KR20170066471A

KR20170066471A - 낮은 아크릴산 농도를 갖는 아크릴아미드 수용액의 제조 방법

Info

Publication number: KR20170066471A
Application number: KR1020177011261A
Authority: KR
Inventors: 미하엘 브라운; 위르겐 데우벨; 한스-위르겐 랑; 페터 외드만; 카이-우베 발데니우스; 마티아스 클라이너; 미하엘 키퍼; 슈테판 플라이어; 미하엘 부데
Original assignee: 바스프 에스이
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2017-06-14
Also published as: BR112017005840A2; US10227621B2; US20170283840A1; WO2016050818A1; RU2017114398A; RU2017114398A3; AU2015326907A1; MY187158A; JP6716547B2; AU2015326907B2; JP2017535249A; CN106715702B; EP3201348A1; CO2017004030A2; CN106715702A; EP3201348B2; CA2962510A1; EP3201348B1; RU2706533C2

Abstract

본 발명은 낮은 아크릴산 농도를 갖는 아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아크릴아미드 수용액의 아크릴산 농도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 생체촉매의 존재 하에 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환을 수반하며, 여기서 생물전환 동안 아크릴로니트릴의 함량은 반응기 중의 조성물의 전체 중량에 대해 0.3 w/w % 이상으로 유지된다. 또한 제공되는 것은 본 발명의 방법에 의해 수득되는 아크릴아미드 수용액이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 아크릴아미드 수용액의 중합에 의해 수득되는 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체에 관한 것이다.

Description

낮은 아크릴산 농도를 갖는 아크릴아미드 수용액의 제조 방법 {METHOD FOR PREPARING AN AQUEOUS ACRYLAMIDE SOLUTION HAVING A LOW ACRYLIC ACID CONCENTRATION}

본 발명은 낮은 아크릴산 농도를 갖는 아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법, 이러한 방법에 의해 수득가능한 아크릴아미드 수용액, 및 이러한 아크릴아미드의 중합에 의해 수득가능한 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한 아크릴아미드 수용액의 아크릴산 농도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.

폴리아크릴아미드는 응집제로서, 제지 산업에서 증점제로서, 3차 오일 회수에서 첨가제로서, 및 기타 분야에서 널리 사용된다. 폴리아크릴아미드의 원료 물질은 전형적으로 그의 단량체 아크릴아미드이다. 원칙적으로, 산업 규모에서 아크릴아미드를 제조하기 위한 2 가지 다른 방법이 존재한다: 화학 합성 및 생물학적 합성, 여기서 생물학적 합성 방법은 보다 온화한 반응 조건 및 고유의 공정 안전성으로 인해 더욱 더 증가하고 있다. 보다 온화한 반응 조건, 구리 촉매의 부재 및 니트릴의 양적 전환으로 인해, 증류 또는 이온 교환과 같은 고가의 다운스트림 처리 단계가 생물학적 합성에서 회피될 수 있으므로, 플랜트 공간을 크게 감소시켜 보다 저렴한 플랜트를 산출할 수 있다.

두 합성 방법 모두 아크릴로니트릴을 출발 물질로서 사용한다. 화학 합성 방법은 구리 촉매를 사용하지만 (예를 들어, US4048226, US3597481), 생물학적 합성 방법 (바이오 기반 방법으로도 공지됨) 은 아크릴로니트릴을 수화 (즉, 전환) 시키는 생체촉매를 사용하여 아크릴아미드를 수득한다. 일반적으로, 이러한 생체촉매는 효소 니트릴 히드라타아제 (2014 년 9 월 30 일자 IUBMB 명명법: EC 4.2.1.84; CAS-No. 2391-37-5; 예를 들어, NH아제로도 지칭됨) 를 생산 (즉, 인코딩) 할 수 있는 미생물이다. 니트릴 히드라타아제 생산 미생물은 주로 환경에 분포하며, 특히, 종 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) , 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans), 로도코쿠스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis) , 로도코쿠스 에쿠이 (Rhodococcus equi), 로도코쿠스 러버 (Rhodococcus ruber), 로도코쿠스 오파쿠스 (Rhodococcus opacus), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) , 아시도보락스 아베나에 (Acidovorax avenae) , 아시도보락스 파실리스 (Acidovorax facilis), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) , 아그로박테리움 라디오박테르 (Agrobacterium radiobacter), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스 팔리두스 (Bacillus pallidus) , 바실루스 스미티 (Bacillus smithii), 바실루스 sp BR449, 브라디리조비움 올리고트로피쿰 (Bradyrhizobium oligotrophicum), 브라디리조비움 디아조에피시엔스 (Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 부르크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia) , 부르크홀데리아 글라디올리 (Burkholderia gladioli), 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia), 클레브시엘라 바리이콜라 (Klebsiella variicola), 메소리조비움 시세리 (Mesorhizobium ciceri), 메소리조비움 오포투니스툼 (Mesorhizobium opportunistum), 메소리조비움 sp F28, 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 엔도피티카 (Pantoea endophytica), 판토에아 아글로메란스 (Pantoea agglomerans), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 세라티아 리쿠에파시엔스 ( Serratia liquefaciens) , 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens) , 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter), 브레비박테리움 sp CH1, 브레비박테리움 sp CH2, 브레비박테리움 sp R312, 브레비박테리움 임페리알레 (Brevibacterium imperiale), 코리네박테리움 니트릴로필루스 (Corynebacterium nitrilophilus) , 코리네박테리움 슈도디프테리티쿰 (Corynebacterium pseudodiphteriticum), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 호프마니 (Corynebacterium hoffmanii), 마이크로박테리움 임페리알레 (Microbacterium imperiale), 마이크로박테리움 스메그마티스 (Microbacterium smegmatis) , 마이크로코쿠스 루테우스 (Micrococcus luteus), 노카르디아 글로베룰라 (Nocardia globerula), 노카르디아 로도크로우스 (Nocardia rhodochrous), 슈도노카르디아 터모필라 (Pseudonocardia thermophila), 트리코데르마 (Trichoderma), 미로테시움 베루카리아 (Myrothecium verrucaria), 아우레오바시듐 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) , 칸디다 파마타 (Candida famata), 칸디다 길리에르몬디 (Candida guilliermondii) , 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 크립토코쿠스 플라부스 (Cryptococcus flavus), 크립토코쿠스 sp UFMG- Y28 , 데바리오마이세스 한세이 (Debaryomyces hanseii), 지오트리쿰 칸디둠 (Geotrichum candidum), 지오트리쿰 sp JR1 , 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 클루이베로마이세스 터모톨레란스 (Kluyveromyces thermotolerans), 피키아 클루이베리 (Pichia kluyveri), 로도토룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis), 코모모나스 테스토스테로니 (Comomonas testosteronni), 피로코쿠스 아비시 (Pyrococcus abyssi) , 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) , 및 피로코쿠스 호리코시 (Pyrococcus horikoshii) 의 대표물을 포함한다 (예를 들어, Prasad, Biotechnology Advances (2010), 28(6): 725-741; FR2835531 참조). 효소 니트릴 히드라타아제는 철- 또는 코발트-의존성이며 (즉, 그 활성 중심에 배위된 철 또는 코발트 원자를 가짐) 이는 특히 아크릴로니트릴의 전환을 촉매하여 아크릴로니트릴을 수화시킴으로써 아크릴아미드를 수득하는 능력을 특징으로 한다 (Kobayashi, Nature Biotechnology (1998),16: 733 - 736).

아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환시키는 생물학적 합성 방법의 생성물은 아크릴아미드 수용액이다. 그러나, 일반적으로 수득되는 아크릴아미드 수용액은 생물전환 동안 부산물로 형성되는 아크릴산을 추가로 함유한다.

아크릴아미드는 아크릴아미드의 중합체를 형성하기 위한 단량체로서 사용된다. 중합 반응을 위해, 생물학적 합성 방법에 의해 제조된 아크릴아미드 수용액이 사용될 수 있다.

그러나, 중합 반응에 사용되는 아크릴아미드 수용액 중 존재하는 아크릴산이 생성되는 아크릴아미드 중합체의 감소된 성능을 야기한다는 것이 밝혀졌다. 더욱 구체적으로는, 아크릴산의 존재는 아크릴아미드 중합체 물질의 물리적 특성을 상당히 손상시킬 수 있고, 이는 예를 들어 각종 적용, 예컨대 수처리, 제지, 오일 회수 또는 채굴에서 감소된 용해도 및 성능을 야기한다.

따라서, 낮은 농도의 아크릴산을 갖는 아크릴아미드 수용액을 제조하는 생체촉매적 방법에 대한 요구가 존재한다.

이 목적하는 기술적 문제는 청구 범위에서 정의된 바와 같이 및 하기 본원에 설명되고 예시된 바와 같이 본 발명에 의해 극복되었다.

본 발명은 아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법에 관한 것으로, 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 하기 성분 (i) 내지 (iii) 을 반응기에 첨가하여 생물전환용 조성물을 수득하는 단계:

(i) 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 생체촉매;

(ii) 아크릴로니트릴;

(iii) 물; 및

(b) 단계 (a) 에서 수득한 조성물에 생물전환을 수행하는 단계;

(c) 추가의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 10 분 내지 48 시간 동안, 바람직하게는 15 분 내지 24 시간 동안, 더 바람직하게는 30 분 내지 18 시간 동안, 가장 바람직하게는 1 시간 내지 12 시간 동안 유지하는 단계 (여기서 w/w % 의 표시는 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄).

또한, 본 발명은 또한 아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법에 관한 것으로, 방법은 하기 단계를 포함한다:

(ii) 아크릴로니트릴;

(iii) 물; 및

(c) 추가의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 아크릴아미드 함량이 적어도 20 w/w %, 바람직하게는 적어도 25 w/w %, 더 바람직하게는 적어도 30 w/w %, 보다 더 바람직하게는 적어도 35 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 42.5 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 45 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 47.5 w/w %, 가장 바람직하게는 적어도 50 w/w % 에 도달할 때까지 유지하는 단계 (여기서, w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄).

또한, 본 발명에 의해 포함되는 것은 아크릴아미드 수용액의 아크릴산 농도를 감소시키는 방법으로, 여기서 아크릴아미드 수용액은 생체촉매를 사용하여 아크릴로니트릴이 아크릴아미드로 전환되는 방법에 의해 제조되고, 방법은 하기 단계를 포함한다:

(ii) 아크릴로니트릴;

(iii) 물; 및

(c) 추가의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 유지하는 단계 (여기서, w/w % 의 표시는 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄).

아크릴아미드 수용액을 제조하는 이들 방법을 고려하여, 발명자들은 단계 (b) 에서의 생물전환 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 10 분 내지 48 시간 동안 유지하거나, 단계 (b) 에서의 생물전환 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 아크릴아미드 함량이 적어도 20 w/w % 에 도달할 때까지 유지함으로써, 수득한 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산의 농도가 감소됨을 발견하였다. 또한, 발명자들은 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 유지함으로써 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산의 농도가 감소되는, 아크릴아미드 수용액의 아크릴산 농도를 감소시키는 방법을 발견하였다. 아크릴아미드 수용액을 제조하기 위한 또는 아크릴아미드 수용액의 아크릴산 농도를 감소시키기 위한 본원에 기재된 방법 중 어느 하나와 관련하여, 이러한 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산 농도의 감소는 단계 (b) 에서의 생물전환 동안 아크릴로니트릴의 함량이 0.3 w/w % 이상으로 유지되는 본 발명의 방법 중 어느 하나에 따라 제조된 아크릴아미드 수용액이 생물전환 동안 아크릴로니트릴의 함량이 0.3 w/w % 이상으로 유지되지 않는 방법을 사용하여 제조된 아크릴아미드 수용액과 비교하여 보다 낮은 아크릴산의 농도를 갖는다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물전환" 은 본 발명의 방법 중 어느 하나의 맥락에서 일반적으로 물 및 생체촉매의 존재 하에 아크릴로니트릴이 아크릴아미드로 전환되는 반응을 의미한다. 아크릴아미드는 물에 용해되어, 본원에 기재 및 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 아크릴아미드 수용액이 형성된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조성물" 은 예를 들어 생체촉매, 아크릴로니트릴, 아크릴아미드 및 물과 같은 반응기에 존재하는 모든 성분을 포함한다.

본원에 기재된 방법 중 어느 하나와 관련하여 사용된 바와 같이, 용어 "생체촉매" 는 특히 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 미생물 (예를 들어, 박테리아 또는 원생대 진핵 생물) 및 효소를 포함한다. 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환하는 주어진 생체촉매 (예를 들어, 미생물 또는 효소) 의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예로서, 본 발명의 방법 중 어느 하나의 맥락에서, 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 주어진 생체촉매의 활성은 본 발명의 의미에서 하기와 같이 측정될 수 있다: 먼저 10 분 동안 1,000 rpm 에서 에펜도르프 튜브 쉐이커에서 25 ℃ 에서 25 ㎕ 의 아크릴로니트릴 및 875 ㎕ 의 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액과 100 ㎕ 의 세포 현탁액, 세포 용해물, 용해된 효소 분말, 또는 생각되는 생체촉매를 함유하는 임의의 기타 제제를 반응시킨다. 반응 시간 10 분 이후, 샘플은 꺼내지고, 즉시 1.4% 염산을 동일 부피 첨가하여 ??칭될 수 있다. 샘플 혼합 이후, 세포는 10,000 rpm 으로 1 분 동안 원심분리하여 제거될 수 있고, 형성된 아크릴아미드의 양은 HPLC 에 의해 맑은 상청액을 분석하여 측정된다. 본 발명의 맥락에서 생체촉매가 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 것으로 확인되는 경우, 아크릴아미드의 농도는 0.25 내지 1.25 mmol/l 일 것이고 - 필요한 경우, 샘플은 그에 따라 희석되고 전환이 반복되어야 한다. 활성은 이후 반응 시간 (이는 10 분 걸림) 으로 HPLC 분석으로부터 유래된 아크릴아미드 농도를 나누고, 이러한 값과 HPLC 샘플과 본래의 샘플 사이의 희석 배수를 곱함으로써, 아크릴아미드의 농도로부터 추정될 수 있다. 활성 >5 U/mg 건조 세포 중량, 바람직하게는 >25 U/mg 건조 세포 중량, 더 바람직하게는 >50 U/mg 건조 세포 중량, 가장 바람직하게는 >100 U/mg 건조 세포 중량은 기능적 생체촉매의 존재를 나타내고, 본 발명의 맥락에서 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 생체촉매로서 고려된다.

더욱 구체적으로는, 본 발명의 방법 중 어느 하나를 사용함으로써, 생물전환의 종료 시 조성물의 아크릴산 농도는 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1200 ppm 이하, 더 바람직하게는 1000 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 750 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 500 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하일 수 있으며, 여기서 ppm 의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고, 각각 생물전환의 종료 시 조성물의 전체 중량을 의미한다. 이와 관련하여, 용어 "생물전환의 종료 시" 는 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 실질적으로 완전한 전환이 도달되었음을 의미한다. "아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 실질적으로 완전한 전환" 은 특히 조성물의 아크릴로니트릴의 함량이 1000 ppm 이하, 바람직하게는 500 ppm 이하, 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하인 것을 의미하며, 여기서 ppm 의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고, 각각 조성물의 전체 중량을 나타낸다. 생물전환의 종료 시 조성물의 아크릴산 농도 및/또는 아크릴로니트릴의 함량은 HPLC 를 사용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, HPLC 방법은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 사용된다.

따라서, 본 발명은 또한 아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법에 관한 것으로, 방법은 하기 단계를 포함한다:

(ii) 아크릴로니트릴;

(iii) 물;

(c) 추가의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 유지하는 단계 (여기서 w/w % 의 표시는 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄); 및

(d) 생물전환의 종료 시 조성물의 아크릴산 농도가 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1200 ppm 이하, 더 바람직하게는 1000 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 750 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 500 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하인 조성물을 수득하는 단계 (여기서 ppm 의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고, 각각 생물전환의 종료 시 조성물의 전체 중량을 나타냄).

특히, 발명자들은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법 중 어느 하나를 수행함으로써, 아크릴산 농도가 레퍼런스 방법과 비교하여 적어도 10 %, 바람직하게는 적어도 15 %, 더 바람직하게는 적어도 20 %, 보다 더 바람직하게는 적어도 25 %, 가장 바람직하게는 적어도 35 % 감소될 수 있음을 발견하였다. 이러한 맥락에서, 본 발명의 방법에 정의된 바와 같은 아크릴산 농도의 감소는 본 발명의 방법에 의해 제조되지 않은 아크릴아미드 수용액 (즉, 본원에 기재된 바와 같이 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 유지하지 않음) 에 함유된 아크릴산의 최종 농도와 비교하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 아크릴아미드 수용액 (즉, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 유지함) 중 함유된 아크릴산의 최종 농도와 관련된다.

본원에 기재 및 제공된 방법 중 어느 하나에서, 아크릴로니트릴 (성분(ii)) 이 단계 (a) 에서 반응기에 첨가된다. 본 발명의 방법 중 어느 하나의 맥락에서, 아크릴로니트릴은 물이 첨가되기 전에, 물이 첨가된 후에, 또는 물과 함께 반응기에 첨가될 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 있어서, 추가의 아크릴로니트릴이 단계 (c) 에서 첨가된다. 이와 관련하여, 아크릴로니트릴이 연속적으로 또는 간헐적으로 첨가될 수 있다. 아크릴로니트릴의 첨가는 일정하거나 가변적인 공급 속도 또는 회분식일 수 있다. 아크릴로니트릴은 순수한 형태 또는 용액으로 첨가될 수 있다. 예를 들어, 아크릴로니트릴의 수용액이 사용될 수 있다.

또한, 본원에 기재 및 제공된 방법 중 어느 하나에서, 물 (성분(iii)) 은 단계 (a) 에서 반응기에 첨가된다. 물은 그 자체로서 첨가될 수 있거나, 본원에 기재된 바와 같은 생체촉매의 일부, 본원에 기재된 바와 같은 아크릴로니트릴 용액의 일부일 수 있거나, 또는 다르게 첨가될 수 있다. 물이 그 자체로서 첨가되는 경우, 일반적으로 수돗물 또는 탈이온수가 사용될 수 있다. 물은 또한 염의 수용액과 같은 수성 조성물의 일부일 수 있다. 특히, 완충액이 사용될 수 있다.

본원에 기재 및 제공된 방법 중 어느 하나의 단계 (a) 에 있어, 성분 (i) 내지 (iii) 가 반응기에 첨가되는 순서는 무관하다.

첨가되는 성분의 양에 관하여, 생체촉매, 아크릴로니트릴 및 물은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나의 단계 (a) 내지 (c) 동안 0.001 내지 0.5 w/w % 의 생체촉매, 22 내지 45 w/w % 의 아크릴로니트릴 및 나머지 100 w/w % 까지의 물; 바람직하게는 0.005 내지 0.2 w/w % 의 생체촉매, 26 내지 42 w/w % 의 아크릴로니트릴 및 나머지 100 w/w % 까지의 물; 더 바람직하게는 0.01 내지 0.1 w/w % 의 생체촉매, 30 내지 40 w/w % 의 아크릴로니트릴 및 나머지 100 w/w % 까지의 물; 가장 바람직하게는 0.015 내지 0.065 w/w % 의 생체촉매, 35 내지 39 w/w % 의 아크릴로니트릴 및 나머지 100 w/w % 까지의 물의 중량비로 첨가될 수 있으며, 여기서 각 경우 w/w % 의 표시는 단계 (a) 내지 (c) 동안 첨가되는 생체촉매, 아크릴로니트릴 및 물의 조합된 중량의 전체 중량 (100 w/w %) 을 나타낸다. 예를 들어, 단계 (a) 및 단계 (c) 에서 첨가되는 아크릴로니트릴의 경우, 이는 단계 (a) 및 (c) 에서 첨가되는 아크릴로니트릴의 조합된 양이 비를 계산하는데 사용됨을 의미한다. 생체촉매의 비의 w/w % 의 표시는 각 경우 생체촉매의 건조 중량, 특히 생체촉매의 건조 세포 중량의 관점에서 생체촉매의 비를 의미할 수 있다. 나머지 100 w/w % 까지를 형성하는 물은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 물은 염의 수용액과 같은 수성 조성물일 수 있다. 특히, 완충액이 사용될 수 있다. 그러나, 물이 수돗물 또는 탈이온수인 것이 바람직하다.

본원에 기재 및 제공된 방법 중 어느 하나의 단계 (b) 는 아크릴로니트릴이 본원에 기재 및 예시된 바와 같은 생체촉매에 의해 아크릴아미드로 전환되는 생물전환 단계를 나타낸다. 더욱 구체적으로는, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서, 단계 (b) 에서의 생물전환은 5 ℃ 내지 40 ℃ 에서 10 분 내지 48 시간 동안, 바람직하게는 5 ℃ 내지 35 ℃ 에서 10 분 내지 48 시간 동안, 더 바람직하게는 15 ℃ 내지 30 ℃ 에서 10 분 내지 48 시간 동안, 가장 바람직하게는 20 ℃ 내지 28 ℃ 에서 10 분 내지 48 시간 동안 수행될 수 있다. 특히, 이러한 반응 온도는 생체촉매의 높은 활성 및 합리적인 반응 시간의 관점에서 바람직하다. 단계 (b) 에 적용되는 실제 시간은 또한 제조될 아크릴아미드 수용액의 원하는 아크릴아미드 함량에 따라 다르다.

이러한 온도 및 시간 조건에 추가로 또는 독립적으로, 본 발명의 방법 중 어느 하나에서 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량은 0.3 w/w % 이상으로 10 분 내지 48 시간 동안, 바람직하게는 15 분 내지 24 시간 동안, 더 바람직하게는 30 분 내지 18 시간 동안, 가장 바람직하게는 1 시간 내지 12 시간 동안 유지될 수 있다. 특히, 아크릴로니트릴의 함량은 단계 (b) 동안 0.3 w/w % 이상으로 2 시간 내지 12 시간 동안, 4 시간 내지 12 시간 동안, 6 시간 내지 12 시간 동안, 8 시간 내지 12 시간 동안 또는 10 시간 내지 12 시간 동안 유지될 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 있어서, 아크릴로니트릴의 함량은 단계 (b) 동안 0.3 w/w % 이상으로 아크릴아미드 함량이 적어도 20 w/w %, 바람직하게는 적어도 25 w/w %, 더 바람직하게는 적어도 30 w/w %, 보다 더 바람직하게는 적어도 35 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 42.5 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 45 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 47.5 w/w %, 가장 바람직하게는 적어도 50 w/w % 에 도달할 때까지 유지될 수 있으며, 여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타낸다. 이러한 아크릴아미드의 함량이 도달된 후, 아크릴로니트릴의 첨가가 중단될 수 있다. 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서, 반응기 중의 조성물의 아크릴아미드 함량은 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR) 을 사용하여 측정될 수 있다.

상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 방법 중 어느 하나에서, 단계 (b) 의 생물전환 동안 아크릴로니트릴의 함량은 0.3 w/w % 이상으로 유지된다. 바람직하게는, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량은 0.4 w/w % 이상으로, 더 바람직하게는 0.5 w/w % 이상으로, 보다 더 바람직하게는 0.6 w/w % 이상으로, 더욱 더 바람직하게는 0.8 w/w % 이상으로, 가장 바람직하게는 1.0 w/w % 이상으로 유지되며, 여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타낸다. 이와 관련하여, 발명자들은 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 증가시킴으로써 아크릴산 농도를 더욱 낮출 수 있다는 것을 발견하였다.

아크릴로니트릴 함량의 최소값을 유지하는 것 이외에, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서, 아크릴로니트릴의 함량은 바람직하게는 단계 (b) 동안 6 w/w % 이하, 바람직하게는 5 w/w % 이하, 더 바람직하게는 4 w/w % 이하, 가장 바람직하게는 3 w/w % 이하로 유지되며, 여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타낸다. 발명자들은 아크릴로니트릴 함량을 이러한 상한치 미만으로 유지하는 것이 생체촉매의 우수한 활성 및 수득되는 아크릴아미드 수용액에서의 아크릴산 농도의 효율적인 감소를 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 또한, 아크릴로니트릴 함량이 6 w/w % 의 값을 초과하는 경우 생체촉매의 활성 손실이 발생할 수 있다. 특히, 아크릴로니트릴 함량은 단계 (b) 동안 0.3 w/w % 내지 6 w/w %, 바람직하게는 0.4 w/w % 내지 5 w/w %, 더 바람직하게는 0.5 w/w % 내지 4 w/w %, 보다 더 바람직하게는 0.6 w/w % 내지 3 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 0.8 w/w % 내지 3 w/w %, 가장 바람직하게는 1.0 w/w % 내지 3 w/w % 의 범위 내로 유지될 수 있으며, 여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타낸다.

본 발명의 방법 중 어느 하나, 특히 아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법 중 어느 하나의 구현예에 있어서, 아크릴로니트릴의 함량은 아크릴로니트릴의 첨가 동안 2 w/w % 가 아니며, 여기서 w/w % 의 표시는 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타낸다. 이는 특히 단계 (c) 에 따른 아크릴로니트릴의 첨가에 유효하다.

상기 기재한 바와 같이, 단계 (b)의 생물전환 동안 높은 아크릴로니트릴 함량이 유지되는 경우 생체촉매의 활성이 감소될 수 있다. 이와 관련하여, 발명자들은 제 1 범위에서 제 1 기간 동안 아크릴로니트릴 함량을 유지한 후에, 아크릴로니트릴 함량이 제 2 범위로 감소되고 제 2 범위에서 제 2 기간 동안 유지되는 경우, 생물전환 동안 생체촉매의 활성 손실이 줄어드는 것을 발견하였다. 따라서, 생체촉매의 높은 활성 및 따라서 합리적인 반응 시간을 달성하기 위해, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서, 아크릴로니트릴 함량을 단계 (b) 동안 0.3 w/w % 이상으로 유지하는 것은 하기를 포함할 수 있다:

(i) 아크릴로니트릴 함량을 제 1 범위에서 제 1 기간 동안 유지함;

(ii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위로 감소시킴; 및

(iii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위에서에서 제 2 기간 동안 유지함.

특히, 생물전환 동안 아크릴로니트릴 함량의 감소를 포함하는 이러한 프로토콜을 사용함으로써, 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 실질적으로 완전한 전환이 본원에 기재된 방법에서 달성될 수 있다.

바람직하게는, 아크릴로니트릴 함량이 제 1 범위에서 제 1 기간 동안 유지되고, 아크릴로니트릴 함량이 제 2 범위로 감소되고, 아크릴로니트릴 함량이 제 2 범위에서 제 2 기간 동안 유지되는, 본 발명의 방법 중 어느 하나의 단계 (b) 는 하기를 포함한다:

(i) 아크릴로니트릴 함량을 1.2 w/w % 내지 6 w/w % 의 제 1 범위에서 30 분 내지 4 시간의 제 1 기간 동안 유지함;

(ii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위로 감소시킴; 및

(iii) 아크릴로니트릴 함량을 0.3 w/w % 내지 1.2 w/w % 의 제 2 범위에서 30 분 내지 24 시간의 제 2 기간 동안 유지함,

여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄.

더 바람직하게는, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나의 단계 (b) 는 하기를 포함한다:

(i) 아크릴로니트릴 함량을 1.2 w/w % 내지 4 w/w % 의 제 1 범위에서 30 분 내지 3 시간의 제 1 기간 동안 유지함;

(ii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위로 감소시킴; 및

(iii) 아크릴로니트릴 함량을 0.5 w/w % 내지 1.1 w/w % 의 제 2 범위에서 30 분 내지 12 시간의 제 2 기간 동안 유지함,

가장 바람직하게는, 본 발명의 방법 중 어느 하나의 단계 (b) 는 하기를 포함한다:

(i) 아크릴로니트릴 함량을 1.3 w/w % 내지 3 w/w % 의 제 1 범위에서 30 분 내지 2 시간의 제 1 기간 동안 유지함;

(ii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위로 감소시킴; 및

(iii) 아크릴로니트릴 함량을 0.6 w/w % 내지 1.0 w/w % 의 제 2 범위에서 1 시간 내지 8 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 5 시간의 제 2 기간 동안 유지함,

본원에 기재된 방법 중 어느 하나는 연속 공정을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "연속 공정" 은 반응기에서 전체 반응 혼합물을 수집하지 않고 연속 방식으로 아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법을 의미한다. 이는 생체촉매, 물 및 아크릴로니트릴을 포함할 수 있는 반응 원료 물질이 반응기에 연속적으로 또는 간헐적으로 공급되며, 수득되는 생성물이 반응기로부터 연속적으로 또는 간헐적으로 회수되는 것을 의미한다.

대안적으로, 본 발명의 방법 중 어느 하나는 반-회분식 공정을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "반-회분식 공정" 은 아크릴아미드 수용액이 불연속적인 방식으로 제조되는 것을 포함할 수 있다. 이러한 반-회분식 공정 수를 수행하는 비-제한적 실시예에 있어서, 일정량의 아크릴로니트릴 및 생체촉매가 반응기에 배치된다. 이어서, 조성물의 아크릴아미드의 원하는 함량이 도달될 때까지 추가의 아크릴로니트릴이 생물전환 동안 첨가된다. 이러한 아크릴아미드의 원하는 함량이 도달된 후, 수득된 조성물은 새로운 반응물이 그 안에 배치되기 전에 반응기로부터 완전히 회수된다.

생물전환 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 공급과 관련하여, 본 발명의 방법 중 어느 하나의 비-제한적인 구현예에 있어서, 아크릴로니트릴은 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량이 ±10 w/w %, 바람직하게는 ±5 w/w %, 더 바람직하게는 ±2 w/w %, 가장 바람직하게는 ±1 w/w % 범위 내의 소정 값의 아크릴로니트릴 함량이 유지되도록 공급될 수 있으며, 여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 아크릴로니트릴의 전체 중량을 나타낸다. 특히, 본 발명의 방법 중 어느 하나에서, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량이 소정 값으로 실질적으로 일정하게 유지되도록 아크릴로니트릴이 공급될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 방법 중 어느 하나에서, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴 함량 및/또는 아크릴아미드 함량은 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR) 을 사용하여 측정될 수 있다. 특히, 아크릴로니트릴 함량 및/또는 아크릴아미드 함량은 FTIR 을 사용하여 온라인 측정될 수 있다.

본 발명의 방법 중 어느 하나에 있어서, 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 생체촉매는 효소 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 미생물일 수 있다. 이와 관련하여, 미생물이 자연적으로 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는지, 또는 이것이 상기 효소를 인코딩하기 위해 유전적으로 조작되었는지, 또는 자연적으로 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 미생물이 더 많은 및/또는 향상된 니트릴 히드라타아제를 생산할 수 있도록 조작되었는지는 본 발명과 무관하다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "(효소) 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 생체촉매 (예를 들어, 미생물)" 등은 일반적으로 이러한 미생물이 일반적으로 또한 니트릴 히드라타아제를 생산하고 안정하게 유지할 수 있음을 의미한다. 즉, 본원에 사용된 바와 같이 및 당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 니트릴 히드라타아제를 (자연적으로 또는 비자연적으로) 인코딩하는 본 발명에 따라 사용되는 생체촉매 (예를 들어, 미생물) 는 일반적으로 또한 니트릴 히드라타아제를 생산하고 안정하게 유지할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 이러한 미생물이 본원에 기재 및 제공된 방법 중 어느 하나의 단계 (a) 에 따라서 반응기에 첨가되기 전에, 미생물의 배양 (또는 발효) 동안 오로지 니트릴 히드라타아제를 생산 (이에 따라 이후 니트릴 히드라타아제를 함유함) 하는 것이 또한 가능하다. 이러한 경우, 미생물이 본원에 기재 및 제공된 방법 동안 니트릴 히드라타아제를 더이상 생산하지 않지만, 이는 이들이 이전에 생산하고 이들이 여전히 함유하는 니트릴 히드라타아제 단위를 통해서만 작용하는 것이 가능하다. 당업자에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 일부 니트릴 히드라타아제 분자는 미생물 (예를 들어, 미생물의 용해로 인함) 을 떠날 수 있고 생체촉매로서 용액에서 자유롭게 작용하는 것이 또한 가능하다. 이와 같이, 본원에서 사용되는 용어 "생체촉매" 는 본원에 기재 및 예시된 바와 같이 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 한 효소 니트릴 히드라타아제 그 자체를 포함할 수도 있다. 본 발명의 맥락에서, 생체촉매로서 니트릴 히드라타아제를 직접 사용할 수도 있다.

본 발명의 맥락에서, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서 생체촉매로서 사용될 수 있는 니트릴 히드라타아제를 자연적으로 인코딩하는 미생물은 로도코쿠스 (Rhodococcus), 아스페르길루스 (Aspergillus), 아시도보락스 (Acidovorax), 아그로박테리움 (Agrobacterium) , 바실루스 (Bacillus) , 브라디리조비움 ( Bradyrhizobium), 부르크홀데리아 (Burkholderia), 에스케리키아 (Escherichia) , 지오바실루스 (Geobacillus), 클레브시엘라 (Klebsiella) , 메소리조비움 (Mesorhizobium) , 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 (Pantoea), 슈도모나스 (Pseudomonas), 리조비움 (Rhizobium) , 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 세라티아 (Serratia) , 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter), 브레비박테리움 (Brevibacterium) , 코리네박테리움 (Corynebacterium) , 마이크로박테리움 (Microbacterium) , 마이크로코쿠스 (Micrococcus), 노카르디아 (Nocardia), 슈도노카르디아 (Pseudonocardia), 트리코데르마 (Trichoderma), 미로테시움 (Myrothecium), 아우레오바시듐 (Aureobasidium), 칸디다 (Candida), 크립토코쿠스 (Cryptococcus), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 지오트리쿰 (Geotrichum), 한세니아스포라 (Hanseniaspora) , 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 로도토룰라 (Rhodotorula), 코모모나스 (Comomonas), 및 피로코쿠스 (Pyrococcus) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속한 종을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 생체촉매는 속 로도코쿠스 (Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas) , 에스케리키아 (Escherichia) 및 지오바실루스 (Geobacillus) 의 박테리아로부터 선택된다.

본 발명의 방법 중 어느 하나의 맥락에서 사용된 바람직한 생체촉매는 속 로도코쿠스 (Rhodococcus) 의 대표물을 포함한다. 본 발명의 방법 중 어느 하나의 맥락에서 사용되는 생체촉매로서 적합한 종은, 예를 들어, 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) (예를 들어, NCIMB 41164, J1/FERM-BP 1478, M33 또는 M8), 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans), 로도코쿠스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis), 로도코쿠스 에쿠이 (Rhodococcus equi), 로도코쿠스 러버 (Rhodococcus ruber), 로도코쿠스 오파쿠스 (Rhodococcus opacus), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) , 아시도보락스 아베나에 (Acidovorax avenae) , 아시도보락스 파실리스 (Acidovorax facilis) , 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아그로박테리움 라디오박테르 (Agrobacterium radiobacter), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) , 바실루스 팔리두스 (Bacillus pallidus), 바실루스 스미티 (Bacillus smithii) , 바실루스 sp BR449, 브라디리조비움 올리고트로피쿰 (Bradyrhizobium oligotrophicum), 브라디리조비움 디아조에피시엔스 (Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 부르크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia), 부르크홀데리아 글라디올리 (Burkholderia gladioli) , 대장균 (Escherichia coli), 지오바실루스 sp. RAPc8, 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca) , 클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia), 클레브시엘라 바리이콜라 (Klebsiella variicola), 메소리조비움 시세리 (Mesorhizobium ciceri), 메소리조비움 오포투니스툼 (Mesorhizobium opportunistum), 메소리조비움 sp F28, 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 엔도피티카 (Pantoea endophytica), 판토에아 아글로메란스 (Pantoea agglomerans), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 세라티아 리쿠에파시엔스 (Serratia liquefaciens) , 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter) , 브레비박테리움 sp CH1, 브레비박테리움 sp CH2, 브레비박테리움 sp R312, 브레비박테리움 임페리알레 (Brevibacterium imperiale), 브레비박테리움 카세이 (Brevibacterium casei), 코리네박테리움 니트릴로필루스 (Corynebacterium nitrilophilus) , 코리네박테리움 슈도디프테리티쿰 (Corynebacterium pseudodiphteriticum), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 호프마니 (Corynebacterium hoffmanii), 마이크로박테리움 임페리알레 (Microbacterium imperiale), 마이크로박테리움 스메그마티스 (Microbacterium smegmatis) , 마이크로코쿠스 루테우스 (Micrococcus luteus), 노카르디아 글로베룰라 (Nocardia globerula), 노카르디아 로도크로우스 (Nocardia rhodochrous), 노카르디아 sp 163, 슈도노카르디아 터모필라 (Pseudonocardia thermophila), 트리코데르마 (Trichoderma) , 미로테시움 베루카리아 (Myrothecium verrucaria), 아우레오바시듐 풀루란스 (Aureobasidium pullulans), 칸디다 파마타 (Candida famata) , 칸디다 길리에르몬디 (Candida guilliermondii), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 크립토코쿠스 플라부스 (Cryptococcus flavus) , 크립토코쿠스 sp UFMG- Y28 , 데바리오마이세스 한세이 (Debaryomyces hanseii), 지오트리쿰 칸디둠 (Geotrichum candidum), 지오트리쿰 sp JR1 , 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 클루이베로마이세스 터모톨레란스 (Kluyveromyces thermotolerans), 피키아 클루이베리 (Pichia kyveri) , 로도토룰라 글루티니스 ( Rhodotorula glutinis ), 코모모나스 테스토스테로니 (Comomonas testo tero i) , 피로코쿠스 아비시 (Pyrococcus abyssi), 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus ) 또는 피로코쿠스 호리코시 (Pyrococcus horikoshii) 를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법 중 어느 하나의 한 구현예에 있어서, 사용되는 생체촉매는 종 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) 에 속한다. 본원에 기재된 방법 중 어느 하나의 맥락에서 사용될 수 있는 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) 에 속하는 균주의 특정예는 NCIMB 41164, J1 (FERM-BP 1478), M33 및 M8 을 포함한다.

로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) 에 대안으로 또는 이에 부가하여, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에서 사용되는 생체촉매는 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans) 일 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 자연적으로 니트릴 히드라타아제를 인코딩하지 않는 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 미생물은 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 유전자를 자연적으로 함유하지 않지만, 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하기 위해 (예를 들어, 형질전환, 형질도입, 트랜스펙션 (transfection), 컨쥬게이션 (conjugation), 또는 업계에 공지된 세포에 폴리뉴클레오티드를 수송 또는 삽입하는데 적합한 기타 방법을 통함; Sambrook and Russell 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 참조) 조작되어, 미생물이 니트릴 히드라타아제 효소를 생산하고 안정하게 유지할 수 있게 하는, 유전자 조작 미생물일 수 있다. 이러한 목적으로, 니트릴 히드라타아제 유전자 또는 mRNA 각각의 전사 및 해독을 허용하는 것이 필요할 수 있는 추가 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것이 추가로 필요할 수 있다. 이러한 추가 폴리뉴클레오티드는 특히 프로모터 서열, 폴리T- 또는 폴리U-테일, 또는 복제 기원 또는 기타 플라스미드-제어 서열을 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 유전자를 자연적으로 함유하지는 않지만 예컨대 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하기 위해 조작되는 이러한 유전자 조작된 미생물은, 원핵 또는 진핵 미생물일 수 있다. 이러한 원핵 미생물의 예는 예를 들어 종 대장균 (Escherichia coli) 의 대표물을 포함한다. 이러한 진핵 미생물의 예는 예를 들어 이스트 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)) 를 포함한다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "니트릴 히드라타아제" (이하 NH아제로도 지칭됨) 는 일반적으로 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 전환 (즉, 수화) 을 촉매작용할 수 있는 효소를 의미한다. 이러한 효소는 예를 들어 2014 년 9 월 30 일자 IUBMB 명명법 하에 등록된 효소일 수 있다: EC 4.2.1.84; CAS-No. 2391-37-5. 그러나, 본원에 사용된 용어 "니트릴 히드라타아제" 는 또한 예를 들어 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 더욱 빠르게 전환할 수 있거나, 더 높은 수율/시간-비율로 생산될 수 있거나, 더욱 안정한 (이들이 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 전환 (즉, 수화) 을 촉매작용할 수 있는 한), 조작 또는 개선된 효소를 포함한다. 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 전환을 촉매작용하기 위한 주어진 생체촉매 (예를 들어, 미생물 또는 효소) 의 능력을 측정하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예로서, 본 발명의 맥락에서, 본 발명의 의미에서 니트릴 히드라타아제로 작용하는 주어진 생체촉매의 활성은 하기와 같이 측정될 수 있다: 먼저 10 분 동안 1,000 rpm 에서 에펜도르프 튜브 쉐이커에서 25 ℃ 에서 25 ㎕ 의 아크릴로니트릴 및 875 ㎕ 의 50 mM 칼륨 포스페이트 완충액과 100 ㎕ 의 세포 현탁액, 세포 용해물, 용해된 효소 분말, 또는 생각되는 니트릴 히드라타아제를 함유하는 임의의 기타 제제를 반응시킨다. 반응 시간 10 분 이후, 샘플은 꺼내지고, 즉시 1.4% 염산을 동일 부피 첨가하여 ??칭될 수 있다. 샘플 혼합 이후, 세포는 10,000 rpm 으로 1 분 동안 원심분리하여 제거될 수 있고, 형성된 아크릴아미드의 양은 HPLC 에 의해 맑은 상청액을 분석하여 측정된다. 본 발명의 맥락에서 효소가 니트릴 히드라타아제인 것으로 확인되는 경우, 아크릴아미드의 농도는 0.25 내지 1.25 mmol/l 일 것이고 - 필요한 경우, 샘플은 그에 따라 희석되고 전환이 반복되어야 한다. 효소 활성은 이후 반응 시간 (이는 10 분 걸림) 으로 HPLC 분석으로부터 유래된 아크릴아미드 농도를 나누고, 이러한 값과 HPLC 샘플과 본래의 샘플 사이의 희석 배수를 곱함으로써, 아크릴아미드의 농도로부터 추정될 수 있다. 활성 >5 U/mg 건조 세포 중량, 바람직하게는 >25 U/mg 건조 세포 중량, 더 바람직하게는 >50 U/mg 건조 세포 중량, 가장 바람직하게는 >100 U/mg 건조 세포 중량은 기능적으로 발현된 니트릴 히드라타아제의 존재를 나타내고, 본 발명의 맥락에서 니트릴 히드라타아제로서 고려된다.

본 발명의 맥락에서, 니트릴 히드라타아제는 SEQ ID NO: 1 의 뉴클레오티드 서열 (R. 로도크로우스의 니트릴 히드라타아제의 알파-서브유닛:

)

및/또는 SEQ ID NO: 3 의 뉴클레오티드 서열 (R. 로도크로우스의 니트릴 히드라타아제의 베타-서브유닛:

)

과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 96%, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 적어도 99%, 더 바람직하게는 적어도 99.5%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드일 수 있고, 단 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 본원에 기재 및 예시된 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 수화를 촉매작용할 수 있다 (즉, 니트릴 히드라타아제 활성을 가짐). 또한 본 발명의 맥락에서, 니트릴 히드라타아제는 SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열 (R. 로도크로우스의 니트릴 히드라타아제의 알파-서브유닛:

)

및/또는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열 (R. 로도크로우스의 니트릴 히드라타아제의 베타-서브유닛:

)

과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 96%, 더 바람직하게는 적어도 97%, 더 바람직하게는 적어도 98%, 더 바람직하게는 적어도 99%, 더 바람직하게는 적어도 99.5%, 가장 바람직하게는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있고, 단 상기 폴리펩티드는 본원에 기재 및 예시된 아크릴아미드로의 아크릴로니트릴의 수화를 촉매작용할 수 있다.

둘 이상의 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 아미노산 서열) 사이의 상동성 (identity) 의 수준은 예를 들어 BLAST 분석에 의해 업계에 공지된 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 맥락에서, 예를 들어 서열 비교에 의해 비교하고자 하는 두 서열 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열) 이 상동성이 다른 경우, 용어 "상동성" 은 더 짧은 서열, 및 상기 더 짧은 서열에 매칭되는 더 긴 서열의 해당 부분을 나타낼 수 있다. 따라서, 비교하고자 하는 서열이 동일한 길이를 갖지 않을 때, 상동성 정도는 바람직하게는 더 긴 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 더 짧은 서열의 뉴클레오티드 잔기의 백분율, 또는 더 짧은 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일한 더 긴 서열의 뉴클레오티드의 백분율을 나타낼 수 있다. 이러한 맥락에서, 당업자는 쉽게 더 짧은 서열에 매칭되는 더 긴 서열의 해당 부분을 결정하는 위치에 있다. 또한, 본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 상동성 수준은 각각의 서열의 전체 길이를 나타낼 수 있고 바람직하게는 쌍으로 평가되고, 여기서 각각의 갭은 하나의 미스매치로 계수된다. 이러한 서열 비교에 대한 정의 (예를 들어, "상동성" 값의 확립) 는 본원에 기재 및 개시된 모든 서열에 적용된다.

또한, 본원에 사용된 용어 "상동성" 은 상응하는 서열 사이의 기능적 및/또는 구조적 동등성이 있음을 의미한다. 본원에 기재된 특정 핵산/아미노산 서열에 대해 주어진 상동성 수준을 갖는 핵산/아미노산 서열은, 바람직하게는 동일한 생물학적 기능을 갖는 이러한 서열의 유도체/변이체를 나타낼 수 있다. 이는 자연 발생 변이, 예를 들어 기타 변종, 종 등으로부터의 서열, 또는 돌연변이일 수 있고, 상기 돌연변이는 자연적으로 형성될 수 있거나 고의적 돌연변이 생성에 의해 생성될 수 있다. 또한, 변이는 합성적으로 생성된 서열일 수 있다. 변이체는 자연 발생 변이체 또는 합성적 생성 변이체 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된 변이체일 수 있다. 상기 기재된 핵산 서열로부터의 편차는 예를 들어 결실, 치환, 부가, 삽입 및/또는 재조합에 의해 생성될 수 있다. 용어 "부가" 는 주어진 서열의 말단에 적어도 하나의 핵산 잔기/아미노산을 부가하는 것을 나타내는 한편, "삽입" 은 주어진 서열 내에 적어도 하나의 핵산 잔기/아미노산을 삽입하는 것을 나타낸다. 용어 "결실" 은 주어진 서열에서의 적어도 하나의 핵산 잔기 또는 아미노산 잔기의 결실 또는 제거를 나타낸다. 용어 "치환" 은 주어진 서열에서의 적어도 하나의 핵산 잔기/아미노산 잔기의 대체를 나타낸다. 또다시, 여기서 사용된 이러한 정의는 필요한 부분만 약간 수정하여 본원에 제공 및 기재된 모든 서열에 적용된다.

일반적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 또는 "핵산 분자" 는 동의어로 이해된다. 일반적으로, 핵산 분자는 특히 DNA 분자, RNA 분자, 올리고뉴클레오티드 티오포스페이트, 치환 리보-올리고뉴클레오티드 또는 PNA 분자를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "핵산 분자" 는 업계에 공지된 DNA 또는 RNA 또는 이의 하이브리드 또는 이의 임의의 변형을 나타낼 수 있다 (예를 들어 US 5525711, US 471 1955, US 5792608 또는 EP 302175 변형예 참조). 폴리뉴클레오티드 서열은 단일- 또는 이중- 가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성일 수 있고, 임의의 크기 제한이 없다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA, 미토콘드리아 DNA, mRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 RNA 및 상기 RNA 를 인코딩하는 DNA 또는 키메로플라스트 (chimeroplast) (Gamper, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 4332 - 4339) 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터, 플라스미드 또는 바이러스성 DNA 또는 RNA 의 형태일 수 있다. 또한 본원에 기재되는 것은, 상기 기재된 핵산 분자에 상보적인 핵산 분자 및 본원에 기재된 핵산 분자와 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자이다. 본원에 기재된 핵산 분자는 또한 본 발명의 맥락에서 핵산 분자의 분절일 수 있다. 특히, 이러한 분절은 기능성 분절이다. 이러한 기능성 분절의 예는 프라이머로서 역할할 수 있는 핵산 분자이다.

본 발명의 방법 중 어느 하나에서 생체촉매를 반응기에 첨가할 때, 생체촉매는 발효 브로쓰로부터 바로 취할 수 있다. 생체촉매는 본원에 개시된 방법에서 발효 브로쓰의 형태로 사용될 수 있음이 또한 예상된다. 따라서, 생체촉매는 발효 브로쓰로부터 단리될 필요가 없으며, 생체촉매를 포함하는 발효 브로쓰가 생물전환에 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체촉매를 포함하는 발효 브로쓰가 본 발명의 방법 단계 (a) 에서 반응기에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 따르면, 생체촉매는 반응기에 첨가되기 전에 건조될 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 "전에" 는 반드시 생체촉매가 건조된 후 바로 반응기에 첨가됨을 의미하지는 않는다. 건조 및 첨가 사이에 추가의 단계가 수행되는지 여부와 무관하게, 생체촉매가 반응기에 첨가되기 전에 임의의 시간에 건조 단계를 거치는 것이 오히려 충분하다 비-제한적인 예로서, 건조 단계 및 반응기에의 첨가 사이의 이러한 추가의 단계는 저장 또는 재구성일 수 있다. 그러나, 건조 직후 반응기에 생체촉매를 첨가할 수도 있다. 발명자들은 놀랍게도 건조 단계를 거친 생체촉매를 사용함으로써, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 수득된 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산의 농도가 생물 전환에 사용되기 전에 건조를 거치지 않은 생체촉매가 사용되는 경우와 비교하여 더욱 감소됨을 발견하였다.

건조 방법과 관련하여, 본원에 기재 및 제공된 방법 중 어느 하나에서, 동결 건조, 분무 건조, 가열 건조, 진공 건조, 유동층 건조 및/또는 분무 과립화를 사용하여 건조된 생체촉매가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 분무 건조 및 동결 건조가 바람직한데, 일반적으로 분무- 또는 동결 건조된 생체촉매를 사용함으로써, 다른 방법을 사용하여 건조된 생체촉매를 사용하는 것과 비교하여 수득된 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산 농도의 보다 높은 감소가 달성되기 때문이다.

본 발명의 방법 중 어느 하나에 있어서, 건조된 생체촉매가 반응기에 첨가될 수 있다. 이는 생체촉매가 건조된 형태로 반응기에 첨가됨을 의미한다. 특히, 생체촉매는 분말 또는 과립의 형태일 수 있다. 건조된 생체촉매를 반응기에 첨가하는 것의 대안으로서, 건조된 생체촉매는 반응기에 첨가되기 전에 재구성될 수 있다. 예를 들어, 생체촉매는 수성 조성물 중에 현탁시킴으로써 재구성될 수 있다. 이와 관련하여, 수성 조성물은 물 또는 완충액일 수 있다. 추가의 대안으로서, 매트릭스 결합 미생물 형태의 생체촉매가 반응기에 첨가될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "건조된 생체촉매" 는 건조 단계를 거친 생체촉매를 의미한다. 건조된 생체촉매는 전형적으로 생체촉매 샘플의 전체 중량을 기준으로 약 20 w/w % 미만, 더 바람직하게는 약 15　w/w % 미만, 보다 더 바람직하게는 약 14　w/w % 미만, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 10　w/w % 의 수분 함량을 갖는다. 수분 함량을 측정하는 방법은 당업자에게 익숙하다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 건조된 생체촉매 샘플의 수분 함량은 열 중량 분석을 통해 측정될 수 있다. 열 중량 분석의 시작 시 샘플의 초기 중량이 측정된다. 샘플은 이후 가열되고 수분은 증발한다. 샘플 중량이 일정하게 유지될 때까지 가열을 계속한다. 분석 종료 시 일정한 중량과 초기 중량의 차이는 분석 동안 증발된 물의 양을 나타내며, 이는 샘플의 수분 함량을 계산할 수 있게 한다. 열 중량 분석을 통해 수분 함량을 측정하기 위해, 생체촉매 샘플은, 예를 들어, 샘플 중량이 적어도 30 초 동안 일정하게 유지될 때까지 130 ℃ 에서 작동하는 'Mettler Toledo HB43-S Halogen moisture analyzer' 에서 분석될 수 있다.

본원에 기재된 방법 중 어느 하나를 수행함으로써, 아크릴아미드 수용액은 생체촉매와 함께 수득될 수 있다. 따라서, 생체촉매는 수득되는 아크릴아미드 수용액으로부터 분리될 수 있다. 이러한 생체촉매의 분리는 예를 들어, 아크릴아미드 단독중합 또는 공중합을 포함할 수 있는 원하는 적용에 관해 수행될 수 있다. 생체촉매 분리에 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 원심분리, 침강 (예를 들어, 응집에 의함), 멤브레인 분리 및 여과를 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 기재 및 제공된 방법 중 어느 하나에 의해 수득가능하거나 수득되는 아크릴아미드 수용액에 관한 것이다.

아크릴아미드 수용액, 특히 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 수득가능하거나 수득되는 아크릴아미드 수용액은 35 내지 65 w/w % 의 아크릴아미드를 함유할 수 있으며, 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1000 ppm 이하, 더 바람직하게는 750 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 500 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하의 아크릴산 농도를 가질 수 있으며, 여기서 w/w % 및 ppm 의 표시는 각각 용액의 전체 중량을 나타내고, ppm 은 각각 중량부에 관한 것이다.

바람직하게는, 아크릴아미드 수용액은 40 내지 60 w/w % 의 아크릴아미드를 함유하며, 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1000 ppm 이하, 더 바람직하게는 750 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 500 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하의 아크릴산 농도를 가지며, 여기서 w/w % 및 ppm 의 표시는 각각 용액의 전체 중량을 나타내고, ppm 은 각각 중량부에 관한 것이다.

더 바람직하게는, 수성 아크릴아미드는 45 내지 55 w/w % 의 아크릴아미드를 함유하며, 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1000 ppm 이하, 더 바람직하게는 750 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 500 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하의 아크릴산 농도를 가지며, 여기서 w/w % 및 ppm 의 표시는 각각 용액의 전체 중량을 나타내고, ppm 은 각각 중량부에 관한 것이다.

가장 바람직하게는, 아크릴아미드 수용액은 50 내지 54 w/w % 의 아크릴아미드를 함유하며, 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1000 ppm 이하, 더 바람직하게는 750 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 500 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하의 아크릴산 농도를 가지며, 여기서 w/w % 및 ppm 의 표시는 각각 용액의 전체 중량을 나타내고, ppm 은 각각 중량부에 관한 것이다.

아크릴아미드 수용액 중 어느 하나에서, 아크릴아미드 함량 및/또는 아크릴산 농도는 HPLC 를 사용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, HPLC 방법은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 사용된다.

뿐만 아니라, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 아크릴아미드 수용액의 중합에 의해 수득가능하거나 수득되는 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체에 관한 것이다. 이와 관련하여, 단독중합체의 경우 용어 "중합" 은 단독중합 반응을 의미하고, 공중합체의 경우 용어 "중합" 은 공중합 반응을 의미한다. 단독중합 또는 공중합은 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 수득가능하거나 수득되는 아크릴아미드 수용액을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 아크릴아미드 수용액이 사용될 수 있는데, 이로부터 생체촉매가 중합 전에 분리된다. 대안적으로, 아크릴아미드는 단독중합 또는 공중합되기 전에 아크릴아미드 수용액으로부터 단리될 수 있다.

아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체, 특히 본원에 기재된 바와 같은 아크릴아미드 수용액의 중합에 의해 수득가능하거나 수득되는 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체는 60,000 ppm 이하, 바람직하게는 20,000 ppm 이하, 더 바람직하게는 10,000 ppm 이하, 가장 바람직하게는 2,000 ppm 이하의 아크릴산 함량을 가질 수 있으며, 여기서 ppm 의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고, 각각 고체 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체의 전체 중량을 나타낸다.

아크릴아미드 용액 내의 높은 아크릴산 함량은 특히 양이온성 폴리아크릴아미드 생성물, 즉, 아크릴아미드와 양이온성 공단량체의 공중합체에 대해, 생성되는 폴리아크릴아미드 단독중합체 및 공중합체의 감소된 성능을 야기할 수 있다. 이는 낮은 양이온성 공단량체 함량을 갖는 양이온성 공중합체의 경우 매우 명백하다. 임의의 이론에 구속되지 않으면서, 공중합체 사슬 내의 음이온성 아크릴산 및 양이온성 공단량체의 몰 당량은 전하 착물을 생성한다. 이는 폴리아크릴아미드 물질의 물리적 특성을 상당히 손상시켜, 수처리, 제지, 오일 회수 또는 채굴과 같은 적용에서 용해도 및 성능을 감소시킬 수 있다.

아크릴산의 이러한 영향과 관련하여, 본원애 기재 및 제공된 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체는 바람직하게는 양이온성 폴리아크릴아미드이다. 당업자에게 일반적으로 공지된 바와 같이, 용어 "양이온성 폴리아크릴아미드" 는 아크릴아미드 단량체 이외에 예를 들어 4차 암모늄기를 포함하는 공단량체와 같은 양이온성 공단량체를 함유하는 공중합체를 의미한다. 아크릴산 함량이 60,000 ppm 이하, 바람직하게는 20,000 ppm 이하, 더 바람직하게는 10,000 ppm 이하, 가장 바람직하게는 2,000 ppm 이하인 양이온성 폴리아크릴아미드가 특히 바람직하며, 여기서 ppm 의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고, 각각 고체 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체의 전체 중량을 나타낸다.

일반적으로, 본원에 기재된 임의의 중합체 또는 공중합체의 아크릴산 함량은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, European Polymer Journal (2007), 43(3): 824-834 에 기재된 바와 같은 NMR 분광법을 사용하여 측정될 수 있다.

아크릴아미드 단독중합체 및/또는 공중합체는, 예를 들어, 유전 적용에 사용된다. 특히, 아크릴아미드 단독중합체 및/또는 공중합체는 향상된 오일 회수로도 나타내는 3차 오일 회수에서 사용된다. 이와 관련하여, 3차 오일 회수 방법에서, 중합체의 수용액이 암석에 주입되어 오일 치환을 촉진하고 따라서 미정제 오일의 수율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 아크릴아미드 단독중합체 및/또는 공중합체의 수용액에 관한 것이다. 수용액을 위한 물로 해수가 사용될 수 있다.

이 설명은 본 발명을 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 임의의 정보가 선행 기술이거나 현재 청구된 발명과 관련이 있거나, 명시적으로 또는 암시적으로 언급된 임의의 문헌이 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the" 는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것이 주목되어야 한다. 따라서, 예를 들어 "작용제" 에 대한 언급은 이러한 상이한 작용제 하나 이상을 포함하고, "방법" 에 대한 언급은 본원에 기재된 방법으로 변형 또는 치환될 수 있는 당업자에 공지된 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.

당업자는 단지 통상적 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 동등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

달리 나타내지 않는 한, 일련의 구성 요소에 선행하는 용어 "적어도" 는 일련의 구성요소 모두를 나타내는 것으로 이해된다. 당업자는 단지 통상적 실험을 사용하여, 본원에 기재된 방법 및 용도의 특정 구현예에 대한 많은 동등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

여러 문헌이 본 개시의 내용 전체에 걸쳐 언급된다. 본원에 언급된 문헌 각각 (모든 특허, 특허 출원, 과학 문헌, 제조사 사양, 지시사항 등을 포함) 은, 위에서든 아래에서든지, 본원에서 그 전체가 참조 인용된다. 참조로 인용된 내용이 본 명세서와 모순되거나 불일치하는 경우, 본 명세서는 임의의 이러한 내용을 대신할 것이다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 개시물보다 선행하는 권리가 없다는 인정으로 해석되지 않는다.

본 명세서 및 이하의 청구항 전반에 걸쳐, 맥락이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 및 변형 예컨대 "포함함" 및 "포함하는" 은, 나타낸 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군의 내포를 시사하나 임의의 기타 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용될 때 용어 "포함하는" 은 용어 "함유하는" 또는 때때로 본원에서 사용될 때 용어 "갖는" 으로 치환될 수 있다.

본원에 사용되는 경우, "~로 이루어진" 은 청구항 구성요소에 특정되지 않은 임의의 구성요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에 사용되는 경우, "~로 본질적으로 이루어진" 은 청구항의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원의 각 예에서, 임의의 용어 "포함하는", "~로 본질적으로 이루어진" 및 "~로 이루어진" 은 다른 두 용어 중 하나로 대체될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 복수의 언급된 구성요소 사이의 접속어 "및/또는" 은 개별 및 조합된 옵션 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 구성요소가 "및/또는" 에 의해 결합된 경우, 제 1 옵션은 제 2 구성요소가 없는 제 1 구성요소의 적용성을 나타낸다. 제 2 옵션은 제 1 구성요소가 없는 제 2 구성요소의 적용성을 나타낸다. 제 3 옵션은 제 1 및 제 2 구성요소 함께의 적용성을 나타낸다. 이러한 옵션 중 어느 하나는 상기 의미 내에 있고, 이에 따라 본원에 사용된 용어 "및/또는" 의 요건을 만족하는 것으로 이해된다. 옵션 중 하나 초과의 동시 적용성이 또한 상기 의미 내에 있고, 이에 따라 본원에 사용된 용어 "및/또는" 의 요건을 만족하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 바와 같은 단어 "약" 은 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지 (즉, 측정 시스템의 한계) 에 부분적으로 의존할 것인 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대한 허용가능한 에러 범위 내에 존재하는 값을 의미한다. 예를 들어, "약" 은 당업계의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 용어 "약" 은 또한 당해 양 또는 값이 지정된 값이거나 거의 동일한 어떤 다른 값일 수 있음을 나타내는데 사용된다. 이 문구는 본 발명에 따라 동등한 결과 또는 효과를 촉진하는 동일한 값을 전달하기 위한 것이다. 이러한 맥락에서 "약" 은 10% 까지 초과 및/또는 미만의 범위를 나타낼 수 있다. 단어 "약" 은 일부 구현예에서 5% 까지, 예컨대 2% 까지, 1% 까지, 또는 0.5 % 까지 초과 또는 미만의 값인 특정 값 초과 및 미만의 범위를 나타낸다. 한 구현예에서, "약" 은 주어진 값의 0.1 % 까지 초과 및 미만의 범위를 나타낸다.

일반적으로, 본 발명은 본원에 기재된 모든 구현예뿐 아니라 이들의 모든 순열 및 조합에 관한 것이다. 본원에 기재된 임의의 특정 양태 또는 구현예는 이러한 양태 또는 구현예에 대해 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

하기 실시예는 본원에 제공된 발명을 추가로 기재 및 예시하나, 본원에 정의된 임의의 상세한 설명 또는 구현예로 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1:

반-회분식 공정에서, 아크릴로니트릴 및 2446 g 의 물을 유리 반응기에 배치하고, 여기서 아크릴로니트릴의 농도가 하기 표 1 에 기재한 바와 같이 반응기에서 도달되도록 아크릴로니트릴을 각각의 시행에서 첨가하였다. 그 다음, 건조된 생체촉매 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous), 균주 NCIMB 41164 를 첨가하여 생물전환을 개시하였다. 생물전환 동안 추가의 아크릴로니트릴을 조절된 속도로 첨가하면서 아크릴로니트릴의 함량을 표 1 에 요약한 초기 값으로 일정하게 유지하였다. 이와 관련하여, 아크릴로니트릴 및 아크릴아미드의 함량을 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR) 을 사용하여 생물전환 동안 온라인 측정하였다. 대체로, 생물전환을 시작하기 전에 반응기에 배치하고 반응 동안 첨가한 아크릴로니트릴의 총량인 1553 g 의 아크릴로니트릴이 아크릴아미드로 전환되었다. 반응 종료 시, 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 기준으로 52 w/w % 아크릴아미드의 함량을 갖는 4 kg 의 아크릴아미드 수용액을 수득하였다.

하기 표 1 은 각각 생체촉매의 상이한 양이 사용되고 생물전환 동안 아크릴로니트릴 함량이 상이한 값으로 유지되는, 20 ℃ 및 26 ℃ 의 온도에서 전 단락에 기재한 바와 같은 방법의 상이한 시행을 나타낸다.

* 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR) 을 사용하여 생물전환 동안 온라인 측정함

** 하기 제공한 방법에 따라 HPLC 를 사용하여 결정함

표 1 에 요약한 결과는 생물전환 동안 아크릴로니트릴 함량을 0.3 w/w % 이상으로 유지함으로써 낮은 농도의 아크릴산을 갖는 아크릴아미드 수용액이 제조됨을 보여준다. 특히, 결과는 생물전환 동안 유지되는 아크릴로니트릴의 함량을 증가시킴으로써 수득되는 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산의 농도가 감소됨을 나타낸다.

실시예 2:

아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 생물전환의 시행은 하기를 제외하고 실시예 1 과 동일한 조건 하에 수행되었다:

(i) 보다 높은 아크릴로니트릴의 함량을 생물전환의 시작부터 1 시간 동안 유지함;

(ii) 생물전환의 시작 1 시간 후에 아크릴로니트릴 함량을 보다 낮은 아크릴로니트릴 함량으로 감소시킴; 및

(iii) 보다 낮은 아크릴로니트릴 함량을 생물전환이 종료될 때까지, 즉, 1553 g 아크릴로니트릴이 전환되어 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 기준으로 52 w/w % 아크릴아미드의 함량을 갖는 4 kg 의 아크릴아미드 수용액을 형성할 때까지 유지함.

특정 조건 및 결과를 표 2 에 나타냈다.

** 하기 제공한 방법에 따라 HPLC 를 사용하여 결정함

표 2 의 시행 1 에서, 아크릴로니트릴의 함량은 전체 생물전환 동안 0.8 w/w % 로 유지되었다. 시행 2 및 3 에서, 각각, 1.5 및 2 w/w % 의 아크릴로니트릴의 보다 높은 함량이 생물전환의 시작부터 1 시간까지 유지되었다. 1 시간 후, 아크릴로니트릴의 함량이 0.8 w/w % 로 감소되었으며 생물전환이 종료될 때까지 이 값으로 유지되었다.

결과는 생물전환이 종료될 때까지 필요한 동등한 시간에서, 수득된 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산의 농도가 아크릴로니트릴의 보다 높은 함량이 특정 기간에 걸쳐 유지된 다음, 아크릴로니트릴의 함량이 아크릴로니트릴의 보다 낮은 함량으로 감소되고 이 아크릴로니트릴의 보다 낮은 함량이 생물 전환이 끝날 때까지 유지되는 경우에 더욱 감소된다는 것을 나타낸다.

실시예 3:

물 및 18 g 의 아크릴로니트릴을 반응기에 배치하였다. 물의 양은 물 및 생체촉매의 총량이 1835 g 가 되도록 조정하였다. 생체촉매의 두 상이한 형태 (i) 및 (ii) 가 하기 기재한 바와 같은 독립적인 시행에서 사용되었다:

(i) NH아제 활성이 1512 kU/kg 이고 물 함량이 96.1 w/w % 인, 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) 의 세포, 균주 J1 (FERM-BP 1478) 을 함유하는 발효 브로쓰; 및

(ii) 83.6 w/w % 의 물 함량까지 원심분리하여 (i) 를 농축한 다음 농축물을 동결 건조시킴으로써 수득한 건조 분말. 건조 분말의 물 함량은 13 w/w % 였고, NH아제 활성은 211 kU/g 이었다.

생체촉매를 반응기에 첨가하여, 반응을 개시하였다. 생물전환 동안 1147 g 의 추가 아크릴로니트릴을 첨가하여 종료 시 전체 반응 배치 크기가 3000 g 이 되도록 하였다. 온도는 반응 동안 23℃ 로 일정하게 유지하였다. 아크릴로니트릴의 함량은 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR) 을 사용하여 생물전환 동안 온라인 측정하였고, 전체 아크릴로니트릴이 반응기에 첨가될 때까지 반응 혼합물 중 아크릴로니트릴 함량이 1.0 ± 0.1 w/w % 또는 0.3 w/w % 로 일정하게 유지되도록 아크릴로니트릴의 첨가 속도를 조정하였다. 전환으로 인해 아크릴로니트릴 함량이 < 100 ppm 로 감소된 후에 반응을 중단하였다. 반응 종료 시, 매 시행에서 아크릴아미드 농도는 ≥ 51 w/w % 였다.

조건 및 결과를 하기 표 3 에 나타냈다.

** 하기 제공한 방법에 따라 HPLC 를 사용하여 결정함

표 3 의 결과는 아크릴로니트릴 함량이 일정하게 유지되는 생물전환에서 건조된 생체촉매를 사용함으로써, 수득된 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산의 농도가 건조되지 않은 생체촉매를 사용하는 것에 비해 감소됨을 보여준다.

상기 언급한 실시예에서, 수득된 아크릴아미드 수용액 중 아크릴산의 농도를 HPLC 를 사용하여 측정하였다. 아크릴아미드, 아크릴산 및 아크릴로니트릴의 함량을 측정하기 위해 하기 조건을 적용하였다:

칼럼: Aqua C18, 250*4.6 mm (Phenomenex)

가드 칼럼: C18 Aqua

온도: 40 ℃

유속: 1.00 ml/분

주입 부피: 1.0 ㎕

검출: UV 검출기, 파장 210 nm

중단 시간: 8.0 분

후속 시간: 0.0 분

최대 압력: 250 bar

용리액 A: 10 mM KH₂PO₄, pH 2.5

용리액 B: 아세토니트릴

구배:

매트릭스: 발효 브로쓰, 생물전환 혼합물

샘플을 0.22 ㎛ 를 통해 여과함

피분석물:

SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Method for preparing an aqueous acrylamide solution having a low acrylic acid concentration <130> BAS15081PCT <150> EP14003377.0 <151> 2014-09-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 612 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <220> <223> alpha-subunit of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous <400> 1 gtgagcgagc acgtcaataa gtacacggag tacgaggcac gtaccaaggc gatcgaaacc 60 ttgctgtacg agcgagggct catcacgccc gccgcggtcg accgagtcgt ttcgtactac 120 gagaacgaga tcggcccgat gggcggtgcc aaggtcgtgg ccaagtcctg ggtggaccct 180 gagtaccgca agtggctcga agaggacgcg acggccgcga tggcgtcatt gggctatgcc 240 ggtgagcagg cacaccaaat ttcggcggtc ttcaacgact cccaaacgca tcacgtggtg 300 gtgtgcactc tgtgttcgtg ctatccgtgg ccggtgcttg gtctcccgcc cgcctggtac 360 aagagcatgg agtaccggtc ccgagtggta gcggaccctc gtggagtgct caagcgcgat 420 ttcggtttcg acatccccga tgaggtggag gtcagggttt gggacagcag ctccgaaatc 480 cgctacatcg tcatcccgga acggccggcc ggcaccgacg gttggtccga ggaggagctg 540 acgaagctgg tgagccggga ctcgatgatc ggtgtcagta atgcgctcac accgcaggaa 600 gtgatcgtat ga 612 <210> 2 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous <220> <223> alpha-subunit of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous <400> 2 Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 3 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus rhodochrous <220> <223> beta-subunit of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous <400> 3 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 4 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous <220> <223> beta-subunit of nitrile hydratase of Rhodococcus rhodochrous <400> 4 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225

Claims

아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 하기 성분 (i) 내지 (iii) 을 반응기에 첨가하여 생물전환용 조성물을 수득하는 단계:
(i) 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 생체촉매;
(ii) 아크릴로니트릴;
(iii) 물; 및
(b) 단계 (a) 에서 수득한 조성물에 생물전환을 수행하는 단계;
(c) 추가의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 10 분 내지 48 시간 동안, 바람직하게는 15 분 내지 24 시간 동안, 더 바람직하게는 30 분 내지 18 시간 동안, 가장 바람직하게는 1 시간 내지 12 시간 동안 유지하는 단계 (여기서 w/w % 의 표시는 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄).
아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 하기 성분 (i) 내지 (iii) 을 반응기에 첨가하여 생물전환용 조성물을 수득하는 단계:
(i) 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 생체촉매;
(ii) 아크릴로니트릴;
(iii) 물; 및
(b) 단계 (a) 에서 수득한 조성물에 생물전환을 수행하는 단계;
(c) 추가의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 아크릴아미드 함량이 적어도 20 w/w %, 바람직하게는 적어도 25 w/w %, 더 바람직하게는 적어도 30 w/w %, 보다 더 바람직하게는 적어도 35 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 42.5 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 45 w/w %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 47.5 w/w %, 가장 바람직하게는 적어도 50 w/w % 에 도달할 때까지 유지하는 단계 (여기서, w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄).
아크릴아미드 수용액의 아크릴산 농도를 감소시키는 방법으로서, 상기 아크릴아미드 수용액은 생체촉매를 사용하여 아크릴로니트릴이 아크릴아미드로 전환되는 방법에 의해 제조되고, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 하기 성분 (i) 내지 (iii) 을 반응기에 첨가하여 생물전환용 조성물을 수득하는 단계:
(i) 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 생체촉매;
(ii) 아크릴로니트릴;
(iii) 물; 및
(b) 단계 (a) 에서 수득한 조성물에 생물전환을 수행하는 단계;
(c) 추가의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 유지하는 단계 (여기서, w/w % 의 표시는 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄).
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물전환의 종료 시 조성물의 아크릴산 농도가 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1200 ppm 이하, 더 바람직하게는 1000 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 750 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 500 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하인 방법 (여기서 ppm 의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고, 각각 생물전환의 종료 시 조성물의 전체 중량을 나타냄).
아크릴아미드 수용액을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 하기 성분 (i) 내지 (iii) 을 반응기에 첨가하여 생물전환용 조성물을 수득하는 단계:
(i) 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 전환할 수 있는 생체촉매;
(ii) 아크릴로니트릴;
(iii) 물;
(b) 단계 (a) 에서 수득한 조성물에 생물전환을 수행하는 단계;
(c) 추가의 아크릴로니트릴을 첨가하고, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴의 함량을 0.3 w/w % 이상으로 유지하는 단계 (여기서 w/w % 의 표시는 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄); 및
(d) 생물전환의 종료 시 조성물의 아크릴산 농도가 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1200 ppm 이하, 더 바람직하게는 1000 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 750 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 500 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하인 조성물을 수득하는 단계 (여기서 ppm 의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고, 각각 생물전환의 종료 시 조성물의 전체 중량을 나타냄).
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체촉매, 아크릴로니트릴 및 물이 상기 방법의 단계 (a) 내지 (c) 동안 0.001 내지 0.5 w/w % 의 생체촉매, 22 내지 45 w/w % 의 아크릴로니트릴 및 나머지 100 w/w % 까지의 물; 바람직하게는 0.005 내지 0.2 w/w % 의 생체촉매, 26 내지 42 w/w % 의 아크릴로니트릴 및 나머지 100 w/w % 까지의 물; 더 바람직하게는 0.01 내지 0.1 w/w % 의 생체촉매, 30 내지 40 w/w % 의 아크릴로니트릴 및 나머지 100 w/w % 까지의 물; 가장 바람직하게는 0.015 내지 0.065 w/w % 의 생체촉매, 35 내지 39 w/w % 의 아크릴로니트릴 및 나머지 100 w/w % 까지의 물의 중량비로 첨가되는 방법 (각 경우 w/w % 의 표시는 단계 (a) 내지 (c) 동안 첨가된 생체촉매, 아크릴로니트릴 및 물의 조합된 중량의 전체 중량 (100 w/w %) 을 나타냄).
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 에서 생물전환이 5 ℃ 내지 40 ℃ 에서 10 분 내지 48 시간 동안, 바람직하게는 5 ℃ 내지 35 ℃ 에서 10 분 내지 48 시간 동안, 더 바람직하게는 15 ℃ 내지 30 ℃ 에서 10 분 내지 48 시간 동안, 가장 바람직하게는 20 ℃ 내지 28 ℃ 에서 10 분 내지 48 시간 동안 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 아크릴로니트릴의 함량이 단계 (b) 동안 6 w/w % 이하, 바람직하게는 5 w/w % 이하, 더 바람직하게는 4 w/w % 이하, 가장 바람직하게는 3 w/w % 이하로 유지되는 방법 (여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄).
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 0.3 w/w % 이상의 아크릴로니트릴 함량을 단계 (b) 동안 유지하는 것이 하기를 포함하는 방법:
(i) 아크릴로니트릴 함량을 제 1 범위에서 제 1 기간 동안 유지함;
(ii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위로 감소시킴; 및
(iii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위에서 제 2 기간 동안 유지함.
제 9 항에 있어서, 단계 (b) 가 하기를 포함하는 방법:
(i) 아크릴로니트릴 함량을 1.2 w/w % 내지 6 w/w % 의 제 1 범위에서 30 분 내지 4 시간의 제 1 기간 동안 유지함;
(ii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위로 감소시킴; 및
(iii) 아크릴로니트릴 함량을 0.3 w/w % 내지 1.2 w/w % 의 제 2 범위에서 30 분 내지 24 시간의 제 2 기간 동안 유지함,
여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄.
제 10 항에 있어서, 단계 (b) 가 하기를 포함하는 방법:
(i) 아크릴로니트릴 함량을 1.2 w/w % 내지 4 w/w % 의 제 1 범위에서 30 분 내지 3 시간의 제 1 기간 동안 유지함;
(ii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위로 감소시킴; 및
(iii) 아크릴로니트릴 함량을 0.5 w/w % 내지 1.1 w/w % 의 제 2 범위에서 30 분 내지 12 시간의 제 2 기간 동안 유지함,
여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄.
제 11 항에 있어서, 단계 (b) 가 하기를 포함하는 방법:
(i) 아크릴로니트릴 함량을 1.3 w/w % 내지 3 w/w % 의 제 1 범위에서 30 분 내지 2 시간의 제 1 기간 동안 유지함;
(ii) 아크릴로니트릴 함량을 제 2 범위로 감소시킴; 및
(iii) 아크릴로니트릴 함량을 0.6 w/w % 내지 1.0 w/w % 의 제 2 범위에서 1 시간 내지 8 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 5 시간의 제 2 기간 동안 유지함,
여기서 w/w % 의 표시는 각각 반응기 중의 조성물의 전체 중량을 나타냄.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 반-회분식 공정을 사용하여 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 동안 아크릴로니트릴 함량 및/또는 아크릴아미드 함량이 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR) 을 사용하여 측정되는 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체촉매가 효소 니트릴 히드라타아제를 인코딩하는 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체촉매가 로도코쿠스 (Rhodococcus), 아스페르길루스 (Aspergillus), 아시도보락스 (Acidovorax), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 바실루스 (Bacillus), 브라디리조비움 (Bradyrhizobium), 부르크홀데리아 (Burkholderia), 에스케리키아 (Escherichia), 지오바실루스 (Geobacillus), 클레브시엘라 (Klebsiella), 메소리조비움 (Mesorhizobium), 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 (Pantoea), 슈도모나스 (Pseudomonas), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 세라티아 (Serratia), 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 마이크로박테리움 (Microbacterium), 마이크로코쿠스 (Micrococcus), 노카르디아 (Nocardia), 슈도노카르디아 (Pseudonocardia), 트리코데르마 (Trichoderma), 미로테시움 (Myrothecium), 아우레오바시듐 (Aureobasidium), 칸디다 (Candida), 크립토코쿠스 (Cryptococcus), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 지오트리쿰 (Geotrichum), 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 로도토룰라 (Rhodotorula), 코모모나스 (Comomonas), 및 피로코쿠스 (Pyrococcus) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 16 항에 있어서, 생체촉매가 로도코쿠스 (Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 에스케리키아 (Escherichia) 및 지오바실루스 (Geobacillus) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체촉매가 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous), 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans), 로도코쿠스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis) , 로도코쿠스 에쿠이 (Rhodococcus equi), 로도코쿠스 러버 (Rhodococcus ruber), 로도코쿠스 오파쿠스 (Rhodococcus opacus), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) , 아시도보락스 아베나에 (Acidovorax avenae) , 아시도보락스 파실리스 (Acidovorax facilis), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) , 아그로박테리움 라디오박테르 (Agrobacterium radiobacter), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실루스 팔리두스 (Bacillus pallidus) , 바실루스 스미티 (Bacillus smithii), 바실루스 sp BR449, 브라디리조비움 올리고트로피쿰 (Bradyrhizobium oligotrophicum), 브라디리조비움 디아조에피시엔스 (Bradyrhizobium diazoefficiens), 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum), 부르크홀데리아 세노세파시아 (Burkholderia cenocepacia) , 부르크홀데리아 글라디올리 (Burkholderia gladioli), 대장균 (Escherichia coli), 지오바실루스 sp. RAPc8, 클레브시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia), 클레브시엘라 바리이콜라 (Klebsiella variicola), 메소리조비움 시세리 (Mesorhizobium ciceri), 메소리조비움 오포투니스툼 (Mesorhizobium opportunistum), 메소리조비움 sp F28, 모락셀라 (Moraxella), 판토에아 엔도피티카 (Pantoea endophytica), 판토에아 아글로메란스 (Pantoea agglomerans), 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) , 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 팔루스트리스 (Rhodopseudomonas palustris), 세라티아 리쿠에파시엔스 (Serratia liquefaciens), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 아미콜라토프시스 (Amycolatopsis), 아트로박테르 (Arthrobacter), 브레비박테리움 sp CH1, 브레비박테리움 sp CH2, 브레비박테리움 sp R312, 브레비박테리움 임페리알레 (Brevibacterium imperiale), 브레비박테리움 카세이 (Brevibacterium casei), 코리네박테리움 니트릴로필루스 (Corynebacterium nitrilophilus), 코리네박테리움 슈도디프테리티쿰 (Corynebacterium pseudodiphteriticum), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 호프마니 (Corynebacterium hoffmanii), 마이크로박테리움 임페리알레 (Microbacterium imperiale), 마이크로박테리움 스메그마티스 (Microbacterium smegmatis) , 마이크로코쿠스 루테우스 (Micrococcus luteus), 노카르디아 글로베룰라 (Nocardia globerula), 노카르디아 로도크로우스 (Nocardia rhodochrous), 노카르디아 sp 163, 슈도노카르디아 터모필라 (Pseudonocardia thermophila), 트리코데르마 (Trichoderma) , 미로테시움 베루카리아 (Myrothecium verrucaria), 아우레오바시듐 풀루란스 (Aureobasidium pullulans), 칸디다 파마타 (Candida famata), 칸디다 길리에르몬디 (Candida guilliermondii), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 크립토코쿠스 플라부스 (Cryptococcus flavus), 크립토코쿠스 sp UFMG- Y28 , 데바리오마이세스 한세이 (Debaryomyces hanseii), 지오트리쿰 칸디둠 (Geotrichum candidum), 지오트리쿰 sp JR1 , 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 클루이베로마이세스 터모톨레란스 (Kluyveromyces thermotolerans), 피키아 클루이베리 (Pichia kluyveri), 로도토룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis), 코모모나스 테스토스테로니 (Comomonas testoteroi), 피로코쿠스 아비시 (Pyrococcus abyssi), 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) , 및 피로코쿠스 호리코시 (Pyrococcus horikoshii) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 18 항에 있어서, 생체촉매가 로도코쿠스 로도크로우스 (Rhodococcus rhodochrous) 인 방법.
제 18 항에 있어서, 생체촉매가 로도코쿠스 피리디노보란스 (Rhodococcus pyridinovorans) 인 방법.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체촉매가 반응기에 첨가되기 전에 건조되는 방법.
제 21 항에 있어서, 생체촉매가 동결 건조, 분무 건조, 가열 건조, 진공 건조, 유동층 건조 및/또는 분무 과립화를 사용하여 건조되고, 분무 건조 및 동결 건조가 바람직한 방법.
제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 건조된 생체촉매가 반응기에 첨가되는 방법.
제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 건조된 생체촉매가 반응기에 첨가되기 전에 재구성되는 방법.
제 24 항에 있어서, 생체촉매가 수성 조성물 중에 현탁시킴으로써 재구성되는 방법.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 아크릴아미드 수용액.
특히 제 26 항에 있어서, 1500 ppm 이하, 바람직하게는 1000 ppm 이하, 더 바람직하게는 750 ppm 이하, 추가로 바람직하게는 500 ppm 이하, 보다 더 바람직하게는 300 ppm 이하, 더욱 더 바람직하게는 200 ppm 이하, 가장 바람직하게는 100 ppm 이하의 아크릴산 농도를 갖는 35 내지 65 w/w % 의 아크릴아미드를 함유하는 아크릴아미드 수용액 (여기서 w/w % 및 ppm 의 표시는 각각 용액의 전체 중량을 나타내고, ppm 은 각각 중량부에 관한 것임).
제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 아크릴아미드 함량 및/또는 아크릴산 농도가 HPLC 를 사용하여 측정되는 아크릴아미드 수용액.
제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 수용액의 아크릴아미드 중합에 의해 수득가능한 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체.
특히 제 29 항에 있어서, 60,000 ppm 이하, 바람직하게는 20,000 ppm 이하, 더 바람직하게는 10,000 ppm 이하, 가장 바람직하게는 2,000 ppm 이하의 아크릴산 함량을 갖는 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체 (여기서 ppm 의 표시는 각각 중량부에 관한 것이고, 각각 고체 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체의 전체 중량을 나타냄).
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 아크릴아미드 공중합체가 양이온성 폴리아크릴아미드인 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체.
제 29 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 아크릴산 함량이 NMR 분광법을 사용하여 측정되는 아크릴아미드 단독중합체 또는 공중합체.
해수 중 제 29 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항의 아크릴아미드 단독중합체 및/또는 공중합체의 용액.