KR20170073647A - 형질전환 마우스 - Google Patents

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KR20170073647A
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크레센도 바이오로직스 리미티드
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Abstract

본 발명은 중쇄 유일 항체 및 VH 도메인의 제조를 위한 마우스 내 발현용 핵산 구조체, 형질전환 마우스, 관련 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

형질전환 마우스{TRANSGENIC MICE}
본 발명은 마우스 내 발현을 위한 핵산 구조체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 예를 들어 경쇄(L-사슬) 및 중쇄(H-사슬) 유전자좌의 발현이 손상된 마우스에서 제조된 중쇄-유일 항체(heavy chain-only antibodies)를 제조하는데 있어서 이러한 구조체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 중쇄-유일 항체로부터 유래된 단일 VH 도메인의 분리 및 용도에 관한 것이다.
대부분의 천연의 항체 또는 면역글로불린(Ig's)은 전형적으로 두 개의 무거운(H) 사슬 및 두 개의 가벼운(L) 사슬을 포함한다. H-사슬은 유연한 힌지 도메인 근처에 위치한 이황화 결합에 의해서 서로 결합하고, 각각의 H-사슬은, H2L2 헤테로테트라머를 형성하기 위해서, 그것의 N-말단 영역에 결합된 L-사슬 이황화 결합을 갖는다. 각각의 L-사슬은 가변(VL) 및 불변(CL) 도메인을 갖는 반면, 각각의 H-사슬은 가변 도메인(VH), 첫번째 불변 도메인(CH1), 힌지 도메인 및 2개 또는 3개의 추가 불변 도메인(CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 포함한다. 정상 이량체 항체(H2L2)에서 각각의 VH 및 VL 도메인의 상호작용은 항원 결합 영역(CH1 도메인과 CL 도메인 사이의 상호작용은 중쇄 및 경쇄 사이의 기능적 결합을 가능하게 한다고도 알려져 있다)을 형성한다.
몇몇 상이한 분류의 천연의 Ig가 알려져 있다. 이러한 분류(또는 이소타입)은 결과적으로 Ig의 기능에 영향을 주는 그들의 H-사슬의 불변 도메인이 상이하다. 포유동물에서, Ig의 5개의 이소타입은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이다. IgA는 Cα 유전자 단편에 의해 인코딩되는 CH 도메인을 포함하고 점막 면역에 있어 중심적인 역할을 수행한다. 분비 IgA는 이량체이고, 한 개의 J 사슬에 의해 결합된 두 개의 H2L2 소단위를 포함하며, 일반적으로 우유 및 초유와 같은 분비물에 풍부하다. 혈청 IgA는 인간에서 H2L2 단량체로 존재한다. IgD는 Cδ 유전자 단편에 의해서 인코딩되는 CH 도메인을 포함하고, 단량체이며, 항체 제조를 담당하는 세포인 B 세포 상의 항원 수용체로서 기능 한다. IgE는 Cε 유전자 단편에 의해서 인코딩되는 CH 도메인을 갖고, 또한 단량체이며, 친화도가 높은 비만 세포 상의 Fcε 수용체에 결합하는 경우 사이토카인과 히스타민(알러지 반응)의 방출을 유발하는 알레르겐에 의해서 가교 결합될 수 있다. IgG는 인간에서 4개의 상이한 아형으로 존재하고, 이들 모두는 단량체이며 Cγ 유전자 단편에 의해서 인코딩되는 CH 도메인을 포함한다. IgG 이소타입은 성숙 항체-기반 (체액성) 면역 반응의 대부분을 구성한다. 마지막으로, IgM는 Cμ 유전자 단편에 의해서 인코딩되는 CH 도메인을 가지며, (IgG, A 및 E와 유사하게) B 세포의 표면 상에서 그리고 분비 형태 모두로 발현된다. 분비된 IgM은 오량체이고 초기 체액성 반응의 일부로서 병원체를 제거하는 데 중요한 역할을 한다.
B 세포에서 정상 Ig 발현은 유전자 재배치의 정렬된 연속을 수반한다. H-사슬의 가변 영역을 인코딩하는 엑손은 인 비보에서 VH, 다양성(D) 및 결합(JH) 단편의 조립에 의해서 구성된다. L-사슬에 대한 가변 영역은 VL과 JL 단편의 조립에 의해서 동일한 과정으로 편집된다. 재배치된 VDJ 영역은 초기에 Cμ 유전자 단편과 결합되어 전사되고, IgM H-사슬의 합성을 유도한다. 이어서, 주변부에서, 스위치 재조합이 VDJ 엑손에 가까운 하류의 CH 유전자 단편(δ,γ, α 또는 ε)를 가져오고 결과적으로 Ig 분류 스위칭(IgG class switching)이 일어난다. L-사슬 없는 H-사슬 Ig를 발현하는 B 세포의 성숙은 소포체에서 H-사슬의 사페론 결합에 의해 방해된다. 그러나, CH1이 H-사슬로부터 누락되면, 이러한 조절이 제거되고 H-사슬은 세포 표면에 방해받지 않으며 이동할 수 있고 분비될 수 있다. 사실, 본 발명자들은 이전에 예상치 못하게 L-/-(κ-/-λ-/--결핍) 마우스가 혈청에서 어떠한 추가적인 유전적 조작 없이 다양한 H 사슬-유일 항체를 생산하며 그들은 상대적으로 낮은 수준에서 H-사슬 전사물 유래의 CH1 엑손의 자발적인 소실의 결과로 그렇게 되는 것을 밝혔다.
낙타목 또는 낙타과(단봉낙타, 낙타 및 라마)에서, 쌍을 이루는 중쇄(중쇄 유일 항체, HCAb)만으로 구성된 주요한 유형의 Ig는 통상적인 H2L2 항체에 더하여 항원에 대한 정상 체액성 면역 반응의 일부로서 생산된다(Padlan, E.A. 1994, Mol. Immunol. 31:169-217). 이러한 동물에서 HCAb 발현을 유도하는 발달 과정은 알려져 있지 않지만, 그들이 통상적인 중쇄보다 더 작아지는 결과를 유도하는, CH1 도메인이 결핍된(RNA 전사물의 선택적 스플라이싱에 의해 제거됨) 특정 분류의 VH (VHH) 및 Cγ 유전자를 사용하는 것이 알려져 있다. 중쇄 항체는 또한 일부 원시 어류에서 존재하는데, 예컨대 수염 상어에서 신규 항원 수용체(new antigen receptor: NAR) 및 은상어에서 특수한 중쇄(COS5)이다(Greenberg et al, 1996, Eur. J. Immunol. 26:1123-1129, Rast et al, 1998, Immunogenetics, 47:234-245). 반복하여 이러한 중쇄 Ig는 CH1유형 도메인이 결핍되어 있다.
통상적인 항체는 타겟 항원에 대한 그들의 탁월한 선택성, 특이성 및 효능에 기초하여 오랫동안 강력한 도구로 고려되어 왔다. 사실, 이제 그들은 2012년에 540억 달러의 매출을 갖는 앞으로도 계속하여 상당히 성장할 것으로 기대되는 매우 효과적인 치료제로서 잘 정립되었다. 그러나, 차세대 항체 기반 치료제 후보를 도출하기 위해 대체 형식 및 더 작은 단편의 이점을 활용할 필요성이 증가하고 있다.
VH 또는 VHH 단편은 타겟 특이성 및 효능 및 안정성, 용해도, 공학 및 제조의 용이성 측면에서 가장 견고한 항체 단편을 갖는 면역글로불린 분자의 최소 부분이다. 이것은 국부 및 국소 전달, 순수한 길항제 및 이중 또는 다중 특이성을 위한 제품의 개발에 특히 중요한 이점을 갖는 매우 매력적인 치료제로 만든다. 특히, 잠재적인 의약품으로 사용되는 낙타 VHH 도메인의 잠재력은 많은 관심을 끌고 있다. 그러나, 그들이 인간 아미노산 서열을 가지고 있지 않다는 사실은 인간에게 투여될 때(특히 질병 증상이 만성 투여를 필요로 하는 경우), 항-약물 항체 반응을 유도할 가능성을 가지고 있기 때문에 낙타 VHH 도메인이 최적의 약물 후보가 되지 않는 하나의 중요한 특징이다.
결과적으로 치료제 후보로서 인간 VH(또는 VL) 도메인의 제조에 대한 많은 관심이 있어 왔다. 통상적인 항체로부터 유래된 VH 도메인은 부재시에 발현되기 어렵고, 종종 불용성이며 타겟 항원에 대한 결합 친화력 및 특이성의 손실을 겪는 동안 동반 VL 도메인을 필요로 하는 것이 잘 알려져 있다. 결과적으로, 파트너 도메인의 존재 하에서 발달된 도메인을 이용하여 설계된 인 비트로 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 분리된 인간 VH(또는 VL) 도메인은 용해도 및 안정성을 향상시키기 위해 상당한 엔지니어링이 필요하다.
본 발명은 CH1을 갖지 않는 다양한 HCAb가 녹아웃 마우스에서 그들의 천연의 형태인 10 이상의 기능적 인간 및 비-조작된 V 유전자를 포함하는 키메라 핵산 구조체를 발현시킴으로써 생산될 수 있다는 놀라운 발견(하기 실시예 참조)로부터 발생하였다. 인간 또는 그것의 게놈에 통합된 키메라 중쇄 유전자좌를 갖는 본 발명의 마우스에서 HCAb의 생산은 치료제의 생산에 있어 수많은 이점을 제공한다. 이러한 HCAb 항체는, 인 비보에서 파트너 VL 도메인의 부존재 하에 성숙된 완전한 인간 VH 도메인을 포함한다. 이러한 HCAb로부터 유래된 VH 도메인은 매우 효능이 있고, 가용성이며, 안정하고 높은 수준으로 발현될 수 있다.
선행기술은 면역글로불린 경쇄가 기능적으로 침묵되고 H-사슬 전사물이 자연적으로 자발적인 CH1 엑손의 결실을 겪은 마우스에서 중쇄-유일 항체의 생산을 개시한다(US 12/455,913). 또한 선행기술은 낙타과의 VHH 유전자를 포함하는 구조체를 이용한 HCAb의 생산을 개시한다(예를 들어 WO 2006/008548 참조).
본 발명은 마우스의 형질전환을 위한 개선된 구조체 및 인간 VH 도메인의 생산을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 양상에서, 본 발명은
a) 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자(functional human heavy chain V genes)로서, 그들의 천연의 형태인 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자;
b) 1 이상의 인간 중쇄 D 유전자 및 1 이상의 인간 중쇄 J 유전자;
c) CH1 엑손이 결핍된 쥐과(murine) C 영역(region)
을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 벡터는 쥐과 3' 인핸서 영역 또는 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역 또는 유전자는 약 42kb 이상의 크기이다. 일 구현예에서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역은 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 인핸서 요소를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역은 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7을 포함한다.
또한 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 쥐과 숙주 세포에 관한 것이다. 추가적으로 본 발명은 본 발명에 따른 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 형질전환 마우스에 관한 것이다. 바람직하게, 마우스는 어떠한 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 제조하지 않는 삼중 녹아웃 마우스이다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 본 발명의 형질전환 마우스에서 제조되거나 형질전환 마우스로부터 수득할 수 있는 중쇄 유일 항체 또는 VH 도메인에 관한 것이다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 마우스에서 본 발명에 따른 벡터를 도입 및 발현하는 단계를 포함하는 HCAb, 이의 단편 또는 이로부터 유래된 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 단편은 VH 도메인이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 인간 VH 영역 및 CH1 영역이 결핍된 쥐과 불변 영역을 포함하는 중쇄 유일 항체에 관한 것이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 수득된 또는 수득할 수 있는 VH 도메인에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 라이브러리, 예컨대 나이브(naive) 라이브러리 구축에있어서 본 발명의 형질전환 마우스의 용도에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 형질전환 마우스를 사용하여 라이브러리, 예컨대 나이브 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 형질전환 마우스의 엑스 비보 면역화 또는 본 발명의 형질전환 마우스의 조직 또는 세포의 엑스 비보 면역화를 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 것이다.
마지막 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 수득된 또는 수득할 수 있는 VH 도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 VH 도메인을 단독으로 또는 다른 VH 도메인, 단백질, 또는 치료 효과를 갖는 다른 분자와 조합하여 포함한다.
본 발명은 하기 비제한적인 도면에서 추가적으로 기술된다.
도 1: 인간 BAC.
도 2: 마우스 BAC.
도 3: 클로닝된 a1 및 a2를 갖는 pYAC3.
도 4: TAR 클로닝에 의한 BAC의 YAC으로의 전환.
도 5: BIT에 의한 두 개의 YAC의 결합. L: LYS2; A: ADE2; T: TRP1; U: URA3; K: KANr.
도 6: 마우스 Eμ-Sμ 영역의 증폭.
도 7: CH1이 제거된 마우스 Cγ1 단편의 증폭.
도 8: pYNOT 벡터.
도 9: Hy-HIS3-텔로미어 YAC 암 생산용 벡터 pHKT-Hy.
도 10: 본 발명의 구조체.
YAC1: 왼쪽부터 오른쪽으로, 텔로미어-효모 TRP1 마커 유전자-센트로미어-10 인간 V 유전자- 인간 D 유전자- 인간 J 유전자-마우스 μ 인핸서 및 스위치-마우스 Cγ1(CH1Δ) 유전자-마우스 3' 인핸서-하이그로마이신 저항성 유전자-효모 마커 유전자 HIS3-텔로미어.
YAC2: 왼쪽부터 오른쪽으로; 텔로미어-효모 TRP1 마커 유전자-센트로미어-23인간 V 유전자- 인간 D 유전자- 인간 J 유전자-마우스 μ 인핸서 및 스위치-마우스 Cγ1 (CH1Δ) 유전자-쥐과 3' 인핸서-하이그로마이신 저항성 유전자-효모 마커 유전자 HIS3-텔로미어.
YAC3: 왼쪽부터 오른쪽으로, 텔로미어-효모 TRP1 마커 유전자-센트로미어-23 인간 V 유전자- 인간 D 유전자- 인간 J 유전자-마우스 μ 인핸서 및 스위치-마우스 Cγ1 (CH1Δ) 유전자-마우스 Cγ2b (CH1Δ) 유전자-마우스 Cγ2a (CH1Δ) 유전자-마우스 3' 인핸서-하이그로마이신 저항성 유전자-효모 마커 유전자 HIS3-텔로미어.
도 11: 표적된 내인성 면역글로불린 사슬 유전자좌를 갖거나 갖지 않는 마우스로 유래의 gDNA를 사용한 유전형 분석 PCR 반응.
도 12: 혈청 내 마우스 면역글로불린 단백질의 ELISA. TKO 마우스는 혈청 내 마우스 중쇄를 갖지 않는다. TKO 마우스는 혈청 내 마우스 중쇄-경쇄 복합체를 갖지 않는다. TKO 마우스는 혈청 내 경쇄를 갖지 않는다.
도 13: 형질전환 과정의 도식 표현.
도 14: ES 클론 내에서 YAC 형질전환 유전자의 표적된 구축(build-on)의 도식.
도 15: 전핵 미세주입에 따라 태어난 새끼들 유래의 지노믹 DNA의 PCR 스크리닝 및 F0에서 F1 세대로의 생식세포 전달 시험. a) YAC1, b) 겔 전기영동, c) 결과.
도 16: 삽입된 YAC 형질전환 유전자의 복제 수.
도 17: 파지미드 벡터의 맵.
도 18: 재배치된 형질전환 유전자좌로부터 생성된 전사물의 예.
도 19: a) 및 b) 클로닝된 VH 서열의 다양성. 단일 나이브 형질전환 YAC1 마우스로부터 분리된 전사물의 서열 분석. 분석된 전체 서열: 409. 상이한 CDR3의 수: 346. 평균 CDR3 길이: 13.24. 모든 V 유전자가 활용되었다.
도 20: 혈청에서 HCAb를 검출한 ELISA.
도 21: 염색된 골수 세포를 사용한 유동세포분석.
도 22: a) 내지 c) 비장세포의 염색을 나타낸 유동세포분석.
도 23: 해마톡실린 및 에오신으로 염색된 후 비장 단편의 면역조직화학분석.
도 24: 면역화에 대한 HCAb 반응을 검출한 ELISA. 다양한 항원으로 면역화된 마우스 유래의 혈청을 면역화 전(출혈 전) 및 실험의 종기에 모았고 표적 항원에 결합하기 위한 ELISA로 실험하였다.
도 25: 파지 디스플레이 선별 과정의 도식.
도 26: 면역화된 마우스 유래의 클로닝된 VH의 파지 선별 전 및 후의 HIS-태깅된 조 VH 제조 물질의 ELISA.
도 27: 면역화된 마우스 유래의 선별 전 및 후 라이브러리의 서열. a) 선별 전 라이브러리 크기와 서열 다양성. 파지 라이브러리는 4마리의 면역화된 마우스로부터 구축되었고, 항원에 대한 선별 수행 전 소수(n=69)의 클론을 라이브러리 중 하나로부터 샘플링하고 서열 분석하였다. 이러한 클론 중에서 CDR3 길이의 분포 및 각각의 CDR3 서열의 발생 빈도를 나타내었다. 4개의 틀(framework) 영역(서열번호. 143, 144, 145, 146, 147 및 CDRs)을 갖는 클론 1은 b) c)에 나타내었다. ELISA에서 더 높은 친화도 결합을 유도하는 인 비보 체세포초돌연변이의 예를 나타내었다. 면역화된 마우스 유래의 파지 디스플레이를 사용하여 분리된 항원-결합 VH 군의 요약.
도 28: 선별된 VH에 대한 결합 동력학의 BIAcore 측정.
도 29: 수용체에 대한 리간드 결합의 VH 매개된 저해.
도 30: a) 및 b) 실험실 규모 배양 유래의 클로닝된 VH의 수율.
도 31: 정제된 재조합 VH의 녹는점.
도 32: 정제된 VH의 HPLC 분석.
도 33: 삼중 KO 백그라운드에서 YAC2를 운반하는 형질전환 마우스가 내인성 경쇄 혼합이 없는 HCAb를 생산함을 증명하는 ELISA. 임의의 내인성 경쇄(HC -/-, 카파 -/-, 람다 +/- OR HC -/-, 카파 +/-, 람다 -/- OR HC -/-, 카파 +/-, 람다 +/-)의 존재는 경쇄와 짝을 이룬 HCAb를 야기한다.
도 34: 3개의 상이한 항원으로 면역화된 마우스로부터 분리된 812개의 항원-결합 VH 클론의 Kabat 및 Wu 변이성 플롯(Variability Plot). 각각의 아미노산 위치에서의 % 변이성을 플로팅하였다. 각각의 표시된 아미노산 위치에는, 순서대로 VH1 (16 클론), VH2 (14 클론), VH3 (514 클론), VH4 (163 클론) 및 VH6 (105 클론) 군 서열을 나타내는 5개의 바(bar)가 있다. CDR1, CDR2 및 CDR3 루프를 형성하는 서열은 박스로 나타내었다.
도 35: 나이브 라이브러리. VH1, 2, 3, 4 및 6 라이브러리가 113개의 나이브 YAC1 마우스의 비장으로부터 생성되었다.
i.) 각각의 라이브러리에서 클론의 수.
ⅱ.) 우수한 다양성을 나타내는 각각의 나이브 라이브러리 유래 시료의 서열 분석.
ⅲ.) 각각의 나이브 라이브러리 유래 서열 시료에서 CDR3 아미노산 길이의 빈도.
본 발명을 추가적으로 기술한다. 하기에서, 본 발명의 상이한 양상이 보다 구체적으로 정의된다. 이와 같이 정의된 각각의 양상은 명확하게 반대되는 것으로 표시된 경우를 제외하고는 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 유리하거나 바람직한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다. 본 발명의 실시는 달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 있는 면역학, 분자생물학, 화학, 생화학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어있다.
효모인공염색체(Yeast artificial chromosomes: YAC)는 효모에서 매우 큰 DNA 삽입물의 클로닝을 위해 사용될 수 있는 벡터이다. 천연의 효모 염색체와 같이 행동하기 위해 필수적인 모든 세개의 시스-작용 구성 인자(cis-acting structural element), (자가복제서열(autonomously replicating sequence: ARS), 센트로미어(centromere: CEN) 및 두 개의 텔로미어(telomere: TEL))를 포함할 뿐만 아니라, 큰 DNA 삽입물을 받아들일 수 있는 그들의 능력은 그들이 염색체-유사 안정성 및 효모 세포에서 전달의 정확도에 필요한 최소 크기(150 kb)에 도달할 수 있도록 한다. YAC의 구조 및 사용은 당업계에 잘 알려져 있다(예컨대, Bruschi, C.V. 및 Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group / www.els.net).
본 발명자들은 마우스에서 발현을 위한 일련의 YAC을 제조했다(도 10). 이러한 YAC들은 형질전환 마우스에서 B 세포 중쇄-유일 항체 목록을 일으키기 위한 체세포 재조합을 겪을 수 있는 인간 중쇄 유전자좌를 암호화한다. 이러한 일련의 YAC은 YAC2 또는 YAC3보다 더 적은 VH 유전자 단편을 갖는 YAC1 및 추가적인 가능한 면역글로불린 불변 영역 유전자를 갖는 YAC3을 가지며 복잡성이 증가된다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 일련의 YAC은 V(N)이 쥐과 불변 영역과 조합하여 10 이상의 생식세포 형태의 인간 VH를 갖는 추가적 VH 유전자를 갖는 추가적인 YAC 구조체를 위한 기초를 형성할 수 있다.
예를 들어, 배아줄기세포에 구조체의 형질감염(transfection), 선별 및 ES 클론의 스크리닝을 돕기 위해 또는 형질전환 동안 정해진 결합을 촉진하기 위한 추가적인 특징 또한 본 발명의 YAC 구조체에 포함될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. YAC 이외의 벡터가 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 벡터, 벡터 구조체, 구조체 또는 전이유전자는 항원 챌린지에 대한 반응으로 형질전환 마우스에서 선택 유형의 완전한 기능적, 항원-특이성, 높은 친화성 HCAb 또는 VH 결합 도메인을 제조하는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명에 발현 벡터는 인간 및 쥐과 기원의 서열을 포함하는 키메라 중쇄 유전자좌를 갖는다. 따라서, 벡터는 이종의 중쇄 유전자좌를 포함한다. 벡터는 CH1 도메인을 인코딩하지 않는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 벡터는 설치류에서 이종의 중쇄 유전자좌의 발현에 사용될 수 있다. 설치류, 예컨대 마우스에서 발현될 때, 유전자좌는 안정하고 가용성인 HCAb 또는 VH 도메인을 형성할 수 있다.
본원에 기술된 발명의 다양한 양상의 일 구현예에서, 상기 벡터는 YAC이다. 그러나, 당업자에게 공지된 다른 벡터, 예컨대 BAC 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은
a) 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자(functional human heavy chain V genes)로서, 그들의 천연의 형태인 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자;
b) 1 이상의 인간 중쇄 D 유전자 및 1 이상의 인간 중쇄 J 유전자;
c) CH1 엑손이 결핍된 쥐과 C 유전자;
를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 구조체는 쥐과 3' 인핸서 영역 또는 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역 또는 유전자는 약 42kb 이상의 크기이다. 일 구현예에서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역은 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 인핸서 요소를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역은 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7을 포함한다.
일 구현예에서, 벡터는 하나 또는 그 이상의 쥐과 C 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 쥐과 C 유전자는 쥐과 Cγ1 유전자이다.
일 구현예에서, 벡터는 쥐과 μ 인핸서 및 스위치(switch) μ 요소 또는 스위치 γ 요소를 포함한다. 따라서, 스위치 μ 요소 또는 스위치 γ 요소는 쥐과 μ 인핸서의 하류에 위치하고 따라서 이러한 요소들은 그들의 천연의 형태이다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은
a) 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자로서, 실질적으로 그들의 천연의 형태인 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자;
b) 1 이상의 인간 중쇄 D 유전자 및 1 이상의 인간 중쇄 J 유전자;
c) 쥐과 μ 인핸서 및 스위치 μ 요소 또는 스위치 γ 요소;
d) CH1 엑손이 결핍된 쥐과 Cγ1 유전자 및
e) 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7을 포함하는 쥐과 3' 인핸서 유전자
를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
a) 내지 e)로 나열된 요소들은 5'→3' 순서이다. 본 발명의 벡터는 키메라이고 인간 및 쥐과 서열을 포함한다. 인간 서열은 벡터의 5' 말단에 위치하고 중쇄 V, D 및 J 유전자를 포함한다. 인간 J 유전자의 하류에 위치한 벡터의 3' 영역은 쥐과 기원의 서열을 포함하고 인간 기원의 서열을 포함하지 않는다.
다른 곳에서 언급한 바와 같이, 일 구현예에서 벡터는 YAC이다.
일 구현예에서, 벡터는 약 0.5 MB 이상의 인간 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 벡터는 실질적으로 천연의 형태인 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 모든 기능적 인간 V 유전자에 대해 10개 이상을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, V 유전자의 수는 10 내지 약 44이다. 일 구현예에서, 기능적 V 유전자의 수는 10 내지 20, 10 내지 30 또는 10 내지 44이다. 일 구현예에서, 기능적 V 유전자의 수는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 28, 29, 40, 41, 42, 43 또는 44이다. 일 구현예에서, 기능적 V 유전자의 수는 10 내지 23이다.
일 구현예에서, 벡터는 기능적 V 유전자의 종열반복(tandem repeat)을 포함할 수 있다. 각각의 종열반복은 실질적으로 그들의 천연의 형태인 10 이상의 인간 중쇄 V 유전자를 포함한다. 따라서, 벡터는 10 내지 수백개 이상, 예컨대 10 내지 약 50, 10 내지 약 100, 10 내지 약 200 또는 그 이상의 기능적 V 유전자를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 벡터는 10 이상의 기능적 V 유전자를 포함할 수 있다. 각각의 종열반복 내에서, 10 이상의 기능적 V 유전자는 실질적으로 그들 천연의 형태이다.
예를 들어, 각각 10 또는 23 기능적 인간 중쇄 V 유전자를 갖는 본 발명에 따른 벡터를 도 10에 YAC1, 2 및 3으로 나타내었다. 그러나, 당업자는 본 발명이 도 10에 나타내어진 YAC에 제한되지 않으며, 본 발명에 따른 벡터의 다른 설계 특징이 손상되지 않는다면 추가적인 기능적 V 유전자가 제공될 수 있음을 이해할 것이다.
V 유전자는 인간 기원이며 기능적이다. 따라서, V 유전자는 유전자 산물을 인코딩하며 위유전자(pseudogene)가 아니다(비록 위유전자가 구조체 내에 존재할 수 있지만, 기능적 V 유전자의 수의 결정에는 포함되지 않는다).
또한, 본 발명의 벡터 구조체에 따르면, 벡터에 존재하는 10 이상의 기능적 V 유전자는 백터 내에 실질적으로 그들의 천연의 형태이다. 즉, 본 발명의 구조체는 실질적으로 재배열되지 않은 천연의 형태로 10 이상의 기능적 인간 V 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 구조체는 재배열되지 않는 천연의 형태로 10 이상의 기능적 인간 V 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 용어 천연의 형태는 유전자 순서 및/또는 DNA 서열을 지칭한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 벡터에 포함된 인간 V 유전자의 10 이상의 기능적 인간 V 유전자는 그들이 인간 생식세포에서 발견될 수 있는 것과 동일한 서열 순서이다. 즉, 본 발명의 구조체는 재배열되지 않은 순서인 10 이상의 기능적 인간 V 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 재배열되지 않은 순서인 10 기능적 인간 V 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 10 이상의 기능적 인간 V 유전자를 포함하고 이들 중 10개는 재배열되지 않은 순서이다. 일 구현예에서, 벡터는 10 이상의 기능적 인간 V 유전자를 포함하고 여기서 모두는 재배열되지 않은 순서이다. 따라서 본 발명은 그들이 더이상 자연의 순서로 존재하지 않도록 V 유전자가 선택되고 조합된 10 이상의 상이한 기능적 인간 V 유전자의 조합을 배제한다.
또한 그들의 천연의 순서인 10 이상의 V 유전자는 개입 유전자(intervening sequence)를 포함한다.
또한, 10 이상의 기능적 인간 V 유전자의 서열 및 그들의 개입 영역은 실질적으로 인간 생식세포에서 발견될 수 있다. 예를 들어, 서열은 인간 생식세포에서 발견될 수 있는 서열에 대하여 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 나타낸다. 개입 영역은 V 유전자에 대한 접근에 영향을 미치고 그들이 어떻게 항체 목록 생성에 사용되는지 결정할 때 중요하다. 당업자라면 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 벡터 구조체를 구축하기 위한 과정 동안 효모에서 재조합 사건에 기인하여 서열상의 작은 차이가 발생할 수 있다.
따라서, 바람직하게, 본 발명에 따라서, 본 발명의 구조체에 사용된 10 이상의 기능적 인간 V 유전자가 기능적 V 유전자 사이에 위치한 하나 또는 그 이상의 개입 서열을 제거 또는 변형하는 것을 목표로 하는 조작에 의해서 변형되지 않는다. 이러한 표적된 조작은 본 발명의 벡터 구조체를 구축하기 위한 과정 동안 효모 내의 재조합 사건에 기인한 서열상의 작은 차이를 배제한다. 따라서, 본 발명의 구조체는 실질적으로 천연의 서열인 10 이상의 기능적 인간 V 유전자를 포함한다.
또한, 바람직하게, V 유전자는 용해도를 증가시키기 위한 잔기를 변형하도록 설계되지 않는다. 즉, V 유전자는 자연발생적이다.
벡터, 예컨대 YAC에 사용된 본 발명의 기능적 인간 V 유전자의 특정 조합은 실시예에 나타내었다. 그러나, 벡터에 포함된 10 이상의 기능적 인간 V 유전자가 인간 생식세포에서 발견될 수 있는 것과 동일한 순서로 제공되는 HCAb의 생산적인 발현을 위해 사용될 수 있는 V 유전자 및 임의의 기능적 인간 V 유전자의 임의의 특정 조합이 요구되지 않는다.
상기 기술한 바와 같이, 벡터는 인간 중쇄 D 및 J 유전자를 포함한다. 따라서, 1 이상, 바람직하게는 그 이상의 인간 중쇄 D 유전자 및 1 이상, 바람직하게는 그 이상의 인간 J 유전자가 본 발명의 구조체에 존재한다. 일 구현예에서, 구조체는 1-19, 예컨대 5 이상, 10 이상, 15 또는 그 이상의 인간 중쇄 D 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 구조체는 5 이상, 10 이상, 15 또는 그 이상의 인간 중쇄 J 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 구조체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19의 인간 중쇄 J 및 D 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 구조체는 모든 인간 중쇄 D 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 구조체는 모든 인간 중쇄 J 유전자를 포함한다. 또다른 구현예에서, 인간 중쇄 D 및 J 유전자는 실질적으로 그들의 천연의 형태이다. 일 구현예에서, 인간 중쇄 D 및 J 유전자는 그들이 인간 생식세포에서 발견될 수 있는 것과 동일한 순서이다. 따라서, 바람직하게, 본 발명에 따라서, 본 발명의 구조체에 사용된 D 및 J 유전자는 하나 또는 그 이상의 개입 서열을 제거 도는 변형하기 위해 표적된 조작에 의해서 변형되지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터 구조체는 또한 쥐과 μ 인핸서, IgH 유전자 전사 및 VDJ 재조합의 주요 조절자, 및 쥐과 스위치 μ 요소를 포함한다. 스위치 요소는 유형 스위칭에 필수적이다.
일 구현예에서, 벡터는 추가적으로 하나 또는 그 이상의 쥐과 C 영역 유전자를 포함한다. 일 구현예에서, C 영역 유전자는 Cγ1, Cγ2b 및/또는 Cγ2a로부터 선택된다. 일 구현예에서, 벡터는 Cγ1, Cγ2b 및 Cγ2a를 포함한다.
본 발명의 벡터 구조체는 따라서 CH1 엑손이 결핍된 마우스 Cγ1 유전자를 포함한다. 그러나 벡터 구조체는 또한 추가적인 C 유전자 또는 영역을 포함할 수 있다.
또한, 일 구현예에서, 벡터는 쥐과 3' 인핸서 영역을 포함한다. 바람직하게, 이것은 약 42kb 크기인 영역이다. 일 구현예에서, 이 영역은 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4 및 요소 hs5, hs6 및 hs7을 포함하는 예측된 격리 영역(insulator region)을 포함한다(Garrett et al., 2005; Chatterjee et al., 2011). 실시예에 나타낸 바와 같이, 이것은 조절 요소의 존재를 나타내는 다중 DNsae I 과민성(hs) 부위를 포함하는 약 42kb 크기의 영역이다. 3' 인핸서는 B 세포 발달 및 IgH 발현 동안 유형 스위치 재조합 과정에서 필수적인 것으로 나타났다(Lieberson et al, 1995; Vincent-Fabert et al., 2010). 랫트 3' 인핸서 내 747bp 영역은 인간 β-글로빈 유전자의 전사를 측정함으로써 인 비트로 분석을 통해 인핸서 활성을 보유하는 것으로 확인되었다(Pettersson et al., 1990). 각각의 개별적인 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B 및 hs4의 표적된 삭제를 갖는 마우스는 야생형 대조군으로부터 유형 스위치에서 구별할 수 없었다(Cogne et al., 1994; Manis et la., 1998; Zhang et al., 2007; Vincent-Fabert et al., 2009; Bebin et al,, 2010). 그러나, 모든 4개의 hs 요소의 조합된 삭제는 모든 이소타입에 대하여 유형 스위치를 제거하였다(Vincent-Fabert et al., 2010). 격리 영역은 하류 또는 다른 곳에 위치한 비-IgH 유전자로부터 IgH 유전자좌를 분리할 것으로 예측된다(Chatterjee et al., 2011). 따라서, 본 발명의 YAC 구조체에서 전체 크기의 3' 인핸서를 포함시키는 것은 불필요하여 시너지 역할 뿐만 아니라 게놈 유전자좌의 나머지를 보호하기 위한 격리를 갖는 인핸서 요소의 모든 공급원을 제공한다.
벡터는 추가적으로 마커 유전자, 예컨대 효모 마커 유전자 TRP1 , HIS3 및/또는 ADE2, 및/또는 하이그로마이신 저항성 유전자를 포함할 수 있다. 추가적인 선별 마커가 포함될 수 있다.
10 또는 그 이상의 기능적 인간 V 유전자를 갖는 본 발명에 따른 벡터 구조체는 실시예에 나타낸 바와 같이 인 비트로 또는 인 비보에서 생산될 수 있다. 인 비보에서 생산하기 위해서, 예를 들어 도 10에 나타낸 바와 같이 YAC1은 마우스 ES 세포로 도입되고 V 유전자의 수는 ES 세포 내 표적된 유전자 녹-인에 의해서 연장될 수 있다. 간단히, 추가된 V 유전자를 갖는 타겟 벡터는 존재하는 형질전환 유전자와 상동성을 갖는 영역과 함께 상동 재조합 사건을 통해 형질전환 유전자를 연장시키는데 사용된다.
벡터 형질전환 유전자로서 본 발명의 벡터를 포함하는 ES 세포는 형질감염에 의해서 벡터 DNA를 ES 세포로 직접 도입함으로써, 또는 마우스가 운반하는 형질전환 유전자로부터 유래한 ES 세포를 유도함으로써 얻을 수 있다. 재유도된 ES 세포는 마우스와 동일한 게놈 위치에 동일한 복제 수로 형질전환 유전자를 운반할 수 있지만, 형질감염된 세포는 특정적으로 표적되지 않는 한 다양한 복제 수를 가질 수 있고 마우스 게놈 내 어느 곳으로나 융합될 수 있다.
본 발명에 따른 YAC 또는 다른 벡터는 형질전환 유전자로서 HCAb 또는 이의 단편을 제조하기 위해 마우스 세포로 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같이 HCAb를 제조하기 위한 방법에서 벡터의 용도에 관한 것이다. 하기에 설명된 바와 같이, VH 결합 도메인은 가용성이고, 응집되지 않으며 실질적으로 단량체이고 하기에 자세히 설명된 바와 같이 마우스에서 생산될 수 있다. 본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같이 HCAb를 제조하는 마우스의 생산 및 상기 마우스로부터 유래한 VH 도메인의 생산에 있어서 벡터의 사용에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환된 형질전환 마우스, 또는 형질전환 쥐과 숙주 세포를 제공하고 따라서 본원에 기재된 바와 같이 이종의 중쇄 유전자좌를 발현한다. 따라서, 일 양상에서, 본 발명은
a) 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자로서 그들의 천연의 형태인 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자;
b) 1 이상의 인간 중쇄 D 유전자 및 1 이상의 인간 중쇄 J 유전자;
c) 쥐과 μ 인핸서 및 스위치 μ 요소 또는 스위치 γ 요소;
d) CH1 엑손이 결핍된 쥐과 C 유전자 및
e) 쥐과 3' 인핸서 요소
를 포함하는 YAC 또는 다른 벡터로 형질전환된 형질전환 마우스에 관한 것이다.
쥐과 3' 인핸서 요소는 다른 곳에 기술된 바와 같다. 벡터의 다른 특징 또한 다른 곳에 기술되어있다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 YAC이다.
일 구현예에서, 상기 쥐과 C 유전자는 쥐과 Cγ1 유전자이다. 일 구현예에서, 상기 쥐과 3' 인핸서 요소는 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명은
a) 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자로서 실질적으로 그들의 천연의 형태인 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자;
b) 1 이상의 인간 중쇄 D 유전자 및 1 이상의 인간 중쇄 J 유전자;
c) 쥐과 μ 인핸서 및 스위치 μ 요소 또는 스위치 γ 요소;
d) CH1 엑손이 결핍된 쥐과 Cγ1 유전자 및
e) 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7을 포함하는 쥐과 3' 인핸서 요소
를 포함하는 YAC으로 형질전환된 형질전환 마우스 또는 쥐과 숙주 세포에 관한 것이다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 쥐과 숙주 세포이다. 일 구현예에서, 형질전환 마우스는 감소된 내인성 항체 유전자를 발현하는 능력을 갖는다. 따라서, 일 구현예에서, 마우스는 감소된 내인성 경쇄 및/또는 중쇄 항체 유전자를 발현하는 능력을 갖는다. 따라서 마우스는 내인성 경쇄 및/또는 중쇄 항체 유전자의 발현을 방해하고 따라서 기능적 경쇄 및/또는 중쇄가 제조되지 않도록 하는 추가적인 변형을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 마우스는 비-기능적 람다 경쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 마우스는 기능적 내인성 람다 경쇄를 만들지 않는다. 일 구현예에서, 람다 경쇄 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 삭제되거나 삽입을 통해 비-기능적으로 만들어진다. 예를 들어, 적어도 불변 영역 유전자 C1, C2 및 C3가 삭제되거나 삽입을 통해서 비-기능적으로 만들어질 수 있다. 일 구현예에서, 유전자좌는 기능적으로 침묵되고 따라서 마우스가 기능적 람다 경쇄를 만들지 않는다.
또한, 마우스는 비-기능적 카파 경쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 마우스는 기능적 내인성 카파 경쇄를 만들지 않는다. 일 구현예에서, 카파 경쇄 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 삭제되거나 삽입을 통해서 비-기능적으로 만들어질 수 있다. 일 구현예에서, 유전자좌는 기능적으로 침묵되고 따라서 마우스가 기능적 카파 경쇄를 만들지 않는다.
기능적으로 침묵된 내인성 람다 및 카파 L-사슬 유전자좌를 갖는 마우스는, 예를 들어, 본원에 이의 전체로서 참고문헌으로 포함된, WO2003/000737에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.
또한, 마우스는 비-기능적 중쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 따라서, 마우스는 기능적 내인성 중쇄를 만들지 않는다. 일 구현예에서, 중쇄 유전자좌는 부분적으로 또는 완전히 삭제되거나 삽입을 통해서 비-기능적으로 만들어질 수 있다. 일 구현예에서, 유전자좌는 기능적으로 침묵되고 따라서 마우스가 기능적 중쇄를 만들지 않는다.
예를 들어, WO2004/076618에 기술된 바와 같이, 모든 8개의 내인성 중쇄 불변 영역 면역글로불린 유전자(μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε 및 α)가 마우스에서 결핍되거나, 그들이 비-기능적일 정도까지 부분적으로 결핍되거나, 유전자 δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b 및 ε가 결핍되고 측면(flanking) 유전자 μ 및 α는 그들이 비-기능적으로 만들어질 정도까지 부분적으로 결핍되거나, 유전자 μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b 및 ε가 결핍되고 α는 비-기능적으로 만들어질 정도까지 부분적으로 결핍되거나, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε 및 α가 결핍되고 μ는 비-기능적으로 만들어질 정도까지 부분적으로 결핍된다. WO2004/076618는 그것의 전체로 본원에 의해 참고문헌으로서 포함된다.
부분적으로 삭제에 의해서란 내인성 유전자좌 유전자 서열이 삭제 또는 파괴되는 것을 의미한다, 예컨대 삽입에 대해서 기능적이지 않고 내인성 유전자 산물이 유전자좌에 의해서 인코딩되지 않을 정도로, 즉, 그런 기능적이지 않은 산물이 유전자좌로부터 발현된다. 또 다른 구현예에서, 유전자좌는 기능적으로 침묵된다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터를 발현하는 마우스는 비-기능적 중쇄 유전자좌, 비-기능적 람다 경쇄 유전자좌 및 비-기능적 카파 경쇄 유전자좌를 포함한다. 따라서 마우스는 어떠한 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 제조하지 않는다. 따라서, 마우스는 삼중 녹아웃(triple knockout: TKO) 마우스이다.
형질전환 마우스는 실시예(도 13 참조)에 예시된 바와 같이 표준 기술에 따라서 생산될 수 있다. 형질전환 마우스를 생산하기 위한 두 개의 가장 특성화된 경로는 유전 물질의 막 수정된 난모세포로의 전핵 미세주입을 통한 것 또는 안정하게 형질감염된 배아 줄기세포를 상실배 또는 배반포 단계의 배아로의 도입을 통한 것이다.
형질전환 유전자를 갖는 ES 세포주는 인 비트로에서 생산되거나 형질전환 마우스의 배아로부터 유래된다. 상동 재조합 또는 삽입 벡터의 사용에 의해서 형질전환 유전자로 새로운 특징이 도입될 수 있다. (예를 들어) 리포펙션, 전기천공법 또는 다른 당업계에 알려진 방법을 사용해서 구조체가 ES 세포로 도입될 수 있다. 선별 저항성 마커를 갖는 클론을 골라내고 성공적인 융합에 대해 스크리닝한다. 구조체 및 ES 세포 모두 필요한 구조체의 융합 및 올바르게 표적된 ES 클론의 스크리닝 및 선별을 돕기 위한 분자적인 특성으로 변형될 수 있다.
형질전환 엔지니어링은 하나 또는 그 이상의 하기의 특징을 포함할 수 있고, 이들은 모두 당업계에 공지되어 있다:
·선별 마커: 임의의 조합으로 사용될 수 있는 Bsd, Zeo, Puro, Hyg
· 음성 선별 마커: 티미딘 키나아제(thymidine kinase: TK). 음성 선별은 하나 또는 그 이상의 선별 마커와 조합하여 사용될 수 있다.
·마커 및/또는 벡터 서열은 loxP, 변이체 loxP, Frt 또는 변이체 Frt 부위의 측면에 있을 수 있다. 부위의 쌍은 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 2 이상의 부위가 사용될 수 있다.
· 삭제, 전좌 또는 치환 서열을 위한 재조합효소(Cre, Flp)의 사용
· 정해진 서열에서 유전자의 이중 가닥 절단의 생산, 예컨대
○ 징크 핑거
○ TALENs
○ CRISPR
○ 메가 뉴클레아제(호밍 엔도뉴클레아제)
를 통하여 이루어진다.
표적된 구축(build-on)은 단일 또는 다중 단계로 달성될 수 있다. 서열은 상동 재조합 및 선별 마커를 통해서 삽입된 후에 재조합효소-매개된 결손에 의해서 제거될 수 있다. 대신 첫 번째 변형 단계는 재조합효소 식별 부위 및 선택적으로 음성 선별 마커와 같은 특징을 도입하는 단계일 수 있고, 카세트 교환 매개 재조합을 통한 서열 도입을 사용할 수 있다.
표적된 구축을 위해 사용된 전략은 교환 벡터, 삽입 벡터 또는 카세트 교환 매개 재조합(recombination mediated cassette exchange: RMCE)을 포함할 수 있다. DNA는 각각의 단계에서 도입 및/또는 삭제될 수 있다. 도입된 DNA는 인간, 박테리아, 효모 또는 바이러스 기원일 수 있다. DNA는 형질전환 유전자 내의 임의의 위치에 도입될 수 있다. 형질전환 유전자 기술은 주위의 게놈 서열을 사용할 수 있다.
표적된 빌드는 V, D 및 J 유전자가 천연의 인간 IgH 유전자좌와 동일한 순서 및 간격이고, C 영역이 천연의 마우스 유전자좌와 동일한 형질전환 유전자좌를 야기할 수 있다. 재조합(예컨대 손상 또는 작은 삭제)에 의해서 발생하는 최소한의 변화를 포함하는 다형성(polymorphism)이 발생할 수 있다.
유전 물질이 어떻게 도입되는지 불구하고, 조작된 배아는 임신이 지속되고 후보 형질전환 새끼가 태어나는 거짓된 임신의 암컷 수여자에게 전달된다.
이러한 광범위한 방법들 사이의 주요한 차이점은 ES 클론이 형질전환 동물을 만들어내기 위해 그를 사용하기 이전에 광범위하게 스크리닝될 수 있다는 것이다. 또한, 형질전환 유전자는 ES 세포로 정해진 위치에 융합되거나 무작위적 위치에 융합될 수 있다. 반대로, 전핵 미세주입은 그것의 도입 이후에 숙주 세놈으로 융합되는 유전 물질에 의존하고, 일반적으로, 성공적인 도입 및 형질전환 유전자의 기능은 새끼가 태어난 이후까지 확인될 수 없다.
당업계에는 형질전환 유전자의 성공적인 도입이 발생하는지 여부를 결정하고 이를 도와주는 많은 방법이 공지되어 있다. 형질전환 동물은 구조체의 게놈으로의 무작위 융합, 위치-특이적 융합, 또는 상동 재조합을 포함하는 다중 방법에 의해서 생산될 수 있다. 형질전환 유전자 융합의 유도 및 선별과 약물 저항성 마커(양성 선별), 재조합 효소, 카세트 교환 매개 재조합, 음성 선별 기술, 및 재조합의 효율을 개선하기 위한 뉴클레아제의 사용을 포함하는 이후의 변형에 사용될 수 있는 다양한 도구와 기술이 있다. 이러한 방법의 대부분은 보통 ES 세포의 변형에 사용된다. 그러나, 몇몇 기술은 전핵 주입을 통해 매개되는 형질전환을 향상시키기 위한 용도를 갖는다.
원하는 백그라운드 내에서의 형질전환 계통의 좀 더 효율적인 생산을 위해서 추가적인 세분화가 사용될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 바람직한 구현예에서, 내인성 마우스 면역글로불린 발현은 약물 발견을 위한 HCAb의 발현을 허용하기 위해서만 침묵된다. 유전적으로 조작된 마우스, 예컨대 모든 내인성 면역글로불린 유전자좌(마우스 중쇄, 마우스 카파 사슬 및 마우스 람다 사슬)에 대해 침묵된 TKO 마우스는 상기 기술된 바와 같이 사용될 수 있다. 임의의 도입된 형질전환 유전자의 이러한 TKO 백그라운드로의 전달은 육종(또는 통상적이거나 공정의 효과적인 스케일링을 위한 IVF 단계를 포함)을 통해서 달성될 수 있다. 그러나, 형질전환 과정 동안 TKO 백그라운드를 포함하는 것도 가능하다. 예를 들어, 미세주입의 경우, 난모세포가 TKO 기증자로부터 유래될 수 있다. 유사하게, 본 발명자들은 또한 TKO 배아 유래의 ES 세포(하기 참조)를 형질전환에 사용하였다. 또한, 상기 언급한 바와 같이, YAC1은 대안적인 구조체(도 10에 기술됨)내에 존재하는 공통의 중심 구조이기 때문에, YAC1 형질전환 마우스로부터 유래한 ES 세포가 중심 YAC1 설계를 갖는 YAC2, 3 또는 다른 YAC들에 존재하는 것과 같은 동일한 특징을 갖는 형질전환 유전자를 유도하는 표적된 추가를 위해 사용될 수 있다. 다양한 형질전환 선택은 도 13에 요약되어 있다.
본 발명의 추가적 양상은 기능적 CH1 도메인이 결핍된 HCAb의 생산에 있어서 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 벡터를 발현하는 마우스의 용도이다. 이는 바람직하게는 본원에 기술된 바와 같은 삼중 녹아웃 마우스이다. 일 구현예에서, HCAb는 예컨대 설치류 및 인간에서 유래한 서열을 포함하는 키메라 항체일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 가용성 VH 도메인을 생산하기 위한 방법에서 본 발명의 마우스가 사용된다. 따라서, 가용성 VH 결합 도메인은 본 발명의 마우스를 사용하여 생산될 수 있다.
본 발명의 마우스는 또한 인 비트로 디스플레이 라이브러리와 같은 라이브러리의 구축에 사용될 수 있다. 이는 비-제한적인 예로 예시된다. 일 구현예에서, 본 발명의 마우스는 나이브 라이브러리를 구축하는데 사용된다. 따라서, 본 발명은 라이브러리의 구축에 있어서의 본 발명의 마우스의 사용에 관한 것이다. 일 구현예에서, 라이브러리는 나이브 라이브러리이다. 일 구현예에서, 면역화는 엑스 비보이다.
또한 본원에 기술된 바와 같은 벡터를 마우스로 도입하는 단계를 포함하는 HCAb를 생산하는 쥐과 세포 또는 마우스를 생산하는 방법이 제공된다. 바람직하게, 상기 마우스는 비-기능적 중쇄 유전자좌, 비-기능적 람다 경쇄 유전자좌 및 비-기능적 카파 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 마우스로부터 나이브 라이브러리를 생산하는 단계를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 마우스는 면역화, 예컨대 엑스 비보 면역화된 마우스이다.
또한 본 발명은
(i) 본 발명의 벡터, 예컨대 YAC을 도입하는 단계;
(ⅱ) 마우스 내에서 HCAb 또는 기능적 CH1 도메인이 결핍된 항원 결합 분자의 형성을 허용하는 단계; 및
(ⅲ) 마우스 혈청으로부터 HCAb 또는 항원 결합 분자를 얻는 단계
를 포함하는 HCAb 또는 이의 단편, 예컨대 마우스 유래의 VH 도메인을 얻는 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 마우스는 비-기능적 중쇄 유전자좌, 비-기능적 람다 경쇄 유전자좌 및 비-기능적 카파 경쇄 유전자좌를 포함한다.
V, D 및 J 유전자 단편은 마우스에서 발현될 때 VDJ 코딩 서열을 형성하기 위하여 재조합될 수 있다. 또한, 이종 유전자좌는 마우스에서 발현될 때, 마우스에 도입된 벡터 내에 불변 유전자가 포함된 임의의 유형의 기능적 면역글로불린 분자를 형성할 수 있다. 항체의 유형은 구조체 내에 존재하는 C 유전자에 의해서 지정될 것이다. 따라서, 항체 이소타입은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다. 바람직하게, 이소타입은 IgG이다. IgG는 임의의 사형으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 유형-특이적 HCAb 및 단일 도메인 항체, 특히 가용성 VH 도메인의 효율적인 엔지니어링의 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명의 방법을 사용해서 얻어진 또는 얻을 수 있는 분리된 HCAb-생산 또는 VH 도메인-생산 세포를 제공한다. 세포의 선별 및 분리는 유동세포분석 또는 다른 세포 분석 공정, 예컨대 기능적 CH1 도메인이 결핍된 항원-특이적 HCAb가 생성되는 B220int /+, 신데칸+ 비장-유도 형질 세포 동정 및 분리를 사용할 수 있다. 그러나, 당업자는 생산이 이러한 유형의 B 세포 또는 방법에 제한되지 않는 것을 알 수 있다.
본 발명의 이러한 양상의 항체-생산 세포는 이차 림프 기관으로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 이차 림프 기관은 비-비장 기관, 예컨대 림프절, 편도선, 및 장-연관 림프조직(gut-associated lymphoid tissue: GALT), 기관지-연관 림프조직(bronchus-associated lymphoid tissue: BALT), 코-연관 림프조직(nose-associated lymphoid tissue: NALT), 후두-연관 림프조직(larynx-associated lymphoid tissue: LALT), 피부-연관 림프조직(skin-associated lymphoid tissue: SALT), 혈관-연관 림프조직(vascular-associated lymphoid tissue: VALT), 및/또는 결막-연관 림프조직(conjunctiva-associated lymphoid tissue: CALT)을 포함하는 점막-연관 림프조직(mucosa-associated lymphoid tissue: MALT)으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 것일 수 있다. 일 구현예에서, 항체-생산 세포는 복막 세포이다. 일 구현예에서, 본 발명의 이러한 양상의 항체-생산 세포는 골수로부터 분리된다.
본 발명의 마우스는 기능적 CH1 도메인 또는 VH 도메인이 결핍된 HCAb를 제공한다. 본 발명의 항체는 분리 및 정제된 형태일 수 있다. 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 분리 및/또는 특성화될 수 있다. 일단 특성화되면, HCAb 또는 VH 도메인은 당업계에 잘 알려진 재조합 또는 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 해당 선행기술 방법에 대해서는 하기의 목록을 참고하라.
본 발명에 따른 형질전환 마우스는 치료 표적에 대해 분리된 인간 VH 도메인을 생산하기 위해 이용될 수 있는 HCAb를 포함하는 중쇄 B 세포의 목록을 운반한다. 이러한 VH 도메인은 많은 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들어, B 세포를 포함하는 림프 세포의 집단은 형질전환 마우스 유래의 다양한 림프 기원으로부터 추출될 수 있고 표적-특이적 VH의 동정 전에 인 비트로에서 선별 또는 자극될 수 있다. 라이브러리는 클로닝된 엑스 비보 전사물로부터 구축될 수 있고 이에 제한되는 것은 아니지만, 파지 및 리보솜 디스플레이를 포함하는 다양한 인 비트로 디스플레이 플랫폼을 사용해서 항원 결합 도메인에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이러한 라이브러리는 나이브 마우스 또는 특정 표적 항원에 반응하는 친화성-성숙 면역 목록을 포함하는 면화된 동물로부터 구축될 수 있다.
본 발명의 방법에 따른 HCAb 생산은 항체-생산 세포로부터의 발현, 또는 세포 표면상의 발현 또는 분비(즉 세포로부터 항체의 방출)에 의한 발현을 포함할 수 있다.
HCAb 또는 VH 도메인은 바람직하게는 마우스에서 생리학적 수준으로 제조될 수 있다. 일 구현예에서, HCAb 또는 VH 도메인은 야생형에서보다 더 높은 수준으로 제조될 수 있다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 형질전환 유전자가 도입된 경우, 유리 HCAb는 삼중 녹아웃 마우스의 혈청에서 제조될 수 있다.
또한, 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 HCAb 또는 VH 도메인은 가용성이며 안정하다.
HCAb 또는 VH 도메인은 가용성을 증가시키기 위해서, 예컨대 하나 또는 그 이상의 유전자를 코딩하는 항체의 유전적 엔지니어링에 의해서 변형될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 마우스를 사용해서 가용성 VH 도메인을 제조하는 방법에 관한 것이다. VH 도메인은 가용성이고, 응집되지 않으며, 높은 열안정성과 친화도를 갖는다. 일 구현예에서, 가용성 VH 도메인을 제조하는 방법은 다음의 단계로 구성된다:
a) 형질전환 마우스에서 본 발명의 벡터를 발현시키는 단계,
b) HCAb를 발현하는 세포 또는 조직을 분리하는 단계,
c) 분리된 세포 또는 조직으로부터 유래된 mRNA로부터 VH 도메인을 코딩하는 서열을 클로닝하는 단계,
d) 클로닝된 전사물로부터 라이브러리를 구축하는 단계 및
e) VH 도메인을 분리하는 단계.
어딘가에 설명된 바와 같이, 마우스는 바람직하게는 어떠한 기능적 내인성 경쇄 또는 중쇄를 제조하지 않는 삼중 녹아웃 마우스이다.
구축된 라이브러리는 VH 도메인의 분리를 위한 선별 기술을 디스플레이하는데 사용될 수 있다. 디스플레이 선별 기술은 파지 디스플레이, 효모 또는 리보솜 디스플레이를 포함한다.
추가적인 단계에서, VH 도메인은 발현 시스템, 예컨대 미생물 또는 포유동물 발현 시스템에서 발현될 수 있다.
추가적인 단계에서, VH 도메인은 친화도에 대해 분석될 수 있다. 이는 ELISA 및 BIAcore를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 알려진 많은 기술에 의해서 수행될 수 있다. 또한, 세포 표면 항원에 대한 결합은 형광표지세포분류기(fluorescence activated cell sorting: FACS)에 의해서 측정될 수 있다. 분리된 VH 도메인의 표적 항원에 대한 친화도는 후보 VH 도메인이 치료제 후보로서 추가적으로 개발될지를 결정하는 데 있어 중요한 변수이다. 친화도는 보통 몰(M) 단위로 해리상수 Kd(Kd = [항체][항원]/[항체/항원 복합체])에 의해서 측정된다. 높은 Kd 값은 표적 항원에 대하여 상대적으로 낮은 친화도를 갖는 항체를 나타낸다. 반대로 종종 서브- 나노몰(nM) 범위에 있는 낮은 Kd는 높은 항체 친화도를 나타낸다.
표적 항원에 대한 결합의 힘 외에도, 주어진 표적의 기능에 영향을 주는 VH의 능력 또한 분석될 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 또한 항원-특이적 항체 제조를 포함하는 면역 반응을 일으키기 위해서 표적 항원으로 동물을 면역화하는 단계를 포함한다. 그러나, 라이브러리는 또한 나이브 동물로부터 구축될 수 있다.
형질전환 마우스에서 HCAb 반응을 유도하기 위해 다양한 면역화 프로토콜을 사용할 수 있다. 가장 흔하게 사용되는 과정은 애쥬번트와 접합된 단백질-기반 표적을 투여하는 단계를 사용한다. 표적은 종종 정제된 형태이지만 조 항원 제조물 또한 사용될 수 있다. 세포는 또한 항원의 근원으로서 사용될 수 있고, 여기서 필요한 표적은 세포에 의해서 자연적으로 또는 유전적 조작의 결과로 발현된다. DNA는 또한 면역원의 근원으로서 사용될 수 있다. 이러한 경우, 분자 또는 사이토카인 애쥬번트롸 결합된 발현 플라스미드는 종종 단백질 면역원을 유발하는 인-비보 형질감염에 사용된다. 면역화 동안 그리고 면역화 후에, HCAb 반응은 (예를 들어) 혈청-ELISA 또는 ELISpot 기술의 적용에 의해서 관찰될 수 있다.
라이브러리-기반의 발견 방법 외에도, 엑스-비보 B 세포(림프 집단 내 또는 사전 선택됨)가 파트너 골수종 세포와 융합되어 원하는 결합 특성을 위하여 스크리닝될 수 있는 HCAb를 제조하는 단일 클론 하이브리도마를 생성하는 데 하이브리도마 기술을 사용할 수 있다. 이후 VH 서열은 하이브리도마로부터 클로닝되고 필요한 최종 형태로 전환된다.
따라서, 또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 가용성 VH 도메인을 제조하는 방법에 관한 것이다:
a) 형질전환 마우스에서 본 발명의 벡터를 발현시키는 단계,
b) HCAb를 발현하는 세포 또는 조직을 분리하는 단계,
c) 상기 세포로부터 하이브리도마를 제조하는 단계,
d) VH 도메인을 분리하는 단계.
추가적으로 본 발명은 B-세포 암세포주와 함께 본원에 정의된 바와 같은 HCAb-생산 세포 또는 VH 도메인 생산 세포의 융합에 의해서 얻을 수 있는 하이브리도마를 제공한다. 본 발명의 특정 구현예에서 하이브리도마를 형성하기 위해 사용되는 항체-생산 세포는 비-비장 이차 림프 기관 세포(상기 참조)이다. 단일클론 항체의 제조를 위한 단일 클론 하이브리도마를 생산 및 선별하는 공지된 방법이 본 발명에 적용될 수 있다.
또한 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해서 얻어진 또는 얻을 수 있는 HCAb, 이들로부터 유래된 항체 또는 그 단편을 제공한다. 따라서, 본 발명은 마우스에서 제조된 HCAb, 또는 본 발명의 벡터를 발현하는 마우스로부터 얻어진 또는 유래된 그들의 단편을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명의 마우스, 바람직하게는 형질전환 TKO 마우스로부터 유래된 단편은 VH 도메인이다.
HCAb 또는 VH 도메인은 항원 특이적일 수 있다. HCAb 또는 VH 도메인은 하나 또는 그 이상의 특이성을 갖는 이가 또는 다가항체로 엔지니어링될 수 있다.
HCAb는 단일클론 항체, IgG-유사 항체 또는 IgM-유사 항체일 수 있다. 본 발명의 방법 및 마우스에 의해서 제조되는 HCAb 또는 VH 도메인은 진단, 예후 또는 치료적 영상 작용제로서 사용될 수 있다. HCAb 또는 VH 도메인은 추가적으로 또는 대안적으로 세포내 결합제, 또는 항체효소로서 사용될 수 있다.
또한 본원에 기술된 바와 같은 HCAb 또는 VH 도메인 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제, 약학적 제형 또는 조성물을 제공한다. 약제는 환자에게 투여되기 전 공지된 방법을 사용하여 전형적으로 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 얻어진 또는 얻을 수 있는 VH 도메인을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 VH 도메인을 단독으로 또는 또다른 VH 도메인, 단백질, 또는 다른 치료적 용도의 다른 분자와의 조합으로 포함한다. 비제한적인 예가 하기에 나열되어 있다.
일 구현예에서, 접합은 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate: ADC)를 형성하기 위한 독성 모이어티(페이로드)에 또는 인간 VH 도메인의 결합을 이용하는 목적으로 방사성 면역 접합을 형성하기 위한 방사성 핵종에, 세포외 또는 세포내 위치로 독성 모이어티를 전달하기 위해서 그것의 인 비보 표적 항원에 대한 것일 수 있다. VH 도메인은 따라서 독성 페이로드를 페이로드가 그것의 세포독성 활성을 나타내고 세포를 사멸시킬 수 있는 표적 세포(암 세포일 수 있음)로 인도한다. 독성 모이어티는 VH 도메인에 직접적으로 융합될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 독성 모이어티는 VH 도메인에 직접적으로 또는 링커를 통해서 화학적으로 결합될 수 있다. 링커는 펩티드, 올리고펩티드, 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 이들 중 임의의 것은 천연의 또는 비천연의 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 링커는 합성 링커를 포함할 수 있다. 링커는 쪼개어지거나 또는 쪼개어지지않을 수 있다. 전형적으로, 링커는 리신 잔기의 아미노기를 통해서, 또는 시스테인 잔기상의 티올기에 의해서 항원 결합 분자에 부착된다. 많은 링커가 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 Ducry et al, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13 및 WO 2004/01095에 기술되어 있다. 참고문헌 모두는 본원에 참고로서 포함된다. 또 다른 구현예에서, VH 도메인은 Fc 영역 또는 그의 부분과 융합된다.
본 조성물의 일 구현예에서, 2 이상의 VH 도메인이 라인 내에서 함께 융합되거나 당업계에 공지된 방법에 의해서 연결되거나 접합된다. VH 도메인은 동일한 표적 항원 또는 상이한 항원에 결합할 수 있다.
VH 도메인은 따라서 질병의 치료에 있어서 의약으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 VH 도메인을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함하는 의학적 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체를 사용하여 치료하기 쉬운 질병은 이에 제한되는 것은 아니나, 상처 치료, 신생물, 흑색종, 폐, 결장, 골육종, 직장, 난소, 육종, 경부, 식도, 가슴, 췌장, 방광, 두경부 및 다른 고형 종양을 포함하는 세포 증식성 질환; 백혈병, 비호지킨림프종, 백혈구감소증, 혈소판감소증, 혈관신생질환, 카포시육종과 같은 골수 증식성 질환; 알러지, 염증성 장질환, 관절염, 건선 호흡기 염증, 천식, 면역장애 및 장기 이식 거부를 포함하는 자가면역/염증성 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상동맥경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상 및 허혈을 포함하는 심혈관 및 혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머 병, 뇌 손상, 근위축성측삭, 및 통증을 포함하는 신경질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 및 비만, AIDS 및 신장 질환을 포함하는 대사성 질환; 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염 및 기생충 감염을 포함하는 감염, 태반 및 다른 병리학적 병태와 연관된 병리학적 병태를 포함한다. 적절한 투여 경로가 당업자에게 공지되어 있다.
또한, 본 발명은 인간 VH 및 마우스 불변 영역을 포함하는 기능적 CH1 도메인이 결핍된 HCAb에 관한 것이다.
본 발명은 하나 또는 그 이상의 도면을 참조하여 본원에서 앞서 기술된 바와 같은 벡터 구조체를 포함한다. 일 양상에서, 본 발명은 도 10에 나타낸 것과 같은 벡터에 관한 것이다.
다수의 다른 효과적인 대안이 발생할 수 있음은 당업자에게 자명하다. 본 발명은 기술된 구현예에 제한되지 않으며 당업자에게 자명하고 본원에 첨부된 청구범위의 의미와 범위 내에 있는 변형을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 언급된 모든 문서 및 간행물은 그의 전체가 참조로 본원에 포함된다.
"및/또는"이 본원에 사용된 경우, 두 개의 특정한 특징 또는 구성요소 각각의 구체적인 개시로 받아들여질 것이다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각 (ⅰ) A, (ⅱ) B 및 (ⅲ) A 및 B 각각의 구체적인 개시를 나타낸다.
문맥에 달리 규정되어 있지 않는 한, 상기 나타내어진 특징의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 양상 또는 구현예에 제한되지 않으며 기술된 모든 양상 및 구현예에 동등하게 적용된다.
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에서 추가적으로 기술된다.
실시예
실시예 1: YAC 구조체
1.1 재료
벡터:
pYAC3 (Bruschi, ICGEB, Yeast Molecular Genetics Group, Trieste, ITALY 에서 얻음)
pYNOT (URA3을 LEU2 마커로 치환한 pYAC3에서 유래함. Bruschi, ICGEB, Yeast Molecular Genetics Group, Trieste, ITALY에서 얻음)
pHTK (LEU2를 HIS3 마커로 치환한 pYNOT에서 유래함)
pHKT-Hy (하이그로마이신 (Hy) 저항성 유전자가 삽입된 pHKT)
pYES1L (Invitrogen)
효모 균주:
YLBW1 (Hamer et al., 1995), AB1380 (Markie, 2006).
1.2 BAC을 YAC으로 전환
BAC(원형 형식 내 박테리아 인공 염색체)는 ~150kbp-350kbp 크기의 DNA 단편의 조작(예컨대 시퀀싱 및 클로닝)을 가능하게 하는 당업계에 알려진 도구이다(Methods in Molecular Biology, Volume 54 및 349). 인간 또는 마우스의 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래한 DNA를 포함하는 BAC은 다양하고 당업계에 공지되어 있다. 이러한 BAC의 예(도 1 및 2에도 나열됨)는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다:
인간:
· RP11-1065N8
· RP11-659B19
· RP11-141I7
· RP11-72N10
· RP11-683L4
· RP11-12F16
쥐과:
· P23-354L16
· RP24-72M1
또한 BAC이 훨씬더 큰 DNA 분자를 생성하기 위하여 중첩된(상보적인) 서열을 포함하는 다수의 DNA 단편의 순차적인 분자 결합을 가능하게 하는데 사용될 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 이를 달성하기 위한 하나의 방법인 브리지 유발된 전위(bridge induced translocation: BIT)는 BAC이 효모 내에서 효모 인공 염색체(yeast artificial chromosomes: YAC)와 같은 비-중첩된 선형 형식으로 먼저 전환되는 것을 필요로 한다.
형질전환-연관 재조합(Transformation-Associated Recombination: TAR) 클로닝에 의한 BAC 전환
BAC 전환 및 YAC 조작은 예를 들어 YAC Protocols (Methods in Molecular Biology, Volume 54 및 349)에 기술된 잘 확립된 기술로서, 영양요구성 마커, 효모 선별, 배지, 효모 형질전환, YAC 스크리닝, YAC 전이, YAC 변형 및 증폭을 위한 레시피와 방법이 상세히 설명되어 있다.
간략히, 후속 결합을 위한 BAC으로부터 보유되는 비-중첩된 서열에 인접한 두 개의 앵커 서열인 앵커 1(a1) 및 앵커 2(a2)를 pYAC3(http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector_descrip/COMPLETE/PYAC3.SEQ.html) 벡터(도 3)로 클로닝하기 위한 PCR 프라이머의 말단에 설계된 제한효소 부위(SalI 및 SphI)로 PCR에 의해 증폭하였다. 이러한 앵커 서열에 대한 설계 요건은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 Alasdair MacKenzie, 2006, YAC protocols, 2nd Edition ). 제한효소로 절단된 a1 및 a2를 순차적으로 pYAC3에 클로닝하였다(도 3). 이후 pYAC3-a1-a2 벡터를 SphI 및 BamHI으로 절단하여 두 개의 YAC 암, a1-URA3-텔로미어 및 a2-센트로미어-TRP1-텔로미어를 생성하였다. 원래의 BAC을 운반하는 효모를 이러한 두 개의 YAC 암으로 형질전환하고, 트립토판과 우라실을 점적한 효모 배지 상에 플레이팅하고 30℃에서 3일 동안 배양하였다. 앵커 위치에서 YAC 암 및 BAC 사이의 상동 재조합은 전환된 YAC을 제조하였다(도 4). 바람직하게 전환된 산물에 대하여 접합체의 PCR 및 크기에 대한 펄스 필드 겔 전기영동(pulse field gel electrophoresis: PFGE)에 의해 형질전환체(transformant)를 스크리닝하였다. 이어서 결합될 인접 DNA 서열을 포함하는 비-중첩된 YAC을 BIT에 의해 조립하였다.
BIT에 의한 두개의 비- 증첩된 YAC의 결합
각각의 말단에 FRT 부위와 결합을 위한 두 개의 YAC 말단에 특이적인 YAC 상동 서열의 65bp 단편을 추가하여 카나마이신 저항성 유전자 KAN R 카세트를 만들었다(도 5). 이러한 카세트를 결합될 두 개의 YAC을 포함하는 효모로 형질전환시켰다. 카나마이신 저항성 클론을 성공적인 결합을 확인하기 위하여 PCR 및 서던 블롯에 의해서 추가적으로 특성화하였다. 이후 FLP 재조합 효소를 이용하여 KAN R 유전자를 튀어나오게 하였다. 결합 영역에 있는 DNA를 시퀀싱하였고, 결합 부위에서 FRT 서열을 포함하는 DNA '흔적(scar)'의 존재를 확인하였다. YAC 조절의 각 단계에서, PFGE를 적용하여 YAC 크기를 확인하였다. 원래의 인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌 유래의 인접 서열을 포함하는 YAC의 순차적 결합을 이용하여 각각 인간 C-, D- 및 J-유전자와 증가하는 수의 V- 유전자를 갖는 다수의 YAC 구조체를 생산하였다.
1.3 마우스 요소를 갖는 C 영역 구조체
YAC 구조체로부터 유래된 면역 반응의 효율을 향상시키기 위해서, 이후에 그들을 각각 변형시켜 인간 C-영역 유전자를 쥐과 중쇄 불변 영역의 요소로 치환하였다.
중첩된 DNA 단편의 재조합을 받아들이고 효과적으로 재조합하는 효모의 능력을 사용해서(Gibson et al, 2008), 단일 불변 유전자를 갖는 YAC 구조체를 만들기 위해서 다수의 중첩된 단편을 사용하여 쥐과 μ 인핸서, 쥐과 μ 스위치 및 쥐과 불변 γ1 유전자(후자는 CH1 도메인이 삭제됨)를 마지막 인간 J 유전자의 3' 말단에 첨가하였다. 이후, CH1 도메인이 삭제된 다중 쥐과 불변 유전자 Cγ1, Cγ2b 및 Cγ2a를 포함하는 YAC 구조체를 만들기 위해서 유사한 시도를 적용하였다.
1.3. 1 단일 쥐과 C-유전자를 갖는 YAC
효모 형질전환을 위한 DNA 단편의 제조
마우스 μ 인핸서 및 스위치 μ 인자
정방향 프라이머:
GACATTCTGCCATTGTGATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGGCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAGAAT (서열번호 1). 이 프라이머의 처음 69bp는 인간 J6로부터 유래한 것이다(ID: J00256, http://www.imgt.org/IMGTlect/?query=201+J00256). 이 프라이머의 마지막 24 bp는 J4의 마우스 서열 3'에 대해 상보적이다. 역방향 프라이머: TTGAGGACCAGAGAGGGATAAAAGAGAAATG (서열번호 2), 이 프라이머는 마우스 IGHμ CH1의 5' 영역에 대해 역 상보적이다(도 6). BAC RP23-354L16을 주형으로 사용하여 이러한 두 개의 프라이머로 수행한 PCR은 마우스 μ 인핸서 및 μ 스위치 영역을 커버하는 5.8kb 단편을 생산하였고, 하나의 말단이 인간 J6 영역과 상보적이다.
C H 1 이 삭제된 마우스 Cγ1 유전자
정방향 프라이머: AGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTC (서열번호 3); 역방향 프라이머: AACACCTTCAGCGATGCAGAC (서열번호 4). BAC RP23-354L16을 주형으로 사용하여 이러한 두 개의 프라이머로 수행한 7.8kb의 PCR 산물은 CH1 엑손이 배제된 전체 마우스 Cγ1 전사 영역을 커버한다(도 7).
비-중첩된 Eμ , Cγ1 및 YAC 암 단편을 연결하는 링커
Eμ 및 Cγ1 단편을 위한 링커 1:
TCATGCCCCTAGAGTTGGCTGAAGGGCCAGATCCACCTACTCTAGAGGCATCTCTCCCTGTCTGTGAAGGCTTCCAAAGTCACGTTCCTGTGGCTAGAAGGCAGCTCCATAGCCCTGCTGCAGTTTCGTCCTGTATACCAGGTTCACCTACTACCATATCTAGCCCTGCCTGCCTTAAGAGTAGCAACAAGGAAATAGCAGGGTGTAGAGGGATCTCCTGTCTGACAGGAGGCAAGAAGACAGATTCTTACCCCTCCATTTCTCTTTTATCCCTCTCTGGTCCTCAGAAGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTCACTAGAGGTGAGGCTCAAGCCATTAGCCTGCCTAAACCAACCAGGCTGGACAGCCATCACCAGGAAATGGATCTCAGCCCAGAAGATCGAAAGTTGTTCTTCTCCCTTCTGGAGATTTCTATGTCCTTTACACTCATTGGTTAATATCCTGGGTTGGATTCCCACACATCTTGACAAACAGAGACAATTGAGTATCACCAGCCAAAAGTCATACCCAAAAACAGCCTGGCAT (서열번호 5). 링커 1을 만들기 위해서, PCR1(313bp, 프라이머1 F: TCATGCCCCTAGAGTTGGCTG; 프라이머1 R: GAACCCCTCCTCCCTATACGTCCTCTTTGAGGACCAGAGAGGGATAAAAGAGAAATG (서열번호 6)) 및 PCR2(258bp, 프라이머2 F: AGAGGACGTATAGGGAGGAGGGGTTC (서열번호 7); 프라이머2 R:ATGCCAGGCTGTTTTTGGGTA (서열번호 8))을 BAC RP23-354L16을 주형으로 사용하여 합성하였다. 중첩된 서열을 갖는 PCR1 및 PCR2를 프라이머1 F 및 프라이머2 R을 사용하는 융합 PCR에 의해 링커 1로 조립하였다.
Cγ1 및 YAC 암 단편을 위한 링커 2:
TACATCTTTTTTCCTCTCTGTCTGCATCGCTGAAGGTGTTTCGTCGCCGCACTTATGACT GTCTTCTTTA TCATGCAACT (서열번호 9)
YAC 암
PshAI 및 BamHI 제한효소로 pYNOT 벡터를 절단함으로써 LEU2 유전자 마커를 갖는 5.7kb YAC 암을 생산하였다(도 8, URA3을 LEU2 마커로 치환한 pYAC3으로부터 유래됨).
효모 상동 재조합에 의한 인간 C-영역의 마우스 C-영역으로의 치환
효모 스페로플라스트(spheroplast) 형질전환(Sanchez and Lanzer, 2006)을 사용하여 5개의 단편(쥐과 Eμ, 쥐과 Cγ1, YAC 암, 링커 1 및 링커 2)를 인간 C-영역을 포함하는 YAC을 운반하는 효모 YLBW1 주에 도입하였다. 형질전환체를 트립토판 및 류신을 점적한 배지 상에서 선별하였다. 인간 J6에서 중첩된 서열 사이의 상동 재조합은 인간 유전자의 마우스 Eμ 및 Cγ1으로의 치환을 야기하였다. 결합 부위의 PCR 및 시퀀싱에 의해 신규 YAC을 특성화하였다.
3' 인핸서의 추가
BAC - YAC 벡터로 42kb 3' 인핸서 단편의 클로닝
쥐과 3' 인핸서는 마지막 불변 유전자 Cα의 43kb 영역 3'에 산재된 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7을 포함한다. Cγ1 유전자의 3' 부위에 전체 인핸서를 추가하기 위해서, 42kb MfeI 단편을 BAC-YAC 벡터 pYES1L (Invitrogen)에 서브클로닝하였고 이후에는 invitrogen에 의해 제공된 설명서에 따랐다. 구조체를 PCR, PFGE 및 시퀀싱에 의해 완전히 특성화하였다. MfeI 절단으로 이후의 효모 형질전환을 위한 벡터로부터 42kb 단편이 방출되었다.
하이그로마이신- HIS3 YAC 암의 제조
pHKT(LEU2를 HIS3 마커로의 치환에 의한 pYNOT에서 유래됨)로 하이그로마이신(Hy) 저항성 유전자의 삽입에 의해 YAC 벡터 (pHKT-Hy, 도 9)를 구축하였다. 이 벡터의 SpeI 및 BamHI로의 이중 절단은 Hy-HIS3-텔로미어를 포함하는 6.2kb의 YAC 암 단편을 생산하였다.
3' 인핸서 단편을 마우스 Cγ1 유전자 및 Hy - HIS3 YAC 암에 연결하는 링커
마우스 Cγ1 및 42kb 3' 인핸서를 위한 링커 1( 626bp )
ACGGCTCAGGAGGAAAAGGCACTCTGTGTGGAGCTCTTCAGTGGGTATGAAATGGTGATGGAGAAGCCCAGGTGCACTGAAAATCCAGGAGCTGAATTTGATCACCAGGACGCATATGGTAGAGAGGAAAATGAATTGATTCCCAAATGTTCTCCTCTATGTGTGCACCGTGGCATGTGCATGCACACAATTACACATAAACACATTCAACATAAATACAACACACATATACACGCTGCACACACATACACACACAGAACACACACCACACACACACACCACACACAATCACACACATATTCCACACAGTACACCACAAACATCTATACACACCACACACACACAGACACACACACACACACATTCATACACAGCACAACACAAACATCTATACACAACACACACACAATACACATAGTCACACGCATATTCACTCACACACATATTCACCCACACACAATCATACATAGACACATTCAACATAAACACAACACCACACACACACACACTTGCACACACAAATGTAATGATTTTTTTAAGGACTACATCTTTTTTCCTCTCTGTCTGCATCGCTGAAGGTGTTCAATTGCCAAAATCACAGGTGAGCCCAGATGCATACCCGGGAC (서열번호 10). 링커 1을 만들기 위해서, PCR1 (604bp, 프라이머1 F:ACGGCTCAGGAGGAAAAGGCAC (서열번호 11); 프라이머1 R: TCACCTGTGATTTTGGCAATTGAACACCTTCAGCGATGCAGAC (서열번호 12))를 주형으로 BAC RP23-354L16을 사용하여 합성하였다. 이후 프라이머1 F 및 프라이머 R:
GTCCCGGGTATGCATCTGGGCTCACCTGTGATTTTGGCAATTG (서열번호 13)에 의해 PCR1을 626 bp까지 연장시켰다.
42kb 3' 인핸서 및 Hy-HIS3 YAC 암을 위한 링커 2 ( 766bp )
GAGGTACAGGGGGCTCATGGGTTTATAAGTTCAGGTTTATACCAAGGTTTCGGGGGGTAGCCTGAGGCTCATGTACCTTCTTGTGGTAGCCCCCAGGTTCTGTGCATGGTACTGCTCAGTTACTGGCATGGCTTCTGGGAAGGCTGGGCTCCCACGTCCCCTGTGGACACATGGTTACGCCAAGAACAGAACTACAAAGTTAGGAGTTACCATTCCCACCTGCACCTGTATCTCCAGTACCTGGGTTTCTAAGACGTAGTGAGTCCTCTTGCCAACCAGGGTCTGCCACAATGGTCAGGCACAGCTGTGGGCCGGTCAGCCCCATCAGGTCACACCAGCAGGTCCCAGGAGCACAGAGCTTAAATGCCCCCTAGTGTCCCTAGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGC (서열번호 14). 링커 2를 만들기 위해서, PCR1 (379bp, 프라이머1 F:GAGGTACAGGGGGCTCATGGGT (서열번호 15); 프라이머1 R:AGCCTCACTAG GGACACTAGGGGGCATTTAAGC (서열번호 16)) 및 PCR2 (387bp, 프라이머2 F:CCCTAGTGTCCCTAGTGAGGCTCCGGTGCCCGT (서열번호 17); 프라이머2 R:GCGCAAGGCCTCGAACTCTC (서열번호 18))을 각각 주형으로 BAC RP23-354L16 및 BAC RP24-72M1을 이용하여 합성하였다. 중첩된 서열을 갖는 PCR1 및 PCR2을 조립하였고 프라이머1 F 및 프라이머2 R을 사용한 융합 PCR에 의해서 링커 2를 생산하였다.
효모 형질전환
4개의 단편(3' 인핸서, Hy-HIS3-텔로미어 YAC 암, 링커 1 및 링커 2)를 효모 스페로플라스트 형질전환에 의한 3' 인핸서의 추가를 위한 YAC을 포함하는 효모 YLBW1 주에 도입하였다. 형질전환체를 트립토판 및 히스티딘을 점적한 배지 상에서 선별하였다. 중첩된 단편 사이의 상동 재조합은 선택한 YAC에 3' 인핸서 및 Hy-HIS3-텔로미어 암의 추가를 야기하였고, 크레센도(Crescendo) YAC1 또는 YAC2(도 10)을 생산하였다. 결합 부위의 PCR 및 시퀀싱에 의해 신규 YAC을 특성화하였다. 신규 YAC의 크기를 PFGE 및 서던 블롯팅에 의해 확인하였다.
1.3.2 다중 불변 유전자를 갖는 YAC
마우스 Cγ1 유전자를 포함하는 YAC에 더하여, 다중 불변 유전자-모두 CH1 도메인이 삭제된 마우스 불변 유전자 Cγ1, Cγ2b 및 Cγ2a를 포함하도록 다른 YAC을 설계하였다(도 10).
C H 1이 삭제된 Cγ2b 및 Cγ2a를 포함하는 45kb 단편의 생산.
하기 나열된 프라이머를 사용하여, 주형으로 RP24-72M1을 사용하여 7개의 중첩된 PCR 단편을 증폭하였다. 단편 3을 Cγ2b(CH1 삭제됨) 이용한 융합 PCR에 의해 합성하였고; 단편 6을 Cγ2a(CH1 삭제됨)를 갖는 융합 PCR에 의해 합성하였다.
7 PCR에 사용된 프라이머 :
단편 1: 45k-1 8057bp
정방향: GGTTGGATTCTATCTTCGCATGG (서열번호 19)
역방향: TGGGTCCTGTCTTTCTACCTTTG (서열번호 20)
단편 2: 45k-2 8304bp
정방향: GCTCCTTGCTGGGTCTTAATGTT (서열번호 21)
역방향: TTAGAACCGTGTCTTCTACAATTGA (서열번호 22)
단편 3: 45k-3 1.3kb CH1Δ
45k-3-좌
정방향: GGGTAGGAGGTTGTTGGTTA (서열번호 23)
역방향: CCCGCTGGGCTCTGCAAGAGAGGAGAATGTGTGA (서열번호 24)
45K-3-우
정방향: CTCTCTTGCAGAGCCCAGCGGGCCCATTTCA (서열번호 25)
역방향: GCTTGTTTTTATATCGAGCTTGC (서열번호 26)
단편 4: 45k-4 8412bp
정방향: TCAGTCTCACTTGCCTGGTCGT (서열번호 27)
역방향: CTTTGTAGCACATGCGTCATCC (서열번호 28)
단편 5: 45k-5 9012bp
정방향: TGAAGGCATGAAGGAGTTGAGC (서열번호 29)
역방향: ACAACCCCCTATCCTACACATT (서열번호 30)
단편 6: 45k-6 2274b CH1Δ
45k-6-좌
Forward: GGGTCCTGGCAACATTAGCG (서열번호 31)
역방향: CACTCTGGGCTCTGCAAGAAAGGAGGATGTGTGA (서열번호 32)
45k-6-우
정방향: CTTTCTTGCAGAGCCCAGAGTGCCCATAACAC (서열번호 33)
역방향: TGGTGTTCAGCAGGCTAATTTG (서열번호 34)
단편 7: 45k-7 9968bp
정방향: CAGGCCCCACTTCTTTACCTAA (서열번호 35)
역방향: TTGTTAGTTCATCACAGGGCAATTC (서열번호 36)
동종 재조합을 위해 7 PCR 산물 및 말단에 단편 1 및 7에 대한 중첩된 서열을 갖는 선형화된 BAC-YAC 벡터를 효모에 형질전환 시켰다. 45kb-YAC을 결합의 PCR, PFGE 및 시퀀싱에 의해 확인하였다. PmeI 제한효소는 원형 YAC으로부터 45kb 단편을 방출하였다.
C H 1이 결핍된 Cγ1 , Cγ2b 및 Cγ2a를 포함하는 58kb 단편의 생산.
상동 재조합을 위해, 마우스 μ 인핸서 및 스위치 μ 단편, CH1이 삭제된 Cγ1 단편 및 링커 1(1.3.1), Cγ2b 및 Cγ2a를 포함하는 45kb PmeI 제한효소 단편 및 말단에 μ 인핸서 단편의 5' 및 45kb 단편의 3'를 갖는 선형화된 BAC-YAC 벡터를 효모로 형질전환 시켰다. 58kb-YAC을 결합의 PCR, PFGE 및 시퀀싱에 의해 확인하였다. PmeI 제한효소는 원형 YAC으로부터 58kb 단편을 방출하였다.
다중 불변 유전자로 YAC에 대한 효모 형질전환
스페로플라스트 형질전환에 의해 하나는 Cγ1-Cγ2b-Cγ2a를 포함하는 58kb이고 다른 하나는 58kb 단편의 3' 말단에 중첩된 서열을 갖는 YAC 암인 두 개의 단편을 Cγ1-Cγ2b-Cγ2a 유전자의 추가를 위한 YAC을 포함하는 효모에 도입하였다. 형질전환체를 YAC 암 상에서 운반되는 영양 요구성 마커에 의존하여 아미노산을 점적한 배지에서 선별하였다. 중첩된 단편 사이의 상동 재조합은 Cγ1-Cγ2b-Cγ2a 단편의 추가와 선택 YAC에 대한 신규 YAC 암을 야기하였다. 신규 YAC를 결합 부위의 PCR 및 시퀀싱에 의해 특성화하였다. 신규 YAC의 크기를 PFGE 및 서던 블롯팅에 의해 확인하였다. 이후, 42kb 쥐과 3' 인핸서를 (상기 기술된 바와 같이) 추가하여 크레센도 YAC3을 생산하였다(도 10).
실시예 2: 녹아웃 마우스의 생산
마우스 중쇄 유전자좌(WO2004/076618 + Ren, L., et al., Genomics 84 (2004), 686-695), 마우스 람다 유전자좌(Zou, X., et al., EJI, 1995, 25, 2154-2162 and WO2003/000737) 및 카파 유전자좌(Zou, X., et al., JI 2003 170, 1354-1361 and WO2003/000737)를 침묵시키기 위해 사용되는 방법은 이전에 기술되었다. 간략하게, 마우스 중쇄 불변 영역 및 마우스 람다 사슬 유전자좌의 대규모 삭제는 이러한 두 개의 면역글로불린 사슬의 침묵을 야기했다. 네오마이신 저항성 카세트의 표적된 삽입을 통해서 카파 경쇄를 침묵시켰다.
a) 중쇄 및 경쇄 KO 마우스의 이종 교배
내인성 경쇄(카파 및 람다)의 이중 침묵을 갖는 마우스를 통상적인 육종(Zou, X., et al., JI 2003 170, 1354-1361)에 의하여 제조하였다. 이러한 경쇄-KO 마우스를 중쇄 KO 마우스와 추가적으로 교배시켜서 삼중 녹아웃(triple knockoutL TKO) 라인을 유도하기 위한 육종에 필요한 삼중 이형접합 동물을 얻었다. 이 라인이 생식력이 있고 순수-육종 라인으로 유지될 수 있음을 확인하였다.
b) 이종 교배로부터 얻은 자손의 유전형 분석
야생형 및 침묵된 유전자좌를 구별하도록 내인성 중쇄, 카파 및 람다 경쇄 영역 각각에 대하여 프라이머를 설계하였다. 새끼로부터 얻은 꼬리 또는 귀 생검으로부터 지노믹 DNA를 추출하고 PCR 반응에서 주형 DNA로 사용하였다. gDNA를 기술된 방법(예컨대 Viagen Direct PCR lysis reagent (tail) 카탈로그 번호 102-T를 제조업자의 지시에 따라 사용)을 사용하여 추출하였다. 하기 프라이머(Sigma에서 구입)를 PCR 반응에 사용하였다.
중쇄 프라이머
Figure pct00001
PCR 산물 크기:
WT: 1027 bp
KO: 613 bp
HET: 1027 및 613 bp
카파 프라이머
Figure pct00002
카파 PCR 산물 크기:
WT: 400 bp
KO: 1700 bp
HET: 400 bp 및 1700 bp
람다 프라이머
Figure pct00003
람다 PCR 산물 크기:
WT: 1127 bp
KO: 686 bp
HET: 1127 bp 및 686 bp
이러한 프라이머는 다양한 DNA 중합효소 및 버퍼와 사용할 수 있고 사이클링 조건은 특정 효소에 적합하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, Fermentas DreamTaq-Ready Mix (#K1081)를 하기와 같이 사용할 수 있다;
Figure pct00004
반응을 위해 1μl의 주형을 사용하였다. 유전형 분석을 할 시료에는 양성 대조군 및 물 대조군을 항상 포함하였다.
이 특정 효소에 대해 하기 사이클링 조건을 사용하였다;
Figure pct00005
PCR 반응 후에, 산물을 DNA 염색을 이용하여 시각화하고 1% 아가로스 겔에서 전기영동 하였다. 도 11은 wt, 중쇄 KO, 경쇄 KO 또는 TKO 유전자형을 갖는 2 동물로부터 추출한 지노믹 DNA로 수행한 대표적인 유전형 분석 실험의 결과를 나타낸다.
c) TKO 마우스 내 내인성 면역글로불린 발현의 결핍
마우스 중쇄, 중쇄/경쇄 복합체 및 경쇄에 특이적인 효소결합면역흡착분석법(enzyme linked immunosorbant assay: ELISA)을 사용하여 TKO 마우스의 무(null) 표현형을 확인하였다. 간략히, 면역흡착 플레이트(예를 들어 Nunc Maxisorb 96F 웰 플레이트 Cat. No. 443404)를 인산염완충식염수(phosphate buffered saline: PBS)에 희석된, 5μg/ml 용액의 포획 항체로 코팅하였다. 이후 PBS/0.05% Tween, PBS로 세척하고 3% 용액의 밀크 파우더로 차단하고, 혈청 희석물(3% 밀크 파우더/PBS 내)을 플레이트에 두었다. 결합되지 않은 단백질을 세척한 후, 결합된 단백질을 적절한 비오틴화된 검출 항체 용액을 사용해서, 사전에 결정된 최적의 희석에서 검출한 후 뉴트라비딘-HRP 시각화하였다. 상업적으로 얻을 수 있는 다양한 항체를 이러한 ELSIA에 사용할 수 있다. 표 1에 이러한 항체의 예를 나타내었다.
ELISA에 사용된 항체
ELISA 포획 항체 검출 항체
마우스 중쇄 Jackson 115-005-164, AffiniPure 염소 항-마우스 IgG (서브클래스1+2a+2b+3), Fcγ Frag 특이적 Amersham RPN1001V, 항-마우스 Ig 비오틴
중쇄 / 경쇄 복합체 Jackson 115-005-164, AffiniPure 염소 항-마우스 IgG (서브클래스 1+2a+2b+3), Fcγ Frag 특이적. Jackson 115-065-174, 비오틴-SP-접합된 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG, 경쇄 특이적
경쇄 BD 559748 & BD 553432, 랫트 항-마우스 Ig 카파, 클론 187.1 및 랫트 항-마우스 Ig 람다 1,2,3. Jackson 115-065-174, 비오틴-SP-접합된 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG, 경쇄 특이적
도 12에 입증된 바와 같이, TKO 마우스는 검출 가능한 내인성 면역글로불린 사슬이 없는 것으로 나타났다. 2마리의 야생형 및 2마리의 TKO 마우스 각각으로부터 얻은 혈청 시료를 분석하였다.
d) ES 세포의 분리 및 배양
배아 줄기세포의 분리는, 기술되어있다(Ying, Q.L. et al., Nature, 453, 519-523, 2008, Nichols, J. Et al., Development, 1136, 3215-3222, 2009, Nagy, K. & Nichols, J., "Advanced Protocols for Animal Transgenesis의 "Derivation of Murine ES Cell Lines", p431 - 455. ISTT Manual.Ed. Shirley Pease & Thomas L. Saunders).
2i 방법은 ES 세포를 미분화 상태로 유지하면서, FGF/Erk 신호전달 경로를 차단하는 소분자 저해제를 이용한다. 또한, 이러한 저해제를 포함하는 배지에서 초기 단계 배아를 배양하는 것은 세포내 덩어리가 배반엽상피 계통으로 전환되어, 분화 유도성 내배엽으로 발달하는 것을 방해한다. 이것은 더 쉽게 유도될 수 있는 ES 세포주 유래의 풍부한 배반엽상피 구획을 제공한다.
ES 세포주는 TKO 배아로부터 유래된다. 초기 단계의 TKO 배아는 동결 보존에서 해동되고, 참조된 방법에 정의된 바와 같이, 그들이 배반포 단계에 도달할 때까지 배양된다. 이후 영양외배엽의 제거에 의해 달성된 배반엽상피가 유리되기 전에 항-마우스 혈청 및 보체를 사용하여 그들을 추가적으로 2일 동안 배양하였다. 이후 트립신 용액에서 분할 및 결과물인 ES 세포주의 확장 전에 배반엽상피를 확장시켰다. ES 세포주 및 클론의 증식을 위한 배양 배지는 잘 기술되어 있다. 본 발명의 경우, ES 세포는 2i 배지에서 유지되거나 LIF 및 혈청으로 보충된 배지 상에서 키웠다.
실시예 3: 형질전환
a) 전핵 미세주입(Pronuclear microinjection )
형질전환 동물을 생성하기 위한 DNA의 전핵 미세주입 기술은 잘 기술되어 있다(예컨대 K. Becker & B. Jerchow "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual.Ed. Shirley Pease & Thomas L. Saunders.Springer Protocols 2011의 "Generation of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection" pp 99-115 참조). 간략히, 번식용 수컷과 교배시킨 과배란된 암컷 마우스로부터 수정란을 분리하였다. 과배란을 유도하기 위해서, 암컷에 5 I.U.의 임신말 혈청성 성선자극호르몬(pregnant mare's serum gonadotropin: PMSG)을 포함하는 100μl의 PBS를 2일차에 복강내로 주입하였다. 46-48시간 후 100μl의 PBS 내의 5 I.U.의 인간 융모성 성선자극호르몬(human chorion gonadotropin: hCG)을 투여하고(복강내) 암컷을 번식용 수컷과 교배시켰다. 다음날 아침, 히알루로니다제 용액으로 분해되어 방출된 난관 및 난모세포로부터 수집된 퇴적 복합체를 수확하였다. 미세주입을 위한 수정란을 생산하기 위한 다양한 마우스 계통을 성공적으로 이용할 수 있다.
C57Bl6 x CBA F2 야생형(wt) 마우스를 사용하여, 상기 과정을 적용하여 정제된 YAC DNA를 도입하였다. 형질전한 개관(도 13)에 나타낸 바와 같이, TKO 마우스를 사용할 때 유사한 과정을 사용하였다. 미세주입을 위한 정제를 위해서 소위 '윈도우(window)' 주 효모(Hamer et al., PNAS, 1995, 92(25), 11706-10)로 YAC을 도입하였다. '윈도우' 주 효모는 겔 전기영동을 할 때, 패신저(passenger) YAC이 효모 내인성 염색체를 피할 수 있는 크기로 이동하는, 내인성 염색체의 전략적 분리로 만들어진 숙주 효모의 시리즈이다. 대안적으로, 효모 염색체를 분리를 위해 적절한 프라이머와 PCR 전략을 이용해서 다시(de novo) 적절한 "윈도우"를 생성할 수 있다. 따라서, 미세주입을 위한 YAC을 펄스 필드 겔 전기영동(pulsed-field gel electrophoresis: PFGGE) 후 이차 겔 전기영동 용리에 의해 정제하였다. 이러한 과정은 A. Fernandez, D. Munoz & L. Montoliu "Advanced Protocols for Animal Transgenesis. An ISTT Manual.Ed. Shirley Pease & Thomas L. Saunders.Springer Protocols 2011에서 "Generation of Transgenic Animals by Use of YACs" pp 137-158에 기술되어 있다.
수정란을 수집한 후, 정제된 YAC DNA 용액을 유리 미세주입 바늘을 이용해서 전핵에 주입하였다. 모든 작업은 가열된 스테이지를 장착하고 방진 테이블에 장착된 현미경 하의 마이크로조작기(micromanipulator)를 이용해서 수행하였다. 미세주입 후, 난모세포가 24시간까지 회복하도록 하였고 이후 거짓 임신 대리모의 난관으로 이동시켰다. 거짓 임신 암컷은 이동 날짜의 24시간 전에 정관수술을 받은 번식용 수컷과 암컷을 교배시킴으로써 생산하였다. 보통 새끼들은 19-21일 후에 분만된다. 그들의 크기 때문에, YAC의 미세주입은 까다로운 과정이며 더 작은 BAC 또는 플라스미드에서 관찰되는 것보다 삽입의 효율이 더 낮다. 표 2는 2개의 관련 YAC 구조체로 수행한 미세주입 연구로부터 얻은 통계의 요약이다.
정제된 YAC의 전핵 미세주입을 통한 형질전환
YAC # 실험 # 주입된 난모세포 # 전이된 난모세포 # 분만된 새끼 # 분석된 새끼 # 형질전환 마우스 % 형질전환 마우스
YAC 1 10 834 562 69 59 5 8.5%
4 부분적 1 완전한 1.7%
YAC 2 7 674 474 123 122 13 10.7%
12 부분적 1 완전한 0.8%
b. ES 세포
YAC 구조체를 ES 세포로 도입하기 위한 다양한 경로가 있다(하기에 기술됨). 어떤 경로를 선택하든지 관계 없이, 목표는 형질전환 유전자가 성공적으로 융합된 ES 클론을 수득하는 것이다. 전핵 미세주입 기술과 비교하여 ES-매개 형질전환의 장점은 ES 클론이 형질전환 라인의 생성을 위한 사용 전에 충분히 특성화될 수 있다는 점이다. ES 클론에서 수행되는 특성화는 전핵 주입(하기 참조)에서 유도된 F0 및 F1 동물의 스크리닝에 이용되는 것과 본질적으로 동일하다. 인 시츄 혼성화 또한 융합 염색체를 결정하기 위해 적용될 수 있다. 이는 특히 ES 세포가 TKO가 아니라 wt인 경우 더욱 바람직할 수 있다; 형질전환 라인의 생성을 위해 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌가 결손된 염색체 상에 융합된 YAC을 갖는 ES 클론만이 선택될 수 있다. 이러한 사전 선별은 TKO 백그라운드로의 효율적인 역교배를 방해할 수 있는 연관되지 않은 유전자좌가 존재하지 않음을 확인한다.
향후 ES 세포의 B 세포 계통으로의 인 비트로 분화를 지원하는 과정의 개발이 형질전환 전에 도입된 형질전환 유전자좌의 기능 시험을 가능하게 할 수 있다. 그러나, 현재 기술적으로는 가능하지 않다.
i) 정제된 YAC의 형질감염( transfection )
YAC은 상기 기술된 바와 같이 필수적으로 정제될 수 있다(상기 "미세주입을 위한 YAC의 정제" 참조). 정제된 YAC을 예를 들어 리포펙션(예컨대 Invitrogen Lipofectamine reagents로 수행)을 사용하여 ES 세포에 도입하고, 이후 하이그로마이신(대안적으로 YAC 설계에 기술된 바와 같은 선별 시약을 사용할 수 있다)을 사용해서 세포를 선별하였다. 클론을 골라내고 스크리닝하고 적절한 클론을 이용해서 형질전환 라인을 생성하였다. 다양한 특징들을 구조체 및/또는 표적된 ES 세포에 도입하여 형질감염된 ES 클론의 유도를 가능하게 할 수 있다(하기 참조).
ⅱ) 스페로플라스트 융합 방법
YAC을 ES 세포로 도입하기 위한 대안적인 방법은 스페로플라스트 융합에 의한 것이다. 이 방법은 큰 구조체의 조작이 최소화되어 전단에 의해 구조체에 발생할 수 있는 손상에 대한 가능성이 제한되는 이점을 제공한다. 스페로플라스트 융합 기술은 기술되어 있다("Antibody Engineering. A Practical Approach" Ed. McCafferty et al., IRL Press at Oxford University Press, 1996 내에 Davies, N., et al., "Human antibody repertoires in transgenic mice: manipulation and transfer of YACs" p59-76). 간략히, 효모 세포 벽의 지몰리아제 절단에 의해서 효모 스페로플라스트를 생산하였다. 분해된 ES 세포를 스페로플라스트와 혼합하고 폴리에틸렌글리콜 용액의 첨가를 통해서 융합을 수행하였다. 이후 배지에 재현탁하고, ES 세포를 세척하고 선별 배양, 클로닝 및 스크리닝을 하기 기술된 바와 같이 수행하였다.
ⅲ) Tg -TKO ES 세포의 표적된 구축(build-on)
YAC1 형질전환 유전자(모든 후속 YAC 구조체에 공통적인 중심 구조를 포함)에 추가적인 특징을 추가하기 위한 대안적인 전략은 ES 세포주 내에 위치한 YAC1 형질전환 유전자의 표적된 확장을 수행하는 것이다(도 14). YAC1 형질전환 유전자를 갖는 ES 세포주를 인 비트로에서 생산하거나 또는 YAC1 형질전환 마우스의 배아에서 유도하였다. 본원의 어딘가에 기술된 바와 같은 상동 재조합 또는 삽입 벡터의 사용에 의해서 형질전환 유전자에 새로운 특징을 도입할 수 있다.
실시예 4: 선조(founder)의 특성화 및 스크리닝
a) 형질전환 유전자 및 생식세포 전달의 존재
모든 새끼들이 태어난 후 그들의 게놈 DNA 내 YAC의 존재에 대해서 미세주입된 난모세포의 전달을 확인하였다. ES 세포에서 유래된 형질전환 새끼에 대해서, 털색 유전학 또한 적절한 배반포 기증자 동물의 선별과 조합 사용하여 그들의 털색으로부터 용이하게 키메라 새끼들을 동정할 수 있다. 하기 스크리닝의 실시예는 전핵 미세주입 형질전환으로부터 유래한 대소변을 사용하였다. 그러나, ES 클론에 대한 형질전환 전에, 확실한 결과를 위해 스크리닝되는 결과물인 대소변과 함께 유사한 분석을 수행하는데 사용될 수 있다.
YAC 형질전환 유전자에 대한 시험은 꼬리 또는 귀 생검 유래 gDNA의 정제 및 PCR 반응을 사용한 YAC의 영역에 대한 시험을 포함한다. gDNA의 분리 및 PCR 방법은 상기에 기술되어 있다(상기 참조). YAC의 각 말단 부분을 표적하는 PCR 반응이 수행될 수 있고 양쪽 영역에 대한 양성 융합을 갖는 임의의 시료를 이후 YAC 형질전환 유전자의 다양한 내부 영역을 증폭하기 위해 설계된 추가적인 프라이머로 스크리닝할 수 있다. 이러한 스크리닝을 위한 PCR 프라이머를 표 3에 열거하였다. 이후 PCR 양성 결과를 나타내는 임의의 선조 마우스(F0)를 형질전환 유전자(들)의 생식세포 전달을 체크하기 위해서 그리고 PCR 스크리닝 결과가 단편이 아닌 완전한 YAC의 존재 때문인 것인지 또한 확인하기 위해서 교배시켰다; 후자의 경우, 가장 가능성 있는 시나리오는 단편이 상이한 염색체 상에 위치하고 있다는 것과 F1 자손 사이의 독립 분리에 의해 확인되는 것이다. 선조의 스크리닝의 예와 그것의 생식세포 전달을 도 15에 나타내었다.
형질전환 유전자 및 생식세포 전달의 존재에 대한 스크리닝용 PCR 프라이머
YAC 영역 프라이머 산물 크기(bp)
V H 2 -5 좌 GAGGGAGCACCAATGAGAAG (서열번호 45)
우 CAGATGAGGGGAATGCAAAT (서열번호 46)
 625
V H 4 -4 좌 CCCAAGCTTGGTGCCTCTGATCCCAGGGCT (서열번호 47)

우 GCTCTAGATCTGGGCTCACACTCACCT (서열번호 48)
 380
V H 1 -3 좌 CCCAAGCTTGAAGCCAGTCAAGGGGGCTTC (서열번호 49)

우 GCTCTAGAGGGGTTTTCACACTGTGTC (서열번호 50)
 400
V H 1 -2 좌CCCAAGCTTGAGTCCAGTCCAGGGAGATCT
(서열번호 51)
우 GCTCTAGAGGGGTTTTCACACTGTGTC (서열번호 52)
 615
V H 6 -1 좌 CCCAAGCTTTCACAGCAGCATTCACAGA (서열번호 53)

우 GGAATTCCTGACTTCCCCTCACTGTG (서열번호 54)
 336
3-63 (DP-81) 좌 GGGGCTGGAGGGAGTAATAG (서열번호 55)
우 ACTTAGCTCGGACCACAGGA (서열번호 56)
 603
3-64 ( YAC6 좌 ATGATGGAGTTTGGGCTGAG (서열번호 57)

우GGAAATCAGCCTTCATCTGC (서열번호 58)
 597
3-65 ( YAC4 ) 좌 GGGTACTGCCTTCTCGTCAG (서열번호 59)

우 ATTTGCAGATAGGCGATGCT (서열번호 60)
 600
1-67 ( YAC8 ) 좌 CCACGCTGGTCAGTTTTGTA (서열번호 61)

우 GCTGGGAATAGGGGACTCTC (서열번호 62)
 403
1-69 ( YAC7 ) 좌 GGGGTGAGACACCTGAAGAA (서열번호 63)

우GAGTGCAGGAAAATCATCCA (서열번호 64)
 406
2-70 ( YAC3 ) 좌 GCACAGGTTTGTGGCATTTA (서열번호 65)

우TGCAGCGGTAGGTTTTCTTT (서열번호 66)
 298
V3-7 좌 GCCCTTCACAGAGTCCACAT (서열번호 67)

우 ACTCCAAGGCCTTTCCACTT (서열번호 68)
 409
3-72 (DP-29) 좌 ATCTCTTCCCCTGCACTTCC (서열번호 69)

우 CTACCAAACGACCCAGCAAT (서열번호 70)
 395
3-73 ( YAC9 ) 좌 CCATCCTCAGCAACATCTGA (서열번호 71)

우 GCATGAAAGGTCCTGCTACC (서열번호 72)
 405
3-76 (DP-41) 좌 GGGTGGAGAGACCAGTGTGT (서열번호 73)

우 TTAGGTGCTGGGAGCTCATT (서열번호 74)
 386
5-78 (DP-80 좌 AGGACCATGGACAAGAGTGC (서열번호 75)

우 TTGGAAGGATGGGCTGTATC (서열번호 76)
 608
7-81 ( YAC10 ) 좌 GGGAGAATCCCCTAGAGCAC (서열번호 77)

우 GTGGATGTCGATGCAAAATG (서열번호 78)
 596
V1-8 좌 AGCTCCATGTAGGCTGTGCT (서열번호 79)

우ATGGACTGGACCTGGAGGAT (서열번호 80)
 391
V3-9 좌 GGAGTTCTTGGCGTTGTCTC (서열번호 81)

우 AGGACTCACCATGGAGTTGG (서열번호 82)
 392
V3-11 좌 CTCAGGCTGTTCATTTGCAG (서열번호 83)

우 GAGCTGGGTTTTCCTTGTTG (서열번호 84)
 400
V3-13 좌 GGCATTTTCTCTGGAGATGG (서열번호 85)

우 AGGACTCACCATGGAGTTGG (서열번호 86)
 392
D 1-1 좌 GAGTCATCAGGGTCGGTGTC (서열번호 87)

우 ACGACCACCGTGAGAAAAAC (서열번호 88)
 403
D 2-8 좌 GCTGGTGGGTGTGATGTATG (서열번호 89)

우 CTTCCCTTGACCGAAGACAG (서열번호 90)
 406
D 3-16 좌 CTGTGGTAGCCACCATACCC (서열번호 91)

우 TGGGTAGGGACATAGGGACA (서열번호 92)
 388
D4-23 좌 GCTCTTGTGCTCCTGGAGAG (서열번호 93)

우 AAAAGGTATCCCCACCTTGC (서열번호 94)
 401
J1P 좌 GGGGAGCATGGTTTTTGTAG (서열번호 95)

우 CTGCTGCTGGGAAAACAAGT (서열번호 96)
 400
J3 좌 GCAGGAGAGAGGTTGTGAGG (서열번호 97)

우 GCTTTCCTTCTGCCTCCTTT (서열번호 98)
 390
J6 좌 CCTGGTTTGTTCAGGCATCT (서열번호 99)

우 CGGAGACAGAAGGTCTCTGG (서열번호 100)
 398
Emu 좌 AGCCTTTTCAGTTTCGGTCA (서열번호 101)

우 CTGGTTTCCAAGAGAAAAGGA (서열번호 102)
 581
링커 1- 3'enh 좌 CAAGTGTACAGTCCCCGAAGCAAG (서열번호 103)

우 TGATACACGCAACACGCTTGTC (서열번호 104)
 1357
링커 2 - 3'enh 좌 GAGGTACAGGGGGCTCATGGGT (서열번호 105)

우 CTTGGCCCGCATTTACAAGACTATC (서열번호 106)
 954
His 3 좌 CGTGCGTGGAGTAAAAAGGT (서열번호 107)
우 TGAACGCACTCTCACTACGG (서열번호 108)		 592
Trp 좌 GCCCAATAGAAAGAGAACAATTGACC (서열번호 109)

우 ACACCTCCGCTTACATCAACACC (서열번호 110)
 488
b) YAC 형질전환 유전자의 지문 분석(fingerprint analysis)
모든 경우에, 형질전환 유전자좌는 인간 게놈 DNA 서열을 운반한다. 따라서 인간 서열에 존재하는 반복된 모티프인 인간 DNA Alu 요소 G15N2 (Genbank X55929.1)의 존재에 대한 스크리닝이 가능하다. 제한효소로 절단된 인간 gDNA의 주어진 영역은 Alu 프로브를 사용한 서던 블롯 분석법의 특징적인 밴드 패턴을 나타내었다. 따라서, YAC의 Alu 지문은 형질전환 동물로부터 추출된 gDNA로부터 수득한 것과 비교하여 형질전환 유전자의 구조적 완전성을 나타낸다. 완전한 YAC 형질전환 유전자는 효모 내에 존재하는 YAC에 대하여 유사한 지문을 나타낼 것으로 예상된다.
하기 프라이머를 사용하여 클로닝된 서열(Genbank X55929.1) 또는 gDNA로부터 Alu 프로브를 제조하였다:
Figure pct00006
사이클링 조건은 다음과 같다;
Figure pct00007
방사성 또는 비-방사성 방법(예컨대 PCR 단계 동안 DIG-dUTP 잔기를 추가하기 위해서 DIG probe synthesis kit (Roche cat# 11636090910)을 사용)을 사용하여 프로브를 표지하였다. 이후 프로브-서던 블롯의 화학 발광 검출은 알칼리성 포스파타제가 표지된 항-디곡시게닌(Digoxigenin) 항체 후에 적절한 기질(예컨대 CDP-Star 발광 기질, Sigma C0712)의 추가를 통해서 매개된다.
c) 형질절환 유전자의 복제 수
YAC의 1 이상의 복제가 형질전환 마우스(또는 선별된 ES 클론)의 게놈 사이에 존재하는 것이 가능하다. 이는 상이한 융합 부위에서 또는 단일 염색체 위치에서 반복적인 방식으로 발생할 수 있다. 독립적으로 분리된 융합 부위의 수는 유전적 상속 패턴의 연구와 멘델 유전학의 적용에 의해서 추론할 수 있다. 예를 들어, 단일 융합 부위는 자손에서 50% 상속 패턴을 야기하지만, 2개의 융합 부위는 3:1의 형질전환:비-형질전환 상속을 나타낸다.
Q-PCR 기반 접근을 사용하여 YAC의 영역 유래의 앰플리콘과 하우스키핑 유전자의 PCR 반응의 상대적 양을 비교하였다. 복제 수 측정은 기준 앰플리콘 및 형질전환 유전자 앰플리콘이 독립적인 염색약을 사용한다고 보고된 다중 반응을 사용하여 수행하였다. 예를 들어, 하우스키핑 2배수 유전자(예컨대 마우스 트랜스패린 수용체; Invitrogen cat no 4458366) 및 YAC 영역(예컨대 형질전환 유전자의 인간 J 영역; Taqman copy number assay id Hs03892805_cn 또는 하이그로마이신 선별 유전자; assay id Mr00661678)에 특이적인 분석을 사용하는 TaqMan 프로브 기술(또는 적절한 대안)을 사용하였다. 이러한 반응을 위해, 상업적으로 구할 수 있는 시약(예컨대 Taqman Genotyping Master Mix 400rxns, cat no 4371355), 제조업자에 의해 권장된 조건에 따른 조건 및 동일한 PCR 반응 내에서 측정된 각각의 앰플리콘에 대한 CT 값을 사용하여 Q-PCR을 정립하였다. 복제 수 분석의 예를 도 16에 나타내었다. 이 예에서, YAC2에 대한 이형접합(단일 복제 융합) 또는 YAC2 형질전환 유전자에 대한 동형접합(2 복제)를 나타내는 마우스 유래 DNA의 Q-PCR 분석을 나타내었다.
실시예 5: TKO에 대한 육종
a) 통상적인 육종
야생형 백그라운드에서 생성된 형질전환 마우스를 TKO 라인과 역교배하여 목적 백그라운드에 형질전환 유전자를 전달하였다. 이는 통상적인 교배에 의해서 달성되었고, 각각의 육종 일정에 대해 선택한 신중하게 유전형 분석된 자손을 후속 육종에 사용하였다.
b) IVF를 포함하는 역교배
형질전환 라인을 TKO 백그라운드로 이동시키는 것은 각각의 육종이 완성되기까지 9-12주가 소요되는 긴 과정이다. 그러나, IVF 전략은, 신중한 계획으로, 이러한 규모로 육종을 확장시키기 위해 사용되고, TKO 라인과 Tg/wt의 초기 교배로부터 얻은 ~15주령의 Tg/TKO 새끼의 상당히 큰 코호트를 나타내는 역교배를 완성하는것이 가능하다. 표 5는 이러한 IVF-강화된 육종 프로그램으로부터 얻은 데이터를 포함한다. 유사한 IVF 단계를 사용하여 미리 TKO 백그라운드 상에서 생산된 형질전환 라인을 빠르게 확장할 수 있다(예컨대 TKO/ES 세포로부터 또는 TKO 난모세포에 대한 전핵 미세주입으로부터).
형질전환 기증자 수컷 마우스에서 유래한 정자와 수정하기 위한 대량의 난모세포의 제공을 위해 사용되는 TKO 마우스를 허용하는 조건을 결정하였다. 간략히, 과배란을 유도하기 위해 8-12주령의 암컷 마우스를 호르몬으로 처리하였다(실시예 3 참조). 난모세포를 번식용 형질전환 수컷 유래 정자와 수정시키고 수정란을 4-24시간 내에 거짓 임신 암컷에 전달하거나 이후의 전달을 위하여 동결보존하였다.
YAC1 라인의 IVF 육종에서 얻은 데이터
# 전달됨 신선 또는 동결보존 후 # 수여자 # 새끼 %
690 신선 35 22 32.2%
300 동결보존 후 15 150 50.0%
300 동결보존 후 15 32 10.5%
1290 65 404 31.3%
실시예 6: 형질전환 유전자 사용의 측정
B 세포 발달 동안, 면역글로불린 유전자좌의 체세포 재조합이 항체 목록 생성을 일으킨다(예컨대 검토를 위해 Kuby Immunology, sixth Edition; T.J. Kindt, R.A. Goldsby, B.A. Osborne, J Kuby. Published by W.H. Freeman and Company, New York, 2007.를 참고). 중쇄에 대해서, 이 과정은 V-D-J 영역 재조합을 포함한다. 이러한 유전자 절편의 부정확한 결합은 나이브 목록의 잠재적으로 가능한 다양성을 더한다. 스플라이싱된 VDJ 유전자 단편은 VH 도메인을 야기하며 이것은 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 다른 도메인과 연결된다. 재배치된 gDNA는 B 세포 내에서 RNA 전사물을 야기하고 이들은 막-발현 및 분비가 모두 되는 HcAb 분자를 생성하기 위해 번역된다. 따라서, YAC 형질전환 유전자 전사물의 기능적 활성을 찾을 때, B 세포 및 혈청 단백질 모두를 분석하였다.
하기 부분은 도입된 형질전환 유전자가 기능적인지를 결정하기 위해 사용될 수 있는 다양한 분자, 단백질 및 세포 분석법의 일부를 기술한다.
a) 분자 분석; 전사물 - RT- PCR , 클로닝 및 시퀀싱
림프성 시료(예컨대 혈액 시료, 비장)를 형질전환 동물로부터 수득하였다. 상업적으로 얻을 수 있는 시약(예컨대 RNeasy Qiagen kit cat no. 74106) RNA를 림프성 시료로부터 분리하고 적절한 프라이머(하기 세부 사항) 또는 Supercript III enzyme (Gibco)와 함깨 올리고dT 프라이머(Gibco)를 사용하여 역전사하였다. 모든 관련 버퍼 및 조건은 제조업자에 의해 제안된 것과 같다. 이렇게 수득한 cDNA를 VH 도메인(일부는 앞으로의 라이브러리 생성에 대한 적용-하기 참조)에 특이적인 프라이머 또는 VH 리더 및 불변 영역에 대한 프라이머를 사용하여 VH 영역을 증폭하기 위한 PCR 반응에 사용하였다(표 6).
형질전환 마우스의 분석에 사용된 프라이머
마우스 C H 2 rev GACCTCGGGATCATCCTTGC (서열번호 113)
V H lleader1 _ 17mer ATGGACTGGACCTGGAG (서열번호 114)
V H 2 leader.2 ATGGACACACTTTGCTCCACGC (서열번호 115)
V H 4 leader ATGAAACACCTGTGGTTCTTC (서열번호 116)
V H 6 leader ATGTCTGTCTCCTTCCTCATC (서열번호 117)
V H 3-leader ATGGARTTKGGRCTGAGCTG (서열번호 118)
V H 1.2_3_ genomic _rev GTCAGGATGTGGGTTTTC (서열번호 119)
V H 2.5_ genomic _rev GGAGGTGCCCTGGGCTGTGTC (서열번호 120)
V H 4.4_ genomic _rev GTGTCTGGGCACACACTC (서열번호 121)
V H 6.1_ genomic _rev CTCACACTGACTTCCCCTC (서열번호 122)
V1/a GGAACAGACCACCATGGCCCAGGTBCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGG (서열번호 123)
V1/B GGAACAGACCACCATGGCCCAGGTBCAGCTGGTGCAGTCTGG (서열번호 124)
VH1-2+ GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGG (서열번호 125)
VH1-3 GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTCGTGCAGTCTGGGGCTGAGG (서열번호 126)
VH1-18 GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGG (서열번호 127)
VH1-24 GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGG (서열번호 128)
VH2+ GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGG (서열번호 129)
V2/B GGAACAGACCACCATGGCCCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG (서열번호 130)
V3/B GGAACAGACCACCATGGCCSAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG (서열번호 131)
VH3-7+ GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG (서열번호 132)
VH3-9 GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG (서열번호 133)
VH3-11+ GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG (서열번호 134)
VH3-23 GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGG (서열번호 135)
VH4-4+ GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG (서열번호 136)
V4-4/B GGAACAGACCACCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG (서열번호 137)
VH4-34 GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGC (서열번호 138)
V6/B GGAACAGACCACCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG (서열번호 139)
VH6-1 GCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG (서열번호 140)
VH _J/F GCTACCGCCACCCTCGAGTGARGAGACRGTGACC (서열번호 141)
JH CCGTGGTGATGGTGGTGATGGCTACCGCCACCCTCGAGTGARGAGACRGTGACC (서열번호 142)
하기 실시예에서, PCR 반응은 프루프-리더(proof-reader) 효소(예컨대 Phusion high fidelity DNA polymerase, cat no F530S) 및 "터치-다운(touch-down)" PCR 사이클링 조건을 사용한다.
예시적인 터치다운 프로그램;
Figure pct00008
PCR 산물을 정제하고 상업적으로 이용가능한 클로닝 벡터(예컨대 pJET1.2, Fermentas K1231)에 클로닝하거나 파지미드 벡터에 클로닝하기 전 NcoI 및 XhoI으로 절단하거나 PCR 기반 클로닝 전략을 사용하여 파지미드 벡터로 포함시켰다(파지미드 벡터에 대한 구체적인 사항은 도 17 및 하기 참조).
클론을 시퀀싱하고 분석하여 형질전환 유전자에서 유래된 전사물이 존재하는지 여부를 결정하였다. 형질전환 동물에서 클로닝된 전사물의 예를 도 18에 나타내었다. 형질전환 동물 내에서 VH 목록의 가능한 다양성이 또한 이러한 서열 분석으로부터 측정될 수 있다(비록 예를 들어 시료준비단계 또는 특정 PCR 증폭 단계의 포함으로 인해 치우침이 발생할 수 있지만) 도 19에 나타낸 예에서, VH를 개별적인 나이브 형질전환 마우스로부터 클로닝하였다. 클로닝 단계에서 중합효소 사슬 증폭의 사용에도 불구하고, 형질전환 마우스가 다양한 B 세포 목록을 포함하고, 중복 서열이 거의 발견되지 않는 것이 분명하다. 이 단일 마우스 분석으로부터 넓은 범위의 CDR3 길이가 명백해졌다. 서열을 생식세포 VH 서열과 비교하였고 변이성 플롯을 그렸다. 나이브 마우스로부터 유래한 VH는 대부분 생식 계열이었고, CDR3 영역 밖에서는 변의를 거의 갖지 않았다. 상기 서술한 통상적인 클로닝과 시퀀싱에 더하여, 형질전환 동물의 전사체 정보를 얻기 위해서, 예를 들어 형질전환 동물의 다음 세대 시퀀싱을 사용하여 VH 목록을 분석할 수 있다.
b) 단백질 분석-혈청 ELISA
샌드위치 ELISA(sandwich ELISA) 기술은 상기에 기술되었다(TKO 마우스의 특성화 참조). 포획 및 검출을 위한 적절한 항체 쌍을 사용하여 형질전환 유전자에 의해서 인코딩되는 단백질을 형질전환 마우스의 혈청 내에서 검출하였다. 샌드위치 ELISA에 사용되는 시약은 상업적으로 이용 가능하다. 혈청 내 HcAb를 검출하기 위해 ELISA를 사용한 경우 형질전환 마우스의 분석을 도 20에 나타내었다.
본 발명자들은 또한 인간 VH를 이용하는 HCAb의 생산을 위한 형질전환 플랫폼의 수행을 위한 삼중 녹-아웃 백그라운드의 중요성을 조사하였다. 이를 위해서 본 발명자들은 ELISA를 사용하여 내인성 중쇄 유전자에 대하여 녹아웃되었지만 다양한 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자를 갖는 녹-아웃 백그라운드 마우스의 혈청 내에서 HCAb 및 중쇄/경쇄 복합체의 존재를 조사하였다(도 33 참조). 포획 항체의 경우, 인간, 소, 말, 토끼, 및 랫트 혈청 단백질(Jackson, cat # 415-005-166)에 대한 최소한의 교차 반응을 갖는 다클론 염소 항-마우스 IgG(H+L)를 사용하였다. 분석(비오틴-랫트 항-마우스 Ig, 카파 경쇄, 클론 87.1, BD Pharmingen cat #559750, 비오틴-랫트 항-마우스 Ig, 람다1, 람다2 및 람다 3 경쇄, 클론 R26-46, BD Pharmingen cat#553433, 및 비오틴-SP-접합된 affini-Pure 염소 항-마우스 IgG, Fc-감마 단편 특이적, Jackson cat#115-065-008)에 사용된 항체 검출에 의해서 직접적으로 결합하는데 실패한 것으로 이 항체를 선택할 수 있다. 따라서, 측정된 신호는 샌드위치 ELISA에서 포획된 항체가 아닌 포획된 중쇄 단백질에 대한 검출 항체의 결합에 기여할 수 있다. 간략히, ELISA의 경우, 마우스의 혈청 내 항체는 코팅된 항-마우스 IgG 항체를 통해 포획하였다. 세척 후, 포획된 중쇄 단백질 또는 복합된 경쇄를 비오틴화된 항-마우스 IgG 중쇄-특이적 항체 또는 비오틴화된 항-마우스 카파 경쇄 Ab 또는 비오틴화된 항-마우스 람다 사슬 Ab를 사용하여 검출하였다. 뉴트라비딘-HRP 복합체에 의해서 비색 반응이 유발되는 경우 TMB 기질을 이용해서 검출 항체를 시각화하였다. 상기 기술된 바와 같이(도 12 참조), 형질전환 유전자가 결핍된 TKO 마우스는 그것의 혈청 내에 항체를 갖지 않는다. 그러나, YAC2 형질전환 유전자가 존재하는 경우, 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자 백그라운드에 관계 없이 HcAb가 모든 경우에 발견될 수 있다. 기능적 내인성 카파 유전자 유전자좌가 존재하는 경우, 카파 경쇄가 포획된 중쇄 상에서 검출될 수 있고, 내인성 카파 경쇄와 복합된 형질전환 HcAb의 존재를 나타낸다. 내인성 카파 및 내인성 람다 경쇄 유전자좌가 모두 존재하는 경우, 카파 경쇄 단백질의 성공적인 생산에 의해서 람다 재재배치가 방지되는 경우 마우스에서 정상적인 것처럼, 카파 사슬이 우선적으로 사용된다. 따라서, 이 경우, 람다 경쇄가 형질전환 키메라 HCAb와 결합하여 거물되기 더 어렵다. 이러한 ELISA의 결과는, 단지 Hc-유일 항체만을 생산하는 능력을 갖는 형질전환 마우스의 제공을 위해, 어떠한 내인성 면역글로불린 단백질을 생산하는 것이 불가능한 삼중 녹-아웃 백그라운드를 갖는 것에 대한 필요성을 증명한다.
실시예 7: 세포 분석-유동세포분석
B 세포 발달 경로는 다양한 잘 특성화된 시약 및 특정 발달 단계와 연관된 마커를 이용한 유동세포분석을 사용하여 관찰할 수 있다. 예를 들어, 초기 전 B 세포는 세포가 성숙 표면 Ig-양성 B 세포로 발달함에 따라 획득되거나(예컨대 CD19, B220), 획득되고 하향 조절된(예컨대 CD43), CD43, CD19, B220과 같은 다른 마커 및 와 함께, c-Kit 및 IL7R을 발현한다(도 21 참조). 또한, B 세포 목록 내에서, 다른 B 세포의 부분 집합으로부터, B-2 B 세포(CD23＋, CD5-)를 구별하는데 마커를 사용할 수 있고, 전자는 획득 체액성 면역 반응에 참여할 수 있다(도 22 참조).
유동세포분석에서, 단일 세포 현탁액을 림프성 조직(예컨대 골수, 비장)으로부터 제조한 후, 표면 마커 또는 이소타입 대조군에 대한 항체와 함께 FACS 버퍼(PBS/1%BSA/0.01%NaN2)에서 차단(예컨대 Fc 단편(Rockland))으로 염색하였다. 비오틴-접합 항체를 적절한 스트렙타비딘 콘쥬게이트(예컨대 PE-Cy7 스트렙타비딘)를 사용하여 검출하였다. 염색한 후, 세포를 3.7% 포름알데히드 수용액에 고정시키고 유동세포분석기(예컨대 FACSCalibur 또는 LSRII 기계)로 적절한 볼트와 보정 설정을 사용하여 분석하였다. FlowJo & WinMDI, 프리웨어 프로그램(도 21&22 참조)을 포함하는 다양한 소프트웨어 패키지를 사용해서 데이터를 분석하였다. 유동세포분석 전 염색을 위한 시약은 당업계에 공지되어있다(예컨대 http://www.bd.com/uk/products/main.asp 참조).
실시예 8: 비장의 면역조직화학
비장은 붉은색과 하얀색 펄프 영역을 갖는 조직화된 구조를 갖고, 후자는 B 세포와 T 세포가 풍부한 영역을 포함한다. 포름알데히드-고정된 파라핀-임베딩된 조직으로부터 취한 조직 절편의 해마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 이러한 구조를 밝혔고, 야생형, 삼중 KO, 및 Tg/TKO 마우스에 대한 비교 이미지를 나타내었다(도 23). 이로부터, 그 구조가 세포 수가 적고 소낭(follicle) 주변의 경계가 없는 소낭을 갖는 TKO 마우스에서 발휘되지 못하는 것이 분명하다. 이러한 특징은 TKO 마우스에서 B 세포의 부재와 부합한다. 이미지가 Tg 마우스에 대해 나타내는 바와 같이, 구조가 회복되고 소낭이 더욱 밀집되어있고 뚜렷한 경계 영역으로 둘러싸여 있다.
실시예 9: V H 도메인의 생산
면역화된 또는 나이브 형질전환 마우스로부터 유래한 RNA를 사용해서 생성된 디스플레이 라이브러리를 사용하여 표적 특이적 VH 도메인을 분리하였다.
a) 면역화
상이한 표적 항원의 선별을 당업계에 공지된 많은 면역화 프로토콜 중 하나를 이용하여 형질전환 마우스에 투여하였다. 혈청 ELISA의 예를 도 24에 나타내었다. 샌드위치 ELISA는 상기 요약된 바와 유사하다. 간략히, 흡수 플레이트를 항원으로 코팅한 후, 세척하고 차단한 뒤 동물 유래 혈청 희석액을 첨가하였다. 비오틴화된 항-Fc Ab 후 뉴트라비딘-HRP와 인큐베이션 및 기질을 첨가한 후에 항원이 코팅된 플레이트에 결합한 임의의 HCAb를 검출하였다.
b) 나이브 라이브러리
YAC1 형질전환 유래의 113개 비장을 사용해서 각각의 VH 패밀리에 대한 큰 라이브러리를 구축하였다. 각각의 비장을 개별적으로 진행하였고, 상기 기술된 바와 같이, 각각의 RNA 앨리쿼트를 상이한 VH 패밀리 라이브러리 구축에 사용하였다. 이 라이브러리의 특성 요약을 도 35 나이브 라이브러리에 나타내었다. 라이브러리는 약 3.81×1010 클론으로 구성되고 각각의 패밀리 유래의 시퀀싱 시료는 높은 클론 다양성을 나타내었고, 대부분의 클론은 시료 내에서 단 한번에 분리되었다.
cDNA 라이브러리의 구축 및 사용
나이브 및 면역화된 형질전환 동물 모두로부터 디스플레이 라이브러리를 구축하였다. 간략히, 림프성 조직을 RNA로 모은 후 기계적 균질화 및 용해를 수행하였다. 대안적으로, 신선한 림프성 조직, 혈액 또는 하이브리도마를 포함하는 또다른 B 세포의 근원을 RNA의 근원으로 사용할 수 있다. RNA(전체 또는 메신저 RNA) 추출 후, cDNA를 만들었다. 이후 PCR을 사용해서 VH 서열을 증폭하고, 파지미드 벡터로 클로닝할 수 있도록 하는 적절한 어댑터를 추가하였다. VH를 클로닝하는데 많은 전략을 사용할 수 있다. 본 발명의 경우, 형질전환 유전자 사이에 존재하는 리더 서열에 대한 축퇴된 프라이머를 J/H 연결에 대한 축퇴된 프라이머와 함께 결합에 사용하였다. 대안적인 방법은 리더 서열의 자리에 사용하기 위한 반복된 데옥시뉴클레오티드 염기 꼬리(basetail) 또는 앵커의 첨가를 위한 말단 데옥시트랜스퍼라제의 사용에 의존한다. 증폭 후, VH 산물을 NcoI 및 XhoI로 절단하고 벡터로 라이게이션하거나 또는 프라이머로 사용하고 PCR-기반 전략을 사용해서 파지미드 벡터로 포함시켰다. 파지미드 벡터는 사내(in-house)에서 구축되었다(도 17 참조). 추가된 어댑터 서열은 이전 부분(분자 분석; 전사물 - RT- PCR , 클로닝 및 시퀀싱 참조)에 기술되어 있다.
따라서 구축된 라이브러리는 파지 디스플레이 선별에 사용된다(도 25의 과정 모식도 참조). 이에 제한되는 것은 아니나 가용성 선별, off- 또는 on-rate 기반 선별, 및 경쟁 선별을 포함하는 이 기술의 변형을 사용할 수 있다.
각각의 선별 과정의 결과물을 ELISA에 의해 스크리닝하였고 파지 선별 전과 후의 일부 라이브러리 스크리닝의 예를 도 26에 나타내었다. 이 경우, VH 라이브러리를 면역화된 마우스로부터 클로닝하였고 항원 면역화에 대해 선별되기 전과 후 모두에서 ELISA에 의해 라이브러리를 스크리닝하였다. 면역원에 특이적인 VH 항체를, 하기 출판된 방법(Antibody Engineering, Edited by Benny Lo, chapter 8, p161-176, 2004)에 따라, E.coli의 주변세포질 유래의 정제된 VH를 사용하여 ELISA에 의해 동정하였다. 엑스 비보에서 라이브러리가 낮은 빈도의 면역원 바인더(binder)를 포함하는 것이 분명하다. 이는 형질전환 마우스 내에서 반응 및 나이브 B 세포의 채취와 일치한다. 하기 선별 이후 항원-결합 VH가 풍부해졌다(도 26). 사실, 도 27에 나타낸 바와 같이, 선별 전 라이브러리 및 파지 디스플레이에 의한 이후의 한차례의 엄격한 선별에서 높은 다양성이 분명했고, 항원 결합 VH는 CDR3 다양성에 의해 그룹화된 바와 같이, 50개의 서열 패밀리에 속하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 체세포 과돌연변이의 증거가 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열의 조사로부터 분명하였고 아마도 인 비보 체세포 과돌연변이의 결과인 많은 형제 서열이 분리되었다(도 27a)i) 참조). 그러한 체세포 과돌연변이의 결과인 항원에 대한 증가된 친화도가 항원에 결합하는 곳에 네 개의 형제 서열의 선택 패널에 대하여 입증되었다(도 27a)i) 참조). VH의 서열 다양화를 유도하는 체세포 과돌연변이의 추가적인 증거를 도 34에 나타내었다-항원 바인더의 Kabat 및 Wu. 이 경우, 항원의 3분의 1에 결합된 105 VH가 분석되었고 각각의 아미노산 위치에서 생식세포 서열과 비교하여 변이를 플롯팅하였다. 나이브 마우스 유래의 유사한 플롯과의 비교에 의하면(도 19 참조), CDR1과 2 영역에서 퍼지는 돌연변이를 갖는, 실질적인 돌연변이가 축적되는 것이 분명하였다. 공지된 기술 및 상기 기술된 바에 따른 VH 도메인의 분리 이외에도, VH 도메인을 분석하여 표적 항원에 대한 친화도를 결정하였다(도 28). 이는 ELISA 및 BIAcore를 포함하지만 이제 제한되지 않는, 당업계에 공지된 많은 기술에 의해서 수행하였다. 또한, 세포 표면 항원에 대한 결합을 형광표지세포분류기(fluorescence activated cell sorting: FACS)에 의해서 측정할 수 있다.
표적 항원에 대한 결합의 세기에 더하여, VH가 주어진 항원의 기능에 영향을 주는 능력 또한 측정될 수 있다(예컨대 이는 리간드:수용체 결합의 저해를 포함할 수 있다). 리간드에 대한 VH 특이성 포함에 의한 리간드/수용체 상호작용 저해의 예를 도 29에 나타내었다.
실시예 10: V H 의 특성
상기 기술된 YAC 구조체의 하나를 운반하는 형질전환 마우스는 양질의 약물 후보의 발견에 있어서 중요한 이점을 제공한다. 통상적인 근원(예컨대 인간 cDNA)으로부터 분리된 VH 도메인과 달리, VH 도메인은 경쇄의 부존재 하에서 발달하고 성숙한다. 이와 같이, 형질전환 마우스로부터 유래된 VH 도메인은 그들의 접합을 안정화시키거나 그들이 가용성을 얻기 위한 파트너 경쇄의 존재에 의존하지 않는다. 이의 증거는 나이브 형질전환 마우스 유래의 VH와 인간 cDNA 라이브러리에서 유래한 인 비트로 VH를 비교한 실험으로부터 유래된다. 이전에 기술된 바와 같이 VH에 대한 서열을 파지미드 벡터로 클로닝하였고 E.coli에서 소규모(50ml) 발현 연구를 수행하였다. 이는 서열의 최적화 없이 수행하였고 단백질 제조를 최대화하기 위한 특성화된 방법을 사용하지 않고 수행하였다. IPTG로 유도한 후, 가용성 VH의 발현을 결정하였다. 매치된 V-유전자 패밀리 유래의 VH를 사용하여, 단지 47% (15/32 클론)의 인간 cDNA-유래 VH 클론이 적어도 10μg의 E.coli-유래 주변세포질 추출 유래의 가용성 단백질을 제공할 수 있음을 발견하였다. 비교에 따르면, 나이브 형질전환 YAC1/TKO 마우스 유래의 클로닝된 VH의 79% (27/34)가 10μg 초과의 가용성 발현 수율을 나타내었다. 또한, 도 30에 나타낸 결과와 같이, 집단 기반에서, 더 높은 수율은 VH가 본 발명자들이 파트너 경쇄와 결합하여 발달되는 것으로 추측한 인간 cDNA 라이브러리로부터 유래된 것(평균=37.6μg/50ml)과 비교하여 형질전환 마우스(평균=176μg/50ml) 내에서 경쇄의 부존재 하에서 발달되었다는 증거이다. 따라서, 비록 어떠한 근원 유래의 VH라도 가용성 형식으로 발현될 수 있고, 형질전환 마우스 내에서 발달된 집단은 전체적으로 약 5-배 더 높은 수율의 가용성 단백질을 제공하는 향상된 용해도를 나타낸다. 면역화 후 마우스 유래의 클로닝된 인 비보 친화도-성숙 VH에 있어서 향상된 수율은 명백하였다. 이 경우에, 소규모 실험실 배양은 ~10ng/l로 증가하였고, 이는 어떠한 최적화도 하지 않은 파지미드 발현 시스템을 사용하여 수득된 것이다.
단백질의 녹는점(Tm)은 그 단백질의 안정성에 대한 대용 측정으로 사용될 수 있다. 그들을 정제한 후, 차주사형광측정법(Differential Scanning Fluorimetry: DSF)를 사용하여 상기 VH 클론의 선별의 Tm을 측정하였다. 인간 cDNA 유래의 많은 VH는 예외적으로 생산 수율이 좋지 않기 때문에 시험할 수 없었고, 이 클론 집단에 대한 평균 Tm 값은 최상의 경우를 나타내는 것으로 보인다. 간략히, 이 기술은 노출된 소수성 잔기에 성공적으로 결합할 때 신호를 방출하는 레포터 염료의 형광 검출에 의존한다. 따라서, 단백질이 가열되고 펼쳐짐에 따라, 레포터 염료가 결합하고 형광이 검출될 수 있다. 도 31에 나타낸 결과는 Protein Thermal Shift Kit (Applied Biosytems, cat no 4461146)을 사용하여 생성하였고 Protein Thermal Shift software (Cat. no. 4466037)를 사용하여 분석을 수행하였다. 볼츠만 피트(Boltzmann fit)에서 유래한 Tm 값이 보고되었고(도 31) 형질전환 마우스에서 분리된 VH의 집단이 인간 cDNA에서 분리된 것과 비교하여(인간 근원에서 클로닝된 VH에 대한 54.1℃와 비교하여 형질전환 마우스 유래의 VH에 대해 57.9℃) 유의적으로 더 높은 Tm을 제공하는 것의 증거였다. 이러한 데이터가 나이브 마우스 유래의 것이며 주로 생식세포 서열이며 친화도 성숙을 거치지 않은 VH를 나타낸다는 것을 주목해야 한다. 면역화 후, 항원-특이적, 친화도-성숙된 VH는 보통 본원에 나타낸 것과 비교하여 유의적으로 향상된 Tm을 나타낸다.
면역화된 마우스 유래의 VH는 응집에 대한 경향을 나타내지 않는다(도 32 참조). 정제된 VH의 HPLC 크기 배제 분석을 수행하였다. 간략히, TSK 겔 G2000SWXL (TOSOH) 컬럼 상의 Waters 2795 Separation Module을 이용해서 280nM에서의 검출로 VH 용액을 분석하였으며, 10%의 이소프로판올 이동상, 90% PBS 또는 pH6.8 100mM 인산염 버퍼, 150mM NaCl 및 0.5-0.7ml/분의 유속을 사용하였다. 일부 VH 제조에 있어서, 사용된 특정 E.coli 균주는 파지미드 벡터 내에서 유전자 Ⅲ 서열로의 판독 통과를 허용하고 소량의 VH-유전자 Ⅲ 융합 산물이 명백하다. 그러나, 무시할 수 있는 양의 이량체 또는 응집된 VH가 발견되었다.
전체적으로, 이러한 실험은 형질전환 마우스로부터 유래된 인간 VH가 재배치된 파트너 경쇄와 결합하여 발달된 경우 보다 향상된 용해도 및 안정성을 갖는 것을 입증하였다.
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Primer <400> 95 ggggagcatg gtttttgtag 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 96 ctgctgctgg gaaaacaagt 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 97 gcaggagaga ggttgtgagg 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 98 gctttccttc tgcctccttt 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 99 cctggtttgt tcaggcatct 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 100 cggagacaga aggtctctgg 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 101 agccttttca gtttcggtca 20 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 102 ctggtttcca agagaaaagg a 21 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 103 caagtgtaca gtccccgaag caag 24 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 104 tgatacacgc aacacgcttg tc 22 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 105 gaggtacagg gggctcatgg gt 22 <210> 106 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 106 cttggcccgc atttacaaga ctatc 25 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 107 cgtgcgtgga gtaaaaaggt 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 108 tgaacgcact ctcactacgg 20 <210> 109 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 109 gcccaataga aagagaacaa ttgacc 26 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 110 acacctccgc ttacatcaac acc 23 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 111 ggatcacgag gtcaggagat 20 <210> 112 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 112 acggagtctc gctctgtcg 19 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 113 gacctcggga tcatccttgc 20 <210> 114 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 114 atggactgga cctggag 17 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 115 atggacacac tttgctccac gc 22 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 116 atgaaacacc tgtggttctt c 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 117 atgtctgtct ccttcctcat c 21 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 118 atggarttkg grctgagctg 20 <210> 119 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 119 gtcaggatgt gggttttc 18 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 120 ggaggtgccc tgggctgtgt c 21 <210> 121 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 121 gtgtctgggc acacactc 18 <210> 122 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 122 ctcacactga cttcccctc 19 <210> 123 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 123 ggaacagacc accatggccc aggtbcagct ggtgcagtct ggggctgagg 50 <210> 124 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 124 ggaacagacc accatggccc aggtbcagct ggtgcagtct gg 42 <210> 125 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 125 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtgca gctggtgcag 60 tctggggctg agg 73 <210> 126 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 126 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtcca gctcgtgcag 60 tctggggctg agg 73 <210> 127 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 127 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggttca gctggtgcag 60 tctggagctg agg 73 <210> 128 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 128 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtcca gctggtacag 60 tctggggctg agg 73 <210> 129 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 129 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccagrtcac cttgaaggag 60 tctgg 65 <210> 130 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 130 ggaacagacc accatggccc agatcacctt gaaggagtct gg 42 <210> 131 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 131 ggaacagacc accatggccs aggtgcagct ggtggagtct gggggagg 48 <210> 132 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 132 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg ccgaggtgca gctggtggag 60 tctgggggag g 71 <210> 133 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 133 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg ccgaagtgca gctggtggag 60 tctgggggag g 71 <210> 134 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 134 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtgca gctggtggag 60 tctgggggag g 71 <210> 135 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 135 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg ccgaggtgca gctgttggag 60 tctgggggag g 71 <210> 136 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 136 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtgca gctgcaggag 60 tcggg 65 <210> 137 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 137 ggaacagacc accatggccc aggtgcagct gcaggagtcg gg 42 <210> 138 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 138 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtgca gctacagcag 60 tggggc 66 <210> 139 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 139 ggaacagacc accatggccc aggtacagct gcagcagtca gg 42 <210> 140 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 140 gccgctggat tgttattact cgcggcccag ccggccatgg cccaggtaca gctgcagcag 60 tcagg 65 <210> 141 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 141 gctaccgcca ccctcgagtg argagacrgt gacc 34 <210> 142 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 142 ccgtggtgat ggtggtgatg gctaccgcca ccctcgagtg argagacrgt gacc 54 <210> 143 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Hypervariable region <400> 143 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 144 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Hypervariable region <400> 144 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 145 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Hypervariable region <400> 145 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg 20 <210> 146 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Hypervariable region <400> 146 Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg 1 5 10 <210> 147 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Hypervariable region <400> 147 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

Claims (42)

  1. a) 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자(functional human heavy chain V genes)로서, 그들의 천연의 형태인 10 이상의 기능적 인간 중쇄 V 유전자;
    b) 1 이상의 인간 중쇄 D 유전자 및 1 이상의 인간 중쇄 J 유전자;
    c) CH1 엑손이 결핍된 쥐과(murine) C 유전자;
    를 포함하는 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 벡터는 쥐과 3' 인핸서 영역(enhancer region)을 포함하는 것인, 벡터.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역은 약 42kb 이상의 크기인 것인, 벡터.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역은 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7로부터 선택된 하나 이상의 인핸서 요소(enhancer elements)를 포함하는 것인, 벡터.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 쥐과 3' 인핸서 영역은 인핸서 요소 hs3A, hs1.2, hs3B, hs4, hs5, hs6 및 hs7을 포함하는 것인, 벡터.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 쥐과 μ 인핸서를 포함하는 것인, 벡터.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 스위치 μ 요소를 포함하는 것인, 벡터.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 쥐과 Cγ 유전자를 포함하는 것인, 벡터.
  9. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 쥐과 μ 인핸서 및 스위치 μ 요소 또는 쥐과 μ 인핸서 및 쥐과 Cγ 유전자를 포함하는 것인, 벡터.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 쥐과 Cγ 1 유전자를 포함하는 것인, 벡터.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 10 내지 약 44개의 기능적 인간 V 유전자를 포함하는 것인, 벡터.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 쥐과 Cγ 유전자를 더 포함하는 것인, 벡터.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 Cγ 유전자는 Cγ2b 및 Cγ2a로부터 선택된 것인, 벡터.
  14. 청구항 13에 있어서, Cγ2b 및 Cγ2a를 포함하는 것인, 벡터.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 선별 마커를 더 포함하는 것인, 벡터.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 효모인공염색체(Yeast Artificial Chromosome: YAC)인 것인, 벡터.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환된 형질전환 쥐과 숙주 세포.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 세포가 ES 세포인, 형질전환 쥐과 숙주 세포.
  19. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 청구항 17 또는 18에 따른 세포를 포함하는 형질전환 마우스.
  20. 청구항 19에서, 상기 마우스는 하나 이상의 비-기능적 내인성 면역글로불린 유전자좌(non-functional endogenous immunoglobulin loci)를 포함하는 것인, 형질전환 마우스.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 람다 경쇄 유전자좌(non-functional endogenous lambda light chain locus)를 포함하는 것인, 형질전환 마우스.
  22. 청구항 20 내지 21에 있어서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 카파 경쇄 유전자좌(non-functional endogenous kappa light chain locus)를 포함하는 것인, 형질전환 마우스.
  23. 청구항 20 내지 22에 있어서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 중쇄 유전자좌를 포함하는 것인, 형질전환 마우스.
  24. 청구항 20에 있어서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 람다 경쇄 유전자좌, 비-기능적 내인성 카파 경쇄 유전자좌 및 비-기능적 내인성 중쇄 유전자좌를 포함하는 것인, 형질전환 마우스.
  25. HCAb 또는 VH 도메인 제조에서 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 따른 형질전환 마우스 또는 청구항 17 또는 18에 따른 세포의 용도.
  26. 라이브러리 구축에서 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 따른 형질전환 마우스의 용도.
  27. 청구항 26에서, 상기 라이브러리는 나이브(naive) 라이브러리인 것인, 형질전환 마우스의 용도.
  28. 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 따른 형질전환 마우스를 이용하여 라이브러리를 제조하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 라이브러리는 나이브 라이브러리인 것인, 방법.
  30. 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 따른 형질전환 마우스 또는 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 따른 형질전환 마우스의 엑스 비보(ex vivo) 조직 또는 세포의 엑스 비보 면역화를 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법.
  31. 청구항 17 또는 18에 따른 숙주세포 또는 청구항 19 내지 24 중 어느 한 항에 따른 형질전환 마우스 내에서 제조되거나 이로부터 수득된 HCAb 또는 VH 도메인.
  32. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 벡터를 마우스 또는 쥐과 숙주 세포에서 도입 및 발현시키는 단계를 포함하는 HCAb 또는 VH 도메인을 제조하는 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 마우스는 하나 이상의 비-기능적 내인성 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 것인, 방법.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 람다 경쇄 유전자좌를 포함하는 것인, 방법.
  35. 청구항 32 내지 34에 있어서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 카파 경쇄 유전자좌를 포함하는 것인, 방법.
  36. 청구항 32 내지 35에 있어서, 상기 마우스는 비-기능적 내인성 중쇄 유전자좌를 포함하는 것인, 방법.
  37. 청구항 32에 있어서, 상기 마우스 는 비-기능적 내인성 람다 경쇄 유전자좌, 비-기능적 내인성 카파 경쇄 유전자좌 및 비-기능적 내인성 중쇄 유전자좌를 포함하는 것인, 방법.
  38. 청구항 32 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 분리된 세포 또는 조직으로부터 유래된 mRNA로부터 VH 도메인을 인코딩하는 서열을 클로닝하는 단계, 클로닝된 전사물로부터 라이브러리를 구축하는 단계 및 VH 도메인을 분리하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  39. a) 청구항 1-16 중 어느 한 항의 벡터를 형질전환 마우스에서 발현시키는 단계,
    b) HCAb를 발현하는 세포 또는 조직을 분리하는 단계,
    c) 분리된 세포 또는 조직으로부터 유래된 mRNA로부터 VH 도메인을 인코딩하는 서열을 클로닝하는 단계,
    d) 클로닝된 전사물로부터 라이브러리를 구축하는 단계 및
    e) VH 도메인을 분리하는 단계
    를 포함하는 가용성 VH 결합 도메인을 제조하는 방법.
  40. 청구항 38 또는 39의 방법에 의해서 수득한 또는 수득할 수 있는 가용성 VH 도메인.
  41. 청구항 40에 따른 VH 도메인을 포함하는 조성물.
  42. 청구항 41에 있어서, VH 도메인을 단독으로 또는 다른 VH 도메인, 단백질, 또는 치료 효과를 갖는 다른 분자와 조합하여 포함하는 것인, 조성물.
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