KR20170040232A - 신규 항-인간 Igβ 항체 - Google Patents

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Abstract

[과제] BCR 및 FcγRIIb에 가교되면서 종래의 항체의 것보다 더 증강된 면역억제 기능을 갖는 항-인간 Igβ 항체가 제공된다.
[해결수단] 서열 번호 2의 아미노산 번호 31 내지 35의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50 내지 65의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 98 내지 108의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24 내지 38의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 54 내지 60의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 93 내지 101의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.

Description

신규 항-인간 Igβ 항체{NOVEL ANTI-HUMAN Igβ ANTIBODY}
본 발명은 약학 조성물의 활성 성분으로서 유용한 신규의 항-인간 Igβ 항체에 관한 것이다.
B 세포 수용체(BCR)는 Igα(CD79A) 및 Igβ(CD79B)의 헤테로이량체와 회합된 막결합형 면역글로불린(mIg) 분자로 구성된다. 항원은 mIg에 결합하고 수용체를 응집시키며, Igα/Igβ 서브유닛은 B 세포 내에 신호를 전달한다 (Mol. Immunol., Vol. 41, p. 599-613, 2004).
IgG 항체에 대한 Fc 수용체인 Fcγ 수용체(FcγR)의 단백질 패밀리로서, 면역활성적 기능을 갖는 FcγRIa(CD64A), FcγRIIa(CD32A), 및 FcγRIIIa(CD16A), 및 면역억제 기능을 갖는 FcγRIIb(CD32B)가 보고되고 있다. B 세포 상의 BCR 및 FcγRIIb가 IgG 면역 복합체를 통해 가교되면, B 세포의 활성이 억제되고 이에 B 세포의 증식 및 항체 생산이 억제되는 것으로 보고되고 있다 (Nat. Rev. Immunol., Vol. 10, p. 328-343, 2010; Nat. Rev. Immunol., Vol. 8, p. 34-47, 2008; Nat. Rev. Immunol., Vol. 2, p. 580-592, 2002).
이러한 FcγRIIb를 통한 B 세포의 활성의 제어는 자기면역 질환 예컨대 류마티스 관절염 및 전신 홍반 루푸스의 병적 측면과 깊게 관련되는 것으로 보고되고 있다.
류마티스 관절염과 관련해서는, FcγRIIb 넉아웃 마우스에서, 체액성 면역이 적절하게 제어되지 않고(Nature, Vol. 379, p. 346-349, 1996; J. Immunol., Vol. 163, p. 618-622, 1999) 및 콜라겐 유도 관절염에 대한 감수성이 증가되는 것으로 보고되고 있다(J. Exp. Med., Vol. 189, p. 187-194, 1999). 또한, 류마티스 관절염 환자의 메모리 B 세포에서 FcγRIIb의 발현은 감소되는 것으로 확인되고 있다 (J. Immunol., Vol. 190, p. 6015-6022, 2013).
전신 홍반 루푸스와 관련해서는, FcγRIIb의 발현이 B 세포에서 특이적으로 향상되는 트랜스제닉 마우스에서 전신 홍반 루푸스 질환의 발병이 유의하게 억제되는 것으로 보고되고 있다 (J. Exp. Med., Vol. 205, p. 883-895, 2008). FcγRIIb의 넉아웃 마우스와 관련하여, 자기 반응성 B 세포 또는 혈장 세포가 출현하고 전신 홍반 루푸스의 병태가 자발적으로 발생하는 것으로 확인되고 있다(Immunity, Vol. 13, p. 277-285, 2000; J. Exp. Med., Vol. 207, p. 2767-2778, 2010). 또한, 전신 홍반 루푸스 환자의 메모리 B 세포에서 FcγRIIb의 발현 감소(J. Exp. Med., Vol. 203, p. 2157-2164, 2006; J. Immunol., Vol. 178, p. 3272-3280, 2007) 및 FcγRIIb의 세포 막관통 영역에서의 유전자 다형과 전신 홍반 루푸스의 발병의 빈도 간의 관련성(Arthritis Rheum., Vol. 46, p. 1242-1254, 2002)이 보고되고 있다.
또한, FcγRIIb를 통한 B 세포 활성의 제어에 의한 항체 생산의 억제는 자기항체가 병태와 연관되는 자기면역 질환의 치료에 유효하다.
특발성 혈소판 감소성 자반증은 환자의 혈소판에 대한 자기항체가 혈소판 파괴를 일으키는 자기면역 질환이다 (Autoimmun. Rev., Vol. 13, p. 577-583, 2014). 항혈소판 항체가 투여된 동물에서, 혈소판 감소가 유도되고(Br. J. Haematol., Vol. 167, p. 110-120, 2014) 및 자기항체의 감소가 특발성 혈소판 감소성 자반증의 치료에 효과적인 것으로 보고되고 있다 (Ther. Apher. Dial. Vol. 16, p. 311-320, 2012; Lupus, Vol. 22, p. 664-674, 2013).
따라서, BCR 및 FcγRIIb에 가교되고 FcγRIIb의 면역억제 기능을 증가시키는 모노클로날 항체가 개발될 수 있다면, 그러한 모노클로날 항체가 자기면역 질환 예컨대 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 및 특발성 혈소판 감소성 자반증의 예방 또는 치료에 유용할 것으로 기대된다.
BCR 및 FcγRIIb에 가교되는 항체로서, Igβ 및 FcγRIIb에 대한 이중특이적 항체인 DART(특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1), 및 BCR 복합체의 일부인 CD19에 결합하는 가변 영역 및 FcγRIIb에 대한 친화성이 증가되는 Fc 영역을 갖는 항-CD19 S267E/L328F(특허 문헌 2, 및 비특허 문헌 2 및 3)가 보고된다. 이들 중, 항-CD19 S267E/L328F가 상세히 검토되며, BCR을 자극하는 B 세포의 활성에 대한 억제 작용 및 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 이식된 마우스에서 인간 혈중 항체가(antibody titer) 농도의 저하 작용이 확인되었다 (특허 문헌 2, 및 비특허 문헌 2 및 3).
특허 문헌 1: WO 2012/018687 특허 문헌 2: WO 2008/150494
비특허 문헌 1: Arthritis & Rheumatism (US) 2010; 62(7): 1933-1943 비특허 문헌 2: Molecular Immunology (US) 2008; 45(15): 3926-3933 비특허 문헌 3: The Journal of Immunology (US) 2011; 186(7): 4223-4233
본 발명의 목적은 BCR 및 FcγRIIb에 가교되며 종래의 항체의 것보다 더 증강된 면역억제 기능을 갖는 항-인간 Igβ 항체를 제공하는데 있다.
본 발명자들에 의해 항-인간 Igβ 항체의 제조에 대한 집중적인 연구 결과, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31 내지 35의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50 내지 65의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 98 내지 108의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24 내지 38의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 54 내지 60의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 93 내지 101의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 복수의 항-인간 Igβ 항체로서, 상기 항체의 중쇄 불변 영역이 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 항체를 제조했으며(실시예 1 내지 3), 이들 항체가 인간 B 세포상의 인간 Igβ에 결합하고(실시예 4 및 5) 항-IgM 항체에 의해 유도된 인간 B 세포의 활성화를 억제하는 것을 밝혀내었다(실시예 6). 그 결과, 상술한 항-인간 Igβ 항체가 제공되며, 이에 본 발명을 완성한 것이다. 또한, 상기 항체는 인간 PBMC 이입 NOG 마우스 모델에서 혈장 인간 항체가를 억제하고(실시예 7), 원숭이 TTx 항원 감작 모델에서 혈장 중의 총 항체가에 영향을 주지 않으면서 항원 특이적 항체를 억제하는 것(실시예 8)을 발견했다.
다시 말해, 본 발명은 의료상 또는 산업상 적용가능한 물질 또는 방법으로서 이하의 발명을 포함한다.
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31 내지 35의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50 내지 65의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 98 내지 108의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24 내지 38의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 54 내지 60의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 93 내지 101의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
(2) 인간화 항체인 상기 (1)의 항-인간 Igβ 항체.
(3) 하기 1) 내지 4)로 이루어진 군에서 선택되는, 상기 (1)의 항-인간 Igβ 항체:
1) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
3) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 번역후 수식에서 유도되는 항-인간 Igβ 항체.
(4) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는, 상기 (3)의 항-인간 Igβ 항체.
(5) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는, 상기 (3)의 항-인간 Igβ 항체.
(6) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는, 상기 (3)의 항-인간 Igβ 항체.
(7) 상기 (4) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 번역후 수식에서 유도되는 항-인간 Igβ 항체.
(8) 번역후 수식이 중쇄 가변 영역의 N 말단에서 피로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실인, 상기 (3) 또는 (7)의 항-인간 Igβ 항체.
(9) 인간 Igκ 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함하는, 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체.
(10) 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 상기 (1)의 항-인간 Igβ 항체.
(11) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 상기 (1)의 항-인간 Igβ 항체.
(12) 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 상기 (1)의 항-인간 Igβ 항체.
(13) 상기 (10) 내지 (12) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 번역후 수식에서 유도되는 항-인간 Igβ 항체.
(14) 번역후 수식이 중쇄 가변 영역의 N 말단에서 피로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실인, 상기 (13)의 항-인간 Igβ 항체.
(15) 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 상기 (13)의 항-인간 Igβ 항체.
(16) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 상기 (13)의 항-인간 Igβ 항체.
(17) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는, 상기 (13)의 항-인간 Igβ 항체.
(18) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(19) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(20) 상기 (18) 및/또는 (19)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
(21) 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택되는, 상기 (20)의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포:
(a) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(b) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(c) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
(d) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
(22) 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택되는, 상기 (20)의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포:
(a) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(b) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(c) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
(d) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
(23) 항-인간 Igβ 항체를 생산하는 방법으로서, 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 세포(들)를 배양하여 항-인간 Igβ 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 생산 방법:
(a) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(b) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
(c) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
(24) 항-인간 Igβ 항체를 생산하는 방법으로서, 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 세포(들)를 배양하여 항-인간 Igβ 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 생산 방법:
(a) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(b) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
(c) 상기 (10) 내지 (13) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
(25) 상기 (23)의 방법에 의해 생산되는 항-인간 Igβ 항체.
(26) 상기 (24)의 방법에 의해 생산되는 항-인간 Igβ 항체.
(27) 상기 (1) 내지 (17), (25) 및 (26) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
(28) 상기 (10)의 항-인간 Igβ 항체, 상기 (15)의 항-인간 Igβ 항체, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
(29) 자기면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물인, 상기 (27) 또는 (28)의 약학 조성물.
(30) 자기면역 질환이 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증인, 상기 (29)의 약학 조성물.
(31) 자기면역 질환의 예방 또는 치료 방법으로서, 상기 (1) 내지 (17), (25) 및 (26) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 예방 또는 치료 방법.
(32) 자기면역 질환이 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증인, 상기 (1) 내지 (17), (25) 및 (26)의 방법.
(33) 자기면역 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 (1) 내지 (17), (25) 및 (26) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체.
(34) 자기면역 질환이 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증인, 상기 (33)의 항-인간 Igβ 항체.
(35) 자기면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 상기 (1) 내지 (17), (25) 및 (26) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 용도.
(36) 자기면역 질환이 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증인, 상기 (35)의 용도.
본 발명의 항-인간 Igβ는 B 세포의 활성화를 저해함으로써 우수한 면역억제 작용을 가지며, 자기면역 질환 예컨대 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 및 특발성 혈소판 감소성 자반증의 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있다.
도 1은 인간 B 세포에서 항-IgM 항체-유발 세포 증식에 대한 인간화 항-Igβ 항체의 저해 효과를 도시한다. 종축은 B 세포의 증식률를 나타내고, 횡축은 첨가되는 항체 농도(㎍/mL)를 나타낸다.
도 2는 인간 PBMC의 NOG 마우스 내로 이입에 의해 유발되는 혈장 중 인간 IgM 항체가의 상승에 대한 인간화 항-Igβ 항체의 저해 작용을 도시한다. 종축은 혈장 중 인간 IgM 항체가(㎍/mL)를 나타내고 횡축은 인간 PBMC를 NOG 마우스 내로 이입하는 것에서부터의 시간(일)을 나타낸다.
도 3은 인간 PBMC의 NOG 마우스 내로의 이입에 의해 유발되는 혈장 중 인간 IgE 항체가의 상승에 대한 인간화 항-Igβ 항체의 저해 작용을 도시한다. 종축은 혈장 중 인간 IgE 항체가(ng/mL)를 나타내고, 횡축은 인간 PBMC를 NOG 마우스 내로 이입하는 것에서부터의 시간(일)을 나타낸다.
도 4는 흡착 파상풍 톡소이드를 원숭이에 면역시킴으로써 야기되는 혈장 중 항-흡착 파상풍 톡소이드의 증가에 대한 인간화 항-Igβ 항체의 저해 작용을 도시한다. 종축은 혈장 중 항-흡착 파상풍 톡소이드 항체가(U/mL)를 나타내고, 횡축은 흡착 파상풍 톡소이드를 원숭이에 면역시키는 것에서부터의 시간(일)을 나타낸다.
도 5는 흡착 파상풍 톡소이드에 의해 면역된 원숭이의 혈장 중 총 IgM 항체가에 대한 인간화 항-Igβ 항체의 작용을 도시한다. 종축은 혈장 중 총 IgM 항체가(U/mL)를 나타내고, 횡축은 흡착 파상풍 톡소이드를 원숭이에 면역시키는 것에서부터의 시간(일)을 나타낸다.
도 6은 흡착 파상풍 톡소이드에 의해 면역된 원숭이의 혈장 중 총 IgA 항체가에 대한 인간화 항-Igβ 항체의 작용을 도시한다. 종축은 혈장 중 총 IgA 항체가(U/mL)를 나타내고, 횡축은 흡착 파상풍 톡소이드를 원숭이에 면역시키는 것에서부터의 시간(일)을 나타낸다.
도 7은 흡착 파상풍 톡소이드에 의해 면역된 원숭이의 혈장 중 총 IgG 항체가에 대한 인간화 항-Igβ 항체의 작용을 도시한다. 종축은 혈장 중 총 IgG 항체가(U/mL)를 나타내고, 횡축은 흡착 파상풍 톡소이드를 원숭이에 면역시키는 것에서부터의 시간(일)을 나타낸다.
이하에서, 본 발명을 상세히 설명한다.
항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE의 5개의 클래스가 존재한다. 항체 분자의 기본 구조는 각 클래스 공통으로 분자량 50000 내지 70000인 중쇄 및 분자량 20000 내지 30000인 경쇄로 구성된다. 중쇄는 통상 대략 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 쇄로 이루어지고, 클래스 각각에 대해 특징적인 구조를 가지며, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE에 대응되는 Igγ, Igμ, Igα, Igδ, 및 Igε로서 지칭된다. 나아가, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4의 4개의 서브클래스가 IgG에 존재하며, 이들에 각각 대응되는 중쇄가 Igγ1, Igγ2, Igγ3, 및 Igγ4로서 지칭된다. 경쇄는 통상 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 쇄로 이루어지고, 이의 2가지 타입, 타입 L 및 타입 K가 공지되어 있으며, Igλ 및 Igκ로서 지칭된다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성에서, 2개의 상동인 중쇄 및 2개의 상동인 경쇄가 이황화 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 이의 분자량은 150000 내지 190000 이다. 2종의 경쇄는 임의의 중쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 각각의 항체 분자는 전형적으로 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진다.
쇄내 S-S 결합과 관련해, 4개의 S-S 결합이 중쇄에 존재하고 (μ 및 ε 쇄에는 5개) 2개의 S-S 결합이 경쇄에 존재하며; 100 내지 110개의 아미노산 잔기 당 하나의 루프가 형성되며, 이러한 입체 구조는 루프들 간에 유사하고 구조 단위 또는 도메인으로서 지칭된다. 중쇄 및 경쇄 둘다에서 아미노 말단측(N 말단측)에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 샘플에서조차 아미노산 서열이 일정하지 않으며, 가변 영역으로서 지칭되고, 각각의 도메인은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로서 지칭된다. 상기 가변 영역으로부터의 카르복시 말단측(C 말단측)의 아미노산 서열은 각각의 클래스 또는 서브클래스에서 거의 일정하며 불변 영역으로서 지칭된다.
항체의 항원 결합 부위는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 구성되고, 결합 특이성은 이 부위의 아미노산 서열에 좌우된다. 한편, 상보체 및 각종 세포에 결합하는 것과 같은 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 불변 영역 구조에 있어 차이를 반영한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 가변성은 두 쇄에 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 대부분 한정되며 이들 영역은 상보성 결정 영역(CDR: N 말단측으로부터 CDR1, CDR2, 및 CDR3)으로서 지칭되는 것으로 인식된다. 가변 영역의 나머지 부분은 프레임워크 영역(FR)으로서 지칭되며 비교적 일정하다.
<본 발명의 항-인간 Igβ 항체>
본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 이하의 특성을 갖는 항-인간 Igβ 항체를 포함한다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 31 내지 35의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50 내지 65의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 98 내지 108의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24 내지 38의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 54 내지 60의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 93 내지 101의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
일 실시양태에서, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 인간화 항체이다. 본 명세서에서 "인간화 항체"는 마우스 항체 유래의 CDR과 인간 항체 유래의 다른 항체 부분을 포함하는 형태의 항체를 의미한다. 인간화 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며 미국 특허 제5225539호, 제6180370호, 등을 참조하여 제조될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 하기 1) 내지 3) 중 어느 하나에 기재된 항-인간 Igβ 항체이다:
1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
2) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
3) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
본 명세서에서 사용되는 항체 불변 영역에서 아미노산 변이의 도입과 관련한 잔기 번호는 EU 인덱스(Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda)를 따른다. S239D는 인간 Igγ1 불변 영역에서 Kabat 등의 EU 인덱스에 따른 아미노산의 239번 위치의 세린의 아스파르트산으로의 치환이다. H268D는 인간 Igγ1 불변 영역에서 Kabat 등의 EU 인덱스에 따른 아미노산의 268번 위치의 히스티딘의 아스파르트산으로의 치환이다. L328W는 인간 Igγ1 불변 영역에서 Kabat 등의 EU 인덱스에 따른 아미노산의 328번 위치의 류신의 트립토판으로의 치환이다. S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역의 예는 서열 번호 2의 아미노산 번호 120 내지 449의 아미노산 서열로 이루어진 인간 Igγ1 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄 불변 영역으로서, Igλ 및 Igκ의 불변 영역 중 어느 하나가 선택될 수 있지만, 인간 Igκ 불변 영역이 바람직하다. 인간 Igκ 불변 영역의 예는 서열 번호 4의 아미노산 번호 113 내지 218의 아미노산 서열로 이루어진 인간 Igκ 불변 영역을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나에서 선택된 항-인간 Igβ 항체이다:
i) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
ii) 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
iii) 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
항체가 세포 내에서 발현되는 경우, 항체는 번역후 수식되는 것으로 알려져 있다. 번역후 수식의 예는 카르복시펩티다제에 의한 중쇄의 C 말단에서 리신의 절단; 중쇄 및 경쇄의 N 말단에서 글루타민 또는 글루탐산의 피로글루타밀화에 의한 피로글루탐산으로의 수식; 글리코실화; 산화; 탈아미드화; 및 당화를 포함하며, 이러한 번역후 수식은 각종 항체에서 일어나는 것으로 알려져 있다 (Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 97, p. 2426-2447, 2008).
본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 번역후 수식을 겪은 항-인간 Igβ 항체를 포함한다. 번역후 수식을 겪은 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 예는 중쇄 가변 영역의 N 말단에서 피로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실을 겪은 항-인간 Igβ 항체를 포함한다. N 말단에서 피로글루타밀화 및 C 말단에서 리신의 결실로 인한 이러한 번역후 수식은 항체의 활성에 어떠한 영향을 미치지 않는 것으로 업계에 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, Vol. 348, p. 24-39, 2006).
예를 들면, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 하기 1) 내지 3) 중 어느 하나에 기재된 항-인간 Igβ 항체를 포함한다:
1) 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식되고/거나 아미노산 번호 449의 리신이 결실된 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
2) 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식되고/거나 아미노산 번호 449의 리신이 결실된 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
3) 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식되고/거나 아미노산 번호 449의 리신이 결실된 서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
일 실시양태에서, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나에서 선택된 항-인간 Igβ 항체이다:
i) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
ii) 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
iii) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
당업자는 본 발명에 기초하여 항체와 다른 펩티드 또는 단백질의 융합 형태를 제조할 수 있고, 수식제가 결합하는 수식된 형태를 제조할 수 있으며, 본 발명의 항체는 이들 형태의 항체를 포함한다. 융합에 사용되는 다른 펩티드 또는 단백질은 항체의 결합 활성이 저하되지 않는 한 특별히 제한되지 않고, 이의 예들은 인간 혈청 알부민, 각종 태그 펩티드, 인공 헬릭스 모티프 펩티드, 말토스 결합 단백질, 글루타티온 S 트랜스퍼라제, 각종 독소, 다량체화를 촉진할 수 있는 다른 펩티드 또는 단백질, 등을 포함한다. 수식에 사용되는 수식제는 항체의 결합 활성이 저하되지 않는 한 특별히 제한되지 않고, 이의 예들은 폴리에틸렌 글리콜, 당쇄, 인지질, 리포좀, 저분자 화합물, 등을 포함한다.
본 명세서에서 "항-인간 Igβ 항체"는 인간 Igβ에 결합하는 항체를 의미한다. "항-인간 Igβ 항체"가 인간 Igβ에 결합하는지 여부는 공지의 결합 활성 측정 방법에 의해 확인된다. 결합 활성 측정 방법의 예는 효소 결합 면역흡착제 검정법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA) 등의 방법을 포함한다. ELISA를 사용하는 경우, 예를 들면, 인간 Igβ-Flag 단백질(예를 들면, 서열 번호 13의 염기 서열에 의해 코딩됨)은 ELISA 플레이트에 고상화되고 시험 항체가 여기에 첨가되어 반응되어진다. 반응 후, 이차 항체 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 등과 같은 효소로 표지된 항-IgG 항체를 반응시키고, 세정한 다음, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들면, HRP 표지의 경우, BM-화학발광 ELISA 기질(POD)(Roche Diagnostics Inc.))을 이용하는 활성 측정을 통해 이차 항체의 결합을 동정함으로써 시험 항체가 인간 Igβ에 결합하는지를 확인할 수 있다. 구체적인 측정 방법으로서, 이하의 실시예 4에 기재된 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 항-인간 Igβ 항체는, 항체가 인간 Igβ에 결합하는 한, 인간 Igβ에의 결합에 더하여, 다른 동물 유래의 Igβ(예를 들면, 원숭이 Igβ)에 결합하는 항체를 포함한다.
본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 활성을 평가하는 방법으로서, 인간 B 세포에 대한 결합 활성 또는 BCR 자극에 의해 유발되는 인간 B 세포의 활성화를 저해하는 활성이 평가될 수 있다. 이러한 활성을 평가하는 방법으로서, 이하의 실시예 5 및 6에 기재된 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 인간 Igβ에 결합하고 BCR 자극에 의해 유발되는 인간 B 세포의 활성화를 저해하는 활성을 갖는다.
본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 본 명세서에 개시된 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄의 서열 정보에 기초하여 해당 분야에 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 특별히 제한되지 않지만, 이하에 기재된 <본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 생산 방법, 및 이 방법에 의해 생산되는 항-인간 Igβ 항체>의 섹션에 기재된 방법에 따라 생산될 수 있다.
본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 필요시 추가 정제되고, 통상적인 방법에 따라 제제화되며, 자기면역 질환 예컨대 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 바세도우씨병, 시속척수염, 자기면역성 용혈성 빈혈, 천포창, 항인지질 항체 증후군, ANCA 관련 혈관염, 쇼그렌 증후군, 하시모토병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 또는 만성 피로 증후군의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
<본 발명의 폴리뉴클레오티드>
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 예는 서열 번호 1 또는 15에 제시된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 예는 서열 번호 5에 제시된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 예는 서열 번호 9에 제시된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 예는 서열 번호 3에 제시된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 예는 서열 번호 7에 제시된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 예는 서열 번호 11에 제시된 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 그 염기 서열에 기초하여 해당 분야에 공지된 방법을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 해당 분야에 공지된 유전자 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 유전자 합성 방법으로서, 다양한 방법 예컨대 당업자에 의해 공지된 WO90/07861에 기재된 항체 유전자의 합성 방법이 사용될 수 있다.
<본 발명의 발현 벡터>
본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 사용되는 발현 벡터는, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 진핵 세포(예를 들면, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 효모) 및/또는 원핵 세포(예를 들면, 대장균)의 각종 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 이들에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 생산될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 발현 벡터의 예는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들면, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스), 등을 포함한다. 바람직하게는 pEE6.4 또는 pEE12.4(Lonza Biologics, Inc.)가 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 동물 세포로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터의 예는 바이러스 유래 프로모터 예컨대 CMV, RSV, 또는 SV40, 액틴 프로모터, EF(신장 인자) 1α 프로모터, 및 열 충격 프로모터를 포함한다. 박테리아(예를 들면, 에쉐리키아속(Escherichia))에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터의 예는 trp 프로모터, lac 프로모터, λPL 프로모터, 및 tac 프로모터를 포함한다. 나아가, 효모에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터의 예는 GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, 및 ADH 프로모터를 포함한다.
숙주 세포로서 동물 세포, 곤충 세포, 또는 효모를 사용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 발현 벡터는 인핸서 서열, 본 발명의 항체 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 신호 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐화 부위, 또는 복제가능 단위를 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 대장균을 사용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는 개시 코돈, 종결 코돈, 터미네이터 영역, 및 복제가능 단위를 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 발현 벡터는 일반적으로 목적에 따라 사용되는 선택 마커(예를 들면, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 또는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자)를 포함할 수 있다.
<본 발명의 형질전환된 숙주 세포>
본 발명의 형질전환된 숙주 세포는 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다:
(a) 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
(d) 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
바람직한 본 발명의 형질전환된 숙주 세포의 예는 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다.
형질전환된 숙주 세포는, 숙주 세포가 사용되는 발현 벡터에 적합하고, 상기 발현 벡터로 형질전환되어 항체를 발현시킬 수 있다면 특별히 한정되지 않는다. 형질전환된 숙주 세포의 예는 각종 세포 예컨대 본 발명의 분야에서 일반적으로 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 확립된 세포(예를 들면, 동물 세포 (예를 들면, CHO-K1SV 세포), 곤충 세포(예를 들면, Sf9), 박테리아(예를 들면, 에쉐리키아속), 효모 (예를 들면, 사카로마이세스속(Saccharomyces) 또는 피키아속(Pichia)) 등)를 포함한다. 바람직하게는, 배양 세포 예컨대 CHO-K1SV 세포, CHO-DG 44 세포, 293 세포, 또는 NS0 세포가 사용될 수 있다.
숙주 세포를 형질전환하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 인산칼슘법 또는 전기천공법이 사용될 수 있다.
<본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 생산 방법, 및 이 방법에 의해 생산되는 항-인간 Igβ 항체>
본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 생산 방법은 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 세포(들)를 배양하여 항-인간 Igβ 항체를 발현시킴으로써 항-인간 Igβ 항체를 생산하는 방법을 포함한다:
(a) 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 생산 방법은 본 발명의 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항-인간 Igβ 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 한 특별히 제한되지 않는다. 상기 방법에 사용되는 바람직한 숙주 세포의 예는 상술한 바와 같은 본 발명의 바람직한 형질전환된 숙주 세포를 포함한다.
형질전환된 숙주 세포는 공지된 방법에 의해 배양될 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, 배지의 pH, 및 배양 시간은 적절히 선택된다. 숙주 세포가 동물 세포인 경우, 배지의 예는 대략 5% 내지 20%의 태아 소 혈청이 보충된 MEM 배지(Science, Vol. 130, p. 432-437, 1959), DMEM 배지(Virology, Vol. 8, p. 396, 1959), RPMI1640 배지(J. Am. Med. Assoc., Vol. 199, p. 519, 1967), 및 199 배지(Exp. Biol. Med., Vol. 73, p. 1-8, 1950)를 포함한다. 배지의 pH는 바람직하게는 대략 6 내지 8이고, 배양은 필요시 통기 및 교반하면서 일반적으로 대략 30℃ 내지 40℃에서 대략 15 시간 내지 72 시간 동안 수행된다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, 배지로서, 예를 들면, 태아 소 혈청이 보충된 그레이스 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 8404, 1985)가 사용될 수 있다. 배지의 pH는 바람직하게는 대략 5 내지 8이고, 배양은 필요시 통기 및 교반하면서 일반적으로 대략 20℃ 내지 40℃에서 대략 15 시간 내지 100 시간 동안 수행된다. 숙주 세포가 대장균 또는 효모인 경우, 배지로서, 예를 들면, 영양원이 보충된 액체 배지가 적절하다. 영양 배지는 형질전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원, 또는 유기 질소원을 포함하는 것이 바람직하다. 탄소원의 예는 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분, 및 수크로스를 포함하고 무기 질소원 또는 유기 질소원의 예는 암모늄염, 질산염, 아미노산, 콘스티프 리쿼, 펩톤, 카제인, 고기 추출물, 대두박, 및 감자 추출물을 포함한다. 원한다면 다른 영양분(예를 들면, 무기 염(예를 들면, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 및 염화마그네슘), 비타민), 및 항생제(예를 들면, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 및 카나마이신)이 포함될 수 있다. 배지의 pH는 바람직하게는 대략 5 내지 8이다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 배지의 바람직한 예는 LB 배지 및 M9 배지(Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 3, A2.2)를 포함한다. 배양은 필요시 통기 및 교반하면서 일반적으로 대략 14℃ 내지 43℃에서 대략 3 시간 내지 24 시간 동안 수행된다. 숙주 세포가 효모인 경우, 배지로서, 예를 들면, Burkholder 최소 배지(Proc. Natl. Acad, Sci, USA, Vol. 77, p. 4505, 1980)가 사용될 수 있다. 배양은 필요시 통기 및 교반하면서 일반적으로 대략 20℃ 내지 35℃에서 대략 14 시간 내지 144 시간 동안 수행된다. 배양을 상술된 방식으로 수행함으로써, 본 발명의 항-인간 Igβ 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 생산 방법은, 본 발명의 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항-인간 Igβ 항체를 발현시키는 단계 이외에, 형질전환된 숙주 세포로부터 항-인간 Igβ 항체를 회수, 바람직하게는 단리 또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 단리 또는 정제 방법의 예는 용해도를 이용하는 방법 예컨대 염분 제거 및 용매 침전법, 분자량 차이를 이용하는 방법 예컨대 투석, 한외여과, 및 겔 여과, 전하를 이용하는 방법 예컨대 이온 교환 크로마토그래피 및 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 특이적 친화성을 이용하는 방법 예컨대 친화성 크로마토그래피, 소수성의 차이를 이용하는 방법 예컨대 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 및 등전점의 차이를 이용하는 방법 예컨대 등전점 전기영동을 포함한다. 바람직하게는, 배양 상청액에 축적된 항체가 각종 크로마토그래피, 예를 들면, 단백질 A 컬럼 또는 단백질 G 컬럼을 이용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 또한 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 생산 방법에 의해 생산되는 항-인간 Igβ 항체를 포함한다.
<본 발명의 약학 조성물>
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항-인간 Igβ 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 부형제, 즉, 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 약제용 부형제 또는 약제용 담체와 함께 일반적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 약학 조성물의 제형의 예는 비경구 약물 예컨대 주사제 및 점적용제를 포함하며, 이들은 정맥내 투여, 피하 투여, 등에 의해 투여될 수 있다. 약물 제조에서, 제형에 따라 부형제, 담체, 및 첨가제가 약학적으로 허용가능한 범위 내에서 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 복수 종의 본 발명의 항-인간 Igβ 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 번역후 수식을 겪지 않은 항체 및 항체의 번역후 수식에서 유도된 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 하기 (1) 내지 (3)으로 이루어진 군에서 선택되는 항-인간 Igβ 항체 및 상기 항-인간 Igβ 항체의 번역후 수식에서 유도된 항-인간 Igβ 항체를 포함한다:
(1) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
(2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
(3) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
본 발명의 약학 조성물은 중쇄의 C 말단의 리신이 결실된 항체, N 말단에 번역후 수식이 이루어진 항체, 중쇄의 C 말단의 리신이 결실되고 N 말단에 번역후 수식이 이루어진 항체, 및/또는 중쇄의 C 말단의 리신이 결실되고 N 말단에 번역후 수식이 이루어지지 않은 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
일 실시양태에서, 항-인간 Igβ 항체를 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 하기 (1) 내지 (4)에서 선택되는 2종 이상의 항-인간 Igβ 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다:
(1) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
(2) 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
(3) 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
(4) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
일 실시양태에서, 항-인간 Igβ 항체를 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 하기 (1) 내지 (4)에서 선택되는 2종 이상의 항-인간 Igβ 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다:
(1) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
(2) 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
(3) 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
(4) 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
일 실시양태에서, 항-인간 Igβ 항체를 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 하기 (1) 내지 (4)에서 선택되는 2종 이상의 항-인간 Igβ 항체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다:
(1) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
(2) 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
(3) 아미노산 번호 1의 글루탐산이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
(4) 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
나아가, 일 실시양태에서, 본 발명의 약학 조성물은 이하에 기재된 약학 조성물이다:
서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체, 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
제제화에 있어 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 첨가량은 환자의 증상의 정도, 환자의 연령, 사용할 약물의 제형, 항체의 결합 역가, 등에 따라 달라지며, 예를 들면, 대략 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg의 첨가량이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 자기면역 질환 예컨대 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 바세도우씨병, 시속척수염, 자기면역성 용혈성 빈혈, 천포창, 항인지질 항체 증후군, ANCA 관련 혈관염, 쇼그렌 증후군, 하시모토병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 만성 피로 증후군, 등의 치료제로서 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항-인간 Igβ 항체를 포함하는, 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증의 예방 또는 치료 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항-인간 Igβ 항체를 포함한다. 이외에도, 본 발명은 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항-인간 Igβ 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 이해도를 높이기 위해 참조되는 특정의 실시예를 제공하고 있지만, 이들은 단지 예시적이며 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
[ 실시예 ]
시판되는 키트 또는 시약을 이용하는 부분에서는, 달리 언급이 없다면 첨부된 프로토콜에 따라 시험이 수행된다.
(실시예 1: 인간 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질의 취득)
Flag 태그가 인간 Igβ에 결합된 단백질(인간 Igβ-Flag 단백질) 및 Flag 태그가 원숭이 Igβ에 결합된 단백질(원숭이 Igβ-Flag 단백질)을 취득했다. 인간 Igβ-Flag 유전자(서열 번호 13)를 GS 벡터 pEE6.4(Lonza Biologics, Inc.) 내에 도입했다. 원숭이 Igβ-Flag 유전자(서열 번호 14)를 GS 벡터 pEE6.4(Lonza Biologics, Inc.) 내에 도입했다. 준비된 각각의 벡터를 FreeStyle MAX 시약(life Technologies, Inc.)을 사용하여 FreeStyle 293 세포(Life Technologies, Inc.)에 유전자 도입했다. 각각의 세포를 FreeStyle 293 발현 배지(Life Technologies, Inc.)를 사용하는 무혈청 배양 시스템에서 1주일간 배양하고 인간 Igβ-Flag 단백질 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질을 각각 함유하는 배양 상청액을 취득했다. 얻어진 배양 상청액으로부터 항-Flag M2 항체 친화성 겔(SIGMA-ALDRICH Corporation)을 사용하여 단백질을 정제한 다음 이하의 시험에 사용했다.
(실시예 2: 항-인간 Igβ 항체의 취득)
항-인간 Igβ 항체를 취득하기 위해, 실시예 1에서 취득된 인간 Igβ-Flag 단백질 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질을 면역 반응을 일으키는 아쥬번트와 함께 C3H/HeJJmsSlc-lpr/lpr 마우스(Japan SLC, Inc.)에 주입하여 면역화를 수행했다. 마우스를 수회 면역시키고 최종 면역화를 수행했다. 통상적인 방법에 따라, 면역된 마우스의 비장 및 림프절을 적출하고, 림프구를 수집하고 마우스 골수종 세포 SP2/0(ATCC CRL-1581)와 세포 융합시켜, 하이브리도마를 제조했다. 하이브리도마의 한계 희석 샘플을 제조하고 하이브리도마를 모노클론화했다. 각각의 클론을 확대 배양하고, 배지를 무혈청 배지인 하이브리도마 SFM(Life Technologies, Inc.)으로 교환한 다음, 클론을 3 내지 5일간 배양했다. 얻어진 배양 상청액으로부터 항체 정제 키트(단백질 G 정제 키트; Proteus, Inc.)를 사용하여 항체를 정제했다.
각각의 클론으로부터 얻어진 항체에 대해, 인간 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질에 대한 결합 활성 및 인간 및 원숭이 B 세포에 대한 결합 활성을 평가했다. 그 결과, CL6_40으로 지칭되는 항체가 인간 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질 둘다에 결합하고 인간 및 원숭이 B 세포 둘다에 대해 높은 결합 활성을 갖는 것이 밝혀졌다. CL6_40에 대해, 하이브리도마로부터 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 클로닝하고 서열 결정을 시행했다.
(실시예 3: 인간화 항체의 제조)
CL6_40의 중쇄 및 경쇄의 CDR을 다른 인간 항체에 이식하고, 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄의 복수의 유전자를 제조했다. 각각의 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄의 두 유전자를 포함하는 발현 벡터를 GS 벡터(Lonza Biologics, Inc.)를 사용하여 구축했다. 구체적으로, 신호 서열을 코딩하는 유전자(N. Whittle et al., Protein Eng., Vol. 1, p. 499-505, 1987) 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1의 불변 영역 유전자(서열 번호 1의 염기 번호 358 내지 1350의 염기 서열로 이루어짐)를 각각의 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 유전자의 5' 측 및 3' 측에 각각 라이게이션한 다음, 중쇄 유전자를 GS 벡터 pEE6.4 내에 삽입했다. 또한, 신호 서열을 코딩하는 유전자(N. Whittle et al., 앞서 언급됨) 및 인간 κ 쇄의 불변 영역 유전자(서열 번호 3의 염기 번호 337 내지 657의 염기 서열로 이루어짐)를 각각의 인간화 항체의 경쇄 가변 영역 유전자의 5' 측 및 3' 측에 각각 라이게이션한 다음, 경쇄 유전자를 GS 벡터 pEE12.4 내에 삽입했다.
제조된 인간화 항체 CL6_40m12_DDW의 중쇄의 염기 서열은 서열 번호: 1 및 15에 제시되고, 상기 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 2에 제시되며, 상기 항체의 경쇄의 염기 서열은 서열 번호 3에 제시되고, 상기 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 4에 제시된다. 서열 번호 2에 제시된 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 31 내지 35, 50 내지 65, 및 98 내지 108의 아미노산 서열로 이루어진다. 서열 번호 4에 제시된 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 24 내지 38, 54 내지 60, 및 93 내지 101의 아미노산 서열로 이루어진다.
제조된 인간화 항체 CL6_40m14_DDW의 중쇄의 염기 서열은 서열 번호 5에 제시되고, 상기 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 6에 제시되며, 상기 항체의 경쇄의 염기 서열은 서열 번호 7에 제시되고, 상기 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 8에 제시된다. 서열 번호 6에 제시된 중쇄의 가변 영역은 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 중쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열 번호 6의 아미노산 번호 31 내지 35, 50 내지 65, 및 98 내지 108의 아미노산 서열로 이루어진다. 서열 번호 8에 제시된 경쇄의 가변 영역은 서열 번호 8의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열 번호 8의 아미노산 번호 24 내지 38, 54 내지 60, 및 93 내지 101의 아미노산 서열로 이루어진다.
제조된 인간화 항체 CL6_40m16_DDW의 중쇄의 염기 서열은 서열 번호 9에 제시되고, 상기 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 10에 제시되며, 상기 항체의 경쇄의 염기 서열은 서열 번호 11에 제시되고, 상기 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열 번호 12에 제시된다. 서열 번호 10에 제시된 중쇄의 가변 영역은 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열 번호 10의 아미노산 번호 31 내지 35, 50 내지 65, 및 98 내지 108의 아미노산 서열로 이루어진다. 서열 번호 12에 제시된 경쇄의 가변 영역은 서열 번호 12의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 각각 서열 번호 12의 아미노산 번호 24 내지 38, 54 내지 60, 및 93 내지 101의 아미노산 서열로 이루어진다.
서열 번호: 6 및 10에 제시된 중쇄 각각의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 서열 번호 2에 제시된 중쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 동일하고, 서열 번호: 8 및 12에 제시된 경쇄 각각의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 서열 번호 4에 제시된 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3과 동일하다.
각 인간화 항체를 제조하기 위해, 각 항체의 중쇄 및 경쇄의 유전자가 각각 삽입된 상술한 GS 벡터를 NotI 및 PvuI로 제한 효소 절단하고, 라이게이션-컨비니언스 키트(Ligation-Convenience Kit)(NIPPONGENE Co., Ltd.)를 사용하여 라이게이션을 시행하여, 중쇄 및 경쇄의 양 유전자가 삽입된 더블-유전자 벡터를 구축했다. 다음, Expi 293 발현 배지(Life Technologies, Inc.)에서 대략 3000000 세포/mL로 배양한 Expi 293 세포(Life Technologies, Inc.)에 대해, 더블-유전자 벡터를 ExpiFectamine 293(Life Technologies, Inc.)을 사용하여 형질감염시키고, 5일간 배양했다. 다음, 얻어진 배양 상청액으로부터 단백질 G(GE Healthcare Japan Corporation)를 사용하여 각각의 인간화 항체의 정제된 항체를 얻었다. 항시적 발현과 관련해서, 상술한 더블-유전자 벡터를 CHO-K1SV 세포(Lonza Biologics, Inc.)에 형질감염시킴으로써 항체를 발현시켰다. 이후, 배양 상청액으로부터 MabSelect SuRe(GE Healthcare Japan Corporation)를 사용하여 각각의 인간화 항체의 정제된 항체를 얻었다. 각각의 정제된 인간화 항체의 아미노산 수식을 분석한 결과, 정제된 항체 대부분에서, 중쇄의 C 말단에서의 리신의 결실이 CL6_40m12_DDW에서 일어났고, 중쇄의 N 말단에서의 피로글루타밀화 및 중쇄의 C 말단에서의 리신의 결실이 CL6_40m14_DDW에서 일어났으며, 중쇄의 C 말단에서의 리신의 결실이 CL6_40m16_DDW에서 일어났다.
(실시예 4: 항원에 대한 ELISA 어세이)
인간화 항체의 항원 결합 활성을 측정하기 위해, 항원 ELISA를 사용했다. 실시예 1에서 취득한 인간 Igβ-Flag 단백질을, 5000 ng/mL의 농도가 되도록 하기 위해 트리스 완충 식염수(TBS; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)로 조제하고, NUNC MaxiSorp 화이트 384 플레이트(Maxisorp 384 플레이트: Nunc Corporation)에 1 웰 당 15 ㎕의 양으로 첨가한 다음, 실온에서 1시간 동안 고상화시켰다. 결과물을 TBS-T(0.05% Tween-20 함유 TBS: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)로 2회 세정하고, 120 ㎕의 블로킹제(Blocking One: Nacalai tesque, Inc.)를 첨가하고, 결과물을 실온에서 1시간 동안 정치하고, 용액을 제거했다. 등량의 블로킹제 및 TBS를 첨가함으로써 얻어진 희석 용액을 사용하여 실시예 3에서 얻어진 각각의 인간화 항체의 희석계열(최종 농도가 0.46 ng/mL 내지 1 ㎍/mL인 8 단계)을 제조한 다음 여기에 15 ㎕의 양으로 첨가했다. 결과물을 실온에서 1시간 동안 정치하고, TBS-T 세정액으로 3회 세정하고, 희석 용액으로 3000배 희석된 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-표지된 토끼 항-인간 Ig 항체(Dako Ltd.)를 20 ㎕ 첨가했다. 이후, 결과물을 실온에서 1시간 동안 정치한 다음 TBS-T 세정액으로 3회 세정했다. 다음, 화학발광 검출 시약인 BM-화학발광 ELISA 기질(POD)(Roche Diagnostics Inc.)을 30 ㎕ 첨가하고, 이의 화학발광량을 EnVision 카운터(PerkinElmer, Co., Ltd.)로 측정했다. 동일한 방법을 사용하여, 실시예 1에서 취득한 원숭이 Igβ-Flag 단백질을 사용해 항원 ELISA 어세이를 수행했다. 시험 항체의 각각의 농도에서 결합 활성을 계산할 때, 시험 항체가 첨가되지 않은 웰의 측정량을 0%로 설정하고 시험 항체의 최대 활성의 수렴치를 100%로 설정했다. 계산된 결합 활성을 분석하고, 시험 항체의 EC50 값을 곡선 피팅에 의해 계산했다.
그 결과, CL6_40m12_DDW의 인간 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질에 대한 EC50 값은 각각 128 ng/mL 및 183 ng/mL였다. CL6_40m14_DDW의 인간 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질에 대한 EC50 값은 각각 100 ng/mL 및 106 ng/mL였다. CL6_40m16_DDW의 인간 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질에 대한 EC50 값은 각각 132 ng/mL 및 118 ng/mL였다. 각각의 인간화 항체 모두 인간 및 원숭이 Igβ-Flag 단백질 둘다에 대해 높은 결합 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
(실시예 5: 인간 및 원숭이 PBMC에 대한 FACS 분석)
인간 및 원숭이 세포에 대한 인간화 항체의 결합 활성을 평가하기 위해, 형광 활성화 세포 선별(Fluorescence Activated Cell Sorting: FACS) 분석을 인간 및 원숭이 PBMC에서 PBMC에 함유된 B 세포를 표적으로 사용하여 B 세포 마커인 CD20을 지표로하여 시행했다. 원숭이 PBMC는 원숭이의 혈액을 등량의 PBS(Life Technologies, Inc.)로 희석하고, 희석된 혈액을 등량의 Ficoll(GE Healthcare Japan Corporation)상에 적층하고, 실온에서 및 1500 rpm에서 30분간 원심처리를 행함으로써 제조되었다. 다음, 인간 PBMC(AllCells, Inc.) 또는 원숭이 PBMC를 96-웰 플레이트(Greiner Bio-One)에 1웰 당 200000개의 양으로 30 ㎕의 스테인 버퍼(Stain Buffer)(Becton, Dickinson Company)에 현탁된 상태로 파종했다. 실시예 3에서 취득한 각 인간화 항체의 희석계열(최종 농도가 0.03 ng/mL 내지 30 ㎍/mL인 4 단계)을 스테인 버퍼를 사용하여 제조하고 희석계열을 30 ㎕ 첨가했다. 결과물을 얼음상에서 30분간 정치하고, 스테인 버퍼로 3회 세정하고, 스테인 버퍼로 200배 희석된 피코에리트린-표지된 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편(JACKSON, Inc.)과 스테인 버퍼로 8배 희석된 알로피코시아닌-표지된 마우스 항-CD20 항체(Becton, Dickinson Company)를 갖는 용액을 40 ㎕ 첨가했다. 결과물을 얼음상에서 30분간 정치하고 스테인 버퍼로 2회 세정했으며, FACSArray(Becton, Dickinson Company)를 사용하여 형광 강도를 측정한 다음, 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity: MFI)를 계산했다. 분석을 위해 FlowJo(TOMY DIGITAL BIOLOGY Co., Ltd.)를 사용했다.
그 결과, 각 인간화 항체는 모두 인간 및 원숭이 B 세포 둘다에서 높은 결합 활성을 갖는 것을 확인했다.
(실시예 6: 항-IgM 항체-유발 세포 증식 활성의 평가)
BCR 자극으로 인한 인간 B 세포의 활성화에 대한 인간화 항체의 저해 효과를 평가하기 위해, 인간 B 세포에서 항-IgM 항체-유발 세포 증식 활성을 평가했다. 항-IgM 항체는 BCR을 응집시킴으로써 B 세포를 활성화시킨다. BCR 및 FcγRIIb 둘다에 결합하는 항체는 FcγRIIb를 BCR에 동원하고 이에 B 세포의 증식이 저해될 수 있다. 본 실시예에서는, 항-CD19 S267E/L328F(특허 문헌 2)가 비교 항체로서 사용되었다. 대조군 항체로서, 생체내에 존재하지 않는 항원인 KLH(keyhole limpet hemocyanin)에 대한 인간 IgG1 항체(항-KLH Ab)가 사용되었다(WO 2013/094723). 다음, 인간 B 세포(AllCells, Inc.)를 96-웰 플레이트(Iwaki, Co., Ltd.)에서 1 웰 당 30000개의 양으로 60 ㎕의 RPMI 배지(SIGMA-ALDRICH Corporation)로 파종했다. 이후, 실시예 3에서 취득한 각각의 완전 인간 항체, 항-CD19 S267E/L328F, 또는 항-KLH Ab의 희석계열(최종 농도가 0.3 ng/mL 내지 30 ㎍/mL인 3 단계)을 제조하고 20 ㎕의 양으로 RPMI 배지로 첨가했다. RPMI 배지에서 최종 농도가 5 ㎍/mL로 조절되게 제조된 항-IgM 항체(JACKSON, Inc.)를 20 ㎕ 첨가하고 CO2 인큐베이터에서 4일간 인큐베이트했다. 다음, CellTiter-Glo(Promega K.K.)를 사용하여 세포 증식 분석을 실시했다. 나아가, 본 실시예에서는, 시험 항체 비첨가/항-IgM 항체 비첨가 군 및 시험 항체 비첨가/항-IgM 항체 첨가 군을 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로서 제조한 다음 시험을 실시했다. 각각의 시험 항체에 대해 듀플리케이트로 시험을 실시했다.
도 1은 인간 B 세포의 증식률의 결과를 도시한다. 시험 항체 투여 군의 증식률은 시험 항체 비첨가/항-IgM 항체 비첨가 군을 음성 대조군(증식률: 0%)으로서 그리고 시험 항체 비첨가/항-IgM 항체 첨가 군을 양성 대조군(증식률: 100%)으로서 설정하여 계산되었다. 이는 시험 항체의 BCR에 대한 저해 활성이 이의 증식률의 값이 작을수록 더 강하다는 것을 의미한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 30 ㎍/mL의 항-CD19 S267E/L328F에 대한 증식률이 52.3%인 반면, 30 ㎍/mL의 CL6_40m12_DDW, CL6_40m14_DDW, 및 CL6_40m16_DDW에 대한 증식률은 각각 2.8%, 20.2%, 및 23.2%였다. 따라서, 상술한 완전 인간 항체는 모두 항-CD19 S267E/L328F에 비해 인간 B 세포에서 항-IgM 항체-유발 세포 증식에 대해 강한 저해 활성을 갖는 것이 분명하다.
(실시예 7: 인간 PBMC 이입 NOG 마우스 모델에서 약효의 평가)
생체내 항체 생산에 대해 인간화 항체의 효과성을 확인할 목적으로, 인간 PBMC를 NOG 마우스로 이입함으로써 유도된 인간 항체가의 상승에 대한 각종 항체의 치료 투여에 있어서의 작용을 평가했다. 본 모델에서, 이물(마우스) 인식에 의해 격렬히 활성화된 인간 B 세포가 마우스 체내에서 혈장(블라스트) 세포로 분화하는 것이 고려되고, 인간 B 계열 세포의 활성에 대한 시험 약물의 약리 작용을 평가하는데 있어 본 모델이 적합한 것으로 고려된다.
인간 PBMC(AllCells, Inc.)를 PBS(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에서 10000000 세포/mL로 현탁하고 11 주령의 수컷 NOG 마우스(In-vivo Science, Inc.)의 꼬리 정맥에 0.25 mL(2500000 세포)의 양으로 투여했다. 34일째 (PBMC 이입 후 34일째), 체중을 측정하고 혈액을 샘플링했다. 혈장 인간 IgM 및 IgE 항체가를 ELISA(Bethyl Laboratories, Inc.)를 사용하여 측정했다. 혈장 인간 IgM, IgE 항체가, 및 체중 데이터에 기초하여 그룹핑을 실시했다.
본 실시예에서는, 비교 항체로서, 항-CD19 S267E/L328F를 사용했다. 대조군 항체로서, 항-KLH Ab를 사용했다. 35일 및 42일째 10 mg/10 mL/kg의 시험 항체를 마우스에 피하 투여했다. 42일 및 49일째 혈액 샘플링을 실시하고 혈장 인간 IgM 및 IgE 항체가를 ELISA(Bethyl Laboratories, Inc.)를 사용하여 측정했다. 시험은 4 또는 5 마리 동물의 단위 군에서 실시되었다. 시험 결과는 "평균 값 ± 표준 오차"로 표시된다. 항-KLH Ab 군 및 각종 시험 항체 군의 유의차 시험은 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행되었고, p 값이 0.05 미만인 경우는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 상술한 시험은 GraphPad Prism(버젼 5.04)을 사용하여 수행되었다.
도 2는 혈장 인간 IgM 항체가에 대한 시험 항체의 작용을 도시한다. 혈장 인간 IgM 항체가는 항-KLH Ab에 비해 CL6_40m12_DDW 및 CL6_40m14_DDW에 의해 유의하게 감소했다. 혈장 인간 IgM 항체가에 대한 CL6_40m12_DDW 및 CL6_40m14_DDW 저하 작용은 매우 조기에 발현되며 투여 개시 후 첫주(42일째)부터 인식되었다. 한편, 항-CD19 S267E/L328F에서는, 혈장 인간 IgM 항체가에 대한 저하 작용이 투여 개시 후 2주(49일째) 이후에만 유의했다.
다음, 도 3은 혈장 인간 IgE 항체가에 대한 시험 항체의 작용을 도시한다. CL6_40m12_DDW 및 CL6_40m14_DDW에서, 혈장 인간 IgE 항체가는 항-KLH Ab에 비해 빠르게 그리고 유의하게 감소했다. 한편, 항-CD19 S267E/L328F에서는, 혈장 인간 IgE 항체가가 저하되지 않았다.
도 2 및 3에 도시된 바와 같이, 상술한 CL6_40m12_DDW 및 CL6_40m14_DDW는 둘다 항-CD19 S267E/L328F에 비해 인간 항체가의 증가에 대해 강한 저해 활성을 갖는 것이 분명하다.
(실시예 8: 원숭이 TTx 항원 감작 모델에서 약효의 평가)
흡착 파상풍 톡소이드(TTx) 항원을 원숭이에 1회 감작시켜 TTx 항원-특이적 IgG를 생산했다. 본 모델에서는, 혈장 중 TTx 항원-특이적 IgG 이외에 혈장 중 총 항체가를 평가할 수 있다. 따라서, 본 모델에서는, 자기면역 질환의 치료시에 효과성 이외에 안전성을 평가할 수 있다.
수컷 시아노몰거스 원숭이(생산지: 중국, 3세 이상)를 사용하여, 2 mg/kg 내지 5 mg/kg(0.05 mL/kg: USP Corporation)의 졸라제팜 염산염 및 2.5 mg/kg 내지 5 mg/kg의 틸레타민 염산염을 마취하에 혼합하고 TTx를 감작시켰다 (감작일을 0일로 설정했음). TTx의 감작은 0.6 mL/원숭이의 파상풍 톡소이드(TTx, 10 Lf/mL, Denka Seika Co., Ltd.)를 대퇴부 근육에 주입하고 0.6 mL/원숭이(12 군데 각 50 ㎕)를 등부의 피내에 주입함으로써 수행되었다. 처리 군으로서, 비히클 군(용매(20mM의 시트르산나트륨 완충제/120 mM, NaCl (pH: 6.0); KOHJIN BIO Co., Ltd.) 1 mL/kg, n = 3) 및 항체 투여 군(10 mg/1 mL/kg, 인간화 항체 CL6_40m14_DDW (용매로 희석), n = 3)를 사용했다. 투여의 타이밍은 TTx 감작 후 14일째로 설정하고, 정맥 투여는 각성시 1 mL/kg의 용량으로 행했다.
CL6_40m14_DDW를 상술한 시아노몰거스 원숭이에 투여한 후, 경시적으로, 예를 들면, 4 시간, 72 시간, 168 시간, 및 336 시간 후에 혈액을 샘플링하고, 원심 처리한 다음, 혈장을 회수했다. 혈장 중 약물 농도는 GyrolabTM xP 워크스테이션(Gyros AB)을 사용하여 측정했다. 방법 및 디스크로서, 200-3W-001-A 및 Bioaffy 200 컴팩트 디스크(Gyros AB)를 사용했다. 나아가, 고상화 항원 및 검출 항체로서, 비오틴-표지된 재조합 인간 CD79B(Novoprotein, Inc.) 및 알렉사-표지된 염소 항-인간 IgG(Southern Biotechnology Associates, Inc.)를 사용했다. 표 1에 수록된 바와 같이, CL6_40m14_DDW의 혈장 중 약물 농도는 본 모델의 평가 기간 동안 유지되었다.
표 1: 원숭이에서 인간화 항-Igβ 항체에 대한 혈장 중 약물 농도의 추이
개체 1의 혈장에서 약물의 농도 (㎍/mL) 개체 2의 혈장에서 약물의 농도 (㎍/mL) 개체 3의 혈장에서 약물의 농도 (㎍/mL)
4 시간 후 252.111 263.242 258.271
72 시간 후 143.586 144.095 114.605
168 시간 후 120.070 112.865 95.848
336 시간 후 76.854 62.281 53.305
상술한 시아노몰거스 원숭이로부터 13일째(흡착 파상풍 톡소이드에 의해 시아노몰거스가 면역된 후 13일), 14일째, 17일째, 21일째, 및 28일째 경시적으로 혈액을 샘플링하고, 원심 처리를 실시하며, 혈장을 회수했다. 회수된 혈장에서 항-흡착 파상풍 톡소이드(항-TTx IgG)를 측정하기 위해, 항원 ELISA를 사용했다. 흡착 파상풍 톡소이드(Denka Seika Co., Ltd.)를 인산염 완충 식염수(PBS; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)로 20배 희석하고, NUNC MaxiSorp 96 플레이트(Maxisorp 96 플레이트: Nunc Corporation)에 1웰 당 100 ㎕의 양으로 첨가한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 고상화시켰다. 결과물을 PBS-T(0.05% Tween-20 함유 PBS: Thermo Scientific, Inc.)로 4회 세정하고, 200 ㎕의 블로킹제(Blocker Casein In PBS; Life Technologies, Inc.)를 첨가했으며, 결과물을 실온에서 2시간 동안 정치시키고, 용액을 제거했다. 다음, 회수된 혈장 100 ㎕ 및 검량선을 위한 샘플 100 ㎕를 각각 첨가했다. 검량선을 위한 샘플로서, 흡착 파상풍 톡소이드에 의한 시아노몰거스 원숭이의 면역화로부터 21일 및 23일 후에 수집된 혈장과 혼합된 샘플이 사용되었고, 이의 양은 100 U/mL로 조절되었으며, 희석 용액으로서 블로킹제를 사용하여 제조된 희석계열(0.488 mU/mL 내지 500 mU/mL)을 사용했다. 결과물을 실온에서 2시간 동안 정치하고, PBS-T 세정액으로 4회 세정했으며, 블로킹제로 3000배 희석된 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-표지된 염소 항-원숭이 IgG 항체(Nordic, Inc.)를 100 ㎕ 첨가했다. 이후, 결과물을 실온에서 1시간 동안 정치한 다음 PBS-T 세정액으로 4회 세정했다. 다음, TMB Microwell Peroxidase Substrate System(KPL, Inc.)을 사용하여 측정을 실시했다. 흡광도는 SpectraMax(Molecular Devices, Inc.)를 사용하여 측정했다.
도 4는 혈장 중 흡착 파상풍 톡소이드 항체가에 대한 시험 항체의 작용을 도시한다. 혈장 중 흡착 파상풍 톡소이드 항체가(항-TTX IgG)는 비히클 군에 비해 CL6-40m14_DDW에서 저하되었다.
시아노몰거스 원숭이로부터 14일째, 17일째, 21일째, 및 28일째 회수된 혈장 중 총 항체가(IgM, IgA, 및 IgG)는 하기 방법을 사용하여 측정되었다. 토끼 항-원숭이 IgM 폴리클로날 항체(COVANCE, Inc.) 및 토끼 항-인간 IgA 폴리클로날 항체(Bethyl Laboratories, Inc.)를 인산염 완충 식염수(PBS: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)로 100배, 500배, 및 1000배 희석하고, NUNC MaxiSorp 96 플레이트(Maxisorp 96 플레이트: Nunc Corporation)에 100 ㎕의 양으로 첨가한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 고상화시켰다. 결과물을 PBS-T(0.05% Tween-20 함유 PBS: Thermo Scientific, Inc.)로 4회 세정하고, 200 ㎕의 블로킹제(Blocker Casein In PBS; Life Technologies, Inc.)를 첨가하고, 결과물을 실온에서 1시간 동안 정치하고 PBS-T 세정액으로 4회 세정했다. 검량선을 위한 샘플 및 수집된 원숭이 혈장의 희석계열을 희석 용액으로서 블로킹제를 사용하여 제조했고 희석계열 100 ㎕를 첨가했다. 검량선을 위한 샘플로서, 정상 시아노몰거스 원숭이로부터 조제된 혈장을 희석한 다음 사용했다. 결과물을 실온에서 2시간 동안 정치하고, PBS-T 세정액으로 4회 세정하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-표지된 항-원숭이 IgM 항체(KPL, Inc.), 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-표지된 항-인간 IgA 항체(Bethyl Laboratories, Inc.), 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-표지된 항-원숭이 IgG 항체(KPL, Inc.)를 블로킹제로 각각 1000배, 5000배, 및 3000배 희석하고 각각 100 ㎕의 양으로 첨가했다. 이후, 결과물을 실온에서 2시간 동안 정치한 다음, PBS-T 세정액으로 4회 세정했다. 다음, TMB Microwell Peroxidase Substrate System(KPL, Inc.)을 사용하여 측정을 실시했다. 흡광도를 SpectraMax(Molecular Devices, Inc.)로 측정했다.
도 5, 6, 및 7은 혈장 중 총 항체가(IgM, IgA, 및 IgG)에 대한 시험 항체의 작용을 도시한다. CL6_40m14_DDW는 비히클 군에 비해 혈장 중 총 항체가(IgM, IgA, 및 IgG)에 영향을 미치지 않았다.
상술한 결과로부터, CL6_40m14_DDW는 혈장 중 총 항체가에 영향을 미침이 없이 항원-특이적 항체를 억제하는 것이 명백하다. 나아가, CL6_40m14_DDW는 자기면역 질환의 치료시의 효과성 이외에 안전성 측면에서도 우수한 프로파일을 갖는 것이 또한 명백하다.
산업상 이용가능성
본 발명의 항-인간 Igβ 항체는 자기면역 질환의 예방 및 치료에 유용하다. 나아가, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 형질전환된 숙주 세포, 및 항체 생산 방법은 상기 항-인간 Igβ 항체의 생산에 유용하다.
서열 목록 프리 텍스트
서열 목록의 번호 표제 <223>에서, "Artificial Sequence"의 설명이 기재된다. 구체적으로, 서열 목록의 서열 번호 1 및 3에 제시된 염기 서열은 각각 CL6_40m12_DDW의 중쇄 및 경쇄의 염기 서열이고, 서열 번호 2 및 4에 제시된 아미노산 서열은 각각 서열 번호 1 및 3에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열 목록의 서열 번호 5 및 7에 제시된 염기 서열은 각각 CL6_40m14_DDW의 중쇄 및 경쇄의 염기 서열이고, 서열 번호 6 및 8에 제시된 아미노산 서열은 각각 서열 번호 5 및 7에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열 목록의 서열 번호 9 및 11에 제시된 염기 서열은 각각 CL6_40m16_DDW의 중쇄 및 경쇄의 염기 서열이고, 서열 목록의 서열 번호 10 및 12에 제시된 아미노산 서열은 각각 서열 번호 9 및 11에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열 목록의 서열 번호 13에 제시된 염기 서열은 인간 Igβ-Flag 유전자의 염기 서열이고 서열 목록의 서열 번호 14에 제시된 염기 서열은 원숭이 Igβ-Flag 유전자의 염기 서열이다. 서열 목록의 서열 번호 15에 제시된 염기 서열은 CL6_40m12_DDW의 중쇄의 염기 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> Novel anti-human Ig-beta antibody <130> A15019A00 <150> JP2014-160141 <151> 2014-08-06 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain of anti-human Ig-beta antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(1350) <400> 1 gag gtg cag atg gtc gag agc ggg ggg ggc ctg gtg cag cct ggg ggt 48 Glu Val Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aga ctg tct tgt gcc gtg tcc ggg ttt tca ctg tcc agc tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 agt gtg cac tgg gtc cga cag gca cca ggg aag ggt ctg gag tgg gtg 144 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gga atc tgg tca gga gga tcc att cat tat acc cct gcc ctg tct 192 Ala Gly Ile Trp Ser Gly Gly Ser Ile His Tyr Thr Pro Ala Leu Ser 50 55 60 agt aga ttc aca gtg agc cgc gac gat tct aaa aac aca gtc tac ctg 240 Ser Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn 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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Trp Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 3 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain of anti-human Ig-beta antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(657) <400> 3 gac atc cag ctg acc cag tcc ccc tcc agc ctg tcc gcc tct gtg ggc 48 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtg acc atc aca tgc aag gcc tcc cag tcc gtg gac tac gac 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala 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cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg 720 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 gac gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc 768 Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc gac gaa gac 816 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp 260 265 270 cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat 864 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg 912 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag 960 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc tgg cca gcc ccc atc gag aaa 1008 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Trp Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc 1056 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc 1104 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag 1152 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg 1200 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag 1248 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag 1296 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt 1344 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 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acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 8 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser 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Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 12 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 13 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Ig-beta-Flag fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(447) <400> 13 gcc aga tcg gag gac cgg tac cgg aat ccc aaa ggt agt gct tgt tcg 48 Ala Arg Ser Glu Asp Arg Tyr Arg Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser 1 5 10 15 cgg atc tgg cag agc cca cgt ttc ata gcc agg aaa cgg ggc ttc acg 96 Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr 20 25 30 gtg aaa atg cac tgc tac atg aac agc gcc tcc ggc aat gtg agc tgg 144 Val Lys Met His Cys Tyr Met Asn Ser Ala Ser Gly Asn Val Ser Trp 35 40 45 ctc tgg aag cag gag atg gac gag aat ccc cag cag ctg aag ctg gaa 192 Leu Trp Lys Gln Glu Met Asp Glu Asn Pro Gln Gln Leu Lys Leu Glu 50 55 60 aag ggc cgc atg gaa gag tcc cag aac gaa tct ctc gcc acc ctc acc 240 Lys Gly Arg Met Glu Glu Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ala Thr Leu Thr 65 70 75 80 atc caa ggc atc cgg ttt gag gac aat ggc atc tac ttc tgt cag cag 288 Ile Gln Gly Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 aag tgc aac aac acc tcg gag gtc tac cag ggc tgc ggc aca gag ctg 336 Lys Cys Asn Asn Thr Ser Glu Val Tyr Gln Gly Cys Gly Thr Glu Leu 100 105 110 cga gtc atg gga ttc agc acc ttg gca cag ctg aag cag agg aac acg 384 Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn Thr 115 120 125 ctg aag gat tcg tca gca gac ctg gtt ccg cgc gga tcc gac tac aag 432 Leu Lys Asp Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp Tyr Lys 130 135 140 gac gat gac gat aaa tga 450 Asp Asp Asp Asp Lys 145 <210> 14 <211> 453 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monkey Ig-beta-Flag fusion gene <220> <221> CDS <222> (1)..(450) <400> 14 gcc aaa tca gag gac ctg tac ccg aat ccc aaa ggt agt gct tgt tct 48 Ala Lys Ser Glu Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Gly Ser Ala Cys Ser 1 5 10 15 cgg atc tgg cag agc cca cgt ttc ata gcc agg aaa cgg ggc ttc acg 96 Arg Ile Trp Gln Ser Pro Arg Phe Ile Ala Arg Lys Arg Gly Phe Thr 20 25 30 gtg aaa atg cac tgc tac gtg acc aac agc acc ttc agc atc gtg agc 144 Val Lys Met His Cys Tyr Val Thr Asn Ser Thr Phe Ser Ile Val Ser 35 40 45 tgg ctc cgg aag cgg gag acg gac aag gag ccc caa cag gtg aac ctg 192 Trp Leu Arg Lys Arg Glu Thr Asp Lys Glu Pro Gln Gln Val Asn Leu 50 55 60 gag cag ggc cac atg cat cag acc caa aac agc tct gtc acc acc ctc 240 Glu Gln Gly His Met His Gln Thr Gln Asn Ser Ser Val Thr Thr Leu 65 70 75 80 atc atc caa gac atc cgg ttt gag gac aac ggc atc tac ttc tgt cag 288 Ile Ile Gln Asp Ile Arg Phe Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Gln 85 90 95 cag gag tgc agc aag acc tcg gag gtc tac cgg ggc tgc ggc acg gag 336 Gln Glu Cys Ser Lys Thr Ser Glu Val Tyr Arg Gly Cys Gly Thr Glu 100 105 110 ctg cga gtc atg ggg ttc agc acc ttg gca cag ctg aag cag agg aac 384 Leu Arg Val Met Gly Phe Ser Thr Leu Ala Gln Leu Lys Gln Arg Asn 115 120 125 acg ctg aag gat tcg tca gca gac ctg gtt ccg cgc gga tcc gac tac 432 Thr Leu Lys Asp Ser Ser Ala Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp Tyr 130 135 140 aag gac gat gac gat aaa tga 453 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 145 150 <210> 15 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain of anti-human Ig-beta antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(1350) <400> 15 gag gtg cag atg gtg gaa tcc ggc gga ggc ctg gtg cag cct ggc ggc 48 Glu Val Gln Met Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctg tcc tgc gcc gtg tcc ggc ttc agc ctg tcc tcc tac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 tcc gtg cac tgg gtc cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144 Ser Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gcc ggc att tgg agc ggc ggc tcc atc cac tac acc cct gcc ctg tcc 192 Ala Gly Ile Trp Ser Gly Gly Ser Ile His Tyr Thr Pro Ala Leu Ser 50 55 60 tcc cgg ttc acc gtg tcc cgg gac gac tcc aag aac acc gtg tac ctg 240 Ser Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 cag atg aac tcc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc gcc 288 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 cgc tac gac aga tac gag aca tac gcc atg gac tac tgg ggc cag ggc 336 Arg Tyr Asp Arg Tyr Glu Thr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 acc ctg gtg aca gtg tcc tcc gcc tcc acc aag ggc ccc tcc gtg ttc 384 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 cct ctg gcc ccc tcc agc aag tcc acc tct ggc ggc acc gct gcc ctg 432 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 ggc tgc ctg gtg aaa gac tac ttc ccc gag ccc gtg acc gtg tcc tgg 480 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 aac tct ggc gcc ctg acc tcc ggc gtg cac acc ttc cct gcc gtg ctg 528 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 cag tcc tcc ggc ctg tac tcc ctg tcc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc 576 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 agc tct ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aac cac aag ccc 624 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag tcc tgc gac aag 672 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 acc cac acc tgt ccc cct tgc cct gcc cct gag ctg ctg ggc gga ccc 720 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 gat gtg ttt ctg ttc ccc cca aag ccc aag gac acc ctg atg atc tcc 768 Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 cgg acc ccc gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg gac gtg tcc gac gag gac 816 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Asp Glu Asp 260 265 270 cct gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac 864 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 gcc aag acc aag ccc aga gag gaa cag tac aac tcc acc tac cgg gtg 912 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aaa gaa 960 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 tac aag tgc aag gtt tcc aac aag gcc tgg cct gcc ccc atc gaa aag 1008 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Trp Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 acc atc tcc aag gcc aag ggc cag ccc cgc gag ccc cag gtg tac acc 1056 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 ctg ccc cct agc cgg gac gag ctg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc 1104 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 tgt ctg gtg aaa ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc gtg gaa tgg gag 1152 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 tcc aac ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc cct gtg ctg 1200 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 gac tcc gac ggc tca ttc ttc ctg tac tcc aag ctg acc gtg gac aag 1248 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 tcc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc tcc gtg atg cac gag 1296 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 gcc ctg cac aat cac tac acc cag aag tcc ctg tcc ctg agc ccc ggc 1344 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 aag tga 1350 Lys

Claims (36)

  1. 서열 번호 2의 아미노산 번호 31 내지 35의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50 내지 65의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 98 내지 108의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24 내지 38의 아미노산 서열로 이루어진 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 54 내지 60의 아미노산 서열로 이루어진 CDR2, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 93 내지 101의 아미노산 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간화 항체인 항-인간 Igβ 항체.
  3. 제1항에 있어서, 하기 (1) 내지 (4)로 이루어진 군에서 선택되는 항-인간 Igβ 항체:
    (1) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
    (2) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체;
    (3) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체; 및
    (4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나의 항-인간 Igβ 항체의 번역후 수식에서 유도되는 항-인간 Igβ 항체.
  4. 제3항에 있어서, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 8의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  5. 제3항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  6. 제3항에 있어서, 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 119의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역, 서열 번호 12의 아미노산 번호 1 내지 112의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역, 및 S239D, H268D, 및 L328W의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 불변 영역인 중쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 번역후 수식에서 유도되는 항-인간 Igβ 항체.
  8. 제3항 또는 제7항에 있어서, 번역후 수식이 중쇄 가변 영역의 N 말단에서 피로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실인 항-인간 Igβ 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Igκ 불변 영역인 경쇄 불변 영역을 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  10. 제1항에 있어서, 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  11. 제1항에 있어서, 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  12. 제1항에 있어서, 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 번역후 수식에서 유도되는 항-인간 Igβ 항체.
  14. 제13항에 있어서, 번역후 수식이 중쇄 가변 영역의 N 말단에서 피로글루타밀화 및/또는 중쇄의 C 말단에서 리신의 결실인 항-인간 Igβ 항체.
  15. 제13항에 있어서, 아미노산 번호 1의 글루타민이 피로글루탐산으로 수식된 서열 번호 6의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  16. 제13항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  17. 제13항에 있어서, 서열 번호 10의 아미노산 번호 1 내지 448의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 서열 번호 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항-인간 Igβ 항체.
  18. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 제18항 및/또는 제19항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  21. 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택되는, 제20항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포:
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
    (b) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
    (c) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
    (d) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  22. 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군에서 선택되는, 제20항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포:
    (a) 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
    (b) 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
    (c) 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
    (d) 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  23. 항-인간 Igβ 항체를 생산하는 방법으로서, 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 세포(들)를 배양하여 항-인간 Igβ 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 생산 방법:
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
    (b) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  24. 항-인간 Igβ 항체를 생산하는 방법으로서, 하기 (a) 내지 (c)로 이루어진 군에서 선택되는 숙주 세포(들)를 배양하여 항-인간 Igβ 항체를 발현시키는 단계를 포함하는 생산 방법:
    (a) 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포;
    (b) 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  25. 제23항에 따른 생산 방법에 의해 생산되는 항-인간 Igβ 항체.
  26. 제24항에 따른 생산 방법에 의해 생산되는 항-인간 Igβ 항체.
  27. 제1항 내지 제17항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  28. 제10항에 따른 항-인간 Igβ 항체, 제15항에 따른 항-인간 Igβ 항체, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 자기면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물인 약학 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 자기면역 질환이 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증인 약학 조성물.
  31. 자기면역 질환의 예방 또는 치료 방법으로서, 제1항 내지 제17항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 예방 또는 치료 방법.
  32. 제31항에 있어서, 자기면역 질환이 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증인 예방 또는 치료 방법.
  33. 제1항 내지 제17항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 자기면역 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항-인간 Igβ 항체.
  34. 제33항에 있어서, 자기면역 질환이 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증인 항-인간 Igβ 항체.
  35. 자기면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 제1항 내지 제17항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 항-인간 Igβ 항체의 용도.
  36. 제35항에 있어서, 자기면역 질환이 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 또는 특발성 혈소판 감소성 자반증인 용도.
KR1020177003135A 2014-08-06 2015-08-05 신규 항-인간 Igβ 항체 Active KR102488214B1 (ko)

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