KR20170081699A - Cd47 항체, 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대체로 CD47에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체, 더 구체적으로는 유의한 혈소판 응집 활성을 갖지 않으며 유의한 혈구응집 활성을 갖지 않는 CD47 항체에 관한 것이다. 또한, 이러한 항체를 생성하는 방법 및 이러한 단클론성 항체를 치료제로 사용하는 방법이 제공된다.

Description

CD47 항체, 방법 및 용도{CD47 ANTIBODIES, METHODS, AND USES}

서열 목록

본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2015년 11월 5일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 PRD3361WOPCT_SL.txt이며, 크기가 72,842 바이트이다.

기술분야

본 명세서의 발명 요지는 대체로 CD47에 결합하는 항체에 관한 것이다. 기술된 항-CD47 항체는 백혈병과 같은 혈액학적 장애에 대한 치료제로 유용하다.

인테그린 관련 단백질 (IAP), 난소암 항원 OA3 및 Rh 관련 항원으로도 알려진 단백질 분화 클러스터 47 (CD47)은 편재적으로 발현되는 세포 표면 펜타스팬(pentaspan) 막관통 Ig 수퍼패밀리 구성원이다. CD47은 대식세포 상의 SIRP 알파 (신호 조절 단백질 알파(signal-regulatory protein alpha))와 상호작용하여 식세포작용을 약화시킨다. 이러한 경로를 선택하는 암세포는 식세포작용을 회피하여 암세포 생존을 촉진시킨다 (문헌[Jaiswal, S., et al., Trends in Immunol 31: 212-219, 2010]). 이것은 새로 발견된 종양 면역 회피 메커니즘이며; 이에 따라 CD47을 치료적으로 표적화하는 것은 수많은 암에서 광범위한 적용을 갖는다.

CD47의 발현은 비호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 난소암, 교종, 교아세포종 등을 포함하는 많은 별개의 악성 종양에서 더 나쁜 임상 결과와 상관관계가 있다. 또한, CD47은 백혈병 및 고형 종양 둘 모두에서 암 줄기 세포 마커로 확인되었다 (문헌[Jaiswal, et al., 2009 Cell, 138(2): 271-85]; 문헌[Chan, et al., 2009 Proc Natl Acad Sci USA, 106(33): 14016-21]; 문헌[Chan et al., 2010 Curr Opin Urol, 20(5): 393-7]; 문헌[Majeti R,et al., 2011 Oncogene, 30(9): 1009-19]).

CD47 차단 항체는 다수의 생체내(in vivo) 종양 모델에 대해 항종양 활성을 나타내었다. CD47과 SIRP 알파의 상호작용을 차단함으로써 대식세포에 의한 CD47 발현 세포의 식세포작용을 촉진시킬 수 있다 (문헌[Chao, et al., 2012 Curr Opin Immunol, 24(2): 225-32]에서 검토됨). 또한, 이러한 CD47 차단 항체는 종양 모델에서 Rituxan® 및 Herceptin®을 포함하는 다른 치료용 항체와 상승 작용하는 것으로 밝혀졌다.

그러나, CD47 항체는 혈소판 응집 및 적혈구의 혈구응집을 야기하는 것으로 보고되었다. 혈소판 응집 및 혈구응집은, 2가의 CD47 결합 엔티티(entity)로 처리될 때 2개의 CD47 발현 세포가 응집되게 하거나 응괴를 형성하게 하는, 동형 상호작용(homotypic interaction)의 예이다. 예를 들어, 완전 IgG 또는 F(ab′)₂로서의 CD47 항체인 MABL은 적혈구의 혈구응집을 야기하는 것으로 보고되었고, MABL이 scFv 또는 2가 scFv로 변경된 경우에만 이러한 효과가 완화되었다. (예를 들어, 문헌[Uno S, Kinoshita Y, Azuma Y, et al., 2007 Oncol Rep, 17(5):1189-94] 참조). 유사하게, CD47 항체인 B6H12는 Fc 수용체인 FcγRII의 특정 다형을 갖는 특정 피검자의 혈소판의 직접적인 응집을 유도하는 것으로 보고되었다 (문헌[Dorahy DJ, Thorne RF, Fecondo JV and Burns GF, 1997 Journal of Biol. Chem. 272:1323-1330]). 따라서, 혈소판 응집 및 RBC의 혈구응집은 기존의 CD47 항체로 CD47을 치료적으로 표적화하는 것의 주요 한계를 나타낸다.

CD47에 특이적으로 결합하고, CD47이 SIRP 알파와 상호작용하는 것을 억제하며, 유의한 혈소판 응집 활성을 갖지 않는 항체가 본 명세서에 기술된다.

일부 실시 형태에서, 항체는 다음의 CD47 (신호 서열을 제외한 서열 번호 21) 아미노산 잔기와 상호작용함으로써 CD47에 특이적으로 결합한다: Q1, L3, N27, E29, E97, L101, T102, R103 및 E104. 일부 실시 형태에서, 항체는 CD47 (신호 서열을 제외한 서열 번호 21) 아미노산 잔기 Y37, K39, R45, D46, T49, A53, L54, N55, K56, S57, T58, V59, P60, T61, S64, A66 및 K67과 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 CD47 (신호 서열을 제외한 서열 번호 21) 아미노산 잔기 E35, K39, Y37, D46, 49, D51, A53, L54, K56, T58, V59, T99, L101 및 T102와 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 CD47 (신호 서열을 제외한 서열 번호 21) 아미노산 잔기 E29, Q31, N32, T34, E35, V36, Y37, K39, N41, D46, D51, A53, E97, T99, E100, L101, T102, R103 및 E104와 상호작용한다.

기술된 일부 실시 형태의 다른 태양은 서열 번호 4 내지 6으로부터 선택되는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 사이노(cyno) CD47에 특이적으로 결합하는 항체를 특징으로 한다. 항체는 선택적으로 서열 번호 7 및 8로부터 선택되는 가변 경(VL)쇄 영역을 포함한다. 일부의 경우, 항체는 서열 번호 4 내지 6으로부터 선택되는 VH쇄 영역 및 서열 번호 7 및 8로부터 선택되는 VL쇄 영역을 포함한다. 다른 태양에서, 항체는 서열 번호 7을 포함하는 VL쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 4 또는 5를 포함하는 VH쇄 영역을 갖는다. 또 다른 태양에서, 항체는 서열 번호 8을 포함하는 VL쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 6을 포함하는 VH쇄 영역을 갖는다.

일부 실시 형태에서, CD47 항체는 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 제시된 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1) 서열, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12에 제시된 VH CDR2 서열, 서열 번호 13 또는 서열 번호 14에 제시된 VH CDR3 서열, 서열 번호 15 또는 서열 번호 16에 제시된 VL CDR1 서열, 서열 번호 17 또는 서열 번호 18에 제시된 VL CDR2 서열 및 서열 번호 19 또는 서열 번호 20에 제시된 VL CDR3 서열을 포함한다. 예를 들어, CD47 항체는 서열 번호 9에 제시된 VH CDR1 서열, 서열 번호 11에 제시된 VH CDR2 서열, 서열 번호 13에 제시된 VH CDR3 서열, 서열 번호 15에 제시된 VL CDR1 서열, 서열 번호 17에 제시된 VL CDR2 서열 및 서열 번호 19에 제시된 VL CDR3 서열을 포함한다. 다른 예에서, CD47 항체는 서열 번호 10에 제시된 VH CDR1 서열, 서열 번호 12에 제시된 VH CDR2 서열, 서열 번호 14에 제시된 VH CDR3 서열, 서열 번호 16에 제시된 VL CDR1, 서열 번호 18에 제시된 VL CDR2 서열 및 서열 번호 20에 제시된 VL CDR3 서열을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항체는, VH쇄가 VL쇄보다 CD47과 더 광범위한 접촉을 갖고, 항체의 VH쇄가 CD47 발현 세포의 막 부근에 위치하고, 항체의 VL쇄가 CD47 상의 SIRP 알파 결합 부위를 폐색시키는, 위치에서 CD47에 결합한다.

일부 실시 형태에서, 항체는 유의한 혈구응집 활성을 갖지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항체의 혈소판 응집 활성은 항체의 부재 하에 관찰되는 혈소판 응집의 정도보다 10%를 초과하여 크지 않다. 일부 실시 형태에서, 항체는 키메라(chimeric), 인간화(humanized), 또는 완전 인간이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 인간 CD47 또는 사이노몰거스 (사이노) CD47에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 CD47 발현 세포의 대식세포 매개 식세포작용을 촉진시킨다. 일부 실시 형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1 동종형 및 IgG2 동종형으로부터 선택되는 IgG 동종형을 포함한다.

또한, 본 명세서에 기술된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 기술된다. 기술된 항체는 키트에 포함될 수 있다. 또한, 기술된 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 기술된 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 데 적합한 벡터 및 세포가 기술된다.

다른 실시 형태는 투여 후 유의한 혈소판 응집 활성을 갖지 않는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 항체를 암 또는 다른 신생물 질환의 증상의 경감을 필요로 하는 피검자에게 투여함으로써 암 또는 다른 신생물 질환의 증상을 경감시키는 방법을 포함한다. 항체는 피검자에서 암 또는 다른 신생물 질환의 증상을 경감시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 피검자는 인간이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 키메라, 인간화, 또는 완전 인간이다. 일부 실시 형태에서, 항체는 CD47이 SIRP 알파와 상호작용하는 것을 억제한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 IgG1 동종형 및 IgG2 동종형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IgG 동종형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 화학요법이 기술된 항체와 함께 적용된다.

도 1a 및 도 1b. 파지 유래 인간 IgG2 Fc 침묵(silent) mAb에 의한 Jurkat 세포에 대한 SIRP 알파-Fc 결합의 억제 (도 1a). 파지 유래 인간 IgG2 Fc 침묵 mAb에 의한 Jurkat 세포에 대한 결합 (도 1b). 각각 MSD (a) 및 FACS (b) 검정에 의해 결정된 바와 같은 양성 대조군인 항-CD47 mAb B6H12.2 및 인간 IgG2 Fc 침묵 (IgG2sigma) 동종형 대조군에 비한 10개의 파지 유래 mAb의 SIRP 알파 차단 및 CD47 결합 활성이 나타나 있다.
도 2a 내지 도 2d. 23개의 인간 IgG Fc 침묵 mAb의 서브세트에 의한 CD47 발현 Jurkat 세포에 대한 SIRP 알파-Fc 결합의 용량 의존성 억제. 세포 기반 SIRP 알파 차단 MSD 검정에서 양성 대조군인 항-CD47 mAb B6H12.2에 비한 17개의 하이브리도마 mAb 및 3개의 파지 mAb의 용량 반응 곡선이 나타나 있다.
도 3a 및 도 3b. 다양한 용량의 항-인간 CD47 단클론성 항체인 IgG1/IgG2 Fc 침묵 B6H12.2 및 구매가능한 BRIC126에 반응하는 인간 적혈구의 혈구응집 (도 3a). 23개의 항-CD47 mAb를 사용한 혈구응집 검정의 대표적인 결과. C47B91, C47B98, C47B116, C47B123 및 C47B131에 반응하는 혈구응집 결과가 도시되어 있다(도 3b).
도 4. 다양한 용량의 항-인간 IgG1/IgG2 Fc 침묵 C47B157, C47B161 및 C47B222에 반응하는 인간 적혈구의 혈구응집. 혈구응집을 유도하는 것으로 알려진 IgG2 Fc 침묵 C47B98 (도 3b 참조)을 양성 대조군으로 포함시켰다.
도 5a 내지 도 5d. C47B116의 HFA 변이체에 의한 CD47 발현 Jurkat 세포에 대한 SIRP 알파-Fc 결합의 용량 의존성 억제. 세포 기반 SIRP 알파 차단 MSD 검정에서 모체(parent) 하이브리도마 mAb C47B116에 비한 12개의 인간 프레임 워크 적응된 변이체의 용량 반응 곡선이 나타나 있다.
도 6. C47B161 (출현 순서로 각각 서열 번호 56, 57 및 62), C47B167 (출현 순서로 각각 서열 번호 56, 58 및 63), C47B222 (출현 순서로 각각 서열 번호 56, 59 및 64), C47B227 (출현 순서로 각각 서열 번호 56, 60 및 65) 및 B6H12.2 (출현 순서로 각각 서열 번호 56, 61 및 66)의 에피토프 및 파라토프 영역. CD47 ECD -C15G 돌연변이체로부터의 에피토프 잔기 (서열 번호 49) 및 각각의 C47B161 (서열 번호 5 및 7), C47B167 (서열 번호 50 및 51), C47B222 (서열 번호 6 및 8), C47B227 (서열 번호 41 및 46) 및 B6H12.2 (서열 번호 52 및 53)의 VH 및 VL로부터의 파라토프 잔기는 음영 처리되어 있고, CDR 영역은 밑줄 그어져 있고 표지되어 있으며 (카밧(Kabat) 정의), SIRP 알파 결합 잔기는 CD47 서열 위에 점으로 표시되어 있다.
도 7a 내지 도 7d. 에피토프 위치 및 CD47과 C47B161 사이의 상호작용. C47B161은 검정색으로 나타낸 에피토프 빈(epitope bin) 2에 결합한다 (도 7a). CD47과 C47B161 사이의 2D 상호작용 맵. CDR L1 및 L2는 항원과의 접촉에 연계(engaging)되는 반면, CDR L3은 CD47과 상호작용하지 않는다. 모든 중쇄 CDR로부터의 잔기는 CD47과 접촉한다. 반데르발스 상호작용은 파선으로 나타나 있고, H 결합은 실선이며, 화살표는 골격 H 결합을 나타내고 골격 원자를 가리킨다. CD47, VL 및 VH 잔기는 각각 회색 박스, 흰색 박스 및 타원 내에 있다. 4Å의 거리 컷오프(distance cut-off)를 사용하여 접촉 잔기를 규정하였다 (도 7b). Fab 경쇄 (도 7c) 및 중쇄 (도 7d)와의 CD47 주요 상호작용. 긴 CDR-L1은 잔기 H31, N33, Y35 및 Y37로 표현되어 있다. H 결합은 파선으로 나타나 있다. CD47 잔기는 밑줄 그어져 있다.
도 8a 내지 도 8d. 에피토프 위치 및 CD47과 C47B167 사이의 상호작용. C47B167은 검정색의 에피토프 빈 3 영역을 인식한다. 항체는 V59-T61 에피토프 영역의 서열 차이로 인해 인간 CD47 (서열 번호 67)에 잘 결합하고, 사이노 CD47 (서열 번호 68)에 약하게 결합한다 (도 8a). CD47과 C47B167 사이의 2D 상호작용 맵. 반데르발스 상호작용은 파선으로 나타나 있고, H 결합은 실선이며, 화살표는 골격 H 결합을 나타내고 골격 원자를 가리킨다. CD47, VL 및 VH 잔기는 각각 회색 박스, 흰색 박스 및 타원 내에 있다. 4Å의 거리 컷오프를 사용하여 접촉 잔기를 규정하였다 (도 8b). Fab 경쇄 (도 8c) 및 중쇄 (도 8d)와의 CD47 주요 상호작용이 나타나 있다. H 결합은 파선으로 나타나 있다. CD47 잔기는 밑줄 그어져 있다.
도 9a 및 도 9b. C47B161과 C47B167 둘 모두에 결합된 CD47. 3원 복합체는 두 복합체 내의 동등한 CD47 Cα 원자의 중첩에 의해 달성되었다 (도 9a). 2개의 항체 사이에 에피토프 중복은 없다 (도 9b). C47B167 복합체로부터의 CD47 구조는 도 9b에 나타나 있다. C47B167 에피토프는 검정색으로 나타나 있고, C47B161 에피토프는 흰색으로 나타나 있다.
도 10a 내지 도 10d. 에피토프 위치 및 CD47과 C47B222 사이의 상호작용. 에피토프 전체 위치: C47B161은 검정색으로 나타낸 에피토프 빈 1 영역에 결합한다 (도 10a). CD47과 C47B222 사이의 2D 상호작용 맵: LC 및 HC에 의해 인식되는 CD47 잔기들 사이에 구분이 존재한다. 반데르발스 상호작용은 파선으로 나타나 있고, H 결합은 실선이며, 화살표는 골격 H 결합을 나타내고 골격 원자를 가리킨다. CD47, VL 및 VH 잔기는 각각 회색 박스, 흰색 박스 및 타원 내에 있다 (도 10b). 4Å의 거리 컷오프를 사용하여 접촉 잔기를 규정하였다. Fab 경쇄 (도 10c) 및 중쇄 (도 10d)와의 CD47 주요 상호작용이 나타나 있다. CDR-L3은 CD47과 결합하지 않는다. H 결합은 파선으로 나타나 있다. CD47 잔기는 밑줄 그어져 있다.
도 11a 내지 도 11d. 에피토프 위치 및 CD47과 C47B227 사이의 상호작용. 에피토프 전체 위치: C47B227은 검정색으로 나타낸 에피토프 빈 1 영역에 결합한다 (도 11a). CD47과 C47B227 사이의 2D 상호작용 맵: LC 또는 HC에 의해 인식되는 영역에 대해 에피토프 구분이 존재한다. 반데르발스 상호작용은 파선으로 나타나 있고, H 결합은 실선이며, 화살표는 골격 H 결합을 나타내고 골격 원자를 가리킨다. CD47, VL 및 VH 잔기는 각각 회색 박스, 흰색 박스 및 타원 내에 있다. 4Å의 거리 컷오프를 사용하여 접촉 잔기를 규정하였다(도 11b). Fab 경쇄 (도 11c) 및 중쇄(도 11d)와의 CD47의 주요 상호작용. H 결합은 파선으로 나타나 있다. CD47 잔기는 밑줄 그어져 있다.
도 12a 및 도 12b. C47B222와 C47B227 사이의 에피토프 및 파라토프 차이. 경쇄 상호작용의 차이: CDR-L1 및 CDR-L3에서의 N30G, N31S 및 Y93S 돌연변이는 CR47의 FG 루프의 재배치 및 H 결합 패턴의 변화를 가져온다 (도 12a). 중쇄 상호작용의 차이: C47B222의 CDR-H3 루프에 대한 상이한 입체형태는 H3 루프에 의해 형성된 H 결합의 수를 C47B227의 경우 0개에서 C47B222의 경우 4개 결합 (CD47 잔기 Y37, K39, D46 및 D51과의 결합)으로 증가시킨다. 구조적 오버레이(structuaral overlay)는 두 복합체 내의 동등한 CD47 Cα 원자의 중첩에 의해 달성되었다. CD47 잔기는 밑줄 그어져 있다 (도 12b).
도 13a 내지 도 13d. 에피토프 위치 및 CD47과 B6H12.2 사이의 상호작용. 에피토프 전체 위치. B6H12.2는 검정색으로 나타낸 에피토프 빈 1 영역에 결합한다 (도 13a). CD47과 B6H12.2 사이의 2D 상호작용 맵: 반데르발스 상호작용은 파선으로 나타나 있고, H 결합은 실선이며, 화살표는 골격 H 결합을 나타내고 골격 원자를 가리킨다. CD47, VL 및 VH 잔기는 각각 회색 박스, 흰색 박스 및 타원 내에 있다. 4Å의 거리 컷오프를 사용하여 접촉 잔기를 규정하였다 (도 13b). Fab 경쇄 (도 13c) 및 중쇄 (도 13d)와의 CD47 주요 상호작용. H 결합은 파선으로 나타나 있다. CD47 잔기는 밑줄 그어져 있다.
도 14는 다양한 농도의 항-인간 CD47 IgG1/IgG2 Fc 침묵 C47B157, C47B161, C47B222 및 B6H12.2로의 90분 처리에 반응하는 인간 PBMC 유래 대식세포에 의한 Jurkat 표적 세포의 식세포작용.
도 15a 및 도 15b. 다양한 농도의 항-인간 CD47 IgG1/IgG2 Fc 침묵 C47B157, C47B161, C47B222 및 B6H12.2로의 24시간 처리에 반응하는 Jurkat 세포 (도 15a) 및 HL60 세포 (도 15b)에서 아폽토시스의 유도.
도 16a 및 도 16b. 다양한 농도의 항-인간 CD47 IgG1/IgG2 Fc 침묵 C47B157, C47B161, C47B222, B6H12.2에 반응하는 Wil2-s 표적 세포에 대한 보체 의존성 세포독성의 향상. 리툭시맙(rituximab)을 양성 대조군으로 포함시켰다.
도 17a 내지 도 17d. PBS, 200 ㎍/ml의 IgG1/IgG2 Fc 침묵 B6H12.2 및 10 μM ADP (도 17a); PBS, 200 ㎍/ml의 IgG1/IgG2 Fc 침묵 C47B157 및 IgG1 B6H12.2 (도 17b); PBS, 200 ㎍/ml의 IgG1/IgG2sigma C47B161 및 IgG1 B6H12.2 (도 17c); 및 PBS, 200 ㎍/ml의 IgG1/IgG2sigma C47B222 및 IgG1 B6H12.2 (도 17d)와의 혈소판 풍부 혈장의 인큐베이션에 반응하는 인간 혈소판의 응집.
도 18a 내지 도 18d. HL60/NSG 마우스 모델에서의 IgG1/IgG2 Fc 침묵 C47B157, C47B161, C47B222 및 B6H12.2의 생체내 활성. NSG 마우스에 1000만 개의 HL60 세포를 정맥내 이식하고, 종양 세포 이식 후 6일째에 항체 처리를 개시하였다. 각각의 그룹은 5 마리의 마우스로 이루어졌다. 동물은 매주 2회로 총 6회 용량을 투여받았다 (23일째 최종 투여). 14일째부터 시작하여 (42일째 최종 수집), 마우스로부터 말초 혈액을 매주 수집하고, FACS를 통해 분석하여 종양 세포 증생(outgrowth) 및 처리 효과를 평가하였다.
도 19a 및 도 19b. MV4-11/NSG 마우스 모델에서의 IgG1/IgG2 Fc 침묵 C47B157, C47B161, C47B222 및 B6H12.2의 생체내 활성. NSG 마우스에 500만 개의 MV4-11 세포를 정맥내 이식하고, 종양 세포 이식 후 6일째에 항체 처리를 개시하였다. 각각의 그룹은 5 마리의 마우스로 이루어졌다. 동물은 매주 2회로 총 6회 용량을 투여받았다 (23일째 최종 투여). 34일째에 마우스로부터 말초 혈액을 수집하고, FACS를 통해 분석하여 종양 세포 증생에 대한 처리의 효과를 평가하였다.
도 20a 내지 도 20d. Kasumi-3/NSG 마우스 모델에서의 IgG1/IgG2 Fc 침묵 C47B157, C47B161, C47B222 및 B6H12.2의 생체내 활성. NSG 마우스에 1000만 개의 Kasumi-3 세포를 정맥내 이식하고, 종양 세포 이식 후 6일째에 항체 처리를 개시하였다. 각각의 처리 그룹은 5 마리의 마우스로 이루어졌다. 동물은 매주 2회로 총 12회 용량을 투여받았다 (44일째 최종 투여). 14일째부터 시작하여, 마우스로부터 말초 혈액을 매주 수집하고, FACS를 통해 분석하여 종양 세포 증생 및 처리 효과를 평가하였다. 그래프는 34일째부터 시작하여 CD45% 세포의 백분율을 나타낸다.
도 21a 및 도 21b. 항체 중화 방식. CD47/SIRPα 복합체 상으로의 CD47/Fab 복합체의 구조적 오버레이는 Fab와 SIRP 알파 사이의 충돌 영역을 나타낸다. 오버레이는 두 복합체 내의 동등한 CD47 Cα 원자의 중첩에 의해 달성되었다 (도 21a). 각각의 에피토프와 SIRP 알파 결합 부위 사이의 중복 영역 (도 21b). C47B222 복합체로부터의 CD47의 구조가 도 21b에 사용되었다.

본 명세서에 기술된 항체의 일부 특징은 다음을 포함한다:

인간 CD47 및 사이노 CD47에 대한 특이적 결합,

SIRP 알파와의 CD47 상호작용의 차단,

유의한 인간 혈소판 응집 활성을 갖지 않음,

유의한 혈구응집 활성을 갖지 않음,

대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진시킬 수 있음,

인간 암의 마우스 모델에서 강력한 항종양 활성을 나타냄.

따라서, 본 명세서에 기술된 항체는 다수의 암 치료에 매우 중요하다고 할 것이다.

많은 기존의 CD47 항체는 SIRP 알파를 차단한다. 그러나, 본 명세서에 기술된 발명 요지 이전에, SIRP 알파를 차단한 기존의 완전 IgG CD47 항체는 상기 기술된 바와 같이 바람직하지 않은 특징인 혈소판 응집 및/또는 혈구응집의 부작용을 야기하였다. 2D3과 같은 다른 기존의 항체는 혈구응집을 야기하지 않지만, 이러한 항체는 SIRP 알파를 차단하지도 않는다. 따라서, 혈소판 및 적혈구 응괴 형성을 야기하지 않으면서 SIRP 알파를 차단한 완전 IgG 포맷의 CD47 항체는 이전에 알려지지 않았다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 IgG CD47 항체는 유의한 혈소판 응집 및 혈구응집을 나타내지 않음으로써 CD47을 치료적으로 표적화하는 효능을 증가시키고, CD47과 SIRP 알파의 상호작용을 차단하는 능력을 유지하여 CD47 발현 세포의 식세포작용을 촉진시킨다. 구체적으로, 본 발명의 완전 IgG CD47 항체 (예를 들어, C47B157, C47B161 및 C47B222)는 유의한 세포 응집 활성을 갖지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 CD47 항체는 유의한 혈소판 응집 및 혈구응집 활성을 갖지 않는다. 따라서, 종합해 보면, 본 명세서에 기술된 항체 (예를 들어, C47B157, C47B161 및 C47B222 및 이의 유도체)는 유의한 혈소판 응집 및 혈구응집 활성 없이 SIRP 알파를 차단하는 능력 면에서 기존의 CD47 항체 중에서 독특하다.

개요

당업자는 본 명세서의 발명이 구체적으로 기술된 것 이외의 변화 및 변형을 허용함을 인식할 것이다. 본 발명은 모든 이러한 변화 및 변형을 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명은 개별적으로 또는 집합적으로 본 명세서에 지칭되거나 언급된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징의 임의의 조합 및 모든 조합 또는 임의의 둘 이상을 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 실시 형태에 의해 범위가 제한되어서는 안 되며, 이들은 단지 예시 목적을 위한 것이고자 한다. 기능적으로 동등한 생성물, 조성물 및 방법은 명백히 본 발명의 범위 내에 있다.

본 명세서에 기술된 물질의 조성물 및 방법은 달리 지시되지 않는 한 분자 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액 중 펩티드 합성, 고체상 펩티드 합성, 약화학(pharmaceutical chemistry), 의약 화학(medicinal chemistry) 및 면역학의 종래의 기법을 사용하여 과도한 실험 없이 생성 또는 수행된다. 약제 제조, 제형화 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 표준 기법이 사용된다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다.

본 발명에 따라 이용된 바와 같이, 다음의 용어는 달리 지시되지 않는 한 다음의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다:

용어 "및/또는", 예를 들어 "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 둘 모두의 의미 또는 어느 하나의 의미에 대한 명확한 뒷받침을 제공하는 것으로 받아들여져야 한다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 구체적으로 명시되지 않거나 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계의 군 또는 물질의 조성물의 군에 대한 언급은 하나 및 복수 (즉, 하나 이상)의 그러한 단계, 물질의 조성물, 단계의 군 또는 물질의 조성물의 군을 포함하는 것으로 받아들여져야 한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 측면을 포함한다. 예를 들어, 단수 형태에 대한 언급은 하나뿐만 아니라 둘 이상을 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "CD47", "인테그린 관련 단백질 (IAP)", "난소암 항원 OA3" 및 "Rh 관련 항원"은 동의어이며 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

용어 "적혈 세포(들)" 및 "적혈구(들)"는 동의어이며 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "혈소판 응집"은 활성화 혈소판의 응집체 또는 응괴의 형성을 초래하는 활성화 혈소판 서로 간의 부착을 지칭한다. 혈소판 응집은, 혈소판 응집이 발생함에 따른 광 투과율의 증가를 측정하는 응집측정기를 사용하여 실시예에 기술된 바와 같이 측정된다. "유의한 혈소판 응집 활성"은 항체 첨가 전의 광 투과율에 비해 본 명세서에 기술된 항체의 첨가 후 6분까지 적어도 25%의 광 투과율의 증가가 존재하는 경우 발생한다.

용어 "응집"은 세포 응괴 형성을 지칭하는 한편, 용어 "혈구응집"은 세포의 특정 서브세트, 즉, 적혈구의 응괴 형성을 지칭한다. 따라서, 혈구응집은 응집의 일 유형이다.

본 명세서에 기술된 혈구응집 검정에서, "버튼(button)", "헤일로(halo)" 또는 둘 사이의 중간 형태일 수 있는, 주어진 웰 내의 패턴이 적혈구에 의해 형성된다. 용어 "유의한 혈구응집 활성"은 본 명세서에 기술된 항체의 첨가 시 웰 내의 임의의 헤일로 패턴의 존재를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 (Ig) 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 항원과 특이적으로 결합하는 (면역 반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. "특이적으로 결합하다" 또는 "면역 반응한다" 또는 "에 대해 유도된"은 항체가 요망되는 항원의 하나 이상의 항원 결정기와 반응하고 다른 폴리펩티드와는 반응하지 않거나 훨씬 더 낮은 친화성 (K_d>10^―6)으로 이에 결합함을 의미한다. 항체는 단클론성, 키메라, dAb (도메인 항체), 단일 사슬, Fab, Fab 단편과 F(ab′)₂ 단편, F_v, scFv 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지며, 각각의 쌍은 하나의 "경"쇄 (약 25 kDa) 및 하나의 "중"쇄 (약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 사슬의 카르복시 말단 부분은 주로 이펙터(effector) 기능을 담당하는 불변 영역을 규정한다. 대체로, 인간으로부터 얻어진 항체 분자는, 분자에 존재하는 중쇄의 성질이 서로 상이한, IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 클래스 중 어느 것과 관련된다. 특정 클래스는 또한 IgG1, IgG₂ 등과 같은 서브클래스를 갖는다. 또한, 인간의 경우, 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "단클론성 항체" (mAb) 또는 "단클론성 항체 조성물"은 독특한 경쇄 유전자 생성물과 독특한 중쇄 유전자 생성물로 이루어진 항체 분자의 단지 하나의 분자 종을 함유하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 특히, 단클론성 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)은 집단의 모든 분자에서 동일하다. MAb는 항원의 특정 에피토프와 면역 반응할 수 있는 항원 결합 부위를 함유한다.

대체로, 인간으로부터 얻어진 항체 분자는, 분자에 존재하는 중쇄의 성질이 서로 상이한, IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 클래스 중 어느 것과 관련된다. 특정 클래스는 또한 IgG₁, IgG₂ 등과 같은 서브클래스를 갖는다. 또한, 인간의 경우, 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다.

용어 "항원 결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 관여하는 면역글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 항원 결합 부위는 중("H")쇄 및 경("L")쇄의 N 말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"이라 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 고도의 분기성 스트레치(divergent stretch)가 "프레임워크 영역" 또는 "FR"로 알려진 더 보존된 플랭킹 스트레치(flanking stretch)들 사이에 개재되어 있다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린 내의 초가변 영역들 사이에서 그리고 이에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원 결합 표면을 형성한다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이고, 중쇄 및 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 아미노산을 각각의 도메인에 할당하는 것은 면역학적 관심 단백질의 카밧 서열 (Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)의 정의 (미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 미국 국립보건원(National Institutes of Health) (1987년 및 1991년)), 또는 문헌[Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)], 문헌[Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)]에 따른다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 이의 단편, 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화 (grouping)로 이루어지며, 통상 특정 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 항체는 해리 상수가 1 μM 이하일 때 항원과 특이적으로 결합한다고 한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다"는 면역글로불린 분자와 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에 발생하는 유형의 비공유 상호작용을 지칭한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화성은 상호작용의 해리 상수 (K_d)로 표현될 수 있으며, K_d 가 작을수록 더 큰 친화성을 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 그러한 한 가지 방법은 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 수반하며, 이들 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화성 및 양방향으로 속도에 동등하게 영향을 미치는 기하학적 파라미터에 좌우된다. 따라서, "온(on) 속도 상수" (k_on) 및 "오프(off) 속도 상수" (k_off) 둘 모두는 농도 및 실제의 회합 및 해리 속도의 계산에 의해 결정될 수 있다. (문헌[Nature 361:186-87 (1993)] 참조). k_off/k_on의 비는 친화성과 관련없는 모든 파라미터의 무효화를 가능하게 하며, 해리 상수 K_d와 동일하다. (대체로 문헌[Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473] 참조). 본 발명의 항체는, 방사성리간드 결합 검정, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 유동 세포계측 결합 검정 또는 당업자에게 알려진 유사한 검정과 같은 검정에 의해 측정하여 평형 결합 상수 (K_d)가 1 μM 이하일 때 CD47에 특이적으로 결합한다고 한다.

"단리된" 항체는, 확인되어 이의 자연적 환경의 성분으로부터 분리 및/또는 회수된 것이다. 이의 자연적 환경의 오염 성분은 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 결정하여 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체로 정제되거나, (2) 회전 컵 서열분석기(spinning cup sequenator)를 사용하여 적어도 15개 잔기의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열을 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색제를 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 동질성이 되도록 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내 원위치(in situ)의 항체를 포함하는데, 이는 항체의 자연적 환경의 적어도 하나의 성분도 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

용어 "폴리펩티드"는 본 명세서에서 천연 단백질, 단편 또는 폴리펩티드 서열의 유사체를 지칭하는 포괄적인 용어로 사용된다. 따라서, 천연 단백질 단편 및 유사체는 폴리펩티드 속(genus)의 종(species)이다.

대상에 적용되는 경우 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "자연 발생적"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 또는 다른 방식으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적이다.

본 명세서에서 지칭되는 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생적 및 비-자연 발생적 올리고뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결된 자연 발생적 및 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 대체로 200개 이하의 염기 길이를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 길이가 10개 내지 60개의 염기이고, 가장 바람직하게는 길이가 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 내지 40개의 염기이다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 프로브의 경우, 통상 단일 가닥이지만, 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 유전자 돌연변이체의 작제에 사용되는 경우, 이중 가닥일 수 있다. 본 명세서에 기술된 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

용어 "서열 동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 비교 윈도우(comparison window)에 걸쳐 동일함 (즉, 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 잔기 대 잔기 기준으로)을 의미한다. 용어 "서열 동일성 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 둘 모두의 서열에서 동일한 핵산 염기 (예를 들어, A, T, C, G, U 또는 I) 또는 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "실질적 동일성"은, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산이 적어도 18개의 뉴클레오티드 (6개의 아미노산) 위치의 비교 윈도우, 종종 적어도 24개 내지 48개의 뉴클레오티드 (8개 내지 16개의 아미노산) 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 기준 서열과 비교하여 적어도 85 퍼센트의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95 퍼센트의 서열 동일성, 더욱 통상적으로 적어도 99 퍼센트의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특징을 나타내며, 서열 동일성 백분율은 기준 서열을 비교 윈도우에 걸쳐 기준 서열의 총 20 퍼센트 이하인 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 서열과 비교함으로써 계산된다. 기준 서열은 더 큰 서열의 서브세트일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 20개의 종래의 아미노산 및 이의 약어는 종래의 사용법을 따른다. 문헌[Immunology―A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))]이 참조된다. 20개의 종래의 아미노산, 비천연 아미노산, 예를 들어 α-,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 다른 비종래의 아미노산의 입체이성질체 (예를 들어, D-아미노산)가 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 적합한 성분일 수 있다. 비종래의 아미노산의 예는 4 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트라이메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산 (예를 들어, 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 폴리펩티드 표기법에서, 표준 사용법 및 관례에 따라, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카르복시 말단 방향이다.

유사하게, 달리 명시되지 않는 한, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 신생 RNA 전사체의 5'에서 3'으로의 첨가 방향은 전사 방향으로 지칭되고, RNA와 동일한 서열을 가지며 RNA 전사체의 5' 말단의 5'쪽인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류 서열"로 지칭되고, RNA와 동일한 서열을 가지며 RNA 전사체의 3' 말단의 3'쪽인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류 서열"로 지칭된다. 폴리펩티드에 적용된 바와 같이, 용어 "실질적 동일성"은, 예를 들어 디폴트 갭 중량(default gap weight)을 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬된 경우, 2개의 펩티드 서열이 적어도 80 퍼센트의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 퍼센트의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95 퍼센트의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 99 퍼센트의 서열 동일성을 공유함을 의미한다.

바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.

"보존적" 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환 가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신이고; 지방족 하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아르파르트산 및 아스파라긴-글루타민이다.

본 명세서에 논의된 바와 같이, 아미노산 서열의 변화가 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99%를 유지한다면, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열의 미미한 변화는 본 발명에 의해 포함되는 것으로 고려된다. 특히, 보존적 아미노산 대체가 고려된다. 보존적 대체는 측쇄가 관련된 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 유전적으로 인코딩되는 아미노산은 대체로 다음의 패밀리로 나뉘어 진다: (1) 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트이고; (2) 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘이고; (3) 비극성 아미노산은 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이고; (4) 비하전 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산은 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 세린 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 다른 아미노산 패밀리는 (i) 지방족-하이드록시 패밀리인 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드 함유 패밀리인 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 패밀리인 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; 및 (iv) 방향족 패밀리인 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다. 예를 들어, 류신의 아이소류신 또는 발린으로의, 아스파테이트의 글루타메이트로의, 트레오닌의 세린으로의 단리된 대체 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로의 유사한 대체는, 특히 대체가 프레임워크 부위 내의 아미노산을 포함하지 않는다면, 생성된 분자의 결합 또는 특성에 큰 영향을 미치지 않을 것이라고 기대하는 것은 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 펩티드를 가져오는지의 여부는 폴리펩티드 유도체의 비활성(specific activity)을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 검정은 본 명세서에 상세히 기술되어 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노 말단 및 카르복시 말단은 기능적 도메인의 경계 부근에 존재한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공개적 또는 독점적 서열 데이터베이스와 비교함으로써 확인될 수 있다. 바람직하게는, 구조 및/또는 기능이 공지된 다른 단백질에 존재하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 입체형태 도메인을 확인하는 데 컴퓨터화된 비교 방법이 사용된다. 공지된 3차원 구조로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다 (문헌[Bowie et al. Science 253:164 (1991)]). 따라서, 전술한 예는 당업자가 본 발명에 따라 구조적 및 기능적 도메인을 규정하는 데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조적 입체형태를 인식할 수 있음을 나타낸다.

바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하는 결합 친화성을 변경시키고, (4) 결합 친화성을 변경시키고, (5) 그러한 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것이다. 유사체는 자연 발생적 펩티드 서열 이외에 서열의 다양한 뮤테인(mutein)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 자연 발생적 서열에서 (바람직하게는 분자간 접촉부를 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모체 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다 (예를 들어, 대체 아미노산은 모체 서열에 존재하는 나선을 파괴하거나 모체 서열을 특징짓는 다른 유형의 2차 구조를 붕괴시키려 하지 않아야 한다). 당업계에서 인정된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)]; 문헌[Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)]; 및 문헌[Thornton et al. Nature 354:105 (1991)]에 기술되어 있다.

용어 "작용제(agent)"는 본 명세서에서 화학적 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 나타내는 데 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "표지" 또는 "표지된"은, 예를 들어 폴리펩티드로의 방사성표지된 아미노산의 혼입 또는 마킹(marking)된 아비딘 (예를 들어, 광학적 또는 열량측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티(moiety)의 부착에 의한, 검출가능한 마커의 혼입을 지칭한다. 특정 상황에서, 표지 또는 마커는 또한 치료적일 수 있다. 폴리펩티드 및 당당백질을 표지하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (예를 들어, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 표지 (예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 효소 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, p-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광제, 비오티닐 기, 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍(leucine zipper pair) 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 일부 실시 형태에서, 표지는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)에 의해 부착된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적 작용제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여된 경우 요망되는 치료 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다.

용어 "항신생물제"는 본 명세서에서 인간의 신생물, 특히 악성 (암성) 병변, 예를 들어 암종, 육종, 림프종 또는 백혈병의 발생 또는 진행을 억제하는 기능적 특성을 갖는 작용제를 지칭하는 데 사용된다. 전이의 억제가 종종 항신생물제의 특성이다.

본 명세서에서 다른 화학 용어는 문헌[The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))]에 예시된 바와 같이 당업계의 종래 사용법에 따라 사용된다.

CD47 항체

본 명세서에 기술된 단클론성 항체는 CD47에 결합하고, CD47에 대한 SIRP 알파의 결합을 억제하고, CD47-SIRP 알파 매개 신호전달을 감소시키고, 식세포작용을 촉진시키고, 종양 성장 및/또는 이동을 억제하는 능력을 갖는다. 억제는, 예를 들어 본 명세서의 실시예에 기술된 세포 검정을 사용하여 결정된다.

본 명세서에 기술된 예시적인 항체는 서열 번호 4 내지 6으로부터 선택되는 가변 중(VH)쇄와 서열 번호 7 및 8로부터 선택되는 가변 경(VL)쇄를 갖는 항체를 포함한다. 구체적으로, 예시적인 항체는 표 1에 제공된 것을 포함한다.

[표 1]

CD47 항체의 VH쇄의 상보성 결정 영역 (CDR)은 아래에 강조되어 있다. 일부 실시 형태에서, VH CDR1의 아미노산 서열은 DYNMH (서열 번호 9) 또는 DYWIG (서열 번호 10)이다. 일부 실시 형태에서, VH CDR2의 아미노산 서열은 DIYPYNGGTGYNQKFKG (서열 번호 11) 또는 IIYPGDSDTRYSPSFQG (서열 번호 12)이다. 일부 실시 형태에서, VH CDR3의 아미노산 서열은 GGWHAMDS (서열 번호 13) 또는 VGRFASHQLDY (서열 번호 14)이다.

일부 실시 형태에서, VL CDR1의 아미노산 서열은 RSRQSIVHTNRYTYLA (서열 번호 15) 또는 RASQSVNNRLA (서열 번호 16)이다. 일부 실시 형태에서, VL CDR2의 아미노산 서열은 KVSNRFS (서열 번호 17) 또는 WASTRAI (서열 번호 18)이다. 일부 실시 형태에서, VL CDR3의 아미노산 서열은 FQGSHVPYT (서열 번호 19) 또는 QQGASWPFT (서열 번호 20)이다.

또한, 본 발명에는 본 명세서에 기술된 CD47 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 포함된다. 예를 들어, 본 출원에 기술된 항체는 아래에 제공된 예시적인 인간 CD47 (본 명세서에 참고로 포함된, GenBank 수탁 번호 Q08722.1호 (GI:1171879))의 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 신호 서열 (아미노산 1-18)은 밑줄 그어져 있다.

서열 번호 21

일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 21의 Q1, L3, N27, E29, E97, L101, T102, R103 및 E104와 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 21의 Y37, K39, R45, D46, T49, A53, L54, N55, K56, S57, T58, V59, P60, T61, S64, A66 및 K67과 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 21의 E35, K39, Y37, D46, 49, D51, A53, L54, K56, T58, V59, T99, L101 및 T102와 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, 항체는 서열 번호 21의 E29, Q31, N32, T34, E35, V36, Y37, K39, N41, D46, D51, A53, E97, T99, E100, L101, T102, R103 및 E104와 상호작용한다.

당업자는 과도한 실험 없이 항체가 본 명세서에 기술된 항체 (예를 들어, C47B157, C47B161 및 C47B222, 또는 서열 번호 4 내지 6으로부터 선택되는 가변 중쇄와 서열 번호 7 및 8로부터 선택되는 가변 경쇄를 갖는 항체) 중 하나와 동일한 특이성을 갖는지를 결정하는 것이 가능함을 인식할 것이며, 이는 후자가 CD47에 결합하는 것을 전자가 방지하는지의 여부를 확인함으로써 이루어진다. 본 명세서에 기술된 항체에 의한 결합의 감소에 의해 나타난 바와 같이 시험 중인 항체가 본 발명의 항체와 경쟁하는 경우, 두 항체는 동일한 또는 인근의 에피토프에 결합할 가능성이 높다.

항체가 본 명세서에 기술된 항체의 특이성을 갖는지를 결정하는 대안적인 방법은 본 명세서에 기술된 항체를 (이것이 정상적으로 반응하는) 가용성 CD47 단백질과 사전 인큐베이션하고, 이어서 시험 중인 항체를 첨가하여 시험 중인 항체가 CD47과 결합하는 능력이 억제되는지를 결정하는 것이다. 시험 중인 항체의 결합이 억제되는 경우, 십중팔구 이것은 본 발명의 항체와 동일한, 또는 기능적으로 동등한 에피토프 특이성을 가질 것이다.

본 발명의 항체

본 명세서에 기술된 항체는 CD47 및/또는 CD47/SIRP 알파 매개 신호전달을 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 다른 방식으로 방해하는 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, 이러한 평가는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 항체의 존재 하에 CD47 및/또는 CD47/SIRP 알파 매개 신호전달을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 검정은 경쟁 결합 검정을 포함할 수 있거나 실시예 7에 기술된 바와 같이 생물학적 판독값, 예를 들어 대식세포에 의한 CD47 발현 세포의 식세포작용을 촉진시키는 능력을 측정할 수 있다.

당업계에 공지된 다양한 절차가 CD47, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체, 호모로그 또는 오르토로그에 대해 유도되는 단클론성 항체의 생성에 사용될 수 있다. (예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조). 완전 인간 항체는 CDR을 포함하는 경쇄와 중쇄 둘 모두의 전체 서열이 인간 유전자로부터 유래하는 항체 분자이다. 이러한 항체는 본 명세서에서 "인간 항체" 또는 "완전 인간 항체"로 명명된다. 인간 단클론성 항체는, 예를 들어 아래에 제공된 실시예에 기술된 절차를 사용하여 제조된다. 인간 단클론성 항체는 또한 트리오마(trioma) 기법; 인간 B 세포 하이브리도마 기법 (문헌[Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72] 참조); 및 인간 단클론성 항체를 생성하는 EBV 하이브리도마 기법 (문헌[Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참조)을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 단클론성 항체가 이용될 수 있으며, 이는 인간 하이브리도마를 사용하여 (문헌[Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030] 참조) 또는 시험관내(in vitro)에서 인간 B 세포를 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus)로 형질전환시킴으로써 (문헌[Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참조) 생성될 수 있다.

항체는, 주로 면역 혈청의 IgG 분획을 제공하는, 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화성 크로마토그래피와 같은 널리 공지된 기법에 의해 정제된다. 후속적으로 또는 대안적으로, 추구하는 면역글로불린의 표적인 특정 항원 또는 이의 에피토프는, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 면역 특이적 항체를 정제하기 위해 컬럼 상에 고정될 수 있다. 면역글로불린의 정제는, 예를 들어 문헌[D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia Pa., Vol. 14, No. 8 (Apr. 17, 2000), pp. 25-28)]에 논의되어 있다.

본 발명의 CD47 항체는 단클론성 항체이다. CD47 및/또는 CD47/SIRP 알파 매개 세포 신호전달을 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 다른 방식으로 방해하는 단클론성 항체는, 예를 들어 막 결합 및/또는 가용성 CD47, 예를 들어 인간 CD47 또는 이의 면역원성 단편, 유도체 또는 변이체로 동물을 면역화시킴으로써 생성된다. 대안적으로, 동물은, CD47이 발현되고 형질감염된 세포의 표면과 회합되도록, CD47을 인코딩하는 핵산 분자를 함유하는 벡터로 형질감염된 세포로 면역화된다. 대안적으로, 항체는 CD47에 결합하는 항체 또는 항원 결합 도메인 서열을 함유하는 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어진다. 이러한 라이브러리는, 예를 들어 조립된 파지 입자의 표면 상에 발현되는 박테리오파지 외피 단백질에 대한 단백질 또는 펩티드 융합체로서 박테리오파지에서 제조되고, 인코딩 DNA 서열은 파지 입자 내에 함유되어 있다 (즉, "파지 디스플레이 라이브러리"). 이어서, 골수종/B 세포 융합체로부터 생성된 하이브리도마가 CD47에 대한 반응성에 대해 스크리닝된다.

단클론성 항체는, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기술된 것과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조된다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제로 면역화되어, 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 이를 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.

면역화제는 전형적으로 단백질 항원, 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 포함할 것이다. 대체로, 인간 기원의 세포가 요망되는 경우 말초 혈액 림프구가 사용되거나, 비인간 포유류 공급원이 요망되는 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 불멸화 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]). 불멸화 세포주는 통상 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는, 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모체 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있는 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT 결핍 세포의 성장을 방지한다.

바람직한 불멸화 세포주는, 효율적으로 융합되고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것이다. 더 바람직한 불멸화 세포주는, 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌디애고 소재의 SICDC (Salk Institute Cell Distribution Center) 및 미국 버지니아주 매너서스 소재의 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 얻을 수 있는 뮤린 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종(heteromyeloma) 세포주가 단클론성 항체의 생성에 대해 기술되었다. (문헌[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)] 참조).

이어서, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 항원에 대해 유도된 단클론성 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론성 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 검정, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정된다. 이러한 기법 및 검정은 당업계에 공지되어 있다. 단클론성 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 문헌[Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석(Scatchard analysis)에 의해 결정될 수 있다. 더욱이, 단클론성 항체의 치료적 적용에서, 표적 항원에 대해 고도의 특이성 및 높은 결합 친화성을 갖는 항체를 확인하는 것이 중요하다.

요망되는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 서브클로닝되며 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. (문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103] 참조). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유류에서 복수(ascite)로서 생체내에서 성장될 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 단클론성 항체는 종래의 면역글로불린 정제 절차, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.

단클론성 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에 기술된 단클론성 항체를 인코딩하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 본 명세서에 기술된 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 넣어질 수 있고, 이어서 이 벡터는 숙주 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 293 세포, 시미안(simian) COS 세포, PER.C6®, NS0 세포, SP2/0, YB2/0 또는 골수종 세포로 형질감염되어 - 이들은 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하지 않음 -, 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 얻는다. 또한, DNA는, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)] 참조) 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 비면역글로불린 폴리펩티드는 본 명세서에 기술된 항체의 불변 도메인 대신 사용되거나 본 명세서에 기술된 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인 대신 사용되어 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.

인간 항체 및 항체의 인간화

본 명세서에 기술된 항체는 완전 인간 항체 또는 인간화 항체를 포함한다. 이러한 항체는 투여된 면역글로불린에 대한 인간의 면역 반응을 일으키지 않으면서 인간에 투여하기에 적합하다.

CD47 항체는, 예를 들어 인간 서열만을 함유하는 항체를 사용하여 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된다. 이러한 접근법은 당업계에, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함된, 국제특허 공개 WO92/01047호 및 미국 특허 제6,521,404호에 널리 공지되어 있다. 이러한 접근법에서, 경쇄 및 중쇄의 무작위 쌍을 지니는 파지의 조합 라이브러리는 CD47 또는 이의 단편의 천연 또는 재조합 공급원을 사용하여 스크리닝된다. 다른 접근법에서, CD47 항체는, 공정의 적어도 하나의 단계가 유전자도입 비인간 동물을 인간 CD47 단백질로 면역화시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 생성될 수 있다. 이러한 접근법에서는, 이러한 이종 비인간 동물의 내인성 중쇄 및/또는 카파 경쇄 유전자좌의 일부가 불활성화되었고, 항원에 반응하여 면역글로불린을 인코딩하는 유전자를 생성하는 데 필요한 재배열이 불가능하다. 또한, 적어도 하나의 인간 중쇄 유전자좌 및 적어도 하나의 인간 경쇄 유전자좌가 동물에 안정하게 형질감염되었다. 따라서, 투여된 항원에 반응하여, 인간 유전자좌는 재배열되어 항원에 면역특이적인 인간 가변 영역을 인코딩하는 유전자를 제공한다. 따라서, 면역화 시, 제노마우스(xenomouse)는 완전 인간 면역글로불린을 분비하는 B 세포를 생성한다.

이종 비인간 동물을 생성하는 다양한 기법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된, 미국 특허 제6,075,181호 및 미국 특허 제6,150,584호가 참조된다. 이러한 일반적 전략은 1994년에 공개된 바와 같은 최초의 XenoMouse™ 계통의 생성과 관련하여 입증되었다. 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된, 문헌[Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)]이 참조된다. 또한, 미국 특허 제6,162,963호; 미국 특허 제6,150,584호; 미국 특허 제6,114,598호; 미국 특허 제6,075,181호; 및 미국 특허 제5,939,598호 및 일본 특허 제3 068 180 B2호, 일본 특허 제3 068 506 B2호, 및 일본 특허 제3 068 507 B2호 및 유럽 특허 EP 0 463 151 B1호 및 국제특허 공개 WO 94/02602호, 국제특허 공개 WO 96/34096호, 국제특허 공개 WO 98/24893호, 국제특허 공개 WO 00/76310호 및 관련 패밀리 사건이 참조된다.

감소된 면역원성을 갖는 항체의 생성은 또한 적절한 라이브러리를 사용하여 인간화, 키메라화 및 디스플레이 기법을 통해 달성된다. 뮤린 항체 또는 다른 종으로부터의 항체는 당업계에 널리 공지된 기법을 사용하여 인간화 또는 영장류화(primatize)될 수 있는 것으로 인식될 것이다. 예를 들어, 문헌[Winter and Harris Immunol Today 14:43 46 (1993)] 및 문헌[Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)]이 참조된다. 관심 항체는 재조합 DNA 기법에 의해 조작되어 CH1, CH2, CH3, 힌지 도메인 및/또는 프레임워크 도메인을 상응하는 인간 서열로 치환할 수 있다 (국제특허 공개 WO 92102190호 및 미국 특허 제5,530,101호; 미국 특허 제5,585,089호; 미국 특허 제5,693,761호; 미국 특허 제5,693,792호; 미국 특허 제5,714,350호; 및 미국 특허 제5,777,085호 참조). 또한, 키메라 면역글로불린 유전자의 작제에 Ig cDNA를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다 (문헌[Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987)] 및 문헌[J. Immunol. 139:3521 (1987)]). mRNA는 하이브리도마 또는 항체를 생성하는 다른 세포로부터 단리되어 cDNA를 생성하는 데 사용된다. 관심 cDNA는 특정 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 증폭될 수 있다 (미국 특허 제4,683,195호 및 미국 특허 제4,683,202호). 대안적으로, 라이브러리를 제조하고 스크리닝하여 관심 서열을 단리한다. 이어서, 항체의 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 인간 불변 영역 서열에 융합한다. 인간 불변 영역 유전자의 서열은 문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242]에서 찾아볼 수 있다. 인간 C 영역 유전자는 공지된 클론으로부터 용이하게 이용가능하다. 동종형의 선택은 요망되는 이펙터 기능, 예를 들어 보체 고정(complement fixation) 또는 항체 의존성 세포 세포독성의 활성에 의해 안내될 것이다. 바람직한 동종형은 IgG1 및 IgG2이다. 인간 경쇄 불변 영역인 카파 또는 람다 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 이어서, 키메라 인간화 항체가 종래의 방법에 의해 발현된다.

항체 단편, 예를 들어 Fv, F(ab′)₂ 및 Fab는 무손상 단백질의 절단, 예를 들어 프로테아제 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 절두형(truncated) 유전자가 설계된다. 예를 들어, F(ab′)₂ 단편의 일부를 인코딩하는 키메라 유전자는 H쇄의 CH1 도메인과 힌지 영역을 인코딩하는 DNA 서열에 이어 번역 정지 코돈을 포함하여 절두형 분자를 생성시킬 것이다.

H 및 L J 영역의 컨센서스 서열은, 인간 C 영역 절편에 대한 V 영역 절편의 후속 연결을 위해 J 영역에 유용한 제한 부위를 도입시키는 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드를 설계하는 데 사용될 수 있다. C 영역 cDNA는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 변형되어 인간 서열의 유사한 위치에 제한 부위를 배치시킬 수 있다.

발현 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, YAC, EBV 유래 에피솜 등을 포함한다. 편리한 벡터는, 기능적으로 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 인코딩하며 임의의 VH 또는 VL 서열이 쉽게 삽입되고 발현될 수 있도록 조작된 적절한 제한 부위를 갖는 것이다. 그러한 벡터에서는, 삽입된 J 영역의 스플라이스 도너(donor) 부위와 인간 C 영역에 선행하는 스플라이스 억셉터(acceptor) 부위 사이에서 그리고 또한 인간 CH 엑손 내에 존재하는 스플라이스 영역에서 스플라이싱이 통상 발생한다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 영역의 하류에 있는 천연 염색체 부위에서 발생한다. 생성된 키메라 항체는 레트로바이러스 LTR, 예를 들어 SV-40 초기 프로모터 (문헌[Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)]), 라우스(Rous) 육종 바이러스 LTR (문헌[Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)]) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 LTR (문헌[Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)])를 포함하는 임의의 강한 프로모터에 결합될 수 있다. 또한, 인식되는 바와 같이, 천연 Ig 프로모터 등이 사용될 수 있다.

또한, 인간 항체 또는 다른 종으로부터의 항체는 당업계에 널리 공지된 기법을 사용하여 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 다른 기법을 제한없이 포함하는 디스플레이형 기술을 통해 생성될 수 있고, 생성된 분자는 친화성 성숙과 같은 추가의 성숙을 겪게 될 수 있으며, 그러한 기법은 당업계에 널리 공지되어 있는 바와 같다. 문헌[Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)], 문헌[

] (리보솜 디스플레이), 문헌[Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988)] (파지 디스플레이), 문헌[Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992)], 문헌[Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990)], 문헌[Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993)], 문헌[Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992)], 문헌[Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992)] 및 미국 특허 제5,733,743호가 참조된다. 디스플레이 기술이 인간이 아닌 항체를 생성하는 데 이용되는 경우, 이러한 항체는 상기 기술된 바와 같이 인간화될 수 있다.

이러한 기법을 사용하여, 항체는 CD47 발현 세포, 가용성 형태의 CD47, 이의 에피토프 또는 펩티드 및 이에 대한 발현 라이브러리에 대해 생성될 수 있으며 (예를 들어, 미국 특허 제5,703,057호 참조), 이는 그 후 요망되는 특징에 대해 이전에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.

본 명세서에 기술된 CD47 항체는 상기 기술된 단일 사슬 항체를 인코딩하는 DNA 절편을 함유하는 벡터에 의해 발현될 수 있다. 이것은 벡터, 리포솜, 네이키드(naked) DNA, 애쥬번트 보조 DNA, 유전자 총, 카테터 등을 포함할 수 있다. 벡터는 표적화 모이어티 (예를 들어, 세포 표면 수용체에 대한 리간드)와 핵산 결합 모이어티 (예를 들어, 폴리라이신)를 갖는 국제특허 공개 WO 93/64701호에 기술된 바와 같은 화학적 접합체, 바이러스 벡터 (예를 들어, DNA 또는 RNA 바이러스 벡터), 표적 모이어티 (예를 들어, 표적 세포에 특이적인 항체)와 핵산 결합 모이어티 (예를 들어, 프로타민)를 함유하는 융합 단백질인 PCT/US95/02140호 (국제특허 공개 WO 95/22618호)에 기술된 바와 같은 융합 단백질, 플라스미드, 파지 등을 포함한다. 벡터는 염색체, 비염색체 또는 합성일 수 있다.

바람직한 벡터는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스를 포함한다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이러한 벡터는 폭스 벡터, 예를 들어 오르토폭스(orthopox) 또는 아비폭스(avipox) 벡터, I형 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터와 같은 포진 바이러스 벡터 (문헌[Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995)]; 문헌[Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995)]; 문헌[Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993)]; 문헌[Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 87:1149 (1990)] 참조), 아데노바이러스 벡터 (문헌[LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993)]; 문헌[Davidson, et al., Nat. Genet. 3:219 (1993)]; 문헌[Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)] 참조) 및 아데노 관련 바이러스 벡터 (문헌[Kaplitt, M. G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)] 참조)를 포함한다.

폭스 바이러스 벡터는 유전자를 세포의 세포질에 도입한다. 아비폭스 바이러스 벡터는 핵산의 단지 단기적인 발현을 가져온다. 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 단순 포진 바이러스 (HSV) 벡터가 핵산을 신경 세포에 도입하기에 바람직하다. 아데노바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스 (약 4개월)보다 단기적인 발현 (약 2개월)을 가져오며, 이때 아데노 관련 바이러스는 다시 HSV 벡터보다 짧다. 선택된 특정 벡터는 표적 세포 및 치료되는 질환에 좌우될 것이다. 도입은 표준 기법, 예를 들어 감염, 형질감염, 형질도입 또는 형질전환에 의해 이루어질 수 있다. 유전자 전이(gene transfer) 방식의 예는, 예를 들어 네이키드 DNA, CaPO₄ 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공, 원형질체 융합, 리포펙션, 세포 미세주사 및 바이러스 벡터를 포함한다.

벡터는 본질적으로 임의의 요망되는 표적 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 정위 주사(stereotaxic injection)가 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, HSV)를 요망되는 위치로 유도하는 데 사용될 수 있다. 또한, 입자는 미니펌프 주입 시스템, 예를 들어 싱크로메드 주입 시스템(SynchroMed Infusion System)을 사용하여 뇌실내 (icy) 주입에 의해 전달될 수 있다. 대류라 명명되는 벌크 유동(bulk flow)에 기반한 방법은 또한 큰 분자를 뇌의 확장된 면적에 전달하는 데 효과적인 것으로 입증되었으며, 벡터를 표적 세포에 전달하는 데 유용할 수 있다. (문헌[Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994)]; 문헌[Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)] 참조). 사용될 수 있는 다른 방법은 카테터, 정맥내, 비경구적, 복강내 및 피하 주사, 및 경구적 또는 다른 공지된 투여 경로를 포함한다.

이러한 벡터는 다양한 방식으로 사용될 수 있는 다량의 항체를 발현하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플에서 CD47의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 또한, 항체는 CD47 및/또는 CD47/SIRP 알파 상호작용 및 CD47/SIRP 알파 매개 신호전달에 결합하여 이를 붕괴시키려고 하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에 기술된 항원 단백질에 특이적인 단일 사슬 항체의 생성을 위해 기법이 적응될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, 단백질 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 호모로그에 대해 요망되는 특이성을 갖는 단클론성 Fab 단편의 신속하고 효과적인 확인을 가능하게 하는 Fab 발현 라이브러리의 구축 (예를 들어, 문헌[Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281] 참조)을 위해 방법이 적응될 수 있다. 단백질 항원에 대한 이디오타입을 함유하는 항체 단편은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 기법에 의해 생성될 수 있다: (i) 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성된 F(ab′)₂ 단편; (ii) F(ab′)₂ 단편의 이황화물 다리를 환원시킴으로써 생성된 Fab 단편; (iii) 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성된 Fab 단편 및 (iv) F_v 단편. 따라서, 기술된 실시 형태의 변화가 고려되며, 이에는 F_v, Fab, Fab' 및 F(ab')₂ CD47 단편, 단일 사슬 CD47 항체, 단일 도메인 항체 (예를 들어, 나노바디 또는 VHH), 이중특이적 CD47 항체 및 이형접합 CD47 항체가 포함된다.

Fc 변형

예를 들어 비정상적 CD47 신호전달과 관련된 질병 및 장애를 치료하는 데 있어서 항체의 유효성을 향상시키기 위해, 이펙터 기능과 관련하여 본 명세서에 기술된 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CD47이 편재적으로 발현되기 때문에, 이펙터 기능을 침묵시킴으로써 정상적인 세포 치사의 가능성을 감소시키기 위해, 돌연변이(들)가 항체의 Fc 영역에 도입될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체는 IgG 동종형이다. 일부 실시 형태에서, 항체의 불변 영역은 인간 IgG1 동종형을 가지며 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 항체의 불변 영역은 인간 IgG2 동종형을 가지며 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 인간 IgG2 불변 영역은 아미노산 Val234, Gly237, Pro238, His268, Val309, Ala329 및 Pro330 (카밧 번호표기)에서 변형되어 Fc 수용체 상호작용을 변경시킨다 (국제특허 공개 WO11/066501 A1호 참조). 예를 들어, Val234Ala, Gly237Ala (G237A), Pro238Ser (P238S), His268Ala (H268A), Val309Leu (V309L), Ala329Ser (A329S) 및 Pro330Ser (P330S)이 있다. (문헌[EU index of Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest]). 일부 실시 형태에서, 변형된 인간 IgG2의 항체의 불변 영역은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는다.

CD47에 대한 항체의 사용

기술된 실시 형태에 따른 치료제는 적합한 담체, 부형제 및 개선된 전이, 전달, 내성 등을 제공하기 위해 제형에 혼입되는 다른 작용제와 함께 투여됨이 인식될 것이다. 다수의 적절한 제형은 모든 약품 화학자에게 공지된 처방집에서 찾아볼 수 있다: 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1975))], 특히 이 문헌의 87장 (Blaug, Seymour) 참조. 이러한 제형은, 예를 들어 분말, 페이스트, 연고(ointment), 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포를 함유하는 (양이온성 또는 음이온성) 지질 (예를 들어, Lipofectin™), DNA 접합체, 무수성 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀전, 에멀전 카보왁스(carbowax) (다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 카보왁스를 함유하는 반고체 혼합물을 포함한다. 제형 중의 활성 구성성분이 제형에 의해 불활성화되지 않고 제형이 투여 경로와 생리학적으로 양립가능하고 허용될 수 있기만 하면, 전술한 혼합물 중 임의의 것이 본 발명에 따른 치료 및 요법에 사용하기에 적절할 수 있다.

일 실시 형태에서, 기술된 항체는 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 작용제는 대체로 피검자에서 비정상적 CD47 발현, 활성 및/또는 신호전달과 관련된 질병 또는 병증을 치료, 경감 및/또는 예방하는 데 사용될 것이다. 치료 계획(therapeutic regimen)은 표준 방법을 사용하여, 피검자, 예를 들어 비정상적 CD47 발현, 활성 및/또는 신호전달과 관련된 질병 또는 장애, 예를 들어 암 또는 다른 신생물 장애를 앓고 있는 (또는 발병 위험이 있는) 인간 환자를 확인함으로써 수행된다. 항체 제제(preparation), 바람직하게는 이의 표적 항원에 대해 높은 특이성 및 높은 친화성을 갖는 항체 제제가 피검자에게 투여되고, 대체로 표적과 이의 결합으로 인해 효과를 가질 것이다. 항체의 투여는 표적 (예를 들어, CD47)의 발현, 활성 및/또는 신호전달 기능을 폐기 또는 억제 또는 방해할 수 있다. 항체의 투여는 표적 (예를 들어, CD47)과 이것이 자연적으로 결합하는 내인성 리간드 (예를 들어, SIRP 알파)의 결합을 폐기 또는 억제 또는 방해할 수 있다. 예를 들어, 항체는 표적에 결합하며, CD47 발현, 활성 및/또는 신호전달을 조절, 차단, 억제, 감소, 길항, 중화 또는 다른 방식으로 방해한다. 일부 실시 형태에서, 표 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 경쇄 CDR을 갖는 항체가 비정상적 CD47 발현과 관련된 질병 또는 장애를 치료하기 위해 피검자에게 투여될 수 있다. 일 실시 형태에서, 비정상적 CD47 발현과 관련된 질병 또는 장애는 암일 수 있다.

[표 2]

비정상적 CD47 발현, 활성 및/또는 신호전달과 관련된 질병 또는 장애는 비제한적인 예로 혈액 암 및/또는 고형 종양을 포함한다. 혈액 암은, 예를 들어 백혈병, 림프종 및 골수종을 포함한다. 특정 형태의 백혈병은 비제한적인 예로 급성 림프구성 백혈병 (ALL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 만성 골수성 백혈병 (CML); 골수증식성 장애/신생물 (MPDS); 및 골수이형성 증후군을 포함한다. 특정 형태의 림프종은 비제한적인 예로 호지킨 림프종, 무통성 및 공격성 둘 모두의 비호지킨 림프종, 버킷 림프종 및 여포성 림프종 (소형 세포 및 대형 세포)을 포함한다. 특정 형태의 골수종은 비제한적인 예로 다발성 골수종 (MM), 거대 세포 골수종, 중쇄 골수종 및 경쇄 또는 벤스-존스(Bence-Jones) 골수종을 포함한다. 고형 종양은, 예를 들어 유방 종양, 난소 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 전립선 종양, 흑색종 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 두경부 종양, 방광 종양, 식도 종양, 간 종양 및 신장 종양을 포함한다.

암 및 다른 신생물 장애와 관련된 증상은, 예를 들어 염증, 발열, 전신 권태감, 발열, 자주 염증 부위에 국한되는 통증, 식욕 상실, 체중 감소, 부종, 두통, 피로, 발진, 빈혈, 근육 약화, 근육 피로 및 복부 증상, 예를 들어 복통, 설사 또는 변비를 포함한다.

본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효량은 대체로 치료 목적을 달성하는 데 필요한 양에 관한 것이다. 앞서 설명된 바와 같이, 이것은 항체와 이의 표적 항원 사이의 결합 상호작용일 수 있으며, 이는 특정 경우에 표적의 기능을 방해한다. 필요한 투여량은 또한 특정 항원에 대한 항체의 결합 친화성에 좌우될 것이며, 또한 투여된 항체가 신체로부터 제거되는 속도에 좌우될 것이다. 본 명세서에 기술된 항체 또는 항체 단편의 치료적 유효 용량에 대한 통상적인 범위는 비제한적인 예로 약 0.1 mg/㎏ 체중 내지 약 100 mg/㎏ 체중일 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 0.1 mg/㎏ 체중 내지 약 0.3 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 0.4 mg/㎏ 체중 내지 약 0.6 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 0.7 mg/㎏ 체중 내지 약 0.9 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 1.0 mg/㎏ 체중 내지 약 2.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 2.0 mg/㎏ 체중 내지 약 3.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 3.0 mg/㎏ 체중 내지 약 4.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 4.0 mg/㎏ 체중 내지 약 5.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 5.0 mg/㎏ 체중 내지 약 6.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 6.0 mg/㎏ 체중 내지 약 7.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 7.0 mg/㎏ 체중 내지 약 8.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 8.0 mg/㎏ 체중 내지 약 9.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 9.0 mg/㎏ 체중 내지 약 10.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 10.0 mg/㎏ 체중 내지 약 15.0 mg/㎏ 체중이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체의 치료적 유효 용량은 약 15.0 mg/㎏ 체중 내지 약 20.0 mg/㎏ 체중이다. 통상적인 투여 빈도는, 예를 들어 1일 1회 내지 1일 2회 내지 격일로 1회 내지 1주 1회의 범위일 수 있다.

치료의 효능은 특정 염증 관련 장애를 진단 또는 치료하기 위한 임의의 공지된 방법과 관련하여 결정된다. 염증 관련 장애의 하나 이상의 증상의 경감은 항체가 임상적 이점을 부여한다는 것을 나타낸다.

다른 실시 형태에서, CD47에 대해 유도된 항체는 CD47의 국재화 및/또는 정량화에 관해 (예를 들어, 적절한 생리학적 샘플 내의 CD47 및/또는 CD47과 SIRP 알파 둘 모두의 수준을 측정하는 데 사용하기 위해, 진단 방법에 사용하기 위해, 단백질의 이미징에 사용하기 위해 등) 당업계에 공지된 방법에 사용될 수 있다. 주어진 실시 형태에서, 항체 유래 항원 결합 도메인을 함유하는, CD47, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 호모로그에 특이적인 항체는 약리학적 활성 화합물 (이하, "치료제"로 지칭됨)로 이용된다.

다른 실시 형태에서, CD47에 특이적인 항체는 면역친화성, 크로마토그래피 또는 면역침전과 같은 표준 기법에 의해 CD7 폴리펩티드를 단리하는 데 사용될 수 있다. CD47 단백질 (또는 이의 단편)에 대해 유도된 항체는 생물학적 샘플에서 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD47은, 예를 들어 주어진 치료 계획의 효능을 결정하기 위해, 임상 시험 절차의 일부로서 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 검출은 항체를 검출가능한 물질에 커플링 (즉, 물리적으로 연결)시킴으로써 용이하게 될 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결 분자단 복합체의 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린 및 애큐오린(aequorin)을 포함하고, 적합한 방사성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체는 샘플에서 CD47 및/또는 CD47과 SIRP 알파 단백질 (또는 이의 단백질 단편) 둘 모두의 존재를 검출하기 위한 작용제로서 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체는 검출가능한 표지를 함유한다. 항체는 다클론성이거나 더욱 바람직하게는 단클론성이다. 무손상 항체 또는 이의 단편 (예를 들어, Fab, scFv 또는 F(ab′)₂)이 사용된다. 항체와 관련하여 용어 "표지된"은 검출가능한 물질을 항체에 커플링 (즉, 물리적으로 연결)시켜 항체를 직접 표지하는 것뿐만 아니라 직접 표지되는 다른 시약과의 반응성에 의해 항체를 간접 표지하는 것을 포함하고자 한다. 간접 표지의 예는 형광 표지된 2차 항체를 사용하는 1차 항체의 검출 및 형광 표지된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴에 의한 항체의 말단 표지를 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 피검자로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 체액뿐만 아니라 피검자 내에 존재하는 조직, 세포 및 체액을 포함하고자 한다. 따라서, 용어 "생물학적 샘플"의 용법에는 혈액, 및 혈청, 혈장 또는 림프를 포함하는 혈액의 분획 또는 성분이 포함된다. 즉, 기술된 실시 형태의 검출 방법은 시험관내뿐만 아니라 생체내에서 생물학적 샘플 내의 분석물 mRNA, 단백질 또는 게놈 DNA를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 분석물 mRNA의 검출을 위한 시험관내 기법은 노던(Northern) 하이브리드화 및 원위치 하이브리드화를 포함한다. 분석물 단백질의 검출을 위한 시험관내 기법은 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침전 및 면역형광을 포함한다. 분석물 게놈 DNA의 검출을 위한 시험관내 기법은 서던 하이브리드화를 포함한다. 면역검정을 수행하는 절차는, 예를 들어 문헌["ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, N.J., 1995]; 문헌["Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1996]; 및 문헌["Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985]에 기술되어 있다. 또한, 분석물 단백질의 검출을 위한 생체내 기법은 표지된 항-분석물 단백질 항체를 피검자에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 항체는, 피검자 내의 존재 및 위치가 표준 이미징 기법에 의해 검출될 수 있는 방사성 마커로 표지될 수 있다.

CD47 항체의 치료적 투여 및 제형

본 명세서에 기술된 항체 및 이의 유도체, 단편, 유사체 및 호모로그는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물을 제조하는 데 관련된 원리 및 고려 사항뿐만 아니라 성분의 선택 시의 지침은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995]; 문헌[Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994]; 및 문헌[Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York]이 참조된다.

이러한 조성물은 전형적으로 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 억제 단편이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열에 기반하여, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 보유하는 펩티드 분자가 설계될 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고/되거나 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)] 참조).

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 약제 투여와 양립가능한 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매체, 코팅, 항세균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함하고자 한다. 적합한 담체는, 당업계의 표준 참고 도서이며 본 명세서에 참고로 포함된, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]의 최신판에 기술되어 있다. 이러한 담체 또는 희석제의 바람직한 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 리포솜 및 비수성 비히클, 예를 들어 고정유(fixed oil)가 또한 사용될 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매체 및 작용제의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 종래의 매체 또는 작용제가 항체와 양립가능하지 않는 경우를 제외하고는, 조성물에서 이의 사용이 고려된다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 무균이어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

기술된 실시 형태의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로와 양립가능하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (즉, 국소적), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항세균제, 예를 들어 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA): 완충액, 예를 들어 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염, 및 장성(tonicity) 조정제, 예를 들어 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구용 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 1회용 주사기 또는 다회 투여 바이알에 넣어질 수 있다.

주사가능한 용도에 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정세균수, Cremophor EL™ (미국 뉴저지주 파시패니 소재의 BASF) 또는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우, 조성물은 무균이어야 하며, 쉬운 주사능(syringeability)이 존재할 정도로 유동적이어야 한다. 이것은 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 가져올 수 있다.

멸균 주사 용액은 필요한 양의 항체를 필요에 따라 상기 열거된 구성성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 혼입시킨 다음 멸균 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 대체로, 분산물은 기본 분산 매체 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 구성성분을 함유하는 멸균 비히클에 항체를 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 제조 방법은 미리 멸균 여과된 용액으로부터의 활성 구성성분 및 임의의 추가의 요망되는 구성성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조이다.

흡입에 의한 투여의 경우, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들어 이산화탄소와 같은 가스를 함유하는 가압 용기 또는 디스펜서, 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투하려는 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 대체로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여의 경우 표면활성제(detergent), 담즙염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 하나 이상의 기술된 항체가 당업계에 대체로 공지된 바와 같이 연고, 샐브(salve), 겔 또는 크림으로 제형화될 수 있다.

화합물은 또한 직장 전달을 위해 좌제 (예를 들어, 종래의 좌제 베이스, 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리세라이드를 사용함) 또는 정체 관장제(retention enema) 형태로 제조될 수 있다.

일 실시 형태에서, 기술된 항체는 임플란트 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하는 지속/제어 방출 제형과 같은 신체로부터 급속한 제거에 대해 보호하는 담체로 제조될 수 있다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

예를 들어, 활성 구성성분은, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀전, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀전(macroemulsion)에서, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예컨대 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 캡슐화될 수 있다.

지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하며, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사용 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하는 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 하이드로겔은 더 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다.

리포솜 현탁액 (바이러스 항원에 대한 단클론성 항체와 함께 감염된 세포에 표적화된 리포솜을 포함함)이 또한 약제학적으로 허용되는 담체로 사용될 수 있다. 이것은, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기술된 바와 같은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 비경구 조성물을 투여 단위형으로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투여 단위형은 치료하려는 피검자를 위한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 함께 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 하나 이상의 기술된 항체를 함유한다. 기술된 실시 형태의 투여 단위형에 대한 규격(specification)은 항체의 독특한 특징 및 달성하려는 특정 치료 효과, 및 개체의 치료를 위해 그러한 항체를 배합하는 것과 관련하여 당업계에 내재된 한계에 의해 영향을 받고 이에 직접적으로 좌우된다.

기술된 약제학적 조성물은 투여 설명서와 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.

또한, 본 명세서에 기술된 제형은 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 하나 초과의 기술된 항체, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 조성물은 이의 기능을 향상시키는 작용제, 예를 들어 세포독성제, 사이토카인, 화학치료제 또는 성장 억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

일 실시 형태에서, 하나 이상의 기술된 항체는 병용 요법으로, 즉, 병리학적 질환 또는 장애, 예를 들어 다양한 형태의 암, 자가면역 장애 및 염증성 질병을 치료하는 데 유용한 다른 작용제, 예를 들어 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 상황에서 용어 "병용하여"는 작용제들이 동시 투여 또는 순차 투여로 실질적으로 동시적으로 투여됨을 의미한다. 순차 투여되는 경우, 제2 화합물의 투여 개시 시점에서, 두 화합물 중 제1 화합물은 바람직하게는 치료 부위에서 여전히 유효한 농도로 검출가능하다.

예를 들어, 병용 요법은, 아래에 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들어 하나 이상의 사이토카인 및 성장 인자 억제제, 면역억제제, 항염증제, 대사 억제제, 효소 억제제 및/또는 세포독성제 또는 세포증식억제제(cytostatic agent)와 공동 제형화(coformulated) 및/또는 공동 투여되는(coadministered) 본 명세서에 기술된 하나 이상의 항체를 포함할 수 있다. 유리하게도, 이러한 병용 요법은 투여되는 치료제들의 더 적은 투여량을 이용하며, 이에 따라 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 회피할 수 있다.

본 명세서에 기술된 항체와 병용하여 사용되는 바람직한 치료제는 염증 반응의 다양한 단계에서 개입하는 작용제이다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 항체는, 하나 이상의 추가 작용제, 예를 들어 다른 사이토카인 또는 성장 인자 길항제 (예를 들어, 가용성 수용체, 펩티드 억제제, 소분자, 리간드 융합체); 또는 다른 표적에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 (예를 들어, 다른 사이토카인 또는 성장 인자, 이의 수용체, 또는 다른 세포 표면 분자에 결합하는 항체); 및 항염증성 사이토카인 또는 이의 효능제(agonist)와 공동 제형화 및/또는 공동 투여될 수 있다.

다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체는 자가면역 장애, 염증성 질병 등에 대한 백신 애쥬번트로 사용된다. 이러한 유형의 장애의 치료를 위한 애쥬번트들의 조합은 표적화된 자기 항원(self antigen)으로부터의 매우 다양한 항원, 즉, 자가면역에 관여하는 자가항원(autoantigen), 예를 들어 미엘린 염기성 단백질; 염증성 자기 항원, 예를 들어 아밀로이드 펩티드 단백질, 또는 이식 항원(transplant antigen), 예를 들어 동종항원(alloantigen)과 병용하여 사용하기에 적합하다. 항원은 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 폴리펩티드뿐만 아니라 다음 중 어느 것의 단편을 포함할 수 있다: 당류, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 자가항원, 아밀로이드 펩티드 단백질, 이식 항원, 알레르겐, 또는 다른 고분자 성분. 일부의 경우, 하나 초과의 항원이 항원 조성물에 포함된다.

추가의 스크리닝 방법

본 발명은 조절자, 즉, SIRP 알파에 대한 CD47의 결합을 조절 또는 다른 방식으로 방해하는 후보 또는 시험 화합물 또는 작용제 (예를 들어, 펩티드, 펩티드 모방체(peptidomimetic), 소분자 또는 다른 약물), 또는 CD47 및/또는 CD47-SIRP 알파의 신호전달 기능을 조절 또는 다른 방식으로 방해하는 후보 또는 시험 화합물 또는 작용제를 확인하는 방법 (본 명세서에서 "스크리닝 검정"으로도 지칭됨)을 제공한다. 또한, 비정상적 CD47 및/또는 CD47-SIRP 알파 발현, 활성 및/또는 신호전달과 관련된 장애를 치료하는 데 유용한 화합물을 확인하는 방법이 제공된다. 스크리닝 방법은 당업계에 공지되거나 당업계에서 사용되는 것 또는 본 명세서에 기술된 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, CD47은 미세역가 플레이트 상에 고정되어 SIRP 알파의 존재 하에 후보 또는 시험 화합물, 예를 들어 CD47 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 후속하여, 결합된 SIRP 알파가 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있고, 흡광도가 플레이트 판독기에서 검출될 수 있다.

또한, 대식세포에 의한 종양 세포의 식세포작용을 촉진시킬 수 있는 화합물을 확인하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 당업계에 공지되거나 당업계에서 사용되는 것 또는 본 명세서에 기술된 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대식세포는 후보 화합물, 예를 들어 CD47 항체의 존재 하에 표지된 종양 세포와 함께 인큐베이션된다. 일정 시간 후, 대식세포는 종양 표지의 내재화에 대해 관찰되어 식세포작용을 확인할 수 있다. 이러한 방법에 관한 추가의 세부 사항, 예를 들어 SIRP 알파 차단 검정 및 식세포작용 검정이 실시예에 제공되어 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 스크리닝 검정에서 확인된 화합물을 포함한다.

일 실시 형태에서, CD47의 신호전달 기능을 조절하는 후보 또는 시험 화합물을 스크리닝하는 검정이 제공된다. 시험 화합물은 다음을 포함하는 당업계에 공지된 조합 라이브러리 방법의 수많은 접근법 중 임의의 것을 사용하여 얻어질 수 있다: 생물학적 라이브러리; 공간적으로 어드레스 가능한(addressable) 병렬 고체상 또는 액체상 라이브러리; 디컨볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; "원-비드 원-화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법; 및 친화성 크로마토그래피 선택을 사용하는 합성 라이브러리 방법. 생물학적 라이브러리 접근법은 펩티드 라이브러리로 제한되지만, 다른 4개의 접근법은 펩티드, 비펩티드 올리고머 또는 화합물들의 소분자 라이브러리에 적용 가능하다. (예를 들어, 문헌[Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145] 참조).

본 명세서에 사용된 바와 같은 "소분자"는 분자량이 약 5 kD 미만, 가장 바람직하게는 약 4 kD 미만인 조성물을 지칭하고자 한다. 소분자는, 예를 들어 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 또는 무기 분자일 수 있다. 진균, 세균 또는 조류 추출물과 같은 화학적 및/또는 생물학적 혼합물의 라이브러리가 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기술된 검정 중 임의의 것으로 스크리닝될 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 당업계에서, 예를 들어 문헌[DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909]; 문헌[Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422]; 문헌[Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678]; 문헌[Cho, et al., 1993. Science 261: 1303]; 문헌[Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059]; 문헌[Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061]; 및 문헌[Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233]에서 찾아볼 수 있다.

화합물의 라이브러리는 용액 중에 (예를 들어, 문헌[Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421] 참조), 또는 비드 상에 (문헌[Lam, 1991. Nature 354: 82-84] 참조), 칩 상에 (문헌[Fodor, 1993. Nature 364: 555-556] 참조), 세균으로 (미국 특허 제5,223,409호 참조), 포자로 (미국 특허 제5,233,409호 참조), 플라스미드로 (문헌[Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869] 참조) 또는 파지 상에 (문헌[Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390]; 문헌[Devlin, 1990. Science 249: 404-406]; 문헌[Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382]; 문헌[Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310]; 및 미국 특허 제5,233,409호 참조) 제공될 수 있다.

일 실시 형태에서, 후보 화합물이 항체-항원 복합체에 도입되고, 후보 화합물이 항체-항원 복합체를 붕괴시키는지를 결정하는데, 이러한 복합체의 붕괴는 후보 화합물이 CD47의 신호전달 기능 및/또는 CD47과 SIRP 알파 사이의 상호작용을 조절한다는 것을 나타낸다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 가용성 CD47 및/또는 CD47과 SIRP 알파 단백질 둘 모두가 제공되며, 적어도 하나의 중화 단클론성 항체에 노출된다. 항체-항원 복합체의 형성이 검출되고, 하나 이상의 후보 화합물이 복합체에 도입된다. 항체-항원 복합체가 하나 이상의 후보 화합물의 도입 후 붕괴되는 경우, 후보 화합물은 비정상적 CD47 및/또는 CD47-SIRP 알파 신호전달과 관련된 장애를 치료하는 데 유용하다.

항체-항원 복합체를 방해 또는 붕괴하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어 항원 또는 이의 생물학적 활성 부분에 대한 시험 화합물의 결합이 복합체에서 표지된 화합물을 검출함으로써 결정될 수 있도록 시험 화합물을 방사성동위원소 또는 효소 표지와 커플링시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 시험 화합물은 직접 또는 간접적으로 ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C 또는 ³H로 표지될 수 있고, 방사성동위원소는 방사방출(radioemission)의 직접 계산 또는 섬광 계수에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 시험 화합물은, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 또는 루시퍼라제로 효소 표지될 수 있고, 효소 표지는 적절한 기질의 생성물로의 전환의 결정에 의해 검출될 수 있다.

일 실시 형태에서, 검정은 항체-항원 복합체를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및 항원과 상호작용하거나 그렇지 않으면 기존의 항체-항원 복합체를 붕괴시키는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 항원과 상호작용하고/하거나 항체-항원 복합체를 붕괴시키는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은 항체와 비교하여 항원 또는 이의 생물학적 활성 부분에 우선적으로 결합하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다.

다른 실시 형태에서, 검정은 항체-항원 복합체를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및 항체-항원 복합체를 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함한다. 항체-항원 복합체를 조절하는 시험 화합물의 능력을 결정하는 것은, 예를 들어 시험 화합물의 존재 하에 항체에 결합하거나 이와 상호작용하는 항원의 능력을 결정함으로써 달성될 수 있다.

당업자는 본 명세서에 개시된 스크리닝 방법 중 임의의 것에서 항체가 CD47 활성 및/또는 신호전달을 조절하거나 다른 방식으로 방해하는 중화 항체일 수 있음을 인식할 것이다.

본 명세서에 개시된 스크리닝 방법은 세포 기반 검정 또는 무세포 검정으로 수행될 수 있다. 기술된 실시 형태의 무세포 검정은 가용성 형태 또는 막 결합 형태의 CD47 및 이의 단편의 사용에 적합하다. 막 결합 형태의 CD47을 포함하는 무세포 검정의 경우, 막 결합 형태의 단백질이 용액 중에 유지되도록 가용화제를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 가용화제의 예는 비이온성 표면활성제, 예를 들어 n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드, 데카노일-N-메틸글루카미드, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, 아이소트라이데실폴리(에틸렌 글리콜 에테르)_n, N-도데실-N,N-다이메틸-3-암모니오-1-프로판 설포네이트, 3-(3-콜아미도프로필) 다이메틸암미니올-1-프로판 설포네이트 (CHAPS) 또는 3-(3-콜아미도프로필)다이메틸암미니올-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트 (CHAPSO)를 포함한다.

하나 초과의 실시 형태에서, 항체 또는 항원 중 어느 하나를 고정시켜 후보 화합물의 도입 후 복합체화된 형태를 하나 또는 둘 모두의 복합체화되지 않은 형태로부터 분리하는 것을 용이하게 하는 것뿐만 아니라 검정의 자동화를 수용하는 것이 바람직할 수 있다. 후보 화합물의 존재 및 부재 하에 항체-항원 복합체의 관찰은 반응물을 함유하는 데 적합한 임의의 용기에서 달성될 수 있다. 이러한 용기의 예는 미세역가 플레이트, 시험관 및 미세 원심분리관을 포함한다. 일 실시 형태에서, 단백질 중 하나 또는 둘 모두가 매트릭스에 결합될 수 있게 하는 도메인을 부가하는 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, GST-항체 융합 단백질 또는 GST-항원 융합 단백질이 글루타티온 세파로스 비드 (미국 미주리주 세인트루인스 소재의 Sigma Chemical) 또는 글루타티온 유도체화 미세역가 플레이트 상에 흡착되고, 이어서 시험 화합물과 배합되고, 혼합물은 복합체 형성에 도움이 되는 조건 하에서 (예를 들어, 염 및 pH에 대해 생리적 조건에서) 인큐베이션된다. 인큐베이션 후, 비드 또는 미세역가 플레이트 웰을 세척하여 임의의 결합되지 않은 성분을 제거하고, 비드의 경우 매트릭스를 고정시키며, 직접 또는 간접적으로 복합체를 결정한다. 대안적으로, 복합체는 매트릭스로부터 해리될 수 있고, 항체-항원 복합체 형성의 수준은 표준 기법을 사용하여 결정될 수 있다.

단백질을 매트릭스 상에 고정시키는 다른 기법이 또한 기술된 실시 형태의 스크리닝 검정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 (예컨대, C47B157, C47B161 및 C47B222, 또는 서열 번호 4 내지 6으로부터 선택되는 가변 중쇄와 서열 번호 7 및 8로부터 선택되는 가변 경쇄를 갖는 항체) 또는 항원 (예컨대, CD47 단백질)은 비오틴과 스트렙타비딘의 접합을 이용하여 고정될 수 있다. 비오티닐화 항체 또는 항원 분자는 당업계에 널리 공지된 기법 (예를 들어, 미국 일리노이주 록퍼드 소재의 Pierce Chemicals의 비오티닐화 키트)을 사용하여 비오틴-NHS(N-하이드록시-석신이미드)로부터 제조될 수 있고, 스트렙타비딘 코팅된 96 웰 플레이트 (Pierce Chemical)의 웰에 고정될 수 있다. 대안적으로, 관심 항체 또는 항원과 반응성이지만 관심 항체-항원 복합체의 형성을 방해하지 않는 다른 항체가 플레이트의 웰에 유도체화될 수 있고, 결합되지 않은 항체 또는 항원은 항체 접합에 의해 웰에 가두어질 수 있다. GST 고정된 복합체에 대해 상기 기술된 것 이외에 이러한 복합체를 검출하는 방법은 항체 또는 항원과 반응성인 이러한 다른 항체를 사용하는 복합체의 면역검출을 포함한다.

본 발명은 추가로 전술된 스크리닝 검정 중 임의의 것에 의해 확인된 신규 작용제 및 본 명세서에 기술된 바와 같은 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다.

진단용 및 예방용 제형

본 명세서에 기술된 항체는 진단용 및 예방용 제형에 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 하나 이상의 기술된 항체는 하나 이상의 전술된 질병, 예를 들어 제한 없이 암 또는 다른 신생물 질환이 발병될 위험이 있는 피검자에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 전술된 암 또는 다른 신생물 질환에 대한 피검자 또는 기관의 소인(predisposition)은 유전자형, 혈청학적 또는 생화학적 마커를 사용하여 결정될 수 있다.

본 명세서에 기술된 항체는 또한 환자 샘플 내의 CD47 및/또는 SIRP 알파의 검출에 유용하며, 따라서 진단제로 유용하다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 CD47 항체는 환자 샘플에서 CD47 및/또는 SIRP 알파 수준을 검출하기 위해 ELISA와 같은 시험관내 검정에서 사용된다.

일 실시 형태에서, 본 명세서에 기술된 항체는 고체 지지체 (예를 들어, 미세역가 플레이트의 웰(들)) 상에 고정된다. 고정된 항체는 시험 샘플에 존재할 수 있는 임의의 CD47 및/또는 SIRP 알파에 대한 포획 항체의 역할을 한다. 고정된 항체를 환자 샘플과 접촉시키기 전에, 고체 지지체는 분석물의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 우유 단백질 또는 알부민과 같은 차단제로 헹구고 처리된다.

후속하여, 웰은 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시험 샘플 또는 표준량의 항원을 함유하는 용액으로 처리된다. 이러한 샘플은, 예를 들어 병증의 진단인 것으로 간주되는 순환 항원의 수준을 갖는 것으로 의심되는 피검자로부터의 혈청 샘플이다. 시험 샘플 또는 표준 물질을 헹구어 낸 후, 고체 지지체는 검출가능하게 표지된 2차 항체로 처리된다. 표지된 2차 항체는 검출 항체의 역할을 한다. 검출가능한 표지의 수준이 측정되고, 시험 샘플 중의 CD47 및/또는 SIRPα의 농도가 표준 샘플로부터 작성된 표준 곡선과의 비교에 의해 결정된다.

시험관내 진단 검정에 기술된 항체를 사용하여 얻어진 결과를 기반으로 하여, CD47 및/또는 SIRP 알파의 발현 수준에 기반하여 피검자의 질병 (예를 들어, 허헐과 관련된 임상 적응증, 자가면역 또는 염증성 장애)의 단계를 결정하는 것이 가능하다는 것이 인식될 것이다. 주어진 질병에 대해, 질병 진행의 다양한 단계 및/또는 질병의 치료적 처리의 다양한 시점에 있는 것으로 진단된 피검자로부터 혈액의 샘플이 채취된다. 진행 또는 요법의 각 단계에 대해 통계적으로 유의한 결과를 제공하는 샘플의 집단을 사용하여, 각 단계의 특징으로 간주될 수 있는 항원의 농도 범위가 지정된다.

본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 관한 임의의 논의는 이들 사항 중 임의의 것 또는 전부가, 그것이 본 출원의 각 청구항의 우선일 전에 존재했기 때문에 본 발명과 관련된 분야에서 통상적인 일반 지식이었다거나 종래 기술 기반의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1: 하이브리도마 기술을 사용한 CD47 항체의 생성

표준 면역화 프로토콜을 사용하여, 프로인트 애쥬번트 (Sigma), InterFAD (마우스 인터페론 알파, PBL InterferonSource) 또는 2-용량 애쥬번트 (Creative Diagnostics)를 이용하여 Balb/c 마우스를 재조합 인간 CD47-Fc 키메라 (R&D systems)로 면역화하여 항-CD47 항체 개발을 개시하였다. CD47 항체를 발현하는 하이브리도마를 개발하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장을 채취하고, SP20-Bcl2 골수종 세포와의 융합을 위해 B 세포를 단리하였다. 4개의 융합체 (C47Y1, C47Y2, C47Y3, 및 C47Y4)로부터의 하이브리도마 클론을, CD47에 결합하지만 Fc-태그에는 결합하지 않는 항체에 대해 ELISA에 의해 검정하였다. CD47에 대한 특이적 결합을 나타내는 하이브리도마 상청액을, MSD(meso scale discovery) 기반 검정에 의해 CD47 발현 Jurkat 세포 (TIB-152, ATCC)에 대한 결합 및 Jurkat 세포에 대한 SIRP 알파 결합의 차단에 대해 추가로 스크리닝하였다.

간략하게 말하면, Jurkat 세포를 세척하고, 인산염 완충 식염수에 재현탁시키고, 이어서 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션함으로써 웰당 30,000개의 세포로 MSD 96-웰 고결합 플레이트 상에 포획시켰다. 플레이트를 부드럽게 교반하면서 실온에서 30분 동안 15% 소 태아 혈청 (FBS) (또는 열 불활성화된 FBS)로 차단하였다. 세포 결합 활성의 경우, 하이브리도마 상청액을 4℃에서 1시간 동안 MSD 고결합 플레이트 상에 포획된 세포와 함께 인큐베이션하고, 결합된 항체를 MSD Sulfo-태그 표지된 염소 항-마우스 항체로 검출하였다.

SIRP 알파 차단 활성의 경우, 2 ㎍/ml의 재조합 SIRP 알파-Fc (R&D systems)를 하이브리도마 상청액의 존재 하에 Jurkat 세포와 함께 1 내지 1.5시간 동안 인큐베이션하고, 결합된 SIRP 알파를 MSD Sulfo-태그 표지된 마우스 항-SIRP 알파 항체 (R&D systems)로 검출하였다. 플레이트를 섹터(Sector) 6000 이미저(imager)에서 판독하고, 전기화학발광 (ECL) 신호를 기록하였다. % 억제를 검정에 포함된 무항체(no antibody) 및 무 SIRP 알파(no SIRP alpha) 대조군에 대해 정규화시켰다. SIRP 알파 결합의 중화를 나타내는 하이브리도마 히트(hit)를, 항체 V 영역의 분자 클로닝을 위해 선택하였다. 간략하게 말하면, 관심 하이브리도마 히트로부터의 cDNA를 Invitrogen의 SuperScript III 세포 Direct cDNA System으로 역전사효소 반응에 의해 단리하고, 이어서, 뮤린 IgG1/K 불변 영역 상으로의 주입 클로닝 전에 사전 혼합된 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 PCR을 통해 V 영역을 증폭시켰다. HEK293 세포 (Life Technologies)에서 재조합 발현 후, mIgG1 mAb를 함유하는 일시적 형질감염 상청액을 Jurkat 세포 결합 검정 및 SIRP 알파 차단 검정에서 재스크리닝(re-screening)하였다. 확인된 SIRP 알파 차단 활성 (40% 초과의 억제, 표 3)을 갖는 총 20개의 서열이 독특한 mlgG1 mAb를, 키메라 인간 IgG2 Fc 침묵 /인간 카파 mAb로의 전환을 위해 선택하였다.

[표 3]

실시예 2: 파지 디스플레이 기술을 사용한 CD47 항체의 생성

CD47 시약 및 방법: C-말단 6xHIS 태그 (서열 번호 55)가 첨가된 재조합 인간 CD47 세포외 도메인 (ECD) 단백질 (서열 번호 22)을, 파지 패닝(phage panning)을 위해 사내(in-house)에서 생성하였다. 인간 CD47에 대한 cDNA 클론을 Origene으로부터 얻었고, ECD 영역을 PCR에 의해 증폭시키고, 포유류 발현 벡터에 서브클로닝하였다. HEK 293F 세포의 일시적 형질감염 후, 분비된 His 태깅된 인간 CD47-ECD 단백질을, HisTrap 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(Immobilized-metal affinity chromatography) (IMAC)를 통해 정제하였다. 피크 분획을 풀링(pooling) 및 농축한 후, 최종 폴리싱(polishing) 단계를 위해 26/60 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 크로마토그래피하여 단량체 형태 및 이량체 형태의 CD47-ECD 단백질을 얻었다. 파지 패닝 실험을 위해 10배 몰 과량의 설포-NHS-LC-비오틴 (Pierce)을 사용하여 CD47-ECD 단백질을 비오티닐화하였다.

파지 디스플레이: 사내 드 노보(de novo) 파지 라이브러리가 상세히 기술되어 있다 (문헌[Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397:385-396]; 국제특허 공개 WO09/085462호). 이러한 라이브러리는 CDR-H3에서 높은 다양성을 갖도록 설계된 3개의 인간 VH 생식세포계열 유전자 (IGHV1-69, 3-23, 5-51) 및 4개의 인간 VL 생식세포계열 유전자 (A27, B3, L6, O12) 상에서 구축되었다. 파지 외피 단백질 pIX 상에 Fab 변이체를 나타내는 3개의 드 노보 파지 라이브러리 (DNP00004 -169HC /LC 혼합체, DNP00005 -323HC /LC 혼합체 및 DNP00006 -551HC / LC 혼합체)를 표준 프로토콜에 따라 이량체 형태의 비오티닐화 인간 CD47-ECD에 대해 패닝하였다. 사용된 패닝 조건은 다음을 포함한다: 실온에서 1시간 동안 비오티닐화 인간 CD47 ECD 이량체로 패닝하는데, 라운드 1은 항원 농도가 100 nM이고 파지 포획에 스트렙타비딘 비드를 사용하고; 라운드 2는 항원 농도가 100 nM이고 파지 포획에 뉴트라비딘(Neutravidin) 비드를 사용하고; 라운드 3은 항원 농도가 10 nM이고 파지 포획에 스트렙타비딘 비드를 사용한다. Fab 단백질을 생성하고, 다클론성 항-Fd (CH1) 항체에 의해 ELISA 플레이트 상에 포획하였다. 비오티닐화 CD47 ECD를 요망되는 nM 농도로 첨가하고, 결합된 비오티닐화 CD47을 HRP 접합 스트렙타비딘에 의해 검출하고, 화학발광을 플레이트 판독기에서 판독하였다. 또한, Fab 클론을 이의 VH 및 VL 동일성에 대해 서열분석하였다. 선택된 Fab로부터의 VH를, PCR을 사용하여 관심 Fab를 발현하는 대장균(E. coli) 클론으로부터 프레임워크 특이적 프라이머로 증폭시키고, 포유류 발현을 위한 신호 펩티드 및 인간 IgG2 이펙터 기능 침묵 (IgG2 Fc 침묵) 중쇄 불변 영역을 함유하는 포유류 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 유사하게, VL을 증폭시키고, 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 포유류 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 서브클로닝은 주입 클로닝 (Clontech)에 의해 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머는 표 4에 요약되어 있다. 주입 클로닝은 리게이션(ligation) 의존성 클로닝 (LIC)으로도 알려져 있으며, 여기서 DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제 또는 DNA 리가제의 사용 없이 서열 상동성에 기반하여 서로 연결되었다.

[표 4]

새로 생성된 VH 및 VL 포유류 발현 DNA 작제물이 함께 쌍을 이루게 하여 추가 특성규명을 위해 10개의 mAb를 생성시켰다. 이것을 HEK293F 세포에서 일시적으로 형질감염시키고, mAb를 함유하는 생성된 상청액을, FACS에 의해 Jurkat 세포 상의 CD47에 결합하는 능력 및 이전에 기술된 바와 같이 Jurkat 세포에 대한 SIRP 알파 결합을 차단하는 능력에 대해 특성규명하였다. 구매가능한 항-CD47 B6H12.2를 인간 IgG2sigma 불변 영역에 서브클로닝하고, 검정에서 양성 대조군으로 사용하였다. 도 1은 10개의 파지 유래 mAb의 활성을 도시하며, 그 중 4개는 강한 SIRP 알파 차단 활성을 나타내었다. 그 중 3개인 C47B91 (=C47M91), C47B96 (=C47M96) 및 C47B98 (=C47M98)은 CD47 특이적 세포 결합제로서 확인되었고, 따라서 추가 특성규명을 위해 선택되었다.

실시예 3: CD47 항체의 생체활성

CD47과 결합하고 CD47의 특정 생체활성을 차단하는 (20개는 하이브리도마 방법으로부터 그리고 3개는 파지 디스플레이 방법으로부터) 생성된 총 23개의 CD47 항체의 능력을, 아래에 기술된 바와 같은 다양한 시험관내 검정을 사용하여 분석하였다.

CD47 결합 검정: 인간 CD47 및 사이노 CD47 ECD 단백질을 실시예 2에 기술된 바와 같이 His 태깅된 단백질로서 사내에서 생성하였다. 인간 CD47 및 사이노 CD47 ECD 단백질에 대한 속도론적 결합 친화성을 단백질 상호작용 어레이 시스템(Protein Interaction Array System) (ProteOn)에 의해 결정하였다. 간략하게 말하면, mAb를 항-IgG-Fc를 통해 센서 칩 상에 포획하여 200 내지 350 RU의 표면 밀도에 도달시켰다. CD47 ECD 단량체 단백질을 300 nM로부터 3.7 nM에 이르기까지 연속 적정하고, 5분 동안 주사하였다. 해리를 30분 동안 모니터링하였다. 데이터를 1:1 결합 모델에 적합시켰다. 23개의 mAb의 K_D 값뿐만 아니라 인간 및 사이노 CD47 단백질에 대한 친화성들 사이의 비가 표 3에 열거되어 있다. 대부분의 mAb는 C47B121, C47B120 및 C47B131을 제외하고 사이노 CD47 교차 반응성 (인간 CD47의 5배 이내의 친화성)을 나타내었다.

비닝 검정(binning assay): 본 검정은 포획 시약과 검출 시약 둘 모두로서 개별적으로 항체들의 패널의 평가를 허용하는데, 이는 항체들의 나머지가 패널에 있는 상태에서 행해진다. 서로 효과적인 포획/검출 시약을 형성하는 항체들은 이론적으로 단량체 단백질 상의 공간적으로 분리된 에피토프들을 인식하여, 둘 모두의 항체가 동시에 표적 단백질에 결합할 수 있게 한다. 전체 패널에 걸쳐 유사한 활성 패턴을 나타내는 클론들의 그룹은 유사한 에피토프들에 결합하는 것으로 가정된다. 따라서, 상이한 그룹들로부터 클론들을 선택하는 것은, 상이한 에피토프들을 인식하는 항체들을 제공할 것이다. CD47 항체를 GLC 센서 (BioRad) 상에 직접 고정시켰다. 경쟁 샘플을 200 nM의 CD47-ECD와 함께 4시간 동안 사전 인큐베이션한 후, 4분 동안 칩 표면 위로 주사하여 회합을 가능하게 하였다. 이어서, 해리를 4분 동안 모니터링하였다. 결과는 4개의 별개의 에피토프 그룹이 존재할 수 있음을 암시하는데, 그룹 1과 그룹 2는 중복되고 서로 경쟁하는 반면, 그룹 3은 그룹 1과만 중복되고 그룹 2와는 중복되지 않는다.

SIRP 알파 차단 활성: 항체를 연속 적정하고 MSD 고결합 플레이트 상에 포획된 Jurkat 세포와 함께 1시간 동안 인큐베이션함으로써 23개의 CD47 항체에 의한 SIRP 알파 차단의 효력(potency)을 측정하고, 이어서 분리한 후 추가 1.5시간 동안 Jurkat 세포에 대한 재조합 SIRP 알파-Fc의 인큐베이션을 수행하였다. 결합된 SIRP 알파를 MSD Sulfo-태그 표지된 마우스 항-SIRP 알파 항체로 검출하였다. ECL 신호를 항체 농도의 함수로서 플롯팅하고, GraphPad Prism에서 비선형 회귀 모델을 사용하여 용량 반응 곡선을 적합시켜 EC₅₀ 값을 얻었다. 모든 항체는 CD47 발현 세포에 대한 SIRP 알파 결합의 용량 의존성 억제를 나타내었다. 도 2는 이 검정에서의 항-CD47 mAb의 서브세트의 용량 반응 곡선을 도시한다.

혈구응집 활성: 23개의 mAb를 또한 혈구응집 검정에서 활성에 대해 평가하였다. 간략하게 말하면, 건강한 도너 자원자로부터 소듐 시트레이트로 완충된 Vacutainer 혈액 수집관 (BD Biosciences)에 혈액을 수집하였다. 혈액을 PBS로 3회 세척하고, 2% 적혈구 현탁액을 PBS 중에 제조하였다. 50 μl의 연속 희석된 mAb (2배)를 투명한 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 실온에서 2시간 동안 50 μl의 2% 적혈구 현탁액과 함께 인큐베이션하고, 후속하여 RBC가 웰에서 조밀한 펠릿(pellet)으로 나타나지 않은 경우 혈구응집에 대해 점수를 매겼다. 2배 연속 희석물의 제조 시의 출발 농도는 시험된 대부분의 mAb에 대해 200 ㎍/ml였다. 항체 원액 농도(stock concentration)가 덜 농축된 경우 (C47B118 및 C47B119), 항체에 대해 제조된 출발 농도는 85 ㎍/ml였다. 대부분의 시험된 mAb는 혈구응집을 유도하였지만 (대표적인 결과는 도 3 및 도 4에 도시됨), 혈구응집과 이러한 mAb의 임의의 다른 특성의 관련성은 발견되지 않았다.

이러한 검정에서의 23개의 mAb의 특징을 표 5에 요약하였다. 이 중에서, C47B116 및 C47B91이 추가 최적화를 위해 선택되었는데, 이는 이들이 혈구응집을 유도하지 않았으며 강력한 SIRP 알파 차단 활성뿐만 아니라 인간 CD47와 사이노 CD47 둘 모두에 대한 양호한 친화성을 나타내었기 때문이다.

[표 5]

실시예 4: C47B116의 인간 프레임워크 적응

C47B116 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 30)의 초기 분석은 가장 가까운 마우스 생식세포계열 유전자가 HV에 대해서는 IGHV1S29*02이고, HJ에 대해서는 IGHJ4*01임을 암시한다. C47B116 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 54)의 초기 분석은 가장 가까운 마우스 생식세포계열 유전자가 IGKV117*01 및 IGKJ2*01임을 암시한다. 인간에서 면역원성을 감소시키기 위한 C47B116의 인간 프레임워크 적응(human framework adaption) (HFA)을 위하여, 4개의 인간 VH (IGHV1-3, IGHV1-46, IGHV1-69 및 IGHV5-51) 및 3개의 인간 VL (IGKV2-28, IGKV3-1 및 IGKV4-1) 변이체 사슬을, 서열 상동성 분석 및 사내 드 노보 라이브러리를 사용한 장래의 친화성 성숙에 대한 고려에 기반하여, CDR은 무손상 상태로 유지하면서 C47B116 VL 및 VH 서열의 마우스 프레임워크를 인간 프레임워크로 대체하도록 설계하였다. 각각의 VH (서열 번호 4, 5, 31 및 32) 및 VL (서열 번호 7, 33 및 34) 사슬에 대한 작제물을 유전자 어셈블리(gene assembly)에 의해 생성하고, 인간 IgG2sigma 발현을 위한 벡터에 클로닝하였다. VH 및 VL 변이체의 조합물을 HEK 293Expi 발현 시스템에 공동 형질감염시키고, 생성된 12개의 HFA 변이체를 단백질-A 크로마토그래피에 의해 배양 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 C47B116 HFA 변이체를 이전에 기술된 바와 같이 SIRP 알파 차단, 인간 및 사이노 CD47에 대한 결합 친화성, 및 혈구응집에 대해 다시 특성규명하였다. 혈구응집 검정의 경우, 2배 연속 희석물의 제조 시의 출발 농도는 시험된 대부분의 mAb에 대해 200 ㎍/ml였다. 항체 원액 농도가 덜 농축된 경우, 연속 희석을 위한 출발 농도는 125 ㎍/ml (C47B160), 170 ㎍/ml487B156) 및195 ㎍/ml (C47B159)로 제조되었다. 모든 변이체는 강력한 SIRP 알파 차단 활성을 나타내었다 (도 5). C47B148, C47B151, C47B152, C47B156 및 C47B160은 혈구응집을 유도하였으며, 이는 프레임워크가 이러한 활성에 기여할 수 있음을 암시한다. 속도론적 결합 연구를 위해 조사된 선택된 C47B116 HFA 변이체는 인간 CD47 및 사이노 CD47에 대해 유사한 친화성을 나타내었다. 일부 HFA 변이체 (C47B155, C47B157, C47B159 및 C47B161)는 CD47에 대해 양호한 결합 친화성 (모체 mAb C47B116의 5배 이내)을 유지한 반면, 다른 것 (C47B147, C47B149, C47B151 및 C47B153)은 친화성의 더 유의한 손실 (C47B116과 비교하여 6배 초과의 감소)을 나타내었다. 데이터는 표 6에 요약되어 있다. C47B157 및 C47B161이 추가 특성규명을 위해 선택되었는데, 이는 이들이 강력한 SIRP 알파 차단 활성, 인간 및 사이노 CD47 둘 모두에 대한 양호한 결합 친화성을 유지하였지만 혈구응집 활성 또는 생물물리학적 특성 문제를 나타내지 않았기 때문이었다.

[표 6]

실시예 5: C47B91의 친화성 성숙

C47B91의 중쇄 (서열 번호 35)는 5-51 생식세포계열로부터 유래하고, 경쇄 (서열 번호 36)는 L6 생식세포계열로부터 유래한다. C47B91의 친화성 성숙을 위해 2개의 Fab 라이브러리를 설계하였다. Fab 라이브러리 중 하나는 중쇄 라이브러리 (C47F8L1)로, 드 노보 V5.0으로부터의 다양성을 C47B91의 VH 내의 CDR1 및 CDR2에 부가하고 (표 7); 다른 Fab 라이브러리는 경쇄 라이브러리 (C47F18L1)로, C47B91의 VL 생식세포계열 (L6)을 기반으로 드 노보 5.0으로부터의 VL 다양성을 부가한다 (표 8). Fab 라이브러리는, 클로닝 목적으로 제한 효소 부위에 미미한 변형을 가하면서, 미국 특허 제6,472,147호 및 국제특허 공개 WO09/085462호에 기술된 바와 같은 pIX 파지 디스플레이 시스템에서 구축되었다.

[표 7]

[표 8]

파지 외피 단백질 IX 상에 디스플레이된 친화성 성숙 Fab 라이브러리를, 전장(full length) 인간 CD47을 발현하는 CHO-S 포유류 세포에 대해 패닝하였다. 파지 라이브러리를 1×10⁸개의 CHO-S 모체 세포와 함께 10% FBS/DMEM 중에서 4℃에서 하룻밤 인큐베이션함으로써 이들 세포로 사전 소제(pre-clearing)하였다. 사전 소제된 라이브러리를 원심분리를 통해 회수하여 CHO-S 모체 세포를 제거하고, PEG/NaCl 침전에 의해 농축시켰다. 약 1 × 10⁷개의 CHO-S CD47 발현 세포를 각 패닝 라운드에 사용하였고, 패닝은 4℃에서 약 2시간 수행되었다. 파지와 결합하는 세포를 PBS 중의 40% Ficoll/2% BSA로 1회 그리고 빙랭(ice-cold) PBS/0.2% FBS로 3회 세척하였다. 라운드 1과 라운드 2는 CHO-S CD47 고발현 클론을 사용한 반면, 라운드 3은 CHO-S CD47 고발현 클론 또는 저발현 클론 중 어느 하나를 사용하여 더 조밀한 결합물(binder)을 부화(enriching)시켰다. 또한, 동일한 라이브러리를 사용하여 비오티닐화 CD47 인간 CD47 ECD 단량체로 패닝하였다. 패닝을 25℃에서 1시간 동안 수행하였고, 항원 농도는 라운드 1의 경우 1 nM, 라운드 2의 경우 0.1 nM 그리고 라운드 3의 경우 0.1 nM 또는 0.01 nM이었다. 스트렙타비딘-비드를 첨가하여 비드/항원/파지 복합체를 형성하여 결합물을 회수하였고, 이를 TBST 중에서 세척하였다. 대안적으로, 더 느린 오프 속도로 결합물을 부화시키기 위해 하룻밤 세척을 사용하였다.

패닝 후 부화된 파지 플라스미드 DNA로부터 Fa 생성을 유도하였다. 분비된 Fab를 함유하는 상청액을 직접 사용하여, 이전에 기술된 바와 같이 Jurkat 세포 상의 인간 CD47에 대한 재조합 인간 SIRP 알파 결합의 억제에 대해 시험하고 ELISA에 의해 인간 CD47 ECD 단량체 및 이량체에 대한 이의 결합을 검사하였다. 또한, Fab 클론을 서열분석하여 이의 VH 및 VL 동일성에 대해 검사하였다. 독특한 서열, ECD 단백질에 대한 결합 활성 및 SIRP 알파 차단 활성에 기반하여 Fab 히트를 선택하였다.

선택된 Fab로부터의 V_H 를, PCR을 사용하여 관심 Fab를 발현하는 대장균 클론으로부터 프레임워크 특이적 프라이머로 증폭시켰다. 증폭된 단편을, 포유류 발현을 위한 신호 펩티드 및 인간 IgG2 Sigma 중쇄 불변 영역을 함유하는 포유류 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 유사하게, V_L 단편을 증폭시키고, 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 포유류 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 서브클로닝은 다음의 프라이머를 사용하여 주입 클로닝 (Clontech)에 의해 수행하였다: HuG1_DNVH_F551, HuG1_DNVH_R, HuK_DNVL_FA27L6muSP 및 HuK_DNVL_R (서열은 표 3에 열거되어 있음). 새로 생성된 V_H 및 V_L 포유류 발현 DNA 작제물이 함께 쌍을 이루게 하여 추가 특성규명을 위해 mAb를 생성시켰다.

총 32개의 C47B91 친화성 성숙 mAb를, 10개의 친화성 성숙 VH쇄 (서열 번호 6 및 서열 번호 37 내지 45)의 모체 VL쇄와의 쌍 이룸, 4개의 친화성 성숙 VL쇄 (서열 번호 8 및 서열 번호 46 내지 48)의 모체 VH쇄와의 쌍 이룸 또는 최상의 사슬 교차로부터의 쌍 이룸을 통해 생성시켰다. 이들을 HEK 293 Expi 세포에서 발현시켰고, 단백질-A 크로마토그래피를 통해 정제하였고, SIRP 알파 차단 활성, 인간 및 사이노 CD47에 대한 결합 친화성 및 혈구응집 활성에 대해 특성규명하였다. 생화학적 검정을 수행하여 CD47에 대한 SIRP 알파 결합을 차단하는 변이체의 능력을 조사하였다. 이 경우, His 태깅된 CD47-ECD 이량체 단백질을 mAb와 함께 사전 인큐베이션한 후, MSD 표준 플레이트 상에 포획된 SIRP 알파-Fc에 첨가하고, 이어서 CD47의 결합량을, MSD Sulfo 태그 표지된 항-양 항체 (Meso Scale Discovery)와 조합된 양 다클론성 항-CD47 항체 (R&D systems)에 의해 검출하였다. 항체의 SIRP 알파 차단 활성을, Ab가 없는 경우 (최대 결합) 및 CD47이 없는 경우 (백그라운드)의 신호에 대한 억제 백분율에 대해 정규화하였다. 10 ㎍/ml에서의 이러한 mAb의 억제 활성을 표 9에 나타내었고, 32개의 mAb 중 25개가 10 ㎍/ml에서의 모체 C47B91보다 큰 SIRP 알파 결합의 억제를 나타내었다. 인간 및 사이노 CD47에 대한 결합 친화성은 이전에 기술된 바와 같이 ProteOn에 의해 측정하였다. 대부분의 변이체는 모체 C47B91 mAb에 비해 친화성 개선을 나타내었고, C47B222, C47B223, C27B226 및 C47B227이 최대를 나타내었는데, 친화성이 C47B91과 비교하여 5배 내지 7배 친밀하였다. 중요한 것은, 이러한 변이체 중 일부의 경우 오프 속도가 유의하게 개선되었다는 것이다. 변이체 중 일부는 혈구응집을 유도하였는데, 이는 CDR 서열의 변화가 또한 혈구응집 활성에 기여할 수 있음을 암시한다. SIRP 알파 차단, 인간 및 사이노 CD47에 대한 결합 친화성 및 혈구응집에 대한 데이터는 표 8에 요약되어 있다.

[표 9]

실시예 6: X-선 결정학에 의한 에피토프 및 파라토프 확인

항체 C47B161, C47B167, C47B222, C47B227 및 B6H12.2의 상세한 에피토프 및 파라토프를 이의 상응하는 Fab와 CD47 ECD -C15G 돌연변이체 [(서열 번호 49), 이하 간단히 CD47이라 함]의 공결정화(co-crystallization) 및 X-선 결정학에 의한 구조 결정에 의해 결정하였다. C47B167은, 실시예 4에서 C47B116에 대해 기술된 것과 유사한 접근법을 사용하여 에피토프 빈 3의 C47B131의 인간 프레임워크 적응으로부터 유래되었다. 이것은 SIRP 알파 결합을 차단하고 (EC₅₀ = 0.79 ㎍/ml), 중간 정도의 친화성 (kD = 5.2 nM)으로 인간 CD47에 결합하고, 혈구응집을 유도하지 않는다.

His 태깅된 C47B161, C47B167, C47B222, C47B227 Fab를 HEK293 세포에서 발현시키고, 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. His 태깅된 CD47을 탈글리코실화하고, 친화성 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. Fab를 과량의 CD47과 1.2:1.0 내지 1.5:1.0 범위의 몰비로 혼합함으로써 복합체 CD47:Fab를 제조하였다. 복합체를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하고, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 복합체화되지 않은 종으로부터 분리하고, 20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 5% 글리세롤 중에 7.5 내지 20 mg/mL로 농축시켰다. 이어서, 농축된 복합체를 사용하여 20℃에서 시팅 드롭법(sitting drop method)을 사용하는 결정화 시험을 셋업(set up)하였고, 단백질 대 저장기(reservoir) 비를 변화시킴으로써 결정을 최적화시켰다. 각각의 Fab-CD47 복합체에 대한 최적화된 결정화 조건은 표 10에 열거되어 있다.

[표 10]

X-선 데이터 수집을 위하여, 20% 글리세롤이 보충된 결정화 용액을 함유하는 동결보호 용액에 하나의 결정을 수초 동안 침지시키고, 100 K에서 질소 스트림으로 급속 동결시켰다. 0.25°-이미지마다 2분 노출과 함께 240° 결정 회전에 걸쳐 아르곤 국립연구소(Argonne National Laboratory)에 있는 APS(Advanced Photon Source)의 빔라인 17-ID의 Dectris Pilatus 6M 픽셀 어레이(Pixel Array) 검출기에서 회절 데이터를 수집하고, 프로그램 HKL2000으로 처리하였다. X-선 데이터 통계가 표 11 및 표 12에 주어져 있다.

[표 11]

[표 12]

전체 구조

CD47 분자에 대한 구조 모델은 IgV 도메인에 상응하는 1 내지 적어도 114의 잔기 및 위치 5, 16, 32, 55 및 93의 글리칸을 포함하며, 단, C47B161 Fab 복합체에서 CD47은 가시적인 글리칸을 갖지 않는다. CD47 C-말단 6xHis (서열 번호 55)는 무질서하다. Fab 구조 모델은 경쇄에 대해 1 내지 적어도 211의 잔기 그리고 중쇄에 대해 1 내지 적어도 217의 잔기를 함유한다. Fab C-말단 6xHis 태그 (서열 번호 55) 및 사슬간 이황화물 결합은 무질서하다. C47B222/C47B227 중쇄의 경우, 또한 잔기 135-140이 무질서하다. 항체/항원 결합 부위는 모든 5개의 복합체에서 전자 밀도에 의해 명확하며, 이는 결합 잔기의 신뢰성 있는 위치선정을 가능하게 한다. Fab는 모든 도면에서 순차적으로 번호가 표기되어 있고, CD47 번호표기는 성숙한 단백질의 N-말단에서 시작한다.

Fab 복합체 내의 CD47 분자들은 이들 자체 간에 그리고 SIRP 알파에 결합된 CD47과 (문헌[Hatherley, 2008]) 0.45 내지 0.98Å의 RMSD로 겹쳐졌는데, 이는 다양한 복합체에서 CD47의 고도의 구조적 유사성 및 Fab 또는 수용체 결합에 의해 유도되는 큰 입체형태적 변화의 부재를 나타낸다.

에피토프, 파라토프 및 항체/항원 상호작용

C47B161, C47B167 및 C47B222/ C47B227/B6H12.2는 항체 경쟁 비닝 검정에 의해 밝혀진 바와 같이 3개의 별개의 에피토프 빈에 결합한다. C47B222와 C47B227은 동일한 전체 위치에 결합하는 반면, C47B167은 세포막에 더 가깝게 결합하고, C47B161과 B6H12.2는 CD47의 더 정점인 영역에 결합한다. 막에 더 가까운 에피토프에 결합한다는 것은, 항체의 제2 Fab 아암에 전파하고 이 아암이 다른 CD47 분자에 결합하는 것을 더 어렵게 할 수 있다는, Fab에 대한 추가의 제약을 야기할 수 있다. 본 발명자들은 에피토프 위치로 인한 제2 Fab 아암에 대한 제약이 CD47/항체/CD47 교차결합으로부터의 더 적은 세포 응집으로 전환될 수 있다고 추측한다. C47B222 Fab의 경우, HC는 LC보다 CD47과 더 광범위한 접촉을 가지며, 이것은 막에 더 가까운 사슬이다.

에피토프 및 파라토프 서열은 도 6에 도시되어 있다. CD47과 각각의 Fab 사이에 이루어지는 상호작용의 세부 사항은 아래에서 상세히 논의된다.

CD47/C47B161 복합체

C47B161은 도 7에 도시된 바와 같이 CD47 N-말단 (Q1 및 L3), BC (N27 및 E29)와 FG (잔기 101-103) 루프 영역 및 F (잔기 E97)와 G (E104) β-가닥의 잔기들로 이루어진 입체형태 에피토프를 인식한다. M259는 에피토프 빈 2 영역에 결합하여 CD47 상의 약 690 Ų의 면적을 커버한다.

파라토프는 CDR-L3를 제외한 5개의 CDR로부터의 잔기들로 이루어진다. LC는 대부분 CD47 β-시트 상에 위치하는 반면, HC는 항원의 정점 루프 영역을 커버한다. 평가받은 다른 항-CD47 Fab와 비교하여, C47B161은 위치 30에 6개의 잔기의 삽입을 갖는 긴 CDR-L1을 갖는다. CDR-L1 루프의 첨단 부근의 Y35 및 Y37 잔기는 CD47의 β-시트와 H 결합함으로써 항체의 이의 항원에 대한 친화성을 향상시킨다 (도 7c). L1 루프 첨단에 있는 다른 잔기 (H31 및 N33 잔기)는 CD47과의 직접 접촉에 관여하지 않지만, CD47과의 효과적인 상호작용을 위해 Y35 및 특히 Y37을 배향시키는 데 중요한 역할을 한다. VH 측 상에서는, 모든 CDR이 항원과의 상호작용, 특히 피로글루타메이트로 고리화되는 N-말단 Q1 잔기, 및 27-29 및 102-103 루프 절편과의 상호작용에 관여한다 (도 7b 및 도 7d).

CD47/C47B167 복합체

C47B167은 도 8에 도시된 바와 같이 C (Y37 및 K39), C' (R45, D46 및 T49)와 C'' (N55-T58) β-가닥 및 C'C'' (A53, L54)와 C"E (V59-T61, S64, A66, K67) 루프 영역의 잔기들로 이루어진 입체형태 에피토프를 인식한다. C47B167은 에피토프 빈 3 영역에 결합하여 CD47 상의 약 930 Ų의 면적을 커버한다.

C47B167 파라토프는 모든 6개의 CDR로부터의 잔기들로 이루어져 있다. C와 C' β-가닥 (Y37, K39, R45, D46 및 T49)은 LC CDR과만 상호작용하는 반면, 루프 영역 64-67은 긴 CDR-H3 (9개 잔기 삽입)에 의해서만 접촉된다.

C47B167은 에피토프 영역 V59-T61에서의 서열 발산(sequence divergence)으로 인해 사이노 원숭이 CD47에 대해 감소된 교차반응성을 가진다 (도 8a의 서열 정렬 스트레치(stretch) 참조). T61A 인간에서 사이노CD47로의 변화는 사이노에서 잔기 61과 LC 잔기 D49 및 R52 사이의 H 결합을 없앤다 (도 8c). 또한, 사이노 CD47의 위치 62에 있는 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위 (인간의 경우에는 없음)는 V59-T61 영역에 결합하는 항체에 대한 입체 장애를 생성시킬 수 있다. V59A 변화는 미미한 영향을 미칠 것이다 (도 8d).

에피토프 빈 2와 3 사이에 공통 잔기는 존재하지 않는다. C47B161 (빈 2) 및 C47B167 (빈 3)은 도 9에 도시된 바와 같이 임의의 충돌 영역 없이 CD47에 동시에 결합할 수 있다. 이러한 결과는 또한 항체 경쟁 비닝 검정을 사용하여 입증되었다 (실시예 3 참조). C47B167은 C47B161보다 더 큰 면적의 CD47 β-시트를 인식하며, 세포막에 훨씬 더 가깝게 결합한다.

CD47/C47B222 및 CD47/C47B227 복합체

C47B222는 도 10에 도시된 바와 같이 C (Y37 및 K39), C' (D46, T49, D51), C'' (K56, T58)와 F (T99) β-가닥, 및 BC (E35), C'C'' (A53 및 L54), C''E (V59)와 FG (L101, T102) 루프 영역의 잔기들로 이루어진 입체형태 에피토프를 인식한다. C47B222의 에피토프는 빈 1 영역에 위치하여 약 730 Ų의 CD47 면적을 커버한다. C47B222는 CD47 결합에 대해 C47B161, C47B167, C47B227 및 B6H12.2와 경쟁한다. 다른 에피토프와 중복되는 C47B222 에피토프의 영역은 도 6에 나타나 있다.

C47B222 파라토프는 CDR-L3를 제외한 모든 CDR로부터의 잔기들로 이루어진다. CD47과의 C47B222 상호작용의 대부분은 H 결합과 반데르발스 접촉의 조합을 사용하여 중쇄에 의해 이루어진다 (도 10). HC 및 LC 파라토프에 의해 인식되는 에피토프 영역들 사이에 명확한 구분이 존재한다. 중쇄는 C'C'' 루프 및 F 가닥을 제외한 모든 β-가닥 에피토프 영역과 독점적으로 상호작용한다. 경쇄는 또한 BC 및 FG 루프 및 F 가닥과 독점적으로 결합하여, CD47에 대한 SIRP 알파 결합을 매우 효과적으로 차단하는 역할을 하는 CD7 상의 더 정점인 위치를 점유한다. C'C'' 루프의 류신 54는 결합 부위의 중심 위치에 존재하며, 모든 3개의 중쇄 CDR과 접촉한다 (도 10b). C'' 가닥은 CDR-H2와 수소 결합하고, C와 C' β-가닥은 CDR-H3와 접촉한다.

C47B227 입체형태 에피토프는 또한 빈 1에 위치해 있다. 에피토프는 도 11에 도시된 바와 같이 β-시트의 모든 가닥 (가닥 C: Y37; 가닥 C': T49 및 D51; 가닥 C'': N55, K56 및 T58; 가닥 F: T99; 가닥 G: E104) 및 BC (E35), C'C'' (잔기 범위 53-55) 및 FG (L101, T102) 루프 영역의 절편의 잔기들로 이루어진 약 800 Ų의 CD47 면적을 커버한다.

C47B227 파라토프는 모든 CDR로부터의 잔기들로 이루어져 있다. C47B222와 유사하게, C47B227의 중쇄는 C, C', 및 C'' β-가닥 및 대부분의 C'C'' 루프 영역 ― A53은 예외인데, 이는 C'C'' 루프에 존재하며 CDR-L3와의 반데르발스 접촉을 가짐 - 과 독점적으로 상호작용한다. M263의 경쇄는 F와 G 가닥 및 BC와 FG 루프에 결합한다. C47B222와 C47B227은 유사한 배향으로 CD47에 결합하며, 많은 에피토프 및 파라토프 잔기를 공유한다 (도 6).

C47B222는 C47B227과 97%의 서열 동일성을 가지며, CDR 부근의 영역 또는 CDR에서 6개의 아미노산 변화를 갖는다 (C47B222에서 C47B227로의 HC: T30D 및 LC: N30G, N31S, H49Y, I56T 및 S93Y 변화. 도 6 참조). 그럼에도 불구하고, C47B222 및 C47B227은 동일한 전체 배향으로 CD47에 결합하며, 유사한 친화성 (약 1 nM)으로 대략 동일한 에피토프 영역을 인식한다. 다양한 경쇄에 대한 이러한 에피토프 관용(tolerance)은 CD47의 C47B222 / C47B227 인식의 직접적인 결과이며, 이는 HC 접촉 및 HC 및 LC 파라토프에 의해 인식되는 에피토프 영역들 사이의 분리 (에피토프 구분)에 크게 기반한다. 또한, C47B222와 C47B227 사이의 잔기 변화의 유효 개수는 단지 3개 (N30G, N31S 및 S93Y)인데, 이는 중쇄 T30D 및 경쇄 H49Y 및 I56T 변화가 CD47 인식에 효과를 미치기에는 결합 부위로부터 너무 멀리 떨어져 (6Å 초과) 있기 때문이다. C47B222에서만의 G30의 Asn으로의 대체는 도 11a에 도시된 바와 같이 약간 상이한 위치에 CD47 FG 루프의 수용을 유도하여 L101과 N30 사이의 입체적 충돌을 피한다. N31S 및 S93Y 변화는 T102 주 사슬 및 M263의 E35와 새로운 H 결합을 생성하여, C47B222와 비교하여 C47B227 LC와 CD47의 상호작용을 강화시키며 C47B227의 CDR-H3에 의해 형성된 더 적은 H 결합에 역균형(contra-balancing)을 이루는데, 이는 상이한 입체형태를 채택하고 독특하게 CD47 잔기 Y37, K39, D46 및 D51과 H 결합을 형성한다 (도 10 내지 도 12).

CD47/B6H12.2 복합체

B6H12.2는 에피토프 빈 1 영역에 결합하며, 이것을 대조 항체로 사용하였다. B6H12.2는 도 10에 도시된 바와 같이 C (V36, Y37, K39 및 K41), C' (D46, D51), F (E97, T99) 및 G (E104) β-가닥 및 BC (E29, Q31, N32, T34 및 E35), C'C'' (A53) 및 FG (E100-R103) 루프 영역의 잔기들로 이루어진 입체형태 에피토프를 인식한다. 또한 빈 1에서 클러스터링된 C47B222 및 C47B227과 달리, B6H12.2는 C'' β-가닥 또는 C''D 루프 영역 내의 어떠한 잔기도 인식하지 않는다. 그럼에도 불구하고, B6H12.2는 C47B161, C47B167, C47B222 및 C47B227보다 큰 에피토프 면적을 갖는다 (약 1055 Ų 대, C47B161의 경우 690 Ų, C47B167의 경우 930 Ų, C47B222의 경우 730 Ų, 및 C47B227의 경우 800 Ų).

B6H12.2 파라토프는 모든 CDR로부터의 잔기들로 이루어져 있다 (도 13). 항체 및 항원 인식은 대부분 H 결합에 의해 유도되는 것으로 나타난다. 경쇄는 CD47 측쇄와 6개의 H 결합을 그리고 골격 원자와 3개의 H 결합을 형성한다. 다른 한편, 중쇄는 CD47과 13개의 H 결합에 연계되며, 이 중 대부분은 골격 원자를 포함한다. B6H12.2는, 결합 부위에 깊이 들어가고, FG 루프를 안정화시키고, CDR-H2가 BC 루프의 상단에 퍼지도록 공간을 제공하는 짧은 CDR-H3를 갖는다. 중쇄는 BC (주로 CDR-H2), C'C'' (CDR-H3) 및 대부분의 FG (CDR-H2 및 H3) 루프 영역과 독점적으로 접촉하는 반면, LC는 C' 가닥 및 C 가닥의 인접 C-말단 면적과 독점적으로 접촉한다. 그러나, C47B222 및 C47B227의 경우보다 B6H12.2의 경우 더 적은 에피토프 구분이 존재한다. HC 및 LC 둘 모두와 상호작용하는 F 가닥 및 FG 루프에는 다수의 에피토프 잔기가 존재한다.

에피토프 요약

C47B161과 달리, B6H12.2는 CD47의 N-말단 영역을 인식하지 않는다. C47B167, C47B222 및 C47B227과 달리, B6H12.2는 CD47의 C'' β-가닥 또는 C''D 루프 영역의 어떠한 잔기도 인식하지 않는다 (도 6 참조). 구체적으로, B6H12.2에 대해 확인된 에피토프와 일치하지 않는 각각의 Fab의 에피토프 잔기는 다음과 같다:

C47B161: N-말단 (Q1 및 L3) 및 BC 루프 (N27) 영역의 잔기.

C47B167: β-가닥 C' (R45 및 T49), C'C'' 루프 (L54), β-가닥 C'' (K56, S57 및 T58) 및 C''D 루프 (V59, P60, T61, S64 및 K67) 영역의 잔기.

C47B222: β-가닥 C' (T49), C'C'' 루프 (L54), β-가닥 C'' (K56 및 T58) 및 C''D 루프 (V59) 영역의 잔기.

C47B227: C'C'' 루프 (L54) 및 β-가닥 C'' (K56 및 T58) 영역의 잔기.

실시예 7: CD47 항체의 특성규명

요망되는 특징을 갖는 몇몇 인간 CD47 IgG2sigma 항체를 생체검정에서 추가 평가를 위해 IgG1 Fc 포맷으로 변환시켰다. 이의 IgG1 변이체는 인간 CD47에 결합하고, SIRP 알파 결합을 차단하는 것으로 확인되었다. 혈구응집을 유도하지 않은 IgG1/IgG2sigma Fc 변이체 (C47B222, C47B157 및 C47B161)를, 식세포작용, 아폽토시스, 보체 매개 세포독성 (CDC) 및 혈소판 응집 활성의 향상에 대해 시험관내에서 추가로 평가하였다. 또한, 이러한 3개의 mAb의 항종양 활성을 생체내에서 시험하였다.

식세포작용:

시험관내 식세포작용 검정을 수행하여 C47B157, C47B161 및 C47B222가 인간 대식세포에 의한 CD47 발현 표적 세포의 식세포작용을 향상시키는지를 평가하였다. 간략하게 말하면, CD16 고갈 없이 Stemcell EasySep 인간 단핵구 부화 키트를 사용하여 음성 고갈에 의해 류코팩(leukopak) 정제 PBMC로부터 CD14 양성 단핵구를 단리하였다. 정제된 단핵구를, 10% FBS (Invitrogen) 및 25 ng/ml의 M-CSF (R&D Systems)가 보충된 X-VIVO-10 배지 (Lonza)에 0.1 × 10⁶개의 세포/㎠로 플레이팅하고, 7일 동안 대식세포로 분화시켰다. 분화의 최종 24시간 동안 IFN-γ (R&D Systems)을 50 ng/ml로 첨가하였다. 후속하여, 부착성 대식세포를 Accutase (Sigma) 처리에 의해 조직 배양 접시로부터 탈착시키고, 대식세포 (1×10⁵개)를 다양한 농도의 항-CD47 mAb의 존재 하에 GFP 발현 Jurkat 세포 (1×10⁵개)와 1:1 비로 96-웰 U-바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 완료 시, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 세포를 Accutase로 탈착시켰다 (20분 인큐베이션). 세포를 펠릿화하고, 세척하고, 대식세포를 30분 동안 APC 접합 항-인간 CD11b 항체 (eBiosciences)로 염색한 후 염색 완충액 (BD Biosciences)으로 2회 세척하였다. MacsQuant 유동 세포계측기에서 세포를 획득하였다. 데이터를 FloJo 소프트웨어로 분석하였다. % 식세포작용을 다음 식으로 결정하였다 [((GFP^pos, CD11b^pos 세포)/(GFP^pos, CD11b^pos + GFP^pos 세포))x100%].

이러한 실험은 IgG1 B157, B161, B222 및 B6H12.2가 강력한 식세포작용 향상 능력을 나타낸 반면 IgG2sigma B157, B161, B222 및 B6H12.2 (도 14)는 식세포작용을 최소한으로 향상시켰음을 나타내었다.

아폽토시스:

몇몇 항-CD47 mAb (예를 들어, AD-22, 1F7 및 MABL-1)는 CD47의 리게이션 시 가용성 형태의 표적 세포의 아폽토시스를 매개하는 것으로 기술되었다. CD47의 리게이션 시 C47B157, C47B161 및 C47B222가 아폽토시스를 매개하는지를 시험하기 위해, Jurkat 세포 또는 HL60 세포 (100 μl 중의 1×10⁶개의 세포/ml)를 항체 (0.05, 0.5 및 5 ㎍/ml)의 존재 또는 부재 하에 10% FBS가 보충된 RPMI1640에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 아폽토시스는 FITC 아넥신(Annexin)-V 아폽토시스 검출 키트 (BD Pharmingen)로 검출하였다. 아폽토시스는 초기 아폽토시스 (아넥신-V 양성/PI 음성)과 후기 아폽토시스 (아넥신-V 양성/ PI 음성)의 합으로 표현되었다.

이러한 실험은 대조 mAb B6H12.2가 Jurkat 및 HL60 세포에서 IgG2sigma로서는 강력한 아폽토시스를 유도하였지만, IgG1로서는 그렇지 않음을 밝혀주었다 (도 15 참조). 유사하게, C47B157 및 C47B161은 Jurkat 세포에서 IgG2sigma로서는 낮은 수준의 아폽토시스를 유도하였지만, IgG1로서는 그렇지 않았다. IgG1/IgG2sigma C47B157 및 C47B161은 HL60 세포에서 프로아폽토시스 효과(proapoptotic effect)를 갖지 않았다. IgG1 또는 IgG2sigma C47B222에 의한 Jurkat 및 HL60 세포의 24시간 처리는 아폽토시스 유도를 가져오지 않았다.

보체 매개 세포독성:

C47B157, C47B161 및 C47B222를 보체 매개 세포독성 (CDC)에 대해 시험하였다. CDC 검정은 Wil2-S 표적 세포로 수행하였다. 50,000개의 Wil2-S 세포를, 10% 열 불활성화 FBS와 0.1 mM NEAA가 보충된 25 μl RPMI-1640에서 불투명한 흰색의 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다 (모든 시약은 Invitrogen로부터 입수). 항체가 보충되거나 보충되지 않은 25 μl의 배지의 첨가 시, 세포를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 후속하여, 50 μl의 인간 혈청 (Bioreclamation, 보체 보존됨)을 첨가하고, 세포를 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 최대 용해를 평가하기 위해, 20 μl의 2% Triton-X-100을 대조 웰에 첨가하고, 세포를 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 일단 인큐베이션이 완료되면, 100 μl의 CellTiter-Glo 시약 (Promega; 완충액과 기질의 사전 혼합물)을 각각의 웰에 첨가하고, 내용물을 부드럽게 혼합하여 세포 용해를 유도하고, 발광을 2104 EnVision Multilabel 판독기 (Perkin Elmer)에서 기록하였다. 특이적 용해를 다음 식에 의해 계산하였다: [특이적 용해 = ((실험적 방출-자연 방출)/(최대 방출-자연 방출))*100].

도 16에 도시된 바와 같이, IgG1/IgG2sigma C47B157, C47B161 및 C47B222는 IgG1 또는 IgG2sigma로서는 CDC를 향상시키지 않았다. 대조적으로, 툴(tool) mAb B6H12.2 IgG1은 양성 대조군인 리툭시맙과 유사하게 강력한 CDC를 매개하였으며, 이펙터 기능 침묵 IgG2sigma 골격에서는 CDC를 향상시키지 않았다.

혈소판 응집:

구매가능한 항-CD47 mAb B6H12 (mIgG1)가 혈소판 응집을 유도하였다는 관찰 (문헌[Fujimoto TT, Katsutani S, Shimomura T, Fujimura K. (2003) J Biol Chem 278: 26655-26665])에 기반하여, C47B157, C47B161 및 C47B222의 혈소판 응집 활성을 결정하는 검정을 확립하였다. 간략하게 말하면, 건강한 도너 자원자로부터 소듐 시트레이트로 완충된 Vacutainer 혈액 수집관 (BD Biosciences)에 혈액을 수집하였다. 혈소판 풍부 혈장 (PRP) 및 혈소판 빈약 혈장 (PPP)을 제조사의 프로토콜에 따라 PDQ 혈소판 기능 원심분리기 (Biodata Corporation)로 제조하였다. 혈소판 응집을 제조사에 의해 권고된 바와 같이 PAP-8E 응집측정기 (Biodata Corporation)로 측정하였다. 구체적으로는, 10 μM ADP 또는 100, 140, 150 또는 200 ㎍/ml의 시험 항체 (시험되는 항체의 이용가능성에 따름)의 최종 농도를 위해 25 μl의 ADP (양성 대조군; Biodata Corporation) 또는 항체를 225 μl의 PRP에 첨가하였다. 연속 교반하면서 37℃에서 250 μl 샘플을 통한 광 투과율을 측정하여 응집을 결정하였다. PPP의 투과율은 100%로 설정되었다. 응집을 총 6분 동안 기록하였다.

본 명세서에 기술된 mAb의 혈소판 응집 활성을 평가하기 위해, 독립적인 도너를 사용한 8가지의 검정을 평가하였다: 1.) IgG1/IgG2sigma B6H12.2의 활성을 양성 대조군인 10 μM ADP 및 음성 대조군인 PBS와 비교한 5가지 실험을 수행하였고; 2.) IgG1/IgG2sigma C47B157, C47B161 및 C47B222의 활성을 IgG1 B6H12.2 및 음성 PBS 대조군과 비교한 3 가지 실험을 수행하였다. 혈소판 응집 검정은, C47B157, C47B161 및 C47B222가 100 내지 200 ㎍/ml 범위의 농도로 시험된 경우 3명의 독립적인 도너에 대해 IgG1 또는 IgG2sigma 골격에서 혈소판 응집을 유도하지 않았음을 나타내었다 (200 ㎍/ml에서 실행된 실험에 대한 결과를 도시한 도 17b 내지 17d 참조). IgG1/IgG2sigma C47B157, C47B161 및 C47B222에 대해 관찰된 최대 응집은 PBS 대조군에 대해 관찰된 것 (8명의 독립적인 도너; 최대 응집은 2 내지 11%의 범위임)과 유사하게 0 내지 7%의 범위였다. 대조적으로, 100 및 200 ㎍/ml로 시험된 B6H12.2는 IgG1로서는 양성 대조군인 10 μM ADP (5명의 도너; 응집은 55 내지 120%의 범위임)와 유사하게 40 내지 93%의 범위로 응집을 유도하였지만 (8명의 도너), IgG2sigma로서는 1 내지 6%의 범위로 응집을 유도하지 않았다 (5명의 독립적인 도너).

CD47 항체의 Fc 변이체의 생체내 항종양 효능:

C47B157, C47B161 및 C47B222의 생체내 항종양 활성을 3가지 인간 종양 세포 모델에서 시험하였다. 간략하게 말하면, 처음 두 모델의 경우, 10×10⁶개의 HL-60 또는 5×10⁶개의 MV4-11 세포를 NSG 마우스에 정맥내 이식하였다. 두 모델 모두의 경우, 항체 처리는 종양 세포 이식 후 6일째에 개시하였고, 동물에게 복강내 주사를 통해 0.2 및 10 mg/㎏으로 매주 2회 투여하였다. 총 6회의 용량을 투여하였고 (23일째 최종 투여), 각각의 투여 그룹은 5 마리의 마우스로 이루어졌다. HL-60/NSG 마우스 모델의 경우, 14일째부터 시작하여 (42일째 최종 수집), 마우스로부터 말초 혈액을 매주 수집하고, FACS를 통해 분석하여 종양 세포 증생 및 처리 효과를 평가하였다. MV4-11/NSG 모델의 경우, 34일째에 마우스로부터 말초 혈액을 수집하고, FACS를 통해 분석하여 말초 혈액에서 종양 세포 증생에 대한 처리의 효과를 평가하였다. 세 번재 생체내 모델의 경우, 10×10⁶개의 Kasumi-3 세포를 NSG 마우스에 정맥내 이식하고, 종양 세포 이식 후 6일째에 처리를 개시하였다. 동물에게 총 12회의 용량에 대해 복강내 주사를 통해 0.2 및 10 mg/㎏으로 매주 2회 투여하였다. 최종 용량은 44일째에 투여하였고, 각각의 투여 그룹은 5 마리의 마우스로 이루어졌다. 14일째부터 시작하여, 말초 혈액을 마우스로부터 매주 수집하고, FACS를 통해 분석하여 말초 혈액에서 종양 세포 증생을 평가하였다.

시험된 모든 3 가지 모델에서, C47B157, C47B161, C47B222 및 B6H12.2는 항종양 활성을 나타내었다. HL60 모델에서 시험된 경우 (도 18 참조), 각각의 mAb의 효능은 시험된 용량 및 각각의 mAb의 Fc 이펙터 기능에 좌우되었다. 모든 mAb의 이펙터 기능 컴피턴트(competent) IgG1 및 이펙터 기능 침묵 IgG2 sigma 변형체는 용량 의존성 활성을 나타내었다. IgG1은 10 mg/㎏에서 종양 세포 증생을 강력하게 억제하였고, 0.2 mg/㎏에서 종양 세포 증생을 지연시켰다. IgG2sigma는 10 mg/㎏에서 종양 세포 성장을 지연시킨 반면, 0.2 mg/㎏에서 항종양 효과는 덜 현저하였다. HL60 모델과 유사하게, MV4-11 모델 내에서 시험된 경우 (도 19), mAb는 IgG1으로서는 0.2 및 10 mg/㎏에서 종양 세포 성장을 효과적으로 억제한다. 종양 세포 증생 억제는, mAb가 IgG2 sigma 골격에서 시험된 경우 적었다. 이펙터 기능은 HL60 및 MV4-11 모델에서 효능의 향상을 제공하였지만, IgG1 및 IgG2sigma C47B157, C47B161, C47B222 및 B6H12.2는 0.2 및 10 mg/㎏ 둘 모두로 IgG1 또는 IgG2sigma 골격에서 시험된 경우 강력한 항종양 활성을 나타낸다 (도 20).

실시예 8: 제안된 항체 중화 방식

이전의 실시예에 설명된 바와 같이, 대식세포의 SIRP 알파 수용체에 대한 표적 세포의 CD47의 결합을 차단하고, 결과적으로, 붕괴되지 않았더라면 표적 세포가 대식세포로 보내게 될, "잇-미-낫(eat-me-not)" 신호를 붕괴시킴으로써, 세포 식세포작용을 촉진시킬 가능성이 높을 수 있는 항체를 생성시켰다. 도 21에서 CD47/Fab 구조와 CD47/SIRP 알파 구조의 오버레이는 모든 Fv 도메인과 SIRP 알파 D1 도메인 사이의 충돌 영역을 나타내며, 이는 항체와 SIRP 알파 둘 모두가 동시에 CD47에 결합하는 것을 불가능하게 한다.

서열 목록의 간단한 설명

SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN PHARMACEUTICA NV <120> CD47 ANTIBODIES, METHODS, AND USES <130> PRD3361WOPCT <140> <141> <150> 62/081,134 <151> 2014-11-18 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr 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fascicularis <400> 68 Thr Ala Pro Ala Asn Phe Ser 1 5

Claims (25)

1. 다음의 특성을 포함하는 단리된 항체:
   a. 상기 항체는 CD47에 특이적으로 결합하고;
   b. 상기 항체는 CD47이 신호 조절 단백질 알파 (SIRP 알파)와 상호작용하는 것을 방지하고;
   c. 상기 항체는 유의한 혈소판 응집 활성을 갖지 않음.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 다음의 CD47 (신호 서열을 제외한 서열 번호 21) 아미노산 잔기와 상호작용함으로써 CD47에 특이적으로 결합하는, 항체:
   a. Q1, L3, N27, E29, E97, L101, T102, R103 및 E104;
   b. Y37, K39, R45, D46, T49, A53, L54, N55, K56, S57, T58, V59, P60, T61, S64, A66 및 K67;
   c. E35, K39, Y37, D46, 49, D51, A53, L54, K56, T58, V59, T99, L101 및 T102; 또는
   d. E29, Q31, N32, T34, E35, V36, Y37, K39, N41, D46, D51, A53, E97, T99, E100, L101, T102, R103 및 E104.
3. 인간 또는 사이노(cyno) CD47에 특이적으로 결합하며, 서열 번호 4 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가변 중(VH)쇄 영역을 포함하는, 단리된 항체.
4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 가변 경(VL)쇄 영역을 포함하는, 항체.
5. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 4 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 VH 영역 및 서열 번호 7 및 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 VL 영역을 포함하는, 항체.
6. 제5항에 있어서, 상기 VH쇄 영역은 서열 번호 7을 포함하는 VL쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 4 또는 서열 번호 5를 포함하는, 항체.
7. 제5항에 있어서, 상기 VH쇄 영역은 서열 번호 8을 포함하는 VL쇄 영역과 쌍을 이룬 서열 번호 6을 포함하는, 항체.
8. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 9 또는 서열 번호 10에 제시된 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1) 서열, 서열 번호 11 또는 서열 번호 12에 제시된 VH CDR2 서열, 서열 번호 13 또는 서열 번호 14에 제시된 VH CDR3 서열, 서열 번호 15 또는 서열 번호 16에 제시된 VL CDR1 서열, 서열 번호 17 또는 서열 번호 18에 제시된 VL CDR2 서열 및 서열 번호 19 또는 서열 번호 20에 제시된 VL CDR3 서열을 포함하는, 항체.
9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 9에 제시된 VH CDR1 서열, 서열 번호 11에 제시된 VH CDR2 서열, 서열 번호 13에 제시된 VH CDR3 서열, 서열 번호 15에 제시된 VL CDR1 서열, 서열 번호 17에 제시된 VL CDR2 서열 및 서열 번호 19에 제시된 VL CDR3 서열을 포함하는, 항체.
10. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열 번호 10에 제시된 VH CDR1 서열, 서열 번호 12에 제시된 VH CDR2 서열, 서열 번호 14에 제시된 VH CDR3 서열, 서열 번호 16에 제시된 VL CDR1, 서열 번호 18에 제시된 VL CDR2 서열 및 서열 번호 20에 제시된 VL CDR3 서열을 포함하는, 항체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 VH쇄는 상기 항체의 VL쇄보다 CD47과 더 광범위한 접촉을 갖는, 항체.
12. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 VH쇄에 의해 결합되는 에피토프는 CD47 발현 세포의 막 부근에 위치하고, 상기 항체의 VL쇄는 CD47 상의 SIRP 알파 결합 부위를 폐색시키는, 항체.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 유의한 혈구응집 활성을 갖지 않는, 항체.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 혈소판 응집 활성은 상기 항체의 부재 하에 관찰되는 혈소판 응집의 정도보다 10%를 초과하여 크지 않은, 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라(chimeric), 인간화(humanized) 또는 완전 인간인, 항체.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD47은 인간 CD47 또는 사이노 CD47인, 항체.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD47 발현 세포의 대식세포 매개 식세포작용을 촉진시키는, 항체.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG1 동종형(isotype) 및 IgG2 동종형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IgG 동종형을 포함하는, 항체.
19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체를 암 또는 다른 신생물 질환의 증상의 경감을 필요로 하는 피검자에게 상기 피검자의 암 또는 다른 신생물 질환의 증상을 경감시키기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 다른 신생물 질환의 증상을 경감시키는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 피검자가 인간인, 방법.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 항체가 키메라, 인간화 또는 완전 인간인, 방법.
23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD47이 SIRP 알파와 상호작용하는 것을 방지하는, 방법.
24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG1 동종형 및 IgG2 동종형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IgG 동종형을 포함하는, 방법.
25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법을 적용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

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