(BBB: blood/brain barrier) 전달을 지원하는 항원, 예컨대, 트랜스페린 수용체 또는 LRP1에 대한 것일 수 있다.
본 개시내용은 또한 조성물, 예컨대, 특정 항원 특이성을 가지는 상기의 신규한 포맷을 포함하는 약학 조성물로 확장된다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 치료에서의 포맷 및 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자 또는 다중특이적 분자를 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상의 것과 함께 첨가하고, 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 조성물 또는 진단학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
항체 분자 또는 다중특이적 분자는 약학 조성물 또는 진단학적 조성물 중에서 유일한 활성제일 수 있거나, 다른 항체 성분 또는 비항체 성분, 예컨대, 스테로이드제 또는 다른 약물 분자를 비롯한 다른 활성 성분을 동반할 수 있다.
약학 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 적합하게 포함한다. 본원에서 사용되는 바, "치료적 유효량"이라는 용어는 표적화된 질환 또는 병태를 치료, 호전, 또는 예방하는 데, 또는 검출가능한 치료학적 또는 예방학적 효과를 보이도록 하는 데 필요한 치료제의 양을 의미한다. 임의의 항체의 경우, 치료적 유효량은 초기에 세포 배양 검정법에서, 또는 동물 모델에서, 일반적으로, 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 예측될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는 데에도 사용될 수 있다. 이어서, 상기 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정할 수 있다.
인간 피험체에 대해 정확한 치료적 유효량은 질환 상태의 중증도, 피험체의 건강 상태, 피험체의 연령, 체중, 및 성별, 섭식, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감수성 및 요법에 대한 내성/반응에 의존하게 될 것이다. 이 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의의 판단 범위 내에 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대, 100 mg/Kg일 것이다.
약학 조성물은 편리하게 1회 투약당 미리 결정된 양으로 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 투약 형태로 제공될 수 있다.
조성물은 개별적으로 환자에게 투여될 수 있거나, 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 조합하여(예컨대, 동시에, 순차적으로 또는 별개로) 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 작용제란, 투여되었을 때, 생리학적 효과를 발휘하는 엔티티를 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 약물이란, 치료학적 용량에서 적절한 생리학적 효과를 발휘하는 화학적 엔티티를 의미한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 단편은 면역억제 요법, 예컨대, 스테로이드제, 특히, 프레드니손과 함께 사용된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 단편은 리툭시맙(Rituximab) 또는 다른 B 세포 요법과 함께 사용된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 단편은 임의의 B 세포 또는 T 세포 조절제 또는 면역조절제와 함께 사용된다. 예로는 메토트렉세이트, 마이크로페니올레이트 및 아자티오프린을 포함한다.
본 발명의 항체 분자가 투여되는 용량은 치료하고자 하는 병태의 성질, 존재하는 염증의 정도, 및 항체가 예방학적으로 사용되는지 또는 현재 앓고 있는 병태를 치료하기 위한 것인지 여부에 의존하여 투여된다.
투약 빈도는 항체 분자의 반감기 또는 그의 효과 지속 기간에 의존할 것이다. 항체 분자의 반감기가 짧다면(예컨대, 2시간 내지 10시간), 1일 1회 이상 투약하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로 항체 분자의 반감기가 길다면(예컨대, 2일 내지 15일) 및/또는 약력학적(PD) 프로파일이 장기간 지속되다면, 단지 1일 1회, 주 1회, 또는 심지어는 매달 또는 격월마다 1회 투여량을 제공하는 것이 필요할 수 있다.
한 실시양태에서, 용량은 격주로, 즉, 매월 2회 전달된다.
한 실시양태에서, 추가 용량을 투여하기 전 항약물(이 경우, 항항체) 반응이 웨이닝(waine)할 수 있도록 일정 간격을 두고 투약된다.
본원에서 사용되는 바, 반감기란, 순환 중, 예를 들어, 혈청/혈장 중에서의 분자의 지속 기간을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 약력학적 성질은 본 개시내용의 분자의 생물학적 작용의 프로파일 및 특히, 그의 지속 기간을 의미한다.
약학적으로 허용되는 담체는 그 자체가 조성물을 받는 개체에게 유해한 항체 생산을 유도하지 않아야 하고, 독성을 띠지 않아야 한다. 적합한 담체는 크고, 천천히 대사되는 거대분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.
약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 무기산 염, 예컨대, 하이드로클로라이드, 하이브로브로마이드, 포스페이트 및 술페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대, 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트가 사용될 수 있다.
치료학적 조성물 중의 약학적으로 허용되는 담체는 추가적으로 액체, 예컨대, 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충화 물질이 상기 조성물 중에 존재할 수 있다. 상기 담체를 통해 약학 조성물은 환자가 복용할 수 있는 정제, 환제, 당의정, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리 및 현탁제로서 제제화될 수 있다.
투여에 적합한 형태는 예컨대, 주사 또는 주입에 의해, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구적인 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 이는 오일성 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 액제, 또는 에멀젼 형태를 취할 수 있고, 제제화 작용제, 예컨대, 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체로 재구성되는 건식 형태일 수 있다.
일단 제제화되고 나면, 본 발명의 조성물은 피험체에게 직접 투여될 수 있다. 치료하고자 하는 피험체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시양태에서, 조성물은 인간 피험체에게 투여할 수 있도록 그에 맞게 적합화된다.
본 개시내용에 따라 제제에서 적합하게, 최종 제제의 pH는 항체 또는 단편의 등전점 값과 유사하지 않고, 단백질의 pI 범위가 8-9 이상일 경우, 이때 제제의 pH는 7인 것이 적절할 수 있다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 궁극적으로는 안정성이 개선된 최종 제제, 예를 들어, 항체 또는 단편이 용액 중에서 그대로 유지되는 것을 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
한 예에서, pH 범위가 4.0 내지 7.0인 약학 제제는 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 본 개시내용의 항체 분자, 1 mM 내지 100 mM의 완충제, 0.001% 내지 1%의 계면활성제, a) 10 mM 내지 500 mM의 안정제, b) 10 mM 내지 500 mM의 안정제 및 5 mM 또는 500 mM의 장성 작용제, 또는 c) 5 mM 내지 500 mM의 장성 작용제를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 관절내, 척수내, 경막내, 심실내, 경피적, 피부경유(예를 들어, WO98/20734 참조), 피하, 복강내, 비내, 장내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이 또한 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료학적 조성물은 액상 액제 또는 현탁제로서 주사용으로 제조될 수 있다. 주사 이전에 액체 비히클 중의 액제로 또는 현탁제로 적합한 고체 형태 또는 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하로, 복강내로 또는 정맥내로 또는 근육내로의 주사에 의해 달성될 수 있거나, 조직의 간극 공간으로 전달될 수 있을 것이다. 조성물은 또한 병변으로 투여될 수 있다. 투여 치료는 단일 투약 스케줄 또는 다회 투약 스케줄일 수 있다.
조성물 중 활성 성분은 항체 분자가 된다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 이는 위장관 내에서 쉽게 분해될 것이다. 따라서, 조성물이 위장관 경로를 사용하여 투여하고자 하는 것인 경우, 조성물은 항체가 분해되지 못하도록 그를 보호하지만, 일단 위장관으로부터 흡수되고 나면, 이중특이적 단백질 복합체를 유리시키는 것인 작용제를 함유하는 것을 필요로 할 것이다.
약학적으로 허용되는 담체에 관한 상세한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)]에서 이용가능하다.
한 실시양태에서, 제제는 흡입을 포함하는, 국소 투여용 제제로서 제공된다.
적합한 흡입용 제제는 흡입용 분제, 추진체 가스를 함유하는 계량 에어로졸 또는 추진체 가스가 없는 흡입용 액제를 포함한다. 본 개시내용에 따른, 활성 물질을 함유하는 흡입용 분제는 오직 상기 언급된 활성 물질로만 이루어질 수 있거나, 또는 생리학적으로 허용되는 부형제와 함께 상기 언급된 활성 물질의 혼합물로 이루어질 수 있다.
상기 흡입용 분제는 단당류(예컨대, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예컨대, 락토스, 사카로스, 말로스), 올리고당 및 다당류(예컨대, 덱스트란), 폴리알콜알콜(예컨대, 소르비톨, 만니톨, 크실리톨), 염(예컨대, 염화나트륨, 탄산칼슘) 또는 이들 서로간의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적합하게 사용되며, 락토스 또는 글루코스 사용, 특히, 그의 수화물 형태 사용이 배제되지는 않는다.
폐에 침착되는 입자의 경우, 입자 크기는 10 미크론 미만, 예컨대, 1-9 미크론, 예를 들어, 1 ㎛ 내지 5 ㎛여야 한다. 활성 성분(예컨대, 항체 또는 단편)의 입자 크기가 가장 중요하다.
흡입용 에어로졸을 제조하는 데 사용될 수 있는 추진체 가스는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 추진체 가스는 탄화수소 중에서 예컨대, n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예컨대, 염소화된 및/또는 불소화된, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 추진체 가스는 그 단독으로 또는 그의 혼합물로서 사용될 수 있다.
특히 적합한 추진체 가스는 TG 11, TG 12, TG 134a 및 TG227 중에서 선택되는, 할로겐화된 알칼 유도체이다. 상기 언급된 할로겐화된 탄화수소 중, TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 그의 혼합물이 특히 적합하다.
추진체 가스를 함유하는 흡입용 에어로졸은 또한 다른 성분, 예컨대, 공용매, 안정제, 표면 활성제(계면활성제), 항산화제, 윤활제 및 pH 조절 수단을 함유할 수 있다. 이들 성분들 모두 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른, 추진체 가스를 함유하는 흡입용 에어로졸은 최대 5 중량%의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들어, 0.002 중량% 내지 5 중량%, 0.01 중량% 내지 3 중량%, 0.015 중량% 내지 2 중량%, 0.1 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 2 중량% 또는 0.5 중량% 내지 1 중량%의 활성 성분을 함유한다.
대안적으로, 폐로의 국소 투여 또한 예를 들어, 장치, 예컨대, 분무기, 예를 들어, 압축기에 연결된 분무기(예컨대, 파리 레스피레이터리 이큅먼트, 인크.(Pari Respiratory Equipment, Inc.: 미국 버지니아주 리치몬드)에 의해 제작된, 파리 마스터(Pari Master)(R) 압축기에 연결된 파리 LC-제트 플러스(Pari LC-Jet Plus)(R) 분무기)를 사용하여 액상 액제 또는 현탁제 제제를 투여함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 다중특이적 분자는 예컨대, 용액 또는 현탁액 형태로 용매 중에 분산되어 전달될 수 있다. 이는 적절한 생리학적 용액, 예컨대, 염수 또는 다른 약리학적으로 허용되는 용매 또는 완충처리된 용액 중에 현탁될 수 있다. 당업계에 공지된 완충처리된 용액은 pH 약 4.0 내지 5.0을 달성하기 위해 물 1 ml당 0.05 mg 내지 0.15 mg 디소듐 에데테이트, 8.0 mg 내지 9.0 mg NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg 무수 시트르산, 및 0.45 mg 내지 0.55 mg 소듐 시트레이트를 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들어, 동결건조된 항체로부터 사용될 수 있다.
치료학적 현탁제 또는 액제 제제는 또한 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 부형제는는 당업계에 널리 공지되어 있고, 이는 완충제(예컨대, 시트레이트 완충제, 포스페이트 완충제, 아세테이트 완충제 및 비카보네이트 완충제), 아미노산, 우레아, 알콜, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예컨대, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포솜, 만니톨, 소르비톨, 및 글리세롤을 포함한다. 액제 또는 현탁제는 리포솜 또는 생체분해성 미세구에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 멸균 제조 공정을 사용하여 실질적으로 멸균성인 형태로 제공될 것이다.
이는 제제화에 사용되는 완충처리된 용매/용액을 여과하고, 멸균 완충처리된 용매/용액 중에 항체를 무균 방식으로 현탁시키고, 당업계의 숙련가에게 익숙한 방법에 의해 상기 제제를 멸균 용기에 분배함으로써 생산 및 멸균화하는 것을 포함할 수 있다.
본 개시내용에 따른 분무가능한 제제는 예를 들어, 호일 인벨럽에 패킹된 단일 투약 단위(예컨대, 실링된 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각 바이알은 일정 부피로 단위 용량을, 예컨대, 2 ml의 용매/용액 완충제를 함유한다.
본원에 개시된 항체는 분무를 통해 전달하는 데 적합할 수 있다.
본 발명의 항체를 유전자 유법을 사용하여 투여할 수 있다는 것 또한 구상된다. 이를 달성하기 위해, 적절한 DNA 성분의 제어하에 있는 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 환자 내로 도입하여 항체 쇄가 DNA 서열로부터 발현되고, 계내에서 조립될 수 있도록 한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자, 예컨대, 본원에 기술된 이중특이적 단백질 복합체는 관심의 대상이 되는 항원 또는 항원들의 활성을 기능적으로 변경시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 단백질 복합체는 상기 항원 또는 항원들의 활성을 직접 또는 간접적으로 중화시키거나, 길항시키거나, 또는 효능작용할 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 분자 또는 그의 성분을 포함하는 키트로 확장된다. 한 실시양태에서, 키트는
a) 결합 쌍의 제1 결합 파트너(X)에 부착된, CD22 또는 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 제1 항체 또는 항체 단편(A)을 포함하는, 하나 이상의 융합 단백질(A-X); 및
b) 제1 결합 파트너에 특이적인, 결합 쌍의 제2 결합 파트너(Y)에 부착된, CD22 또는 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 제2 항체 또는 항체 단편(B)을 포함하는, 하나 이상의 융합 단백질(B-Y)을 포함하고;
예를 들어, 여기서, 제1 결합 파트너(X)는 펩티드 또는 폴리펩티드이고, 제2 결합 파트너(Y)는 그에 특이적인 항체 또는 항체 단편이고;
여기서, Y인 제2 결합 파트너는 제1 결합 파트너 X에 특이적이고, 제2 결합 파트너는 예를 들어, 그에 특이적인 항체 또는 항체 단편이고; 두 결합 파트너의 특이적인 상호작용(예컨대, 결합 상호작용)이 a) 및 b)로부터 두 융합 단백질을 물리적으로 함께 가교시키는 이종이량체-테더를 형성하여 이중특이적 단백질 복합체를 형성하고;
여기서, A 또는 B 중 적어도 하나는 CD22에 특이적이고, 나머지 다른 하나는 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적이고,
융합 단백질(들)은 복합체 형태이거나, 또는 비복합체 형태이다.
이롭게는, 키트는 본 개시내용의 이중특이적 단백질 복합체를 포함할 수 있거나, 또는 복합체 형태이거나, 또는 비복합체 형태인 융합 단백질을 포함할 수 있다. 전자의 경우, 이중특이적 단백질 복합체는 사용의 편의성 및 용의성을 제공하는 "개봉 후 즉시 사용이 가능한" 것인 반면, 후자의 경우, 이중특이적 단백질 복합체는 상이한 융합 단백질을 조합하여 사용함으로써 사용자의 요구 사항에 따라 조립할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 사용 설명서를 추가로 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 기능 검정법을 수행하기 위한 하나 이상의 시약을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 융합 단백질, 이중특이적 단백질 복합체를 비롯한, 본 개시내용의 분자, 또는 그를 포함하는 조성물은 실험실용 시약 용도로 제공된다.
추가 측면
추가 측면에서, 예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 다중특이적 분자 또는 융합 단백질을 비롯한, 본원에 기술된 바와 같은 구성체를 코딩하는 DNA 서열과 같은 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
한 실시양태에서, 예를 들어, 본 개시내용에 따른 다중특이적 분자 또는 이중특이적 단백질 복합체 또는 항체를 비롯한, 본원에 기술된 바와 같은 구성체를 코딩하는 DNA 서열과 같은 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본원의 개시내용은 또한 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 확장된다.
본원에서 사용되는 바, "벡터"라는 용어는 그에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 예로는, 그 안으로 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프인 "플라스미드"가 있다. 다른 유형의 벡터로는, 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈으로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 특정 벡터는 그 내부로의 도입 대상이 되는 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예컨대, 박테리아 복제 기점을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비에피좀 포유동물 벡터)가 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이어서, 그 곳에서 숙주 게놈과 함께 복제된다. 본 출원에서, 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태인 바, "플라스미드" 및 "벡터"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
벡터를 구성할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "선별가능한 마커"라는 용어는, 그의 발현을 통해 마커 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되거나, 또는 형질감염된 세포를 확인할 수 있는 것인 단백질을 의미한다. 매우 다양한 선별 마커가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 전형적으로, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 약물, 예컨대, G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 선별가능한 마커는 또한 시각적으로 확인가능한 마커, 예컨대, 형광 마커일 수 있다. 형광 마커의 예로는 로다민, FITC, TRITC, 알렉사 플루오르(Alexa Fluors) 및 그의 다양한 컨쥬게이트를 포함한다.
본 개시내용의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또한 제공한다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템이 본 개시내용의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어, E. 콜라이, 및 다른 미생물 시스템이 사용될 수 있거나, 또는 진핵성, 예를 들어, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질을 발현시키는 데 적합한 조건하에서 본 개시내용의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 분자를 단리시키는 단계를 포함하는, 본 개시내용에 따른 분자 또는 그의 성분을 제조하는 방법 또한 제공한다.
본원에 기술된 이중특이적 단백질 복합체를 비롯한, 본 개시내용의 분자는 진단용/검출용 키트에서 사용될 수 있다. 키트는 예를 들어, 두 항원 모두가 같은 세포 유형 상에 존재하는, 상기 두 항원에 특이적인 이중특이적 항체 복합체를 포함하고, 여기서, 두 항원 모두가 성공적으로 검출되는 경우에만 오직 양성 진단을 받을 수 있다. 비복합체 형태의 2개의 개별 항체 또는 항체 단편보다는, 본 개시내용의 분자, 예컨대, 본원에 기술된 이중특이적 항체 복합체를 사용함으로써 검출 특이성은 크게 증강될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 분자, 예컨대, 이중특이적 항체 복합체는 고체 표면 상에 고정된다. 고체 표면은 예를 들어, 칩 또는 ELISA 플레이트일 수 있다.
샘플 중 제1 및 제2 펩티드의 존재를 검출하기 위한, 본 개시내용에 따른 분자, 예를 들어, 본원에 기술된 이중특이적 단백질 복합체의 용도를 추가로 제공하며, 이로써, 상기 분자는 검출용 작용제로서 사용된다.
본 개시내용의 분자, 예컨대, 본원에 기술된 이중특이적 항체 복합체는 예를 들어, 결합된 항체-항원 복합체의 검출을 용이하게 하는 형광 마커에 컨쥬게이션될 수 있다. 상기 이중특이적 항체 복합체는 면역형광 현미경용으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 이중특이적 항체 복합체는 또한 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA용으로 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 분자 또는 그의 성분을 정제하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 불순물은 칼럼 상에 그대로 보유되고, 항체는 비결합 분획 중에 유지되도록 하는 비결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 본 개시내용에 따른 분자 또는 그의 성분을 정제하는 방법을 제공한다. 상기 단계는 예를 들여, pH 약 6-8에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 예를 들여, pH 약 4 내지 5에서 수행되는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 초기 포획 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 생성물 및 방법과 관련된 불순물이 확실하게 생성물 스트림으로부터 적절히 제거될 수 있도록 하기 위해 추가의 크로마토그래피(들)로 추가로 구성될 수 있다.
정제 방법은 또한 하나 이상의 한외여과 단계, 예컨대, 농축 및 정용여과 단계를 포함할 수 있다.
상기 사용된 바와 같이, "정제된 형태"란, 90% w/w 이상의 순도, 예컨대, 91% w/w, 92% w/w, 93% w/w, 94% w/w, 95% w/w, 96% w/w, 97% w/w, 98% w/w, 99% w/w 이상으로 순수한 것을 의미하는 것으로 의도된다.
본 개시내용의 서열은 본원 하기에서 제공한다.
서열
Figure pct00005
Figure pct00006
본 개시내용은 또한 하나 또는 둘 모두의 시스테인 잔기가 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 특히, 제1 cys는 세린으로 치환되고, 제2 cys는 변함없이 그대로 유지되거나, 또는 제1 시스테인은 변함없이 그대로 유지되고, 제2 시스테인은 세린으로 치환되거나, 또는 두 시스테인이 모두 세린으로 치환된 것인, 서열 번호: 77의 유도체로 확장된다.
Figure pct00007
Figure pct00008
본 개시내용은 또한 모티프 DG 중의 아미노산 중 적어도 하나가 다른 아미노산으로 치환된, 예를 들어, 모티프가 EG, DA 또는 DS로 돌연변이화된 서열 번호: 87의 유도체로 확장된다.
Figure pct00009
본 개시내용은 또한 시스테인 잔기가 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 98의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 시스테인 잔기가 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 99의 유도체로 확장된다.
Figure pct00010
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 108의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 109의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 110의 유도체로 확장된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
본 개시내용은 또한 하기 돌연변이가 독립적으로 이루어진, 예를 들어, DS가 EA, DA 또는 DT로 변형되고, DG가 EG, DA 또는 DS로 변형된, 서열 번호: 117의 유도체로 확장된다. 한 실시양태에서, DS: DG 서열 DS, EG; DS, DA; DS, DS; EA, DG; EA, EG; EA, DA; EA, DS; DA, DG; DA, EG; DA, DA; DA, DS; DT, DG; DT, EG; DT, DA; 및 DT, DS이다.
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 118의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 119의 유도체로 확장된다.
Figure pct00013
Figure pct00014
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 128의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 129의 유도체로 확장된다.
Figure pct00015
Figure pct00016
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 139의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 모티프 NS가 예를 들어, NA 또는 NT로 변형된, 서열 번호: 139의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 모티프 NS가 예를 들어, NA 또는 NT로 변형된, 서열 번호: 140의 유도체로 확장된다.
Figure pct00017
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 148의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들어, 세린으로 치환된, 서열 번호: 149의 유도체로 확장된다.
본 개시내용은 또한 모티프 NS가 예를 들어, NA 또는 NT로 변형된, 서열 번호: 149의 유도체로 확장된다.
혈청 알부민 결합 항체
Figure pct00018
Figure pct00019
본 명세서의 문맥상, "포함하는(comprising)"이라는 것은 "포함하는(comprising)"인 것으로 해석되어야 한다. 특정 요소를 포함하는 본 개시내용의 측면은 또한 관련된 요소"로 이루어지거나," 또는 "본질적으로 이루어진" 대안적 실시양태로 확장되는 것으로 의도된다. 긍정적으로 언급된 실시양태는 본원에서 단서에 대한 기본적 토대로서 사용될 수 있다. 본원에서 참조된 모든 참고 문헌은 구체적으로 본원에서 참조로 포함된다.
참조문헌
Figure pct00020
실시예
본 실시예에서 사용되는 바, Fab-Kd-Fab라는 용어는 화학식 A-X:Y-B를 가지는 이중특이적 단백질 복합체를 기술하며, 여기서,
A-X는 제1 융합 단백질이고;
Y-B는 제2 융합 단백질이고;
X:Y는 이종이량체-테더이고;
A는 항원, 예컨대, CD22 또는 CD79에 특이적인 Fab 단편을 포함하고;
B는 항원, 예컨대, CD22 또는 CD79에 특이적인 Fab 단편을 포함하고;
X는 결합 쌍의 제1 결합 파트너, 예컨대, scFv이고;
Y는 결합 쌍의 제2 결합 파트너, 예컨대, 펩티드이고;
:은 X와 Y 사이의 상호작용(예컨대, 결합 상호작용)이다.
실시예 1 - 기능성 검정을 위한 Fab '-A( Fab - scFv [A-X]) 및 Fab '-B( Fab -펩티드[B-Y]) 제조
클로닝 전략법
PCR 또는 유전자 합성에 의해 제한 효소 부위 DNA 서열 측면에 위치하는 항체 가변 영역 DNA를 생성하였다. 상기 부위는 가변 중쇄의 경우, HindIII 및 XhoI, 및 가변 경쇄의 경우, HindIII 및 BsiWI였다. 이로써, 중쇄 가변 영역은 상보적인 제한 부위를 가지기 때문에, 중쇄 가변 영역은 2개의 중쇄 벡터로 쉽게 라이게이션될 수 있다(FabB-Y를 포함하는 pNAFH 및 FabA-Xds[안정화된 이황화]). 이는 뮤린 불변 영역 및 펩티드 Y(GCN4) 또는 scFv X(52SR4) 상류(5')에 가변 영역을 라이게이션시켜 전체 리딩 프레임을 형성한다. 다시 같은 상보성 제한 부위를 사용하여 하우스 뮤린 불변 카파 벡터(pMmCK 또는 pMmCK S171C) 중 표준으로 경쇄를 클로닝하였다. 가변 영역이 토끼로부터 단리된 경우에는 pMmCK S171C 벡터를 사용한다. 전체 오픈 리딩 프레임 측면에 위치하는 프라이머를 사용하여 서열분석함으로써 클로닝 이벤트를 확인하였다.
CHO -S 배양
CHOS 세포의 현탁액을 2 mM(100x) 글루타맥스로로 보충된 CDCHO 배지(인비트로겐(Invitrogen))에 맞게 미리 적합화시켰다. 세포를 대수 성장기에서 유지시키고, 진탕기 인큐베이터(쿠너 아게(Kuner AG: 스위스 비르스펠덴))에서 140 rpm으로 교반시키고, 8% CO2로 보충된 상태하에 37℃에서 배양하였다.
전기천공 형질감염
형질감염에 앞서, CEDEX 세포 계수기(인노파르티스 아게(Innovatis AG: 독일 빌레펠트))를 이용하여 세포 개수 및 생존능을 측정하고, 필요한 양의 세포(2x108개의 세포/ml)를 코니칼 원심관으로 옮겨 놓고, 10분 동안 1,400 rpm으로 회전시켰다. 펠릿화된 세포를 멸균 얼즈 평형 염 용액(Earls Balanced Salts Solution) 중에 재현탁시키고, 추가로 10분 동안 1,400 rpm으로 회전시켰다. 상청액을 폐기하고, 원하는 세포 밀도가 될 때까지 펠릿을 재현탁시켰다.
2x108개의 세포/ml 믹스에 대해 400 ug 및 800 ㎕의 최종 농도로 벡터 DNA를 큐베트(Cuvettes)(바이오래드(Biorad))로 피펫팅하고, 사내 전기천공 시스템을 이용하여 전기천공시켰다.
2 mM 글루타맥스 및 항생성 항유사분열 (100X) 용액(1/500)으로 강화된 ProCHO 5 배지를 함유하는 1X 3 L 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer Flask)로 직접 형질감염된 세포를 옮겨 놓고, 세포를 37℃, 5% CO2에서 및 140 rpm으로 진탕시키는 것으로 설정된 쿠너 진탕기 인큐베이터에서 세포를 배양하였다. 영양 공급 보충물 2 g/L ASF(아지노모토(AJINOMOTO))를 형질감염 후 24 hr째에 첨가하고, 추가로 13일 동안 배양하는 동안 온도는 37℃로 하락하였다. 4일째 3 mM 소듐 부티레이트(n-부티르산 소듐 염(BUTRIC ACID Sodium Salt), 시그마(Sigma) B-5887))를 배양물에 첨가하였다.
14일째, 배양물을 튜브로 옮기고, 30분 동안 4,000 rpm으로 원심분리한 후, 세포로부터 상청액을 분리하였다. 보유 상청액을 추가로 0.22 um 사르토 브란 P 밀리포어(SARTO BRAN P Millipore)를 통해 여과한 후, 0.22 ㎛ 감마 금 필터로 여과하였다. 단백질 G-HPLC에 의해 최종 발현 수준을 측정하였다.
대규모 ( 1.0L ) 정제
AKTA X프레스(AKTA Xpress) 시스템 및 히스트랩 엑셀(HisTrap Excel) 프리 패킹된 니켈 칼럼(GE 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 친화도 포획에 의해 Fab-A 및 Fab-B를 정제하였다. 배양물 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하고, 필요할 경우, 칼럼 상에 로딩하기 전에 약산 또는 약염기를 이용하여 중성으로 pH를 조정하였다. 15-25 mM 이미다졸을 포함하는 2차 세척 단계를 사용하여 임의의 약하게 결합된 숙주 세포 단백질/비특이 His 결합제를 니켈 수지로부터 제거하였다. 10 mM 인산나트륨, pH 7.4 + 1 M NaCl + 250 mM 이미다졸을 이용하여 용리를 수행하고, 2 ml 분획을 수집하였다. 용리로 1 칼럼 부피가 되었을 때, 시스템을 용리 피크를 엄격하게 하기 위해 10분 동안 정지시켰고, 그 결과, 총 용리 부피는 감소되었다. 가장 투명한 분획을 풀링하고, PBS(시그마)(pH 7.4)로 완충제를 교체하고, 0.22 ㎛ 여과를 수행하였다. A280 스캔(A280 Scan), SE-HPLC(G3000 방법), SDS-PAGE(환원 & 비환원)에 의해, 및 내독소인 경우, PTS 엔도세이프(PTS Endosafe) 시스템을 사용하여 최종 풀을 검정하였다.
실시예 2 - 2가가 아닌 CD79/CD22 이중특이적 조합이 Akt 신호전달을 억제 시킨다는 것을 입증하기 위한 이종이량체 방식의- 테더 이중특이적 단백질 복합체 포맷의 Fab'-A(Fab-scFv [A-X]) 및 Fab'-b(Fab-펩티드 [B-Y])의 용도
혈소판 성분채집 원추체로부터 유래된 인간 PBMC를 냉동 분취물로서 저장하였다. 검정법을 수행하기 전에, 세포를 해동하고, DMEM(라이프 테크놀러지즈(Life Technologies)) 중에서 세척하고, 37℃/5% CO2 환경으로 적응시켰다. 이 기간 동안, 등몰량(200 nM)의, 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대해 항원 특이성을 가지는 Fab'-A(Fab-scFv) 및 Fab'-B(Fab-펩티드)를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM 중에 희석하여 이중특이적 또는 2가 항체의 그리드를 생성하였다. 이 그리드는 하기 표 4에 제시되어 있다.
Figure pct00021
V 바닥형 96 웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하기 전에 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 Fab'A-X 및 Fab'B-Y를 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, PBMC + 이중특이적 또는 2가 조합을 함께 추가로 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 37℃에서 8분 동안 200 nM의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지(Southern Biotechnology))을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 이어서, 동 부피의 사이토픽스(Cytofix) 완충제(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 첨가하여 신호전달 반응을 정지시켰다. 이어서, 플레이트를 5분 동안 500 g로 원심분리하기 전 15분 동안 실온에서 방치하였다. 세포 펠릿으로부터 과량의 상청액을 폐기하고, 이를 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3) 중에 재현탁시키고, 한번 더 세척하였다. 이어서, 유동 완충제 중에서 2회에 걸쳐 세척하기 전 30분 동안 세포를 빙냉 펌 버퍼 III(Perm Buffer III)(BD 바이오사이언시즈) 중에 재현탁시켰다.
이어서, 세포를 형광 표지된 항CD20 항체(BD 바이오사이언시즈), 및 단백질 상의 473번 위치의 변형된 세린 잔기를 인식하는 형광 표지된 항포스포 Akt 항체로 염색하였다. 이어서, 플레이트를 재현탁시키고, 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 추가로 2회 세척하고, 25 ㎕의 유동 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리사이트 HTFC(Intellicyt HTFC)™ 유세포 분석기를 사용하여 CD20 및 Akt의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 패키지 포레사이트(Forecyt)™(인텔리사이트)를 이용함으로써 B 세포가 다른 세포 집단과 뚜렷이 다른 것을 확인하였고, 각 웰에 대한 Akt 수준의 기하 평균을 계산하였다. 이어서, 모든 데이터는 최대 반응(오직 항IgM만) - 배경(오직 세포만)의 억제율(%)로서 표시하였다. CD22 및 CD79b의 조합의 상대적인 효과는 하기 표 5에 제시되어 있다(↓ = 억제, ↑ = 자극 및 ↔ = 전체적인 효과 없음).
Figure pct00022
상기 데이터는 또한 막대 차트 형태로도 제시되어 있으며(도 1): 데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰 구간이다. 데이터는 CD22와 CD79b의 조합이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 포스포-Akt 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 그에 반해, CD22와 CD22의 조합의 경우, 포스포-Akt 발현 수준은 상승한 것으로 나타났다.
실시예 3 2가가 아닌 CD79/CD22 이중특이적 조합이 PLC γ 2 신호전달을 억제시킨다는 것을 입증하기 위한 이종이량체 방식의- 테더 이중특이적 단백질 복합체 포맷의 Fab'-A(Fab-scFv [A-X]) 및 Fab'-b(Fab-펩티드 [B-Y])의 용도.
혈소판 성분채집 원추체로부터 유래된 인간 PBMC를 냉동 분취물로서 저장하였다. 검정법을 수행하기 전에, 세포를 해동하고, DMEM(라이프 테크놀러지즈) 중에서 세척하고, 37℃/5% CO2 환경으로 적응시켰다. 이 기간 동안, 등몰량(200 nM)의, 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대해 항원 특이성을 가지는 Fab'-a(Fab-scFv [A-X]) 및 Fab'-B(Fab-펩티드[B-Y])를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM 중에 희석하여 이중특이적 또는 2가 항체의 그리드를 생성하였다. 이 그리드는 표 4에 제시되어 있다.
V 바닥형 96 웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하기 전에 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 Fab'A-X 및 Fab'B-Y를 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, PBMC + 이중특이적 또는 2가 조합을 함께 추가로 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 37℃에서 8분 동안 200 nM의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 이어서, 동 부피의 사이토픽스 완충제(BD 바이오사이언시즈)를 첨가하여 신호전달 반응을 정지시켰다. 이어서, 플레이트를 5분 동안 500 g로 원심분리하기 전 15분 동안 실온에서 방치하였다. 세포 펠릿으로부터 과량의 상청액을 폐기하고, 이를 유동 완충제 중에 재현탁시키고, 한번 더 세척하였다. 이어서, 유동 완충제 중에서 2회에 걸쳐 세척하기 전 30분 동안 세포를 빙냉 펌 버퍼 III(BD 바이오사이언시즈) 중에 재현탁시켰다.
이어서, 세포를 형광 표지된 항CD20 항체(BD 바이오사이언시즈), 및 단백질 상의 759번 위치의 변형된 티로신 잔기를 인식하는 형광 표지된 항포스포 PLCγ2 항체로 염색하였다. 이어서, 플레이트를 재현탁시키고, 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 추가로 2회 세척하고, 25 ㎕의 유동 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포 분석기를 사용하여 CD20 및 PLCγ2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 패키지 포레사이트™(인텔리사이트)를 이용함으로써 B 세포가 다른 세포 집단과 뚜렷이 다른 것을 확인하였고, 각 웰에 대한 PLCγ2 수준의 기하 평균을 계산하였다. 이어서, 모든 데이터는 최대 반응(오직 항IgM만) - 배경(오직 세포만)의 억제율(%)로서 표시하였다. CD22 및 CD79b의 조합의 상대적인 효과는 하기 표 6에 제시되어 있다(↓ = 억제, ↑ = 자극 및 ↔ = 전체적인 효과 없음).
Figure pct00023
상기 데이터는 또한 막대 차트 형태로도 제시되어 있으며(도 2), 데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰 구간이다. 데이터는 CD22와 CD79b, 및 CD79b와 CD79b의 조합이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 포스포-PLCγ2 발현을 모두 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 그에 반해, CD22와 CD22의 조합의 경우, 포스포-PLCγ2 발현 수준은 상승한 것으로 나타났다.
실시예 4 CD79 /CD22 이중특이적 조합이 CD86 발현을 억제시킨다는 것을 입증하기 위한 이종이량체 방식의- 테더 이중특이적 단백질 복합체 포맷의 Fab '-A(Fab-scFv [A-X]) 및 Fab'-b(Fab-펩티드 [B-Y])의 용도.
혈소판 성분채집 원추체로부터 유래된 인간 PBMC를 냉동 분취물로서 저장하였다. 검정법을 수행하기 전에, 세포를 해동하고, DMEM(라이프 테크놀러지즈) 중에서 세척하고, 37℃/5% CO2 환경으로 적응시켰다. 이 기간 동안, 등몰량(200 nM)의, 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대해 항원 특이성을 가지는 Fab'-X(Fab-scFv) 및 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM 중에 희석하여 이중특이적 또는 2가 항체의 그리드를 생성하였다. 이 그리드는 표 4에 제시되어 있다.
V 바닥형 96 웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하기 전에 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 Fab'A-X 및 Fab'B-Y를 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, PBMC + 이중특이적 또는 2가 조합을 함께 추가로 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 37℃에서 24시간 동안 200 nM의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 얼음 상에 놓고, 빙냉 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3) 중에서 한번 더 세척하였다. 이어서, 세포를 형광 표지된 항CD19 항체(BD 바이오사이언시즈) 및 형광 표지된 항CD86 항체로 염색하고, 암실에서 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 추가로 2회 세척하고, 25 ㎕의 유동 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포 분석기를 사용하여 CD19 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 패키지 포레사이트™(인텔리사이트)를 이용함으로써 B 세포가 다른 세포 집단과 뚜렷이 다른 것을 확인하였고, 각 웰에 대한 CD86 수준의 기하 평균을 계산하였다. 이어서, 모든 데이터는 최대 반응(오직 항IgM만) - 배경(오직 세포만)의 억제율(%)로서 표시하였다. CD22 및 CD79b의 조합의 상대적인 효과는 하기 표 7에 제시되어 있다(↓ = 억제, ↑ = 자극 및 ↔ = 전체적인 효과 없음).
상기 데이터는 또한 막대 차트 형태로도 제시되어 있으며(도 3), 데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰 구간이다. 데이터는 CD22와 CD79b, 및 CD79b와 CD79b의 조합이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포 상에서의 CD86 발현을 모두 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 그에 반해, CD22와 CD22의 조합의 경우, CD86 발현 수준은 상승한 것으로 나타났다.
실시예 5 CD22 및 CD79b의 억제 효과는 오직 항체가 이중특이적 배향으로 배열되어 있을 때 재현될 수 있다.
혈소판 성분채집 원추체로부터 유래된 인간 PBMC를 냉동 분취물로서 저장하였다. 검정법을 수행하기 전에, 세포를 해동하고, DMEM(라이프 테크놀러지즈) 중에서 세척하고, 37℃/5% CO2 환경으로 적응시켰다. 이 기간 동안, 등몰량(200 nM)의, 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대해 항원 특이성을 가지는 Fab'-X(Fab-scFv) 및/또는 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM 중에 희석하여 항체의 이중특이적, 2가 또는 혼합물의 조합을 생성하였다. 이 조합은 하기 표 8에 제시되어 있다. 이어서, 적정 곡선 실험을 위해, 상기 조합을 1:2.5의 희석률로 8 단계에 걸쳐 단계식으로 희석시켜 상기 조합에 대한 용량 적정을 하였다.
Figure pct00025
V 바닥형 96 웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하기 전에 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y를 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, PBMC + Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y 조합을 함께 추가로 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 37℃에서 8분 동안 200 nM의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 이어서, 동 부피의 사이토픽스 완충제(BD 바이오사이언시즈)를 첨가하여 신호전달 반응을 정지시켰다. 이어서, 플레이트를 5분 동안 500 g로 원심분리하기 전 15분 동안 실온에서 방치하였다. 세포 펠릿으로부터 과량의 상청액을 폐기하고, 이를 유동 완충제 (PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3) 중에 재현탁시키고, 한번 더 세척하였다. 이어서, 유동 완충제 중에서 2회에 걸쳐 세척하기 전 30분 동안 세포를 빙냉 펌 버퍼 III(BD 바이오사이언시즈) 중에 재현탁시켰다.
이어서, 세포를 형광 표지된 항CD20 항체(BD 바이오사이언시즈), 단백질 상의 473번 위치의 변형된 세린 잔기를 인식하는 형광 표지된 항포스포 Akt 항체 및 단백질 상의 759번 위치의 변형된 티로신 잔기를 인식하는 형광 표지된 항포스포 PLCγ2 항체로 염색하였다. 이어서, 플레이트를 재현탁시키고, 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 추가로 2회 세척하고, 25 ㎕의 유동 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포 분석기를 사용하여 CD20, Akt 및 PLCγ2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 패키지 포레사이트™(인텔리사이트)를 이용함으로써 B 세포가 다른 세포 집단과 뚜렷이 다른 것을 확인하였고, 각 웰에 대한 Akt 및 PLCγ2 수준의 기하 평균을 계산하였다. 이어서, 모든 데이터는 최대 반응(오직 항IgM만) - 배경(오직 세포만)의 억제율(%)로서 표시하였다. 도 4 및 5는 CD22 및 CD79b 항체의 혼합물이 아닌, CD22 및 CD79b의 이중특이적 조합만이 오직 인산화된 Akt 및 PLCγ2 발현을 억제시켰다는 것을 나타낸다(데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰 구간이다).
CD22 및 CD79b의 이중특이적 조합의 경우에 관찰된 억제를 입증하기 위하여, 상기 조합을 CD22 및 CD79b 항체의 혼합물과 함께 적정하였고, B 세포에서 총 세포내 IkB(신호전달 판독값) 및 CD86(24시간 후의 활성화 마커)의 억제를 측정하였다.
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 총 IkB 단백질의 수준에 의해 측정된 바, CD22-X/CD79b-X의 조합이 아닌, CD22-X/CD79b-Y의 조합이 항IgM 자극 이후의 NF-kB 신호 활성화를 억제시킬 수 있었다. 그래프패드 프리즘 6(Graphpad Prism 6)을 사용한 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트를 이용하여 외삽된 바, IC50은 7.5 nM이었다(데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차이다). 추가로, CD22-X/CD79b-X의 조합이 아닌, CD22-X/CD79b-Y의 조합의 적정이 24시간 후 B 세포 상에서의 항IgM 유도성 CD86 발현을 억제시킬 수 있었다(도 7 참조).
혈소판 성분채집 원추체로부터 유래된 인간 PBMC를 냉동 분취물로서 저장하였다. 검정법을 수행하기 전에, 세포를 해동하고, DMEM(라이프 테크놀러지즈) 중에서 세척하고, 37℃/5% CO2 환경으로 적응시켰다. 이 기간 동안, 등몰량(500 nM)의, 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대해 항원 특이성을 가지는 Fab'-X(Fab-scFv) 및 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM 중에 희석하여 이중특이적 조합을 생성하였다. 이 조합을 1:2.5의 희석률로 8 단계에 걸쳐 단계식으로 희석시켜 상기 조합에 대한 용량 적정을 하였다. V 바닥형 96 웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하기 전에 (37℃/5% CO2 환경에서) 90분 동안 Fab'-X 및 Fab'-Y를 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, PBMC를 Fab'-X 및 Fab'-Y 조합에 첨가하고, 함께 추가로 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 37℃에서 24시간 동안 200 nM의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 세포 표면 활성화 마커를 검출할 수 있도록 하기 위해, 플레이트를 얼음 상에 놓고, 빙냉 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3) 중에서 한번 더 세척하였다. 이어서, 세포를 형광 표지된 항CD19 항체(BD 바이오사이언시즈) 및 형광 표지된 항CD86 항체로 염색하고, 암실에서 1시간 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 추가로 2회 세척하고, 25 ul의 유동 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포 분석기를 사용하여 CD19 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다. 데이터 분석 소프트웨어 패키지 포레사이트™(인텔리사이트)를 이용함으로써 B 세포가 다른 세포 집단과 뚜렷이 다른 것을 확인하였고, 각 웰에 대한 CD86 수준의 기하 평균을 계산하였다. 이어서, 모든 데이터는 최대 반응(오직 항IgM만) - 배경(오직 세포만)의 억제율(%)로서 표시하였다. 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, CD22-X/CD79b-Y의 조합의 적정이 24시간 후 B 세포 상에서의 항IgM 유도성 CD86 발현을 억제시킬 수 있었다(도 7 참조). 그래프패드 프리즘 6을 사용한 4 파라미터 로지스틱 곡선 피트를 이용하여 외삽된 바, IC50은 10.3 nM이었다(데이터는 평균 값을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차이다).
실시예 6 - CD22 및 CD79b 이중특이적 단백질의 억제 효과는 상이한 항체 V 영역으로 재현될 수 있다.
면역화: 선택된 항원을 코딩하는 DNA를 유전자 합성에 의해, 또는 상업적 공급원에 의해 수득하고, 강한 구성적 프로모터를 포함하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 이어서, 사내 전기천공 시스템을 이용하여 플라스미드 DNA로 Rab-9 토끼 섬유아세포인 세포(ATCC® CRL-1414™)를 형질감염시켰다. 24시간 경과 후, 세포를 유세포 분석법에 의해 항원 발현에 대해 체크하고 사용할 때까지 액체 질소 중에서 분취량으로 냉동시켰다. 같은 세포 상에서 공동 발현시킴으로써, 또는 단일 또는 다중 형질감염된 세포의 혼합물을 제조함으로써 토끼 1마리당 최대 6개의 항원으로 면역화시켰다. 3 용량의 세포를 이용하여 토끼를 면역화시켰다.
항체 발견: 문헌 [Zubler et al. (1985)]에 기술되어 있는 것과 유사한 방법을 사용하여 B 세포 배양물을 제조하였다. 간략하게, 10% FCS(PAA 라보라토리즈 리미티드(PAA laboratories ltd)), 2% HEPES(시그마 알드리치(Sigma Aldrich)), 1% L-글루타민(기브코 BRL(Gibco BRL)), 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액(기브코 BRL), 0.1% b-메르캅토에탄올(기브코 BRL), 3% 활성화된 비장세포 배양물 상청액 및 감마 방사선 조사된 돌연변이체 EL4 뮤린 흉선종 세포(5x104/웰)로 보충된 200 ㎕/웰 RPMI 1640 배지(기브코 BRL)를 포함하는, 바코드가 부착되어 있는 96 웰 조직 배양물 플레이트 중에서 대략 2,000-5,000개의 세포/웰인 밀도로 면역화된 토끼로부터의 비장 또는 PBMC 유래 B 세포를 5% CO2 대기하에 37℃에서 7일 동안 배양하였다.
토끼를 면역화시킨 항원으로 공동 형질감염된 HEK293 세포를 이용하여 균일 형광 기반 결합 검정법을 사용함으로써 B 세포 배양물 상청액 중 항원 특이 항체의 존재를 측정하였다. 스크리닝은 매트릭스 플레이트메이트(Matrix Platemate) 액체 처리기를 사용하여 10 ul의 상청액을 바코드가 부착되어 있는 96 웰 조직 배양물 플레이트로부터, 표적 항원으로 형질감염된 HEK293 세포를 함유하는 바코드가 부착되어 있는 384 웰 검은색 벽이 있는 검정용 플레이트(대략 3,000개의 세포/웰)로 옮겨 놓는 것을 포함하였다. 염소 항토끼 IgG Fcγ 특이 Cy-5 컨쥬게이트(잭슨(Jackson))를 이용하여 결합을 밝혔다. 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 8200 세포 검출 시스템 상에서 플레이트를 판독하였다.
1차 스크리닝 후, 아비소 오닉스(Aviso Onyx) 히트-피킹(hit-picking) 로보트를 사용하여 96 웰 바코드가 부착되어 있는 마스터 플레이트 상에서 양성 상청액을 통합하고, 세포 배양물 플레이트 중의 B 세포를 -80℃에서 냉동시켰다. 이어서, 마스터 플레이트를 항원들로 따로따로 및 항원 공급원으로서 의 재조합 단백질로 코팅된 슈퍼아비딘(Superavidin)™ 비드(뱅즈 라보라토리즈(Bangs Laboratories))로 형질감염된 HEK293 세포에 대해 균일 형광 기반 결합 검정법으로 스크리닝하였다. 이는 각 웰에 대한 항원 특이성을 측정하기 위해 수행하였다.
관심의 대상이 되는 웰 선택물로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수할 수 있도록 하기 위해, 디콘볼루션 단계를 수행하여 이질성 B 세포 집단을 함유하는 주어진 웰 중 항원 특이 B 세포를 확인할 수 있었다. 이는 형광 초점 방법을 사용하여 달성하였다(문헌 [Clargo et al., 2014.Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159]; EP1570267B1). 간략하면, 양성 웰로부터의 면역글로불린 분비 B 세포를, 표적 항원으로 형질감염된 HEK293 세포, 또는 비오티닐화된 표적 항원으로 코팅된 스트렙트아비딘 비드(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New Engl및 Biolabs)) 및 염소 항토끼 Fcγ 단편 특이 FITC 컨쥬게이트(잭슨)의 최종 1:1,200의 희석액과 함께 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 정적 인큐베이션을 수행한 후, 항원 특이 B 세포 주변의 형광성 할로의 존재에 기인하여 상기 B 세포를 확인할 수 있었다. 이어서, 올림푸스(Olympus) 현미경을 사용하여 확인된, 다수의 상기 개별 B 세포 클론을 에펜도르프(Eppendorf) 미세 조작기를 사용하여 채취하고, PCR 튜브 안에 넣었다. 형광 초점 방법 또한 사용하여, 면역화된 토끼의 골수로부터 직접 얻은 이질성 B 세포 집단으로부터 항원 특이 B 세포를 확인하였다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 특이 프라이머를 사용하여 역전사(RT: reverse transcription)-PCR에 의해 단일 세포로부터 항체 가변 영역 유전자를 회수하였다. 2회에 걸쳐 PCR을 수행하였으며, 여기서, 네스티드 2차 PCR을 통해 3' 및 5' 단부에 제한 부위가 도입되었고, 가변 영역이 마우스 Fab-X 및 Fab-Y(VH) 또는 마우스 카파(VL) 포유동물 발현 벡터로 클로닝될 수 있었다. Fab-X 및 Fab-Y 발현 벡터에 대한 중쇄 및 경쇄 구성체를 펙틴 293(Fectin 293)(라이프 테크놀러지즈)를 사용하여 HEK-293 세포에 또는 엑시피펙트아민(Expifectamine)(라이프 테크놀러지즈)을 사용하여 Expi293 세포에 공동으로 형질감염시키고, 재조합 항체를 5 ml 부피로 6 웰 조직 배양물 플레이트에서 발현시켰다. 5-7일 동안의 발현 후, 상청액을 수거하고, 항원 및 재조합 단백질로 코팅된 슈퍼아비딘™ 비드(뱅즈 라보라토리즈)로 형질감염된 HEK293 세포에 대해 균일 형광 기반 결합 검정법으로 시험하였다. 이는 클로닝된 항체의 특이성을 확인하기 위해 수행하였다.
Fab A-X 및 Fab B-Y의 소규모 제조(소규모 ( 50 mL ) Expi293 형질감염)
Expi293 세포를 통상적으로 Expi293™ 발현 배지 중에서 최종 농도 0.5 x 106개의 생존가능한 세포/mL까지 계대배양하고, 120 rpm, 8% CO2 및 37℃의 궤도식 진탕 인큐베이터(멀티트론(Multitron), 인포스 HT(Infors HT))에서 인큐베이션시켰다.
형질감염 당일, 자동 세포 계수기(비-셀(Vi-CELL), 베크만-쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 세포 생존능 및 농도를 측정하였다. 최종 농도 2.5x106개의 생존가능한 세포/mL를 달성하기 위해, 적절한 부피의 세포 현탁액을 멸균 250 mL 에를렌마이어 진탕 플라스크에 첨가하고, 각 50 mL 형질감염을 위해 미리 가온된, 새 Expi293™ 발현 배지를 첨가함으로써 42.5 mL 부피가 되도록 만들었다.
각 형질감염을 위한 지질-DNA 복합체를 제조하기 위해, 총 50 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 옵티-MEM® I(Opti-MEM® I) 배지(라이프 테크놀러지즈) 중에서 총 부피 2.5 mL로까지 희석시키고, 135 ㎕의 엑시피펙트아민™ 293 시약(라이프 테크놀러지즈)을 옵티-MEM® I 배지 중에서 총 부피 2.5 mL로까지 희석시켰다. 모든 희석액을 온화하게 혼합하고, 실온에서 5분 이하의 기간 동안 인큐베이션시킨 후, 각 DNA 용액을 각각의 희석된 엑시피펙트아민™ 293 시약에 첨가하여 총 부피 5 mL를 얻었다. DNA-엑시피펙트아민™ 293 시약 혼합물을 온화하게 혼합하고, 실온에서 20-30분 동안 인큐베이션시켜 DNA-엑시피펙트아민™ 293 시약 복합체가 형성될 수 있도록 하였다.
DNA-엑시피펙트아민™ 293 시약 복합체 인큐베이션 완료 후, 5 mL의 DNA-엑시피펙트아민™ 293 시약 복합체를 각 진탕 플라스크를 120 rpm, 8% CO2 및 37℃의 궤도식 진탕 인큐베이터(멀티트론, 인포스 HT)에서 인큐베이션시켰다.
형질감염 후 대략 16-18시간 경과 후, 250 ㎕의 엑시피펙트아민™ 293 형질감염 인핸서 1(라이프 테크놀러지즈) 및 2.5 mL의 엑시피펙트아민™ 293 형질감염 인핸서 2(라이프 테크놀러지즈)를 각 진탕 플라스크에 첨가하였다.
세포 배양물을 형질감염 후 7일째 수거하였다. 세포를 50 mL 회전식 튜브(팔콘(Falcon))로 옮겨 놓고, 30 min 동안 4,000 rpm으로 스핀 다운시킨 후, 0.22 um 스테리컵(Stericup)(머크 밀리포어(Merck Millipore))을 통해 멸균 여과시켰다. 정화 및 멸균 여과된 상청액을 4℃에서 보관하였다. 단백질 G-HPLC에 의해 최종 발현 수준을 측정하였다.
소규모 ( 50 ml ) 정제: Fab-X 및 Fab-Y, 둘 모두를 소규모 진공 기반 정제 시스템을 이용하여 친화도 포획에 의해 따로따로 정제하였다. 간략하면, 50 ml의 배양물 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과시킨 후, 500 ㎕의 Ni 세파로스 비드(GE 헬쓰케어)를 첨가하였다. 이어서, 진공을 가하여 상청액을 제거하기 전 약 1시간 동안 상청액 비드 혼합물을 텀블링하였다. 이어서, 비드를 와쉬 1(50 mM 인산나트륨 1 M NaCl pH 6.2) 및 와쉬 2(0.5 M NaCl)로 세척하였다. 50 mM 아세트산나트륨, pH 4.0 + 1M NaCl을 이용하여 용리를 수행하였다. 용리된 분획에 대해 PBS(시그마)(pH 7.4)로 완충제를 교체하고, 0.22 ㎛ 여과를 수행하였다. A280 스캔, SE-UPLC(BEH200 방법), SDS-PAGE(환원 & 비환원)에 의해, 및 내독소인 경우, PTS 엔도세이프 시스템을 사용하여 최종 풀을 검정하였다.
혈소판 성분채집 원추체로부터 유래된 인간 PBMC를 냉동 분취물로서 저장하였다. 검정법을 수행하기 전에, 세포를 해동하고, RPMI 1640(라이프 테크놀러지즈) 중에서 세척하고, 37℃/5% CO2 환경으로 적응시켰다. 이 기간 동안, 등몰량(200 nM)의, 세포 표면 단백질 CD22 및 CD79b에 대해 항원 특이성을 가지는 Fab'-X(Fab-scFv) 및/또는 Fab'-Y(Fab-펩티드)를 10% 우태아 혈청, 50 유니트/mL 페니실린, 50 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 2 mM 글루타민을 함유하는 RPMI 1640 중에 희석하여 항체의 이중특이적, 2가 또는 혼합물의 조합을 생성하였다. 3개의 상이한 CD79b Fab-Y 및 3개의 상이한 CD22 Fab-X로 이루어진 이 조합은 하기 표 9에 제시되어 있다.
Figure pct00026
V 바닥형 96 웰 플레이트에서 2.5x105개의 PBMC와 혼합하기 전에 (37℃/5% CO2 환경에서) 60분 동안 Fab'A-X 및 Fab'B-Y를 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, PBMC + Fab'A-X 및/또는 Fab'B-Y 조합을 함께 추가로 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 37℃에서 10분 동안 12.5 ㎍/mL의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 이어서, 동 부피의 사이토픽스 완충제(BD 바이오사이언시즈)를 첨가하여 신호전달 반응을 정지시켰다. 이어서, 플레이트를 5분 동안 500 g로 원심분리하기 전 15분 동안 실온에서 방치하였다. 세포 펠릿으로부터 과량의 상청액을 폐기하고, 이를 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3 + 2 mM EDTA) 중에 재현탁시키고, 한번 더 세척하였다. 이어서, 유동 완충제 중에서 2회에 걸쳐 세척하기 전 30분 동안 세포를 빙냉 펌 버퍼 III(BD 바이오사이언시즈) 중에 재현탁시켰다.
이어서, 세포를 형광 표지된 항CD20 항체(BD 바이오사이언시즈), 및 759번 위치의 변형된 티로신 잔기를 인식하는 항포스포 PLCγ2 항체로 염색하였다. 이어서, 플레이트를 재현탁시키고, 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 추가로 2회 세척하고, 40 ㎕의 유동 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포 분석기를 사용하여 CD20 및 PLCγ2의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 패키지 포레사이트™(인텔리사이트)를 이용함으로써 B 세포가 다른 세포 집단과 뚜렷이 다른 것을 확인하였고, 각 웰에 대한 PLCγ2 수준의 기하 평균을 계산하였다. 이어서, 모든 데이터는 최대 반응(오직 항IgM만) - 배경(오직 세포만)의 억제율(%)로서 표시하였다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 데이터는 모든 상이한 항체 V 영역을 사용한, CD22와 CD79b의 조합이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 포스포-PLCγ2 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 신규한 이중특이적 항체 표적을 확인하기 위한 이종이량체 방식으로 테더링된 단백질 복합체의 큰 패널의 그리드 스크리닝.
개요: 앞서 실시예에서의 이중특이적 포맷의 성공적인 입증 및 스크리닝 방법을 수행한 후, 더 많은 개수의 항원 쌍으로 스크리닝을 확장시켰다. B 세포 상에서 발현된 23개의 상이한 항원에 대한 항체 가변(V) 영역 쌍의 패널을 생성하였다. Fab-Kd-Fab[즉, A-X:Y-B, 여기서, A 및 B는 Fab 단편이다] 포맷을 사용하여, 315개의 상이한 항원 쌍 조합 각각의 다중 V 영역의 조합을 나타내는, 이종이량체 방식으로 테더링된 단백질 복합체의 그리드를 형성하였다. 이 조합을 고처리량 유세포 분석 검정법에서 BCR(B 세포 수용체) 신호전달을 조절할 수 있는 그의 능력에 대하여 스크리닝하여 이중특이적 항체를 이용한 개입을 위한 신규한 표적 쌍을 선별하였다.
실시예 6에 기술된 바와 같이 항체를 단리시켰다 .
스크리닝 검정법
37℃로 설정된 수조를 사용하여 기증자 PBMC를 신속하게 해동시키고, 50 ml 팔콘 튜브로 조심히 옮겨 놓았다. 이어서, 삼투압 충격을 최소화하기 위해 검저용 배지 중에서 5 ml로 적가하여 희석시켰다. 이어서, 최종 배지 희석제를 첨가하여 부피를 50 ml로 만들기 전에 세포를 조심히 20 ml로 희석시켰다. 이어서, 상청액을 제거하고, 1 ml 배지 중에 세포를 재현탁시키기 전에 세포를 5분 동안 500 g로 희석시켰다. 이어서, 세포를 계수하고, 1.66x106개의 세포/ml로 희석시킨 후, 30 ㎕/웰로 V 바닥형 TC 플레이트로 분배하여 최종 검정 농도 5.0x104개의 세포/웰을 얻었다. 이어서, 필요시까지 세포 플레이트를 커버링하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 보관하였고, 이로써, 최소 1시간의 휴지기를 주었다.
검정용 배지 중에서 5x 최종 검정 농도로 Fab-X 및 Fab-Y 시약을 등몰비로 혼합하고, 37℃, 5% CO2에서 90 min 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 96 웰 U자형 바닥의 폴리프로필렌 플레이트 중에서 제조하고, 인큐베이션 동안 커버링하였다.
10 ㎕의 5x Fab-KD-Fab 혼합물을 세포를 함유하는 적절한 시험 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 90 min 동안 인큐베이션시키기 전에 30 sec 동안 1,000 rpm으로 진탕시켜 혼합하였다.
이어서, 세포를 10 ㎕의 항인간 IgM으로 자극시켰다. 자극제의 최종 검정 농도는 검정 패널 판독값에 의존하여 달리하였고, 3개의 항체 칵테일 A, B 및 C(하기에서 상세히 설명)를 최종 검정 농도 50 ㎍/ml(칵테일 A & C) 또는 25 ㎍/ml(칵테일 B)로 자극시켰다. 이어서, 검정 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 5 min(항체 칵테일 A & C) 동안 또는 2 min(항체 칵테일 B) 동안 인큐베이션시키기 전에 30 sec 동안 1,000 rpm으로 온화하게 혼합하였다. 150 ㎕ 빙냉 BD 사이토픽스을 모든 웰에 첨가하여 검정을 중단하고, RT에서 15 min 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 고정된 세포를 5 min 동안 500 g로 희전시켜 세포를 펠릿화하고, 바이오테크(BioTek) ELx405 플레이트 세척제를 이용하여 상청액을 제거시켰다. 30 sec 동안 2,400 rpm으로 플레이트를 와동시켜 펠릿을 재현탁시켰다. 이어서, 30 min 동안 100 ㎕ 빙냉 BD 세포 투과화 완충제 III을 첨가하여 세포를 4℃에서 투과시켰다. 이어서, 세포를 100 ㎕ FACS 완충제 중에서 세척하고, 5 min 동안 500 g로 희전시켰다. 상청액을 사용하기 전에 ELx405에 의해 다시 제거함으로써 200 ㎕ FACS 완충제를 신속하게 분배하여 임의의 잔류 투과화 완충제를 세척하여 제거하였다. 세포를 다시 500 g로 희전시키고, 도립시켜 상청액을 제거하였다. 선행 회전 단계 동안, FACS 완충제 중에서 항체 칵테일을 제조하고, 차광 상태로 유지시켰다. 이어서, 20 ㎕의 항체 칵테일을 모든 웰에 첨가하기 전에 와동시켜(2,400 RPM, 30 sec) 세포를 재현탁시키고, 30 sec 동안 1,000 rpm으로 플레이트를 진탕시켰다. 이어서, 세포를 암실에서 60 min 동안 RT에서 인큐베이션시켰다.
이어서, 세포를 500 g로 회전시키면서, 200 ㎕ FACS 완충제 중에서 2회에 걸쳐 세척하고, 각 단계 후에는 상청액을 제거하였다. 마지막으로, 최종 20 ㎕ FACS 완충제를 첨가하기 전 30 sec 동안 2,400 rpm으로 와동시켜 세포를 재현탁시켰다. 이어서, 플레이트(들)를 인텔리사이트 HTFC/i큐(iQue) 장치에서 판독하였다.
FACS 완충제 = PBS + 1% BSA + 0.05% NaN3 + 2 mM EDTA
항체 칵테일 A = 1:2 CD20 PerCp-Cy5.5(BD 바이오사이언시즈) + 1:5 PLCγ2 AF88 + 1:10 Akt AF647 + 1:50 ERK1/2 PE(FACS 완충제 중에서 희석).
항체 칵테일 B = 1:2 CD20 PerCp-Cy5.5(BD 바이오사이언시즈) + 1:5 Syk PE + 1:5 BLNK AF647(FACS 완충제 중에서 희석)
항체 칵테일 C = 1:5 CD20 PerCp-Cy5.5(바이오레전드(Biolegend)) + 1:5 PLCγ2 AF488 + 1:10 Akt AF647 + 1:5 Syk PE(FACS 완충제 중에서 희석)
Figure pct00027
Figure pct00028
항체 칵테일 A 및 B 또는 C 단독인 것을 이용하여 Fab-X + Fab-Y 조합을 스크리닝하였다. 모든 스크린은 2명의 다른 혈액 기증자로부터의 원추체 세포에 대하여 수행하였다. 데이터를 포착하고, 상업적으로 이용가능한 소프트웨어 도구를 이용하여 평가하였다. 315개의 상이한 항원 조합에 대하여 총 2,500개의 Fab-X + Fab-Y 조합을 스크리닝하였다.
결과
각 Fab-Kd-Fab[즉, A-X:Y-B, 여기서, A 및 B는 Fab 단편이다] 조합에 의한 BCR 신호전달 캐스케이드 단백질의 인산화 유도 억제율(%)을 계산하였고, 본 실시예에서의 B 세포 기능을 억제시키는 항원의 새로운 조합을 찾기 위한, 양성 조합에 대한 기준을 적어도 1개의 V 영역에 의해 2개 이상의 포스포-판독값이 30% 이상 억제되는 것으로 설정하였다. 상기 역치에 따라, 검사된 315개 항원 쌍 중 11개의 새로운 항원 쌍 조합이 필요한 기준을 충족시켰다. 이는 3.5% 히트율을 나타내며, 이는 원하는 활성을 가지는 것, 및 CC79b 및 CD22의 조합의 활성이 얼마나 희귀한지를 밝히는 데 있어 다수의 조합을 스크리닝하는 것이 중요하다는 것을 입증한다.
도 10-12는 항원 그리드 교차 특이성에 대한 데이터를 보여주는 것이다. 값은 각각 Syk, PLCγ2 & AKT의 억제율(%)(활성화에 대한 음성 값)이고, 이는 평가된 다중의 V 영역 조합의 평균을 나타낸다. 315개의 상이한 항원 조합을 시험하였고, 알 수 있는 바와 같이, 항체의 상이한 조합에 의한 BCR 신호전달에 미치는 효과는 예컨대, 도 11에 제시된 바와 같은, Fab-Y 상의 항원 3(CD22)과 함께 조합된 Fab-X 상의 항원 2(CD79b)(포스포 Syk 억제 69.66%) 및 Fab-X 상의 항원 3(CD22)과 함께 조합된 Fab-Y 상의 항원 2(CD79b)(포스포 Syk 억제 52.32%) 경우와 같은 강력한 억제에서부터 예컨대, X 상의 항원 6 및 Y 상의 항원 11 경우와 같은 활성화(-118.10% 포스포 Syk, 도 11)에 이르기까지 유의적으로 달랐다.
도 10-12에 제시된 평균 값(%)을 나타내는 각 데이터 점은 도 13의 Fab-X 상의 항원 2(CD79b) 및 Fab-Y 상의 항원 3(CD22)에 대한 것이다. 이 경우, 23개의, 상이한 항체 V 영역의 상이한 조합을 평가하였다. 항원 조합은 동일하지만, 대안적인 배향을 가지는 것, Fab-Y 상의 항원 2(CD79b) 및 Fab-X 상의 항원 3(CD22)은 도 14에 제시되어 있다. 이 경우, 9개의, 상이한 항체 V 영역의 상이한 조합을 평가하였다. 모든 V 영역이 억제를 보였지만, 이롭게는, 상기 방법은 또한 최적의 V 영역 조합을 선택하는 데에서도 사용될 수 있다.
실시예 8 Fab - Kd - Fab 스크리닝 포맷의 항원 CD79b + 항원 CD22 공동 표적화 의 활성과 분자적으로 연결된 이중특이적 BYbe 포맷과의 비교
개요: Fab-Kd-Fab 이종이량체 방식으로 테더링된 스크리닝 복합체로 확인된 CD79b/CD22 표적 쌍 활성이 대체 치료학적 분자적으로 연결된 포맷에서 유사한 원하는 활성으로 번역될 수 있는지 검사하기 위해, 항원 CD79b 특이성(VR4447) 및 항원 CD22 특이성(VR4130)을 BYbe 포맷으로 생성하였다. 이 BYbe 포맷은 링커 SGGGGSGGGGS(서열 번호: 17)를 통해 항항원 CD79b Fab(VR4447)의 중쇄에 융합된 이황화 안정화된(ds: disulphide stabilised) 단일 쇄(sc)-Fv로서 항항원 CD22 V 영역(VR4130)으로 구성된다.
방법:
기능 스크리닝을 위해 BYbe의 정제를 하기와 같이 수행하였다:
기능 스크리닝 BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C 말단으로부터의 scFv]) 포맷을 하기와 같이 정제하였다. 표준 expiHEK 또는 CHO 발현으로부터의 정화된 세포 배양물 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다. 여과된 상청액을, PBS(pH 7.4)에서 평형화된 50 ml 감마바인드플러스 세파로스(GammabindPlus Sepharose) XK26 칼럼(GE 헬쓰케어) 상에 2 ml/min으로 로딩하였다. 로딩 후, 칼럼을 PBS(pH 7.4)로 세척한 후, 0.1 M 글리신/HCl(pH 2.7)로 용리시켰다. 용리한 후, 280 nm에서 흡광도를 판독한 후, 용리 피크를 수집한 후, 1/25 부피의 2 M 트리스/HCl(pH 8.5)로 중화시켰다. 중화된 샘플을 10 kDa(BYbe) 분자량 컷 오프 막을 이용하여 암비콘 울트라(Amicon Ultra)-15 농축기를 사용하여 농축시키고, 선회 회전기에서 4,000 x g로 농축시켰다. 농축된 샘플을 PBS(pH 7.4)에서 평형화된 XK16/60 또는 XK26/60 슈퍼덱스200 칼럼(GE 헬쓰케어)에 가하였다. 칼럼을 각각 1 ml/min 또는 2.6 ml/min으로 PBS(pH 7.4)의 등용매 구배로 전개시켰다. 분획을 수집하고, TSK 겔 G3000SWXL 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하고; 5 ㎛, 7.8 X 300 mm 칼럼은 1 ml/min으로 0.2 M 포스페이트(pH 7.0)의 등용매 구배로 전개시키고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하고, 10 kDa 분자량 컷 오프 막을 이용하여 암비콘 울트라-15 농축기를 사용하여 >1 mg/ml로 농축시키고, 선회 회전기에서 4,000 x g로 농축시켰다. A280 스캐닝 UV-가시광선 분광광도계(캐리 50바이오(Cary 50Bio))에 의한 농축에 대해; TSK 겔 G3000SWXL 상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단량체(%)에 대해; 1 ml/min으로 0.2 M 포스페이트(pH 7.0)의 등용매 구배로 전개시키고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출된 5 ㎛, 7.8x300 mm 칼럼에 대해; 53분 동안 50 mA(웰당)로 4-20% 트리스-글리신 1.5 mm 겔(노벡스(Novex)) 상에서의 환원 및 비환원 SDS-PAGE 전개에 의해; 및 리물루스 아메바양세포 용해물(LAL: Limulus Amebocyte Lysate) 시험 카트리지를 이용하는 찰스 리버스 엔도세이프® 포터블 테스트 시스템(Charles River’s EndoSafe® Portable Test System)에 의한 내독소에 대해 최종 샘플을 검정하였다.
기능 검정법
활성화 마커 검정법: 항원 CD79b 특이 Fab'-Y 및 항원 CD22 특이 Fab'-X를 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 인큐베이션시켰다. 100 nM의 출발 몰 농도부터 1:4 연속 희석률로 조합을 적정하였다. 항원 CD79b 및 CD22 특이 BYbe 또한 100 nM의 출발 몰 농도부터 1:4 연속 희석률로 적정하였다. V 바닥형 96 웰 플레이트에서 1.5x105개의 PBMC를 웰에 첨가한 후, 여기에 적정된 Fab'-X 및 Fab'-Y 조합 또는 적정된 BYbe를 첨가하였다. Fab'-X 및 Fab'-Y 조합 또는 BYbe를 세포와 함께 추가로 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 37℃ + 5% CO2에서 24시간 동안 25 ㎍/mL의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 웰에 100 ㎕ 빙냉 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.1% NaN3 + 2 mM EDTA)를 첨가하고, 플레이트를 실링하고, 4℃에서 5분 동안 500 xg로 원심분리하기 전에 대략 15분 동안 습식 얼음으로 커버링하였다. 세포 펠릿으로부터 과량의 상청액을 폐기하고, 플레이트를 30초 동안 2,000 rpm으로 진탕시켰다.
이어서, 세포를 형광 표지된 항CD19, 항CD20 및 항CD71, 항CD40 및 항CD86 항체(BD 바이오사이언시즈)의 칵테일로 염색하였다. 플레이트를 단기간 진탕시키고, 암실에서 1시간 동안 습식 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 2회 세척하고, 20 ㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리사이트 HTFC™ 유세포 분석기를 사용하여 CD20 및 PLCγ2의 세포 발현을 측정하였다. 인텔리사이트 iQUE® 스크리너 유세포 분석기를 이용하여 CD19, CD20 및 CD71, CD40 및 CD86의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 패키지 포레사이트™(인텔리사이트)를 이용함으로써 B 세포가 다른 세포 집단과 뚜렷이 다른 것을 확인하였고, 각 웰에 대한 CD71, CD40 및 CD86의 기하 평균을 계산하였다. 이어서, 모든 데이터는 최대 반응(오직 항IgM만) - 배경(오직 세포만)의 억제율(%)로서 표시하였다.
포스플로우 검정법: 항원 CD79b 특이 Fab'-Y 및 항원 CD22 특이 Fab'-X를 등몰 농도로 (37℃ 및 5% CO2 환경에서) 60분 동안 함께 인큐베이션시켰다. 100 nM의 출발 몰 농도부터 1:4 연속 희석률로 조합을 적정하였다. 항원 CD79b 및 항원 CD22 특이 BYbe 또한 100 nM의 출발 몰 농도부터 1:4 연속 희석률로 적정하였다. V 바닥형 96 웰 플레이트에서 5.0 x104개의 PBMC를 웰에 첨가한 후, 여기에 적정된 Fab'-X 및 Fab'-Y 조합 또는 적정된 BYbe를 첨가하였다. Fab'-X 및 Fab'-Y 조합 또는 BYbe를 세포와 함께 추가로 90분 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 37℃ + 5% CO2에서 15분 동안 25 ㎍/mL의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지)을 첨가하여 B 세포를 활성화시켰다. 이어서, 동 부피의 사이토픽스 완충제(BD 바이오사이언시즈)를 첨가하여 신호전달 반응을 정지시켰다. 이어서, 플레이트를 5분 동안 500 x g로 원심분리하기 전 15분 동안 실온에서 방치하였다. 세포 펠릿으로부터 과량의 상청액을 폐기하고, 이를 FACS 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3 + 2 mM EDTA) 중에 재현탁시키고, 한번 더 세척하였다. 이어서, 유동 완충제 중에서 2회에 걸쳐 세척하기 전 30분 동안 세포를 빙냉 펌 버퍼 III(BD 바이오사이언시즈) 중에 재현탁시켰다.
이어서, 세포를 형광 표지된 항CD20 항체(BD 바이오사이언시즈) 및 항인산화된 PLCγ2, 항인산화된 Akt 및 항인산화된 p38 항체(BD 바이오사이언시즈)로 염색하였다. 이어서, 플레이트를 재현탁시키고, 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 플레이트를 추가로 2회 세척하고, 20 ㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁시켰다. 인텔리사이트 iQUE® 유세포 분석기를 사용하여 CD20 및 포스포-PLCγ2, 포스포-Akt 및 포스포-p38의 세포 발현을 측정하였다.
데이터 분석 소프트웨어 패키지 포레사이트™(인텔리사이트)를 이용함으로써 B 세포가 다른 세포 집단과 뚜렷이 다른 것을 확인하였고, 각 웰에 대한 PLCγ2, Akt 및 p38 수준의 기하 평균을 계산하였다. 이어서, 모든 데이터는 최대 반응(오직 항IgM만) - 배경(오직 세포만)의 억제율(%)로서 표시하였다.
결과
포스플로우 검정법: 도 15의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷으로 항원 CD79b 및 항원 CD22를 표적화하는 것이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 인산화된 PLCγ2를 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 도 16의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷으로 항원 CD79b 및 항원 CD22를 표적화하는 것이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 인산화된 P38을 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 도 17의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷으로 항원 CD79b 및 항원 CD22를 표적화하는 것이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 인산화된 Akt를 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
활성화 마커 검정법: 도 18에서 알 수 있는 바와 같이, 본 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷으로 항원 CD79b 및 항원 CD22를 표적화하는 것이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 CD71 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 도 19의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷으로 항원 CD79b 및 항원 CD22를 표적화하는 것이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 CD40 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 도 20의 데이터는 Fab-Kd-Fab 또는 BYbe 포맷으로 항원 CD79b 및 항원 CD22를 표적화하는 것이 항IgM으로 자극을 받은 B 세포에서 CD86 발현을 억제시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 9 - 생체내 반감기 연장을 위한 추가의 항알부민 결합 도메인 첨가가 이루어진 분자적으로 연결된 이중특이적 Bybe 포맷의 항원 CD79b + 항원 CD22 공동 표적화 활성의 비교.
개요: Fab-Kd-Fab 이종이량체 방식으로 테더링된 스크리닝 복합체로 확인된 CD79b/CD22 표적 쌍 활성이 생체내 반감기 연장에서 표적화된 항알부민을 포함하는 잠재적인 치료학적 분자적으로 연결된 포맷에서 유사한 원하는 활성으로 번역될 수 있는지 검사하기 위해, 항알부민 항체 단편을 서열 SGGGGSGGGGS(서열 번호: 17)를 가지는 링커를 통해 실시예 8에 기술된 BYbe 포맷의 항원 CD22 Fab의 경쇄에 융합시켰다. 항알부민 단편(VR0645)의 첨가 및 비첨가하에서 Bybe 포맷으로 항원 CD79b 특이성(VR4447) 및 항원 CD22 특이성(VR4130 및 VR4126)을 생성하였다.
Figure pct00029
방법
항알부민의 추가적 특이성하에서 /그의 부재하에서의 BYbe의 정제
BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C 말단으로부터의 scFv]) 및 항알부민을 포함하는 BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab 중쇄 및 경쇄의 C 말단으로부터의 scFvs]) 포맷을 하기와 같이 정제하였다. 표준 expiHEK 또는 CHO 발현으로부터의 정화된 세포 배양물 상청액을 0.22 ㎛ 멸균 여과하였다. 여과된 상청액을, PBS(pH 7.4)(시그마 알드리치 케미칼즈(Sigma Aldrich Chemicals))에서 평형화된 50 ml 감마바인드플러스 세파로스 XK26 칼럼(GE 헬쓰케어) 상에 2 ml/min으로 로딩하였다. 로딩 후, 칼럼을 PBS(pH 7.4)로 세척한 후, 0.1 M 글리신/HCl(pH 2.7)로 용리시켰다. 용리한 후, 280 nm에서 흡광도를 판독한 후, 용리 피크를 수집한 후, 1/25 부피의 2 M 트리스/HCl(pH 8.5)로 중화시켰다. 중화된 샘플을 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷 오프 막을 이용하여 암비콘 울트라-15 농축기를 사용하여 농축시키고, 선회 회전기에서 4,000 x g로 농축시켰다. 농축된 샘플을 PBS(pH 7.4)에서 평형화된 XK16/60 또는 XK26/60 슈퍼덱스200 칼럼(GE 헬쓰케어)에 가하였다. 칼럼을 각각 1 ml/min 또는 2.6 ml/min으로 PBS(pH 7.4)의 등용매 구배로 전개시켰다. 분획을 수집하고, TSK 겔 G3000SWXL 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하고; 5 ㎛, 7.8 X 300 mm 칼럼은 1 ml/min으로 0.2 M 포스페이트(pH 7.0)의 등용매 구배로 전개시키고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출하였다. 선택된 단량체 분획을 풀링하고, 10 kDa 또는 30 kDa 분자량 컷 오프 막을 이용하여 암비콘 울트라-15 농축기를 사용하여 >1 mg/ml로 농축시키고, 선회 회전기에서 4,000 x g로 농축시켰다. A280 스캐닝 UV-가시광선 분광광도계(캐리 50바이오)에 의한 농축에 대해; TSK 겔 G3000SWXL 상에서의 크기 배제 크로마토그래피에 의한 단량체(%)에 대해; 1 ml/min으로 0.2 M 포스페이트(pH 7.0)의 등용매 구배로 전개시키고, 280 nm에서의 흡광도에 의해 검출된 5 ㎛, 7.8x300 mm 칼럼에 대해; 53분 동안 50 mA(웰당)로 4-20% 트리스-글리신 1.5 mm 겔(노벡스) 상에서의 환원 및 비환원 SDS-PAGE 전개에 의해; 및 리물루스 아메바양세포 용해물(LAL) 시험 카트리지를 이용하는 찰스 리버스 엔도세이프® 포터블 테스트 시스템에 의한 내독소에 대해 최종 샘플을 검정하였다.
100 nM의 각 구성체 정제된 단백질을 5명의 다른 기증자로부터 유래된 인간 PBMC와 함께 RPMI 1640 배지 + 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타맥스(R10 배지) 중에서 37℃/5% CO2에서 60 min 동안 미리 인큐베이션시켰다. 60 min 후, 오직 B 세포만을 자극시키는 거스로 디자인된 25 ug/ml의 염소 항IgM 항체로 세포를 자극시켰다. 24시간 후, 플레이트를 얼음 상에 놓음으로써 임의의 추가의 세포 활성화를 정지시킨 후, 빙냉 유세포 분석용 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3)로 1회 세척하였다. 상청액 모두 제거하고, 세포 펠릿을 재현탁시켰다. 세포를 얼음 위에 놓고, 항CD19, -CD20, -CD27, -CD71 및 CD86 항체의 칵테일을 첨가하였다. 60 min 동안 세포를 인큐베이션시킨 후, 유세포 분석용 완충제로 2회 세척하였다. i큐 고처리량 유세포 분석기를 이용하여 CD19/CD20 양성 B 세포에의 항CD27, -CD71 및 CD86의 결합에 대해 데이터를 생성하였다. 포레사이트 소프트웨어를 사용하여 히스토그램을 작성하고, 항CD27, -CD71 및 CD86 항체의 B 세포에의 결합에 대한 기하 평균 강도 판독값을 도출해 내었다. 상기 데이터를 엑셀로 임포트하고, 각 조합에 대하여 억제율(%) 값을 생성하였다. 이어서, 데이터를 그래프패드 프리즘으로 임포트하고, 각 조합에 대하여 박스 및 위스커 차트를 작성하였고, 여기서, 평균은 '+'로 표시하였다.
도 21은 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된 B 세포 상에서의 CD27 발현 억제를 보여주는 것이다. 5명의 시험된 기증자들 간에 상기 둘 모두는 일관되게 항IgM 유도성 CD27의 억제를 유사한 수준으로 나타내었다. 도 22는 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된 B 세포 상에서의 CD71 발현 억제를 보여주는 것이다. 5명의 시험된 기증자들 간에 상기 둘 모두는 일관되게 항IgM 유도성 CD71의 억제를 유사한 수준으로 나타내었다. 도 23은 VR4447/VR4126 BYbe 및 VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된 B 세포 상에서의 CD86 발현 억제를 보여주는 것이다. 5명의 시험된 기증자들 간에 상기 둘 모두는 일관되게 항IgM 유도성 CD86의 억제를 유사한 수준으로 나타내었다.
도 24는 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된 B 세포 상에서의 CD27 발현 억제를 보여주는 것이다. 5명의 시험된 기증자들 간에 상기 둘 모두는 일관되게 항IgM 유도성 CD27의 억제를 유사한 수준으로 나타내었다. 도 25는 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된 B 세포 상에서의 CD71 발현 억제를 보여주는 것이다. 5명의 시험된 기증자들 간에 상기 둘 모두는 일관되게 항IgM 유도성 CD71의 억제를 유사한 수준으로 나타내었다. 도 26은 VR4447/VR4130 BYbe 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민에 의해 유도된 B 세포 상에서의 CD86 발현 억제를 보여주는 것이다. 5명의 시험된 기증자들 간에 상기 둘 모두는 일관되게 항IgM 유도성 CD86의 억제를 유사한 수준으로 나타내었다.
실시예 10 - 항알부민의 추가 첨가하에서의 또는 그를 추가 첨가하지 않고, 분자적으로 연결된 이중특이적 Bybe를 사용하여 항원 CD79b + 항원 CD22를 공동 표 적화하는 것이 기억 B 세포 기능에 미치는 효과.
개요: 장기 배양에서 CD79b/CD22를 표적화하는 것이 B 세포에 기능적으로 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해, 단리된 상태로 또는 혼합된 PBMC 중에서 배양된 B 세포로부터의 IgG 생산을 측정하였다. 회상 항원 파상풍 톡소이드에 대해 특이적인 항체를 측정함으로써 기억 B 세포 기능을 판독할 수 있다.
항알부민 단편(VR0645)의 추가하에 또는 그를 추가하지 않고 BYbe 포맷으로 항원 CD79b 특이성(VR4447) 및 항원 CD22 특이성(VR4126, VR4127 및 VR4130)을 생성하였다. 실시예 8에 기술된 바와 같이, 서열 SGGGGSGGGGS(서열 번호: 17)를 통해 항알부민 항체 단편을 BYbe 포맷의 항원 CD22 Fab의 경쇄에 융합시켰다.
Figure pct00030
방법
항알부민의 추가적 특이성하에서 /그의 부재하에서의 BYbe의 정제
BYbe(Fab-dsscFv[Fab 중쇄의 C 말단으로부터의 scFv]) 및 항알부민을 포함하는 BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab 중쇄 및 경쇄의 C 말단으로부터의 scFvs]) 포맷을 실시예 9에 기술된 바와 같이 정제하였다.
B 세포 활성화 및 파상풍 톡소이드 특이 IgG 측정
최대 3명의 다른 기증자로부터 유래된 인간 PBMC 또는 정제된 B 세포를 6일 동안 1640 배지 + 10% 우태아 혈청 및 2 mM 글루타맥스(R10 배지) 중 500 ng/ml CD40L, 1 ug/ml CpG 및 50 ng/ml IL-21로 자극시켰다. 0일째, 정제된 단백질의 구성체를 100 nM 최종 농도로 첨가하고, 검정 기간 동안 배양 배지 중에서 그대로 유지시켰다. 6일 후, 상청액을 수거하고, ELISA에 의해 파상풍 톡소이드 특이 IgG의 양을 검출하였다. 간략하면, 맥시소르프(Maxisorp) 웰 ELISA 플레이트(눈크(Nunc)) 절반을 4℃에서 밤새도록 PBS 중 10 ug/ml 파상풍 톡소이드로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 2시간 동안 0.05% 트윈20을 함유하는 PBS 중의 5% 밀크 중에서 차단시켰다. 상청액을 희석한 후, 실온에서 2시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS-0.05% 트윈20으로 세척하고, 5% 밀크-PBS-0.05% 트윈20 중 1 ug/ml로 희석된 퍼옥시다제-염소 항인간 IgG(H+L)를 이용하여 파상풍 결합 항체를 검출하였다. TMB 기질 용액(KPL)을 사용하여 플레이트를 발색시키고, 시너지(Synergy) 2 마이크로플레이트 판독기(바이오테크)를 사용하여 450 nM에서 흡광도를 측정하였다. 엑셀로 데이터를 익스포트하고, 시험 항체 없이 배양된 세포에 대한 상대적인 값으로 억제율(%)을 계산하였다. 이어서, 그래프패드 프리즘®로 데이터를 인포트하고, 막대 차트로서 플롯팅하였다.
도 27은 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe 및 VR4447/VR4130 BYbe와 함께 배양된 PBMC로부터의 파상풍 톡소이드 IgG 생산의 억제를 보여주는 것이다. 데이터는 3명의 기증자로부터의 풀링된 데이터를 나타낸다.
도 28은 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe 및 VR4447/VR4130 BYbe와 함께 배양된 정제된 B 세포로부터의 파상풍 톡소이드 IgG 생산의 억제를 보여주는 것이다. 데이터는 3명의 기증자로부터의 풀링된 데이터를 나타낸다.
도 29는 VR4447/VR4126 BYbe, VR4447/VR4127 BYbe, VR4447/VR4130 BYbe, VR4447/VR4126/VR645 BYbe/알부민 및 VR4447/VR4130/VR645 BYbe/알부민과 함께 배양된 PBMC 또는 정제된 B 세포로부터의 파상풍 톡소이드 IgG 생산의 억제를 보여주는 것이다. 데이터는 단일 기증자로부터의 것을 제시한 것이다.
실시예 11 - SLE 환자 B 세포에서의 BCR 신호전달 조절이상 & 항원 CD79b + 항원 CD22를 공동 표적화하는 것인 SLE B 세포 기능에 미치는 효과.
개요: CD79b/CD22의 조합이 자가면역 질환을 앓는 사람을 치료하는 데 사용될 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명자들은 모델 시스템으로서 전신 홍반성 루프스(SLE: systemic lupus erythematosus) 환자로부터의 B 세포를 사용하였다. B 세포 기능에 관여하지만, 건강한 지원자와 비교하였을 때, SLE 환자에서는 조절이상이 있는 것으로 알려져 있는 신호전달 단백질의 활성화 상태에 대해 CD79b/CD22 조합 (VR4447/VR4130)이 미치는 영향을 시험하였다. 본 실험에서는, CD79b 및 CD22를 공동 표적화하는 것이 B 세포의 활성화 상태에 미치는 효과에 대하여 12명의 SLE 환자 및 12명의 건강한 지원자로부터의 B 세포를 비교하였다.
방법:
포스플로우 검정법: 모든 검정법은 2x105개의 PBMC/웰을 사용하였다.
처리된 샘플에서, 항원 CD79b 및 항원 CD22 특이 BYbe를 100 nM의 농도로 시험하였다. 건강한 지원자, 및 SLE 환자, 둘 모두로부터의 PBMC를 37℃에서 90분 동안 BYbe를 미리 인큐베이션시켰다. 비처리된 샘플에서는, 인큐베이션 기간 동안 BYbe를 생략하였다. 이 시간 후, 세포를 37℃ + 5% CO2에서 10분 동안 25 ㎍/mL의 염소 F(ab')2 항인간 IgM(써던 바이오테크놀러지)으로 활성화시키고, 고정제(사이토픽스 - BD 바이오사이언시즈)를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 자극받지 않은 샘플에서는, 간단하게 인큐베이션 기간 동안 항인간 IgM을 생략하였다. 실온에서 15분 경과 후, 세포를 펠릿화한 후(5 min 동안 500 xg로), 빙냉 펌 버퍼 III(BD 바이오사이언시즈) 중에 재현탁시킨 후, 유동 완충제(PBS + 1% BSA + 0.01% NaN3 + 2 mM EDTA) 중에서 2회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 세포를 항CD20, 항인산화된(p) NF-κB, 항pSyk, 항pAtk 및 항pErk1&2로 염색하고, 암실에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 플레이트를 유동 완충제 중에서 2회에 걸쳐 세척한 후, i큐 유세포 분석기(인텔리사이트) 상에서 측정하였다. 이어서, B 세포에서의 pNF-κB, pSyk, pAkt 및 pErk1&2 발현의 기하 평균(평균 형광 강도, MFI: mean fluorescence intensity)을 계산하고, 그래프 형태로 표시하였다.
결과:
도 30은 건강한 지원자와 비교하였을 때, SLE 환자 B 세포에서 NF-κB, Syk, Akt 및 Erk1&2의 기준선에서의 인산화가 (자극받지 않고, 처리되지 않은 것) 상승되어 있다는 것을 보여주는 것이다.
도 31 내지 34는 CD79/CD22 BYbe가 건강한 지원자 및 SLE 환자에서 pNF-κB, pSyk, pAkt 및 pErk1&2를 동등하게 억제시킬 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
결론:
본 데이터는 건강한 지원자와 비교하였을 때, SLE 환자로부터의 세포가 임의의 시험관내 자극 이전에 활성화되어 있다는 것을 보여준다. B 세포 수용체를 통한 세포 자극시, 건강한 지원자 및 SLE 환자, 둘 모두, 배경 신호와 비교하였을 때, 증강된 활성화 수준을 보인다. 건강한 지원자 및 SLE 환자, 둘 모두에서, 상기 신호는 CD79b/CD22 조합에 의해 실질적으로 차단된다. 본 데이터는 CD79b/CD22 조합이 건강한 지원자 뿐만 아니라, 기저 자가면역 질환을 앓는 사람, 둘 모두로부터의 B 세포를 억제시킬 수 있다는 것을 나타내며, 이는 상기 경로가 B 세포 활성화에 근본적으로 중요하다는 것을 시사한다.
SEQUENCE LISTING <110> UCB Pharma <120> Molecules with Specificity for CD79 and CD22 <130> G0224_WO <150> GB1412658.5 <151> 2014-07-16 <160> 163 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GCN4(7P14P) sequence <400> 1 Ala Ser Gly Gly Gly Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Pro Lys Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys 20 25 30 Lys Leu Val Gly Glu Arg His His His His His His 35 40 <210> 2 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCN4(7P14P) sequence <400> 2 gctagcggag gcggaagaat gaaacaactt gaacccaagg ttgaagaatt gcttccgaaa 60 aattatcact tggaaaatga ggttgccaga ttaaagaaat tagttggcga acgccatcac 120 catcaccatc ac 132 <210> 3 <211> 262 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 52SR4 ds scFv sequence <400> 3 Asp Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Ser Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Ser Trp Val Gln Glu Lys 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peptide <400> 58 Gln Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Glu Asp Asp Glu 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin binding peptide <400> 59 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val 20 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin binding peptide <400> 60 Gln Gly Leu Ile Gly Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 15 Gly Arg Ser Val Lys 20 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin binding peptide <400> 61 Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp 1 5 10 15 <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin binding peptide <400> 62 Arg Leu Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 1 5 10 15 Asp Asp <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin binding peptide <400> 63 Met Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 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gcttcagcag 120 aaaccagggc agcctcccaa gcaactgatc cattctgcat ccactctggc atctggggtc 180 tcatcgcggt tcagcggcag tggatctggg acacaattca ctctcaccat cagcggcgtg 240 cagtgtgaag atgctgccac ttactactgt ctaggcgaat ttagttgtag tagtcatgat 300 tgtaatgctt tcggcggagg gaccgaggtg gtggtcaaa 339 <210> 73 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rabbit Ab 4447 VH region <400> 73 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Ala 20 25 30 Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Tyr Ile Glu Thr Gly Thr Thr Trp Tyr Ala Asn Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Thr Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Ser Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Glu 85 90 95 Pro Tyr Glu Pro Tyr Asp Asp Ser Asn Ile Tyr Tyr Gly Met Asp Pro 100 105 110 Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 74 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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<211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 <400> 149 Cys Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 150 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 <400> 150 Glu Trp Val Ser Gly Tyr Tyr Lys Asp Ala Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 151 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 dAbH1 <400> 151 Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr Ala Ile Asn 1 5 10 <210> 152 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 dAbH1 <400> 152 Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 153 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 dAbH1 <400> 153 Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 154 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 dAbL1 <400> 154 Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser 1 5 10 <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 dAbL1 <400> 155 Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser 1 5 <210> 156 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 dAbL1 <400> 156 Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr 1 5 10 <210> 157 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable domain of anti-albumin antibody (no ds) <400> 157 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 158 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable domain of anti-albumin antibody (ds) <400> 158 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 159 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable domain of anti-albumin antibody (no ds) <400> 159 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn 20 25 30 Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile 85 90 95 Ser Asp Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 160 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable domain of anti-albumin antibody (ds) <400> 160 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Gly Lys Pro Thr His 1 5 10 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 20 25 30 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn 35 40 45 Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 50 55 60 Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 85 90 95 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile 100 105 110 Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 <210> 161 <211> 847 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD22 <400> 161 Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr Leu 1 5 10 15 Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu 20 25 30 Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala 35 40 45 Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr 50 55 60 Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr 65 70 75 80 Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly 85 90 95 Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn 100 105 110 Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp 115 120 125 Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His 130 135 140 Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr 145 150 155 160 Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp 165 170 175 Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser 180 185 190 Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro 195 200 205 Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala 210 215 220 Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His 225 230 235 240 Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg 245 250 255 Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro 260 265 270 Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys 275 280 285 Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser 290 295 300 Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser 305 310 315 320 Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val 325 330 335 Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu 340 345 350 Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His 355 360 365 Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro 370 375 380 Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn 385 390 395 400 Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln 405 410 415 Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile 420 425 430 Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn 435 440 445 Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu 450 455 460 Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr 465 470 475 480 Thr Ile Ala Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro 485 490 495 Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys 500 505 510 Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln 515 520 525 Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu 530 535 540 Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser 545 550 555 560 Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser 565 570 575 Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala 580 585 590 Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu 595 600 605 Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val 610 615 620 Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His 625 630 635 640 Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala 645 650 655 Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu 660 665 670 Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Val 675 680 685 Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile Cys 690 695 700 Gly Leu Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly 705 710 715 720 Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys 725 730 735 Val Arg Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr 740 745 750 Asn Pro Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro 755 760 765 Glu Met Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln 770 775 780 Arg Pro Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His 785 790 795 800 Lys Arg Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu 805 810 815 Asp Glu Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu 820 825 830 Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His 835 840 845 <210> 162 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD79a <400> 162 Met Pro Gly Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Ala Thr Ile Phe 1 5 10 15 Leu Leu Phe Leu Leu Ser Ala Val Tyr Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala 20 25 30 Leu Trp Met His Lys Val Pro Ala Ser Leu Met Val Ser Leu Gly Glu 35 40 45 Asp Ala His Phe Gln Cys Pro His Asn Ser Ser Asn Asn Ala Asn Val 50 55 60 Thr Trp Trp Arg Val Leu His Gly Asn Tyr Thr Trp Pro Pro Glu Phe 65 70 75 80 Leu Gly Pro Gly Glu Asp Pro Asn Gly Thr Leu Ile Ile Gln Asn Val 85 90 95 Asn Lys Ser His Gly Gly Ile Tyr Val Cys Arg Val Gln Glu Gly Asn 100 105 110 Glu Ser Tyr Gln Gln Ser Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Gln Pro 115 120 125 Pro Pro Arg Pro Phe Leu Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile 130 135 140 Ile Thr Ala Glu Gly Ile Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly 145 150 155 160 Thr Leu Leu Leu Phe Arg Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Leu Gly Leu 165 170 175 Asp Ala Gly Asp Glu Tyr Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn 180 185 190 Leu Asp Asp Cys Ser Met Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly 195 200 205 Thr Tyr Gln Asp Val Gly Ser Leu Asn Ile Gly Asp Val Gln Leu Glu 210 215 220 Lys Pro 225 <210> 163 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD79b <400> 163 Met Ala Arg Leu Ala Leu Ser Pro Val Pro Ser His Trp Met Val Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala Glu Pro Val Pro Ala Ala Arg Ser Glu 20 25 30 Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser Arg Ile Trp Gln 35 40 45 Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr Val Lys Met His 50 55 60 Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp Leu Trp Lys Gln 65 70 75 80 Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu Lys Gly Arg Met 85 90 95 Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr Ile Gln Gly Ile 100 105 110 Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Lys Cys Asn Asn 115 120 125 Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu Arg Val Met Gly 130 135 140 Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly 145 150 155 160 Ile Ile Met Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro 165 170 175 Ile Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu 180 185 190 Asp His Thr Tyr Glu Gly Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu 195 200 205 Asp Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu 210 215 220 His Pro Gly Gln Glu 225

Claims (37)

  1. 항원 CD22에 특이적인 결합 도메인, 및 항원 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자.
  2. 제1항에 있어서, 결합 도메인 또는 결합 도메인들이 관련된 항원에 특이적인 항체 가변 영역을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각 결합 도메인이 2개의 항체 가변 도메인을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  4. 제3항에 있어서, 2개의 항체 가변 도메인이 VH/VL 쌍인 다중특이적 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 이중특이적 또는 삼중특이적인 다중특이적 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 분자가 융합 단백질인 다중특이적 분자.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분자 포맷이 디아바디, sc디아바디, 트리아바디, 탠덤 scFv, FabFv, Fab'Fv, FabdsFv, Fab-scFv, Fab-dsscFv, Fab-(dsscFv)2 디Fab, 디Fab', 트리바디, 탠덤 scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3, Ig-scFv, scFv-Ig, V-Ig, Ig-V, 듀오바디(Duobody) 및 DVD-Ig로부터 선택되는 것인 다중특이적 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각 결합 도메인이 단일특이적인 다중특이적 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 분자가 CD22에 특이적인 1개 이하의 결합 도메인, 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 1개 이하의 결합 도메인을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인, 및 CD79a 및/또는 CD79b에 특이적인 결합 도메인이 독립적으로 Fab, scFv, Fv, dsFv 및 dsscFv로부터 선택되는 것인 다중특이적 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CD79b에 특이적인 결합 도메인이 CDRH1에 대하여 서열 번호: 78, CDRH2에 대하여 서열 번호: 79 및 CDRH3에 대하여 서열 번호: 80에 제공된 서열을 가지는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, CD79b에 특이적인 결합 도메인이 CDRH1에 대하여 서열 번호: 88, CDRH2에 대하여 서열 번호: 89 및 CDRH3에 대하여 서열 번호: 90에 제공된 서열을 가지는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CD79b에 특이적인 결합 도메인이 CDRL1에 대하여 서열 번호: 75, CDRL2에 대하여 서열 번호: 76 및 CDRL3에 대하여 서열 번호: 77에 제공된 서열을 가지는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, CD79b에 특이적인 결합 도메인이 CDRL1에 대하여 서열 번호: 85, CDRL2에 대하여 서열 번호: 86 및 CDRL3에 대하여 서열 번호: 87에 제공된 서열을 가지는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRH1에 대하여 서열 번호: 98, CDRH2에 대하여 서열 번호: 99 및 CDRH3에 대하여 서열 번호: 100에 제공된 서열을 가지는 3개의 중쇄를 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRH1에 대하여 서열 번호: 108, CDRH2에 대하여 서열 번호: 109 및 CDRH3에 대하여 서열 번호: 110에 제공된 서열을 가지는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRH1에 대하여 서열 번호: 118, CDRH2에 대하여 서열 번호: 119 및 CDRH3에 대하여 서열 번호: 120에 제공된 서열을 가지는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRH1에 대하여 서열 번호: 128, CDRH2에 대하여 서열 번호: 129 및 CDRH3에 대하여 서열 번호: 130에 제공된 서열을 가지는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRH1에 대하여 서열 번호: 138, CDRH2에 대하여 서열 번호: 139 및 CDRH3에 대하여 서열 번호: 140에 제공된 서열을 가지는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRH1에 대하여 서열 번호: 148, CDRH2에 대하여 서열 번호: 149 및 CDRH3에 대하여 서열 번호: 150에 제공된 서열을 가지는 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRL1에 대하여 서열 번호: 95, CDRL2에 대하여 서열 번호: 96 및 CDRL3에 대하여 서열 번호: 97에 제공된 서열을 가지는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRL1에 대하여 서열 번호: 105, CDRL2에 대하여 서열 번호: 106 및 CDRL3에 대하여 서열 번호: 107에 제공된 서열을 가지는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRL1에 대하여 서열 번호: 115, CDRL2에 대하여 서열 번호: 116 및 CDRL3에 대하여 서열 번호: 117에 제공된 서열을 가지는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  24. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRL1에 대하여 서열 번호: 125, CDRL2에 대하여 서열 번호: 126 및 CDRL3에 대하여 서열 번호: 127에 제공된 서열을 가지는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRL1에 대하여 서열 번호: 135, CDRL2에 대하여 서열 번호: 136 및 CDRL3에 대하여 서열 번호: 137에 제공된 서열을 가지는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CD22에 특이적인 결합 도메인이 CDRL1에 대하여 서열 번호: 145, CDRL2에 대하여 서열 번호: 146 및 CDRL3에 대하여 서열 번호: 147에 제공된 서열을 가지는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인이 인간화된 것인 다중특이적 분자.
  28. 제11항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인 다중특이적 분자.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 것인 다중특이적 분자.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 하나 이상의 아스파르트산 이성질체화 부위 및/또는 아스파라긴 탈아미드화 부위 및/또는 글리코실화 부위가 하나 이상의 CDR 내의 하나 이상의 아미노산을 치환함으로써 제거된 것인 다중특이적 분자.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민에 특이적인 결합 도메인을 추가로 포함하는 것인 다중특이적 분자.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에서 정의된 하나 이상의 다중특이적 단백질을 포함하는 조성물.
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에서 정의된 다중특이적 단백질 또는 그의 성분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
  34. 제33항에서 정의된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  35. 요법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 단백질 또는 제32항에 따른 조성물.
  36. 요법에서 사용하기 위한 의약, 특히 본원에 기술된 병태 또는 장애 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 단백질 또는 제30항에 따른 조성물의 용도.
  37. 치료적 유효량의, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 다중특이적 단백질 또는 제32항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
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