KR20170093984A - 단백질 제조 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는 신규한 단백질 제조 방법을 제공하며, 보다 구체적으로, 생성물 관련 불순물 수준을 감소시키는 단백질 제조 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 제조

본 발명은 숙주 세포에서 발현되는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이고, 보다 구체적으로, 본 발명은 생성물 관련 불순물의 수준이 감소된 단백질을 생성하는 단백질 제조 방법에 관한 것이다.

치료제 분야에 있어서, 특히, 단백질과 항체 및 항체 유래의 분자의 용도는 꾸준히 영향력과 중요성을 얻고 있고, 그 결과, 제어된 제조 공정에 대한 요구가 동시에 발생하였다. 치료용 단백질의 상업화는 단백질의 대량 생산을 요구한다. 이를 위해, 단백질을 종종 숙주 세포에서 발현시킨 후 회수 및 정제한 뒤 투여 가능한 형태로 제조하고 있다.

발현시키고자 하는 단백질에 따라, 숙주 세포의 선택은 포유동물 숙주 세포, 종종 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포, 또는 박테리아 숙주 세포일 수 있다. 첫번째 경우, 단백질은 일반적으로 배양 상청액으로 분비되고, 이것을 회수하며, 그 후 이 용액을 단백질 정제를 위해 처리한다.

숙주 세포가 그램 음성 원핵 세포일 경우, 흔히 선호되는 발현 시스템은 새로 합성된 단백질이 주변세포질 공간 내에 축적되고 그로부터 이 단백질을 단리하는 것과 관련되어 있다. 이 경우, 원하는 수준의 단백질 발현이 달성되면, 세포를 회수하고 처리한다. 그 후, 회수된 세포에 대해, 주변세포질로부터 용액으로 단백질을 방출시키고 그 후 세포 잔해물과 기타 불순물을 제거하는 것을 포함하는 단백질 추출 공정을 실시함으로써 그 단백질을 회수한다. 세포 회수부터 단백질 방출까지의 이러한 단계들은 일반적으로 소위 1차 회수에 포함된다. 그 후, 얻어진 단백질 함유 용액을 단백질 정제를 위해 처리한다. 주변세포질 발현을 위해 사용되는 바람직한 그램 음성 원핵 세포는 일반적으로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 또는 슈도모나스 플루오렌센스(Pseudomonas fluorescens) 세포이다.

주변세포질 공간으로부터의 1차 추출 시, 원핵 숙주 세포에서 발현된 이종성 단백질의 회수는 종종 도전과제가 되었다. 이와 관련하여, 선행 기술에 여러 방법들이 개시되었다. 예를 들어, 미국 특허 제5,655,866호는, 항체의 기능성 Fab' 단편의 후속 단리를 용이하게 위해 열 처리를 이용하는 것을 기재한다. WO　2006/054063은 1차 추출 단계에서 열 처리와 함께 비용해성 처리를 포함시키는 것을 기재한다. WO　2005/019466은 발효 후 추출 전에 중단(interruption) 단계를 포함시키는 것을 기재한다. US　2013/0060009는 추출 단계 동안 열 처리 진행 전에 샘플의 pH를 조절하는 것을 기재한다.

그러나, 또 다른 중요한 도전과제는, 후속 정제 단계에 대한 부담을 증가시키는 1차 추출 후에 존재하는 높은 수준의 불순물과 전체 정제 공정의 총합 효율이다. 이러한 불순물은 세포 잔해물, 숙주 세포 단백질(host cell protein; HCP), DNA, 또는 생성물 관련 불순물의 형태, 예컨대 발현된 생성물의 절두된 형태, 응집물 또는 다른 변형된 형태, 예컨대 탈아미드화 형태, 이성체화 형태, 산화 형태 또는 다른 접합된 형태일 수 있다. 이들 중에서, 생성물 관련 불순물이라고도 불리는 재조합 단백질 분해 생성물은, 이들이 표적 단백질과 매우 유사한 물리화학적 특성, 예컨대 융점(Tm)을 갖는다는 점을 고려하면, 종종 열 추출 공정 및 1차 회수 동안에 제거하기가 가장 어렵다.

그 후, 추출 후에 얻은 수득된 단백질 용액을 단백질 정제를 위해 처리한다고 해도, 이 용액의 순도는 총합 효율과 정제 단계에 관련된 비용에 영향을 미치고, 그에 따라 총 치료용 단백질 생산의 총합 효율과 비용에도 영향을 미친다. 이러한 영향은 대규모 단백질 제조 공정을 고려할 때 더욱 더 명백해진다. 특히, 생성물 관련 불순물은 최종 제품 품질 프로파일에 영향을 미치며, 이것의 컨트롤은 서로 다른 뱃치 간의 일관성에 있어서 특히 의미가 있다.

따라서, 당해 기술 분야에, 세포 배양물로부터 단백질을 추출할 때 불순물 제거를 개선하는 방법이 요구되고 있다.

도 1. 추출의 산화환원 전위 및 온도 프로파일. 관찰할 수 있는 바와 같이, 열 처리 단계 동안 질소 오버레이(overlay)를 유지하는 것은, 59℃에서의 온도 유지 동안 최소 약 -435 mV, 일반적으로 -375 mV로 낮은 산화환원 전위 측정값을 내내 유지한다. 질소를 스파징(sparging)하였을 때 유사하게 낮은 산화환원 전위가 관찰되었다. 숙주 세포 함유 버퍼에 질소 대신 공기를 오버레이하였을 때, 산화환원 전위값이 열 단계 추출 동안 현저히 높아져서, 59℃에서의 온도 유지 동안 양의 값(일반적으로 약 +45　mV)이 되었다. 공기를 스파징하였을 때 유사하게 높은 산화환원 전위가 관찰되었다. 높은 발포도가 관찰됨으로 인해 추출을 거치면서 기체 스파징을 오버레이로 부분적으로 전환시켰다.
도 2. 추출 후 샘플의 SDS-PAGE 겔. 레인 M은 분자량 표준 마커(마크 12, Invitrogen)를 나타낸다. 레인 1은 항-TNF 알파 Fab' 참조 표준이다. 레인 2는 DsbC 표준(디설파이드 결합 이소머라제 단백질)이다. 레인 3은 추출 동안에 질소 오버레이가 적용된 추출 후 샘플이다. 레인 4는 추출 동안에 공기 오버레이가 적용된 추출 후 샘플이다. 레인 5는 추출 동안에 질소가 샘플을 통해 스파징된 추출 후 샘플이다. 레인 6은 추출 동안에 공기가 샘플을 통해 스파징된 추출 후 샘플이다. 이 도면은, 질소 존재 하에서의, 열 추출 동안의 환원성 조건이, 공기 존재 하에 수행된 추출에 비해, 생성물 관련 불순물 수준을 현저히 저감하기에 충분하다는 것을 보여준다.
도 3. 단백질 L 정제 후 CEX HPLC에 의해 측정한 모든 생성물 관련 종의 %로서 나타낸 총 Fab' 단편. 생성물 관련 불순물의 제거(clearance)에 대해 질소 오버레이가 갖는 명백한 효과를 관찰할 수 있다. 질소 오버레이가 적용되지 않은 추출 #8은 생성물 관련 불순물 수준이 현저히 더 높았다. 이에 반해, 이 도면은 또한, 추출 1과 2, 7과 8을 비교할 때, 질소 오버레이율이 이 불순물의 제거에 영향을 미칠 수 있다는 것을 제시한다.
도 4. 단백질 L 정제 후 CEX HPLC에 의해 측정한 모든 생성물 관련 종의 %로서 나타낸 총 Fab' 단편. 이 결과 역시, 열 추출 후에 남아있는 생성물 관련 불순물 수준을 현저히 감소시키는 질소 존재의 유용성을 보여준다. 생성물 관련 불순물 수준이 이전 실시예와 비교하여 더 감소되는 것으로 나타나기 때문에, 열 추출 전에 수행된 pH 조절로부터 추가적인 유익한 효과가 얻어진다.
도 5. 종점 산화환원 전위 측정값 대 쉐이크 플라스크 충전 부피. 이들 결과는, 질소 오버레이 존재 하에 제조된 쉐이크 플라스크가, 공기 존재 하에 제조된 플라스크보다 추출물 중에 환원성이 더 큰 환경을 유지하였다는 것을 입증한다. 이 도면은 또한, 더 큰 충전 부피를 갖는 플라스크가 더 작은 충전 부피를 갖는 플라스크보다 환원성이 더 컸다는 것을 보여주고, 이는 아마도 더 작은 표면적 대 부피 비로 인해 추출물 산화 속도가 더 느려진 것에 기인하는 것 같다. 공기 중에서 제조된 플라스크는 모두 양의 종점 산화환원 값을 가졌으며, 충전 부피와 상관관계가 없었다.
도 6. 단백질 L 정제 후 CEX HPLC에 의해 측정한 모든 생성물 관련 종의 %로서 나타낸 총 Fab' 단편. 이들 결과는, 질소 하에 제조된 쉐이크 플라스크가 추출 후 생성물 관련 불순물을 현저히 더 적게 가졌음을 보여준다. 모든 질소 제조 플라스크(종점 산화환원 전위 범위 -10　mV 내지 -116　mV)는, 공기 중에서 제조된 모든 플라스크(종점 산화환원 전위 범위 +79　mV 내지 +97　mV)보다 현저히 더 적은 생성물 관련 불순물 수준을 입증한다.
도 7. 정제된 Fab' 단편의 Tm에 대한 pH 및 환원성 환경의 영향. 이 도면은 2종의 주요 생성물 관련 불순물 종에 대한 열 안정성 측정 결과를 보여준다. 산화환원 전위와 열 안정성(융점)은 서로 관련이 있는 것으로 나타난다: 산화환원 전위가 낮을수록 단백질의 융점이 낮다. 유사한 효과가 pH가 보다 중성이 될 때 pH에 대해서도 설명될 수 있다. 두 변수 모두, 생성물 관련 불순물이 분해에 더 취약하게 만들기 때문에, 이들의 제거를 용이하게 한다.

본 발명은, 숙주 세포에서 단백질을 발현시키는, 신규한 단백질 제조 방법을 제공함으로써 상기에 언급한 요구사항을 해결한다. 특히, 본 발명은 산업적 제조에 적합한 방법을 제공한다.

제1 실시형태에서, 본 발명은, 숙주 세포에서 발현되는 관심있는 단백질의 제조 방법으로서,

- 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,

- 세포 배양액으로부터 상기 숙주 세포를 수집하는 단계,

- 상기 숙주 세포에 버퍼를 첨가하는 단계, 및

- 버퍼 중의 상기 숙주 세포에 대해 열 처리를 실시하는 단계로서, 버퍼의 산화환원 전위를 열 처리 동안 -0 mV 미만으로 유지하는 것인 단계

를 포함하는 제조 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예컨대 그램 음성 박테리아이다. 또 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 이 콜라이(E. coli) 세포 또는 피 플루오레센스(P. fluorescens) 세포이다. 단백질 발현을 위한 원핵 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있다(Terpe, K. (2006). Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol 72, 211-222.). 본 발명에 따른 숙주 세포는 항체 단편과 같은 관심있는 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 재조합 세포를 포함한다. 재조합 이 콜라이 숙주 세포는 MC4100, TG1, TG2, DHB4, DH5α, DH1, BL21, K12, XL1Blue 및 JM109를 비롯한 임의의 적절한 이 콜라이 균주로부터 유래될 수 있다. 일례는 재조합 단백질 발효를 위해 통상적으로 사용되는 숙주 균주인 이 콜라이 균주 W3110(ATCC 27,325)이다. WO 2011/086138, WO 2011/086139, WO 2011/086136 및 WO 2013/007388에 개시된 것과 같은, 변형된 이 콜라이 균주, 예를 들어 대사 돌연변이체 또는 프로테아제 결손 이 콜라이 균주를 배양함으로써 항체 단편을 또한 제조할 수 있으며, 상기 문헌들은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.

본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 관심있는 단백질을 통상적으로 이 콜라이 숙주 세포의 주변세포질로부터 단리한다. 이 구획에 단백질을 표적화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Makrides, S.C. (1996). Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev 60, 512-538.). 이 콜라이의 주변세포질로 단백질을 안내하는 적절힌 신호 서열의 예로는 이 콜라이 PhoA, OmpA, OmpT, LamB 및 OmpF 신호 서열을 들 수 있다.

이 콜라이 숙주 세포에서의 재조합 단백질의 발현은 또한 유도성 시스템의 제어 하에 있을 수 있으며, 이로써 이 콜라이에서의 재조합 항체의 발현은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 이 콜라이에 사용하기에 적합한 다수의 유도성 프로모터가 당업계에 잘 알려져 있으며, 프로모터에 따라, 증식 배지 중의 특정 물질의 농도 또는 온도 등의 요인을 변경시킴으로써 재조합 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 유도성 프로모터의 예로는 락토스 또는 비가수분해성 락토스 유사체인 이소프로필-b-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의해 유도될 수 있는 이 콜라이 lac, tac, 및 trc 프로모터 및 각각 포스페이트, 트립토판 및 L-아라비노스에 의해 유도되는 phoA, trp 및 araBAD 프로모터를 들 수 있다. 발현은, 예를 들어, 유도물질의 첨가에 의해, 또는 유도가 온도 의존적인 경우 온도 변화에 의해 유도할 수 있다. 재조합 단백질 발현의 유도가 배양물에 유도물질을 첨가하는 것에 의해 이루어지는 경우, 발효 시스템 및 유도물질에 따라 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들어, 단독 샷 첨가 또는 다중 샷 첨가에 의해 또는 유도물질을 공급물을 통해 점차적으로 첨가하는 것에 의해 첨가할 수 있다. 유도물질의 첨가와 실제 단백질 발현 유도 사이에 지연이 있을 수 있음이 이해될 것이며, 예를 들어, 유도물질이 락토스인 경우, 락토스에 앞서 임의의 기존의 탄소원이 이용되는 동안 단백질 발현의 유도가 일어나기 전에 지연이 있을 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 방법에 따라 정제할 수 있는 관심있는 단백질을 피 플루오레센스의 주변세포질로부터 단리한다. 피 플루오레센스 내의 주변세포질 구획으로 단백질을 안내하는 적절한 서열은 당업계에 공지되어 있는 sec 타입 분비 리더를 포함한다(D.M. Retallack, et al. Transport of heterologous proteins to the periplasmic space of Pseudomonas fluorescens using variety of native signal sequences Biotechnol. Lett., 29 (2007), pp. 1483-1491). 관심있는 단백질의 발현은 유도성 시스템의 제어 하에 있을 수 있으며, 이로써 발현이 이전 단락에서 기재한 것과 같은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. IPTG와 같은 잘 알려져 있는 유도물질이 이와 관련하여 사용될 수 있으며, 대안적으로, Pben509 및 Pben278 프로모터를 각각 유도하는 안트라닐레이트의 벤조에이트와 같은 유도물질이 피 플루오레센스 발현 시스템과 관련하여 알려져 있다

원핵 숙주 세포 배양물(발효물)은 숙주 세포의 증식과 재조합 단백질 발현을 지지하는 임의의 배지 중에서 배양할 수 있다. 배지는, 예를 들어 문헌[Durany O, et al. (2004)]에 이 콜라이에 대해 기재된 것과 같은 임의의 화학적 규정 배지일 수 있다. 에스케리키아 콜라이에서의 재조합 푸쿨로스-1-포스페이트 알돌라제의 발현에 대한 연구는 문헌[Process Biochem 39, 1677-1684]을 참조할 수 있다.

원핵 숙주 세포의 발효는, 임의의 적절한 시스템에서, 요구되는 단백질 및 수율에 따라, 예를 들어, 연속식, 회분식 또는 반회분식 모드로 수행할 수 있다. 회분식 모드는 요구되는 경우 영양물질 또는 유도물질의 샷 첨가와 함께 이용할 수 있다. 대안적으로, 반회분식 배양이 이용될 수 있고, 발효가 완료될 때까지 성장률을 제어하기 위해 이용되는 하나 이상의 영양물질 공급 레짐과 발효기 내에 초기에 존재하는 영양물질을 이용하여 유지할 수 있는 최대 비성장률에서 유도 전 회분식으로 배양물을 배양한다. 반회분식 모드는 또한 원핵 숙주 세포의 대사를 제어하고 더 높은 세포 밀도에 도달할 수 있도록 유도 전에 이용될 수 있다.

그 후, 발효 배지로부터 숙주 세포를 수집하며, 예를 들어, 원심분리, 여과 또는 농축에 의해 샘플로부터 숙주 세포를 수집한다.

본 발명에 따른 방법의 일 실시형태에서, 세포 수집 단계는 원심분리 및 세포 회수 단계를 포함한다. 본 발명의 특정한 바람직한 실시형태에서, 상기 원심분리 단계는 연속식 원심분리이며, 이로부터 세포 슬러리가 회수된다.

항체 단편과 같은 관심있는 단백질이 숙주 세포의 주변세포질 공간에서 발견되는 원핵생물(예를 들어, 이 콜라이) 숙주 세포 배양 공정의 경우, 숙주 세포로부터 단백질을 방출시키는 것이 필요하다. 이 방출은, 기계적 또는 압력 처리, 동결 해동 처리, 삼투압 충격, 추출제 및/또는 열 처리에 의한 세포 용해와 같은 임의의 적절한 방법 또는 그 조합에 의해 수행할 수 있다. 단백질 방출을 위한 그러한 추출 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 단백질 추출은 열 처리 단계에 의해, 즉, 정해진 시간 동안 세포를 상승된 온도에서 유지하는 것에 의해 수행한다.

본 발명의 방법에 따르면, 열 처리 단계 전에 세포 배양액으로부터 수집한 세포에 버퍼를 첨가한다. 본 발명의 방법의 특정 실시형태에서, 상기 버퍼는 100　mM Tris 및 10　mM EDTA, pH　7.4이고, 추가 실시형태에서, 상기 추출 버퍼는 75 mM Tris 및 7.5 mM EDTA, pH　7.4, 200 mM Tris 및 20 mM EDTA, pH　7.4, 또는 300 mM Tris 및 30 mM EDTA, pH　7.4이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 버퍼는, 본원에서 그 전체를 참고로 포함하는 WO 2012/013930에 기재된 바와 같이, 열 처리 단계 전에, 샘플의 pH가 pH 6∼9, 예를 들어 pH 6∼8이 되도록 하는 pH를 갖는다. 바람직하게는, 상기 pH는 6.5∼8, pH 6.8∼7.8, 또는 pH 7∼7.6이다.

당업자라면 단백질 추출에 이용되는 당업계에 공지된 추가적인 적절한 버퍼를 알 것이다.

추가의 대안적 실시형태에서, 상기 버퍼의 산화환원 전위는 -100　mV 미만, -200　mV 미만, -300　mV 미만 또는 -400　mV 미만으로 유지된다.

환경의 산화환원 전위는 단백질 분자 내에 존재하는 시스테인 잔기 상의 티올기 간의 디설파이드 결합의 동역학적 특성에 특히 중요하다. 환원될 경우, 상기 디설파이드 결합은 파괴되어 해당 티올기(-SH)를 유리시킨다. 항체 분자는 몇 개의 디설파이드 결합을 가지며, 이 결합은 그 구조를 유지하고, 그에 따라 그 생물학적 활성을 유지하는 데 있어서 중요하다. 이러한 디설파이드 결합의 일부는, 분자 내의 그 위치를 고려할 때, 환경 내에 존재하는 환원성 및/또는 산화성 종에 대해 다른 것보다 더 잘 접근할 수 있으며, 그 결과 파괴에 더 취약하다.

본 발명에 있어서, 생성물 관련 불순물은 실제로 관심있는 단백질의 단편이며, 따라서 구조가 더 작고 단순하다. 이론에 의해 구속되기를 원하는 것은 아니지만, 상기 생성물 관련 불순물 내의 시스테인 결합은 환경의 산화환원 전위의 결과로서 더 접근이 용이하므로 파괴에 더 취약하다.

본 발명의 방법의 제2 실시형태에서, 상기 열 처리는 컨테이너 내에서 수행되고, 상기 산화환원 전위는, 열 처리 동안 컨테이너 내의 기체상 중에 존재하는 산소(O₂)의 양을 줄임으로써 유지한다.

일반적으로, 컨테이너 내에는, 버퍼와 숙주 세포로 이루어지는 샘플 위에 다량의 공기(본원에서 기체상이라 칭함)가 존재한다. 본 발명의 취지에 있어서, 기체상 중의 산소의 양을 줄이는 것은 상기 기체상이 공기보다 적은 산소를 함유하도록 상기 기체상의 조성을 변경하는 것을 의미한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 공기는 전형적으로 약 21%의 산소(부피)를 포함한다.

당업자라면, 본 발명의 방법에 따라 산화환원 전위를 0 mV 미만으로 유지하기 위해서, 추출 샘플의 산화를 방지하기 위해 이용 가능한 여러 가지 수단이 존재한다는 것을 알 것이다. 이것은 컨테이너 내의 기체상 중에 존재하는 산소 및 다른 산화성 기체를 제거함으로써, 일반적으로 다른 비활성 기체로 치환함으로써 수행할 수 있다. 상기 치환은 질소(N₂) 오버레이를 이용하여, 즉, 컨테이너 내의 샘플과 N₂ 함유 기체상과의 접촉을 유지함으로써, 또는 비활성 기체를 샘플을 통해 컨테이너로 스파징함으로써, 즉 버블링 또는 패싱함으로써 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 산화환원 전위를 유지하는 데 이용될 수 있는 다른 비활성 기체는 아르곤 및 헬륨을 포함한다.

대안적으로, 당업계에서 이용 가능한 다양한 강도를 갖는 환원제를 선택할 수 있다. 따라서, 당업자는 원하는 산화환원 전위와 유지하고자 하는 시간의 길이에 따라 가장 적절한 환원제를 선택할 것이다. 당업계에 공지된 환원제로는 글루타티온, 머캅토에탄올, 디티오트레이톨 또는 트리스(2-카복시에틸)포스핀을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

원핵 숙주 세포의 배양은, 요구되는 생산 규모에 따라, 쉐이크 플라스크 또는 발효기와 같은 임의의 적절한 컨테이너에서 수행될 수 있다. 1,000 리터 초과 내지 약 100,000 리터의 용량을 갖는 다양한 대규모 발효기가 이용 가능하다. 바람직하게는, 1,000 내지 50,000 리터의 발효기가 사용되며, 더 바람직하게는 1,000 내지 25,000 리터 또는 1,000 내지 20,000 리터, 1,000 내지 15,000 리터, 1,000 내지 10,000 리터, 1,000 내지 5,000 리터, 20,000 리터, 15,000 리터, 12,000 리터, 10,000 리터, 5000 리터 또는 2000 리터의 발효기가 사용된다. 0.5 내지 1,000 리터의 용량을 갖는 더 작은 규모의 발효기도 사용될 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 상기 기체상은 열 처리 단계 동안 20%, 15%, 12%, 10%, 8%, 5%, 2% 또는 1% 미만의 산소(부피)를 함유한다.

바람직한 실시형태에서, 열 처리 단계 동안 기체상으로부터 산소가 실질적으로 배제된다.

본 발명의 방법의 제3 실시형태에서, 컨테이너의 기체상에 질소(N₂)를 첨가한다.

본 발명의 방법의 제4 실시형태에서, 상기 기체상은 적어도 80%의 N₂, 적어도 85%의 N₂, 적어도 90%의 N₂, 적어도 95%의 N₂ 또는 적어도 97% 또는 99%의 N₂를 포함한다. 추가의 대안적인 실시형태에서, 기체상은 실질적으로 N₂이다.

일반적으로, 상기 N₂를 컨테이너의 기체상에 오버레이로서 첨가하고, 100% N₂ 기체를 헤드스페이스에 0.1 내지 1　vvm(분당 액체 부피당 기체 부피, 즉 1 L 추출 부피에 대한 1　L/min)으로 첨가함으로써, 버퍼와 숙주 세포를 함유하는 컨테이너의 헤드스페이스 내에서 유지한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은, 숙주 세포에서 발현되는 관심있는 단백질의 제조 방법으로서,

- 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,

- 세포 배양액으로부터 상기 숙주 세포를 수집하는 단계,

- 상기 숙주 세포에 버퍼를 첨가하는 단계, 및

- 버퍼 중의 상기 숙주 세포에 대해 컨테이너 내에서의 열 처리를 실시하는 단계로서, 상기 컨테이너의 기체상은 실질적으로 N₂인 단계

를 포함하는 제조 방법에 관한 것이다.

컨테이너의 구성에 따라, 상기 N₂는 컨테이너의 기체상에 첨가될 수 있으며, 그 후 상기 컨테이너를 밀폐하여, 즉 컨테이너의 내부를 외부로부터 단절시켜, 열 처리 동안 기체상에 N₂를 남긴다. 대안적으로, 예를 들어, 외부 환경으로부터 내부를 밀폐시킬 수 없는 컨테이너의 경우, N₂의 일정한 흐름을 열 처리 단계 동안 컨테이너의 기체상을 통해 적용한다.

일 실시형태에서, N₂를 열 처리 단계 전에 기체상에 첨가하거나 도입하여, 산화환원 전위가 열 처리 단계 동안 원하는 값 아래로 유지되도록 한다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은

- 숙주 세포가 관심있는 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,

- 세포 배양액으로부터 상기 숙주 세포를 수집하는 단계,

- 컨테이너 내에서 상기 숙주 세포에 버퍼를 첨가하는 단계,

- 상기 컨테이너의 기체상에 N₂를 첨가하는 단계,

- 상기 컨테이너를 밀폐시키는 단계, 및

- 버퍼 중의 상기 숙주 세포에 대해 컨테이너 내에서의 열 처리를 실시하는 단게로서, 상기 버퍼의 산화환원 전위를 상기 열 처리 동안 0　mV 미만으로 유지하는 것인 단계

를 포함한다.

따라서, 본 발명의 방법의 추가 실시형태에서, N₂를, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 또는 100%의 N₂를 사용하여 오버레이로서 도입한다.

본 발명의 대안적인 실시형태에서, N₂를, 열 처리 동안 N₂를 버퍼를 통해 스파징함으로써, 바람직하게는 실질적으로 순수한 N₂를 스파징함으로써 컨테이너에 첨가한다.

본 발명의 제5 실시형태에서, N₂를, 컨테이너의 기체상의 오버레이로서 또는 N₂를 버퍼를 통해 스파징함으로써 컨테이너에 첨가한다.

본 발명에 따른 방법은, 다른 단백질 관련 물질의 제거를 용이하게 함으로써 항체 단편과 같은 가용성의 적절하게 폴딩되고 조립된 단백질의 샘플을 얻을 수 있게 하는 열 처리 단계를 포함한다.

"적절하게 폴딩되고 조립된" 단백질은, 비환원성 SDS-PAGE 상의 조립된 단백질 사슬에 대한 예상 분자량에 해당하는 단일 밴드의 존재에 의해 확인된다. 다른 단백질 관련 물질은 일반적으로 적절하게 폴딩되고 조립된 단백질의 부분 분해 단편이다.

본 발명의 방법의 열 처리 단계는, 가열 단계(heat up phase) 동안 원하는 상승된 온도에 도달되면, 샘플의 온도를 그 원하는 상승된 온도로 유지하는 단계이다.

열 처리 단계는, 샘플을 원하는 상승된 온도에 노출시킴으로써 수행한다. 가장 바람직하게는, 열 처리 단계는 30℃ 내지 70℃ 범위에서 수행한다. 온도는 원하는 대로 선택할 수 있고, 정제를 위한 단백질의 안정성에 따라 달라질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 40℃ 내지 65℃의 범위이거나, 또는 바람직하게는 40℃ 내지 60℃의 범위, 더 바람직하게는 45℃ 내지 60℃의 범위, 더욱 더 바람직하게는 50℃ 내지 60℃의 범위이고, 가장 바람직하게는 55℃ 내지 60℃, 58℃ 내지 60℃ 또는 59℃이다. 따라서, 최저 온도는 30℃, 35℃ 또는 40℃고, 최고 온도는 60℃, 65℃ 또는 70℃이다.

본 발명의 방법의 제6 실시형태에서, 상기 열 처리 단계는 30℃ 내지 70℃에서 수행한다.

본 발명의 방법의 제7 실시형태에서, 상기 열 처리 단계는 55℃ 내지 65℃에서 수행한다.

열 처리 단계는 바람직하게는 장시간 동안 수행한다. 열 처리의 길이는 바람직하게는 1시간 내지 24시간, 또는 1시간 내지 18시간, 더 바람직하게는 4시간 내지 18시간, 더욱 더 바람직하게는 6시간 내지 16시간, 가장 바람직하게는 8시간 내지 14시간 또는 8시간 내지 12시간, 예를 들어 10시간이다. 따라서, 열 처리의 최소 시간은 1시간, 2시간 또는 3시간이고, 최대 시간은 20시간, 22시간 또는 24시간이다.

본 발명의 방법의 제8 실시형태에서, 제6 또는 제7 실시형태의 열 처리 단계를 1시간 내지 18시간 동안 유지한다.

당업자가 알고 있는 바와 같이, 일반적으로 반응 시간과 온도 간에는 반비례 관계가 존재하여, 반응이 수행되는 온도가 높을수록 반응이 일어나는 데 필요한 시간이 단축된다.

특정 실시형태에서, 열 처리를 50℃ 내지 60℃에서 10시간 내지 16시간 동안, 더 바람직하게는 59℃에서 10시간 내지 12시간 동안 수행한다. 당업자라면 항체 또는 항체 단편과 같은 관심있는 단백질의 특성과 해당 샘플에 적합하도록 온도 및 시간을 선택할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 방법의 추가의 대안적 실시형태에서, 상기 단백질 추출을 58℃ 내지 60℃의 온도에서 8시간 내지 12시간 동안 수행한다.

열 처리 단계는 바람직하게는, 예를 들어, 적절한 교반 속도로, 예컨대 분당 200 회전수(RPM)의 속도로 작동하는 쉐이커 또는 교반기 세트에서 샘플을 교반하면서 수행한다. 그러나, 적절한 교반 속도는 방법의 규모에 따라 달라질 것이다.

본 발명의 방법의 제9 실시형태에서, 샘플은 열 처리 단계 전에 6 내지 9의 pH를 갖거나 그 pH로 조절된다. 본 발명의 방법의 추가적인 특정 실시형태에서, 상기 샘플의 pH는 열 처리 단계 전에 6.5 내지 8, 6.5 내지 7.5, 또는 6.8 내지 7.2이다.

특정 실시형태에서, 열 처리 단계 동안의 샘플의 pH가 5 내지 9가 되도록, 바람직하게는 열 처리 단계 동안의 샘플의 pH가 6 내지 7이 되도록, 샘플의 pH를 열 처리 단계 전에 측정하거나 조절한다.

추가 실시형태에서, pH를 무기 염기, 예를 들어 수산화나트륨 또는 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민 또는 트리메틸아민 또는 트리스 염기와 같은 염기로 조절한다.

샘플의 pH를 조절하기 위해 임의의 적절한 제제가 이용될 수 있다. 그 제제는 버퍼이거나 또는 버퍼보다 먼저 및/또는 뒤에 첨가될 수 있다. pH 조절에 이용될 수 있는 전형적인 제제는 NaOH, NH₄OH, 황산, EDTA, 트리스 버퍼 중 하나 이상을 포함하거나 이것으로 이루어진다.

추가적인 특정 실시형태에서, 샘플의 pH를, 산화환원 전위를 0 mV 미만으로 유지하기 위해, 열 처리 단계 전, 질소 등의 비활성 기체를 컨테이너의 기체상에 첨가하기 전에 측정하거나 조절한다. 대안적으로, 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 샘플의 pH를 열 처리 단계 전에 측정 및/또는 조절하고, 열 처리 단계 동안 질소 등의 비활성 기체를 샘플에 통과시킨다.

본원에서 언급된 pH 측정값은 일반적으로 20℃로 표준화된다.

본 발명의 내용에 있어서, "열 처리 단계 전"은, 샘플이 원하는 상승된 온도에 도달하고 열 처리 단계(상승된 온도에서 유지함)가 시작되는 시점을 포함한 그 이전을 의미한다. 열 처리 단계를 위한 원하는 상승된 온도에 도달하기 위해서는, 샘플에 대해 "가열 단계(heat up phase)"를 실시하며, 이 단계에서 샘플의 온도가 원하는 온도로 상승한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 샘플에 대해 가열 단계와 열 처리 단계를 실시하는 것을 포함한다. 샘플에 대해 가열 단계와 열 처리 단계를 실시하는 것을 포함하는 방법의 실시형태에서, 샘플은 가열 단계 시작 전에 요구되는 pH 수준일 수 있고/있거나 가열 단계 중에 요구되는 pH 수준일 수 있다.

특정 실시형태에서, N₂를 가열 단계 시작 전에 컨테이너의 기체상에 첨가한다. 바람직하게는, 샘플이 가열 단계 전에 요구되는 pH 수준이다.

본 발명의 방법의 제10 실시형태에서, 관심있는 단백질은 발현 벡터에서 코딩되는 재조합 단백질이다.

제11 실시형태에서, 본 발명의 제8 실시형태에 따른 방법에서, 단백질은 재조합 항체이다.

제12 실시형태에서, 상기 재조합 항체는 재조합 항체 단편이다. Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 및 scFv 단편을 비롯하여 당업계에 공지된 다수의 재조합 항체 단편이 존재한다. 대안적으로, 재조합 항체는, Fab-Fv 구성체를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는, 항체 또는 항체 단편으로부터 형성된 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 도메인 항체, 단일쇄 항체, 이중 특이적, 삼중 특이적, 사중 특이적 또는 다중 특이적 항체로부터 선택된다.

본 발명의 방법의 제13 실시형태에서, 상기 재조합 항체 또는 재조합 항체 단편은 TNF-알파 또는 CD154에 특이적으로 결합한다.

일 실시형태에서, 본 발명은, 숙주 세포에서 재조합 항체를 발현시키는 재조합 항체의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은, 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 숙주 세포 배양액으로부터 상기 숙주 세포를 수집하는 단계, 상기 숙주 세포에 버퍼를 첨가하는 단계, 및 컨테이너에서 상기 숙주 세포에 대해 열 처리를 실시하여 상기 숙주 세포로부터 재조합 항체를 추출하는 단계를 포함하고, 상기 버퍼의 산화환원 전위는 상기 추출 동안 0　mV 미만, -100 mV 미만, -200 mV 미만, -300 mV 미만 또는 -400 mV 미만으로 유지한다.

또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명은, 숙주 세포에서 재조합 항체를 발현시키는 재조합 항체의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은, 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 숙주 세포 배양액으로부터 상기 숙주 세포를 수집하는 단계, 컨테이너에서 상기 숙주 세포에 버퍼를 첨가하는 단계, 및 컨테이너의 기체상에 N₂를 첨가하는 단계, 숙주 세포에 대해 열 처리를 실시하는 단계 및 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법의 또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명은, 숙주 세포에서 재조합 항체를 발현시키는, 재조합 항체의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계, 세포 배양액으로부터 숙주 세포를 수집하는 단계, 컨테이너에서 숙주 세포에 버퍼를 첨가하는 단계, 컨테이너의 기체상에 N₂를 첨가하는 단계, 숙주 세포에 대해 열 처리를 실시하는 단계 및 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함하며, 상기 회수된 단백질은 컨테이너의 기체상 중의 N₂ 부재 하에 수행되는 열 처리를 포함하는 제조 방법으로부터 회수된 단백질에 비해 생성물 관련 불순물이 수준이 더 적다.

본 발명에 따른 방법은 여과 및/또는 원심분리와 같은 정제 절차 등의 하나 이상의 추가 단계를 포함할 수 있다. 유동상 크로마토그래피도 포함된다. 바람직한 추가의 정제 절차는 이온 교환 크로마토그래피, 미세여과, 한외여과, 정용여과, 및 고정상 포획 및 팽창상 포획 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체" 또는 "항체들"은 단클론 또는 다클론 항체를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체" 또는 "항체들"은 당업계에 공지된 재조합 기술에 의해 생성되는 재조합 항체를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. "항체" 또는 "항체들"은 임의의 종의 항체, 특히 포유동물 종의 항체, 예컨대 IgA₁, IgA₂, IgD, IgG₁, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃, IgG₄, IgE 및 IgM 및 이들의 변형된 변이체를 비롯한 임의의 이소타입의 인간 항체, 비인간 영장류 항체, 예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 붉은 털 원숭이(rhesus) 또는 사이노몰거스 원숭이 유래의 항체; 설치류 항체, 예를 들어, 마우스, 래트, 또는 토끼 유래의 항체; 염소 또는 말 항체; 및 낙타과 항체(예를 들어, 낙타 또는 라마 유래의 항체, 예컨대 나노바디^TM) 및 이들의 유도체; 또는 조류 종의 항체, 예컨대 닭 항체 또는 상어 항체 등의 어류 종의 항체를 포함한다. 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한, 적어도 하나의 중쇄 및/또는 경쇄 항체 서열의 제1 부분이 제1 종으로부터 유래되고, 중쇄 및 경쇄 항체 서열의 제2 부분이 제2 종으로부터 유래되는 "키메라" 항체를 의미한다. 본원에서 관심있는 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 구대륙 원숭이(Old World Monkey), 예컨대 개코원숭이, 붉은 털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이) 유래의 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체를 포함한다. "인간화" 항체는 비인간 항체로부터 유래되는 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 유래의 잔기가, 원하는 특이성, 친화성 및 활성을 갖는 마우스, 래트, 토끼, 닭 또는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역[또는 상보성 결정 영역(CDR)] 유래의 잔기로 치환되는 인간 항체(수용자 항체)이다. 대부분의 경우, CDR 외부의, 즉 프레임워크 영역(FR) 내의 인간(수용자) 항체의 잔기가 상응하는 비인간 잔기로 추가로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어진다. 인간화는 인간에 있어서 비인간 항체의 면역원성을 감소시키며, 이로써 항체를 인간 질병의 치료에 적용하는 것을 촉진한다. 인간화 항체 및 이를 제조하기 위한 몇 가지 다양한 기술이 당업계에 잘 알려져 있다. 용어 "항체" 또는 "항체들"은 또한 인간 항체를 의미하며, 이것은 인간화의 대안으로서 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화되면, 내인성 쥐과동물 항체 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)을 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포계 돌연변이 마우스에 있어서의 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형접합 결실은 내인성 항체 생성을 완전히 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 생식세포계 돌연변이 마우스에서의 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자 어레이의 이전은, 상기 항원으로 인간 생식세포계 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 동물을 면역화할 때 특정 항원에 대해 특이성을 갖는 인간 항체를 생성하게 된다. 이러한 트랜스제닉 동물을 제조하는 기술과 그러한 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 단리하고 생성하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 대안적으로, 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 마우스에서, 마우스 항체의 가변 영역을 코딩하는 면역글로불린 유전자만 상응하는 인간 가변 면역글로불린 유전자 서열로 대체한다. 항체 불변 영역을 코딩하는 마우스 생식세포계 면역글로불린 유전자는 변경되지 않는다. 이러한 방식으로, 항체 이펙터는 트랜스제닉 마우스의 면역계에 있어서 기능을 하며, 그 결과 B 세포 발달은 실질적으로 변화하지 않고, 이는 생체내에서 항원이 공격할 때 개선된 항체 반응을 유도할 수 있다. 관심있는 특정 항체를 코딩하는 유전자가 그러한 트랜스제닉 동물로부터 단리되었을 때, 불변 영역을 코딩하는 유전자를 인간 불변 영역 유전자로 대체하여 완전 인간 항체를 얻을 수 있다. 시험관내에서 인간 항체/항체 단편을 얻기 위한 다른 방법은 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이 기법과 같은 디스플레이 기법에 기초한 것이며, 이 때 공여자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 유래되거나 적어도 부분적으로 인공적으로 만들어진 재조합 DNA 라이브러리가 사용된다. 인간 항체를 생성하기 위한 파지 및 리보솜 디스플레이 기법은 당업계에 잘 알려져 있다. 인간 항체는 또한 관심있는 항원으로 생체외에서 면역화된 단리된 인간 B 세포로부터 생성할 수 있으며, 그 후 융합하여 하이브리도마를 생성할 수 있고, 이것은 그 후 최적 인간 항체에 대해 스크리닝될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "항체" 또는 "항체들"은 또한 아글리코실화(aglycosylated) 항체를 의미한다.

본 발명의 특정 실시형태에서, 항체는 수용성 폴리머, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(에틸렌글리콜)과 폴리(프로필렌글리콜)의 코폴리머, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리(비닐알코올), 폴리(비닐피롤리돈) 또는 폴리(프롤린)과 같은 기능성 모이어티의 공유 결합에 의해 변형되는 항체이며, 상기한 것들은 모두 상응하는 비변형 단백질보다 정맥내 주사 후 혈중에서 실질적으로 더 긴 반감기를 나타내는 것으로 알려져 있다.

몇몇 실시형태에서, 본 발명의 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티와 같은 기능성 모이어티에 부착된 항체이다. 특정한 일 실시형태에서, 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편에 위치하는 임의의 이용 가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들어, 임의의 유리 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 기를 통해 부착될 수 있다. 그러한 아미노산은 항체 단편 내에 자연적으로 발생하거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편 내로 삽입되도록 조작될 수 있다(예를 들어, US　5,219,996; US　5,667,425; WO　98/25971 참조).

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항체" 또는 "항체들"은 인간 유래의 항체(예를 들어, IgG) 및 다른 포유동물 종 유래의 항체를 비롯한 임의의 종의 비절두형 항체뿐만 아니라 항체 단편을 의미하기도 한다. 항체 단편은 당업계에 공지되어 있는 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린 도메인을 포함하고, 하나 이상의 항원(들)에 결합한다. 본 발명에 따른 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 및 scFv 단편뿐만 아니라; Fab-Fv 또는 Fab-Fv-Fv 구성체를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는, 항체 단편 또는 항체로부터 형성되는 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 도메인 항체(dAb), 예컨대 sdAb, V_HH 및 V_NAR 단편, 단일쇄 항체, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체, 사중 특이적 항체 또는 다중 특이적 항체를 포함한다. 상기에 정의된 항체 단편은 당업계에 공지되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "산화환원 전위"는 전자를 획득함으로써 환원되는 화학 종의 경향의 척도를 의미한다. 산화환원 전위는 볼트(V) 또는 밀리볼트(mV)로 측정된다. 각각의 종은 그 자신의 고유 환원 전위를 가지며, 전위가 더 큰 양의 값을 가질수록 전자에 대한 그 종의 친화성 및 환원 경향은 커진다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "추출" 또는 "단백질 추출"은 숙주 세포로부터 숙주 세포 내에서 발현된 단백질을 제거하는 것을 의미한다. 추출은 숙주 세포의 파괴와 세포 잔해물로부터 세포내 액을 단리하는 것 또는 그러한 세포로부터 주변세포질 공간의 액을 방출시키기 위해 그램 음성 박테리아 또는 외부 세포막을 갖는 다른 세포의 외부 세포막이 누출되게 숙주를 조작하는 것을 포함할 수 있다.

실시예

방법

발효 공정 A

인간 TNF-알파에 특이적으로 결합하는 Fab'을 발현하도록 벡터로 형질감염시킨 이 콜라이 W3110을 숙주 세포로서 사용하였다.

이들 세포를 함유하는 동결된 세포 뱅크 바이알을, 테트라사이클린이 부가된 6x 펩톤-효모 추출물(6xP-Y) 배지를 함유하는 쉐이크 플라스크(총 부피 700 ml)를 접종하는 데 사용하였다. 이 쉐이크 플라스크를 30℃에서 230 rpm로 인큐베이트하였다. 요구되는 OD 범위(OD600 = 2∼3)에서, 이 쉐이크 플라스크를, 글리세롤을 탄소원으로서 포함하고, 테트라사이클린이 부가된 SM6 화학적 규정 배지(Popplewell et al. Expression of Antibody Fragments by Periplasmic Secretion in Escherichia coli; Methods in Molecular Biology, vol. 308: Therapeutic Proteins: Methods and Protocols; 2005)를 함유하는 시드(seed) 발효기(총 부피 10 L)를 접종하는 데 사용하였다. 시드 발효기 내의 세포 배양물을 30℃에서 유지하였고, 용존 산소 농도(pO₂)를 30%로 유지하였으며, pH를 7.0으로 조절하였다.

요구되는 OD 범위(OD600 = 30∼37)에서, 시드 배양물을, 글리세롤을 탄소원으로서 포함하는 화학적 규정 배지를 함유하는 생산 발효기(총 부피 600 L)를 접종하는 데 사용하였다. 초기에 생산 발효기를 30℃, 30% pO₂로 유지하고, pH를 7.0으로 조절하고, 유도 시까지 세포를 회분 단계(batch phase)로 증식시켰다. 회분 단계 동안 온도를 25℃로 낮추고, MgSO₄를, 이 대사물질의 고갈을 방지하기 위해 첨가하였다.

글리세롤 고갈이 발생하는 특정 OD 범위(OD600 = 43∼47)에서, 배양물에 락토스 용액을 볼러스 첨가하였다. 그 후, 세포는 주 탄소원으로 락토스를 사용하게 되며, 락토스는 또한 Fab' 발현의 유도물질로서 작용하게 된다. 연속 공급을 통해 유도 단계 내내 락토스 농도를 유지하였고, 유도 후 30시간째 세포를 회수하였다.

발효 공정 B

인간 TNF-알파에 특이적으로 결합하는 Fab'을 발현하는 이 콜라이 MXE012 숙주 세포를 함유하는 동결된 세포 뱅크 바이알을, 테트라사이클린이 부가된 6x 펩톤-효모 추출물(6xP-Y) 배지를 함유하는 쉐이크 플라스크(총 부피 700 ml)를 접종하는 데 사용하였다. 이 쉐이크 플라스크를 30℃에서 230 rpm로 인큐베이트하였다. 요구되는 OD 범위(OD600 = 2∼3)에서, 이 쉐이크 플라스크를, 글리세롤을 탄소원으로서 포함하고, 테트라사이클린이 부가된 MD 화학적 규정 배지(Durany et al. 2004. Studies on the expression of recombinant fuculose-1-phosphate aldolase in Escherichia coli. Process Biochem 39:1677-1684)를 함유하는 시드 발효기(총 부피 10 L)를 접종하는 데 사용하였다. 시드 발효기 내의 세포 배양물을 30℃에서 유지하였고, 용존 산소 농도(pO₂)를 30%로 유지하였으며, pH를 6.9로 조절하였다.

요구되는 OD 범위(OD600 = 30∼37)에서, 시드 배양물을, 글리세롤을 탄소원으로서 포함하는 화학적 규정 배지를 함유하는 생산 발효기(총 부피 600 L)를 접종하는 데 사용하였다. 초기에 생산 발효기를 30℃, 30% pO₂로 유지하고, pH를 6.9로 조절하고, 글리세롤이 고갈될 때까지 회분 단계로 세포를 증식시켰다. 이 시간 동안, MgSO₄를, 이 대사물질의 고갈을 방지하기 위해 첨가하였다.

회분 단계가 끝날 때, 지수적 글리세롤 공급으로 전환하고, 배양물에 OD600이 약 70 유닛이 되도록 특정량의 글리세롤을 공급하였다. 이 시점에서, 글리세롤 공급을 지수적 공급으로부터 선형 공급으로 전환하였으며, IPTG(배양물 1 kg당 38.79 g)를 첨가함으로써 Fab' 발현을 유도하였다. 유도 후 40시간째 세포를 회수하였다.

이 콜라이 균주 MXE012는 WO　2011/086136(본원에서 그 전체가 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 spr 유전자에 대한 돌연변이 sprH145A를 포함하는 이 콜라이 대사 돌연변이체이다.

회수 및 추출 방법

웨스트팔리아(Westfalia) PSC 5 디스크 스택 원심분리기를 사용하여 연속 원심분리에 의해 세포를 회수하였다.

2 L 또는 5 L 유리 용기에서, 물과 추출 버퍼(pH 7.4)를 10 mM EDTA, 100 mM Tris의 최종 추출 버퍼 농도가 되도록 첨가함으로써, 농축된 세포 슬러리를 재현탁시켜 최초의 세포 회수 농도로 되돌렸다.

필요에 따라, 가열 단계를 통한 단백질 추출 전에, 2.5　M Tris 염기를 추출 버퍼에 첨가함으로써, 재현탁된 세포를 pH 7.2로 조절하였다. 가열 추출을 위해, 세포를 59℃로 10시간 동안 가열하였다. Biostat BPlus 컨트롤 유닛(Sartorius) 및 멀티플 퍼멘터 컨트롤 시스템(Multiple Fermenter Control System)(MFCS®) 소프트웨어를 이용하여 온도 및 혼합을 유지하였다.

샘플 정제

생성물 관련 불순물을 평가할 수 있도록 추출 샘플로부터 Fab' 관련 종을 정제하였다. 먼저, 추출 샘플을 원심분리에 의해 청징화하고, 청징화된 상청액을 수집하고, 0.2　㎛ 필터를 통해 여과하였다. 그 후, 청징화된 상청액을 1　mL 단백질　L 컬럼(Pierce #89928)에 로딩하고, 저농도의 포스페이트 버퍼(pH 7.4)로 세척하고, 글리신 버퍼(pH 2.8)로 용리시켰다. 단백질　L 수지는 Fab' 단편을 포획할 수 있었고, 회수는 실험 범위 내에서 선형적이었고 재현성이 있다는 것이 입증되었다.

샘플 분석

정제된 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피로 분석하고 정량하였다. 샘플을 Dionex Pro Pac SCX-10(Thermo Scientific) 분석용 컬럼에 로딩하고 염 구배를 이용하여 용리시켰다. 용리된 단백질을 280　nm에서 모니터링하였고, 표준 절차에 따라 크로마토그램 피크를 정량하고 해석하였다.

실시예 1

공정 B에 따라 발효를 수행하였고, 상기에 기재한 바와 같이 단백질을 추출하였다. 산화환원 전위는, 컨테이너에서 추출 공정 중에, ORP(산화환원 전위) 프로브(Broadley James Corporation, 미국 캘리포이나 어바인 소재)를 이용하여 측정하였고, MFCS® 소프트웨어(Sartorius, 미국 펜실베이니아주 베들레헴 소재)를 이용하여 모니터링하였다.

감소된 산화환원 환경을 유지하는 것의 효과를 평가하기 위해, 추출 동안, 몇 개의 추출 컨테이너를 질소에 노출시키고, 다른 것들은 공기에 노출시켰으며, 또한, 가체를 샘플을 통해 컨테이너로 스파징하거나 컨테이너의 헤드스페이스로의 오버레이 흐름으로서 유지하였다.

하기 표 1은, 컨테이너 기체 흐름 조건의 개요를 제시한다. 모든 기체 흐름을, 100% 질소 또는 압축 공기 공급을 이용하여, 1　vvm(분당 액체 부피당 기체 부피, 즉, 1 L 추출에 대하여 1　L/min)의 유량으로 유지하였다.

도 1 및 2는, 추출의 상응하는 산화환원 및 온도 프로파일(도 1) 및 추출 후 샘플의 SDS PAGE 겔(도 2)을 도시한다.

이들 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 열 처리 단계 중에 질소 오버레이를 유지하는 것은, 59℃에서의 온도 유지 동안 최소 약 -435　mV, 일반적으로 -375　mV로, 내내 낮은 산화환원 전위 측정값을 유지한다. 질소가 스파징되었을 때, 유사하게 낮은 산화환원 전위가 관찰되었다. 숙주 세포 함유 버퍼를 질소 대신 공기로 오버레이하였을 때, 산화환원 전위값이 가열 단계 추출 동안 현저히 더 높았고, 59℃에서의 온도 유지 동안, 양의 값(일반적으로 약 +45　mV)이 되는 것을 알 수 있다. 공기를 스파징하였을 때 유사하게 높은 산화환원 전위가 관찰되었다. 높은 발포도가 관찰됨으로 인해 추출을 거치면서 기체 스파징을 오버레이로 부분적으로 전환시켰다.

도 2는 SDS PAGE에 의해 측정된 생성물 관련 불순물 수준에 있어서의 유의적 차이를 입증한다. 이 도면은, 질소 존재 하에, 열 추출 동안의 환원성 조건이 공기 존재 하에 수행된 추출에 비해 생성물 관련 불순물 수준을 현저히 감소시킬 수 있는 데 충분하다는 것을 보여준다.

실시예 2

공정 A에 따른 발효와 후속 추출을 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 헤드스페이스로의 질소 유량은 하기 표 2에 따른 다양한 교반 속도 및 충전 부피와 함께 0.1 vvm로부터 1 vvm까지 변화시켰다.

도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 생성물 관련 불순물의 제거에 질소 오버레이가 미치는 명백한 효과를 관찰할 수 있다. 질소 오버레이가 적용되지 않은 추출 #8은 생성물 관련 불순물의 수준이 현저히 더 높았다. 이에 반해, 이 도면은 또한, 추출 1과 2, 7과 8을 비교할 때, 질소 오버레이율이 이 불순물 제거에 영향을 미칠 수 있다는 것을 제시한다.

실시예 3

공정 A에 따른 발효 및 세포 회수를 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 열 추출 직전에, 2.5　M Tris 염기를 추출 버퍼에 첨가함으로써 재현탁된 숙주 세포를 pH 7.2로 조절하였다. 이 열 추출은 질소 오버레이 존재 또는 부재 하에 수행하였다. 적용 가능하다면, 100% 질소를 사용하여 1　vvm으로 컨테이너의 헤드스페이스를 가스처리하여 질소 오버레이를 유지하였다.

도 4에서는, 추출 1 내지 3은 질소 오버레이 존재 하에 수행된 반면, 추출 4 내지 6은 공기로 오버레이되었다. 결과는 역시, 질소 존재의 유익을 보여주며, 열 추출 후 남아있는 생성물 관련 불순물의 수준을 현저히 감소시켰다. 생성물 관련 불순물 수준이 이전 실시예와 비교하여 더 감소된 것으로 나타나기 때문에, 열 추출 전에 수행된 pH 조절로부터 추가적인 유익한 효과가 얻어진다.

실시예 4

환원성 조건 하에서의 추출 효과를 또한 더 작은 규모로, 즉 쉐이크 플라스크를 사용하여 분석하였다.

단백질 유도 세포 배양물 25 내지 100　mL를 회수하고, 물 및 3x 추출 버퍼(pH 7.4)를 최종 1x 추출 버퍼 농도(10　mM EDTA, 100　mM Tris)가 되도록 첨가함으로써 250　mL 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에 재현탁시켰다. 이 플라스크는 플러그 시일(plug seal)을 가졌고, 플라스크로의 산소 투과율을 최소화하기 위해 폴리카보네이트로 제조된 것이었다. 1회용 글로브 백(Aldrich AtmosBag, cat #Z530220)을 사용하여 이 글로브 백을 통해 질소를 연속적으로 흐르게 하여 플라스크의 기체상에 질소 오버레이를 첨가하였다. 글로브 백으로부터 꺼내어 열 추출을 수행하기 전에 플라스크를 밀폐시켰다. 또한, 비교용 샘플을 벤치(플라스크의 기체상의 오버레이로서 공기를 이용함)에서 제조하였다. 쉐이크 플라스크 인큐베이터(New Brunswick Innova42)에서 60℃에서 10시간 동안 열 추출을 수행하였다. Broadley James ORP 프로브를 사용하여 추출 후 각각의 플라스크에서 산화환원 전위를 측정하였다. 또한, 단백질 추출에 대한 상이한 표면적 대 부피 비가 미치는 영향을 평가하기 위해, 상이한 플라스크 충전 부피로 열 처리 단계를 수행하였다. 하기 표 3은 테스트한 실험 조건을 요약한 것이다.

도 5는, 질소 오버레이 존재 하에 제조된 쉐이크 플라스크가, 공기 존재 하에 제조된 플라스크보다 추출물 내에 보다 환원성의 환경을 유지하였다는 것을 입증한다. 이 도면은 또한, 더 큰 충전 부피를 갖는 플라스크가 더 작은 충전 부피를 갖는 플라스크보다 환원성이 더 컸다는 것을 보여주는데, 이것은 더 작은 표면적 대 부피 비로 인한 추출물의 더 느린 산화 속도에 기인하는 것 같다. 공기 중에서 제조된 플라스크는 모두 양의 값의 종점 산화환원 전위값을 가졌으며, 충전 부피와 상관관계가 없었다.

도 6은, 질소 하에 제조된 쉐이크 플라스크가 추출 후 생성물 관련 불순물 수준이 현저히 더 낮았다는 것을 보여준다. 질소 하에 제조된 모든 플라스크(종점 산화환원 전위 범위 -10　mV 내지 -116　mV)는 공기 중에서 제조된 모든 플라스크 (종점 산화환원 전위 범위 +79　mV 내지 +97　mV)보다 현저히 더 낮은 생성물 관련 불순물 수준을 입증한다.

실시예 5

인간 TNF-알파에 특이적으로 결합하는 Fab'은 HCP(숙주 세포 단백질)보다 더 높은 융점(Tm)을 가지며, 이것은 열 처리 단계 동안 개발되는 특징이다. 가열은 상당량의 HCP 및 생성물 관련 불순물을 변성시켜, 이들을 응집시키고 추출 단계 동안 제거되게 한다. 그러나, 이전 실시예에서 설명한 바와 같이, 이들 불순물의 제거는, 낮은 산화환원 전위를 고려하면, 질소 오버레이가 적용될 때 크게 개선된다. 환원성 환경은 가열 시의 이들 종 내의 사슬내 결합의 환원으로 인하여 불순물의 제거를 촉진하여, 불순물의 융점 감소로 이어지는 것으로 생각된다.

상기한 점을 확인하기 위해, 2종의 주요 생성물 관련 불순물 종의 융점을 비환원성 조건과 환원성 조건 하에 측정하였다. 상기 환원성 조건은, 추출 중에 형성된 질소 오버레이에 의해 만들어진 환경을 모방하기 위해, TCEP-HCL(트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드)를 사용하여 형성하였다.

소수성 영역의 일부 또는 전부가 노출되는다는 전제 하에 단백질에 결합하는 소수성 형광체의 사용에 기초하여, 써머플루오르 어세이(Thermofluor assay)를 이용하여 측정을 수행하였다. 이러한 특정 경우, 형광체는 SYPRO 오렌지(DMSO 중 5000X 농도; Life Technologies S-6650)였다. 이것은, 변성 조건 하에(예를 들어, 온도를 증가시킴), 염료가 단백질에 결합될 경우 그 염료에 의해 방출되는 형광을, 리얼 타임 PCR 시스템(7900HT fast real-time PCR system, Life Technologies 제품)을 이용하여 측정함으로써 비폴딩 프로세스를 모니터링할 수 있게 한다. 샘플을 온도를 증가시키면서 (30초 유지 및 0.5℃ 증분으로 25℃에서 99℃로) 인큐베이트하고, 형광 발광을 기록한다. 데이터를 플롯하고, 기울기의 변곡점을 찾아 단백질의 융점을 결정한다.

이 경우, 2종의 정제된 생성물 관련 불순물을 pH 5.0 및 7.0의 시트레이트-포스페이트 버퍼 및 pH 7.4의 포스페이트 완충 염수에서 측정하였다. 2:1 및 10:1의 환원제 대 단백질의 몰비를 얻기 위해 2가지의 상이한 농도의 TCEP-HCL을 이용하였고, TCEP-HCL을 갖지 않는 샘플을 대조군으로서 함께 러닝하였다.

도 7은, 2종의 주요 생성물 관련 불순물 종의 열 안정성 측정 결과를 도시한다. 산화환원 전위와 열 안정성(융점)은 서로 상관성이 있는 것으로 나타난다: 산화환원 전위가 낮을수록 단백질의 융점이 낮아진다. 유사한 효과가 pH가 더 중성이 될 때 pH에 대해서도 설명될 수 있다. 두 변수는 모두, 생성물 관련 불순물이 분해에 더 취약하게 되도록 만들어, 그들의 제거를 촉진한다.

결론

종합하면, 데이터는, 가열 단계 동안 환원성 환경(낮은 산화환원 전위)을 유지하는 것이 단백질 추출 동안의 생성물 관련 불순물의 수준을 현저히 낮추는 데 있어서 중요하다는 것을 입증한다. 또한, 이 데이터는 이러한 환원성 환경이 질소 오버레이의 적용을 통해 만들어질 수 있고, 질소 오버레이가 없는 경우, 환경의 산화환원 전위는 현저히 환원성이 적고, 이는 생성물 관련 불순물 수준을 높이는 결과를 가져온다는 것을 입증한다.

Claims (14)

1. 숙주 세포에서 발현되는 관심있는 단백질의 제조 방법으로서,
   a) 상기 숙주 세포가 상기 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계,
   b) 세포 배양액으로부터 상기 숙주 세포를 수집하는 단계,
   c) 상기 숙주 세포에 버퍼를 첨가하는 단계, 및
   d) 상기 숙주 세포에 대해 열 처리를 실시하는 단계로서, 상기 버퍼의 산화환원 전위를 열 처리 동안 -0 mV 미만으로 유지하는 것인 단계
   를 포함하는, 관심있는 단백질의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 열 처리를 컨테이너에서 수행하고, 단백질 추출 동안 컨테이너 내의 기체상에 존재하는 산소(O₂)의 양을 줄임으로써 상기 산화환원 전위를 유지하는 것인 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 컨테이너의 기체상에 질소(N₂)를 첨가하는 것인 제조 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 기체상이 50% 이상의 N₂를 포함하는 것인 제조 방법.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, N₂를, 컨테이너의 기체상의 오버레이(overlay)로서 또는 N₂를 샘플을 통해 스파징함으로써 컨테이너에 첨가하는 것인 제조 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열 처리 단계를 30℃ 내지 70℃에서 수행하는 것인 제조 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 열 처리 단계를 55℃ 내지 65℃에서 수행하는 것인 제조 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 온도를 1시간 내지 18시간 동안 유지하는 것인 제조 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 버퍼의 pH를 숙주 세포에 첨가한 후 열 처리 전에 측정하는 것인 제조 방법.
10. 제9항에 있어서, 버퍼의 pH는 pH 6 내지 9이거나 pH 6 내지 9로 조절되는 것인 제조 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 발현 벡터 내에서 코딩되는 재조합 단백질인 제조 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 단백질이 재조합 항체인 제조 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 재조합 항체가 재조합 항체 단편인 제조 방법.
14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 재조합 항체 단편이 TNF-알파 또는 CD154에 특이적으로 결합하는 것인 제조 방법.

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