ES2378407T3 - Aumento de la expresión de inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgénicos no humanos - Google Patents

Aumento de la expresión de inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgénicos no humanos Download PDF

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Abstract

Un animal transgénico no humano seleccionado de entre el grupo que consiste en primates no humanos, roedores, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, pollos, pavos, patos y gansos que comprende: (a) una construcción transgénica que codifica una subunidad completa de la lgα; humana de Id. de Sec. Nº : 1 y/o, (b) una construcción transgénica que codifica una subunidad completa de la Igβ humana de Id. de Sec. Nº : 7, y, (c) una construcción transgénica que codifica un locus de inmunoglobulina humana; en la que los productos transgénicos resultantes se combinan para formar un complejo receptor de células B humanas.

Description

Aumento de la expresión de inmunoglobulina humana o humanizada en animales transgénicos no humanos
Campo de la invención
Esta invención está relacionada con un método para mejorar la expresión de inmunoglobulina humana en animales transgénicos no humanos mediante la promoción del desarrollo de células B normales y mediante el sostenimiento de la expresión de anticuerpos humanos en animales no humanos portadores del loci de inmunoglobulina humana. En particular, esta invención está relacionada con la expresión simultánea de transgenes que codifican Igα Oy/o Igβ humana, componentes del receptor de linfocito B, y transgenes que codifican un locus o loci de inmunoglobulina humana. Este método permite la expresión dominante de anticuerpos humanos, por ejemplo en la sangre, leche o huevos de los animales transgénicos no humanos.
Descripción de la materia relacionada
Los anticuerpos son una clase importante de productos farmacéuticos que se han utilizado con éxito en el tratamiento de varias enfermedades y condiciones humanas, como el cáncer, enfermedades alérgicas, prevención del rechazo de un transplante y enfermedad de huésped frente a injerto.
El principal problema de las preparaciones de anticuerpo obtenidas a partir de animales no humanos es la inmunogenicidad intrínseca de las inmunoglobulinas no humanas en pacientes humanos. Para poder reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos no humanos, se ha demostrado que al fusionar exones de la región variable (V) de animales con exones de la región constante (C) humana, se puede obtener un gen de anticuerpo quimérico. Dichos anticuerpos quiméricos o humanizados presentan una mínima inmunogenicidad en humanos y son apropiados para utilizar en el tratamiento terapéutico de sujetos humanos.
Se han desarrollado anticuerpos monoclonales humanizados y se utilizan en la práctica clínica. No obstante, el uso de anticuerpos monoclonales en general, ya sean quimericos, humanizados o humanos, para el tratamiento de enfermedades devastadoras como el cáncer o infecciones con patógenos virulentos, está limitado debido a la complejidad, etiología multifactorial y adaptabilidad de estas enfermedades. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra dianas únicas normalmente fracasan cuando estas dianas cambian, evolucionan y mutan. Por ejemplo, las neoplasias pueden ganar resistencia a las terapias con anticuerpos monoclonales estándar. Una solución a este problema es utilizar anticuerpos policlonales que poseen la capacidad de dirigirse hacia una serie de dianas en evolución. Los anticuerpos policlonales pueden neutralizar toxinas bacterianas o virales, y dirigir respuestas inmunitarias para matar y eliminar a los patógenos.
De acuerdo con esto, existe una gran necesidad clínica de métodos adecuados para la producción a gran escala de anticuerpos monoclonales y policlonales de gran titulación, alta afinidad, humanizados. Además, debido a que la producción de anticuerpos en animales transgenicos más grandes como conejos, pollos, ovejas y vacas está favorecido desde un punto de vista de rendimiento del anticuerpo, la creación de animales fundadores más grandes que expresan mayores cantidades de productos codificados por transgenes también es muy deseable.
Los anticuerpos monoclonales humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR, y posiblemente algunos residuos FR, están sustituidos por residuos de sitios análogos en animales no humanos, p.ej., anticuerpos de roedores. La humanización puede realizarse en esencia siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988)), mediante la sustitución de CDR de animales no humanos o secuencias de CDR (p.ej., roedores), por las correspondientes secuencias de un anticuerpo monoclonal humano.
Mientras se realizaban anticuerpos humanizados en animales, se encontró un problema que es la producción endógena de anticuerpos del huésped sobre el anticuerpo transgénico, que necesita ser suprimido. Se ha descrito que la deleción homocigota del anticuerpo, gen de la región de unión de la cadena pesada (JH) en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal, resulta en la inhibición completa de la producción endógena del anticuerpo. La transferencia de un conjunto de genes de inmunoglobulina humana de línea germinal en dicho ratón mutante de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras la presentación de antígenos. Véase, p.ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggemann et al., Year in Inmunol., 7: 33 (1993); Nº de Patente Estadounidense 7.064.244 depositada el 20 de junio de 2006.
La introducción de genes de inmunoglobulina humana en el genoma de ratones resulta en la expresión de un repertorio diversificado de anticuerpos humanos en estos ratones modificados genéticamente. La generación de ratones que expresan anticuerpos quiméricos humano-ratón se han descrito en Pluschke et al., Journal of Inmunological Methods 215: 27-37 (1998). La generación de ratones que expresan polipéptidos de inmunoglobulina humana se han descrito en Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989); Lonberg et al., Int. Rev. Inmunol. 13(1):65-93 (1995); y Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8(4): 455-8 (1997); Patente Estadounidense Nº 5.545.806,
depositada en Agosto de 1996; Patente Estadounidense Nº 5.545.807, depositada en Agosto de 1996 y Patente Estadounidense Nº 5.569.825, depositada en Octubre de 1996. La generación de vacas que expresan anticuerpos humanos se ha descrito en Kuroiwa et al., Nature Biotech 20(9): 889-894 (2002). La producción de animales transgénicos no humanos que expresan transloci de inmunoglobulina humana o humanizada y la producción de anticuerpos de dichos animales transgénicos también se ha descrito en detalle en la Publicación PCT Nº WO 92/03918, WO 02/12437, y en las Patentes Estadounidenses Nº 5.814.318, y 5.570.429.
Los anticuerpos humanizados obtenidos presentan una mínima inmunogenicidad en humanos y son apropiados para su uso en el tratamiento terapéutico de sujetos humanos.
Mientras que las aproximaciones en ingeniería genética citadas anteriormente resulta en la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina humana en ratones modificados genéticamente, el nivel de expresión de inmunoglobulina humana es inferior al normal. Esto puede ser debido a elementos regulatorios específico de especie en el loci de inmunoglobulina que son necesarios para una expresión eficiente de inmunoglobulinas. Tal como se ha demostrado en líneas celulares transfectadas, los elementos regulatorios presentes en los genes de inmunoglobulina humana puede que no funcionen de forma adecuada en animales no humanos. Se han descrito muchos elementos reguladores en genes de inmunoglobulina. Son de particular importancia los potenciadores (3’) de las regiones constantes de cadena pesada y los potenciadores intrónicos en los genes de cadena ligera. Además, otros elementos de control, aún por identificar, pueden estar presentes en los genes de inmunoglobulina. Estudios en ratones han demostrado que la cola de membrana y la cola citoplasmática de la forma de membrana de las moléculas de inmunoglobulina juegan un papel importante en los niveles de expresión de anticuerpos quiméricos humano-ratón en el suero de ratones homocigotos para el gen humano Cγl. Por lo tanto, para la expresión de genes de inmunoglobulina heterólogos en animales, es deseable sustituir secuencias que contienen elementos potenciadores y exones que codifican la cola transmembranal (exón M1) y la cola citoplasmática (exón M2) con secuencias que se encuentran normalmente en el animal en posiciones similares.
La expresión de la inmunoglobulina humana en estos animales genéticamente modificados puede también verse afectada por el desarrollo de células B de las células B humanos portadores de loci de inmunoglobulina humana o humanizada. La influencia del receptor de células B (BCR) sobre el desarrollo de células B se ha estudiado de forma extensa en ratones. No obstante, no está claro cómo un anticuerpo humano o parcialmente humano se combina para formar un BCR funcional, y cómo dicho BCR influirá de forma eficiente el desarrollo y supervivencia de células B no humanos que expresan Ig humano o humanizado, en animales transgénicos, que a su vez, afectarán a las proporciones de anticuerpo.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra un alineamiento de aminoácidos de la secuencia humana de polipéptido Igα (Id. de sec. Nº: 1) con otras secuencias Igα no humanasO (Id. de sec. Nº: 2-6).
La figura 2 muestra un alineamiento de aminoácidos de la secuencia humana de polipéptido Igβ (Id. de sec. Nº: 7) con otras secuencias Igβ no humanas (Id. de sec. Nº: 8-12).
Resumen de la invención
En un aspecto, la descripción proporciona una construcción transgénica que codifica una subunidad IgαO quimérica del BCR, en el que la subunidad IgαO quimérica comprende una secuencia de dominio intracelular y una secuencia de dominio transmembranal de una secuencia no humana de polipéptido, Igα; y además, un polipéptido con al menos un 85% de identidad de secuencia con el dominio extracelular de Igα O humano de Id. de sec. Nº: 1.
En otro aspecto, la descripción proporciona una construcción transgénica que codifica una subunidad IgβO quimérica del BCR, en el que la subunidad IgβO quimérica comprende una secuencia de dominio intracelular y una secuencia de dominio transmembranal de una secuencia no humana de polipéptido, Igβ; y además, un polipéptido con al menos un 85% de identidad de secuencia con el dominio extracelular de Igβ O humano de Id. de sec. Nº.:7.
En ciertos aspectos de la descripción el tipo de secuencia de polipéptido IgαOOno humano incluye, pero no se limita a, a las secuencias bovina (Id. de sec. Nº: 2); murina (Id. de sec. Nº: 3); canina (Id. de sec. Nº: 4); de primate ((Id. de sec. Nº: 5); de conejo (Id. de sec. Nº: 6) u otras secuencias no humanas. En otro aspecto de la descripción, el tipo de secuencia de polipéptido IgβOOno humano incluye, pero no se limita a, las secuencias canina (Id. de sec. Nº: 8); de rata (Id. de sec. Nº: 9); bovina (Id. de sec. Nº: 10); murina (Id. de sec. Nº: 11); de pollo (Id. de sec. Nº: 12) u otras secuencias no humanas.
En un aspecto de la invención, los animales transgénicos no humanos seleccionados de un grupo que consiste de primates no humanos, conejos, ratones, ratas, cerdos, ovejas, cabras, caballos, burros, pollos, pavos, patos, gansos, y vacas comprende (a) una construcción transgénica que codifica una subunidad IgαO humana de longitud completa de Id. de sec. Nº.: 1, y/o, (b) una construcción transgénica que codifica una subunidad IgβOhumana de longitud
completa de Id. de sec. Nº: 7 y, (c) una construcción transgénica que codifica un locus de inmunoglobulina humana, en el que los productos transgénicos resultantes se combinan para formar un complejo de receptor de linfocito B humano.
En una realización de este aspecto, la expresión de cualquier producción de Ig endógena, y/o, expresión de subunidad IgαO endógena y/o IgβO endógena, de los animales transgénicos no humanos se reduce de forma sustancial.
En una realización preferible, los animales transgénicos no humanos son conejos.
En otro aspecto, la descripción también proporciona una inmunoglobulina humana o humanizada aislada de los animales transgénicos no humanos definidos anteriormente, que puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En cierta realización de este aspecto, la inmunoglobulina humana o humanizada aislada puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, o alternativamente, es un fragmento de anticuerpo. El fragmento de anticuerpo puede ser de un de un anticuerpo monoclonal o policlonal. Además, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede marcarse, o fusionarse con una toxina para formar una inmunotoxina, o acoplado a un agente terapéutico, o fusionado con cualquier secuencia heteróloga de aminoácidos bien definida y utilizada en la materia. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fc, Fv, Fab, Fab’ o F(ab’)2.
En otro aspecto, la invención proporciona un linfocito B aislado de un animal transgénico no humano definido anteriormente, en el que el linfocito B expresa la subunidad nativa humana de IgαO de Id. de sec. Nº: 1 y/o la subunidad nativa humana de IgβO de Id. de sec. Nº: 7, y además, también expresa el locus de inmunoglobulina humana. En ciertas realizaciones, este linfocito B está inmortalizado y en una realización preferible, deriva de un conejo.
En otro aspecto, la descripción proporciona un anticuerpo preparación que comprende an anticuerpo o an fragmento de anticuerpo, como se ha descrito anteriormente.
En otro aspecto, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, como se ha descrito anteriormente, en una mezcla con un ingrediente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender tanto un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, o uno o varios anticuerpos policlonales o fragmentos de los mismos.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir anticuerpos humanos en un animal no humano como se ha definido anteriormente que comprende: (a) introducir y expresar una construcción transgénica que codifica una subunidad IgαO nativa humana de Id. de sec. Nº: 1 y/o una construcción transgénica que codifica una subunidad IgβO nativa humana de Id. de sec. Nº: 7 en un animal no humano; y, (b) introducir y expresar una construcción transgénica que codifica un locus de inmunoglobulina humana en un animal no humano; (c) someter al animal a un estímulo antigénico; y (d) aislar anticuerpos humanos del animal. En cierta realización de este aspecto, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, o es un fragmento de un anticuerpo monoclonal o policlonal. Además, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede estar marcado, o puede estar fusionado con una toxina para formar una inmunotoxina, o acoplado a un agente terapéutico, o puede estar fusionado con cualquier secuencia de aminoácido heteróloga.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir un animal no humano como se ha definido anteriormente que exprese anticuerpos humanos que comprende: (a) introducir y expresar una construcción transgénica que codifica una subunidad IgαO nativa humana de Id. de sec. Nº: 1 y/o una construcción transgénica que codifica una subunidad IgβO nativa humana de Id. de sec. Nº: 7 en un linfocito B de un animal no humano; y, (b) introducir y expresar una construcción transgénica que codifica un locus de inmunoglobulina humana en un animal no humano; en los que los productos transgénicos resultantes se combinan para formar un complejo receptor de linfocito B humano. En una realización, el animal no humano que expresa anticuerpos humanos es un animal que crea diversidad de anticuerpos mediante la conversión génica y/o hipermutación somática. En una realización preferible, el animal es un conejo.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
A no ser que se defina de otra manera, los términos técnicos y científicos utilizados aquí, poseen el mismo significado que entiende de forma usual un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994), y March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, NY 1992), proporcionan a un experto en la materia una guía general a muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.
Un experto en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, que pueden utilizarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no está limitada en ninguna medida a los métodos y materiales descritos. Se definen para la presente invención, los siguientes términos.
"Una construcción transgénica o construcción de expresión " tal como se define en este documento, se refiere a una molécula de DNA que contiene la secuencia codificante para al menos un transgén de interés junto con las secuencias regulatorias apropiadas necesarias para una expresión temporal, específica de célula y/o aumentada para el (los) transgén(es) de interés en las células diana de un animal transgénico no humano.
"Células B" se definen como un linaje de linfocitos B que son capaces de llevar a cabo una redistribución de segmentos de genes de inmunoglobulina y expresar genes de inmunoglobulina en alguna etapa de su ciclo de vida. Estas células incluyen, pero no se limitan a, prelinfocitos B de fase temprana, prelinfocitos B de fase tardía, prelinfocitos B de gran tamaño, prelinfocitos B pequeños, linfocitos B inmaduros, linfocitos B maduros, linfocitos B de memoria, células plasmáticas, etc.
El "Complejo receptor de células B (BCR) " tal como se define en este documento, se refiere al receptor multisubunidad de reconocimiento inmune expresado en células B, que incluye las siguientes subunidades: el receptor de antígeno (Ag), la inmunoglobulina unida a membrana (mig), la subunidad IgαO y la subunidad Igβ. El receptor de linfocito B, sus componentes, y se asociación con las cinco clases de inmunoglobulina se han descrito en Wienands et al., EMBO J. 9(2): 449-455 (1990), Venkitaraman et al., Nature 352: 777-781 (1991), Herren et al., Inmunologic Res. 26(1-3): 35-43 (2002). Además, existen varias proteínas asociadas a BCR (BAP) que han sido clonadas y secuenciadas, pero su función sigue siendo desconocida, y su papel, como componente del BCR, ha siso cuestionado. Las proteínas asociadas a BCR han sido descritas por Adachi et al., EMBO J 15(7): 1534-1541 (1996) y Schamel et al., PNAS 100(17): 9861-9866 (2003).
Las "subunidades Igα Oo IgβO nativas" se refieren a secuencias de polipéptido de Igα Oo IgβO que aparecen de forma naturalO, que incluye alelos de subunidades de Igα Oo IgβO que aparecen de forma natural que se encuentran en un tipo determinado de animal, o en una especie relacionada. Estos también se refieren como "secuencias Igα Oo IgβO de longitud completa". La secuencia de polipéptido de Igα humana se clonó por Flaswinkel et al., Inmunogenetics 36 (4): 266-69 (1992); número de acceso M74721 (Figura 1, Id. de sec. Nº: 1). La secuencia de polipéptido de IgβO humana se clonó por Mueller et al., Eur. J. Biochem. 22, 1621-25 (1992); número de acceso M80461 (Figura 2, Id. de sec. Nº: 7).
El término "humano o humanizado" se refiere a una secuencia totalmente humana o una secuencia que contiene una o más secuencias humanas. Así, el término, tal como se utiliza aquí, incluye secuencias humanas y humanizadas.
Una subunidad o proteína o polipéptido "Igα quimérico" se refiere a una secuencia de polipéptido Igα de un animal (p.ej.; rata, ratón, humano, conejo, pollo, etc.), en el que uno o más dominios del polipéptido Igα está sustituido con un dominio o dominios correspondientes de un polipéptido de Igα diferente de otro animal o especie, o con un dominio o dominios correspondientes de una versión alélica diferente de Igα, o de una variante de secuencia de Igα con una o más sustituciones de aminoácidos, o de una variante de secuencia de Igα con al menos un 85% de identidad de secuencia del dominio correspondiente de una secuencia de Igα determinada. Los términos "Igα quimérico" y "Igα humana o humanizada" se utilizan de forma intercambiable en la especificación. Las secuencias de polipéptido Igα (Id. de sec. Nº: 2-6) de algunos animales no humanos también están definidos en la Figura 1.
Una subunidad o proteína o polipéptido "Igβ quimérico" se refiere a una secuencia de polipéptido Igβ de un animal (p.ej.; rata, ratón, humano, conejo, pollo, etc.), en el que uno o más dominios del polipéptido Igβ está sustituido con un dominio o dominios correspondientes de un polipéptido de Igβ diferente de otro animal o especie, o con un dominio o dominios correspondientes de una versión alélica diferente de Igβ, o de una variante de secuencia de Igβ con una o más sustituciones de aminoácidos, o de una variante de secuencia de Igβ con al menos un 85% de identidad de secuencia del dominio correspondiente de una secuencia de Igβ determinada. Los términos "Igβ quimérico" y "Igβ humana o humanizada" se utilizan de forma intercambiable en la especificación. Las secuencias de polipéptido Igβ (Id. de sec. Nº: 8-12) de algunos animales no humanos también están definidos en la Figura 2.
"Dominio o polipéptido Intracelular" o "cola citoplasmática" se refiere a esa parte de la secuencia de polipéptido de una determinada proteína unida a membrana o subunidad que existe dentro de los límites de la célula. Normalmente, el dominio intracelular de la proteína es responsable de la transducción de señales.
Por "secuencia del dominio intracelular" de una subunidad IgαO o IgβO se entiende por la secuencia de polipéptido del polipéptido IgαO o IgβO, o fragmentos del mismo, que normalmente existe dentro de los límites de la célula.
"Secuencia del dominio transmembrana" de una subunidad IgαO o IgβO se entiende por la secuencia de polipéptido del polipéptido IgαO o IgβO, o fragmentos del mismo, que abarca una membrana biológica como una membrana plasmática, orgánulo de membrana, o bicapa lipídica. La "secuencia del dominio transmembrana" tal como se define en este documento incluye polipéptidos naturales que abarcan la membrana, o pueden ser secuencias consenso no naturales, o fragmentos de las mismas.
"Dominio o polipéptido extracelular" se refiere a esa parte de la secuencia de polipéptido de una determinada proteína unida a membrana o subunidad que existe fuera de los límites de la célula. Por "dominio extracelular de IgαO o IgβO se entiende la secuencia de polipéptido del polipéptido IgαO o Igβ, o fragmentos del mismo, que existe fuera de los límites de la célula.
El término "locus de inmunoglobulina humana o humanizada" tal como se utiliza aquí incluye ambas secuencias que aparecen de forma natural de una inmunoglobulina humana o locus génico de Ig o un segmento del mismo, formas degeneradas de secuencias que aparecen de forma natural de un locus génico de Ig humana o segmentos del mismo, así como secuencias sintéticas que codifican una secuencia de polipéptido sustancialmente idéntica a un polipéptido codificado por una secuencia que aparece de forma natural de un human locus génico de Ig humana o un segmento del mismo. En una realización particular, los segmentos génicos de Ig humana conserva la molécula de inmunoglobulina no inmunogénica en humanos. Aquí, los términos "locus de cadena ligera y/o pesada de inmunoglobulina (Ig) humana o humanizada" o " locus de inmunoglobulina o Ig humana o humanizada" se utilizan de forma intercambiable.
El término "complejo del receptor de linfocito B (BCR) humano o humanizado" tal como se utiliza aquí dr refiere a aquellos complejos multisubunidad de BCR en los que la subunidad IgαO puede estar en su forma nativa, subunidad IgαO humana o una subunidad quimérica de IgαO que poseen secuencias de IgαO humana o humanizadas como se ha descrito anteriormente; y/o además, en que la subunidad IgβO puede estar en su forma nativa, subunidad IgβO humana o una subunidad quimérica de IgβO que poseen secuencias de IgβO humana o humanizadas como se ha descrito anteriormente; y además, cuando la inmunoglobulina unida a la membrana (mIg) es de una inmunoglobulina humana o humanizada, como se ha descrito anteriormente.
Los términos "anticuerpo humano" e "inmunoglobulina humana" se utilizan aquí para referirse a anticuerpos y moléculas de inmunoglobulina que comprende secuencias totalmente humanizadas.
Los términos "anticuerpos humanizados" e "inmunoglobulinas humanizadas" tal como se utiliza aquí, indica una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos una porción de una secuencia de polipéptido de inmunoglobulina humana (o una secuencia de polipéptido codificada por un segmento génico de inmunoglobulina humana). Las moléculas de inmunoglobulina humanizadas de la presente invención pueden aislarse a partir de un animal transgénico no humano modificado para producir moléculas de inmunoglobulina humanizadas. Dichas moléculas de inmunoglobulina humanizadas son menos inmunogénicas para los primates, especialmente humanos, en relación a las moléculas de inmunoglobulina no humanizadas preparadas a partir de un animal o preparadas a partir de células derivadas del animal. Las inmunoglobulinas humanizadas o anticuerpos incluye inmunoglobulinas (Igs) y anticuerpos que están además diversificados a través de la conversión génica y las hipermutaciones somáticas en animales para conversión génica. Dichos anticuerpos o Ig humanizadas no son "humanos" ya que no se producen de forma natural en humanos (ya que los humanos no diversifican su repertorio de anticuerpos a través de la conversión génica) y además, los anticuerpos o Ig humanizados no son inmunogénicos en humanos ya que poseen secuencias de Ig humanas en su estructura.
Por el término producción de Ig endógena "sustancialmente reducida", y/o expresión de las subunidades Igα Oy/o IgβO significa que el grado de producción tanto de la Ig endógena sola o adicionalmente, la expresión endógena de Igα Oy/o IgβO se reduce preferiblemente en al menos alrededor de un 30%-49%, o más preferiblemente en al menos alrededor de un 50%-79%, o aún más preferiblemente en al menos alrededor de un 80-89%, o lo más preferible en al menos alrededor de un 90-100% en el animal transgénico.
El término "anticuerpo monoclonal" se utiliza para referirse a una molécula de anticuerpo sintetizada por un único clon de linfocito B.
El término "anticuerpo policlonal" se utiliza para referirse a una población de moléculas de anticuerpo sintetizadas por una población de células B.
Un "locus de inmunoglobulina (Ig)" con la capacidad de padecer una redistribución génica y conversión génica también se refiere aquí como un locus de Ig "funcional", y los anticuerpos con una diversidad generada por un locus de Ig funcional también se refiere aquí como anticuerpos "funcionales" o un repertorio de anticuerpos "funcional".
El término "animal (transgénico) no humano" tal como se utiliza aquí incluye, pero no se limita a, mamíferos como, por ejemplo, primates no humanos, roedores (p.ej., ratones y ratas), mamíferos no roedores, como, por ejemplo, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, y pájaros (p.ej., pollos, pavos, patos, gansos y similares).
El término "animal no primate" tal como se utiliza aquí incluye, pero no se limita a, mamíferos diferentes de primates, lo que incluye pero no se limita a los mamíferos específicamente listados anteriormente.
Descripción detallada
Esta invención está basada, al menos en parte, en que el reconocimiento de la producción de inmunoglobulina humana o humanizada (incluyendo cadenas de inmunoglobulina) en un a animal transgénico no humano puede aumentarse de forma significativa mediante la coexpresión de Igα Oy/o IgβO humanas o humanizadas en las células B del animal. La inclusión de Igα Oy/o IgβO humanas o humanizadas en los células B en animales transgénicos se cree que reconstituyen y mejoran las interacciones entre las proteínas de receptor B de linfocito, aumentando así el reconocimiento de antígeno, desarrollo de linfocito B y supervivencia de las células B portadores de dichos transgenes. La coexpresión de inmunoglobulina humanizada en animales transgénicos también portadores de transgenes de Igα Oy/o IgβO humanas o humanizadas mejorará enormemente la producción de inmunoglobulina humanizada. Será deseable expresar ambos, el transgén de Igα Oy/o IgβO humano o humanizado y el transgén de inmunoglobulina humanizada frente a un fondo genético en el que se ha eliminado, preferiblemente, ambas Ig endógenas, así como Igα Oy/o IgβO endógena.
Receptor de células B y sus proteínas asociadas.
El receptor de linfocito B consiste de una inmunoglobulina unida a membrana y un heterodímero transductor de señales, que consiste de dos glicoproteínas unidas por puentes disulfuro denominadas Igα Oy IgβO. Además, se han descrito las proteínas asociadas a BCR (BAP).
La expresión de BCR es importante para el desarrollo de células B, selección y supervivencia. Estos procesos dependen de la señalización de BCR a través del heterodímero Igα / IgβO. Los dominios citoplasmáticos de estas moléculas llevan un motivo de secuencia que contiene varios residuos de tirosina ensamblados en el denominado motivo de activación de inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM), que está fosforilado tras la activación de BCR.
Los experimentos de localización génica han demostrado que los dominios citoplasmáticos del heterodímero Igα / Igβ son cruciales para el desarrollo de células B. Las señales transducidas por el heterodímero Igα / Igβ están involucradas en ambas selecciones positiva y negativa del desarrollo de células B .
Una molécula de inmunoglobulina unida a membrana (mIg) consiste de dos cadenas pesadas, que forman un homodímero, y dos cadenas ligeras, cada uno de los cuales está unido de forma covalente a una de las cadenas pesadas. Al extremo N terminal la cadena pesada lleva un dominio VH, que, dependiendo del isotipo, está seguido por 4 (IgM, IgE), 3 (IgG, IgA) o 2 (IgD) dominios C. El sitio de unión a antígeno está formado por las regiones hipervariables de una pareja VH:VL. Así, cada molécula de mIg posee dos lugares de unión a antígeno.
La molécula de mIgM difiere de la forma secretada de IgM en la la IgM secretada forma un pentámero con 10 lugares de unión a antígeno potenciales. La pentamerización está controlada por secuencias en la parte C-terminal de la cadena ps secretada. Esta parte, que consta de 22 aminoácidos, está ausente en la cadena μm unida a membrana, que en su lugar lleva 48 aminoácidos C-terminales codificados por los exones M1 y M2.
La parte específica μm de la secuencia es la parte más conservada en la evolución de toda la molécula de IgM. Es casi idéntica entre la mIgM de ratones, conejos y humanos, y la conservación es también evidente si se compara la mIgM de ratones con la de tiburón. La conservación de aminoácidos es también evidente cuando uno compara la secuencia C-terminal de mIgM a la de otros isotipos de mlg de ratón. Este hallazgo proporciona evidencias que los aminoácidos transmembrana conservados interactúan entre ellos en el homodímero de la cadena H o con las subunidades Igα e Igβ.
Ambas, Igα e Igβ poseen un segmento transmembranal de 22 aminoácidos, seguido por una cola citoplasmática Cterminal de alrededor de 40-70 aminoácidos, que contiene varios residuos de tirosina. En el extremo N-terminal, ambas proteínas son portadoras de un péptido líder, seguido de un dominio extracelular que contiene residuos de cisteína, un triptófano, así como otros varios aminoácidos conservados que se encuentran en proteínas de la superfamilia de las Ig. Esto sugiere que las partes extracelulares de ambas subunidades Igα e Igβ forman un dominio similar a Ig. Además las cisteínas que forman enlaces disulfuro intra-dominio, las secuencias Igα e Igβ contienen cisteínas adicionales que presumiblemente forman enlaces disulfuro intercadena entre las subunidades Igα e Igβ.
Una comparación entre la secuencia Igα de ratón y la humana muestra que, todos los residuos importantes para la información del dominio Ig y los enlaces intercadena están conservados entre las Igα de ambas especies. La comparación, no obstante, también muestra que la conservación de la secuencia en la parte extracelular solo es de alrededor del 56%, mientras que la cola transmembranal y citoplasmática muestra una conservación del 100% y del 87%, respectivamente. Esto último refleja la importancia de los residuos dentro de la parte C-terminal de la molécula.
El ensamblaje de la molécula de mIgM con el heterodímero Igα/Igβ es necesario para la expresión en superficie de mIgM. Este requisito puede eliminarse mediante mutaciones de la parte transmembranal de la cadena μm. Por ejemplo, la sustitución de la región transmembrana de la cadena μm con la parte transmembrana de la molécula H-2Kκ resulta en la expresión en superficie de mIgM independiente de Igα/Igβ. Estos datos demuestran que la región transmembrana μm es necesaria para las interacciones específicas entre la cadena μm y el heterodímero Igα/Igβ. Además, las células B poseen un mecanismo de control que previene el transporte de componentes sencillos o ensamblados de forma incompleta del complejo de proteínas transmembranales fuera del RE.
Aunque las porciones transmembranales del BCR son probablemente las estructuras más importantes que son necesarias para la formación del complejo BCR, el dominio Ig extracelular de Igα e Igβ también se ha sugerido que juega un papel importante en la unión de la molécula de mIgM. Por ejemplo, en la línea celular de ratón J558Lμm, que no expresa la Igα de ratón, la transfección con un transgén de Igα reestablece la expresión en superfície de mIgM. Es interesante que la transfección con un gen de ratón de Igα resulta en una expresión 10 veces superior que la transfección con un gen human de Igα. Este dato sugiere que el dominio extracelular de Igα, de forma adicional, puede interaccionar con las partes extracelulares de mIgM. Por otro lado, los ratones transgénicos con loci de inmunoglobulina humana expresan inmunoglobulinas humanas. No queda claro si el desarrollo de células B, la supervivencia de células B o la expresión de mIgM humana o humanizada en animales transgénicos no humanos se verá influido por la coexpresión de Igα humana Oy/o Igβ humana en células B portadoras de genes mIgM humanas o humanizadas.
Además, existen varias proteínas asociadas a BCR (BAP) que se han clonado y secuenciado, pero que su(s) función(es) sigue(n) siendo desconocida(s). Aún cuando estas proteínas están asociadas con el BCR, su papel, como componentes del BCR, ha siso cuestionado. Aún así, la expresión ubicua y la fuerte conservación evolutiva de BAP sugiere que debe jugar un papel importante, posiblemente en los procesos celulares generales y se han propuesto varias presuntas funciones. Por ejemplo, estas proteínas pueden estar involucradas en el acoplamiento de BCR al citoesqueleto, o en el control del transporte vesicular. Por último, se ha propuesto que funcionan como chaperonas, ayudando al plegamiento y ensamblaje de las proteínas transmembranales.
Bibliografía relevante
El receptor de linfocito B, sus componentes, y su asociación con las cinco clases de inmunoglobulina se han descrito en Wienands et al., EMBO J. 9(2): 449-455 (1990), Venkitaraman et al., Nature 352: 777-781 (1991), Herren et al., Inmunologic Res. 26(1-3): 35-43 (2002). las proteínas asociadas a BCR se han descrito en Adachi et al., EMBD J 15(7): 1534-1541 (1996) y Schamel et al., PNAS 100(17): 9861-9866 (2003). La influencia del receptor de linfocito B sobre el desarrollo de células B y la supervivencia se han descrito en Reth, Annual Reviews of Inmunology 10: 97121 (1992), Kraus et al., Cell 117(6): 787-800 (2004), Sayegh et al., Inmunological Reviews 175: 187-200 (2000), Reichlin et al, Journal of Experimental Medicine 193(1): 13-23 (2001), Pike et al., Journal of Inmunology 172: 22102218 (2004), Pelanda et al., Journal of Inmunology 169: 865-872 (2002). La regulación de la señalización de BCR y su influencia en el desarrollo de células B y la apoptosis se ha descrito en Cronin et al., J. Inmunology 161: 252-259 (1998), Muller et al., PNAS 97 (15): 8451-8454 (2000), Cragg et al., Blood 100: 3068-3076 (2002), Wang et al., J. Inmunology 171: 6381-6388 (2003), Fuentes-Pananá et al., J. Inmunology 174: 1245-1252 (2005).
La presente invención por lo tanto está dirigida a los métodos para coexpresar human Igα humana Oy/o Igβ en células B, en particular en animales transgénicos que son capaces de producir un repertorio diversificado de anticuerpos humanos para mejorar la supervivencia de células B en dichos animales transgénicos. Los tipos de animales incluyen animales no humanos grandes como conejos, pájaros, pollos, ovejas, cabras, vacas, cerdos, caballos y burros. Cuando estos animales expresan un translocus de Ig, debido a su gran tamaño, su cantidad de anticuerpo también será mayor. Así, esta invención tiene como objetivo crear animales fundadores más grandes para producir mayores cantidades de inmunoglobulinas humanas a través de la potenciación del desarrollo y supervivencia de células B.
De acuerdo con esto, la presente invención está dirigida a construcciones transgénicas que codifican polipéptidos de Ig α Oy Igβ humanas de longitud completa, tal como se define en detalle a continuación.
Por "transgén o construcción transgénica que codifica el polipéptido de la Igα y/o Igβ humana" se entiende la secuencia de DNA nativa y completa, de la Igα y/o Igβ humana respectivamente, así como cualquier secuencia de DNA variante, con codones optimizados que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente de la Igα y/o Igβ humana, pero que presenta una secuencia de DNA diferente basada en la degeneración de los codones. Este concepto se discute en más detalle a continuación. La secuencia polipeptídica nativa completa de la Igα humana se define en el Id. de Sec. Nº: I (Figura 1). La secuencia polipeptídica nativa completa de la Igβ humana se define en el Id. de Sec. Nº: 7 (Figura 1).
También se hace referencia en esta descripción a una "molécula ácido nucleico o transgén o construcción transgénica que codifica la Igα quimérica o humana o humanizada". Una subunidad o proteína o polipéptido de una "
Igα quimérica" se refiere a una secuencia polipeptídica de la Igα de un animal (por ejemplo rata, ratón, humano, conejo, pollo, etc.), en la que uno o más dominios del polipéptido de la Igα están reemplazados por el dominio o dominios correspondientes de un polipéptido de la Igα diferente de otro animal o especie, o por el correspondiente dominio o dominios de una versión alélica diferente de la Igα, o por una secuencia variante de la Igα con una o más sustituciones de aminoácidos, o por una secuencia variante de la Igα con al menos un 85% de identidad de secuencia con el dominio correspondiente de una secuencia dada de la Igα. Los términos "Igα quimérica" y "Igα humana o humanizada" se utilizan de forma intercambiable a lo largo de la especificación. Las secuencias polipeptídicas no humanas de la Igα de las que pueden obtenerse las secuencias intracelulares y/o del dominio transmembrana incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a las secuencias bovinas (Id. de Sec. Nº: 2), murinas (Id. de Sec. Nº: 3), caninas (Id. de Sec. Nº: 4), de primate (Id. de Sec. Nº: 5), de conejo (Id. de Sec. Nº: 6) o de otras especies no humanas.
También se hace referencia en esta descripción a una "molécula ácido nucleico o transgén o construcción transgénica que codifica la Igβ quimérica o humana o humanizada". Una subunidad o proteína o polipéptido de una " Igβ quimérica" se refiere a una secuencia polipeptídica de la Igβ de un animal (por ejemplo rata, ratón, humano, conejo, pollo, etc.), en la que uno o más dominios del polipéptido de la Igβ están reemplazados por el dominio o dominios correspondientes de un polipéptido de la Igα diferente de otro animal o especie, o por el correspondiente dominio o dominios de una versión alélica diferente de la Igβ, o por una secuencia variante de la Igβ con una o más sustituciones de aminoácidos, o por una secuencia variante de la Igβ con al menos un 85% de identidad de secuencia con el dominio correspondiente de una secuencia dada de la Igβ. Los términos "Igβ quimérica" e "Igβ humana o humanizada" se utilizan de forma intercambiable a lo largo de la especificación. Las secuencias polipeptídicas no humanas de la Igβ de las que pueden obtenerse las secuencias intracelulares y/o del dominio transmembrana incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a las secuencias caninas (Id. de Sec. Nº: 8), de rata (Id. de Sec. Nº: 9), bovinas (Id. de Sec. Nº: 10), murinas (Id. de Sec. Nº: 11), de pollo (Id. de Sec. Nº: 12) o de otras especies no humanas. Por lo tanto, brevemente, un transgén de la Igα o de la Igβ quimérico consiste en 1) una secuencia nucleotídica que codifica el dominio extracelular de la Igα o de la Igβ humana respectivamente, y 2) una secuencia nucleotídica que codifica el dominio transmembrana e intracelular de la Igα o de la Igβ del animal transgénico huésped, respectivamente.
En otro aspecto, la presente invención también utiliza construcciones transgénicas que codifican inmunoglobulinas o loci human(izados) como se han descrito en solicitudes estadounidenses registradas anteriormente, ahora disponibles como la publicación U.S. 2003-0017534, publicada el 23 de enero de 2003 y la publicación U.S. 20060026696, publicada el 2 de febrero de 2006. Los animales transgénicos, las células B o las líneas celulares generadas en las mismas, y las metodologías relevantes que en éstas se describen también forman un aspecto de esta invención.
En una aproximación alternativa al aspecto mencionado anteriormente, la presente invención también utiliza las construcciones transgénicas que codifican la inmunoglobulina humana o humanizada o la cadena o loci de Ig, descritas en la patente estadounidense Nº 5.545.806 depositada en agosto de 1996, la patente estadounidense Nº 5.545.807, depositada en agosto de 1996 y la patente estadounidense Nº 5.569.825, depositada en octubre de 1996, la patente estadounidense Nº 7.064.244, depositada el 20 de junio de 2006, o en las publicaciones PCT Nº WO 92/03918, WO 02/12437, y en las patentes estadounidenses Nº 5.814.318 y 5.570.429; véase también Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993); Pluschke et al., Journal of Immunological Methods 215: 27-37 (1998); Neuberger et al., Nature 338: 350-2 (1989); Lonberg et al, Int. Rev. Immunol. 13(1): 65-93 (1995); y Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8(4): 455-8 (1997); y Kuroiwa et al., Nature Biotech 20(9): 889-894 (2002)
Los animales transgénicos, células B o líneas celulares generadas en las mismas, y las metodologías relevantes que se describen allí también forman parte de un aspecto de esta invención.
Los transgenes o construcciones transgénicas pueden introducirse en el genoma de un animal mediante una serie de técnicas, lo que incluye la microinyección de pronúcleos, la transfección, el clonaje por transferencia nuclear, la transferencia de genes mediada por esperma, la transferencia de genes mediada por testículos y similares.
En una realización, el gen de la Igα o de la Igβ humana, preferiblemente se expresa en las células B del animal transgénico mediante un promotor específico inmune, preferiblemente un promotor específico de células B. Esta expresión del gen de la Igα o de la Igβ humana sucede preferiblemente sólo en células B, lo que da lugar al desarrollo de células B mejoradas y mayor supervivencia del animal transgénico no humano. Por "promotor específico de células B" se entiende la secuencia promotora/ potenciadora de cualquier gen específico de células B, y/o las variantes o porciones modificadas de los mismos, que normalmente controlan la expresión de los genes que se expresan en las células B, cuyos ejemplos incluyen pero no se limitan a los promotores/ potenciadores de CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD40, CD72, Blimp-1, CD79b (también conocido como B29 o Ig beta), mb-1 (también conocido como Ig alfa), quinasa de tirosinas blk, VpreB, la cadena pesada de las inmunoglobulinas, cadena ligera kappa de las inmunoglobulinas, cadena ligera lambda de las inmunoglobulinas, cadena J de las
inmunoglobulinas, etc. En una realización preferible, el promotor/ potenciador de la CD79a, CD79b o de la cadena ligera kappa controla la expresión específica de las células B de los genes de la Igα o de la Igβ humana.
En otra realización, la construcción transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica los genes de la Igα y/o Igβ humana se coexpresa con la construcción transgénica que comprende una inmunoglobulina exógena o locus transgénico de una cadena de inmunoglobulinas (Ig). En esta realización, tanto el locus transgénico de Ig como el transgén de la Igα y/o Igβ humanapueden estar presentes en el mismo vector de expresión transgénico o en dos vectores de expresión transgénicos diferentes. En este último caso, los dos vectores de expresión transgénicos pueden introducirse en el animal transgénico no humano al mismo tiempo o bien secuencialmente.
De acuerdo con esta descripción, se incluyen variantes de longitud completa o sólo del dominio extracelular, de la Igα or Igβ humana. Esto pretende indicar secuencias de ácido nucleico que permiten la degeneración del código genético, secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia polipeptídica que comprende sustituciones de aminoácidos de residuos equivalentes funcionalmente y/o mutaciones que potencian la funcionalidad del dominio extracelular. La "funcionalidad del dominio extracelular" incluye, pero no se limita a la formación de un BCR capaz de generar una transducción de señales.
Permitiendo la degeneración del código genético, la invención incluye secuencias con al menos alrededor del 70%, más frecuentemente alrededor del 80 a 85%, preferiblemente al menos alrededor del 90% y más preferiblemente alrededor del 95% de identidad de secuencia con la secuencia polipeptídica extracelular de la Igα y Igβ humanas.
El término equivalente funcional a nivel biológico es bien entendido en la materia y se define aquí en más detalle. De acuerdo con esto, las secuencias que poseen entre un 70% y alrededor del 80%; o más preferiblemente, entre alrededor del 81 % y alrededor del 90%; o incluso más preferiblemente, entre alrededor del 91 % y alrededor del 99% de identidad a nivel de aminoácidos se consideran equivalentes funcionalmente con la Igα y Igβ humanas, siempre que la actividad biológica de las proteínas se mantenga.
El término codón equivalente a nivel funcional se utiliza aquí para referirse a los codones que codifican el mismo aminoácido, como los seis codones de la arginina o serina, y también se refiere a los codones que codifican aminoácidos equivalentes a nivel biológico.
La siguiente discusión se basa en el cambio de los aminoácidos de una proteína para crear un equivalente, o incluso una molécula mejorada de segunda generación. Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin una pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras como, por ejemplo, las regiones de unión a antígeno de los anticuerpos o lugares de unión sobre las moléculas de sustrato. Ya que la capacidad de interaccionar y la naturaleza de una proteína es lo que define la actividad funcional biológica de esa proteína, ciertas sustituciones de aminoácido pueden realizarse en una secuencia de proteínas, y en la secuencia subyacente de DNA que la codifica, y sin embargo obtener una proteína con las mismas propiedades. Por lo tanto, los inventores contemplan que pueden realizarse varios cambios en las secuencias de DNA de los genes sin una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica, como se discute a continuación.
Al realizar estos cambios, también debe considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos en conferir una función biológica de interacción con una proteína se conoce generalmente bien en la materia (Kyte & Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo de los aminoácidos contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, DNA, anticuerpos, antígenos y similares.
También se entiende en la materia que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de forma efectiva en base a su hidrofilicidad. La patente estadounidense Nº 4.554.101 indica que una mayor hidrofilicidad local de promedio en una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de aminoácidos adyacentes, correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente estadounidense Nº 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 +-,1); glutamato (+3,0,+-,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2), glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5,+,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (- 1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4).
Se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro con un valor de hidrofilicidad similar y aun así producir una proteína equivalente a nivel biológico e inmunológico. En tales cambios, es preferible la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están entre ,+-,2, aquellos que están entre ,+-,1 son particularmente preferibles y aquellos entre ,+-,0,5 son incluso más particularmente preferibles.
Como se remarca aquí, las sustituciones de aminoácido generalmente se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de los aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Ejemplos de sustituciones que tienen en consideración las anteriores distintas características son bien
conocidos por los expertos en la materia e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.
Otra realización para la preparación de polipéptidos de acuerdo con la invención es la utilización de miméticos de péptido. Los miméticos son moléculas que contienen péptidos que mimetizan elementos de la estructura secundaria de una proteína (Johnson 1993). El racional subyacente al uso de miméticos de péptidos es que el esqueleto peptídico de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de los aminoácidos de forma que se faciliten las interacciones moleculares, como las que ocurren entre un anticuerpo y un antígeno. Es esperable que un mimético de péptido permita unas interacciones moleculares similares a las de la molécula natural. Estos principios pueden utilizarse, en conjunto con los principios remarcados anteriormente, para diseñar moléculas de segunda generación con muchas de las propiedades naturales de la Igα o de la Igβ humana con características alteradas y mejoradas.
Por lo tanto, las secuencias variantes de ácido nucleico que codifican la Igα o Igβ humana y los polipéptidos funcionalmente equivalentes de la Igα o Igβ humana son útiles en esta invención.
Los vectores transgénicos que contienen los genes de interés pueden introducirse en la célula o células recipiente y luego integrarse en el genoma de la célula o células recipiente mediante integración al azar o mediante una integración dirigida.
Para la integración al azar, puede introducirse un vector transgénico que contiene una Igα o Igβ humana en una célula animal recipiente mediante la tecnología estándar para obtener transgénicos. Por ejemplo, puede inyectarse directamente un vector transgénico en el pronúcleo de un oocito fertilizado. Un vector transgénico también puede introducirse mediante coincubación de esperma con el vector transgénico antes de la fertilización del oocito. Los animales transgénicos pueden desarrollarse a partir de oocitos fertilizados. Otra forma de introducir un vector transgénico es transfectar células madre embrionarias y a continuación inyectar las células madre embrionarias modificadas genéticamente en embriones en desarrollo. Alternativamente, un vector transgénico (desnudo o en combinación con reactivos facilitadores) pueden inyectarse directamente en un embrión en desarrollo. En último lugar, los animales quiméricos transgénicos se producen a partir de los embriones que contienen el transgén de la Ig humana o humanizada integrada en el genoma de al menos algunas células somáticas del animal transgénico.
En una realización particular, un transgén que contiene una Igα o Igβ humana se integra al azar en el genoma de las células recipiente (como los oocitos fertilizados o embriones en desarrollo) derivadas de líneas de animales con una expresión alterada de las Igα o Igβ endógenas. La utilización de tales líneas de animales permite la expresión preferencial de las moléculas de inmunoglobulina a partir del locus de Ig transgénico humano o humanizado. Alternativamente, los animales transgénicos con transgenes de la Igα o Igβ humanos o humanizados pueden cruzarse con líneas de animales con una expresión alterada de las Igα o Igβ endógenas. Pueden obtenerse descendientes homozigotos con una expresión alterada de la Igα o Igβ y con Igα o Igβ humana o humanizada. Alternativamente, la expresión de la Igα y/o Igβ endógena puede inhibirse o reducirse utilizando la tecnología de antisentidos, la expresión de anti-Igα y/o Igβ intracelular, y similares. En una realización, el método de elección para eliminar la producción endógena de Igα y/o Igβ de los animales huésped es el método del RNA de interferencia (RNAi), que introduce un RNA de doble cadena (dsRNA) o más preferiblemente, un dúplex de RNA corto o pequeño de interferencia (siRNA) en las células B que poseen secuencias de ácido nucleico intracelulares de las Igα y/o Igβ del animal huésped. Esto puede conseguirse utilizando equipos disponibles a nivel comercial, lo que incluye pero no se limita a los equipos de RNA Block iT™ o Stealth™ de Invitrogen Corp.
Para la integración dirigida, puede introducirse un vector transgénico en las células animales recipiente apropiadas como las células madre embrionarias o células somáticas ya diferenciadas. A continuación, las células en las que el transgén se ha integrado en genoma del animal y ha reemplazado el correspondiente gen endógeno mediante recombinación homóloga puede seleccionarse mediante métodos estándar (véase por ejemplo, Kuroiwa et al. Nature Genetics 2004, 6 de Junio). Entonces pueden fusionarse las células seleccionadas con células unidad de transferencia nuclear enucleadas, por ejemplo oocitos o células madre embrionarias, que son totipotentes y capaces de formar un neonato funcional. La fusión se realiza de acuerdo con las técnicas convencionales que están bien establecidas. La enucleación de los oocitos y la transferencia nuclear también puede realizarse mediante microcirugía utilizando pipetas de inyección (véase, por ejemplo, Wakayama et al., Nature (1998) 394:369). Las células embrión resultantes se cultivan entonces en un medio apropiado y se transfieren a recipientes sincronizados para generar animales transgénicos. Alternativamente, las células modificadas genéticamente seleccionadas pueden inyectarse en embriones en desarrollo que a continuación se desarrollan en animales quiméricos.
Además, de acuerdo con la presente invención, también puede obtenerse un animal transgénico capaz de producir una Igα y/o Igβ humana o humanizada introduciendo en una célula o células recipiente, una o más de los vectores recombinantes descritos aquí anteriormente, uno de los cuales es portador de un segmento del gen de la Igα o Igβ humana, acoplado a las secuencias flanqueantes 5’ y 3’ que son homólogas a las secuencias flanqueantes del segmento del gen de la Igα o Igβ endógenas, seleccionándose así las células en las que el segmento del gen de la Igα o Igβ endógena está reemplazado por el segmento del gen de la Igα o Igβ humana mediante una recombinación
homóloga, y se deriva un animal a partir de la célula o células recipiente modificadas genéticamente seleccionadas.
De forma similar a la inserción dirigida de un vector transgénico, las células apropiadas para su utilización como células recipiente en esta aproximación incluyen las células madre embrionarias o las células somáticas ya diferenciadas. Un vector recombinante portador de un segmento de un gen de la Igα o Igβ humana puede introducirse en tales células recipiente mediante cualquier métodos factible, por ejemplo, la transfección. Después, las células en las que el segmento de un gen de la Igα y/o Igβ humana ha reemplazado al correspondiente segmento génico de la Igα y/o Igβ endógeno mediante recombinación homóloga, puede seleccionarse mediante métodos estándar. Estas células modificadas genéticamente pueden servir como células donadoras de núcleos en un procedimiento de transferencia nuclear para el clonaje de un animal transgénico. Alternativamente, las células madre embrionarias modificadas genéticamente seleccionadas pueden inyectarse en embriones en desarrollo que subsiguientemente pueden acabar desarrollando animales quiméricos.
En una realización específica, las construcciones transgénicas de la invención pueden introducirse en el animal transgénico durante la vida embrionaria mediante la inyección de los transgenes directamente en el embrión o la inyección indirectamente de los mismos en una hembra embarazada o en una gallina que ha puesto huevos. Los animales transgénicos producidos mediante cualquiera de los métodos anteriores forman otra realización de la presente invención. Los animales transgénicos poseen al menos uno, es decir, uno o más, genes de la Igα y/o Igβ humana o humanizada en el genoma, a partir del cual puede producirse una proteína funcional Igα y/o Igβ humana o humanizada.
Además, las construcciones transgénicas de la invención, es decir, el transgén de la Igα y/o Igβ humana o humanizada y el transgén de la inmunoglobulina humanizada, se expresan preferiblemente frente a un fondo genético en el que se han eliminado la expresión de una, o más preferiblemente ambas, Ig endógenas, así como un fondo en el que se ha eliminado la expresión de la Igα y/o Igβ endógena. Así, los animales transgénicos de la presente invención son capaces de reordenar los loci de la Ig humana o humanizada y expresar de forma eficiente un repertorio funcional de anticuerpos humanos o humanizados frente a un fondo genético con una expresión sustancialmente reducida de Ig endógena y más preferiblemente, también sustancialmente reducida de la Igα y/o Igβ endógena. En este contexto, con "sustancialmente" se indica que el grado de producción endógeno, de expresión de la Ig endógena sola o adicionalmente, de la expresión de la Igα y/o Igβ endógena, se reduce preferiblemente al menos en alrededor del 30%-49%, o más preferiblemente al menos en alrededor del 50-79%, o aún más preferiblemente al menos en alrededor del 80-89%, o más preferiblemente en alrededor del 90-100%.
La presente invención proporciona conejos transgénicos que expresan uno o más locus de la Ig humana y de la Igα y/o Igβ humana de acuerdo con el Id. de Sec. Nº: 1 y 7, respectivamente, que son capaces de reordenar y provocar una conversión génica en el locus de la Ig humana, y expresan un repertorio funcional de anticuerpos humanos. Preferiblemente, estos conejos, adicionalmente, no producen cantidades sustanciales de inmunoglobulinas de conejo funcionales endógenas, o Igα y/o Igβ de conejo funcional endógena.
La presente invención también proporciona otros animales transgénicos mayores, lo que incluye pero no se limita a, aves, roedores y animales de granja como vacas, cerdos, ovejas, cabras, burros, caballos y similares que expresan uno o más loci de Ig humana y Igα y/o Igβ de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 1 y 7, respectivamente. De nuevo, preferiblemente, estos animales, adicionalmente, no producen cantidades sustanciales de inmunoglobulinas endógenas funcionales, o Igα y/o Igβ endógena funcional. Por lo tanto, estos animales transgénicos son capaces de reordenar el locus de la Ig humana o humanizada, y expresan eficientemente un repertorio funcional de anticuerpos humanos o humanizados, con un rendimiento aumentado.
La invención también está dirigida a células B aisladas de los diferentes tipos de animales transgénicos descritos anteriormente, que expresan el gen de la Igα y/o Igβ humana de acuerdo con el Id. de Sec. Nº 1 y 7, respectivamente, y el loci de la inmunoglobulina humana. Además, tales células B pueden inmortalizarse utilizando los métodos convencionales conocidos y utilizados por los expertos en la materia, lo que incluye pero no se limita a, la utilización de la transformación viral, etc.
La inmunización con antígeno da lugar a la producción de anticuerpos humanos o humanizados frente al mismo antígeno en dichos animales transgénicos.
Una vez se obtiene un animal transgénico no humano capaz de producir moléculas de inmunoglobulina humana o humanizada diversificada (como se establece a continuación), pueden obtenerse inmunoglobulinas humanas o humanizadas y preparaciones de anticuerpos humanos o humanizados frente a un antígeno, inmunizando el animal con el antígeno. Pueden utilizarse una variedad de antígenos para inmunizar un animal transgénico huésped. Estos antígenos incluyen microorganismos, por ejemplo virus y organismos unicelulares (como bacterias y hongos), vivos, atenuados o muertos, fragmentos de los microorganismos, o moléculas antigénicas aisladas de los microorganismos.
Los antígenos bacterianos preferibles para su utilización en la inmunización de un animal incluyen antígenos
purificados a partir de Staphylococcus aureus como los polisacáridos capsulares tipo 5 y 8, las versiones recombinantes de los factores de virulencia como la alfa-toxina, proteínas de unión a adhesina, proteínas de unión a colágeno y proteínas de unión a fibronectina. Los antígenos bacterianos preferibles también incluyen una versión atenuada de S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, enterococcus, enterobacter y Klebsiella pneumoniae, o los sobrenadantes de cultivo de estas células bacterianas. Otros antígenos bacterianos que pueden utilizarse en la inmunización incluyen el lipopolisacárido purificado (LPS), antígenos capsulares, polisacáridos capsulares y/o versiones recombinantes de las proteínas de la membrana externa, proteínas de unión a fibronectina, endotoxina y exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, enterococcus, enterobacter y Klebsiella pneumoniae.
Los antígenos preferibles para la generación de anticuerpos frente a hongos incluyen una versión atenuada de los hongos o las proteínas de membrana de los mismos, y estos hongos incluyen, pero no se limitan a Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis y Cryptococcus neoformans.
Los antígenos preferibles para su utilización en la inmunización para generar anticuerpos frente a virus incluyen las proteínas de cubierta y versiones atenuadas de virus, lo que incluye, pero no se limita al virus respiratorio sincitial (VRS) (en particular la proteína F), virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis B (VHB), citomegalovirus (CMV), EBV y VHS.
Pueden generarse anticuerpos terapéuticos para el tratamiento del cáncer inmunizando animales transgénicos con células tumorales aisladas o líneas celulares tumorales; antígenos asociados a tumores que incluyen pero no se limitan al antígeno Her-2-neu (los anticuerpos contra éste son útiles para el tratamiento del cáncer de mama), antígenos CD19, CD20, CD22 y CD53 (los anticuerpos contra éstos son útiles para el tratamiento de los linfomas de células B), (3) antígeno de membrana específico de prostate (PMSA) (los anticuerpos contra éste son útiles para el tratamiento del cáncer de próstata), y la molécula 17-1A (los anticuerpos contra éste son útiles para el tratamiento del cáncer de colon).
Los antígenos pueden administrarse a un animal huésped transgénico de cualquier modo conveniente, con o sin un adyuvante, y pueden administrarse de acuerdo con un programa predeterminado.
Tras la inmunización, puede fraccionarse el suero o la leche del animal transgénico inmunizado para la purificación de anticuerpos policlonales de grado farmacéutico específicos del antígeno. En el caso de las aves transgénicas, los anticuerpos también pueden obtenerse fraccionando la yema de sus huevos. Puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina concentrada purificada mediante cromatografía (de afinidad, de intercambio ionico, de filtración en gel, etc.), precipitación selectiva con sales como el sulfato de amonio, solventes orgánicos como el etanol, o polímeros como el polietilenglicol.
Los anticuerpos fraccionados humanos o humanizados pueden disolverse o diluirse en medios no tóxicos, no pirogénicos adecuados para su administración intravenosa en humanos, por ejemplo, salina tamponada esteril.
Las preparaciones de anticuerpo utilizadas para su administración generalmente se caracterizan por tener concentraciones de inmunoglobulina de entre 0,1 y 100 mg/ml, más frecuentemente de 1 a 10 mg/ml. La preparación de anticuerpo puede contener inmunoglobulinas de varios isotipos. Alternativamente, la preparación de anticuerpo puede contener anticuerpos de sólo un isotipo, o un número de isotipos seleccionados.
Para obtener un anticuerpo monoclonal humano o humanizado, se aislan células del bazo del animal transgénico immunizado en las que las células B que expresan la inmunoglobulina endógena del animal se han eliminado. Las células del bazo aisladas se utilizan en una fusión celular con líneas celulares transformadas para la producción de hibridomas, o se clonan segmentos de cDNA que codifican anticuerpos mediante técnicas estándar de biología molecular y se expresan en células transfectadas. Los procedimientos para obtener anticuerpos monoclonal están bien establecidos en la materia. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente europea 0 583 980 A1 ("Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"), la patente estadounidense Nº 4.977.081 ("Stable Rabbit-Mouse Hybridomas and Secretion Products Thereof"), la WO 97/16537 ("Stable Chicken B Cell Line and Method of Use Therefor") y la EP 0 491 057 B1 ("Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G") . La producción in vitro de anticuerpos monoclonales a partir de moléculas de cDNA clonadas ha sido descrita por Andris-Widhopf et al., "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Immunol Methods
242:159 (2000), y por Burton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995).
En la mayoría de ejemplos, la preparación de anticuerpo consiste en inmunoglobulinas no modificadas, es decir, anticuerpos humanos o humanizados preparados a partir del animal sin ninguna modificación adicional, por ejemplo, mediante agentes químicos o enzimas. Alternativamente, la fracción de inmunoglobulina puede estar sometida a tratamientos como la digestión enzimática (por ejemplo con pepsina, papaína, plasmina, glucosidasas, nucleasas, etc.), calor, etc., y/o posterior fraccionamiento para generar "fragmentos de anticuerpo".
La presente descripción también incluye composiciones farmacéuticas o preparaciones de anticuerpo que comprenden los anticuerpos o sus fragmentos obtenidos mediante los métodos definidos anteriormente. El término "ingrediente farmacéuticamente aceptable " o "formulación" como se utiliza aquí pretende incluir un producto que
comprende el(los) ingrediente(s) activo(s) reivindicado(s), es decir el anticuerpo humano o humanizado o el fragmento de anticuerpo, en cantidades específicas, así como cualquier producto que resulte, directamente o indirectamente, de la combinación del (de los) ingrediente(s) activo(s) especificado(s) en las cantidades especificadas. Dicho término pretende incluir un producto que comprende el(los) ingrediente(s) activo(s), y el(los) ingrediente(s) inerte(s) que funcionan como transportador, así como cualquier producto que resulte, directlamente o indirectamente, de la combinación, acomplejado o agregación de dos o más de entre cualquiera de los ingredientes,
o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. De acuerdo con esto, las "composiciones farmacéuticas" de la presente invención incluyen cualquier composición obtenida al mezclar cualquier compuesto activo de la presente invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.
Los términos "administración de" y "administrar un" compuesto debe entenderse que significan proporcionar cualquier compuesto activo de la invención, en cualquier formulación, a un individuo con necesidad de un tratamiento.
Las composiciones farmacéuticas para la administración de los compuestos de esta invención pueden presentarse de forma conveniente en formas de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en farmacia. Los métodos y transportadores adecuados para su utilización son aquellos que están bien descritos en la materia, por ejemplo, en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Ed. Gennaro et al., 20ª Ed. (2000), aunque el experto en el área de la inmunología reconocerá rápidamente que existen otros métodos y que son adecuados para preparar las composiciones de la presente invención. Todos los métodos incluyen el paso de poner en asociación en ingrediente activo con el transportador que constituye uno o más ingredientes adicionales. En general, las composiciones farmacéuticas se preparan mediante una asociación uniforme e íntima del ingrediente activo con un transportador líquido o un transportador sólido finamente dividido o ambos, y luego, si es necesario, se le da forma al producto en la formulación deseada. En la composición farmacéutica, el ingrediente activo se incluye en una cantidad efectiva, que se ha discutido anteriormente, suficiente para producir el efecto deseado sobre el proceso o estado de las enfermedades. Además, se han descrito formulaciones para la liberación controlada y prolongada de moléculas de anticuerpo en la patente estadounidense Nº 6.706.289. Así, las construcciones transgénicas, los vectores que comprenden las construcciones transgénicas y los animales transgénicos generados utilizando los métodos descritos anteriormente son todos ellos realizaciones de la invención. La invención se ilustra en más detalle, pero en modo alguno se ve limitada, en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Transfección de una línea de células B de conejo con Igα e Igβ humana.
Para demostrar el efecto de la Igα e Igβ humana sobre la expresión de mIgM humana en células B de conejo, tales células se transfectan con vectores de expresión que codifican Igα e Igβ humana o una mIgM humana.
Los genes que codifican las Igα e Igβ humanas e IgM humana se clonaron en vectores de expresión.
Una línea de células B de conejo inmortalizada se transfectó con los vectores de expresión y se cultivaron en un medio en presencia de neomicina para la selección de transfectantes estables. Las células resistentes se analizaron mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos para IgM humana e Igα e Igβ humanas. La transfección de células B de conejo con un vector de expresión que codifica la IgM humana resulta en una baja expresión en la superficie celular de IgM humana. La cotransfección con Igα y/o Igβ humana Oresulta en una alta expresión en la superficie celular de mIgM humana. Esto demuestra que la Igα y/o Igβ humanas son necesarias y suficientes para una alta expresión en la superficie celular de mIgM humana o quimérica.
Ejemplo 2
Transfección de una línea de células B derivada de cualquier animal con Igα e Igβ humana
Para demostrar el efecto de Igα e Igβ humana sobre la expresión de mIgM humana en células B derivadas de animales, los vectores de expresión que codifican Igα o Igβ humana o una mIgM humana se transfectaron en células B derivadas de pollo (DT40), vaca, y cerdos.
Las líneas celulares de células B inmortalizadas se transfectaron con los vectores de expresión y se cultivaron en un medio en presencia de neomicina para la selección de transfectantes estables. Las células resistentes se analizaron mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos específicos para IgM humana e Igα e Igβ humanas. La transfección de células B de conejo con un vector de expresión que codifica la IgM humana resulta en una baja expresión en la superficie celular de IgM humana. La cotransfección con Igα y/o Igβ humana Oresulta en una alta expresión en la superficie celular de mIgM humana. Esto demuestra que la Igα y/o Igβ humanas son necesarias y suficientes para una alta expresión en la superficie celular de mIgM humana o quimérica.
Ejemplo 3
Conejos transgénicos que expresan el transgén de las cadenas ligera y/o pesada de inmunoglobulina humanizada con o sin Igα y/o Igβ humana
Los conejos transgénicos se generaron como se describe en Fan et al. (Pathol. Int. 49: 583-594, 1999). Resumiendo, se superovularon conejos hembra utilizando métodos estándar y se emparejaron con conejos macho. Se recogieron zigotos en estadío pronuclear recogidos de los oviductos y se colocaron en un medio adecuado como tampón salino fosfato de Dulbecco suplementado con suero fetal bovino al 20%. El DNA exógeno (p.ej., vectores de
10 expresión que contienen el locus de inmunoglobulina humana o humanizada o Igα o Igβ humana) se microinyectaron ien el pronúcleo con la ayuda de un par de manipuladoras. Los zigotos morfológicamente vivos se transfirieron a los oviductos de los conejas pseudoembarazadas. El pseudoembarazo se indujo mediante la inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG). Entre alrededor de un 0,1-1% de los zigotos inyectados desarrollaron un conejo transgénico vivo. La integración del transgén en el genoma se confirmó mediante PCR y FISH.
15 La presencia de anticuerpos que contienen IgG humana y/o determinantes antigénicos de la cadena ligera kappa humana en el suero de conejos fundadores transgénicos se determinó utilizando un ensayo ELISA. La expresión de anticuerpos en la superficie de células B se analizó mediante citometría de flujo. Los conejos con un transgén que codifica un locus humano de la cadena pesada de inmunoglobulina, expresó 1-10 ug/ml de IgM humana. Los
20 animales jóvenes (6-9 semanas) expresaron 100-4000 ug/ml IgG humanas. Sin embargo, la expresión de IgG humana descendió rápidamente hasta niveles de 10-100 ug/ml. El análisis de citometría de flujo de las células B en sangre periférica reveló una pequeña población de células positivas para la mIgM humana (1-2%). El apéndice de los conejos jóvenes contenía hasta un 10% de células positivas para la mIgM humana que desaparecían rápidamente con la edad.
25 La introducción de transgenes que codifican la Igα y/o Igβ humana resulta en la expresión de 100-2000 ug/ml de IgM humana en el suero y en la expresión estable de 2000-12.000 ug/ml de IgG humana. En el apéndice, el 30-70% de los linfocitos son mIgM humana +. En sangre periférica, un número equivalente de células B expresan la mIgM o mIgG de conejo y humana.
30 Aunque la invención se ilustra en referencia a ciertas realizaciones, no es tan limitada. Un experto en la materia entenderá que varias modificaciones están fácilmente disponibles y pueden realizarse sin realizar cambios sustanciales en el modo de funcionamiento de la invención. Se pretende específicamente que todas estas modificaciones se encuentren dentro del alcance de la invención que aquí se reivindica.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Buelow, Roland 5 <120> Expresión mejorada de inmunoglobulinas humanas o humanizadas en animales transgénicos no humanos
<130> 39691-0016.PCT
<140> No asignado aún
<141> Adjunto
<150> 60/841.890
15 <151> 2006-09-01
<160> 12
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
<210> 1
<211> 226
25 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 65
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 2
5 <210> 3
<211> 66
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
<210> 4
<211> 66
20 <212> PRT
<213> Canis
<400> 4
<210> 5
30 <211> 73
<212> PRT
<213> Pan
<400> 5
<210> 6
<211> 2
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
15 <400> 6
20 <211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 51
<212> PRT
<213> Canis
10 <400> 8
<210> 9
15 <211> 70
<212> PRT
<213> Rattus
<400> 9
<210> 10
<211> 71
<212> PRT 30 <213> Bos taurus
<400> 10
<210> 11
<211> 70
<212> PRT
<213> Mus musculus
10 <400> 11
<210> 12
15 <211> 139
<212> PRT
<213> Gallus
<400> 12

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un animal transgénico no humano seleccionado de entre el grupo que consiste en primates no humanos, roedores, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, pollos, pavos, patos y gansos que comprende:
    5 (a) una construcción transgénica que codifica una subunidad completa de la Igα humana de Id. de Sec. Nº: 1 y/o, (b) una construcción transgénica que codifica una subunidad completa de la Igβ humana de Id. de Sec. Nº: 7, y, (c) una construcción transgénica que codifica un locus de inmunoglobulina humana; en la que los productos transgénicos resultantes se combinan para formar un complejo receptor de células B humanas.
    10 2. El animal transgénico no humano de la reivindicación 1 en el que la expresión de cualquier Ig endógena y/o subunidades de la Igα y/o Igß del animal transgénico no humano se han reducido sustancialmente.
  2. 3. El animal transgénico no humano de la reivindicación 1 o 2 que es un conejo.
    15 4. Las células B aisladas de dicho animal transgénico no humano de la reivindicación 1, en las que dichas células B expresan la subunidad nativa de la Igα humana de Id. de Sec. Nº: I y/o la subunidad nativa de la Igß humana de Id. de Sec. Nº: 7, y un locus de inmunoglobulina humana.
  3. 5.
    Las células B aisladas de la reivindicación 4 en las que dichas células B están inmortalizadas.
  4. 6.
    Las células B aisladas de la reivindicación 4 o 5 en las que dichas células B se han derivado de un conejo.
  5. 7.
    Un método para obtener anticuerpos humanos en un animal no humano seleccionado de entre el grupo que consiste en primates no humanos, roedores, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, pollos,
    25 pavos, patos y gansos que comprende: (a) la introducción y expresión de una construcción transgénica que codifica una subunidad nativa de la Igα humana de Id. de Sec. Nº: 1, y/o una construcción transgénica que codifica una subunidad nativa de la Igß humana de Id. de Sec. Nº: 7 en dicho animal no humano y, (b) la introducción y expresión de una construcción transgénica que codifica un locus de una inmunoglobulina humana en dicho animal no humano;
    (c)
    someter a dicho animal a un estímulo antigénico; y (d) el aislamiento de anticuerpos humanos a partir de dicho 30 animal.
  6. 8. El método para producir los anticuerpos humanos de la reivindicación 7, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal o monoclonal.
    35 9. Un método para producir un animal no humano seleccionado de entre el grupo que consiste en primates no humanos, roedores, conejos, cerdos, ovejas, cabras, vacas, caballos y burros, pollos, pavos, patos y gansos que expresan anticuerpos humanos o humanizados que comprenden: (a) la introducción y expresión de una construcción transgénica que codifica una subunidad nativa de la Igα human de Id. de Sec. Nº: 1 y/o una construcción transgénica que codifica una subunidad nativa de la Igß humana de Id. de Sec. Nº: 7 en las células B de dicho animal no
    40 humano; y, (b) la introducción y expresión de una construcción transgénica que codifica un locus de una inmunoglobulina humana en dicho animal no humano; en el que los productos transgénicos resultantes se combinan para formar un complejo receptor de las células B humanas.
  7. 10. El método de la reivindicación 9 en el que dicho animal crea una diversidad de anticuerpos por conversión 45 génica y/o hipermutación somática.
  8. 11. El método de la reivindicación 10 en el que dicho animal es un conejo.
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    M74721 humano D16412 vaca NM_007655 ratón XM_541597 perro (predicción) XM_512693 chimpancé (predicción) Conejo (predicción)
    (Id. De Sec. Nº 7) (Id. De Sec. Nº 8) (Id. De Sec. Nº 9) Figura 2: 1g beta (Id. De Sec. Nº 10) (Id. De Sec. Nº 11) (Id. De Sec. Nº 12)
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