KR20170077292A - 주사용 보툴리눔 독소 제제 - Google Patents

주사용 보툴리눔 독소 제제 Download PDF

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KR20170077292A
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Abstract

본 발명은 다양한 치료적, 심미적 및/또는 미용적 목적을 위해 개체에게 투여될 수 있는 보툴리눔 독소를 포함하는 신규한 주사용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 고려되는 주사용 조성물은 기존의 보툴리눔 독소 제제 대비, 감소된 항원성, 주사 후 원치않는 국소화된 확산을 수행하는 경향의 감소, 임상적 효능의 증가된 지속기간, 또는 강화된 효능, 임상적 효과의 보다 빠른 개시 및/또는 개선된 안정성을 포함한 하나 이상의 장점을 보인다.

Description

주사용 보툴리눔 독소 제제{Injectable botulinum toxin formulations}
관련 특허 출원
본 출원은 그 내용의 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 2008년 12월 31일에 출원된 미국 임시 특허출원 제61/142,063호에 대해 35 U.S.C. §119에 따라 우선원의 이익을 주장한다.
본 발명은 다양한 치료적, 심미적 및/또는 미용적 목적을 위해 개체에게 투여될 수 있는 보툴리눔 독소를 포함하는 신규한 주사 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부의 환경적 위협으로부터 신체의 기관을 보호하고 체온을 유지하기 위한 자동온도조절장치(thermostat)로서 작용한다. 피부는 수개의 상이한 층들로 구성되며, 각 층은 특화된 기능을 갖는다. 주요 층들은 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하조직(hypodermis)을 포함한다. 표피는 결합 조직으로 구성되는 진피를 덮는 상피 세포들의 겹층(stratifying layer)이다. 표피 및 진피는 모두 지방 조직의 내부 층인 피하조직에 의해 더 지지된다.
피부의 최상층인 표피는 그 두께가 0.1 내지 1.5 밀리미터에 불과하다(Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)). 표피는 각질형성세포(keratinocyte)로 구성되며 그들의 분화 상태에 근거하여 수개의 층들로 분류된다. 표피는 각질층(stratum corneum) 및 과립(granular) 세포, 유극(melphigian) 세포 및 기저(basal) 세포로 구성된 생 표피층(viable epidermis)으로 더 분류될 수 있다. 각질층은 수분을 흡수하며 그 유연성 및 부드러움을 유지하기 위해 10 중량% 이상의 수분을 필요로 한다. 흡습성(hygroscopicity)은 부분적으로 케라틴의 수분-보유 능력에서 기인한다. 각질층이 그의 부드러움 및 유연성을 상실하면, 이는 거칠고 부서지기 쉬워져서, 건조한 피부를 초래한다.
표피 바로 하부에 존재하는 진피는 그 두께가 1.5 내지 4 밀리미터이다. 진피는 피부의 세 층들 중에서 가장 두껍다. 또한, 진피는 한선 및 유선(면포, 또는 모공이라 불리는 피부의 개구부들을 통해 물질들을 분비함), 모근, 신경 말단 및 혈관 및 림프관을 포함한 피부의 구조물들의 대부분이 존재하는 곳이다(Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)). 그러나, 진피의 주요 성분들은 콜라겐 및 엘라스틴이다.
피하조직은 피부의 최심부 층이다. 피하조직은 체온 유지를 위한 절연층 및 기관 보호를 위한 충격 흡수층으로 작용한다(Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7(1998)). 또한, 피하조직은 에너지 저장을 위해 지방을 저장한다. 피부의 pH는 정상 상태에서 5와 6 사이이다. 피부의 산성은 피지선의 분비물로부터 유래한 양쪽성(amphoteric) 아미노산, 젖산, 및 지방산의 존재 때문이다. "산성 맨틀(acid mantle)"이라는 용어는 피부의 대부분의 영역 상에 있는 수용성 물질들의 존재를 의미한다. 피부의 완충(buffering) 능력은 부분적으로는 피부의 각질층에 저장된 이 분비물들에서 기인한다.
노화의 자명한 징후들 중 하나인 주름은 피부에 대한 환경적 손상으로부터 축적되는 생화학적, 조직학적, 및 생리적 변화들에 의해 유발될 수 있다(Benedetto, International Journal of Dermatology, 38: 641-655(1999)). 또한, 안면 주름의 특징적인 접힘(fold), 골(furrow), 및 구겨짐(crease)을 유발할 수 있는 다른 이차 인자들이 있다(Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)). 이와 같은 이차 인자들은 피부에 대한 중력의 지속적인 인력, 빈번하고 지속적인 위치적 압력(positional pressure)(예를 들면, 수면 동안), 및 안면 근육의 수축에 의해 유발되는 반복적인 안면 운동을 포함한다(Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nd ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)).
노화의 징후들 중 일부를 잠재적으로 완화시키기 위해 상이한 기법들이 이용되고 있다. 이 기법들은 알파 히드록시산 및 레티놀을 포함하는 안면 보습제에서 외과적 수술 및 신경 독소의 주사에 이르기까지 다양하다. 예를 들면, 1986년에, 안과성형 전문의 및 피부과 전문의로 구성된 부부인 Jean 및 Alastair Carruthers는 미간 영역에 있는 운동과 연관된 주름들의 치료를 위해 타입 A형 보툴리눔 독소를 사용하는 방법을 개발했다(Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150(1981)). Carruther 부부에 의한 주름의 치료를 위한 타입 A형 보툴리눔 독소의 이용은 1992년에 이 방식의 중요한 발표로 이어졌다(Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York : Academic Press, 143-150(1981)). 1994년까지, 동일한 팀은 안면에서 다른 운동-연관된 주름들에 대한 경험을 보고했다(Scott, Ophthalmol, 87: 1044-1049(1980)). 이는 뒤이어 타입 A형 보툴리눔 독소를 이용한 미용 치료의 시대의 탄생을 가져왔다.
A형 보툴리눔 독소는 인간에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학적 작용제인 것으로 보고된다. 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 포자는 토양에서 발견되고 부적절하게 멸균되고 밀봉된 식품 용기에서 성장할 수 있다. 이 박테리아의 섭취는 치명적일 수 있는 보툴리누스 중독증을 유발할 수 있다. 보툴리눔 독소는 신경근 접합부(neuromuscular junction)를 통한 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것에 의해 시냅스 전달(synaptic transmission)을 방지하여 의해 근육의 마비를 초래하도록 작용하고 또한 다른 방식으로도 작용하는 것으로 사료된다. 그들의 작용은 통상적으로 근육 경련 또는 수축을 유발하는 신호를 본질적으로 차단하여, 마비를 초래한다. 그러나, 최근 10년 동안, 보툴리눔 독소의 근육-마비 효과는 치료적 효과를 위해 이용되고 있다. 보툴리눔 독소의 제어 투여가 다양한 의학적 상태, 예를 들면, 과다활성의 골격근을 특징으로 하는 신경근 질환을 치료하기 위한 근육 마비를 제공하기 위해 이용되고 있다. 보툴리눔 독소에 의해 치료된 상태는 반측안면경련, 성인 발병 경련성 사경(adult onset spasmodic torticollis), 열항, 안검경련, 뇌성마비, 경부 근긴장 이상증(cervical dystonia), 편두통, 사시, 측두하악관절장애(temperomandibular joint disorder), 및 다양한 종류의 근육 경련 및 발작을 포함한다. 보다 최근에는, 보툴리눔 독소의 근육-마비 효과가 주름, 찡그린 선(frown lines), 및 안면 근육의 경련 또는 수축의 다른 결과들의 치료와 같은 치료적 및 미용학적 안면 적용에서 이용되었다.
A형 보툴리눔 외에, 그람-양성 박테리아인 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 생성되는, 혈청학적으로(serologically) 구별되는 7종의 다른 보툴리눔 독소가 있다. 이 8종의 혈청학적으로 구별되는 보툴리눔 독소 중에서,마비를 유발할 수 있는 7종이 보툴리눔 독소 혈청형, A형, B형, C형, D형, E형, F형 및 G형으로 지정되었다. 이들 각각은 혈청형-특이적 항체(type-specific antibody)에 의한 중화에 의해 구별된다. 보툴리눔 독소 단백질 각각의 분자량은 약 150 kD이다. 보툴리눔 독소의 분자 크기 및 분자 구조 때문에, 보툴리눔 독소는 각질층 및 하부 피부 구조(underlying skin architecture)의 다중층을 통과할 수 없다. 보툴리눔 독소의 상이한 혈청형은 효과 및 그들이 상이한 동물 종에서 유발하는 마비의 중증도 및 지속기간이 다양하다. 예를 들면, 랫트에서 A형 보툴리눔 독소는 생성된 마비율에 의해 측정된 바와 같이, B형 보툴리눔 독소보다 500배 더 강력하다. 또한, B형 보툴리눔 독소는 A형 보툴리눔 독소의 영장류 LD50의 약 12배인, 480 U/kg의 투여량에서 영장류에서 무독성인 것으로 확인되었다.
클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 의해 분비되는, 보툴리눔 독소는 결합된 비-독소 단백질(non-toxin protein)과 함께 약 150 kD의 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 독소 복합체의 성분이다. 이 내생 비-독소 단백질은 헤마글루티닌 단백질의 패밀리 및 비-헤마글루티닌 단백질을 포함하는 것으로 생각된다. 상기 비-독소 단백질은 독소 복합체에서 보툴리눔 독소 분자를 안정화시키고, 변성(denaturation)으로부터, 예를 들면, 독소 복합체가 섭취되는 경우, 소화 산(digestive acid)에 의한 변성으로부터 이를 보호하는 것으로 생각된다. 따라서, 상기 독소 복합체의 비-독소 단백질은 보툴리눔 독소의 활성을 보호하고, 그에 의해, 상기 독소 복합체가 위장관을 통해 투여되는 경우 전신 투과(systemic penetration)를 증가시킨다. 또한, 비-독소 단백질의 일부는 혈액 내의 보툴리눔 독소 분자를 안정화시키는 것으로 사료된다.
상기 독소 복합체 내에서 비-독소 단백질의 존재는 상기 독소 복합체가 전술된 바와 같이, 약 150 kD인 보툴리눔 독소 분자 자체의 분자량보다 더 큰 분자량을 갖게 한다. 예를 들면, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아는 약 900 kD, 500 kD 또는 300 kD의 분자량을 갖는 A형 보툴리눔 독소 복합체를 생성할 수 있다. B형 및 C형 보툴리눔 독소는 약 700 kD 또는 약 500 kD의 분자량을 갖는 복합체로서 생성되는 것으로 보인다. D형 보툴리눔 독소는 약 300 kD 또는 500 kD의 분자량을 갖는 복합체로 생성된다. E형 및 F형 보툴리눔 독소는 약 300 kD의 분자량을 갖는 복합체로서 생성된다.
보툴리눔 독소에 추가적인 안정성을 제공하기 위해, 통상적으로 제조 동안 보툴리눔 독소 복합체를 알부민과 조합하는 것에 의해 독소 복합체를 안정화시킨다. 예를 들면, BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA)은 부속 단백질(accessory protein), 0.5 밀리그램의 인간 알부민을 포함하는 A형 보툴리눔 독소 100 U, 및 0.9 밀리그램의 염화나트륨을 포함하는 보툴리눔 독소-함유 제제이다. 상기 알부민은 제조, 수송, 보관, 및 투여와 연관된 환경을 포함한, 이질적인 환경에서 독소 복합체에 결합하여 이를 안정화시키는 작용을 한다.
일반적으로, 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 복합체와 알부민을 포함하는 조성물의 세심한 제어 주사(controlled injection)에 의해 환자에게 투여된다. 그러나, 이 접근방법과 관련된 여러 문제들이 있다. 주사가 고통스러울 뿐 아니라, 그들은 종종 원하는 치료 또는 미용 효과를 달성하기 위해, 주사 부위 주위에 국소로 대형 피하 웰(subdermal well of toxin)을 형성하기에 충분한 독소를 전달해야 한다. 보툴리눔 독소는 이 피하 웰로부터 이동하여 신체의 주변 영역에서 원치않는 마비를 유발할 수 있다. 이 문제는 치료대상 영역이 크고 다수의 주사가 요구되는 경우 심각해진다. 또한, 주사된 독소 복합체는 보툴리눔 독소를 안정화시키고 독소-단백질의 분자량을 증가시키는 비-독소 단백질 및 알부민을 포함하기 때문에, 상기 독소 복합체는 체내에서 긴 반감기를 가지며, 환자에서 바람직하지 않은 항원성 반응을 유발할 수 있다. 예를 들면, 일부 환자는 시간의 경과에 따라 현재의 시판 제제에서 안정화제를 이용되는 알부민에 대한 알레르기를 발병할 것이다. 또한, 독소 복합체는 환자의 면역계가 중화 항체(neutralizing antibody)를 형성하도록 유도할 수 있어서, 동일한 효과를 달성하기 위해, 후속 투여에서 보다 많은 양의 독소가 요구된다. 이 상황이 발생하는 경우, 이들이 환자의 혈류 내로 치명적인 전신 중독(systemic poisoning)을 초래하는 다량의 독소를 배출하지 않도록, 후속 주사는 조심스럽게 배치하며, 이는 특히, 무독성 단백질 및 알부민이 혈액 중의 보툴리눔 독소를 안정화시키기 때문이다.
현재의 보툴리눔 독소 제제와 연관된 단점을 고려할 때, 효과적이고 안정하나, 감소된 항원성 및 주사 후 국소로 확산되는 보다 낮은 경향을 보이는 주사용 보툴리눔 독소 제제를 갖는 것이 매우 바람직할 것이다. 또한, 다양한 치료적, 심미적 및/또는 미용적 목적을 위해 그와 같은 보툴리눔 독소 제제를 이용하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명은 양으로 하전된 담체 분자와 비-공유결합에 의해(non-covalently) 결합된 보툴리눔 독소를 포함하는 주사용 조성물을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 종래의 상업적인 주사용 보툴리눔 독소 제제, 예를 들면, BOTOX® 또는 MYOBLOC®에 비해 하나 이상의 장점을 갖는다. 예를 들면, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 기존의 보툴리눔 독소 제제 대비, 감소된 항원성, 주사 후 주변 조직으로 확산되는 감소된 경향, 임상적 효능의 증가된 지속기간, 또는 강화된 효능, 임상적 효능의 보다 빠른 개시 및/또는 개선된 안정성을 포함한 하나 이상의 장점을 보일 수 있다.
본 발명의 일 양태는 특정한 비-원형(non-native) 분자(즉, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아로부터 수득된 보툴리눔 독소 복합체에서 발견되지 않는 분자)가 조직을 통한 독소 확산을 개선하기 위해, 보툴리눔 독소, 보툴리눔 독소 복합체, 및 특히, (본 명세서에서 정의된 바와 같은) 감소된 보툴리눔 독소 복합체에 첨가될 수 있다는 인식이다. 상기 비-원형 분자는 상기 독소와 비-공유결합에 의해 결합하고 주사 후 상기 독소가 표적 구조에 도달하는 능력을 개선하는 침투 촉진제(penetration enhancer)로 작용한다. 또한, 상기 비-원형 분자는 주사 전 및 후에 상기 독소의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예로서, 상기 침투 촉진제는 내재된 보투리눔-독소-유사 활성을 갖지 않고, 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain)을 포함하는, 양이온성 펩티드와 같은 양으로 하전된 담체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 보툴리눔 독소, 보툴리눔 독소 복합체(또는 150 kD 신경독소 자체, 또는 원형 복합체 단백질의 전부는 아닌, 일부를 포함하는 신경독소를 포함한 감소된 보툴리눔 독소 복합체) 및 양으로 하전된 담체를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 개체 또는 환자에게 유효량의 본 발명의 조성물을 주사하는 것에 의해 생물학적(biologic) 효과를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 생물학적 효과는 예를 들면, 근육 마비, 과다분비 또는 발한의 감소, 신경 통증 또는 편두통의 치료, 비염 또는 부비동염의 관리, 과민성 방광의 치료, 근육 경련의 경감, 여드름의 치료 또는 경감, 면역 반응의 경감 또는 강화, 주름 감소, 또는 다양한 기타 질환의 예방 또는 치료를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 보툴리눔 독소, 보툴리눔 독소 복합체, 또는 감소된 보툴리눔 독소 복합체 및 양으로 하전된 담체를 포함하는 제제, 또는 결과적으로 그와 같은 제제를 제조하기 위해 이용될 수 있는 프리믹스(premix)를 포함하는 키트를 제공한다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체(또는 150 kD 신경독소 자체 또는 일부 원형(native) 복합체 단백질을 포함하는 신경독소를 포함하는 감소된 보툴리눔 독소 복합체) 및 양으로 하전된 담체를 순차적으로 투여하기 위한 수단을 포함하는 키트가 제공된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 보툴리눔 독소, 보툴리눔 독소 복합체, 또는 감소된 보툴리눔 독소 복합체를 포함하는 신규한 주사용 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 독소를 안정화시키거나 또는 주사 후 조직을 통한 독소의 수송 또는 전달을 가능하게 하여, 상기 독소가 외생(exogenous) 알부민에 결합된 종래의 상업적 보툴리눔 독소 복합체(예를 들면, BOTOX® 또는 MYOBLOC®)에 비해, 감소된 항원성, 보다 우수한 안정성 프로파일, 증가된 효능(potency), 임상적 효과의 보다 신속한 개시 및/또는 임상적 효과의 보다 긴 지속기간을 갖는다. 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은, 다양한 치료적, 심미적 및/또는 미용적 목적을 위해, 개체에게 보툴리눔 독소를 제공하기 위한 주사 적용으로 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 보툴리눔 독소의 전달을 위한 다른 조성물 및 방법에 비해 개선된 안정성 프로파일을 갖는다. 또한, 이 조성물은 보툴리눔 독소에 대한 면역 반응의 유용한 경감을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보툴리눔 독소(botulinum toxin)"는 박테리아 또는 재조합 기법에 의해 생성되는지 여부에 관계없이 임의의 공지된 종류의 보툴리눔 독소(즉, 약 150 kD의 보툴리눔 독소 단백질 분자), 및 새로 발견된 혈청형(serotype), 및 공학적으로 조작된 변이체 또는 융합 단백질을 포함한, 나중에 발견될 수 있는 종류의 보툴리눔 독소를 의미한다. 전술된 바와 같이, 현재 7종류의 면역학적으로 구별되는 보툴리눔 신경독소, 각각 타입-특이적 항체(type-specific antibody)에 의한 중화에 의해 구별되는, 보툴리눔 신경독소 혈청형 A, B, C, D, E, F 및 G가 밝혀졌다. 보툴리눔 독소 혈청형은 예를 들면, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)와 Metabiologics, Inc. (Madison, Wisconsin) 및 기타 출처로부터 상업적으로 구매가능하다. 상이한 혈청형의 보툴리눔 독소는 그들이 영향을 미치는 동물 종 및 그들이 유발하는 마비의 중증도 및 지속기간이 다양하다. 적어도 두 타입의 보툴리눔 독소, A형 및 B형이 특정한 상태의 치료를 위한 제제로 상업적으로 구매가능하다. 예를 들면, A형은 상표명 BOTOX®를 갖는 알레르겐(Allergen) 및 상품명 DYSPORT®를 갖는 입센(Ipsen)의 제제에 포함되고, B형은 상품명 MYOBLOC®을 갖는 엘란(Elan)의 제제에 포함된다.
본 발명의 조성물에서 사용되는 용어 "보툴리눔 독소"는 대안적으로 보툴리눔 독소 유도체, 즉, 보툴리눔 독소 활성을 가지나 천연 보툴리눔 독소 또는 재조합 원형(recombinant native) 보툴리눔 독소에 대해 임의의 부분 또는 임의의 아미노산 사슬 상에 하나 이상의 화학적 변형 또는 기능적 변형을 포함하는 보툴리눔 독소 유도체를 의미할 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소는 원형에 비해 결실, 변형 또는 치환된 하나 이상의 아미노산을 갖는 신경독소인 변형된 신경독소일 수 있거나, 또는 상기 변형된 신경독소는 재조합 기법에 의해 생산된 신경독소 또는 그의 유도체 또는 그의 단편일 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소는 그의 특성을 강화하거나 또는 바람직하지 않은 부작용을 감소시키나, 여전히 원하는 보툴리눔 독소 활성을 유지하는 방식으로 변형된 보툴리눔 독소일 수 있다. 보툴리눔 독소는 전술된 바와 같이, 박테리아에 의해 생성된 임의의 보툴리눔 독소 복합체일 수 있다. 대안적으로, 본 발명에서 사용된 보툴리눔 독소는 재조합 또는 합성 화학적 기법을 이용하여 생성된 독소, 예를 들면, 재조합 펩티드, 융합 단백질, 또는 예를 들면, 상이한 보툴리눔 독소 혈청형의 서브유닛 또는 도메인으로부터 제조된 하이브리드 신경독소(예를 들면, 미국특허 제6,444,209호 참조)일 수 있다. 보툴리눔 독소는 또한 필요한 보툴리눔 독소 활성을 갖는 것으로 입증된 전체 분자의 일부일 수 있고, 그와 같은 경우에 그 자체로서, 또는 조합 또는 컨쥬게이트 분자, 예를 들면, 융합 단백질의 일부로서 이용될 수 있다. 대안적으로, 보툴리눔 독소는 그 자체로 무독성일 수 있는 보툴리눔 독소 전구체, 예를 들면, 단백질분해효소에 의한 절단시 독성을 갖게 되는 무독성 아연 프로테아제(zinc protease)의 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "보툴리눔 독소 복합체(botulinum toxin complex)" 또는 "독소 복합체"는 결합된 내생의 비-독소 단백질(즉, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 의해 생산된 헤마글루티닌 단백질 및 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질)을 갖는, 약 150 kD의 보툴리눔 독소 단백질(보툴리눔 독소 혈청형 A-G 중 하나에 속함)을 의미한다. 그러나, 보툴리눔 독소 복합체는 클로스트리디움 보툴리눔 세균로부터 하나의 독소 복합체(unitary toxin complex)로서 유래되지 않아도 된다. 예를 들면, 보툴리눔 독소 또는 변형된 보툴리눔 독소가 먼저 재조합 기법에 의해 제조되고 뒤이어 비-독소 단백질과 조합될 수 있다. 또한, 재조합 보툴리눔 독소가 (예를 들면, List Biological Laboratories, Campbell, CA로부터) 구매되고 비-독소 단백질과 조합될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 외생(exogenous) 안정화제의 첨가, 내생 안정화제의 제거, 또는 이들의 조합을 통한 보툴리눔 독소 분자의 안정성의 조절을 고려한다. 예를 들면, 본 발명은 보툴리눔 독소 복합체가 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 의해 생성된 보툴리눔 독소 복합체에서 자연적으로 발견되는 양에 비해 감소된 양의 비-독소 단백질을 갖는 것인 "감소된 보툴리눔 독소 복합체(reduced botulinum toxin complex)"를 고려한다. 일 구체예에서, 감소된 보툴리눔 독소 복합체는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아로부터 유래된 보툴리눔 독소 복합체로부터 헤마글루티닌 단백질 또는 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질(non-toxin non-hemagglutinin protein)의 분획을 추출하기 위한 임의의 통상적인 단백질 분리 방법을 이용하여 제조된다. 예를 들면, 감소된 보툴리눔 독소 복합체는 보툴리눔 독소 복합체를 7.3의 pH에서 적혈구 세포에 노출시켜 분리시키는 것에 의해 제조될 수 있다(참조에 의해 본 명세서에 포함된, EP 1514556 Al 참조). HPLC, 투석, 컬럼, 원심분리 및 단백질로부터 단백질을 추출하는 기타 방법이 이용될 수 있다. 대안적으로, 감소된 보툴리눔 독소 복합체가 합성에 의해 제조된 보툴리눔 독소를 비-독소 단백질과 조합시키는 것에 의해 제조되는 경우, 천연 보툴리눔 독소 복합체에 존재하는 것보다 적은 양의 헤마글루티닌 또는 비-독소, 비-헤마글루티닌 단백질을 상기 조합에 첨가할 수 있다. 본 발명에 따른 감소된 보툴리눔 독소 복합체에 담긴 임의의 비-독소 단백질(예를 들면, 헤마글루티닌 단백질 또는 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질 또는 양자 모두)은 독립적으로 임의의 양만큼 감소될 수 있다. 특정한 대표적인 구체예에서, 하나 이상의 비-독소 단백질은 보툴리눔 독소 복합체에서 일반적으로 발견되는 양 대비 약 0.5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소된다. 전술된 바와 같이, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아는 7개의 상이한 혈청형의 독소를 생성하고 상이한 상대적 양의 비-독소 단백질과 함께(즉, 상이한 양의 독소 복합체) 상용 제제로 제조된다. 예를 들면, MYOBLOC™은 0.05% 인간 혈청 알부민, 0.01 M 소디움 숙시네이트, 및 0.1 M 염화나트륨과 함께 ml 당 5000 U의 B형 보툴리눔 독소를 갖는다. DYSPORT™는 125 mcg 알부민 및 2.4 mg 락토오스와 함께 500 U의 A형 보툴리눔 독소-헤마글루티닌 복합체를 갖는다. 특정 흥미로운 구체예에서, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아로부터 유래된 보툴리눔 독소 복합체에서 일반적으로 발견되는 실질적으로 모든 비-독소 단백질(예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하는 양의 헤마글루티닌 단백질 및 비-독소 비-헤마글루니틴 단배질)이 보툴리눔 독소 복합체로부터 제거된다. 또한, 일부 경우에 내생 비-독소 단백질이 동일한 양만큼 감소될 수 있으나, 본 발명은 또한 각각의 내생 비-독소 단백질이 상이한 양씩 감소되는 경우 및 내생 비-독소 단백질 중 하나 이상을 감소시키고 나머지는 감소시키지 않는 경우를 고려한다.
전술된 바와 같이, 외생 안정화제(예를 들면, 알부민)는 통상적으로 보툴리눔 독소 제제를 안정화시키기 위해 첨가된다. 예를 들면, BOTOX®의 경우, 100 U의 A형 보툴리눔 독소 복합체 당 0.5 mg의 인간 알부민이 상기 복합체를 안정화시키기 위해 첨가된다. 일반적으로, 본 발명에 따른 조성물을 안정화시키기 위해 첨가될 수 있는 외생 안정화제의 양은 구체적으로 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 첨가되는 안정화제의 양은 본 발명의 양으로 하전된 담체가 그 자체로 안정화제로 작용하는 능력 때문에, 통상적으로 첨가되는 양보다 더 낮을 수 있다. 예를 들면, 첨가된 외생 알부민의 양은 통상적인 1000배 과량의 외생 알부민보다 더 작은 양일 수 있고, 본 발명의 일부 대표적인 구체예에서, 100 U의 보툴리눔 독소 당 약 0.25, 0.20, 0.15, 0.10, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.00001, 0.000005, 0.000001, 또는 0.0000001 mg에 불과하다. 일 구체예에서, 외생 알부민이 본 발명의 조성물에 안정화제로 첨가되지 않는다.
본 발명에 따르면, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 단백질 형질도입 도메인 또는 효능기(efficiency group)를 갖는 양으로 하전된 담체 분자는 보툴리눔 독소의 수송 시스템으로서 적합하여, 독소가 근육 및/또는 기타 피부-연관 구조와 같은 표적 구조로의 개선된 침투율로 주사될 수 있게 하는 것으로 확인되었다. 수송은 보툴리눔 독소의 공유결합에 의한 변형 없이 일어난다. 보툴리눔 독소의 침투 촉진 외에, 본 발명의 양으로 하전된 담체는 일부 바람직한 구체예에서, 보툴리눔 독소를 분해로부터 안정화시킨다. 그와 같은 구체예에서, 통상적으로 보툴리눔 독소를 안정화시키기 위해 존재하는 헤마글루티닌(hemagglutinin) 단백질 및 비-독소, 비-헤마글루티닌 단백질(non-toxin, non-hemagglutinin protein)은 감소되거나 또는 완전히 생략될 수 있다. 유사하게, 제조 동안 통상적으로 첨가되는 외생 알부민이 생략될 수 있다.
용어 "담체(carrier)"와 관련하여 용어 "양으로 하전된(positively charged)" 또는 "양이온성(cationic)"의 사용에 의해, 상기 담체는 적어도 일부 용액-상(solution-phase) 조건 하에서, 보다 바람직하게는 적어도 일부 생리학적으로 적합한(physiologically compatible) 조건 하에 양 전하를 갖는다는 것을 의미한다. 보다 구체적으로, 본 명세서에서 사용된 "양으로 하전된" 및 "양이온성"은 해당 작용기가 모든 pH 조건 하에서 하전된 관능기, 예를 들면, 사차 아민을 포함하거나, 또는 일부 용액-상 조건 하에서, 예를 들면, 일차 아민의 경우, pH 변화 하에서 양전하를 얻을 수 있는 관능기를 포함한다는 것을 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 명세서에서 사용된 "양으로 하전된" 또는 "양이온성"은 생리학적으로 적합한 조건 하에서 음이온과 결합하는 거동을 갖는 작용기들을 의미한다. 복수의 양으로 하전된 모이어티를 갖는 중합체는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 단일중합체(homopolymer)일 필요는 없다. 양으로 하전된 모이어티의 다른 예들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 종래 기술에서 잘 알려져 있고, 용이하게 채택될 수 있다.
일반적으로, 양으로 하전된 담체("양으로 하전된 백본(positively charged backbone)"으로도 지칭됨)는 통상적으로 생리학적 pH에서 양 전하를 갖는 사슬 중의 작용기를 갖거나, 또는 백본으로부터 연장되는 곁사슬에 결합된 양전하를 갖는 작용기를 갖는, 원자들의 사슬이다. 일부 바람직한 구체예에서, 양으로 하전된 백본은 양이온성 펩티드이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "펩티드(peptide)"는 아미노산 서열을 의미하나, 상기 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기의 갯수에 대한 암시를 포함하지 않는다. 따라서, 용어 "펩티드"는 또한 폴리펩티드 및 단백질을 포괄할 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 양으로 하전된 백본 자체는 정해진 효소적 또는 치료적 생물학적 활성을 갖지 않을 것이다. 일부 구체예에서, 상기 백본은, 특정 구체예에서 질소, 산소, 황, 실리콘 및 인으로부터 선택된 헤테로원자에 의해 중단되는, 선형 탄화수소 백본이다. 백본 사슬 원자의 대부분은 일반적으로 탄소이다. 추가적으로, 상기 백본은 종종 반복 단위의 중합체(예를 들면, 아미노산, 폴리(에틸렌옥시), 폴리(프로필렌아민), 폴리알킬렌이민, 등)일 것이나, 헤테로중합체일 수 있다. 일군의 구체예에서, 양으로 하전된 백본은 아민 질소 원자의 다수가 양전하를 갖는 암모늄기(테트라-치환)로 존재하는 것인 폴리프로필렌아민이다. 또 다른 구체예에서, 양으로 하전된 백본은 폴리알킬렌이민, 예를 들면, 약 10,000 내지 약 2,500,000, 바람직하게는, 약 100,000 내지 약 1,800,000, 가장 바람직하게는 약 500,000 내지 약 1,400,000의 분자량을 갖는, 폴리에틸렌이민 또는 폴리프로필렌이민과 같은 헤테로-중합체 또는 단일-중합체일 수 있는 비펩티드(nonpeptidyl) 중합체이다. 또 다른 군의 구체예에서, 상기 백본은 양으로 하전된 작용기(예를 들면, 암모늄기, 피리디늄기, 포스포늄기, 술포늄기, 구아니디늄기, 또는 아미디늄기)를 포함하는 복수의 곁사슬 모이어티를 갖는다. 이 군의 구체예에서 곁사슬 모이어티는 거리(separation)가 일정하거나 가변적인, 백본을 따른 간격(spacing)으로 배치될 수 있다. 또한, 곁사슬의 길이는 유사하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 이 군의 구체예에서, 곁사슬은 1 내지 20개의 탄소 원자를 가지며, 원위 말단(백본으로부터 떨어진 말단)에서 전술된 양으로 하전된 작용기 중 하나로 종료되는 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 사슬일 수 있다. 양으로 하전된 담체와 보툴리눔 독소 간의 결합은 비-공유결합성 상호작용에 의하며, 그의 비-한정적인 예는 이온성 상호작용, 수소 결합, 반 데스 발스 힘(van der Waals force), 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 군의 구체예에서, 상기 양으로 하전된 백본은 복수의 양으로 하전된 곁사슬기(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 호모아르기닌, 등)을 갖는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, 상기 폴리텝티드는 약 100 내지 약 1,500,000, 보다 바람직하게는 약 500 내지 약 1,200,000, 가장 바람직하게는 약 1000 내지 약 1,000,000의 분자량을 갖는다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 아미노산이 본 발명의 이 부분에서 사용될 때, 곁사슬은 결합 중심(center of attachment)에서 D- 또는 L-형(R 또는 S 배열)을 가질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특정한 바람직한 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 약 500 내지 약 5000, 보다 바람직하게는 약 1000 내지 약 4000, 보다 바람직하게는 약 2000 내지 약 3000의 분자량을 갖는다.
대안적으로, 상기 백본은 아미노산 유사체 및/또는 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 백본은 또한 펩토이드(peptoid)와 같은 폴리펩티드의 유사체일 수 있다. 예를 들면, Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80 (1992); 및 Simon et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:9367 (1992))을 참조한다. 요약하면, 펩토이드는 곁사슬이 α-탄소 원자가 아니라, 백본 질소 원자에 결합된 것인 폴리글리신이다. 전술된 바와 같이, 곁사슬의 일부는 통상적으로 양으로 하전된 백본 성분을 제공하기 위해 양으로 하전된 작용기로 종료될 것이다. 펩토이드의 합성은 예를 들면, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제5,877,278호에 기재된다. 본 명세서에서 상기 용어가 사용되는 경우, 펩토이드 백본 구조(peptoid backbone construction)을 갖는 양으로 하전된 백본은 알파-탄소 위치에 천연 곁사슬을 갖는 아미노산으로 구성되지 않기 때문에 "비-펩티드(non-peptide)"로 간주된다.
다양한 다른 백본들, 예를 들면, 펩티드의 아미드 결합이 에스테르 결합, 티오아미드(--CSNH--), 역전 티오아미드(reversed thioamide)(--NHCS--), 아미노메틸렌(--NHCH2--) 또는 역전 메틸렌아미노(--CH2NH--)기, 케토-메틸렌(--COCH2--)기, 포스피네이트(--PO2RCH2--), 포스폰아미데이트 및 포스폰아미데이트 에스테르(--PO2RNH--), 역 펩티드(reverse peptide)(--NHCO--), 트랜스-알켄(--CR=CH--), 플루오로알켄(--CF=CH--), 디메틸렌(--CH2CH2--), 티오에테르(--CH2S--), 히드록시에틸렌(--CH(OH)CH2--), 메틸렌옥시(--CH2O--), 테트라졸(CN4), 술폰아미도(--SO2NH--), 메틸렌술폰아미도(--CHRSO2NH--), 역전 술폰아미드(--NHSO2--)와 같은 대리물(surrogate)로 교체된 것인 폴리펩티드의 입체 또는 전자적 유사체(steric or electronic mimics)를 이용하는 백본 및 말로네이트 및/또는 겜-디아미노-알킬 서브유닛(gem-diamino-alkyl subunit)을 갖는 백본, 예를 들면, Fletcher 등((1998) Chem. Rev. 98:763)에 의해 검토되고, 그에 인용된 참조문헌에 의해 상세하게 설명된 백본이 이용될 수 있다. 전술된 치환의 다수는 α-아미노산으로부터 형성된 백본 대비 거의 등전자(isosteric) 중합체 백본을 초래할 것이다.
전술된 백본의 각각에, 양으로 하전된 기를 갖는 곁사슬기가 부착될 수 있다. 예를 들면, 술폰아미드-결합 백본(--SO2NH-- 및 --NHSO2--)은 질소 원자에 결합된 곁사슬기를 가질 수 있다. 유사하게, 히드록시에틸렌 (--CH(OH)CH2--) 결합은 히드록시 치환기에 결합된 곁사슬을 가질 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 표준 합성 방법을 이용하여 양으로 하전된 곁사슬기를 제공하기 위해 다른 결합 화학을 용이하게 개조할 수 있다.
일 구체예에서, 양으로 하전된 백본은 단백질 형질도입 도메인(효능기로도 지칭됨)을 갖는 폴리펩티드이다. 본 명세서에서 사용된, 효능기 또는 단백질 형질도입 도메인은 양으로 하전된 백본의 조직 또는 세포 막을 통한 이동(translocation)을 촉진하는 작용제(agent)이다. 단백질 형질도입 도메인 또는 효능기의 비-한정적인 예는 (gly)n1-(arg)n2, HIV-TAT 또는 그의 단편, 안테나페디아(Antennapedia)의 단백질 형질도입(transduction) 도메인, 또는 그의 단편이고, 상기 첨자 n1은 0 내지 20의 정수이고, 보다 바람직하게는 0 내지 8의 정수이고, 훨씬 더 바람직하게는 2 내지 5의 정수이며, 상기 첨자 n2는 독립적으로 약 5 내지 약 25의 홀수, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 17의 홀수, 가장 바람직하게는 약 7 내지 약 13의 홀수이다. 일부 구체예에서, HIV-TAT 단편은 디술피드 응집과 연관된 문제를 최소화하기 위해, HIV-TAT 분자의 시스테인-풍부(cystein-rich) 영역을 포함하지 않는다. HIV-TAT 단편이 첨자 p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 20의 정수인 것인 식 (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q 또는 (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q를 가지며, 상기 단편은 그의 C-말단 또는 N-말단을 통해 백본에 결합된 것인 구체예가 또한 바람직하다. 특정한 바람직한 구체예에서, p는 1이고, q는 0이거나, 또는 p는 0이고 q는 1이다. 바람직한 HIV-TAT 단편은 첨자 p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 8, 보다 바람직하게는 0 내지 5의 정수인 것인 단편이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 양으로 하전된 곁사슬 또는 분지 기(branching group)는 안테나페디아 (Antp) 단백질 형질도입 도메인 (PTD), 또는 활성을 보유한 그의 단편이다. 이들은 당해 기술 분야에서 알려져 있고, 예를 들면, Console et al., J. Biol. Chem. 278:35109 (2003)로부터 알려져 있고, 본 발명에 의해 고려되는 Antp PTD의 비-한정적인 예는 SGRQIKIWFQNRRMKWKKC이다.
바람직하게는, 양으로 하전된 담체는 총 담체 중량의 백분율로, 약 0.01% 이상의 양, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 50 중량%의 양, 보다 바람직하게는 약 0.05 내지 약 45 중량%, 및 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 30 중량%의 양으로 곁사슬에 양으로 하전된 단백질 형질도입 도메인(side-chain positively charged protein transduction domain)을 포함한다. 식 -(gly)n1-(arg)n2를 갖는 양으로 하전된 단백질 형질도입 도메인의 경우, 바람직한 범위는 약 0.1 내지 약 25%이다.
또 다른 구체예에서, 백본 부분은 폴리라이신이고 양으로 하전된 단백질 형질도입 도메인은 라이신 곁사슬 아미노기 또는 C- 또는 N-말단에 결합된다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 폴리라이신은 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 또는 6000 D 이상, 및 약 2,000,000, 1,000,000, 500,000, 250,000, 100,000, 75,000, 50,000, 및 25,000 D 미만의 분자량을 가질 수 있다. 100 내지 2,000,000 D의 범위 내에서, 하한 및/또는 상한 범위가 각각 100 만큼 증가되거나 또는 감소될 수 있는 것으로 고려되고, 각각의 결과적인 하위 범위(sub-range)는 명확하게 고려된 본 발명의 구체예이다. 일부 대표적인 구체예에서, 상기 폴리라이신은 약 1,000 내지 약 1,500,000 D, 약 2,000 내지 약 800,000 D, 또는 약 3,000 내지 약 200,000 D의 분자량을 갖는다. 다른 대표적인 구체예에서, 상기 폴리라이신은 약 100 내지 약 10,000 D, 약 500 내지 약 5,000 D, 약 1,000 내지 약 4,000 D, 약 1,500 내지 약 3,500 D 또는 약 2,000 내지 약 3,000 D의 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 본 발명에 의해 고려되는 폴리라이신은 상업적으로 이용가능한 (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., USA) 폴리라이신, 예를 들면, 70,000보다 큰 MW을 갖는 폴리라이신, 70,000 내지 150,000의 MW을 갖는 폴리라이신, 150,000 내지 300,000의 MW을 갖는 폴리라이신 및 300,000보다 큰 MW을 갖는 폴리라이신일 수 있다. 적합한 폴리라이신의 선택은 조성물의 나머지 성분들에 의존적이고, 조성물의 전체 순 양전하를 제공하고, 바람직하게는 음으로 하전된 성분의 전체 길이의 1배 내지 4배인 길이를 제공하기에 충분할 것이다. 바람직한 양으로 하전된 단백질 형질도입 도메인 또는 효능기는 예를 들면, -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg (-Gly3Arg7) 또는 HIV-TAT를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 양으로 하전된 백본은 폴리알킬렌이민이고, 그의 비-한정적인 예는 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌이민, 및 폴리부틸렌이민을 포함한다. 특정 구체예에서, 폴리알킬렌이민은 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 또는 6000 D 이상, 및 약 2,000,000, 1,000,000, 500,000, 250,000, 100,000, 75,000, 50,000, 및 25,000 D 미만의 분자량을 갖는다. 100 내지 2,000,000 D의 범위 내에서, 하한 및/또는 상한 범위는 각각 100 만큼 증가되거나 또는 감소될 수 있는 것으로 고려되고, 각각의 결과적인 하위 범위는 명확하게 고려된 본 발명의 구체예이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 담체는 비교적 짧은 폴리라이신 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 백본(직쇄형이거나 분지형일 수 있음)이며 양으로 하전된 분지형 작용기를 갖는다. 이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 그와 같은 담체는 치료적 조성물에서 수송 효율성의 급격한 감소를 유발하는, 백본 및 보툴리눔 독소의 제어되지 않은 응집을 최소화하기 위해 유용한 것으로 사료된다. 상기 담체가 비교적 짧은 직쇄형 폴리라이신 또는 PEI 백본인 경우, 백본은 75,000 D 미만, 보다 바람직하게는 30,000 D 미만, 및 가장 바람직하게는, 25,000 D 미만의 분자량을 가질 것이다. 그러나, 상기 담체가 비교적 짧은 분지형 폴리라이신 또는 PEI 백본인 경우, 백본은 60,000 D 미만, 보다 바람직하게는 55,000 D 미만, 및 가장 바람직하게는 50,000 D 미만의 분자량을 가질 것이다.
하나의 특히 흥미로운 구체예에서, 비-원형 분자는 내재된 보툴리눔-독소-유사 활성을 갖지 않고 또한 본 명세서에 기재된 하나 이상의 단백질 형질도입 도메인을 갖는 양이온성 펩티드이다. 특정한 과학적 이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 상기 펩티드는 주사 후 복합체로 결합된 분자들의 조직 침투를 증가시키고, 피부 내에서 및 인 비트로에서 보툴리눔 독소 안정화를 증가시키는 것으로 사료된다. 이 펩티드에 의해 제공된 증가된 조직 침투는 외생 알부민에 결합된 통상적인 상업용 보툴리눔 독소 복합체(예를 들면, BOTOX® 또는 MYOBLOC®)에 비해, 특히 감소된 항원성, 보다 우수한 안정성 프로파일, 증가된 효능, 임상적 효과의 보다 신속한 발생, 또는 임상적 효과의 보다 긴 지속기간을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물 중 양으로 하전된 담체의 농도는 운동 신경 판(motor nerve plate)과 같은 분자 표적으로의 보툴리눔 독소의 전달을 증가시키기에 충분하다. 또한, 이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 침투 율(penetration rate)은 수용체-매개 동역학을 따르므로, 조직 침투는 수송 속도가 일정해지는 것인 포화점(saturation point)까지 침투-촉진-분자의 양 증가에 따라 증가하는 것으로 사료된다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 첨가된 침투-촉진-분자의 양은 포화 직전에 침투율을 극대화하는 양과 동일하다. 본 발명의 주사용 조성물 중 양으로 하전된 담체의 유용한 농도 범위는 본 명세서에 기재된 보툴리눔 독소 조성물의 단위당, 약 0.1 pg 내지 약 1.0 mg이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물 중 양으로 하전된 담체는 보툴리눔 독소의 단위당, 약 1.0 pg 내지 0.5 mg의 범위로 존재한다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 개체 또는 환자(즉, 특정한 치료를 필요로 하는 인간 또는 다른 포유동물)의 피부 또는 상피로 주사될 수 있는 제형으로 존재한다. 용어 "필요로 하는(in need)"은 약학적 또는 건강-관련 필요성(예를 들면, 바람직하지 않은 안면 근육 경련을 포함하는 상태를 치료할 필요성), 및 미용적 및 주관적 필요성(예를 들면, 안면 조직의 외형을 변형시키거나 또는 개선할 필요성)을 모두 포함하도록 의도된다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 보툴리눔 독소(결합된 비-독소 단백질 또는 감소된 양의 결합된 비-독소 단백질을 포함함)와 양으로 하전된 담체, 및 하나 이상의 추가적인 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 혼합하는 것에 의해 제조된다. 그들의 가장 간단한 형태에서, 그들은 완충 염수(예를 들면, 인산염 완충 염수)와 같은, 수성의 약제학적으로 허용가능한 희석제를 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 그들이 적용될 조직과 융화될 수 있는 피부학적으로 또는 약제학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 매질을 포함한, 주사용 약학적 또는 미용약학적(cosmeceutical) 조성물에서 전형적으로 발견되는 다른 성분들을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "피부학적으로 또는 약제학적으로 허용가능한(dermatologically or pharmaceutically acceptable)"은 그와 같이 기술된 조성물 또는 그의 성분들이 전반적으로, 과도한 독성, 불화합성(incompatibility), 불안정성, 알레르기 반응, 등 없이 조직들과 접촉에서의 사용 또는 환자에서의 사용을 위해 적합하다는 것을 의미한다. 적합한 경우, 본 발명의 조성물은 고려되는 분야 및 특히, 미용학 및 피부학 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 성분을 포함할 수 있다.
그들의 제형 측면에서, 본 발명의 조성물은 용액, 에멀젼(마이크로에멀젼 포함), 현탁액, 겔, 분말, 또는 본 발명의 조성물이 이용될 수 있는 근육 및 기타 조직으로의 주사를 위해 이용되는 기타 전형적인 고체 또는 액체 조성물을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 주사기에 의한 주사를 위해 적합한, 저-점도, 멸균 제제로 존재한다. 본 발명의 조성물은 주사 전에 약제학적으로 허용가능한 액체 희석제를 이용하여 재구성되는 동결건조된 분말의 제형일 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 동결건조된 분말은 약 0.1 내지 약 2000 cP, 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 약 500 cP, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.3 내지 약 50 cP, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 0.3 내지 약 2.0 cP의 점도를 갖는 주사용 제제를 형성하기 위해 액체 희석제로 재구성된다. 본 발명의 조성물은 보툴리눔 독소 및 양으로 하전된 담체 외에, 그와 같은 제품들에서 일반적으로 이용되는 다른 성분들, 예를 들면, 항균제(antimicrobial), 수화제, 조직 확장제(tissue bulking agent) 또는 조직 충전제, 보존제, 유화제(emulsifier), 천연 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 디터전트, 겔화제, 항산화제, 충전제(filler), 증점제(thickner), 분말, 점도 조절제 및 물을 포함하고, 선택적으로 마취제, 항-소양증제(anti-itch actives), 식물 추출물, 컨디셔닝제(conditioning agent), 미네랄, 폴리페놀, 실리콘 또는 그의 유도체, 비타민, 및 약용식물(phytomedicinal)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 주사용 조성물은 시간의 경과에 따라 제어되는 방식으로 피부로 방출되도록 캡슐화되거나 또는 물질 내에 담긴 보툴리눔 독소 및 양으로 하전된 담체를 포함하는 제어-방출형(controlled-release) 조성물 또는 지속-방출형(sustained-release) 조성물의 제형일 수 있다. 보툴리눔 독소 및 양으로 하전된 담체를 포함하는 조성물은 매트릭스, 리포좀, 소포(vesicle), 마이크로캡슐, 미소구체(microsphere) 및 그 등가물에 포함되거나, 또는 고체 입자형 물질(solid particulate material) 내에 포함되고, 이들 모두는 시간의 경과에 따라 보툴리눔 독소의 방출을 제공하도록 선택되고 및/또는 구축될 수 있다. 보툴리눔 독소 및 양으로 하전된 담체는 함께(예를 들면, 동일한 캡슐 내에) 또는 별개로(별개의 캡슐에) 캡슐화될 수 있다.
본 발명에 따른 보툴리눔 독소 제제는 피부 아래의 근육 또는 피부 내의 선 구조(glandular structure)로 (통상적으로 주사기를 사용한) 주사에 의해 마비를 일으키고, 이완(relaxation)을 초래하며, 수축을 경감시키거나, 경련을 예방 또는 경감하거나, 선 분비량(glandular output)을 감소시키거나 또는 다른 원하는 효과를 생성하기에 유효한 양으로 전달될 수 있다. 이 방식에 의한 보툴리눔 독소의 국소 전달은 주사 또는 이식용 물질 대비, 투여량 저하를 가능하게 하고, 독성을 저하시키며 원하는 효과를 위한 보다 정확한 투여량 최적화를 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 보툴리눔 독소의 유효량이 전달되도록 투여된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "유효량(effective amount)"은 원하는 근육 마비 또는 다른 생물학적 또는 심미적 효과를 생성하기에 충분하나, 내재적으로 안전한 양, 즉, 심각한 부작용을 방지할 정도로 충분히 낮은 양인 앞서 정의된 바와 같은 보툴리눔 독소의 양을 의미한다. 원하는 효과는 예를 들면, 미세 라인(fine lines) 및/또는 주름, 특히 안면의 미세 라인 및/또는 주름을 감소시키거나, 또는 눈을 넓히거나, 구각(corner of the mouth)을 높이거나 또는 윗 입술로부터 전개되는 라인을 평탄화하는 것과 같은 다른 방식으로 안면의 외형을 조정하거나, 또는 근육 긴장의 전반적인 완화(general relief)를 목적으로 한 일부 근육의 이완을 포함한다. 마지막에 언급된 효과, 근육 긴장의 전반적인 완화는 얼굴 또는 그 외의 부위에서 일어날 수 있다. 본 발명의 조성물은 단일-투여 치료제로서의 적용을 위한 보툴리눔 독소의 적합한 유효량을 포함하거나, 또는 투여 장소에서 희석을 위해, 또는 복수 적용으로의 사용을 위해 보다 농축된 것일 수 있다. 본 발명의 양으로 하전된 담체의 이용을 통해, 보툴리눔 독소는 주름, 바람직하지 않은 안면 근육 또는 다른 근육 경련, 다한증, 여드름과 같은 상태 또는 근육통 또는 경련의 완화가 바람직한 신체 내의 부위에서의 상태를 치료하기 위해 개체에게 주사에 의해 투여될 수 있다. 보툴리눔 독소는 근육 또는 기타 피부-관련 표적 구조, 또는 기타 표적 조직 구조로 주사에 의해 투여된다. 투여는 예를 들면, 다리, 어깨, 등(허리 포함), 액와, 손바닥, 발, 목, 얼굴, 서혜부(groin), 손등 또는 발등, 팔꿈치, 상완, 무릎, 상지(upper leg), 둔부, 몸체(torso), 골반, 또는 보툴리눔 독소의 투여가 바람직한 신체의 기타 부위로 이루어질 수 있다.
본 발명의 주사용 보툴리눔 독소-함유 조성물의 투여는 또한 아세틸콜린의 시냅스 전달(synaptic transmission) 또는 분비의 억제가 치료 효과를 갖는 것인 상태를 포함한 다른 상태들을 치료하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 조성물에 의해 치료될 수 있는 상태는 신경 통증, 편두통 또는 기타 두통, 과민성 방광, 비염, 부비동염, 여드름, 근긴장 이상증, (자각적 또는 임상적) 근긴장 이상성 수축, (자각적 또는 임상적) 다한증, 및 콜린성 신경계에 의해 제어되는 하나 이상의 선의 과다분비를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 조성물은 또한 면역계를 저하 또는 강화하기 위해, 또는 주사에 의한 보툴리눔 독소의 투여가 제안되거나 또는 수행되는 것인 다른 상태의 치료를 위해 이용될 수 있다.
가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 의사 또는 기타 의료 전문가에 의해 또는 그들의 지시 하에 투여된다. 그들은 단일 치료로 또는 시간의 경과에 따라 일련의 치료(a series of treatments)로 투여될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 그 효과가 바람직한 위치 또는 위치들에서 피부에 국소로 적용된다. 그의 속성 때문에, 보툴리눔 독소는 바람직하게는, 부작용 또는 바람직하지 않은 결과를 생성하지 않으면서 원하는 효과를 생성할 적용 비율(application rate) 및 적용 빈도로 투여된다. 예를 들면, 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 피부 표면의 cm2 당 약 1 U 내지 약 20,000 U, 보다 바람직하게는 약 1 U 내지 약 10,000 U 보툴리눔 독소의 비율로 적용되어야 한다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 제어 방출 물질과 함께 보툴리눔 독소가 투여되는 것인 상태에서 이 범위 내에서 보다 높은 투여량이 이용될 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 발명의 보툴리눔 독소 제제는 주사당 1 내지 400 U, 보다 바람직하게는 10 내지 350 U, 훨씬 더 바람직하게는 30 내지 250 U 및 가장 바람직하게는 50 내지 200 U의 보툴리눔 독소를 제공하도록 투여된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 보툴리눔 독소-함유 조성물을 피부를 통해 주사하기 위한 다양한 전달 장치의 이용을 고려한다. 그와 같은 장치는 주사 바늘과 주사기를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않고, 상기 조성물을 분배할 수 있고 그의 분배를 모니터링할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 양태에서 개체의 상태를 모니터링(예를 들면, 분배된 물질에 대한 개체의 반응을 모니터링함)하기 위한 보다 정교한 장치를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 조성물은 미리-제제화되고 및/또는 그 자체로 전달 장치에 미리-장착될 수 있다. 본 발명은 또한 조성물이 하나 이상의 성분을 나머지 성분들과 별도로 보관하는 키트로 제공되는 것인 구체예를 고려한다. 예를 들면, 특정 구체예에서, 본 발명은 적용 시 또는 적용 전에 조합하기 위해 보툴리눔 독소와 양으로 하전된 담체를 별개로 보관하는 키트를 제공한다. 양으로 하전된 담체의 양 또는 보툴리눔 독소 대비 이 분자들의 농도 비는 해당 조성물에서 사용하기 위해 선택된 담체에 따라 결정될 것이다. 주어진 경우에서 담체 분자의 적합한 양 또는 비는 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같은 하나 이상의 실험을 수행하는 것에 의해, 용이하게 결정될 수 있다.
일반적으로, 본 발명은 또한 필요로 하는 개체 또는 환자에게 보툴리눔 독소(바람직하게는 보툴리눔 독소 복합체 또는 감소된 보툴리눔 독소 복합체로서)를 투여하는 방법으로서, 보툴리눔 독소의 유효량이 본 명세서에 기재된 바와 같이, 양으로 하전된 담체와 함께 국소로 투여되는 것인 방법을 고려한다. "함께(in conjunction with)"는 두 성분들(보툴리눔 독소 및 양으로 하전된 담체)이 조합 방법으로 투여된다는 것을 의미하며, 조합 방법은 그들을 개체에 대한 국소 투여 전에 조합하거나 또는 별도로 투여하나, 그들이 유효량의 치료 단백질의 필요한 전달을 제공하기 위해 함께 작용하는 방식으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 담체를 포함하는 조성물이 개체의 피부에 먼저 투여되고, 뒤이어 보툴리눔 독소를 포함하는 주사기 또는 다른 장치가 적용될 수 있다. 보툴리눔 독소는 주사기 또는 다른 분배 장치(dispensing device)에 건조된 제형으로 내포될 수 있고 양으로 하전된 담체는 상기 독소의 적용 전에 주사되어, 상기 두 성분들이 함께 작용하여 원하는 조직 침투 촉진을 가져올 수 있다. 그와 같은 측면에서, 두 성분들(양으로 하전된 담체 및 보툴리눔 독소)은 조합되어 작용하거나 또는 인 시투(in situ)로 조성물 또는 배합을 형성하기 위해 상호작용한다. 따라서, 본 발명은 또한 피부를 통해 보툴리눔 독소를 분배하는 장치 및 양으로 하전된 담체를 포함하고 개체의 피부 또는 표적 조직에 적용하기에 적합한 액체, 겔, 등을 포함하는 키트를 포함한다. 의료 전문가의 지시에 따라 또는 환자 또는 개체에 의해 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 키트는 또한 그 목적에 적합한 맞춤형 애플리케이터(custom applicator)를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약 4.5 내지 약 6.3 범위의 pH를 갖는 생리적 환경에서 사용하기에 적합하고 따라서 그와 같은 pH를 가질 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 실온 또는 냉장 조건 하에서 보관될 수 있다.
하기의 실시예 및 본 명세서에 기재된 구체예는 예시 목적만을 위한 것이고 그들에 근거하여 다양한 변형 또는 변화가 본 발명이 속하는 당업자에게 암시되고 이들은 본 출원의 발명 원리 및 범위와 첨부된 청구항의 범위 내에 포함될 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 특허, 및 특허출원은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 1: RT003 또는 BOTOX®의 반복 투여 후 기준(baseline) DAS 값(0.4)으로의 복귀에 필요한 시간을 보여주는 막대 그래프
도 2: 도 2A는 측부-내지-중심선(lateral-to-midline) 주사에 의해 영향받은 마우스의 비복근의 부분을 나타내기 위해 진한 염료(dark dye)가 주사된 마우스의 후지(hind leg)를 보여준다. 도 2B는 중심선 주사에 의해 영향받은 마우스의 비복근의 부분을 나타내기 위해 진한 염료가 주사된 마우스의 후지를 보여준다.
도 3: RT003, RTT150, 또는 BOTOX®의 마우스의 비복근의 측부-내지-중심선 또는 중심선으로의 주사 후 시간의 함수로 측정된 DAS(digital abduction score).
실시예 1
마우스 모델에서 국소 근육 마비의 지속시간
본 실시예는 RT003 또는 BOTOX®를 주사한 마우스에서 국소 근육 마비의 지속시간을 비교한다. RT003은 A형 보툴리눔 독소(모든 내생 비-독소 단백질을 제거하기 위해 정제된 독소) 및 서열 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR을 갖는 양으로 하전된 담체를 포함하는 본 발명에 따른 대표적인 주사용 제제이다. BOTOX®도 A형 보툴리눔 독소를 포함하나, A형 보툴리눔 독소 분자를 안정화시키기 위해 외생 알부민이 첨가된다.
근육 마비를 "A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice", Toxicon 2001;39(12):1815-1820에서 Aoki. K.R.에 의해 보고된 DAS(digit abduction score) 분석을 이용하여 측정하였다. DAS 분석에서, 마우스에 그의 후지(hind limb)를 신장하고 그의 뒷 발가락(hind digit)을 벌리는 것인 특징적인 놀람 반응(startle response)을 유발하기 위해 마우스를 단시간 동안 그의 꼬리에 의해 부유하게 한다. 마우스가 이 놀람 반응을 보일 수 있는 정도를 5점 척도(0 내지 4)로 평가하고, 0점은 정상적인 놀람 반응을 나타내며, 4점은 발가락 벌림(digit abduction) 및 다리 신장(leg extension)의 최대 감소를 나타낸다. 대상 마우스가 신경독소로 처리된 정도에 대한 지식을 갖지 않는 관찰자가 평가한다. DAS 분석을 이용한 기준 점수는 미처리 동물 집단에 대한 0.4로 결정했다.
본 실시예에서 보고된 연구는 10마리의 동물을 포함했다(RT003 그룹의 5 마리의 마우스 및 BOTOX® 그룹의 5마리의 마우스). 각 동물에 개별적인 보툴리눔 독소(즉, RT003 또는 BOTOX®)를 3회 주사하고, 각 투여 간에 40-일 기간을 두었다. 주사 후에, 각 테스트 그룹의 모든 동물들이 DAS 분석의 0.4 기준보다 높았던 일자의 수를 계수하였다. 도 1에 도시된 결과는 RT003-처리 그룹의 DAS 분석 점수는 각각 1번째 처리, 2번째 처리 및 3번째 처리 후 25일, 22일 및 21일 동안 0.4 기준 값보다 높았다는 것을 보여준다. 대조적으로, BOTOX®-처리 그룹의 DAS 분석 점수는 각각 1번째 처리, 2번째 처리 및 3번째 처리 후 11일, 18일 및 11일 동안 0.4 기준값보다 높았다
이 DAS 분석 데이터는 RT003 제제에 의해 유발된 국소 근육 마비가 BOTOX®에 의해 유발된 국소 근육 마비의 거의 2배 기간 동안 지속된다는 것을 나타낸다. 이 결과는 RT003 및 본 발명에 따른 다른 주사용 보툴리눔 독소-함유 화합물의 치료적 용도에 대해 중요한 영향을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 주사용 조성물을 이용하는 것에 의해, 보툴리눔 독소에 의해 유발된 특정한 미용 또는 치료 효과를 유지하기 위해 요구되는 후속 주사의 빈도를 상당히 감소시킬 수 있다. 결과적으로, 적용의 감소된 빈도는 개체가 보툴리눔 독소에 대한 항체를 생성하는 경향을 감소시키기 때문에 보다 우수한 장기적 효과(long-term efficacy)를 가져올 수 있다.
실시예 2
개선된 안전성 프로파일을 갖는 주사용 보툴리눔 독소 제제
지난 수십 년 동안, 보툴리눔 독소는 주름, 다한증, 및 근육 경련을 포함한 다양한 상태를 치료하기 위한 치료제로서의 용도로 이용되었다. 그러나, 보툴리눔 독소는 인간에게 알려진 가장 강력한 천연 독소이므로, 상기 독소의 부적합한 투여는 매우 위험할 수 있다. 예를 들면, 보툴리눔 독소의 우발적인 전신 전달은 마비, 호흡 곤란, 및 심지어 사망을 초래할 수 있다. 또한, 보툴리눔 독소가 치유적 치료의 일부로 신체의 국소 영역에 적절하게 전달되는 경우에도, 상기 독소는 시간의 경과에 따라 자연적으로 확산되는 경향을 가져서, 이에 의해 신체의 다른 부위에서 원치않는 마비를 유발할 위험을 증가시킨다. 예를 들면, 보툴리눔 독소가 주름을 치료하기 위해 눈의 주위에 주사되는 경우, 상기 독소는 안검의 운동을 조절하는 근육까지 확산될 수 있다. 이 확산이 일어나는 경우, 안검 근육은 부분적으로 마비되어, 안검이 부분적으로 닫혀서 정상적인 시각을 방해하는 것인 "안검 하수(eyelid droop)"로 알려진 상태를 초래할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 현재 이용가능한 상업적인 보툴리눔 독소 제제에 비해 개선된 안전성 프로파일을 갖는 주사용 보툴리눔 독소 제제를 제공하는 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 주사용 보툴리눔 독소 제제는 주사 후 감소된 확산 경향을 갖는다. 이에 의해, 본 발명의 특정한 바람직한 제제는 보툴리눔 독소의 보다 정확한 전달을 가능하게 하고, 보툴리눔 독소의 제어되지 않는 국소 확산과 연관된 원치않는 부작용을 현저하게 감소시킨다.
본 실시예는 다양한 제제 중 보툴리눔 독소의 주사 후 확산 경향의 비교 연구를 보고한다. 본 연구는 3종의 보툴리눔 독소 제제를 포함했다: (1) BOTOX®; (2) RT003, 식 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR을 갖는 양으로 하전된 담체와 비-공유결합에 의해 결합된 150 kD A형 보툴리눔 독소 분자를 포함하는 완충되고, 안정화된 용액; 및 (3) RT003에 존재하는 양으로 하전된 담체를 포함하지 않는 것을 제외하고는, RT003 제제와 동일한, RTT150.
본 연구에서 이용된 각 마우스의 비복근에 근육의 측부-내지-중심선 부분(도 2A), 또는 근육의 중심선 부분(도 2B)에 전술된 보툴리눔 독소 제제 중 하나를 주사하였다. 개별적인 제제의 보툴리눔 독소가 비복근으로부터 마우스의 뒷발을 향해 확산되는 경향을 보이는지 여부를 결정하기 위해 보툴리눔 독소의 주사 후 4일 동안 각 마우스를 대상으로 DAS 분석을 수행했다. DAS 분석으로부터, 테스트 동물에서 뒷발가락을 벌리는 능력의 감소를 보툴리눔 독소 확산의 표시로 해석하였다.
도 3은 전술된 상이한 보툴리눔 독소 제제를 테스트 동물에 주사한 후 수행된 DAS 분석의 결과를 보여준다. DAS(digital abduction score)는 주사가 비복근의 중심선 또는 측부-내지-중심선 부분에서 이루어졌는지에 따라 두 개의 클러스터로 분류된다는 것에 주목한다. 측부-내지-중심선 주사에 대한 DAS 점수에 비해, 중심선 주사에 대한 보다 낮은 DAS 점수는 테스트 동물의 뒷발에서 마비의 정도가 전반적으로 중심선 주사 후에 더 낮다는 것을 나타낸다. 이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 이 거동은 측부-내지-중심선 주사에 비해, 중심선 주사 후 테스트 동물의 뒷발가락에 도달하기 위해 보툴리눔 독소가 이동해야 하는 보다 긴 거리로부터 기인된 것으로 사료된다. 이와 같은 보툴리눔 독소에 의한 보다 긴 요구되는 이동 거리가 뒷발가락의 마비 가능성을 감소시키는 것으로 사료된다.
도 3은 RT003 제제의 중심선 주사 후 4일 동안 0의 DAS 점수를 보여준다. 이 결과는 RT003 제제 중의 보툴리눔 독소가 주사 후 비복근의 중심선 부분에 국재화되고 실험 기간 동안 마비-유발 확산이 일어나지 않는다는 것을 나타낸다. 대조적으로, RTT150 및 BOTOX® 제제의 주사 후 0.4의 DAS 기준 점수보다 높은 DAS 점수가 관찰되고, 평균 DAS 점수는 BOTOX® 제제보다 더 높다. RTT 150 및 BOTOX® 제제의 DAS 결과는 이 제제들의 중심선 주사 후 테스트 동물의 뒷발가락 마비가 관찰되며, BOTOX® 제제의 주사 후 보다 높은 정도의 마비가 관찰된다는 것을 나타낸다. 이 데이터는 RTT150 및 BOTOX® 제제 중의 보툴리눔 독소 분자가 주사 후 국소로 확산될 수 있고, BOTOX® 제제 중의 보툴리눔 독소 분자에 대해 보다 높은 정도의 국소 확산이 관찰된다는 것을 나타낸다.
도 3은 또한 특정한 보툴리눔 독소 제제에 관계없이, 측부-내지-중심선 주사 후 모든 테스트 동물에서 뒷발가락 마비가 관찰된다는 것을 보여준다. 앞서 검토된 바와 같이, 중심선 주사에 비해, 측부-내지-중심선 주사 후 보다 높은 정도의 마비는 보툴리눔 독소의 테스트 동물의 뒷발까지의 보다 짧은 거리와 관련된 것으로 사료된다. 그러나, 3개의 보툴리눔 독소 제제가 모두 측부-내지-중심선 주사 후 마비-유발 확산을 보이나, RT003을 주사한 테스트 동물에서 마비의 정도는 실험기간 동안 평균적으로 RTTl50 및 BOTOX® 제제에 대해 관찰된 마비의 정도보다 더 낮다. 따라서, 측부-내지-중심선 주사에 해당하는 DAS 분석 데이터가 RTT150 및 BOTOX®에 비해, RT003 제제의 보툴리눔 독소의 국소 확산에 대한 감소된 경향을 보인다는 점에서 중심선 주사의 데이터와 정성적으로 유사하다.
중심선 주사 및 측부-내지-중심선 주사 후 국소 확산 속도의 비교가 하기 식 (1)에 따라 정의된, "확산 지수(diffusion index)"로 불리는 파라미터를 고려하는 것에 의해 이루어질 수 있다:
Figure pat00001
DAS 점수는 0 내지 4의 범위일 수 있고, 측부-내지-중심선 DAS 점수는 (앞서 검토된 바와 같이) 중심선 DAS 점수보다 더 높을 것으로 예상되므로, 확산 지수 값은 통상적으로 0 내지 100의 범위일 것이다. 100에 접근하는 확산 지수 값은 중심선 DAS 점수와 측부-내지-중심선 DAS 값의 비가 1에 접근한다는 것을 나타낸다. 주사 후 확산의 속도가 충분히 높아서 중심선 주사 및 측부-내지-중심선 주사 후 보툴리눔 독소가 테스트 동물의 뒷발가락에 도달하여 마비시키기 위한 확산 시간이 유사하거나 거의 동일한 경우, 이 상황이 일어날 수 있다. 반대의 극단에서, 0에 접근하는 확산 지수 값은 중심선 DAS 점수와 측부-내지-중심선 DAS 점수의 비가 0에 접근한다는 것을 나타낸다. 측부-내지-중심선 주사 후 마비가 관찰되더라도, 중심선 주사 후 보툴리눔 독소의 확산이 너무 낮아서 테스트 동물의 뒷발가락에서 마비를 유발하기에 불충분한 경우 이 상황이 일어날 수 있다.
표 1은 도 3에 상응하는 실험에서 보고된 바와 같이, BOTOX®, RT003, 및 RTT150의 중심선 또는 측부-내지-중심선 주사 후 DAS 점수를 이용하여 계산된 확산 지수를 보여준다. 실험기간 동안, BOTOX® 제제의 주사에 해당하는 확산 지수 값이 RTT150 및 RT003 제제에 대해 관찰된 값들보다 더 높다. 이는 BOTOX® 제제의 주사의 경우, RTT150 및 RT003 제제에 대해 관찰된 값들에 비해, 중심선 DAS 값 및 측부-내지-중심선 DAS 값의 비가 1에 더 가깝다는 것을 나타낸다. 보툴리눔 독소는 중심선 주사 후 테스트 동물의 뒷발가락 마비를 유발하기 위해 더 멀리 확산되어야 하므로, BOTOX® 주사 후 중심선 DAS 점수와 측부-내지-중심선 DAS 점수의 비가 1에 더 가깝다는 관찰은 BOTOX®의 중심선 주사 후 보툴리눔 독소 확산 속도가 측부-내지-중심선 주사 후 속도에 비해 상당히 크다는 것을 시사한다. 바꾸어 말하면, 중심선 주사와 연관된 증가된 확산 경로 길이가 뒷발가락 마비 유발에 대한 장벽은 아니다.
대조적으로, RT003에 대한 확산 지수 값은 실험의 4일 기간에 대해 모두 0이다. 이 결과는 RT003의 중심선 주사 후 마비-유발 확산이 관찰되지 않는다는 것을 나타낸다. 바꾸어 말하면, 양으로 하전된 담체와 비-공유결합에 의해 결합된 A형 보툴리눔 독소를 포함하는 RT003 제제가 주사된 A형 보툴리눔 독소의 증가된 국재화를 가능하게 한다. 이에 의해, RT003 제제는 BOTOX®의 안정성 프로파일에 비해 개선된 안전성 프로파일을 제공하고 원치않는 마비를 최소화한다.
RT003의 경우에서와 같이 0이 아니나, RTT150에 대한 관찰된 확산 지수 값은 BOTOX® 제제에 대해 관찰된 값들보다 훨씬 더 낮다(표 1 참조). 이 결과는 실험의 4일 동안 관찰가능한 뒷발가락 마비를 생성하기 위해 충분한 보툴리눔 독소 확산이 일어나나, 보툴리눔 독소의 마비-유발 확산을 위해 필요한 시간은 중심선 주사 후 상대적으로 더 길다는 것을 나타낸다.
표 1: RTT150, BOTOX® 및 RT003에 대한 보투리눔 독소 확산 지수 측정값.
처리 후 경과 일수
0 1 2 3 4
BOTOX® NA 42 38 38 9
RT003 NA 0 0 0 0
RTT150 NA 20 20 27 17
실시예 3
감소된 항체 생성 경향을 갖는 주사용 보툴리눔 독소 제제
보툴리눔 독소가 주름과 같은 원치않는 상태를 치료하기 위해 환자에게 주기적으로 투여되는 경우, 보툴리눔 독소의 효과의 지속기간이 동일하게 유지될 수 있으나, 보툴리눔 독소의 효과가 연속적인 주사에 따라 감소된다는 것이 종종 관찰된다. 이 현상은 환자의 면역계에 의한 보툴리눔 독소에 대한 항체의 형성의 결과인 것으로 사료된다. 치료 관점에서, 점차 더 많은 투여량의 보툴리눔 독소가 동일한 효과를 달성하기 위해 요구되고, 이는 안전성 및 비용과 관련된 심각한 문제를 제기하기 때문에, 환자에 의한 보툴리눔 독소에 대한 항체의 형성은 바람직하지 않다.
특정한 구체예에서, 본 발명은 현재 이용가능한 상업적인 주사용 보툴리눔 독소 제제에 비해, 항체 형성을 유도하는 감소된 경향을 갖는 주사용 보툴리눔 독소 제제를 제공한다. 따라서, 이 구체예에서, 보툴리눔 독소 제제는 시간의 경과에 따라 동일한 효과를 달성하기 위해 보다 적은 양의 독소를 사용할 수 있게 하는 것에 의해 보툴리눔 독소와 연관된 위험을 최소화하는데 기여한다.
이 실시예에서, 실시예 2에 기재된 바와 같이 반복된 RT003 및 BOTOX® 주사 후 수득된 DAS 분석 데이터를 동일한 테스트 동물로의 반복된 투여시 이 두개의 제제의 효과 변화를 결정하기 위해 시간의 함수로 분석하였다. 일반적으로, 각 제제의 반복 투여 후, 보툴리눔 독소와 연관된 효과의 지속기간은 동일했다. 그러나, 반복 투여 후 근육 마비의 정도는 제제에 따라 상이했다. 근육 마비 정도의 변화를 정량하기 위해, RT003 또는 BOTOX®의 주사 후 DAS 점수의 퍼센트 변화를 하기 식 (2)에 따라 결정했다:
Figure pat00002
식 (2)의 분자는 n번째 처리 및 제1 처리에 대해 측정된 DAS 점수 간의 차이이므로, n번째 처리에 대해 측정된 DAS 점수가 제1 처리에 대해 측정된 DAS 점수보다 더 낮은 경우, DAS의 퍼센트 변화는 음수일 것이다. 바꾸어 말하면, 1번째 처리에 비해 n번째 처리 후 보다 낮은 정도의 마비가 관찰되는 경우, DAS의 퍼센트 변화는 음수이다. 표 2는 실시예 2에 기재된 절차에 따라 RT003 및 BOTOX® 제제의 반복 투여 후 측정된 DAS 값의 퍼센트 변화를 보여준다.
표 2: RT003 및 BOTOX®의 반복 투여 후 DAS 값의 퍼센트 변화
1번째 투여 1번째 재투여 2번째 재투여
RT003 0% 0% -30%
BOTOX® 0% -44% -67%
표 2에 표시된 바와 같이, 1번째 재투여(retreatment) 후, BOTOX® 제제에 대한 DAS 점수의 퍼센트 변화는 -44%였고, 이는 효과의 상당한 감소를 시사한다. 대조적으로, RT003 제제에 대한 DAS 점수의 퍼센트 변화는 0이었고, 이는 2번째 재투여 후 DAS 점수가 최초 투여 및 1번째 재투여 후 DAS 점수와 동일하다는 것을 시사한다. 이 결과는 RT003의 1번째 재투여 후 관찰된 마비의 정도가 1번째 투여 후 마비의 정도와 동일하고 1번째 재투여후에도 테스트 동물에서 미량의 중화 항체의 형성이 일어났다는 것을 나타낸다. RT003 및 BOTOX®의 2번째 재투여 후, RT003 제제의 DAS 값의 퍼센트 변화의 크기가 BOTOX®에 대해 결정된 값의 절반이나, 두 제제 모두에 대해 DAS 값의 계산된 퍼센트 변화는 음수였다. BOTOX®에 대해 관찰된 DAS 값의 보다 큰 음수의 퍼센트 변화는 RT003에 비해, 테스트 동물이 보다 높은 비율의 BOTOX®에 대한 항체 생성을 갖는다는 것을 시사한다. 따라서, 이 데이터는 RT003과 같은, 본 발명에 의해 고려된 제제가 보툴리눔 독소의 효과를 중화시키는 항체의 형성을 유도하는 보다 낮은 경향을 가질 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 결과는 본 발명에 의해 고려된 제제를 이용하는 것에 의해, 시간의 경과에 따라 동일한 치료 효과를 달성하기 위해 보다 적은 양의 보툴리눔 독소를 사용할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 4
개선된 안정성을 갖는 주사용 보툴리눔 독소 제제
본 실시예는 본 발명의 주사용 보툴리눔 독소 제제에서 사용된 양으로 하전된 담체 분자가 제제의 안전성 프로파일을 개선하고(실시예 2), 또한 그들의 안정 성을 개선한다는 것을 보여준다. 표 3은 다양한 시간 간격 동안 RT003 및 RTT150 제제가 4℃ (RT003 단독) 및 40℃ (RT003 및 RTT150 모두)에서 노화되는 것인 노화(aging) 실험의 결과를 보여준다. 특정된 시간 동안 특정된 온도에서의 노화 후에, RT003 및 RTT150 제제의 효능을 일련의 마우스 IP LD50 분석을 통해 측정했다. 표 3에 요약된 결과들은 RT003의 효능이 6개월 후에도, 4℃에서의 노화 후에 본질적으로 변하지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 제제가 마우스 IP LD50 분석에서 표적 동물을 살상하는 제제의 능력에 의해 측정된 RT003 제제의 효능은 RT003 제제가 6개월 동안 상승된 온도(40℃)에서 노화된 경우에도, 낮은 정도로만 감소된다. 대조적으로, RTT150 제제는 40℃에서 단 1개월의 노화 후 효능의 유의성 있는 감소를 보였다. RT003 및 RTT150 제제는 RT003 제제가 식 RKKRRQRRRG-(K)15-GRKKRRQRRR을 갖는 양으로 하전된 담체 분자를 포함한다는 것을 제외하고는 동일하기 때문에, 이 데이터는 RT003 제제에서 양으로 하전된 담체 분자가 보툴리눔 독소의 안정성을 개선한다는 것을 나타낸다.
표 3: 다양한 조건에서RT003 및 RTT150의 노화(aging) 후 마우스 IP LD50 분석의 결과
조건 (℃) 시간(개월) 목표 대비 %
RT003

 4 0 100%
4 6 118%
40 6 93%
RTT150 40 1 <50%
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Claims (1)

  1. 필요로 하는 개체에게 치료적 또는 미용적 효과를 달성하기 위해 보툴리눔 독소를 투여하는 방법으로서, 상기 방법은
    치료적 또는 미용적 효과를 달성하기 위해 상기 개체에게 유효량의 조성물을 주사하는 단계를 포함하고,
    상기 조성물은
    그에 결합된 복수의 효능기(efficiency group)를 갖는 양으로 하전된 백본을 포함하는 양으로 하전된 담체,
    보툴리눔 독소 복합체, 감소된 보툴리눔 독소 복합체(reduced botulinum complex), 또는 보툴리눔 독소를 포함하고,
    상기 양으로 하전된 담체는 상기 보툴리눔 독소 복합체, 감소된 보툴리눔 독소 복합체, 또는 보툴리눔 독소에 비-공유결합에 의해 결합된 것인 방법.
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