KR20170072366A - 재활성화를 예방하기 위한 결핵 백신 - Google Patents

재활성화를 예방하기 위한 결핵 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 결핵 복합체 미생물(결핵균, M. 보비스, M. 아프리카눔)의 종에 의하여 야기되는 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방하기 위하여, 모두가 상호의존적으로 분비가 요구되고 발병에 필수적인 것으로 알려진 ESX-1 분비 시스템에 모두 속하는 ESAT6, CFP10 및 EspA. ESAT6, CFP10 및 EspA과 같이 항시 발현되는 항원들을 목표로 함으로써, 잠복 감염된 대상에 투약되는 백신에 의하여 결핵 복합체(결핵균, M. 보비스, M. 아프리카눔)의 종에 의하여 야기되는 감염을 치료하는 것에 대한 것이다. 이들 분비된 항원들은 박테리아 전염(dessemination) 및 세포막 용균에 결정적이다. 예컨대, Ag85의 발현이 감염 후 곧 하향조절되는 것에 반하여, ESAT6, CFP10 및 EspA은 또한 질병의 서로 다른 단계에서 항시 발현되는 항원들이다. 놀랍게도 면역원성 구조적으로 발현되는 항원들은 노출 후 백신으로서 투약되는 경우 감염 잠복을 유지함으로써 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방한다.

Description

재활성화를 예방하기 위한 결핵 백신{A TUBERCULOSIS TB VACCINE TO PREVENT REACTIVATION}
본 발명은 ESAT6, CFP10 및 ESX-1 분비 시스템 결핵 유래의 다른 항원들과 같이 본질적으로 발현된 항원들을 타겟으로 함으로써, 결핵 복합체 미생물들(결핵균(Mycobacterium tuberculosis), M.보비스(M. bovis), M.아프리카눔(M. africanum))의 종에 의하여 야기되는 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방하기 위하여 잠복감염된 대상에게 투약할 수 있는 백신을 개시한다.
WHO에 의하면, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis))이 야기하는 인간 결핵은 연간 약 3백만명의 사망의 원인이 되는 심각한 전세계적인 건강상의 문제이다. 1960년대 및 1970년대 동안 신종 결핵(TB)의 전세계적인 발병률은 감소하였으나, 부분적으로는 AIDS의 출현 및 다제내성 결핵 균주의 발생 때문에, 최근 수십년간 이러한 경향은 현저히 변하였다.
결핵균 복합체의 생물들은 다양한 질병을 일으킬 수 있으나 가장 흔한 침범 경로는 박테리아의 흡입에 의한 것이다. 이는 폐 감염을 야기하는데, 폐 감염은 결국에는 신체의 다른 부위로 퍼질 수 있다. 보통은, 이러한 감염은 면역 시스템에 의하여 성장이 제한되며, 이로써 감염된 대상의 대부분은 기침 및 열 외 증상은 거의 보이지 않고, 기침 및 열은 결국은 완화된다. 대략 30%의 사람들은 감염을 유지하는 것이 불가능하며, 그들은 원발성 질병(primary disease)으로 발전하는데, 많은 경우 이는 결국은 치명적인 것으로 판명된다. 그러나 감염을 명백히 조절하는 이러한 사람들조차도 대개는 그들의 남은 삶 동안 감염된 채로 유지된다. 확실히 수년 간 또는 심지어 수십년 간 건강한 사람들이 결핵을 갑자기 발전시키는데, 이는 수년 전에 그들이 감염되었던 동일한 생물에 의하여 야기된 것으로 판명된다. 결핵균 복합체(TB complex)의 M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis) 및 다른 생물들은 마이코박테리아(mycobacteria)가 면역 반응에 침범하여 불응 비복제 또는 느린 속도로 복제가 일어나는 단계(slowly-replicating stage)에서 오랜 기간 살 수 있다는 점에서 특이하다. 이는 잠복 결핵이라 불리며, 오늘날 세계 인구의 대략 1/3에게 영향을 끼치는 것으로 추정되는, 매우 심각한 전세계적인 건강상의 문제이다(Anon., 2001).
현재 임상 용도로 이용 가능한 유일한 백신은 BCG인데, 이는 그 효능에 대하여 아직 논쟁의 문제가 남아 있다. 비록 BCG가 1차 감염의 동물 모델에서 일관되게 잘 기능한다고 하더라도, 그것은 결핵의 유행을 통제하는데에는 명백하게 실패하였다. 마찬가지로, BCG 백신 접종은 소아 결핵(이는 1차 감염때문이다)으로부터는 보호하는 것으로 보이나, 성인 질병(이는 종종 유년기에 얻은 잠복 감염의 재활성화이다)에 대하여는 보호를 하지 못하거나 거의 보호를 제공하지 못한다. 또한 현재 마이코박테리아에 민감하거나(sensitize) 또는 잠복감염된 대상에게 백신 접종하는 것은 효과가 없는 것으로 보인다.
M. 튜버쿨로시스 감염의 진행은 본질적으로 도 1에서 도시하는대로 3 단계로 이루어진다. 급성기 동안, 면역 반응이 증가하여 감염을 통제할 수 있고, 그 결과 박테리아의 부담이 정점에 이르고 감소하기 시작하는 때까지 박테리아는 기관 내에서 증가한다. 그 이후, 박테리아 부담이 낮은 수준에서 안정적으로 유지되는 잠복기가 확립된다. 이 단계에서, M. 튜버쿨로시스가 활동적인 증식으로부터 휴면(dormancy)으로 가서, 본질적으로 비복제가 되며 육아종(granuloma) 내에 남아 있게 된다는 것이 최근의 생각이었다.
그러나, 최근, 지속적으로 낮은 박테리아 수를 보이는 단계에서조차 박테리아 군 중 적어도 일부는 활동성 대사 상태에 있는 것이 명확하여졌다(Talaat AM et al. 2007). 그러므로 이들 박테리아는 살아남으며, 활동성 대사를 유지하고, 강한 면역 반응에도 불구하고 복제한다. 그러므로 감염된 대상에서는 비복제(non-replicating) 박테리아(이들이 세포 내에 위치하기 면역 시스템이 감지하는 것을 매우 어려울 수 있다) 및 면역 숙주 내에서 마주치는 적대적인 환경에 적응하기 위한 시도인, 활동적이지만 변화된 발현 프로필(profile)을 갖는 천천히 복제되는 박테리아 간에 균형이 있다. 종래의 예방 백신들을 잠복 감염된 실험 동물들에 가할 때 활성이 부족하다는 점이 예시하듯, 이 단계에 있는 박테리아는 현재 결핵 분야에서 개발 중인 대부분의 예방 백신이 전형적으로 목표로 하는 것은 아니다(Turner 2000).
어떤 경우, 균형은 병원체 쪽으로 기울어져, 박테리아가 급격히 복제를 시작하고 감염된 대상 내 박테리아 수가 증가하는 재활성 단계로 감염이 진행된다. 매우 강한 면역 압력 하 감염 잠복된 대상 내에서 복제하는 박테리아는 본 발명의 백신 접종 전략의 목표이다. 예방 백신들을 잠복 감염된 실험 동물들에 가할 때 활성이 부족하다는 점이 예시하듯, 이러한 잠복 감염 단계에 있는 박테리아는 현재 결핵 분야에서 개발 중인 대부분의 예방 백신이 전형적으로 목표로 하는 것은 아니다(Turner 등 2000). 강한 숙주 면역 반응이 주요한 예방 백신 항원 Ag85 및 PstS과 같은 많은 항원들의 하향 조절에 이르게 된다는 것이 현재 알려져 있는바, 이는 놀라운 것은 아니다(Rogerson, BJ et al 2006). Ag85B의 경우, 감염 이후 Ag85B 발현에는 초기 과도 증가가 있으나, 감염 2주 후에 이미 박테리아 Ag85B 발현 수준은 피크기 동안 M.tb의 CFU 당 0.3 전사물(transcript)에서 CFU 당 0.02 전사물로 떨어지며, 이러한 낮은 수준은 적어도 감염 후 100일까지 유지된다. 그러므로 감염 2주 후 어느 시점에서든 박테리아의 2% 미만이 활동적으로 Ag85B를 발현시킨다(동일 책). Ag85B의 낮은 발현은 감염 후 3주 또는 그 이후 폐에서 Ag85B에 대한 반응에서 IFN-g를 만들 수 있는 T 세포의 수가 급격히 떨어지는 것에 의하여 지지된다.
이에 반하여, 어떤 항원들은 감염의 다른 단계들에서 계속해서 더욱 안정적으로(항시) 발현되는데, 그 예가 ESAT6이다. 초기 감염 단계 이후 ESAT-6 발현 수준은 M. 튜버쿨로시스 CFU 당 0.8 전사물로 안정된다. 이것은 Ag85B보다 더욱 높은 전사 수준이며, 이러한 수준은 감염 후 적어도 100일까지 안정적으로 유지된다(Rogerson, BJ 등 2006). 또한 전사 데이터는 감염 부위에서 감염의 뒷 단계에서의 ESAT-6의 강한 T 세포 인식을 보이는 면역 데이터에 의하여 뒷받침된다(동일 책). 이러한 구조적인 발현 패턴은 이들 분자들이 병원체의 결정적인 중요성인 본질적인 기능, 즉 병원체가 면역 숙주 내에서 생존하기 위하여 항시 발현될 필요가 있는 유전자들에 의존하는 기능을 달성한다는 것을 보여주는 중요한 특징이다. 이들 분자들은 본 발명의 기초이며, 잠복 감염된 대상들에 투약되는 백신에서 특히 중요한 항원들인데, 이는 이들이 박테리아 라이프 스타일의 모든 단계를 목표로 하고, 그러므로 활성을 위하여 가장 폭넓은 가능한 성분(basis)를 갖기 때문이다. 이는 비복제 지속기(persistence) 동안 마이코박테리아에 의하여 상향조절되는 항원을 확인하는데 주목해온 최근의 생각과는 다른 것이다(Andersen, P. 2007, WO02048391, WO04006952, Lin MYand Ottenhoff TH 2008; Leyten EM. 등 2006). 비록 이러한 항원들이 비복제 지속기 동안 상향조절되기는 하나, 비복제 박테리아로부터 이용 가능한 양은 인지(detection) 또는 보호 면역 작동체(effector) 기능을 유발하기 위한 합리적인 역치 이하인바, 그것들이 항상 면역 인식에 이용가능한 것은 아니다.
반면, ESX-1 분비 시스템 유래의 몇몇 단백질들은 높은 면역원성을 보였으며 높은 수준으로 발현되었다. ESX-1은 몇몇 병원성 마이코박테리아에서 보존되며, 결핵균(tubercle bacilli)의 발병력에 관여한다. ESAT-6, CFP10 및 EspA의 분비에 있어 개개의 ESX-1 단백질의 기여는 잘 보고되어 왔으며((Pym AS 등 2003; Guinn Kl 등, 2004;Stanley, SA 등. 2003; Brodin, P. 등. 2006; MacGurn JA 등. 2005; Raghavan, S. 등. 2008), 작동체 분자들의 기능은 박테리아가 퍼지는 것과 포식소체(phagosome)를 피하는 멤브레인 용균인 것으로 나타났다(Gao LY 등 2004; Smith J. 등 2008).
재활성화로 이끄는 인자들 및 잠복 감염을 통제하는 면역 반응의 완전한 특성들은 대부분 알려져 있지 않다. 그러나 책임있는 우세한 세포 타입의 변화에 대하여는 몇 가지 증거가 있다. 급성기 동안 감염의 조절에 CD4 T 세포가 필수적이면서도 충분한 반면, 연구는 잠복기에는 CD8 T 세포 반응이 더 중요하다는 것을 제안한다(van Pinxteren LA 등 2000).
당업자가 쉽게 인정하듯이, 유전자의 발현은 그것을 좋은 백신 후보로 만드는데 충분하지 않다. 한 단백질이 M. 튜버쿨로시스의 잠복 감염 동안 면역 시스템에 의하여 인식되는지 여부를 확인하는 유일한 방법은 상기 단백질을 생산하고, 그것을 여기에 기재한 적절한 검사로 시험하는 것이다. 이 점에 있어서, 우리 그룹은 ESAT-6 (Early Secretory Antigen Target-6)와 같이, 마이코박테리아에 의하여 강하게 발현되는 항원들이 감염의 모든 단계의 대상, 사실 특히 잠복 감염된 대상에서 인식된다고 주장한다(Boesen , Ravn, Doherty 2002).
그러나 자연적인 감염 동안 준비되는 ESAT-6 특이적 T 세포들은, 비록 그것들이 많은 수로 존재한다고 하더라도, 감염성 질환에 대한 방어(protective) T 세포로서 낮은 활성 및 매우 제한된 수명을 가지며, 궁극적으로 분화되는 T 세포들인 거의 독점적인 소위 작동체(effector) 발현형이다(Seder R, et al. 2008). 이는 결핵 재활성화로부터 보호하기 위해 본 연구에서 주장되는 백신에 의하여 촉진되는 고품질, 소위 다기능성(polyfunctional) T 세포와는 현저하게 다른 것이다.
그것은 노출 후(post exposure) 백신으로서 유용한 고발현 면역원성 단백질들과는 거리가 먼데, 이는 다수가 과민 반응을 일으켜 상황을 악화시키기 때문이다. 이것은 Kock의 오리지널 투베르쿨린(tuberculin) 백신의 의학 시험에서 명백히 증명된 것이다. 상기 백신은 피부 및 폐 결핵을 포함하는 다양한 형태의 질병으로부터 고통받는 환자들에게 노출 후 백신으로서 처치되었다. 이 시험은 완벽한 실패였으며 기록된 환자들 중 몇몇은 심각한 과민 반응때문에 사망하였다((Guttstadt A. 1891). 1차 감염 동안 발현하는 것으로 알려지고 백신으로서 시험된 수백 개의 항원들 중 6개 미만이 중요한 후보로 증명되었다. 지금까지 오직 하나의 항원이 노출 후 백신으로서 잠재성을 갖는 것으로 나타났다(Lowrie, 1999). 그러나 이 백신은 지금까지 인간에 사용하기에는 승인되지 않은 실험 기술인 DNA 백신으로서 처리할 때 오직 작동했다. 게다가 이 기술은 이 프로토콜을 이용하는 백신 접종이 비특이적 보호 또는 심지어 질병 악화를 유도한다고 주장하는 다른 그룹들과 논쟁이 있는 것으로 알려졌다(Turner, 2000).
그러므로 질병의 재활성화로부터 감염된 대상을 보호하기 위한, 효과적인 노출 후 백신 접종 전략이 강하게 요구된다.
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본 발명은 결핵 복합체 미생물들(결핵균(Mycobacterium tuberculosis), M.보비스(M.bovis), M.아프리카눔(M. africanum))의 종에 의하여 야기되는 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방하기 위하여 잠복감염된 대상에게 투약할 수 있는 백신을 개시한다.
본 발명은 ESAT6, CFP10 및 ESX-1 분비 시스템 결핵 유래의 다른 항원들과 같이 본질적으로 발현된 항원들을 타겟으로 함으로써, 결핵 복합체 미생물들(결핵균(Mycobacterium tuberculosis), M.보비스(M. bovis), M.아프리카눔(M. africanum))의 종에 의하여 야기되는 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방하기 위하여 잠복감염된 대상에게 투약할 수 있는 백신을 개시한다.
본 발명은 결핵 복합체 미생물(결핵균, M. 보비스, M. 아프리카눔)의 종에 의하여 야기되는 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방하기 위하여, 모두가 상호의존적으로 분비가 요구되고 발병에 필수적인 것으로 알려진 ESX-1 분비 시스템에 모두 속하는 ESAT6, CFP10 및 EspA. ESAT6, CFP10 및 EspA과 같이 항시 발현되는 항원들을 목표로 함으로써, 잠복 감염된 대상에 투약되는 백신에 의하여 결핵 복합체(결핵균, M. 보비스, M. 아프리카눔)의 종에 의하여 야기되는 감염을 치료하는 것에 대한 것이다. 이들 분비된 항원들은 박테리아 전염(dessemination) 및 세포막 용균에 결정적이다. 예컨대, Ag85의 발현이 감염 후 곧 하향조절되는 것에 반하여, ESAT6, CFP10 및 EspA은 또한 질병의 서로 다른 단계에서 항시 발현되는 항원들이다. 놀랍게도 면역원성 항시 발현되는 항원들은 노출 후 백신으로서 투약되는 경우 감염 잠복을 유지함으로써 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방한다.
도 1: M. 튜버쿨로시스 감염 과정은 본질적으로 3 기(phase)를 통하여 진행된다.
도 2: 재활성화를 예방하기 위한 노출후 백신 접종의 모델.
도 3: TB 백신 접종 모델.
노출후 백신의 시험을 위하여 SSI에서 사용한 모델의 도식적인 개요. 마우스들은 에어로졸 경로에 의하여 병독성 M. tb로 감염된다. 감염 후 6주부터 12주까지 마우스들은 잠복 TB 상태를 확립시키기 위하여 항생제로 처리된다. 마우스들은 3 주 간격으로 2에서 3회 백신 접종되는데, 이는 노출후 백신 후보들로 감염된 지 10주 후에 시작한다. 이 마우스들은 질병을 재활성화시키도록 시간이 허용되고, 대략 20주 후, 백신의 보호 효험(protective efficacy)을 평가하기 위하여 폐들을 박테리아 수를 평가한다.
도 4: Ag85가 아닌 ESAT6에 의하여 보호가 유도되는 노출후 백신
마우스들은 실시예 1의 도식적인 개요에 따라 감염되고, 치료되며 백신접종되었다. 마우스들은 감염 후 30-40주 사이에 희생시켰으며, 이 시점에서 폐들이 박테리아 부하(load)가 평가되거나(도 A, C-E), ESAT6에 대한 감염 전반에 걸쳐, 박테리아 부하가 몇몇 시점에서 결정된 도 4B에 기재되어 있듯이 평가되었다. (A 및 B) 대조군 동물에 비교한 ESAT6 백신 접종된 박테리아 부하. (C) 대조군 동물에 비교한 Ag85B 백신 접종된 박테리아 부하. (D) Ag85B 백신접종된 군 및 대조군 동물에 모두 비교한 백신접종된 ESAT-6 펩믹스(pepmix)(전장 ESAT6 서열을 커버하는 오버랩핑 펩타이드들의 풀(pool))의 박테리아 부하. (E) 재활성화에 대한 보호로, 그 다음에 Ag85B-ESAT-6 (H1)의 노출후 백신접종을 하는데, 이는 비-백신접종된 대조군 마우스에 비교하여 백신접종된 것이다. 도 4A, C-E의 모든 데이터는 평균이 함께 그려진, 각각 대상 동물을 나타내는 도트 플롯(dot plots)으로 개시되며, 반면 도 4B는 평균±평균의 표준 에러(standard error of the mean (SEM))로 개시되며, 6 대상 동물들을 나타낸다(B).모든 통계적인 분석은 짝지워지지 않은 t-테스트(도 A-C 및 E) 또는 p<0.05가 중요하게 고려되는 Turkey의 다중 비교 시험(Tukey's multiple comparison test)(도 D)을 이용하여 수행되었다.
도 5: ESAT-6 노출후 백신 접종은 다기능성(polyfunctional) T 세포를 유도한다.
비-백신접종되거나 또는 ESAT-6 백신접종된 동물의 감염된 폐의 세포들이 항-CD4, -CD8, -IFN-γ, -TNF-α 및 -IL-2로 염색되기(staining) 전에 ESAT-6로 인 비트로에서 자극되었다. (A 및 B)사이토카인 프로파일들은 CD4 T 세포들을 IFN-γ 양성(+) 또는 IFN-γ 음성(-)세포들로 먼저 나눔으로써 결정되었다. IFN-γ+ 및 IFN-γ- 세포들은 모두 TNF-α 및 IL-2의 생산과 관련하여 분석되었다. 원 그래프(A 및 B)는 사이토카인 생산 프로파일에 따라 색깔로 부호처리되고, 주어진 사이토카인 생산 프로파일에 양성인 CD4+ T 세포 반응(ESAT-6 특이적 CD4 T 세포 밖으로)의 부분들(fractions)을 요약하였다. (C) 사이토카인들의 모든 가능한 조합이 막대 그래프의 x축 상에 나타나 있으며, 사이토카인들의 임의의 조합을 발현하는 ESAT-6 백신접종된 마우스(검은 막대) 또는 비-백신접종된 마우스((회색 막대) 내 ESAT-6 특이적 CD4+ T 세포들의 퍼센트는 각각 면역화 그룹으로 주어졌다. (D) 잠복 감염된 마우스들은 ESAT-6로 2 회 백신 면역되고, 마지막 백신 면역 후 20주에, 보호 효험을 결정하기 위하여 폐들이 박테리아 수를 위하여 평가되었다(**p<0.01, One way ANOVA Tukey's 다중 비교 시험).
도 6: 모든 노출후 실험의 풀 분석(pooled analysis)
ESAT6, Rv3871 , Ag85B, Rv3905, Rv3445, RvO569 또는 Rv2031c(도 A), Ag85B-ESAT6 (H1) 또는 Ag85B-ESAT6-Rv2660 (H56)(도 B)가 노출후 백신 접종에 사용된 대상 실험을 위하여, 항원 보강제(adjuvant) 대조군의 박테리아 부하의 중앙값(median)이, 전술한 항원 중 하나로 백신 면역된 백신 면역 군의 각각의 대상 마우스의 박테리아 부하와 비교되었다. 도 A 및 B에서, 각각의 도트는 보호 수준, 즉, 항원 보강제 대조군에 비교하여 백신 접종에 의하여 부여된 △Log10 CFU에 해당하고, 몇몇의 비의존적 실험으로 구성된다. (A) 단일 항원 ESAT6, Rv3871 , Ag85B, Rv3905, Rv3445, RvO569 또는 Rv2031c를 위하거나 (B) 또는 ESAT 단독에 비교한 하이브리드 항원 H1 및 H56을 위한 Log10 보호. Kruskall Wallis 다중 비교 시험을 이용하여 서로 다른 군들 간의 중앙값 비교를 위하여 통계적 분석을 적용하였다. p<0.05가 중요하게 고려되었다.
도 7: ESAT6 및 대조군 동물에 비교한 Rv3871로 노출후 백신 접종의 효과.
마우스들은 감염되고, 치료되고, 감염 후 10, 13 및 18 주에 백신 면역되었다. 감염 후 36주에 마우스들을 끝내고, 백신 면역된 마우스 및 비-백신 면역된 식염수 대조군 마우스 양쪽으로부터의 폐 림프구들이, Rv3871(도 7A) 또는 ESAT6(도 7B)로 인 비트로로 재자극되었다. ELISA 에 의하여 평가된 IFN-γ 방출 및 샘플들이 3회에 걸쳐 수행되었다. 데이터들은 평균±SEM으로 나타내었다. 백신들에 의하여 부여된 보호 효험은, 전체 폐-균질현탁액(homogenate)으로부터 배양된 폐의 박테리아를 셈으로써, 결정되었다(n=16-18). 도트 플롯으로 나타낸 데이터로, 각각의 도트는 대상 동물을 가리키며, 중앙값으로 나타낸다(빨간 선).
본 발명은 잠복 감염된 대상에 노출 후(post-exposure) 투여되며, M. 튜버쿨로시스의 감염 동안 항시 발현되는 항원 또는 상기 항원을 코드하는 핵산을 포함하는 결핵 재활성화를 예방하는 백신 또는 면역원성 조성물을 개시한다.
바람직하게는 상기 조성물은 ESX-1 분비 시스템에 속하며 항시 발현되는 항원들인 ESAT6 (서열번호 1) , CFP10 (서열번호 2), EspA (서열번호 3), Rv3614c (서열번호 4), Rv3615c (서열번호 5), EspR (서열번호 6), Rv3868 (서열번호 7) Rv3869 (서열번호 8), Rv3870 (서열번호 9), Rv3871 (서열번호 10), Rv3872 (서열번호 11), Rv3873 (서열번호 12), Rv3876 (서열번호 13), Rv3877 (서열번호 14), Rv3878 (서열번호 15), Rv3879c (서열번호 16), Rv3880c (서열번호 17), Rv3881c (서열번호 18), Rv3882c (서열번호 32), Rv3883c (서열번호 33), Rv3865c (서열번호 34), 또는 예컨대 T 세포 에피토프인 이들 서열들 중 어느 하나의 면역원성 부위, 또는 이들 서열들 중 어느 하나와 적어도 70%의 서열 일치성을 갖고 동시에 면역원성인 아미노산 서열 상동체(analogue)를 포함한다.
또는, 상기 조성물은 바람직하게는 서열 번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 31로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역원성 부위의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 또다른 예는 상기 폴리펩타이드가 마이코박테리아 과(family)의 박테리아에 의하여 발현되는 항원과 융합하는(fuse) 조성물이며, 이때 바람직하게는 융합 파트너는 항시 발현되는 항원이다. 바람직한 융합 단백질은 CFP10에 융합된 ESAT6를 포함한다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 마이코박테리아 유전자를 발현하는 바이러스 또는 박테리아와 같은 유전자-변형된 생물인 생(live) 재조합 백신 중에서 선택되는 추가적인 전달 시스템, 또는 상기 전술한 단백질의 유전자 또는 유전자 단편을 발현하는 플라스미드인 DNA 백신, 또는 항원 보강제(adjuvant)와 같은 전달 시스템에서 전달되는 단백질 자체 또는 단백질 자체로부터 유도되는 합성 펩타이드인 단백질 백신과 같은 면역원성 전달 시스템을 포함한다. 항원 보강제는 바람직하게는 디메틸디옥타디시암모니움 브로마이드(dimethyldi-octadecylammonium bromide (DDA)), 퀼 A(Quil A), 폴리 I;C(poly I:C), 암모니움 하이드록사이드(aluminium hydroxide), 프로인트 불완전 항원보강제(Freund's in-complete adjuvant), IFN-γ, IL-2, IL-12, 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A (MPL)), 트레홀로스 디마이코레이트(Treholose Dimycolate (TDM)), 트레할로스 디베헤네이트(Trehalose Dibehenate) 및 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide (MDP))로 구성되는 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 DDA/TDB 및 IC31과 같이 다기능성(polyfuctional) T 세포 반응을 촉진하는 항원 보강제이다. 가장 바람직한 항원 보강제는 DDA/TDB 및/또는 폴리 I:C를 포함한다. 또는 상기 아미노산 서열은 폴리펩타이드가 자체-항원보강 효과를 갖도록 지질화(lipidate)된다.
본 발명은 또한 잠복 결핵의 치료 및 감염의 재활성화 예방 용도를 위하여 상기 기재된 항원들을 개시한다.
예컨대 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 아프리카눔(Mycobacterium africanum) 또는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)인 병독성 마이코박테리아에 의하여 야기되는 결핵 감염의 재활성화에 대한, 인간을 포함하는 동물의 치료 방법은 전술한 백신 또는 면역원성 조성물을 동물에 투여하는 단계를 포함하는데, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은, 급성기 감염 동안 또는 그 이후 및/또는 잠복기 감염 동안과 같이, 감염 후에 투여한다.
이 방법은 항시 발현된 항원으로 자극한 후 IP10의 검출, HBHA에 대한 반응의 인 비트로 검출, 콴티페론(Quantiferon) 검사 또는 망뚜(Mantoux) 투베르쿨린 피부 테스트(TST)와 같은 진단 절차에 의하여 병독성 마이코박테리아에 의하여 잠복 감염된 개체를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 예컨대 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), M.보비스(M. bovis) 및 M.아프리카눔(M. africanum)인 결핵 복합체 종에 의하여 야기되는 잠복 감염의 재활성화에 대한 노출 후(postexposure) 백신 또는 면역원성 조성물의 제조를 위한, 전술한 항원의 용도를 개시하는데, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 전술한 바와 같이 하나 또는 그 이상의 면역원성 부위를 포함하며, 급성기 감영 동안 또는 그 이후 및/또는 잠복기 동안과 같은 감염 후 투여를 위한 것이다.
마이크로박테리아의 병원체로서의 성공은 그것이 그것의 숙주와 상호작용하는 복잡하고 정교한 방식-분화된 ESX-1 박테리아 단백질-분비 시스템에 의하여 부분적은로 통제되는 방법-때문이다. 이 ESX-1 시스템은 박테리아 단백질(예컨대, ESAT-6, CFP10 및 EspA)을 숙주 세포로 전달하며 그것은 병독성에 결정적이다. 간균(bacilli)으로부터 분비된 후, ESAT-6 단백질은 포식소체 막(phagosomal membrane) 내에 구멍(pore)를 형성하여, 간균이 포식소체 내 그것의 봉쇄로부터 세포질로 피할 수 있도록 하며, 이로써 그것은 세포에서 세포로 퍼지는 것을 촉진한다.
구조적인 발현 패턴은 이들 분자가 병원체에게는 결정적으로 중요한 필수 기능, 병원체가 면역 숙주 내에서 생존하기 위하여 항시 발현될 필요가 있는 유전자들에 의존하는 기능을 수행하는 것을 설명하는 중요한 특징이다. 이들 분자들은 본 발명의 기초이며, 이들이 박테리아 생활 양식의 모든 단계를 목표로 하고, 그러므로 활성을 위한 가장 넓은 가능한 성분(basis)를 갖고 있기 때문에 잠복 감염된 대상에 투여하기 위한 백신에서는 특히 중요한 항원들이다.
ESAT6, CFP10 및 EspA은 모두 분비에 요구되며, 이들은 모두 병독성에 필수적인 것으로 알려진 ESX-1 분비 시스템에 속한다. 이들 분비된 항원들은 박테리아 전염(dessemination) 및 세포막 용균(lysis)에 결정적이다. 예컨대, Ag85의 발현이 감염 후 곧 하향조절되는 것에 반하여, ESAT6, CFP10 및 EspA은 또한 질병의 서로 다른 단계에서 항시 발현되는 항원들이다. 면역원성 항시 발현되는 항원들은 치료적 백신으로서 투여 시 감염 잠복을 유지함으로써 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방한다.
정의
다기능성 T 세포
용어에 의하여 다기능성(polyfunctional) T 세포는 IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α 또는 IL-2의 모든 사이토카인과 IFN-γ 및 TNF-α의 두 다른 사이토카인 중 적어도 하나를 동시에 발현시키는 T 세포로 이해된다.
폴리펩타이드
본 발명에서 "폴리펩타이드"라는 단어는 그것의 보통의 의미를 갖는다. 그것은 아미노산 잔기가 공유 펩타이드 결합으로 연결된 전장 단백질, 올리고 펩타이드, 짧은 펩타이드 및 그것의 단편을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬이다.
폴리펩타이드는 글리코실화되거나, (예컨대, Mowat 등 1991에 기재된 바와 같이 팔미토일록시 숙시니마이드(palmitoyloxy succinimide)나 Lustig 등 1976에 기재된 바와 같이 도데카노일 클로라이드(dodecanoyl chloride)로 화학적 지질화에 의하여) 지질화(lipidate)되거나, 인공 군을 포함하거나, 또는 예컨대 his-태그 또는 시그널 펩타이드와 같은 추가적인 아미노산을 포함함으로써 화학적으로 변형될 수 있다.
그러므로 각각의 폴리펩타이드는 특정 아미노산으로 특징되며, 특정 핵산 서열에 의하여 코드된다. 이러한 서열들은 재조합 또는 합성 방법에 의하여 생산된 변이체(variant)들 및 상동체(analogue)들을 포함하며, 이러한 폴리펩타이드 서열들은 재조합 폴리펩타이드 내 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입(insertion), 추가(addition) 또는 결실에 의하여 변형되며 여기에 기재된 임의의 생물학적 시험에서 여전히 면역원성을 갖는 것으로 이해된다. 치환은 바람직하게는 "보존적"이다. 이들은 하기 표 1에 의하여 정의된다. 두 번째 칼럼의 동일 블럭 및 바람직하게는 세 번째 칼럼의 동일 행의 아미노산들은 서로 치환될 수 있다. 세 번째 칼럼의 아미노산들은 1 글자 기호로 나타낸다.
지방족




 비극성
 GAP
ILV
극성-하전되지않은(uncharged)
 CSTM
NQ
극성-하전된(charged)
 DE
KR
방향족 HFWY
본 발명에서 바람직한 폴리펩타이드는 생물이 잠복 감염과 관련된 스트레스에 처했을 때 생산되는 M. 튜버쿨로시스 유래의 면역원성 항원이다. 이러한 항원은 예컨대 M. 튜버쿨로시스 세포 및/또는 M. 튜버쿨로시스 배양 여과물로부터 유래할 수 있다. 그러므로 상기 항원들 중 하나의 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩타이드는 면역원성 부위만으로 구성될 수도 있고, 추가적인 서열을 포함할 수도 있다. 추가적인 서열은 원래의 M. 튜버풀로시스 항원으로부터 유래할 수도 있으며, 이종 기원일 수도 있고(heterologous), 이러한 서열들은 면역원성일 수도 있으나 꼭 그럴 필요는 없다.
각각의 폴리펩타이드는 특정 핵산 서열에 의하여 코드된다. 이러한 서열들은 그것의 변이체 및 상동체를 포함하며, 이러한 핵산 서열들은 하나 또는 그 이상의 핵산의 치환, 삽입, 추가 또는 결실에 의하여 변형된 것으로 이해될 수 있다. 치환은 바람직하게는 아미노산 서열에는 아무런 변화를 일으키지 않으나, 단백질 발현을 강화시키도록 도입될 수 있는 코돈 선호도(codon usage) 내 침묵 치환이다.
본 문맥에서 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드 단편"은 그것이 본래 결합된(associated) 다른 폴리펩타이드 물질을 많아야 5 중량% 포함하는 폴리펩타이드 제조를 의미한다(다른 폴리펩타이드 물질은 낮은 퍼센트, 예컨대, 많아야 4%, 많아야 3%, 많아야 2%, 많아야 1 %, 및 많아야 1/2%인 것이 바람직하다). 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 적어도 96% 순수한 것, 즉, 폴리펩타이드가 적어도 96 중량%의 제조 시 존재하는 총 폴리펩타이드 물질로 구성되는 것이 바람직하며, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99,25%, 적어도 99,5%, 및 적어도 99,75%와 같은 더 높은 퍼센트가 바람직하다. 폴리펩타이드 단편이 "본질적으로 순수한 형태"인 것, 즉, 폴리펩타이드 단편이 그것이 본래 관련된 다른 항원이 본질적으로 없는, 즉, 결핵 복합체 또는 병독성 마이코박테리아에 속하는 박테리아 유래의 임의의 다른 항원이 없는 것이 특히 바람직하다. 이는 하기 자세히 기재한 대로 비(non)-마이코박테리아 숙주 세포 내 재조합 방법인 수단으로 폴리펩타이드 단편을 제조하거나, 또는 널리 알려진 고체 또는 액체상 펩타이드 합성 방법, 예컨대, 메리필드(Merrifield)가 기재한 방법이나 그 변형으로 폴리펩타이드 단편을 합성하여 달성할 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, 상기 "실질적으로 순수한 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편"의 정의는 마이코박테리아 또는 비-마이코박테리아 기원의 다른 정제되거나 합성된 항원들과 결합하여(in combination) 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 단편을 배제하는 것은 아니다.
용어에 의하여 "병독성 마이코박테리아"는 동물 또는 인간에게 결핵 병을 야기할 수 있는 박테리아로 이해된다. 병독성 마이코박테리아는 M. 튜버쿨로시스, M. 아프리카눔, 및 M. 보비스를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 적절한 동물의 예는 소, 주머니쥐(possum), 오소리(badger) 및 캥거루들이다.
"감염된 대상"은 병독성 마이코박테리아에 의한 미시적으로 판명된 감염 또는 배양인 대상 및/또는 항-결핵 화학치료에 대하여 반응하고 결핵으로 임상에서 진단된 대상이다. 결핵의 임상적인 진단, 검경(microscopy) 및 배양은 당업자에게 널리 알려져 있다.
용어에 의하여, "PPD-양성 대상"은 PPD(정제된 단백질 유도체(purified protein derivative))가 IFN-γ의 방출에 의하여 결정되는 양성 인 비트로 기억 반응(recall response)를 유도하는 대상 또는 망뚜 시험이 양성을 보인 대상으로 이해된다.
"잠복 감염된 대상"은 병독성 마이코박테리아, 예컨대, M. 튜버불로시스에 감염되었으나 활동성 결핵의 징후를 보이지 않은 대상으로 이해된다. 백신 접종, 예컨대, BCG 접종된 대상이나 결핵 치료를 받은 대상은 PPD 반응성을 시험하면 이들은 양성일 것으로 예상되므로 비록 현재로서는 증명하는 것이 불가능 하지만, 이들의 체내에 마이코박테리아를 여전히 보유하고 있을 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 가장 정확한 점에서, "잠복 감염된"은 그들의 조직 내에 M. 튜버쿨로시스가 존재하면서도 임상적으로 아프지는 않은 임의의 대상을 묘사하는데 사용된다. 잠복 감염된 대상은 망뚜 투베르쿨린 피부 테스트(Mantoux tuberculin skin test (TST)), 콴티페론(Quantiferon) 시험과 같은 오늘날 임상적으로 이용되는 많은 방법에 의하여 확인될 수 있으며, 앞으로는 최근 제안된 HBHA(Hougardy 2007)에 대한 반응의 인 비트로 검출 또는 ESAT6에 의한 인 비트로 자극 후 IP10의 검출(Ruhwald 2008)과 같은 감염의 특정 단계를 진단하는 더욱 민감한 수단들이 있을 것이다.
용어에 의하여 "재활성화:는 비복제 박테리아(그것들이 세포 내 위치하기 때문에 면역 시스템이 이를 감지하기는 매우 어려울 수 있다)과 면역 숙주 내에서 마주치는 적대적인 환경에 적응하기 위한 시도에서 활동적이나 변화된 발현 프로파일(profile)을 갖는 천천히 복제하는(slowly replicating) 박테리아 사이의 균형이 병원체 측으로 기울어져, 박테리아가 다시 급격히 복제하기 시작하고 감염된 대상 내 박테리아의 수가 증가하는 단계로 감염이 진행하는 상황으로 이해된다. 매우 강한 면역 압력 하 잠복 감염된 대상 내 이들 박테리아는 본 발명의 백신 접종 전략의 목표이다.
용어에 의하여 "IFN-γ"는 인터페론-감마로 이해된다. IFN-γ의 측정은 면역 반응의 징후로 사용된다.
용어에 의하여 "핵산 단편" 및 "핵산 서열"은 DNA, RNA , LNA (locked nucleic acids), PNA, RNA, dsRNA 및 RNA-DNA-하이브리드를 포함하는 임의의 핵산 분자로 이해된다. 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오시드(nucleoside)를 포함하는 핵산 분자 또한 포함된다. 용어는 용도에 의존적인 임의의 길이, 예컨대 10부터 10000 뉴클레오티드까지의 핵산 분자들을 포함한다. 핵산 분자가 약학적, 예컨대 DNA 치료로 사용되거나 본 발명에 의하여 폴리펩타이드의 생산 방법에 사용되는 경우, 바람직하게는 약 18에서 약 1000 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 선택적으로 벡터에 삽입되며, 적어도 하나의 에피토프를 코드하는 분자가 이용된다.
이 명세서에서, 문맥이 다르게 요구하지 않는 한, "포함한다"는 단어 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 그것의 변형은 언급한 구성 요소, 또는 전체(integer) 또는 구성 요소 또는 전체의 군을 함유하는 것을 의미하며, 임의의 다른 구성 요소, 전체 또는 구성요소 또는 전체의 군을 배제하는 것이 아니다.
항시 발현되는 유전자들은 폐에서의 결핵균 CFU 수와 서로 관련된 후, 감염 3주 후 이후의 시점에서, 군 수준(population level)에서 mRNA의 자세한 분석 후, 폐에서 in vivo로 동등하게 잘 발현되는 유전자들이다. 이러한 정의로부터, 구조적 유전자들은 하나의 박테리아 레벨에서는 다르게 발현될 수 있다. 유전자 발현을 정량화하는 방법은 정량적 PCR(quantitate PCR)이다. "동등하게 잘"은 전의 측정으로부터 +/- 5 배 내인 것으로 정의된다. 비교는 항상 현재의 바로 전의 시점과 한다. 측정들 간의 시간은 감염 및 전의 측정 간의 시간보다 길 수 없는데, 즉(e.c), 만약 유전자 발현이 감염 후 3주에 최초로 측정되었다면, 두 번째 측정은 감염 후 6주보다 늦게 될 수 없고, 세 번째는 감염 후 12 주보다 늦을 수 없는 등이다.
항시 발현하는 항원들은 항시 발현하는 유전자들의 산물인 폴리펩타이드 또는 이들 폴리펩타이드들의 부분이다.
서열 일치성
"서열 일치성(sequence identity)"이라는 용어는 동일한 길이의 두 뉴클레오티드 서열 간 또는 동일한 길이의 두 아미노산 서열 간의 상동성(homology)의 정도를 정량적으로 측정한 것을 가리킨다. 비교될 두 서열은 단백질 서열의 말단에서 간격(gap)의 삽입 또는 대체적으로는, 절단(truncation)을 허용하는 가능한 최적의 적합 상태로 정렬되어야 한다. 서열 일치성은
Figure pat00001
로 계산될 수 있으며, 이때 Ndif는 정렬될 때 두 서열의 비-일치성 잔기(non-identical residues)의 총 수이고, Nref는 서열 중 하나의 잔기의 수이다. 그러므로 DNA 서열 AGTCAGTC은 서열 AATCAATC과 75%의 서열 일치성을 가질 것이다(Ndif=2 및 Nref=8). 간격은 특정 잔기의 비특이성으로 산출되는데, 즉, DNA 서열 AGTGTC는 DNA 서열 AGTCAGTC과 75%의 서열 일치성을 가질 것이다((Ndif=2 및 Nref=8). 서열 일치성은 대체적으로 BLASST 프로그램에 의하여 계산될 수 있는대, 예컨대, BLAST 프로그램(Pearson, 1988, 또는 www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)이다. 본 발명의 한 관점에서, 정렬은 hompson J., et a/ 1994, available at http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/에 의하여 기재된 디폴트(default) 변수를 가지고 서열 정렬 방법 ClustalW에 의하여 수행된다.
서열 일치성의 바람직한 최소의 퍼센트는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 적어도 99.5%와 같이 적어도 80%이다.
면역원성 부위
발명의 바람직한 예에 있어서, 폴리펩타이드는 B-세포 또는 T-세포의 에피토프와 같은 폴리펩타이드의 면역원성 부위를 포함한다. 폴리펩타이드의 면역원성 부위는 동물 또는 인간 및/또는 여기에 기재된 임의의 생물학적 검사(assay)에 의하여 결정되는 생물학적 샘플에서 면역 반응을 유도하는 폴리펩타이드의 부분이다. 폴리펩타이드의 면역 부위는 T-세포 에피토프 또는 B-세포 에피토프일 수 있다. 면역원성 부위들은 폴리펩타이드의 하나 또는 몇몇의 상대적으로 작은 부분들과 연결될 수 있으며, 그것들은 폴리펩타이드 서열 곳곳에 분산되어 있을 수도 있고, 폴리펩타이드의 특정 부분에 위치할 수도 있다. 몇몇 폴리펩타이드의 경우, 에피토프들이 폴리펩타이드를 커버하는 전장 서열 곳곳에 분산되어 있는 것이 증명되었다(Ravn et al 1999). 면역 반응 동안 인식되는 적절한 T-세포 에피토프를 확인하기 위하여, 예컨대 폴리펩타이드로부터 유래한 20 아미노산 잔기 길이를 갖는 MHC 클라스 Ⅱ 에피토프의 검출을 위하여 올리고펩타이드 오버랩핑(overlapping)을 이용할 수 있다. 이들 펩타이드들은 생물학적인 검사(assay)에서 시험될 수 있고(예컨대, 여기에 기재된 IFN-γ 검사), 이들 중 일부는 펩타이드 내 T 세포 에피토프가 존재하는 증거로서, (그리고 이로써 면역원성인) 양성 반응을 준다. ESAT-6 및 CFP10의 경우 이러한 연구는 항원의 모든 부분이 T-세포 에피토프를 포함한다는 것을 보여주었다(Mustafa et al. 2000, Arend SM et al. 2000). MHC 클라스 Ⅰ 에피토프의 검출을 위하여, 결합할 펩타이드들을 예측하고(Stryhn et al. 1996), 이후에 이들 펩타이드를 합성적으로(synthetic) 생산하며, 예컨대, 여기에 기재한 바와 같이 IFN-γ 검사인 적절한 생물학적 검사에서 시험할 수 있다. 이 펩타이드들은 바람직하게는, 예컨대, 폴리펩타이드로부터 유래한 8~11 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. B-세포 에피토프들은, 예컨대 Harboe et al 1998에 기재된 대로 관심있는 폴리펩타이드를 커버하는 오버랩핑(overlapping) 펩타이드들에 대한 B-세포 인식 분석에 의하여 결정될 수 있다. 이 정의와 일치하여, 여기에 기재된 폴리펩타이드의 면역원성 부위는 면역 반응을 유도하는 부위로서 확인될 수 있다:이하의 "면역 반응"의 정의 참조.
비록 T-세포 에피토프의 최소 길이가 적어도 6 아미노산인 것으로 알려졌지만, 이러한 에피토프들은 아미노산들의 더 긴 스트렛치들(stretches)로 구성되어 있는 것이 정상이다. 그러므로 본 발명의 폴리펩타이드 단편은 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 20, 적어도 22, 적어도 24, 및 적어도 30 아미노산 잔기와 같은, 적어도 7 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 그러므로, 본 발명 방법의 중요한 예에서, 폴리펩타이드 단편은 많아야 40, 35, 30, 25, 및 20 아미노산 잔기와 같이, 많아야 50 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것이 바람직하다. 10 내지 20 아미노산 잔기 사이의 길이를 갖는 펩타이드가 MHC 클라스 Ⅱ 에피토프로서 가장 효과적일 것으로 확인되고, 그러므로 본 발명 방법에서 사용되는 폴리펩타이드 단편의 특히 바람직한 길이는 15, 14, 13, 12 및 심지어 11 아미노산 잔기와 같은 18인 것으로 예상된다. 7 및 12 아미노산 잔기 사이의 길이를 갖는 펩타이드들이 MHC 클라스 Ⅰ 에피토프로서 가장 효과적일 것으로 확인되고, 그러므로 본 발명 방법에서 사용되는 폴리펩타이드 단편의 특히 바람직한 길이는 10, 9, 8 및 심지어 7 아미노산 잔기와 같은 11일 것으로 예상된다.
폴리펩타이드의 면역원성 부위들은 유전적으로 이종적인(heterogeneous) 인간 군(population)의 넓은 부분(높은 빈도) 또는 적은 부분(낮은 빈도)에 의하여 인식될 수 있다. 또한 일부 면역원성 부위들은 다른 것들이 낮지만 여전히 중요한 면역반응을 유도하는데 반하여(준우성(subdominant)), 높은 면역 반응(우성(dominant))을 유도한다. 높은 빈도><낮은 빈도는 넓게 분포한 MHC 분자(HLA 타입)에 결합한 면역원성 부위에 대하여 또는 다중(multiple) MHC 분자들에 의하여라도 관련있을 수 있다(Sini-gaglia, 1988, Kilgus, 1991).
그러나 새 결핵 백신을 위한 후보 분자들을 준비하는 문맥에서, 준우성 에피토프들은 우성 에피토프만큼이나 관련이 있는데, 이는 이러한 에피토프들이 강하게 또는 광범위하게 인식되지 않는다는 사실에 관계없이, 이러한 에피토프들이 보호를 유도할 수 있다는 것이 알려졌기 때문이다(Olsen, 2000).
변이체
본 발명의 폴리펩타이드들의 공통된 특징은 실시예에서 나타나듯이 면역 반응을 유도하는 그것들의 특성이다. 치환, 삽입, 추가 또는 결실에 의하여 생산되는 본 발명의 폴리펩타이드의 변이체는 여기에 기재된 임의의 검사에 의하여 결정되듯이 면역원성일 수 있는 것으로 이해된다.
면역 대상
면역 대상(immune individual)은 병독성 마이코박테리아에 의한 감염이 깨끗하거나 통제되었거나, 또는 M.보비스 BCG 백신 접종과 같은 예방 백신 접종을 받은 사람 또는 동물로 정의된다.
면역 반응
면역 반응은 하기 방법들 중 하나에 의하여 모니터(monitor)될 수 있다.
● 인 비트로 세포 반응은 관련된 폴리펩타이드로 면역되거나 또는 병독성 마이코박테리아로 전에 감염되거나 현재 감염된 인간 또는 동물로부터 회수한 림프구 내 증식을 유도하거나 또는 이로부터의 IFN-γ와 같은 관련 사이토카인의 방출 유도에 의하여 결정된다. 웰 당 2×105 세포부터 4×105 세포까지 포함하는 부유액에 폴리펩타이드의 면역원성 부위 또는 폴리펩타이드를 첨가함으로써 상기 유도를 수행한다. 혈액, 비장, 간 또는 폐로부터 분리한 세포 및 ㎖ 부유액 당 20 ㎍을 넘지 않는 농도가 되는 폴리펩타이드 또는 면역원성 부위의 첨가 및 2~5 일간 수행되는 자극. 세포 증식의 모니터링을 위하여, 세포들은 방사성 표지된 티미딘(Thymidine)으로 펄스(pulse)되며, 배양 16-22시간 후 액체 섬광 계수법에 의하여 증식을 검출하였다. 양성 반응은 백그라운드+ 2 표준 편차보다 많은 반응인 것으로 정의한다. IFN- γ의 방출은 당업계에 널리 알려진 ELISA 방법에 의하여 결정될 수 있다. 백그라운드+2 표준편차를 넘는 반응인 양성 반응. IL-12, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, TGF-β와 같이, IFN-γ이 아닌 다른 사이토카인이 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 모니터링할 때 적절할 수 있다.면역 반응을 검출하는 또 다른 그리고 더욱 민감한 방법은 ELISpot 방법으로, 이 때 세포를 생산하는 IFN-γ의 빈도가 결정(determine)된다. IFN- γ 항체들(PharMingen)로 미리 코팅된 ELIspot 플레이트(MAHA, Millipore)에서, 각각 혈액, 비장 또는 폐로부터 분리된 선별된 수의 세포들(graded numbers of cells)이 폴리펩타이드 또는 면역원성 부위의 존재 하 24-32 시간 동안 배양되어(전형적으로는 1 ~ 4×105 세포/웰 사이이다), ㎖ 당 20 ㎍을 넘지 않는 농도가 된다. 플레이트는 그 다음, 비오틴화된(biotinylated) 항-IFN-γ 항원과 함께 배양되고, 그 후 스트렙타비딘-알칼라인 파스파타제(streptavidin-alkaline phosphatase) 배양을 한다. IFN-γ 생산 세포는 스팟(spot)을 일으키는 관련 기질(substrate)에 BCIP/NBT(Sigma)을 가하여 확인한다. 이들 스팟은 해부 현미경(dissection microscope)을 이용하여 셀 수 있다. 이것은 또한 PCR 기술을 이용하여 관련 사이토카인을 코드하는 mRNA의 존재를 결정하는 가능성이기도 하다. 보통 하나 또는 그 이상의 사이토카인이 예컨대 PCR, ELISPOT 또는 ELISA를 이용하여 측정된다. 특정 폴리펩타이드에 의하여 유도되는 이들 중 임의의 사이토카인의 양의 중요한 증가 또는 감소가 폴리펩타이드의 면역 활성 평가에 이용될 수 있다는 것은 자명할 것이다.
● 인 비트로 세포 반응은 또한 M. 튜버쿨로시스-감염된 사람 또는 면역 대상으로부터 유래한 T 세포주를 이용하여 결정될 수 있는데, 상기 T 세포주는 살아있는 마이코박테리아, 박테리아 세포의 추출물 또는 IL-2를 첨가하고 10~20일 된 배양여과액으로부터 유래한 것이다. 1×105 세포~3×105 세포를 포함하는 T 세포주에 ㎖ 부유액 당 20 ㎍을 넘지 않는 폴리펩타이드를 첨가하여 수행하는 유도 및 2~6일 간 수행되는 배양. IFN-γ의 유도 또는 다른 관련 사이토카인의 방출은 ELISA에 의하여 검출된다. T 세포의 자극은 또한 전술한 바와 같이 방사성 표지된 티미딘을 이용하여 세포 증식을 검출함으로써 모니터될 수 있다. 양 검사를 위하여, 백그라운드+2 표준편차를 넘는 반응인 양성 반응.
● 인 비보 세포 반응은, 주사 또는 적용 후 72~96 시간 적어도 5mm의 지름을 갖는 양성 반응, 병독성 마이코박테리아에 의하여 임상적으로(clinically) 또는 준임상적으로(subclinically) 감염된 대상에, 많아야 100 ㎍의 면역원성 부위 또는 폴리펩타이드를 진피 주사 또는 국부 적용 패치 후 양성 DTH 반응으로서 결정될 수 있다.
● 인 비트로 체액성 반응은 면역 또는 감염된 대상 내 특정 항원 반응에 의하여 결정된다. 항원의 존재는 ELISA 기술 또는 웨스턴 블럿에 의하여 결정될 수 있으며, 폴리펩타이드 또는 면역원성 부위는 니트로셀룰로스 막 또는 폴리스티렌 표면에 흡수된다. 혈청은 바람직하게는 1:10부터 1:100까지 PBS에서 희석되며, 흡수된 폴리펩타이드에 첨가되며, 1~12 시간 동안 배양이 수행된다. 표지된 2차 항체를 이용하여, 특정 항체의 존재는 OD, 예컨대 ELISA에 의하여 결정될 수 있으며, 양성반응은 백그라운드+2 표준편차를 넘는 반응이거나, 또는 대체적으로 웨스턴 블럿에서의 가시적 반응이다.
● 또다른 관련된 변수는 항원 보강제 내 폴리펩타이드를 백신 접종한 후, 또는 DNA 백신 접종한 후 유도된 동물 모델 내 보호의 측정이다. 적절한 동물 모델은 영장류, 기니피그, 쥐이며, 이들은 병독성 마이코박테리아의 감염에 의하여 시험감염(challenge)된다. 유도된 보호의 판독(readout)은 비-백신접종된 동물에 비교한 목표 기관 내 박테리아 부하(load)의 감소, 비-백신접종된 동물에 비교한 연장된 생존 기간 및 비-백신접종된 동물에 비교한 감소된 체중 감소일 수 있다.
제조 방법
일반적으로, M.튜버쿨로시스 항원, 및 이러한 항원을 코드하는 DNA 서열은 다양한 절차들 중 임의의 것을 이용하여 제조할 수 있다.
그것들은 전술한 바와 같이 절차에 의하여 배양 여과액 또는 M.튜버쿨로시스 세포로부터 원래(native) 단백질로서 정제될 수 있다. 면역원성 항원들은 항원을 코드하는 DNA 서열을 이용하여 재조합형으로 생산될 수 있으며, 발현 벡터 내 도입되어, 적절한 숙주 내에서 발현된다. 숙주 세포의 예는 대장균이다. 그것의 폴리펩타이드 또는 면역원성 부위는 또한 약 100 아미노산보다 적게 합성적으로 생산될 수 있고, 50 아미노산보다 유전적으로 적게 아미노산들이 서열적으로 성장하는 아미노산 사슬에 가해지는 상업적으로 이용가능한 고체상 기술과 같은 당업계에 널리 알려진 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
DNA 백신 접종에서 정의된 폴리펩타이드를 코드하는 플라스미드 DNA의 구조화(construction) 및 제조에서, 대장균과 같은 숙주 균주가 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA는 관심있는 플라스미드를 운반하는 숙주 균주의 배양물로부터 제조할 수 있고, 예컨대, 엔도톡신 제거 단계를 포함하는 Qiagen Giga -Plasmid column kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA)를 이용하여 정제할 수 있다. DNA 백신 접종에 사용되는 플라스미드 DNA는 무-엔도톡신(endotoxin free)인 것이 바람직하다.
융합 단백질
면역원성 폴리펩타이드는 또한 융합 단백질일 수 있으며, 이로써 본 발명의 폴리펩타이드의 우수한 특성, 방법이 달성될 수 있다. 예를 들어, 재조합적으로 생산될 때 폴리펩타이드의 이출(export)를 촉진하는 융합 파트너들, 폴리펩타이드의 정제를 촉진하는 융합 파트너들, 및 본 발명의 폴리펩타이드 단편의 면역원성을 증강시키는 융합 파트너들이 모두 관심있는 가능성들이다. 그러므로, 본 발명은 또한 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 적어도 하나의 융합 파트너 및 상기 정의한 면역원성 부위를 포함하는 융합 파트너에 관련된다.면역원성을 증진시키기 위하여, 융합 파트너는 ESAT-6, CFP10, EspA, TB10.4, RD1-ORF5, RD1-ORF2, Rv1036, MPB64, MPT64, Ag85A, Ag85B (MPT59), MPB59, Ag85C, 19kDa 리포프로틴 MPT32 및 알파-크리스탈린(alpha-crystallin), 또는 상기 언급된 항원들 중 임의의 것의 적어도 하나의 T-세포 에피토프(SkjΦt et al 2000; WO0179274; WO0104151; US patent application 09/0505,739; Rosenkrands et al 1998; Nagai et al 1991)와 같은 결핵 복합체에 속하는 박테리아로부터 유래한 폴리펩타이드 단편과 같은 M.튜버쿨로시스 유래의 또다른 폴리펩타이드일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 둘 또는 그 이상의 포리펩타이드(또는 이들의 면역원성 부위)의 상호 융합(mutual fusion)을 포함하는 융합 폴리펩타이드에 관한 것이다. 산물의 면역원성을 증진시킬 수 있는 다른 융합 파트너들은 IFN-γ, IL-2 및 IL-12와 같은 림포카인(lymphokine)이다. 발현 및/또는 정제를 촉진시키기 위하여, 융합 파트너는 예컨대, 박테리아 섬모(fimbrial) 단백질, 예컨대, 섬모(pilus) 구성성분인 섬모소(pilin) 및 papA;단백질 A; ZZ-펩타이드(ZZ-융합은 스웨덴의 Pharmacia에 의하여 판매된담); 말토스(maltose) 결합 단백질; 글루타티온 S-트랜스페라제, β-갈락토시다제; 또는 폴리-히스티딘일 수 있다. 융합 파트너들은 숙주 세포 내에서 재조합적으로 생산될 수 있고, 이는 대장균이 될 수 있으며, 이는 서로 다른 융합 파트너들 사이에 링커 영역을 유도하는 가능성이다.
다른 관심있는 융합 파트너들은 지질화((lipidated)되어 면역 체계에 적합한 방식의 면역원성 폴리펩타이드가 존재하게 되는, 폴리펩타이드이다. 이러한 효과, 예컨대 WO 96/40718 A에 기재된 바와 같이 Borrelia burgdorferi OspA 폴리펩타이드에 기초한 백신 또는 Pseudomonas aeruginosa Oprl lipoprotein (Cote-Sierra J 1998)에 기초한 백신으로 알려진 것이다. 또다른 가능성은 kdffuwls신호 서열 및 N-말단 시트신(cystein)의 면역원성 폴리펩타이드에 대한 N-말단 융합이다. 이러한 융합은 적절한 생산 숙주 내에서 생산될 때, N-말단 시스틴에서 면역원성 폴리펩타이드의 지질화에 재적합하다(resuit).
용도
백신
백신은 특정 질병에 대한 면역을 개선시키거나 확립하는 생물학적 조제품이다. 백신은 예방적(예컨대, 임의의 자연적 또는 "야생" 병균에 의하여 장래 감염된 효과를 예방하거나 개선시키기 위하여), 노출후(예컨대, 임상적 증상 없이 잠복 감염된 대상에서 재활성화를 예방하기 위하여) 또는 치료적(예컨대, 단독으로 치료를 단축하기 위하여 항생제 치료와 결합하여 또는 단독으로 활성 질병을 치료하기 위하여 사용되는 백신)일 수 있다.
잠복 결핵을 위한 동물 모델
M.tb에 의한 낮은 수준의 잠복 감염을 유도하기 위하여, 정상 량(dose)의 M.tb(폐에 약 150 박테리아)를 이용하여 동물들을 처음에 에어로졸 감염시켰다. 감염 6 주 후, 동물들은 6주간 차선의 화학요법 치료를 받으며, 그 동안 대부분-그러나 모든 것은 아니다-의 박테리아들이 근절된다. 남아있는 박테리아는 잠복 감염으로 확립된다. 하기 화학요법 치료에서, 일부 동물들은 잠복 감염의 재활성화를 예방하는 백신 능력을 시험하기 위하여 백신 면역될 것이고, 그것은 화학요법 치료 후 5-15 주에 자연히 발생할 것이다. 도 2 참조.
단백질 백신
본 발명의 또다른 부분은 본 발명에 의한 융합 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드(또는 적어도 그것의 하나의 면역원성 부위)를 포함하는 백신 조성물에 대한 것이다. 이러한 백신 조성물의 최적의 수행을 확실히 하기 위하여, 그것은 면역적으로 약학적으로 적절한 담체, 비히클 또는 아쥬반트(adjuvant)를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리펩타이드가 동물에 의하여 인식되는 유효한 백신은 비-백신 접종된 동물에 비하여 병독성 마이코박테리아에 의하여 시험감염된 후 동물 모델 내에서 목표 기관 내 박테리아 부하의 감소, 생존 기간의 연장, 및/또는 감소된 체중 감소를 일으킬 수 있다.
적절한 담체는 예컨대, 플라스틱, 폴리스티렌과 같은 폴리펩타이드가 소수성 비-공유 상호작용에 의하여 결합하는 폴리머, 또는 폴리사카라이드, 또는 폴리펩타이드, 예컨대 소혈청알부민, 오발부민 또는 keyhole limpet haemocyanin과 같은 폴리펩타이드가 공유적으로 결합하는 폴리머로 구성되는 군으로부터 선택된다. 아쥬반트(adjuvant)는 바람직하게는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(di-methyldioctadecylammonium bromide)(DDA), 퀼 A(Quil A)), 폴리 O:C(poly I:C), 알루미늄 하이드록사이드(aluminium hydroxide), 프로인트 불완전 아쥬반트(Freund's incomplete adjuvant), IFN-γ, IL-2, IL-12, 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A (MPL)), 트레할로스 디마이코레이트(Tre-holose Dimycolate (TDM)), 트레할로스 디베헤네이트(Trehalose Dibehenate) 및 뮤라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide (MDP))로 구성되는 군으로부터 선택된다.
유효 성분으로 펩타이드 서열을 포함하는 백신의 제조는 일반적으로 당업계에 잘 알려져 잇는데, 여기에 참조로 모두 포함되는 U.S. Patents 4,608,251 ; 4,601 ,903; 4,599,231 및 4,599,230가 좋은 예가 될 것이다.
백신의 항원 보강 효과(adjuvant effect)를 달성하기 위한 다른 방법들은 알루미늄 하이드록사이드 또는 인(alum), 당의 합성 폴리머(Carbopol), 열처리에 의한 백신 내 단백질의 응집, 펩신 처리된(Fab) 항원의 알부민에 대한 재활성화에 의한 응집, 그람-음성 박테리아의 리포사카라이드 구성성분 또는 엔도톡신, 또는 C.파르붐(C. parvum)과 같은 박테리아 세포의 혼합물, 만니드 모노올레이트(mannide monooleate)(Aracel A)와 같은 생리적으로 수용가능한 오일 담체 내 에멀젼, 또는 블록 대체제(block substitute)로 사용하는 퍼플루오로카본(perfluorocarbon)(Fluosol-DA)의 20 퍼센트 용액을 가진 에멀젼과 같은 약품의 사용을 포함한다. 다른 가능성은 전술한 아쥬반트와 복합된 폴리 I:C와 같은 IFN-γ 유도체 또는 사이토카인와 같은 면역 조절 물질의 이용을 수반한다.
항원 보강 효과를 달성하기 위한 또다른 흥미로운 가능성은 (여기 참조로서 포함된) Gosselin et al., 1992에 기재된 기술을 이용하는 것이다. 간략히 말하면, 본 발명의 항원과 같이 관련된 항원은 단핵구/대식세포 상 Fcγ 수용체에 대하여 항체(또는 항원 결합 항체 단편)와 콘쥬게이트(conjugate)될 수 있다.
본 백신은 용량 공식(dosage formulation)에 양립가능한 방식이며, 재활성화를 예방하는데 효과적이고 면역원성인 용량으로 투여된다. 투여되는 양은 치료되는, 예컨대, 면역 반응을 시작하는(mount) 대상의 면역 시스템의 능력(capacity), 및 원하는 보호 정도를 포함하여, 개체(subject)에 의존적이다. 적절한 용량 범위는 약 1 ㎍에서 300 ㎍의 범위, 특히 약 10 ㎍에서 50 ㎍의 범위와 같은, 약 0.1 ㎍에서 1000 ㎍까지 바람직한 범위의 백신 접종 당 수백 마이크로그람의 유효 성분의 체계(order)이다. 초기 투여 및 추가 주사(booster shots)을 위한 적절한 요법(regimen)은 또한 다양하나, 초기 투여 후 이루어지는 접종 또는 다른 투여가 전형적이다.
적용 방식은 널리 다양하다. 백신 투여를 위한 현행 방식 중 무엇이든 적용이 가능하다. 이들은 생리학적으로 허용가능한 분산(dispersion) 또는 고형(solid)인 생리학적으로 허용가능한 염에의 경구 적용, 비경구적으로, 주사 또는 이와 유사한 것에 의한 것을 포함한다. 백신의 용량은 투여 경로에 의존적이게 되고, 백신 접종될 사람의 연령, 이보다 덜한 정도로는, 백신 접종될 사람의 크기에 따라 다양하게 된다.
백신은 에컨대, 에어로졸, 흡입, 비경구적으로, 예를 들어 피하 또는 근육 내, 주사에 의하여, 전형적으로(conventionally) 폐 내로 투여된다. 투여의 다른 방식을 위한 적절한 다른 제형은 좌약 및 일부 경우, 구강 제형을 포함한다. 좌약의 경우, 예를 들어, 폴리알칼렌 글리콜 또는 트리글리세라이드인 전통적인 결합체(binder) 및 담체들을 포함할 수 있는데, 이러한 좌약들은 유효 성분 0.5%에서 10%, 바람직하게는 1-2%의 범위로 포함하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구 제형은 예컨대, 약학적 품질(grade)인 만니톨, 락토우즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 및 기타 동종의 것들인 정상적으로 이용된 부형제를 포함한다. 이들 조성물들은 용액, 부유액, 타블렛(tablet), 환약(pill), 캡슐, 지속되는 방출 제형 또는 산제(powder)의 형태를 취하며, 유리하게는 유효성분을 10-95%, 바람직하게는 25-70% 포함한다.
많은 경우, 백신을 복수 투여(multiple administration)할 필요가 있을 것이다. 대상이 이미 감염되었거나, 감염되었다고 의심되는 경우, 종전의 백신 접종은 1차 질병을 예방하기에 충분한 면역을 제공하였을 수 있으나, 앞서 논의한 바와 같이, 이러한 면역 반응을 신장시키는(boost) 것은 잡목 감염에 대하여는 도움이 되지 않을 것이다. 이러한 상황에서, 본 백신은 필연적으로, 재부상하는(remerging) 결핵 감염 또는 감염의 잠복기에 대하여 유효하게 디자인된 노출후(postesposure) 백신이어야 한다.
유전적 다양성 때문에, 많은 대상(individuals)들이 동일한 폴리펩타이드에 대해 다양한 길이의 면역 반응에 반응한다. 그러므로 본 발명에 따른 백신은 면역 반응을 증가시키기 위하여 몇몇의 서로 다른 폴리펩타이드들을 포함할 수 있다. 백신은 둘 또는 그 이상의 폴리펩타이드 또는 면역원성 부위를 포함할 수 있으며, 모든 폴리펩타이드들은 상기 기재한 바와 같고, 펩타이드들 중 전부는 아니나 일부는 병독성 마이코박테리아로부터 유래할 수 있다. 뒤의 예에서, 폴리펩타이드들에 대하여 앞에서 제시한 기준을 필연적으로 만족시키지 않는 폴리펩타이드들은, 그것들 고유의 면역원성 때문에 반응하거나 EH는 단순히 항원 보강제로서 반응할 수 있다.
백신은 2-20과 같은 1-20, 또는 3-20의 서로 다른 폴리펩타이드, 또는 3-10의 서로 다른 폴리펩타이드들 또는 융합 폴리펩타이드와 같은 융합 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
DNA 백신
본 발명의 핵산 단편들은 항원의 인 비보 발현을 가져오기 위하여 사용될 수 있는데, 즉, 핵산 단편은 참조로 포함된 Ulmer et al 1993 내에 리뷰된 소위 DNA 백신에 사용될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 단편을 포함하는 노출후(post exposure) 백신에 대한 것이며, 상기 백신은 백신이 투여되는 인간을 포함하는 동물에 의한 항원의 인비보 발현을 가져오고, 발현된 항원의 양은 인간을 포함하는 동물 내 병독성 마이코박테리아에 의하여 야기되는 감염의 치료를 해주기 위하여 효과적이다.
이러한 DNA 백신의 효험은 아마도 면역 반응을 조절하는 능력을 갖는 폴리펩타이드를 코드하는 DNA 단편과 함께 발현 산물을 코드하는 유전자를 투여함으로써 증강될 수 있을 것이다.
생 재조합 백신(live recombinant vaccines)
노출후 백신을 위하여 세포 면역 반응을 효과적으로 활성화시킬 하나의 가능성은, 바이러스 또는 비-병원성 미생물에서 백신 내 관련 항원을 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 미생물 중 잘 알려진 예가 마이코박테리움 보비스 BCG, 살모넬라(Salmonella) 및 슈노모나(Pseudomona)이고, 바이러스들의 예는 박시니아 바이러스(Vaccinia Virus) 및 아데노바이러스(Adenovirus)이다.
그러므로, 본 발명의 또다른 중요한 측면은 현재 이용 가능한 살아있는 (living) BCG 백신의 개선으로, 이는 앞서 정의한 바에 따라 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드를 코드하는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 카피(copies)를 미생물이 발현을 하도록 하는 방식으로 미생물 내 게놈(genome)에 도입(incorporate)시켜 왔다. 면역 반응을 증강시키기 위하여 본 발명의 핵산 서열의 하나를 초과하는 카피를 도입하는 것이 고려된다.
또다른 가능성은 아데노바이러스 또는 박시니아 바이러스(Rolph et al 1997)와 같은 약독화된 바이러스 내에 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코드하는 DNA를 통합시키는(integrate) 것이다. 재조합 박시니아 바이러스는 감염된 숙주 세포의 세포질(cytoplasma) 내에서 복제될 수 있고, 그러므로 관심있는 폴리펩타이드가 면역 반응을 유도할 수 있으며, 이는 TB에 대하여 보호를 유도할 것으로 생각된다.
본 출원에서 인용된 모든 특허 및 비특허 문헌들은 그 전체가 참고로서, 여기에 통합된다. 본 발명은 하기의 비-제한적 실험예에서 좀더 자세히 설명될 것이다.
실험예
실험예 1: 백신 접종을 위한 뮤린(MURINE) TB 모델
이 모델은 재활성화를 예방하기 위하여 백신 후보 능력을 시험하기 위하여 우리 실험실에서 적응시켰다. 마우스들은 초기에 에어로졸로 병독성 M.tb를 감염시켰으며, 박테리아 부하를 감소시키기 위하여, 감염 후 6주에 항생제 처리가 시작되었다. 이는 마우스 내에서 저절로 일어나지 않는 인간 감염의 잠복기를 모방하기 위한(mimic) 것이다. 이 잠복 단계(연속적인 낮은 박테리아 수의 단계) 동안, 마우스들은 두 번 면역화되고, 백신에 의하여 재활성화를 예방하는 능력은 마지막 면역화 후 20주에 살아있는 M.tb를 비장 및 폐에서 배양함으로써 결정된다. 백신 효험의 판독(readout)을 위한 전제 조건인 질병의 재활성화를 위해서는 충분한 시간을 주어야 하기 때문에, 실험의 오랜 기간은 필요하다(도 3).
실험예 2:Ag85가 아닌 ESAT6에 의하여 보호가 유도된 노출후 백신(postexposure vaccine).
ESAT-6 및 Ag85B는 단일 요소로서, 또한 융합 분자 Ag85B-ESAT6(H1)로서 예방 백신 접종에서 보호적인(protective) 것으로 증명되었다. 그러나 이들 항원들이 노출후 모델에서 시험될 때(상기 실험예 1에서 기재한 대로), 오직 ESAT6만이 재활성화기 동안 보호 효과 및 박테리아 성장 조절능을 가졌다(도 4). 게다가, 도 4B에 나타난 바와 같이, 재활성화에 대항한 ESAT6 보호는 그 자체로, 감염 후 W18만큼 일찍 나타나며, 이러한 보호는 실험의 경과 전반에 걸쳐 유지되었다(감염 후 40주까지). 이는 Ag85B가 노출후 백신으로서 사용되었을 때 관찰된 때(도 4C 및 D)과는 대조되는데, 이때에는 대조군에 비하여 박테리아 부하의 중요한 감소는 없었다. 또한, 우리는 예방 세팅(prophylactic setting)에서 촉망되는 효험을 보였던 ESAT-6 및 TB 항원 Ag85B를 포함하는 H1 융합 단백질을 평가하였다. 이 분자가 SSI 노출후 모델에서 노출후 백신으로서 이용될 때, 그것은 박테리아 수를 상당히 감소시킬 수 있었다(도 4E).
실험예 3:노출 후 백신은 ESAT6 펩타이드 혼합물(mix)에 의하여 보호를 유도하였다.
상기 실험예들에서 나타났듯이, 대조군에 비교하면, 또한 Ag85B에 비교하면, ESAT-6 분자는 매우 활동적이어서(active), 노출후 조건 하 박테리아 부하의 감소를 야기한다. 게다가 ESAT6의 강한 활성 및 노출후 백신으로서 기능하는 능력을 입증함으로써, 우리는 재조합 단백질 대신 오버랩핑 펩타이드의 풀(pool)로서 주어진 ESAT-6가 또한 대조군 및 Ag85B 모두에 비교할 때 재활성화에 대하여 더 나은 보호를 야기한다는 것을 보였다(도 4D).
보호 실험에서 사용된 오버랩핑 ESAT-6 펩타이드들(P1-P13):
P1 MTEQQWNFAGIEAAA (서열번호 19)
P2 NFAGIEAAASAIQGN (서열번호 20)
P3 ASAIQGNVTSIHSLL (서열번호 21)
P4 NVTSIHSLLDEGKQS (서열번호 22)
P5 SLLDEGKQSLTKLAA (서열번호 23)
P6 KQSLTKLAAAWGGSG (서열번호 24)
P7 AAWGGSGSEAYQGVQ (서열번호 25)
P8 GSEAYQGVQQKWDAT (서열번호 26)
P9 QQKWDATATELNNAL (서열번호 27)
P1O TATELNNALQNLART (서열번호 28)
P11 ALQNLARTISEAGQA (서열번호 29)
P12 TISEAGQAMASTEGN (서열번호 30)
P13 QAMASTEGNVTGMFA (서열번호 31)
실험예 5: ESAT-6의 노출후 백신 접종은 다기능성 T 세포를 유도한다.
ESAT-6 특이적 세포들의 사이토카인 발현 프로파일에 대한 ESAT-6의 노출후 백신 접종의 효과를 시험하기 위하여, 마우스들을 먼저 에어로졸에 의하여 병독성 M.tb로 감염시키고, 박테리아 부하를 감소시키고 잠복 감염을 확정하기 위하여 감염 후 6주에 항생제 처치를 시작하였다. 잠복기 동안 마우스들은 3주 간격으로 3회 (도 3에 기재된 바와 같이) 백신 접종되었고, 다기능성 T 세포의 수에 영향을 미치고 M.tb의 재활성화를 예방하기 위한 ESAT-6 백신의 능력은 마지막 백신 접종 후 20주에 결정되었다. 그 결과는 비-백신접종 군에서 상당한 ESAT-6 반응이 있었으나, 사이토카인 발현 프로파일은, 특히 다기능성 T 세포(IFN-γ+TNF-α+IL-2+ CD4 T 세포들)의 경우, ESAT-6 백신 접종된 군과는 현저하게 달랐다는 것을 보여준다(도 5). 그러므로, 비 백신접종된 군에 비교하여, 우리는 FN-γ/TNF-α CD4 T 세포의 수가 감소한 것을 관찰하였으며, FN-γ/TNF-α/IL-2을 함께-발현하는 삼중 양성 다기능성 CD4 T 세포들의 수가 증가한 것을 관찰하였다. ESAT-6 백신 면역된 동물들의 폐 내 감소된 박테리아 수와 연관성이 있는 다기능성 T 세포의 존재의 증가(도 5D).
실험예 6: 감염의 초기 및 잠복기 모두에서 관련된 다른 항원들과 비교하여, ESAT6의 노출후 백신 면역은 더욱 지속적으로 재활성화에 대하여 보호한다.
재활성화에 대하여 어떤 항원이 가장 지속적으로 보호하는지 결정하기 위하여, 우리는 모든 수행된 노출후 실험에 기초하여 정규화된(normalized) 데이터의 풀 분석(pooled analysis)을 하였다. 각각의 실험들로부터 얻어진 데이터들은 그룹 내 각각의 마우스들의 박테리아 부하를 대조군의 중앙값에 대하여 비교함으로써 정규화(normalize)되었는데, 즉, 각각의 데이터 포인트는 대조군 중앙값 CFU 및 각각의 대상 동물의 CFU 사이의 차이(Log10 CFU 대조군 중앙값-Log 10 CFU 백신 군)를 가리킨다(도 6). 도 6A에서, 항원들, 잠복 관련된 항원 RvO569, Rv2031c 및 초기 항원 Ag85B, ESAT6, Rv3871 , Rv3905 및 Rv3445들(이중 뒤의 둘은 ESAT 패밀리 단백질이다)의 보호를 위하여 세트(se)된 데이터 풀(pooled data)의 비교는, 평가된 다른 항원들에 비교할 때 ESAT6 백신 접종된 동물들이 재활성화로부터 상당히 잘 보호된다는 것을 보여주었다. 게다가, 그 후 Rv3871로 노출후 백신 접종에 이르른 보호 수준은, ESX-1 단백질이 또한 다른 항원들에 비교할 때 증가된 것으로 보인다(도 6A). 특히 ESAT6의 활성을 추가로 입증하기 위하여, 우리는 ESAT6에 의하여 획득되는 보호를, 모두 ESAT6를 포함하는 두 개의 융합 구조체 H1 (Ag85B-ESAT6) 및 H56 (Ag85B-ESAT6-Rv2660)와 비교하였다(도 6B). 분석은 상기 언급한 두 융합 구조체 내 포함될 때에도 ESAT6 활성이 여전히 재활성화에 대하여 보호를 야기한다는 것을 보여준다.
실험예 7: ESX -1 패밀리의 또 다른 멤버, Rv3871에 의한 노출후 백신 접종은 재활성화 과정에 대하여 억제 효과를 갖는 것으로 보인다.
우리는 ESAT6과 동시에 ESX-1 패밀리의 다른 멤버를 평가하였으며, 비록 ESAT6가 유도한 면역 반응의 정도까지는 아니라도(도 7A), Rv3871 노출후 백신 접종이 Rv3871 특이적 면역 반응을 이끈다는 것을 발견하였다(도 7B). 그렇기는 하지만, ESAT6 및 Rv3871은 모두 식염수 대조군에 비교할 때 더 큰 면역반응을 유도하였다. 백신 특이적 면역 반응의 유도는, 식염수 군에 비교할 때 백신 군들 모두에서 낮은(중앙값) 박테리아 부하를 갖는 것과 관련되었다. 대조군에서 수준이 다소 증가한 것과 비교할 때 이들 두 군에서의 박테리아 수가 유사한 수준이라는 점으로 입증되듯이, 이는 Rv3871이 ESAT6에 비교할 때 재활성화에 대한 보호에 있어서 유사한 효과를 가질 수 있을 것이라는 점을 가리킨다(도 7C).
<110> Statens Serum Institut <120> A tuberculosis vaccine to prevent reactivation <130> DIP110051DK <150> DKPA200900539 <151> 2009-04-24 <160> 34 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 95 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly 20 25 30 Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu 50 55 60 Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly 65 70 75 80 Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala 85 90 95 <210> 2 <211> 100 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val 20 25 30 Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly 35 40 45 Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys 50 55 60 Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly 65 70 75 80 Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser 85 90 95 Gln Met Gly Phe 100 <210> 3 <211> 392 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 3 Met Ser Arg Ala Phe Ile Ile Asp Pro Thr Ile Ser Ala Ile Asp Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Asp Leu Leu Gly Ile Gly Ile Pro Asn Gln Gly Gly Ile Leu 20 25 30 Tyr Ser Ser Leu Glu Tyr Phe Glu Lys Ala Leu Glu Glu Leu Ala Ala 35 40 45 Ala Phe Pro Gly Asp Gly Trp Leu Gly Ser Ala Ala Asp Lys Tyr Ala 50 55 60 Gly Lys Asn Arg Asn His Val Asn Phe Phe Gln Glu Leu Ala Asp Leu 65 70 75 80 Asp Arg Gln Leu Ile Ser Leu Ile His Asp Gln Ala Asn Ala Val Gln 85 90 95 Thr Thr Arg Asp Ile Leu Glu Gly Ala Lys Lys Gly Leu Glu Phe Val 100 105 110 Arg Pro Val Ala Val Asp Leu Thr Tyr Ile Pro Val Val Gly His Ala 115 120 125 Leu Ser Ala Ala Phe Gln Ala Pro Phe Cys Ala Gly Ala Met Ala Val 130 135 140 Val Gly Gly Ala Leu Ala Tyr Leu Val Val Lys Thr Leu 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Lys Ala Ala Tyr Phe Thr Asp Asp Glu Tyr 65 70 75 80 Tyr Glu Lys Leu Asp Lys Glu Leu Gln Trp Leu Cys Thr Met Arg Asp 85 90 95 Asp Gly Val Arg Arg Ile Ala Gln Arg Ala His Gly Leu Pro Ser Ala 100 105 110 Ala Gln Gln Lys Val Leu Asp Arg Ile Asp Glu Leu Arg Arg Ala Glu 115 120 125 Gly Ile Asp Ala 130 <210> 7 <211> 573 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 7 Met Thr Asp Arg Leu Ala Ser Leu Phe Glu Ser Ala Val Ser Met Leu 1 5 10 15 Pro Met Ser Glu Ala Arg Ser Leu Asp Leu Phe Thr Glu Ile Thr Asn 20 25 30 Tyr Asp Glu Ser Ala Cys Asp Ala Trp Ile Gly Arg Ile Arg Cys Gly 35 40 45 Asp Thr Asp Arg Val Thr Leu Phe Arg Ala Trp Tyr Ser Arg Arg Asn 50 55 60 Phe Gly Gln Leu Ser Gly Ser Val Gln Ile Ser Met Ser Thr Leu Asn 65 70 75 80 Ala Arg Ile Ala Ile Gly Gly Leu Tyr Gly Asp Ile Thr Tyr Pro Val 85 90 95 Thr Ser Pro Leu Ala Ile Thr Met Gly Phe Ala Ala Cys Glu Ala Ala 100 105 110 Gln Gly Asn Tyr Ala Asp Ala Met Glu Ala Leu Glu Ala Ala Pro Val 115 120 125 Ala Gly Ser Glu His Leu Val Ala Trp Met 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80 Ala Arg Pro Gly Ser Pro Pro Leu Lys Leu Asp Gln Ser Leu Asp Asp 85 90 95 Ala Gly Val Val Asp Gly Ser Leu Leu Thr Leu Val Ser Val Ser Arg 100 105 110 Thr Glu Arg Tyr Arg Pro Leu Val Glu Asp Val Ile Asp Ala Ile Ala 115 120 125 Val Leu Asp Glu Ser Pro Glu Phe Asp Arg Thr Ala Leu Asn Arg Phe 130 135 140 Val Gly Ala Ala Ile Pro Leu Leu Thr Ala Pro Val Ile Gly Met Ala 145 150 155 160 Met Arg Ala Trp Trp Glu Thr Gly Arg Ser Leu Trp Trp Pro Leu Ala 165 170 175 Ile Gly Ile Leu Gly Ile Ala Val Leu Val Gly Ser Phe Val Ala Asn 180 185 190 Arg Phe Tyr Gln Ser Gly His Leu Ala Glu Cys Leu Leu Val Thr Thr 195 200 205 Tyr Leu Leu Ile Ala Thr Ala Ala Ala Leu Ala Val Pro Leu Pro Arg 210 215 220 Gly Val Asn Ser Leu Gly Ala Pro Gln Val Ala Gly Ala Ala Thr Ala 225 230 235 240 Val Leu Phe Leu Thr Leu Met Thr Arg Gly Gly Pro Arg Lys Arg His 245 250 255 Glu Leu Ala Ser Phe Ala Val Ile Thr Ala Ile Ala Val Ile Ala Ala 260 265 270 Ala Ala Ala Phe Gly Tyr Gly Tyr Gln Asp Trp Val Pro Ala Gly Gly 275 280 285 Ile Ala Phe Gly Leu Phe Ile Val Thr Asn Ala Ala Lys Leu Thr Val 290 295 300 Ala Val Ala Arg Ile Ala Leu Pro Pro Ile Pro Val Pro Gly Glu Thr 305 310 315 320 Val Asp Asn Glu Glu Leu Leu Asp Pro Val Ala Thr Pro Glu Ala Thr 325 330 335 Ser Glu Glu Thr Pro Thr Trp Gln Ala Ile Ile Ala Ser Val Pro Ala 340 345 350 Ser Ala Val Arg Leu Thr Glu Arg Ser Lys Leu Ala Lys Gln Leu Leu 355 360 365 Ile Gly Tyr Val Thr Ser Gly Thr Leu Ile Leu Ala Ala Gly Ala Ile 370 375 380 Ala Val Val Val Arg Gly His Phe Phe Val His Ser Leu Val Val Ala 385 390 395 400 Gly Leu Ile Thr Thr Val Cys Gly Phe Arg Ser Arg Leu Tyr Ala Glu 405 410 415 Arg Trp Cys Ala Trp Ala Leu Leu Ala Ala Thr Val Ala Ile Pro Thr 420 425 430 Gly Leu Thr Ala Lys Leu Ile Ile Trp Tyr Pro His Tyr Ala Trp Leu 435 440 445 Leu Leu Ser Val Tyr Leu Thr Val Ala Leu Val Ala Leu Val Val Val 450 455 460 Gly Ser Met Ala His Val Arg Arg Val Ser Pro Val Val Lys Arg Thr 465 470 475 480 Leu Glu Leu Ile Asp Gly Ala Met Ile Ala Ala Ile Ile Pro Met Leu 485 490 495 Leu Trp Ile Thr Gly Val Tyr Asp Thr Val Arg Asn Ile Arg Phe 500 505 510 <210> 15 <211> 280 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 15 Met Ala Glu Pro Leu Ala Val Asp Pro Thr Gly Leu Ser Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Gly Leu Val Phe Pro Gln Pro Pro Ala Pro Ile Ala 20 25 30 Val Ser Gly Thr Asp Ser Val Val Ala Ala Ile Asn Glu Thr Met Pro 35 40 45 Ser Ile Glu Ser Leu Val Ser Asp Gly Leu Pro Gly Val Lys Ala Ala 50 55 60 Leu Thr Arg Thr Ala Ser Asn Met Asn Ala Ala Ala Asp Val Tyr Ala 65 70 75 80 Lys Thr Asp Gln Ser Leu Gly Thr Ser Leu Ser Gln Tyr Ala Phe Gly 85 90 95 Ser Ser Gly Glu Gly Leu Ala Gly Val Ala Ser Val Gly Gly Gln Pro 100 105 110 Ser Gln Ala Thr Gln Leu Leu Ser Thr Pro Val Ser Gln Val Thr Thr 115 120 125 Gln Leu Gly Glu Thr Ala Ala Glu Leu Ala Pro Arg Val Val Ala Thr 130 135 140 Val Pro Gln Leu Val Gln Leu Ala Pro His Ala Val Gln Met Ser Gln 145 150 155 160 Asn Ala Ser Pro Ile Ala Gln Thr Ile Ser Gln Thr Ala Gln Gln Ala 165 170 175 Ala Gln Ser Ala Gln Gly Gly Ser Gly Pro Met Pro Ala Gln Leu Ala 180 185 190 Ser Ala Glu Lys Pro Ala Thr Glu Gln Ala Glu Pro Val His Glu Val 195 200 205 Thr Asn Asp Asp Gln Gly Asp Gln Gly Asp Val Gln Pro Ala Glu Val 210 215 220 Val Ala Ala Ala Arg Asp Glu Gly Ala Gly Ala Ser Pro Gly Gln Gln 225 230 235 240 Pro Gly Gly Gly Val Pro Ala Gln Ala Met Asp Thr Gly Ala Gly Ala 245 250 255 Arg Pro Ala Ala Ser Pro Leu Ala Ala Pro Val Asp Pro Ser Thr Pro 260 265 270 Ala Pro Ser Thr Thr Thr Thr Leu 275 280 <210> 16 <211> 729 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 16 Met Ser Ile Thr Arg Pro Thr Gly Ser Tyr Ala Arg Gln Met Leu Asp 1 5 10 15 Pro Gly Gly Trp Val Glu Ala Asp Glu Asp Thr Phe Tyr Asp Arg Ala 20 25 30 Gln Glu Tyr Ser Gln Val Leu Gln Arg Val Thr Asp Val Leu Asp Thr 35 40 45 Cys Arg Gln Gln Lys Gly His Val Phe Glu Gly Gly Leu Trp Ser Gly 50 55 60 Gly Ala Ala Asn Ala Ala Asn Gly Ala Leu Gly Ala Asn Ile Asn Gln 65 70 75 80 Leu Met Thr Leu Gln Asp Tyr Leu Ala Thr Val Ile Thr Trp His Arg 85 90 95 His Ile Ala Gly Leu Ile Glu Gln Ala Lys Ser Asp Ile Gly Asn Asn 100 105 110 Val Asp Gly Ala Gln Arg Glu Ile Asp Ile Leu Glu Asn Asp Pro Ser 115 120 125 Leu Asp Ala Asp Glu Arg His Thr Ala Ile Asn Ser Leu Val Thr Ala 130 135 140 Thr His Gly Ala Asn Val Ser Leu Val Ala Glu Thr Ala Glu Arg Val 145 150 155 160 Leu Glu Ser Lys Asn Trp Lys Pro Pro Lys Asn Ala Leu Glu Asp Leu 165 170 175 Leu Gln Gln Lys Ser Pro Pro Pro Pro Asp Val Pro Thr Leu Val Val 180 185 190 Pro Ser Pro Gly Thr Pro Gly Thr Pro Gly Thr Pro Ile Thr Pro Gly 195 200 205 Thr Pro Ile Thr Pro Gly Thr Pro Ile Thr Pro Ile Pro Gly Ala Pro 210 215 220 Val Thr Pro Ile Thr Pro Thr Pro Gly Thr Pro Val Thr Pro Val Thr 225 230 235 240 Pro Gly Lys Pro Val Thr Pro Val Thr Pro Val Lys Pro Gly Thr Pro 245 250 255 Gly Glu Pro Thr Pro Ile Thr Pro Val Thr Pro Pro Val Ala Pro Ala 260 265 270 Thr Pro Ala Thr Pro Ala Thr Pro Val Thr Pro Ala Pro Ala Pro His 275 280 285 Pro Gln Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Pro Gly Pro Gln Pro Val 290 295 300 Thr Pro Ala Thr Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Thr Pro Gly Thr Pro 305 310 315 320 Gly Gly Glu Pro Ala Pro His Val Lys Pro Ala Ala Leu Ala Glu Gln 325 330 335 Pro Gly Val Pro Gly Gln His Ala Gly Gly Gly Thr Gln Ser Gly Pro 340 345 350 Ala His Ala Asp Glu Ser Ala Ala Ser Val Thr Pro Ala Ala Ala Ser 355 360 365 Gly Val Pro Gly Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Gly Thr Ala 370 375 380 Val Gly Ala Gly Ala Arg Ser Ser Val Gly Thr Ala Ala Ala Ser Gly 385 390 395 400 Ala Gly Ser His Ala Ala Thr Gly Arg Ala Pro Val Ala Thr Ser Asp 405 410 415 Lys Ala Ala Ala Pro Ser Thr Arg Ala Ala Ser Ala Arg Thr Ala Pro 420 425 430 Pro Ala Arg Pro Pro Ser Thr Asp His Ile Asp Lys Pro Asp Arg Ser 435 440 445 Glu Ser Ala Asp Asp Gly Thr Pro Val Ser Met Ile Pro Val Ser Ala 450 455 460 Ala Arg Ala Ala Arg Asp Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Arg Gln 465 470 475 480 Arg Gly Arg Gly Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Arg Ile Ala Ala Ala 485 490 495 Leu Asn Ala Ser Asp Asn Asn Ala Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Trp Ile 500 505 510 Thr Ala Val Thr Thr Asp Gly Ser Ile Val Val Ala Asn Ser Tyr Gly 515 520 525 Leu Ala Tyr Ile Pro Asp Gly Met Glu Leu Pro Asn Lys Val Tyr Leu 530 535 540 Ala Ser Ala Asp His Ala Ile Pro Val Asp Glu Ile Ala Arg Cys Ala 545 550 555 560 Thr Tyr Pro Val Leu Ala Val Gln Ala Trp Ala Ala Phe His Asp Met 565 570 575 Thr Leu Arg Ala Val Ile Gly Thr Ala Glu Gln Leu Ala Ser Ser Asp 580 585 590 Pro Gly Val Ala Lys Ile Val Leu Glu Pro Asp Asp Ile Pro Glu Ser 595 600 605 Gly Lys Met Thr Gly Arg Ser Arg Leu Glu Val Val Asp Pro Ser Ala 610 615 620 Ala Ala Gln Leu Ala Asp Thr Thr Asp Gln Arg Leu Leu Asp Leu Leu 625 630 635 640 Pro Pro Ala Pro Val Asp Val Asn Pro Pro Gly Asp Glu Arg His Met 645 650 655 Leu Trp Phe Glu Leu Met Lys Pro Met Thr Ser Thr Ala Thr Gly Arg 660 665 670 Glu Ala Ala His Leu Arg Ala Phe Arg Ala Tyr Ala Ala His Ser Gln 675 680 685 Glu Ile Ala Leu His Gln Ala His Thr Ala Thr Asp Ala Ala Val Gln 690 695 700 Arg Val Ala Val Ala Asp Trp Leu Tyr Trp Gln Tyr Val Thr Gly Leu 705 710 715 720 Leu Asp Arg Ala Leu Ala Ala Ala Cys 725 <210> 17 <211> 115 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 17 Val Ser Met Asp Glu Leu Asp Pro His Val Ala Arg Ala Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ala Ala Arg Phe Gln Ser Ala Leu Asp Gly Thr Leu Asn Gln Met Asn 20 25 30 Asn Gly Ser Phe Arg Ala Thr Asp Glu Ala Glu Thr Val Glu Val Thr 35 40 45 Ile Asn Gly His Gln Trp Leu Thr Gly Leu Arg Ile Glu Asp Gly Leu 50 55 60 Leu Lys Lys Leu Gly Ala Glu Ala Val Ala Gln Arg Val Asn Glu Ala 65 70 75 80 Leu His Asn Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Tyr Asn Asp Ala Ala Gly 85 90 95 Glu Gln Leu Thr Ala Ala Leu Ser Ala Met Ser Arg Ala Met Asn Glu 100 105 110 Gly Met Ala 115 <210> 18 <211> 460 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 18 Met Thr Gln Ser Gln Thr Val Thr Val Asp Gln Gln Glu Ile Leu Asn 1 5 10 15 Arg Ala Asn Glu Val Glu Ala Pro Met Ala Asp Pro Pro Thr Asp Val 20 25 30 Pro Ile Thr Pro Cys Glu Leu Thr Ala Ala Lys Asn Ala Ala Gln Gln 35 40 45 Leu Val Leu Ser Ala Asp Asn Met Arg Glu Tyr Leu Ala Ala Gly Ala 50 55 60 Lys Glu Arg Gln Arg Leu Ala Thr Ser Leu Arg Asn Ala Ala Lys Ala 65 70 75 80 Tyr Gly Glu Val Asp Glu Glu Ala Ala Thr Ala Leu Asp Asn Asp Gly 85 90 95 Glu Gly Thr Val Gln Ala Glu Ser Ala Gly Ala Val Gly Gly Asp Ser 100 105 110 Ser Ala Glu Leu Thr Asp Thr Pro Arg Val Ala Thr Ala Gly Glu Pro 115 120 125 Asn Phe Met Asp Leu Lys Glu Ala Ala Arg Lys Leu Glu Thr Gly Asp 130 135 140 Gln Gly Ala Ser Leu Ala His Phe Ala Asp Gly Trp Asn Thr Phe Asn 145 150 155 160 Leu Thr Leu Gln Gly Asp Val Lys Arg Phe Arg Gly Phe Asp Asn Trp 165 170 175 Glu Gly Asp Ala Ala Thr Ala Cys Glu Ala Ser Leu Asp Gln Gln Arg 180 185 190 Gln Trp Ile Leu His Met Ala Lys Leu Ser Ala Ala Met Ala Lys Gln 195 200 205 Ala Gln Tyr Val Ala Gln Leu His Val Trp Ala Arg Arg Glu His Pro 210 215 220 Thr Tyr Glu Asp Ile Val Gly Leu Glu Arg Leu Tyr Ala Glu Asn Pro 225 230 235 240 Ser Ala Arg Asp Gln Ile Leu Pro Val Tyr Ala Glu Tyr Gln Gln Arg 245 250 255 Ser Glu Lys Val Leu Thr Glu Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Leu Glu Pro 260 265 270 Val Asn Pro Pro Lys Pro Pro Pro Ala Ile Lys Ile Asp Pro Pro Pro 275 280 285 Pro Pro Gln Glu Gln Gly Leu Ile Pro Gly Phe Leu Met Pro Pro Ser 290 295 300 Asp Gly Ser Gly Val Thr Pro Gly Thr Gly Met Pro Ala Ala Pro Met 305 310 315 320 Val Pro Pro Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Leu Pro Ala Asp Thr Ala 325 330 335 Ala Gln Leu Thr Ser Ala Gly Arg Glu Ala Ala Ala Leu Ser Gly Asp 340 345 350 Val Ala Val Lys Ala Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val 355 360 365 Pro Ser Ala Pro Leu Gly Ser Ala Ile Gly Gly Ala Glu Ser Val Arg 370 375 380 Pro Ala Gly Ala Gly Asp Ile Ala Gly Leu Gly Gln Gly Arg Ala Gly 385 390 395 400 Gly Gly Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Met Gly Met Pro Met Gly Ala 405 410 415 Ala His Gln Gly Gln Gly Gly Ala Lys Ser Lys Gly Ser Gln Gln Glu 420 425 430 Asp Glu Ala Leu Tyr Thr Glu Asp Arg Ala Trp Thr Glu Ala Val Ile 435 440 445 Gly Asn Arg Arg Arg Gln Asp Ser Lys Glu Ser Lys 450 455 460 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 19 Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 20 Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 21 Ala Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 22 Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 23 Ser Leu Leu Asp Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 24 Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 25 Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 26 Gly Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 27 Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 28 Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 29 Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 30 Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 31 Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala 1 5 10 15 <210> 32 <211> 462 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 32 Met Arg Asn Pro Leu Gly Leu Arg Phe Ser Thr Gly His Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ser Ala Leu Ala Pro Pro Cys Ile Ile Ala Phe Leu Glu Thr Arg 20 25 30 Tyr Trp Trp Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ser Leu Gly Val Ile Val Ala 35 40 45 Thr Val Thr Phe Tyr Gly Arg Arg Ile Thr Gly Trp Val Ala Ala Val 50 55 60 Tyr Ala Trp Leu Arg Arg Arg Arg Arg Pro Pro Asp Ser Ser Ser Glu 65 70 75 80 Pro Val Val Gly Ala Thr Val Lys Pro Gly Asp His Val Ala Val Arg 85 90 95 Trp Gln Gly Glu Phe Leu Val Ala Val Ile Glu Leu Ile Pro Arg Pro 100 105 110 Phe Thr Pro Thr Val Ile Val Asp Gly Gln Ala His Thr Asp Asp Met 115 120 125 Leu Asp Thr Gly Leu Val Glu Glu Leu Leu Ser Val His Cys Pro Asp 130 135 140 Leu Glu Ala Asp Ile Val Ser Ala Gly Tyr Arg Val Gly Asn Thr Ala 145 150 155 160 Ala Pro Asp Val Val Ser Leu Tyr Gln Gln Val Ile Gly Thr Asp Pro 165 170 175 Ala Pro Ala Asn Arg Arg Thr Trp Ile Val Leu Arg Ala Asp Pro Glu 180 185 190 Arg Thr Arg Lys Ser Ala Gln Arg Arg Asp Glu Gly Val Ala Gly Leu 195 200 205 Ala Arg Tyr Leu Val Ala Ser Ala Thr Arg Ile Ala Asp Arg Leu Ala 210 215 220 Ser His Gly Val Asp Ala Val Cys Gly Arg Ser Phe Asp Asp Tyr Asp 225 230 235 240 His Ala Thr Asp Ile Gly Phe Val Arg Glu Lys Trp Ser Met Ile Lys 245 250 255 Gly Arg Asp Ala Tyr Thr Ala Ala Tyr Ala Ala Pro Gly Gly Pro Asp 260 265 270 Val Trp Trp Ser Ala Arg Ala Asp His Thr Ile Thr Arg Val Arg Val 275 280 285 Ala Pro Gly Met Ala Pro Gln Ser Thr Val Leu Leu Thr Thr Ala Asp 290 295 300 Lys Pro Lys Thr Pro Arg Gly Phe Ala Arg Leu Phe Gly Gly Gln Arg 305 310 315 320 Pro Ala Leu Gln Gly Gln His Leu Val Ala Asn Arg His Cys Gln Leu 325 330 335 Pro Ile Gly Ser Ala Gly Val Leu Val Gly Glu Thr Val Asn Arg Cys 340 345 350 Pro Val Tyr Met Pro Phe Asp Asp Val Asp Ile Ala Leu Asn Leu Gly 355 360 365 Asp Ala Gln Thr Phe Thr Gln Phe Val Val Arg Ala Ala Ala Ala Gly 370 375 380 Ala Met Val Thr Val Gly Pro Gln Phe Glu Glu Phe Ala Arg Leu Ile 385 390 395 400 Gly Ala His Ile Gly Gln Glu Val Lys Val Ala Trp Pro Asn Ala Thr 405 410 415 Thr Tyr Leu Gly Pro His Pro Gly Ile Asp Arg Val Ile Leu Arg His 420 425 430 Asn Val Ile Gly Thr Pro Arg His Arg Gln Leu Pro Ile Arg Arg Val 435 440 445 Ser Pro Pro Glu Glu Ser Arg Tyr Gln Met Ala Leu Pro Lys 450 455 460 <210> 33 <211> 446 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 33 Val His Arg Ile Phe Leu Ile Thr Val Ala Leu Ala Leu Leu Thr Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ala Ser Ala Ile Thr Pro Pro Pro Ile Asp Pro Gly Ala Leu 20 25 30 Pro Pro Asp Val Thr Gly Pro Asp Gln Pro Thr Glu Gln Arg Val Leu 35 40 45 Cys Ala Ser Pro Thr Thr Leu Pro Gly Ser Gly Phe His Asp Pro Pro 50 55 60 Trp Ser Asn Thr Tyr Leu Gly Val Ala Asp Ala His Lys Phe Ala Thr 65 70 75 80 Gly Ala Gly Val Thr Val Ala Val Ile Asp Thr Gly Val Asp Ala Ser 85 90 95 Pro Arg Val Pro Ala Glu Pro Gly Gly Asp Phe Val Asp Gln Ala Gly 100 105 110 Asn Gly Leu Ser Asp Cys Asp Ala His Gly Thr Leu Thr Ala Ser Ile 115 120 125 Ile Ala Gly Arg Pro Ala Pro Thr Asp Gly Phe Val Gly Val Ala Pro 130 135 140 Asp Ala Arg Leu Leu Ser Leu Arg Gln Thr Ser Glu Ala Phe Glu Pro 145 150 155 160 Val Gly Ser Gln Ala Asn Pro Asn Asp Pro Asn Ala Thr Pro Ala Ala 165 170 175 Gly Ser Ile Arg Ser Leu Ala Arg Ala Val Val His Ala Ala Asn Leu 180 185 190 Gly Val Gly Val Ile Asn Ile Ser Glu Ala Ala Cys Tyr Lys Val Ser 195 200 205 Arg Pro Ile Asp Glu Thr Ser Leu Gly Ala Ser Ile Asp Tyr Ala Val 210 215 220 Asn Val Lys Gly Val Val Val Val Val Ala Ala Gly Asn Thr Gly Gly 225 230 235 240 Asp Cys Val Gln Asn Pro Ala Pro Asp Pro Ser Thr Pro Gly Asp Pro 245 250 255 Arg Gly Trp Asn Asn Val Gln Thr Val Val Thr Pro Ala Trp Tyr Ala 260 265 270 Pro Leu Val Leu Ser Val Gly Gly Ile Gly Gln Thr Gly Met Pro Ser 275 280 285 Ser Phe Ser Met His Gly Pro Trp Val Asp Val Ala Ala Pro Ala Glu 290 295 300 Asn Ile Val Ala Leu Gly Asp Thr Gly Glu Pro Val Asn Ala Leu Gln 305 310 315 320 Gly Arg Glu Gly Pro Val Pro Ile Ala Gly Thr Ser Phe Ala Ala Ala 325 330 335 Tyr Val Ser Gly Leu Ala Ala Leu Leu Arg Gln Arg Phe Pro Asp Leu 340 345 350 Thr Pro Ala Gln Ile Ile His Arg Ile Thr Ala Thr Ala Arg His Pro 355 360 365 Gly Gly Gly Val Asp Asp Leu Val Gly Ala Gly Val Ile Asp Ala Val 370 375 380 Ala Ala Leu Thr Trp Asp Ile Pro Pro Gly Pro Ala Ser Ala Pro Tyr 385 390 395 400 Asn Val Arg Arg Leu Pro Pro Pro Val Val Glu Pro Gly Pro Asp Arg 405 410 415 Arg Pro Ile Thr Ala Val Ala Leu Val Ala Val Gly Leu Thr Leu Ala 420 425 430 Leu Gly Leu Gly Ala Leu Ala Arg Arg Ala Leu Ser Arg Arg 435 440 445 <210> 34 <211> 103 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 34 Met Thr Gly Phe Leu Gly Val Val Pro Ser Phe Leu Lys Val Leu Ala 1 5 10 15 Gly Met His Asn Glu Ile Val Gly Asp Ile Lys Arg Ala Thr Asp Thr 20 25 30 Val Ala Gly Ile Ser Gly Arg Val Gln Leu Thr His Gly Ser Phe Thr 35 40 45 Ser Lys Phe Asn Asp Thr Leu Gln Glu Phe Glu Thr Thr Arg Ser Ser 50 55 60 Thr Gly Thr Gly Leu Gln Gly Val Thr Ser Gly Leu Ala Asn Asn Leu 65 70 75 80 Leu Ala Ala Ala Gly Ala Tyr Leu Lys Ala Asp Asp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Val Ile Asp Lys Ile Phe Gly 100

Claims (14)

  1. 재활성화를 예방하며,
    ⅰ) 서열번호 1
    ⅱ) 상기 ⅰ)의 서열중 어느 하나의 면역원성 부위;및
    ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 의 서열들 중 어느 하나에 적어도 70%의 서열 일치성을 가지며, 동시에 면역원성인 아미노산 서열 상동체
    로 구성되는 군으로부터 선택되고, 그리고 ESX-1 분비 시스템에 속하며,
    그리고 이때 백신 또는 면역원성 조성물은, 폴리 I:C와 함께 또는 없이, IC31 또는 DDA/TDB를 포함하는 항원 보강제를 포함하는,
    백신 또는 면역원성 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    면역원성 부위들의 혼합물을 포함하는 백신 또는 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    서열번호 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 및 31으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항원 폴리펩타이드들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 또는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항원 폴리펩타이드는 융합 파트너와 융합되고, 상기 융합 파트너는 마이코박테리아 과의 박테리아에 의하여 발현되는 항원인 것을 특징으로 하는 백신 또는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 융합 파트너는 항시 발현되는 항원인 것을 특징으로 하는 백신 또는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    CFP10에 융합된 ESAT6를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 또는 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이코박테리아 유전자들을 발현시키는, 유전자-변형된 박테리아, 바이러스들 또는 다른 생물들인 생 재조합 백신들, 또는 면역원성 DNA 백신들 또는 서열번호 1로부터 선택되는 항원 폴리펩타이드를 코드하는 유전자들, 또는 유전자 단편들, 또는 그것들의 면역원성 부위들을 발현시키는 플라스미드들인 다른 면역원성 전달 시스템들, 또는 항원 보강제에서 전달되는 단백질들 자체로부터 유래되는 합성 펩타이드들 또는 단백질들 자체인, 단백질 백신들로부터 선택되는 추가적인 전달 시스템을 포함하는 백신 또는 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 항원 보강제는 DDA/TDB를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 또는 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 폴리펩타이드는 폴리펩타이드가 자체-항원 보강 효과를 갖도록 지질화되는 것을 특징으로 하는 백신 또는 조성물.
  10. 잠복 결핵의 치료에 사용되는 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에서 규정된 항원 폴리펩타이드들로부터 선택되는 항원 폴리펩타이드.
  11. 병독성 마이코박테리아에 의하여 야기되는 결핵 감염의 재활성화에 대하여, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 백신 또는 면역원성 조성물을, 인간을 제외한 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 치료 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 급성기 후 및/또는 잠복기 감염 동안 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 방법은 병독성 마이코박테리아에 의하여 잠복 감염된 개체(subject)를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 병독성 마이코박테리아에 의하여 잠복 감염된 개체는 항시 발현된 항원으로 자극한 후 IP10의 검출, HBHA에 대한 반응의 인 비트로 검출, 콴티페론(Quantiferon) 검사 또는 망뚜(Mantoux) 투베르쿨린 피부 테스트(TST)로부터 선택되는 진단 절차에서 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
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