KR20170077185A - 인터페론 α2b 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 제1 도메인은 세포 표면에 회합된 항원에 결합하는 폴리펩티드 리간드를 포함하고, 제2 도메인은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 서열을 갖는 아글리코실화된 인터페론 α2b(IFNα2b)를 포함하는 것인, 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 아글리코실화된 IFNα2b는 아글리코실화된 IFNα2b의 활성을 약화시키는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 추가로 포함한다.

Description

인터페론 α2b 변이체{INTERFERON α2b VARIANTS}
본 발명은, 세포 표면 항원에 대해 표적화되는 리간드 및 아글리코실화된(aglycosylated) 인터페론 α2b(IFNα2b)를 포함하는 폴리펩티드, 및 암 치료에 있어서의 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
다수의 펩티드 및 폴리펩티드 분자는 세포 표면 상의 수용체와 상호작용하여, 일반적으로 상기 수용체를 보유하는 세포 내부의 신호 전달 경로를 관여시키는 생물학적 반응을 자극하거나, 억제하거나, 다른 방식으로 조절함으로써 작용하는 것으로 기술되어 왔다. 그러한 분자의 예로는 펩티드 및 폴리펩티드 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 아폽토시스 유도 인자 등을 포함한다. 이들 분자는 가용성일 수 있거나, 다른 세포의 표면에 부착되어 있을 수 있다.
상기 분자의 생물학적 활성에 기인하여, 일부 분자는 치료제로서의 잠재적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 인간 성장 호르몬, 인슐린, 인터페론 IFNα2b, IFNα2a, IFNβ, 에리트로포이에틴, G-CSF 및 GM-CSF를 비롯한, 여러 종의 펩티드 또는 폴리펩티드 분자가 치료학적 제품으로서 규제 기관의 승인을 받아 왔다. 이들 및 다른 펩티드들 다수는 치료학적 적용에서 잠재능이 있는 것으로 입증되었지만, 이는 또한 인간 환자에게 투여되었을 때에는 독성도 나타내었다. 독성에 대한 한가지 이유는 이들 분자 대부분이 치료학적 효과를 매개하는 것 이외의 세포를 포함하는 다양한 세포 상의 수용체에서의 반응을 일으키기 때문이다. 예를 들어, IFNα2b가 다발성 골수종 치료를 위해 사용될 때, 그의 유용성은 그가 적어도 부분적으로는 골수종 세포 상의 I형 인터페론 수용체에 결합하여 차례로 증식 감소를 일으키고, 이로써, 질환 진행을 제한하는 데 있다. 그러나, 불행하게도, 상기 IFN은 또한 신체 내의 다수의 다른 정상 세포에도 결합하여 다양한 다른 세포 반응을 일으키고, 이 중 일부는 유해하다(예컨대, 감기 유사 증상, 호중구 감소증, 우울증). 펩티드의 상기와 같은 "오프 타겟(off target)" 활성의 결과는 다수의 펩티드가 약물 후보물질로서 적합하지 않다는 것이다. 이와 관련하여, "오프 타겟 활성"이란, 펩티드의 천연 수용체 상, 그러나, 치료학상 유익한 효과를 매개하는 것 이외의 다른 세포의 표면 상에서의 활성을 의미한다.
비록 일부 펩티드, 예컨대, IFNα2b는 의학적 병태 치료를 위한 것으로 승인은 받았지만, 그의 "오프 타겟" 생물학적 활성에 기인하여 내약성이 불량하다. 오프 타겟 활성 및 연관된 불량한 내약성은 또한 상기 펩티드에 기반한 약물 중 일부는 치료학적 효과를 매개하는 표적 세포에 대하여 최적의 치료학적 효과를 발휘하는 데 충분히 높은 투여량으로는 투여될 수 없다는 것을 의미하기도 한다.
유사하게, 1980년대 중반 이래로 인터페론, 특히, IFNα는 아폽토시스를 증가시킬 수 있고, 특정 암 세포의 증식을 감소시킬 수 있다고 알려져 왔다. 이러한 생물학적 활성은 암 세포의 표면 상의 I형 인터페론 수용체에 의해 매개되는데, 이는 자극을 받았을 때, 다양한 신호 전달 경로를 개시시켜 증식을 감소시키고/거나, 최종의 분화 또는 아폽토시스를 유도한다. IFNα는 흑색종, 신장 세포 암종, B 세포 림프종, 다발성 골수종, 만성골수성 백혈병 (CML) 및 모발상 세포 백혈병을 비롯한, 몇 종의 암 치료용으로서 FDA의 승인을 받았다. IFNα가 종양 세포에 대해 미치는 "직접적인" 효과는 상기 세포 상의 I형 IFN 수용체에 직접 결합하고, 아폽토시스, 최종의 분화 또는 증식 감소를 자극하는 IFNα에 의해 매개된다. 비암 세포에 대해 IFNα가 미치는 한 가지 "간접적인" 효과는 면역계를 자극하는 것인데, 이는 면역계가 종양을 거부하도록 유발함으로써 추가의 항암 효과를 일으킬 수 있다.
불행하게도, I형 인터페론 수용체는 대부분의 비암성 세포 상에도 또한 존재한다. IFNα에 의한 상기 세포 상의 이들 수용체의 활성화는 다수의 염증유발성 사이토카인 및 케모카인 발현을 유발하여 독성을 일으킨다. 상기 독성은 암 세포에 대하여 최대의 항증식성 및 아폽토시스 유발 활성을 발휘하는 수준으로 IFNα를 피험체에게 투약하지 못하게 막는다.
(Ozzello) 등(문헌 [Breast Cancer Research and Treatment 25:265-76, 1993])은 종양 성장률을 감소시키는 방법으로서, 인간 IFNα를 종양 표적화 항체에 공유적으로 부착시켜 IFNα의 직접적인 억제 활성을 종양으로 국재화시키는 것을 기술하였고, 상기 컨쥬게이트가 인간 암의 이종이식편 모델에서 항종양 활성을 갖는다는 것을 입증하였다. 관찰된 항암 활성의 기전은 IFNα가 암 세포에 미치는 직접적인 효과에 기인하였는데, 이는 상기 실험에서 사용된 인간 IFNα가 뮤린 I형 IFN 수용체와 눈에 띨 정도로 상호작용하지 않았기 때문이며, 이는 간접적인 항암 효과도 일으킬 수도 있다. 그러나, 이같은 인간 IFNα의 뮤린 세포에의 결합 부족 때문에 저자는 유리 INFα 대비의 항체-IFNα 컨쥬게이트의 독성을 평가할 수 없었다. 상기 저자들은 IFNα를 항체에 부착시키는 데 화학적 방법을 사용하였다.
(Alkan) 등 (문헌 [Journal of Interferon Research, volume 4, number 3, p. 355-63, 1984])은 엡스타인-바 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus) 막 항원(MA: membrane antigen)에 결합하는 항체에 인간 IFNα를 부착시키는 것이 EBV-MA 항원을 발현하는 세포로의 그의 항증식 활성을 증가시켰다는 것을 입증하였다. 이러한 효능 증가는 표적 세포에 의한 항원 발현, 및 항체의 결합 특이성, 둘 모두에 의존하였다. 테스트된 세포주는 암 세포주 QIMR-WIL, 골수아구성 백혈병이었다. 저자는 IFNα를 항체에 부착시키는 것이 종양 성장을 감소시키기 때문에 이는 암 치료용으로서 사용될 수 있다고 제안하였다. (Alkan) 등은 정상적인 항원 음성 세포와 그의 상호작용으로부터 유발되는 상기의 항체-IFNα 컨쥬게이트의 잠재적인 독성은 처리하지 못했다.
또한, 항체와 IFNα 사이의 연결은 융합 단백질 구성체를 제조함으로써 달성될 수 있는 것으로도 알려져 있다. 예를 들어, IDEC(WO01/97844)에는 종양 항원 CD20을 표적화하는 IgG의 중쇄의 C 말단에의 인간 IFNα의 직접적인 융합이 개시되어 있다. 다른 그룹들은 IgG 중쇄의 C 말단과 IFNα 사이에 다양한 링커를 사용하는 것을 개시하였다. 예를 들어, US 7,456,257에는 서열 (GGGGS)n(여기서, n은 1, 2, 또는 3일 수 있다)으로 이루어진, 개재 세린-글리신이 풍부한(S/G) 링커를 통해 항체 중쇄 불변 영역의 C 말단을 IFNα에 연결시킬 수 있고, 링커 길이와는 상관없이 융합 단백질 구성체의 IFNα 활성에 있어 어떤 유의적인 차이도 없다고 개시되어 있다.
(Morrison) 등 (US2011/0104112 A1; 및 문헌 [Xuan C, Steward KK, Timmerman JM, Morrison SL. Targeted delivery of interferon-α via fusion to anti-CD20 results in potent antitumor activity against B-cell lymphoma. Blood 2010;115:2864-71])은 또한 개재 S/G 링커를 이용하여 암 표적화 IgG 항체의 중쇄의 C 말단에 연결된 IFNα를 개시하였고, IgG 및 링커의 IFNα에의 융합이, 세포 표면 상에 상응하는 항원을 발현하지 않는 세포에 대한 IFNα의 활성을 감소시켰다는 것을 관찰하게 되었다. 이들 융합 단백질 구성체의 감소된 IFN 활성은 인간 세포에 대해 작용하는 인간 비융합 단백질 IFNα(유리 IFNα)와 비교하였을 때에는 그다지 크지 않았지만, 뮤린 세포 상의 뮤린 IFNα에 대해서는 유의적으로 더 큰 것으로 나타났다. 인간 IFNα를 항체의 C 말단에 융합시킴으로써 이루어진 인간 IFNα의 활성 감소는 (Morrison) 등에 의해 및 US 7,456,257에서 관찰된 바와 같이, 그다지 크지 않고, 일반적으로 이는 IFN 효능을 감소시키기 때문에 단점인 것으로 여겨진다. 이러한 단점은 예를 들어, IFNα 활성 손실이 관찰되지 않는 방식으로 IFNα를 종양 표적화 항체에 부착시키는 대안적 전략법을 사용한, (Rossi) 등 (문헌 [Blood vol. 114, No. 18, pp3864-71])에 의해 지적되었다.
일반적으로, 선행 기술은 강력한 효능을 지닌 IFN을 사용하고, 상기 IFN을 암 세포로 표적화하는 것을 교시한다. 이러한 접근법은 암 세포에 대한 IFN의 활성을 증가시키지만, 정상적인 "오프 타겟" 세포에 대한 IFN의 활성에 관한 문제는 다루지 않고 있다. 상기 언급된 선행 기술의 예에서, 항체-IFNα 융합 단백질의 인간 IFNα 부분은 인간 세포 표면 상에 상응하는 항원을 발현하지 않는 인간 세포에 노출시켰을 때, 높은 비율로 천연 IFNα 활성을 유지하였다. 이러한 활성은 융합 단백질의 IFNα 부분에 의해 비암성의 정상적인 ("오프 타겟") 세포의 활성화로부터 유발되는 독성을 일으킬 수 있다. 따라서, IFN 기반 약물의 "온 타겟(on target)" 치료학적 효과는 유지시키면서, 상기 약물의 "오프 타겟" 활성은 감소시키는 것이 요구되고 있다. 이러한 유형의 치료제의 표적 특이 활성은 유지시키면서, 동시에, 비표적 독성은 감소시키는 것이 치료학상 유용한 펩티드에 대하여 더욱 큰 치료학적 농도 창을 생성하게 될 것이다. 예를 들어, 정상적인 인간 세포에 대한 그의 효과는 최소화시키면서, 그의 활성이 암 세포에 대해서 이루어질 수 있도록 하는 형태로 인간 IFNα를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이상적으로는, 암 세포 상의 I형 인터페론 수용체는 최대로 자극을 받겠지만, 동시에 비암성 세포 상의 같은 수용체는 최소의 자극을 경험하게 될 것이다. 항원을 나타내지 않는 정상 세포 상에서보다는 항원을 나타내는 암 세포 상에서 현저하게 더욱 큰 활성을 가지도록 하는 방식으로 인간 IFNα를 암 세포로 표적화하는 것이 요구되고 있다. 같은 논리가 잠재적으로 치료학적인 다른 분자, 예컨대, 다른 사이토카인, 펩티드 및 폴리펩티드 호르몬, 케모카인, 성장 인자, 아폽토시스 유도 인자 등에도 적용된다.
상기 접근법의 논리는 WO 2013/059885, 및 WO 2014/178820에서 입증된 바 있으며, 상기 문헌은 각각 그 개시내용이 본원에서 상호 참조로 포함된다.
제1 측면에서, 본 발명은 제1 도메인은 세포 표면에 회합된 항원에 결합하는 폴리펩티드 리간드를 포함하고, 제2 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 또는 서열식별번호: 2의 서열을 갖는 인간 아글리코실화된 인터페론 α2b(IFNα2b)를 포함하고, 여기서, 아글리코실화된 IFNα2b는 아글리코실화된 IFNα2b의 활성을 약화시키는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 추가로 포함하는 것인, 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 31, 61 내지 77, 83 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 서열식별번호: 81, 82 및 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 87 및 서열식별번호: 81을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 85를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 80 및 서열식별번호: 86을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 78을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩티드, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 피험체에게 본 발명의 융합 폴리펩티드, 또는 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 융합 폴리펩티드의 제1 도메인은 종양의 세포에 결합하는 것인, 피험체에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 융합 폴리펩티드의 제1 도메인이 종양에 결합하는 것인, 종양 치료에서의 본 발명의 융합 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 융합 폴리펩티드(들)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(들)를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 포유동물 세포에서, 감소된 불균질성(heterogeneity) 및/또는 강화된 FcRn 결합 및/또는 강화된 표적 선택성을 갖는 폴리펩티드 리간드-약화된 IFNα2b 융합 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드 리간드-약화된 IFNα2b 융합 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 IFNα2b 서열의 T106은, 상기 포유동물 세포에서 발현될 때 융합 단백질의 IFNα2b 성분이 아글리코실화되도록 다른 아미노산으로 치환되거나 결실되어 있는 것인 방법을 제공한다.
도 1: IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재 및 부재하의 IgG1 또는 IgG4 포맷의 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질을 이용한 (a) ARP1 및 (b) NCI-H929 세포 치료 시의 항증식 활성.
도 2a, b, c, d 및 e. 약화된 IFNα2b로부터 O-결합 글리코실화 부위를 제거하는 다른 아미노산 치환을 갖는 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 항증식 활성.
도 3: IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 및 부재(T106A)하의 (a) A10.21 및 (b) A10.43 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 온 타겟 활성.
도 4: IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 및 부재(T106A)하의 (a) A10.21 및 (b) A10.43 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 오프 타겟 활성.
도 5: IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 및 부재(T106A 또는 ΔT106)하의 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질에 의한 오프 타겟 활성.
도 6: a, b, c, d, e 및 f: 약화된 IFNα2b로부터 O-결합 글리코실화 부위를 제거하는 다른 아미노산 치환을 갖는 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 오프 타겟 활성.
도 7: IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 부재(T106A)하의 A10.43 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 오프 타겟 활성.
도 8: 다발성 골수종의 뮤린 모델에서의 종양 치료에서 차선 투여량의, O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 부재(T106A)하의 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 효능.
도 9: IEF 겔 상의 밴드 개수로 사정된, IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 부재(T106A, T106, T106S, T106V, T106G, T106E)하의 하전된 A10.21 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질 종의 개수.
도 10: IEF 겔 상의 밴드 개수로 사정된, IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 부재(T106A), 및 다양한 Fc 이소타입을 포함하는 하전된 A10.21 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질 종의 개수.
도 11: IEF 겔 상의 밴드 개수로 사정된, 항체 불변 영역 중의 YTE 치환의 존재하에서 IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 부재(T106A)하의 하전된 A10.21 (IgG4는 S228P를 포함) 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질 종의 개수.
도 12: IEF 겔 상의 밴드 개수로 사정된, IFN을 약화시키는 다양한 치환의 존재하에서 IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 부재(T106A)하의 하전된 A10.21 (IgG4는 S228P를 포함) 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질 종의 개수.
도 13: IEF 겔 상의 밴드 개수로 사정된, 표적 특이성이 다른 하전된 항체 종; IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 부재(T106A)하의 약화된 IFNα2b에 융합된 항CD138 항체, 항HLA 항체, 및 항 CD38 항체(A02.12)(IgG4 모두 S228P를 포함)의 개수.
도 14: IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 및 부재(T106A, T106, T106S, T106V, T106G, T106E)하의 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질(A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D))의 "온 타겟" 활성.
도 15: IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 및 부재(T106A)하인, CD38 상의 상이한 에피토프에 결합하는 2종의 다른 항CD38 항체-약화된 IFNα2b 융합 단백질(A02.12 및 A10.21, 두 IgG4 모두 S228P를 포함)의 "온 타겟" 활성.
도 16: IFN을 약화시키는 다양한 치환(R33A, R144I, R145Q, A145K 또는 A145G)을 포함하는, IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 및 부재(T106A)하의 A10.21 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질(A10.21 IgG4 (S228P) IFN)의 "온 타겟" 활성.
도 17: 표적 특이성이 다른 항체; IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 부재(T106A)하의 약화된 IFNα2b에 융합된 항CD138 항체, 및 항HLA 항체(두 IgG4 모두 S228P를 포함)의 "온 타겟" 활성.
도 18: 항체 항체 중쇄 중의 YTE 치환의 존재하에서 IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 및 부재(T106A)하의 A10.21 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질(A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D))의 "온 타겟" 활성.
도 19: IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 및 부재(T106A), 및 다양한 면역글로불린 Fc 이소타입을 포함하는 A10.21 항CD38-약화된 IFNα2b(A145D) 융합 단백질의 "온 타겟" 활성.
도 20: IFN의 글리코실화를 제거하는 다양한 아미노산 치환, 반감기 연장, IFN 약화를 위한 면역글로불린 불변 영역 중의 YTE 치환, 및 Fc 이소타입의 존재하에서 IFNα2b의 O-결합 글리코실화의 존재 및 부재하의 A10.21 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 선택성 지수.
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 전역에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어, 또는 예컨대, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는"이라는 파생어는 임의의 다른 요소 또는 완전체, 또는 요소 또는 완전체 군을 배제하는 것이 아니라, 언급된 요소 또는 완전체, 또는 요소 또는 완전체 군을 포함한다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 임의의 선행 공개 문헌(또는 그로부터 도출된 정보), 또는 임의의 공지 내용에 관하여 언급하는 것은, 선행 공개 문헌(또는 그로부터 도출된 정보), 또는 공지 내용이 본 명세서와 관련하여 시도되는 분야에서 일반 상식의 일부를 형성한다는 것을 승인하거나, 인정하거나, 또는 어느 형태로든 제안하는 것으로 간주되지 않으며, 간주되지 않아야 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다.
본 대상 명세서에서 사용될 때, 단수 형태인 "하나(a, an)" 및 "그"는 문맥상 명확하게 달리 언급되지 않는 한, 복수 개의 측면을 포함한다는 것에 주목하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "한 작용제"라고 언급하는 것은 단일 작용제 뿐만 아니라, 2개 이상의 작용제를 포함하고; "한 분자"라고 언급하는 것은 단일 분자 뿐만 아니라, 2개 이상의 분자를 포함하는 등 그러하다.
본 발명의 구성체는 관심 세포 상의 세포 표면 수용체로 표적화하는 리간드 및 세포 표면 IFN 수용체에의 친화도가 감소된 약화된 IFNα2b, 둘 모두의 작용에 기인하여 신호전달 경로를 활성화시키는 것과 관련하여 상승된 항원 선택성 지수를 보이는, 폴리펩티드 리간드-약화된 아글리코실화된 IFNα2b 융합 구성체이다. 상기 구성체는, 항체-IFN 융합 구성체와 관련하여 IFN 부분은 항원 양성 세포 상의 IFN 활성은 진행된다 해도 오직 소규모로만 약화되면서, 항원 음성 세포 상의 IFN 활성은 현저하게 약화되도록 하는 방식으로 돌연변이화될 수 있다는, WO 2013/059885에서 개략적으로 설명된 발견에 기초한다. 상기 구성체는 유리 IFN보다 항원 음성 세포와 비교하여 항원 양성 세포 상에서 10, 102, 103, 104 또는 105배 더 큰 효능을 보인다. 한 실시양태에서, 항체-약화된 IFN 구성체는 약화되지 않은 유리(즉, 항체에 부착되지 않은) IFN와 같이 항원 양성 세포 상에서 효능의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%를 유지사한다. 추가로, 한 실시양태에서, 항체-약화된 IFN 구성체는 약화되지 않은 유리(즉, 항체에 부착되지 않은) IFN의 최대 활성의 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75% 또는 적어도 90%를 유지하고; 이와 관련하여, "최대 활성"은 용량-반응 곡선의 높은 안정 상태 부분에서의 신호전달 활성(또는 그의 하류 효과)의 양을 의미하는 것으로 이해하여야 하며, 여기서, 상기 작용제의 추가 증가가 그 반응을 추가로 증가시키지는 않는다.
이에, 본 발명자들은 O-글리코실화된 IFNα2b를 포함하는 구성체와 비교하였을 때 아글리코실화된 IFNα2b를 포함하는 구성체를 사용함으로써 예상치 못한 이점을 얻을 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 일부 실시양태에서, 상기 이점으로는 포유동물 세포 발현 시스템에서 제조되었을 때, O-글리코실화된 IFNα2b보다 불균질성이 더 즉은 생성물을 제공하면서, 온 타겟 활성 증가, 표적 선택성 증가 및 FcRn에의 친화도 강화 중 하나 이상의 것을 포함한다. FcRn 결합 강화는 Fc 영역을 포함하는 생물학적 치료제의 pK를 개선시키는 데 바람직할 수 있다. 표적 선택성 증가는, 이는 온 타겟 활성은 실질적으로 유지시키면서, 오프 타겟 독성을 잠재적으로 감소시키므로, 바람직할 수 있다. 불균질성 감소는 포유동물 세포 배양 시스템으로부터의 정제 생성물의 수율을 증가시킬 수 있다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 제1 도메인은 세포 표면에 회합된 항원에 결합하는 폴리펩티드 리간드를 포함하고, 제2 도메인은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 서열을 갖는 아글리코실화된 인터페론 α2b(IFNα2b)를 포함하고, 여기서, 아글리코실화된 IFNα2b는 아글리코실화된 IFNα2b의 활성을 약화시키는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 추가로 포함하는 것인, 제1 및 제2 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열은 106번 위치의 잔기가 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y인 서열식별번호: 1이다. 이는 인간 IFNα2b에 일반적으로 존재하는 T106이, 포유동물 세포 배양물에서 제조되었을 때, 상기 위치에서 O-결합 글리코실화를 허용하지 않는 자연적으로 발생된 아미노산으로 치환된 것을 나타낸다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열은 서열식별번호: 2이다. 이는 정상적인 인간 IFNα2b에서 발견되는 잔기 T106의 결실을 나타내고, 이는 또한 상기 분자에서 발견되는 O-결합 글리코실화 부위를 제거한다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 치환 또는 결실은 각각 인간 약화된 IFNα2b로부터 O-글리코실화 부위를 제거하고, IEF 겔에서 측정되는 바와 같이 분자의 불균질성을 감소시키고, CHO 세포에 의해 발현되었을 때에는 세포 표면 IFN 수용체에 결합하고, 하류 신호전달을 개시할 수 있는 약화된 IFNα2b의 활성은 적어도 실질적으로 유지시키면서 이루어진다.
추가 실시양태에서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열은 L15A, R22A, R23A, S25A, L26A, F27A, L30A, L30V, K31A, D32A, R33A, R33K, R33Q, H34A, Q40A, D114R, L117A, R120A, R120E, R125A, R125E, K131A, E132A, K133A, K134A, M148A, R149A, S152A, L153A, N156A, (L30A, H57Y, E58N 및 Q61S), (M148A, H57Y, E58N 및 Q61S), (L153A, H57Y, E58N 및 Q61S), (R144A, H57Y, E58N 및 Q61S), (N65A, L80A, Y85A 및 Y89A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 D114A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 L117A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 R120A), (Y85A, Y89A 및 D114A), (D114A 및 R120A), (L117A 및 R120A), (L117A, R120A 및 K121A), (R120A 및 K121A), (R120E 및 K121E), 144번 위치의 R의 A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환, 145번 위치의 A의 D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환, 및 잔기 L161 내지 E165의 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 약화 돌연변이에 의해 변형된 서열식별번호: 1이다.
추가의 실시양태에서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열은 L15A, R22A, R23A, S25A, L26A, F27A, L30A, L30V, K31A, D32A, R33A, R33K, R33Q, H34A, Q40A, D113R, L116A, R119A, R119E, R124A, R124E, K130A, E131A, K132A, K133A, M147A, R148A, S149A, L152A, N155A, (L30A, H57Y, E58N 및 Q61S), (M147A, H57Y, E58N 및 Q61S), (L152A, H57Y, E58N 및 Q61S), (R143A, H57Y, E58N 및 Q61S), (N65A, L80A, Y85A 및 Y89A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 D113A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 L116A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 R1190A), (Y85A, Y89A 및 D113A), (D113A 및 R119A), (L116A 및 R119A), (L116A, R119A 및 K120A), (R119A 및 K120A), (R119E 및 K120E), 143번 위치의 R의 A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환, 144번 위치의 A의 D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환, 및 잔기 L160 내지 E164의 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 약화 돌연변이에 의해 변형된 서열식별번호: 2이다.
또 다른 실시양태에서, 약화 돌연변이에 의해 변형된 아글리코실화된 IFNα2b의 서열은 서열식별번호: 3 내지 30 및 서열식별번호: 32 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 세포 표면에 회합된 항원은 CD38, CD138, RANK-리간드, HM1.24, CD56, CS1, CD20, CD74, IL-6R, Blys(BAFF), BCMA, HLA-SR, HLA-DR, 키니노젠(키니노젠), 베타2 마이크로글로불린, FGFR3, ICAM-1, 매트립타제, CD52, EGFR, GM2, 알파4-인테그린, IFG-1R, KIR, CD3, CD4, CD8, CD24, CD44, CD69, CD71, CD79, CD83, CD86, CD96, HLA, PD-1, ICOS, CD33, CD115, CD11c, CD19, CD52, CD14, FSP1, FAP, PDGFR 알파, PDGFR 베타, ASGR1, ASGR2, FSP1, RTI140/Ti-알파, HTI56, VEGF 수용체, CD241 RCHE 유전자의 생성물, CD117(c-kit), CD71(트랜스페린 수용체), CD36(트롬보스폰딘 수용체), CD34, CD45RO, CD45RA, CD115, CD168, CD235, CD236, CD237, CD238, CD239 및 CD240으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합부이다.
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 리간드는 CD38에 결합하는 항체이다. 항체의 VH 서열은 서열식별번호: 48 내지 56 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되고, 항체의 VL 서열은 서열식별번호: 81, 82 및 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 리간드는 CD138에 결합하는 항체이다. 항체의 VH 서열은 서열식별번호: 59이고, 항체의 VL 서열은 서열식별번호: 85인 것이 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 리간드는 RANK-리간드에 결합한다. 폴리펩티드 리간드의 서열이 서열식별번호: 57인 것이 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 제1 도메인은 펩티드 결합을 통해 제2 도메인에 연결된다. 제1 도메인은 펩티드 결합("길이가 0인 링커")에 의해 직접, 또는 길이가 1 내지 20개의 아미노산 길이인 펩티드 링커를 통해 제2 도메인에 연결될 수 있다. 링커는 (SGGGGS)n(여기서, n은 1 내지 3이다)일 수 있다. 링커의 예로는 SGGGGS 및 SGGGGSGGGGSGGGGS를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 도메인의 C 말단이 제2 도메인의 N 말단에 연결되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 제1 도메인의 아미노산 서열은 글리코실화되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 31, 61 내지 77, 83 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 서열식별번호: 81, 82 및 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 87 및 서열식별번호: 81을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 79 및 서열식별번호: 85를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 80 및 서열식별번호: 86을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열식별번호: 78을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
상기 논의로부터 이해되는 바와 같이, 본 발명의 융합 폴리펩티드의 특정 형태는 하기와 같다:
a. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 A인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
b. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 C인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
c. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 D인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
d. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 E인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
e. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 F인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
f. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 G인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
g. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 H인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
h. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 I인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
i. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 K인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
j. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 L인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
k. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 M인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
l. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 N인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
m. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 P인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
n. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 Q인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
o. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 R인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
p. T아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 V인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
q. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 W인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
r. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 Y인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
s. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 L15A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
t. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 A19W에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
u. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 R22A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
v. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 R23A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
w. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 S25A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
x. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 L26A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
y. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 F27A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
z. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 L30A 또는 L30V에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
aa. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 K31A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
bb. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 D32A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
cc. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 약화 돌연변이 R33A, R33K 또는 R33Q에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
dd. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 H34A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ee. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 Q40A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ff. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 D114R에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 D113R에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
gg. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 L117A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 L116A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
hh. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 R120A 또는 R120E에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 R119A 또는 R119E에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ii. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 R125A 또는 R125E에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 R124A 또는 R124E에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
jj. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 K131A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 K130A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
kk. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 E132A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 E131A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ll. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 K133A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 K132A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
mm. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 K134A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 K133A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
nn. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 M148A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 M147A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
oo. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 R149A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 R148A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
pp. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 S152A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 S151A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
qq. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 L153A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 L152A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
rr. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 N156A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 N155A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ss. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 L30A, H57Y, E58N 및 Q61S에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
tt. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 M148A, H57Y, E58N 및 Q61S에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 M147A, H57Y, E58N 및 Q61S에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
uu. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 L153A, H57Y, E58N 및 Q61S에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 L152A, H57Y, E58N 및 Q61S에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
vv. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 R144A, H57Y, E58N 및 Q61S에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 R143A, H57Y, E58N 및 Q61S에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ww. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 N65A, L80A, Y85A 및 Y89A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
xx. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 D114A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 D113A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
yy. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 L117A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 L116A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
zz. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 R120A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 R119A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
aaa. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 Y85A, Y89A 및 D114A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 Y85A, Y89A 및 D113A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
bbb. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 D114A 및 R120A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 D113A 및 R119A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ccc. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 약화 돌연변이 L117A 및 R120A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 약화 돌연변이 L116A 및 R119A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ddd. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 돌연변이 L117A, R120A 및 K121A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 돌연변이 L116A, R119A 및 K120A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
eee. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 돌연변이 R120A 및 K121A에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 돌연변이 R119A 및 K120A에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
fff. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 돌연변이 R120E 및 K121E에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 돌연변이 R119E 및 K120E에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
ggg. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 144번 위치의 R의 A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 143번 위치의 R의 A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
hhh. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 145번 위치의 A의 D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 144번 위치의 A의 D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
iii. 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 잔기 L161 내지 E165의 결실에 의해 변형된 서열식별번호: 1 또는 잔기 L161 내지 E165의 결실에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
jjj. 제1항에 있어서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 서열식별번호: 3 내지 30 및 서열식별번호: 32 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 폴리펩티드.
본원에서 사용될 때, "항체"라는 용어는 광범위하게는 면역글로불린(Ig) 분자의 필수적인 에피토프 결합 특징을 보유하는, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩티드 쇄로 구성된 임의의 Ig 분자, 또는 이의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭한다. 상기 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체 포맷은 당업계에 공지되어 있고, 그의 비제한적인 실시양태는 하기에서 논의된다.
전장 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL로 구성되고, 이는 인간에서는 λ 또는 μ 부류의 것일 수 있다. VH 영역 및 VL 영역은 골격 영역(FR: framework region)으로서 지칭되는 보존성이 더욱 큰 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)으로서 지칭되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 하기 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브부류의 것일 수 있다.
본원에서 사용될 때, 항체의 "항원 결합 도메인" 또는 "항원 결합부"라는 용어는 항원(예컨대, CD38)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 또는 단백질의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 상기 항체 실시양태는 또한 2개 이상의 상이한 항원들에 특이적으로 결합하는 이중특이적, 2중 특이적 또는 다중특이적 포맷일 수도 있다. 항체의 "항원 결합부"라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역의 부분 이외에 힌지 영역에서 다이설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 도메인 항체(dAb)(문헌 [Ward et al. 1989 Nature 341 544-6], PCT 공보 WO 90/05144 A1((Winter) 등)(상기 문헌은 본원에서 참조로 포함된다)); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되기는 하지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv: single chain Fv)로서 공지됨; 예컨대, 예컨대, [Bird et al. 1988 Science 242 423-6]; [Huston et al. 1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879-83] 참조)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 이들이 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있다. 상기 단일쇄 항체 또한 항체의 "항원 결합부"라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 단일쇄 항체의 다른 형태, 예컨대, 디아바디 또한 포함한다. 디아바디는 동일한 쇄 상의 VH 및 VL 도메인, 두 도메인 사이에서 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써 상기 도메인이 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하게 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성함으로써 상기 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 상에서 발현되어 있는 2가 이중특이적 항체이다(예컨대, 문헌 [Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]; [Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123]) 참조). 상기 항체 결합부는 당업계에 공지되어 있다(문헌 [Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag. New York. 790 pp., ISBN 3-540-41354-5]). 한 실시양태에서, 항체 결합부는 Fab 단편이다.
본원에 기술된 항체는 인간화 항체일 수 있다. "인간화 항체"라는 용어는 인간 항체의 FR 상으로 이식되어 있거나, 또는 이러한 FR 내로 삽입되어 있는, 비인간 종(예컨대, 마우스, 래트 또는 비인간 영장류)으로부터 유래된 항체의 CDR을 포함하는 인간 유사 가변 영역을 포함하는 단백질을 지칭하는 것으로 이해하여야 한다(상기 유형의 항체는 또한 "CDR-이식된 항체"로도 지칭된다). 인간화 항체는 또한 인간 단백질의 하나 이상의 잔기가 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형되고/거나, 인간 단백질의 하나 이상의 FR 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 대체된 단백질도 포함한다. 인간화 항체는 또한 인간 항체 또는 비인간 항체에서 발견되지 않는 잔기도 포함할 수 있다. 단백질의 임의의 추가 영역(예컨대, Fc 영역)은 일반적으로 인간 영역이다. 인간화는 당업계, 예컨대, US5,225,539, US6,054,297, US7,566,771 또는 US5,585,089에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. "인간화 항체"라는 용어는 또한 예컨대, US7,732,578에 기술된 바와 같이, 초인간화 항체도 포함한다.
본원에 기술된 항체는 인간 항체일 수 있다. 본원에서 사용될 때, "인간 항체"라는 용어는 인간에서, 예컨대, 인간 생식계열 또는 체세포에서 발견된 가변 항체 영역 및 임의적으로 불변 항체 영역, 또는 상기 영역을 사용함으로써 제조된 라이브러리로부터 발견된 가변 항체 영역 및 임의적으로 불변 항체 영역을 갖는 단백질을 지칭한다. "인간" 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기, 예컨대, 시험관내 무작위 또는 부위 지정된 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이(특히, 단백질의 소수 잔기, 예컨대, 단백질의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 잔기에 보존적 치환 또는 돌연변이를 포함하는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 상기 "인간 항체"는 반드시 인간의 면역 반응의 결과로서 발생될 필요는 없고, 오히려 재조합 수단(예컨대, 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝)의 이용, 및/또는 인간 항체 불변 및/또는 가변 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 트랜스제닉 동물(예컨대, 마우스)에 의해, 및/또는 (예컨대, US5,565,332에 기술된 바와 같은) 가이드된 선택을 이용함으로써 통해 생성될 수 있다. 본 용어는 또한 상기 항체의 친화성 성숙된 형태도 포함한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 인간 단백질은 예컨대, US6,300,064 및/또는 US6,248,516에 기술된 바와 같이 인간 항체로부터의 FR, 또는 인간 FR의 컨센서스 서열로부터의 서열을 포함하는 FR을 포함하고, 여기서, CDR 중 하나 이상의 것이 무작위 또는 반무작위 CDR인 단백질도 포함하는 것으로 간주될 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 항체 부분은 임의의 부류, 바람직하게는 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 전장 항체일 수 있다. 상기 항체의 불변 도메인은 바람직하게는 인간 불변 도메인이다. 상기 항체의 가변 도메인은 비인간으로부터 유래될 수 있거나, 바람직하게는 인간으로부터 유래될 수 있거나 인간화 것일 수 있다. 항체 단편 또한 전장 항체 대신에 사용될 수 있다.
"항체"라는 용어는 또한 조작된 항체도 포함한다. 이해하는 바와 같이, 조작된 항체의 변형물 다수(예컨대, 마우스 단일클론, 키메라, 인간화 및 인간 단일클론 항체, 단일쇄 가변 항체 단편(scFv's), 미니바디, 압타머뿐만 아니라, 상기 기술된 바와 같은 이중특이적 항체 및 디아바디)가 존재한다.
단일 가변 영역 도메인(dAb로 지칭)은 예를 들어, 문헌 ([Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546]; [Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448]; [Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339: 285-290])에 개시되어 있다.
미니바디는, 전체 항체의 필수 요소를 단일쇄에서 코딩하는 전체 항체의 작은 버전이다. 적합하게, 미니바디는 예를 들어: 미국 특허 번호 5,837,821에 개시된 바와 같이, 면역글로불린 분자의 힌지 영역 및 CH3 도메인에 융합된 천연 항체의 VH 및 VL 도메인으로 구성된다.
대안적 실시양태에서, 조작된 항체는 비면역글로불린으로부터 유래된 단백질 골격을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합에 대해 선택된, CDR을 생성하도록 무작위화된 2개의 루프를 갖는 4개 나선 다발 단백질 사이토크롬 b562를 개시하는 문헌 [Ku & Schutz, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552-6556]을 참조할 수 있다.
본 발명의 구성체에서 항원 결합 도메인으로서 사용될 수 있는 비항체 인식 단백질 또는 단백질 도메인 스캐폴드가 다수 존재한다. 이는 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA-4: cytotoxic T lymphocyte-associated 항원 4)(에비바디(Evibody); US7,166,697); 인간 트랜스페린(트랜스바디); 단백질 A의 Z 도메인으로부터의 3개 나선 다발(어피바디(Affibody)); 단량체 또는 삼량체 인간 C형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 제10 인간 피브로넥틴 III형 도메인(애드넥틴(AdNectin)); 인간 또는 소 트립신 억제제의 쿠니츠형(Kunitz-type) 도메인; 곤충 데핀신(Defensin) A(IICA29), APPI(쿤티즈(Kuntiz) 도메인); 리포칼린, FABP, 빌린(Bilin) 결합 단백질, 아폴로프로프테인(Apoloproptein) D(안티칼린(Anticalin)); 인간 α-크리스탈린 또는 유비퀴틴 분자(어필린(Affilin)); 트립신 억제제 II(마이크로바디); α2p8 또는 안키린(Ankyrin) 반복부(반복부 모티프 단백질), 카리브도톡신(Charybdotoxin)(전갈 독소), Min-23, 셀룰로스 결합 도메인(노틴(Knottin)); 네오카지노스타틴(Neocarzinostatin), CBM4-2 및 텐다미스타트(Tendamistat)에 기초한 스캐폴드를 포함한다.
추가로, 상기 기술된 바와 같은 항체 유래의 도메인 또는 비항체 폴드에 의해 제공된 스캐폴드 이외에도, 본 발명에서 리간드 결합 도메인으로서 사용될 수 있는 자연적으로 발생된 리간드 결합 단백질 또는 단백질 도메인이 존재한다. 예를 들어, 리간드 결합 특성을 보유하는 단백질 도메인은 수용체, 신호전달 단백질, 예컨대, Ras 결합 단백질 AF6의 PDZ 모듈, 부착 분자 및 효소의 세포외 도메인을 포함한다.
당업계에서 널리 공지된, 예컨대, 친화성 성숙에 의해 결합을 증가시키는 방법, 또는 예측된 MHC 클래스 II 결합 모티프를 제거함으로써 면역원성을 감소시키는 방법을 이용한다. 본원에 기술된 항체의 치료학적 유용성은 항체의 기능적 특징, 예컨대, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 보체 의존적 세포독성(CDC: complement-dependent cytotoxicity), 혈청 반감기, 생체분포 및 Fc 수용체에의 결합, 또는 상기 중 임의의 것의 조합을 조절함으로써 추가로 증진될 수 있다. 상기 조절은 단백질 조작, 당 조작 또는 화학적 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 활성 중 임의의 것을 증가시키거나 또는 감소시키는 것은 필요한 치료학적 적용에 따라 유리할 수 있다.
당 조작의 예는 문헌 [Shinkawa T. et al., 2003 (J Biol Chem 278: 3466-73)]에 기술된 바와 같은 포텔리전트(Potelligent)® 방법을 이용하였다.
다수의 항체 친화성 성숙 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이들 다수는 돌연변이유발 후, 이어서, 개선된 친화성에 대한 선택 및 /또는 스크리닝으로 변이체 단백질의 패널 또는 라이브러리를 생성하는 일반 전략법에 기초한다. 돌연변이유발은 종종 DNA 수준에서 예를 들어, 오류 유발 PCR에 의해(문헌 [Thie, Voedisch et al. 2009, Methods Mol Biol 525: 309-322]), 유전자 셔플링에 의해(문헌 [Kolkman and Stemmer 2001, Nat Biotechnol. May; 19(5):423-8]), 돌연변이유발성 화학물질 또는 방사선조사의 이용에 의해, 오류 유발 복제 기구를 갖는 '돌연변이 유발 유전자' 균주의 이용에 의해 (문헌 [(Greener 1996, In Vitro Mutagenesis Protocols. Humana press, NJ]), 또는 천연 친화성 성숙 기구를 활용하는 체세포 과다돌연변이 접근법(문헌 [Peled, Kuang et al. 2008, Annu Rev Immunol. 26:481-511])에 의해 수행된다. 돌연변이유발은 또한 RNA 수준에서 예를 들어, Qβ 레플리카제의 이용에 의해 수행될 수도 있다 (문헌 [Kopsidas, Roberts et al. 2006, Immunol Lett. 2006 Nov 15; 107(2):163-8]). 개선된 변이체 단백질의 스크리닝을 가능하게 하는 라이브러리 기반 방법은 다양한 디스플레이 기술, 예컨대, 파지, 효모, 리보솜, 박테리아 또는 포유동물 세포에 기초할 수 있고, 당업계에서 널리 공지되어 있다 (문헌 [Benhar 2007, Expert Opin Biol Ther. May; 7(5): 763-79]). 친화성 성숙은 지정성이 더욱 큰/예측 방법, 예를 들어, 부위 지정된 돌연변이유발 또는 3D 단백질 모델링으로부터의 관찰 결과에 의해 가이드된 유전자 합성에 의해 달성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Queen, Schneider et al. 1989, PNAS, 86(24): 10029-33], 미국 특허 6,180,370 또는 미국 특허 5,225,539 참조).
ADCC를 증가시키는 방법은 문헌 [Ferrara, Brunker et al. 2006, Biotechnol Bioeng; 93:851-61]; [Li, Sethuraman et al. 2006, Nat Biotechnol; 24:210-5]; [Stavenhagen, Gorlatov et al. 2007, Cancer Res; 67:8882-90]; [Shields, Namenuk et al. 2001, J Biol Chem; 276:6591-604]; [Shinkawa, Nakamura et al. 2003, J Biol Chem; 278:3466-73]; 및 WO 2008/006554에 기술되어 있다.
CDC를 증가시키는 방법은 문헌 [Idusogie, Wong et al. 2001, J Immunol; 176:346-56]; [Dall'Acqua, Cook et al. 2006, J Biol Chem; 281:23514-24]; [Michaelsen, Aase et al. 1990, Scand J Immunol; 32:517-28]; [Brekke, Bremnes et al. 1993, Mol Immunol; 30:1419-25]; [Tan, Shopes et al. 1990, PNAS; 87:162-6]; 및 [Norderhaug, Brekke et al. 1991, Eur J Immunol; 21:2379-84]에 기술되어 있다.
ADCC 및 CDC를 증가시키는 방법을 기술한 참고 문헌으로는 문헌 [Natsume, In et al. 2008, Cancer Res; 68:3863-72]를 포함한다. 상기 참고 문헌들은 각각 그 개시내용이 본원에서 상호 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드의 항체 성분의 ADCC 및 CDC 활성을 감소시키거나, 또는 제거하는 것이 유리할 수 있으며, 이로써, IFNα2b 활성은 표적 세포 생존을 조절하는 폴리펩티드의 주요 활성이 된다.
항체 혈청 반감기 및 생체분포를 조절하는 다수의 방법은 이화작용으로부터 IgG를 보호하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 수용체인 신생아 Fc 수용체(FcRn)와 항체 사이의 상호작용을 변경하고, 높은 혈청 항체 농도를 유지하는 데 기초한다. (Dall'Acqua) 등은 FcRn에 대한 결합 친화도를 향상시켜 혈청 반감기를 증가시키는 IgG1의 Fc 영역에서의 치환을 기술하였고(문헌 [Dall'Acqua, Woods et al. 2002, J Immunol; 169:5171-80]), M252Y/S254T/T256E(EU 인텍스에 따른 잔기 넘버링) 또는 M265Y/S267T/T269(카바트(Kabat) 넘버링 체계에 따른 잔기 넘버링)의 삼중 치환을 이용한 생체이용률 향상 및 ADCC 활성 조절을 추가로 입증하였다(문헌 [Dall'Acqua, Kiener et al. 2006, J Biol Chem; 279:6213-6]). 미국 특허 번호 6,277,375; 6,821,505; 및 7,083,784 또한 참조할 수 있다. (Hinton) 등은 생체내 반감기를 증가시키는 250번 및 428번 위치에서의 불변 도메인 아미노산 치환을 기술하였다(문헌 [Hinton, Johlfs et al. 2004, J Biol Chem; 279:6213-6]; [Hinton, Xiong et al. 2006, J Immunol; 176:346-56]). 미국 특허 번호 7,217,797 또한 참조할 수 있다. (Petkova) 등은 생체내 반감기를 증가시키는 307번, 380번 및 434번 위치에서의 불변 도메인 아미노산 치환을 기술하였다(문헌 [Petkova, Akilesh et al. 2006, Int Immunol; 18:1759-69]). 문헌 [Shields et al 2001, J Biol Chem; 276:6591-604] 및 WO 2000/42072 또한 참조할 수 있다. Fc 수용체에의 결합, 및 이어서, FcRn 결합 및 혈청 반감기를 비롯한, 상기 수용체에 의해 매개되는 후속 기능을 조절하는 불변 도메인 아미노산 치환의 다른 예는 미국 특허 출원 번호 20090142340; 20090068175 및 20090092599에 기술되어 있다. 카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 넘버링된, 본원에서 "S228P"로 언급되는 치환은 또한 (Kabat) 등 (문헌 [1987 Sequences of proteins of immunological interest. United States Department of Health and Human Services, Washington DC.])에 따라 "S241P"로 언급되었다. 상기 치환은 IgG4 분자의 힌지 영역을 안정화시키며, 상기 힌지 영역의 코어 서열을 IgG1 또는 IgG2 이소타입 항체의 것과 동일하게 만드는 효과를 갖는다. 그 결과, 중쇄의 자발적인 해리 및 재회합은 감소하게 되고, 이는 종종 이종이량체 IgG4 항체가 제조되는 결과를 초래한다.
항체 분자에 연결된 글리칸은 항체와 Fc 수용체 및 글리칸 수용체의 상호작용에 영향을 미침으로써 혈청 반감기를 비롯한 항체 활성에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다(문헌 [Kaneko, Nimmerjahn et al. 2006, Science; 313:670-3]; [Jones, Papac et al. 2007, Glcobiology; 17:529-40]; 및 [Kanda, Yamada et al. 2007, Glycobiology; 17:104-18]). 따라서, 원하는 항체 활성을 조절하는 특정 당형태는 치료학적 이점을 부여할 수 있다. 조작된 당형태를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 미국 특허 번호 US6,602,684; US7,326,681; US7,388,081 및 WO 2008/006554에 기술된 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol)의 추가에 의한 반감기의 연장은 예를 들어, 문헌 [Fishburn 2008, J Pharm Sci; 97:4167-83]에 의해 검토된 바와 같이, 단백질의 혈청 반감기를 연장시키는 데 널리 사용되고 있다.
인식되는 바와 같이, 본 발명의 서열 내에서 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. "보존적 치환"이란, 유사한 성질을 가진 아미노산을 의미한다. 본 명세서에서 사용될 때, 하기 아미노산 군이 보존적 치환으로서 간주되어야 한다: H, R 및 K; D, E, N 및 Q; V, I 및 L; C 및 M; S, T, P, A 및 G; 및 F, Y 및 W. 그러나, 구체적으로 언급된 것 이외의 다른 치환이 약화 및/또는 글리코실화 부위에서 이루어질 수 있다고 의도되는 것은 아니다.
본원에서 사용될 때, "세포 표면에 회합된 항원"이라는 용어는 광범위하게는 제한 없이, 악성 종양 세포 또는 감염성 또는 외래 세포를 비롯한 세포의 표면 상에서 발현되는 임의의 항원을 지칭한다.
본 발명의 특정 측면에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드 구성체 또는 조성물은 암 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 고려되는 암으로는 세포의 분화된 상이한 세포로의 어떤 분화도 없이 비조절형의 세포 성장(예컨대, 종양 형성)을 특징으로 하는 질환 및 장애 군을 포함한다. 상기 질환 및 장애는 ABL1 프로토온코진, AIDS 관련 암, 청각 신경종, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수양 백혈병, 선낭 암종, 부신피질 암, 원인불명 골수양 화생, 탈모증, 포상 연부 육종, 항문암, 혈관육종, 재생 불량성 빈혈, 성상 세포종, 모세 혈관 확장성 운동 실조증, 기저 세포 암종(피부), 방광암, 뼈암, 장암, 뇌간 신경교종, 뇌 및 CNS 종양, 유방암, 카르시노이드 종양, 자궁경부암, 소아 뇌 종양, 소아 암, 소아 백혈병, 소아 연조직 육종, 연골육종, 융모암종, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수양 백혈병, 결장직장암, 피부 T 세포 림프종, 융기성 피부 섬유 육종, 섬유 조직 형성 소원형 세포 종양, 관 암종, 내분비암, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암(esophageal cancer), 유잉 육종, 간외 담관암, 안암, 눈: 흑색종, 망막아종, 난관암, 판코니 빈혈, 섬유육종, 담낭암, 위암, 위장암, 위장 카르시노이드 종양, 비뇨기암, 생식 세포 종양, 임신성 융모성 질환, 신경교종, 부인과 암, 혈액학상의 악성 종양, 모발상 세포 백혈병, 두부경부암, 간세포암, 유전성 유방암, 조직구증, 호지킨병, 인간 유두종 바이러스, 포상기태, 고칼슘혈증, 하인두암, 안구내 흑색종, 섬세포암, 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 평활근육종, 백혈병, 리-프라우메니 증후군, 구순암, 지방육종, 간암, 폐암, 림프부종, 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 남성 유방암, 신장의 악성 간상 종양, 수아세포종, 흑색종, 메르켈 세포, 중피종, 전이성 암, 구강암, 다발성 내분비 종양증, 균상 식육종, 골수 형성 이상 증후군, 다발성 골수종, 골수증식성 장애, 비암, 비인두암, 신아세포종, 신경아세포종, 신경섬유종증, 네이메헌 파손 증후군(nijmegen breakage syndrome), 비흑색종 피부암, 비소세포 폐암(NSCLC: non-small-cell-lung-cancer), 안구암, 식도암(oesophageal cancer), 구강암, 구강인두암, 골육종, 장루 난소암, 췌장암, 부비강암, 부갑상선암, 이하선암, 음경암, 말초 신경외배엽성 종양, 뇌하수체암, 진성 적혈구증가증, 전립선암, 희귀암 및 연관 장애, 신장 세포 암종, 망막아종, 횡문근육종, 로트문드-톰슨 증후군(Rothmund-Thomson syndrome), 침샘암, 육종, 슈반종, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암(SCLC: small cell lung cancer), 소장암, 연조직 육종, 척수 종양, 편평 세포 암종(피부), 위암, 활액막 육종, 고환암, 흉선암, 갑상선암, 이행 세포 암(방광), 이행 세포 암(신우-/-요관), 융모성 암, 요도암, 비뇨기암, 유로플라킨, 자궁 육종, 자궁암, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 및 빌름스 종양을 포함한다. 한 실시양태에서, 종양은 다발성 골수종 또는 비호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
암 치료를 위한 것으로 고려할 때, 본 발명의 융합 구성체의 항체 부분은 종양과 관련된 항원, 즉, 암 세포에 의해 선택적으로 발현되거나, 대부분의 정상 세포와 비교하여 암 세포에서 과발현되는 세포 표면 항원에 결합할 수 있다. 당업계에는 다수의 종양 관련 항원(TAA: tumour-associated antigen)이 공지되어 있다. TAA의 비제한적인 예로는 효소 티로시나제; 흑색종 항원 GM2; 알파태아단백질(AFP: alphafetoprotein); 암배아 항원(CEA: carcinoembryonic antigen); 뮤신 1(MUC1); 인간 표피 성장 인자 수용체(Her2/Neu); 및 T 세포 백혈병/림프종 1(TCL1: T-cell leukemia/lymphoma 1) 발암 단백질을 포함한다. 다수의 상이한 암과 관련된 예시적인 TAA로는 텔로머라제(hTERT); 전립선 특이적 막 항원(PSMA: prostate-specific membrane antigen); 유로키나제 플라스미노겐 활성인자 및 이의 수용체(uPA/uPAR); 혈관 내피 성장 인자 및 이의 수용체(VEGF: vascular endothelial growth factor/VEGFR); 세포외 매트릭스 메탈로프로테이나제 유도인자(EMMPRIN: extracellular matrix metalloproteinase inducer/CD147); 표피 성장 인자(EGFR: 표피 성장 인자); 혈소판 유래 성장 인자 및 이의 수용체(PDGF: platelet-derived growth factor/PDGFR); 및 c-kit(CD117)가 있다.
다른 TAA에 대한 목록은 US 2010/0297076에 제공되어 있으며, 상기 문헌의 개시내용은 본원에서 참조로 포함된다. CD38, CD138, CD79, CS1, 및 HM1.24를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다발성 골수종 백혈병 또는 림프종 세포와 관련된 세포 표면 항원이 특히 관심의 대상이 된다. 한 실시양태에서, 리간드-약화된 IFN 구성체, 예를 들어, 항체-약화된 인터페론 구성체에 대한 항원은 CD38이다.
CD38은 46 kDa II형 막관통 당단백질이다. 이는 20개의 아미노산으로 이루어진 짧은 N 말단 세포질 테일, 단일 막관통 나선 및 256개의 아미노산으로 이루어진 긴 세포외 도메인을 갖는다(문헌 [Bergsagel, P., Blood; 85:436, 1995] 및 [Liu, Q., Structure, 13:1331, 2005]). 이는 CD4 및 CD8 양성 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 혈장 세포를 비롯한 다수의 면역 세포 상에서, 및 상당 비율의 정상 골수 전구체 세포 상에서 발현된다(문헌 [Malavasi, F., Hum. Immunol. 9:9, 1984]). 그러나, 림프구에서의 발현은 세포의 분화 및 활성화 상태에 의존하는 것으로 보인다. 휴지기 T 세포 및 B 세포는 CD38 발현에 대해 음성을 나타내는 반면, 미성숙 림프구 및 활성화된 림프구는 CD38 발현에 대해 대부분 양성을 띤다(문헌 [Funaro, A., J. Immunol. 145:2390, 1990]). 추가 연구는 비조혈 장기, 예컨대, 췌장, 뇌, 비장 및 간에서의 mRNA 발현을 시사한다(문헌 [Koguma, T., Biochim. Biophys. Acta 1223:160, 1994]).
CD38은 막관통 신호전달 및 세포 부착에 관여하는 다기능성 외효소이다. 이는 또한 세포외 pH에 의존하여 NAD+ 및 NADP+를 cADPR, ADPR 및 NAADP로 변환시킬 수 있기 때문에 사이클릭 ADP 리보스 하이드롤라제로도 공지되어 있다. 이들 생성물들은 세포내 Ca2 + 동원을 유도함으로써 세포의 타이로신 인산화 및 활성화를 일으킬 수 있다. CD38은 또한 리간드인 CD31과 상호작용할 수 있는 수용체이기도 하다. CD31을 통한 수용체의 활성화는 Ca2 + 동원, 세포 활성화, 증식, 분화 및 이동을 비롯한 세포내 이벤트를 일으킨다(문헌 [Deaglio, S., Trends in Mol. Med. 14:210, 2008]에서 검토).
CD38은 대개의 경우, T 및 B 계통 급성 림프아구성 백혈병, 일부 급성 골수 세포 백혈병, 여포성 중앙 세포 림프종 및 T 림프아구성 림프종의 다발성 골수종 세포 상에서 높은 수준으로 발현된다(문헌 [Malavasi, F., J. Clin Lab Res. 22:73, 1992]). 더욱 최근에, CD38 발현은 B 계통 만성 림프아구성 백혈병(B-CLL: B-lineage chronic lymphoblastic leukemia)에서의 신뢰할 수 있는 예후 마커가 되었다(문헌 [Ibrahim, S., Blood. 98:181, 2001] 및 [Durig, J., Leuk. Res. 25:927, 2002]). 독립적인 그룹은 CD38+ 클론을 제시하는 B-CLL 환자가 질환의 병기가 더 높은 진행성 병기를 가지고, 화학요법에 대한 반응은 불량하며, 생존 기간은 더 짧은, 바람직하지 못한 임상 과정을 특징으로 한다는 것을 입증하였다(문헌 [Morabito, F., Haematologica. 87:217,2002]). 림프양 종양 상에서의 CD38의 일관되고, 강화된 발현으로 CD38은 치료학적 항체 기술을 위해 관심의 대상이 되는 표적이 된다.
암을 표적화하는 항체-약화된 아글리코실화 IFNα2b 융합 단백질 구성체의 개발을 위해 바람직한 항원은 체내의 대다수의 다른 비형질전환된 세포 상에서보다 암 세포 상에서 선택적인 또는 더욱 큰 발현을 보이는 항원이다. 상기 항원 중 단백질이 아닌 것의 예로는 스핑고지질, 강글리오시드 GD2(문헌 [Saleh et al., 1993, J. Immunol., 151, 3390-3398]), 강글리오시드 GD3(문헌 [Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380]), 강글리오시드 GM2(문헌 [Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12:1036-1044]), 강글리오시드 GM3(문헌 [Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53:5244-5250]) 및 단백질 또는 당지질 상에서 디스플레이될 수 있는 루이스x, 루이스y 및 루이스xy 탄수화물 항원을 포함한다. 단백질 항원의 예로는 HER-2/neu, 인간 유두종 바이러스-E6 또는 -E7, MUC-1; KS 1/4 범-암종 항원(문헌 [Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142:3662-3667]; [Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415]); 난소 암종 항원 CA125(문헌 [Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2):468-475]); 전립선 산성 포스페이트(문헌 [Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928]); 전립선 특이 항원(문헌 [Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910]; [Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230]); 흑색종 관련 항원 p97(문헌 [Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-446]); 흑색종 항원 gp75(문헌 [Vijayasardahl et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380]); 전립선 특이 막 항원; 암배아 항원(CEA)(문헌 [Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294]), MUC16(항체로는 MJ-170, MJ-171, MJ-172 및 MJ-173 [US 7,202,346], 3A5[US 7,723,485] 포함), NMB(US 8,039,593), 악성 인간 림프구 항원-APO-1(문헌 [Bernhard et al., 1989, Science 245:301-304]); 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA: high molecular weight melanoma antigen)(문헌 [Natali et al., 1987, Cancer 59:55-63]; [Mittelman et al., 1990, J. Clin. Invest. 86:2136-2144]); 버킷 림프종 항원-38.13; CD19(문헌 [Ghetie et al., 1994, Blood 83:1329-1336]); 인간 B-림프종 항원-CD20(문헌 [Reff et al., 1994, Blood 83:435-445]); GICA 19-9(문헌 [Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2:135]), CTA-1 및 LEA; CD33(문헌 [Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430]); 종양태아 항원, 예컨대, 간암에 대한 알파 태아단백질 또는 방광 종양 종양태아 항원(문헌 [Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2188]); 분화 항원, 예컨대, 인간 폐암종 항원 L6 또는 L20(문헌 [Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923]); 섬유육종의 항원; 인간 백혈병 T 세포 항원-Gp37(문헌 [Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. Immunol. 141:1398-1403]); 종양 특이 이식형의 세포 표면 항원(TSTA: tumor-specific transplantation type of cell-surface antigen), 예컨대, T 항원을 비롯한 바이러스에 의해 유도된 종양 항원, DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 외피 항원; 네오글리코프로테인, 유방암 항원, 예컨대, EGFR(표피 성장 인자 수용체), 다형성 상피 뮤신(PEM: polymorphic epithelial mucin)(문헌 [Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359]); 다형성 상피 뮤신 항원; 인간 유지방 구형 항원; 결장직장 종양 관련 항원, 예컨대, TAG-72(문헌 [Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52:3402-3408), CO 17-1A(문헌 [Ragnhammar et al., 1993, Int. J. Cancer 53:751-758]); 분화 항원(문헌 [Feizi, 1985, Nature 314:53-57]), 예컨대, 위 선암종에서 발견된 I(Ma), 골수양 세포에서 발견된 SSEA-1, 유방 상피암에서 발견된 VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, M18 및 M39, 결장직장암에서 발견된 D156-22, TRA-1-85(혈액형 H), 결장 선암종에서 발견된 C14, 폐 선암종에서 발견된 F3, 위암에서 발견된 AH6, 배아 암종 세포에서 발견된 Y 합텐, TL5(혈액형 A), 췌장암에서 발견된 E1 시리즈(혈액형 B) 항원, 배아 암종 세포에서 발견된 FC10.2, 위 선암종 항원, 선암종에서 발견된 CO-514(혈액형 Lea), CO-43(혈액형 Leb), A431 세포에서 발견된 G49, 결장암에서 발견된 19.9; 위암 뮤신; 흑색종에서 발견된 R24, 결장 선암종에서 발견된 MH2(혈액형 ALeb/Ley), 배아 암종 세포에서 발견된 4.2, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2 및 M1:22:25:8, 및 SSEA-3 및 SSEA-4가 있다. 흑색종 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸으로도 공지되어 있는 HMW-MAA(서열식별번호: 433)는 수술에 의해 제거된 양성 모반 및 흑색종 병변의 90% 초과에서 과발현되는, 2,322개의 잔기로 이루어진 막 결합 단백질이다(문헌 [Camploi, et. al, Crit Rev Immunol.;24:267,2004]). 따라서, 상기 단백질은 잠재적인 표적 세포 표면에 회합된 항원일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 구성체로 표적화하기 위한 암 항원의 다른 예(괄호 안에는 암의 예가 제시되어 있다)로는 CD5(T 세포 백혈병/림프종), CA15-3(암종), CA19-9(암종), L6(암종), CA 242(결장직장암), 태반 알칼리성 포스파타제(암종), 전립선 산성 포스파타제(전립선암), MAGE-1(암종), MAGE-2(암종), MAGE-3(암종), MAGE-4(암종), 트랜스페린 수용체(암종), p97(흑색종), MUC1(유방암), MART1(흑색종), CD20(비호지킨 림프종), CD52(백혈병), CD33(백혈병), 인간 융모성 고나도트로핀(암종), CD38(다발성 골수종), CD21(B 세포 림프종), CD22(림프종), CD25(B 세포 림프종), CD37(B 세포 림프종), CD45(급성 골수아구성 백혈병), HLA-DR(B 세포 림프종), IL-2 수용체(T 세포 백혈병 및 림프종), CD40(림프종), CD79(B 세포 백혈병 또는 림프종, 호지킨 림프종), 각종 뮤신(암종), P21(암종), MPG(흑색종), Ep-CAM(상피성 종양), 폴레이트 수용체 알파(난소암), A33(결장직장암), G250(신장암), 페리틴(호지킨 림프종), de2-7 EGFR(아교모세포종, 유방암, 및 폐암), 섬유아세포 활성화 단백질(상피성 암) 및 테나신 메탈로프로테이나제(아교모세포종)를 포함한다. 일부 특이적인, 유용한 항체로는 BR64(문헌 [Trail et al., 1997, Cancer Research 57:100 105]), BR96 mAb(문헌 [Trail et al., 1993, Science 261:212-215]), CD40 항원에 대한 mAb, 예컨대, S2C6 mAb(문헌 [Francisco et al., 2000, Cancer Res. 60:3225-3231]) 또는 다른 항CD40 항체, 예컨대, 미국 특허 공개 번호 2003-0211100 및 2002-0142358에 개시된 것; CD30 항원에 대한 mAb, 예컨대, AC10(문헌 [Bowen et al., 1993, J. Immunol. 151:5896-5906]; [Wahl et al., 2002 Cancer Res. 62(13):3736-42]) 또는 MDX-0060(미국 특허 공개 번호 2004-0006215) 및 CD70 항원에 대한 mAb, 예컨대, 1F6 mAb 및 2F2 mAb(예컨대, 미국 특허 공개 번호 2006-0083736 참조) 또는 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7(US 8,124,738)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 항체는 다른 문헌에서도 리뷰되었다(문헌 [Franke et al., 2000, Cancer Biother. Radiopharm. 15:459 76]; [Murray, 2000, Semin. Oncol. 27:64 70]; [Breitling, F., and Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998]).
특정 실시양태에서, 유용한 항체는 표적 세포 상에서 발현된 수용체 또는 수용체 복합체에 결합할 수 있다. 상기 수용체 또는 수용체 복합체는 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리 구성원, 주조직 적합성 단백질, 사이토카인 수용체, TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원, 케모카인 수용체, 인테그린, 렉틴, 보체 조절 단백질, 성장 인자 수용체, 호르몬 수용체 또는 신경전달물질 수용체를 포함할 수 있다. 적절한 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원의 비제한적인 예로는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1, B7-H4, B7-H3, 및 ICOS가 있다. 적합한 TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원의 비제한적인 예로는 TACI, BCMA, CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/0X40, CD137/4-1BB, TNFR1, TNFR2, RANK, 오스테오프로테게린, APO 3, Apo2/TRAIL R1, TRAIL R2, TRAIL R3 및 TRAIL R4가 있다. 적합한 인테그린의 비제한적인 예로는 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 및 CD104가 있다. 적합한 렉틴의 비제한적인 예는 S형, C형, 및 I형 렉틴이 있다. CEA에 대한 항체의 예는 하기 표 1에 제시되어 있다.
Figure pct00001
인간 B 세포 상에서 발현된 CD22 항원에 결합하는 항체로는 예를 들어, HD6, RFB4, UV22-2, To15, 4KB128 및 인간화 항CD22 항체(hLL2)를 포함한다(예컨대, 문헌 [Li et al. (1989) Cell. Immunol. 111: 85-99]; [Mason et al. (1987) Blood 69: 836-40]; [Behr et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 3304s-3314s]; [Bonardi et al. (1993) Cancer Res. 53: 3015-3021] 참조).
CD33에 대한 항체로는 예를 들어, HuM195(예컨대, 문헌 [Kossman et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748-2755; US5693761] 참조) 및 CMA-676(예컨대, 문헌 [Sievers et al., (1999) Blood 93: 3678-3684] 참조)을 포함한다.
예시적인 항MUC-1 항체로는 Mc5(예컨대, 문헌 [Peterson et al. (1997) Cancer Res. 57: 1103-1108]; [Ozzello et al. (1993) Breast Cancer Res. Treat. 25: 265-276] 참조), 및 hCTMO1(예컨대, 문헌 [Van Hof et al. (1996) Cancer Res. 56: 5179-5185] 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 항TAG-72 항체로는 CC49(예컨대, 문헌 [Pavlinkova et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 2613-2619] 참조), B72.3(예컨대, 문헌 [Divgi et al. (1994) Nucl. Med. Biol. 21: 9-15] 참조), 및 미국 특허 번호 5,976,531에 개시된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예시적인 항HM1.24 항체로는 마우스 단일클론 항HM1.24 및 인간화 항HM1.24 IgG1카파 항체(예컨대, 문헌 [Ono et al. (1999) Mol. Immuno. 36: 387-395] 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 표적화 모이어티는 항HER2 항체를 포함한다. 더욱 일반적으로는 (Her-2/neu)로 공지되어 있는, erBB 2 유전자는 막관통 수용체를 코딩하는 온코진이다. Her-2/neu에 대하여 여러 항체가 개발되었으며, 이 중 일부는 임상적으로 사용되고 있다. 이러한 항체로는 트라스투주맙(예컨대, 허셉틴(HERCEPTIN)™; 문헌 [Fornir et al. (1999) Oncology (Huntingt) 13: 647-58]), TAB-250(문헌 [Rosenblum et al. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 865-874]), BACH-250(상기 문헌 동일), TA1(문헌 [Maier et al. (1991) Cancer Res. 51: 5361-5369]), 및 미국 특허 번호 5,772,997; 5,770,195에 기술되어 있는 mAb(mAb 4D5; ATCC CRL 10463); 및 미국 특허 번호 5,677,171에 기술되어 있는 mAb를 포함한다.
다른 완전 인간 항Her2/neu 항체가 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 항체로는 C6 항체, 예컨대, C6.5, DPL5, G98A, C6MH3-B1, B1D2, C6VLB, C6VLD, C6VLE, C6VLF, C6MH3-D7, C6MH3-D6, C6MH3-D5, C6MH3-D3, C6MH3-D2, C6MH3-D1, C6MH3-C4, C6MH3-C3, C6MH3-B9, C6MH3-B5, C6MH3-B48, C6MH3-B47, C6MH3-B46, C6MH3-B43, C6MH3-B41, C6MH3-B39, C6MH3-B34, C6MH3-B33, C6MH3-B31, C6MH3-B27, C6MH3-B25, C6MH3-B21, C6MH3-B20, C6MH3-B2, C6MH3-B16, C6MH3-B15, C6MH3-B11, C6MH3-B1, C6MH3-A3, C6MH3-A2, 및 C6ML3-9를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항HER2/neu 항체 및 다른 항체는 미국 특허 번호 6,512,097 및 5,977,322에, PCT 공보 WO 97/00271에, 문헌 [Schier et al. (1996) J Mol Biol 255: 28-43], [Schier et al. (1996) J Mol Biol 263: 551-567] 등에 기술되어 있다.
더 일반적으로, 표피 성장 인자 수용체 패밀리의 다양한 구성원에 대한 항체가 본 발명의 구성체에서 표적화 항체 또는 이의 항원 결합부로서 사용하는 데 매우 적합하다. 상기 항체로는 미국 특허 번호 5,844,093 및 5,558,864에, 및 유럽 특허 번호 706,799A에 기술되어 있는 것과 같은 항EGFR 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 예시적인 항EGFR 패밀리 항체로는 항체, 예컨대, C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 및 HER4.C7 등를 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예컨대, 미국 특허 공개 US 2006/0099205 A1 및 US 2004/0071696 A1(상기 특허는 본원에서 참조로 포함된다)).
CD38은 본 발명의 융합 단백질 구성체에 대한 항체 표적으로서 특히 관심의 대상이 된다. CD38에 대한 항체로는 예를 들어, AT13/5(예컨대, 문헌 [Ellis et al. (1995) J. Immunol. 155: 925-937] 참조), HB7 등을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 임의의 적합한 보조제, 예컨대, 제한 없이, 희석제, 결합제, 안정제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 애주번트 등 중 적어도 1종을 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 보조제가 바람직하다. 상기 멸균 용액, 및 이의 제조 방법에 관한 비제한적인 예는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 문헌 [Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990]과 같이, 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업계에서 널리 공지되어 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같이 항체 조성물의 투여 모드, 가용성 및/또는 안정성에 적합한 약학적으로 허용되는 담체가 통상적으로 선택될 수 있다.
본 조성물에서 유용한 약학적 부형제 및 첨가제로는 단독으로 또는 조합으로 1-99.99 중량% 또는 1-99.99 부피%를 차지하는, 단독으로 또는 조합으로 존재할 수 있는 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질 및 탄수화물(예컨대, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류 및 올리고당을 포함하는 당; 유도체화된 당, 예컨대, 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등; 및 다당류 또는 당 중합체)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 단백질 부형제로는 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA: human serum albumin), 재조합 인간 알부민(rHA: recombinant human albumin), 젤라틴, 카세인 등을 포함한다. 완충능으로도 작용할 수 있는 대표 아미노산으로는 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 루신, 이소루신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등을 포함한다. 한 바람직한 아미노산은 히스티딘이다. 제2 바람직한 아미노산은 아르기닌이다.
본 발명에서 사용되기에 적합한 탄수화물 부형제로는 예를 들어, 단당류, 예컨대, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예컨대, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예컨대, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대, 만닛톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨 소르비톨(글루시톨), 미요이노시톨 등을 포함한다. 본 발명에서 사용되기에 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스 및 라피노스이다.
항체 조성물은 완충제 또는 pH 조정제 또한 포함할 수 있고; 전형적으로, 완충제는 유기산 또는 유기 염기로부터 제조되는 염이다. 대표적인 완충제로는 유기산 염, 예컨대, 시트르산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; 트리스; 트로메타민 하이드로클로라이드; 또는 포스페이트 완충제 또는 아미노산 완충제를 포함한다. 본 조성물에서 사용되기에 바람직한 완충제는 유기산 염, 예컨대, 시트레이트 또는 아미노산이다.
추가로, 본 발명의 조성물은 중합체 부형제/첨가제, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(중합체 당), 덱스트레이트(예컨대, 사이클로덱스트린, 예컨대, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 향미제, 항미생물제, 감미제, 항산화제, 정전기 방지제, 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트, 예컨대, "트윈(TWEEN)® 20" 및 "트윈® 80"), 지질(예컨대, 인지질, 지방산), 스테로이드(예컨대, 콜레스테롤) 및 킬레이트제(예컨대, EDTA)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 조성물에서 사용되기에 적합한 상기 및 추가의 공지된 약학적 부형제 및/또는 첨가제는 예컨대, 그의 개시내용이 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 문헌 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19 th ed., Williams & Williams, (1995)]에, 및 문헌 ["Physician's Desk Reference", 52 nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)]에(상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 열거되어 있는 바와 같이, 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물(예컨대, 당류 및 알디톨) 및 완충제(예컨대, 시트레이트) 또는 중합체 물질이다.
본원에 기술된 본 발명은 구체적으로 기술된 이외의 것으로 쉽게 변형 및 수정될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 본 발명은 본 정신 및 범주에 포함되는 상기의 모든 변형 및 수정을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 총칭하여 언급 또는 명시된 단계, 특징, 조성물 및 화합물 모두, 및 상기 단계 또는 특징들 중 임의의 2개 이상의 것의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명의 속하는 당업계의 숙련가가 통상 이해하는 것과 같은 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 그와 등가인 임의의 물질 및 방법이 본 발명의 실시 또는 테스트하는 데 사용될 수는 있지만, 바람직한 물질 및 방법은 이제 기술한다.
실시예
일반적 방법
HEK -293E 세포에서의 항체-융합 구성체 제조.
본 발명의 융합 폴리펩티드 중의 다수의 도메인의 DNA 서열은 본원에 포함된, 첨부된 서열 목록에 제공되어 있다. 하이스피드 플라스미드 맥시 키트(HiSpeed Plasmid Maxi Kit)(퀴아젠(Qiagen: 미국 캘리포니아주 발렌시아))를 사용하여 단백질 구성체(항체-약화된 IFNα2b 융합 구성체)를 코딩하는 DNA 플라스미드를 제조한 후, 상업적으로 이용 가능한 형질감염 시약 및 OptiMEM 배지(인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여, 0.45% (w/v) D-(+)-글루코스(시그마(Sigma: 호주 NSW주 캐슬 힐)), 25 ㎍/mL 게네티신(인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)), 및 1 x 글루타맥스(GlutaMAX)(인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)로 보충된 F17 합성 배지에서 성장시킨 HEK293E 세포(CNRC, 캐나다 몬트리올)로 형질감염시켰다. 5% CO2가 공급되고, 120 rpm으로 진탕되는 인큐베이터에서 6일 동안 발현시킨 후, 배양 배지를 단리하고, 프로테인 A Mab 셀렉트 슈어(Protein A Mab Select SuRe)™ 아가로스 비드(GE 헬쓰케어(GE Healthcare: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이))를 사용하여 그에 대해 친화성 정제를 수행하였다. 정제된 단백질 구성체에 대해 PD 미디-트랩(Midi-Trap) G-25 칼럼(GE 헬쓰케어: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이) 또는 하이프렙 26/10 디솔팅(HiPrep 26/10 Desalting) 칼럼(하이프렙 디솔팅 하이프렙 26/10 디솔팅(HiTrap Desalting HiPrep 26/10 Desalting))을 사용하여 0.2 M 아르기닌 HCl, 25 mM 시트르산, 71.5 mM 수산화나트륨(pH 6.0)으로 완충제를 교환하였다. 이어서, 50 kDa 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터 장치(밀리포어(Millipore: 미국 매사추세츠주 빌레리카))를 사용하여 정제된 단백질 구성체를 농축시킨 후, 280 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 단백질 농도를 측정하였다.
EXPI293 세포에서의 항체-융합 구성체의 제조.
하이스피드 플라스미드 맥시 키트(퀴아젠: 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 단백질 구성체(항체-IFNα2b 관련 구성체)를 코딩하는 DNA 플라스미드를 제조한 후, EXPI293 형질감염 키트에 제공된 형질감염 시약 및 OptiMEM 배지(인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여, EXPI 발현 배지(라이프 테크놀러지즈(Life Technologies: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))에서 성장시킨 EXPI293 세포(라이프 테크놀러지즈: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)로 형질감염시켰다. 5% CO2가 공급되고, 120 rpm으로 진탕되는 인큐베이터에서 3일 동안 발현시킨 후, 배양 배지를 단리하고, 프로테인 A Mab 셀렉트 슈어™ 아가로스 비드(GE 헬쓰케어: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이)를 사용하여 그에 대해 친화성 정제를 수행하였다. 정제된 단백질 구성체에 대해 PD 미디-트랩 G-25 칼럼(GE 헬쓰케어: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이) 또는 하이프렙 26/10 디솔팅 칼럼(하이프렙 디솔팅 하이프렙 26/10 디솔팅)을 사용하여 0.2 M 아르기닌 HCl(pH 6.0)로 완충제를 교환하였다. 이어서, 50 kDa 아미콘 울트라 원심분리 필터 장치(밀리포어: 미국 매사추세츠주 빌레리카)를 사용하여 정제된 단백질 구성체를 농축시킨 후, 280 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 단백질 농도를 측정하였다.
CHO 세포에서의 항체-융합 구성체의 제조.
하이스피드 플라스미드 맥시 키트(퀴아젠: 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 단백질 구성체(항체-IFNα2b 관련 구성체)를 코딩하는 DNA 플라스미드를 제조한 후, 상업적으로 이용 가능한 형질감염 시약 및 OptiPro SFM™ 배지(인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 사용하여, 프리스타일(Freestyle)™ CHO 발현 배지(인비트로겐: 미국 캘리포니아주 칼즈배드)에서 성장시킨 CHO 세포(론자(Lonza))로 형질감염시켰다. 10% CO2가 공급되고, 120 rpm으로 진탕되는 인큐베이터에서 6일 동안 발현시킨 후, 배양 배지를 단리하고, 프로테인 A Mab 셀렉트 슈어™ 아가로스 비드(GE 헬쓰케어: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이)를 사용하여 그에 대해 친화성 정제를 수행하였다. 정제된 단백질 구성체에 대해 PD 미디-트랩 G-25 칼럼(GE 헬쓰케어: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이) 또는 하이프렙 26/10 디솔팅 칼럼(하이프렙 디솔팅 하이프렙 26/10 디솔팅)을 사용하여 0.2 M 아르기닌.HCl, 25 mM 시트르산, 71.5 mM 수산화나트륨(pH 6.0)로 완충제를 교환하였다. 이어서, 50 kDa 아미콘 울트라 원심분리 필터 장치(밀리포어: 미국 매사추세츠주 빌레리카)를 사용하여 정제된 단백질 구성체를 농축시킨 후, 280 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 단백질 농도를 측정하였다.
항체- IFNα2b 융합 단백질 구성체의 항원 표적화 활성을 측정하는 방법
"온 타겟(다우디(Daudi)) 어세이(assay)": 본 어세이는 IFN 수용체, 및 IFNα2b가 융합된 항체에 의해 표적화되는 항원, 둘 모두를 보이는 세포에 대한 IFNα2b 및 항체-IFNα2b 융합 단백질 구성체의 항증식 활성을 정량화기 위해 사용되었다. 다우디 세포는 세포 표면에 회합된 항원으로서 CD20 및 CD38 뿐만 아니라, 세포 표면 IFN 수용체, 둘 모두를 발현한다. 프로메가(Promega: 미국 위스콘신주 매디슨)로부터의 시약 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)®(카탈로그 번호 G7570)를 사용하여 다우디 세포의 생존력을 측정하였다. 이는 ATP 정량화에 기초하여 배양물 중의 세포의 생존력을 측정하는 발광 기반 어세이이다. 신호 강도는 마이크로타이터 플레이트 웰 중의 생존가능한 세포 개수에 비례한다. 본 어세이의 세부 사항은 하기와 같다:
다우디 세포(ATCC(미국 버지니아주 마나사스)로부터 입수)를 T75 플라스크(TPP: 스위스 트라사딘겐), 카탈로그 번호 90076)에서 10% 우태아 혈청(FBS: Fetal Bovine Serum; 하이클론(Hyclone: 미국 유타주 로간), 카탈로그 번호 SH30070.03)을 함유하는 RPMI 1640(메디아테크 인크.(Mediatech, Inc.: 미국 버지니아주 마나사스), 카탈로그 번호 10-040-CV) 중에서 0.5 x 105 내지 0.8 x 105개의 생존가능한 세포/ml인 바람직한 밀도까지 배양하였다. 400 g로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 경사분리하고, 세포 펠릿을 RPMI 1640 + 10% FBS에 재현탁시킴으로써 세포를 회수하였다. 이어서, 세포를 계수하고, RPMI 1640 + 10% FBS 중 밀도를 3.0 x 105개의 세포/ml로 조정하였다. 이어서, 50 ㎕의 세포 현탁액을 96웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트(이하, "실험 플레이트")(TPP, 카탈로그 번호 92067)의 각 웰 내로 분취하였다. 별도의 멸균 96웰 플레이트(이하, "희석 플레이트"; 코스타(Costar: 미국 뉴욕주 코닝), 카탈로그 번호 3879) 상에서 테스트 물질을 RPMI 1640 + 10% FBS 중에서 이중으로 연속적으로 희석하였다. 이어서, 50 ㎕/웰을 희석 플레이트에서 실험 플레이트로 옮겼다. 이어서, 실험 플레이트를 5% CO2 존재하에 37℃에서 4일 동안 인큐베이션하였다.
제조자에 의해 공급된 어세이 완충제 및 어세이 기질의 혼합물(이하, "셀타이터글로 시약," 제조자의 설명서에 따라 혼합됨)을 100 ㎕/웰로 실험 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 2분 동안 진탕시켰다. 이어서, 100 ㎕/웰을 실험 플레이트로부터 96웰 평평 바닥 백색 불투명 플레이트(이하, "어세이 플레이트"; BD 바이오사이언시스(BD Biosciences: 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스), NJ 카탈로그 번호 35 3296)로 옮겼다. 어세이 플레이트의 내용물을 실온의 암실에서 15분 동안 안정화시켰다. 상기 플레이트를 발광측정 채널 상의 빅토르 3V 멀티라벨 카운터(Victor 3V Multilabel Counter)(퍼킨 엘머(Perkin Elmer: 미국 매사추세츠주 월섬, 모델# 1420-041) 상에서 판독하고, 발광을 측정하였다. 결과는 "상대적 발광 단위(RLU: relative luminescence units)"로서 제시한다.
곡선의 중간점(EC50)을 측정하기 위해 비선형 회귀 및 3 파라미터 곡선 피트를 이용하는 프리즘 5(Prism 5)(그래프패드(Graphpad: 미국 캘리포니아주 샌디에고))를 이용하여 데이터를 분석하였다. 각 테스트 물질에 대해, 유리 IFNα2b(또는 유리 IFNα2b 대비의 상대적인 공지된 효능을 갖는 다른 형태의 IFN) 대비의 상대적인 효능을 EC50의 비로서 계산하였다.
당업계의 숙련가는 이 또한 사용될 수 있는 세포 생존력을 측정하는 방법으로서 보편적으로 사용되는 다른 어세이들도 다수 존재한다는 것을 이해할 것이다.
"온 타겟(ARP) 어세이"(이는 또한 본원에서 종종 "표적화된 어세이"로 지칭된다): 다발성 골수종 세포주 ARP-1은 아칸사스 대학 의료 센터(University of Arkansas Medical Center: 미국 아칸사스주 리틀 록)의 골수종 연구소(Myeloma Institute)의 책임자인 (Bart Barlogie MD, PhD)로부터 기증받았다. 상기 세포주는 문헌 [Hardin J. et al.　(Interleukin-6 prevents dexamethasone-induced myeloma cell death. Blood; 84:3063, 1994)]에 기술되어 있다. ARP-1 세포(CD38+)를 사용하여 CD38 표적화 항체-IFN 융합 단백질 구성체를 테스트하였다. 하기 사항: ARP-1을 4.0 x 105 내지 6.0 x 105개의 세포/ml인 밀도로 배양하였다는 것만을 예외로 하고, 배양 및 어세이 조건은 상기 개략적으로 설명된 다우디 기반 어세이에 대한 것과 동일하였다. 어세이 이전의 ARP-1 농도를 1.0 x 104개의 세포/ml로 조정하였다.
실시예 1
항CD38 항체- 약화된 IFNα2b 융합 단백질의 등전점
항CD38 항체-약화된 IFNα2b 융합 구성체(하기 표 2)를 발현하는, 각종의 일시적으로 형질감염된 세포를 회수하고, Mab 셀렉트 슈어 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제하였다. 샘플을 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 칼럼을 사용하여 200 mM 아르기닌, 25 mM 히스티딘(pH 6.5)으로 탈염시켰다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
등전 포커싱 겔을 사용하여 융합 폴리펩티드의 등전점(pI)을 측정하고, 번역 후 변형, 예컨대, 인산화 및 글리코실화에 기인한 단백질의 작은 변화를 검출하였다.
겔과 완충제 사이의 밀봉 차단을 보장하기 위해 겔 탱크에 사전 주조된 IEF 겔을 셋업하였다. 이어서, 완충제가 확실히 외부 챔버 안에는 들어가지 못하게 하면서, 200 mL의 1x 캐소드 완충제를 내부 챔버 안에 부었다. 이어서, 500 mL의 1x 애노드 완충제는 외부 챔버 안에 붓고, 탱크의 ¾을 충전시켰다. 샘플 및 래더를 겔 상에 로딩한 후, 이어서, 100 볼트에서 1시간 동안, 200 볼트에서 1시간 동안 및 500 볼트에서 ½시간 동안 전개시켰다. 겔 전개가 끝나자마자, 겔을 꺼내어 30 min 동안 유리 용기 중 TCA 용액 중에서 고정시켰다. 이어서, 겔을 바로 탈이온수로 3회에 걸쳐 세척하였다. 겔을 심플리블루 세이프스테인(SimplyBlue SafeStain)(인비트로겐 라이프 테크놀러지즈) 중에서 1시간 내내 염색시키고, 물 중에서 밤새도록 방치하여 탈색시켰다. 스캐너를 이용하여 최종 영상을 스캐닝하였다.
인터페론의 트레오닌 106(T106)을 알라닌으로(T106A로 제시), 세린으로(T106S), 발린으로(T106V), 글리신으로(T106G) 또는 글루탐산으로(T106E) 치환시킴으로써, 또는 T106을 결실시킴으로써(ΔT106으로 제시) 항체-약화된 인터페론 융합 구성체의 IFNα2b의 O-결합 글리코실화 부위를 제거하였다. IEF 겔 상에서의 분리에 의하여 O-결합 글리코실화가 존재하는 구성체 및 O-결합 글리코실화가 부재하는 구성체를 비교함으로써 상기와 같은 변이가 융합 구성체의 pI 및 불균질성에 미치는 영향을 조사하였다.
각 경우에서, 변형되지 않은 T106과 직접 비교하였을 때, 밴드 개수의 감소로 입증되는 바와 같이, T106 결실, 또는 T106의 알라닌, 세린, 발린, 글리신 또는 글루탐산으로의 치환이 IEF 겔 상에서 관찰되는 하전된 종의 개수를 감소시켰으며, 이로써, 융합 구성체의 불균질성도 감소시켰다(도 9). IEF 겔 상의 하전된 종의 개수 감소 및 따라서, T106S를 도입한 분자의 불균질성 감소는 IFNα2b의 106번 위치에서의 O-결합 글리코실화의 제거와 일치한다.
항체 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위의 제거는 O-유사 글리코실화된 단백질과 비교하였을 때, pI를 증가시켰다. A10.21의 같은 항체 프론트 엔드를 사용하였을 때, 구성체에서는 항체의 이소타입이 IgG4, IgG1, IgG1 AA(IgG1 L235A, G237A, IgG1의 이펙터 기능이 감소된 형태인 것), IgG2 또는 IgG2 SS(IgG2 (A330S, P331S))인지 여부와 상관없이 상기 경향이 일관되게 나타났다.
YTE 치환(M252Y, S254T, T256E)은 가정컨대, 항체의 반감기를 증가시키면서, FcRn에 대한 친화성은 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 추가 실험에서는 항체 IFN 융합된 구성체의 다른 부분에서의 치환이 T106 결실 또는 치환으로부터 초래되는 불균질성 감소에 영향을 주는지 여부를 조사하였다. IEF 겔 상에서 글리코실화된 A10.21 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 구성체(YTE, T106T) 및 YTE 치환을 포함하는 비글리코실화 IFN 융합 구성체(YTE, T106A)의 불균질성을 사정하였다. YTE 돌연변이를 보유하는 융합 구성체의 IFNα2b 성분의 글리코실화 제거가 불균질성을 감소시켰다(도 11).
IFNα2b의 약화는 IFN 수용체에의 결합을 담당하는 중요한 아미노산 잔기의 치환에 의해 달성된다. IFNα2b 성분의 O-결합 글리코실화의 존재(T106T) 또는 그의 부재(T106A)하의, IFNα2b에서의 다양한 약화 아미노산 치환을 포함하는 A10.21 IgG4(S228P) IFN 구성체의 하전된 종의 개수를 평가하였다. IFNα2b의 개별 아미노산 잔기 아르기닌-33, 아르기닌-144 및 알라닌-145를 잔기 33의 경우, 알라닌으로(R33A), 잔기 144의 경우, 이소루신으로(R144I), 또는 잔기 145의 경우, 리신, 글리신, 또는 글루타민으로(A145K, A145G, A145Q) 한번에 하나씩 치환시켰다. 직접 비교하였을 때, 아글리코실화된 IFN 융합 구성체는 그의 글리코실화된 상대물보다 일관되게 더 적은 불균질성을 보였다(도 12).
관찰된 불균질성 감소는 구성체의 항체 부분과는 관계가 없었다. HLA, CD138 및 CD38(항체 A10.21 - 항체 A02.12에 대한 CD38 상의 상이한 에피토프)에 대하여 특이성을 가진 항체(IgG4 (S228P))-약화된 IFN 융합 구성체의 약화된 IFNα2b 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위의 제거 또한 IEF에 의해 검출된 바, 불균질성을 감소시켰다(도 13).
실시예 2
항체- 약화된 인터페론α2b 융합 단백질의 항증식 활성
IFNα2b의 항증식 효과는 직접 및 간접 활성으로 이루어진다. 직접 활성은 세포 주기 정지(문헌 [Matsui et al. 2003]), 사멸 수용체 의존적(문헌 [Crowder et al. 2005]) 및 비의존적(문헌 [Otsuki et al. 1998]) 경로에 의한 아폽토시스, 또는 분화(문헌 [Matsui et al. 2003])에 의해 암 세포 성장을 억제시킴으로써 이루어진다. 발광성 세포 생존력 어세이를 이용하여 표적 양성 세포주에 대한 항체-약화된 인터페론 융합 단백질의 표적 특이의 직접적인 세포독성을 측정하였다.
항 CD38- IFN 리드 서열 샘플
구성체(하기 표 3)를 안정하게 클로닝하거나, 또는 일시적으로 형질감염시키고, 회수하고, Mab 셀렉트 슈어 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제하였다. 샘플을 하이로드 슈퍼덱스 200 칼럼을 사용하여 200 mM 아르기닌, 25 mM 히스티딘(pH 6.5)으로 탈염시켰다.
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시판용 IFNα2b
셰링-플라우(Schering-Plough)로부터 박테리아에 의해 생산된 시판용 IFNα2b인 인트론(INTRON)® A를 양성 대조군으로서 사용하였다.
항증식 활성 측정
상기 "다우디 세포 증식 어세이" 및 "ARP-1 세포 증식 어세이"에 기술된 방법을 사용하여 항증식 활성을 측정하였다. 항체-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 항증식 활성 측정을 위해 추가의 세포주 NCI-H929와 함께 ARP-1 세포 증식 어세이 방법을 사용하였다. 일부 일부에서는, 플레이트를 전용 글로맥스® 96 마이크로플레이트 루미노미터(GloMax® 96 Microplate Luminometer) 상에서 판독하였고, 원래의 셀타이터-글로 대신 셀타이터-글로® 2.0 시약을 사용하였으며, 상기 중 어느 것도 결과에 영향을 주지는 않았다. ARP-1/NCI-H929 또는 다우디 세포 증식 어세이를 이용하여 CD38을 제시하는 세포에 대한 IFN 및 항체-약화된 IFNα2b 융합 단백질 구성체의 항증식 활성을 정량화하였다. 다우디, ARP1 및 NCI-H929 세포는 세포 표면에 회합된 항원으로서 CD38을 발현한다. 본 어세이의 세부 사항은 하기와 같다.
ARP-1/NCI-H929 세포 증식 어세이에서, 프로메가(미국 위스콘신주 매디슨)로부터의 시약 셀타이터-글로® 2.0(카탈로그 번호 G9242)를 사용하여 세포의 생존력을 측정하였다. 이는 ATP 정량화에 기초하여 배양물 중의 세포의 생존력을 측정하는 발광 기반 어세이이다. 신호 강도는 마이크로타이터 플레이트 웰 중의 생존가능한 세포 개수에 비례한다. 세포(ATCC(미국 버지니아주 마나사스)로부터의 NCI-H929, 및 아칸사스 대학 의료 센터(미국 아칸사스주 리틀 록)의 골수종 연구소의 책임자인 (Bart Barlogie MD, PhD)로부터의 기증물인 ARP-1)를 T75 플라스크(TPP: 스위스 트라사딘겐), 카탈로그 번호 90076)에서 10% 우태아 혈청(FBS; 하이클론: 미국 유타주 로간, 카탈로그 번호 SH30070.03)을 함유하는 RPMI 1640(메디아테크 인크.: 미국 버지니아주 마나사스, 카탈로그 번호 10-040-CV) 중에서 0.5 x 105 내지 0.8 x 105개의 생존가능한 세포/ml인 바람직한 밀도까지 배양하였다. 400 x g로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 경사분리하고, 세포 펠릿을 RPMI 1640 + 10% FBS에 재현탁시킴으로써 세포를 회수하였다. 이어서, 세포를 계수하고, RPMI 1640 + 10% FBS 중 밀도를 3.0 x 105개의 세포/ml로 조정하였다. 50 ㎕의 세포 현탁액을 96웰 둥근 바닥 조직 배양 플레이트(이하, "실험 플레이트")(TPP, 카탈로그 번호 92067)의 각 웰 내로 시딩하였다. 세포를, 테스트 화합물을 첨가하기 전에 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 별도의 멸균 96웰 플레이트(이하, "희석 플레이트"; 코스타: 미국 뉴욕주 코닝, 카탈로그 번호 3879) 상에서 테스트 물질을 RPMI 1640 + 10% FBS 중에서 이중으로 연속적으로 희석하였다. 50 ㎕/웰을 희석 플레이트에서 실험 플레이트로 옮겼다. 이어서, 실험 플레이트를 5% CO2 존재하에 37℃에서 4일 동안 인큐베이션시켰다. "셀타이터-글로® 시약 2.0"을 100 ㎕/웰로 실험 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 2분 동안 진탕시켰다. 100 ㎕/웰을 실험 플레이트로부터 96웰 평평 바닥 백색 불투명 플레이트(이하, "어세이 플레이트"; BD 바이오사이언시스: 미국 뉴저지주 프랭클린 5 레이크스, NJ 카탈로그 번호 35 3296)로 옮겼다. 이어서, 어세이 플레이트의 내용물을 실온의 암실에서 15분 동안 안정화시켰다. 상기 플레이트를 글로맥스® 96 마이크로플레이트 루미노미터 상에서 판독하였다. 결과는 "상대적 발광 단위"(RLU)"로서 제시한다.
IC50을 측정하기 위해 비선형 회귀 및 4 파라미터 곡선 피트를 이용하는 프리즘 5(그래프패드: 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
트레오닌 106(T106)을 알라닌으로(T106A로 제시), 세린으로(T106S), 발린으로(T106V), 글리신으로(T106G) 또는 글루탐산으로(T106E) 치환시킴으로써, 또는 T106을 결실시킴으로써(ΔT106으로 제시) 항CD38 항체-약화된 인터페론 융합 구성체의 O-결합 글리코실화 부위를 제거하였다. O-결합 글리코실화의 존재 및 부재의 약화된 IFNα2b에 융합된 A10.21 항CD38 항체를 비교함으로써 세포 증식에 미치는 영향을 조사하였다. ARP1(도 1a) 및 NCI-H929 세포(도 1b), 둘 모두에서 상응하는 O-결합 글리코실화된 융합 단백질, 즉 A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106T) 및 A10.21 IgG1 IFN (A145D, T106T)와 비교하였을 때, 더 낮은 IC50(nM)으로 나타난 바와 같이, 항체 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위의 제거가 항증식 활성을 증가시켰다. 항체의 이소타입이 IgG4 및 IgG1인지 여부와 상관없이 상기 경향이 일관되게 나타났다.
O-결합 글리코실화된 융합 단백질과 비교하였을 때, 더 낮은 IC50(nM)으로 나타난 바와 같이, 트레오닌 106(T106)의 알라닌(T106A), 세린(T106S), 발린(T106V), 글리신(T106G) 또는 글루탐산(T106E)으로의 치환이 항증식 활성을 증가시켰다. NCI-H929 세포에서 모든 비글리코실화 구성체는 그의 글리코실화된 상대물과 비교하였을 때, 더 높은 "온 타겟" 효능을 보였다(도 14).
약화된 IFNα2b 성분으로부터의 O-결합 글리코실화 부위 제거가 항증식 활성에 미치는 영향을 다양한 항CD38 항체-약화된 IFNα2b 융합 단백질에서 조사하였다. IFN 성분 상의 O-결합 글리코실화 부위를 제거하는 T106에서의 상이한 아미노산 치환(T106A, T106G, T106N, T106F, T106R, T106D, T106E, T106Q, T106H, T106I, T106L, T106K, T106M, T106F, T106P, T106S, T106V, T106Y 및 T106W(하기 표 4))을 갖는 항CD38 항체-약화된 IFNα2b 융합 단백질 R10A2 IgG4 (S228P) IFN (A145D)의 변이체를 조사하였고, 그 결과는 도 2에 제시되어 있다.
T106 부위에서의 상이한 치환 사이에 효능 수준은 달랐지만, O-결합 글리코실화를 제거하는 것으로 예측되는 모든 치환은 상응하는 O-결합 글리코실화된 단백질과 비교하였을 때, 효능을 증가시켰다(도 2).
Figure pct00011
CD38 상의 상이한 에피토프에 결합하는, O-결합 글리코실화의 존재 또는 부재의 상이한 두 항CD38 항체 인터페론 융합 단백질(A02.12 및 A10.21)(A02.12 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106T), A02.12 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106A), A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106T) 및 A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106A)) 사이의 효능상의 상대적인 변화를 유사한 방식으로 사정하였다. CD38에 대하여 상이한 특이성을 갖는, 항체(IgG4 (S228P)) 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위 제거가 구성체의 항체 부분의 표적과 상관없이 항증식 활성을 증가시켰다(도 15).
IFNα2b의 약화는 다양한 약화 치환에 의해 달성된다. O-결합 글리코실화 존재(T106T) 및 그의 부재(T106A)의, IFNα2b 중 다양한 약화 치환을 갖는 A10.21 IgG4 (S228P) IFN 구성체(하기 표 5)의 항증식 활성 또한 평가하였다. 다양한 약화 치환을 갖는 구성체의 IFNα2b 성분 중의 O-결합 글리코실화 부위 제거 모두 그의 글리코실화된 상대물보다 더 높은 효능을 보였다(도 16).
Figure pct00012
Figure pct00013
상이한 결합 표적을 갖는 다른 약화된 IFNα2b 융합된 항체/단백질이 O-결합 글리코실화 제거의 결과로서 조절된 항증식 활성을 갖는지 여부를 조사하기 위해, 2개의 구성체(O-결합 글리코실화의 존재 또는 부재의, IFN (A145D)에 융합된 항CD138 항체 및 항HLA 항체)(하기 표 6)를 생성하고, 항증식 활성에 대하여 테스트하였다.
HLA 및 CD138에 대하여 특이성을 갖는 항체(IgG4 (S228P)) 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위 제거가 구성체의 항체 부분의 표적과 상관없이 항증식 활성을 증가시켰다. 이는 HLA 및 CD138에 대한 항체 융합 구성체에서 입증되었다(도 17).
Figure pct00014
반감기 연장 또는 이펙터 기능 감소를 위해 Fc 영역에 치환을 포함하는 융합 단백질로부터의 O-결합 글리코실화 제거가 항증식 활성에 미치는 효과
YTE 치환은 가정컨대, 항체의 반감기를 증가시키면서, FcRn에 대한 친화성은 증가시키는 것으로 밝혀졌다. O-결합 글리코실화의 존재 및 부재하에서 YTE 치환을 함유하는 IFN 융합된 항체를 항증식 활성에 대하여 테스트하였다. A10.21 항CD38 항체-약화된 IFN 융합 단백질에 대한 하기의 변이체를 제조하였다(하기 표 7).
A10.21 IgG4 (S228P)(A145D, T106A)에의 YTE 치환 도입이 약화된 IFN으로부터의 O-결합 글리코실화 제거에 의해 유발되는 효능 증가에는 영향을 주지 않았다(도 18).
IgG1 변이체의 Fc 부분에서의 L235A 및 G237A 치환, 및 IgG2 변이체의 Fc 부분에서의 A330S 및 P331S 치환이 이펙터 기능을 감소시킨다. L235A 및 G237A 치환을 함유하는 약화된 IFN 융합된 IgG1 항체 및 A330S 및 P331S 치환을 함유하는 약화된 IFN 융합된 IgG2 항체를 O-결합 글리코실화의 존재 및 부재하에서 항증식 활성에 대해 테스트하였다. A10.21 항CD38 항체-약화된 IFN 융합 단백질에 대한 이들 변이체를 제조하였다(하기 표 7). 항체 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위 제거는, 항체 구성체에서의 항체의 이소타입이 IgG1 또는 IgG1 AA(IgG1 (L235A, G237A)), IgG2 또는 IgG2 SS(IgG2 (A330S, P331S))인지 여부와 상관없이 효능을 증가시켰다(도 19).
Figure pct00015
T106의 아미노산 치환 또는 결실에 의한, 항CD38 항체 인터페론 융합 단백질의 약화된 인터페론 부분으로부터의 O-결합 글리코실화 부위 제거가 표적 CD38, CD138 또는 HLA 양성 세포에서 항증식 활성을 증가시켰다(1.3-12배).
실시예 3
항체- 약화된 IFNα2b 융합 단백질의 온/ 오프 타겟 활성
인간 인터페론 알파(IFNα2b) 생체활성(IU/ml)을 정량적으로 측정하기 위해 루시페라제 발생 생체발광을 사용하여 iLite(iLite)™ 리포터 유전자 어세이를 수행하였다. 본 어세이에서 사용되는 세포는 CD38을 발현하고, 이를 사용하여 항CD38-약화된 IFNα2b 융합 단백질의 '온 타겟' 활성을 측정하였다. 상기 세포는 또한 CD38이 동일한 에피토프를 인식하는 항CD38 항체로 차단될 때, '오프 타겟' 활성을 측정하기 위해서도 사용될 수 있다. 상기 어세이를 이용하여, 항CD38 IFN 융합 단백질이 얼마나 선택적으로 CD38+ 표적 세포에 대해서는 활성을 띠고, CD38이 차단된 세포(모방 CD38- 세포)에 대해서는 비활성을 띠는지를 나타내는 척도인 선택성 지수(SI: Selectivity Index)를 측정할 수 있다. SI가 클수록, 작용제는 표적에 대하여 더욱 큰 선택성을 띠며, 수치가 1에 가깝다는 것은 표적 또는 비표적에 대한 선택성이 없다는 것을 시사한다. 인트론 A는 인터페론 알파 수용체, IFNAR1/2를 발현하는 세포에 대해서는 활성을 띠지만, 다른 세포 표면 발현 항원(즉, CD38)에 대해서는 비선택성을 띠고, SI는 대략 1인 바, 인트론 A를 양성 대조군으로서 사용하였다.
항체- 약화된 IFN 구성체
사용된 구성체의 서열은 서열 목록에 기재되어 있고, 하기 표 8에 열거되어 있다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
인트론® A를 양성 대조군으로서 사용하였다.
온/ 오프 타겟 활성 측정
상기 "iLite 유전자 리포터 어세이"로서 상기에 기재된 것과 동일한 방법을 이용하여 온/오프 타겟 활성을 측정하였다.
인간 IgG 차단 단계를 부가하면서, 대체로는 제조사에 의해 기술된 바와 같이 iLite 리포터 유전자 어세이(PBL 인터페론 소스(PBL Interferon Source: 미국 뉴저지주 피츠카타웨이), 카탈로그 번호 51100)를 수행하였다. iLite 세포주는 "세포 표면 상의 MHC 클래스 II 항원, 특히, 인간 림프구 항원(HLADR) 발현을 특징으로 하는 상업적으로 이용 가능한 전단핵구 인간 세포주로부터 유래된 안정적으로 형질감염된 세포주"로서 제조사에 의해 기술된 것이다. 상기 세포주는 CD38을 발현하고, 안정적으로 형질감염된 루시페라제 유전자를 함유하는데, 이 루시페라제 유전자의 발현은 인터페론 반응 요소(IRE: interferon-response element)에 의해 구동되며, 이로써, 인터페론 활성은 발광 결과에 기초하여 정량화될 수 있다.
제조사로부터 공급받은 iLite 플레이트(이하, 어세이 플레이트) 및 희석제를 -80℃ 냉동기에서 꺼내 옮기고, 실온으로 평형화시켰다. 웰당 50 ㎕의 희석제를 어세이 플레이트에 첨가하였다. 제조사로부터 공급받은 리포터 세포의 바이알을 -80℃ 냉동기에서 꺼내 옮기고, 37℃ 수조에서 해동시켰다. 25 ㎕ 분취량의 세포를 어세이 플레이트의 각 웰로 분배하였다. 이어서, RPMI 1640 + 10% FBS(시그마 케미칼즈(Sigma Chemicals: 미국 미주리주 세인트 루이스); 카탈로그 번호 I4506) 중에 희석된 8 mg/mL 인간 IgG를 각 웰당 12.5 ㎕씩 첨가하였다. 내용물을 혼합하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 별도의 "희석 플레이트" 상에서 테스트 물질을 RPMI 1640 + 10% FBS 중에서 이중으로 연속적으로 희석하였다. 이어서, 12.5 ㎕의 테스트 물질을 희석 플레이트로부터 어세이 플레이트로 옮겼다. 이어서, 어세이 플레이트를 5% CO2 존재하에 37℃에서 17시간 동안 인큐베이션시켰다. 제조사로부터 공급받은 어세이 완충제 및 기질을 -80℃ 냉동기에서 꺼내 옮기고, 2시간 동안 실온으로 평형화시켰다. 웰당 50 ㎕의 희석제를 어세이 플레이트에 첨가하였다. 제조사로부터 공급받은 어세이 완충제를 제조사로부터 공급받은 기질 바이알에 첨가하고, 제조사의 설명서에 따라 잘 혼합하여 "발광액"을 생성하였다. 이어서, 100 ㎕의 발광액을 어세이 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 2분 동안 진탕시켰다. 이어서, 플레이트를 실온의 암실에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 발광측정 채널 상의 빅토르 3V 멀티라벨 카운터 상에서 판독하고, 발광을 측정하고, RLU로서 제시하였다.
iLite 어세이에서 항CD38 항체-IFN 융합 단백질 구성체의 오프 타겟 활성을 테스트하기 위해, 제조사로부터 공급받은 희석제를 0.25 mg/mL 항CD38 항체(테스트된 항체-IFN 융합 단백질 구성체와 동일한 CD38 상의 에피토프를 인식하는 항체, iLite 세포 상에서 발현된 CD38에의 항CD38 항체-IFN 융합 단백질 구성체의 임의의 결합을 차단하기 위해)로 보충하였다. 상기 차단 단계 후, 이어서, 항CD38 항체-IFN 융합 단백질 또는 IFNα2b로 처리하였다.
곡선의 중간점(EC50)을 측정하기 위해 비선형 회귀 및 3 파라미터 곡선 피트를 이용하는 프리즘 5(그래프패드: 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 이용하여 데이터를 분석하였다. 선택성 지수(SI)는 EC50(오프 타겟 활성)/EC50(온 타겟 활성)으로 계산하였다. 선택성 지수(SI)는 항CD38 IFN 융합 단백질이 얼마나 선택적으로 CD38+ 표적 세포에 대해서는 활성을 띠고, CD38이 차단된 세포(모방 CD38- 세포)에 대해서는 비활성을 띠는지를 나타내는 척도이다. 수치가 클수록, 작용제는 표적에 대하여 더욱 큰 선택성을 띠며, 수치가 1에 가깝다는 것은 표적에 대한 선택성이 없다는 것을 시사한다. 인트론 A를 양성 대조군으로서 사용하였으며, 그의 SI는 대략 1이다.
트레오닌 106(T106)을 알라닌으로 치환(T106A로 제시)하여 항CD38 항체-약화된 인터페론 융합 구성체의 O-결합 글리코실화 부위를 제거하였다. O-결합 글리코실화 존재 및 부재의 IFNα2b에 융합된 A10.21 및 A10.43 항CD38 항체를 비교함으로써 활성을 조사하였다.
O-결합 글리코실화된 단백질과 비교하였을 때, 항체 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위 제거(T106A로 제시)는 온 타겟 활성을 약간 증가시켰고(도 3 및 하기 표 9), 오프 타겟 활성은 조금도 증가시키지 않았다. O-결합 글리코실화된 단백질 및 비글리코실화 단백질, 둘 모두 CD38+ 세포에 대하여 높은 선택성을 보인 반면, 인트론 A는 선택성을 보이지 않았다.
Figure pct00020
융합 단백질의 약화된 IFN으로부터의 O-결합 글리코실화 부위 제거가 온/오프 타겟 활성에 미치는 영향 또한 유사한 방식으로 조사할 수 있다.
항CD38-약화된 IFN 융합 단백질의, 표적 CD38+ 세포에 대한 선택적 활성, 및 CD38이, 표적 음성 세포 상에서 예상되는 활성을 모방하는 (동일 에피토프를 인식하는) 항CD38 항체로 차단되었을 때의 세포에 대한 제한된 활성을 입증하기 위해 iLiteTM 리포터 유전자 온-오프 타겟 활성 어세이를 수행하였다.
O-결합 글리코실화된 단백질과 비교하였을 때, (T106A 치환에 의한) 항체 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위 제거는 온 타겟 활성을 약간 증가시켰고, 오프 타겟 활성은 조금도 증가시키지 않았다. O-결합 글리코실화된 항CD38 항체-약화된 인터페론 융합 단백질 및 비글리코실화 항CD38 항체-약화된 인터페론 융합 단백질, 둘 모두 CD38+ 세포에 대하여 높은 선택성을 보인 반면, 인트론 A는 선택성을 보이지 않았다.
항체 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위 제거 결과로서 선택성 지수의 조절에 대하여 추가로 조사하기 위해, 온-오프 타겟 활성을 다양한 구성체에서 조사하였다. 조사된 변화는 A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106T) 구성체를 기준으로 하였다. 이는 트레오닌 106(T106)의 결실, T106의 세린으로의 치환(T106S), YTE 치환(YTE T106T 및 YTE T106A), 알라닌 145의 글루타민으로의 치환(A145Q)에 의한 IFN 약화, 및 IgG1로의 다양한 항체 이소타입(IgG1 T106T 및 IgG1 T106A)을 포함하였다.
구성체 대다수는 선택성 지수 >1로 나타났고, 표적화된 CD38+ 세포에 대한 선택성 크기는 항CD38 IFN 융합된 구성체에 따라 달랐다(도 20). A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106A)에서 선택성이 가장 큰 것으로 관찰되었다.
실시예 4
항CD38 항체- 약화된 IFNα2b 융합 단백질의 오프 타겟 활성
HEK-블루(HEK-Blue)™ IFN-α/β 세포는 ISGF3 경로의 활성화를 모니터링함으로써 생체활성 인간 I형 IFN을 검출할 수 있게 한다. HEK-블루™ IFN-α/β 세포를 IFN-α로 자극시키면, JAK/STAT/ISGF3 경로는 활성화되고, 이어서, SEAP(IFN-α/β 유도성 ISG54 프로모터 제어하의 리포터 유전자) 생산이 유도된다. 상청액 중의 SEAP의 수준은 콴티-블루(QUANTI-Blue)™로 쉽게 측정될 수 있다. 상기 리포터 유전자 어세이를 이용하여 항체 인터페론 융합 단백질의 약화된 인터페론 부분으로부터 O-결합 글리코실화의 제거가 미치는 효과를 평가하였다.
항체/ Fc 융합 단백질 구성체 제조
인터페론 융합 단백질을 발현하는 각종의 일시적으로 형질감염된 세포를 회수하고, Mab 셀렉트 슈어 프로테인 A 칼럼을 사용하여 정제하였다. 샘플을 하이로드 슈퍼덱스 200 칼럼을 사용하여 200 mM 아르기닌, 25 mM 히스티딘(pH 6.5)으로 탈염시켰다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
인트론® A를 양성 대조군으로서 사용하였다.
HEK - 블루 어세이에 의한 오프 타겟 활성 측정
"HEK-블루 오프 타겟 어세이"에 기술된 것과 동일한 방법을 사용하되, 단, 시딩된 세포, 희석된 항체 및 사용된 상청액의 부피는 예외로 하여, 항체-IFN 융합물의 오프 타겟 활성을 측정하였다. 본 어세이의 세부 사항은 하기와 같다.
HEK-블루™ IFN-알파/β 세포주(인비보겐(InvivoGen: 미국 캘리포니아주 샌디에고))를 사용하여 인터페론-알파/β 수용체(IFNAR: interferon-alpha/β receptor)에 결합할 수 있는 항체-IFN 융합 구성체의 능력을 정량화하는 데 HEK-블루 오프 타겟 어세이를 이용하였다. 대체로는 HEK-블루 IFN-알파/β 세포주의 제조사에 의해 기술된 바와 같이 "오프 타겟(HB-IFN) 어세이"를 수행하였다. HEK-블루™ IFN-알파/β 세포는, I형 IFN에 의해 유도되는 JAK-STAT 경로의 활성화를 모니터링하도록 특수 디자인된 것이다. 완전한 활성을 띠는 I형 IFN 신호전달 경로를 얻기 위해 인간 STAT2 및 IRF9 유전자를 HEK293 세포 내로 도입함으로써 세포를 생성하였다. HEK-블루™ IFN-알파/β 세포는 리포터 유전자인 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP: secreted embryonic alkaline phosphatase)를 ISG54 프로모터의 제어하에서 안정적으로 발현한다. ISG54는 I형 IFN에 의해 ISRE 의존 기전을 통해 활성화되는, 널리 공지된 ISG이다. IFN-알파 또는 IFNβ 자극시, HEK-블루™ IFN-알파/β 세포는 JAK-STAT 경로를 활성화시킨 후, SEAP 리포터 유전자의 발현을 활성화시킨다. SEAP는 배지로 분비되고, 이는 비색 시약 콴티블루™를 사용하여 정량화될 수 있다.
간략하면, HEK-블루 IFN-알파/β 세포(인비보겐: 미국 캘리포니아주 샌디에고, 카탈로그 번호 hkb-ifnab)를 해동시키고, DMEM 배지(메디아테크: 미국 버지니아주 마나사스, 카탈로그 번호 10-013-CV) + 열 불활성화된 10% FBS(하이클론: 미국 유타주 로간, 카탈로그 번호 SH30070.03)(HI FBS) 중에서 배양하였다. 세포 전면생장률이 60-80%에 도달하였을 때, 세포를 셀 스트리퍼(메디아테크, 카탈로그 번호 25-056-Cl)로 리프팅하였다. 세포를 DMEM + HI FBS 중에서 2회에 걸쳐 세척하고, 계수하였다. 세포를 DMEM + HI FBS 중에서 2.77 x 105개의 생존가능한 세포/ml로 조정하고, 평평 바닥 96웰 조직 배양 플레이트(이하, "실험 플레이트")로 웰당 180 ㎕씩 시딩하였다. 이어서, DMEM + HI FBS에 희석된, IFN-알파2b 또는 융합 단백질 구성체를 웰당 20 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 5% CO2에서 16-24시간 동안 인큐베이션시켰다. 제조사의 설명서에 따라 콴티블루(인비보겐, 카탈로그 번호 rep-qb1)를 제조하였다. 콴티블루(180 ㎕)를 평평 바닥 플레이트(이하, "어세이 플레이트")의 각 웰에 시딩하였다. 이어서, 실험 플레이트로부터 각 웰당 20 ㎕의 상청액을 어세이 플레이트로 옮겼다. 어세이 플레이트를 37℃에서 1-3시간 동안 인큐베이션시켰다. 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices)로부터의 모델 스펙트라맥스플러스 384 마이크로플레이트 리더(SpectraMaxPlus 384 Microplate Reader) 상에서 620 nm에서의 어세이 플레이트 흡광도를 판독하였다. 그래프 패드 프리즘을 이용하여 데이터를 분석하였다.
IFNα2b 중의 O-결합 글리코실화의 존재 또는 부재가 약화된 IFN 융합된 항CD38 항체의 오프 타겟 활성에 미치는 영향을 평가하였다.
트레오닌 106(T106)을 알라닌으로 치환시킴으로써(T106A로 제시), 또는 T106을 결실시킴으로써(ΔT106으로 제시) 항CD38 항체-약화된 인터페론 융합 구성체의 O-결합 글리코실화 부위를 제거하였다. O-결합 글리코실화의 존재 및 부재의 약화된 IFNα2b에 융합된 X10.21 항CD38 항체를 비교함으로써 오프 타겟 활성에 미치는 효과를 조사하였다.
O-결합 글리코실화된 단백질, 즉 A10.21 IgG4 IFN (145D, T106T) 및 A10.21 IgG1 IFN (145D, T106T)와 비교하였을 때, 항체 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중의 O-결합 글리코실화 부위 제거가 오프 타겟 활성을 약간 증가시켰다(도 5). 이러한 경향은 이소타입과 상관없이 일관되게 나타났다(도 5). 그러나, IFNα2b(A145D)는 본 어세이에서 심지어 최고 용량으로 사용된 경우에서도 조차 SEAP 유도 수준은 제한될 정도로 매우 약화된 상태이다. 그러므로, EC50은 단지 근사값일 뿐이다.
O-결합 글리코실화의 제거를 위해 상이한 아미노산 치환을 갖는 약화된 IFN과 융합된 항체((R10A2 IgG4 (S228P) IFN (A145D)))의 오프 타겟 활성을 조사하였다. 모든 가능한 아미노산 치환을 테스트하였고, 구성체는 하기 표 11에 열거되어 있다.
Figure pct00025
Figure pct00026
이들 각 치환들은 O-글리코실화된 IFN 융합된 항체 R10A2 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106T)와 비교하였을 때, 유사하거나, 또는 약간 더 작은 오프 타겟 활성(EC50 증가)을 보인 것으로 나타났다. 그러나, IFNα2b(A145D)는 본 어세이에서 심지어 최고 용량으로 사용된 경우에서도 조차 SEAP 유도 수준은 제한될 정도로 매우 약화된 상태이다. 그러므로, EC50은 단지 근사값일 뿐이다.
또 다른 항CD38 항체-약화된 IFNα2b 구성체의 오프 타겟 활성, 및 T106A 치환에 의한 O-결합 글리코실화 제거가 미치는 영향을 조사하였다. A10.43은 A10.21과 비교하였을 때, 중쇄에 7개의 아미노산 변이를 갖는 반면, 두 구성체는 동일한 경쇄 서열을 공유한다(서열 목록 참조). T106A 치환에 의한 O-결합 글리코실화 부위 제거가 A10.43의 오프 타겟 활성을 약간 증가시켰다는 것이 결과로 입증되었다. 그러나, IFNα2b(A145D)는 본 어세이에서 심지어 최고 용량으로 사용된 경우에서도 조차 SEAP 유도 수준은 제한될 정도로 매우 약화된 상태이다. 그러므로, EC50은 단지 근사값일 뿐이다.
O-결합 글리코실화된 단백질과 비교하였을 때, 항체 인터페론 융합 구성체의 약화된 IFN 부분 중 O-결합 글리코실화 부위 제거는 오프 타겟 활성은 조금도 증가시키지 않았고, 온 타겟 활성은 약간 증가시켰다. O-결합 글리코실화된 항CD38 항체-약화된 인터페론 융합 단백질 및 비글리코실화 항CD38 항체-약화된 인터페론 융합 단백질, 둘 모두 CD38+ 세포에 대하여 높은 선택성을 보인 반면, 인트론 A는 선택성을 보이지 않았다.
실시예 5
항CD38-약화된 IFN에의 인간 신생아 Fc 수용체( FcRn ) 결합의 평가
아민 커플링 프로토콜을 사용하여 비아코어(Biacore) T200 증강 장치 중 CM5 센서의 지정된 활성 플로우 셀 상에 폴리-his-태그부착된 FcRn을 고정시켰고, 동시에, 참조 플로우 셀 상에서는 블랭크 고정을 수행하였다. 용액이 확실하게 플로우 셀 상에 미리 농축되도록 하기 위해 poly-his-태그부착된 FcRn 펄스를 활성 표면 상에 주입하였다. 이어서, 표면을 50 mM NaOH로 세척하였다. 참조 표면 및 활성 표면, 둘 모두 50:50 EDC/NHS 믹스로 7분 동안 활성화시켰다. 오직 활성 표면 상에서만 10 mM 아세트산 나트륨(pH 5.0) 중 2 ㎍/mL로 폴리-his-태그부착된 FcRn 펄스를 연속 진행시켰다. 일단 150 RU 표적에 도달하고 나면, 두 표면 모두를 7분 동안 1 M 에탄올아민(pH 8.5)을 이용하여 비활성화시켰다. 본 프로토콜을 통해 대략 150 RU의 폴리-his-태그부착된 FcRn이 활성 표면 상에 고정화되었다. 각 활성 표면을 1회 실행을 위해 사용하였다.
제바 스핀 디솔팅 칼럼(Zeba Spin Desalting Column), 7K MWCO, 0.5 mL(피어스(Pierce) 제품 # 89882)를 사용하여 PBS-P 전개 완충제(DPBS, pH 7.4 및 25℃에서 HCl을 이용하여 pH 6.0으로 조정된 0.005% 트윈-20) 중에서 테스트 항체를 탈염시켰다. 탈염 후, 각 샘플의 농도를 1 mg/mL로 조정하였다.
어세이 당일, 1 mg/mL 용액을 전개 완충제 중에서 추가로 희석하여 최고 농도를 제조한 후, 1:2로 희석하여 농축액 시리즈를 제조하였다. 50 ㎕/분의 유동 속도를 사용하여 표면 상에 테스트 샘플을 통과시켰다. 테스트된 모든 농축액에 대하여 회합 단계는 100초인 반면, 해리 단계는 300초였다. 100 mM 트리스, 50 mM NaCl(pH 8.0)의 60초 주입을 사용하여 테스트 항체를 제거함으로써 활성 표면 및 참조 표면을 재생하였다. 결합 상수는 25℃에서 측정하였다.
Rmax가 국소인 것으로 설정되었고, RI(굴절률: refractive index) 파라미터가 국소 파라미터로 설정된, 2 상태 반응 모델을 사용하여 항체 폴리-his-FcRn 결합 상호작용을 평가하였다. 모든 데이터에 대해 이중으로 참조값을 감산하였는데: 먼저, 덱스트란 매트릭스에 결합하는 항체로부터 생성된 참조 셀(블랭크 고정)에서의 신호를 감산하였고, 이어서, 두 번째로는 활성 표면 상에서 0 nM 항체의 신호를 감산하였다.
결합 상수는 각 항체에 대하여 2회 이상의 별도의 실행으로 측정하였다. 각 실행에 대해 양성 대조군으로서 항CD38/IFN 샘플과 함께 프롤리아 로트(Prolia Lot) 1035726을 테스트하였다. ka1. kd1, ka2, kd2 및 KD의 평균값을 측정하였다.
4개의 항CD38/IFN(A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106A), A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106T) A10.43 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106A) A10.43 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106T))의 FcRn 결합에 대한 평균 동력학적 성질 및 친화도 값을 측정하였다. 본 샘플 세트에서, 클론 A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A145D, T106A)이 FcRn에 대해 가장 높은 친화도를 보였다.
실시예 6
마우스 NCI-H929 다발성 골수종 모델에서의 O-결합 글리코실화의 존재 및 부재의 약화된 인터페론 알파 2b에 융합된 항CD38 항체의 효능
약물 및 치료:
Figure pct00027
절차:
· 50% 마트리겔(Matrigel) 중 1x107개의 H929 종양 세포를 이용하여 CR 암컷 CB.17 SCID 마우스 옆구리에 sc로 셋업한다.
· 세포 주사량은 0.2 mL/마우스이다.
· 출발일 나이: 8 내지 12주령.
· 종양의 평균 크기가 170 - 350 ㎣에 도달하였을 때, 쌍 매칭을 수행하고, 처리를 시작한다.
· 투약 부피 = 0.2 mL/마우스. 체중에 맞게 조절하지 않는다.
· 체중: qd x 5, 이어서, 종료시까지 biwk.
· 캘리퍼 측정: 종료시까지 biwk.
· 종점 TGD. 동물을 개별적으로 모니터링하여야 한다. 실험 종점은 종양 부피가 2,000 ㎣일 때, 또는 60일째일 때로, 어느 경우가 먼저 발생하든 그 시점이 종점이 된다. 반응을 보인 동물에서는 그보다 더 긴 기간 동안 진행될 수 있다. 종점에 도달하였을 때, SOP #687에 따라 동물을 안락사시켜야 한다.
본 결과는 도 8에 제시되어 있다. O-결합 글리코실화 존재 및 부재하에서는 거의 등가인 효능이 관찰되었으며, 종양 성장을 저해하는 데 있어서 아글리코실화된 형태가 약간 더 강력한 효능을 보였다.
실시예 7
O-결합 글리코실화 존재 및 부재의, 약화된 IFN에 융합된 항CD38 항체에의 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 평가에서, O-결합 글리코실화 부재의 단백질이 FcRn에 대해 가장 높은 친화도를 보였다. 상기 효과를 사이노몰구스 원숭이 및 인간화 FcRn 마우스에서 평가할 수 있다.
사이노몰구스 원숭이 연구
+/- O- glyc 비교를 위한 원숭이 연구 디자인
· 유치 카테터를 통하여 하기를 3 mg/kg으로 단일 정맥내 주입(1시간)
- A10.21 IgG4 (S228P) IFN (145D, T106A)(n=4)
- A10.21 IgG4 (S228P) IFN (145D, T106T)(n=4)
- A10.21 IgG4 (S228P) IFN (145D, T106A)(n=4)
- A10.21 IgG4 (S228P) IFN (145D, T106T)(n=4).
· PK 및 PD(즉, 생물학적 효과, 즉, 혈청 네오프테린 수준)을 비교한다.
· PK: 모든 원숭이, ≤1 ml, 11개 시점(투약 이전, 0분(주입 종료 후 즉시), 주입 후 2, 6, 12, 24, 48, 96, 120, 168 및 240시간째. ELISA에 의해 샘플(80)을 분석한다.
· TK 모델링: WinNonlin 테이블 어셈블리(WinNonlin Table Assembly)(비구획 분석).
· 임상 병리: 혈액학적 성질 및 혈액 화학적 성질 - 모든 원숭이, 3차례 (치료 이전, 투약 후 24시간째 및 8일째).
· 혈청 네오프테린 - 모든 원숭이, 5개의 시점(투약 이전, 투약 후 12, 24, 96, 168시간째)에 3차례.
인간화 FcRN 마우스에서의 약동학적 성질 연구
1. 1일째 서른 두 마리(32마리)의 B6.Cg-Fcgr tm1Dcr 'Tg(CAG-FCGRT)276Dcr/DcrJ(JAX 스톡 번호 004919) 암컷 마우스에 1 mg/kg의
- A10.21 IgG4 (S228P) IFN (145D, T106A)(n=8)
- A10.21 IgG4 (S228P) IFN (145D, T106T)(n=8)
- A10.43 IgG4 (S228P) IFN (145D, T106A)(n=8)
- A10.43 IgG4 (S228P) IFN (145D, T106T)(n=8)을 IP 주사에 의해 투약한다.
2. 투약 3일 전, 투약 당일 및 그 이후 매주 체중을 측정한다.
3. 케이지 사이드 관찰은 매일 수행하고, 임상적 관찰은 매주 수행한다.
4. 약동학적 성질 혈액 수집: 투약 3일 전 및 투약 후 1, 12, 24, 48 및 72시간, 및 5, 7, 10, 및 14일째 마우스에서 채혈한다(25 ㎕). 2개의 코호트에 있는 마우스에서 채혈한다(4마리 마우스/군/코호트).
5. 14일째 마우스 모두 희생시킨다. 최종의 심장천자를 수행하여 혈액을 수집한다.
6. 혈액을 리튬 헤파린 튜브에 수집하고, 4℃에서 2 min 동안 10,000 rpm으로 원심분리한다.
7. A10.21 IgG4 IFN(145D) A106, A10.21 IgG4 IFN(145D) T106, A10.43 IgG4 IFN(145D) A106 또는 A10.43 IgG4 IFN(145D) T106에 대한 결합 ELISA에 의해 분석하기 전에 혈장 샘플을 PBS 중에서 1:10으로 희석하여, 냉동시킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd <120> Interferon alpha 2b variants <130> 35241105/WJP <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human interferon alpha-2-b with mutation at amino acid position 106 <220> <221> VARIANT <222> (106)..(106) <223> Xaa can be any amino acid selected from A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, Y <400> 1 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Xaa Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 2 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human Interferon alpha-2-b with deletion of amino acid at position 106 <400> 2 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu 100 105 110 Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr 115 120 125 Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala 130 135 140 Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu 145 150 155 160 Arg Ser Lys Glu <210> 3 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation L15A <400> 3 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Ala Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 4 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation A19W <400> 4 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Trp Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 5 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R22A <400> 5 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Ala Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 6 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R23A <400> 6 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Ala Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 7 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation S25A <400> 7 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ala Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 8 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation L26A <400> 8 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Ala Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 9 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation F27A <400> 9 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Ala Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 10 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation L30X, where X can be any amino acid selected from A, V <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any amino acid selected from A, V <400> 10 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Xaa Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 11 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation K31A <400> 11 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Ala Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 12 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation D32A <400> 12 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Ala 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 13 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R33X, where X can be any amino acid selected from K, A, Q <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any amino acid selected from K, A, Q <400> 13 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Xaa His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 14 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation H34A <400> 14 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg Ala Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 15 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation Q40A <400> 15 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Ala Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 16 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation D114R <400> 16 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Arg Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 17 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation L117A <400> 17 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Ala Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 18 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R120X where X can be any amino acid selected from A, E <220> <221> VARIANT <222> (120)..(120) <223> Xaa can be any amino acid selected from A, E <400> 18 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Xaa Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 19 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R125X where X can be any amino acid selected from A, E <220> <221> VARIANT <222> (125)..(125) <223> Xaa can be any amino acid selected from A, E <400> 19 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Xaa Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 20 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation K131A <400> 20 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Ala Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 21 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation E132A <400> 21 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Ala Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 22 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation K133A <400> 22 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Ala Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 23 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation K134A <400> 23 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Ala Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 24 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R144X where X can be any amino acid selected from A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V, Y <220> <221> VARIANT <222> (144)..(144) <223> Xaa can be any amino acid selected from A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V, Y <400> 24 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Xaa 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 25 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation A145X where X can be any amino acid selected from D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y <220> <221> VARIANT <222> (145)..(145) <223> Xaa can be any amino acid selected from D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y <400> 25 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Xaa Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 26 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation M148A <400> 26 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Ala Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 27 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R149A <400> 27 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Ala Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 28 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation S152A <400> 28 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ala Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 29 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation L153A <400> 29 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ala Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 30 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation N156A <400> 30 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Ala Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 31 <211> 612 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A10.21 IgG4 (S228P) IFN (A592D, T553X) where X can be any amino acid selected from A, G, E, S, V <220> <221> VARIANT <222> (553)..(553) <223> Xaa can be any amino acid selected from A, G, E, S, V <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Cys 435 440 445 Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu 450 455 460 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg 465 470 475 480 His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys 485 490 495 Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn 500 505 510 Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu 515 520 525 Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala 530 535 540 Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Xaa Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu 545 550 555 560 Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr 565 570 575 Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Asp 580 585 590 Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu 595 600 605 Arg Ser Lys Glu 610 <210> 32 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations L30A, H57Y, E58N and Q61S <400> 32 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Ala Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 33 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations R33A, H57Y, E58N and Q61S <400> 33 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Ala His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 34 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations M148A, H57Y, E58N and Q61S <400> 34 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Ala Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 35 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations L153A, H57Y, E58N and Q61S <400> 35 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Ala Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 36 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations R144A, H57Y, E58N and Q61S <400> 36 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu Tyr Asn Met Ile Ser Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Ala 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 37 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations N65A,L80A, Y85A, Y89A <400> 37 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Ala Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Ala 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 38 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations N65A,L80A, Y85A, Y89A and D114A <400> 38 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Ala Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Ala 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Ala Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 39 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations N65A,L80A, Y85A, Y89A and L117A <400> 39 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Ala Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Ala 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Ala Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 40 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations N65A,L80A, Y85A, Y89A and R120A <400> 40 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Ala Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Ala 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Ala Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 41 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations Y85A, Y89A and R120A <400> 41 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Ala Thr Glu Leu Ala Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Ala Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 42 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations D114A,R120A <400> 42 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Ala Ser Ile Leu Ala Val Ala Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 43 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations L117A,R120A <400> 43 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Ala Ala Val Ala Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 44 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations L117A,R120A,K121A <400> 44 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Ala Ala Val Ala Ala Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 45 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations R120A,K121A <400> 45 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Ala Ala Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 46 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutations R120E,K121E <400> 46 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Glu Glu Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 47 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aglycosylated (T106A) human interferon alpha-2-b comprising attenuating deletion of residues L161-E165 <400> 47 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 <210> 48 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.21 formatted as IgG4 incorporating hinge stabilisation substitution S228P <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 49 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.21 formatted as an IgG4 incorporating hinge stabilisation substitution S228P and YTE residues substituted in positions 252, 254, 256 respectively <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 50 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.21 formatted as an IgG1 <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 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390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 51 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.21 formatted as an IgG1 incorporating substitutions L238A and G240A to reduce effector function <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 52 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.21 formatted as an IgG1 incorporating substitutions L235A and G237A (reduce effector function) and M255Y, S257T, T259E <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 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10.21 formatted onto an IgG2 backbone <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 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Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 54 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.21 formatted onto an IgG2 backbone incorporating substitutions M251Y, S253T and T255E <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 55 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.43 formatted onto an IgG4 backbone incorporating the hinge stabilisation substitution S228P <400> 55 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 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10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 57 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> OPG-Fc construct <400> 57 Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 1 5 10 15 Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His 20 25 30 Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45 Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80 Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Gly Glu Phe 85 90 95 Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala 100 105 110 Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125 Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140 Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160 Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gln Lys Glu Arg Lys 165 170 175 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 180 185 190 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 195 200 205 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 210 215 220 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 225 230 235 240 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val 245 250 255 Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 260 265 270 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 275 280 285 Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 290 295 300 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 305 310 315 320 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 325 330 335 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 340 345 350 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 355 360 365 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 370 375 380 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 385 390 395 400 Lys <210> 58 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> X2.12 VH sequence formatted as an IgG4 (S228P) <400> 58 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Val Gly Gly Ala Gly Gly Trp Pro Leu Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu 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subsitution S228P and the deletion of Threonine residue at position 553 (ie:T106 in interferon sequence) <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 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Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn 500 505 510 Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu 515 520 525 Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala 530 535 540 Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu 545 550 555 560 Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr 565 570 575 Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Asp 580 585 590 Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu 595 600 605 Arg Ser Lys Glu 610 <210> 77 <211> 613 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> A02.12 IgG4 IFN <400> 77 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Val Gly Gly Ala Gly Gly Trp Pro Leu Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu 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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Cys 435 440 445 Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu 450 455 460 Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg 465 470 475 480 His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys 485 490 495 Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn 500 505 510 Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu 515 520 525 Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala 530 535 540 Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Ala Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu 545 550 555 560 Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr 565 570 575 Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Asp 580 585 590 Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu 595 600 605 Arg Ser Lys Glu 610 <210> 88 <211> 495 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IFN alpha-2-beta <400> 88 tgtgatctgc ctcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag 60 atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac atgactttgg atttccccag 120 gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc 180 cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc 240 ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata 300 cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg 360 aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg 420 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt 480 ttaagaagta aggaa 495 <210> 89 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide of 10.21 as an IgG2 incorporating S228P <400> 89 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcgctac cgtgaagatc 60 tcctgcaagg tgtccggcta caccttcacc gactccgtga tgaactgggt gcagcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg gatgggctgg atcgaccccg agtacggcag aaccgacgtg 180 gccgagaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca cctccaccga caccgcctac 240 atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaccaag 300 tacaactccg gctacggctt cccctactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc 360 gcctccacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420 tctaccgccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcctgt gacagtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccttcca gctccctggg caccaagacc 600 tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660 aagtacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaat ttctgggcgg accttccgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaagaggac cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag 960 tgcaaagtct ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggacagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaagagga aatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg cctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140 tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg accgtggaca agtcccggtg gcaagagggc 1260 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgtccctga gcctgggcaa g 1341 <210> 90 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of 10.43 as an IgG4 incorporating S228P <400> 90 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg tgtccggcta caccctgacc gactccgtga tgaactgggt ccgacaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg gatgggctgg atcgaccccg agtacggcag aaccgacgtg 180 gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg accgccgaca cctccaccga caccgcctac 240 atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaccaag 300 tacaactccg gctacggctt cccctactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctct 360 gcttccacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420 tctaccgccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcctgt gacagtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccttcca gctccctggg caccaagacc 600 tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660 aagtacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaat ttctgggcgg accttccgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaagaggac cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag 960 tgcaaagtct ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggacagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaagagga aatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg cctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140 tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg accgtggaca agtcccggtg gcaagagggc 1260 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgtccctga gcctgggcaa g 1341 <210> 91 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide of 2.12 formatted an an IgG4 incorporating S228P <400> 91 cagctgcagc tgcaggaatc tggccctggc ctcgtgaagc ccagcgagac actgagcctg 60 acctgtaccg tgtccggcgg cagcatcagc agcagctcct actactggtc ctggatcaga 120 cagcaccccg gcaagggcct ggaatggatc ggctacatct actacagcgg cagcaccaac 180 tacaacccca gcctgaagtc cagagtgacc atcagcgtgg acaccagcaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagcagcgt gacagccgcc gataccgccg tgtactactg tgccagagtg 300 ggcggagctg gcggctggcc tctggatgtg tggggacagg gcaccaccgt gacagtgtcc 360 tcagctagca ccaagggccc cagcgtgttc cctctggccc cttgtagcag aagcaccagc 420 gagtctacag ccgccctggg ctgcctcgtg aaggactact ttcccgagcc cgtcaccgtg 480 tcctggaact ctggcgctct gacaagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540 agcggcctgt actctctgag cagcgtcgtg accgtgccca gctctagcct gggcaccaag 600 acctacacct gtaacgtgga ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gcgggtggaa 660 tctaagtacg gccctccctg ccctccttgc ccagcccctg aatttctggg cggaccctcc 720 gtgttcctgt tccccccaaa gcccaaggac accctgatga tcagccggac ccccgaagtg 780 acctgcgtgg tggtggatgt gtcccaggaa gatcccgagg tgcagttcaa ttggtacgtg 840 gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aggaacagtt caacagcacc 900 taccgggtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagagtac 960 aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctgcct agcagcatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1020 aagggccagc cccgcgaacc tcaggtgtac acactgcccc ctagccagga agagatgacc 1080 aagaaccagg tgtccctgac ctgtctcgtg aaaggcttct acccctccga tatcgccgtg 1140 gaatgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac 1200 agcgacggct cattcttcct gtacagcaga ctgaccgtgg acaagagccg gtggcaggaa 1260 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 tccctgtccc tgtctctggg caag 1344 <210> 92 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide of R10A2 formatted as an IgG4 incorporating S228P <400> 92 gaagtccagc tgcagcagtc tggccccgaa gtgggcagac ctggctcctc cgtgaagatc 60 tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactccgtga tgaactgggt caagcagtct 120 cccggccagg gcctggaatg gatcggatgg atcgaccccg agtacggcag aaccgacgtg 180 gccgagaagt tcaagaagaa ggccaccctg accgccgact cctccagctc caccgcctac 240 atctacctgt ccggcctgac ctccgaggac accgccacct acttttgcgc ccggaccaag 300 tacaacagcg gctacggctt cccctactgg ggacagggct ctctcgtgac agtgtcctca 360 gcctccacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420 tctaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcctgt gaccgtgagc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgaca gtgccctcct ccagcctggg caccaagacc 600 tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660 aagtacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaat ttctgggcgg accttccgtg 720 tttctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat ccagaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaggaaga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgacat tgccgtggaa 1140 tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg acagtggata agtcccggtg gcaggaaggc 1260 aacgtgttct cctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagtcc 1320 ctgtccctga gcctgggcaa g 1341 <210> 93 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of R10A2 VK <400> 93 gacatcgtga tgacccagag ccccacctcc atctccatca gcgtgggcga gcgcgtgacc 60 atgaactgca aggcctccca gaacgtggac agcgacgtgg actggtatca gcagaaaacc 120 ggccagtccc ccaagctgct gatctacaag gccagcaaca gatacaccgg cgtgcccgac 180 aggttcaccg gctctggctc tggaaccgac ttcaccttca ccatcagcaa catgcaggcc 240 gaggatctgg ccgtgtacta ctgtatgcag tccaacaccc acccccggac cttcggcgga 300 ggcaccaaac tggaactgaa gcggaccgtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtct gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtctgg caacagccag 480 gaaagcgtca ccgagcagga cagcaaggat agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtcac ccaccagggc 600 ctgtctagcc ccgtcaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 94 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of VK used to generate antibody 10.21 and antibody 10.43 <400> 94 gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgca aggcctccca gaacgtggac tccgacgtgg actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gcctccaacg actacaccgg cgtgccctcc 180 agattctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccttca ccatctccag cctgcagccc 240 gaggatatcg ccacctacta ctgcatgcag agcaacaccc acccccggac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccaa 480 gagtccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 95 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of 10.152 formatted as an IgG4 incorporating S228P <400> 95 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcgctac cgtgaagatc 60 tcctgcaagg tgtccggcta caccttcacc gactccgtga tgaactgggt gcagcagcat 120 cccggcaagg gcctggaatg gatgggctgg atcgaccccg agtacggcag aaccgacgtg 180 gccgagaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca cctccaccga caccgcctac 240 atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggaccaag 300 tacaactccg gctacggctt cccctactgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctct 360 gcctccacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt gctcccggtc cacctccgag 420 tctaccgccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcctgt gacagtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccttcca gctccctggg caccaagacc 600 tacacctgta acgtggacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660 aagtacggcc ctccctgccc cccctgccct gcccctgaat ttctgggcgg accttccgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaagaggac cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa ctccacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag 960 tgcaaagtct ccaacaaggg cctgccctcc agcatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1020 ggacagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccta gccaagagga aatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg cctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140 tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctgta ctctcggctg accgtggaca agtcccggtg gcaagagggc 1260 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgtccctga gcctgggcaa g 1341 <210> 96 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of 10.152 light chain <400> 96 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Val Asp Ser Asp 20 25 30 Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Asp Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Ser Asn Thr His Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 97 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of 10.152 light chain <400> 97 gacatccaga tgactcagag cccgtcctcg ctttcggctt ccgtcggcga ccgcgtgacc 60 atcacttgtc aggcgtcgca gaacgtcgat tccgacgtgg actggtacca acagaagccg 120 gggaaagcgc ccaagctgct gatctacaag gcctccaatg attacactgg agtgcctagc 180 cggttcagcg gatcagggtc gggaacggac ttcactttta ccatctcaag cctccaacca 240 gaagatattg ccacctatta ctgcgcacaa tcaaacaccc acccgagaac cttcggcgga 300 ggaaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gcggcgccca gcgtgttcat cttcccaccc 360 agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 98 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of 2.12 light chain <400> 98 caggccgtgc tgacccagcc tgcctccctg tctgcctctc ctggcgagtc cgccagactg 60 acctgcaccc tgccctccga catcaacgtg cggtactaca acatctactg gtatcagcag 120 aagcccggca gcccccccag atacctgctg tactactact ccgactccca caagggccag 180 ggctccggcg tgccctccag attctccggc tccaaggacg tgtccaccaa ctccggcatc 240 ctgctgatct ccggcctgca gtccgaggac attgccacct actactgcat gacttggagc 300 agcaacggca gcggcgtgtt cggcggaggc acccagctga ccgtcctagg tcagcccaag 360 gccgctccca gcgtgaccct gttcccccca agcagcgagg aactgcaggc caacaaggcc 420 accctggtgt gcctgatcag cgacttctac cctggggccg tgaccgtggc ctggaaggcc 480 gatagcagcc ctgtgaaggc cggcgtggaa accaccaccc cctccaagca gagcaacaac 540 aaatacgccg ccagcagcta cctgtccctg acccccgagc agtggaagtc ccaccggtcc 600 tacagctgcc aggtgacaca cgagggcagc accgtggaaa agaccgtggc ccccaccgag 660 tgcagc 666 <210> 99 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of Anti-CD138 kappa light chain <400> 99 gacatccaga tgacccagag cacatcctct ctgagcgcct ccctgggcga tcgcgtgact 60 atcagttgca gcgcttccca agggattaac aattacctca actggtacca gcagaagccc 120 gacggaaccg tcgagctgct catctattac acatctacgc tgcaaagcgg cgtgccttcc 180 aggttctcag ggagcggttc cggaactgat tactctctga ccattagcaa tctcgaacca 240 gaagacatcg gcacatatta ctgtcagcag tactccaagc tgccccggac ttttggggga 300 ggcaccaaac tggagatcaa gcgtacggtg gcggcgccca gcgtgttcat cttcccaccc 360 agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 100 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of Anti-CD138 IgG4 (S228P) <400> 100 caggtgcagc tccaacagag cggctccgaa ctgatgatgc ctggggcctc tgtcaagatt 60 tcctgcaaag ctaccggcta cacattcagc aactattgga ttgagtgggt gaagcagcgc 120 ccagggcacg gtctggagtg gatcggagag atcctgccag gcaccgggag gactatttac 180 aatgaaaagt ttaaaggaaa ggccacattc accgcagaca tctctagcaa cactgttcaa 240 atgcagctct cctctctgac ctccgaggat agcgccgtgt attactgtgc tcggagagac 300 tactatggca atttttacta tgctatggat tactggggac agggcacatc tgtgaccgtc 360 agctccgcta gcaccaaggg ccccagcgtg ttccccctgg ccccttgtag cagaagcacc 420 agcgagagca cagccgccct gggctgcctg gtgaaagact acttccccga gcccgtcacc 480 gtgtcctgga acagcggagc cctgaccagc ggcgtgcaca cctttccagc cgtgctgcag 540 agcagcggcc tgtacagcct gagcagcgtg gtgacagtgc cctccagcag cctgggcacc 600 aagacctaca cctgtaacgt ggaccacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagcgggtg 660 gaatctaagt acggcccacc ctgccccccc tgccctgccc ctgaatttct gggcggaccc 720 tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa 780 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccag gaagatcccg aggtccagtt caattggtac 840 gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaacagc 900 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 960 tacaagtgca aagtctccaa caagggcctg cccagctcca tcgagaaaac catcagcaag 1020 gccaagggcc agccccgcga gcctcaggtg tacacactgc cccccagcca ggaagagatg 1080 accaagaacc aggtgtccct gacctgtctg gtgaaaggct tctaccccag cgatatcgcc 1140 gtggaatggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1200 gacagcgacg gcagcttctt cctgtactcc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 1260 gaaggcaacg tcttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320 aagtccctga gcctgagcct gggcaag 1347 <210> 101 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of Anti-HLA IgG4 (S228P) <400> 101 caggtccaac tcaagcagtc cggtccgggg ctggtccagc catctcaatc actgtctctt 60 acttgcaccg tgtccggatt cagcctgacc tcatacggag tgcattgggt gcggcagcct 120 cccgggaaag gactggagtg gctcggagtc atttggtccg gtggatcaac tgactacaat 180 gccgctttca tcagcaggct gagcattcgg aaggacaact ctaagagcca agtgttcttc 240 aagatgaact cactccaggc cgatgacacc gccatctact attgtgccag aaccttcacc 300 accagcacct ctgcatggtt tgcatactgg ggccagggca ctcttgtgac cgtgtcagct 360 gctagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggcccctt gtagcagaag caccagcgag 420 agcacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt caccgtgtcc 480 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgccctcca gcagcctggg caccaagacc 600 tacacctgta acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660 aagtacggcc caccctgccc cccctgccct gcccctgaat ttctgggcgg accctccgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaagtct ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020 ggccagcccc gcgagcctca ggtgtacaca ctgcccccca gccaggaaga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaaa ggcttctacc ccagcgatat cgccgtggaa 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200 gacggcagct tcttcctgta ctcccggctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 1260 aacgtcttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgagcctga gcctgggcaa g 1341 <210> 102 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of Anti-HLA VK <400> 102 tctatcgtca tgacccagac cccgaagttc ctcctggtgt cagctggtga tcgggtgacc 60 atcacttgta aggcctctca gtctgtctca aacgacgtcg catggtacca acaaaagcct 120 gggcagtcac ctaagcttct gatctactat gcttccaatc gctacaccgg cgtgcccgac 180 aggttcaccg gatcagggta cggaaccgac ttcaccttta ctatttccac cgtgcaggcc 240 gaggacctcg ccgtgtattt ctgccagcaa gattacagca gcccaccctg gactttcggt 300 ggaggaacta aactggaaat tagacgtacg gtggcggcgc ccagcgtgtt catcttccca 360 cccagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420 tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600 ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645 <210> 103 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of OPG-Fc <400> 103 gaaacctttc cgccgaaata tctgcattat gatgaagaaa ccagccatca gctgctgtgc 60 gataaatgcc cgccgggcac ctatctgaaa cagcattgca ccgcgaaatg gaaaaccgtg 120 tgcgcgccgt gcccggatca ttattatacc gatagctggc ataccagcga tgaatgcctg 180 tattgcagcc cggtgtgcaa agaactgcag tatgtgaaac aggaatgcaa ccgcacccat 240 aaccgcgtgt gcgaatgcaa agaaggccgc tatctggaag gcgaattttg cctgaaacat 300 cgcagctgcc cgccgggctt tggcgtggtg caggcgggca ccccggaacg caacaccgtg 360 tgcaaacgct gcccggatgg cttttttagc aacgaaacca gcagcaaagc gccgtgccgc 420 aaacatacca actgcagcgt gtttggcctg ctgctgaccc agaaaggcaa cgcgacccat 480 gataacattt gcagcggcaa cagcgaaagc acccagaaag aacgcaaatg ctgcgtggaa 540 tgcccgccgt gcccggcgcc gccggtggcg ggcccgagcg tgtttctgtt tccgccgaaa 600 ccgaaagata ccctgatgat tagccgcacc ccggaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg 660 agccatgaag atccggaagt gcagtttaac tggtatgtgg atggcgtgga agtgcataac 720 gcgaaaacca aaccgcgcga agaacagttt aacagcacct ttcgcgtggt gagcgtgctg 780 accgtggtgc atcaggattg gctgaacggc aaagaatata aatgcaaagt gagcaacaaa 840 ggcctgccgg cgccgattga aaaaaccatt agcaaaacca aaggccagcc gcgcgaaccg 900 caggtgtata ccctgccgcc gagccgcgaa gaaatgacca aaaaccaggt gagcctgacc 960 tgcctggtga aaggctttta tccgagcgat attgcggtgg aatgggaaag caacggccag 1020 ccggaaaaca actataaaac caccccgccg atgctggata gcgatggcag cttttttctg 1080 tatagcaaac tgaccgtgga taaaagccgc tggcagcagg gcaacgtgtt tagctgcagc 1140 gtgatgcatg aagcgctgca taaccattat acccagaaaa gcctgagcct gagcccgggc 1200 aaa 1203 <210> 104 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of 10.21 formatted as an IgG1 <400> 104 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccac cgtgaagatc 60 agctgcaagg tgtccggcta caccttcacc gacagcgtga tgaactgggt gcagcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg gatgggatgg atcgaccccg agtacggcag aaccgacgtg 180 gccgagaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcaccga caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccggaccaag 300 tacaacagcg gctacggctt cccctactgg ggccagggca caaccgtgac agtgtcctca 360 gctagcacca agggacccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420 ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcctgt caccgtgtct 480 tggaactctg gcgccctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagct ctagcctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660 aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaact gctgggaggc 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccaag cagggacgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctcgtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgagcctgag ccccggcaag 1350 <210> 105 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of 10.21 IgG2 <400> 105 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccac cgtgaagatc 60 agctgcaagg tgtccggcta caccttcacc gacagcgtga tgaactgggt gcagcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg gatgggatgg atcgaccccg agtacggcag aaccgacgtg 180 gccgagaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcaccga caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccggaccaag 300 tacaacagcg gctacggctt cccctactgg ggccagggca caaccgtgac agtgtcctca 360 gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccct gcagcagaag caccagcgag 420 agcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gacagtgagc 480 tggaacagcg gagccctgac ctccggtgta cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtact ccctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcaacttcgg cacccagacc 600 tacacctgca acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac cgtggagagg 660 aagtgctgcg tggagtgccc cccctgccca gcccccccag tggccggacc ctccgtgttt 720 ctgttccccc ccaagcccaa ggacaccctg atgatcagca ggacccccga ggtgacctgc 780 gtggtggtgg acgtgagcca cgaggatccg gaggtgcagt tcaactggta cgtggacggc 840 gtggaggtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggagc agtttaacag caccttcagg 900 gtggtgtccg tgctgaccgt ggtgcaccag gactggctga acggcaagga atacaagtgc 960 aaggtctcca acaagggcct gccagccccc atcgagaaaa ccatcagcaa gaccaagggc 1020 cagccacggg agccccaagt gtataccctg ccccccagcc gggaggagat gaccaagaac 1080 caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccatgct ggacagcgac 1200 ggcagcttct tcctgtactc caagctgaca gtggacaagt ccaggtggca gcagggcaac 1260 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg 1320 agcctgtccc ccggcaag 1338 <210> 106 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Polynucleotide sequence of 10.21 IgG3 <400> 106 gaagtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgccac cgtgaagatc 60 agctgcaagg tgtccggcta caccttcacc gacagcgtga tgaactgggt gcagcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg gatgggatgg atcgaccccg agtacggcag aaccgacgtg 180 gccgagaagt tccagggcag agtgaccatc accgccgaca ccagcaccga caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc ccggaccaag 300 tacaacagcg gctacggctt cccctactgg ggccagggca caaccgtgac agtgtcctca 360 gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg ctggcgccgt gcagccgcag caccagcggc 420 ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc 480 tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg catacctttc cggcggtgct gcagagcagc 540 ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc 600 tatacctgca acgtgaacca taaaccgagc aacaccaaag tggataaacg cgtggaactg 660 aaaaccccgc tgggcgatac cacccatacc tgcccgcgct gcccggaacc gaaaagctgc 720 gataccccgc cgccgtgccc gcgctgcccg gaaccgaaaa gctgcgatac cccgccgccg 780 tgcccgcgct gcccggaacc gaaaagctgc gataccccgc cgccgtgccc gcgctgcccg 840 gcgccggaac tgctgggcgg cccgagcgtg tttctgtttc cgccgaaacc gaaagatacc 900 ctgatgatta gccgcacccc ggaagtgacc tgcgtggtgg tggatgtgag ccatgaagat 960 ccggaagtgc agtttaaatg gtatgtggat ggcgtggaag tgcataacgc gaaaaccaaa 1020 ccgcgcgaag aacagtttaa cagcaccttt cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcat 1080 caggattggc tgaacggcaa agaatataaa tgcaaagtga gcaacaaagc gctgccggcg 1140 ccgattgaaa aaaccattag caaaaccaaa ggccagccgc gcgaaccgca ggtgtatacc 1200 ctgccgccga gccgcgaaga aatgaccaaa aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaaa 1260 ggcttttatc cgagcgatat tgcggtggaa tgggaaagca gcggccagcc ggaaaacaac 1320 tataacacca ccccgccgat gctggatagc gatggcagct tttttctgta tagcaaactg 1380 accgtggata aaagccgctg gcagcagggc aacattttta gctgcagcgt gatgcatgaa 1440 gcgctgcata accgctttac ccagaaaagc ctgagcctga gcccgggcaa a 1491 <210> 107 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Glycosylated (T106T) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation A145X where X can be any amino acid selected from D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y <220> <221> VARIANT <222> (145)..(145) <223> Xaa can be any amino acid selected from D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y <400> 107 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Xaa Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 108 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Glycosylated (T106T) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R144X where X can be any amino acid selected from A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V, Y <220> <221> VARIANT <222> (144)..(144) <223> Xaa can be any amino acid selected from A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V, Y <400> 108 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Xaa 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 109 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Glycosylated (T106T) human interferon alpha-2-b comprising attenuating mutation R33X, where X can be any amino acid selected from K, A, Q <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any amino acid selected from K, A, Q <400> 109 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Xaa His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg 130 135 140 Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser 145 150 155 160 Leu Arg Ser Lys Glu 165 <210> 110 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Human interferon alpha-2-b comprising with deletion of amino acid at position 106 and comprising attenuating mutation A144X where X, can be any amino acid selected from D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y <220> <221> VARIANT <222> (144)..(144) <223> Xaa can be any amino acid selected from D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, Y <400> 110 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln 35 40 45 Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu 85 90 95 Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu 100 105 110 Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr 115 120 125 Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Xaa 130 135 140 Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu 145 150 155 160 Arg Ser Lys Glu <210> 111 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.21 formatted as an IgG1 incorporating substitutions M255Y, S257T, T259E <400> 111 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile 245 250 255 Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 112 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VH sequence of 10.21 formatted onto an IgG2 backbone incorporating substitutions A330S and P331S <400> 112 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Val Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Tyr Gly Arg Thr Asp Val Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Lys Tyr Asn Ser Gly Tyr Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val 210 215 220 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Claims (25)

  1. 제1 및 제2 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드로서, 제1 도메인은 세포 표면에 회합된 항원에 결합하는 폴리펩티드 리간드를 포함하고, 제2 도메인은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 서열을 갖는 아글리코실화된 인터페론 α2b(IFNα2b)를 포함하며, 상기 아글리코실화된 IFNα2b는 아글리코실화된 IFNα2b의 활성을 약화시키는 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실을 추가로 포함하는 것인 융합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이, 106번 위치의 잔기가 A인 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 L15A, R22A, R23A, S25A, L26A, F27A, L30A, L30V, K31A, D32A, R33A, R33K, R33Q, H34A, Q40A, D114R, L117A, R120A, R120E, R125A, R125E, K131A, E132A, K133A, K134A, M148A, R149A, S152A, L153A, N156A, (L30A, H57Y, E58N 및 Q61S), (M148A, H57Y, E58N 및 Q61S), (L153A, H57Y, E58N 및 Q61S), (R144A, H57Y, E58N 및 Q61S), (N65A, L80A, Y85A 및 Y89A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 D114A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 L117A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 R120A), (Y85A, Y89A 및 D114A), (D114A 및 R120A), (L117A 및 R120A), (L117A, R120A 및 K121A), (R120A 및 K121A), (R120E 및 K121E), 144번 위치의 R의 A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환, 145번 위치의 A의 D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환, 및 잔기 L161 내지 E165의 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 약화 돌연변이(들)에 의해 변형된 서열식별번호: 1인 융합 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 L15A, R22A, R23A, S25A, L26A, F27A, L30A, L30V, K31A, D32A, R33A, R33K, R33Q, H34A, Q40A, D113R, L116A, R119A, R119E, R124A, R124E, K130A, E131A, K132A, K133A, M147A, R148A, S149A, L152A, N155A, (L30A, H57Y, E58N 및 Q61S), (M147A, H57Y, E58N 및 Q61S), (L152A, H57Y, E58N 및 Q61S), (R143A, H57Y, E58N 및 Q61S), (N65A, L80A, Y85A 및 Y89A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 D113A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 L116A), (N65A, L80A, Y85A, Y89A 및 R1190A), (Y85A, Y89A 및 D113A), (D113A 및 R119A), (L116A 및 R119A), (L116A, R119A 및 K120A), (R119A 및 K120A), (R119E 및 K120E), 143번 위치의 R의 A, D, E, G, H, I, K, L, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환, 144번 위치의 A의 D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, S, T, V 또는 Y로의 치환, 잔기 L160 내지 E164의 결실로 이루어진 군으로부터 선택되는 약화 돌연변이(들)에 의해 변형된 서열식별번호: 2인 융합 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 아글리코실화된 IFNα2b의 서열이 서열식별번호: 3 내지 30 및 서열식별번호: 32 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면에 회합된 항원이 CD38, CD138, RANK-리간드, HM1.24, CD56, CS1, CD20, CD74, IL-6R, Blys(BAFF), BCMA, HLA-SR, HLA-DR, 키니노젠, 베타2 마이크로글로불린, FGFR3, ICAM-1, 매트립타제, CD52, EGFR, GM2, 알파4-인테그린, IFG-1R, KIR, CD3, CD4, CD8, CD24, CD44, CD69, CD71, CD79, CD83, CD86, CD96, HLA, PD-1, ICOS, CD33, CD115, CD11c, CD19, CD52, CD14, FSP1, FAP, PDGFR 알파, PDGFR 베타, ASGR1, ASGR2, FSP1, RTI140/Ti-알파, HTI56, VEGF 수용체, CD241 RCHE 유전자의 생성물, CD117(c-kit), CD71(트랜스페린 수용체), CD36(트롬보스폰딘 수용체), CD34, CD45RO, CD45RA, CD115, CD168, CD235, CD236, CD237, CD238, CD239 및 CD240으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 리간드가 항체 또는 이의 항원 결합부인 융합 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 리간드가 CD38에 결합하는 항체인 융합 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 항체의 VH 서열이 서열식별번호: 48 내지 56 및 58로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 폴리펩티드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 항체의 VL 서열이 서열식별번호: 81, 82 및 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인이 펩티드 결합을 통해 제2 도메인에 연결되는 것인 융합 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인이 펩티드 결합을 통해 직접 제2 도메인에 연결되는 것인 융합 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인의 C 말단이 제2 도메인의 N 말단에 연결되는 것인 융합 폴리펩티드.
  15. 서열식별번호: 31, 61 내지 77, 83 및 87로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 서열식별번호: 81, 82 및 84로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  16. 서열식별번호: 87 및 서열식별번호: 81을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 융합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  18. 피험체의 종양을 치료하는 방법으로서, 상기 피험체에게 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 융합 폴리펩티드 또는 제17항에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 융합 폴리펩티드의 제1 도메인이 상기 종양의 세포에 결합하는 것인 피험체의 종양을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 종양이 다발성 골수종 또는 비호지킨 림프종으로부터 선택되는 것인 피험체의 종양을 치료하는 방법.
  20. 종양 치료에 있어서의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 융합 폴리펩티드의 용도로서, 상기 융합 폴리펩티드의 제1 도메인이 상기 종양의 세포에 결합하는 것인 용도.
  21. 제20항에 있어서, 암 치료에 사용되고, 상기 암이 다발성 골수종 또는 비호지킨 림프종인 융합 폴리펩티드의 용도.
  22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 융합 폴리펩티드(들)를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드(들).
  23. 제22항의 폴리뉴클레오티드(들) 중 하나 이상을 포함하는 벡터.
  24. 제23항의 벡터를 포함하는 형질전환된 세포.
  25. 포유동물 세포에서, 감소된 불균질성 및/또는 강화된 FcRn 결합 및/또는 강화된 표적 선택성을 갖는 폴리펩티드 리간드-약화된 IFNα2b 융합 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드 리간드-약화된 IFNα2b 융합 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 포유동물 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 IFNα2b 서열의 T106은, 발현될 때 융합 단백질의 IFNα2b 성분이 아글리코실화되도록 다른 아미노산으로 치환되거나 결실되어 있는 것인, 포유동물 세포에서 폴리펩티드 리간드-약화된 IFNα2b 융합 폴리펩티드를 생성하는 방법.
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