KR20170077286A - 연속 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 또는 바이러스를 생산하는 방법 - Google Patents

연속 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 또는 바이러스를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 특히, 혈청-없는 또는 화학적으로 규정된 배지에서 포유동물 세포, 예를 들면, 유전적으로 변형되는 세포의 배양을 향상시키기 위하여, 관류 개방 시스템 및 키모스탯 개방 시스템의 일정한 이점을 결합하는 키모스탯-유사 연속 세포 배양 시스템이 기술된다. 본 명세서에서 기술되는 연속 배양 시스템은 연속 세포 배양 시스템에서 포유동물 세포를 배양하는 것을 수반하고, 상기 시스템은 세포 유지 장치를 포함하고, 여기서 상기 세포 배양 시스템은 대략 2 d-1 이하의 희석 속도 (D), 그리고 대략 2X107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도를 갖는다. 또한, 본 명세서에서는 연속 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 생산하는 방법이 기술되고, 상기 방법은 연속 세포 배양 시스템에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 상기 시스템은 세포 유지 장치를 포함하고, 여기서 상기 세포 배양 시스템은 대략 2 d-1 이하의 희석 속도 (D), 그리고 대략 2X107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도를 갖고; 그리고 상기 세포 배양 시스템의 배지로부터 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 회수하는 단계를 포함한다.

Description

연속 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 또는 바이러스를 생산하는 방법{METHOD OF PRODUCING A POLYPEPTIDE OR VIRUS OF INTEREST IN A CONTINUOUS CELL CULTURE}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2009년 7월 31일 제출된 U.S. 특허가출원 No. 61/230,313에 우선권을 주장하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 포유동물 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 또는 바이러스를 생산하기 위한 연속 세포 배양 전략에 관계한다. 본 명세서에서 기술되는 연속 세포 배양 전략은 키모스탯 (chemostat)과 관류 (perfusion) 배양 기술의 이점을 결합한다.
본 발명의 배경기술
목적 폴리펩티드 또는 바이러스를 생산하는 능력은 생물공학 산업에 더욱 중요해지고 있다. 지난 20년동안, 생물공학에서 진전은 백신 및 약제로서 잠재적 치료적 유용성을 갖는 다수의 폴리펩티드와 바이러스에 관심을 유발시켰다. 대규모 생산은 일반적으로, 예로써 세균, 효모, 곤충, 포유동물, 또는 기타 세포 유형에서 목적 폴리펩티드 또는 바이러스의 재조합 생산을 필요로 한다. 특히, 포유동물 배양에서 목적 폴리펩티드 또는 바이러스의 생산은 예로써, 이황화물-의존성 접힘 (folding)과 당화 (glycosylation)에 의해 복잡한 단백질 구조를 번역후 가공하는 포유동물 세포의 능력으로 인하여, 세균 또는 기타 하등 미생물 숙주에서 생산보다 이점을 갖는다.
포유동물 세포는 일반적으로, 2가지 양식 중에서 한 가지로 시험관내에서 증식된다: 대부분의 배양 동안 현탁 상태에서 자유롭게 성장하는 비-고정 의존성 세포로서; 또는 증식 (즉, 단층 유형의 세포 성장)을 위하여 고형 기질에 부착을 요하는 고정-의존성 세포로서. 양쪽 유형의 성장을 조화시키는 미립담체 시스템이 개발되었다. 가령, 고정-의존성 세포는 느린 교반에 의해 성장 배지에서 현탁된 작은 고형 입자를 포함하는 미립담체 시스템에서 증식되었다. 이러한 시스템은 고정-의존성 세포가 현탁된 입자의 표면에 부착하고, 그리고 합류 수준 (confluency)으로 성장할 수 있도록 하고, 반면 미립담체는 성장 배지에서 현탁된 상태로 남아있다. 대안으로, 마크로다공성 미립담체는 예로써, 이런 미립담체의 표면에 대한 세포의 비-특이적 부착에 의해 생물반응장치에서 비-고정 의존성 세포를 내포하는데 이용될 수 있다. 비-고정 의존성 세포 또는 고정-의존성 세포의 미립담체 현탁 배양은 세포 및 세포 산물의 대규모 생산에 가장 폭넓게 이용되는 수단이다.
대규모 현탁 배양은 폐쇄 시스템, 예를 들면, 회분식 또는 유가식 폐쇄 시스템에서 수행될 수 있는데, 이들은 개방 시스템보다 수행 및 정률 증가가 더욱 간단하다. 전형적으로, 폐쇄 시스템에서, 세포, 산물, 및/또는 폐기물은 전혀 제거되지 않는다(비록 공기 (가령, 산소)가 첨가되고 CO2가 통기에 의해 제거되긴 하지만). 회분식 성장 시스템에서 관찰되는 전형적인 성장 프로필은 유도기 (lag phase), 그 이후에 지수기 (exponential phase), 정지기 (stationary phase), 그리고 쇠퇴기 (decline phase)를 수반한다. 이런 회분식 시스템에서, 환경은 지속적으로 변하는데, 그 이유는 영양소가 고갈되고 대사산물이 축적되기 때문이다. 유가식 시스템에서, 핵심 영양소는 비록 세포, 산물, 부산물, 그리고 독성 대사산물을 비롯한 폐기물이 제거되지 않지만, 성장 주기를 연장시키기 위하여 시스템 내로 지속적으로 공급된다. 따라서 회분식 또는 유가식 시스템에 의한 목적 폴리펩티드 또는 바이러스의 생산은 세포 및 유해 물질, 예를 들면, 독성 대사산물의 축적에 의해 제한된다.
대규모 현탁 배양은 또한, 개방 시스템, 예를 들면, 관류 시스템 또는 키모스탯 시스템에서 수행될 수 있다. 관류 시스템에서, 새로운 배지는 배양 내내 관류되는 반면, 세포는 다양한 세포 유지 장치로 유지된다. 세포 유지 장치의 유형에는 예로써, 미립담체, 미세 그물눈 스핀 필터 (fine mesh spin filter), 유공 섬유 (hollow fiber), 플랫 플레이트 막 필터 (flat plate membrane filter), 정착 튜브 (settling tube), 초음파 세포 유지 장치 등이 포함된다. 전형적으로, 관류 배양은 >90%의 세포 유지 비율을 갖도록 설계되고 작동되는 세포 유지 장치로, 세포 밀도를 최대로 증가시키도록 설계된다. 이런 배양은 전형적으로, >2X107의 세포 밀도에 도달하는데, 이것은 대략 2.0 d-1보다 큰 희석 속도 (dilution rate)에서 세포 배양 배지 공급으로 제공되어야 한다. 하지만 이러한 시스템의 정상 상태 (steady state)는 바이오매스 (biomass)에서 통제되지 않은 증가로 인하여 지속되기 어렵고, 그리고 불변하는 생산 조건은 통제 및/또는 달성하기 어렵다.
키모스탯 시스템은 배지의 연속 유입 및 세포와 산물의 유출로 작동된다. 키모스탯 시스템에서, 세포 유지 장치는 존재하지 않고, 따라서 생물반응장치에서 세포의 농도 및 생물반응장치로부터 수확된 상층액에서 세포의 농도가 실질적으로 동일하다. 전형적으로, 배양 배지는 미리 결정된 불변 속도로 반응장치에 공급되고, 배양의 낮은 희석 속도 (전형적으로 0.3 d-1 내지 0.8 d-1)를 지속한다. 세포의 유실을 예방하기 위하여, 희석 속도는 일반적으로, 세포의 최대 비 성장 속도 (specific growth rate)보다 낮고, 그리고 때때로 이와 동등하도록 선택된다. 세포, 세포 산물, 부산물, 폐기물 등을 내포하는 배양액은 동일한 속도에서, 또는 실질적으로 동일한 속도로 제거된다. 키모스탯 시스템은 전형적으로, 높은 수준의 통제를 제공하는데, 그 이유는 배양이 평형을 유지하기 때문이다, 다시 말하면, 희석 속도에 동등한 비 성장 속도에서 정상 상태에 도달하기 때문이다. 이러한 평형상태 (equilibration)는 세포, 대사산물, 폐기물, 발현된 산물 (가령, 분비된 단백질) 등의 농도를 결정한다. 키모스탯 시스템에서 비 성장 속도는 전형적으로, 적어도 한 가지 제한 기질 (limiting substrate)로 인하여 최대 성장 속도보다 낮다. 하지만, 일부 시스템에서, 정상 상태는 예로써, 키모스탯 배양의 터비도스탯 시스템에서 바이오매스를 통제하고 조정함으로써 최대 비 성장 속도에서 지속될 수 있다. 바람직하게는, 이런 키모스탯 배양은 생물반응장치 전반에서 세포의 균질한 분포 (가령, 단일 세포 현탁)를 내포한다. 하지만, 관류 시스템과 비교하여, 키모스탯 시스템은 전형적으로, 더욱 낮은 세포 밀도를 유발한다. 게다가, 키모스탯 시스템의 선천적 단점은 세포의 공급이 생물반응장치 시스템에서 세포 밀도와 독립적으로 통제될 수 없다는 것이다.
혈청-없는 및/또는 화학적으로 규정된 배지에서 재조합 단백질을 생산하기 위한 현탁 세포 배양 역시 혈청-없는 및/또는 화학적으로 규정된 배지가 전형적으로, 혈청을 내포하는 배지에서 성장된 세포와 비교하여 더욱 느린 성장 속도를 지원한다는 점에서 제한된다. 배양 수단에서 하향된 성장 속도는 목적 폴리펩티드 또는 바이러스의 생산을 하향시켰다.
따라서 예로써, 적은 비용으로 증가된 생산에 대한 요구를 충족시키기 위하여, 목적 폴리펩티드 또는 바이러스의 생산을 계속할 수 있는 세포 배양 시스템의 개발, 특히 연장된 기간 동안 계속될 수 있는 배양이 여전히 요구된다.
본 발명에서는 이런 요구 및 기타 요구를 충족시키는 것을 목적으로 하는 방법과 조성물을 제시한다.
요약
본 명세서에서는 포유동물 세포, 특히 비-고정 의존성 세포에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스의 생산을 위한 연속 세포 배양이 개시된다. 본 명세서에서 개시되는 연속 세포 배양 방법은 관류 개방 시스템 및 키모스탯 개방 시스템의 이점을 결합하고, 그리고 특히 혈청-없는 또는 화학적으로 규정된 배지에서 증가된 세포 밀도와 세포 성장을 가능하게 한다. 증가된 세포 밀도와 세포 성장은 목적 단백질 및/또는 바이러스의 향상된 수율을 제공하면서 공정 파라미터에서 더욱 세심한 통제를 가능하게 한다.
따라서 본 발명의 한 측면은 연속 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 산출하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 연속 세포 배양 시스템에서 이러한 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 여기서 세포 배양 시스템은 세포 유지 장치를 포함하고 대략 2 d-1 이하의 희석 속도 및 대략 2X107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도를 갖고; 그리고 세포 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 이들 세포는 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 재조합 방식으로 발현하도록 유전적으로 변형된다.
일부 구체예에서, 이러한 세포 유지 장치는 전형적인 세포 유지 장치보다 세포를 유지하는 능력이 덜하도록 선택된다. 일부 구체예에서, 세포 유지 장치는 대략 90% 이하, 대략 85% 이하, 대략 80% 이하, 또는 대략 75% 이하의 세포 유지 비율을 산출한다. 일부 구체예에서, 세포 유지 장치는 마크로다공성 미립담체, 예를 들면, 셀룰로오스-기초된 입자를 포함한다.
희석 속도와 세포 밀도는 바람직하게는, 선택된 값 또는 범위에서 지속된다. 일부 구체예에서, 희석 속도는 대략 1 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.1 내지 대략 1.0 d-1이다. 일부 구체예에서, 세포 밀도는 대략 1X107개 세포/㎖ 이하이다. 일부 구체예에서, 세포 배양 시스템의 희석 속도와 비 성장 속도의 비율 (D/μ)은 선택된 값 또는 범위에서 지속된다. 일부 바람직한 구체예에서, 세포 배양 시스템은 대략 1 이상, 예를 들면, 대략 1.2 내지 대략 5.0, 또는 대략 1.8 내지 대략 3의 희석 속도와 비 성장 속도의 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 비 성장 속도는 0.2 d-1 내지 0.8 d-1에서 지속된다.
본 명세서에서 기술되는 연속 세포 배양 시스템의 일정한 구체예의 이점은 배양이 연장된 기간 동안 지속될 수 있다는 것이다. 일부 구체예에서, 예로써, 희석 속도 및/또는 세포 밀도는 연속 세포 배양 시스템에서 세포가 배양되는 시간의 적어도 대략 80% 동안 지속된다. 일부 구체예에서, 세포는 세포 배양 시스템에서 20일 이상, 바람직하게는 40일 이상, 그리고 더욱 바람직하게는, 50일 이상 배양되고, 예로써 잠재적으로 적은 비용으로 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스의 증가된 생산을 가능하게 한다.
연속 세포 배양 시스템의 일정한 구체예의 다른 이점은 전형적인 키모스탯 배양과 비교하여, 더욱 높은 세포 밀도에 기인하는 부피당 생산성 (volumetric productivity)에서 증가이다. 가령, 특정 바람직한 구체예에서, 부피당 생산성은 70%, 90%, 또는 그 이상 증가한다. 연속 세포 배양 시스템의 일정한 구체예의 또 다른 이점은 예로써, 배양 단위에서 감소된 체류 시간에 기인하는 회수되는 단백질의 향상된 비 활성인데, 이는 단백질의 안정성, 구조 및/또는 기능에 대한 유익한 효과를 가질 수 있다.
본 명세서에서 기술되는 연속 세포 배양 시스템의 일정한 구체예의 다른 이점은 상기 시스템이 대규모 생산을 위하여 정률 증가될 수 있다는 것이다. 다시 말하면, 표준 키모스탯 배양 시스템과 비교하여 증가된 세포 밀도 및/또는 세포 성장을 가능하게 함으로써, 본 명세서에서 개시되는 연속 세포 배양 시스템은 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스의 상업적 규모 생산을 제공한다. 가령, 일부 구체예에서, 세포는 적어도 대략 250 ℓ의 배지, 예를 들면, 적어도 대략 500 ℓ, 또는 적어도 대략 1,000 ℓ의 배지에서 배양된다. 일부 바람직한 구체예에서, 세포는 혈청-없는 배지 및/또는 화학적으로 규정된 배지에서 배양된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 예로써, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 연속 세포 배양 시스템에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스의 생산을 위하여 세포를 순응시키는 전-배양 단계를 더욱 포함한다. 따라서 일부 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 배양 단계에 앞서, 예로써 배양이 적절한 부피에 도달할 때까지 세포를 현탁 상태에서 전-배양하는 단계를 더욱 포함한다.
특정 구체예에서, 목적 폴리펩티드는 트롬보스폰딘 타입 1 모티프 13을 갖는 디스인테그린-유사 및 금속단백분해효소 (ADAMTS13) 단백질이다. 일부 구체예에서, 포유동물 세포는 CHO 세포, 예를 들면, ADAMTS13 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형된 CHO 세포이다. 특정 구체예에서, 연속 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 생산하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 (a) 연속 세포 배양 시스템에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 비-고정 의존성 포유동물 세포를 배양하는 단계, 여기서 세포 배양 시스템은 90% 이하의 세포 유지 비율을 갖는 세포 유지 장치를 포함하고, 그리고 0.1 내지 1.0 d-1의 희석 속도 (D) 및 1 X 107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도를 갖고; 그리고 (b) 세포 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 회수하는 단계를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 연속 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 생산하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 (a) 연속 세포 배양 시스템에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 비-고정 의존성 세포 CHO 세포를 배양하는 단계, 여기서 세포 배양 시스템은 90% 이하의 세포 유지 비율을 갖는 마크로다공성 미립담체 세포 유지 장치를 포함하고, 그리고 0.1 내지 1.0 d-1의 희석 속도 (D) 및 1 X 107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도를 갖고; 그리고 (b) 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 연속 세포 배양에서 ADAMTS13을 생산하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 (a) 연속 세포 배양 시스템에서 재조합 ADAMTS13 단백질을 발현하는 비-고정 의존성 세포 포유동물 세포를 배양하는 단계, 여기서 세포 배양 시스템은 90% 이하의 세포 유지 비율을 갖는 마크로다공성 미립담체 세포 유지 장치를 포함하고, 그리고 0.1 내지 1.0 d-1의 희석 속도 (D) 및 1 X 107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도를 갖고; 그리고 (b) 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 ADAMTS13 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 연속 세포 배양에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 생산하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 (a) 연속 세포 배양 시스템에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 비-고정 의존성 세포 포유동물 세포를 배양하는 단계, 여기서 세포 배양 시스템은 90% 이하의 세포 유지 비율을 갖는 세포 유지 장치를 포함하고, 그리고 0.1 내지 1.0 d-1의 희석 속도 (D), 1 X 107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도, 그리고 1.2 내지 5의 희석 속도와 비 성장 속도의 비율 (D/μ)을 갖고; 그리고 (b) 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스 세포를 회수하는 단계를 포함하고; 게다가 이들 세포는 세포 배양 시스템에서 50일 이상 동안 배양되고, 그리고 희석 속도, 세포 밀도, 그리고 희석 속도와 비 성장 속도의 비율은 각각, 세포가 세포 배양 시스템에서 배양되는 시간의 적어도 80% 동안 지속된다.
본 발명의 다른 측면은 본 명세서에서 기술되는 방법에 따라 생산된 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 포함하는 조성물, 예를 들면, 본 발명에 따라 생산된 재조합 ADAMTS13 단백질을 포함하는 조성물에 관계한다.
본 발명의 이들 측면 및 기타 측면은 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
상세한 설명
본 명세서에서 기술되는 바와 같은 연속 세포 배양 시스템은 포유동물 세포의 관류 배양 및 키모스탯 배양 둘 모두의 일부 장점을 결합시킨다. 앞서 기술된 바와 같이, 관류 배양 시스템은 세포 배양 내내 관류하는 새로운 배지로 작동되고, 반면 세포는 세포 유지 장치를 이용하여 유지된다; 키모스탯 배양 시스템은 세포 유지 장치 없이, 배지의 연속 유입 및 세포와 산물의 유출로 작동된다.
본 명세서에서, "관류"는 세포 집단을 통해 또는 세포 집단 위에서 정상 속도 (steady rate)로 생리학적 영양소 용액의 연속 흐름을 지칭한다. 관류 시스템이 일반적으로, 배양 단위 내에서 세포의 유지를 수반하기 때문에, 관류 배양은 특징적으로, 상대적으로 높은 세포 밀도를 갖지만, 이들 배양 조건은 지속 및 통제가 어렵다. 이에 더하여, 세포가 배양 단위 내에서 높은 밀도로 성장되고, 이후 높은 밀도에서 유지되기 때문에, 성장 속도는 전형적으로, 시간의 흐름에서 지속적으로 감소하고, 세포 성장의 후기 지수기 또는 심지어 정지기로 이어진다. 대조적으로, 본 명세서에서, "키모스탯"은 예로써, 키모스탯 시스템에서처럼 세포 배양을 통해, 회수된 배지와 함께 세포 및 기타 산물의 연속 유출과 결합된 생리학적 영양소 용액의 연속 유입을 지칭한다. 하지만, 세포가 지속적으로 제거되기 때문에, 이러한 키모스탯 시스템은 전형적으로, 단지 낮은 세포 밀도만을 지원한다.
본 명세서에서 기술되는 연속 배양 전략은 일반적으로, 포유동물 세포, 예를 들면, 비-고정 의존성 세포를 배양하고, 연속 세포 배양 시스템에서 생산 국면 (production phase) 동안 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 것을 포함한다. "비-고정 의존성 세포"는 증식 동안 고형 기질에 부착되거나 고정되는 것과 대조적으로, 대부분의 배양 동안 현탁 상태에서 자유롭게 증식하는 세포를 의미한다. 연속 세포 배양 시스템은 관류 시스템에 이용되는 것과 유사하지만, 바람직하게는 관류 배양에서보다 더욱 낮은 비율의 세포가 유지되도록 세포의 상당 부분의 연속 제거를 가능하게 하는 세포 유지 장치를 포함할 것이다. "세포 유지 장치"는 세포 배양 동안 특정 위치에서 세포, 특히 비-고정 의존성 세포를 유지할 수 있는 임의의 구조를 의미한다. 무제한적 실례에는 생물반응장치 내에서 비-고정 의존성 세포를 유지할 수 있는 미립담체, 미세 그물눈 스핀 필터, 유공 섬유, 플랫 플레이트 막 필터, 정착 튜브, 초음파 세포 유지 장치 등이 포함된다. 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스 (가령, 재조합 폴리펩티드 및/또는 재조합 바이러스)는 세포 배양 시스템, 예를 들면, 세포 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 회수될 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스 (가령, 재조합 폴리펩티드 및/또는 재조합 바이러스)를 생산하는 방법에는 키모스탯-유사 배양 시스템을 제공하고 세포 유지 장치를 이용하는 세포 배양 방법이 포함된다. 이러한 시스템은 연속 세포 배양 시스템에서 세포 유지 장치로 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 세포 유지 장치의 역할은 새로운 배지로 소모된 배양 배지의 보충 동안 생존 세포의 일부분, 바람직하게는 상당 부분이 배양으로부터 제거되는 것을 예방하는 것이다. 성공적인 세포 유지 장치는 하기 필요 조건 중에서 가능한 많은 것을 충족해야 한다: (1) 최소 세포 손상 또는 세포 성장과 생산성에 대한 효과, (2) 단지 생존 세포의 선별적 유지 (비-생존 세포는 바람직하게는, 배양으로부터 제거되는데, 그 이유는 이들이 배양 환경으로 독성 대사산물을 방출하기 때문이다), (3) 오랜 배양 기간 동안 중단없는 작동, (4) 낮은 에너지 소비, (5) 작동 및 정비의 간편, (6) 대규모 생산 단위를 위한 정률 증가 능력, (7) 밀집된 구조, 그리고 (8) 비용 효율성.
특히 바람직한 구체예에서, 이용된 세포 유지 장치는 세포의 부분적인 유지를 허용한다. 세포 유지 장치 및/또는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 다수는 전통적인 침강 (sedimentation), 원심분리 (centrifugation), 및/또는 여과 (filtration) 기술에 기초된다. 세포 유지 장치의 무제한적 실례에는 미립담체, 스핀 필터, 예를 들면, 미세 그물눈 스핀 필터, 유공 섬유, 플랫 플레이트 막 필터, 정착 튜브, 초음파 세포 유지 장치, 중력 침강기 (gravity settler), 원심분리기, 음향 세포 필터 (acoustic cell filter), 유전이동 (dielectrophoresis)-기초된 세포 분리기 등이 포함된다 (참조: U.S. Patent No. 5,019,512; 5,626,734, 이들은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다).
본 명세서에서 기술되는 배양 시스템의 한 구체예에 따라, 미립담체가 세포 유지 장치로서 이용될 수 있다. 미립담체는 세포 유지를 보조하기 위하여 비-고정 의존성 세포가 고정될 수 있는 저비용 확장성 표면으로서 기능할 수 있다. 본 명세서에서, "미립담체"는 바람직하게는, 세포에 현저한 전단 손상 (shear damage)을 유발하지 않는 교반 속도 (stirring rate)로, 현탁 배양에 이용될 수 있을 만큼 작은 입자를 지칭한다. 미립담체는 고형이거나, 다공성이거나, 또는 다공성 코팅을 갖는 고형 코어를 가질 수 있다. 미립담체는 예로써, 제한 없이 셀룰로오스 또는 덱스트란-기초되고, 그리고 그들의 표면 (다공성 담체의 경우에 외부와 내부 표면)이 양으로 하전될 수 있다. 미립담체에 관한 추가의 상세는 예로써, WO 02/29083에서 확인할 수 있고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
한 구체예에서, 미립담체는 마크로다공성 미립담체이다. 본 명세서에서, "마크로다공성 미립담체"는 하기 특성을 갖는 입자, 예를 들면, 셀룰로오스-기초된 입자를 지칭한다: (a) 이들은 바람직하게는, 세포에 현저한 전단 손상을 유발하지 않는 교반 속도로, 현탁 배양에 이용될 수 있을 만큼 작다; 그리고 (b) 이들은 세포가 내부 공간으로 이동할 수 있도록 할 만큼 충분한 크기의 구멍과 내부 공간을 갖는다. 이들의 표면 (외부와 내부)은 한 구체예에서, 양으로 하전될 수 있다.
한 구체예에서, 담체는 (a) 대략 150 내지 대략 350 ㎛의 전체 입자 직경을 갖고; (b) 대략 15 내지 대략 40 ㎛의 평균 구멍 개방 직경을 갖는 구멍을 보유하고; 그리고 (c) 대략 0.8 내지 2.0 meq/g의 양성 전하 밀도를 갖는다. 일부 구체예에서, 양성 전하는 DEAE (N,N,-디에틸아미노에틸) 기에 의해 제공된다. 유용한 마크로다공성 미립담체에는 제한 없이, CYTOPORE 1TM 및 CYTOPORE 2TM (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)이 포함된다. 특히 유용한 마크로다공성 미립담체는 CYTOPORE 2TM 담체인데, 이들은 230 ㎛의 평균 입자 직경, 30 ㎛의 평균 구멍 크기, 그리고 1.8 meq/g의 양성 전하 밀도를 갖는다.
일부 구체예에서, 이들 배양 단위는 교반된다. 교반은 당분야에 공지된 바와 같이, 셰이킹 (shaking), 스터링 (stirring), 락킹 (rocking), 비브레이팅 (vibrating) 등을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 교반은 배플 (baffle)이 구비된 Rushton 타입 임펠러 (impeller)로 달성된다. 배플은 대략 140 rpm으로 작동되는데, 이는 대략 40 W/m3의 비 파워/부피 입력 (specific power/volume input)에 상응한다. 일부 구체예에서, 비 파워/부피 입력은 대략 40 W/m3 이상, 예를 들면, 대략 50 W/m3, 대략 60 W/m3, 대략 70 W/m3, 대략 80 W/m3 또는 그 이상이다. 다른 속도는 이용되는 특정 세포 또는 배양에 따라 적절한 경우에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 기술되는 바와 같은 미립담체의 농도는 예로써, 희석 속도 및 세포 밀도를 특정 범위에서 지속하는데 도움이 되도록 일반적으로 낮다. 한 구체예에서, 배양 단위는 0.05-1.0 g/ℓ의 범위에서 최종 미립담체 농도에 상응하는 양의 미립담체를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 최종 미립담체 농도는 대략 0.05-0.1 g/ℓ이다. 한 구체예에서, 최종 미립담체 농도는 대략 0.1-0.25 g/ℓ이다. 다른 구체예에서, 최종 미립담체 농도는 대략 0.25-0.5 g/ℓ이다. 다른 구체예에서, 최종 미립담체 농도는 대략 0.5-0.75 g/ℓ이다. 다른 구체예에서, 최종 미립담체 농도는 대략 0.75-1.0 g/ℓ이다. 다른 구체예에서, 담체 농도는 예로써, 세포 밀도 및 희석 속도를 미리 결정된 범위 내에서 조정하기 위하여 연속 배양 동안 증가되거나 감소될 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 연속 세포 배양 시스템은 바람직한 희석 속도 (D) 및 바람직한 세포 밀도를 갖는다. 특히, 희석 속도 및 세포 밀도는 미리 결정된 값에서 또는 미리 결정된 범위 내에서 지속된다. 게다가 본 명세서에서 개시되는 연속 세포 배양 시스템은 전체 공정 기간 동안 최소 비 성장 속도 또는 미리 결정된 범위의 비 성장 속도를 가질 수 있다.
희석 속도 (D)는 배양의 부피로 나눗셈된, 하루에 공급되는 배지의 부피를 지칭한다. 비록 본 명세서에서 기술되는 연속 세포 배양 시스템이 세포 유지를 수반하지만, 연속 세포 배양 시스템의 희석 속도는 일반적으로 관류 배양의 희석 속도보다 낮다, 예를 들면, 대략 2 희석 부피/day (2 d- 1)보다 낮다. 한 구체예에서, 희석 속도는 대략 0.2 d-1 이상 내지 대략 2.0 d-1 이하에서 지속된다. 다른 구체예에서, 희석 속도는 대략 2.0 d-1 이하, 예를 들면, 대략 1.8 d-1 이하, 예를 들면, 대략 1.5 d-1 이하, 예를 들면, 대략 1.2 d-1 이하 등에서 지속된다. 다른 구체예에서, 희석 속도는 대략 1.0 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.9 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.8 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.7 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.6 d-1 이하 등에서 지속된다. 다른 구체예에서, 희석 속도는 대략 0.2 d-1 이상, 예를 들면, 대략 0.3 d-1 이상, 예를 들면, 대략 0.4 d-1 이상, 예를 들면, 대략 0.5 d-1 이상 등에서 지속된다.
부가적으로, 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 연속 세포 배양 시스템에서, 세포 밀도는 관류 배양 시스템에서 지속되는 세포 밀도보다 낮지만 키모스탯 시스템에서 달성되는 세포 밀도보다 높은 값에서 지속된다. 한 구체예에서, 세포 밀도는 대략 2X107개 세포/㎖ 이하, 예를 들면, 대략 1.5X107개 세포/㎖ 이하, 예를 들면, 대략 1X107개 세포/㎖ 이하, 예를 들면, 대략 8X106개 세포/㎖ 이하, 예를 들면, 대략 6X106개 세포/㎖ 이하, 예를 들면, 대략 5X106개 세포/㎖ 이하이다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 대략 1X106개 세포/㎖ 이상, 예를 들면, 대략 1.5X106개 세포/㎖ 이상, 예를 들면, 대략 2X106개 세포/㎖ 이상, 예를 들면, 대략 3X106개 세포/㎖ 이상, 예를 들면, 대략 4X106개 세포/㎖ 이상 등이다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 대략 1.0X106개 세포/㎖ 내지 대략 2X106개 세포/㎖에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 대략 2X106개 세포/㎖ 내지 대략 4X106개 세포/㎖에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 대략 5X106개 세포/㎖ 내지 대략 1X107개 세포/㎖, 예를 들면, 대략 6X106개 세포/㎖ 내지 대략 8X106개 세포/㎖에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 대략 1X107개 세포/㎖ 내지 대략 2X107개 세포/㎖에서 지속된다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 세포 밀도가 지속되는 기전은 세포 유지 장치로 유지되는 세포의 부분, 다시 말하면, 세포 유지 비율을 감소시키는 것을 수반할 수 있다. 일반적으로, 관류 배양은 90% 또는 95% 이상, 그리고 많은 경우에, 100%에 가까운 세포 유지 비율을 갖는다. 본 명세서에서 개시되는 연속 세포 배양 시스템에서, 세포 유지 비율은 90% 이하이다. 한 구체예에서, 세포 유지는 대략 85% 이하, 예를 들면, 대략 75% 이하이다. 한 구체예에서, 세포 유지 비율은 대략 70% 이하, 예를 들면, 대략 60% 이하, 예를 들면, 대략 50% 이하, 예를 들면, 대략 40% 이하, 예를 들면, 대략 30% 이하이다. 한 구체예에서, 세포 유지는 대략 30% 내지 대략 90%에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 유지는 대략 30% 내지 대략 80%에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 유지는 대략 30% 내지 대략 70%에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 유지는 대략 40% 내지 대략 60%에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 유지는 대략 40% 내지 대략 70%에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 유지는 대략 50% 내지 대략 90%에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 유지는 대략 60% 내지 대략 90%에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 유지는 대략 70% 내지 대략 90%에서 지속된다. 다른 구체예에서, 세포 유지는 대략 80% 내지 대략 90%에서 지속된다.
배양은 또한, 희석 속도와 비 성장 속도의 비율로 특징될 수 있다. 비 성장 속도 (μ)는 하루 세포량 (cell mass)당 세포량에서 증가 (총 세포량에 상대적)를 지칭한다: μ = (ln(Xt / Xt -1))/((t)-(t-1)); 여기서 Xt는 시간 (t)에서 바이오매스 농도이고, 그리고 Xt -1은 이전 시점에서 바이오매스이다. 일반적으로, 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 연속 배양 시스템의 비 성장 속도는 최소의 성장-연관된 폴리펩티드 및/또는 바이러스 발현을 담보하기 위하여 미리 결정된 범위 내에서, 그리고 바람직하게는, 일정한 최소 수준에서 불변이어야 한다. 가령, 본 명세서에서 기술되는 연속 배양 시스템의 비 성장 속도는 대략 0.1 d-1 내지 대략 1.0 d-1일 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 기술되는 연속 배양 시스템에 의해 지속되는 비 성장 속도는 대략 0.1 d-1 이상, 예를 들면, 대략 0.15 d-1 이상, 예를 들면, 대략 0.2 d-1 이상, 예를 들면, 대략 0.25 d-1 이상, 예를 들면, 대략 0.3 d-1 이상, 예를 들면, 대략 0.35d-1 이상 등이다. 다른 구체예에서, 본 명세서에서 기술되는 연속 배양 시스템에 의해 지속되는 비 성장 속도는 대략 1.0 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.8 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.7 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.6 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.5 d-1 이하, 예를 들면, 대략 0.45 d-1 이하이다. 다른 구체예에서, 비 성장 속도는 대략 0.1 d-1 내지 대략 0.45 d-1에서 지속될 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 기술되는 연속 배양 시스템에 의해 지속되는 비 성장 속도는 대략 0.15 d-1 내지 대략 0.3 d-1이다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 기술되는 연속 배양 시스템에 의해 지속되는 비 성장 속도는 대략 0.2 d-1 내지 대략 0.25 d-1이다.
앞서 기술된 바와 같이, 본 명세서에서 개시되는 연속 배양 시스템은 대략 2X107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도를 지속한다. 앞서 기술된 바와 같이, 세포 밀도가 지속되는 기전은 특정 희석 속도 대(對) 비 성장 속도 비율을 지속하는 것을 수반한다. 키모스탯 배양은 대략 1의 D/μ 비율로, 비 성장 속도에 거의 동등한 희석 속도를 갖는다. 관류 배양은 일반적으로, 더욱 높은 절대 희석 속도 및 매우 낮은 비 성장 속도를 갖고, 따라서 D/μ 비율이 1보다 훨씬 크다. 하지만, 본 명세서에서 개시되는 연속 배양 시스템에서, 바람직하게는 비 성장 속도보다 약간 높은 희석 속도가 지속된다. 따라서 본 명세서에서 개시되는 연속 배양에서, 1보다 큰 D/μ 비율이 지속된다. 특히 바람직한 구체예에서, 희석 속도는 비 성장 속도를 미리 결정된 범위 내에서 지속하기 위하여 유지 장치의 효율에 따라서 계산되고 설정된다. 한 구체예에서, 희석 속도 대(對) 비 성장 속도의 비율은 대략 1.0 이상, 예를 들면, 대략 1.2 이상, 예를 들면, 대략 1.5 이상, 예를 들면, 대략 2 이상, 예를 들면, 대략 2.5 이상이다. 다른 구체예에서, 희석 속도 대(對) 비 성장 속도의 비율은 대략 5 이하, 예를 들면, 대략 4 이하, 예를 들면, 대략 3 이하이다. 한 구체예에서, D/μ의 비율은 대략 1.2 내지 대략 5이다. 다른 구체예에서, 희석 속도 대(對) 비 성장 속도의 비율은 대략 1.8 내지 대략 3이다. 다른 구체예에서, 희석 속도 대(對) 비 성장 속도의 비율은 대략 2.0 내지 대략 2.5이다.
본 발명의 방법은 적절한 배양 단위 또는 생물반응장치에서 실시될 수 있다. 생물반응장치는 세포, 예를 들면, 포유동물 세포를 배양하는데 유용하기만 하면 임의의 크기일 수 있다. 낮은 세포 밀도에서 공정은 일반적으로 정률 증가가 용이하기 때문에, 본 발명의 방법은 대규모 배양 (즉, 250 ℓ 이상의 배양 부피)에 특히 유리하고, 그리고 배양 조건의 최소 변형으로 작은 실험실 규모 배양 (가령, 10 ℓ)에서 생산 규모 배양 (가령, 250 ℓ 또는 그 이상)으로의 정률 증가가 특히 용이하다. pH, pO2, 그리고 온도가 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 배양 단위의 내부 조건은 전형적으로, 배양 기간 동안 통제된다. 생산 배양 단위 (production culture unit)는 목적 폴리펩티드, 바이러스, 및/또는 임의의 기타 산물의 생산에 이용되는 최종 배양 단위를 지칭한다. 대규모 생산 배양 단위의 부피는 일반적으로, 대략 250 리터 이상이고, 그리고 대략 300, 대략 500, 대략 800, 대략 1000, 대략 2500, 대략 5000, 대략 8000, 대략 10,000, 대략 12,0000 ℓ 또는 그 이상, 또는 임의의 중간 부피일 수 있다. 적절한 배양 단위 또는 생산 배양 단위는 본 발명에서 예기되는 배양 조건 하에 배지에서 현탁된 세포 배양을 계속 유지하는데 적합한 물질, 그리고 포유동물 세포 성장과 생존력에 도움이 되는 물질로 구성될 수 있다 (즉, 구축될 수 있다). 적절한 물질의 실례에는 제한 없이, 유리, 플라스틱 및/또는 금속이 포함된다. 바람직한 구체예에서, 이들 물질은 원하는 산물, 예를 들면, 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스의 발현 및/또는 안정성을 간섭하지 않거나, 현저하게 간섭하지 않거나, 또는 실질적으로 간섭하지 않는다. 당업자는 본 발명의 연속 배양 시스템을 실시하는데 이용하기 적합한 배양 단위를 인지하고 선택할 수 있을 것이다.
일부 구체예에서, 세포 배양 공정은 예로써, 하나 또는 그 이상의 종 (증식) 배양 단위(들)를 이용하여, 그 이후에 생산 배양 단위를 이용함으로써 하나 이상의 별개의 배양 단위에서 수행된다. 일부 구체예에서, 상기 공정은 이후, 대략 50 ℓ의 증식된 종 배양 (seed culture) (대략 1.0X106개 세포/㎖)를 대략 150 ℓ의 배양 배지를 내포하는 250 ℓ 배양 단위로 이전하는 것을 수반한다. 일반적으로, 본 명세서에서 기술되는 연속 배양 시스템은 생산 배양 단위에만 적용된다. 가령, 종 포유동물 세포는 예로써, 회분식, 유가식, 관류, 및/또는 키모스탯 시스템 내에, 하나 또는 그 이상의 종 배양 단위에서 먼저 증식된다. 세포의 생산 배양 단위로의 이전 이후에, 이들 세포는 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 연속 배양 시스템에 따라, 예로써 대략 2 d-1 이하의 희석 속도 및 대략 2X107개 세포/㎖ 이하의 세포 밀도를 갖는 세포 배양 시스템 내에서 세포 유지 장치로 배양될 수 있다.
대안으로, 세포의 생산 배양 단위와 생산 국면으로의 확대는 하나의 물리적 배양 단위에서 달성될 수 있다. 가령, 세포는 최종 생산 규모로 확대되고, 그리고 공정은 생산 조건으로 전환되고, 여기서 본 명세서에서 기술되는 연속 세포 배양 시스템에 대한 조건이 이용될 수 있다.
본 발명의 배양 방법은 예로써, 키모스탯 또는 관류 시스템에서와 유사한 지속 기간 동안 생산 국면을 지원하기 위하여, 세포 밀도 및 희석 속도를 미리 결정된 범위 내에서 지속하는데 이용될 수 있는 것으로 예상치 않게 밝혀졌다. "미리 결정된 범위"는 표적 범위, 예를 들면, 본 발명의 구체예에 따른 연속 배양 시스템의 작동을 위한 본 명세서에서 기술되는 범위를 의미한다. 가령, 일부 구체예에서, 희석 속도에 대한 표적 범위는 0.2 d-1 내지 2.0 d-1이고, 그리고 세포 밀도는 2X107개 세포/㎖ 이하이다. 다른 구체예에서, 희석 속도는 2.0 d-1 이하, 예를 들면, 1.8 d-1 이하, 예를 들면, 1.5 d-1 이하, 또는 예를 들면, 1.2 d-1 이하에서 지속되고, 그리고 세포 밀도는 1.5X107개 세포/㎖ 이하, 예를 들면, 1X107개 세포/㎖ 이하, 또는 예를 들면, 8X106개 세포/㎖ 이하이다. 일부 구체예에서, 비 성장 속도는 0.1 d-1 내지 1.0 d-1이고, 그리고 희석 속도 대(對) 비 성장 속도의 비율은 1.2 내지 5이다. 일부 구체예에서, 희석 속도에 대한 표적 범위는 0.5 d-1 내지 1.0 d-1이고, 그리고 세포 밀도는 5X106개 세포/㎖ 이하이다. 일부 구체예에서, 비 성장 속도는 0.15 d-1 내지 0.3 d-1이고, 그리고 희석 속도 대(對) 비 성장 속도의 비율은 1.8 내지 3이다. 일부 구체예에서, 비 성장 속도는 0.2 d-1 내지 0.25 d-1이고, 그리고 희석 속도 대(對) 비 성장 속도의 비율은 2.0 내지 2.5이다. 특히 바람직한 구체예에서, 세포 밀도는 5 X 106개 세포/㎖ 또는 그 이하이고, 희석 속도는 0.6 d-1 이하이고, 그리고 비 성장 속도는 0.18 내지 0.27 d-1이다. 다른 특히 바람직한 구체예에서, 세포 밀도는 5 X 106개 세포/㎖ 이하이고, 희석 속도는 0.55 내지 0.6 d-1이고, 그리고 비 성장 속도는 0.16 내지 0.26 d-1이다. 구체예는 총 연속 배양 시간 및/또는 생산 국면 시간의 적어도 대략 50%, 예를 들면, 적어도 대략 60%, 예를 들면, 적어도 대략 70%, 예를 들면, 적어도 대략 80%, 예를 들면, 적어도 대략 90%, 예를 들면, 적어도 대략 95%, 예를 들면, 적어도 대략 98% 동안 희석 속도 및/또는 세포 밀도 및/또는 비 성장 속도 및/또는 희석 속도 대(對) 비 성장 속도의 비율을 표적 범위 (가령, 앞서 열거된 범위) 내에서 지속하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 기술되는 연속 세포 배양 시스템은 포유동물 세포로부터 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스의 계속되는 생산을 가능하게 할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 대략 7일 이상의 총 연속 세포 배양 시간 동안 배양된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 세포는 대략 9일 이상, 대략 14일 이상, 대략 21일 이상, 대략 28일 이상, 대략 35일 이상, 대략 40일 이상, 대략 45일 이상, 또는 대략 50일 이상 동안 배양된다.
용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지" (또는 단순히 "배지")는 하기 범주 중에서 하나 또는 그 이상으로부터 적어도 한 가지 성분을 전형적으로 제공하는 진핵생물 세포를 성장시키는데 이용되는 영양소 용액을 지칭한다: (1) 배지의 삼투질 농도 (osmolality)에 기여하는 염 (가령, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등); (2) 통상적으로, 탄수화물, 예를 들면, 글루코오스 형태의 에너지 공급원; (3) 모든 필수 아미노산, 그리고 통상적으로, 20개 아미노산의 기본 세트; (4) 비타민 및/또는 낮은 농도로 요구되는 기타 유기 화합물; 그리고 (5) 미량 원소, 여기서 미량 원소는 전형적으로, 매우 낮은 농도, 통상적으로 마이크로몰 범위에서 요구되는 무기 화합물로서 정의된다. 영양소 용액은 선택적으로, 하기 범주 중에서 임의의 한 가지로부터 하나 또는 그 이상의 성분으로 보충될 수 있다: (a) 동물 혈청; (b) 호르몬 및 기타 성장 인자, 예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 그리고 표피 성장 인자; 그리고 (c) 단백질 가수분해물을 비롯한 식물, 효모 및/또는 조직의 가수분해물.
본 발명의 연속 배양 시스템은 혈청-없는 배지, 화학적으로 규정된 배지, 또는 동물-유래된 성분이 없는 배지에서 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 포유동물 세포를 배양할 때 특히 유용하다. 화학적으로 규정된 배지는 모든 성분이 공지된 화학 구조를 갖는 배지이다. 화학적으로 규정된 배지는 상업적 공급업체, 예를 들면, Sigma, JRH Biosciences, Gibco 및 Gemini로부터 구입가능하다. 본 발명의 다른 구체예에서, 배지는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 첨가함으로써, 또는 펩톤 또는 단백질 가수분해물 (동물, 효모, 또는 식물 공급원(들)로부터 가수분해물 포함)을 첨가함으로써 유래된 아미노산(들)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 당분야에 공지된 임의의 공급원 또는 방법으로부터 유래된 아미노산(들)을 내포할 수 있다. 본 발명의 조건 하에 세포 성장과 유지를 지원하는 임의의 세포 배양 배지가 이용될 수 있다. 전형적으로, 배지는 물, 삼투질농도 조절제, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산, 무기 또는 재조합 철 공급원, 하나 또는 그 이상의 합성 또는 재조합 성장 인자, 비타민, 그리고 보조인자를 내포한다. 바람직한 구체예에서, 배양 배지는 동물-유래된 성분이 없다. 본 명세서에서, "동물-유래된" 성분은 온전한 동물에서 생산된 임의의 성분 (가령, 혈청으로부터 분리되고 정제된 단백질), 또는 온전한 동물에서 생산되는 성분을 이용하여 생산된 임의의 성분 (가령, 동물로부터 분리되고 정제된 효소를 이용하여 식물 근원 물질을 가수분해함으로써 만들어진 아미노산)이다. 대조적으로, 동물 단백질의 서열을 갖지만 (즉, 동물에서 게놈 기원 (genomic origin)을 갖지만), 온전한 동물에서 생산되거나, 또는 온전한 동물로부터 분리되고 정제된 성분이 없는 배지를 이용하여 세포 배양 동안 시험관내에서 (가령, 재조합 효모 또는 세균 세포에서, 또는 재조합 여부와 상관없이 확립된 연속 진핵생물 세포주에서) 생산되는 단백질은 "동물-유래된" 성분이 아니다. 가령, 효모 또는 세균 세포에서 생산된 인슐린, 또는 확립된 포유동물 세포주, 예를 들면, CHO, BHK 또는 HEK 세포에서 생산된 인슐린, 또는 Namalwa 세포에서 생산된 인터페론은 "동물-유래된" 성분"을 구성하지 못한다. 따라서 동물-유래된 성분이 없는 세포 배양 배지는 재조합 방식으로 생산되는 동물 단백질을 내포할 수 있는 것이다; 하지만, 이런 배지는 예로써, 동물 혈청 또는 단백질, 또는 동물 혈청으로부터 정제된 기타 산물을 내포하지 않는다. 이런 배지는 예로써, 식물로부터 유래된 하나 또는 그 이상의 성분을 내포할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 세포 성장 국면 동안 이용되는 배지에는 농축된 배지, 다시 말하면, 성장 배양에 정상적으로 필요하고 정상적으로 제공되는 것보다 높은 농도의 영양소를 내포하는 배지가 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 세포 배지, 접종 배지 등은 특정 세포, 예를 들면, 동물 세포 (가령, CHO 세포)를 배양하는데 적합하다. 가령, 당업자는 특정 배양을 위한 글루코오스 및 기타 영양소, 예를 들면, 글루타민, 철, 미량 원소 등의 양, 그리고 기타 배양 변수, 예를 들면, 기포의 양, 삼투질농도 등을 적절하게 선택할 수 있을 것이다 (참조: Mather, J. P., et al. (1999) "Culture media, animal cells, large scale production," Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation, Vol. 2:777-785 (특히, 페이지 780 내지 783); U.S. Patent Application Publication No. 2006/0121568 (특히, 단락 [0144] 내지 [0185] 및 [0203] 내지 [0331]); 둘 모두 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다). 본 발명에서는 또한, 이런 공지된 배지의 변형, 예를 들면, 이런 배지의 영양소-농축된 변형, 농축된 배지, 화학적으로 규정된 배지, 혈청-없는 배지, 그리고 본 발명의 다양한 구체예에 따라서 달리 변형된 배지를 예기한다.
연속 배양 시스템은 임의의 유형의 비-고정 의존성 포유동물 세포에 한정되지 않는다. 포유동물 세포는 목적 재조합 폴리펩티드 (및/또는 재조합 바이러스)를 발현하는 유전적으로 변형된 포유동물 세포, 또는 목적 폴리펩티드 (및/또는 바이러스)를 발현하는 변형되지 않은 포유동물 세포일 수 있다. 다수의 포유동물 세포주가 폴리펩티드 및/또는 바이러스의 재조합 발현에 적합한 숙주 세포이다. 포유동물 숙주 세포주에는 예로써, COS, PER.C6, TM4, VERO, MDCK, BRL-3A, W138, Hep G2, MMT, MRC 5, FS4, CHO, 293T, A431, 3T3, CV-1, C3H10T1/2, Colo205, 293, HeLa, L 세포, BHK, HL-60, FRhL-2, U937, HaK, Jurkat 세포, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x, 뮤린 골수종 (가령, SP2/0과 NS0) 및 C2C12 세포, 형질전환된 영장류 세포주, 하이브리도마, 정상 2배체 세포, 그리고 일차 조직과 일차 외식체의 시험관내 배양으로부터 유래된 세포 계통이 포함된다. 현탁 배양에 순응될 수 있는 임의의 포유동물 세포가 본 명세서에서 개시되는 세포 배양 방법에 이용될 수 있다. 무제한적 실례에는 CHO 세포가 포함되는데, 이들은 혈청 및 적절한 표면의 존재에서 배양될 때 고정 의존성이지만, 현탁 배양에서 성장에 쉽게 순응된다 (혈청-없는 CHO 세포주의 배양과 관련하여, 예로써 Rasmussen 1998, Cytotechnology 28: pp31-42, 특히 페이지 34-37 참조). 또한, 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스 (재조합 방식으로 생산되는 지의 여부와 상관없이)를 발현할 수 있는 임의의 포유동물 세포가 본 명세서에서 개시되는 세포 배양 방법에 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 개시되는 연속 세포 배양 방법은 고정 의존성 세포주를 비-고정 의존성 세포주로 순응시키는데 이용될 수 있다. 다수의 세포주는 상업적 공급원, 예를 들면, American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 구입가능하다. 한 구체예에서, 연속 세포 배양 시스템은 유전적으로 변형된 CHO 세포를 배양하는데 이용된다.
본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 연속 세포 배양 시스템은 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스 (가령, 재조합 폴리펩티드 및/또는 재조합 바이러스)의 회수를 가능하게 한다. 폴리펩티드 및/또는 바이러스는 전형적으로, 시스템으로부터 제거된 소모된 배지로부터 회수된다. 본 발명의 바람직한 구체예의 이점에는 생물반응장치에서 단백질 및/또는 바이러스의 체류 시간의 감소가 포함되는데, 이는 분해에 민감한 산물에 특히 유용하다. 하지만, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 연속 세포 배양 시스템은 이런 불안정 폴리펩티드 또는 바이러스에 한정되지 않고, 그리고 다른 목적 폴리펩티드 또는 바이러스의 회수에 이용될 수 있다.
본 발명은 내인성 유전자 또는 자연 감염으로부터, 또는 목적 단백질 또는 바이러스를 인코딩하는 재조합 유전자의 세포 내로의 도입 이후에, 하나 또는 그 이상의 목적 단백질 및/또는 바이러스를 발현하는 포유동물 세포의 향상된 대규모 연속 배양을 위한 방법에 관계한다. 이런 단백질에는 무제한적 실례로써, 효소, 호르몬, 항체, 단백질 수용체, 융합 단백질 (가령, 가용성 수용체 및 IgG의 Fc 도메인의 융합체), 백신, 사이토킨, 케모킨, 성장 인자, 혈액 인자 단백질 등이 포함된다. 한 구체예에서, 목적 단백질은 ADAMTS13이다. 다른 구체예에서, 목적 단백질은 인자 VII 또는 인자 VIII이다. 다른 구체예에서, 목적 단백질은 알파-1-단백분해효소 억제인자이다.
본 발명은 또한, 야생형 또는 재조합인지에 상관없이, 하나 또는 그 이상의 목적 바이러스 (바이러스 입자 및 바이러스 벡터 포함)를 발현하는 포유동물 세포의 향상된 대규모 연속 배양을 위한 방법에 관계한다. 이런 야생형 또는 재조합 바이러스, 바이러스 입자 및/또는 바이러스 벡터의 무제한적 실례에는 아데노바이러스, 포진 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 인플루엔자 바이러스 등이 포함된다. 재조합 바이러스의 생산, 바이러스 입자, 그리고 재조합 바이러스 벡터의 용도는 당분야에 널리 공지되어 있다. 바이러스의 발현을 위하여, 본 발명에 따른 방법은 예로써, HEK293 또는 기타 인간 또는 포유동물 세포주에서 예로써, Vero 세포 또는 렌티바이러스에서 A형 간염 및 TBE와 같은 비-용해성 바이러스로 감염과 이들의 발현이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 적용에 특히 적합하다.
일단 배지가 배양 단위로부터 제거되면, 상기 배지는 목적 단백질 및/또는 바이러스를 수득하기 위하여 하나 또는 그 이상의 가공 단계에 종속될 수 있다. 하류 가공 단계에는 제한 없이, 배양으로부터 이전에 회수되지 않은 세포를 제거하는 원심분리 및/또는 여과; 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피; 이온-교환 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피; 전기영동 절차 (가령, 예비 등전 초점화 (preparative isoelectric focusing, IEF)), 차별적 용해도 (가령, 황산암모늄 침전), 추출 등이 포함된다. 전반적으로, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; 그리고 Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989를 참조한다.
일정한 구체예에서, 포유동물 세포는 전-배양 단계, 예를 들면, 목적 폴리펩티드 및/또는 바이러스의 생산을 위하여 세포를 순응시키는 전-배양 단계에 종속된다. 일부 구체예에서, 순응은 예로써, 배양이 대략 5 ℓ, 대략 8 ℓ, 대략 10 ℓ, 대략 12 ℓ, 대략 15 ℓ, 또는 대략 20 ℓ 등의 원하는 최종 작업 부피 (working volume)에 도달할 수 있도록 하는 시간 동안, 현탁 상태에서 세포를 전-배양하는 것을 포함한다. 이 시점에서, 배양은 연속 배지 공급으로 전환되고, 그리고 본 명세서에서 기술되는 연속 세포 배양 시스템에 따라 수행될 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 본 발명의 예시적인 구체예는 하기에 제공된 실시예에 의해 더욱 논의된다. 하지만, 이들 실시예, 그리고 이들의 특정 상세는 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 : 키모스탯 배양은 표 1.1에서 제시된 바와 같이 보충되는 화학적으로 규정된 BACD-A13 배지 (농축된 DMEM/F12 제제)에서 인간 ADAMTS13을 발현하는 재조합 CHO 세포주로 준비되었다.
Figure pat00001
인간 ADAMTS13을 발현하는 재조합 CHO 세포는 표 1.2에서 제시된 바와 같은 화학적으로 규정된 배지, 다시 말하면, BCS 배지에 순응되었다.
Figure pat00002
개발 작업 세포 은행은 해동되고, 그리고 세포 접종물은 BCS 배지에서 준비되었다. 세포는 Rushton 타입 임펠러가 구비된 10 ℓ 배양 단위에 이전되고, 그리고 아래와 같이 인라인 통제된 파라미터를 갖는 BACD-A13 배지에서 반복 회분식 배양으로 배양되었다: pH 7.10, 온도 36℃, 그리고 DO 20% 공기 포화도 (air saturation).
2회 회분 주기후, 배양은 10 ℓ의 최종 작업 부피에 도달하고, 그리고 배양은 4일자에 연속 배지 공급으로 전환되고 키모스탯 양식으로 18일자까지 수행되었다.
이러한 배양으로부터, Rushton 타입 임펠러 및 세포 유지 장치가 구비된 두 번째 10 ℓ 배양 단위는 동일한 세포 배양 배지를 이용하여, 키모스탯-유사 관류를 위하여 접종되고, 그리고 반복 회분식 배양으로 8일 동안 배양되었다. CYTOPORE 2TM 미립담체 (GE Healthcare)가 첨가되고 (0.25 g/ℓ), 그리고 배양 단위는 키모스탯 양식에서 다른 배양 단위와 병렬로, 연속 키모스탯-유사 관류 양식에서 더욱 작동되었다. 배양 단위는 배플이 구비된 Rushton 타입 임펠러로 140 rpm으로 교반되고, 이는 대략 40 W/m3의 비 파워/부피 입력에 상응한다.
양쪽 배양 단위는 24일 동안 병렬로 작동되었다. 데이터는 3주 간격 및 추가의 3일 간격으로 계산되었다 (표 1.3. (키모스탯) 및 표 1.4 (키모스탯-유사 관류)). 표 1.3.의 4가지 간격 (일자 26-32; 일자 33-39; 일자 40-46; 그리고 일자 47-49)으로부터 데이터는 표 1.4에 제시된 4가지 간격 (일자 9-15; 일자 16-22; 일자 23-29; 그리고 일자 30-32)과 직접적으로 비교되었다.
이들 배양 단위로부터 샘플은 채취되고 ELISA에 의해 ADAMTS13 농도에 대하여 분석되고, 그리고 FRETS-73 검사법에 의해 ADAMTS13 활성에 대하여 분석되었다. 세포 수는 Nucleocounter 기술에 의해 결정되었다. 관류 배양의 경우에, 총 세포 수 및 상층액에서 세포 수는 상대적 세포 유지를 계산하기 위하여 별개로 측정되었다. 희석 속도는 측정되고, 그리고 성장 속도 및 부피당 생산성을 계산하는데 이용되었다. 이들 방정식은 하기에 제공된다.
키모스탯 배양에서 성장 속도 (μ)는 하기 방정식을 이용하여 계산되었다: μ = D + ln ( Xt / Xt -1 ) / (t - t-1), 여기서 D = 희석 속도, Xt = 시간 t에서 총 세포 밀도, 그리고 (t - t-1) = t와 t-1 사이에 시간.
키모스탯-유사 관류 배양에서 성장 속도 (μ)는 하기 방정식을 이용하여 계산되었다: μ = ln ( Xt / Xt -1 ) / (t - t-1) + D x (log평균 XSN/ log평균 X)/ (t - t-1); 여기서 D = 희석 속도, Xt = 시간 t에서 총 세포 밀도, (t - t-1) = t와 t-1 사이에 시간, log평균 X = 총 세포 밀도의 대수 평균 = ( Xt - Xt -1 ) / ( ln( Xt ) - ln (Xt-1 )), 그리고 log평균 XSN = 세포 밀도 상층액의 대수 평균.
세포 유지 비율은 하기와 같이 계산되었다: 100 x (1 - XSN / X)[%]
Figure pat00003
Figure pat00004
회분식 배양에서 이들 세포의 비 성장 속도는 대략 0.42 d-1이었다. 키모스탯 배양으로 전환후, 대략 0.30 d-1까지 비 성장 속도의 감소가 관찰되었는데, 이는 화학적으로 규정된 배지에서 성장 제한 조건을 지시한다. 세포 밀도는 1.8-2x106개 세포/㎖의 범위에서 평형화되었다. 이런 연속 배양 조건 하에, 정상 상태가 도달되고 (간격 12-18에서부터), 그리고 2500U/L/d가 달성될 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 18일자에 세포 유지 장치로 배양 단위를 접종한 이후, 세포는 연속 키모스탯-유사 관류 양식으로 더욱 배양되었다. 세포 유지로 인하여, 키모스탯-유사 관류 배양에서 세포 밀도가 증가하였다. 하지만, 상대적으로 낮은 세포 유지 비율 (평균 72%; 범위 60%-84%)로 인하여, 세포 밀도는 <1X107개 세포/㎖ (평균 4.93X106개 세포/㎖)의 상대적으로 낮은 수준에서 지속되고, 그리고 최대 희석 속도는 0.62 d-1이었다.
이러한 낮은 세포 유지 비율은 또한, 이들 세포가 과도한 세포 밀도를 유발하지 않으면서, 0.18 - 0.27 d-1의 연속 비 성장 속도를 지속할 수 있도록 하였다. 이것은 성장 연관된 방식으로 재조합 단백질을 발현하는 재조합 세포의 경우에 이점으로 간주된다. 감소된 비 생산성 (specific productivity) (가령, 974 mU/E06/d 대(對) 1400 mU/E06/d)에도 불구하고, 부피당 생산성은 대략 2.8-배 높은 세포 밀도로 인하여, 2648 U/L/d에서 4538 U/L/d로 70% 이상 증가하였다. 재조합 단백질의 비 활성 역시 아마도, 배양 단위에서 감소된 체류 시간으로 인하여 향상되고 (941 U/mg 대(對) 834 U/mg), 따라서 발현된 재조합 ADAMTS13의 안정성, 또는 발현된 재조합 ADAMTS13의 구조와 기능에 대한 임의의 다른 유익한 효과가 향상되었다.
실시예 2: 키모스탯 배양은 표 1.1에서 제시된 바와 같이 보충되는 화학적으로 규정된 BACD-A13 배지 (농축된 DMEM/F12 제제)에서 인간 ADAMTS13을 발현하는 재조합 CHO 세포주로 준비되었다.
인간 ADAMTS13을 발현하는 재조합 CHO 세포는 표 1.2에서 제시된 바와 같은 화학적으로 규정된 배지, 다시 말하면, BCS 배지에 순응되었다. 개발 작업 세포 은행은 해동되고, 그리고 세포 접종물은 BCS 배지에서 준비되었다. 세포는 블레이드 임펠러가 구비된 1.5 ℓ 배양 단위에 이전되고, 그리고 인라인 통제된 pH 7.1, 온도 36℃, 그리고 DO 20% 공기 포화도 (air saturation)를 갖는 BACD-A13 배지에서 반복 회분식 배양으로 배양되었다.
2회 회분 주기후, 배양은 1.5 ℓ의 최종 작업 부피에 도달하고, 그리고 배양은 5일자에 연속 배지 공급으로 전환되고 키모스탯 양식으로 7일자까지 수행되었다.
이러한 배양으로부터, 블레이드 임펠러가 구비된 세포 유지 장치를 포함하는 두 번째 배양 단위는 동일한 세포 배양 배지를 이용하여 접종되고, 그리고 회분식 배양으로 1일 동안 배양되었다. CYTOPORE 2TM 미립담체 (GE Healthcare)가 첨가되고 (0.25 g/ℓ), 그리고 배양 단위는 키모스탯 양식에서 다른 배양 단위와 병렬로, 연속 키모스탯-유사 관류 양식에서 더욱 작동되었다.
양쪽 배양 단위는 28일 동안 병렬로 작동되었다. 데이터는 4주 간격으로 계산되었다 (표 2.1 (키모스탯) 및 표 2.2 (키모스탯-유사 관류 양식)).
이들 배양 단위로부터 샘플은 채취되고 ELISA에 의해 ADAMTS13 농도에 대하여 분석되고, 그리고 FRETS-73 검사법에 의해 ADAMTS13 활성에 대하여 분석되었다. 세포 수는 Nucleocounter 기술에 의해 결정되었다. 키모스탯-유사 관류 배양의 경우에, 총 세포 수 및 상층액에서 세포 수는 상대적 세포 유지를 계산하기 위하여 별개로 측정되었다. 희석 속도는 측정되고, 그리고 성장 속도 및 부피당 생산성을 계산하는데 이용되었다. 이들 방정식은 하기에 제공된다.
키모스탯 배양에서 성장 속도 (μ)는 하기 방정식을 이용하여 계산되었다: μ = D + ln ( Xt / Xt -1 ) / (t - t-1), 여기서 D = 희석 속도, Xt = 시간 t에서 총 세포 밀도, 그리고 (t - t-1) = t와 t-1 사이에 시간.
키모스탯-유사 관류 배양에서 성장 속도 (μ)는 하기 방정식을 이용하여 계산되었다: μ = ln ( Xt / Xt -1 ) / (t - t-1) + D x (log평균 XSN/ log평균 X)/ (t - t-1); 여기서 D = 희석 속도, Xt = 시간 t에서 총 세포 밀도, (t - t-1) = t와 t-1 사이에 시간, log평균 X = 총 세포 밀도의 대수 평균 = ( Xt - Xt -1 ) / ( ln( Xt ) - ln (Xt-1 )), 그리고 log평균 XSN = 세포 밀도 상층액의 대수 평균.
세포 유지 비율은 하기와 같이 계산되었다: 100 x (1 - XSN / X)[%]
Figure pat00005
Figure pat00006
회분식 배양에서 ADAMTS-13을 발현하는 재조합 CHO 세포의 비 성장 속도는 대략 0.51 d-1이었다. 키모스탯 배양으로 전환후, 0.30 d-1 이하까지 비 성장 속도의 감소가 관찰되었는데, 이는 화학적으로 규정된 배지에서 성장 제한 조건을 지시한다. 세포 밀도는 0.25-0.27 d-1의 비 성장 속도에서 0.8-1.2x106개 세포/㎖의 범위에서 평형화되었다. 이런 연속 배양 조건 하에, 정상 상태가 도달되었다 (간격 16-36에서부터). 일자 09-36으로부터 4가지 간격 모두의 평균 생산성은 920 U/L/d이었다.
앞서 기술된 바와 같이, 7일자에 세포 유지 장치로 배양 단위를 접종한 이후, 세포는 연속 키모스탯-유사 양식으로 더욱 배양되었다. 표 2.1의 4가지 간격 (일자 9-15; 일자 16-22; 일자 23-29; 그리고 일자 30-36)으로부터 데이터 및 일자 9-36의 평균 값은 표 2.2의 4가지 간격 (일자 2-8; 일자 9-15; 일자 16-22; 그리고 일자 23-29)으로부터 데이터 및 일자 2-29의 평균 값과 직접적으로 비교되었다.
키모스탯-유사 관류 배양은 이후, 키모스탯-유사 관류 배양의 장기 안정성을 증명하기 위하여 추가로 3가지 간격 (일자 30-36; 일자 37-43; 그리고 일자 44-49) 동안 수행되었다 (참고로서 키모스탯 없이). 7주간 연속 배양의 평균 값은 표 2.2에 제시된다 (일자 2-49의 평균).
세포 유지로 인하여, 관류 배양에서 세포 밀도가 증가한다. 하지만, 상대적으로 낮은 세포 유지 비율 (일자 02-29의 평균: 61%, 일자 02-49의 평균: 68%. 범위 38%-72%)로 인하여, 세포 밀도는 <5X106 세포/㎖ (일자 02-49의 평균 = 3.49X106개 세포/㎖)의 상대적으로 낮은 수준에서 지속되었다. 대략 0.60 d-1의 최대 희석 속도가 세 번째 간격에서 도달되고, 이후 실험의 종결 때까지 0.55 d-1 내지 0.60 d-1에서 일정하였다 (일자 02-49의 평균: 0.55 d-1).
이러한 낮은 세포 유지 비율은 또한, 이들 세포가 과도한 세포 밀도를 유발하지 않으면서, 0.16 - 0.26 d-1 (일자 02-49의 평균: 0.22d- 1)의 연속 비 성장 속도를 지속할 수 있도록 하였다. 감소된 비 생산성 (specific productivity) (가령, 595 mU/E06/d 대(對) 799 mU/E06/d)에도 불구하고, 부피당 생산성은 대략 2.8x 높은 세포 밀도로 인하여, 920 U/L/d에서 1807 U/L/d (첫 4가지 간격의 평균)로 90% 이상 증가하였다. 키모스탯-유사 배양의 생산성은 추가의 3가지 간격 동안 1500-1600 U/L/d의 범위에서 상대적으로 안정적으로 유지되었다.
실시예 1에서처럼, 하향된 세포 유지 비율로 연속 현탁 배양을 안정화시키는 이러한 접근법은 일정한 배양 조건 하에 (가령, 화학적으로 규정된 배지를 이용할 때) 심각한 성장 제한의 단점을 보상할 수 있는 것으로 증명되었다. 따라서 세포 유지의 통제는 상대적으로 중간 정도 세포 밀도 및 상대적으로 낮고 불변하는 희석 속도에서 배양이 지속될 수 있도록 한다. 또한, 상대적으로 낮은 세포 유지 비율로 인하여, 이러한 배양은 예로써, 비 성장 속도에 의해 증명되는 바와 같이, 연속 현탁 배양의 특징 중에서 상당수를 유지하였다.
본 명세서에 인용되는 모든 특허, 특허 공보, 그리고 기타 간행물은 마치 각 개별 간행물, 특허, 또는 특허 출원이 본 발명에 참조로서 편입되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본 발명에 참조로서 편입된다.
상기 설명을 살펴본 이후에, 당업자는 일정한 변형과 개선을 구상할 것이다. 이와 같은 모든 변형과 개선은 간결함 및 가독성의 이유로 본 명세서에서 생략된 것으로 이해되어야 한다. 그럼에도 불구하고, 이와 같은 모든 변형과 개선은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 예기되고, 그리고 적절하게는, 하기 특허청구범위의 범위 내에 있다.

Claims (19)

  1. (a) 연속 세포 배양 시스템에서 폴리펩티드를 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 단계이며, 상기 세포 배양 시스템은 세포 유지 장치를 포함하고 2 d-1 미만의 희석 속도 (D) 및 2 X 107개 세포/㎖ 미만의 세포 밀도를 갖는, 단계; 및
    (b) 상기 세포 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 세포는 트롬보스폰딘 타입 1 모티프 13을 갖는 디스인테그린-유사 및 금속단백분해효소 (ADAMTS13) 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형되는 것인,
    연속 세포 배양에서 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 유지 장치는 90% 미만의 세포 유지 비율을 갖는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 배양 시스템은 0.2 d-1 내지 0.8 d-1의 비 성장 속도를 갖는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 세포 배양 시스템은 0.2 d-1 내지 0.8 d-1의 비 성장 속도를 갖는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희석 속도는 0.1 d-1 내지 1.0 d-1인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 밀도는 1 X 107개 세포/㎖ 미만인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 시스템은 1.2 내지 5의 희석 속도와 비 성장 속도의 비율 (D/μ)을 갖는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 20일 초과 동안 상기 세포 배양 시스템에서 배양되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 40일 초과 동안 상기 세포 배양 시스템에서 배양되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 50일 초과 동안 상기 세포 배양 시스템에서 배양되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희석 속도 및 세포 밀도는 세포가 상기 세포 배양 시스템에서 배양되는 시간의 적어도 80% 동안 지속되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 유지 장치는 마크로다공성 미립담체를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 혈청이 없는 배지에서 배양되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 적어도 250 ℓ의 배지에서 배양되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 비고정 의존성 세포인 방법.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 단계에 앞서, 현탁 상태에서 세포를 사전 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포인 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    (a) 연속 세포 배양 시스템에서 재조합 ADAMTS13 단백질을 발현하는 비고정 의존성 포유동물 세포를 배양하는 단계이며, 상기 세포 배양 시스템은 90% 미만의 세포 유지 비율을 갖는 세포 유지 장치를 포함하고 0.1 d-1 내지 1.0 d- 1 의 희석 속도 (D) 및 1 X 107개 세포/㎖ 미만의 세포 밀도를 갖는, 단계; 및
    (b) 상기 세포 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 ADAMTS13 단백질을 회수하는 단계를 포함하는,
    연속 세포 배양에서 ADAMTS13 단백질을 생산하는 방법.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 희석 속도는 약 1.0 d-1 미만, 약 0.9 d-1 미만, 약 0.8 d-1 미만, 약 0.7 d-1 미만, 또는 약 0.6 d-1 미만으로 지속되는 방법.
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