JPS61162193A - 微生物によるアミド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、微生物の作用により、炭素数２〜６のニトリ
ル類を水和して対応するアミドを製造する方法に関する
。

従来の技術 近年、微生物、酵素またはそれらを固定化して種々の単
位化学反応や複合化学反応の触媒として利用しようとす
る動きが盛んになってきている。

ニトリル類を水和して相当するアミド類を生成させる酵
素はニトリラーゼ（またはニトリルヒドラターゼ）とし
て知られており−その代表的な反応例として・例えば・
特開昭５１−８６１βθ号公報にはパチル、ｘ、　（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）Ｍ＊　Ｐｒｅｖｏｔの意味でのバクテ
リジエーム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ　）Ｊ＠ｅミクａ
ｗッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属−およびブレビ
バクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細
菌が一特公昭５６−１７９１８号公報にはコリネバクテ
リウム（Ｃｏｒ−ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属および
ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　）属の細菌が、特公昭
５９−３７９５１号公報にはシェードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）属の細菌がニトリラーゼ活性を有し・
ニトリル類を水和して相当するアミド類を生成すること
伊特に、アクリロニトリルを水和してアクリルアミドを
生成せしめることが記載されている。

発明の概要 本発明者らは、ニトリラーゼ活性を有する微生物を求め
てさらに種々探索検討を続けた。その結果９０ドコツカ
ス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属・　アルスロノ（フタ
−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属およびミクロバク
テリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する
細菌が、ニトリラーゼ活性を有し、炭素数２〜６のニト
リル類を水和して相当するアミドを生成する能力を有す
ることを見出し本発明を完成した。

すなわち２本発明は伊ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃ　−
ｏｃｃｕｓ　）属、アＡ／　ｘ　ｅｔバクター（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属またはミクロパクテリウＡ　
（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、炭素数２
〜６のニトリルを水和して対応するアミドに変換する能
力を有する微生物の培養液、菌体、または菌体処理物を
、水性媒体中核ニトリルに作用せしめることを特徴とす
る微生物によるアミド類の製造法である。

本発明の方法は・アクリロニトリルよりアクリルアミド
を製造する方法において、特に有効である。

本発明で使用される微生物は、ロドコッカス属。

アルスロバクタ−属またはミクロバクテリウム践ｌＣ！
！＋するニトリ２−ゼ活性を有する細菌であり。

例工ばロドコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃ−ｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）　ＩＦＭ１５
５ｅ　ロド３１カスロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ　）　Ｉ　Ｆ　Ｍ１５３
、ｏトコツカｘ　ｓ　ｐ　、　ｓ　−６（Ｒｈｏｄｏｃ
ｏｃｃｕｓＳｐ、５−６）＃フルスロハクター　グロピ
ホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏ
ｒｍｉｓ　）　Ｉ　ＦＯ１２１３８−アルスロバクタ−
オウレセｙ　ｘ　（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｕｒｅ
ｓｃｅｎｓ　）　Ｉ　ＡＭ　１２３４０およびミクロバ
クテリウム　フヲパＡ　（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｆｌｏｖｕｍ　）　Ｉ　ＡＭ　１６４２などをあげ
ることができる。

これらのうち、ＩＦＭ、ＩＦＯおよびＩＡＭの記号を付
したものは公知の微生物であり・各々・千葉大学生物活
性研究所（ＩＦＭ）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）お
よび東京大学応用微生物研究所（ＩＡＭ）の菌株保存機
関（ＪＦＣＣ）を通じて容易に入手することができる。

また、ロドコッカスｅｓｐ＊ｓ６は本発明者らが自然界
より分離した・特にニトリラーゼ活性の高い菌株であり
微工研条寄第６８７号として寄託されており−その菌学
的性質は以下の通りである。

ロドコッカス　ｓｐ、ｓ−６菌株 （ａ）形態 （１）小環状０．５〜０．８　ｓ　Ｘ　１〜５５（２）
培養初期に長稈状を呈し、不規則な分校が認められ、後
に球状ないし短稈状に断裂する。

（多形性） （３）運動性なし く４）　　芽胞の形成なし く５）　　ダラム染色　十 （６）抗酸性　− 中）　各培地における生育状態（３０℃）（１）肉汁寒
天平板培養において、コロニーは円形、不規則１表面平
滑を淡ピンク色 （２）肉汁寒天斜面培養において・生育良好・断面台状
で光沢なし、淡ピンク色 （３）　　肉汁液体培養において菌膜を形成し旺盛に生
育・液は透明で生育にしたがって沈でんする。

（Ｃ）　　生化学的性状 （１）　　硝酸塩還元　十 （２）尿素分解　十 （３）　　インドール産生　− （４）デンプン分解　− （５）ゼラチン分解　− （６）　　セルロース分解　− （７）オキシダーゼ　− （８）　　カメラーゼ　　＋ （９）遊離酸素の要求性　十 αＯ嫌気下での生育　− αυ　Ｏ／Ｆテスト　Ｏ Ｃ２３７℃での生育　十 ＜１３　　ビタミン要求性　− （Ｉ４　　グルコースよりガスの産生　−Ｃ９グルコー
スより酸の産生　　十 （ｄ）　　細胞の化学分析 （１）　　メソ−ジアミノピメリン酸、アジビノースー
ガラクトースを含む。

ＣＢ、Ｂｅｃｋｅｒ　ら　：Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｍｆｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　１２　４２１（１９６４）　＊
　Ｈ，Ａ　Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒら：Ｔｈｅ　Ａｃｔ
ｉｎｏ　−ｍｙｃｅｔａｌｅｓ　３１１　（１９７０）
）（２）主なる脂肪酸としてＣ１６（ｎ、　Ｆｓ　）−
Ｃｔａ（Ｆｘ）・Ｃ，、（１０−ＣＨ，）の脂肪酸を含
む。

（Ｋ、Ｋｏｍａｇａｔａら：　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌｓ　ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　３３　（２）　１８８　（
１９８３））（３）　　ミコール酸タイプとしてＣＳＸ
〜ｃ４ｅのミコール酸を含む ＣＭ、　Ｇｏｏｄｆｅｌ　ｌｏｗ　：　Ｍｌｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃ１ａｓｓ　ｉ　−ｆｉｃａｔｉｏ
ｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｊｆｉｃａｔｉｏｎ（１９８０
））以上の自学的性質をパージニーの分類書（Ｂｅ−ｒ
ｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版（１９７４
）、シ為し−ゲルらの分類書ザプロカリオーテｘ　■（
Ｔｈｅ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ　Ｖｏｌ、［（１９８
１））および微生物の化学分類に関する上記（ｄ）記載
の諸文献などにより調べると、Ｓ−６菌株はダラム（＋
・胞子形成（→・好気性の桿菌で多形性が認められ・抗
酸性Ｈである。また１本面は菌体内にメソ−ジアミノピ
メリン酸、アラビノース、ガラクトースを含み、脂肪酸
タイプとしてＣ８・（ｎ−Ｆ＋）・Ｃ＋ｓ（Ｆθ・Ｃｎ
（１０−ＣＨ，）−ミコール酸タイプとしてＣＳＺ〜Ｃ
ａＳのミコール酸を含む。

以上の菌学的性質より本菌株をロドコッカス（Ｒｈｏｄ
ｏｃｏｃｃｕｓ　）属に属する細菌と同定した。

本発明に使用されるこれら細菌の培養にはグルコース、
グリセロール・マルトースなどの炭素源・硫酸アンそニ
ウム、塩化アンモニウムなどの窒素源、酵母エキス、ペ
プトン−肉エキス−大豆タンパク加水分解物、＝−ンス
ティープリカー（Ｃ８Ｌ）などの有機栄養源、およびリ
ン酸塩・マグネシクム、カリウム・亜鉛、鉄、Ｙンガン
などの無機栄養源などを適宜含有する通常の培地が用い
られる。培養のＰＨは６〜８．温度は２０〜３５℃。

好ましくは２５〜３０℃で１〜３日間通気攪拌下に行わ
れる。

本発明の方法を実施するに当っては・例えば前記した細
菌のうちの一種を選び、これを前述の方法で２〜各５培
養した培養液、培養液から分離した菌体、または菌体処
理物（粗酵素ｐ固定化菌体なと）を水、緩衝液または生
理食塩水ＫＭ濁し−これにニトリル化合物を共存させれ
ばよい。

本発明において・ニトリル化合物に前記菌体類を作用さ
せる条件としては、Ｗｉ体使用ｆｉｏ、０１〜１０重量
％、ニトリル化合物０．１〜１０重ｔチを含む水性懸濁
液を温度氷点〜３０℃、好ましくは氷点〜１５℃、ＰＨ
６〜１０．好ましくはＰＨ７〜９で０．５〜１０時間反
応させればよい。なお・反応に際して一基質であるニト
リル化合物はいずれも生物毒性の強い化合物であり９本
酵素反応の阻害作用が大きい。従りて、系内の基質濃度
は好ましくは５チ以下・より好ましくは２％以下になる
ようコントロールしつつ逐次添加する。また９反応中の
ＰＨは上記範囲からはずれると・生成蓄積したアミドが
さらに加水分解を受けたり・菌体酵素の安定性低下をも
たらすので苛性アルカリ（例；　ＮａＯＨ、ＫＯＨ）を
逐次添加するか、系内に予め緩衝液を加える等によりＰ
Ｈ７〜９にコントロールすることが好ましい。反応条件
を適正に設定してやれば＊１−１ｒ転換率１００チ、副
生物のない状態でニトリル化合物から対応するアミドを
高濃度に生成蓄積させることができる。

反応液からのアミドの採取は、一般に知られている任意
の方法で行なうことができる。すなわち。

例えば５反応液から菌体を遠心分離等によって除き、活
性炭・イオン交換樹脂等による処理により着色物質・不
純物等を除去した後、減圧濃縮して目的のアミド−例え
ば、アクリルアミドを得ることができる。

次に９本発明を実施例により説明する。なお。

下記実施例中の部およびチは重量に関する。また・各種
ニトリルおよび対応するアミドはガスクロマトグラフィ
ーで、対応する有機酸は高速液体クロマトグラフィーに
て分析定量した。

実施例１ グルコース１チ、ペフトン０．５％−酵母エキｘ０．３
　％＊　肉ｚ−＋ｘ　０．３　％カら７’ｃ　６培地（
ＰＨ７，２）を用い、３０℃、４８時間好気的に培養し
て得たロドコッカスｓｐ、ｓ−６株菌体を遠心分離し、
０．０５Ｍ　１７ノ酸バツフアー（ＰＨ７，７）にて洗
浄、遠心分離をくり返し行ってｓ−６株の洗浄菌体（含
水率ｉ１’ｊＯＬ）を調製した。

この洗浄菌体０．５部、０．０５ＭＩＪン酸バッファー
（ＰＨ８，５）　８４．５部を混合し、攪拌下ＫＯ〜３
℃で１５部のアクリロニトリルを反応系内のアクリロニ
トリル濃度が２９ｇ以上にならないよ５にコントロール
しつつ間歇的に添加して水和反応を行なりた。アクリロ
ニトリルの添加は約３時間で終了するが９反応を完結さ
せるためさらに数時間攪拌を続けた。反応終了後、菌体
を遠心分離により除去し、澄明液を得た。このものは２
０％のアクリルアミドを含み、アクリルアミドの収率は
９９．９チ以上であり、未反応のアクリロニトリルは全
く検出されず、副生アクリル酸は０．１％以下（対アク
リルアミド）であった。

この澄明液を５０℃以下で水を留去振縮し結晶を析出さ
せ９次いでこの結晶をメタノールから再結して無色板状
の結晶をえた。このものの融点。

元素分析、およびＩＫから９本品はアクリルアミドと同
定された。

実施例２ 実施例１と同様に培養して得たｓ−５菌株の洗浄菌体を
用い・下記の条件で種々のニトリルＪｉ［対する反応性
を検討した。

ａ０反応条件 ニトリル化合物　　　　２．５チ リン酸カリクムバッファー　　ＰＨ７，７１０，０５Ｍ
菌　　体　　　　　　　５ｍｙ（乾燥菌体として）温　
　　度　　　　　　　　　　　１０℃反応時間　　　　
　　　１０ｍ１ｎ 反応液量　　　　　　　１０ｍｊ ｂ０反応結果 アセトニトリル　　　　　　３０ プロピオニトリル　　　　　１０２ アクリロニトリル　　　　１００ メタクリロニトリル　　　１２３ ブチロニトリル　　　　　　５１ バレロニトリル　　　　　　ｌに 翫チノニトリル　　　　　１６ 養アクリロニトリルに対する活性を１００とした時の相
対値で表した。

実施例３ グリセロールｌチ、　ＫＨ，ＰＯ４０，１％、　Ｍｇ５
Ｏ，・７ＨｔＯＯ，０５％、　Ｆｅ５０．−７Ｈ！ＯＯ
，００１％、大豆タンパク加水分解物０．５９ｇ、酵母
エキス０．１％（ＰＨ７，５）からなる培地を殺菌後、
無菌インブチロニトリル０．５％を加えたもの１００　
ｍｌを５００　ｍ／三角フラスコに調製し−これに予め
実施例１の培地で４８ｈｒ前培養しておいた下記のタイ
プカルチ瓢アー菌の培養液１　ｍｊを添加し・２５℃、
４８ｈｒ振盪培養した。培養終了後遠心分離により収面
し０．０５Ｍリン酸バッファー（ＰＨ７，７）にて洗浄
。

遠心分離をくり返して洗浄菌体を得た。得られた各洗浄
菌体につき・アクリロニトリルからアクリルアミドの生
成活性を実施例２記載の方法に準じて測定した。得られ
た結果は表−１に示す通りであった。

表−１

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ア
   ルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属または
   ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
   属に属し、炭素数２〜６のニトリルを水和して対応する
   アミドに変換する能力を有する微生物の培養液、菌体ま
   たは菌体処理物を、水性媒体中該ニトリルに作用せしめ
   ることを特徴とする微生物によるアミド類の製造法。
2. （２）温度が氷点〜３０℃の水性媒体中で作用せしめる
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。
3. （３）温度が氷点〜１５℃の水性媒体中で作用せしめる
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。
4. （４）ＰＨが６〜１０の水性媒体中で作用せしめる特許
   請求の範囲第１〜３項記載の製造法。
5. （５）ＰＨが７〜９の水性媒体中で作用せしめる特許請
   求の範囲第１〜３項記載の製造法。
6. （６）水性媒体中にニトリルを連続的または間歇的に添
   加する特許請求の範囲第１〜５項記載の製造法。
7. （７）ニトリルがアクリロニトリルであり、微生物がロ
   ドコッカスｓｐ．ｓ−６株（微工研条寄第６８７号）で
   ある特許請求の範囲第１〜６項記載の製造法。